JP2753694B2 - インターロイキン−１β誘導体及び医薬 - Google Patents
インターロイキン−１β誘導体及び医薬Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は新しいポリペプチド、更に詳しく
はインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）の新しい誘導
体、並びにＩＬ−１β及びその新しい誘導体の医薬用途
に関する。 【０００２】第２回国際リンホカインワークシヨツプに
おいて、かつてリンパ球活性化因子（Ｌymphocyte Ａct
ivating Ｆactor ；ＬＡＦ）、マイトジエニツク プロ
テイン（Ｍitogenic Ｐrotein）、ヘルパーピーク−１
（Ｈelper peak−１）、Ｔリンパ球代替因子〔Ｔ−cell
replacing factorIII（ＴＲＦ−III ）、Ｔ−cell rep
lacing factor Ｍφ（ＴＲＦＭ）〕、Ｂセルアクチベー
テイング フアクター（Ｂ−cell activating facto
r）、Ｂリンパ球分化因子（Ｂ−cell differationfacto
r ）などの呼称で報告されてきた生理活性物質は、いず
れもインターロイキン−１（ＩＬ−１）なる呼称に統一
されることが決定された〔Ｃellular Ｉmmunol. ，４
８、４３３−４３６（１９７９）〕。この決定は、上記
各生理活性物質は物質として区別できず生理活性を異な
る角度から把えて表現していたにすぎないとの理由に基
づいている。 【０００３】上記ＩＬ−１は、更に例えばＴリンパ球や
Ｂリンパ球を活性化し、インターロイキン２の産生亢進
作用や抗体産生を亢進させる作用を有し、また肝細胞に
作用して蛋白質合成を亢進させる作用、プスタグランデ
イン産生を亢進させる作用等を有することも報告されて
いる〔Ｒeviews of Ｉnfectious Ｄisease，Ｖol. ６，
No. １，５１−５９（１９８４）、Ｎew Ｅngland.
Ｊ．of Ｍed. ，３１１，１４１３（１９８４）等参
照〕。 【０００４】しかして、物質としてのＩＬ−１の本体に
関しては現在尚不明ではあるが、最近になってＬＡＦ活
性を有するポリペプチドもしくはその前駆体をコードす
る異なる２種の遺伝子の存在がようやく報告された〔Ｐ
roc.Ｎatl.Ａcad ．Ｓci. ，Ｖol. ８１，７９０７−７
９１１（１９８４）、Ｎature ．Ｖol. ３１５，６４１
（１９８５）、ＮucleicＡcid Ｒesearch ，Ｖol. １３
（１６），５８６９（１９８５）〕。これらの報告は２
種の遺伝子の塩基配列から推定される１５９個のアミノ
酸配列を有する「ＩＬ−１α」と１５３個のアミノ酸か
らなる「ＩＬ−１β」を記している。 【０００５】しかしながら、従来よりコンデイシヨンド
メデイウム（conditioned medium）もしくは部分精製
したと報告されるものの前述の生理活性と、上記塩基配
列から推定されるポリペプチドとの関連は、今尚明らか
にはされていない。 【０００６】また、上記公知の生理活性物質としてのＩ
Ｌ−１は、内因性の発熱物質（endogeneous pyrogen ：
ＥＰ）とも同一物質であるとされ、発熱性を示すことが
知られている〔Ｎature ，３０４，４４９（１９８
３）；Ｃell.Ｉmmunol. ，６３，１６４（１９８１）；
Ｊ．Ｅxp．Ｍed.,１５０，７０９（１９７９）；Ｊ．Ｉ
mmunol. ，１３０，（６）２７０８（１９８３）；同，
１３２（３）１３１１（１９８４）等参照〕。この事実
から、従来の生理活性としてのＩＬ−１はもとより、仮
に物質として均一なＩＬ−１が提供されたとしても、そ
の医薬用途への適用は、極めて困難とされている。 【０００７】本発明は医薬用途に有効に使用できる新し
い有用なＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドを提供し
ようとするものである。 【０００８】本発明は新しいＩＬ−１β誘導体であるポ
リペプチドの医薬用途を提供しようとするものである。 【０００９】本発明は新しいＩＬ−１β誘導体をコード
する遺伝子及びこれを用いて遺伝子工学的手法でＩＬ−
１β誘導体であるポリペプチドを製造する方法を提供し
ようとするものである。 【００１０】本発明はまた均質なＩＬ−１β自身の新し
い医薬用途を提供しようとするものである。 【００１１】上記本発明の目的及びそれら以外の本発明
の目的は以下の記載により明かにする。 【００１２】本発明のＩＬ−１β誘導体（ポリペプチ
ド）はインターロイキン−１βの下記（Ａ）式で表わさ
れるアミノ酸配列に於て、 式（Ａ） 【００１３】 【化６】【００１４】ａ）１位Ａla、３位Ｖal、４位Ａrg、５位
Ｓer、８位Ｃys、１１位Ａrg、３０位Ｈis、７１位Ｃy
s、９３位Ｌys、９７位Ｌys、９８位Ａrg、９９位Ｐh
e、１０３位Ｌys、１２０位Ｔrp、１２１位Ｔyr及び１
５３位Ｓerから選ばれた少なくとも１つのアミノ酸残基
が欠失されているか又は他のアミノ酸で置換されている
こと、 ｂ）１位のＡlaから９位のＴhrに至るアミノ酸配列又は
その中の少くとも１つのアミノ酸残基が欠失されている
こと（但し上記ａに記載の１位Ａla、３位Ｖal、４位Ａ
rg、５位Ｓer及び８位Ｃysから成る群から選ばれたアミ
ノ酸残基の少くとも１つが欠失されている場合を除
く）、 ｃ）１０３位のＬysから１５３位のＳerに至るアミノ酸
配列又はその中の少くとも１つのアミノ酸残基が欠失さ
れていること（但し上記ａに記載の１０３位Ｌys、１２
０位Ｔrp、１２１位Ｔyr及び１５３位Ｓerから成る群か
ら選ばれたアミノ酸残基の少くとも１つが欠失されてい
る場合を除く）、 ｄ）式（Ａ）のＮ末端に、Ｍet又は下記式（Ｂ）で示さ
れる１’位のＭetから１１６’位のＡspに至るアミノ酸
配列若しくはそのＣ末端側の一部のアミノ酸配列が付加
されていること、 式（Ｂ） 【００１５】 【化７】【００１６】というａ）〜ｄ）の条件の少くとも１つを
充足する改変されたアミノ酸配列を有することにより特
徴付けられる（但し、少くとも７１位Ｃysが他のアミノ
酸で置換されたポリペプチドを除く）。 【００１７】上記及び以下の本明細書に於けるアミノ酸
及びポリペプチドの表示は、ＩＵＰＡＣ及びＩＵＡＣ−
ＩＵＢによる命名法又は規則に於ける略号乃至当該分野
で慣用されている略号による表示法に従うものとする。
また塩基配列に於ける核酸の表示も同様とする。アミノ
酸の数又は位置は、欠落及び付加がある場合であって
も、全てＩＬ−１βのアミノ酸配列即ち前記式（Ａ）ア
ミノ酸配列に従って表示する。但しアミノ酸位置を示す
数値のうちダツシユを付したものは式（Ｂ）のアミノ酸
配列に従う。 【００１８】本発明のＩＬ−１β誘導体は、ＩＬ−１β
の前記式Ａ）に示されるアミノ酸配列において、上記
ａ）〜ｄ）の要件の１つ又は２以上を組み合わせて充足
するアミノ酸配列を含有する新規なポリペプチドであ
る。好ましい誘導体は前記要件ａ）〜ｃ）の少くとも１
つを充足するアミノ酸配列を有するもの及びａ）〜ｃ）
の少くとも１つの要件とｄ）の要件とを同時に満足する
アミノ酸配列を有するものである。 【００１９】本発明のＩＬ−１β誘導体であるポリペプ
チドの好ましい具体例を挙げると次の通りである。 【００２０】１）少くとも１位Ａlaが欠失されているか
又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００２１】２）少くとも３位Ｖalが欠失されているか
又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００２２】３）少くとも４位Ａrgが欠失されているか
又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００２３】４）少くとも５位Ｓerが欠失されているか
又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００２４】５）少くとも８位Ｃysが欠失されているか
又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００２５】６）少くとも１１位Ａrgが欠失されている
か又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００２６】７）少くとも３０位Ｈisが欠失されている
か又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００２７】８）少くとも７１位Ｃysが欠失されている
か又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００２８】９）少くとも９３位Ｌysが欠失されている
か又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００２９】10）少くとも９７位Ｌysが欠失されている
か又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００３０】11）少くとも９８位Ａrgが欠失されている
か又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００３１】12）少くとも９９位Ｐheが欠失されている
か又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００３２】13）少くとも１０３位Ｌysが欠失されてい
るか又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００３３】14）少くとも１２０位Ｔrpが欠失されてい
るか又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００３４】15）少くとも１２１位Ｔyrが欠失されてい
るか又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００３５】16）少くとも１５３位Ｓerが欠失されてい
るか又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００３６】17）１位のＡlaから３位のＶalに至るアミ
ノ酸配列、１位のＡlaから６位のＬeuに至るアミノ酸配
列又は１位のＡlaから９位のＴhrに至るアミノ酸配列が
少くとも欠失されているポリペプチド。 【００３７】18）１５１位Ｖalから１５３位Ｓerに至る
アミノ酸配列、１４９位Ｇlnから１５３位Ｓerに至るア
ミノ酸配列、１４５位Ａspから１５３位Ｓerに至るアミ
ノ酸配列、１４１位Ｇlnから１５３位Ｓerに至るアミノ
酸配列、１２１位Ｔyrから１５３位Ｓerに至るアミノ酸
配列又は１０３位Ｌysから１５３位Ｓerに至るアミノ酸
配列が少くとも欠失されているポリペプチド。 【００３８】19）式（Ａ）のＮ末端にＭet、式（Ｂ）で
表わされるアミノ酸配列７７’位のＭetから１１６’位
Ａspに至るアミノ酸配列、７１’位Ｍetから１１６’位
Ａspに至るアミノ酸配列、３２’位Ｍetから１１６’位
Ｓerに至るアミノ酸配列又は１’位Ｍetから１１６’位
Ａspに至るアミノ酸配列を少くとも有するポリペプチ
ド。 【００３９】上記本発明のＩＬ−１β誘導体は、ＩＬ−
１βのアミノ酸配列の特定位置の特定アミノ酸が他のア
ミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド
を包含するが、この置換を行い得る他のアミノ酸は、人
体蛋白質を構成するα−アミノ酸であれば、いずれでも
よいが、中性アミノ酸であるのが好適である。但し、Ｃ
ysは、そのＳＨ基に基づいて、分子内又は分子間ジスル
フイド結合を形成することがあり、これを考慮すれば該
アミノ酸はＣys以外の上記アミノ酸であるのが好まし
い。特に好ましいものとして例えば４位Ａrgの場合はＧ
lyを、８位Ｃysの場合はＳer又はＡlaを、１１位Ａrgの
場合はＧlnを、３０位Ｈisの場合はＴyrを、７１位Ｃys
の場合はＳer、Ａla又はＶalを、９３位Ｌysの場合はＬ
euを、９８位Ａrgの場合はＬeuを、１０３位Ｌysの場合
はＧlnを、１２０位Ｔrpの場合はＡrgを、１２１位Ｔyr
の場合はＧlnを、それぞれ好ましいものとして例示する
ことができる。 【００４０】本発明のＩＬ−１β誘導体ならびに本明細
書に記載の方法に従い得られる均質なＩＬ−１βは、例
えばＬＡＦ活性、腫瘍細胞増殖抑制活性（ＧＩＦ活
性）、即ち腫瘍細胞に対して特異的にその増殖を抑制す
る活性、コロニー刺激因子（Ｃolony stimulating fact
or：ＣＳＦ）、インターフエロン（interferon：ＩＦ
Ｎ）、インターロイキン２（interleukin −２：ＩＬ−
２）、インターロイキン３（interleukin −３：ＩＬ−
３）等の種々のサイトカイン（cytokine）類の産生促進
活性、即ち例えばヒト細胞に作用してそれらサイトカイ
ン類の産生を著しく促進させる活性、抗炎症活性、特に
例えば関節炎モデル動物に投与することによって関節炎
の進行を効果的に抑制する活性、放射線障害防止作用、
即ち骨髄移植時の放射線全身照射、癌治療等における放
射線照射、放射線事故時における生体障害乃至は重篤な
副作用等を予防する作用乃至防止する作用等を有してい
る。本発明誘導体は上記各活性のいずれか少なくともひ
とつの点で優れているか、或いは（及び）より毒性が低
く副作用が少ない点で優れている。従って本発明誘導体
ならびに上記の均質なＩＬ−１βは例えば抗体産生促進
やワクチンの効果増強等の免疫系刺激剤、抗腫瘍剤、例
えばＣＳＦ、ＩＬ−２及びＩＬ−３等のサイトカイン産
生促進剤、抗炎症剤、放射線障害防止剤等の医薬品とし
て有用である。 【００４１】殊に上記均質なＩＬ−１β自身が関節炎等
の炎症に著効を示すという本発明による新たな知見は、
従来ＩＬ−１が炎症をメデイエートし、その惹起に関与
するとされていた事実によれば、おどろくべきことてあ
る。また、本発明誘導体は上記各活性のいずれか少なく
ともひとつの点で優れているか、或いは（及び）より毒
性が低く副作用が少ない点で優れている。 【００４２】とりわけ、本発明誘導体は、ＣＳＦ産生促
進剤として有効であり、これをヒトに投与するときに
は、ウィルス感染や抗原抗体反応等の危険性を生じるこ
となく、癌化学療法や放射線療法後の骨髄低形成による
顆粒球減少を有効に回復できる（顆粒球減少治療剤）。
上記ＣＳＦ産生促進剤は、またその本来のＣＳＦ産生促
進作用により、ＣＳＦの作用に基づく各種疾病の予防及
び治療剤としても有効に利用できる。例えば、ＣＳＦは
顆粒球やマクロファージの機能を促進させる作用がある
〔ロペッツら（Ｌopez, Ａ．Ｆ．et al.),Ｊ．Ｉmmuno
l.,１３１，２９８３（１９８３）、ハンダムら（Ｈand
am,Ｅ．et al.),同１２２，１１３４（１９７９）及び
バダスら（Ｖadas, Ｍ．Ａ．et al.), 同１３０，７９
５（１９８３）〕ので、種々の感染症の予防及び治療剤
として臨床応用が期待されており、上記ＣＳＦ産生促進
剤も同様に臨床応用が期待される。 【００４３】殊に、近年生体防御能が低下乃至障害され
た個体（compromised host）に、それまで無害であった
病原体が病原性を発揮して惹起される、所謂日和見感染
症（opportunistic infection 或いは terminal infec
tion）は、臨床的に問題となる病原体（起炎菌）がシュ
ードモナス（Ｐseudomonas）セラティア（Ｓerratia)等
のグラム陰性桿菌、ヘルペス（Ｈerpes simplex,ＨＳ
Ｖ）、バリセラ−ゾースタ（Ｖaricella zoster,ＶＺ
Ｖ）、サイトメガロウイルス（Ｃytomegalovirus，ＣＭ
Ｖ）等のウイルス、キャンディダ（Ｃandida albicans
）アスペルギルス（Ａspergillus fumigatus）、ノカ
ルディア（Ｎocardia asteroidea）等の真菌、カリニ原
虫（Ｐneumocystis carinii)、トキソプラズマ（Ｔoxop
lasma gondii）等の原虫等であり、現用の抗生物質中に
は、之等の病原菌に対して充分な効果を奏し難く、該日
和見感染症に対する新しい薬剤の研究開発が切望されて
いる。本発明誘導体は、かかる日和見感染症の予防及び
治療剤としても有用であり、特にかかる日和見感染症が
高頻度に見られる抗癌剤投与時、即ち急性白血病の化学
療法や骨髄移植時における各種の感染症、例えばガンジ
ダ症、クリプトコックス症、アスペルギルス症、接合菌
症、黒色真菌感染症、ウィルス感染症、サイトメガロウ
ィルス肺炎、之等の合併症等の予防及び治療剤として有
用なものである。更に本発明誘導体ならびに上記のＩＬ
−１βは、上記医薬用途以外に、そのサイトカイン産生
促進活性に基づいて、例えば細胞株からの各種有用サイ
トカインのインビトロ（in vitro）製造に際して極めて
有効に使用し得る。かかる細胞株からの天然型サイトカ
インの製造は、ことに糖蛋白質であるサイトカインにお
いて着目されており、効率的にかつ大量に有用サイトカ
インを収得することができる本発明誘導体中、少くとも
７１位Ｃysを置換乃至は欠失させたもの、特に上記Ｃys
を他のアミノ酸、例えばＳer、Ａla、Ｖal等で置換した
ものは、高活性を示す。 【００４４】また、少くとも４位Ａrg又は少くとも８位
Ｃysを置換乃至は欠失させた本発明誘導体、及び少くと
も１０３位以降の少なくともひとつのアミノ酸を欠失さ
せた本発明誘導体は、いずれもプロスタグランジンＥ
（ＰＧＥ）産生促進作用が弱く、従って発熱作用等の副
作用ならびに毒性がより少ない特徴を有し、更に少くと
も４位Ａrgを置換乃至は欠失させた本発明誘導体は、Ｇ
ＩＦならびにＬＡＦ活性に比較して、ＣＳＦ産生促進活
性ならびに抗炎症活性がより強い特徴を有している。 【００４５】更に、本発明誘導体中、式（Ａ）のＮ末端
に少くとも上記特定のアミノ酸もしくはポリペプチドが
付加したものは、ＧＩＦ活性及びＬＡＦ活性に比してＣ
ＳＦ産生促進作用及び抗炎症作用がより高い特徴を有
し、しかも毒性が低く且つ作用の持続性の点で医薬品と
して、殊に経口剤乃至は座剤として利用する場合に、よ
り有効である。 【００４６】更に、本発明誘導体、ことに少くとも８位
Ｃys及び／又は７１Ｃysを置換乃至は欠失させたもの、
特に上記Ｃysを他のアミノ酸、例えばＳer、Ａla、Ｖal
等で置換したものは、種々の条件下におけるＩＬ−１受
容体への結合性において優れている。 【００４７】尚、本発明誘導体の内でＩＬ−１βに比し
その分子中にＣysをより少なく含むか又は含まないもの
は、ＣysのＳＨ基に基づく分子内もしくは分子間結合の
不要な形成を考慮すれば、より好ましいものである。 【００４８】本発明のポリペプチドは、例えば遺伝子工
学的手法により製造することができる。即ち、前記本発
明に係わる特定のポリペプチドをコードする遺伝子を利
用し、これを微生物のベクターに組込んで該微生物細胞
内で、複製、転写、翻訳させることによって製造するこ
とができる。この方法は、特に大量生産が可能である点
より有利である。 【００４９】上記方法において用いられる遺伝子は、通
常の方法、例えばホスフアイト トリエステル法〔ネイ
チヤー（Ｎature ），３１０，１０５（１９８４）〕等
の常法に従って、核酸の化学合成により全合成すること
もできるが、ＩＬ−１βもしくはその前駆体をコードす
る遺伝子を利用するのが簡便であり、該遺伝子より、上
記化学合成手段を含む常法に従って、前記特定のアミノ
酸配列をコードする核酸配列に改変することにより容易
に製造できる。 【００５０】ＩＬ−１β又はその前駆体をコードする遺
伝子は公知（記述）であり、我々も我々の先の出願（特
願昭６０−１３８２８１号）に記したようにＩＬ−１β
をコードする遺伝子を得、これを用いて遺伝子工学的手
法でＩＬ−１βを収得するに成功した。之等の一連の遺
伝子工学的手法は後記の参考例において明らかにする。 【００５１】上記核酸（塩基）配列の改変操作も公知方
法に従えばよく、目的とするポリペプチドのアミノ酸配
列に応じて実施される〔遺伝子工学的手法としては、例
えば、Ｍolecular Ｃloning Ｃold Ｓpring Ｈarbo
r Ｌaboratory （１９８２）が参照される〕。 【００５２】例えば、ＤＮＡの切断、結合、リン酸化等
を目的とする制限酵素、ＤＮＡリガーゼ、ポリヌクレオ
チドキナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等の各種の酵素処理
等の常套手段等が採用でき、それら酵素は市販品として
容易に入手できる。之等各操作における遺伝子乃至核酸
の単離、精製も常法、例えばアガロース電気泳動法等に
従えばよい。また得られる遺伝子の複製は、一部後述す
るように通常のベクターを利用する方法に従えばよい。
また、所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片や合
成リンカーは上記した化学合成により容易に製造でき
る。尚、上記において所望のアミノ酸に対応するコドン
は自体公知でありまたその選択は任意でよく、例えば利
用する宿主のコドン使用頻度等を考慮した常法に従えば
よい〔Ｎucl. Ａcids. Ｒes. ，９，４３−７４（１
９８１）〕。またこれらの核酸配列のコドンを一部改変
するには、例えば常法どうり、１５〜３０マー程度の、
所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからな
るプライマーを用いたサイト−スペシフィック ミュー
タジエネシス（Ｓite −Ｓpecific Ｍutagenesis）〔Ｐ
roc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,８１，５６６２−５６６６（１
９８４）〕等の方法を採用することができる。 【００５３】上記方法により得られる所望の遺伝子は、
例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法〔Ｍaxam−Ｇ
ilbert, Ｍeth.Ｅnzym.,６５，４９９−５６０（１９８
０）〕やＭ１３フアージを用いるジデオキシヌクレオチ
ド鎖終結法〔Ｍessing, Ｊ．and Ｖieira,Ｊ.,Ｇene,１
９，２６９−２７６（１９８２）〕等により、その塩基
配列の決定及び確認を行なうことができる。 【００５４】上記操作及び方法の具体例は、後記参考例
及び実施例に記述するが、該方法は特に限定されず、当
業界において周知の各種方法のいずれを採用してもよ
い。 【００５５】かくして、本発明によれば前記した特定の
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする新規な
遺伝子も提供される（以下この遺伝子を「本発明遺伝
子」という）。 【００５６】本発明のポリペプチドは、上記特定の遺伝
子（本発明遺伝子）を利用し、従来公知の一般的な遺伝
子組換え技術に従い製造できる。より詳細には、上記本
発明遺伝子が宿主細胞中で発現できるような組換えＤＮ
Ａを作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該
形質転換体を培養すればよい。 【００５７】ここで宿主細胞としては、真核生物及び原
核生物のいずれをも用いることができる。該真核生物の
細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物
細胞としては、例えばサルの細胞であるＣos細胞〔Ｙ．
Ｇluzman，Ｃell,２３，１７５−１８２（１９８１）〕
やチヤイニーズ・ハムスター卵巣細胞のジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ欠損株〔Ｇ．Ｕrlaub and Ｌ．Ａ．Ｃhasin
，Ｐroc. Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,ＵＳＡ，７ ７，４２１
６−４２２０（１９８０）〕等がよく用いられている
が、之等に限定される訳ではない。脊椎動物細胞の発現
ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流
に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポ
リアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを
使用でき、これは更に必要により複製起源を保有してい
てもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初
期プロモーターを保有するｐＳＶ２dhfr〔Ｓ．Ｓubrama
ni, Ｒ．Ｍulligan and Ｐ．Ｂerg,Ｍol. Ｃell.Ｂio
l., １（９），８５４−８６４〕等を例示できるが、こ
れに限定されない。 【００５８】また真核微生物としては酵母が一般によく
用いられており、その中でもサツカロミセス属酵母が有
利に利用できる。該酵母等の真核微生物の発現ベクター
としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプ
ロモーターを持つp ＡＭ８２〔Ａ．Ｍiyanohara et a
l，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,ＵＳＡ，８０，１−５
（１９８３）〕等を好ましく利用できる。 【００５９】原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌
が一般によく用いられている。本発明では例えば該宿主
菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベク
ター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上
流にプロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガ
ーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要なＡＴＧを付
与した発現プラスミドが使用できる。上記宿主菌として
の大腸菌としては、エシエリヒア・コリ（Ｅscherichia
coli）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては
一般にｐＢＲ３２２がよく用いられるが、これに限定さ
れず、公知の各種の菌株及びベクターがいずれも利用で
きる。プロモーターとしては、例えばトリプトフアン・
プロモーター、ＰＬプロモーター、lac プロモーター、
lpp プロモーター等を使用することができ、いずれの場
合にも本発明遺伝子を発現させることができる。 【００６０】トリプトフアン・プロモーターを用いる場
合を例にとり詳述すれば、発現ベクターとしてトリプト
フアン・プロモーター及びＳＤ配列を持つベクターｐＴ
Ｍ１〔今本文男、代謝、Ｖol. ２２，２８９（１９８
５）〕を使用し、ＳＤ配列の下流に存在する制限酵素Ｃ
laＩ部位に、必要に応じてＡＴＧを付与した所望のポリ
ペプチドをコードする遺伝子を連結させればよい。 【００６１】尚、直接発現系に限らず、例えばβ−ガラ
クトシダーゼやβ−ラクタマーゼ等を利用する融合蛋白
質発現系によることもできる。 【００６２】かくして得られる発現ベクターの宿主細胞
への導入及びこれによる形質転換の方法としては、一般
に用いられている方法、例えば主として対数増殖期にあ
る細胞を集め、ＣａＣｌ2処理して自然にＤＮＡを取り
込みやすい状態にして、ベクターを取込ませる方法等を
採用できる。上記方法においては、通常知られているよ
うに形質転換の効率を一層向上させるためにＭｇＣｌ2
やＲｂＣｌを更に共存させることもできる。また、宿主
細胞をスフエロプラスト又はプロトプラスト化してから
形質転換させる方法も採用することができる。 【００６３】かくして得られる所望の形質転換株は、常
法に従い培養することができ、該培養により、所望のポ
リペプチドが生産、蓄積される。該培養に用いられる培
地としては、通常の細胞培養に慣用される各種の培地の
いずれでもよく、その具体例としては、例えばＬ培地、
Ｅ培地、Ｍ９培地等及び之等に通常知られている各種の
炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン類等を添加した培地
を例示できる。尚、上記トリプトフアン・プロモーター
を用いた場合には、一般にプロモーターが働くようにす
るためにカザミノ酸を添加した、例えばＭ９最小培地を
用いて培養することができ、該培地中には培養の適当な
時期にインドールアクリル酸等のトリプトフアン・プロ
モーターの働きを強めるための薬剤を添加することもで
きる。 【００６４】このようにして得られる活性物を含有する
培養物からの目的ポリペプチド、即ち本発明ポリペプチ
ドの精製、単離は常法に従って行なうことができる。
尚、本発明ポリペプチドを宿主から抽出するに当って
は、例えば浸透圧シヨツク法等の温和な条件を採用する
のが、その高次構造保持の面からより好ましい。 【００６５】上記精製、単離は、例えば当該ポリペプチ
ドの物理、化学的性質を利用した各種の処理操作に従い
実施することができる〔例えば「生化学データーブツク
II」pp１１７５〜１２５９、第１版第１印刷、１９８０
年６月２３日、株式会社東京化学同人発行参照〕。該方
法としては、具体的には例えば通常の蛋白沈澱剤による
処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフイー（ゲル
濾過）、液体クロマトグラフイー、遠心分離、電気泳
動、アフイニテイクロマトグラフイー、透析法、之等の
組合せ等を採用できる。 【００６６】より具体的には、上記操作は、例えば以下
のごとくして実施できる。即ち、まず培養上清より予め
目的とするポリペプチドを部分精製する。この部分精製
は、例えばアセトン、メタノール、エタノール、プロパ
ノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒
や酢酸、過塩素酸（ＰＣＡ）、トリクロロ酢酸（ＴＣ
Ａ）等の酸を蛋白沈澱剤として用いる処理、硫酸アンモ
ニウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤
を用いる処理及び／又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等
を用いる限外濾過処理等により行なわれる。之等の各処
理の操作及び条件は、通常のこの種方法のそれらと同様
のものとすればよい。 【００６７】次いで上記で得られた粗精製物を、ゲル濾
過に付すことにより目的物質の活性が認められる画分を
収得する。ここで用いられるゲル濾過剤としては、特に
限定はなく、例えばデキストランゲル、ポリアクリルア
ミドゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガ
ロースゲル、セルロース等を素材とするものをいずれも
利用できる。之等の具体例としては、セフアデツクスＧ
タイプ、同ＬＨタイプ、セフアロースタイプ、セフアク
リルタイプ（以上、フアルマシア社）、セルロフアイン
（チツソ株式会社）、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ
（バイオ−ラド社）、ウルトロゲル（ＬＫＢ社）、ＴＳ
Ｋ−Ｇタイプ（東洋曹達株式会社）等の市販品を例示で
きる。 【００６８】目的とするポリペプチドは、上記ゲル濾過
により得られる活性画分を、例えばハイドロキシアパタ
イトカラムを用いたアフイニテイークロマトグラフイ
ー、ＤＥＡＥ法、ＣＭ法、ＳＰ法等のイオン交換カラム
クロマトグラフイー、クロマトフオーカシング法、逆相
高速液体クロマトグラフイー等に付すことにより、又は
之等各操作の組合せにより更に精製することができ、均
質な物質として単離することができる。 【００６９】上記クロマトフオーカシング法は、公知の
各種方法により実施できる。カラムとしては、例えばＰ
ＢＥ９４（フアルマシア社製）等を、開始緩衝液として
は、例えばイミダゾール−塩酸等を、また溶出液として
は、例えばポリバツフアー７４（フアルマシア社製）−
塩酸（ｐＨ４．０）等を使用できる。 【００７０】上記逆相高速液体クロマトグラフイーは、
例えばＣ4ハイポアー逆相ＨＰＬＣカラム（バイオ−ラ
ド社（Ｂio−Ｒad Ｌaboratories ））等を用いて、移
動剤としてアセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）、水等及び之等の混合溶媒を用いて実施できる。 【００７１】かくして本発明ＩＬ−１β誘導体（ポリペ
プチド）を単離、収得できる。ＩＬ−１βをコードする
遺伝子から同種の遺伝子組換え操作でＩＬ−１βを収得
できる。 【００７２】得られる本発明ポリペプチド又はＩＬ−１
βは、前述した如く優れた薬理活性を有することから、
前述した各種の医薬用途に有用な医薬製剤とすることが
できる。斯かる医薬製剤にはたとえば抗体産生やワクチ
ン効果の増強並びに免疫不全症の治療等の免疫刺激剤、
抗腫瘍剤、サイトカイン類の産生促進剤、抗炎症剤、放
射線障害防止剤、日和見感染症治療剤等が包含される。
該医薬製剤は、通常本発明ポリペプチド又はＩＬ−１β
の薬理有効量と共に適当な医薬製剤担体を配合して製剤
組成物の形態に調製される。該製剤担体としては使用形
態に応じた製剤を調製するのに通常慣用される充填剤、
増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤等の賦形
剤乃至は希釈剤をいずれも使用できる。製剤組成物の形
態は、これが本発明ポリペプチド又はＩＬ−１βを効果
的に含有する状態であれば、特に限定はなく、例えば錠
剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の固剤であつてもよいが、
通常液剤、懸濁剤、乳剤等の注射剤形態とするのが好適
である。またこれは使用前に適当な担体の添加によって
液状となし得る乾燥品とすることもできる。之等の製剤
組成物はいずれも常法に従い調製され得る。 【００７３】得られる医薬製剤は、該製剤組成物の形態
に応じた適当な投与経路、例えば注射剤形態の医薬製剤
は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により
投与され、固剤形態の医薬製剤は、経口乃至は経腸投与
され得る。医薬製剤中の有効成分の量及び該製剤の投与
量は、該製剤の投与方法、投与形態、使用目的、之を適
用される患者の症状等に応じて適宜選択され、一定では
ないが、通常有効成分を約１〜８０重量％程度含有する
製剤形態に調製して、この製剤をこれに含有される有効
成分量が一日成人一人当り約０．１μｇ〜１０ｍｇ程度
となる範囲で投与するのが望ましい。該投与は、一日１
回である必要はなく一日３〜４回に分けることもでき
る。 【００７４】 【実施例】以下、ＩＬ−１βを製造する参考例及び本発
明誘導体を製造する実施例を挙げて、本発明を更に詳し
く説明する。 【００７５】下記各例では、本発明誘導体に関して、之
等を簡略化するため、以下の略号を付した。 【００７６】また、以下の各例において各種生理活性
は、次の方法により測定した。 【００７７】 【化８】【００７８】 【化９】【００７９】 【化１０】【００８０】 【化１１】【００８１】 【化１２】 【００８２】〈活性の測定〉 （１）ＩＬ−１活性の測定 オツペンハインら（Ｊ．Ｊ．Ｏppenhein et al）の方法
〔Ｊ．Ｉmmunol.,１１６，１４６６（１９７６）〕に従
い、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ系マウスの胸腺細胞を利用して測定
したＬＡＦ活性により表示した。 【００８３】（２）ＧＩＦ活性の測定 ９６ウエルマイクロプレート（コーニング社）に種々の
濃度に希釈した供試液０．１ｍｌを入れ、次に各ウエル
にヒトメラノーマ細胞Ａ３７５を２×１０4個／ｍｌの
濃度で含有する１０％ＦＣＳを含むイーグルスＭＥＭ浮
遊液０．１ｍｌを加え、炭酸ガス培養器（ナフコ社製）
内で４日間培養する。培養終了後、０．０５％ニユウト
ラルレツド（和光純薬社製）０．０５ｍｌを各ウエルに
加え、３７℃で２時間培養する。上澄液を除去した後、
リン酸緩衝生理食塩水０．３ｍｌを各ウエルに静かに加
えてウエルを洗浄する。洗浄液を除去した後、各ウエル
にリン酸１ナトリウム−エタノール等量混合液０．１ｍ
ｌを加え、マイクロミキサーで数分間振盪し、細胞内に
取込まれた色素量を、９６ウエル−マイクロタイトレー
シヨンプレート用光度計（タイターチエツクマルチスキ
ヤン、フロウラボラトリーズ社製）を用いて、吸光度５
４０ｍμにて測定し、増殖抑制活性を求める。対照群
（コントロール群）の細胞増殖の５０％抑制を示す試験
群、即ち対照群の吸光度測定値の１／２の吸光度測定値
を示す試験群、の希釈率の逆数をとり、これをＧＩＦ活
性単位とする。従つて例えばこの ＧＩＦ活性が１０単
位の場合、この供試液は１０倍希釈してもなお細胞増殖
を５０％抑制する活性を有する。 【００８４】参考例１ プラスミドｐＧＩＦ−αの製造 (1)ヒトリンパ球の調製 ヒト末梢血を採血し、フイコール・ハイパークの密度勾
配遠心法〔Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol．４，８０８（１９７
４）〕により末梢血リンパ球１．９×１０10個を得た。 【００８５】このリンパ球を４×１０8／ｍｌの細胞濃
度で、ヒト血清５％を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁
させ、直径９cmのシヤーレに分注後、５％炭酸ガス中、
３７℃で１時間培養した。その後、シヤーレ底部に付着
していない細胞を除去し、ウシ胎児血清１０％、ＴＰＡ
（シグマ（Ｓigma）社製）０．５ng／ｍｌ及びＬＰＳ
（デイフコ（Ｄifco）社製）１０μｇ／ｍｌを含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地にて細胞を刺激した。５％炭酸ガス
中、３７℃で４時間培養した後、ＰＢＳ及び０．０２％
ＥＤＴＡにて付着性リンパ球９×１０8個を得た。 【００８６】(2) mＲＮＡの調製 上記(1)で得たヒト付着性リンパ球を、６Ｍ−グアニジ
ンチオシアネート溶液（６Ｍ−グアニジンイソチオシア
ネート、５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、
０．１Ｍ２−メルカプトエタノール、０．５％ザルコシ
ル（Ｓarkosyl ）３０ｍｌにて溶解後、Ｇ１８Ｇ注射針
をつけた５０ｍｌ注射筒を用いてＤＮＡをせん断した。
この溶液に塩化セシウム（Ｃs Ｃｌ）１２ｇを添加し、
完全に溶解させた後、その６．４ｍｌずつを５．７Ｍ
Ｃs Ｃｌ（５．７Ｍ Ｃs Ｃｌ−０．１ＭＥＤＴＡ）４
ｍｌに重層し、ベツクマンローター（Ｂeckman ＳＷ−
４０Ｔi rotor ）にて２５℃で３１５００rpm で２０時
間遠心した。沈澱したＲＮＡのペレツトを７０％エタノ
ールで洗浄後、ＴＥ溶液（１０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ
７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、１／９容の３Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び２．２容のエタノー
ルを加えて、−７０℃で１時間放置した。４℃にて１５
０００rpm で２０分間遠心し、ＲＮＡを回収し、ＴＥ溶
液に溶解させた。 【００８７】かくして付着性リンパ球約９×１０8細胞
から、全ＲＮＡ２５０μｇを得た。 【００８８】次に、上記で得たＲＮＡからｍＲＮＡを取
得するために、オリゴ（ｄＴ）−セルロース（Ｃollabo
rative Ｒesearch Ｉnc．）を用いてカラムクロマトグ
ラフイーを行なつた。吸着は、１０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ７．５），０．５ＭＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ
にて行ない、カラムを同溶液にて洗浄後、１０ｍＭトリ
スＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ ＥＤＴＡにてＲＮ
Ａを溶出させた。 【００８９】この結果、溶出されたm ＲＮＡ量は、１
７．５μｇであつた。 【００９０】(3)ｃＤＮＡの調製 上記(2)で得たｍＲＮＡから、ｃＤＮＡを、インビトロ
で合成し、オカヤマ−ベルグのプラスミドベクター〔Ｏ
kayama，Ｈ．and Ｂerg,Ｐ.,Ｍol．Ｃell.Ｂiol., ２，
１６１（１９８２）〕を用いて組換え体ＤＮＡを作成
し、これをエシエリヒア・コリにトランスホームして、
ｃＤＮＡライブラリーを作製した。各手法は次の通りで
ある。 【００９１】(3)−１）ベクター・プライマーとリンカ
ーＤＮＡの調製 ｐＢＲ３２２−ＳＶ４０（０．７１〜０．８６）ＤＮＡ
４００μｇを、ＫpnＩ（ＮＥＢ）７００単位で、３７℃
で５時間消化し、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
４０μｌと１０％ＳＤＳ２０μｌとの混液で反応を停止
させた後、等容のフエノール−クロロホルム（１：１）
で抽出し、エタノールにてＤＮＡを沈澱させ、遠心後、
７０％エタノールで洗浄し、ＤＮＡを回収した。得られ
たＤＮＡを１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム，３０ｍＭ
トリスＨＣｌ（ｐＨ６．８），１ｍＭＣｏＣｌ2，０．
１ｍＭＤＴＴ及び０．２５ｍＭｄＴＴＰ（α−32Ｐ−ｄ
ＴＴＰ ０．５μＣi を含む）２００μｌに溶解させ、
ターミナルトランスフエラーゼ（ＴＴase ，ＰＬ）４０
０単位にて３０分間ｄＴ鎖の伸長を行なわせ、０．２５
Ｍ ＥＤＴＡ２０μｌと１０％ＳＤＳ １０μｌとを加
えて反応を停止させ、フエノール−クロロホルム抽出を
４回繰返した後、エタノール沈澱にてＤＮＡを回収し
た。この結果、ｄＴ鎖は約７０塩基伸長された。 【００９２】次に、上記で得たＤＮＡを、ＨpaＩ（ＮＥ
Ｂ）１７単位を用いて、３７℃で６時間消化し、アガロ
ース（低融点アガロース，ＢＲＬ，１％）電気泳動にて
約２．７kbのＤＮＡ断片の回収を行なつた。 【００９３】電気泳動後、エチジウムブロマイド０．５
μｇ／ｍｌにてＤＮＡを染色し、ＵＶ照射下で約２．７
kbの断片を含むアガロースを切り出し、５倍容の２０ｍ
ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡを加
え、６５℃で５分間でアガロースを溶解後、フエノール
抽出、フエノール−クロロホルム（１：１）抽出及びク
ロロホルム抽出を順次行ない、エタノール沈澱にてＤＮ
Ａを回収した。 次にオリゴ（ｄＡ）セルロースカラム
クロマトグラフイーでベクタープライマーＤＮＡの精製
を行なつた。上記ＤＮＡを１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．３）−１ｍＭ ＥＤＴＡ−１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液１
ｍｌに溶かし、氷冷した後、同緩衝液で平衡化したカラ
ムに載せ、同緩衝液１ｍｌで洗浄後、室温に戻して、１
０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．３）−１ｍＭ ＥＤＴＡ
で、ＤＮＡを溶出した。溶出のピーク画分を集め、エタ
ノール沈澱にてＤＮＡを回収後、１０m ＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ７．３）−１ｍＭ ＥＤＴＡ１００μｌに溶か
し、４℃で保存した。 【００９４】リンカーＤＮＡを次の通り調製した。即
ち、 ｐＢＲ３２２−ＳＶ４０（０．１９〜０．３２）
ＤＮＡ１００μｇを、ＰstＩ（ＮＥＢ）１２０単位で、
３７℃下、１．５時間消化後、反応を停止させ、フエノ
ール−クロロホルム抽出、エタノール沈澱を行なつた。
ＤＮＡを回収し、１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３
０ｍＭトリスＨＣｌ （ｐＨ６．８）、１ｍＭ ＣｏＣ
ｌ2、０．１ｍＭ ＤＴＴ、０．２５ｍＭｄＧＴＰ（１
μＣi のα−32Ｐ−ｄＧＴＰを含む）５０μｌに溶解
し、ＴＴase ６０単位を２０分間作用させた。この結
果、１８残基のｄＧ鎖が付加された。反応停止後、ＤＮ
Ａを回収し、Ｈind III（宝酒造）５０単位で消化し、
前記したようにアガロース（１．８％）電気泳動で約
０．２８kbのＤＮＡ断片を回収し、２．３μｇのリンカ
ーＤＮＡを得た。 【００９５】(3)−２）ｃＤＮＡの合成とｃＤＮＡライ
ブラリーの作製 ＲＮＡ５μｇを減圧乾燥した後、５ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ８．３）１０μｌに溶解し、６５℃で５分間加熱
した。直ちに３７℃に移し、反応混合液２０μｌ（５０
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、８ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、３０ｍＭ ＫＣｌ、０．３ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ
ｄＮＴＰ、１０μＣi α−32Ｐ−ｄＣＴＰ）を加え、
５分間３７℃にて保温した。 【００９６】ＲＴase（リバーストランスクリプター
ゼ、生化学工業社製）１０単位を加え、３７℃で１５分
間反応させた後、再度ＲＴase １０単位を加え、更に１
５分間保温した。０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐ８．０）
２μｌと１０％ＳＤＳ１μｌとを加えて反応を停止させ
た後、フエノール−クロロホルム抽出を行ない、４Ｍ酢
酸アンモニウム２０μｌとエタノール８０μｌとを加
え、１５分間−７０℃で凍らせた後、室温で融解し、１
５０００rpm、４℃で１０分間遠心し、沈澱させた。沈
澱を１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．３）２０μｌに溶
かし、４Ｍ酢酸アンモニウム１９μｌとエタノール８０
μｌとを加えて再沈澱させた。 【００９７】沈澱を回収し、７０％エタノールで洗つた
後、１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリス
ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１ｍＭ ＣｏＣｌ2、０．１ｍ
ＭＤＴＴ、０．２μｇポリＡ及び６６μＭ〔α−32Ｐ〕
ｄＣＴＰ（１０μＣｉ）１５μｌに溶解した。ＴＴase
（Ｐ．Ｌ．）１８単位を加え、３７℃で５分間反応させ
た後、０℃に急冷し、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ１．３μｌ
と１０％ＳＤＳ ０．６５μｌとで反応を停止させ、フ
エノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行な
つた。 【００９８】沈澱を遠心して回収後、Ｈind III（宝酒
造）４単位で３７℃で２時間消化し、反応停止後、フエ
ノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈澱を行なつ
た。沈澱を回収後、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．
３）及び１ｍＭ ＥＤＴＡの１０μｌに溶かし、エタノ
ール３μｌを加え、−２０℃で保存した。 【００９９】上記で得た試料１μｌをリンカーＤＮＡ５
ngと共に、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ−０．１Ｍ ＮａＣｌ １０μｌ中で、６
５℃で２分間、次いで４２℃で３０分間保温した後、０
℃に冷却した。これに２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、
０．１Ｍ ＫＣｌ、０．１ｍＭ β−ＮＡＤ、５０μｇ
／ｍｌＢＳＡ及び６単位／ｍｌエシエリヒア コリＤＮ
Ａリガーゼの混合溶液を９０μｌ加え、全液量を１００
μｌとし、１２℃で一夜保存した。 【０１００】次いで、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μ
ｌ、 １０ｍＭ ＮＡＤ ０．５６μｌ、エシエリヒア
・コリＤＮＡポリメラーゼＩ（ベーリンガーマンハイム
社製）０．５μｌ及びＲＮase Ｈ（ＰＬ）０．２μｌを
加え、１２℃及び２５℃で順次１時間ずつ保温した後、
−２０℃で凍結保存した。 【０１０１】エシエリヒア コリＨＢ１０１株を、ＬＢ
培地（バクト−トリプトン１０ｇ、バクト−イースト抽
出物５ｇ及びＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）にて、ＯＤ550＝
０．４５まで培養し、５分間氷冷後、４℃で８０００rp
mで５分間遠心して菌体を回収した。菌体のペレツトを
氷冷した３０ｍＭ酢酸カリウム、１００ｍＭ ＲｂＣ
ｌ、１０ｍＭ ＣaＣｌ2、５０ｍＭ ＭｎＣｌ、１５％
グリセリンに懸濁させ、０℃で５分間保ち、４℃、８０
００rpm 、５分間遠心し、得られた菌体を、１０ｍＭ
ＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホニツクアシツ
ド）、７５ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭ ＲｂＣｌ、１
５％グリセリンに再度懸濁させ、０℃にて１５分間保温
して、コンピテント細胞を作製した。かくして得られた
コンピテント細胞は、その後−７０℃で保存した。 【０１０２】凍結菌液を室温で融解し、４００μｌの菌
液に対して上記ＤＮＡ試料２０μｌを加え、３０分間０
℃に放置した後、４２℃で９０秒間熱シヨツクを与え、
再び０℃で１〜２分間静置した。これにＬＢ培地２ｍｌ
を加え、３７℃で３０分間保温し、５０容のＬＢ培地に
植菌し、３７℃で６時間培養した後、５０μg ／ｍｌに
なるようにアンピシリンを加え、更に一夜培養し、ｃＤ
ＮＡライブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリ
ーは、５０％グリセリン中で−２０℃にて保存した。 【０１０３】(3)−３）合成プローブの作製 ＩＬ−１βをコードするｃＤＮＡを有する形質転換株の
選出のためのプローブとして、下記核酸配列に対する相
補的な塩基配列（最下段に示す）を、以下の方法により
合成した。 【０１０４】 【化１３】 【０１０５】即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルメチルホスホロ
アミダイト誘導体を縮合ユニツトとして用いた、固相ホ
スフアイト トリエステル法〔Ｎature,３１０，１０５
（１９８４）〕にて、自動合成機（３８０Ａ ＤＮＡ
Ｓynthesizer，Ａpplied Ｂiosystems Ｉnc.,Ｆoster
Ｃity,Ｃalifornia ９４４０４，ＵＳＡ）を用いて、目
的とする完全保護ＤＮＡを合成した。続いて該完全保護
ＤＮＡを２８％アンモニア水で５５℃で１０時間処理す
ることにより、５’末端のＯＨ基に結合している保護基
としてのＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル）基以外の保護
基（Ａ、Ｇ、Ｃのアミノ基のアシル基をさす）を脱保護
させ、部分保護ＤＮＡ（ＤＭＴｒ体）を得た。次いでこ
のＤＭＴｒ体をＣ18を担体とする逆相ＨＰＬＣにより精
製した後、８０％酢酸で室温で１０分間処理して上記Ｄ
ＭＴｒ基を脱離させ、続いて得られる塩基を、７Ｍ尿素
を含む１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びバイ
オ−ゲルＰ−３０（バイオ−ラド社製）により精製し
て、目的のＤＮＡ（６０mer）を得た。 【０１０６】上記で得たＤＮＡ６μｇを、５０μｌの反
応溶液（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、０．２ｍｇ／ｍｌ子牛胸腺ＤＮＡ、５０μＣi〔γ
−21Ｐ〕−ＡＴＰ）中で、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ（宝酒造）１２単位と、３７℃にて１時間反応させ、
ＤＮＡの５′末端をラベルした。ラベルされたＤＮＡと
未反応の32Ｐを分別するために、バイオゲルＰ−３０
（バイオ−ラド社）によるカラムクロマトグラフイーを
行なつた。ラベルされたＤＮＡ画分を１／９容の３Ｍ酢
酸ナトリウムと２．５容のエタノールにて沈澱させ、遠
心して、回収後、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）
−１ｍＭ ＥＤＴＡ ４００μｌに溶解し、−２０℃で
保存した。 【０１０７】得られたプローブの比活性は１０7cpm ／
μｇＤＮＡ以上であつた。 【０１０８】(3)−４）ｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニング アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地上に径
８０mmのニトロセルロースフイルター（ミリポアＨＡＩ
Ｆ０８２５０）を置き、この上にフイルター当り５００
０コロニーになるように希釈した前記ｃＤＮＡライブラ
リー菌液をまき、３７℃にて一夜培養した。フイルター
は、合計２４枚を作製した。 【０１０９】コロニーの出現したフイルターに新しいニ
トロセルロースフイルターを載せることによつて、レプ
リカフイルターを作製した。 【０１１０】元のフイルター（マスターフイルター）
を、４℃にて保存し、レプリカフイルターを、上記した
寒天培地上で３７℃で６時間培養後、クロラムフエニコ
ール２００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地上に移し替
え、３７℃で一夜培養した。 【０１１１】フイルターを、０．５Ｎ ＮａＯＨ、１Ｍ
トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１ＭトリスＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）−１．５Ｍ ＮａＣｌの順で処理し、風乾
後、８０℃真空下で２時間ベーキングを行なつた。 【０１１２】ベーキング済みのフイルターを、１．２Ｍ
ＮａＣｌ、０．１２Ｍクエン酸３ナトリウム、１０ｍ
ｇ／ｍｌフイコール（Ｆicoll ）、１０ｍｇ／ｍｌポリ
ビニルピロリジン、１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１％
ＳＤＳ及び０．１ｍｇ／ｍｌサルモン スペラム（Ｓal
mon Ｓperm）ＤＮＡの２０ｍｌ中で軽く振盪しながら、
６８℃にて一夜保温した。溶液を１．２Ｍ ＮａＣｌ、
０．１２Ｍクエン酸３ナトリウム、１０ｍｇ／ｍｌフイ
コール（Ｆicoll ）、１０ｍｇ／ｍｌポリビニルピロリ
ジン、１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１％ＳＤＳ及び１
０6cpm ／ｍｌプローブに替え、４２℃で一昼夜軽く振
盪し、ハイブリダイゼーシヨンを行なつた。 【０１１３】ハイブリダイゼーシヨンの終わつたフイル
ターを取り出し、１．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１２Ｍクエ
ン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳにて室温で３回洗浄
し、その後、６０℃で同溶液にてフイルターのバツクグ
ラウンドのカウントがＧＭサーベイメーターで２００cp
mになるまで洗浄した。 【０１１４】フイルターを風乾後、増感紙を用いてＸ線
フイルム（フジＲＸ）に−７０℃にて２日間オートラジ
オグラムを行なつた。 【０１１５】フイルムを現像後、シグナル領域に存在す
るコロニーをマスターフイルターよりかき取り、上記の
方法を繰返してポジテイブシグナルを有するコロニーの
単離を行ない、強いシグナルを有するクローンＩ−２を
単離した。 【０１１６】(3)−５）クローンの解析 クローンＩ−２の有するプラスミドｐＧＩＦ−αのｃＤ
ＮＡの制限酵素地図を作製した。 【０１１７】その結果を図１に示す。 【０１１８】図１よりｃＤＮＡ中には、ＮcoＩ（日本ジ
ーン）、Ｈind III （日本ジーン）、ＰvuII（日本ジー
ン）及びＡccＩ（日本ジーン）により切断される個所が
それぞれ１個所ずつ存在し、５’末端よりその順序で之
等制限酵素による切断個所が存在していることが確認さ
れた。また、ｃＤＮＡの長さは、約１．５kbであり、分
子量約１８kdのＩＬ−１を充分にコードできることが判
った。 【０１１９】次に、ｐＧＩＦ−αのｃＤＮＡの塩基配列
を、マキサム−ギルバートの化学修飾法及びＭ１３フア
ージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法にて決定
した。その結果を次式に示す。 【０１２０】 【化１４】【０１２１】 【化１５】【０１２２】 【化１６】【０１２３】 【化１７】【０１２４】上記図より、合成プローブと相補的な領域
が５’末端より３１２番目〜３７１番目に存在（図に下
線を付して示す）し、ヒトコドン使用頻度から導いた塩
基配列に７５％の相同性を示した。 【０１２５】また、ｐＧＩＦ−αのc ＤＮＡ中の最長の
リーデイングフレーム（reading frame）を検索したと
ころ、５’末端より５７番目から７７１番目の領域であ
る。 【０１２６】上記ヒトＩＬ−１前駆体蛋白質をコードす
るｃＤＮＡを有するプラスミドｐＧＩＦ−αは、これを
エシエリヒア・コリ（Ｅscherichia coli ）χ１７７６
株に保有させ、該株を工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）に、「Ｅscherichia coli χ１７７６／ｐＧ
ＩＦ−α」なる名称で、微工研条寄第９４８号（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−９４８）として寄託されている 参考例２ ポリペプチドＩの製造 上記参考例１で得たプラスミドｐＧＩＦ−αを、制限酵
素ＡccＩ及びＣlaＩにより切断した後、約１．２キロベ
ースペアー（kbp）のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気
泳動により単離精製した。このＤＮＡ断片をＤＮＡポリ
メラーゼＩ（クレノー断片）を用いて、制限酵素ＡccＩ
及びＣlaＩ切断部分を平滑末端とした。 【０１２７】一方ＢamＨＩリンカー（ 5’HOＣＧＧＡＴ
ＣＣＧOH 3’）の５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼによりリン酸化し、これを先の平滑末端としたＤＮ
Ａ断片に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した後、制
限酵素ＢamＨＩで切断し、更に制限酵素ＭspＩで切断
し、得られた反応物をアガロースゲル電気泳動に付し、
約５４０ベースペア（bp）のＭspＩ−ＢamＨＩ ＤＮＡ
断片を単離精製した次に、下記オリゴデオキシヌクレオ
チド（Ｉ）及び（II）を以下のようにして合成した。 【０１２８】 5’HOＣＧＡＴＡＡＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＡＣＧＴＴＣＴＣＴＧＡＡＣＴＧＣ ＡＣＴＣＴＣOH 3’ （Ｉ） 5’HOＣＧＧＡＧＡＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＡＣＡＧＧＡＧＣ ＣＡＴＴＡＴOH 3’ （II） 即ち、マクロポーラスシリカに結合した５’−Ｏ−ジメ
トキシトリチル及びＮ−保護デオキシヌクレオシド（ア
プライド バイオシステムズ社製）を出発原料とし、
３’側より５’側へ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル及び
Ｎ−保護デオキシモノヌクレオシド−３’−ホスホアミ
ダイトを縮合単位として、自動合成機（アプライド バ
イオシステムズ社製、３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザ
ー）を用いて順次、ヌクレオチド鎖を延長させた。続い
てチオフエノールを用いた処理による脱メチル化及び２
８％アンモニアを用いた室温での処理により、シリカよ
りヌクレオチドを脱離させ、完全保護オリゴヌクレオチ
ドを得た。以上の操作はすべて自動合成機を用いて行な
つた〔Ｈunkapiller等、Ｎature ，３１０，１０５（１
９８４）〕。 【０１２９】次いで、得られた完全保護オリゴヌクレオ
チドを２８％アンモニア水２ｍｌで５５℃で１０時間処
理してＮ−保護基を脱離させ、５’−Ｏ−ジメトキシト
リチルオリゴヌクレオチドを得た。この１／５量を用い
て、ＯＤＳ（山村化学研究所社製）を担体とする逆相高
速液体クロマトグラフイーにより精製後、８０％酢酸１
５０μｌで室温で２０分間処理して粗オリゴヌクレオチ
ドを得た。これをＯＤＳを担体とする逆相高速液体クロ
マトグラフイーにより更に精製して、目的とするオリゴ
ヌクレオチドを得た。 【０１３０】上記で合成した合成オリゴデオキシヌクレ
オチド（Ｉ）及び（II）の各５’末端を、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼによりリン酸化し、上記で得たＭspＩ
−ＢamＨＩ ＤＮＡ断片に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結後、制限酵素ＢamＨＩ及びＣlaＩで切断し、得ら
れた反応物をアガロースゲル電気泳動に付して、約５８
０bpのＣlaＩ−ＢamＨＩＤＮＡ断片を単離精製した。 【０１３１】他方、プラスミドp ＴＭＩ〔今本文男，代
謝，Ｖol. ２２，２８９（１９８５）〕を、制限酵素Ｂ
amＨＩ及びＣlaＩで切断後、アガロースゲル電気泳動に
よりtrp プロモーター領域を含む約４．４kbp のＤＮＡ
断片を単離精製した。このＤＮＡ断片と、先に調製した
約５８０bpのＣlaＩ−ＢamＨＩＤＮＡ断片とを、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結して所望のポリペプチドＩ発現用プ
ラスミドp trp ＧＩＦ−αを得た。 【０１３２】該プラスミドを、エシエリヒア・コリーＨ
Ｂ１０１にトランスフオームさせ、目的のトランスフオ
ーマントを、ボイリング法（boiling method）により得
られるプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により選択した
〔Ｔ．Ｍaniatis ，Ｅ．Ｆ．Ｆritsch and Ｊ．Ｓambr
ook ，Ｍolecular Ｃloning，pp３６６，Ｃold Ｓprin
g Ｈarfor Ｌaboratory,（１９８２）〕。 【０１３３】以上の概略を図２に示す。 【０１３４】また上記トランスフオーマントに組込まれ
たプラスミドp trp ＧＩＦ−αは、これをエシェリヒア
・コリχ１７７６にトランスフオームさせ、該形質転換
体を、「Ｅscherichia coliχ１７７６／p trp ＧＩＦ
−α」なる名称で１９８５年１２月１２日に工業技術院
微生物工業研究所に微工研条寄第９４９号（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−９４９）として寄託した。 【０１３５】（２）形質転換体の培養 上記形質転換体（エシェリヒア・コリＨＢ１０１／p tr
p ＧＩＦ−α）を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及びＬ
−トリプトフアン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（１％
トリプトン、０．５％酵母エキス及び０．５％Ｎa Ｃ
ｌ）１０ｍｌ中で、３７℃で一晩振盪培養し、この１ｍ
ｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌ及び１％カザミノ酸を
含むＭ９最小培地（０．６％Ｎａ2ＨＰＯ4、０．３％Ｋ
Ｈ2ＰＯ4、０．０５％ＮａＣｌ、０．１％ＮＨ4Ｃｌ、
２ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２％グルコース及び０．１ｍ
Ｍ ＣａＣｌ2）５０ｍｌに植菌し、３７℃で振盪培養
し、５５０nmでの吸光度（Ｏ．Ｄ．）が１．０となつた
時点で菌体を集め、１５％シユークロース−５０ｍＭト
リスＨＣｌ（ｐＨ８．０）−５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）の溶液５ｍｌに懸濁させ、１０ｍｇ／ｍｌリゾ
チーム〔１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶解し
た溶液〕５００μｌを加え、更に０．３％トリトンＸ１
００−１８７．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）−１５
０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）の溶液５ｍｌを加
え、室温で１５分間放置後、更によく懸濁させ、遠心分
離によつてＧＩＦ活性を有する菌体抽出物上清を得た。 【０１３６】（３）ポリペプチドＩの精製イオン交換クロマトグラフイー（ＣＭ−ＨＰＬＣ） 上記で得た菌体抽出物上清を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５．５）で透析後、ギルソンハイパーフオー
マンス リキツド クロマトグラフイー システム（ギ
ルソン（Ｇilson ）社製）によるイオン交換クロマトグ
ラフイー（ＣＭ−ＨＰＬＣ）にかけた。その条件は次の
通りである。カラム：ＩＥＸ−５３５ＣＭ（６．０×１
５０mm、東洋曹達社製）溶離液：Ａ液＝５０ｍＭ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ５．５、Ｂ液＝０．５Ｍ ＮａＣｌ含有
５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）流 速：０．５
ｍｌ／分 フラクシヨン容積： リテンシヨンタイム ０〜 ６０分…２ｍｌ／４分／チユーブ ６０〜１２０分…０．５ｍｌ／分／チユーブ １２０〜１８０分…２ｍｌ／４分／チユーブ 逆相高速液体クロマトグラフイー 上記ＣＭ−ＨＰＬＣで得たリテンシヨンタイム９０〜９
１分の画分を、次いで逆相高速液体クロマトグラフイー
に付した。その条件は、次の通りである。 【０１３７】カラム：Ｃ4ハイポアー逆相カラム（ＲＰ
３０４）バイオ−ラド社、直径４．６×２５０ｍｍ溶離
液：Ａ液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ液＝アセトニトリル：１
％ＴＦＡ（９：１） 流 速：１ｍｌ／分 チヤートスピード： リテンシヨンタイム ０〜５０分…５分／ｃｍ ５０〜８０分…２分／ｃｍ フラクシヨン容積：２ｍｌ／２分／チユーブ リテンシヨンタイムが６３．９〜６５．３分に、ＧＩＦ
活性に一致する単一の蛋白の吸光度ピークを示す目的の
ポリペプチドＩが得られた。 【０１３８】得られたポリペプチドＩは、ＩＬ−１活性
を有し、その比活性は、ＧＩＦ活性として２．７×１０
7単位／ｍｇ蛋白であった。 【０１３９】（４）ポリペプチドＩの同定ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ） Ｌaemmli，Ｕ．Ｋ．の方法〔Ｎature ，２７７，６８０
（１９７０）〕に従い、上記（３）で得たポリペプチド
ＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なつた。その条件は次の通り
である。 【０１４０】試 料：上記逆相高速液体クロマトグラフ
イーににおけるポリペプチドＩ画分を乾固した後、ラエ
メリーのサンプル バツフアー〔１／２０体積の２−メ
ルカプトエタノールを含む（２ＭＥ+）又は含まない
（２ＭＥ-）〕に溶解し、１００℃で４分間処理した。 【０１４１】ゲル：厚さ１．５mmの１５％ポリアクリル
アミドゲルを使用した。 【０１４２】電気泳動装置：バイオ−ラド（Ｂio−Ｒa
d）社製プロテアンを用いた。 【０１４３】泳動条件：４０ｍＡの定電流で２時間泳動
させた。 【０１４４】泳動後のゲルをバイオ−ラド社製シルバー
スタインキツト（Ｓilver stain kit ）を用いて染色し
た。その結果、ポリペプチドＩは２ＭＥ+下においては
約１７Ｋの位置に、また２ＭＥ-下においては約１７．
５Ｋの位置にそれぞれ単一のバンドとして泳動された。 【０１４５】等電点電気泳動法（ＩＥＦ） ポリペプチドＩの等電点電気泳動を、ｐＨ範囲３．５〜
９．５のアンフオラインＰＡＧプレート（ＬＫＢ社製）
及びモデル１４１５（バイオ−ラド社製）を用いて行な
つた。その条件は次の通りである。 【０１４６】試 料：前記（３）で得たポリペプチドＩ
の０．０３７μｇ、０．０７４μｇ及び０．７４μｇの
各々、及び以下のマーカープロテイン（ｐＩマーカープ
ロテイン）の計４レーンを使用した。 【０１４７】〈マーカープロテイン〉アミログルコシダ
ーゼ（３．５０）、大豆トリプシンインヒビター（４．
５５）、β−ラクトグロブリンＡ（５．２０）、ウシ
カルボニツク アンヒドラーゼ（bovine carbonic anhy
drase ）Ｂ（５．８５）、ヒト カルボニツク アンヒ
ドラーゼ（human carbonic anhydrase）Ｂ（６．５
５）、ウマ ミオグロビン−アシデイツクバンド（hors
e myoglobin-acidic band ）（６．８５）ウマ ミオグ
ロビン−ベイシツクバンド（horse myoglobin-basic ba
nd）（７．３５）、レンチル レクチン−アシデイツク
バンド（lentil lectin-acidic band ）（８．１５）、
レンチル レクチン−ミドルバンド（lentillectin-mid
dle band）（８．４５）、レンチル レクチン−ベイシ
ツクバンド（lentil lectin-basic band）（８．６５）
及びトリプシノーゲン（９．３０）。 【０１４８】電極液：陽極液＝１Ｍ Ｈ3ＰＯ4 陰極液＝１Ｍ ＮａＯＨ 泳動条件：定電力１Ｗ／ｃｍゲル幅で９０分間冷却下
（１０℃）に泳動させた。 【０１４９】染 色：染色は、シルバー スタイン キ
ツトで行なつた。 【０１５０】上記泳動後、ゲルを１ｃｍ間隔でスライス
し、蒸留水１ｍｌにて振盪抽出（２日）し、ｐＨを測定
し、等電点を算出した。 【０１５１】その結果、ポリペプチドＩの等電点（ｐ
Ｉ）は６．８±０．１であり、この位置に単一のバンド
として泳動された。 【０１５２】アミノ酸組成比 上記（３）の逆相高速液体クロマトグラフイーにより得
られたポリペプチドＩ画分の３０μｌを、１２ｍｍ×１
２０ｍｍのパイレツクス製肉厚硬質試験管の底部に注意
深く入れ、水酸化ナトリウム粒を入れたデシケーターに
て減圧乾燥した。乾燥試料の入つた試験管に４Ｎ−メタ
ンスルホン酸〔０．２％の３−（２−アミノエチル）イ
ンドール含有、ピアース（Ｐierce）社製〕５０μｌを
加え、０．１〜０．２mmＨgで１分間脱気後、減圧封管
した。加水分解は１１８℃のヒーター中で２４時間を要
して行なつた。開管後、４Ｎ−水酸化ナトリウム４６μ
ｌで中和し、希釈用クエン酸緩衝液で４５０μｌとし
た。 【０１５３】アミノ酸分析は、アミノ酸アナライザー
（日立製作所製、日立８３５型分析計）を用い、上記試
料溶液２５０μｌを注入して行なつた。分離されたアミ
ノ酸は、オルトフタルアルデヒド法で検出した。また定
量は、試料の前後に分析した標準アミノ酸で作成した検
量線によつて行なつた。 【０１５４】その結果を、Ｐheを基準（９モル）とし
て、各アミノ酸の含有モル比で下記第１表に示す。尚、
上記分析条件下においては、Ｐro及びＣysは測定できな
い。またＳer、Ｔhr及びＭetについては、上記分析条件
下での回収率を（）内に示した。 【０１５５】第 １ 表ア ミ ノ 酸 モ ル 比 Ａsp及び／又はＡsn １７．１ Ｓer １０．９（８０％） Ｔhr ５．４（９０％） Ｇlu及び／又はＧln ２３．８ Ｇly ８．３ Ａla ５．０ Ｖal １０．８ Ｍet ５．５（９０％） Ｉle ４．９ Ｌeu １５．１ Ｔyr ３．９ Ｐhe （ ９ ） Ｌys １４．９ Ｈis ０．９ Ｔrp ０．８ Ａrg ３．０アミノ酸配列 上記（３）の逆相高速クロマトグラフイーで得たポリペ
プチドＩ画分の１５０μｌを、アプライドバイオシステ
ムズ社製プロテインシークエンサーにて分析した。生じ
たＰＴＨ−アミノ酸を、３３％アセトニトリル水溶液１
００〜５０μｌにて適宜希釈し、その５μｌをウオータ
ーズ７１０Ｂ型オートサンプラーにて注入した。クロマ
トグラフイーのシステムは、ベツクマン１１２型ポンプ
２台を、４２１型コントローラーで作働させた。カラム
はウルトラスフエアーＯＤＳ−５μm の充填された２ｍ
ｍ×２５０ｍｍを用い、カラムヒーターにて５５℃に保
つた。流速は０．３ｍｌ／分とし、２０ｍＭ酢酸ナトリ
ウムとアセトニトリルとの混合液を用い、グラジエント
溶出法で分離し、２６９nmでモニターした。分析は４５
分とした。 【０１５６】２０サイクルの分析の結果、前記（３）で
得たポリペプチドＩのＮ末端２０個のアミノ酸配列は、
以下のものであると認められた。 【０１５７】Ａla−Ｐro−Ｖal−Ａrg−Ｓer−Ｌeu−Ａ
sn−Ｃys−Ｔhr−Ｌeu−Ａrg−Ａsp−Ｓer−Ｇln−Ｇln
−Ｌys−Ｓer−Ｌeu−Ｖal−Ｍet− 尚、Ｓerは副生物の一つで確認し、更に３２２nmに吸収
を示すデヒドロ体としての確認も行なつた。サイクル８
では副生物のピークからＣysであると推定し、更に元の
試料をカルボキサミドメチル化した後の分析でＣysと確
認した。 【０１５８】また、ポリペプチドＩをトリプシンで消化
して得たペプチド断片につき、それらのアミノ酸組成を
分析し、Ｃ端部ペプチドも欠損することなく、正確に含
まれていることを確認した。 【０１５９】即ち、ポリペプチドＩ ６０μｇを１％炭
酸水素アンモニウム６００μｌに溶解し、該溶液に、予
め１％炭酸水素アンモニウムに溶解させたトリプシン
（０．２ｍｇ／ｍｌ、クーパー社製）溶液の ２０μｌ
を加え、３７℃で２４時間放置してトリプシン切断ペプ
チドを得た。このペプチド混合物を、逆相ＨＰＬＣ〔Ｃ
−１８，３００オングストローム，４．６×１５０ｍ
ｍ；０．１％ＴＦＡをＡ液及び１％ＴＦＡ１／１０容を
含むアセトニトリルをＢ液として、該Ｂ液を１％／３分
の割合で増加させるプログラムにより溶出させる〕に付
し、Ｂ液が４０％までで全ての成分を単離した。之等の
ペプチドをアミノ酸分析に供した。このアミノ酸組成か
ら予想される全てのペプチド断片が同定でき、特にＣ端
部ペプチドについては、塩基性アミノ酸が含まれておら
ず、そのアミノ酸組成の結果は、予想されるアミノ酸を
正確に含んでいたことから、前記（３）で得られたポリ
ペプチドＩのＣ端部は、予想された通りに正確であるこ
とが確認された。 【０１６０】また、各ペプチド断片につき、上記と同様
にしてそれらのアミノ酸配列を分析した。その結果、確
認された配列は全てＩＬ−１βに一致した。確認された
ペプチド断片につき、之等をＩＬ−１βのアミノ酸番号
により次に示す。 【０１６１】〈確認されたペプチド断片（アミノ酸番
号）〉１〜４、５〜１１、１２〜１６、１７〜２７、２
８〜６３、６４〜６５、６６〜７４、７５〜８８、８９
〜９２、９５〜９８、９９〜１０３、１０４〜１０９、
１１０〜１３８、１３９〜１５３ 以上の結果から、前記（３）で得たポリペプチドＩは、
前記定義の配列で特定されるポリペプチドＩであること
が確認された。尚、ポリペプチドＩの分子量の計算値
は、１７３７６．５９である。 【０１６２】実施例１ 本発明ＩＬ−１β誘導体の製造 (1) ポリペプチドVIの製造 上記参考例２で得たp trp ＧＩＦ−αを利用して、サイ
ト−スペシフイツクミユータジエネシス（Ｓite −Ｓpe
cific Ｍutagenesis）〔Ｐroc.Ｎat. Ａcad.Ｓci.,８
１，５６６２−５６６６（１９８４）〕の方法に従い、
ＩＬ−１β（ポリペプチドＩ）のアミノ末端から７１番
目のＣysをＳerに変更したポリペプチドVIを以下の通り
製造した。 【０１６３】即ち、Ｍ１３mp１１フアージベクターを、
一本鎖（ss）ＤＮＡ鋳型として用いた。まず、プラスミ
ドp trp ＧＩＦ−αより、ＥcoＲＩ／ＢamＨＩＤＮＡフ
ラグメントを切り出し、Ｍ１３mp１１フアージ（ＲＦ）
のＥcoＲＩとＢamＨＩの制限酵素サイトにクローニング
し、これから一本鎖（ss）ＤＮＡ（Ｍ１３−ＧＩＦ−
α）を得、これをミユータジエネシスの鋳型とした。 【０１６４】合成オリゴヌクレオチド〔５’−ＣＴＧＴ
ＣＣＴＣＡＧＴＧＴＴＧ−３’（プライマー）〕を、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、これをssＭ
１３−ＧＩＦ−α ＤＮＡとハイブリダイズし、アニー
リング後、dＮＴＰsの存在下、ＤＮＡポリメラーゼＩ
（クレノーフラグメント）及びＴ４ＤＮＡリガーゼで各
々処理し、１５℃で１８時間インキユベートした。 【０１６５】得られたＤＮＡをＪＭ１０５コンピテント
細胞にトランスフオームし、生じたコロニーを、寒天プ
レート上に５０コロニー植菌し、３７℃で１８時間培養
した。生育したコロニーを含むフイルターを通常の方法
によりアルカリ変性し、乾燥後、８０℃で２時間ベーキ
ング処理を行なった。このフイルターをプレハイブリダ
イズした後、このものと、上記プライマーの５’末端を
32Ｐ−r −ＡＴＰでラベルした32Ｐ−プローベとを、室
温でハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたフイ
ルターを、６×ssc バッフアーで、室温で１０分間、次
いで３７℃で１０分間各々洗浄し、乾燥後、−７０℃で
１８時間オートラジオグラフイーを行なった。 【０１６６】変異した５クローンの内から代表としてＭ
１３−ＧＩＦ−７１s を選びこれをＪＭ１０５に感染さ
せて培養し、ssＤＮＡ及びＲＦ ＤＮＡを調製した。 【０１６７】上記で得たssＤＮＡのＭ１３ジデオキシチ
ェイン ターミネーション シークエンシングにより目
的の遺伝子の変異の確認を行なった。 【０１６８】また上記ＲＦ ＤＮＡにおいて、新しくで
きた制限酵素ＤdeＩサイトも確認できた。 【０１６９】ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ ＤＮＡよ
り、 ＥcoＲＩ／ＢamＨＩフラグメントを調製し、これ
を前記（１）と同様にして発現プラスミドに組込み、所
望のポリペプチドVI発現プラスミド（p trp ＧＩＦ−α
−７１Ｓ）を得た。 【０１７０】該プラスミドは、これをエシエリヒア・コ
リＨＢ１０１に保有させ、該株は微工研に「Ｅsherichi
a coli ＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ−α−７１Ｓ」なる
名称で微工研寄第１２９６号（ＦＥＲＭ ＢＰ １２９
６）として寄託されている。 【０１７１】このプラスミドを用いて、参考例２−
（２）と同様にして、菌体抽出物上清を得、該上清のＧ
ＩＦ活性を測定した。その結果、培養液１ｍｌ当りのＧ
ＩＦ活性（単位／ｍｌ培養液）は、エシェリヒア・コリ
ＨＢ１０１を宿主として２．４×１０6であつた。 【０１７２】これより、参考例２−（３）と同一の手段
により、目的のポリペプチドVIを単離、精製した。 【０１７３】(2) ポリペプチドIVの製造 プラスミドp trp ＧＩＦ−αを利用して上記(1)と同様
にして、ポリペプチドIVを製造した。 【０１７４】即ち、Ｍ１３mp１１フアージベクターを、
一本鎖（ss）ＤＮＡ鋳型として用いた。まずプラスミド
p trp ＧＩＦ−αより、ＥcoＲＩ／ＢamＨＩＤＮＡフラ
グメントを切り出し、Ｍ１３mp１１フアージ（ＲＦ）の
ＥcoＲＩとＢamＨＩの制限酵素サイトにクローニング
し、これから一本鎖（ss）ＤＮＡ（Ｍ１３−ＧＩＦ−
α）を得、これをミュータジェネシスの鋳型とした。 【０１７５】合成オリゴヌクレオチド〔５’−ＣＴＧＡ
ＡＣＴＣＧＡＣＴＣＴＣ−３’（プライマー）〕を、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、これをssＭ
１３−ＧＩＦ−α ＤＮＡとハイブリダイズし、アニー
リング後、ｄＮＴＰｓの存在下、ＤＮＡポリメラーゼＩ
（クレノーフラグメント）及びＴ４ＤＮＡリガーゼで各
々処理し、１５℃で１８時間インキユベートした。 【０１７６】得られたＤＮＡをＪＭ１０５コンピテント
細胞にトランスフオームし、生じたコロニーを、寒天プ
レート上に１００コロニー植菌し、３７℃で１８時間培
養した。生育したコロニーを含むフイルターを通常の方
法によりアルカリ変性し、乾燥後、８０℃で２時間ベー
キング処理を行なった。このフイルターをプレハイブリ
ダイズした後、このものと、上記プライマーの５’末端
を、32Ｐ−ｒ−ＡＴＰでラベルした32Ｐ−プローベと
を、室温でハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせ
たフイルターを、６×ssc バッフアーで、室温で１０分
間、次いで３７℃で１０分間各々洗浄し、乾燥後、−７
０℃で１８時間オートラジオグラフイーを行なった。 【０１７７】変異した４クローンの内から代表としてＭ
１３−ＧＩＦ−８Ｓを選びこれをＪＭ１０５に感染させ
て培養し、ssＤＮＡ及びＲＦ ＤＮＡを調製した。 【０１７８】上記で得たssＤＮＡのＭ１３ジデオキシチ
ェイン ターミネーシヨン シークエンシングにより目
的の遺伝子の変異の確認を行なった。 【０１７９】また上記ＲＦ ＤＮＡにおいて、新しくで
きた制限酵素Ｈinf Ｉサイトも確認できた。 【０１８０】ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ ＤＮＡよ
り、 ＥcoＲＩ／ＢamＨＩフラグメントを調製し、これ
を参考例２−（１）と同様にして発現プラスミドに組込
み、所望のポリペプチドIV発現プラスミド（p trp ＧＩ
Ｆ−α−８Ｓ）を得た。 【０１８１】このプラスミドを用いて、参考例２−
（２）と同様にして、菌体抽出物上清を得た。該上清の
ＧＩＦ活性は、宿主してエシェリヒア・コリＨＢ１０１
を用いた場合、１．２×１０5単位／ｍｌ培養液であ
り、エシェリヒア・コリＷ３１１０を用いた場合、６．
２×１０5単位／ｍｌ培養液であつた。 【０１８２】上記上清より、参考例２−（３）と同一の
手段により、目的のポリペプチドVIを単離、精製した。 【０１８３】(3) ポリペプチドＶの製造 上記(1)及び(2)で得たプラスミドp trp ＧＩＦ−α−７
１Ｓ及びp trp ＧＩＦ−α−８Ｓの各々を、制限酵素Ｅ
coＲＩ及びＨind III で切断後、p trp ＧＩＦ−α−８
Ｓから約４００bpのＤＮＡフラグメントを、またp trp
ＧＩＦ−α−７１Ｓから約４６００bpのＤＮＡフラグメ
ントをそれぞれ取り出し、両者をライゲーシヨンして、
ＩＬ−１β（ポリペプチドＩ）のＮ末端から８番目及び
７１番目のＣysをいずれもＳerに変更させた所望のポリ
ペプチドＶの発現用プラスミドptrp ＧＩＦ−α−８Ｓ
７１Ｓを得た。 【０１８４】このプラスミドを用いて、参考例２−
（２）と同様にして、菌体抽出物上清（エシェリヒア・
コリＨＢ１０１を宿主とする場合はＧＩＦ活性として
１．４×１０4単位／ｍｌ培養液、またエシェリヒア・
コリＷ３１１０を宿主とする場合はＧＩＦ活性として５
×１０5単位／ｍｌ培養液）を得、これより参考例２−
（３）と同一の手段により、目的のポリペプチドＶを単
離、精製した。 【０１８５】(4) ポリペプチドIIの製造 上記(1)と同様にして、５’−ＧＣＴＣＣＴＧＴＡＧＧ
ＴＴＣＴＣＴＧ−３’をプライマーとして用いることに
より、ポリペプチドII発現用プラスミドp trpＧＩＦ−
α−４Ｇを得た。 【０１８６】該プラスミドは、これをエシエリヒア・コ
リＨＢ１０１に保有させ、該株は微工研に「Ｅsherichi
a coli ＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ−α−４Ｇ」なる名
称で微工研寄第１２９７号（ＦＥＲＭ ＢＰ １２９
７）として寄託されている。 【０１８７】該プラスミドを用いて、参考例２−（２）
と同様にして菌体抽出物上清（エシェリヒア・コリＨＢ
１０１を宿主として、ＧＩＦ活性として２．８×１０5
単位／ｍｌ培養液）を得、これより参考例２−（３）と
同一の手段により、目的のポリペプチドIIを単離、精製
した。 【０１８８】この精製操作において、ＣＭ−ＨＰＬＣの
主ピークの前半部の再クロマトグラフイーによりポリペ
プチドＸＸＸＸVIIIを精製品として得た。ポリペプチド
ＸＸＸＸVIIIは、ポリペプチドIIと同程度のＣＳＦ産生
促進活性を有し、同様に、ＧＩＦ活性、ＬＡＦ活性及び
ＰＧＥ産生促進活性がいずれも低い特徴を示した。 【０１８９】(5) ポリペプチドIII の製造 上記(1)と同様にして、５’−ＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧ
ＧＡＣＴＣＡＣＡ−３’をプライマーとして用いること
により、ポリペプチドIII発現用プラスミドp trp ＧＩ
Ｆ−α−１１Ｑを得た。 【０１９０】該プラスミドを用いて、参考例２−（２）
と同様にして菌体抽出物上清（エシェリヒア・コリＨＢ
１０１を宿主として、ＧＩＦ活性として２．８×１０6
単位／ｍｌ培養液）を得、これより参考例２−（３）と
同一の手段により、目的のポリペプチドIIIを単離、精
製した。 【０１９１】(6) ポリペプチドVIIの製造 上記(1)と同様にして、５’−ＴＣＴＴＣＡＡＣＴＡＧ
ＡＴＡＧＡＡ−３’をプライマーとして用いることによ
り、ポリペプチドVII発現用プラスミドp trpＧＩＦ−α
−１０２ＣＴを得た。 【０１９２】該プラスミドを用いて、参考例２−（２）
と同様にして菌体抽出物上清（エシェリヒア・コリＨＢ
１０１を宿主として、ＧＩＦ活性として７．４×１０4
単位／ｍｌ培養液）を得、これより参考例２−（３）と
同一の手段により、目的のポリペプチドVIIを単離、精
製した。 【０１９３】(7) ポリペプチドVIIIの製造 上記(1)と同様にして、５’−ＡＡＡＧＧＣＧＧＣＴＡ
ＧＧＡＴＡＴＡＡ−３’をプライマーとして用いること
により、ポリペプチドVIII発現用プラスミドptrp ＧＩ
Ｆ−α−１４０ＣＴを得た。 【０１９４】該プラスミドを用いて、参考例２−（２）
と同様にして、エシェリヒア・コリＷ３１１０を宿主と
して用いることにより、菌体抽出物上清（ＧＩＦ活性と
して５．８×１０3単位／ｍｌ培養液）を得、これより
参考例２−（３）と同一の手段により、目的のポリペプ
チドVIIIを単離、精製した。 【０１９５】また、上記プラスミドp trp ＧＩＦ−α−
１４０ＣＴを、エシェリヒア・コリＨＢ１０１を宿主と
して発現させることによつて、同様に菌体抽出物上清
（ＧＩＦ活性として１．３×１０6単位／ｍｌ培養液）
が得られ、これより上記と同様にしてポリペプチドＩが
単離、精製された。 【０１９６】尚、上記において、エシェリヒア・コリＨ
Ｂ １０１を宿主とする場合には、ナンセンスサプレツ
サーとしてＳupＥが働き、ＵＡＧの終止コドンがＧlnと
して読まれて（read throughされて）ポリペプチドＩが
発現される。一方宿主をエシェリヒア・コリＷ３１１０
とする場合には、ＳupＥ遺伝子がコードされていないた
め、上記ＵＡＧが終止コドンとして働き、１４０個のア
ミノ酸配列からなるポリペプチドVIIIが発現される。 【０１９７】(8) ポリペプチドＩ〜VIIIの同定 前記(1)〜(7)で得られた本発明のＩＬ−１β誘導体（ポ
リペプチドＩ〜VIII）につき、参考例２−（４）と同様
にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１８％ポリアクリルアミドゲ
ル、２ＭＥ+）を行なった。 その結果、ポリペプチド
Ｉ〜ポリペプチドVIIは、いずれも約１７．５kdの位置
に、またポリペプチドVIIIは約１６kdの位置に、それぞ
れ単一のバンドとして泳動された。 【０１９８】また、ポリペプチドＩのＧＩＦ活性に対す
る中和抗血清（参考例２−（３）で得たポリペプチドＩ
を通常の方法に従い、家兎に免疫して作製した抗血清、
以下同じ）を用いたウエスタンブロツテイング〔Ｗeste
rn blotting,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,ＵＳＡ，７６，
１４２０（１９７９）〕により、ポリペプチドＩ〜ポリ
ペプチドVIIIの各々を、相当する位置に単一のバンドと
して確認した。 【０１９９】実施例２ (1) 参考例２−（１）で得た形質転換体（エシエリヒ
ア・コリＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ−α）を、アンピシ
リン５０μｇ／ｍｌ及びＬ−トリプトフアン２０μｇ／
ｍｌを含むＬＢ培地４００ｍｌ中で３７℃で一晩培養
し、この４００ｍｌを１％カザミノ酸を含むＭ９最小培
地２０ｌに植菌し、３７℃で８．５時間培養した。 【０２００】遠心分離により集菌し、得られる菌体を１
Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4に懸濁させ、一夜冷室に放置した後、
１０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して２
日間透析した。 【０２０１】得られた透析液を遠心分離（１００００rp
m 、３０分間）して上清を得た。 【０２０２】大腸菌培養液３００ｌ分に相当する上記上
清を集め、これを１００ｍＭ酢酸でｐＨ５．０に調製し
た後、ＳＰ−ゼータプレツプ２５０カートリツジ〔ＬＫ
Ｂ社製〕に付し、流速３０ｍｌ／分で始め、１０ｍＭ酢
酸ナトリウム（ｐＨ５．３）で１００分、続いて０．１
Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
５）で２２０分、更に１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢
酸ナトリウム（ｐＨ５．５）でそれぞれ溶出させた。各
分画をＨＰＬＣによりチェックし、目的物の含まれてい
るフラクション、即ち０．１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）のフラクション（フラ
クションＮo.８〜１０）を集めた。 【０２０３】これを１００ｍＭ酢酸でｐＨ４．５とした
後、ＨＰＬＣ〔東洋曹達株式会社製、ＴＳＫゲルＳＰ−
５ＰＷ、５．５×２０cm〕に付し、下記条件で溶出させ
て、リテンションタイム（r.t.）６５〜７２分の分画を
採取した。 【０２０４】 溶離液Ａ：５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５） 溶離液Ｂ：０．５Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５．５） 流 速 ：３０ｍｌ／分 かくしてポリペプチドＩの精製品を得た。 【０２０５】これを、限外濾過（ＹＭ−５メンブラン）
により、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）の溶液組成となるように緩衝液を交換しつつ、濃縮
（２０mg／ｍｌ）した。 【０２０６】更に、ポジタインフイルターＮＦＺ（日本
ポール社製）を装着した濾過装置に、上記濃縮液を供し
て滅菌濾過した後、パイロジエンが１００ｐｇ／ｍｇ蛋
白以下の精製品を得た。 【０２０７】上記精製法により、大腸菌培養液３００ｌ
より、ポリペプチドＩの約３ｇを収得した。 【０２０８】(2) 上記(1)のＨＰＬＣ（ＳＰ−５ＰＷ）
の溶出において、メインピークの前半のフラクション
（r.t.６４〜６５分）を採取し、これを再度クロマトグ
ラフイーに付すことにより、ポリペプチドＸを得た。
２．７×１０6ＧＩＦ単位／ｍｇ蛋白。 【０２０９】また同様に、メインピークの後半のフラク
ション（r.t.７２〜７６分）より、ポリペプチドＸＩを
得た。２．８×１０7ＧＩＦ単位／ｍｇ蛋白。 【０２１０】(3) 上記(1)及び(2)で得られたポリペプ
チドＩ、Ｘ及びＸＩのアミノ酸分析を、参考例２−
（４）と同様にして行なった。結果を下記第２表に示
す。 【０２１１】またポリペプチドＸ及びＸＩについては、
参考例２−（４）におけるアミノ酸配列分析と同様にし
て、それらのＮ末端部配列を確認、同定した。 【０２１２】 【化１８】【０２１３】(4) ポリペプチドＩは、分子内に２個の
Ｃys（８位及び７１位）を有している。之等Ｃysの側鎖
ＳＨ基の存在状態を、下記方法により調べた。 【０２１４】a ．参考例２−（３）で得たポリペプチド
Ｉの約５ナノモル相当（０．１Ｍ ＮａＣｌを含有する
５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）溶液１００μ
ｌ）を、Ａ、Ｂ及びＣの３本の試験管にそれぞれ分取
し、各試験管に０．１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．４５）
を含有させた６Ｍグアニジン塩酸溶液各３００μｌを加
えた。 【０２１５】次に試験管Ａ及びＢには、６Ｍグアニジン
塩酸溶液２５μｌを加えてブランクとし、試験管Ｃには
還元剤であるジチオスレイトール２μモルを含む６Ｍグ
アニジン塩酸溶液２５μｌを加え、各試験管に１分間窒
素ガスを吹込んだ後、５０℃で２時間放置した。 【０２１６】次いで、試験管Ａには、ブランクとして、
６Ｍグアニジン塩酸溶液２５μｌを、試験管Ｂ及びＣに
はヨードアセトアミド４μモルを含む６Ｍグアニジン塩
酸溶液２５μモルを加え、各試験管に１分間窒素ガスを
吹込んだ後、暗所で２５℃下に３０分間放置した。 【０２１７】上記の通り処理した試験管Ａ、Ｂ及びＣ
に、それぞれ１０％ＴＦＡ５μｌを加え、逆相ＨＰＬＣ
（Ｃ3）により蛋白質を精製した。 【０２１８】精製蛋白質の約１／１０量を試験管に取
り、乾燥後、４Ｎ−メタンスルホン酸にて加水分解し、
アミノ酸組成を調べた。 【０２１９】その結果、試験管Ｂ及びＣからは、カルボ
キシメチルシステインが、ほぼ同量検出された。このこ
とから、試験管ＡではポリペプチドＩはそのままの状態
であるのに対し、試験管Ｂ及びＣでは、Ｓ−カルボキサ
ミドメチル化−ポリペプチドＩに変化したことが確認で
き（試験管Ｂは還元剤にさらしていないので）、従って
ポリペプチドＩに含まれるＣysは、ジスルフィド（Ｓ−
Ｓ）結合を本形成していないことが判った。 【０２２０】更に、上記試験管Ａ、Ｂ及びＣ中の生成物
の残量（％）を乾燥後、これらにそれぞれ１％重炭酸ア
ンモニウム溶液６００μｌを加えて溶解させて、各々１
μｇ／５μｌ濃度に調製した。之等各液にトリプシン溶
液７．５μｌをそれぞれ加え、３７℃で２０時間酵素消
化を行なった。その後、各液に１０％ＴＦＡ１０μｌを
加え、酵素反応を停止させ、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ18）に
て、ペプチド断片を分離した。 【０２２１】その結果、試験管Ｂ及びＣはほぼ同じパタ
ーンを示し、試験管Ａは之等とは異なるパターンを示し
た。 【０２２２】上記で単離した各ペプチドのアミノ酸組成
を、前記と同様にして求めた結果、試験管Ａのペプチド
断片から、Ｃys１個を含まなければ生じないポプチドの
存在を確認した。 【０２２３】以上の結果から、ポリペプチドＩのＣys残
基は、分内及び分子間のいずれでもジスルフィド結合を
形成していないことが確認された。 【０２２４】b ．エルマン法〔Ｅllman 法、Ａrch.Ｂio
chem．Ｂiophys.,８２，７０（１９５９）〕に従い、以
下のごとくしてポリペプチドＩのＳＨ基の定量を行なっ
た。 【０２２５】即ち、参考例２−（３）で得たポリペプチ
ドＩの２００μｇ（１１．５μモル）を、６Ｍ塩酸グア
ニジン及び１−ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１ＭトリスＨ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌに溶解させた。一方、
新鮮な０．０１Ｍ ＤＴＮＢ〔５，５’−ジチオビス
（２−ニトロベンゾイック アシッド〕を含む０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（以下これを「エルマン
試薬」という）を調製した。 【０２２６】対照セルに６Ｎ塩酸グアニジン及び１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．０）１ｍｌを、また試料セルにポリペプチドＩを含
む上記溶液１ｍｌをそれぞれ導入し、その各々にエルマ
ン試薬各４０μｌを加えて混合し、直ちに４１２nmにお
ける吸光度を測定した。最大吸光度になった後、ＤＴＮ
Ｂの分解による吸光度の減少を「０」に補正して、ＳＨ
基の濃度を決定したその結果、実際に得られた４１２nm
での吸光度は０．３２８であった。 【０２２７】一方、６Ｍ塩酸グアニジンを含む水溶液中
での３−カルボキシレート−４−ニトロチオフエノレー
ト（３−calboxylate −４−nitrothio-phenolate ）イ
オンのε412は、１３８８０Ｍ-1cm-1であり〔Ｅur. Ｊ.
Ｂiochem.,３０，３２（１９７２）〕、このことよ
り、ポリペプチドＩ溶液のＳＨ基は、０．００００２４
５（Ｍ／e ）であり、ポリペプチドＩの１１．５μモル
中にＳＨ基が２４．５μモル存在することとなることが
判った。 【０２２８】上記より、ポリペプチドＩに含まれるＣys
は、共に遊離のＳＨ基を有していることが確認された。 【０２２９】尚、ポリペプチドＩを水又はＰＢＳ（−）
に溶解し、凍結乾燥を３〜４回繰返した場合において
も、ＧＩＦ活性及び上記エルマン法によるＳＨ基の定量
値には、殆んど変化は認められなかった。 【０２３０】(5) 遺伝子組換え技術に従い、大腸菌等
で多量に異種蛋白質を発現させる場合、その蛋白質は大
腸菌の菌体中に不溶性物質（inclusion body）として蓄
積されることが多く、このような場合には、目的蛋白質
を菌体から採取するに当って、例えば７Ｍ塩酸グアニジ
ン、８Ｍ尿素又は０．１％ＳＤＳ等の変性剤を使用する
過激な条件下での処理が必要となる。しかるに、この様
な処理によれば、目的蛋白質は、その高次構造を含め
て、不可逆的な損傷を受けるおそれが多分にある。従っ
て、できる限り上記の如き変性剤を使用することなく、
温和な条件下で目的蛋白質を単離抽出できることが、上
記遺伝子組換え技術上の重要な関心事である。しかし
て、前記した(1)に示す方法によれば、目的蛋白質の抽
出単離を、浸透圧ショックという非常に温和な条件の採
用により行なうことができ、この点で該方法は極めて好
ましい。また該方法に従い得られる目的蛋白質は、より
天然に近い高次構造を保持されており、この点からも望
ましいものである。 【０２３１】(6) 実施例１−(1)に準じて、プラスミド
p trp ＧＩＦ−αを利用したサイト−スペシフィックミ
ュータジェネシスにより、下記３表に示す各ポリペプチ
ド（本発明ＩＬ−１β誘導体）を得た。尚、各ポリペプ
チドの発現、ＧＩＦ活性の測定及び精製は、上記(1)に
従うものであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは参考例２−（４）
に示す方法に準じた。以下の各例でも特筆しない限り同
様である。 【０２３２】 【化１９】【０２３３】 【化２０】【０２３４】(7) 実施例１−(6)で得たプラスミドp tr
p ＧＩＦ−α−１０２ＣＴを用いて、宿主をエシェリヒ
ア・コリＷ３１１０として、同様に発現及び精製して本
発明ＩＬ−β誘導体であるポリペプチドＸＸＸを得た。
約１１．４kd（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、以下同じ）。 【０２３５】(8) プラスミドp trp ＧＩＦ−α−４Ｇ
を利用し、プライマーとして５’−ＧＣＡＣＴＣＴＣＣ
ＡＧＧＡＣＴＣＡＣＡ−３’を用いて、上記(6)と同様
にしてポリペプチドＸIV発現用プラスミドp trp ＧＩＦ
−α−４Ｇ１１Ｑを得た。該プラスミドを用いて、エシ
ェリヒア・コリＨＢ１０１を宿主として、同様に発現
（２．７×１０5ＧＩＦ単位／ｍｌ培養液）及び精製し
て、本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドＸIVを
得た。 【０２３６】約１７．５kd。 【０２３７】(9) 実施例１−(3)に準じて、プラスミド
p trp ＧＩＦ−α−４Ｇ及びp trp ＧＩＦ−α−９８Ｌ
を用いて、ポリペプチドＸＶ発現用プラスミドp trp Ｇ
ＩＦ−α−４Ｇ９８Ｌを得た。 【０２３８】即ち、上記両プラスミドを制限酵素ＥcoＲ
Ｉ及びＨind III で切断後、p trpＧＩＦ−α−４Ｇか
ら約４００bpのＤＮＡフラグメントを、またp trp ＧＩ
Ｆ−α−９８Ｌから約４．６kbp のＤＮＡフラグメント
をそれぞれ取り出し、両者をライゲーションさせた。 【０２３９】プラスミドp trp ＧＩＦ−α−４Ｇ９８Ｌ
を用いて、エシェリヒア・コリＷ３１１０を宿主として
同様に発現及び精製して本発明ＩＬ−１β誘導体である
ポリペプチドＸＶを得た。約１７．５kd。 【０２４０】〔１０〕 上記(9)において、プラスミドp
trp ＧＩＦ−α−４Ｇの代りにプラスミドp trp ＧＩ
Ｆ−α−１１Ｑ（その約４００bpのＤＮＡフラグメント
を使用）を用いて、同様にしてポリペプチドＸVI発現用
プラスミドp trp ＧＩＦ−α−１１Ｑ９８Ｌを得た。該
プラスミドを用い同様にして本発明ＩＬ−１β誘導体で
あるポリペプチドＸVIを得た。約１７．５kd。 【０２４１】〔１１〕 上記(9)において、プラスミドp
trp ＧＩＦ−α−４Ｇの代りにプラスミドp trp ＧＩ
Ｆ−α−４Ｇ１１Ｑを用いて、該プラスミドからの約４
００bpのＤＮＡフラグメントを使用して、同様にしてポ
リペプチドＸIII発現用プラスミドp trp ＧＩＦ−α−
４Ｇ１１Ｑ９８Ｌを得た。該プラスミドを用い同様にし
て本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドＸIIIを
得た。約１７．５kd。 【０２４２】〔１２〕 実施例１−(3)に準じて、プラ
スミドp trp ＧＩＦ−α−８Ａ及びp trp ＧＩＦ−α−
７１Ｓを用いて、ポリペプチドＸＸＸVI発現用プラスミ
ドp trpＧＩＦ−α−８Ａ７１Ｓを得た。 【０２４３】即ち、上記両プラスミドを制限酵素ＥcoＲ
Ｉ及びＨind IIIで切断後、p trpＧＩＦ−α−８Ａから
約４００bpのＤＮＡフラグメントを、またp trp ＧＩＦ
−α−７１Ｓから約４．６kbp のＤＮＡフラグメントを
それぞれ取り出し、両者をライゲーションさせた。 【０２４４】プラスミドp trp ＧＩＦ−α−８Ａ７１Ｓ
を用い、エシェリヒア・コリＨＢ１０１を宿主として同
様に発現（８．７×１０5ＧＩＦ単位／ｍｌ培養液）及
び精製して本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチド
ＸＸＸVIを得た。約１７．５kd。 【０２４５】〔１３〕 上記〔１２〕において、プラス
ミドp trp ＧＩＦ−α−７１Ｓの代りにプラスミドp tr
p ＧＩＦ−α−７１Ａ（その約４．６kbp のＤＮＡフラ
グメントを使用）を用い、同様にしてポリペプチドＸＸ
ＸVII 発現用プラスミドp trpＧＩＦ−α−８Ａ７１Ａ
を得た。該プラスミドを保有するエシエリヒア・コリＨ
Ｂ１０１は微工研に「Ｅscherihia coli ＨＢ１０１／
ｐｔｒｐ ＧＩＦ−α−８Ａ７１Ａ」なる名称で微工条
研第１２９８号（ＦＥＲＭ ＢＰ １２９８）として寄
託されている。該プラスミドを用い同様に発現（１．６
×１０6ＧＩＦ単位／ｍｌ培養液）及び精製して本発明
ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドＸＸＸVII を得
た。約１７．５kd。 【０２４６】〔１４〕 上記〔１２〕において、プラス
ミドp trp ＧＩＦ−α−７１Ｓの代りにプラスミドp tr
p ＧＩＦ−α−７１Ｖを用いて、該プラスミドからの約
４．６kbp のＤＮＡフラグメントを使用し、同様にして
ポリペプチドＸＸＸVIII発現用プラスミドp trp ＧＩ
Ｆ−α−８Ａ７１Ｖを得た。該プラスミドを用いて同様
に発現（２．１×１０6ＧＩＦ単位／ｍｌ培養液）及び
精製して本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドＸ
ＸＸVIIIを得た。約１７．５kd。 【０２４７】〔１５〕 上記(1)の方法に従い、実施例
１−(1)〜(7)及び後記実施例３−(6)〜(9)の各々で得ら
れた形質転換体より、本発明ＩＬ−１β誘導体であるポ
リペプチドII〜VIII及びＸＸＸＩ〜ＸＸＸIVを製造し
た。 【０２４８】之等はいずれもＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一の
バンドとして泳動された。またポリペプチドII〜VIII
は、前記と同一の位置に泳動され、ポリペプチドＸＸＸ
Ｉ〜ＸＸＸIVは、下記の通りであった。 【０２４９】 ポリペプチドＸＸＸＩ 約２２kd ポリペプチドＸＸＸII 約２３kd ポリペプチドＸＸＸIII 約２７kd ポリペプチドＸＸＸIV 約３１kd 実施例３ (1)Ｕ９３７細胞の培養 ヒトリンパ組織球腫Ｕ９３７細胞（Ａscenso，Ｊ．Ｌ．
et al., Ｂlood，Ｖol．５７，p １７０（１９８１）〕
１．４×１０9個を、１２−Ｏ−テトラデカノイルホル
ボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）（フアルマシア社
製）２５ｎｇ／ｍｌ、コンカナバリンＡ（ＣonＡ）（シ
グマ社製）１０μｇ／ｍｌ及び１０％牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に入れて、４×１０
5個／ｍｌの濃度の細胞浮遊液を調製した。 【０２５０】この細胞浮遊液１０ｍｌずつを、直径９cm
のシヤーレ（フアルコン３００３）に分注し、５％炭酸
ガス中、３７℃で３日間培養後、培養上清をアスピレー
ターにて除去し、１０％ＦＣＳ、細菌リポポリサツカラ
イド（ＬＰＳ）（デイフコ社製）１０μｇ／ｍｌ、ムラ
ミルジペプチド（ＭＤＰ）（和光純薬社製）１μｇ／ｍ
ｌ及びＴＰＡ１ｎｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ−１６４０培
地１０ｍｌを、各シヤーレに分注した。この培地にて５
％炭酸ガス中、３７℃で１８時間培養し、シヤーレ底部
に付着したＵ９３７細胞をm ＲＮＡ調製用の材料として
利用した。 【０２５１】(2)ｍＲＮＡの調製 ＲＮＡの抽出は、グアニジニウム／熱フエノール（guan
idium ／hot phenol）法〔Ｆeramisco, Ｊ．Ｒ，et a
l., Ｊ．Ｂiol.Ｃhem., Ｖol. ２５７，p １１０２４
（１９８２）〕とグアニジニウム／セシウムクロライド
（guanidinium ／cesium chloride ）法〔Ｇlisin,Ｖ．
et al., Ｂiochemistry ，Ｖol. １３，p ２６３３（１
９７４）〕との組合せにより行なった。 【０２５２】上記(1)で培養したＵ９３７細胞を洗浄す
るために、培養上清を除去した後、各シヤーレを５ｍｌ
のＰＢＳ（−）溶液にてすすぎ、その後、各シヤーレに
１ｍｌの４Ｍ−グアニジン・イソチオシアネート混合液
〔４Ｍ−グアニジンイソチオシアネート（Ｆluka社
製）、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、２％ラウロイリルザルコシン酸ナトリウム〕
を添加し、細胞を溶解させた。溶解液をラバーポリスマ
ンとパスツールピペツトにて回収して、細胞溶解液４２
０ｍｌを得た。この溶解液を６０℃に保ち、１８Ｇ注射
針に通過させることにより、染色体ＤＮＡをせん断し、
その後６０℃に保温したフエノールを等量加え、１８Ｇ
注射針にて更に溶液を混合し、せん断した。次いでこの
混合液に０．１Ｍ酢酸ナトリウム−１０ｍＭトリスＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）−１ｍＭ ＥＤＴＡ液２１０ｍｌとク
ロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１容積比）
混液４２０ｍｌとを加え、６０℃に保温しながら、１５
分間激しく撹拌した。混合液を氷冷後、３０００rpm 、
４℃で２０分間遠心し、水層を回収した。水層に２容の
エタノールを加え、−７０℃にて一夜放置後、粗ＲＮＡ
沈澱を得た。該粗ＲＮＡを、６Ｍグアニジン・イソチオ
シアナート−５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
−０．１Ｍβ−メルカプトエタノール−０．５％ラウロ
イリルザルコシン酸ナトリウム液４８ｍｌに溶解させ、
塩化セシウム１９．２g を添加して溶解させた。次にこ
の混合液７ｍｌずつを、５．７Ｍ塩化セシウム−０．１
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の４ｍｌに重層し、ベツク
マンＳＷ４０Ｔi ローターにて、２５℃、３１５００rp
m で２０時間遠心して、ＲＮＡを分取した。 【０２５３】かくして得られたＲＮＡ量は９．７ｍｇで
あつた。 【０２５４】次に上記で得られたＲＮＡからｍＲＮＡを
取得するため、オリゴ(ｄＴ)-セルロース（コラボレイ
テイブ リサーチ（Ｃollaborative Ｒesearch,Ｉnc．
社製）を用いて、カラムクロマトグラフイーを行なっ
た。吸着は１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−０．
５Ｍ ＮａＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡにて行い、溶出は１
０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ
にて行った。 【０２５５】この結果、得られたｍＲＮＡは、４００μ
ｇであつた。 【０２５６】(3)ｃＤＮＡライブラリーの調製 ｃＤＮＡライブラリーの調製は、以下の通り、ｃＤＮＡ
が動物細胞において発現可能なオカヤマ−ベルグ（Ｏka
yama- Ｂerg ）法により行った。即ち、ｃＤＮＡクロー
ニングに用いるｄＴ鎖の付加したベクター・プライマー
は、プラスミドｐＣＤＶ１より、またｄＧ鎖の付加した
リンカーＤＮＡは、プラスミドｐＬ１より、各々オカヤ
マらの方法〔Ｏkayama, Ｈ. and Ｐ．Ｂerg., Ｍolecul
ar andＣellular Ｂiology, Ｖol．３，p ２８０（１９
８３）〕に従って調製した。 【０２５７】次に上記(2)で得た ｍＲＮＡ１５μｇを、
５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−０．５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ７．５）水溶液２０μｌに溶解し、６５℃で
５分間、次いで３７℃で５分間インキユベートした後、
反応液（全量４０μｌ）を、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．３）、８ｍＭ ＭｇＣｌ2、３０ｍＭ ＫＣｌ、
０．３ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭの各ｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、ベクター・プライマ
ー ＤＮＡ２．８μｇ、ＲＮase インヒビター（Ｐrome
ga Ｂiotech社製）６０ユニツト、逆転写酵素（バイオ
−ラド社製）４０ユニツトになるように調整して、３７
℃で１時間インキユベートし、０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ
７．５）２μｌ及び１０％ＳＤＳ２μｌを加えて反応を
停止させた。その後、フエノール・クロロホルム抽出及
びクロロホルム抽出を行い、エタノール沈澱としてベク
ター・プライマーｃＤＮＡ：ｍＲＮＡを回収した。回収
されたベクター・プライマーｃＤＮＡ：ｍＲＮＡを、１
４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ６．８）、１ｍＭ ＣａＣｌ2、０．１ｍＭジチ
オスレイトール、０．３μｇポリ（Ａ）、６６μＭ ｄ
ＣＴＰ及び３８ユニツトのターミナルデオキシヌクレオ
チジルトランスフエラーゼ（フアルマシア社製）からな
る反応液３０μｌ中で３７℃、５分間インキユベートし
た後、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）１．５μｌ及
び１０％ＳＤＳ１．５μｌを加えて反応を停止させ、フ
エノール・クロロホルム抽出及びクロロホルム抽出を行
なって、エタノール沈澱としてオリゴｄＣ鎖付加ｃＤＮ
Ａ：ｍＲＮＡ−ベクター・プライマーを回収した。 【０２５８】この回収された核酸を、７ｍＭトリスＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ2、６０ｍＭＮａ
Ｃｌ、１００μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン及び１２ユニ
ツトの制限酵素Ｈind III（日本ジーン社製）からなる
反応液２０μｌ中で、３７℃で９０分間インキユベート
し、次いで０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）１μｌ及び
１０％ＳＤＳ１μｌを加えて反応を停止させた。その
後、フエノール・クロロホルム抽出及びクロロホルム抽
出を行い、エタノール沈澱として、Ｈind III 分解され
たオリゴｄＣ鎖付加ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡ−ベクター・プ
ライマーを回収した。これを１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）（ＴＥ
（ｐＨ７．５）１０μｌに溶解させた。このうちの１μ
ｌを用いて、上記ＴＥ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ及びオリゴ dＣ鎖の付加されたリンカーＤＮＡ１４
ｎｇからなる反応液１０μｌ中で、６５℃で２分間イン
キユベートし、次いで４２℃で３０分間インキユベート
した後、０℃に冷却した。 【０２５９】上記反応液を、更に２０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ（Ｎ
Ｈ4）2ＳＯ4、０．１Ｍ ＫＣｌ、５０μｇ／ｍｌ牛血
清アルブミン、０．１ｍＭ β−ＮＡＤ（ニコチンアミ
ド・アデニン・ジヌクレオチド、フアルマシア社製）及
び０．６μｇのエシエリヒア・コリＤＮＡリガーゼ（フ
アルマシア社製）を含む反応液１００μｌとなるように
調整し、１２℃で一夜インキユベートした。この反応液
に、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの各々
を４０μＭになるように、またβ−ＮＡＤを ０．１５
ｍＭになるようにそれぞれ加え、更にエシェリヒア・コ
リＤＮＡリガーゼの０．４μｇ、エシェリヒア・コリＤ
ＮＡポリメラーゼＩ（ベーリンガー・マンハイム社製）
の４．６ユニツト及びエシェリヒア・コリＲＮase Ｈ
（フアルマシア社製）の１ユニツトを加え、１２℃で１
時間、次いで２５℃で１時間インキユベートした。 【０２６０】上記で得られた反応液を用いて、エシェリ
ヒア・コリＨＢ１０１株を形質転換させた。エシェリヒ
ア・コリＨＢ１０１株のコンピテント・セルとしては、
ベテスダ リサーチ ラボラトリーズ社（Ｂethesda Ｒ
esearch Ｌaboratories ：ＢＲＬ）の製品を使用し、該
ＢＲＬ社のマニユアルに従って、上記形質転換を行なっ
た。 【０２６１】かくして、約２１０００個からなるｃＤＮ
Ａライブラリーが得られた。 【０２６２】(4)サルＣos−１細胞へのトランスフェク
シヨン 上記(3)で得られたｃＤＮＡライブラリーを、１グルー
プ当り平均７０クローンのグループに分け、各グループ
からプラスミドＤＮＡを調整した。 【０２６３】プラスミドＤＮＡは、アルカリ溶菌法（Ｍ
olecular Ｃloning−Ａ Ｌaboratory Ｍanual,Ｃold
Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory ，１９８２，p ３６８）
に従い調製した。 【０２６４】かくして各グループから調製されたプラス
ミドＤＮＡを、それぞれサル培養細胞のＣos−１細胞
〔Ｇluzman, Ｙ.,Ｃell ，Ｖol. ２３，p １７５（１９
８１）〕にトランスフェクションした。該トランスフェ
クションは、ＤＥＡＥ−デキストラン法によつた〔Ｙok
ota,Ｔ．et al., Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ.,Ｖ
ol. ８１，p １０７０（１９８４）〕。即ち、Ｃos−１
細胞をトリプシン処理により、１０％ＦＣＳを含む Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地に懸濁させ、細胞数を１×１０6
個／ｍｌに調整後、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６
４０培地を２ｍｌ／ウエル加えた６ウエルプレートに、
各々５００μｌずつ分注した。一晩３７℃で培養後、上
清を除き、血清を含まない培地で細胞を洗浄し、１０μ
ｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡ、０．４ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ
−デキストラン（フアルマシア社製）、５０ｍＭトリス
ＨＣｌ（ｐＨ７．４）及び１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ
−１６４０培地を１ｍｌ／ウエル加えて、４．５時間３
７℃で培養した。その後、上清を除き、血清を含まない
培地で細胞を洗浄し、１５０μＭクロロキン（シグマ社
製）及び１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を
２ｍｌ／ウエル加えて、更に３７℃で３時間培養した。
上清を除き、血清を含まない培地で細胞を洗浄後、１０
％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を３ｍｌ／ウエ
ル加えて、３７℃で７２時間培養した。上清を回収した
後、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を２ｍ
ｌ／ウエル加え、凍結融解を２回繰返し、細胞抽出液を
回収した。この培養上清及び細胞抽出液について、ＧＩ
Ｆ活性を測定した。 【０２６５】ＧＩＦ活性を示したグループを１０クロー
ン／グループの２４グループに分け、上記と同様の操作
を行ない、ＧＩＦ活性を測定し、活性を示したグループ
について、更にグループ内の各クローンにつき、上記と
同様の操作を行なって、ＧＩＦ活性を示すクローンを同
定した。 【０２６６】かくして、pcＤ−ＧＩＦ−１６及びpcＤ−
ＧＩＦ−２０７の２種類のクローンを得た。 【０２６７】之等のクローンのＧＩＦ活性（ＧＩＦ単位
／ｍｌ）を第４表に示す。 【０２６８】第 ４ 表クローン 培養上清 細胞抽出物 pcＤ−ＧＩＦ−１６ ４８．３ １２０．７ pcＤ−ＧＩＦ−２０７ ６２．６ １９６．９pcＤＶ１（対照） ０ ０ (5)クローンの解析 次に、両クローン由来のＧＩＦ活性の物質としての異同
を明白にするため一定のＧＩＦ活性を示すpcＤ−ＧＩＦ
−１６又はpcＤ−ＧＩＦ−２０７の培養上清及び細胞抽
出物のそれぞれに対して、ポリペプチドＩのＧＩＦ活性
に対する中和抗血清の順次希釈液を添加し、上記各上清
及び細胞抽出物に与える影響を試験した。 【０２６９】その結果を図３の第３−ａ図（pcＤ−ＧＩ
Ｆ−１６培養上清）、図３の第３−ｂ図（pcＤ−ＧＩＦ
−１６細胞抽出物）、図３の第３−ｃ図（pcＤ−ＧＩＦ
−２０７培養上清）及び図３の第３−ｄ図（pcＤ−ＧＩ
Ｆ−２０７細胞抽出物）に示す。各図において横軸は血
清希釈倍率を、縦軸はＧＩＦ活性（％）を各々示す。ま
た各図中（１）は抗ポリペプチドＩ血清を、（２）は正
常血清をそれぞれ示す。 【０２７０】第３−ａ図及び第３−ｂ図に示す通り、pc
Ｄ−ＧＩＦ−１６由来のＧＩＦ活性は、抗ポリペプチド
Ｉ血清の添加により、濃度依存的に、完全に中和された
が、第３−c 図及び第３−d 図に示す通り、pcＤ−ＧＩ
Ｆ−２０７由来のＧＩＦ活性は、抗ポリペプチドＩ血清
には全く影響されなかった。従って、pcＤ−ＧＩＦ−２
０７由来のＧＩＦ活性物は、ポリペプチドＩ及びpcＤ−
ＧＩＦ−１６由来のＧＩＦ活性物とは、免疫学的に異な
ることが判明した。 【０２７１】また、プラスミドpcＤ−ＧＩＦ−１６及び
pcＤ−ＧＩＦ−２０７のｃＤＮＡの制限酵素地図を図４
に示す。更に之等のｃＤＮＡの塩基配列を塩基特異的化
学修飾法〔Ｍethods in Ｅnzymology,Ｖol. ６５，p ４
９９（１９８０）〕及びフアージＭ１３ベクター〔Ｇen
e,Ｖol. １９，p ２６９（１９８２）〕を使用したジデ
オキシ・チエーン・ターミネーシヨン〔Ｐroc.Ｎatl.Ａ
cad.Ｓci.,ＵＳＡ ,Ｖol. ７４ ,p ５４６３（１９７
７）〕により決定した。 【０２７２】その結果、pcＤ−ＧＩＦ−１６の有するｃ
ＤＮＡは、マーチらの報告するＩＬ−１βの翻訳領域 c
ＤＮＡ配列と同一であり、pcＤ−ＧＩＦ−２０７の有す
るｃＤＮＡは、同じくＩＬ−１αの翻訳領域ｃＤＮＡ配
列と同一であることが確認された〔Ｃarl Ｊ．Ｍarch e
t al.,Ｎature,Ｖol．３１５，p ６４１（１９８
５）〕。 【０２７３】(6) ポリペプチドＸＸＸIVの製造 上記(5)で得たフルレングス（full length ）に近いＩ
Ｌ−１βのｃＤＮＡクローンpcＤ−ＧＩＦ−１６を、制
限酵素ＰvuIIで切断し、更に制限酵素ＮcoＩで部分切断
して、３８０bpのＮcoＩ−ＰvuIIＤＮＡフラグメント
を、アロースゲル電気泳動法により単離、精製した。 【０２７４】このＤＮＡフラグメントにマング・ビーン
・ヌクレアーゼ（mung bean nuclease）を作用させて、
制限酵素ＮcoＩ切断により生じた接着末端を平滑末端と
した。 【０２７５】次に、合成オリゴヌクレオチド〔 5’−Ｇ
ＡＴＡＡＴＧ− 3’及び 5’−ＣＡＴＴＡＴ− 3’〕の
各５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン
酸化し、之等を先のＤＮＡフラグメントにＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結後、制限酵素ＣlaＩ及びＨind III
で切断し、アガロースゲル電気泳動法により、約４００
bpのＣlaＩ−Ｈibd III ＤＮＡフラグメント〈Ａ〉を単
離、精製した。 【０２７６】他方、前記で得た発現プラスミドp trp Ｇ
ＩＦ−αを、制限酵素ＣlaＩ及びＨind III で切断し、
大きい方のＤＮＡフラグメント〈Ｂ〉を、アガロースゲ
ル電気泳動方により単離、精製した。 【０２７７】上記フラグメント〈Ａ〉と〈Ｂ〉とをＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、連結物をエシェリヒア
・コリＨＢ１０１にトランスフオームさせた。ボイリン
グ法により、得られるトランスフォーマントのプラスミ
ドＤＮＡを抽出し、制限酵素による切断地図を解析し
て、目的のトランスフオーマントを選択した。 【０２７８】かくして単離された目的トランスフオーマ
ント（エシエリヒア・コリＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ−
α−Ｖ）を、５０μｇ／ｍｌＬ−トリプトファンを含む
ＬＢ培地１０ｍｌ中で、３７℃で一晩振盪培養し、この
１ｍｌを５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１％カザミノ
酸を含むＭ９最小培地５０ｍｌに植菌し、３７℃で振盪
培養し、５５０nmでの吸光度が約１．０となった時点で
菌体を集め、１５％シュークロース−５０ｍＭトリスＨ
Ｃｌ−５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液５ｍｌ
に懸濁させ、これに１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム〔１０ｍ
ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶解〕溶液５００μｌ
を加え、更に０．３％トリトンＸ１００−１８７．５Ｍ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）−１５０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ８．０）の溶液５ｍｌを加え、室温で１５分間放
置後、超音波処理を行ない、遠心分離により菌体抽出物
上清を得た。 【０２７９】得られた菌体抽出物上清について、ＧＩＦ
活性の測定を行なった所、培養液１ｍｌ当り１１２ユニ
ツトであった。 【０２８０】(7) ポリペプチドＸＸＸIIの製造 前記で得たプラスミドｐＧＩＦ−αを、制限酵素ＮcoＩ
及びＡccＩで切断して、約０．７kbの ＮcoＩ−ＡccＩ
ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法によ
り単離、精製した。このＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（クレノー断片）を用いた処理により、
その両末端を平滑末端とした。 【０２８１】他方、プラスミドp ＴＭ１を、制限酵素Ｈ
ind IIIで切断後、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断
片）を用いて、切断部位を平滑末端とした。 【０２８２】上記により得られる２つのＤＮＡフラグメ
ントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、連結物を
エシェリヒア・コリＨＢ１０１にトランスフォームし、
ボイリング法によりトランスフォーマントからプラスミ
ドＤＮＡを抽出し、制限酵素による切断地図から目的の
トランスフォーマントを選択した。 【０２８３】かくして単離されたトランスフォーマント
（エシェリヒア・コリＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ−α−
III）を、上記(6)に示すエシェリヒア・コリＨＢ１０１
／ptrp ＧＩＦ−α−Ｖの場合と同様にして培養後、菌
体抽出物上清を得た。この培養上清のＧＩＦ活性は培養
液１ｍｌ当り１９０ユニツトであった。 【０２８４】(8) ポリペプチドＸＸＸIII の製造 このポリペプチド発現プラスミドの作成は、サイト−ス
ペシフィック ミユータジェネシスの方法に従い、以下
に詳述するように不要な塩基配列部位を除去することに
より実施した。 【０２８５】即ち、ｐＧＩＦ−αを、制限酵素ＰstＩ及
び ＡccＩで切断後、アガロースゲル電気泳動法によ
り、約０．９kbのＰstＩ−ＡccＩＤＮＡフラグメントを
単離、精製し、その両末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを
用いて平滑末端とした。 【０２８６】このフラグメントを、別途にプラスミドp
ＴＭ１を制限酵素Ｈind IIIで切断後、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ（クレノー断片）を用いて平滑末端として調製し
たＤＮＡフラグメントに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
連結し、連結物をエシェリヒア・コリＨＢ１０１にトラ
ンスフォームし、目的トランスフォーマントを、ボイリ
ング法により抽出されたプラスミドＤＮＡの制限酵素地
図により選択した。また得られたプラスミドのＤＮＡ塩
基配列も確認した。以下このプラスミドを「pＴＭ１−
Ｉ−２」と呼ぶ。 【０２８７】次いで、プラスミドp ＴＭ１−Ｉ−２を、
制限酵素ＥcoＲＩ及びＨind IIIで切断して、約７４０b
pのＥcoＲＩ−Ｈind III ＤＮＡフラグメントを、アガ
ロースゲル電気泳動法により単離、精製した。これを、
Ｍ１３mp１１フアージ（ＲＦ）のＥcoＲＩとＨind III
の制限酵素部位に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
た。これから一本鎖（ss）ＤＮＡ（mp１１−trp−Ｉ２
（Ｅ／Ｍ））を得、これをミューダジェネシスの鋳型と
した。 【０２８８】合成オリゴヌクレオチド〔５’−ＣＡＣＧ
ＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＡＡＧＴＧ
ＣＴＣＣＴ−３’（プライマー）〕を、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼでリン酸化し、これをss mp １１−trp
−Ｉ−２（Ｅ／Ｍ）とハイブリダイズし、アニーリング
後、ｄＮＴＰｓの存在下にＤＮＡポリメラーゼＩ（クレ
ノー断片）及びＴ４ＤＮＡリガーゼで各々処理し、１５
℃で２晩インキユベートした。 【０２８９】得られたＤＮＡをＪＭ１０５コンピテント
細胞にトランスフォームし、生じたコロニーを、寒天プ
レート上に２００コロニー植菌し、３７℃で１８時間培
養した。生育したコロニーを含むフィルターを通常の方
法によりアルカリ処理変性し、乾燥後、８０℃で２時間
ベーキング処理した。このフィルターをハイブリダイズ
した後、このものと上記プライマーの５′末端を32Ｐ−
γ−ＡＴＰでラベルされた32Ｐ−プローベとを、室温で
ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたフイルタ
ーを６×ＳＳＣバッファーを用い、室温で１０分間、次
いで０．２５×ＳＳＣバッファーを用い６０℃で５分間
各々洗浄し、乾燥後、−７０℃で１８時間オートラジオ
グラフィーを行なった。 【０２９０】変異したクローンの内から、代表としてmp
１１−trp ＧＩＦ−α−IV（Ｅ／Ｍ）を選び、これをＪ
Ｍ１０５に感染させて培養し、ssＤＮＡ及びＲＦ ＤＮ
Ａを調製した。 【０２９１】上記で得られたssＤＮＡのＭ１３ジデオキ
シチェイン ターミネーション シークエンシングによ
り、目的遺伝子の削除を確認した。 【０２９２】また、ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ ＤＮ
Ａより約６３０bpのＥcoＲＩ−Ｈind III ＤＮＡフラグ
メントを、アガロースゲル電気泳動法により単離、精製
した。 【０２９３】一方、プラスミドp ＴＭ１−Ｉ−２より、
同様にして約４．２kbＥcoＲＩ−Ｈind III ＤＮＡフラ
グメントを、単離、精製し、これと先の約６３０bpのＥ
coＲＩ−Ｈind III ＤＮＡフラグメントとを、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結させ、連結物をエシェリヒア・
コリＨＢ１０１にトランスフォームさせた。 【０２９４】目的のトランスフォーマントは、ボイリン
グ法に従い、トランスフォーマントよりブラスミドを抽
出し、その制限酵素地図解析により選択した。 【０２９５】かくして単離されたトランスフォーマント
（エシェリヒア・コリＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ−α−
IV）を、前記(6)に示すエシェリヒア・コリＨＢ１０１
／p trp ＧＩＦ−α−Ｖの場合と同様にして培養後、菌
体抽出物上清を得た。この培養上清のＧＩＦ活性は培養
液１ｍｌ当り３３６ユニツトであった。 【０２９６】(9) ポリペプチドＸＸＸＩの製造 上記(8)と同様にして、所望のポリペプチド発現プラス
ミドp trp ＧＩＦ−α−IIを保有するトランスフォーマ
ントを作成した。 【０２９７】鋳型としては、先の一本鎖ＤＮＡmp１１−
trp−Ｉ−２（Ｅ／Ｍ）を用いた。またプライマーとし
ては、合成オリゴヌクレオチド〔５’−ＣＡＣＧＴＡＡ
ＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧＴＴＣＣ
ＣＴ−３’〕を用いた。 【０２９８】上記プラスミドを保有するトランスフォー
マント（エシェリヒア・コリＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ
−α−IIを同様にして培養後、菌体抽出物上清を得た。
この培養上清のＧＩＦ活性は培養液１ｍｌ当り１１２ユ
ニツトであった。 【０２９９】本発明ＩＬ−１β自身（ポリペプチドＩ）
及びその本発明誘導体のＧＩＦ活性については、既に記
載したが、加えて以下の試験を行なった。 【０３００】尚、前記したポリペプチドＩに対する抗血
清を用いて、ＲＩＡ法により測定したポリペプチドＩ換
算蛋白量（ｍｇ）当りのＬＡＦ活性（Ｕ）は、下記第５
表に示す通りである。 【０３０１】第 ５ 表ポリペプチド ＬＡＦ活性 （Ｕ／mg） ポリペフチドＩ ４．５×１０6 ポリペプチドII １．６×１０5 ポリペプチドIII ６．２×１０6 ポリペプチドIV ２．６×１０5 ポリペプチドＶ ２．１×１０5 ポリペプチドVI １．３×１０7 ポリペプチドVIII ８．０×１０ 3 薬理試験例１：ポリペプチドＩのＣＳＦ産生促進効果試
験 (1)ヒト肺細胞のＣＳＦ産生に対する促進効果試験ＣＳ
Ｆ産生株として、ヒト肺細胞由来株ＨＦＬ−１（Ｈuman
Ｅmbryonic lung Ｆibroblasts, ＡＴＣＣ登録細胞株
Ｎo.ＣＣＬ−１５３）を用い、以下の試験を行なった。 【０３０２】まず、上記ＨＦＬ−１細胞を２×１０5個
／ｍｌの細胞濃度となるように、１０％ウシ胎児血清加
ハムスター１２Ｋ培養液〔Ｈam, Ｒ．Ｇ.,Ｐroc.Ｎatl.
Ａcad.Ｓci.,５３，２８８（１９６５）〕に浮遊させ
た。次いで上記細胞懸濁液中に、種々の濃度に調製した
前記参考例で得たポリペプチドＩを加え、炭酸ガス培養
器内で３７℃で２４時間、４８時間及び７２時間各々培
養し、各培養上清を集め、之等培養上清中に産生蓄積さ
れたＣＳＦ量を、マウス骨髄細胞を使用して測定した
〔Ｌewis，Ｉ．Ｃ．et al., Ｊ．Ｉmmunol，１２８，１
６８（１９８２）〕。 【０３０３】ポリペプチドＩを用いて得られた各培養時
間(hr)での結果を図５に示す。図において、横軸はポリ
ペプチドＩの濃度（ＧＩＦ単位／ｍｌ）を、縦軸はＣＳ
Ｆ活性（単位／ｍｌ）を示す。 【０３０４】上記結果より、ポリペプチドＩの添加によ
れば、ＨＦＬ−１細胞株のＣＳＦ産生量は、該ポリペプ
チドの無添加に比べて実に数百倍にも亢進されることが
明らかである。 【０３０５】(2)ヒト皮膚由来細胞のＣＳＦ産生に対す
るポリペプチドＩの促進効果試験 ヒト正常皮膚由来細胞株としてＣＲＬ−１４４５（ＡＴ
ＣＣ．Ｎo.）を利用して以下の試験を行なった。 【０３０６】上記細胞を２×１０5個／ｍｌの細胞濃度
となるように１０％ウシ胎児血清加ダルベツコＭＥＭ培
養液〔Ｄulbeco，Ｒ．and Ｆreeman，Ｇ.,Ｖirology ，
８，３９６（１９５９）〕に浮遊させた。上記細胞浮遊
液に、種々の濃度の参考例で得たポリペプチドＩを加
え、炭酸ガス培養器内で３７℃で２４、４８及び７２時
間培養した後、培養上清を集め、産生されたＣＳＦ量を
マウス骨髄細胞を使用して上記試験(1)と同様にして測
定した。 【０３０７】得られた結果を図５と同様にして、図６に
示す。 【０３０８】図６より、ＧＩＦ活性として１単位／ｍｌ
以上のポリペプチドＩをヒト正常皮膚由来の原線維芽細
胞に加えることにより、該細胞のＣＳＦ産生能は著しく
促進されることが明らかである。 【０３０９】(3)生体内でのＣＳＦ産生に対する促進効
果試験 ポリペプチドＩを生体内に投与した場合、生体内でのＣ
ＳＦ産生亢進作用が発２されることを以下の動物実験に
より試験した。 【０３１０】即ち、正常マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ系マウ
ス、静岡県実験動物協同組合より購入）に、種々の量の
参考例で得たポリペプチドＩ（ＧＩＦ活性として１０5
〜１０5単位／個体）を静脈内投与した。上記投与後
２、４、８、１２及び２４時間目に各実験動物より採血
し、血清中のＣＳＦ濃度をマウス骨髄細胞を用いて測定
した。 【０３１１】結果を図７に示す。図において横軸は各種
濃度（ＧＩＦ単位／個体）のポリペプチドＩの投与後時
間（hr）を、縦軸はＣＳＦ活性（単位／ｍｌ血清）を各
々示す。また図中（１）はポリペプチドＩの１０万ＧＩ
Ｆ単位／個体投与群を、（２）は同１万ＧＩＦ単位／個
体投与群を、（３）は同１０００ＧＩＦ単位／個体投与
群を、また（４）は対照群（ＨＳＡ１０μｇ／個体投与
群）を各々示す。 【０３１２】図７より、ポリペプチドＩを動物に与えた
場合、動物血清中のＣＳＦ濃度は著しく高くなっている
ことが判明した。即ち、ポリペプヂトＩは注射された量
に比例して生体内でのＣＳＦ産生を著しく亢進させる作
用のあることが認められた 薬理試験例２：ポリペプチドＩの抗関節炎試験 (1) パースン〔Ｐearson，Ｃ．Ｍ.,Ｐroc.Ｓoc. Ｅxp.
Ｂiol.Ｍed.,９１，９５（１９５６）〕及びワードと
ジヨーンズ〔Ｗard,Ｊ. Ｒ.,Ｊones, Ｒ．Ｓ.,Ａrthrit
is Ｒheumatism,５，５５７（１９６２）〕の方法に準
じて、アジユバント関節炎ラツトを作製した。即ち、雌
性Ｓ．Ｄ．系ラツトの尾根部皮内に、ミコバクテリウム
・ブチリカム（Ｍycobacterium butyricum）死菌を流動
パラフインに懸濁させたアジユバントを０．０５ｍｌ注
射した。１４日目に足腫脹に基づいて群分けし（n ＝
６）、その翌日より５日間に亘って、参考例で得たポリ
ペプチドＩ又はその溶媒（生理食塩水；対照群）を、皮
内投与した。経日的に足容積を測定することにより、関
節炎に対する影響を評価した。 【０３１３】結果を図８に示す。図において横軸はアジ
ユバント投与後日数（日）を、縦軸は足体積（×０．０
１ｍｌ）を各々示す。また図中（１）はポリペプチドＩ
の１０万ＧＩＦ単位／個体投与群を、（２）は同１万Ｇ
ＩＦ単位／個体投与群を、（３）は同１０００ＧＩＦ単
位／個体投与群を、（４）は同１００ＧＩＦ単位／個体
投与群を、（５）は対照群（生理食塩水投与群）を、ま
た（６）は正常ラツト群を各々示す。 【０３１４】図８より、対照群（グラフ（５））の足腫
脹は、２３日目まで増悪したのに対し、ポリペプチドＩ
の投与群（グラフ（１）〜（４））においては、その投
与の４日目（アジユバンド投与後１８日目）より足腫脹
の抑制作用が認められ、最終投与４日後（アジユバンド
投与後２３日目）においても関節炎の進行を阻止できる
ことが確認された。 【０３１５】薬理試験例３：本発明誘導体のＣＳＦ産生
促進効果試験 細胞株Ｕ−３７３ＭＧ〔ＡＴＣＣ ＨＴＢ１７、Ｇliob
lastoma,Ａstrocytoma, Ｈuman〕を用いて、以下の試験
を行なった。 【０３１６】上記細胞を、２×１０5個／ｍｌの細胞濃
度となるように、１０％ＦＣＳ（GIBCO 社製）、ＭＥＭ
非必須アミノ酸（Ｆlow 社製）及びＭＥＭピルビン酸ナ
トリウム（Ｆlow 社製）を添加したイーグルＭＥＭ培地
（日水社製）に浮遊させ、種々の濃度となるように被験
物質を加えて、炭酸ガス培養器内で３７℃で２４時間培
養した。 【０３１７】各培養上清を集め、之等培養上清中に産生
蓄積されたＣＳＦ量を、マウス骨髄細胞を使用して測定
した〔Ｌewis，Ｉ．Ｃ．et al., Ｊ．Ｉmmunol，１２
８，１６８（１９８２）〕。 【０３１８】結果を図９に示す。図において、横軸は被
験物質の濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、縦軸はＣＳＦ活性（Ｕ
／ｍｌ）を示す。また、図中、曲線（１）〜（７）は、
以下の各ポリペプチドを被験物質とした時の結果を示
す。 【０３１９】曲線（１）…ポリペプチドVI 曲線（２）…ポリペプチドII 曲線（３）…ポリペプチドVIII 曲線（４）…ポリペプチドＶ 曲線（５）…ポリペプチドIV 曲線（６）…ポリペプチドIII 曲線（７）…ポリペプチドＸＸＸ 薬理試験例４：本発明誘導体の抗炎症試験 ウインター（Ｗinter ）らの方法〔Ｐroc.Ｓoc．Ｅxpt
l. Ｂiol.Ｍed.,１１１，５４４−５４７（１９６
２）〕に準じて、この試験を行なった。 【０３２０】即ち、６〜８週齢の雄ラツト（Ｓpraque
Ｄawley 系、日本チャールスリバー社）を、実験前日に
体重に基づいて１群６〜８匹の各群に分けて用いた。起
炎剤としてカラゲニン（Ｍarine Ｃolloid社製）を、生
理食塩水に１％となるように懸濁させたものを使用し、
ラツトの右後肢足蹠皮下に０．１ｍｌ注射して足浮腫を
惹起させた。足浮腫を評価するため、起炎剤注射の前後
の一定時間に、右後肢足蹠容積を、プレシモメーター
（plethysmometer，Ｕgo−Ｖasile 社製）を用いて測定
した。前値に対する起炎剤注射後の容積増加率を浮腫率
（swelling％）として表わした。 【０３２１】被験物質は、ダルベッコのリン酸塩緩衝食
塩水（Ｄulbeco s phosphate buffered saline）に溶解
希釈し、ラツトの背部皮内に０．１ｍｌ宛、起炎剤注射
の１時間前に注射した。尚、対照群として、溶媒投与群
を作成し、同一実験に供した。 【０３２２】結果を図１０に示す。 【０３２３】図において横軸は、起炎剤投与後時間（h
r）を、縦軸は浮腫率（％）を示す。また、図中、曲線
（１）は対照群を、曲線（２）はポリペプチドVIの０．
１μｇ投与群を、曲線（３）はポリペプチドVIの１μｇ
投与群を、曲線（４）はポリペプチドVIの１０μｇ投与
群をそれぞれ示す。 【０３２４】薬理試験例５：本発明誘導体の放射線障害
防止作用試験 ＢＡＬＢ／ｃ系マウス（９週齢）に致死量のＸ線を照射
する２０時間前に、ポリペプチドVIの１μｇ／マウス又
は０．３μｇ／マウスを腹腔内注射した。Ｘ線照射装置
（ＭＢＲ−１５０５Ｒ、日立メディコ社）を使用し、８
５０レントゲンのＸ線を、上記マウスに全身照射し、以
後、毎日その生存を確認した。尚、コントロールとし
て、ＰＢＳ投与群をおいた。 【０３２５】結果を図１１に示す。図において横軸はＸ
線照射後の日数（日）を、縦軸は供試動物の生存率
（％）を示し、曲線（１）はポリペプチドVIの１μｇ投
与群を、曲線（２）はポリペプチドVIの０．３μｇ投与
群を、また曲線（３）はコントロール群をそれぞれ示
す。 【０３２６】図１１より、コントロール群では、Ｘ線照
射後１８日目に全例死亡したのに対し、ポリペプチドVI
投与群では、その投与量に依存して、放射線障害の防止
作用が認められ、１μｇ投与群では、約８割が放射線障
害による死亡から回避され、生存することが確認され
た。 【０３２７】薬理試験例６：本発明誘導体の日和見感染
防御効果試験 易感染モデルマウスを用いて、以下の試験を実施した。 【０３２８】ＩＣＲ系雄性マウス（６週齢）を供試動物
（１群７匹）とし、第１日目に、５−フルオロウラシル
（５−Ｆu 、協和醗酵社製）１００ｍｇ／ｋｇを静脈内
投与した。第２日目、第４日目及び第６日目に、ポリペ
プチドVIの１μｇ／マウスを皮下投与し、第７日目に、
緑膿菌（Ｐseudomonas aeruginosa Ｅ−２）の所定量を
腹腔内投与して感染させた。第１０日目に供試動物の生
存数を計数して、生存率（％）を求めた。 【０３２９】結果を図１２（１）〜（３）に示す。 【０３３０】図１２（１）は上記実験群の結果を、同
（２）はポリペプチドVIを投与しなかった（５−Ｆu の
みを投与した）対照群の結果を、また同（３）は５−Ｆ
u 及びポリペプチドVIのいずれも投与しなかった対照群
の結果をそれぞれ示す。 【０３３１】第１２図中、縦軸は生存率（％）を、横軸
は下記各緑膿菌投与量を採用した群Ａ〜Ｅをそれぞれ示
す。 【０３３２】Ａ群…１９０００菌数／マウス投与群 Ｂ群… ３８００菌数／マウス投与群 Ｃ群… ７５０菌数／マウス投与群 Ｄ群… １５０菌数／マウス投与群 Ｅ群… ３０菌数／マウス投与群 Ｆ群… ６菌数／マウス投与群 製剤例１ ＧＩＦ活性として１×１０7単位／ｍｌのポリペプチドV
Iの生理食塩水溶液に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）
を０．５％となるように添加して、濾過（０．２２μm
メンブランフイルター）後、これを無菌的に１ｍｌずつ
バイアル瓶に分注して凍結乾燥し、注射用製剤を調製し
た。 【０３３３】かくして得られた製剤は、これを用時注射
用蒸留水１ｍｌに溶解して利用される。 【０３３４】〈動物細胞からのサイトカインの製造方
法〉 (1) 種々の濃度のポリペプチドＸＸＸVII 及び０．０
１％ＰＨＡ−Ｐ存在下に、ＨＢＳ−２Ｃ５Ｂ２細胞
〔Ｊ．Ｉmmunol.,１３１，１６８２−１６８９（１９８
５）〕を、２×１０5cells／wellにて培養した。培養２
４時間後の上清を採取し、そのＩＬ−２活性を、スミス
（Ｋ．Ａ．Ｓmith）らの方法に従い、ＩＬ−２依存性マ
ウスＴ細胞（ＣＴＬＬ２）を用いて測定した〔Ｊ．Ｉmm
unol.,１２０，２０２７（１９７８））〕。 【０３３５】結果を下記第６表に示す。 【０３３６】(2) Ｕ−３７３ＭＧ細胞を、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ
−１６４０培地で集密的まで培養し、更に２０ｎｇ／ｍ
ｌのポリペプチドＸＸＸVII を含む又は含まない（コン
トロール）上記培地中で１８時間インキュベートした。 【０３３７】培地を除去した後、前記実施例３−(2)に
準じて、グアニジニウム／セシウムクロライド法により
ＲＮＡを抽出し、オリゴ(ｄＴ）−セルロースクロマ
トグラフィーにより、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
を収得した。ノザン・ブロッティング法（Ｎorthern bl
otting）に従い、上記ポリ（Ａ）+ ＲＮＡの１０μｇを
アガロースゲル（１．２％）電気泳動に付し分画後、ニ
トロセルロース・フィルターに転写した。減圧下に８０
℃でベーキングし、２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．
０）中で１００℃５分間の処理後、５０％フォルムアミ
ド、５×ｓｓｃ、５０ｍＭソジウムフォスフェート（ｐ
Ｈ６．５）、４×デンハード液（Ｄenhardt's solutio
n）及び２００μｇ／ｍｌの変性サルモン スペラムＤ
ＮＡ中で４２℃下にプリハイブリダイゼーションを行っ
た。 【０３３８】５時間後、ニックトランスレーションで放
射能標識したＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡ〔Ｓcience, ２２
８，８１０（１９８５）〕のＰstＩ−ＮcoＩＤＮＡ断片
又はＢＳＦ−２ｃＤＮＡ〔Ｎature, ３２４，７３（１
９８６）〕のＫpnＩ−ＢamHＩＤＮＡ断片と、４２℃下
に２０時間ハイブリダイゼーションを行った。フィルタ
ーを、０．１％ＳＤＳ加２×ｓｓｃで室温下に１５分
間、更に０．１％ＳＤＳ加０．１×ｓｓｃで５０℃下に
１時間洗浄した。オートラジオグラムは、増感紙を用い
て、−７０℃下に一夜行った。 【０３３９】ＧＭ−ＣＳＦのＤＮＡ断片を用いた時の結
果を図１３に示す。レーンＡは本発明ポリペプチドを用
いた結果を、レーンＢは本発明ポリペプチドを用いない
コントロールの結果を示す。 【０３４０】また、ＢＳＦ−２のＤＮＡ断片を用いた時
の結果を図１３に準じて図１４に示す。 【０３４１】以上に示す結果より、本発明ポリペプチド
を用いることにより、動物細胞からの天然サイトカイン
類の生産が効率よく行い得ることが判る。 【０３４２】また、本発明ポリペプチドの、かかる方法
への適用に際しては、極めて微量、通常１０ｎｇ／ｍｌ
程度の使用で十分であり、誘導されたサイトカイン類の
精製過程をも容易にする。 【０３４３】(3) 動物細胞よりサイトカインを生産す
る場合、産生誘引に使用する本発明ポリペプチドがその
条件下において構造的に安定であり、細胞表面上のＩＬ
−１受容体に結合することが必須である。すなわち、本
発明ポリペプチドがＩＬ−１受容体に結合し、サイトカ
イン産生に必要なシグナルを細胞内に伝えることが重要
である。 【０３４４】そこで、線維芽細胞上のＩＬ−１受容体へ
の結合に関して、以下の試験を行った。 【０３４５】６−wellプレート上で、一面にほぼ均一に
まで増殖したＢalb ／３Ｔ３細胞（クローンＡ３１：Ａ
ＴＣＣ，ＣＣＬ−１６３、１×１０6cells／well）に、
125Ｉで標識したポリペプチドＩ（ＩＬ−１β）の５０
０００cpm／well及び事前に１０％ＦＣＳ加Ｄ−ＭＥＭ
中で３７℃下にインキユベートした２０ｎｇ／ｍｌのポ
リペプチドＩを加え、４℃で反応させた。反応液をパス
ツールピペットで除き、１０％ＦＣＳ加Ｄ−ＭＥＭの
１ｍｌを加えて静かに洗い上清をすてた。この洗浄操作
を２回繰返した後、１ｍｌの１％ＳＤＳ、０．２Ｎ Ｎ
ａＯＨで細胞を可溶化し、可溶化液及びさらにウエルを
洗浄した可溶化液中の放射能（結合放射能）をγ−カウ
ンターにて測定した。 【０３４６】尚、上記 125Ｉ標識ポリペプチドＩは、ボ
ルトンとハンター（Ｂolton and Ｈunter）の方法〔Ｂi
ochem. Ｊ.,１３３，５２９（１９７３）〕に従い製
造、精製した（比活性；２５０μＣｉ／μｇprotein 以
上）。 【０３４７】得られた結果を下記第７表に示す。 【０３４８】 阻止能（％）＝（Ａ−Ｃ）／（Ａ−Ｂ）×１００ Ａ：未標識ポリペプチドＩが存在しない時の結合した放
射能 Ｂ：プレートに非特異的に吸着した放射能 Ｃ：結合した放射能の実測値 かかる指標は、共存させたポリペプチドＩのＩＬ−１受
容体への結合力を表わす。 【０３４９】上記第７表より、ポリペプチドＩ、即ちＩ
Ｌ−１β自体は、サイトカイン誘導条件下において、時
間の経過と共に、ＩＬ−１受容体への結合力が低下して
しまうことが明らかとなった。 【０３５０】そこで、上記において、２４時間の事前の
インキュベーションを行ったポリペプチドＩ、ポリペプ
チドVI又はポリペプチドＸＸＸVII を用いた同試験を行
った。 【０３５１】結果を下記第８表に示す。 【０３５２】 上記結果より、動物細胞からのサイトカイン類製造に際
しては、ＩＬ−１β自体よりも、本発明ポリペプチドを
採用するのがより好ましいことが判る。 【０３５３】 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１５３ 配列の型： アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys 5 10 15 Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln 20 25 30 Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln 35 40 45 Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu 50 55 60 Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu 85 90 95 Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe 100 105 110 Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu 115 120 125 Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr 130 135 140 Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 145 150 153 配列番号：２ 配列の長さ：１１６ 配列の型： アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Ala Glu Val Pro Glu Leu Ala Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser 5 10 15 Gly Asn Glu Asp Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Lys Gln Met 20 25 30 Lys Cys Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly Ile 35 40 45 Gln Leu Arg Ile Ser Asp His His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gln Ala 50 55 60 Ala Ser Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro 65 70 75 80 Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe 85 90 95 Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn Glu Ala 100 105 110 Tyr Val His Asp 115 116 配列番号：３ 配列の長さ：１５３ 配列の型： アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys 5 10 15 Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln 20 25 30 Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln 35 40 45 Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu 50 55 60 Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Ser Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu 85 90 95 Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe 100 105 110 Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu 115 120 125 Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr 130 135 140 Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 145 150 153
はインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）の新しい誘導
体、並びにＩＬ−１β及びその新しい誘導体の医薬用途
に関する。 【０００２】第２回国際リンホカインワークシヨツプに
おいて、かつてリンパ球活性化因子（Ｌymphocyte Ａct
ivating Ｆactor ；ＬＡＦ）、マイトジエニツク プロ
テイン（Ｍitogenic Ｐrotein）、ヘルパーピーク−１
（Ｈelper peak−１）、Ｔリンパ球代替因子〔Ｔ−cell
replacing factorIII（ＴＲＦ−III ）、Ｔ−cell rep
lacing factor Ｍφ（ＴＲＦＭ）〕、Ｂセルアクチベー
テイング フアクター（Ｂ−cell activating facto
r）、Ｂリンパ球分化因子（Ｂ−cell differationfacto
r ）などの呼称で報告されてきた生理活性物質は、いず
れもインターロイキン−１（ＩＬ−１）なる呼称に統一
されることが決定された〔Ｃellular Ｉmmunol. ，４
８、４３３−４３６（１９７９）〕。この決定は、上記
各生理活性物質は物質として区別できず生理活性を異な
る角度から把えて表現していたにすぎないとの理由に基
づいている。 【０００３】上記ＩＬ−１は、更に例えばＴリンパ球や
Ｂリンパ球を活性化し、インターロイキン２の産生亢進
作用や抗体産生を亢進させる作用を有し、また肝細胞に
作用して蛋白質合成を亢進させる作用、プスタグランデ
イン産生を亢進させる作用等を有することも報告されて
いる〔Ｒeviews of Ｉnfectious Ｄisease，Ｖol. ６，
No. １，５１−５９（１９８４）、Ｎew Ｅngland.
Ｊ．of Ｍed. ，３１１，１４１３（１９８４）等参
照〕。 【０００４】しかして、物質としてのＩＬ−１の本体に
関しては現在尚不明ではあるが、最近になってＬＡＦ活
性を有するポリペプチドもしくはその前駆体をコードす
る異なる２種の遺伝子の存在がようやく報告された〔Ｐ
roc.Ｎatl.Ａcad ．Ｓci. ，Ｖol. ８１，７９０７−７
９１１（１９８４）、Ｎature ．Ｖol. ３１５，６４１
（１９８５）、ＮucleicＡcid Ｒesearch ，Ｖol. １３
（１６），５８６９（１９８５）〕。これらの報告は２
種の遺伝子の塩基配列から推定される１５９個のアミノ
酸配列を有する「ＩＬ−１α」と１５３個のアミノ酸か
らなる「ＩＬ−１β」を記している。 【０００５】しかしながら、従来よりコンデイシヨンド
メデイウム（conditioned medium）もしくは部分精製
したと報告されるものの前述の生理活性と、上記塩基配
列から推定されるポリペプチドとの関連は、今尚明らか
にはされていない。 【０００６】また、上記公知の生理活性物質としてのＩ
Ｌ−１は、内因性の発熱物質（endogeneous pyrogen ：
ＥＰ）とも同一物質であるとされ、発熱性を示すことが
知られている〔Ｎature ，３０４，４４９（１９８
３）；Ｃell.Ｉmmunol. ，６３，１６４（１９８１）；
Ｊ．Ｅxp．Ｍed.,１５０，７０９（１９７９）；Ｊ．Ｉ
mmunol. ，１３０，（６）２７０８（１９８３）；同，
１３２（３）１３１１（１９８４）等参照〕。この事実
から、従来の生理活性としてのＩＬ−１はもとより、仮
に物質として均一なＩＬ−１が提供されたとしても、そ
の医薬用途への適用は、極めて困難とされている。 【０００７】本発明は医薬用途に有効に使用できる新し
い有用なＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドを提供し
ようとするものである。 【０００８】本発明は新しいＩＬ−１β誘導体であるポ
リペプチドの医薬用途を提供しようとするものである。 【０００９】本発明は新しいＩＬ−１β誘導体をコード
する遺伝子及びこれを用いて遺伝子工学的手法でＩＬ−
１β誘導体であるポリペプチドを製造する方法を提供し
ようとするものである。 【００１０】本発明はまた均質なＩＬ−１β自身の新し
い医薬用途を提供しようとするものである。 【００１１】上記本発明の目的及びそれら以外の本発明
の目的は以下の記載により明かにする。 【００１２】本発明のＩＬ−１β誘導体（ポリペプチ
ド）はインターロイキン−１βの下記（Ａ）式で表わさ
れるアミノ酸配列に於て、 式（Ａ） 【００１３】 【化６】【００１４】ａ）１位Ａla、３位Ｖal、４位Ａrg、５位
Ｓer、８位Ｃys、１１位Ａrg、３０位Ｈis、７１位Ｃy
s、９３位Ｌys、９７位Ｌys、９８位Ａrg、９９位Ｐh
e、１０３位Ｌys、１２０位Ｔrp、１２１位Ｔyr及び１
５３位Ｓerから選ばれた少なくとも１つのアミノ酸残基
が欠失されているか又は他のアミノ酸で置換されている
こと、 ｂ）１位のＡlaから９位のＴhrに至るアミノ酸配列又は
その中の少くとも１つのアミノ酸残基が欠失されている
こと（但し上記ａに記載の１位Ａla、３位Ｖal、４位Ａ
rg、５位Ｓer及び８位Ｃysから成る群から選ばれたアミ
ノ酸残基の少くとも１つが欠失されている場合を除
く）、 ｃ）１０３位のＬysから１５３位のＳerに至るアミノ酸
配列又はその中の少くとも１つのアミノ酸残基が欠失さ
れていること（但し上記ａに記載の１０３位Ｌys、１２
０位Ｔrp、１２１位Ｔyr及び１５３位Ｓerから成る群か
ら選ばれたアミノ酸残基の少くとも１つが欠失されてい
る場合を除く）、 ｄ）式（Ａ）のＮ末端に、Ｍet又は下記式（Ｂ）で示さ
れる１’位のＭetから１１６’位のＡspに至るアミノ酸
配列若しくはそのＣ末端側の一部のアミノ酸配列が付加
されていること、 式（Ｂ） 【００１５】 【化７】【００１６】というａ）〜ｄ）の条件の少くとも１つを
充足する改変されたアミノ酸配列を有することにより特
徴付けられる（但し、少くとも７１位Ｃysが他のアミノ
酸で置換されたポリペプチドを除く）。 【００１７】上記及び以下の本明細書に於けるアミノ酸
及びポリペプチドの表示は、ＩＵＰＡＣ及びＩＵＡＣ−
ＩＵＢによる命名法又は規則に於ける略号乃至当該分野
で慣用されている略号による表示法に従うものとする。
また塩基配列に於ける核酸の表示も同様とする。アミノ
酸の数又は位置は、欠落及び付加がある場合であって
も、全てＩＬ−１βのアミノ酸配列即ち前記式（Ａ）ア
ミノ酸配列に従って表示する。但しアミノ酸位置を示す
数値のうちダツシユを付したものは式（Ｂ）のアミノ酸
配列に従う。 【００１８】本発明のＩＬ−１β誘導体は、ＩＬ−１β
の前記式Ａ）に示されるアミノ酸配列において、上記
ａ）〜ｄ）の要件の１つ又は２以上を組み合わせて充足
するアミノ酸配列を含有する新規なポリペプチドであ
る。好ましい誘導体は前記要件ａ）〜ｃ）の少くとも１
つを充足するアミノ酸配列を有するもの及びａ）〜ｃ）
の少くとも１つの要件とｄ）の要件とを同時に満足する
アミノ酸配列を有するものである。 【００１９】本発明のＩＬ−１β誘導体であるポリペプ
チドの好ましい具体例を挙げると次の通りである。 【００２０】１）少くとも１位Ａlaが欠失されているか
又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００２１】２）少くとも３位Ｖalが欠失されているか
又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００２２】３）少くとも４位Ａrgが欠失されているか
又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００２３】４）少くとも５位Ｓerが欠失されているか
又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００２４】５）少くとも８位Ｃysが欠失されているか
又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００２５】６）少くとも１１位Ａrgが欠失されている
か又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００２６】７）少くとも３０位Ｈisが欠失されている
か又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００２７】８）少くとも７１位Ｃysが欠失されている
か又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００２８】９）少くとも９３位Ｌysが欠失されている
か又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００２９】10）少くとも９７位Ｌysが欠失されている
か又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００３０】11）少くとも９８位Ａrgが欠失されている
か又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００３１】12）少くとも９９位Ｐheが欠失されている
か又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００３２】13）少くとも１０３位Ｌysが欠失されてい
るか又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００３３】14）少くとも１２０位Ｔrpが欠失されてい
るか又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００３４】15）少くとも１２１位Ｔyrが欠失されてい
るか又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００３５】16）少くとも１５３位Ｓerが欠失されてい
るか又は他のアミノ酸で置換されているポリペプチド。 【００３６】17）１位のＡlaから３位のＶalに至るアミ
ノ酸配列、１位のＡlaから６位のＬeuに至るアミノ酸配
列又は１位のＡlaから９位のＴhrに至るアミノ酸配列が
少くとも欠失されているポリペプチド。 【００３７】18）１５１位Ｖalから１５３位Ｓerに至る
アミノ酸配列、１４９位Ｇlnから１５３位Ｓerに至るア
ミノ酸配列、１４５位Ａspから１５３位Ｓerに至るアミ
ノ酸配列、１４１位Ｇlnから１５３位Ｓerに至るアミノ
酸配列、１２１位Ｔyrから１５３位Ｓerに至るアミノ酸
配列又は１０３位Ｌysから１５３位Ｓerに至るアミノ酸
配列が少くとも欠失されているポリペプチド。 【００３８】19）式（Ａ）のＮ末端にＭet、式（Ｂ）で
表わされるアミノ酸配列７７’位のＭetから１１６’位
Ａspに至るアミノ酸配列、７１’位Ｍetから１１６’位
Ａspに至るアミノ酸配列、３２’位Ｍetから１１６’位
Ｓerに至るアミノ酸配列又は１’位Ｍetから１１６’位
Ａspに至るアミノ酸配列を少くとも有するポリペプチ
ド。 【００３９】上記本発明のＩＬ−１β誘導体は、ＩＬ−
１βのアミノ酸配列の特定位置の特定アミノ酸が他のア
ミノ酸で置換されたアミノ酸配列を有するポリペプチド
を包含するが、この置換を行い得る他のアミノ酸は、人
体蛋白質を構成するα−アミノ酸であれば、いずれでも
よいが、中性アミノ酸であるのが好適である。但し、Ｃ
ysは、そのＳＨ基に基づいて、分子内又は分子間ジスル
フイド結合を形成することがあり、これを考慮すれば該
アミノ酸はＣys以外の上記アミノ酸であるのが好まし
い。特に好ましいものとして例えば４位Ａrgの場合はＧ
lyを、８位Ｃysの場合はＳer又はＡlaを、１１位Ａrgの
場合はＧlnを、３０位Ｈisの場合はＴyrを、７１位Ｃys
の場合はＳer、Ａla又はＶalを、９３位Ｌysの場合はＬ
euを、９８位Ａrgの場合はＬeuを、１０３位Ｌysの場合
はＧlnを、１２０位Ｔrpの場合はＡrgを、１２１位Ｔyr
の場合はＧlnを、それぞれ好ましいものとして例示する
ことができる。 【００４０】本発明のＩＬ−１β誘導体ならびに本明細
書に記載の方法に従い得られる均質なＩＬ−１βは、例
えばＬＡＦ活性、腫瘍細胞増殖抑制活性（ＧＩＦ活
性）、即ち腫瘍細胞に対して特異的にその増殖を抑制す
る活性、コロニー刺激因子（Ｃolony stimulating fact
or：ＣＳＦ）、インターフエロン（interferon：ＩＦ
Ｎ）、インターロイキン２（interleukin −２：ＩＬ−
２）、インターロイキン３（interleukin −３：ＩＬ−
３）等の種々のサイトカイン（cytokine）類の産生促進
活性、即ち例えばヒト細胞に作用してそれらサイトカイ
ン類の産生を著しく促進させる活性、抗炎症活性、特に
例えば関節炎モデル動物に投与することによって関節炎
の進行を効果的に抑制する活性、放射線障害防止作用、
即ち骨髄移植時の放射線全身照射、癌治療等における放
射線照射、放射線事故時における生体障害乃至は重篤な
副作用等を予防する作用乃至防止する作用等を有してい
る。本発明誘導体は上記各活性のいずれか少なくともひ
とつの点で優れているか、或いは（及び）より毒性が低
く副作用が少ない点で優れている。従って本発明誘導体
ならびに上記の均質なＩＬ−１βは例えば抗体産生促進
やワクチンの効果増強等の免疫系刺激剤、抗腫瘍剤、例
えばＣＳＦ、ＩＬ−２及びＩＬ−３等のサイトカイン産
生促進剤、抗炎症剤、放射線障害防止剤等の医薬品とし
て有用である。 【００４１】殊に上記均質なＩＬ−１β自身が関節炎等
の炎症に著効を示すという本発明による新たな知見は、
従来ＩＬ−１が炎症をメデイエートし、その惹起に関与
するとされていた事実によれば、おどろくべきことてあ
る。また、本発明誘導体は上記各活性のいずれか少なく
ともひとつの点で優れているか、或いは（及び）より毒
性が低く副作用が少ない点で優れている。 【００４２】とりわけ、本発明誘導体は、ＣＳＦ産生促
進剤として有効であり、これをヒトに投与するときに
は、ウィルス感染や抗原抗体反応等の危険性を生じるこ
となく、癌化学療法や放射線療法後の骨髄低形成による
顆粒球減少を有効に回復できる（顆粒球減少治療剤）。
上記ＣＳＦ産生促進剤は、またその本来のＣＳＦ産生促
進作用により、ＣＳＦの作用に基づく各種疾病の予防及
び治療剤としても有効に利用できる。例えば、ＣＳＦは
顆粒球やマクロファージの機能を促進させる作用がある
〔ロペッツら（Ｌopez, Ａ．Ｆ．et al.),Ｊ．Ｉmmuno
l.,１３１，２９８３（１９８３）、ハンダムら（Ｈand
am,Ｅ．et al.),同１２２，１１３４（１９７９）及び
バダスら（Ｖadas, Ｍ．Ａ．et al.), 同１３０，７９
５（１９８３）〕ので、種々の感染症の予防及び治療剤
として臨床応用が期待されており、上記ＣＳＦ産生促進
剤も同様に臨床応用が期待される。 【００４３】殊に、近年生体防御能が低下乃至障害され
た個体（compromised host）に、それまで無害であった
病原体が病原性を発揮して惹起される、所謂日和見感染
症（opportunistic infection 或いは terminal infec
tion）は、臨床的に問題となる病原体（起炎菌）がシュ
ードモナス（Ｐseudomonas）セラティア（Ｓerratia)等
のグラム陰性桿菌、ヘルペス（Ｈerpes simplex,ＨＳ
Ｖ）、バリセラ−ゾースタ（Ｖaricella zoster,ＶＺ
Ｖ）、サイトメガロウイルス（Ｃytomegalovirus，ＣＭ
Ｖ）等のウイルス、キャンディダ（Ｃandida albicans
）アスペルギルス（Ａspergillus fumigatus）、ノカ
ルディア（Ｎocardia asteroidea）等の真菌、カリニ原
虫（Ｐneumocystis carinii)、トキソプラズマ（Ｔoxop
lasma gondii）等の原虫等であり、現用の抗生物質中に
は、之等の病原菌に対して充分な効果を奏し難く、該日
和見感染症に対する新しい薬剤の研究開発が切望されて
いる。本発明誘導体は、かかる日和見感染症の予防及び
治療剤としても有用であり、特にかかる日和見感染症が
高頻度に見られる抗癌剤投与時、即ち急性白血病の化学
療法や骨髄移植時における各種の感染症、例えばガンジ
ダ症、クリプトコックス症、アスペルギルス症、接合菌
症、黒色真菌感染症、ウィルス感染症、サイトメガロウ
ィルス肺炎、之等の合併症等の予防及び治療剤として有
用なものである。更に本発明誘導体ならびに上記のＩＬ
−１βは、上記医薬用途以外に、そのサイトカイン産生
促進活性に基づいて、例えば細胞株からの各種有用サイ
トカインのインビトロ（in vitro）製造に際して極めて
有効に使用し得る。かかる細胞株からの天然型サイトカ
インの製造は、ことに糖蛋白質であるサイトカインにお
いて着目されており、効率的にかつ大量に有用サイトカ
インを収得することができる本発明誘導体中、少くとも
７１位Ｃysを置換乃至は欠失させたもの、特に上記Ｃys
を他のアミノ酸、例えばＳer、Ａla、Ｖal等で置換した
ものは、高活性を示す。 【００４４】また、少くとも４位Ａrg又は少くとも８位
Ｃysを置換乃至は欠失させた本発明誘導体、及び少くと
も１０３位以降の少なくともひとつのアミノ酸を欠失さ
せた本発明誘導体は、いずれもプロスタグランジンＥ
（ＰＧＥ）産生促進作用が弱く、従って発熱作用等の副
作用ならびに毒性がより少ない特徴を有し、更に少くと
も４位Ａrgを置換乃至は欠失させた本発明誘導体は、Ｇ
ＩＦならびにＬＡＦ活性に比較して、ＣＳＦ産生促進活
性ならびに抗炎症活性がより強い特徴を有している。 【００４５】更に、本発明誘導体中、式（Ａ）のＮ末端
に少くとも上記特定のアミノ酸もしくはポリペプチドが
付加したものは、ＧＩＦ活性及びＬＡＦ活性に比してＣ
ＳＦ産生促進作用及び抗炎症作用がより高い特徴を有
し、しかも毒性が低く且つ作用の持続性の点で医薬品と
して、殊に経口剤乃至は座剤として利用する場合に、よ
り有効である。 【００４６】更に、本発明誘導体、ことに少くとも８位
Ｃys及び／又は７１Ｃysを置換乃至は欠失させたもの、
特に上記Ｃysを他のアミノ酸、例えばＳer、Ａla、Ｖal
等で置換したものは、種々の条件下におけるＩＬ−１受
容体への結合性において優れている。 【００４７】尚、本発明誘導体の内でＩＬ−１βに比し
その分子中にＣysをより少なく含むか又は含まないもの
は、ＣysのＳＨ基に基づく分子内もしくは分子間結合の
不要な形成を考慮すれば、より好ましいものである。 【００４８】本発明のポリペプチドは、例えば遺伝子工
学的手法により製造することができる。即ち、前記本発
明に係わる特定のポリペプチドをコードする遺伝子を利
用し、これを微生物のベクターに組込んで該微生物細胞
内で、複製、転写、翻訳させることによって製造するこ
とができる。この方法は、特に大量生産が可能である点
より有利である。 【００４９】上記方法において用いられる遺伝子は、通
常の方法、例えばホスフアイト トリエステル法〔ネイ
チヤー（Ｎature ），３１０，１０５（１９８４）〕等
の常法に従って、核酸の化学合成により全合成すること
もできるが、ＩＬ−１βもしくはその前駆体をコードす
る遺伝子を利用するのが簡便であり、該遺伝子より、上
記化学合成手段を含む常法に従って、前記特定のアミノ
酸配列をコードする核酸配列に改変することにより容易
に製造できる。 【００５０】ＩＬ−１β又はその前駆体をコードする遺
伝子は公知（記述）であり、我々も我々の先の出願（特
願昭６０−１３８２８１号）に記したようにＩＬ−１β
をコードする遺伝子を得、これを用いて遺伝子工学的手
法でＩＬ−１βを収得するに成功した。之等の一連の遺
伝子工学的手法は後記の参考例において明らかにする。 【００５１】上記核酸（塩基）配列の改変操作も公知方
法に従えばよく、目的とするポリペプチドのアミノ酸配
列に応じて実施される〔遺伝子工学的手法としては、例
えば、Ｍolecular Ｃloning Ｃold Ｓpring Ｈarbo
r Ｌaboratory （１９８２）が参照される〕。 【００５２】例えば、ＤＮＡの切断、結合、リン酸化等
を目的とする制限酵素、ＤＮＡリガーゼ、ポリヌクレオ
チドキナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ等の各種の酵素処理
等の常套手段等が採用でき、それら酵素は市販品として
容易に入手できる。之等各操作における遺伝子乃至核酸
の単離、精製も常法、例えばアガロース電気泳動法等に
従えばよい。また得られる遺伝子の複製は、一部後述す
るように通常のベクターを利用する方法に従えばよい。
また、所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片や合
成リンカーは上記した化学合成により容易に製造でき
る。尚、上記において所望のアミノ酸に対応するコドン
は自体公知でありまたその選択は任意でよく、例えば利
用する宿主のコドン使用頻度等を考慮した常法に従えば
よい〔Ｎucl. Ａcids. Ｒes. ，９，４３−７４（１
９８１）〕。またこれらの核酸配列のコドンを一部改変
するには、例えば常法どうり、１５〜３０マー程度の、
所望の改変をコードする合成オリゴヌクレオチドからな
るプライマーを用いたサイト−スペシフィック ミュー
タジエネシス（Ｓite −Ｓpecific Ｍutagenesis）〔Ｐ
roc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,８１，５６６２−５６６６（１
９８４）〕等の方法を採用することができる。 【００５３】上記方法により得られる所望の遺伝子は、
例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法〔Ｍaxam−Ｇ
ilbert, Ｍeth.Ｅnzym.,６５，４９９−５６０（１９８
０）〕やＭ１３フアージを用いるジデオキシヌクレオチ
ド鎖終結法〔Ｍessing, Ｊ．and Ｖieira,Ｊ.,Ｇene,１
９，２６９−２７６（１９８２）〕等により、その塩基
配列の決定及び確認を行なうことができる。 【００５４】上記操作及び方法の具体例は、後記参考例
及び実施例に記述するが、該方法は特に限定されず、当
業界において周知の各種方法のいずれを採用してもよ
い。 【００５５】かくして、本発明によれば前記した特定の
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする新規な
遺伝子も提供される（以下この遺伝子を「本発明遺伝
子」という）。 【００５６】本発明のポリペプチドは、上記特定の遺伝
子（本発明遺伝子）を利用し、従来公知の一般的な遺伝
子組換え技術に従い製造できる。より詳細には、上記本
発明遺伝子が宿主細胞中で発現できるような組換えＤＮ
Ａを作成し、これを宿主細胞に導入して形質転換し、該
形質転換体を培養すればよい。 【００５７】ここで宿主細胞としては、真核生物及び原
核生物のいずれをも用いることができる。該真核生物の
細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物
細胞としては、例えばサルの細胞であるＣos細胞〔Ｙ．
Ｇluzman，Ｃell,２３，１７５−１８２（１９８１）〕
やチヤイニーズ・ハムスター卵巣細胞のジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ欠損株〔Ｇ．Ｕrlaub and Ｌ．Ａ．Ｃhasin
，Ｐroc. Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,ＵＳＡ，７ ７，４２１
６−４２２０（１９８０）〕等がよく用いられている
が、之等に限定される訳ではない。脊椎動物細胞の発現
ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流
に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポ
リアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを
使用でき、これは更に必要により複製起源を保有してい
てもよい。該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初
期プロモーターを保有するｐＳＶ２dhfr〔Ｓ．Ｓubrama
ni, Ｒ．Ｍulligan and Ｐ．Ｂerg,Ｍol. Ｃell.Ｂio
l., １（９），８５４−８６４〕等を例示できるが、こ
れに限定されない。 【００５８】また真核微生物としては酵母が一般によく
用いられており、その中でもサツカロミセス属酵母が有
利に利用できる。該酵母等の真核微生物の発現ベクター
としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプ
ロモーターを持つp ＡＭ８２〔Ａ．Ｍiyanohara et a
l，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,ＵＳＡ，８０，１−５
（１９８３）〕等を好ましく利用できる。 【００５９】原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌
が一般によく用いられている。本発明では例えば該宿主
菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベク
ター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上
流にプロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガ
ーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要なＡＴＧを付
与した発現プラスミドが使用できる。上記宿主菌として
の大腸菌としては、エシエリヒア・コリ（Ｅscherichia
coli）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては
一般にｐＢＲ３２２がよく用いられるが、これに限定さ
れず、公知の各種の菌株及びベクターがいずれも利用で
きる。プロモーターとしては、例えばトリプトフアン・
プロモーター、ＰＬプロモーター、lac プロモーター、
lpp プロモーター等を使用することができ、いずれの場
合にも本発明遺伝子を発現させることができる。 【００６０】トリプトフアン・プロモーターを用いる場
合を例にとり詳述すれば、発現ベクターとしてトリプト
フアン・プロモーター及びＳＤ配列を持つベクターｐＴ
Ｍ１〔今本文男、代謝、Ｖol. ２２，２８９（１９８
５）〕を使用し、ＳＤ配列の下流に存在する制限酵素Ｃ
laＩ部位に、必要に応じてＡＴＧを付与した所望のポリ
ペプチドをコードする遺伝子を連結させればよい。 【００６１】尚、直接発現系に限らず、例えばβ−ガラ
クトシダーゼやβ−ラクタマーゼ等を利用する融合蛋白
質発現系によることもできる。 【００６２】かくして得られる発現ベクターの宿主細胞
への導入及びこれによる形質転換の方法としては、一般
に用いられている方法、例えば主として対数増殖期にあ
る細胞を集め、ＣａＣｌ2処理して自然にＤＮＡを取り
込みやすい状態にして、ベクターを取込ませる方法等を
採用できる。上記方法においては、通常知られているよ
うに形質転換の効率を一層向上させるためにＭｇＣｌ2
やＲｂＣｌを更に共存させることもできる。また、宿主
細胞をスフエロプラスト又はプロトプラスト化してから
形質転換させる方法も採用することができる。 【００６３】かくして得られる所望の形質転換株は、常
法に従い培養することができ、該培養により、所望のポ
リペプチドが生産、蓄積される。該培養に用いられる培
地としては、通常の細胞培養に慣用される各種の培地の
いずれでもよく、その具体例としては、例えばＬ培地、
Ｅ培地、Ｍ９培地等及び之等に通常知られている各種の
炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン類等を添加した培地
を例示できる。尚、上記トリプトフアン・プロモーター
を用いた場合には、一般にプロモーターが働くようにす
るためにカザミノ酸を添加した、例えばＭ９最小培地を
用いて培養することができ、該培地中には培養の適当な
時期にインドールアクリル酸等のトリプトフアン・プロ
モーターの働きを強めるための薬剤を添加することもで
きる。 【００６４】このようにして得られる活性物を含有する
培養物からの目的ポリペプチド、即ち本発明ポリペプチ
ドの精製、単離は常法に従って行なうことができる。
尚、本発明ポリペプチドを宿主から抽出するに当って
は、例えば浸透圧シヨツク法等の温和な条件を採用する
のが、その高次構造保持の面からより好ましい。 【００６５】上記精製、単離は、例えば当該ポリペプチ
ドの物理、化学的性質を利用した各種の処理操作に従い
実施することができる〔例えば「生化学データーブツク
II」pp１１７５〜１２５９、第１版第１印刷、１９８０
年６月２３日、株式会社東京化学同人発行参照〕。該方
法としては、具体的には例えば通常の蛋白沈澱剤による
処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフイー（ゲル
濾過）、液体クロマトグラフイー、遠心分離、電気泳
動、アフイニテイクロマトグラフイー、透析法、之等の
組合せ等を採用できる。 【００６６】より具体的には、上記操作は、例えば以下
のごとくして実施できる。即ち、まず培養上清より予め
目的とするポリペプチドを部分精製する。この部分精製
は、例えばアセトン、メタノール、エタノール、プロパ
ノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒
や酢酸、過塩素酸（ＰＣＡ）、トリクロロ酢酸（ＴＣ
Ａ）等の酸を蛋白沈澱剤として用いる処理、硫酸アンモ
ニウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤
を用いる処理及び／又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等
を用いる限外濾過処理等により行なわれる。之等の各処
理の操作及び条件は、通常のこの種方法のそれらと同様
のものとすればよい。 【００６７】次いで上記で得られた粗精製物を、ゲル濾
過に付すことにより目的物質の活性が認められる画分を
収得する。ここで用いられるゲル濾過剤としては、特に
限定はなく、例えばデキストランゲル、ポリアクリルア
ミドゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガ
ロースゲル、セルロース等を素材とするものをいずれも
利用できる。之等の具体例としては、セフアデツクスＧ
タイプ、同ＬＨタイプ、セフアロースタイプ、セフアク
リルタイプ（以上、フアルマシア社）、セルロフアイン
（チツソ株式会社）、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ
（バイオ−ラド社）、ウルトロゲル（ＬＫＢ社）、ＴＳ
Ｋ−Ｇタイプ（東洋曹達株式会社）等の市販品を例示で
きる。 【００６８】目的とするポリペプチドは、上記ゲル濾過
により得られる活性画分を、例えばハイドロキシアパタ
イトカラムを用いたアフイニテイークロマトグラフイ
ー、ＤＥＡＥ法、ＣＭ法、ＳＰ法等のイオン交換カラム
クロマトグラフイー、クロマトフオーカシング法、逆相
高速液体クロマトグラフイー等に付すことにより、又は
之等各操作の組合せにより更に精製することができ、均
質な物質として単離することができる。 【００６９】上記クロマトフオーカシング法は、公知の
各種方法により実施できる。カラムとしては、例えばＰ
ＢＥ９４（フアルマシア社製）等を、開始緩衝液として
は、例えばイミダゾール−塩酸等を、また溶出液として
は、例えばポリバツフアー７４（フアルマシア社製）−
塩酸（ｐＨ４．０）等を使用できる。 【００７０】上記逆相高速液体クロマトグラフイーは、
例えばＣ4ハイポアー逆相ＨＰＬＣカラム（バイオ−ラ
ド社（Ｂio−Ｒad Ｌaboratories ））等を用いて、移
動剤としてアセトニトリル、トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ）、水等及び之等の混合溶媒を用いて実施できる。 【００７１】かくして本発明ＩＬ−１β誘導体（ポリペ
プチド）を単離、収得できる。ＩＬ−１βをコードする
遺伝子から同種の遺伝子組換え操作でＩＬ−１βを収得
できる。 【００７２】得られる本発明ポリペプチド又はＩＬ−１
βは、前述した如く優れた薬理活性を有することから、
前述した各種の医薬用途に有用な医薬製剤とすることが
できる。斯かる医薬製剤にはたとえば抗体産生やワクチ
ン効果の増強並びに免疫不全症の治療等の免疫刺激剤、
抗腫瘍剤、サイトカイン類の産生促進剤、抗炎症剤、放
射線障害防止剤、日和見感染症治療剤等が包含される。
該医薬製剤は、通常本発明ポリペプチド又はＩＬ−１β
の薬理有効量と共に適当な医薬製剤担体を配合して製剤
組成物の形態に調製される。該製剤担体としては使用形
態に応じた製剤を調製するのに通常慣用される充填剤、
増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤等の賦形
剤乃至は希釈剤をいずれも使用できる。製剤組成物の形
態は、これが本発明ポリペプチド又はＩＬ−１βを効果
的に含有する状態であれば、特に限定はなく、例えば錠
剤、粉末剤、顆粒剤、丸剤等の固剤であつてもよいが、
通常液剤、懸濁剤、乳剤等の注射剤形態とするのが好適
である。またこれは使用前に適当な担体の添加によって
液状となし得る乾燥品とすることもできる。之等の製剤
組成物はいずれも常法に従い調製され得る。 【００７３】得られる医薬製剤は、該製剤組成物の形態
に応じた適当な投与経路、例えば注射剤形態の医薬製剤
は、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により
投与され、固剤形態の医薬製剤は、経口乃至は経腸投与
され得る。医薬製剤中の有効成分の量及び該製剤の投与
量は、該製剤の投与方法、投与形態、使用目的、之を適
用される患者の症状等に応じて適宜選択され、一定では
ないが、通常有効成分を約１〜８０重量％程度含有する
製剤形態に調製して、この製剤をこれに含有される有効
成分量が一日成人一人当り約０．１μｇ〜１０ｍｇ程度
となる範囲で投与するのが望ましい。該投与は、一日１
回である必要はなく一日３〜４回に分けることもでき
る。 【００７４】 【実施例】以下、ＩＬ−１βを製造する参考例及び本発
明誘導体を製造する実施例を挙げて、本発明を更に詳し
く説明する。 【００７５】下記各例では、本発明誘導体に関して、之
等を簡略化するため、以下の略号を付した。 【００７６】また、以下の各例において各種生理活性
は、次の方法により測定した。 【００７７】 【化８】【００７８】 【化９】【００７９】 【化１０】【００８０】 【化１１】【００８１】 【化１２】 【００８２】〈活性の測定〉 （１）ＩＬ−１活性の測定 オツペンハインら（Ｊ．Ｊ．Ｏppenhein et al）の方法
〔Ｊ．Ｉmmunol.,１１６，１４６６（１９７６）〕に従
い、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ系マウスの胸腺細胞を利用して測定
したＬＡＦ活性により表示した。 【００８３】（２）ＧＩＦ活性の測定 ９６ウエルマイクロプレート（コーニング社）に種々の
濃度に希釈した供試液０．１ｍｌを入れ、次に各ウエル
にヒトメラノーマ細胞Ａ３７５を２×１０4個／ｍｌの
濃度で含有する１０％ＦＣＳを含むイーグルスＭＥＭ浮
遊液０．１ｍｌを加え、炭酸ガス培養器（ナフコ社製）
内で４日間培養する。培養終了後、０．０５％ニユウト
ラルレツド（和光純薬社製）０．０５ｍｌを各ウエルに
加え、３７℃で２時間培養する。上澄液を除去した後、
リン酸緩衝生理食塩水０．３ｍｌを各ウエルに静かに加
えてウエルを洗浄する。洗浄液を除去した後、各ウエル
にリン酸１ナトリウム−エタノール等量混合液０．１ｍ
ｌを加え、マイクロミキサーで数分間振盪し、細胞内に
取込まれた色素量を、９６ウエル−マイクロタイトレー
シヨンプレート用光度計（タイターチエツクマルチスキ
ヤン、フロウラボラトリーズ社製）を用いて、吸光度５
４０ｍμにて測定し、増殖抑制活性を求める。対照群
（コントロール群）の細胞増殖の５０％抑制を示す試験
群、即ち対照群の吸光度測定値の１／２の吸光度測定値
を示す試験群、の希釈率の逆数をとり、これをＧＩＦ活
性単位とする。従つて例えばこの ＧＩＦ活性が１０単
位の場合、この供試液は１０倍希釈してもなお細胞増殖
を５０％抑制する活性を有する。 【００８４】参考例１ プラスミドｐＧＩＦ−αの製造 (1)ヒトリンパ球の調製 ヒト末梢血を採血し、フイコール・ハイパークの密度勾
配遠心法〔Ｅur．Ｊ．Ｉmmunol．４，８０８（１９７
４）〕により末梢血リンパ球１．９×１０10個を得た。 【００８５】このリンパ球を４×１０8／ｍｌの細胞濃
度で、ヒト血清５％を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁
させ、直径９cmのシヤーレに分注後、５％炭酸ガス中、
３７℃で１時間培養した。その後、シヤーレ底部に付着
していない細胞を除去し、ウシ胎児血清１０％、ＴＰＡ
（シグマ（Ｓigma）社製）０．５ng／ｍｌ及びＬＰＳ
（デイフコ（Ｄifco）社製）１０μｇ／ｍｌを含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地にて細胞を刺激した。５％炭酸ガス
中、３７℃で４時間培養した後、ＰＢＳ及び０．０２％
ＥＤＴＡにて付着性リンパ球９×１０8個を得た。 【００８６】(2) mＲＮＡの調製 上記(1)で得たヒト付着性リンパ球を、６Ｍ−グアニジ
ンチオシアネート溶液（６Ｍ−グアニジンイソチオシア
ネート、５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、
０．１Ｍ２−メルカプトエタノール、０．５％ザルコシ
ル（Ｓarkosyl ）３０ｍｌにて溶解後、Ｇ１８Ｇ注射針
をつけた５０ｍｌ注射筒を用いてＤＮＡをせん断した。
この溶液に塩化セシウム（Ｃs Ｃｌ）１２ｇを添加し、
完全に溶解させた後、その６．４ｍｌずつを５．７Ｍ
Ｃs Ｃｌ（５．７Ｍ Ｃs Ｃｌ−０．１ＭＥＤＴＡ）４
ｍｌに重層し、ベツクマンローター（Ｂeckman ＳＷ−
４０Ｔi rotor ）にて２５℃で３１５００rpm で２０時
間遠心した。沈澱したＲＮＡのペレツトを７０％エタノ
ールで洗浄後、ＴＥ溶液（１０ｍＭトリスＨＣｌ，ｐＨ
７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、１／９容の３Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び２．２容のエタノー
ルを加えて、−７０℃で１時間放置した。４℃にて１５
０００rpm で２０分間遠心し、ＲＮＡを回収し、ＴＥ溶
液に溶解させた。 【００８７】かくして付着性リンパ球約９×１０8細胞
から、全ＲＮＡ２５０μｇを得た。 【００８８】次に、上記で得たＲＮＡからｍＲＮＡを取
得するために、オリゴ（ｄＴ）−セルロース（Ｃollabo
rative Ｒesearch Ｉnc．）を用いてカラムクロマトグ
ラフイーを行なつた。吸着は、１０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ７．５），０．５ＭＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ
にて行ない、カラムを同溶液にて洗浄後、１０ｍＭトリ
スＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１ｍＭ ＥＤＴＡにてＲＮ
Ａを溶出させた。 【００８９】この結果、溶出されたm ＲＮＡ量は、１
７．５μｇであつた。 【００９０】(3)ｃＤＮＡの調製 上記(2)で得たｍＲＮＡから、ｃＤＮＡを、インビトロ
で合成し、オカヤマ−ベルグのプラスミドベクター〔Ｏ
kayama，Ｈ．and Ｂerg,Ｐ.,Ｍol．Ｃell.Ｂiol., ２，
１６１（１９８２）〕を用いて組換え体ＤＮＡを作成
し、これをエシエリヒア・コリにトランスホームして、
ｃＤＮＡライブラリーを作製した。各手法は次の通りで
ある。 【００９１】(3)−１）ベクター・プライマーとリンカ
ーＤＮＡの調製 ｐＢＲ３２２−ＳＶ４０（０．７１〜０．８６）ＤＮＡ
４００μｇを、ＫpnＩ（ＮＥＢ）７００単位で、３７℃
で５時間消化し、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
４０μｌと１０％ＳＤＳ２０μｌとの混液で反応を停止
させた後、等容のフエノール−クロロホルム（１：１）
で抽出し、エタノールにてＤＮＡを沈澱させ、遠心後、
７０％エタノールで洗浄し、ＤＮＡを回収した。得られ
たＤＮＡを１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム，３０ｍＭ
トリスＨＣｌ（ｐＨ６．８），１ｍＭＣｏＣｌ2，０．
１ｍＭＤＴＴ及び０．２５ｍＭｄＴＴＰ（α−32Ｐ−ｄ
ＴＴＰ ０．５μＣi を含む）２００μｌに溶解させ、
ターミナルトランスフエラーゼ（ＴＴase ，ＰＬ）４０
０単位にて３０分間ｄＴ鎖の伸長を行なわせ、０．２５
Ｍ ＥＤＴＡ２０μｌと１０％ＳＤＳ １０μｌとを加
えて反応を停止させ、フエノール−クロロホルム抽出を
４回繰返した後、エタノール沈澱にてＤＮＡを回収し
た。この結果、ｄＴ鎖は約７０塩基伸長された。 【００９２】次に、上記で得たＤＮＡを、ＨpaＩ（ＮＥ
Ｂ）１７単位を用いて、３７℃で６時間消化し、アガロ
ース（低融点アガロース，ＢＲＬ，１％）電気泳動にて
約２．７kbのＤＮＡ断片の回収を行なつた。 【００９３】電気泳動後、エチジウムブロマイド０．５
μｇ／ｍｌにてＤＮＡを染色し、ＵＶ照射下で約２．７
kbの断片を含むアガロースを切り出し、５倍容の２０ｍ
ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１ｍＭ ＥＤＴＡを加
え、６５℃で５分間でアガロースを溶解後、フエノール
抽出、フエノール−クロロホルム（１：１）抽出及びク
ロロホルム抽出を順次行ない、エタノール沈澱にてＤＮ
Ａを回収した。 次にオリゴ（ｄＡ）セルロースカラム
クロマトグラフイーでベクタープライマーＤＮＡの精製
を行なつた。上記ＤＮＡを１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ
７．３）−１ｍＭ ＥＤＴＡ−１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液１
ｍｌに溶かし、氷冷した後、同緩衝液で平衡化したカラ
ムに載せ、同緩衝液１ｍｌで洗浄後、室温に戻して、１
０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．３）−１ｍＭ ＥＤＴＡ
で、ＤＮＡを溶出した。溶出のピーク画分を集め、エタ
ノール沈澱にてＤＮＡを回収後、１０m ＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ７．３）−１ｍＭ ＥＤＴＡ１００μｌに溶か
し、４℃で保存した。 【００９４】リンカーＤＮＡを次の通り調製した。即
ち、 ｐＢＲ３２２−ＳＶ４０（０．１９〜０．３２）
ＤＮＡ１００μｇを、ＰstＩ（ＮＥＢ）１２０単位で、
３７℃下、１．５時間消化後、反応を停止させ、フエノ
ール−クロロホルム抽出、エタノール沈澱を行なつた。
ＤＮＡを回収し、１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３
０ｍＭトリスＨＣｌ （ｐＨ６．８）、１ｍＭ ＣｏＣ
ｌ2、０．１ｍＭ ＤＴＴ、０．２５ｍＭｄＧＴＰ（１
μＣi のα−32Ｐ−ｄＧＴＰを含む）５０μｌに溶解
し、ＴＴase ６０単位を２０分間作用させた。この結
果、１８残基のｄＧ鎖が付加された。反応停止後、ＤＮ
Ａを回収し、Ｈind III（宝酒造）５０単位で消化し、
前記したようにアガロース（１．８％）電気泳動で約
０．２８kbのＤＮＡ断片を回収し、２．３μｇのリンカ
ーＤＮＡを得た。 【００９５】(3)−２）ｃＤＮＡの合成とｃＤＮＡライ
ブラリーの作製 ＲＮＡ５μｇを減圧乾燥した後、５ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ８．３）１０μｌに溶解し、６５℃で５分間加熱
した。直ちに３７℃に移し、反応混合液２０μｌ（５０
ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、８ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2、３０ｍＭ ＫＣｌ、０．３ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ
ｄＮＴＰ、１０μＣi α−32Ｐ−ｄＣＴＰ）を加え、
５分間３７℃にて保温した。 【００９６】ＲＴase（リバーストランスクリプター
ゼ、生化学工業社製）１０単位を加え、３７℃で１５分
間反応させた後、再度ＲＴase １０単位を加え、更に１
５分間保温した。０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐ８．０）
２μｌと１０％ＳＤＳ１μｌとを加えて反応を停止させ
た後、フエノール−クロロホルム抽出を行ない、４Ｍ酢
酸アンモニウム２０μｌとエタノール８０μｌとを加
え、１５分間−７０℃で凍らせた後、室温で融解し、１
５０００rpm、４℃で１０分間遠心し、沈澱させた。沈
澱を１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．３）２０μｌに溶
かし、４Ｍ酢酸アンモニウム１９μｌとエタノール８０
μｌとを加えて再沈澱させた。 【００９７】沈澱を回収し、７０％エタノールで洗つた
後、１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリス
ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１ｍＭ ＣｏＣｌ2、０．１ｍ
ＭＤＴＴ、０．２μｇポリＡ及び６６μＭ〔α−32Ｐ〕
ｄＣＴＰ（１０μＣｉ）１５μｌに溶解した。ＴＴase
（Ｐ．Ｌ．）１８単位を加え、３７℃で５分間反応させ
た後、０℃に急冷し、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ１．３μｌ
と１０％ＳＤＳ ０．６５μｌとで反応を停止させ、フ
エノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行な
つた。 【００９８】沈澱を遠心して回収後、Ｈind III（宝酒
造）４単位で３７℃で２時間消化し、反応停止後、フエ
ノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈澱を行なつ
た。沈澱を回収後、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．
３）及び１ｍＭ ＥＤＴＡの１０μｌに溶かし、エタノ
ール３μｌを加え、−２０℃で保存した。 【００９９】上記で得た試料１μｌをリンカーＤＮＡ５
ngと共に、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ−０．１Ｍ ＮａＣｌ １０μｌ中で、６
５℃で２分間、次いで４２℃で３０分間保温した後、０
℃に冷却した。これに２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＳＯ4、
０．１Ｍ ＫＣｌ、０．１ｍＭ β−ＮＡＤ、５０μｇ
／ｍｌＢＳＡ及び６単位／ｍｌエシエリヒア コリＤＮ
Ａリガーゼの混合溶液を９０μｌ加え、全液量を１００
μｌとし、１２℃で一夜保存した。 【０１００】次いで、１０ｍＭ ｄＮＴＰ ０．５μ
ｌ、 １０ｍＭ ＮＡＤ ０．５６μｌ、エシエリヒア
・コリＤＮＡポリメラーゼＩ（ベーリンガーマンハイム
社製）０．５μｌ及びＲＮase Ｈ（ＰＬ）０．２μｌを
加え、１２℃及び２５℃で順次１時間ずつ保温した後、
−２０℃で凍結保存した。 【０１０１】エシエリヒア コリＨＢ１０１株を、ＬＢ
培地（バクト−トリプトン１０ｇ、バクト−イースト抽
出物５ｇ及びＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）にて、ＯＤ550＝
０．４５まで培養し、５分間氷冷後、４℃で８０００rp
mで５分間遠心して菌体を回収した。菌体のペレツトを
氷冷した３０ｍＭ酢酸カリウム、１００ｍＭ ＲｂＣ
ｌ、１０ｍＭ ＣaＣｌ2、５０ｍＭ ＭｎＣｌ、１５％
グリセリンに懸濁させ、０℃で５分間保ち、４℃、８０
００rpm 、５分間遠心し、得られた菌体を、１０ｍＭ
ＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホニツクアシツ
ド）、７５ｍＭ ＣａＣｌ2、１０ｍＭ ＲｂＣｌ、１
５％グリセリンに再度懸濁させ、０℃にて１５分間保温
して、コンピテント細胞を作製した。かくして得られた
コンピテント細胞は、その後−７０℃で保存した。 【０１０２】凍結菌液を室温で融解し、４００μｌの菌
液に対して上記ＤＮＡ試料２０μｌを加え、３０分間０
℃に放置した後、４２℃で９０秒間熱シヨツクを与え、
再び０℃で１〜２分間静置した。これにＬＢ培地２ｍｌ
を加え、３７℃で３０分間保温し、５０容のＬＢ培地に
植菌し、３７℃で６時間培養した後、５０μg ／ｍｌに
なるようにアンピシリンを加え、更に一夜培養し、ｃＤ
ＮＡライブラリーを作製した。このｃＤＮＡライブラリ
ーは、５０％グリセリン中で−２０℃にて保存した。 【０１０３】(3)−３）合成プローブの作製 ＩＬ−１βをコードするｃＤＮＡを有する形質転換株の
選出のためのプローブとして、下記核酸配列に対する相
補的な塩基配列（最下段に示す）を、以下の方法により
合成した。 【０１０４】 【化１３】 【０１０５】即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルメチルホスホロ
アミダイト誘導体を縮合ユニツトとして用いた、固相ホ
スフアイト トリエステル法〔Ｎature,３１０，１０５
（１９８４）〕にて、自動合成機（３８０Ａ ＤＮＡ
Ｓynthesizer，Ａpplied Ｂiosystems Ｉnc.,Ｆoster
Ｃity,Ｃalifornia ９４４０４，ＵＳＡ）を用いて、目
的とする完全保護ＤＮＡを合成した。続いて該完全保護
ＤＮＡを２８％アンモニア水で５５℃で１０時間処理す
ることにより、５’末端のＯＨ基に結合している保護基
としてのＤＭＴｒ（ジメトキシトリチル）基以外の保護
基（Ａ、Ｇ、Ｃのアミノ基のアシル基をさす）を脱保護
させ、部分保護ＤＮＡ（ＤＭＴｒ体）を得た。次いでこ
のＤＭＴｒ体をＣ18を担体とする逆相ＨＰＬＣにより精
製した後、８０％酢酸で室温で１０分間処理して上記Ｄ
ＭＴｒ基を脱離させ、続いて得られる塩基を、７Ｍ尿素
を含む１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びバイ
オ−ゲルＰ−３０（バイオ−ラド社製）により精製し
て、目的のＤＮＡ（６０mer）を得た。 【０１０６】上記で得たＤＮＡ６μｇを、５０μｌの反
応溶液（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、０．２ｍｇ／ｍｌ子牛胸腺ＤＮＡ、５０μＣi〔γ
−21Ｐ〕−ＡＴＰ）中で、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ（宝酒造）１２単位と、３７℃にて１時間反応させ、
ＤＮＡの５′末端をラベルした。ラベルされたＤＮＡと
未反応の32Ｐを分別するために、バイオゲルＰ−３０
（バイオ−ラド社）によるカラムクロマトグラフイーを
行なつた。ラベルされたＤＮＡ画分を１／９容の３Ｍ酢
酸ナトリウムと２．５容のエタノールにて沈澱させ、遠
心して、回収後、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）
−１ｍＭ ＥＤＴＡ ４００μｌに溶解し、−２０℃で
保存した。 【０１０７】得られたプローブの比活性は１０7cpm ／
μｇＤＮＡ以上であつた。 【０１０８】(3)−４）ｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニング アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地上に径
８０mmのニトロセルロースフイルター（ミリポアＨＡＩ
Ｆ０８２５０）を置き、この上にフイルター当り５００
０コロニーになるように希釈した前記ｃＤＮＡライブラ
リー菌液をまき、３７℃にて一夜培養した。フイルター
は、合計２４枚を作製した。 【０１０９】コロニーの出現したフイルターに新しいニ
トロセルロースフイルターを載せることによつて、レプ
リカフイルターを作製した。 【０１１０】元のフイルター（マスターフイルター）
を、４℃にて保存し、レプリカフイルターを、上記した
寒天培地上で３７℃で６時間培養後、クロラムフエニコ
ール２００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地上に移し替
え、３７℃で一夜培養した。 【０１１１】フイルターを、０．５Ｎ ＮａＯＨ、１Ｍ
トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１ＭトリスＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．０）−１．５Ｍ ＮａＣｌの順で処理し、風乾
後、８０℃真空下で２時間ベーキングを行なつた。 【０１１２】ベーキング済みのフイルターを、１．２Ｍ
ＮａＣｌ、０．１２Ｍクエン酸３ナトリウム、１０ｍ
ｇ／ｍｌフイコール（Ｆicoll ）、１０ｍｇ／ｍｌポリ
ビニルピロリジン、１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１％
ＳＤＳ及び０．１ｍｇ／ｍｌサルモン スペラム（Ｓal
mon Ｓperm）ＤＮＡの２０ｍｌ中で軽く振盪しながら、
６８℃にて一夜保温した。溶液を１．２Ｍ ＮａＣｌ、
０．１２Ｍクエン酸３ナトリウム、１０ｍｇ／ｍｌフイ
コール（Ｆicoll ）、１０ｍｇ／ｍｌポリビニルピロリ
ジン、１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．１％ＳＤＳ及び１
０6cpm ／ｍｌプローブに替え、４２℃で一昼夜軽く振
盪し、ハイブリダイゼーシヨンを行なつた。 【０１１３】ハイブリダイゼーシヨンの終わつたフイル
ターを取り出し、１．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１２Ｍクエ
ン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳにて室温で３回洗浄
し、その後、６０℃で同溶液にてフイルターのバツクグ
ラウンドのカウントがＧＭサーベイメーターで２００cp
mになるまで洗浄した。 【０１１４】フイルターを風乾後、増感紙を用いてＸ線
フイルム（フジＲＸ）に−７０℃にて２日間オートラジ
オグラムを行なつた。 【０１１５】フイルムを現像後、シグナル領域に存在す
るコロニーをマスターフイルターよりかき取り、上記の
方法を繰返してポジテイブシグナルを有するコロニーの
単離を行ない、強いシグナルを有するクローンＩ−２を
単離した。 【０１１６】(3)−５）クローンの解析 クローンＩ−２の有するプラスミドｐＧＩＦ−αのｃＤ
ＮＡの制限酵素地図を作製した。 【０１１７】その結果を図１に示す。 【０１１８】図１よりｃＤＮＡ中には、ＮcoＩ（日本ジ
ーン）、Ｈind III （日本ジーン）、ＰvuII（日本ジー
ン）及びＡccＩ（日本ジーン）により切断される個所が
それぞれ１個所ずつ存在し、５’末端よりその順序で之
等制限酵素による切断個所が存在していることが確認さ
れた。また、ｃＤＮＡの長さは、約１．５kbであり、分
子量約１８kdのＩＬ−１を充分にコードできることが判
った。 【０１１９】次に、ｐＧＩＦ−αのｃＤＮＡの塩基配列
を、マキサム−ギルバートの化学修飾法及びＭ１３フア
ージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法にて決定
した。その結果を次式に示す。 【０１２０】 【化１４】【０１２１】 【化１５】【０１２２】 【化１６】【０１２３】 【化１７】【０１２４】上記図より、合成プローブと相補的な領域
が５’末端より３１２番目〜３７１番目に存在（図に下
線を付して示す）し、ヒトコドン使用頻度から導いた塩
基配列に７５％の相同性を示した。 【０１２５】また、ｐＧＩＦ−αのc ＤＮＡ中の最長の
リーデイングフレーム（reading frame）を検索したと
ころ、５’末端より５７番目から７７１番目の領域であ
る。 【０１２６】上記ヒトＩＬ−１前駆体蛋白質をコードす
るｃＤＮＡを有するプラスミドｐＧＩＦ−αは、これを
エシエリヒア・コリ（Ｅscherichia coli ）χ１７７６
株に保有させ、該株を工業技術院微生物工業技術研究所
（微工研）に、「Ｅscherichia coli χ１７７６／ｐＧ
ＩＦ−α」なる名称で、微工研条寄第９４８号（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−９４８）として寄託されている 参考例２ ポリペプチドＩの製造 上記参考例１で得たプラスミドｐＧＩＦ−αを、制限酵
素ＡccＩ及びＣlaＩにより切断した後、約１．２キロベ
ースペアー（kbp）のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気
泳動により単離精製した。このＤＮＡ断片をＤＮＡポリ
メラーゼＩ（クレノー断片）を用いて、制限酵素ＡccＩ
及びＣlaＩ切断部分を平滑末端とした。 【０１２７】一方ＢamＨＩリンカー（ 5’HOＣＧＧＡＴ
ＣＣＧOH 3’）の５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼによりリン酸化し、これを先の平滑末端としたＤＮ
Ａ断片に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した後、制
限酵素ＢamＨＩで切断し、更に制限酵素ＭspＩで切断
し、得られた反応物をアガロースゲル電気泳動に付し、
約５４０ベースペア（bp）のＭspＩ−ＢamＨＩ ＤＮＡ
断片を単離精製した次に、下記オリゴデオキシヌクレオ
チド（Ｉ）及び（II）を以下のようにして合成した。 【０１２８】 5’HOＣＧＡＴＡＡＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＡＣＧＴＴＣＴＣＴＧＡＡＣＴＧＣ ＡＣＴＣＴＣOH 3’ （Ｉ） 5’HOＣＧＧＡＧＡＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＡＣＡＧＧＡＧＣ ＣＡＴＴＡＴOH 3’ （II） 即ち、マクロポーラスシリカに結合した５’−Ｏ−ジメ
トキシトリチル及びＮ−保護デオキシヌクレオシド（ア
プライド バイオシステムズ社製）を出発原料とし、
３’側より５’側へ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル及び
Ｎ−保護デオキシモノヌクレオシド−３’−ホスホアミ
ダイトを縮合単位として、自動合成機（アプライド バ
イオシステムズ社製、３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザ
ー）を用いて順次、ヌクレオチド鎖を延長させた。続い
てチオフエノールを用いた処理による脱メチル化及び２
８％アンモニアを用いた室温での処理により、シリカよ
りヌクレオチドを脱離させ、完全保護オリゴヌクレオチ
ドを得た。以上の操作はすべて自動合成機を用いて行な
つた〔Ｈunkapiller等、Ｎature ，３１０，１０５（１
９８４）〕。 【０１２９】次いで、得られた完全保護オリゴヌクレオ
チドを２８％アンモニア水２ｍｌで５５℃で１０時間処
理してＮ−保護基を脱離させ、５’−Ｏ−ジメトキシト
リチルオリゴヌクレオチドを得た。この１／５量を用い
て、ＯＤＳ（山村化学研究所社製）を担体とする逆相高
速液体クロマトグラフイーにより精製後、８０％酢酸１
５０μｌで室温で２０分間処理して粗オリゴヌクレオチ
ドを得た。これをＯＤＳを担体とする逆相高速液体クロ
マトグラフイーにより更に精製して、目的とするオリゴ
ヌクレオチドを得た。 【０１３０】上記で合成した合成オリゴデオキシヌクレ
オチド（Ｉ）及び（II）の各５’末端を、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼによりリン酸化し、上記で得たＭspＩ
−ＢamＨＩ ＤＮＡ断片に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い
て連結後、制限酵素ＢamＨＩ及びＣlaＩで切断し、得ら
れた反応物をアガロースゲル電気泳動に付して、約５８
０bpのＣlaＩ−ＢamＨＩＤＮＡ断片を単離精製した。 【０１３１】他方、プラスミドp ＴＭＩ〔今本文男，代
謝，Ｖol. ２２，２８９（１９８５）〕を、制限酵素Ｂ
amＨＩ及びＣlaＩで切断後、アガロースゲル電気泳動に
よりtrp プロモーター領域を含む約４．４kbp のＤＮＡ
断片を単離精製した。このＤＮＡ断片と、先に調製した
約５８０bpのＣlaＩ−ＢamＨＩＤＮＡ断片とを、Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結して所望のポリペプチドＩ発現用プ
ラスミドp trp ＧＩＦ−αを得た。 【０１３２】該プラスミドを、エシエリヒア・コリーＨ
Ｂ１０１にトランスフオームさせ、目的のトランスフオ
ーマントを、ボイリング法（boiling method）により得
られるプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により選択した
〔Ｔ．Ｍaniatis ，Ｅ．Ｆ．Ｆritsch and Ｊ．Ｓambr
ook ，Ｍolecular Ｃloning，pp３６６，Ｃold Ｓprin
g Ｈarfor Ｌaboratory,（１９８２）〕。 【０１３３】以上の概略を図２に示す。 【０１３４】また上記トランスフオーマントに組込まれ
たプラスミドp trp ＧＩＦ−αは、これをエシェリヒア
・コリχ１７７６にトランスフオームさせ、該形質転換
体を、「Ｅscherichia coliχ１７７６／p trp ＧＩＦ
−α」なる名称で１９８５年１２月１２日に工業技術院
微生物工業研究所に微工研条寄第９４９号（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−９４９）として寄託した。 【０１３５】（２）形質転換体の培養 上記形質転換体（エシェリヒア・コリＨＢ１０１／p tr
p ＧＩＦ−α）を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ及びＬ
−トリプトフアン２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（１％
トリプトン、０．５％酵母エキス及び０．５％Ｎa Ｃ
ｌ）１０ｍｌ中で、３７℃で一晩振盪培養し、この１ｍ
ｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌ及び１％カザミノ酸を
含むＭ９最小培地（０．６％Ｎａ2ＨＰＯ4、０．３％Ｋ
Ｈ2ＰＯ4、０．０５％ＮａＣｌ、０．１％ＮＨ4Ｃｌ、
２ｍＭ ＭｇＳＯ4、０．２％グルコース及び０．１ｍ
Ｍ ＣａＣｌ2）５０ｍｌに植菌し、３７℃で振盪培養
し、５５０nmでの吸光度（Ｏ．Ｄ．）が１．０となつた
時点で菌体を集め、１５％シユークロース−５０ｍＭト
リスＨＣｌ（ｐＨ８．０）−５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）の溶液５ｍｌに懸濁させ、１０ｍｇ／ｍｌリゾ
チーム〔１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶解し
た溶液〕５００μｌを加え、更に０．３％トリトンＸ１
００−１８７．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）−１５
０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）の溶液５ｍｌを加
え、室温で１５分間放置後、更によく懸濁させ、遠心分
離によつてＧＩＦ活性を有する菌体抽出物上清を得た。 【０１３６】（３）ポリペプチドＩの精製イオン交換クロマトグラフイー（ＣＭ−ＨＰＬＣ） 上記で得た菌体抽出物上清を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５．５）で透析後、ギルソンハイパーフオー
マンス リキツド クロマトグラフイー システム（ギ
ルソン（Ｇilson ）社製）によるイオン交換クロマトグ
ラフイー（ＣＭ−ＨＰＬＣ）にかけた。その条件は次の
通りである。カラム：ＩＥＸ−５３５ＣＭ（６．０×１
５０mm、東洋曹達社製）溶離液：Ａ液＝５０ｍＭ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ５．５、Ｂ液＝０．５Ｍ ＮａＣｌ含有
５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）流 速：０．５
ｍｌ／分 フラクシヨン容積： リテンシヨンタイム ０〜 ６０分…２ｍｌ／４分／チユーブ ６０〜１２０分…０．５ｍｌ／分／チユーブ １２０〜１８０分…２ｍｌ／４分／チユーブ 逆相高速液体クロマトグラフイー 上記ＣＭ−ＨＰＬＣで得たリテンシヨンタイム９０〜９
１分の画分を、次いで逆相高速液体クロマトグラフイー
に付した。その条件は、次の通りである。 【０１３７】カラム：Ｃ4ハイポアー逆相カラム（ＲＰ
３０４）バイオ−ラド社、直径４．６×２５０ｍｍ溶離
液：Ａ液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ液＝アセトニトリル：１
％ＴＦＡ（９：１） 流 速：１ｍｌ／分 チヤートスピード： リテンシヨンタイム ０〜５０分…５分／ｃｍ ５０〜８０分…２分／ｃｍ フラクシヨン容積：２ｍｌ／２分／チユーブ リテンシヨンタイムが６３．９〜６５．３分に、ＧＩＦ
活性に一致する単一の蛋白の吸光度ピークを示す目的の
ポリペプチドＩが得られた。 【０１３８】得られたポリペプチドＩは、ＩＬ−１活性
を有し、その比活性は、ＧＩＦ活性として２．７×１０
7単位／ｍｇ蛋白であった。 【０１３９】（４）ポリペプチドＩの同定ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ） Ｌaemmli，Ｕ．Ｋ．の方法〔Ｎature ，２７７，６８０
（１９７０）〕に従い、上記（３）で得たポリペプチド
ＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なつた。その条件は次の通り
である。 【０１４０】試 料：上記逆相高速液体クロマトグラフ
イーににおけるポリペプチドＩ画分を乾固した後、ラエ
メリーのサンプル バツフアー〔１／２０体積の２−メ
ルカプトエタノールを含む（２ＭＥ+）又は含まない
（２ＭＥ-）〕に溶解し、１００℃で４分間処理した。 【０１４１】ゲル：厚さ１．５mmの１５％ポリアクリル
アミドゲルを使用した。 【０１４２】電気泳動装置：バイオ−ラド（Ｂio−Ｒa
d）社製プロテアンを用いた。 【０１４３】泳動条件：４０ｍＡの定電流で２時間泳動
させた。 【０１４４】泳動後のゲルをバイオ−ラド社製シルバー
スタインキツト（Ｓilver stain kit ）を用いて染色し
た。その結果、ポリペプチドＩは２ＭＥ+下においては
約１７Ｋの位置に、また２ＭＥ-下においては約１７．
５Ｋの位置にそれぞれ単一のバンドとして泳動された。 【０１４５】等電点電気泳動法（ＩＥＦ） ポリペプチドＩの等電点電気泳動を、ｐＨ範囲３．５〜
９．５のアンフオラインＰＡＧプレート（ＬＫＢ社製）
及びモデル１４１５（バイオ−ラド社製）を用いて行な
つた。その条件は次の通りである。 【０１４６】試 料：前記（３）で得たポリペプチドＩ
の０．０３７μｇ、０．０７４μｇ及び０．７４μｇの
各々、及び以下のマーカープロテイン（ｐＩマーカープ
ロテイン）の計４レーンを使用した。 【０１４７】〈マーカープロテイン〉アミログルコシダ
ーゼ（３．５０）、大豆トリプシンインヒビター（４．
５５）、β−ラクトグロブリンＡ（５．２０）、ウシ
カルボニツク アンヒドラーゼ（bovine carbonic anhy
drase ）Ｂ（５．８５）、ヒト カルボニツク アンヒ
ドラーゼ（human carbonic anhydrase）Ｂ（６．５
５）、ウマ ミオグロビン−アシデイツクバンド（hors
e myoglobin-acidic band ）（６．８５）ウマ ミオグ
ロビン−ベイシツクバンド（horse myoglobin-basic ba
nd）（７．３５）、レンチル レクチン−アシデイツク
バンド（lentil lectin-acidic band ）（８．１５）、
レンチル レクチン−ミドルバンド（lentillectin-mid
dle band）（８．４５）、レンチル レクチン−ベイシ
ツクバンド（lentil lectin-basic band）（８．６５）
及びトリプシノーゲン（９．３０）。 【０１４８】電極液：陽極液＝１Ｍ Ｈ3ＰＯ4 陰極液＝１Ｍ ＮａＯＨ 泳動条件：定電力１Ｗ／ｃｍゲル幅で９０分間冷却下
（１０℃）に泳動させた。 【０１４９】染 色：染色は、シルバー スタイン キ
ツトで行なつた。 【０１５０】上記泳動後、ゲルを１ｃｍ間隔でスライス
し、蒸留水１ｍｌにて振盪抽出（２日）し、ｐＨを測定
し、等電点を算出した。 【０１５１】その結果、ポリペプチドＩの等電点（ｐ
Ｉ）は６．８±０．１であり、この位置に単一のバンド
として泳動された。 【０１５２】アミノ酸組成比 上記（３）の逆相高速液体クロマトグラフイーにより得
られたポリペプチドＩ画分の３０μｌを、１２ｍｍ×１
２０ｍｍのパイレツクス製肉厚硬質試験管の底部に注意
深く入れ、水酸化ナトリウム粒を入れたデシケーターに
て減圧乾燥した。乾燥試料の入つた試験管に４Ｎ−メタ
ンスルホン酸〔０．２％の３−（２−アミノエチル）イ
ンドール含有、ピアース（Ｐierce）社製〕５０μｌを
加え、０．１〜０．２mmＨgで１分間脱気後、減圧封管
した。加水分解は１１８℃のヒーター中で２４時間を要
して行なつた。開管後、４Ｎ−水酸化ナトリウム４６μ
ｌで中和し、希釈用クエン酸緩衝液で４５０μｌとし
た。 【０１５３】アミノ酸分析は、アミノ酸アナライザー
（日立製作所製、日立８３５型分析計）を用い、上記試
料溶液２５０μｌを注入して行なつた。分離されたアミ
ノ酸は、オルトフタルアルデヒド法で検出した。また定
量は、試料の前後に分析した標準アミノ酸で作成した検
量線によつて行なつた。 【０１５４】その結果を、Ｐheを基準（９モル）とし
て、各アミノ酸の含有モル比で下記第１表に示す。尚、
上記分析条件下においては、Ｐro及びＣysは測定できな
い。またＳer、Ｔhr及びＭetについては、上記分析条件
下での回収率を（）内に示した。 【０１５５】第 １ 表ア ミ ノ 酸 モ ル 比 Ａsp及び／又はＡsn １７．１ Ｓer １０．９（８０％） Ｔhr ５．４（９０％） Ｇlu及び／又はＧln ２３．８ Ｇly ８．３ Ａla ５．０ Ｖal １０．８ Ｍet ５．５（９０％） Ｉle ４．９ Ｌeu １５．１ Ｔyr ３．９ Ｐhe （ ９ ） Ｌys １４．９ Ｈis ０．９ Ｔrp ０．８ Ａrg ３．０アミノ酸配列 上記（３）の逆相高速クロマトグラフイーで得たポリペ
プチドＩ画分の１５０μｌを、アプライドバイオシステ
ムズ社製プロテインシークエンサーにて分析した。生じ
たＰＴＨ−アミノ酸を、３３％アセトニトリル水溶液１
００〜５０μｌにて適宜希釈し、その５μｌをウオータ
ーズ７１０Ｂ型オートサンプラーにて注入した。クロマ
トグラフイーのシステムは、ベツクマン１１２型ポンプ
２台を、４２１型コントローラーで作働させた。カラム
はウルトラスフエアーＯＤＳ−５μm の充填された２ｍ
ｍ×２５０ｍｍを用い、カラムヒーターにて５５℃に保
つた。流速は０．３ｍｌ／分とし、２０ｍＭ酢酸ナトリ
ウムとアセトニトリルとの混合液を用い、グラジエント
溶出法で分離し、２６９nmでモニターした。分析は４５
分とした。 【０１５６】２０サイクルの分析の結果、前記（３）で
得たポリペプチドＩのＮ末端２０個のアミノ酸配列は、
以下のものであると認められた。 【０１５７】Ａla−Ｐro−Ｖal−Ａrg−Ｓer−Ｌeu−Ａ
sn−Ｃys−Ｔhr−Ｌeu−Ａrg−Ａsp−Ｓer−Ｇln−Ｇln
−Ｌys−Ｓer−Ｌeu−Ｖal−Ｍet− 尚、Ｓerは副生物の一つで確認し、更に３２２nmに吸収
を示すデヒドロ体としての確認も行なつた。サイクル８
では副生物のピークからＣysであると推定し、更に元の
試料をカルボキサミドメチル化した後の分析でＣysと確
認した。 【０１５８】また、ポリペプチドＩをトリプシンで消化
して得たペプチド断片につき、それらのアミノ酸組成を
分析し、Ｃ端部ペプチドも欠損することなく、正確に含
まれていることを確認した。 【０１５９】即ち、ポリペプチドＩ ６０μｇを１％炭
酸水素アンモニウム６００μｌに溶解し、該溶液に、予
め１％炭酸水素アンモニウムに溶解させたトリプシン
（０．２ｍｇ／ｍｌ、クーパー社製）溶液の ２０μｌ
を加え、３７℃で２４時間放置してトリプシン切断ペプ
チドを得た。このペプチド混合物を、逆相ＨＰＬＣ〔Ｃ
−１８，３００オングストローム，４．６×１５０ｍ
ｍ；０．１％ＴＦＡをＡ液及び１％ＴＦＡ１／１０容を
含むアセトニトリルをＢ液として、該Ｂ液を１％／３分
の割合で増加させるプログラムにより溶出させる〕に付
し、Ｂ液が４０％までで全ての成分を単離した。之等の
ペプチドをアミノ酸分析に供した。このアミノ酸組成か
ら予想される全てのペプチド断片が同定でき、特にＣ端
部ペプチドについては、塩基性アミノ酸が含まれておら
ず、そのアミノ酸組成の結果は、予想されるアミノ酸を
正確に含んでいたことから、前記（３）で得られたポリ
ペプチドＩのＣ端部は、予想された通りに正確であるこ
とが確認された。 【０１６０】また、各ペプチド断片につき、上記と同様
にしてそれらのアミノ酸配列を分析した。その結果、確
認された配列は全てＩＬ−１βに一致した。確認された
ペプチド断片につき、之等をＩＬ−１βのアミノ酸番号
により次に示す。 【０１６１】〈確認されたペプチド断片（アミノ酸番
号）〉１〜４、５〜１１、１２〜１６、１７〜２７、２
８〜６３、６４〜６５、６６〜７４、７５〜８８、８９
〜９２、９５〜９８、９９〜１０３、１０４〜１０９、
１１０〜１３８、１３９〜１５３ 以上の結果から、前記（３）で得たポリペプチドＩは、
前記定義の配列で特定されるポリペプチドＩであること
が確認された。尚、ポリペプチドＩの分子量の計算値
は、１７３７６．５９である。 【０１６２】実施例１ 本発明ＩＬ−１β誘導体の製造 (1) ポリペプチドVIの製造 上記参考例２で得たp trp ＧＩＦ−αを利用して、サイ
ト−スペシフイツクミユータジエネシス（Ｓite −Ｓpe
cific Ｍutagenesis）〔Ｐroc.Ｎat. Ａcad.Ｓci.,８
１，５６６２−５６６６（１９８４）〕の方法に従い、
ＩＬ−１β（ポリペプチドＩ）のアミノ末端から７１番
目のＣysをＳerに変更したポリペプチドVIを以下の通り
製造した。 【０１６３】即ち、Ｍ１３mp１１フアージベクターを、
一本鎖（ss）ＤＮＡ鋳型として用いた。まず、プラスミ
ドp trp ＧＩＦ−αより、ＥcoＲＩ／ＢamＨＩＤＮＡフ
ラグメントを切り出し、Ｍ１３mp１１フアージ（ＲＦ）
のＥcoＲＩとＢamＨＩの制限酵素サイトにクローニング
し、これから一本鎖（ss）ＤＮＡ（Ｍ１３−ＧＩＦ−
α）を得、これをミユータジエネシスの鋳型とした。 【０１６４】合成オリゴヌクレオチド〔５’−ＣＴＧＴ
ＣＣＴＣＡＧＴＧＴＴＧ−３’（プライマー）〕を、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、これをssＭ
１３−ＧＩＦ−α ＤＮＡとハイブリダイズし、アニー
リング後、dＮＴＰsの存在下、ＤＮＡポリメラーゼＩ
（クレノーフラグメント）及びＴ４ＤＮＡリガーゼで各
々処理し、１５℃で１８時間インキユベートした。 【０１６５】得られたＤＮＡをＪＭ１０５コンピテント
細胞にトランスフオームし、生じたコロニーを、寒天プ
レート上に５０コロニー植菌し、３７℃で１８時間培養
した。生育したコロニーを含むフイルターを通常の方法
によりアルカリ変性し、乾燥後、８０℃で２時間ベーキ
ング処理を行なった。このフイルターをプレハイブリダ
イズした後、このものと、上記プライマーの５’末端を
32Ｐ−r −ＡＴＰでラベルした32Ｐ−プローベとを、室
温でハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたフイ
ルターを、６×ssc バッフアーで、室温で１０分間、次
いで３７℃で１０分間各々洗浄し、乾燥後、−７０℃で
１８時間オートラジオグラフイーを行なった。 【０１６６】変異した５クローンの内から代表としてＭ
１３−ＧＩＦ−７１s を選びこれをＪＭ１０５に感染さ
せて培養し、ssＤＮＡ及びＲＦ ＤＮＡを調製した。 【０１６７】上記で得たssＤＮＡのＭ１３ジデオキシチ
ェイン ターミネーション シークエンシングにより目
的の遺伝子の変異の確認を行なった。 【０１６８】また上記ＲＦ ＤＮＡにおいて、新しくで
きた制限酵素ＤdeＩサイトも確認できた。 【０１６９】ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ ＤＮＡよ
り、 ＥcoＲＩ／ＢamＨＩフラグメントを調製し、これ
を前記（１）と同様にして発現プラスミドに組込み、所
望のポリペプチドVI発現プラスミド（p trp ＧＩＦ−α
−７１Ｓ）を得た。 【０１７０】該プラスミドは、これをエシエリヒア・コ
リＨＢ１０１に保有させ、該株は微工研に「Ｅsherichi
a coli ＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ−α−７１Ｓ」なる
名称で微工研寄第１２９６号（ＦＥＲＭ ＢＰ １２９
６）として寄託されている。 【０１７１】このプラスミドを用いて、参考例２−
（２）と同様にして、菌体抽出物上清を得、該上清のＧ
ＩＦ活性を測定した。その結果、培養液１ｍｌ当りのＧ
ＩＦ活性（単位／ｍｌ培養液）は、エシェリヒア・コリ
ＨＢ１０１を宿主として２．４×１０6であつた。 【０１７２】これより、参考例２−（３）と同一の手段
により、目的のポリペプチドVIを単離、精製した。 【０１７３】(2) ポリペプチドIVの製造 プラスミドp trp ＧＩＦ−αを利用して上記(1)と同様
にして、ポリペプチドIVを製造した。 【０１７４】即ち、Ｍ１３mp１１フアージベクターを、
一本鎖（ss）ＤＮＡ鋳型として用いた。まずプラスミド
p trp ＧＩＦ−αより、ＥcoＲＩ／ＢamＨＩＤＮＡフラ
グメントを切り出し、Ｍ１３mp１１フアージ（ＲＦ）の
ＥcoＲＩとＢamＨＩの制限酵素サイトにクローニング
し、これから一本鎖（ss）ＤＮＡ（Ｍ１３−ＧＩＦ−
α）を得、これをミュータジェネシスの鋳型とした。 【０１７５】合成オリゴヌクレオチド〔５’−ＣＴＧＡ
ＡＣＴＣＧＡＣＴＣＴＣ−３’（プライマー）〕を、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、これをssＭ
１３−ＧＩＦ−α ＤＮＡとハイブリダイズし、アニー
リング後、ｄＮＴＰｓの存在下、ＤＮＡポリメラーゼＩ
（クレノーフラグメント）及びＴ４ＤＮＡリガーゼで各
々処理し、１５℃で１８時間インキユベートした。 【０１７６】得られたＤＮＡをＪＭ１０５コンピテント
細胞にトランスフオームし、生じたコロニーを、寒天プ
レート上に１００コロニー植菌し、３７℃で１８時間培
養した。生育したコロニーを含むフイルターを通常の方
法によりアルカリ変性し、乾燥後、８０℃で２時間ベー
キング処理を行なった。このフイルターをプレハイブリ
ダイズした後、このものと、上記プライマーの５’末端
を、32Ｐ−ｒ−ＡＴＰでラベルした32Ｐ−プローベと
を、室温でハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせ
たフイルターを、６×ssc バッフアーで、室温で１０分
間、次いで３７℃で１０分間各々洗浄し、乾燥後、−７
０℃で１８時間オートラジオグラフイーを行なった。 【０１７７】変異した４クローンの内から代表としてＭ
１３−ＧＩＦ−８Ｓを選びこれをＪＭ１０５に感染させ
て培養し、ssＤＮＡ及びＲＦ ＤＮＡを調製した。 【０１７８】上記で得たssＤＮＡのＭ１３ジデオキシチ
ェイン ターミネーシヨン シークエンシングにより目
的の遺伝子の変異の確認を行なった。 【０１７９】また上記ＲＦ ＤＮＡにおいて、新しくで
きた制限酵素Ｈinf Ｉサイトも確認できた。 【０１８０】ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ ＤＮＡよ
り、 ＥcoＲＩ／ＢamＨＩフラグメントを調製し、これ
を参考例２−（１）と同様にして発現プラスミドに組込
み、所望のポリペプチドIV発現プラスミド（p trp ＧＩ
Ｆ−α−８Ｓ）を得た。 【０１８１】このプラスミドを用いて、参考例２−
（２）と同様にして、菌体抽出物上清を得た。該上清の
ＧＩＦ活性は、宿主してエシェリヒア・コリＨＢ１０１
を用いた場合、１．２×１０5単位／ｍｌ培養液であ
り、エシェリヒア・コリＷ３１１０を用いた場合、６．
２×１０5単位／ｍｌ培養液であつた。 【０１８２】上記上清より、参考例２−（３）と同一の
手段により、目的のポリペプチドVIを単離、精製した。 【０１８３】(3) ポリペプチドＶの製造 上記(1)及び(2)で得たプラスミドp trp ＧＩＦ−α−７
１Ｓ及びp trp ＧＩＦ−α−８Ｓの各々を、制限酵素Ｅ
coＲＩ及びＨind III で切断後、p trp ＧＩＦ−α−８
Ｓから約４００bpのＤＮＡフラグメントを、またp trp
ＧＩＦ−α−７１Ｓから約４６００bpのＤＮＡフラグメ
ントをそれぞれ取り出し、両者をライゲーシヨンして、
ＩＬ−１β（ポリペプチドＩ）のＮ末端から８番目及び
７１番目のＣysをいずれもＳerに変更させた所望のポリ
ペプチドＶの発現用プラスミドptrp ＧＩＦ−α−８Ｓ
７１Ｓを得た。 【０１８４】このプラスミドを用いて、参考例２−
（２）と同様にして、菌体抽出物上清（エシェリヒア・
コリＨＢ１０１を宿主とする場合はＧＩＦ活性として
１．４×１０4単位／ｍｌ培養液、またエシェリヒア・
コリＷ３１１０を宿主とする場合はＧＩＦ活性として５
×１０5単位／ｍｌ培養液）を得、これより参考例２−
（３）と同一の手段により、目的のポリペプチドＶを単
離、精製した。 【０１８５】(4) ポリペプチドIIの製造 上記(1)と同様にして、５’−ＧＣＴＣＣＴＧＴＡＧＧ
ＴＴＣＴＣＴＧ−３’をプライマーとして用いることに
より、ポリペプチドII発現用プラスミドp trpＧＩＦ−
α−４Ｇを得た。 【０１８６】該プラスミドは、これをエシエリヒア・コ
リＨＢ１０１に保有させ、該株は微工研に「Ｅsherichi
a coli ＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ−α−４Ｇ」なる名
称で微工研寄第１２９７号（ＦＥＲＭ ＢＰ １２９
７）として寄託されている。 【０１８７】該プラスミドを用いて、参考例２−（２）
と同様にして菌体抽出物上清（エシェリヒア・コリＨＢ
１０１を宿主として、ＧＩＦ活性として２．８×１０5
単位／ｍｌ培養液）を得、これより参考例２−（３）と
同一の手段により、目的のポリペプチドIIを単離、精製
した。 【０１８８】この精製操作において、ＣＭ−ＨＰＬＣの
主ピークの前半部の再クロマトグラフイーによりポリペ
プチドＸＸＸＸVIIIを精製品として得た。ポリペプチド
ＸＸＸＸVIIIは、ポリペプチドIIと同程度のＣＳＦ産生
促進活性を有し、同様に、ＧＩＦ活性、ＬＡＦ活性及び
ＰＧＥ産生促進活性がいずれも低い特徴を示した。 【０１８９】(5) ポリペプチドIII の製造 上記(1)と同様にして、５’−ＧＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧ
ＧＡＣＴＣＡＣＡ−３’をプライマーとして用いること
により、ポリペプチドIII発現用プラスミドp trp ＧＩ
Ｆ−α−１１Ｑを得た。 【０１９０】該プラスミドを用いて、参考例２−（２）
と同様にして菌体抽出物上清（エシェリヒア・コリＨＢ
１０１を宿主として、ＧＩＦ活性として２．８×１０6
単位／ｍｌ培養液）を得、これより参考例２−（３）と
同一の手段により、目的のポリペプチドIIIを単離、精
製した。 【０１９１】(6) ポリペプチドVIIの製造 上記(1)と同様にして、５’−ＴＣＴＴＣＡＡＣＴＡＧ
ＡＴＡＧＡＡ−３’をプライマーとして用いることによ
り、ポリペプチドVII発現用プラスミドp trpＧＩＦ−α
−１０２ＣＴを得た。 【０１９２】該プラスミドを用いて、参考例２−（２）
と同様にして菌体抽出物上清（エシェリヒア・コリＨＢ
１０１を宿主として、ＧＩＦ活性として７．４×１０4
単位／ｍｌ培養液）を得、これより参考例２−（３）と
同一の手段により、目的のポリペプチドVIIを単離、精
製した。 【０１９３】(7) ポリペプチドVIIIの製造 上記(1)と同様にして、５’−ＡＡＡＧＧＣＧＧＣＴＡ
ＧＧＡＴＡＴＡＡ−３’をプライマーとして用いること
により、ポリペプチドVIII発現用プラスミドptrp ＧＩ
Ｆ−α−１４０ＣＴを得た。 【０１９４】該プラスミドを用いて、参考例２−（２）
と同様にして、エシェリヒア・コリＷ３１１０を宿主と
して用いることにより、菌体抽出物上清（ＧＩＦ活性と
して５．８×１０3単位／ｍｌ培養液）を得、これより
参考例２−（３）と同一の手段により、目的のポリペプ
チドVIIIを単離、精製した。 【０１９５】また、上記プラスミドp trp ＧＩＦ−α−
１４０ＣＴを、エシェリヒア・コリＨＢ１０１を宿主と
して発現させることによつて、同様に菌体抽出物上清
（ＧＩＦ活性として１．３×１０6単位／ｍｌ培養液）
が得られ、これより上記と同様にしてポリペプチドＩが
単離、精製された。 【０１９６】尚、上記において、エシェリヒア・コリＨ
Ｂ １０１を宿主とする場合には、ナンセンスサプレツ
サーとしてＳupＥが働き、ＵＡＧの終止コドンがＧlnと
して読まれて（read throughされて）ポリペプチドＩが
発現される。一方宿主をエシェリヒア・コリＷ３１１０
とする場合には、ＳupＥ遺伝子がコードされていないた
め、上記ＵＡＧが終止コドンとして働き、１４０個のア
ミノ酸配列からなるポリペプチドVIIIが発現される。 【０１９７】(8) ポリペプチドＩ〜VIIIの同定 前記(1)〜(7)で得られた本発明のＩＬ−１β誘導体（ポ
リペプチドＩ〜VIII）につき、参考例２−（４）と同様
にしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１８％ポリアクリルアミドゲ
ル、２ＭＥ+）を行なった。 その結果、ポリペプチド
Ｉ〜ポリペプチドVIIは、いずれも約１７．５kdの位置
に、またポリペプチドVIIIは約１６kdの位置に、それぞ
れ単一のバンドとして泳動された。 【０１９８】また、ポリペプチドＩのＧＩＦ活性に対す
る中和抗血清（参考例２−（３）で得たポリペプチドＩ
を通常の方法に従い、家兎に免疫して作製した抗血清、
以下同じ）を用いたウエスタンブロツテイング〔Ｗeste
rn blotting,Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,ＵＳＡ，７６，
１４２０（１９７９）〕により、ポリペプチドＩ〜ポリ
ペプチドVIIIの各々を、相当する位置に単一のバンドと
して確認した。 【０１９９】実施例２ (1) 参考例２−（１）で得た形質転換体（エシエリヒ
ア・コリＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ−α）を、アンピシ
リン５０μｇ／ｍｌ及びＬ−トリプトフアン２０μｇ／
ｍｌを含むＬＢ培地４００ｍｌ中で３７℃で一晩培養
し、この４００ｍｌを１％カザミノ酸を含むＭ９最小培
地２０ｌに植菌し、３７℃で８．５時間培養した。 【０２００】遠心分離により集菌し、得られる菌体を１
Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ4に懸濁させ、一夜冷室に放置した後、
１０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に対して２
日間透析した。 【０２０１】得られた透析液を遠心分離（１００００rp
m 、３０分間）して上清を得た。 【０２０２】大腸菌培養液３００ｌ分に相当する上記上
清を集め、これを１００ｍＭ酢酸でｐＨ５．０に調製し
た後、ＳＰ−ゼータプレツプ２５０カートリツジ〔ＬＫ
Ｂ社製〕に付し、流速３０ｍｌ／分で始め、１０ｍＭ酢
酸ナトリウム（ｐＨ５．３）で１００分、続いて０．１
Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．
５）で２２０分、更に１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ酢
酸ナトリウム（ｐＨ５．５）でそれぞれ溶出させた。各
分画をＨＰＬＣによりチェックし、目的物の含まれてい
るフラクション、即ち０．１Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）のフラクション（フラ
クションＮo.８〜１０）を集めた。 【０２０３】これを１００ｍＭ酢酸でｐＨ４．５とした
後、ＨＰＬＣ〔東洋曹達株式会社製、ＴＳＫゲルＳＰ−
５ＰＷ、５．５×２０cm〕に付し、下記条件で溶出させ
て、リテンションタイム（r.t.）６５〜７２分の分画を
採取した。 【０２０４】 溶離液Ａ：５０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５） 溶離液Ｂ：０．５Ｍ ＮａＣｌ含有５０ｍＭ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５．５） 流 速 ：３０ｍｌ／分 かくしてポリペプチドＩの精製品を得た。 【０２０５】これを、限外濾過（ＹＭ−５メンブラン）
により、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．
０）の溶液組成となるように緩衝液を交換しつつ、濃縮
（２０mg／ｍｌ）した。 【０２０６】更に、ポジタインフイルターＮＦＺ（日本
ポール社製）を装着した濾過装置に、上記濃縮液を供し
て滅菌濾過した後、パイロジエンが１００ｐｇ／ｍｇ蛋
白以下の精製品を得た。 【０２０７】上記精製法により、大腸菌培養液３００ｌ
より、ポリペプチドＩの約３ｇを収得した。 【０２０８】(2) 上記(1)のＨＰＬＣ（ＳＰ−５ＰＷ）
の溶出において、メインピークの前半のフラクション
（r.t.６４〜６５分）を採取し、これを再度クロマトグ
ラフイーに付すことにより、ポリペプチドＸを得た。
２．７×１０6ＧＩＦ単位／ｍｇ蛋白。 【０２０９】また同様に、メインピークの後半のフラク
ション（r.t.７２〜７６分）より、ポリペプチドＸＩを
得た。２．８×１０7ＧＩＦ単位／ｍｇ蛋白。 【０２１０】(3) 上記(1)及び(2)で得られたポリペプ
チドＩ、Ｘ及びＸＩのアミノ酸分析を、参考例２−
（４）と同様にして行なった。結果を下記第２表に示
す。 【０２１１】またポリペプチドＸ及びＸＩについては、
参考例２−（４）におけるアミノ酸配列分析と同様にし
て、それらのＮ末端部配列を確認、同定した。 【０２１２】 【化１８】【０２１３】(4) ポリペプチドＩは、分子内に２個の
Ｃys（８位及び７１位）を有している。之等Ｃysの側鎖
ＳＨ基の存在状態を、下記方法により調べた。 【０２１４】a ．参考例２−（３）で得たポリペプチド
Ｉの約５ナノモル相当（０．１Ｍ ＮａＣｌを含有する
５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）溶液１００μ
ｌ）を、Ａ、Ｂ及びＣの３本の試験管にそれぞれ分取
し、各試験管に０．１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．４５）
を含有させた６Ｍグアニジン塩酸溶液各３００μｌを加
えた。 【０２１５】次に試験管Ａ及びＢには、６Ｍグアニジン
塩酸溶液２５μｌを加えてブランクとし、試験管Ｃには
還元剤であるジチオスレイトール２μモルを含む６Ｍグ
アニジン塩酸溶液２５μｌを加え、各試験管に１分間窒
素ガスを吹込んだ後、５０℃で２時間放置した。 【０２１６】次いで、試験管Ａには、ブランクとして、
６Ｍグアニジン塩酸溶液２５μｌを、試験管Ｂ及びＣに
はヨードアセトアミド４μモルを含む６Ｍグアニジン塩
酸溶液２５μモルを加え、各試験管に１分間窒素ガスを
吹込んだ後、暗所で２５℃下に３０分間放置した。 【０２１７】上記の通り処理した試験管Ａ、Ｂ及びＣ
に、それぞれ１０％ＴＦＡ５μｌを加え、逆相ＨＰＬＣ
（Ｃ3）により蛋白質を精製した。 【０２１８】精製蛋白質の約１／１０量を試験管に取
り、乾燥後、４Ｎ−メタンスルホン酸にて加水分解し、
アミノ酸組成を調べた。 【０２１９】その結果、試験管Ｂ及びＣからは、カルボ
キシメチルシステインが、ほぼ同量検出された。このこ
とから、試験管ＡではポリペプチドＩはそのままの状態
であるのに対し、試験管Ｂ及びＣでは、Ｓ−カルボキサ
ミドメチル化−ポリペプチドＩに変化したことが確認で
き（試験管Ｂは還元剤にさらしていないので）、従って
ポリペプチドＩに含まれるＣysは、ジスルフィド（Ｓ−
Ｓ）結合を本形成していないことが判った。 【０２２０】更に、上記試験管Ａ、Ｂ及びＣ中の生成物
の残量（％）を乾燥後、これらにそれぞれ１％重炭酸ア
ンモニウム溶液６００μｌを加えて溶解させて、各々１
μｇ／５μｌ濃度に調製した。之等各液にトリプシン溶
液７．５μｌをそれぞれ加え、３７℃で２０時間酵素消
化を行なった。その後、各液に１０％ＴＦＡ１０μｌを
加え、酵素反応を停止させ、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ18）に
て、ペプチド断片を分離した。 【０２２１】その結果、試験管Ｂ及びＣはほぼ同じパタ
ーンを示し、試験管Ａは之等とは異なるパターンを示し
た。 【０２２２】上記で単離した各ペプチドのアミノ酸組成
を、前記と同様にして求めた結果、試験管Ａのペプチド
断片から、Ｃys１個を含まなければ生じないポプチドの
存在を確認した。 【０２２３】以上の結果から、ポリペプチドＩのＣys残
基は、分内及び分子間のいずれでもジスルフィド結合を
形成していないことが確認された。 【０２２４】b ．エルマン法〔Ｅllman 法、Ａrch.Ｂio
chem．Ｂiophys.,８２，７０（１９５９）〕に従い、以
下のごとくしてポリペプチドＩのＳＨ基の定量を行なっ
た。 【０２２５】即ち、参考例２−（３）で得たポリペプチ
ドＩの２００μｇ（１１．５μモル）を、６Ｍ塩酸グア
ニジン及び１−ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１ＭトリスＨ
Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌに溶解させた。一方、
新鮮な０．０１Ｍ ＤＴＮＢ〔５，５’−ジチオビス
（２−ニトロベンゾイック アシッド〕を含む０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）（以下これを「エルマン
試薬」という）を調製した。 【０２２６】対照セルに６Ｎ塩酸グアニジン及び１０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡを含む０．１ＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．０）１ｍｌを、また試料セルにポリペプチドＩを含
む上記溶液１ｍｌをそれぞれ導入し、その各々にエルマ
ン試薬各４０μｌを加えて混合し、直ちに４１２nmにお
ける吸光度を測定した。最大吸光度になった後、ＤＴＮ
Ｂの分解による吸光度の減少を「０」に補正して、ＳＨ
基の濃度を決定したその結果、実際に得られた４１２nm
での吸光度は０．３２８であった。 【０２２７】一方、６Ｍ塩酸グアニジンを含む水溶液中
での３−カルボキシレート−４−ニトロチオフエノレー
ト（３−calboxylate −４−nitrothio-phenolate ）イ
オンのε412は、１３８８０Ｍ-1cm-1であり〔Ｅur. Ｊ.
Ｂiochem.,３０，３２（１９７２）〕、このことよ
り、ポリペプチドＩ溶液のＳＨ基は、０．００００２４
５（Ｍ／e ）であり、ポリペプチドＩの１１．５μモル
中にＳＨ基が２４．５μモル存在することとなることが
判った。 【０２２８】上記より、ポリペプチドＩに含まれるＣys
は、共に遊離のＳＨ基を有していることが確認された。 【０２２９】尚、ポリペプチドＩを水又はＰＢＳ（−）
に溶解し、凍結乾燥を３〜４回繰返した場合において
も、ＧＩＦ活性及び上記エルマン法によるＳＨ基の定量
値には、殆んど変化は認められなかった。 【０２３０】(5) 遺伝子組換え技術に従い、大腸菌等
で多量に異種蛋白質を発現させる場合、その蛋白質は大
腸菌の菌体中に不溶性物質（inclusion body）として蓄
積されることが多く、このような場合には、目的蛋白質
を菌体から採取するに当って、例えば７Ｍ塩酸グアニジ
ン、８Ｍ尿素又は０．１％ＳＤＳ等の変性剤を使用する
過激な条件下での処理が必要となる。しかるに、この様
な処理によれば、目的蛋白質は、その高次構造を含め
て、不可逆的な損傷を受けるおそれが多分にある。従っ
て、できる限り上記の如き変性剤を使用することなく、
温和な条件下で目的蛋白質を単離抽出できることが、上
記遺伝子組換え技術上の重要な関心事である。しかし
て、前記した(1)に示す方法によれば、目的蛋白質の抽
出単離を、浸透圧ショックという非常に温和な条件の採
用により行なうことができ、この点で該方法は極めて好
ましい。また該方法に従い得られる目的蛋白質は、より
天然に近い高次構造を保持されており、この点からも望
ましいものである。 【０２３１】(6) 実施例１−(1)に準じて、プラスミド
p trp ＧＩＦ−αを利用したサイト−スペシフィックミ
ュータジェネシスにより、下記３表に示す各ポリペプチ
ド（本発明ＩＬ−１β誘導体）を得た。尚、各ポリペプ
チドの発現、ＧＩＦ活性の測定及び精製は、上記(1)に
従うものであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥは参考例２−（４）
に示す方法に準じた。以下の各例でも特筆しない限り同
様である。 【０２３２】 【化１９】【０２３３】 【化２０】【０２３４】(7) 実施例１−(6)で得たプラスミドp tr
p ＧＩＦ−α−１０２ＣＴを用いて、宿主をエシェリヒ
ア・コリＷ３１１０として、同様に発現及び精製して本
発明ＩＬ−β誘導体であるポリペプチドＸＸＸを得た。
約１１．４kd（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、以下同じ）。 【０２３５】(8) プラスミドp trp ＧＩＦ−α−４Ｇ
を利用し、プライマーとして５’−ＧＣＡＣＴＣＴＣＣ
ＡＧＧＡＣＴＣＡＣＡ−３’を用いて、上記(6)と同様
にしてポリペプチドＸIV発現用プラスミドp trp ＧＩＦ
−α−４Ｇ１１Ｑを得た。該プラスミドを用いて、エシ
ェリヒア・コリＨＢ１０１を宿主として、同様に発現
（２．７×１０5ＧＩＦ単位／ｍｌ培養液）及び精製し
て、本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドＸIVを
得た。 【０２３６】約１７．５kd。 【０２３７】(9) 実施例１−(3)に準じて、プラスミド
p trp ＧＩＦ−α−４Ｇ及びp trp ＧＩＦ−α−９８Ｌ
を用いて、ポリペプチドＸＶ発現用プラスミドp trp Ｇ
ＩＦ−α−４Ｇ９８Ｌを得た。 【０２３８】即ち、上記両プラスミドを制限酵素ＥcoＲ
Ｉ及びＨind III で切断後、p trpＧＩＦ−α−４Ｇか
ら約４００bpのＤＮＡフラグメントを、またp trp ＧＩ
Ｆ−α−９８Ｌから約４．６kbp のＤＮＡフラグメント
をそれぞれ取り出し、両者をライゲーションさせた。 【０２３９】プラスミドp trp ＧＩＦ−α−４Ｇ９８Ｌ
を用いて、エシェリヒア・コリＷ３１１０を宿主として
同様に発現及び精製して本発明ＩＬ−１β誘導体である
ポリペプチドＸＶを得た。約１７．５kd。 【０２４０】〔１０〕 上記(9)において、プラスミドp
trp ＧＩＦ−α−４Ｇの代りにプラスミドp trp ＧＩ
Ｆ−α−１１Ｑ（その約４００bpのＤＮＡフラグメント
を使用）を用いて、同様にしてポリペプチドＸVI発現用
プラスミドp trp ＧＩＦ−α−１１Ｑ９８Ｌを得た。該
プラスミドを用い同様にして本発明ＩＬ−１β誘導体で
あるポリペプチドＸVIを得た。約１７．５kd。 【０２４１】〔１１〕 上記(9)において、プラスミドp
trp ＧＩＦ−α−４Ｇの代りにプラスミドp trp ＧＩ
Ｆ−α−４Ｇ１１Ｑを用いて、該プラスミドからの約４
００bpのＤＮＡフラグメントを使用して、同様にしてポ
リペプチドＸIII発現用プラスミドp trp ＧＩＦ−α−
４Ｇ１１Ｑ９８Ｌを得た。該プラスミドを用い同様にし
て本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドＸIIIを
得た。約１７．５kd。 【０２４２】〔１２〕 実施例１−(3)に準じて、プラ
スミドp trp ＧＩＦ−α−８Ａ及びp trp ＧＩＦ−α−
７１Ｓを用いて、ポリペプチドＸＸＸVI発現用プラスミ
ドp trpＧＩＦ−α−８Ａ７１Ｓを得た。 【０２４３】即ち、上記両プラスミドを制限酵素ＥcoＲ
Ｉ及びＨind IIIで切断後、p trpＧＩＦ−α−８Ａから
約４００bpのＤＮＡフラグメントを、またp trp ＧＩＦ
−α−７１Ｓから約４．６kbp のＤＮＡフラグメントを
それぞれ取り出し、両者をライゲーションさせた。 【０２４４】プラスミドp trp ＧＩＦ−α−８Ａ７１Ｓ
を用い、エシェリヒア・コリＨＢ１０１を宿主として同
様に発現（８．７×１０5ＧＩＦ単位／ｍｌ培養液）及
び精製して本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチド
ＸＸＸVIを得た。約１７．５kd。 【０２４５】〔１３〕 上記〔１２〕において、プラス
ミドp trp ＧＩＦ−α−７１Ｓの代りにプラスミドp tr
p ＧＩＦ−α−７１Ａ（その約４．６kbp のＤＮＡフラ
グメントを使用）を用い、同様にしてポリペプチドＸＸ
ＸVII 発現用プラスミドp trpＧＩＦ−α−８Ａ７１Ａ
を得た。該プラスミドを保有するエシエリヒア・コリＨ
Ｂ１０１は微工研に「Ｅscherihia coli ＨＢ１０１／
ｐｔｒｐ ＧＩＦ−α−８Ａ７１Ａ」なる名称で微工条
研第１２９８号（ＦＥＲＭ ＢＰ １２９８）として寄
託されている。該プラスミドを用い同様に発現（１．６
×１０6ＧＩＦ単位／ｍｌ培養液）及び精製して本発明
ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドＸＸＸVII を得
た。約１７．５kd。 【０２４６】〔１４〕 上記〔１２〕において、プラス
ミドp trp ＧＩＦ−α−７１Ｓの代りにプラスミドp tr
p ＧＩＦ−α−７１Ｖを用いて、該プラスミドからの約
４．６kbp のＤＮＡフラグメントを使用し、同様にして
ポリペプチドＸＸＸVIII発現用プラスミドp trp ＧＩ
Ｆ−α−８Ａ７１Ｖを得た。該プラスミドを用いて同様
に発現（２．１×１０6ＧＩＦ単位／ｍｌ培養液）及び
精製して本発明ＩＬ−１β誘導体であるポリペプチドＸ
ＸＸVIIIを得た。約１７．５kd。 【０２４７】〔１５〕 上記(1)の方法に従い、実施例
１−(1)〜(7)及び後記実施例３−(6)〜(9)の各々で得ら
れた形質転換体より、本発明ＩＬ−１β誘導体であるポ
リペプチドII〜VIII及びＸＸＸＩ〜ＸＸＸIVを製造し
た。 【０２４８】之等はいずれもＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一の
バンドとして泳動された。またポリペプチドII〜VIII
は、前記と同一の位置に泳動され、ポリペプチドＸＸＸ
Ｉ〜ＸＸＸIVは、下記の通りであった。 【０２４９】 ポリペプチドＸＸＸＩ 約２２kd ポリペプチドＸＸＸII 約２３kd ポリペプチドＸＸＸIII 約２７kd ポリペプチドＸＸＸIV 約３１kd 実施例３ (1)Ｕ９３７細胞の培養 ヒトリンパ組織球腫Ｕ９３７細胞（Ａscenso，Ｊ．Ｌ．
et al., Ｂlood，Ｖol．５７，p １７０（１９８１）〕
１．４×１０9個を、１２−Ｏ−テトラデカノイルホル
ボール−１３−アセテート（ＴＰＡ）（フアルマシア社
製）２５ｎｇ／ｍｌ、コンカナバリンＡ（ＣonＡ）（シ
グマ社製）１０μｇ／ｍｌ及び１０％牛胎児血清（ＦＣ
Ｓ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に入れて、４×１０
5個／ｍｌの濃度の細胞浮遊液を調製した。 【０２５０】この細胞浮遊液１０ｍｌずつを、直径９cm
のシヤーレ（フアルコン３００３）に分注し、５％炭酸
ガス中、３７℃で３日間培養後、培養上清をアスピレー
ターにて除去し、１０％ＦＣＳ、細菌リポポリサツカラ
イド（ＬＰＳ）（デイフコ社製）１０μｇ／ｍｌ、ムラ
ミルジペプチド（ＭＤＰ）（和光純薬社製）１μｇ／ｍ
ｌ及びＴＰＡ１ｎｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ−１６４０培
地１０ｍｌを、各シヤーレに分注した。この培地にて５
％炭酸ガス中、３７℃で１８時間培養し、シヤーレ底部
に付着したＵ９３７細胞をm ＲＮＡ調製用の材料として
利用した。 【０２５１】(2)ｍＲＮＡの調製 ＲＮＡの抽出は、グアニジニウム／熱フエノール（guan
idium ／hot phenol）法〔Ｆeramisco, Ｊ．Ｒ，et a
l., Ｊ．Ｂiol.Ｃhem., Ｖol. ２５７，p １１０２４
（１９８２）〕とグアニジニウム／セシウムクロライド
（guanidinium ／cesium chloride ）法〔Ｇlisin,Ｖ．
et al., Ｂiochemistry ，Ｖol. １３，p ２６３３（１
９７４）〕との組合せにより行なった。 【０２５２】上記(1)で培養したＵ９３７細胞を洗浄す
るために、培養上清を除去した後、各シヤーレを５ｍｌ
のＰＢＳ（−）溶液にてすすぎ、その後、各シヤーレに
１ｍｌの４Ｍ−グアニジン・イソチオシアネート混合液
〔４Ｍ−グアニジンイソチオシアネート（Ｆluka社
製）、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０ｍＭ
ＥＤＴＡ、２％ラウロイリルザルコシン酸ナトリウム〕
を添加し、細胞を溶解させた。溶解液をラバーポリスマ
ンとパスツールピペツトにて回収して、細胞溶解液４２
０ｍｌを得た。この溶解液を６０℃に保ち、１８Ｇ注射
針に通過させることにより、染色体ＤＮＡをせん断し、
その後６０℃に保温したフエノールを等量加え、１８Ｇ
注射針にて更に溶液を混合し、せん断した。次いでこの
混合液に０．１Ｍ酢酸ナトリウム−１０ｍＭトリスＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）−１ｍＭ ＥＤＴＡ液２１０ｍｌとク
ロロホルム−イソアミルアルコール（２４：１容積比）
混液４２０ｍｌとを加え、６０℃に保温しながら、１５
分間激しく撹拌した。混合液を氷冷後、３０００rpm 、
４℃で２０分間遠心し、水層を回収した。水層に２容の
エタノールを加え、−７０℃にて一夜放置後、粗ＲＮＡ
沈澱を得た。該粗ＲＮＡを、６Ｍグアニジン・イソチオ
シアナート−５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）
−０．１Ｍβ−メルカプトエタノール−０．５％ラウロ
イリルザルコシン酸ナトリウム液４８ｍｌに溶解させ、
塩化セシウム１９．２g を添加して溶解させた。次にこ
の混合液７ｍｌずつを、５．７Ｍ塩化セシウム−０．１
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）の４ｍｌに重層し、ベツク
マンＳＷ４０Ｔi ローターにて、２５℃、３１５００rp
m で２０時間遠心して、ＲＮＡを分取した。 【０２５３】かくして得られたＲＮＡ量は９．７ｍｇで
あつた。 【０２５４】次に上記で得られたＲＮＡからｍＲＮＡを
取得するため、オリゴ(ｄＴ)-セルロース（コラボレイ
テイブ リサーチ（Ｃollaborative Ｒesearch,Ｉnc．
社製）を用いて、カラムクロマトグラフイーを行なっ
た。吸着は１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−０．
５Ｍ ＮａＣｌ−１ｍＭ ＥＤＴＡにて行い、溶出は１
０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ
にて行った。 【０２５５】この結果、得られたｍＲＮＡは、４００μ
ｇであつた。 【０２５６】(3)ｃＤＮＡライブラリーの調製 ｃＤＮＡライブラリーの調製は、以下の通り、ｃＤＮＡ
が動物細胞において発現可能なオカヤマ−ベルグ（Ｏka
yama- Ｂerg ）法により行った。即ち、ｃＤＮＡクロー
ニングに用いるｄＴ鎖の付加したベクター・プライマー
は、プラスミドｐＣＤＶ１より、またｄＧ鎖の付加した
リンカーＤＮＡは、プラスミドｐＬ１より、各々オカヤ
マらの方法〔Ｏkayama, Ｈ. and Ｐ．Ｂerg., Ｍolecul
ar andＣellular Ｂiology, Ｖol．３，p ２８０（１９
８３）〕に従って調製した。 【０２５７】次に上記(2)で得た ｍＲＮＡ１５μｇを、
５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）−０．５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ７．５）水溶液２０μｌに溶解し、６５℃で
５分間、次いで３７℃で５分間インキユベートした後、
反応液（全量４０μｌ）を、５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐ
Ｈ８．３）、８ｍＭ ＭｇＣｌ2、３０ｍＭ ＫＣｌ、
０．３ｍＭジチオスレイトール、２ｍＭの各ｄＡＴＰ、
ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰ、ベクター・プライマ
ー ＤＮＡ２．８μｇ、ＲＮase インヒビター（Ｐrome
ga Ｂiotech社製）６０ユニツト、逆転写酵素（バイオ
−ラド社製）４０ユニツトになるように調整して、３７
℃で１時間インキユベートし、０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ
７．５）２μｌ及び１０％ＳＤＳ２μｌを加えて反応を
停止させた。その後、フエノール・クロロホルム抽出及
びクロロホルム抽出を行い、エタノール沈澱としてベク
ター・プライマーｃＤＮＡ：ｍＲＮＡを回収した。回収
されたベクター・プライマーｃＤＮＡ：ｍＲＮＡを、１
４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ６．８）、１ｍＭ ＣａＣｌ2、０．１ｍＭジチ
オスレイトール、０．３μｇポリ（Ａ）、６６μＭ ｄ
ＣＴＰ及び３８ユニツトのターミナルデオキシヌクレオ
チジルトランスフエラーゼ（フアルマシア社製）からな
る反応液３０μｌ中で３７℃、５分間インキユベートし
た後、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）１．５μｌ及
び１０％ＳＤＳ１．５μｌを加えて反応を停止させ、フ
エノール・クロロホルム抽出及びクロロホルム抽出を行
なって、エタノール沈澱としてオリゴｄＣ鎖付加ｃＤＮ
Ａ：ｍＲＮＡ−ベクター・プライマーを回収した。 【０２５８】この回収された核酸を、７ｍＭトリスＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ ＭｇＣｌ2、６０ｍＭＮａ
Ｃｌ、１００μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン及び１２ユニ
ツトの制限酵素Ｈind III（日本ジーン社製）からなる
反応液２０μｌ中で、３７℃で９０分間インキユベート
し、次いで０．５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）１μｌ及び
１０％ＳＤＳ１μｌを加えて反応を停止させた。その
後、フエノール・クロロホルム抽出及びクロロホルム抽
出を行い、エタノール沈澱として、Ｈind III 分解され
たオリゴｄＣ鎖付加ｃＤＮＡ：ｍＲＮＡ−ベクター・プ
ライマーを回収した。これを１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）−１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）（ＴＥ
（ｐＨ７．５）１０μｌに溶解させた。このうちの１μ
ｌを用いて、上記ＴＥ（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ Ｎａ
Ｃｌ及びオリゴ dＣ鎖の付加されたリンカーＤＮＡ１４
ｎｇからなる反応液１０μｌ中で、６５℃で２分間イン
キユベートし、次いで４２℃で３０分間インキユベート
した後、０℃に冷却した。 【０２５９】上記反応液を、更に２０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、４ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ（Ｎ
Ｈ4）2ＳＯ4、０．１Ｍ ＫＣｌ、５０μｇ／ｍｌ牛血
清アルブミン、０．１ｍＭ β−ＮＡＤ（ニコチンアミ
ド・アデニン・ジヌクレオチド、フアルマシア社製）及
び０．６μｇのエシエリヒア・コリＤＮＡリガーゼ（フ
アルマシア社製）を含む反応液１００μｌとなるように
調整し、１２℃で一夜インキユベートした。この反応液
に、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰの各々
を４０μＭになるように、またβ−ＮＡＤを ０．１５
ｍＭになるようにそれぞれ加え、更にエシェリヒア・コ
リＤＮＡリガーゼの０．４μｇ、エシェリヒア・コリＤ
ＮＡポリメラーゼＩ（ベーリンガー・マンハイム社製）
の４．６ユニツト及びエシェリヒア・コリＲＮase Ｈ
（フアルマシア社製）の１ユニツトを加え、１２℃で１
時間、次いで２５℃で１時間インキユベートした。 【０２６０】上記で得られた反応液を用いて、エシェリ
ヒア・コリＨＢ１０１株を形質転換させた。エシェリヒ
ア・コリＨＢ１０１株のコンピテント・セルとしては、
ベテスダ リサーチ ラボラトリーズ社（Ｂethesda Ｒ
esearch Ｌaboratories ：ＢＲＬ）の製品を使用し、該
ＢＲＬ社のマニユアルに従って、上記形質転換を行なっ
た。 【０２６１】かくして、約２１０００個からなるｃＤＮ
Ａライブラリーが得られた。 【０２６２】(4)サルＣos−１細胞へのトランスフェク
シヨン 上記(3)で得られたｃＤＮＡライブラリーを、１グルー
プ当り平均７０クローンのグループに分け、各グループ
からプラスミドＤＮＡを調整した。 【０２６３】プラスミドＤＮＡは、アルカリ溶菌法（Ｍ
olecular Ｃloning−Ａ Ｌaboratory Ｍanual,Ｃold
Ｓpring Ｈarbor Ｌaboratory ，１９８２，p ３６８）
に従い調製した。 【０２６４】かくして各グループから調製されたプラス
ミドＤＮＡを、それぞれサル培養細胞のＣos−１細胞
〔Ｇluzman, Ｙ.,Ｃell ，Ｖol. ２３，p １７５（１９
８１）〕にトランスフェクションした。該トランスフェ
クションは、ＤＥＡＥ−デキストラン法によつた〔Ｙok
ota,Ｔ．et al., Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci. ＵＳＡ.,Ｖ
ol. ８１，p １０７０（１９８４）〕。即ち、Ｃos−１
細胞をトリプシン処理により、１０％ＦＣＳを含む Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地に懸濁させ、細胞数を１×１０6
個／ｍｌに調整後、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６
４０培地を２ｍｌ／ウエル加えた６ウエルプレートに、
各々５００μｌずつ分注した。一晩３７℃で培養後、上
清を除き、血清を含まない培地で細胞を洗浄し、１０μ
ｇ／ｍｌプラスミドＤＮＡ、０．４ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ
−デキストラン（フアルマシア社製）、５０ｍＭトリス
ＨＣｌ（ｐＨ７．４）及び１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ
−１６４０培地を１ｍｌ／ウエル加えて、４．５時間３
７℃で培養した。その後、上清を除き、血清を含まない
培地で細胞を洗浄し、１５０μＭクロロキン（シグマ社
製）及び１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を
２ｍｌ／ウエル加えて、更に３７℃で３時間培養した。
上清を除き、血清を含まない培地で細胞を洗浄後、１０
％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を３ｍｌ／ウエ
ル加えて、３７℃で７２時間培養した。上清を回収した
後、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を２ｍ
ｌ／ウエル加え、凍結融解を２回繰返し、細胞抽出液を
回収した。この培養上清及び細胞抽出液について、ＧＩ
Ｆ活性を測定した。 【０２６５】ＧＩＦ活性を示したグループを１０クロー
ン／グループの２４グループに分け、上記と同様の操作
を行ない、ＧＩＦ活性を測定し、活性を示したグループ
について、更にグループ内の各クローンにつき、上記と
同様の操作を行なって、ＧＩＦ活性を示すクローンを同
定した。 【０２６６】かくして、pcＤ−ＧＩＦ−１６及びpcＤ−
ＧＩＦ−２０７の２種類のクローンを得た。 【０２６７】之等のクローンのＧＩＦ活性（ＧＩＦ単位
／ｍｌ）を第４表に示す。 【０２６８】第 ４ 表クローン 培養上清 細胞抽出物 pcＤ−ＧＩＦ−１６ ４８．３ １２０．７ pcＤ−ＧＩＦ−２０７ ６２．６ １９６．９pcＤＶ１（対照） ０ ０ (5)クローンの解析 次に、両クローン由来のＧＩＦ活性の物質としての異同
を明白にするため一定のＧＩＦ活性を示すpcＤ−ＧＩＦ
−１６又はpcＤ−ＧＩＦ−２０７の培養上清及び細胞抽
出物のそれぞれに対して、ポリペプチドＩのＧＩＦ活性
に対する中和抗血清の順次希釈液を添加し、上記各上清
及び細胞抽出物に与える影響を試験した。 【０２６９】その結果を図３の第３−ａ図（pcＤ−ＧＩ
Ｆ−１６培養上清）、図３の第３−ｂ図（pcＤ−ＧＩＦ
−１６細胞抽出物）、図３の第３−ｃ図（pcＤ−ＧＩＦ
−２０７培養上清）及び図３の第３−ｄ図（pcＤ−ＧＩ
Ｆ−２０７細胞抽出物）に示す。各図において横軸は血
清希釈倍率を、縦軸はＧＩＦ活性（％）を各々示す。ま
た各図中（１）は抗ポリペプチドＩ血清を、（２）は正
常血清をそれぞれ示す。 【０２７０】第３−ａ図及び第３−ｂ図に示す通り、pc
Ｄ−ＧＩＦ−１６由来のＧＩＦ活性は、抗ポリペプチド
Ｉ血清の添加により、濃度依存的に、完全に中和された
が、第３−c 図及び第３−d 図に示す通り、pcＤ−ＧＩ
Ｆ−２０７由来のＧＩＦ活性は、抗ポリペプチドＩ血清
には全く影響されなかった。従って、pcＤ−ＧＩＦ−２
０７由来のＧＩＦ活性物は、ポリペプチドＩ及びpcＤ−
ＧＩＦ−１６由来のＧＩＦ活性物とは、免疫学的に異な
ることが判明した。 【０２７１】また、プラスミドpcＤ−ＧＩＦ−１６及び
pcＤ−ＧＩＦ−２０７のｃＤＮＡの制限酵素地図を図４
に示す。更に之等のｃＤＮＡの塩基配列を塩基特異的化
学修飾法〔Ｍethods in Ｅnzymology,Ｖol. ６５，p ４
９９（１９８０）〕及びフアージＭ１３ベクター〔Ｇen
e,Ｖol. １９，p ２６９（１９８２）〕を使用したジデ
オキシ・チエーン・ターミネーシヨン〔Ｐroc.Ｎatl.Ａ
cad.Ｓci.,ＵＳＡ ,Ｖol. ７４ ,p ５４６３（１９７
７）〕により決定した。 【０２７２】その結果、pcＤ−ＧＩＦ−１６の有するｃ
ＤＮＡは、マーチらの報告するＩＬ−１βの翻訳領域 c
ＤＮＡ配列と同一であり、pcＤ−ＧＩＦ−２０７の有す
るｃＤＮＡは、同じくＩＬ−１αの翻訳領域ｃＤＮＡ配
列と同一であることが確認された〔Ｃarl Ｊ．Ｍarch e
t al.,Ｎature,Ｖol．３１５，p ６４１（１９８
５）〕。 【０２７３】(6) ポリペプチドＸＸＸIVの製造 上記(5)で得たフルレングス（full length ）に近いＩ
Ｌ−１βのｃＤＮＡクローンpcＤ−ＧＩＦ−１６を、制
限酵素ＰvuIIで切断し、更に制限酵素ＮcoＩで部分切断
して、３８０bpのＮcoＩ−ＰvuIIＤＮＡフラグメント
を、アロースゲル電気泳動法により単離、精製した。 【０２７４】このＤＮＡフラグメントにマング・ビーン
・ヌクレアーゼ（mung bean nuclease）を作用させて、
制限酵素ＮcoＩ切断により生じた接着末端を平滑末端と
した。 【０２７５】次に、合成オリゴヌクレオチド〔 5’−Ｇ
ＡＴＡＡＴＧ− 3’及び 5’−ＣＡＴＴＡＴ− 3’〕の
各５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン
酸化し、之等を先のＤＮＡフラグメントにＴ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結後、制限酵素ＣlaＩ及びＨind III
で切断し、アガロースゲル電気泳動法により、約４００
bpのＣlaＩ−Ｈibd III ＤＮＡフラグメント〈Ａ〉を単
離、精製した。 【０２７６】他方、前記で得た発現プラスミドp trp Ｇ
ＩＦ−αを、制限酵素ＣlaＩ及びＨind III で切断し、
大きい方のＤＮＡフラグメント〈Ｂ〉を、アガロースゲ
ル電気泳動方により単離、精製した。 【０２７７】上記フラグメント〈Ａ〉と〈Ｂ〉とをＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、連結物をエシェリヒア
・コリＨＢ１０１にトランスフオームさせた。ボイリン
グ法により、得られるトランスフォーマントのプラスミ
ドＤＮＡを抽出し、制限酵素による切断地図を解析し
て、目的のトランスフオーマントを選択した。 【０２７８】かくして単離された目的トランスフオーマ
ント（エシエリヒア・コリＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ−
α−Ｖ）を、５０μｇ／ｍｌＬ−トリプトファンを含む
ＬＢ培地１０ｍｌ中で、３７℃で一晩振盪培養し、この
１ｍｌを５０μｇ／ｍｌアンピシリン及び１％カザミノ
酸を含むＭ９最小培地５０ｍｌに植菌し、３７℃で振盪
培養し、５５０nmでの吸光度が約１．０となった時点で
菌体を集め、１５％シュークロース−５０ｍＭトリスＨ
Ｃｌ−５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液５ｍｌ
に懸濁させ、これに１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム〔１０ｍ
ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）で溶解〕溶液５００μｌ
を加え、更に０．３％トリトンＸ１００−１８７．５Ｍ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）−１５０ｍＭトリスＨＣｌ
（ｐＨ８．０）の溶液５ｍｌを加え、室温で１５分間放
置後、超音波処理を行ない、遠心分離により菌体抽出物
上清を得た。 【０２７９】得られた菌体抽出物上清について、ＧＩＦ
活性の測定を行なった所、培養液１ｍｌ当り１１２ユニ
ツトであった。 【０２８０】(7) ポリペプチドＸＸＸIIの製造 前記で得たプラスミドｐＧＩＦ−αを、制限酵素ＮcoＩ
及びＡccＩで切断して、約０．７kbの ＮcoＩ−ＡccＩ
ＤＮＡフラグメントを、アガロースゲル電気泳動法によ
り単離、精製した。このＤＮＡフラグメントを、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（クレノー断片）を用いた処理により、
その両末端を平滑末端とした。 【０２８１】他方、プラスミドp ＴＭ１を、制限酵素Ｈ
ind IIIで切断後、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノー断
片）を用いて、切断部位を平滑末端とした。 【０２８２】上記により得られる２つのＤＮＡフラグメ
ントを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、連結物を
エシェリヒア・コリＨＢ１０１にトランスフォームし、
ボイリング法によりトランスフォーマントからプラスミ
ドＤＮＡを抽出し、制限酵素による切断地図から目的の
トランスフォーマントを選択した。 【０２８３】かくして単離されたトランスフォーマント
（エシェリヒア・コリＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ−α−
III）を、上記(6)に示すエシェリヒア・コリＨＢ１０１
／ptrp ＧＩＦ−α−Ｖの場合と同様にして培養後、菌
体抽出物上清を得た。この培養上清のＧＩＦ活性は培養
液１ｍｌ当り１９０ユニツトであった。 【０２８４】(8) ポリペプチドＸＸＸIII の製造 このポリペプチド発現プラスミドの作成は、サイト−ス
ペシフィック ミユータジェネシスの方法に従い、以下
に詳述するように不要な塩基配列部位を除去することに
より実施した。 【０２８５】即ち、ｐＧＩＦ−αを、制限酵素ＰstＩ及
び ＡccＩで切断後、アガロースゲル電気泳動法によ
り、約０．９kbのＰstＩ−ＡccＩＤＮＡフラグメントを
単離、精製し、その両末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを
用いて平滑末端とした。 【０２８６】このフラグメントを、別途にプラスミドp
ＴＭ１を制限酵素Ｈind IIIで切断後、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ（クレノー断片）を用いて平滑末端として調製し
たＤＮＡフラグメントに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて
連結し、連結物をエシェリヒア・コリＨＢ１０１にトラ
ンスフォームし、目的トランスフォーマントを、ボイリ
ング法により抽出されたプラスミドＤＮＡの制限酵素地
図により選択した。また得られたプラスミドのＤＮＡ塩
基配列も確認した。以下このプラスミドを「pＴＭ１−
Ｉ−２」と呼ぶ。 【０２８７】次いで、プラスミドp ＴＭ１−Ｉ−２を、
制限酵素ＥcoＲＩ及びＨind IIIで切断して、約７４０b
pのＥcoＲＩ−Ｈind III ＤＮＡフラグメントを、アガ
ロースゲル電気泳動法により単離、精製した。これを、
Ｍ１３mp１１フアージ（ＲＦ）のＥcoＲＩとＨind III
の制限酵素部位に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し
た。これから一本鎖（ss）ＤＮＡ（mp１１−trp−Ｉ２
（Ｅ／Ｍ））を得、これをミューダジェネシスの鋳型と
した。 【０２８８】合成オリゴヌクレオチド〔５’−ＣＡＣＧ
ＴＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＡＡＧＴＧ
ＣＴＣＣＴ−３’（プライマー）〕を、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼでリン酸化し、これをss mp １１−trp
−Ｉ−２（Ｅ／Ｍ）とハイブリダイズし、アニーリング
後、ｄＮＴＰｓの存在下にＤＮＡポリメラーゼＩ（クレ
ノー断片）及びＴ４ＤＮＡリガーゼで各々処理し、１５
℃で２晩インキユベートした。 【０２８９】得られたＤＮＡをＪＭ１０５コンピテント
細胞にトランスフォームし、生じたコロニーを、寒天プ
レート上に２００コロニー植菌し、３７℃で１８時間培
養した。生育したコロニーを含むフィルターを通常の方
法によりアルカリ処理変性し、乾燥後、８０℃で２時間
ベーキング処理した。このフィルターをハイブリダイズ
した後、このものと上記プライマーの５′末端を32Ｐ−
γ−ＡＴＰでラベルされた32Ｐ−プローベとを、室温で
ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズさせたフイルタ
ーを６×ＳＳＣバッファーを用い、室温で１０分間、次
いで０．２５×ＳＳＣバッファーを用い６０℃で５分間
各々洗浄し、乾燥後、−７０℃で１８時間オートラジオ
グラフィーを行なった。 【０２９０】変異したクローンの内から、代表としてmp
１１−trp ＧＩＦ−α−IV（Ｅ／Ｍ）を選び、これをＪ
Ｍ１０５に感染させて培養し、ssＤＮＡ及びＲＦ ＤＮ
Ａを調製した。 【０２９１】上記で得られたssＤＮＡのＭ１３ジデオキ
シチェイン ターミネーション シークエンシングによ
り、目的遺伝子の削除を確認した。 【０２９２】また、ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ ＤＮ
Ａより約６３０bpのＥcoＲＩ−Ｈind III ＤＮＡフラグ
メントを、アガロースゲル電気泳動法により単離、精製
した。 【０２９３】一方、プラスミドp ＴＭ１−Ｉ−２より、
同様にして約４．２kbＥcoＲＩ−Ｈind III ＤＮＡフラ
グメントを、単離、精製し、これと先の約６３０bpのＥ
coＲＩ−Ｈind III ＤＮＡフラグメントとを、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結させ、連結物をエシェリヒア・
コリＨＢ１０１にトランスフォームさせた。 【０２９４】目的のトランスフォーマントは、ボイリン
グ法に従い、トランスフォーマントよりブラスミドを抽
出し、その制限酵素地図解析により選択した。 【０２９５】かくして単離されたトランスフォーマント
（エシェリヒア・コリＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ−α−
IV）を、前記(6)に示すエシェリヒア・コリＨＢ１０１
／p trp ＧＩＦ−α−Ｖの場合と同様にして培養後、菌
体抽出物上清を得た。この培養上清のＧＩＦ活性は培養
液１ｍｌ当り３３６ユニツトであった。 【０２９６】(9) ポリペプチドＸＸＸＩの製造 上記(8)と同様にして、所望のポリペプチド発現プラス
ミドp trp ＧＩＦ−α−IIを保有するトランスフォーマ
ントを作成した。 【０２９７】鋳型としては、先の一本鎖ＤＮＡmp１１−
trp−Ｉ−２（Ｅ／Ｍ）を用いた。またプライマーとし
ては、合成オリゴヌクレオチド〔５’−ＣＡＣＧＴＡＡ
ＡＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧＴＴＣＣ
ＣＴ−３’〕を用いた。 【０２９８】上記プラスミドを保有するトランスフォー
マント（エシェリヒア・コリＨＢ１０１／p trp ＧＩＦ
−α−IIを同様にして培養後、菌体抽出物上清を得た。
この培養上清のＧＩＦ活性は培養液１ｍｌ当り１１２ユ
ニツトであった。 【０２９９】本発明ＩＬ−１β自身（ポリペプチドＩ）
及びその本発明誘導体のＧＩＦ活性については、既に記
載したが、加えて以下の試験を行なった。 【０３００】尚、前記したポリペプチドＩに対する抗血
清を用いて、ＲＩＡ法により測定したポリペプチドＩ換
算蛋白量（ｍｇ）当りのＬＡＦ活性（Ｕ）は、下記第５
表に示す通りである。 【０３０１】第 ５ 表ポリペプチド ＬＡＦ活性 （Ｕ／mg） ポリペフチドＩ ４．５×１０6 ポリペプチドII １．６×１０5 ポリペプチドIII ６．２×１０6 ポリペプチドIV ２．６×１０5 ポリペプチドＶ ２．１×１０5 ポリペプチドVI １．３×１０7 ポリペプチドVIII ８．０×１０ 3 薬理試験例１：ポリペプチドＩのＣＳＦ産生促進効果試
験 (1)ヒト肺細胞のＣＳＦ産生に対する促進効果試験ＣＳ
Ｆ産生株として、ヒト肺細胞由来株ＨＦＬ−１（Ｈuman
Ｅmbryonic lung Ｆibroblasts, ＡＴＣＣ登録細胞株
Ｎo.ＣＣＬ−１５３）を用い、以下の試験を行なった。 【０３０２】まず、上記ＨＦＬ−１細胞を２×１０5個
／ｍｌの細胞濃度となるように、１０％ウシ胎児血清加
ハムスター１２Ｋ培養液〔Ｈam, Ｒ．Ｇ.,Ｐroc.Ｎatl.
Ａcad.Ｓci.,５３，２８８（１９６５）〕に浮遊させ
た。次いで上記細胞懸濁液中に、種々の濃度に調製した
前記参考例で得たポリペプチドＩを加え、炭酸ガス培養
器内で３７℃で２４時間、４８時間及び７２時間各々培
養し、各培養上清を集め、之等培養上清中に産生蓄積さ
れたＣＳＦ量を、マウス骨髄細胞を使用して測定した
〔Ｌewis，Ｉ．Ｃ．et al., Ｊ．Ｉmmunol，１２８，１
６８（１９８２）〕。 【０３０３】ポリペプチドＩを用いて得られた各培養時
間(hr)での結果を図５に示す。図において、横軸はポリ
ペプチドＩの濃度（ＧＩＦ単位／ｍｌ）を、縦軸はＣＳ
Ｆ活性（単位／ｍｌ）を示す。 【０３０４】上記結果より、ポリペプチドＩの添加によ
れば、ＨＦＬ−１細胞株のＣＳＦ産生量は、該ポリペプ
チドの無添加に比べて実に数百倍にも亢進されることが
明らかである。 【０３０５】(2)ヒト皮膚由来細胞のＣＳＦ産生に対す
るポリペプチドＩの促進効果試験 ヒト正常皮膚由来細胞株としてＣＲＬ−１４４５（ＡＴ
ＣＣ．Ｎo.）を利用して以下の試験を行なった。 【０３０６】上記細胞を２×１０5個／ｍｌの細胞濃度
となるように１０％ウシ胎児血清加ダルベツコＭＥＭ培
養液〔Ｄulbeco，Ｒ．and Ｆreeman，Ｇ.,Ｖirology ，
８，３９６（１９５９）〕に浮遊させた。上記細胞浮遊
液に、種々の濃度の参考例で得たポリペプチドＩを加
え、炭酸ガス培養器内で３７℃で２４、４８及び７２時
間培養した後、培養上清を集め、産生されたＣＳＦ量を
マウス骨髄細胞を使用して上記試験(1)と同様にして測
定した。 【０３０７】得られた結果を図５と同様にして、図６に
示す。 【０３０８】図６より、ＧＩＦ活性として１単位／ｍｌ
以上のポリペプチドＩをヒト正常皮膚由来の原線維芽細
胞に加えることにより、該細胞のＣＳＦ産生能は著しく
促進されることが明らかである。 【０３０９】(3)生体内でのＣＳＦ産生に対する促進効
果試験 ポリペプチドＩを生体内に投与した場合、生体内でのＣ
ＳＦ産生亢進作用が発２されることを以下の動物実験に
より試験した。 【０３１０】即ち、正常マウス（ＢＡＬＢ／Ｃ系マウ
ス、静岡県実験動物協同組合より購入）に、種々の量の
参考例で得たポリペプチドＩ（ＧＩＦ活性として１０5
〜１０5単位／個体）を静脈内投与した。上記投与後
２、４、８、１２及び２４時間目に各実験動物より採血
し、血清中のＣＳＦ濃度をマウス骨髄細胞を用いて測定
した。 【０３１１】結果を図７に示す。図において横軸は各種
濃度（ＧＩＦ単位／個体）のポリペプチドＩの投与後時
間（hr）を、縦軸はＣＳＦ活性（単位／ｍｌ血清）を各
々示す。また図中（１）はポリペプチドＩの１０万ＧＩ
Ｆ単位／個体投与群を、（２）は同１万ＧＩＦ単位／個
体投与群を、（３）は同１０００ＧＩＦ単位／個体投与
群を、また（４）は対照群（ＨＳＡ１０μｇ／個体投与
群）を各々示す。 【０３１２】図７より、ポリペプチドＩを動物に与えた
場合、動物血清中のＣＳＦ濃度は著しく高くなっている
ことが判明した。即ち、ポリペプヂトＩは注射された量
に比例して生体内でのＣＳＦ産生を著しく亢進させる作
用のあることが認められた 薬理試験例２：ポリペプチドＩの抗関節炎試験 (1) パースン〔Ｐearson，Ｃ．Ｍ.,Ｐroc.Ｓoc. Ｅxp.
Ｂiol.Ｍed.,９１，９５（１９５６）〕及びワードと
ジヨーンズ〔Ｗard,Ｊ. Ｒ.,Ｊones, Ｒ．Ｓ.,Ａrthrit
is Ｒheumatism,５，５５７（１９６２）〕の方法に準
じて、アジユバント関節炎ラツトを作製した。即ち、雌
性Ｓ．Ｄ．系ラツトの尾根部皮内に、ミコバクテリウム
・ブチリカム（Ｍycobacterium butyricum）死菌を流動
パラフインに懸濁させたアジユバントを０．０５ｍｌ注
射した。１４日目に足腫脹に基づいて群分けし（n ＝
６）、その翌日より５日間に亘って、参考例で得たポリ
ペプチドＩ又はその溶媒（生理食塩水；対照群）を、皮
内投与した。経日的に足容積を測定することにより、関
節炎に対する影響を評価した。 【０３１３】結果を図８に示す。図において横軸はアジ
ユバント投与後日数（日）を、縦軸は足体積（×０．０
１ｍｌ）を各々示す。また図中（１）はポリペプチドＩ
の１０万ＧＩＦ単位／個体投与群を、（２）は同１万Ｇ
ＩＦ単位／個体投与群を、（３）は同１０００ＧＩＦ単
位／個体投与群を、（４）は同１００ＧＩＦ単位／個体
投与群を、（５）は対照群（生理食塩水投与群）を、ま
た（６）は正常ラツト群を各々示す。 【０３１４】図８より、対照群（グラフ（５））の足腫
脹は、２３日目まで増悪したのに対し、ポリペプチドＩ
の投与群（グラフ（１）〜（４））においては、その投
与の４日目（アジユバンド投与後１８日目）より足腫脹
の抑制作用が認められ、最終投与４日後（アジユバンド
投与後２３日目）においても関節炎の進行を阻止できる
ことが確認された。 【０３１５】薬理試験例３：本発明誘導体のＣＳＦ産生
促進効果試験 細胞株Ｕ−３７３ＭＧ〔ＡＴＣＣ ＨＴＢ１７、Ｇliob
lastoma,Ａstrocytoma, Ｈuman〕を用いて、以下の試験
を行なった。 【０３１６】上記細胞を、２×１０5個／ｍｌの細胞濃
度となるように、１０％ＦＣＳ（GIBCO 社製）、ＭＥＭ
非必須アミノ酸（Ｆlow 社製）及びＭＥＭピルビン酸ナ
トリウム（Ｆlow 社製）を添加したイーグルＭＥＭ培地
（日水社製）に浮遊させ、種々の濃度となるように被験
物質を加えて、炭酸ガス培養器内で３７℃で２４時間培
養した。 【０３１７】各培養上清を集め、之等培養上清中に産生
蓄積されたＣＳＦ量を、マウス骨髄細胞を使用して測定
した〔Ｌewis，Ｉ．Ｃ．et al., Ｊ．Ｉmmunol，１２
８，１６８（１９８２）〕。 【０３１８】結果を図９に示す。図において、横軸は被
験物質の濃度（ｎｇ／ｍｌ）を、縦軸はＣＳＦ活性（Ｕ
／ｍｌ）を示す。また、図中、曲線（１）〜（７）は、
以下の各ポリペプチドを被験物質とした時の結果を示
す。 【０３１９】曲線（１）…ポリペプチドVI 曲線（２）…ポリペプチドII 曲線（３）…ポリペプチドVIII 曲線（４）…ポリペプチドＶ 曲線（５）…ポリペプチドIV 曲線（６）…ポリペプチドIII 曲線（７）…ポリペプチドＸＸＸ 薬理試験例４：本発明誘導体の抗炎症試験 ウインター（Ｗinter ）らの方法〔Ｐroc.Ｓoc．Ｅxpt
l. Ｂiol.Ｍed.,１１１，５４４−５４７（１９６
２）〕に準じて、この試験を行なった。 【０３２０】即ち、６〜８週齢の雄ラツト（Ｓpraque
Ｄawley 系、日本チャールスリバー社）を、実験前日に
体重に基づいて１群６〜８匹の各群に分けて用いた。起
炎剤としてカラゲニン（Ｍarine Ｃolloid社製）を、生
理食塩水に１％となるように懸濁させたものを使用し、
ラツトの右後肢足蹠皮下に０．１ｍｌ注射して足浮腫を
惹起させた。足浮腫を評価するため、起炎剤注射の前後
の一定時間に、右後肢足蹠容積を、プレシモメーター
（plethysmometer，Ｕgo−Ｖasile 社製）を用いて測定
した。前値に対する起炎剤注射後の容積増加率を浮腫率
（swelling％）として表わした。 【０３２１】被験物質は、ダルベッコのリン酸塩緩衝食
塩水（Ｄulbeco s phosphate buffered saline）に溶解
希釈し、ラツトの背部皮内に０．１ｍｌ宛、起炎剤注射
の１時間前に注射した。尚、対照群として、溶媒投与群
を作成し、同一実験に供した。 【０３２２】結果を図１０に示す。 【０３２３】図において横軸は、起炎剤投与後時間（h
r）を、縦軸は浮腫率（％）を示す。また、図中、曲線
（１）は対照群を、曲線（２）はポリペプチドVIの０．
１μｇ投与群を、曲線（３）はポリペプチドVIの１μｇ
投与群を、曲線（４）はポリペプチドVIの１０μｇ投与
群をそれぞれ示す。 【０３２４】薬理試験例５：本発明誘導体の放射線障害
防止作用試験 ＢＡＬＢ／ｃ系マウス（９週齢）に致死量のＸ線を照射
する２０時間前に、ポリペプチドVIの１μｇ／マウス又
は０．３μｇ／マウスを腹腔内注射した。Ｘ線照射装置
（ＭＢＲ−１５０５Ｒ、日立メディコ社）を使用し、８
５０レントゲンのＸ線を、上記マウスに全身照射し、以
後、毎日その生存を確認した。尚、コントロールとし
て、ＰＢＳ投与群をおいた。 【０３２５】結果を図１１に示す。図において横軸はＸ
線照射後の日数（日）を、縦軸は供試動物の生存率
（％）を示し、曲線（１）はポリペプチドVIの１μｇ投
与群を、曲線（２）はポリペプチドVIの０．３μｇ投与
群を、また曲線（３）はコントロール群をそれぞれ示
す。 【０３２６】図１１より、コントロール群では、Ｘ線照
射後１８日目に全例死亡したのに対し、ポリペプチドVI
投与群では、その投与量に依存して、放射線障害の防止
作用が認められ、１μｇ投与群では、約８割が放射線障
害による死亡から回避され、生存することが確認され
た。 【０３２７】薬理試験例６：本発明誘導体の日和見感染
防御効果試験 易感染モデルマウスを用いて、以下の試験を実施した。 【０３２８】ＩＣＲ系雄性マウス（６週齢）を供試動物
（１群７匹）とし、第１日目に、５−フルオロウラシル
（５−Ｆu 、協和醗酵社製）１００ｍｇ／ｋｇを静脈内
投与した。第２日目、第４日目及び第６日目に、ポリペ
プチドVIの１μｇ／マウスを皮下投与し、第７日目に、
緑膿菌（Ｐseudomonas aeruginosa Ｅ−２）の所定量を
腹腔内投与して感染させた。第１０日目に供試動物の生
存数を計数して、生存率（％）を求めた。 【０３２９】結果を図１２（１）〜（３）に示す。 【０３３０】図１２（１）は上記実験群の結果を、同
（２）はポリペプチドVIを投与しなかった（５−Ｆu の
みを投与した）対照群の結果を、また同（３）は５−Ｆ
u 及びポリペプチドVIのいずれも投与しなかった対照群
の結果をそれぞれ示す。 【０３３１】第１２図中、縦軸は生存率（％）を、横軸
は下記各緑膿菌投与量を採用した群Ａ〜Ｅをそれぞれ示
す。 【０３３２】Ａ群…１９０００菌数／マウス投与群 Ｂ群… ３８００菌数／マウス投与群 Ｃ群… ７５０菌数／マウス投与群 Ｄ群… １５０菌数／マウス投与群 Ｅ群… ３０菌数／マウス投与群 Ｆ群… ６菌数／マウス投与群 製剤例１ ＧＩＦ活性として１×１０7単位／ｍｌのポリペプチドV
Iの生理食塩水溶液に、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）
を０．５％となるように添加して、濾過（０．２２μm
メンブランフイルター）後、これを無菌的に１ｍｌずつ
バイアル瓶に分注して凍結乾燥し、注射用製剤を調製し
た。 【０３３３】かくして得られた製剤は、これを用時注射
用蒸留水１ｍｌに溶解して利用される。 【０３３４】〈動物細胞からのサイトカインの製造方
法〉 (1) 種々の濃度のポリペプチドＸＸＸVII 及び０．０
１％ＰＨＡ−Ｐ存在下に、ＨＢＳ−２Ｃ５Ｂ２細胞
〔Ｊ．Ｉmmunol.,１３１，１６８２−１６８９（１９８
５）〕を、２×１０5cells／wellにて培養した。培養２
４時間後の上清を採取し、そのＩＬ−２活性を、スミス
（Ｋ．Ａ．Ｓmith）らの方法に従い、ＩＬ−２依存性マ
ウスＴ細胞（ＣＴＬＬ２）を用いて測定した〔Ｊ．Ｉmm
unol.,１２０，２０２７（１９７８））〕。 【０３３５】結果を下記第６表に示す。 【０３３６】(2) Ｕ−３７３ＭＧ細胞を、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ
−１６４０培地で集密的まで培養し、更に２０ｎｇ／ｍ
ｌのポリペプチドＸＸＸVII を含む又は含まない（コン
トロール）上記培地中で１８時間インキュベートした。 【０３３７】培地を除去した後、前記実施例３−(2)に
準じて、グアニジニウム／セシウムクロライド法により
ＲＮＡを抽出し、オリゴ(ｄＴ）−セルロースクロマ
トグラフィーにより、ポリ（Ａ）+ ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
を収得した。ノザン・ブロッティング法（Ｎorthern bl
otting）に従い、上記ポリ（Ａ）+ ＲＮＡの１０μｇを
アガロースゲル（１．２％）電気泳動に付し分画後、ニ
トロセルロース・フィルターに転写した。減圧下に８０
℃でベーキングし、２０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．
０）中で１００℃５分間の処理後、５０％フォルムアミ
ド、５×ｓｓｃ、５０ｍＭソジウムフォスフェート（ｐ
Ｈ６．５）、４×デンハード液（Ｄenhardt's solutio
n）及び２００μｇ／ｍｌの変性サルモン スペラムＤ
ＮＡ中で４２℃下にプリハイブリダイゼーションを行っ
た。 【０３３８】５時間後、ニックトランスレーションで放
射能標識したＧＭ−ＣＳＦ ｃＤＮＡ〔Ｓcience, ２２
８，８１０（１９８５）〕のＰstＩ−ＮcoＩＤＮＡ断片
又はＢＳＦ−２ｃＤＮＡ〔Ｎature, ３２４，７３（１
９８６）〕のＫpnＩ−ＢamHＩＤＮＡ断片と、４２℃下
に２０時間ハイブリダイゼーションを行った。フィルタ
ーを、０．１％ＳＤＳ加２×ｓｓｃで室温下に１５分
間、更に０．１％ＳＤＳ加０．１×ｓｓｃで５０℃下に
１時間洗浄した。オートラジオグラムは、増感紙を用い
て、−７０℃下に一夜行った。 【０３３９】ＧＭ−ＣＳＦのＤＮＡ断片を用いた時の結
果を図１３に示す。レーンＡは本発明ポリペプチドを用
いた結果を、レーンＢは本発明ポリペプチドを用いない
コントロールの結果を示す。 【０３４０】また、ＢＳＦ−２のＤＮＡ断片を用いた時
の結果を図１３に準じて図１４に示す。 【０３４１】以上に示す結果より、本発明ポリペプチド
を用いることにより、動物細胞からの天然サイトカイン
類の生産が効率よく行い得ることが判る。 【０３４２】また、本発明ポリペプチドの、かかる方法
への適用に際しては、極めて微量、通常１０ｎｇ／ｍｌ
程度の使用で十分であり、誘導されたサイトカイン類の
精製過程をも容易にする。 【０３４３】(3) 動物細胞よりサイトカインを生産す
る場合、産生誘引に使用する本発明ポリペプチドがその
条件下において構造的に安定であり、細胞表面上のＩＬ
−１受容体に結合することが必須である。すなわち、本
発明ポリペプチドがＩＬ−１受容体に結合し、サイトカ
イン産生に必要なシグナルを細胞内に伝えることが重要
である。 【０３４４】そこで、線維芽細胞上のＩＬ−１受容体へ
の結合に関して、以下の試験を行った。 【０３４５】６−wellプレート上で、一面にほぼ均一に
まで増殖したＢalb ／３Ｔ３細胞（クローンＡ３１：Ａ
ＴＣＣ，ＣＣＬ−１６３、１×１０6cells／well）に、
125Ｉで標識したポリペプチドＩ（ＩＬ−１β）の５０
０００cpm／well及び事前に１０％ＦＣＳ加Ｄ−ＭＥＭ
中で３７℃下にインキユベートした２０ｎｇ／ｍｌのポ
リペプチドＩを加え、４℃で反応させた。反応液をパス
ツールピペットで除き、１０％ＦＣＳ加Ｄ−ＭＥＭの
１ｍｌを加えて静かに洗い上清をすてた。この洗浄操作
を２回繰返した後、１ｍｌの１％ＳＤＳ、０．２Ｎ Ｎ
ａＯＨで細胞を可溶化し、可溶化液及びさらにウエルを
洗浄した可溶化液中の放射能（結合放射能）をγ−カウ
ンターにて測定した。 【０３４６】尚、上記 125Ｉ標識ポリペプチドＩは、ボ
ルトンとハンター（Ｂolton and Ｈunter）の方法〔Ｂi
ochem. Ｊ.,１３３，５２９（１９７３）〕に従い製
造、精製した（比活性；２５０μＣｉ／μｇprotein 以
上）。 【０３４７】得られた結果を下記第７表に示す。 【０３４８】 阻止能（％）＝（Ａ−Ｃ）／（Ａ−Ｂ）×１００ Ａ：未標識ポリペプチドＩが存在しない時の結合した放
射能 Ｂ：プレートに非特異的に吸着した放射能 Ｃ：結合した放射能の実測値 かかる指標は、共存させたポリペプチドＩのＩＬ−１受
容体への結合力を表わす。 【０３４９】上記第７表より、ポリペプチドＩ、即ちＩ
Ｌ−１β自体は、サイトカイン誘導条件下において、時
間の経過と共に、ＩＬ−１受容体への結合力が低下して
しまうことが明らかとなった。 【０３５０】そこで、上記において、２４時間の事前の
インキュベーションを行ったポリペプチドＩ、ポリペプ
チドVI又はポリペプチドＸＸＸVII を用いた同試験を行
った。 【０３５１】結果を下記第８表に示す。 【０３５２】 上記結果より、動物細胞からのサイトカイン類製造に際
しては、ＩＬ−１β自体よりも、本発明ポリペプチドを
採用するのがより好ましいことが判る。 【０３５３】 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１５３ 配列の型： アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys 5 10 15 Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln 20 25 30 Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln 35 40 45 Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu 50 55 60 Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu 85 90 95 Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe 100 105 110 Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu 115 120 125 Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr 130 135 140 Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 145 150 153 配列番号：２ 配列の長さ：１１６ 配列の型： アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Met Ala Glu Val Pro Glu Leu Ala Ser Glu Met Met Ala Tyr Tyr Ser 5 10 15 Gly Asn Glu Asp Asp Leu Phe Phe Glu Ala Asp Gly Pro Lys Gln Met 20 25 30 Lys Cys Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly Ile 35 40 45 Gln Leu Arg Ile Ser Asp His His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gln Ala 50 55 60 Ala Ser Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro 65 70 75 80 Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe 85 90 95 Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn Glu Ala 100 105 110 Tyr Val His Asp 115 116 配列番号：３ 配列の長さ：１５３ 配列の型： アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys 5 10 15 Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln 20 25 30 Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln 35 40 45 Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu 50 55 60 Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Ser Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu 65 70 75 80 Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu 85 90 95 Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe 100 105 110 Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu 115 120 125 Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr 130 135 140 Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 145 150 153
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、プラスミド pＧＩＦ−αの cＤＮＡの
制限酵素地図を示す。 【図２】図２はプラスミド pＧＩＦ−αとプラスミド p
ＴＭＩとからプラスミドptrpＧＩＦ−αを構築する概略
図を示す。 【図３】図３−a 乃至図３−d はプラスミドpcＤ−ＧＩ
Ｆ−１６由来のＧＩＦ活性物及びプラスミドpcＤ−ＧＩ
Ｆ−２０７由来のＧＩＦ活性物の各々に対する抗ポリペ
プチドＩ血清（中和抗体）の影響を示すグラフである。 【図４】図４はプラスミドpcＤ−ＧＩＦ−１６及びプラ
スミドpcＤ−ＧＩＦ−２０７のcＤＮＡの制限酵素地図
を示す。 【図５】図５はポリペプチドＩのＣＳＦ産生に対する促
進効果試験結果を示すグラフである。 【図６】図６はポリペプチドＩのＣＳＦ産生に対する促
進効果試験結果を示すグラフである。 【図７】図７はポリペプチドＩのＣＳＦ産生に対する促
進効果試験結果を示すグラフである。 【図８】図８はポリペプチドＩの抗関節炎試験結果を示
すグラフである。 【図９】図９は本発明ＩＬ−１β誘導体のＣＳＦ産生促
進試験の結果を示すグラフである。 【図１０】図１０は本発明ＩＬ−１β誘導体の抗炎症試
験の結果を示すグラフである。 【図１１】図１１は本発明ＩＬ−１β誘導体の放射線障
害防止作用試験の結果を示すグラフである。 【図１２】図１２は本発明ＩＬ−１β誘導体の日和見感
染症防御効果試験の結果を示すグラフである。 【図１３】図１３は本発明ＩＬ−１の誘導体のＧＭ−Ｃ
ＳＦ誘導産生効果試験の結果を示す図面である。 【図１４】図１４は本発明ＩＬ−１β誘導体のＢＳＦ−
２誘導産生効果試験の結果を示す図面である。
制限酵素地図を示す。 【図２】図２はプラスミド pＧＩＦ−αとプラスミド p
ＴＭＩとからプラスミドptrpＧＩＦ−αを構築する概略
図を示す。 【図３】図３−a 乃至図３−d はプラスミドpcＤ−ＧＩ
Ｆ−１６由来のＧＩＦ活性物及びプラスミドpcＤ−ＧＩ
Ｆ−２０７由来のＧＩＦ活性物の各々に対する抗ポリペ
プチドＩ血清（中和抗体）の影響を示すグラフである。 【図４】図４はプラスミドpcＤ−ＧＩＦ−１６及びプラ
スミドpcＤ−ＧＩＦ−２０７のcＤＮＡの制限酵素地図
を示す。 【図５】図５はポリペプチドＩのＣＳＦ産生に対する促
進効果試験結果を示すグラフである。 【図６】図６はポリペプチドＩのＣＳＦ産生に対する促
進効果試験結果を示すグラフである。 【図７】図７はポリペプチドＩのＣＳＦ産生に対する促
進効果試験結果を示すグラフである。 【図８】図８はポリペプチドＩの抗関節炎試験結果を示
すグラフである。 【図９】図９は本発明ＩＬ−１β誘導体のＣＳＦ産生促
進試験の結果を示すグラフである。 【図１０】図１０は本発明ＩＬ−１β誘導体の抗炎症試
験の結果を示すグラフである。 【図１１】図１１は本発明ＩＬ−１β誘導体の放射線障
害防止作用試験の結果を示すグラフである。 【図１２】図１２は本発明ＩＬ−１β誘導体の日和見感
染症防御効果試験の結果を示すグラフである。 【図１３】図１３は本発明ＩＬ−１の誘導体のＧＭ−Ｃ
ＳＦ誘導産生効果試験の結果を示す図面である。 【図１４】図１４は本発明ＩＬ−１β誘導体のＢＳＦ−
２誘導産生効果試験の結果を示す図面である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＥ
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(31)優先権主張番号 特願昭61−200324
(32)優先日 昭61(1986)８月27日
(33)優先権主張国 日本（ＪＰ）
(72)発明者 河合 一吉
徳島県板野郡松茂町満穂字満穂開拓130
−２ ソレイユ503号
(72)発明者 嶽肩 世津子
徳島市川内町加賀須野1090−18
(72)発明者 石井 清士
徳島県板野郡藍住町住吉字逆藤39−46
(72)発明者 柳原 康夫
徳島市川内町大松891−６
(72)発明者 平井 嘉勝
徳島県板野郡北島町新喜来字江古川５−
49
(56)参考文献 ＮＡＴＵＲＥ ＶＯＬ．315，（20
ＪＵＮＥ 1985） ＰＰ．641−647
ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣ
Ｉ．ＵＳＡ，ＶＯＬ．81 （1984） Ｐ
Ｐ．7907−7911
Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，ＶＯＬ．135,
ＮＯ．４ （1985） ＰＰ．314−320
Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，ＶＯＬ．135,
ＮＯ．６ （1985） ＰＰ．3962−3968
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．インターロイキン−１βの下記式（Ａ）で表される
アミノ酸配列において、 【化１】４位ArgがGlyに置換されたアミノ酸配列； 11位ArgがGlnに置換されたアミノ酸配列； 103位アミノ酸から141位アミノ酸のいずれかからＣ末端
までのアミノ酸配列が欠失されているアミノ酸配列；ま
たは それらアミノ酸配列のＮ末端にMetを有するアミノ酸配
列； を有することを特徴とするポリペプチド。 ２．以下の配列を有する請求項１記載のポリペプチド。 【化２】 ３．インターロイキン−１βの下記式（Ａ）で表される
アミノ酸配列に於いて、 【化３】 ４位ArgがGlyに置換されたアミノ酸配列； 11位ArgがGlnに置換されたアミノ酸配列； 103位アミノ酸から141位アミノ酸のいずれかからＣ末端
までのアミノ酸配列が欠失されているアミノ酸配列；ま
たは それらアミノ酸配列のＮ末端にMetを有するアミノ酸配
列を有することにより特徴付けられるポリペプチドをコ
ードする遺伝子。
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|---|---|---|---|
| JP7343919A JP2753694B2 (ja) | 1986-03-14 | 1995-12-28 | インターロイキン−１β誘導体及び医薬 |
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|---|---|---|---|
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| JP5788586 | 1986-03-14 | ||
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| JP20032486 | 1986-08-27 | ||
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|---|---|---|---|
| JP5212076A Division JP2608023B2 (ja) | 1986-03-14 | 1993-06-28 | インターロイキン−１β誘導体及び医薬 |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
| JP (1) | JP2753694B2 (ja) |
-
1995
- 1995-12-28 JP JP7343919A patent/JP2753694B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，ＶＯＬ．１３５，ＮＯ．４ （１９８５） ＰＰ．３１４−３２０ |
| Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，ＶＯＬ．１３５，ＮＯ．６ （１９８５） ＰＰ．３９６２−３９６８ |
| ＮＡＴＵＲＥ ＶＯＬ．３１５，（２０ ＪＵＮＥ １９８５） ＰＰ．６４１−６４７ |
| ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．ＵＳＡ，ＶＯＬ．８１ （１９８４） ＰＰ．７９０７−７９１１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08225596A (ja) | 1996-09-03 |
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