JPH08245695A - 抗腫瘍活性物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】抗腫瘍活性物質を提供する。 【解決手段】腫瘍細胞増殖抑制活性を有することを特徴
とする均質な物質として単離された抗腫瘍活性物質ＧＩ
Ｆ。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗腫瘍活性物質、
詳しくは腫瘍細胞に対して特異的にその増殖を抑制する
作用を有する物質、その製造法および該物質をコードす
る遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より、生体内には腫瘍細胞に直接働
いて、その増殖を選択的に抑制し、該腫瘍細胞を生体系
より消去する作用を有する物質の存在することが知られ
ている。之等の抗腫瘍活性物質としては、例えばインタ
ーフェロン（ＩＦＮ）、リンフォトキシン（ＬＴ）、ガ
ン壊死因子（ＴＮＦ、Ｔumor Ｎecrotizing Ｆactor）
等が報告されている（Evans C.H., Cancer Immunol.Imm
unother, 12, 181(1982))。之等の抗腫瘍活性物質は、
腫瘍細胞の増殖を抑制する作用を有するところから、抗
腫瘍剤として利用できると考えられ、またそれらに対応
するとされる遺伝子構造が明らかにされつつあり、遺伝
子工学的手法によるそれらの生産も種々研究されつつあ
る（Nature, Vol.312, 20/27, p721 (1984); 同Vol.31
2, 20/27, p724 (1984)等）。

【０００３】

【発明が解決しようとする問題点】本発明の目的は、上
記報告された各種の抗腫瘍活性物質とは、その性状、特
性等を異にする新しい抗腫瘍活性物質を提供することに
ある。

【０００４】本発明の他の目的は、上記新規な抗腫瘍活
性物質を、哺乳動物由来の免疫担当細胞から製造する技
術を提供することにある。

【０００５】本発明の他の目的は、上記抗腫瘍活性物質
を、遺伝子工学的手法により製造する技術を提供するこ
とにある。

【０００６】更に本発明の他の目的は、上記抗腫瘍活性
物質を、遺伝子工学的手法により製造するための遺伝
子、これを挿入した発現ベクター及び該ベクターを組み
込んだ組換え微生物を提供することにある。

【０００７】上記の目的及びその他の本発明の特徴を、
以下に詳述する。

【０００８】

【問題点を解決するための手段】本発明は、下記の項１
〜４の発明に係る。

【０００９】項１． 下記アミノ酸配列（以下、ポリペ
プチドＩという）をその構成蛋白質として含み、腫瘍細
胞増殖抑制活性を有することを特徴とする均質な物質と
して単離された抗腫瘍活性物質ＧＩＦ。

【００１０】 Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 項２． 逆相高速液体クロマトグラフィーにおいて、Ｇ
ＩＦ活性に一致する単一のタンパクの吸光度ピークを示
し、２−メルカプトエタノール存在下のＳＤＳ−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）におい
て、分子量１７Ｋ乃至１８Ｋの位置に単一バンドとして
泳動され、等電点電気泳動（ＩＥＦ）における等電点
（ｐＩ）が約６．５乃至７．０２を示す項１記載のＧＩ
Ｆ。

【００１１】項３． 下記アミノ酸配列をその構成蛋白
質として含み、腫瘍細胞増殖抑制活性を有することを特
徴とする抗腫瘍活性物質ＧＩＦをコードする遺伝子。

【００１２】 Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Ser Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 項４． 下記アミノ酸配列をその構成蛋白質として含
み、腫瘍細胞増殖抑制活性を有することを特徴とする抗
腫瘍活性物質ＧＩＦをコードする遺伝子 Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Ser Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser で形質転換された宿主細胞を、該遺伝子の発現可能な条
件下で培養し、産生するＧＩＦを回収することを特徴と
するＧＩＦの製造方法。

【００１３】本明細書においてペプチドにおけるアミノ
酸の表示は、ＩＵＰＡＣにより採択されているアミノ酸
命名法における略号乃至当該分野で慣用されている略号
によるアミノ酸残基の表示法に従うものとし、塩基配列
における核酸の表示も同様とする。

【００１４】本発明ＧＩＦは、その蛋白の一次構造が１
５３個のアミノ酸配列からなる上記ポリペプチドＩをそ
の基本とするものであるが、該蛋白の一次構造は、上記
ポリペプチドＩのＮ末端に下記配列表の配列番号１の−
８５〜−１の８５個のアミノ酸配列から選択される任意
のペプチド鎖又はアミノ酸（Ａｓｐ−）を有するもので
あってもよい。上記蛋白の代表的具体例としては、下記
ポリペプチドＩ、II、III及びIVを例示できる。

【００１５】〔ポリペプチドＩ〕 Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 〔ポリペプチドII〕 Met Leu Val Pro Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn Glu Ala Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 〔ポリペプチドIII〕 Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn Glu Ala Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Cys Ser Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 〔ポリペプチドIV〕 Met Lys Cys Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly Ile Gln Leu Arg Ile Ser Asp His His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gln Ala Ala Ser Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn Glu Ala Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 本発明ＧＩＦは、後記するように哺乳動物の免疫担当細
胞から単離することができ、この天然型ＧＩＦの遺伝子
解析により、その前駆体の存在が明らかにされており、
上記ポリペプチドＩ〜IVのアミノ酸配列は、この解析結
果から誘導されたものである。

【００１６】更に、本発明ＧＩＦには、ＧＩＦ活性を有
するかぎりにおいて、上記式のポリペプチドで表される
アミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に１個若しくはそれ以
上のアミノ酸を付加したもの又は上記アミノ酸配列から
１個若しくはそれ以上のアミノ酸を欠失乃至置換した蛋
白の一次構造を有するものも包含される。

【００１７】以下、本発明ＧＩＦを、その製造法により
詳述する。

【００１８】本発明のＧＩＦは、例えば哺乳動物由来の
免疫担当細胞の培養により誘導産生される。ここで起源
細胞として用いられる免疫担当細胞としては、哺乳動物
に由来する限り特に制限はなく、哺乳動物種としても限
定されず、例えばヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウ
サギ、マウス等のいずれでもよい。代表的な免疫担当細
胞としては、例えばＴ−細胞、Ｂ−細胞、ヌル細胞、ナ
チュラル キラー細胞等のリンパ球細胞、単核細胞、マ
クロファージ等の単核球細胞等及びそれらの細胞系統(c
ell line)を例示できる。上記リンパ球細胞の例として
は、例えば上記各哺乳動物の脾臓、扁桃腺、肺、血液、
リンパ節等の組織より分離されるリンパ球細胞を例示す
ることができる。之等免疫担当細胞の分離は、常法に従
い例えば目的とする細胞を含む組織を粉砕し、粗雑物を
濾別し、遠心分離する方法等によることができる。

【００１９】本発明者らの研究によれば、上記起源細胞
とする免疫担当細胞の種類やこれを提供する哺乳動物の
種類にかかわらず、得られるＧＩＦの有するＧＩＦ活性
は種特異性を有しないことが確認されている。従って本
発明ＧＩＦはその製造に際して起源細胞に制約を受け
ず、この点からも医療分野での利用に好適である。

【００２０】上記免疫担当細胞の培養は、この種細胞培
養に通常使用されている培地を用いて、好ましくは抗腫
瘍物質誘導剤の存在下に実施され、これにより本発明物
質がその培養上清中に産生される。上記培地としては、
例えばＣＥＭ培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、ＤＭ−１
６０培地、イーグルの最小必須培地(Eagle s MEM)、オ
ートクレーブ可能ＭＥＭ、フィッシャーの培地(Fisher
s Medium)、Ｆ−１０、Ｆ−１２培地、Ｌ−１５培地、
ＮＣＴＣ−１０９培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等を単
独で用いるか又は必要に応じて之等培地に牛胎児血清
（ＦＣＳ）等の血清やアルブミン等の血清成分を添加し
た培地等を例示できる。免疫担当細胞の上記培地に対す
る使用量は、通常１×１０⁴〜１×１０⁷個／ml程度とす
るのが好ましい。

【００２１】この細胞浮遊液に添加存在させることがで
きる抗腫瘍物質誘導剤としては、通常のもの、例えば１
２−Ｏ−テトラデカノイルフォルボール−１３−アセテ
ート（ＴＰＡ）、フィトヘモアグルチニン（ＰＨＡ）、
コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、細菌リポポリサッカラ
イド（ＬＰＳ）、ポツクウイードマイトージェン（ＰＷ
Ｍ）、プロテインＡ（ＰｒｏＡ）等を例示できる。その
使用量は、通常０．０００１〜０．１％（Ｗ／Ｖ％、以
下同じ）、好ましくは０．００１％前後の濃度とするの
がよい。培養は、通常の方法、例えば炭酸ガス培養法に
より実施でき、３０〜４０℃程度、好ましくは３７℃程
度で、１〜５日間を要して行われる。培養終了後、培養
上清は常法に従い遠心分離等の分離手段により分離され
る。

【００２２】上記方法により得られる培養上清からの本
発明ＧＩＦに分離は、基本的には、この種のバイオロジ
カル物質からの蛋白様物質の分離に利用される通常の方
法と同様にして、例えば目的とするＧＩＦの物理的、化
学的性質等を利用した各種の処理操作に従い実施でき
る。（例えば「生化学データーブックII」pp１１７５〜
１２５９、第１版第１刷、１９８０年６月２３日、株式
会社東京化学同人発行参照）。該方法としては、具体的
には例えば通常の蛋白沈殿剤による処理、限外濾過、分
子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、液体クロマ
トグラフィー、遠心分離、電気泳動、アフィニティーク
ロマトグラフィー、透析法、之等の組合せ等を採用でき
る。

【００２３】特に好ましい分離方法においては、まず培
養上清より予め目的とするＧＩＦを部分精製する。この
部分精製は、例えば、アセトン、メタノール、エタノー
ル、プロパノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等
の有機溶媒や酢酸、過塩素酸（ＰＣＡ）、トリクロロ酢
酸（ＴＣＡ）等の酸を蛋白沈殿剤として用いる処理、硫
酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等
の塩析剤を用いる処理及び／又は透析膜、平板膜、中空
繊維膜等を用いる限外濾過処理等により行われる。之等
の各処理の操作及び条件は、通常のこの種の方法のそれ
らと同様のものとすればよい。

【００２４】次いで上記で得られた粗精製物を、ゲル濾
過に付すことにより目的物質の活性が認められる画分を
収得する。ここで用いられるゲル濾過剤としては、特に
限定はなく、例えばデキストランゲル、ポリアクリルア
ミドゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガ
ロースゲル、セルロース等を素材とするものをいずれも
利用できる。之等の具体例としては、セフアデツクスＧ
タイプ、同ＬＨタイプ、セフアロースタイプ、セフアク
リルタイプ（以上、フアルマシア社）、セルロフアイン
（チツソ株式会社）、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ
（ＬＫＢ社）、ＴＳＫ−Ｇタイプ（東洋曹達株式会社）
等の市販品を例示できる。

【００２５】上記ゲル濾過によれば、分子量１万〜２万
５千の画分に本発明物質の活性が認められる。

【００２６】本発明物質は、上記ゲル濾過により得られ
る画分を、例えばハイドロキシアパタイトカラムを用い
たアフイニテイークロマトグラフイー、ＤＥＡＥ法等の
イオン交換カラムクロマトグラフイー、クロマトフオー
カシング法、逆相高速液体クロマトグラフイー等に付す
ことにより、又は之等各操作の組合せにより更に精製す
ることができ、均質な物質として単離することができ
る。

【００２７】上記クロマトフオーカシング法は、公知の
各種方法により実施できる。カラムとしては、例えばＰ
ＢＥ９４（フアルマシア社製）等を、開始緩衝液として
は、例えばイミダゾール−塩酸等を、また溶出液として
は、例えばポリバツフアー７４（フアルマシア社製）−
塩酸（ｐＨ４．０）等を使用できる。

【００２８】また、上記逆相高速液体クロマトグラフイ
ーは、例えばＣ₄ハイポアー逆相ＨＰＬＣカラム（バイ
オ−ラド社（Ｂio−Ｒad Ｌaboratories ））等を用い
て、移動剤としてアセトニトリル、トリフルオロ酢酸
（ＴＦＡ）、水等及び之等の混合溶媒を用いて実施でき
る。

【００２９】かくして得られるＧＩＦは、前記ポリペプ
チドＩをその構成蛋白とする天然型ＧＩＦ（即ち成熟Ｇ
ＩＦ）である。

【００３０】また、本発明ＧＩＦは遺伝子工学的手法に
よって、即ちＧＩＦをコードする遺伝子を利用し、これ
を微生物のベクターに組み込んで該微生物細胞内で複
製、転写、翻訳させることによって、製造することがで
きる。この方法は、特に大量生産が可能である点で有利
である。

【００３１】上記遺伝子工学的手法によるＧＩＦの製造
において、用いられる遺伝子は、ＧＩＦをコードするこ
とにより特徴付けられる。本発明は、かかる新規な遺伝
子も提供するものである。

【００３２】上記遺伝子の代表例は、前記ポリペプチ
ド、殊にポリペプチドＩをコードするものであるが、特
にこれに限定されず、本発明のＧＩＦをコードしており
且つその利用によりＧＩＦが発現、製造される限りいか
なるものでもよく、また各種公知の遺伝暗号(genetic c
ode)が採用されていてもよい。

【００３３】上記遺伝子には、例えばそのＤＮＡ鎖中に
制限酵素ＭpsＩ、ＨindIII及びＰvuIIで切断される箇所
をこの順序で配置された部分を含むことで特徴付けられ
るヒトリンパ球由来細胞より分離されるメッセンジャー
ＲＮＡ（以下「ｍＲＮＡ」という）より調製されたもの
が含まれる。これはより具体的には、前記ポリペプチド
Ｉ〜IVに対応する以下の塩基配列Ｉ、II、III及びIVと
して特定される塩基配列を有する遺伝子である。

【００３４】 〔塩基配列Ｉ〕 ＧＣＡ ＣＣＴ ＧＴＡ ＣＧＡ ＴＣＡ ＣＴＧ ＡＡＣ ＴＧＣ ＡＣＧ ＣＴＣ ＣＧＧ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＡＧ ＣＡＡ ＡＡＡ ＡＧＣ ＴＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＧＴ ＣＣＡ ＴＡＴ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＣＴ ＣＴＣ ＣＡＣ ＣＴＣ ＣＡＧ ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＡＴ ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＡＡ ＣＡＡ ＧＴＧ ＧＴＧ ＴＴＣ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＣＣ ＴＴＴ ＧＴＡ ＣＡＡ ＧＧＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＡＧＴ ＡＡＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＴＡ ＣＣＴ ＧＴＧ ＧＣＣ ＴＴＧ ＧＧＣ ＣＴＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＡＡＴ ＣＴＧ ＴＡＣ ＣＴＧ ＴＣＣ ＴＧＣ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＡＡ ＧＡＴ ＧＡＴ ＡＡＧ ＣＣＣ ＡＣＴ ＣＴＡ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＴＡ ＧＡＴ ＣＣＣ ＡＡＡ ＡＡＴ ＴＡＣ ＣＣＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＣＧＡ ＴＴＴ ＧＴＣ ＴＴＣ ＡＡＣ ＡＡＧ ＡＴＡ ＧＡＡ ＡＴＣ ＡＡＴ ＡＡＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＴＴ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＣＣ ＣＡＧ ＴＴＣ ＣＣＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＴＡＣ ＡＴＣ ＡＧＣ ＡＣＣ ＴＣＴ ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＡＡＣ ＡＴＧ ＣＣＣ ＧＴＣ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＡＣＣ ＡＡＡ ＧＧＣ ＧＧＣ ＣＡＧ ＧＡＴ ＡＴＡ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＣＡＡ ＴＴＴ ＧＴＧ ＴＣＴ ＴＣＣ 〔塩基配列II〕 ＡＴＧ ＣＴＧ ＧＴＴ ＣＣＣ ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＡＧ ＡＣＣ ＴＴＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＡＡＴ ＧＡＣ ＣＴＧ ＡＧＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＴＴＴ ＣＣＣ ＴＴＣ ＡＴＣ ＴＴＴ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＣＴ ＡＴＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＧＡＣ ＡＣＡ ＴＧＧ ＧＡＴ ＡＡＣ ＧＡＧ ＧＣＴ ＴＡＴ ＧＴＧ ＣＡＣ ＧＡＴ ＧＣＡ ＣＣＴ ＧＴＡ ＣＧＡ ＴＣＡ ＣＴＧ ＡＡＣ ＴＧＣ ＡＣＧ ＣＴＣ ＣＧＧ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＡＧ ＣＡＡ ＡＡＡ ＡＧＣ ＴＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＧＴ ＣＣＡ ＴＡＴ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＣＴ ＣＴＣ ＣＡＣ ＣＴＣ ＣＡＧ ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＡＴ ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＡＡ ＣＡＡ ＧＴＧ ＧＴＧ ＴＴＣ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＣＣ ＴＴＴ ＧＴＡ ＣＡＡ ＧＧＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＡＧＴ ＡＡＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＴＡ ＣＣＴ ＧＴＧ ＧＣＣ ＴＴＧ ＧＧＣ ＣＴＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＡＡＴ ＣＴＧ ＴＡＣ ＣＴＧ ＴＣＣ ＴＧＣ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＡＡ ＧＡＴ ＧＡＴ ＡＡＧ ＣＣＣ ＡＣＴ ＣＴＡ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＴＡ ＧＡＴ ＣＣＣ ＡＡＡ ＡＡＴ ＴＡＣ ＣＣＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＣＧＡ ＴＴＴ ＧＴＣ ＴＴＣ ＡＡＣ ＡＡＧ ＡＴＡ ＧＡＡ ＡＴＣ ＡＡＴ ＡＡＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＴＴ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＣＣ ＣＡＧ ＴＴＣ ＣＣＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＴＡＣ ＡＴＣ ＡＧＣ ＡＣＣ ＴＣＴ ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＡＡＣ ＡＴＧ ＣＣＣ ＧＴＣ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＡＣＣ ＡＡＡ ＧＧＣ ＧＧＣ ＣＡＧ ＧＡＴ ＡＴＡ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＣＡＡ ＴＴＴ ＧＴＧ ＴＣＴ ＴＣＣ 〔塩基配列III〕 ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＧＴＴ ＣＣＣ ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＡＧ ＡＣＣ ＴＴＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＡＡＴ ＧＡＣ ＣＴＧ ＡＧＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＴＴＴ ＣＣＣ ＴＴＣ ＡＴＣ ＴＴＴ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＣＴ ＡＴＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＧＡＣ ＡＣＡ ＴＧＧ ＧＡＴ ＡＡＣ ＧＡＧ ＧＣＴ ＴＡＴ ＧＴＧ ＣＡＣ ＧＡＴ ＧＣＡ ＣＣＴ ＧＴＡ ＣＧＡ ＴＣＡ ＣＴＧ ＡＡＣ ＴＧＣ ＡＣＧ ＣＴＣ ＣＧＧ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＡＧ ＣＡＡ ＡＡＡ ＡＧＣ ＴＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＧＴ ＣＣＡ ＴＡＴ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＣＴ ＣＴＣ ＣＡＣ ＣＴＣ ＣＡＧ ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＡＴ ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＡＡ ＣＡＡ ＧＴＧ ＧＴＧ ＴＴＣ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＣＣ ＴＴＴ ＧＴＡ ＣＡＡ ＧＧＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＡＧＴ ＡＡＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＴＡ ＣＣＴ ＧＴＧ ＧＣＣ ＴＴＧ ＧＧＣ ＣＴＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＡＡＴ ＣＴＧ ＴＡＣ ＣＴＧ ＴＣＣ ＴＧＣ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＡＡ ＧＡＴ ＧＡＴ ＡＡＧ ＣＣＣ ＡＣＴ ＣＴＡ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＴＡ ＧＡＴ ＣＣＣ ＡＡＡ ＡＡＴ ＴＡＣ ＣＣＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＣＧＡ ＴＴＴ ＧＴＣ ＴＴＣ ＡＡＣ ＡＡＧ ＡＴＡ ＧＡＡ ＡＴＣ ＡＡＴ ＡＡＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＴＴ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＣＣ ＣＡＧ ＴＴＣ ＣＣＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＴＡＣ ＡＴＣ ＡＧＣ ＡＣＣ ＴＣＴ ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＡＡＣ ＡＴＧ ＣＣＣ ＧＴＣ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＡＣＣ ＡＡＡ ＧＧＣ ＧＧＣ ＣＡＧ ＧＡＴ ＡＴＡ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＣＡＡ ＴＴＴ ＧＴＧ ＴＣＴ ＴＣＣ 〔塩基配列IV〕 ＡＴＧ ＡＡＧ ＴＧＣ ＴＣＣ ＴＴＣ ＣＡＧ ＧＡＣ ＣＴＧ ＧＡＣ ＣＴＣ ＴＧＣ ＣＣＴ ＣＴＧ ＧＡＴ ＧＧＣ ＧＧＣ ＡＴＣ ＣＡＧ ＣＴＡ ＣＧＡ ＡＴＣ ＴＣＣ ＧＡＣ ＣＡＣ ＣＡＣ ＴＡＣ ＡＧＣ ＡＡＧ ＧＧＣ ＴＴＣ ＡＧＧ ＣＡＧ ＧＣＣ ＧＣＧ ＴＣＡ ＧＴＴ ＧＴＴ ＧＴＧ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＡＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＣＴＧ ＧＴＴ ＣＣＣ ＴＧＣ ＣＣＡ ＣＡＧ ＡＣＣ ＴＴＣ ＣＡＧ ＧＡＧ ＡＡＴ ＧＡＣ ＣＴＧ ＡＧＣ ＡＣＣ ＴＴＣ ＴＴＴ ＣＣＣ ＴＴＣ ＡＴＣ ＴＴＴ ＧＡＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＣＴ ＡＴＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＧＡＣ ＡＣＡ ＴＧＧ ＧＡＴ ＡＡＣ ＧＡＧ ＧＣＴ ＴＡＴ ＧＴＧ ＣＡＣ ＧＡＴ ＧＣＡ ＣＣＴ ＧＴＡ ＣＧＡ ＴＣＡ ＣＴＧ ＡＡＣ ＴＧＣ ＡＣＧ ＣＴＣ ＣＧＧ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＡＧ ＣＡＡ ＡＡＡ ＡＧＣ ＴＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ ＴＣＴ ＧＧＴ ＣＣＡ ＴＡＴ ＧＡＡ ＣＴＧ ＡＡＡ ＧＣＴ ＣＴＣ ＣＡＣ ＣＴＣ ＣＡＧ ＧＧＡ ＣＡＧ ＧＡＴ ＡＴＧ ＧＡＧ ＣＡＡ ＣＡＡ ＧＴＧ ＧＴＧ ＴＴＣ ＴＣＣ ＡＴＧ ＴＣＣ ＴＴＴ ＧＴＡ ＣＡＡ ＧＧＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＡＧＴ ＡＡＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＡＴＡ ＣＣＴ ＧＴＧ ＧＣＣ ＴＴＧ ＧＧＣ ＣＴＣ ＡＡＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＡＡＴ ＣＴＧ ＴＡＣ ＣＴＧ ＴＣＣ ＴＧＣ ＧＴＧ ＴＴＧ ＡＡＡ ＧＡＴ ＧＡＴ ＡＡＧ ＣＣＣ ＡＣＴ ＣＴＡ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＡＧＴ ＧＴＡ ＧＡＴ ＣＣＣ ＡＡＡ ＡＡＴ ＴＡＣ ＣＣＡ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＡＡ ＡＡＧ ＣＧＡ ＴＴＴ ＧＴＣ ＴＴＣ ＡＡＣ ＡＡＧ ＡＴＡ ＧＡＡ ＡＴＣ ＡＡＴ ＡＡＣ ＡＡＧ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＴＴ ＧＡＧ ＴＣＴ ＧＣＣ ＣＡＧ ＴＴＣ ＣＣＣ ＡＡＣ ＴＧＧ ＴＡＣ ＡＴＣ ＡＧＣ ＡＣＣ ＴＣＴ ＣＡＡ ＧＣＡ ＧＡＡ ＡＡＣ ＡＴＧ ＣＣＣ ＧＴＣ ＴＴＣ ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＧＧ ＡＣＣ ＡＡＡ ＧＧＣ ＧＧＣ ＣＡＧ ＧＡＴ ＡＴＡ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＣＡＡ ＴＴＴ ＧＴＧ ＴＣＴ ＴＣＣ 本発明方法において用いられる上記遺伝子の製造方法
は、特に制限はなく、以下に示す各種の方法に従うこと
ができる。即ち、該方法としては例えばＧＩＦ生産能を
有するリンパ球由来細胞より得られるｍＲＮＡより調製
されたｃＤＮＡを、エシエリヒア・コリ（Ｅscherichia
coli）のプラスミド ベクター等の適当なベクターに
接続して、微生物細胞内で増幅させ、ＧＩＦを発現し得
るクローンを単離し、この単離されたクローンが有する
プラスミド中に挿入されているＤＮＡを分離する方法、
本明細書に開示したＧＩＦ及びその遺伝情報に基づい
て、例えばホスフアイト トリエステル法〔ネイチヤー
（Ｎature ），３１０，１０５（１９８４）〕等の常法
に従って、核酸の化学合成を行う方法、或いは上記各方
法を併用する方法等を例示できる。

【００３５】尚、上記において遺伝暗号の選択は任意で
よく、例えば利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮し
た常法に従えばよい。またそれら遺伝子がコードするＧ
ＩＦの一部のアミノ酸の置換や配列の改変等には、例え
ばサイト−スペシフィックミュータジエネシス（Ｓite
−Ｓpecific Ｍutagenesis）〔Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓc
i.,８１，５６６２−５６６６（１９８４）〕等の方法
を採用するのが簡便である。

【００３６】本発明に利用する遺伝子の製造法におい
て、上記ｍＲＮＡを経る方法につき、より詳細に説明す
れば次の通りである。

【００３７】上記遺伝子の入手のための起源細胞として
は、ＧＩＦ産生能を有する哺乳動物由来の免疫担当細胞
（ＧＩＦ産生細胞）を好適に利用できる。該ＧＩＦ産生
細胞の具体例は、前記した通りである。

【００３８】ＧＩＦをコードするｍＲＮＡを含むＲＮＡ
は上記ＧＩＦ産生細胞から常法に従い抽出される。該抽
出に先だつて、ＧＩＦ産生細胞は、一般にＧＩＦ産生条
件下におかれる。これは、該細胞をこの種細胞培養に通
常使用される培地を用いて、好ましくは抗腫瘍物質誘導
剤の存在下に、培養することにより行われる。上記培
地、ＧＩＦ産生細胞の上記培地に対する使用量、抗腫瘍
物質誘導剤、その使用量、培養方法等は前記したそれら
と同様とすることができる。ＲＮＡの抽出は、ＧＩＦ活
性が培養上清中に出現する頃の細胞について行うのがよ
い。

【００３９】上記ＲＮＡの抽出は、適当な界面活性剤、
例えばＳＤＳ，ＮＰ−４０、トリトン×１００、デオキ
シコール酸等を用いて、或いはホモジナイザーを用いる
方法や凍結融解等の物理的方法によって、細胞を部分的
または完全に破壊、可溶化した後、染色体ＤＮＡをポリ
トロン（Polytoron model CH-6010、キネマティカ（Kin
ematica）、スイス社製）等のミキサー若しくは注射筒
を用い、ある程度せん断し、その後、蛋白質と核酸分画
とを分別する操作により行われる。この操作には、特に
フェノール・クロロホルム抽出若しくは超遠心を用いる
ＣｓＣｌ重層法（グリシン（Glisin）ら、バイオケミス
トリー（Biochemistry），１３，２６３３（１９７４）
及びチルグウイン（Chirgwin,J.M.）ら、バイオケミス
トリー（Biochemistry），１８，５２９４（１９７
９））等が一般に用いられる。

【００４０】また、上記の各方法においては、ＲＮａｓ
ｅによるＲＮＡの分解を防ぐために、ＲＮａｓｅインヒ
ビター、例えばヘパリン、ポリビニル硫酸、ジエチルピ
ロカーボネート、バナジルリボヌクレオシド複合体、ベ
ントナイト、マカロイド等を添加しておくのがよい。

【００４１】上記抽出操作に従い得られるＲＮＡからの
ｍＲＮＡの分離精製は、抽出物を例えばオリゴｄＴ−セ
ルロース（Ｃollaborative Ｒesearch Ｉnc．）、ポリ
Ｕセファロース（Pharmacia社）、セファロース２Ｂ
（ファルマシア社）等の吸着カラムを用いる方法により
又はバッチ法により実施できる。かくして得られるｍＲ
ＮＡからの、ＧＩＦに対応する目的のｍＲＮＡの精製濃
縮及び同定は、次の如くして行い得る。即ち、例えばＧ
ＩＦに対する抗体を用いてポリゾームからｍＲＮＡを沈
殿させる方法により実施できる。また、蔗糖密度勾配遠
心等によって分画し、その分画につき、蛋白質の翻訳
系、例えばアフリカツメガエルの卵母細胞への注入や、
ウサギ網状赤血球ライゼート又は小麦胚芽等の無細胞系
で蛋白質に翻訳させ、その蛋白質のＧＩＦ活性を調べる
ことにより、目的とするｍＲＮＡの存在を確認する方法
によっても行うことができる。更に目的のｍＲＮＡの確
認は、上記ＧＩＦ活性測定に代えて，ＧＩＦに対する抗
体を用いる免疫法によっても行い得る。

【００４２】上記により得られる精製ｍＲＮＡは、通常
不安定であり、安定な相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の型に代
えられ、目的遺伝子の増幅を可能とするために微生物由
来のレプリコンに接続される。インビトロでの、上記ｍ
ＲＮＡのｃＤＮＡへの変換、即ちｃＤＮＡの合成は、一
般に次のようにして行うことができる。

【００４３】即ち、まずオリゴｄＴをプライマーとし
（このプライマーは遊離のオリゴｄＴ若しくは既にベク
タープライマーに付加されたオリゴｄＴのいずれでもよ
い）、ｍＲＮＡを鋳型としてｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＣＴＰ又はｄＴＴＰ）の存在下で逆転写酵素を
用いてｍＲＮＡに相補的な一本鎖ｃＤＮＡを合成する。
次のステップは、上記において遊離のオリゴｄＴを用い
たか、ベクタープライマーに付加されたオリゴｄＴを用
いたかにより、各々以下の如く異なる。

【００４４】前者の場合、鋳型としたｍＲＮＡをアルカ
リ処理等により分解して除去し、その後一本鎖ＤＮＡを
鋳型として逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼを用いて
二本鎖ＤＮＡを作成する。次に得られる二本鎖ＤＮＡの
両端をエキソヌクレアーゼで処理し、そのそれぞれに適
当なリンカーＤＮＡ又はアニーリング可能な組合せの塩
基を複数付加し、これを適当なベクター、例えばＥＫ系
プラスミドベクター（ストリンジエンド型若しくはリラ
ックス型のいずれでもよい）やλgt系ファージベクター
に組込む。

【００４５】また、後者の場合、鋳型としたｍＲＮＡを
残存させたまま、上記と同様のリンカーを付与した開環
状プラスミドと、リンカーＤＮＡ（しばしば動物細胞で
自立複製できる領域とｍＲＮＡの転写プロモーター領域
を含むＤＮＡ断片が用い得る）とをアニーリングさせて
閉環状とした後、ｄＮＴＰ存在下でＲＮａｓｅとＤＮＡ
ポリメラーゼとを共存させてｍＲＮＡをＤＮＡ鎖に置換
し、完全なプラスミドＤＮＡを作成できる。

【００４６】上記の如くして得られるＤＮＡは、ベクタ
ーの宿主微生物に導入され、該微生物を形質転換でき
る。

【００４７】宿主微生物としては、エシエリヒア コリ
ーが代表的であるが、特にこれに限定されず、その他に
バチルス・ズブチルス（Bacillus subtilis）、サッカ
ロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）
等も使用することができる。

【００４８】ＤＮＡの宿主微生物への導入及びこれによ
る形質転換の方法としては、一般に用いられている方
法、例えば主として対数増殖期にある細胞を集め、Ｃａ
Ｃｌ₂処理して自然にＤＮＡを取り込みやすい状態にし
て、プラスミドを取り込ませる方法等を採用できる。上
記方法においては、通常知られているように形質転換の
効率を一層向上させるためにＭｇＣｌ₂やＲｂＣｌを更
に共存させることもできる。また、微生物細胞をスフェ
ロプラストまたはプロトプラスト化してから形質転換さ
せる方法も採用することができる。

【００４９】上記により得られる形質転換株から、目的
のＧＩＦのｃＤＮＡを有する株を選出する方法として
は、例えば以下に示す各種方法を採用できる。

【００５０】（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを
用いるスクリーニング法 目的蛋白質のアミノ酸配列の全部又は一部が解明されて
いる（該配列は、複数個連続した特異的配列であれば、
目的蛋白のどの領域のものでもよい）場合、該アミノ酸
に対応するオリゴヌクレオチドを合成し（この場合、コ
ドン使用頻度を用いて導いた塩基配列又は考えられる塩
基配列の組合せの複数個のどちらでもよく、また後者の
場合、イノシンを含ませてその種類を減らすこともでき
る）、これをプローブ（³²Ｐ又は³⁵Ｓでラベルする）と
して、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニ卜ロセルロ
ースフイルターとハイブリダイゼーションし、得られた
ポジティブ株を検索して、これを選出する。

【００５１】（２）動物細胞でＧＩＦを産生させてスク
リーニングする方法 形質転換株を培養し、遺伝子を増幅させ、その遺伝子を
動物細胞にトランスフエクトし（この場合、自己複製可
能でｍＲＮＡ転写プロモーター領域を含むプラスミド若
しくは動物細胞染色体にインテグレートするようなプラ
スミドのいずれでもよい）、遺伝子にコードされた蛋白
質を産生させ、その培養上清若しくは細胞抽出物のＧＩ
Ｆ活性を測定するか、又はＧＩＦに対する抗体を用いて
ＧＩＦを検出するかにより、元の形質転換株より目的の
ＧＩＦをコードするｃＤＮＡを有する株を選出する。

【００５２】（３）インダクション特異的な形質転換株
を選出する方法 ＧＩＦは、前記したようにＬＰＳやＴＰＡ等の抗腫瘍物
質誘導剤よって、特異的にその産生が誘発される。

【００５３】インダクション特異的な株を選出するに
は、コロニー ハイブリダイゼーションのプローブとし
て、ＧＩＦを誘導していない産生株（インダクションマ
イナス）からのｍＲＮＡと、上記薬剤を用いてＧＩＦを
誘導させ（インダクションプラス）且つ該ＧＩＦをコー
ドするｍＲＮＡが増幅しているｍＲＮＡ（該ｍＲＮＡか
ら合成したｃＤＮＡでもよい）との両者を用い、これら
をハイブリダイゼーションさせ、その強弱により、イン
ダクション特異的な転換株を選出する（プラス・マイナ
ス法）。

【００５４】また、インダクションマイナスのｍＲＮＡ
（又はそれから作成されるｃＤＮＡ）とインダクション
プラスのｍＲＮＡから作成されたｃＤＮＡ（又はｍＲＮ
Ａそのもの）とのハイブリダイゼーションを行なった
後、ハイブリダイゼーションしなかったｍＲＮＡ（又は
ｃＤＮＡ）をプローブとし、コロニーハイブリダイゼー
ションを行なって、インダクション特異的な株を選出す
る（セレクティブ・ハイブリダイゼーション法）。目的
株の選出は、ｃＤＮＡ若しくはｍＲＮＡの検索により行
ない得る。

【００５５】（４）ＧＩＦに対する抗体を用いて選出す
る方法 予め、ｃＤＮＡを形質転換株内で蛋白質を発現し得るベ
クターに組込み、形質転換株内で蛋白質を産生させ、Ｇ
ＩＦに対する抗体及び該抗体に対する第二抗体を用い
て、ＧＩＦ産生株を検出し、目的株を得る。

【００５６】（５）セレクティブ・ハイブリダイゼーシ
ョン・トランスレーションの系を用いる方法 形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニ卜ロセルロース
フィルター等にブロツトし、ＧＩＦ産生細胞からのｍＲ
ＮＡをハイブリダイゼーションさせた後、ｃＤＮＡに対
応するｍＲＮＡを回収する。回収されたｍＲＮＡを蛋白
翻訳系、例えばアフリカツメガエルの卵母細胞への注入
や、ウサギ網状赤血球ライゼートや小麦胚芽等の無細胞
系で蛋白質に翻訳させ、その蛋白質のＧＩＦ活性を調べ
るか、又はＧＩＦに対する抗体を用いて検出して、目的
の株を得る。

【００５７】得られた目的の形質転換株よりＧＩＦをコ
ードするＤＮＡを採取する方法は、公知の方法、例えば
細胞よりプラスミドＤＮＡに相当する画分を分離し、該
プラスミドＤＮＡよりｃＤＮＡ領域を切り出すことによ
り行ない得る。

【００５８】上記各方法に従い得られるＧＩＦのｃＤＮ
Ａの構造及び塩基配列は、例えばマキサム−ギルバート
(Maxam-Gilbert)の化学的修飾法〔Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙ
ｍ．６５，４９９−５６０（１９８０）〕及びＭ１３フ
ァージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法〔Ｍｅ
ｓｓｉｎｇ Ｊ．ａｎｄ Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎ
ｅ，１９，２６９−２７６（１９８２）〕にて決定でき
る。

【００５９】尚、上記の如くして得られる形質転換体の
一例として、後記実施例で得られるＧＩＦ遺伝子を含む
プラスミドｐＧＩＦ−αをエシエリヒア コリ−χ１７
７６にトランスフォームさせた形質転換体を、「Escher
ichia coliχ1776/pGIF-α」なる名称で工業技術院微生
物工業技術研究所に、「微工研条寄第９４８号（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−９４８）として寄託している。従って、上記
ＧＩＦ遺伝子の調製に当たっては、この形質転換体を利
用するのがより簡便であり好ましい。

【００６０】ＧＩＦポリペプチドをコードする遺伝子の
利用によれば、遺伝子組換え技術に従い、ＧＩＦを大量
に収得することができる。上記技術においては該遺伝子
が宿主細胞中で発現でき得るような組換えＤＮＡを作成
する。該組換えＤＮＡの作成は、当該技術分野における
通常の方法に従うことができ、本明細書に開示のＧＩＦ
の遺伝情報に基づいて容易に実施できる。個々の具体的
操作については一部既に詳述したが、以下により具体的
に詳述する。

【００６１】宿主細胞としては、真核生物及び原核生物
のいずれをも用いることができる。該真核生物の細胞に
は、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞と
しては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞〔Ｙ．Ｇｌ
ｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２（１９８
１）〕やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞ジヒドロ葉
酸レダクターゼ欠損株（Ｇ．Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ
Ｌ．Ａ．Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７７，４２１６−４２２０（１
９８０）〕等がよく用いられているが、之等に限定され
る訳ではない。脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、
通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモー
ター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及
び転写終了配列等を保有するものを使用でき、これは更
に必要により複製起源を保有していてもよい。該発現ベ
クターの例としては、例えばＳＶ４０の初期プロモータ
ーを保有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ〔Ｓ．Ｓａｂｒａｍａｎ
ｉ，Ｒ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ ａｎｄ Ｐ．Ｂｅｒｇ，Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４−８６４（１
９８１）〕等を例示できるが、これに限定されない。

【００６２】また真核微生物としては酵母が一般によく
用いられており、その中でもサッカロミセス属酵母が有
利に利用できる。該酵母等の真核微生物の発現ベクター
としては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプ
ロモーターを持つｐＡＭ８２〔Ａ．Ｍｉｙａｎｏｈａｒ
ａ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．，ＵＳＡ，８０，１−５（１９８３）〕等を好まし
く利用できる。

【００６３】原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌
が一般によく用いられている。本発明では例えば該宿主
菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このべク
ター中にＧＩＦの遺伝子が発現できるようにＧＩＦ遺伝
子の上流にプロモーター及びＳＤ（シャイン・アンド・
ダルガーノ）塩基配列、更に蛋白合成開始に必要なＡＴ
Ｇを付与した発現プラスミドが使用できる。上記宿主菌
としての大腸菌としては、エシェリヒア・コリー（Ｅ．
ｃｏｌｉ）Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとして
は一般にｐＢＲ３２２がよく用いられるが、これに限定
されず、公知の各種の菌株及びベクターがいずれも利用
できる。プロモーターとしては、例えばトリプトファン
・プロモーター、Ｐ_Lプロモーター、ｌａｃプロモータ
ー、ｌｐｐプロモーター等を使用することができ、いず
れの場合にもＧＩＦ遺伝子を発現させることができる。

【００６４】トリプトファン・プロモーターを用いる場
合を例にとり詳述すれば、発現ベクターとしてトリプト
ファン・プロモーター及びＳＤ配列を持つベクターｐＴ
Ｍ１〔今本文男、代謝、Ｖｏｌ．２２，２８９（１９８
５）〕を使用し、ＳＤ配列の下流に存在する制限酵素Ｃ
ｌａＩ部位に、必要に応じてＡＴＧを付与したＧＩＦを
コードする遺伝子を連結させればよい。この方法により
例えば前記ポリペプチドＩを製造する場合、より具体的
には、まずＧＩＦのｃＤＮＡを持つ例えば後記実施例に
示すプラスミドｐＧＩＦ−αを、制限酵素ＡｃｃＩ及び
ＭｓｐＩで切断してポリペプチドＩをコードする遺伝子
の大部分と３’非翻訳領域の一部を含むＤＮＡフラグメ
ントを単離する。このＤＮＡフラグメントではポリペプ
チドＩのアミノ末端側の１０アミノ酸残基をコードする
遺伝子領域が不足している。従って、上記方法では次い
でトリプトファン・プロモーターを持つ発現ベクターｐ
ＴＭ１の制限酵素ＣｌａＩ部位に連結することができ、
且つ翻訳開始コドンＡＴＧを持ち、更にポリペプチドＩ
のアミノ末端側から１０アミノ酸残基をコードし得る合
成ＤＮＡリンカーを作成し、このリンカーを用いて、ト
リプトファン・プロモーターの下流にポリペプチドＩ遺
伝子を挿入して発現プラスミドを調製する。該プラスミ
ドをＣａＣｌ₂処理によりＤＮＡを取り込みやすい状態
とした大腸菌へ形質転換させ、目的の形質転換株を常法
に従い培養することにより、ポリペプチドＩを収得でき
る。上記形質転換株の培養は、一般にはトリプトファン
・プロモーターが働くようにするためにカザミノ酸を添
加したＭ９最小培地を用いて行なわれ、該培地中には培
養中の適当な時期にインドールアクリル酸等のトリプト
ファン・プロモーターの働きを強めるための薬剤を添加
することもできる。かくして培養された大腸菌内には、
ボリペプチドＩが大量に産生、蓄積される。

【００６５】上記に具体的に例示した以外の全ての本発
明ＧＩＦの製造方法も、上記方法と略々同様にして行な
うことができる。

【００６６】上記により、目的の組換え微生物の細胞内
又は細胞外に生産されるＧＩＦは、常法に従い分離さ
れ、ＧＩＦの物理的、化学的性質等を利用した各種の処
理操作に従い単離、精製することができる。該処理操作
の具体例は、前記した通りである。

【００６７】本発明方法に従い得られるＧＩＦは、その
有するＧＩＦ活性及び種々の腫瘍細胞に対して特異的に
その増殖を抑制する作用により、単独でヒト及びその他
の動物の抗腫瘍剤として有用であり、またガンの化学療
法剤として、特に各種抗悪性腫瘍剤との併用による寛解
強化療法、寛解維持療法に有利に用いられる。更に該Ｇ
ＩＦは、毒性が極めて低く、この低毒性の面でも上記用
途に有利である。

【００６８】ＧＩＦを抗腫瘍剤として用いるに当り、該
抗腫瘍剤はＧＩＦの有効量を、薬理的に許容される通常
の無毒性担体と共に含有する各種の薬理組成物の形態に
調製され、該形態に応じた各種投与経路により投与され
る。その製剤形態としては、通常液状形態、即ち溶液、
懸濁液、乳濁液等を例示でき、之等は一般に経口、静
脈、皮下又は筋肉内投与される。之等はまた使用前に適
当な通常の担体の添加によって液状となし得る乾燥品と
して提供することもできる。該抗腫瘍剤の投与量は、患
者の年齢、性別や疾患の程度等により異なるが、通常蛋
白量として約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日を１〜数回
に分けて投与するのが好ましい。

【００６９】

【実施例】以下、本発明を更に詳細に説明するため実施
例を挙げる。

【００７０】尚、ＧＩＦ活性は次の方法により測定し
た。

【００７１】ＧＩＦ活性の測定 ９６ウエルマイクロプレート（コーニング社）に種々の
濃度に希釈した供試液０．１mlを入れ、次に各ウエルに
ヒトメラノーマ細胞Ａ３７５を２×１０⁴個／ｍｌの濃
度で含有する１０％ＦＣＳを含むイーグルスＭＥＭ浮遊
液０．１ｍｌを加え、炭酸ガス培養器（ナフコ社製）内
で４日間培養する。培養終了後、０．０５％ニュウトラ
ルレッド（和光純薬社製）０．０５ｍｌを各ウエルに加
え、３７℃で２時間培養する。上澄液を除去した後、リ
ン酸緩衝生理食塩水０．３ｍｌを各ウエルに静かに加え
てウエルを洗浄する。洗浄液を除去した後、各ウエルに
リン酸１ナトリウム−エタノール等量混合液０．１ｍｌ
を加え、マイクロミキサーで数分間振とうし、細胞内に
取込まれた色素量を、９６ウエル−マイクロタイトレー
ションプレート用光度計（タイターチエツクマルチスキ
ャン、フロウラボラトリーズ社製）を用いて、吸光度５
４０ｍμにて測定し、増殖抑制活性を求める。対照群
（コントロール群）の細胞増殖の５０％抑制を示す試験
群、即ち対照群の吸光度測定値の１／２の吸光度測定値
を示す試験群、の希釈倍数の逆数をとり、これをＧＩＦ
活性単位とする。従って例えばこのＧＩＦ活性が１０単
位の場合、この供試液は１０倍希釈してもなお細胞増殖
を５０％抑制する活性を有する。

【００７２】実施例１ （Ｉ）天然型ＧＩＦの製造 ヒト末梢血リンパ球を、２％牛胎児血清（ＦＣＳ）加Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地に懸濁させ、１×１０⁶個／ｍｌ
の濃度の細胞浮遊液に調製した。

【００７３】この液に抗腫瘍物質誘導剤であるＰＨＡ−
Ｐ（インゲンマメレクチン、デイフコ（Difco）社製）
を０．２％の濃度となるように加え、３７℃で３日間炭
酸ガス培養器（ＮＡＰＣＯ５３００、ナフコ社製）内で
培養し、培養液を遠心分離（２０００ｇ×１０分）して
培養上清を得た。得られた培養上清を以下原料液とす
る。

【００７４】原料液を硫酸アンモニウム沈殿法（日本生
化学会編、生化学実験講座第１巻、東京化学同人）によ
り分画した。硫酸アンモニウム濃度５０〜８０％の画分
にＧＩＦ活性を有する沈殿が認められた。

【００７５】この沈殿物をＡｃＡ５４（ＬＫＢ社）ゲル
クロマトグラフィー〔８０ｃｍ×４．４ｃｍ直径、移動
相０．０２％ポリエチレングリコール（分子量６００
０）を含むリン酸塩緩衝液(phosphate buffer salin
e)、流速３０ｍｌ／ｈｒ〕に付し、分子量１万〜２．５
万の画分にＧＩＦ活性を認めた。この画分にはＴＮＦ、
ＩＦＮ、ＣＳＦの活性は認められなかった。

【００７６】上記ゲルクロマトグラフィーの結果を図１
に示す。図において、横軸はフラクションＮｏ．を示
し、縦軸は下記各測定法に従って求められた各種生理活
性及びＯＤ₂₈₀での吸光度をそれぞれ示す。また、図に
は、参考のため各フラクションに相当する分子量を矢印
を付して示した。図中（１）はＣＳＦ活性を、（２）は
ＩＦＮ活性を、（３）はＩＬ−２活性を、（４）は本発
明のＧＩＦ活性を、（５）はＢＣＤＦ活性を、及び
（６）はＴＮＦ活性をそれぞれ示す曲線であり、（７）
は吸光度曲線である。

【００７７】活性測定 各生理活性の測定は、次の方法によった。

【００７８】・ＧＩＦ（上記方法に従う） ・ＴＮＦ（Ｌ９２９細胞株を使用し、Ａ．Ｋｈａｎらの
方法〔Human Lymphokines, Academic press, p23-32(19
82)〕に従い活性測定）。

【００７９】・ＩＦＮ（ヒト羊膜由来ＦＬ細胞とシンド
ビスウイルス(Sindbis virus)を使用した系においてイ
ンターフェロン活性測定〔須藤哲夫、大久保礼子、飯塚
雅彦、小林茂保、第４２回ウイルス抑制因子研究会、１
９８２年〕にて活性測定） ・ＣＳＦ（colony stimulating factor; フアラ(J.J. F
arrar)らの方法〔J. Immunol., 127, 1983 (1981)〕に
従いＢＡＬＢ／ｃ系マウス骨髄細胞を使用して活性測
定）。

【００８０】・ＬＡＦ（Lymphocyte activation facto
r、オッペンハイム(J.J. Oppenheim)らの方法〔J. Immu
nol., 116, 1466 (1976)〕に従いＣ３Ｈ／ＨｅＪ系マウ
ス胸腺細胞を利用して活性測定）。

【００８１】・ＩＬ−２（インターロイキン−２、ギリ
ス(S. Gillis)とスミス(K.A.Smith)の方法〔J. Immuno
l., 120, 2027 (1978)〕に従いＩＬ−２依存性マウスＴ
細胞（ＣＴＬＬ２）を使用して活性測定）。

【００８２】・ＢＣＤＦ（Ｂ細胞分化因子、Ｂ−cell d
ifferentiation factor、岸本らの方法〔J. Immunol.,
127, 412 (1981)〕に従いＣＥＳＳ細胞株を使用して活
性測定）。

【００８３】次いで上記画分につき、ＰＢＥ９４（ファ
ルマシア社製）ゲルを使用してクロマトフオーカシング
を行った。即ち、開始緩衝液として０．０２５Ｍイミダ
ゾール−塩酸（ｐＨ４）を用い、また溶出液としてポリ
バツフアー７４−塩酸（ｐＨ４）を用いて上記画分を分
画し、得られる各フラクションのＧＩＦ活性を測定し
た。その結果、等電点（ＰＩ）６．４〜６．６の領域に
ＧＩＦ活性が存在した。この領域にはＢＣＤＦ活性は認
められなかった。

【００８４】このクロマトフオーカシング分析結果を図
２に示す。図において、横軸はフラクションＮｏ．を、
縦軸はＯＤ２８０の吸光度（曲線（１）で示される）、
ＢＣＤＦ活性（曲線（２）で示される）、本発明ＧＩＦ
活性（曲線（３）で示される）及びｐＨ（曲線（４）で
示される）をそれぞれ示す。

【００８５】更に上記ＧＩＦ活性画分を逆相高速液体ク
ロマトグラフイー（Ｃ₄ハイポア−逆相カラム（ＲＰ３
０４）、バイオ−ラド社製、直径４．６×２５０ｍｍ、
移動相；Ａ液＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ液＝０．１％ＴＦＡ
＋７０％アセトニトリル、濃度勾配；Ａ液１００％から
８０分間でＢ液１００％とする、流速１ml／分）に付
し、アセトニトリルが４４±３％の画分を得た。この画
分にはＩＬ−２の活性は認められなかった。またＧＩＦ
活性とＬＡＦ活性は一致しなかった。

【００８６】上記により、本発明の天然型ＧＩＦを単離
した。

【００８７】上記逆相高速液体クロマトグラフイーの分
析結果を図３に示す。図において、横軸は保持時間
（分）を、縦軸は曲線（１）で示されるアセトニトリル
の濃度、曲線（２）で示される２８０ｎｍにおける蛋白
の吸光度（ＯＤ₂₈₀）、曲線（３）で示される本発明Ｇ
ＩＦ活性、曲線（４）で示されるＬＡＦ活性及び曲線
（５）で示されるＩＬ−２活性をそれぞれ示す。

【００８８】（II）天然型ＧＩＦの製造 ヒト末梢血リンパ球を、１％牛胎児血清（ＦＣＳ）、
０．１μｇ／ｍｌインドメタシン、２０ｍＭ Ｎ−２−
ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホ
ン酸（ＨＥＰＥＳ）及び１０μｇ／ｍｌＬＰＳ（デイフ
コ社製）を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地にて、１×１
０⁶個／ｍｌの濃度の細胞浮遊液に調製した。

【００８９】この液を、３７℃で２０〜２４時間炭酸ガ
ス培養器（ナフコ社製、ＮＡＰＣＯ５３００）内で培養
し、培養液を遠心分離（１００００ｒｐｍ×３０分）し
て培養上清２４３００ｍｌを得、次いでこれをペリコン
膜（分子量カットオフ、１００００；ミリポアー(Milli
pore)社製）を用いて１０倍に濃縮した。得られた培養
上清濃縮液を以下原料液という。

【００９０】原料液を上記（Ｉ）と同様に硫酸アンモニ
ウム沈殿法により氷冷下に分画した。硫酸アンモニウム
濃度５０〜８０％の画分にＧＩＦ活性を有する沈殿が認
められた。これを生理食塩水に溶解し、生理食塩水で透
析した。

【００９１】上記硫酸アンモニウム分画物を４回に分け
て各々４℃でウルトロゲルＡｃＡ５４（ＬＫＢ社）を用
いたゲルクロマトグラフイーに付した。その条件は次の
通りである。

【００９２】カラム：８８ｃｍ×４．４ｃｍ直径 溶離液：０．０２％ポリエチレングリコール（分子量６
０００）及び０．０２％ＮａＮ₃を含むリン酸塩緩衝生
理食塩液（ＰＢＳ） 流速３０ｍｌ／時間 フラクション容積：１５ml／３０分／チューブ 各回とも分子量約１万〜２．５万の画分（フラクション
Ｎｏ．５７〜６５）にＧＩＦ活性を認め、これを集め
た。

【００９３】この活性画分を、次いで氷冷下、ＹＭ−５
膜（アミコン社製）を用いて濃縮し、溶媒を５０ｍＭ酢
酸ナトリウム（ｐＨ５．５）とした。濃縮後、マイレッ
クスＧＶ（０．０２μｍ；ミリポア社製）で濾過した。

【００９４】上記で得られた活性画分濃縮処理試料を、
２回に分けてジルソン ハイパーミュエーション リキ
ッド クロマトグラフイー システム（ジルソン（Ｇｉ
ｌｓｏｎ）社製）によるイオン交換クロマトグラフィー
（ＣＭ−ＨＰＬＣ）にかけた。その条件は次の通りであ
る。

【００９５】カラム：ＩＥＸ−５３５ＣＭ（６．０×１
５０ｍｍ、東洋曹達社製） 溶離液Ａ：５０ｍＭ−酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５） 溶離液Ｂ：０．５Ｍ−ＮａＣｌ含有５０ｍＭ−酢酸ナト
リウム（ｐＨ５．５） 流速：０．５ｍｌ／分 フラクション容積： リテンションタイム ０〜６０ 分：２ｍｌ／４分／チューブ ６０〜１２０分：０．５ｍｌ／分／チューブ １２０〜１８０分：２ｍｌ／４分／チューブ 上記ＣＭ−ＨＰＬＣの結果、ＧＩＦ活性画分は、リテン
ションタイム９０〜９１分に認められた。

【００９６】上記によるＧＩＦ活性画分（フラクション
Ｎｏ．４５）を、次いで逆相高速液体クロマトグラフィ
ーに付した。その条件は、次の通りである。

【００９７】カラム：Ｃ₄ハイポア−逆相カラム（ＲＰ
３０４、バイオーラド社、直径４．６×２５０ｍｍ） 溶離液：Ａ液＝０．１％ＴＦＡ Ｂ液＝アセトニトリル：１％ＴＦＡ（９：１） 流速：１ｍｌ／分 チャートスピード： リテンションタイム ０〜５０分：５分／ｃｍ ５０〜８０分…２分／ｃｍ フラクション容積：２ｍｌ／２分／チューブ 上記クロマトグラフィーの結果を図４に示す。図におい
て、横軸はリテンションタイム（分）を、縦軸はＧＩＦ
活性（曲線１）、２８０ｎｍにおける蛋白の吸光度（Ａ
₂₈₀、曲線２）及び溶離液の濃度勾配（％Ｂ、曲線３）
をそれぞれ示す。

【００９８】リテンションタイム６３．９〜６５．３分
に、ＧＩＦ活性に一致する単一の蛋白の吸光度ピークを
示すＧＩＦが得られた。

【００９９】その比活性は２．１×１０⁷単位／mg蛋白
であった。

【０１００】ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ） Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．の方法（Ｎａｔｕｒｅ，２７
７，６８０（１９７０））に従い、上記(II)で得たＧＩ
ＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。その条件は次の通り
である。

【０１０１】試料：上記ＧＩＦ活性画分１０μｌを乾固
した後、ラエメリーのサンプル バッファー（１／２０
体積の２−メルカプトエタノールを含む）に溶解し、１
００℃で４分間処理した。

【０１０２】ゲル：厚さ０．７５ｍｍの１５％ポリアク
リルアミトゲルを使用した。

【０１０３】電気泳動装置：バイオーラド社製プロテア
ンを用いた。

【０１０４】泳動条件：２０ｍＡの定電流で２時間泳動
させた。

【０１０５】泳動後のゲルをバイオーラド社製シルバー
スタインキット（Ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎ ｋｉｔ）
を用いて染色した。その結果を図５に示す。

【０１０６】図５において、レーン(1)は以下の分子量
マーカーの結果であり、レーン(2)は上記ＧＩＦ試料の
結果であり、レーン(3)は０．１％ＴＦＡ１０μｌをＧ
ＩＦ活性画分に代えて用いて上記レーン(2)に用いた試
料と同じ処理をしたものの結果を示す。

【０１０７】＜レーン(1)における分子量マーカー＞ ９４Ｋ：フオスフオリラーゼｂ ６７Ｋ：アルブミン ４３Ｋ：オバルブミン ３０Ｋ：カルボニツク アンハイドラーゼ ２０．１Ｋ：トリプシン インヒビター １４．４Ｋ：α−ラクトアルブミン 上記図５より、ＧＩＦは、分子量約１８Ｋに単一のバン
ドとして泳動されることが判る。

【０１０８】等電点電気泳動法（ＩＥＦ） 上記（II）で得たＧＩＦの等電点電気泳動を、ｐＨ範囲
３．５〜９．５のアンフォラインＰＡＧプレート（ＬＫ
Ｂ社製）及びモデル１４１５（バイオ−ラド社製）を用
いて行なった。その条件は次の通りである。

【０１０９】試料：上記ＧＩＦ活性画分１０μｌを、２
５ｍＭのナトリウムフォスフェートバッファー（ｐＨ
７．４）で５倍希釈して用いた。

【０１１０】電極液：陽極液＝１Ｍ Ｈ₃ＰＯ₄ 陰極液＝１Ｍ ＮａＯＨ 泳動条件：定電力１W/cmゲル幅で９０分間冷却下（１０
℃）に泳動させた。

【０１１１】染色；染色は、シルバー スタイン キッ
トで行なった。

【０１１２】上記泳動の結果を図６に示す。図６におい
て、レーン(1)及び(4)は、分子量マーカー２０μｌの結
果であり、レーン(2)は上記ＧＩＦ試料５０μｌの結果
であり、レーン(3)は、０．１％ＴＦＡ １０μｌをレ
ーン(2)の試料と同様にして希釈したもの（バッファ
ー）５０μｌの結果を示す。

【０１１３】また上記泳動後、ゲルを５ｍｍまたは２ｍ
ｍ間隔でスライスし、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０
培地１mlにて振とう抽出（２日）し、ＧＩＦ活性の測定
に供した。等電点は、泳動後のｐＨの測定結果から算出
した。

【０１１４】上記結果を図７に示す。図７において、横
軸はスライスしたゲルＮｏ．を、縦軸はｐＨ勾配（破線
で示される）及びＧＩＦ活性（実線のグラフ）を示す。

【０１１５】図６及び図７より、ＧＩＦの等電点（ｐ
Ｉ）は、７．０２〜６．８８であり、この位置に単一の
バンドとして現れることが判る。

【０１１６】アミノ酸組成比 上記(II)で得たＧＩＦを、加水分解（４Ｎ−メタンスル
ホン酸、２４時間）後、オルトフタルアルデヒド（ＯＰ
Ａ）法により、アミノ酸アナライザー（日立製作所製）
を用いて分析した。

【０１１７】その結果ＧＩＦは、Ｐｈｅを基準として以
下のモル比で各アミノ酸を含有するものと認められた。

【０１１８】尚、上記分析条件下においては、Ｐｒｏ及
びＣｙｓは測定できない。またＳｅｒ及びＴｈｒは同条
件で一般に約５〜１０％程度分解することが知られてい
る。

【０１１９】ア ミ ノ 酸 モ ル 比 Ａｓｐ及び／又はＡｓｎ １７．６ Ｓｅｒ １２．１ Ｔｈｒ ５．７ Ｇｌｕ及び／又はＧｌｎ ２３．１ Ｇｌｙ ８．１ Ａｌａ ５．２ Ｖａｌ １１．８ Ｍｅｔ ５．６ Ｉｌｅ ４．８ Ｌｅｕ １５．４ Ｔｙｒ ３．９ Ｐｈｅ （ ９ ） Ｌｙｓ １５．３ Ｈｉｓ １．１ Ｔｒｐ ０．８ Ａｒｇ ３．０アミノ酸配列 上記(II)で得たＧＩＦのＮ端アミノ酸配列を、気相シー
クエンサー（アプライトバイオシステムズ社製）により
決定した。

【０１２０】その結果ＧＩＦのＮ端２０個のアミノ酸配
列は、以下のものであると認められた。

【０１２１】 Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ− Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ− Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ 尚、Ｎ末端より８番目のアミノ酸は、ＰＴＨアミノ酸と
して検出されなかったことからＣｙｓと推定した。

【０１２２】生理活性 上記（II）で得たＧＩＦを、前記各種生理活性の測定試
験に供した結果、ＴＮＦ、ＩＮＦ、ＣＳＦ、ＩＬ−２及
びＢＣＤＦのいずれの活性も認められず、之等生理活性
物質とは明確に区別される異なる物質であることが判る
と共に、極めて均質であることが確認された。

【０１２３】各種レクチンカラムに対する親和性試験 上記（Ｉ）及び（II）で得たＧＩＦの糖結合特異性を調
べるために、以下に示される各レクチンを用いてアフイ
ニテイークロマトグラフイー〔供試試料３６２４単位／
０．０６mg／０．５ml、ゲル容積１ml、洗浄液：ＰＢＳ
^-−０．００５％ＰＥＧ（但しＳＪＡについては０．０
５Ｍトリス−０．１５ＭＮａＣｌ、ｐＨ８．７を使
用）、溶出液：各洗浄液に下記表１に示す糖を添加した
溶液〕により之等レクチンカラムに対するＧＩＦの結合
性を調べた。

【０１２４】結果を下記表１に示す。尚各レクチンはい
ずれもイー．ワイ．ラボラトリー（E.Y.Laboratories）
社より入手した。

【０１２５】

【表１】レクチン ＣｏｎＡ Concanavalin A ＷＧＡ Wheat Germ Agglutinin ＵＥＡ−Ｉ Ulex europeus Agglutinin ＤＢＡ Dolichos biflorus Agglutinin ＷＦＡ Wistaria floribunda Agglutinin ＰＮＡ Peanut Agglutinin ＳＢＡ Soybean Agglutinin ＳＪＡ Sophora japonica Agglutininレクチン 溶 出 液 ＣｏｎＡ 0.1M-α-メチルマンノピラノサイド ＷＧＡ 0.2M-N-アセチルグルコサミン ＵＥＡ−Ｉ 0.05M-フコース ＤＢＡ 0.1M-N-アセチルガラクトサミン ＷＦＡ （同 上） ＰＮＡ 0.2M-ガラクトース ＳＢＡ （同 上） ＳＪＡ （同 上）レクチン 認識される糖鎖 ＣｏｎＡ α−Ｍａｎ＞α−Ｇｌｃ ＷＧＡ ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ ＵＥＡ−Ｉ （同 上） ＤＢＡ α−ＧａｌＮＡｃ ＷＦＡ （同 上） ＰＮＡ β−Ｇａｌ ＳＢＡ α−ＧａｌＮＡｃ＞β−ＧａｌＮＡｃ ＳＪＡ α−ＧａｌＮＡｃ＞β−Ｇａｌ 上記（Ｉ）で得たＧＩＦについての結果を、また図８に
示す。図８において縦軸は供試試料中に存在するＧＩＦ
活性量を１００％として、各レクチンカラムに吸着せ
ず、通過した画分（Ｗ）及びカラムに吸着し、溶出液よ
り溶出された画分（Ｅ）に含まれる活性量の割合を示
し、横軸は各レクチンカラムにおける各画分（Ｗ及び
Ｅ）を示す。

【０１２６】図８よりＧＩＦは、上記レクチンのいずれ
にも親和性を示さず、従ってこれらの一般的糖鎖は結合
していないことが認識された。

【０１２７】また上記（II）で得たＧＩＦについての結
果も、図８と同様であった。

【０１２８】安定性 ＧＩＦの安定性試験を以下の通り行った。尚、ＧＩＦと
しては上記（Ｉ）で得たもの及び（II）で得たものをそ
れぞれ用いたがいずれの場合も同様の結果を与えた。

【０１２９】ａ．温度安定性 ＧＩＦを表２に示す各条件下で処理し、その温度安定性
を調べた。即ち上記ゲル濾過画分３５０３単位／mlを各
温度でインキュベーションし、処理後の活性量を対照群
に対する残存活性％として求めた。結果を下記表２に示
す。

【０１３０】

【表２】処 理 条 件 対照群に対する残存活性％ ３７℃、１時間 ９７％ ５６℃、３０分間 ０％ ７０℃、３０分間 ０％ ８０℃、３０分間 ０％４℃、１時間 １００％（対照群） ｂ．ｐＨ安定性 上記ａと同様にしてＧＩＦを表３に示す各条件（温度は
４℃一定とした）下で処理し、そのｐＨ安定性を同様に
して求めた。結果を下記表３に示す。

【０１３１】

【表３】処 理 条 件 対照群に対する残存活性％ ｐＨ７．４、５時間 １００％（対照群） ｐＨ２．０、５時間 ６０％ ｐＨ４．０、５時間 ８０％ ｐＨ６．０、５時間 ９０％ ｐＨ８．０、５時間 ９５％ｐＨ９．５、５時間 ７５％ ｃ．蛋白分解酵素に対する安定性 上記ａと同様にしてＧＩＦの各種蛋白分解酵素に対する
安定性を下記表４に示す条件下に調べた。結果を同表に
示す。尚、トリプシンとしてはシグマ社製トリプシン
タイプIII、１２７００ ＢＡＥＥ単位／mg蛋白）を１m
g／mlの濃度で用いた。またプロナーゼとしては科研化
学社製プロナーゼ（４５０００ｐ．ｕ．ｋ／ｇ蛋白）を
１mg／mlの濃度で利用した。

【０１３２】

【表４】処 理 条 件 残 存 活 性 ％ リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）処理 （３７℃、２時間） １００％（対照群） トリプシン処理（３７℃、２時間） ０％プロナーゼ処理（３７℃、２時間） ０％ 上記表４より，ＧＩＦはトリプシン処理及びプロナーゼ
処理により失活することが判る。

【０１３３】ＧＩＦ活性の用量作用曲線 （ａ）上記（Ｉ）で得たＧＩＦ試料１４４．６単位／ml
（蛋白濃度７２３ng／ml）を用いて、各種希釈倍率にお
けるＧＩＦ活性の用量作用曲線を求めた。結果を図９に
示す。図において、横軸は試料の希釈倍率を、縦軸はＧ
ＩＦ活性（腫瘍細胞増殖抑制率）を示す。

【０１３４】図９より、ＧＩＦは数十ng/mlの用量で５
０％程度腫瘍細胞の増殖を抑制することが判る。

【０１３５】（ｂ）前記（II）で得た天然型ＧＩＦの各
種癌細胞に対する抗腫瘍活性を、以下のコロニー抑制試
験及び増殖抑制試験により試験した。

【０１３６】コロニー抑制試験 １２ウエル組織培養プレート（コースター(Coster)社
製）を用い、該プレートの各ウエルに各種供試癌細胞を
１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に２×１０²〜
５×１０²細胞／ウエル（５００μｌ／ウエル）となる
濃度で懸濁させた液を分注する。

【０１３７】上記各ウエルに，ＧＩＦ試料を最終濃度が
１．６〜１０００単位／mlとなる所定量で加える。また
ＧＩＦ試料無添加の対照を作成する。

【０１３８】上記各ウエルを３７℃で５％炭酸ガス存在
下に、１週間培養する。その後、培地をアスピレーター
で除去し、ＣａＣｌ₂含有ＰＢＳ（ＰＢＳ⁺）で２回洗浄
し、１００％メタノールで生成したコロニーを固定し、
次にコロニーをギムザ染色して計数する。

【０１３９】コロニー抑制率（％）は、次式により算出
する。

【０１４０】コロニー抑制率（％）＝〔（１−試料のコ
ロニー数）／（対照のコロニー数）〕×１００ 供試癌細胞として、Ａ−５４９（ヒト肺癌細胞、human
lung cancer cell、ＡＴＣＣ ＣＣＬ１８５）を用いた
結果を図１０に示す。図において横軸はＧＩＦ濃度（単
位／ml）を、縦軸はコロニー抑制率（％）を示す。

【０１４１】増殖抑制試験 ９６ウエル組織培養プレート（コーニング(Corning)社
製）を用い、該プレートの各ウエルに各種供試癌細胞を
１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に２×１０³〜
５×１０³細胞／ウエル（１００μｌ／ウエル）となる
濃度で懸濁させた液を分注する。

【０１４２】上記各ウエルに，ＧＩＦ試料を最終濃度が
１〜１０００単位／ml培地となるように各々１００μｌ
づつ分注する。またＧＩＦ試料無添加の対照を作成す
る。

【０１４３】上記各ウエル内細胞を３７℃で５％炭酸ガ
ス存在下に、４〜５時間培養後、ウエルに更に０．０５
％ニュートラルレッドを５０μｌづつ加え、３７℃で５
％炭酸ガス存在下に、１時間インキュベートし、その
後、各ウエルをＣａＣｌ₂不含ＰＢＳ（ＰＢＳ^-）で洗浄
し、色素抽出緩衝液１００μｌづつを加え、各ウエルの
５４０ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ．）を測定する。

【０１４４】増殖抑制率（％）は、次式により算出され
る。

【０１４５】増殖抑制率（％）＝１−〔（試料のＯＤ）
／（対照のＯＤ）〕×１００ 供試癌細胞として、ＡＣＨＮ（ヒト腎臓アデノカルシノ
ーマ、human renal adenocarcinoma、ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１６１１）を用いた結果を図１１に、またＳＫ−ＢＲ−
３（ヒトブレストアデノカルシノーマ(human breast ad
enocarcinoma、ＡＴＣＣ ＨＴＢ３０）を用いた結果を
図１２にそれぞれ示す。各図において横軸はＧＩＦ濃度
（単位／ml）を、縦軸は増殖抑制率（％）を示す。

【０１４６】ＧＩＦ蛋白の一次構造の決定 （１）ヒト末梢血を採血し、フィコール・ハイパークの
密度勾配遠心法（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４，
８０８（１９７４）〕により末梢血リンパ球１．９×１
０¹⁰個を得た。

【０１４７】このリンパ球を４×１０⁸／ｍｌの細胞濃
度で、ヒト血清５％を含むＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁
させ、直径９ｃｍのシャーレに分注後、５％炭酸ガス
中、３７℃で１時間培養した。その後、シャーレ底部に
付着していない細胞を除去し、ウシ胎児血清１０％、Ｔ
ＰＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）０．５ｎｇ／ｍｌ及
びＬＰＳ（デイフコ（Ｄｉｆｃｏ）社製）１０μｇ／ｍ
ｌを含むＲＰＭＩ１６４０培地にて細胞を刺激した。５
％炭酸ガス中、３７℃で４時間培養した後、ＰＢＳ及び
０．０２％ＥＤＴＡにて付着性リンパ球９×１０⁸個を
得た。

【０１４８】上記においてシャーレ底部に付着した細胞
を同様の培養条件でＬＰＳ１０μｇ／ｍｌで刺激した
後、経時的に培養上清中のＧＩＦ活性を測定した。

【０１４９】結果を図１３に示した。図において横軸は
培養時間（時間）であり、縦軸はＧＩＦ活性（単位／ｍ
ｌ）である。

【０１５０】図１３より、ＬＰＳ刺激４時間後より、Ｇ
ＩＦ活性が培養上清中に出現し、従ってＧＩＦ蛋白質を
産生するｍＲＮＡは、ＬＰＳ刺激４時間後のヒト付着性
細胞より調製すればよいことが判る。

【０１５１】（２）上記（１）に従い、ＴＰＡ０．５ｎ
ｇ／ｍｌ及びＬＰＳ１０μｇ／ｍｌで４時間誘導したヒ
ト付着性リンパ球９×１０⁸細胞を、６Ｍ−グアニジン
チオシアネート溶液（６Ｍグアニジンイソチオシアネー
ト、５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．１
Ｍ２−メルカプトエタノール、０．５％ザルコシル（Ｓ
ａｒｋｏｓｙｌ）３０ｍｌにて溶解後、Ｇ１８Ｇ注射針
をつけた５０ｍｌ注射筒を用いてＤＮＡをせん断した。
この溶液に塩化セシウム（ＣｓＣｌ）１２ｇを添加し、
完全に溶解させた後、その６．４ｍｌずつを５．７Ｍ
ＣｓＣｌ（５．７ＭＣｓＣｌ−０．１ＭＥＤＴＡ）４ｍ
ｌに重層し、ベックマンローター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓ
Ｗ−４０Ｔｉ ｒｏｔｏｒ）にて２５℃で３１５００ｒ
ｐｍで２０時間遠心した。沈澱したＲＮＡのペレットを
７０％エタノールで洗浄後、ＴＥ溶液（１０ｍＭトリス
・ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１ｍＭＥＤＴＡ）に溶解し、１
／９容の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び２．２
容のエタノールを加えて、−７０℃で１時間放置した。
４℃にて１５０００ｒｐｍで２０分間遠心し、ＲＮＡを
回収し、ＴＥ溶液に溶解させた。

【０１５２】かくして付着性リンパ球約９×１０⁸細胞
から、全ＲＮＡ２５０μｇを得た。

【０１５３】次に、上記で得たＲＮＡからｍＲＮＡを取
得するために、オリゴ（ｄＴ）−セルロース（Ｃｏｌｌ
ａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）を
用いてカラムクロマトグラフィーを行なった。吸着は、
１０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ＭＮａ
Ｃｌ、１ｍＭＥＤＴＡにて行ない、カラムを同溶液にて
洗浄後、１０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び１
ｍＭＥＤＴＡにてＲＮＡを溶出させた。

【０１５４】この結果、溶出されたｍＲＮＡ量は、１
７．５μｇであった。

【０１５５】（３）上記（２）で得たｍＲＮＡから、次
いでｃＤＮＡを、インビトロで合成し、オカヤマ−ベル
グのプラスミドベクタ−〔Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．ａｎｄ
Ｂｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，
２，１６１（１９８２））を用いて組換え体ＤＮＡを作
成し、これをエシエリヒア コリーにトランスホームし
て、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。各手法は次の通
りである。

【０１５６】（３−１）ベクター・プライマーとリンカ
ーＤＮＡの調製 ｐＢＲ３２２−ＳＶ４０（０．７１〜０．８６）ＤＮＡ
４００μｇを、ＫｐｎＩ（ＮＥＢ）７００単位で、３７
℃で５時間消化し、０．２５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
４０μｌと１０％ＳＤＳ２０μｌとの混液で反応を停止
させた後、等容のフェノール−クロロホルム（１：１）
で抽出し、エタノールにてＤＮＡを沈澱させ、遠心後、
７０％エタノールで洗浄し、ＤＮＡを回収した。得られ
たＤＮＡを１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム，３０ｍＭ
トリス・ＨＣｌ（ｐＨ６．８），１ｍＭＣｏＣｌ₂，
０．１ｍＭ ＤＴＴ及び０．２５ｍＭ ｄＴＴＰ（α−³²
Ｐ−ｄＴＴＰ ０．５μＣｉを含む）２００μｌに溶解
させ、ターミナルトランスフェラーゼ（ＴＴａｓｅ，Ｐ
Ｌ）４００単位にて３０分間ｄＴ鎖の伸長を行なわせ、
０．２５ＭＥＤＴＡ２０μｌと１０％ＳＤＳ１０μｌと
を加えて反応を停止させ、フェノール−クロロホルム抽
出を４回繰返した後、エタノール沈澱にてＤＮＡを回収
した。この結果、ｄＴ鎖は約７０塩基伸長された。

【０１５７】次に、上記で得たＤＮＡを、ＨｐａＩ（Ｎ
ＥＢ）１７単位を用いて、３７℃で６時間消化し、アガ
ロース（低融点アガロース．ＢＲＬ，１％）電気泳動に
て約２．７ｋｂのＤＮＡ断片の回収を行なった。

【０１５８】電気泳動後、エチジウムブロマイド０．５
μｇ／ｍｌにてＤＮＡを染色し、ＵＶ照射下で約２．７
ｋｂの断片を含むアガロースを切り出し、５倍容の２０
ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−１ｍＭＥＤＴＡを
加え、６５℃で５分間でアガロースを溶解後、フェノー
ル抽出、フエノール−クロロホルム（１：１）抽出及び
クロロホルム抽出を順次行ない、エタノール沈澱にてＤ
ＮＡを回収した。

【０１５９】次にオリゴ（ｄＡ）セルロースカラムクロ
マトグラフィーでベクタープライマーＤＮＡの精製を行
なった。上記ＤＮＡを１０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ
７．３）−１ｍＭＥＤＴＡ−１ＭＮａＣｌ緩衝液１ｍｌ
に溶かし、氷冷した後、同緩衝液で平衡化したカラムに
載せ、同緩衝液１ｍｌで洗浄後、室温に戻して、１０ｍ
Ｍトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．３）−１ｍＭＥＤＴＡで、
ＤＮＡを溶出した。溶出のピーク画分を集め、エタノー
ル沈澱にてＤＮＡを回収後、１０ｍＭトリス・ＨＣｌ
（ｐＨ７．３）−１ｍＭＥＤＴＡ１００μｌに溶かし、
４℃で保存した。

【０１６０】リンカーＤＮＡを次の通り調製した。即
ち、ｐＢＲ３２２−ＳＶ４０（０．１９〜０．３２）Ｄ
ＮＡ１００μｇを、ＰｓｔＩ（ＮＥＢ）１２０単位で、
３７℃下、１．５時間消化後、反応を停止させ、フェノ
ール−クロロホルム抽出、エタノール沈澱を行なった。
ＤＮＡを回収し、１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３
０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１ｍＭＣｏＣｌ
₂、０．１ｍＭＤＴＴ、０．２５ｍＭｄＧＴＰ（１μＣ
ｉのα−³²Ｐ−ｄＧＴＰを含む〉５０μｌに溶解し、Ｔ
Ｔａｓｅ ６０単位を２０分間作用させた。この結果、
１８残基のｄＧ鎖が付加された。反応停止後、ＤＮＡを
回収し、ＨｉｎｄIII（宝酒造）５０単位で消化し、前
記したようにアガロース（１．８％）電気泳動で約０．
２８ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、２．３μｇのリンカー
ＤＮＡを得た。

【０１６１】（３−２）ｃＤＮＡの合成とｃＤＮＡライ
ブラリーの作製 ＲＮＡ５μｇを減圧乾燥した後、５ｍＭトリス・ＨＣｌ
（ｐＨ８．３）１０μｌに溶解し、６５℃で５分間加熱
した。直ちに３７℃に移し、反応混合液２０μl（５０
ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、８ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂、３０ｍＭＫＣｌ、０．３ｍＭＤＴＴ、２ｍＭｄＮ
ＴＰ、１０μＣｉα−³²Ｐ−ｄＣＴＰ）を加え、５分間
３７℃にて保温した。

【０１６２】ＲＴａｓｅ（リバーストランスクリプター
ゼ、生化学工業社製）１０単位を加え、３７℃で１５分
間反応させた後、再度ＲＴａｓｅ １０単位を加え、更
に１５分間保温した。０．２５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）２μｌと１０％ＳＤＳ１μlとを加えて反応を停止
させた後、フェノール−クロロホルム抽出を行ない、４
Ｍ酢酸アンモニウム２０μlとエタノール８０μlとを加
え、１５分間−７０℃で凍らせた後、室温で融解し、１
５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心し、沈澱させた。
沈澱を１０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．３）２０μl
に溶かし、４Ｍ酢酸アンモニウム１９μlとエタノール
８０μlとを加え、再沈澱させた。

【０１６３】沈澱を回収し、７０％エタノールで洗った
後、１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリス
・ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１ｍＭＣｏＣｌ₂、０．１ｍ
ＭＤＴＴ、０．２μｇポリＡ及び６６μＭ〔α−³²Ｐ〕
ｄＣＴＰ（１０μＣｉ）の１５μｌに溶解した。ＴＴａ
ｓｅ（Ｐ．Ｌ．）１８単位を加え、３７℃で５分間反応
させた後、０℃に急冷し、０．２５ＭＥＤＴＡ１．３μ
lと１０％ＳＤＳ０．６５μlとで反応を停止させ、フェ
ノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈澱を行なっ
た。

【０１６４】沈澱を遠心して回収後、ＨｉｎｄIII（宝
酒造）４単位で３７℃で２時間消化し、反応停止後、フ
エノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈澱を行な
った。沈澱を回収後、１０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ
７．３）及び１ｍＭＥＤＴＡの１０μｌに溶かし、エタ
ノール３μlを加え、−２０℃で保存した。

【０１６５】上記で得た試料１μlをリンカーＤＮＡ５
ｎｇと共に、１０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−
１ｍＭＥＤＴＡ−０．１ＭＮａＣｌ １０μl中で、６５
℃で２分間、次いで４２℃で３０分間保温した後、０℃
に冷却した。これに２０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、４ｍＭ ＭｇＣｌ_2,１０ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ
_4,０．１Ｍ ＫＣｌ、０．１ｍＭ β−ＮＡＤ、−５０μ
ｇ／ｍｌＢＳＡ及び６単位／ｍｌエシエリヒア コリー
ＤＮＡリガーゼの混合溶液を９０μl加え、全液量を１
００μlとし、１２℃で一夜保存した。

【０１６６】次いで１０ｍＭｄＮＴＰ０．５μl、１０
ｍＭ ＮＡＤ ０．５６μl、Ｅ．コリーＤＮＡポリメラ
ーゼＩ（ベーリンガーマンハイム社製）０．５μｌ及び
ＲＮａｓｅＨ（ＰＬ）０．２μｌを加え、１２℃及び２
５℃で順次１時間ずつ保温した後、−２０℃で凍結保存
した。

【０１６７】エシェリヒア コリーＨＢ１０１株を、Ｌ
Ｂ培地（バクト−トリプトン１０ｇ、バクト−イースト
抽出物５ｇ及びＮａＣｌ １０ｇ／ｌ）にて、ＯＤ₅₅₀
＝０．４５まで培養し、５分間氷冷後、４℃で８０００
ｒｐｍで５分間遠心して菌体を回収した。菌体のペレッ
トを氷冷した３０ｍＭ酢酸カリウム、１００ｍＭ Ｒｂ
Ｃｌ、１０ｍＭＣａＣｌ₂、５０ｍＭ ＭｎＣｌ₂、１５
％グリセリンに懸濁させ、０℃で５分間保ち、４℃、８
０００ｒｐｍ、５分間遠心し、得られた菌体を、１０ｍ
ＭＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホニツクアシッ
ド）、７５ｍＭＣａＣｌ₂、１０ｍＭ ＲｂＣｌ、１５％
グリセリンに再度懸濁させ、０℃にて１５分間保温し
て、コンピテント細胞を作製した。かくして得られたコ
ンピテント細胞は、その後−７０℃で保存した．凍結菌
液を室温で融解し、４００μｌの菌液に対して上記ＤＮ
Ａ試料２０μｌを加え、３０分間０℃に放置した後、４
２℃で９０秒間熱ショックを与え、再び０℃で１〜２分
間静置した。これにＬＢ培地２ｍｌを加え、３７℃で３
０分間保温し、５０容のＬＢ培地に植菌し、３７℃で６
時間培養した後、５０μｇ／ｍｌになるようにアンピシ
リンを加え、更に一夜培養し、ｃＤＮＡライブラリーを
作製した。このｃＤＮＡライブラリーは、５０％グリセ
リン中で−２０℃にて保存した。

【０１６８】（３−３）合成プローブの作製 前記で決定された天然型ＧＩＦのアミノ酸配列（Ｎ末端
より２０残基）より、下記核酸配列を導いた。

【０１６９】 Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ− ５’ＧＣＣ ＣＣＣ ＧＴＧ ＡＧＧ ＴＣＣ ＣＴＧ ＡＡＣ ＴＧＣ ３’ＣＧＧ ＧＧＧ ＣＡＣ ＴＣＣ ＡＧＧ ＧＡＣ ＴＴＧ ＡＣＧ Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ− ＡＣＣ ＣＴＧ ＡＧＧ ＧＡＣ ＴＣＣ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＴＧＧ ＧＡＣ ＴＣＣ ＣＴＧ ＡＧＧ ＧＴＣ ＧＴＣ ＴＴＣ Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ ＴＣＣ ＣＴＧ ＧＴＧ ＡＴＧ−３’ ＡＧＧ ＧＡＣ ＣＡＣ ＴＡＣ−５’ 上記塩基配列は、ヒトコドン使用頻度（ヌクレイツク
アシッド リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ，９，ｒ４３−７４（１９８１））より決定
した。

【０１７０】上記式に示した塩基配列に対する相補的な
塩基配列（最下段に示す）を、ＧＩＦをコードするｃＤ
ＮＡを有する形質転換株の選出のためのプローブとして
利用するため、以下の方法により合成した。即ち、Ｎ，
Ｎ−ジアルキルメチルホスホロアミダイト誘導体を縮合
ユニットとして用いた、固相ホスフアイト トリエステ
ル法（Ｎａｔｕｒｅ，３１０，１０５（１９８４））に
て、自動合成機（３８０Ａ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚ
ｅｒ，Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎ
ｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ
９４４０４，ＵＳＡ）を用いて、目的とする完全保護
ＤＮＡを合成した。続いて該完全保護ＤＮＡを２８％ア
ンモニア水で５５℃で１０時間処理することにより、
５’末端のＯＨ基に結合している保護基としてのＤＭＴ
ｒ（ジメトキシトリチル）基以外の保護基（Ａ、Ｇ、Ｃ
のアミノ基のアシル基をさす）を脱保護させ、部分保護
ＤＮＡ（ＤＭＴｒ体）を得た。次いでこのＤＭＴｒ体を
Ｃ₁₈を担体とする逆相ＨＰＬＣにより精製した後、８０
％酢酸で室温で１０分間処理して上記ＤＭＴｒ基を脱離
させ、続いて得られる塩基を、７Ｍ尿素を含む１０％ポ
リアクリルアミトゲル電気泳動及びバイオ−ゲルＰ−３
０（バイオ−ラド社）により精製して、目的のＤＮＡ
（６０ｍｅｒ）を得た。

【０１７１】上記で得たＤＮＡ６μｇを、５０μｌの反
応溶液（５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１０
ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、０．２ｍｇ／ｍｌ子牛胸腺ＤＮＡ、５０μＣｉ〔α
−³²Ｐ〕−ＡＴＰ）中で、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼ（宝酒造）１２単位と、３７℃にて１時間反応させ、
ＤＮＡの５’末端をラベルした。ラペルされたＤＮＡと
未反応の³²Ｐを分別するために、バイオゲルＰ−３０
（バイオ−ラド社）によるカラムクロマトグラフィーを
行なった。ラベルされたＤＮＡ画分を１／９容の３Ｍ酢
酸ナトリウムと２．５容のエタノールにて沈澱させ、遠
心して、回収後、１０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）−１ｍＭＥＤＴＡ ４００μｌに溶解し、−２０℃
で保存した。

【０１７２】得られたプローブの比活性は１０⁷ｃｐｍ
／μｇ ＤＮＡ以上であった。

【０１７３】（３−４）ｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニング アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地上に径
８０ｍｍのニトロセルロースフィルター（ミリポアＨＡ
ＩＦ０８２５０）を置き、この上にフィルター当り５０
００コロニーになるように希釈した前記ｃＤＮＡライブ
ラリー菌液を播き、３７℃にて一夜培養した。フィルタ
ーは、合計２４枚を作製した。

【０１７４】コロニーの出現したフィルターに新しいニ
トロセルロースフィルターを載せることによって、レプ
リカフィルターを作製した。元のフィルター（マスター
フィルター）を、４℃にて保存し、レプリカフィルター
を、上記した寒天培地上で３７℃で６時間培養後、クロ
ラムフェニコール２００μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地
上に移し替え、３７℃で一夜培養した。

【０１７５】フィルターを、０．５Ｎ ＮａＯＨ、１Ｍ
トリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）及び１Ｍトリス・ＨＣｌ
（ｐＨ８．０）−１．５Ｍ ＮａＣｌの順で処理し、風
乾後、８０℃真空下で２時間ベーキングを行なった。

【０１７６】べーキング済みのフィルターを、１．２Ｍ
ＮａＣｌ、０．１２Ｍクエン酸３ナトリウム、１０ｍ
ｇ／ｍｌフイコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、１０ｍｇ／ｍｌ
ポリビニルピロリジン、１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．
１％ＳＤＳ及び０．１ｍｇ／ｍｌサルモン スペラム
（Ｓａｌｍｏｎ Ｓｐｅｒｍ）ＤＮＡの２０ｍｌ中で軽
く振とうしながら、６８℃にて一夜保温した。溶液を
１．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１２Ｍクエン酸３ナトリウ
ム、１０ｍｇ／ｍｌフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、１０
ｍｇ／ｍｌポリビニルピロリジン、１０ｍｇ／ｍｌＢＳ
Ａ、０．１％ＳＤＳ及び１０⁶ｃｐｍ／ｍｌプローブに
替え、４２℃で一昼夜軽く振とうし、ハイブリダイゼー
ションを行なった。

【０１７７】ハイブリダイゼーションの終わったフィル
ターを取り出し、１．２Ｍ ＮａＣｌ、０．１２Ｍクエ
ン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳにて室温で３回洗浄
し、その後、６０℃で同溶液にてフィルターのバックグ
ラウンドのカウントがＧＭサーベイメーターで２００ｃ
ｐｍになるまで洗浄した。フィルターを風乾後、増感紙
を用いてＸ線フイルム（フジＲＸ）に−７０℃にて２日
間オートラジオグラムを行なった。

【０１７８】フイルムを現像後、シグナル領域に存在す
るコロニーをマスターフィルターよりかき取り、上記の
方法を繰返してポジティブシグナルを有するコロニーの
単離を行なった。

【０１７９】その結果、強いシグナルを有するクローン
Ｉ−２を単離した。

【０１８０】（３−５）クローンの解析 クローンＩ−２の有するプラスミドｐＧＩＦ−αのｃＤ
ＮＡの制限酵素地図を作製した。その結果を図１４に示
す。

【０１８１】図１４より、ｃＤＮＡ中には、ＮｃｏＩ
（日本ジーン）、ＨｉｎｄIII（日本ジーン）、ＰｖｕI
I（日本ジーン）及びＡｃｃＩ（日本ジーン）により切
断される個所がそれぞれ１個所ずつ存在し、５’末端よ
りその順序で之等制限酵素による切断個所が存在してい
ることが確認された。また、ｃＤＮＡの長さは、約１．
５ｋｂであり、分子量約１８ＫのＧＩＦを充分にコード
できる長さであることが確認された。次に、ｐＧＩＦ−
αのｃＤＮＡの塩基配列を、マキサムーギルバートの化
学修飾法〔Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．６５，４９９−５６
０（１９８０）〕及びＭ１３ファージを用いるジデオキ
シヌクレオチド鎖終結法〔ＭｅｓｓｉｎｇＪ．ａｎｄ
Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６
（１９８２）〕にて決定した。その結果を、下記式に示
す。

【０１８２】 ＣＴＴＡＴＴＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡＣＴＴＧＴＴ ＣＴＴＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＣＴＡＡＡＣＡＧＡＴＧＡＡＧ Ｍet Ｌys ＴＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴＣＴＧ Ｃys Ｓer Ｐhe Ｇln Ａsp Ｌeu Ａsp Ｌeu Ｃys Ｐro Ｌeu ＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＴＣＣＡＧＣＴＡＣＧＡＣＴＣＴＣＣＧＡＣＣＡＣ Ａsp Ｇly Ｇly Ｉle Ｇln Ｌeu Ａrg Ｉle Ｓer Ａsp Ｈis ＣＡＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣＧＣＧＴＣＡ Ｈis Ｔyr Ｓer Ｌys Ｇly Ｐhe Ａrg Ｇln Ａla Ａla Ｓer ＧＴＴＧＴＴＧＴＧＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧ Ｖal Ｖal Ｖal Ａla Ｍet Ａsp Ｌys Ｌeu Ａrg Ｌys Ｍet ＣＴＧＧＴＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＣＡＧＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＡＡＴ Ｌeu Ｖal Ｐro Ｃys Ｐro Ｇln Ｔhr Ｐhe Ｇln Ｇlu Ａsn ＧＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡ Ａsp Ｌeu Ｓer Ｔhr Ｐhe Ｐhe Ｐro Ｐhe Ｉle Ｐhe Ｇlu ＧＡＡＧＡＡＣＣＴＡＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＡＣＡＴＧＧＧＡＴＡＡＣ Ｇlu Ｇlu Ｐro Ｉle Ｐhe Ｐhe Ａsp Ｔhr Ｔrp Ａsp Ａsn ＧＡＧＧＣＴＴＡＴＧＴＧＣＡＣＧＡＴＧＣＡＣＣＴＧＴＡＣＧＡＴＣＡ Ｇlu Ａla Ｔyr Ｖal Ｈis Ａsp Ａla Ｐro Ｖal Ａrg Ｓer ＣＴＧＡＡＣＴＧＣＡＣＧＣＴＣＣＧＧＧＡＣＴＣＡＣＡＧＣＡＡＡＡＡＬeu Ａsn Ｃys Ｔhr Ｌeu Ａrg Ａsp Ｓer Ｇln Ｇln Ｌys ＡＧＣＴＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＴＧＧＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＣＴＧＡＡＡＳer Ｌeu Ｖal Ｍet Ｓer Ｇly Ｐro Ｔyr Ｇlu Ｌeu Ｌys ＧＣＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡ Ａla Ｌeu Ｈis Ｌeu Ｇln Ｇly Ｇln Ａsp Ｍet Ｇlu Ｇlu ＣＡＡＧＴＧＧＴＧＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＣＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＧＡ Ｇln Ｖal Ｖal Ｐhe Ｓer Ｍet Ｓer Ｐhe Ｖal Ｇln Ｇly ＧＡＡＧＡＡＡＧＴＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＴＡＣＣＴＧＴＧＧＣＣＴＴＧ Ｇlu Ｇlu Ｓer Ａsn Ａsp Ｌys Ｉle Ｐro Ｖal Ａla Ｌeu ＧＧＣＣＴＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣ Ｇly Ｌeu Ｌys Ｇlu Ｌys Ａsn Ｌeu Ｔyr Ｌeu Ｓer Ｃys ＧＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡＡＧＣＣＣＡＣＴＣＴＡＣＡＧＣＴＧ Ｖal Ｌeu Ｌys Ａsp Ａsp Ｌys Ｐro Ｔhr Ｌeu Ｇln Ｌeu ＧＡＧＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧ Ｇlu Ｓer Ｖal Ａsp Ｐro Ｌys Ａsn Ｔyr Ｐro Ｌys Ｌys ＡＡＧＡＴＧＧＡＡＡＡＧＣＧＡＴＴＴＧＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＧＡＴＡ Ｌys Ｍet Ｇlu Ｌys Ａrg Ｐhe Ｖal Ｐhe Ａsn Ｌys Ｉle ＧＡＡＡＴＣＡＡＴＡＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＴＴＴＧＡＧＴＣＴＧＣＣ Ｇlu Ｉle Ａsn Ａsn Ｌys Ｌeu Ｇlu Ｐhe Ｇlu Ｓer Ａla ＣＡＧＴＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＴＣＴＣＡＡ Ｇln Ｐhe Ｐro Ａsn Ｔrp Ｔyr Ｉle Ｓer Ｔhr Ｓer Ｇln ＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＴＧＣＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＧＡＧＧＧＡＣＣ Ａla Ｇlu Ａsn Ｍet Ｐro Ｖal Ｐhe Ｌeu Ｇly Ｇly Ｔhr ＡＡＡＧＧＣＧＧＣＣＡＧＧＡＴＡＴＡＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧ Ｌys Ｇly Ｇly Ｇln Ａsp Ｉle Ｔhr Ａsp Ｐhe Ｔhr Ｍet ＣＡＡＴＴＴＧＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＡＡＧＡＧＡＧＣＴＧＴＡＣＣＣＡ Ｇln Ｐhe Ｖal Ｓer Ｓer ＧＡＧＡＧＴＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＡＴＧＴＧＧＡＣＴＣＡＡＴＣＣＣＴ ＡＧＧＧＣＴＧＧＣＡＧＡＡＡＧＧＧＡＡＣＡＧＡＡＧＧＴＴＴＴＴＧＡ ＧＴＡＣＧＧＣＴＡＴＡＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＴＣＣＴＧＴＴＧＴＣＴＡ ＣＡＣＣＡＡＴＧＣＣＣＡＡＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＴＡＧＧＧＴＡＧＴＧ ＣＴＡＡＧＡＣＧＡＴＣＴＣＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＣＡＧＧＡＣＡＧ ＴＣＡＧＣＴＣＴＣＴＣＣＴＴＴＣＡＧＧＧＣＣＡＡＴＣＣＣＡＧＣＣＣ ＴＴＴＴＧＴＴＧＡＧＣＣＡＧＧＣＣＴＣＴＣＴＣＴＣＡＣＣＴＣＴＣＣ ＴＡＣＴＣＡＣＴＴＡＡＡＧＣＣＣＧＣＣＴＧＡＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧ ＣＣＡＣＡＴＴＴＴＧＧＴＴＣＴＡＡＧＡＡＡＣＣＣＴＣＣＴＣＴＧＴＣ ＡＴＴＣＧＣＴＣＣＣＡＣＡＴＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣＣＧＣＴＴＣ ＣＣＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＴＧ ＡＴＴＣＡＴＴＧＧＴＣＴＡＡＴＴＴＡＴＴＣＡＡＡＧＧＧＧＧＣＡＡＧ ＡＡＧＴＡＧＣＡＧＴＧＴＣＴＧＴＡＡＡＡＧＡＧＣＣＴＡＣＴＴＴＴＴ ＡＴＴＡＧＣＴＡＴＧＧＡＡＴＣＡＡＴＴＣＡＡＴＴＴＧＧＡＣＴＧＧＴ ＧＴＧＣＴＣＴＣＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＧＴＣＣＴＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡ ＣＴＧＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＧＣＴＣＡＧＡＴＴＡＴＴＴＡＡＡＴＧＧ ＧＡＡＴＡＴＴＴＡＴＡＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＴＡＴＣＡＴＡＣＴＧＴＴ ＣＡＡＴＧＧＴＴＣＴＣＡＡＡＴＡＡＡＣＴＴＣＡＣＴＡＡＡＡＡＡＡＡ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ 上記図より、合成プローブと相補的な領域が５’末端よ
り３１２番目〜３７１番目に存在（図に下線を付して示
す）し、ヒトコドン使用頻度から導いた塩基配列に７５
％の相同性を示した。また、ｐＧＩＦ−αのｃＤＮＡ中
の最長のリーデイングフレーム（ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒ
ａｍｅ）を検索したところ、５’末端より５７番目から
７７１番目の領域であり、そのコドンのフレームによる
３１２番目〜３７１番目の塩基配列に対応するアミノ酸
配列は、天然型ＧＩＦのＮ端２０−アミノ酸と完全に同
一であった。このことは、ｐＧＩＦ−αのｃＤＮＡがＧ
ＩＦ前駆蛋白質をコードするｃＤＮＡであることを示し
ている。

【０１８３】上記塩基配列より、天然型ＧＩＦは３１２
番〜７７１番の塩基配列にコードされており、１５３ア
ミノ酸より構成されていると同定される。

【０１８４】この結果は、前述した天然型ＧＩＦの物性
（分子量、Ｎ末端アミノ酸配列及び構成アミノ酸組成
比）の結果に一致した。

【０１８５】以上の結果より、決定された天然型ＧＩＦ
の蛋白一次構造を下記に示す。

【０１８６】 Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser実施例２ （Ｉ）組換えＧＩＦ（ｒ−ＧＩＦ）の製造 上記実施例１（II）の（３−５）で得たクローンＩ−２
の有するプラスミドｐＧＩＦ−αを、制限酵素ＨｇｉＡ
Ｉ（ＮＥＢ）及びＡｃｃＩ（日本ジーン）で切断してポ
リペプチドＩをコードする遺伝子５８１ベースペアーズ
（ｂｐ）を切り出し、その５’末端及び３’末端をヌク
レエース マングビーン（Ｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｍｕｎｇ
Ｂｅａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐ−Ｌ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）で削った。このフラグメントをＭ１３
ファージＲＦｍｐ１０のＳｍａＩサイトにクローニング
し、エシエリヒア コリーＪＭ１０５に感染させて培養
し、シングルストランド（ＳＳ）−ＤＮＡを得た。

【０１８７】次に得られたＳＳ−ＤＮＡにＭ１３ユニバ
ーサルプライマー及びデオキシＮＴＰｓ（宝酒造）の存
在下で、ＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフラグメン
ト）（ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ、Ｋｌｅｎｏｗ
Ｆｒａｇｍｅｎｔ，宝酒造）を働かせてダブルストラン
ド（ｄｓ）−ＤＮＡを合成し、続いて制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ及びＢａｍＨＩ（日本ジーン）で切断して目的の制限
酵素サイトをもつＤＮＡフラグメントを得た。

【０１８８】このフラグメントをエクスプレッションベ
クターｐＩＮIIIＡ−３（バイオ テクノロジー（Ｂｉｏ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ｖｏｌ．２，８１−８５
（１９８４）〕のＥｃｏ ＲＩ及びＢａｍＨＩサイトに
挿入して、所望のプラスミドｐＩＮIIIｆ−ＧＩＦ−α
を得た。

【０１８９】以上の概略を図１５に示す。

【０１９０】上記で得たベクタープラスミドを、エシェ
リヒア コリーＨＢ１０１にトランスフォームさせて、
所望の形質転換体を得た。

【０１９１】上記形質転換体をＬ−ブロス培地（アンピ
シリン５０μｇ／ｍｌを含む）で、３７℃で振とう培養
し、増殖がＯＤ₆₅₀ｎｍで０．２となった時、培地にイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴ
Ｇ）を最終濃度２ｍＭ加え、その添加の２時間、５時間
及び６．５時間後に培養液各１ｍｌをサンプリングし、
遠心分離（１００００ｒｐｍ，５分）し、菌体を集め、
ＥＤＴＡ−リゾチーム−トリトン×１００（最終濃度１
％，Ｔｒｉｔｏｎ×１００）１ｍｌで溶菌後、超音波処
理し、サンプルとし、その有するＧＩＦ活性を検討し
た。

【０１９２】対照としてベクタープラスミドｐＩＮIII
Ａ−３を用いて同様の方法で試験を行ない、ＧＩＦ活性
を調べた。

【０１９３】結果を下記表５に示す。

【０１９４】

【表５】 表５より、プラスミドｐＩＮIIIｆ−ＧＩＦ−αでトラ
ンスフォームさせた形質転換微生物の培養により目的と
するＧＩＦの製造を行い得ることが判る。

【０１９５】（II）ｒ−ＧＩＦの製造 下記オリゴデオキジヌクレオチド（Ｉ）及び（II）を以
下のようにして合成した。

【０１９６】 即ち、マクロポーラスシリカに結合した５’−Ｏ−ジメ
トキシトリチル及びＮ−保護デオキシヌクレオシド（ア
プライト バイオシステムズ社製）を出発原料とし、
３’側より５’側へ５’−Ｏ−ジメトキシトリチル及び
Ｎ−保護デオキシモノヌクレオシド−３’−ホスホアミ
ダイトを縮合単位として、自動合成機（アプライト バ
イオシステムズ社製、３８０Ａ ＤＮＡシンセサイザ
ー）を用いて順次、ヌクレオチド鎖を延長させた。続い
てチオフェノールを用いた処理による脱メチル化及び２
８％アンモニアを用いた室温での処理により、シリカよ
りヌクレオチドを脱離させ、完全保護オリゴヌクレオチ
ドを得た。以上の操作はすべて自動合成機を用いて行な
った（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ，３１
０，１０５（１９８４））。

【０１９７】次いで、得られた完全保護オリゴヌクレオ
チドを２８％アンモニア水２ｍｌで５５℃で１０時間処
理してＮ−保護基を脱離させ、５’−Ｏ−ジメトキシト
リチルオリゴヌクレオチドを得た。この１／５量を用い
て、ＯＤＳ（山村化学研究所社製）を担体とする逆相高
速液体クロマトグラフィーにより精製後、８０％酢酸１
５０μｌで室温で２０分間処理して粗オリゴヌクレオチ
ドを得た。これをＯＤＳを担体とする逆相高速液体クロ
マトグラフィーにより更に精製して、目的とするオリゴ
ヌクレオチドを得た。

【０１９８】前記実施例１の（II）の（３−５）で得た
プラスミドｐＧＩＦ−αを、制限酵素ＡｃｃＩ及びＣｌ
ａＩにより切断後、約１．２キロベースペアー（ｋｂ
ｐ）のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により単離
精製した。このＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラーゼＩ（ク
レノー断片）を用いて、制限酵素ＡｃｃＩ及びＣＩａＩ
切断部分を平滑末端とした。

【０１９９】一方ＢａｍＨＩリンカー（５’ ＣＧＧＡ
ＴＣＣＧ ３’）の５’末端をＴ４ポリヌクレオチドキ
ナーゼによりリン酸化し、これを先の平滑末端としたＤ
ＮＡ断片に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した後、
制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、更に制限酵素ＭｓｐＩで
切断し、得られた反応物をアガロースゲル電気泳動に付
して、約５４０ベースペア（ｂｐ）のＭｓｐＩ−Ｂａｍ
ＨＩ ＤＮＡ断片を単離精製した。

【０２００】次に上記で合成した合成オリゴデオキシヌ
クレオチド（Ｉ）及び（II）の各５’末端を、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼによりリン酸化し、上記で得たＭ
ｓｐＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片に、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて連結後、制限酵素Ｂａｍ ＨＩ及びＣｌａＩ
で切断し、得られた反応物をアガロースゲル電気泳動に
付して、約５８０ｂｐのＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ
断片を単離精製した。

【０２０１】他方、プラスミドｐＴＭＩ〔今本文男，代
謝，Ｖｏｌ．２２，２８９（１９８５）〕を、制限酵素
ＢａｍＨＩ及びＣｌａＩで切断後、アガロースゲル電気
泳動によりｔｒｐプロモーター領域を含む約４．４ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片を単離精製した。このＤＮＡ断片と、先
に調製した約５８０ｂｐのＣｌａＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮ
Ａ断片とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結して、所望のプ
ラスミドｐｔｒｐＧＩＦ−αを得た。

【０２０２】該プラスミドをエシェリヒア・コリ−ＨＢ
１０１にトランスフォームさせ、目的のトランスフォー
マントを、ボイリング法（ｂｏｉｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏ
ｄ）により得られるプラスミドＤＮＡの制限酵素分析に
より選択した〔Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ． Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐｐ３６６，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，
（１９８２）〕。

【０２０３】以上の概略を図１６に示す。

【０２０４】また、上記トランスフォーマントに組み込
まれたプラスミドｐｔｒｐＧＩＦ−αは、エシエリヒア
・コリ−χ１７７６にトランスフォームさせ、該形質転
換体を、Escherichia coliχ1776/ptrpGIF-αなる名称
で１９８５年１２月１２日に工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研条寄第９４９（ＦＥＲＭ ＢＰ−９４
９）として寄託されている。

【０２０５】上記形質転換体（エシェリヒア・コリ−Ｈ
Ｂ１０１／ｐｔｒｐＧＩＦ−α）を、アンピシリン５０
μｇ／ｍｌ及びＬ−トリプトファン２０μｇ／ｍｌを含
むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス及び
０．５％ＮａＣｌ）１０ｍｌ中で、３７℃で一晩振とう
培養し、この１ｍｌをアンピシリン５０μｇ／ｍｌ及び
１％カザミノ酸を含むＭ９最小培地（０．６％Ｎａ₂Ｈ
ＰＯ₄、０．３％、ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０５％ＮａＣｌ、
０．１％ＮＨ₄Ｃｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ₄、０．２％グル
コース及び０．１ｍＭ ＣａＣｌ₂）５０ｍｌに植菌し、
３７℃で振とう培養し、５５０ｍμでの吸光度（Ｏ．
Ｄ．）が１．０となった時点で菌体を集め、１５％シュ
ークロース−５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）−
５０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液５ｍｌに懸濁さ
せ、１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム（１０ｍＭトリス・ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．０）で溶解した溶液）５００μｌを加え、
更に０．３％トリトンＸ１００−１８７．５ｍＭＥＤＴ
Ａ（ｐＨ８．０）−１５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ
８．０）の溶液５ｍｌを加え、室温で１５分間放置後、
更によく懸濁させ、遠心分離によって菌体抽出物上清を
得た。

【０２０６】この菌体抽出物上清につきＧＩＦ活性の測
走を行なった結果は表６に示す通りであり、培養物１ｍ
ｌ当り２×１０⁶単位の活性が認められた。

【０２０７】

【表６】 上記で得た菌体抽出物上清を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５．５）で透析後、ジルソン ハイパーミュ
エーション リキッド クロマトグラフイー システム
（ジルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）社製）によるイオン交換ク
ロマトグラフィー（ＣＭ−ＨＰＬＣ）にかけた。その条
件は次の通りである。

【０２０８】カラム：ＩＥＸ−５３５ＣＭ（６．０×１
５０ｍｍ、東洋曹達社製） 溶離液Ａ：５０ｍＭ−酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５） 溶離液Ｂ：０．５Ｍ−ＮａＣｌ含有５０ｍＭ−酢醸ナト
リウム（ｐＨ５．５） 流速：０．５ｍｌ／分 フラクション容積： リテンションタイム ０〜６０ 分：２ml／４分／チューブ ６０〜１２０分：０．５ml／分／チューブ １２０〜１８０分：２ml／４分／チューブ 逆相高速液体クロマトグラフィー 上記ＣＭ−ＨＰＬＣで得たＧＩＦ活性画分（リテンショ
ンタイム９０〜９１分）を、次いで逆相高速液体クロマ
トグラフィーに付した。その条件は、次の通りである。

【０２０９】カラム：Ｃ₄ハイホ゜ア−逆相カラム(RP304)ハ゛イオ-ラ
ト゛社、直径4.6×250mm 溶離液：Ａ液＝０．１％ＴＦＡ、 Ｂ液＝アセトニトリル：１％ＴＦＡ（９：１） 流速：１ml／分 チャートスピード： リテンションタイム ０〜５０分：５分／ｃｍ ５０〜８０分：２分／ｃｍ フラクション容積：２ml／２分／チューブ リテンションタイムが６３．９〜６５．３分に、ＧＩＦ
活性に一致する単一の蛋白の吸光度ピークを示すｒ−Ｇ
ＩＦが得られた。その比活性は２．７×１０⁷単位／ｍ
ｇ蛋白であった。

【０２１０】尚、前記実施例１の（Ｉ）に示した天然型
ＧＩＦの逆相高速液体クロマトグラフィーの分析結果
（図３）によれば、該天然型ＧＩＦ活性はＬＡＦ活性と
は一致しないもののＬＡＦ活性は極めてブロードに観察
されＧＩＦ活性画分にも認められることから、上記で得
たｒ−ＧＩＦについて再度これがＬＡＦ活性を有するか
否かを試験したところ、該ｒ−ＧＩＦはＬＡＦ活性を有
することが確認された。

【０２１１】ＳＤＳポリアクリルアミトゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．の方法〔Ｎａｔｕｒｅ，２７
７，６８０（１９７０）〕に従い、上記（II）で得たｒ
−ＧＩＦのＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。その条件は次
の通りである。

【０２１２】試料：上記逆相高速液体クロマトグラフィ
ーにおけるＧＩＦ活性画分を乾固した後、ラエメリーの
サンプル バッファー〔１／２０体積の２−メルカプト
エタノールを含む（２ＭＥ⁺）又は含まない（２ＭＥ
‐）〕に溶解し、１００℃で４分間処理した。

【０２１３】ゲル：厚さ１．５ｍｍの１５％ポリアクリ
ルアミトゲルを使用した。

【０２１４】電気泳動装置：バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ）社製プロテアンを用いた。

【０２１５】泳動条件：４０ｍＡの定電流で２時間泳動
させた。

【０２１６】泳動後のゲルをバイオ−ラド社製シルバー
スタインキット（Ｓｉｌｖｅｒ ｓｔａｉｎ ｋｉｔ）
を用いて染色した。その結果を図１７（２ＭＥ⁺の場
合）及び図１８（２ＭＥ‐の場合）に示す。

【０２１７】各図において、レーン(1)は以下の分子量
マーカーの結果であり、レーン(2)〜(6)はいずれも上記
ＧＩＦ試料の結果であり、またレーン(7)は天然型ＧＩ
Ｆの結果である。但しレーン(2)では試料１１．７ｎｇ
を、レーン(3)では試料２３．３ｎｇを、レーン(4)では
試料４６．６ｎｇを、レーン(5)では試料７０ｎｇを、
またレーン(6)では試料１１７ｎｇを各々用いた。

【０２１８】＜レーン(1)における分子量マーカー＞ ９４Ｋ：フオスフオリラーゼ ｂ ６７Ｋ：アルブミン ４３Ｋ：オバルブミン ３０Ｋ：カルボニツク アンハイドラーゼ ２０．１Ｋ：トリプシン インヒビター １４．４Ｋ：α−ラクトアルブミン 上記結果より、ｒ−ＧＩＦは２ＭＥ⁺下においては約１
７Ｋの位置に、また２ＭＥ‐下においては約１７．５Ｋ
の位置にそれぞれ単一のバンドとして泳動されることが
判る。

【０２１９】等電点電気泳動法（ＩＥＦ） ｒ−ＧＩＦの等電点電気泳動を、ｐＨ範囲３．５〜９．
５のアンフォラインＰＡＧプレート（ＬＫＢ社製）及び
モデル１４１５（バイオ−ラド社製）を用いて行なっ
た。その条件は次の通りである。

【０２２０】試料：前記ｒ−ＧＩＦの製造（II）で得た
形質転換体を浸透圧ショックで壊した後の上清（１０ｍ
Ｍトリス・ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を、蒸留水で１００倍
希釈したもの１０μl利用した。

【０２２１】電極液：陽極液＝１Ｍ Ｈ₃ＰＯ₄ 陰極液＝１Ｍ ＮａＯＨ 泳動条件：定電力1W/cmゲル幅で90分間冷却下（10℃）
に泳動させた。

【０２２２】染色：染色は、シルバー スタイン キット
で行なった。

【０２２３】上記泳動後、ゲルを５ｍｍ又は２．５ｍｍ
間隔でスライスし、１０％ＦＣＳ加ＲＰＭＩ１６４０培
地１ｍｌにて振とう抽出（２日）し、ＧＩＦ活性の測定
に供した。等電点は、泳動後のｐＨの測定結果から算出
した。

【０２２４】ｒ−ＧＩＦの等電点（ｐＩ）は約６．５〜
６．９であり、この位置に単一のバンドとして泳動され
た。

【０２２５】ｒ−ＧＩＦのアミノ酸組成比 上記（II）の逆相高速液体クロマトグラフィーにより得
られたｒ−ＧＩＦの３０μlを、１２ｍｍ×１２０ｍｍ
のパイレックス製肉厚硬質試験管の底部に注意深く入
れ、水酸化ナトリウム粒を入れたデシケーターにて減圧
乾燥した。乾燥試料の入った試験管に４Ｎ−メタンスル
ホン酸〔０．２％の３−（２−アミノエチル）インドー
ル含有、ピース（Ｐｉｅｒｃｅ）社製〕５０μlを加
え、０．１〜０．２ｍｍＨｇで１分間脱気後、減圧封管
した。加水分解は１１８℃のヒーター中で２４時間を要
して行なった。開管後、４Ｎ−水酸化ナトリウム４６μ
lで中和し、希釈用クエン酸緩衝液で４５０μlとした。
アミノ酸分析は、アミノ酸アナライザー（日立製作所
製、日立８３５型分析計）を用い、上記試料溶液２５０
μlを注入して行なった。分離されたアミノ酸は、オル
トフタルアルデヒド法で検出した。また定量は、試料の
前後に分析した標準アミノ酸で作成した検量線によって
行なった。

【０２２６】その結果を、Ｐｈｅを基準（９モル）とし
て、各アミノ酸の含有モル比で下記表７に示す。尚、上
記分析条件下においては、Ｐｒｏ及びＣｙｓは測定でき
ない。またＳｅｒ、Ｔｈｒ及びＭｅｔについては、上記
分析条件下での回収率を（）内に示した。

【０２２７】

【表７】ア ミ ノ 酸 モ ル 比 Ａｓｐ及び／又はＡｓｎ １７．１ Ｓｅｒ １０．９（８０％） Ｔｈｒ ５．４（９０％） Ｇｌｕ及び／又はＧｌｎ ２３．８ Ｇｌｙ ８．３ Ａｌａ ５．０ Ｖａｌ １０．８ Ｍｅｔ ５．５（９０％） Ｉｌｅ ４．９ Ｌｅｕ １５．１ Ｔｙｒ ３．９ Ｐｈｅ （ ９ ） Ｌｙｓ １４．９ Ｈｉｓ ０．９ Ｔｒｐ ０．８ Ａｒｇ ３．０ｒ−ＧＩＦのアミノ酸配列 上記（II）の逆相高速液体クロマトグラフィーで得たｒ
−ＧＩＦの１５０μlを、アプライトバイオシステムズ
社製プロテインシークエンサーにて分析した。生じたＰ
ＴＨ−アミノ酸を、３３％アセトニトリル水溶液１００
〜５０μlにて適宜希釈し、その５μlをウォーターズ７
１０Ｂオートサンプラーにて注入した。クロマトグラフ
ィーのシステムは、ベックマン１１２型ポンプ２台を、
４２１型コントローラーで作働させた。カラムはウルト
ラスフェアーＯＤＳ−５μmの充填された２ｍｍ×２５
０ｍｍを用い、カラムヒーターにて５５℃に保つた。流
速は０．３ｍｌ／分とし、２０ｍＭ酢酸ナトリウムとア
セトニトリルとの混合液を用い、グラジエント溶出法で
分離し、２６９ｎｍでモニターした。分析は４５分とし
た。

【０２２８】２０サイクルの分析の結果、前記（II）で
得たｒ−ＧＩＦのＮ末端２０個のアミノ酸配列は、以下
のものであると認められた。

【０２２９】 Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ− Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ− Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ− 尚、ＡｒｇはＨＰＬＣ系を若干変更して別途確認した。
Ｓｅｒは副生物の一つで確認し、更に３２２ｎｍでの確
認も行なった。サイクル８では有意のピークが認められ
す、Ｃｙｓであると推定された。

【０２３０】上記結果から前記（II）で得たｒ−ＧＩＦ
は、ポリペプチドＩに一致するものと認められる。尚、
アミノ酸配列から計算されたｒ−ＧＩＦの分子量は、１
７３７６．５９である。

【０２３１】抗腫瘍活性試験(インビボ) 上記実施例２の(II)で得たｒ−ＧＩＦのインビボにおけ
る抗腫瘍活性試験を以下の通り行った。

【０２３２】（１）腫瘍細胞Ａ３７５の１００００００
細胞を、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの皮下に接種（ｓ．
ｃ．）した(第０日目)。次いで、第１０日目〜第１５日
目に、ｒ−ＧＩＦの１０万単位／体重を１日１回各々実
験動物の腫瘍細胞内に投与した。実験動物各６匹を１試
験群とした。対照(コントロール)群にはＰＢＳのみを同
様に投与した。

【０２３３】試験結果を図１９に示す。該図において横
軸は腫瘍細胞接種後日数(日)を、縦軸は腫瘍重量（ｇ）
を示し、曲線(１)は対照群を、曲線(２)はｒ−ＧＩＦ投
与群をそれぞれ示す。また腫瘍重量は、ＳＤ±平均(mea
n)で示されており、曲線(１)における＊はスチュデンツ
Ｔ−テストにおけるＰ＜０．０５を、＊＊は同テストに
おけるＰ＜０．０１を示す。

【０２３４】（２）腫瘍細胞MethＡの２０００００細胞
を、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに皮内接種（ｉ．ｄ．）
した(第０日目)。次いで、第７日目と第８日目に、ｒ−
ＧＩＦの１０万単位／体重を各１回実験動物の腫瘍細胞
内に投与した。実験動物各７匹を１試験群とした。対照
(コントロール)群にはＰＢＳのみを同様に投与した。

【０２３５】試験結果を図２０に示す。該図において横
軸は腫瘍細胞接種後日数(日)を、縦軸は腫瘍重量（ｇ）
を示し、曲線(１)は対照群を、曲線(２)はｒ−ＧＩＦ投
与群をそれぞれ示す。また腫瘍重量は、ＳＤ±平均(mea
n)で示されており、曲線(１)における＊＊はスチュデン
ツＴ−テストにおけるＰ＜０．０１を示す。

【０２３６】上記試験においては、ｒ−ＧＩＦ投与群実
験動物の５匹において腫瘍の退行が認められた。

【０２３７】実施例３ 実施例２で得られたプラスミドｐＧＩＦ−αを利用し
て、該実施例２と同様の操作を行うことにより所望のｒ
−ＧＩＦ、例えばポリペプチドII、III及びIVを製造で
きる。

【０２３８】例えば、ポリペプチドIVは、以下の方法に
より製造できる。即ち、先ずプラスミドｐＧＩＦ−αか
ら、ＨｇｉＡＩ−ＮｃｏＩ ＤＮＡフラグメント（約
０．１ｋｂｐ）及びＮｃｏＩ−ＳｔｕＩ ＤＮＡフラグ
メント（約０．８ｋｂｐ）の２つのフラグメントを単離
する。次いでポリペプチドIVのアミノ末端領域の４アミ
ノ酸コドンを有し、且つプラスミドｐＴＭＩのtrpプロ
モーターの下流に結合できるように構築した合成オリゴ
ヌクレオチドを、上記ＨｇｉＡＩ−ＮｃｏＩ ＤＮＡフ
ラグメントと連結させる。更にかくして得られたＤＮＡ
フラグメントと上記ＮｃｏＩ−ＳｔｕＩＤＮＡフラグメ
ントとを、順次、プラスミドベクターのtrpプロモータ
ーの下流に結合させる。

【０２３９】かくして、エシエリヒア・コリ−内で、tr
pプロモーターの制御下に、ポリペプチドIVを発現する
所望のプラスミドを構築する。

【０２４０】該プラスミドを、プラスミドｐｔｒｐＧＩ
Ｆ−αの代わりに利用して、実施例２と同一の操作を繰
り返すことにより、目的のポリペプチドIVを収得でき
る。

【０２４１】実施例４ ｐｔｒｐＧＩＦ−αを用いてサイト−スペシフィック
ミュータジエネシス（Ｓite −Ｓpecific Ｍutagenesi
s）〔Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.,８１，５６６２−５６
６６（１９８４）〕の方法に従いポリぺプチドＩのアミ
ノ末端から７１番目のＣｙｓをＳｅｒに変更したＧＩＦ
（⁷¹Ｓｅｒ−ｒ−ＧＩＦ）を以下の通り製造した。

【０２４２】即ち、Ｍ１３ｍｐ１１ファージベクター
を、１本鎖(ｓｓ)ＤＮＡ鋳型とした。プラスミドｐｔｒ
ｐＧＩＦ−αよりＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ ＤＮＡフラ
グメントを切り出し、Ｍ１３ｍｐ１１ファージのＥｃｏ
ＲＩとＢａｍＨＩの制限酵素サイトにクローニングし、
これから一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ（Ｍ１３ＧＩＦ−α）を
得、これをミュータジエネシスの鋳型として用いた。

【０２４３】合成オリゴヌクレオチド〔ＣＴＧＴＣＣＴ
ＣＡＧＴＧＴＴＧ（プライマー）〕を、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼでリン酸化し、これをｓｓＭ１３ＧＩＦ
−αＤＮＡとハイブリダイズし、アニーリング後、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ、クレノーフラグメント及びＴ４ＤＮ
Ａリガーゼで各々処理し、１５℃で１８時間インキュベ
ートした。

【０２４４】得られたＤＮＡをＪＭ１０５コンピテント
細胞にトランスフォームし、生じたファージプラーク
を、寒天プレート上に５０コロニー植菌し、３７℃で１
８時間培養した。生育したコロニーを含むフィルターを
通常の方法によりアルカリ変性し、乾燥後、８０℃で２
時間ベークした。上記ＤＮＡをプレハイブリダイズした
後、このものと、上記プライマーを³²Ｐ−ｒ−ＡＴＰで
ラベルした³²Ｐ−プローベとを、室温でハイブリダイズ
させた。ハイブリダイズさせたフィルターを、６×ｓｓ
ｃバッファーで、室温で１０分間、次いで３７℃で１０
分間各々洗浄し、乾燥後、−７０℃で１８時間オートラ
ジオグラフィーを行った。

【０２４５】変異した５クローンの内から代表としてＭ
１３−ＧＩＦ−α−７１ｓを選びこれをＪＭ１０５に感
染させて培養し、ｓｓＤＮＡ及びＲＦ ＤＮＡを調製し
た。

【０２４６】上記で得たｓｓＤＮＡのＭ１３デオキシヌ
クレオチド シークエンシングにより目的の遺伝子の変
異の確認を行った。

【０２４７】また上記ＲＦ ＤＮＡにおいて、新しくで
きた制限酵素ＤｄｅＩサイトも確認できた。

【０２４８】ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ ＤＮＡよ
り、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを調製し、こ
れを前記実施例２の（II）と同様にして発現プラスミド
に組込み、所望の⁷¹Ｓｅｒ−ｒ−ＧＩＦ−α発現プラス
ミド〔ｐｔｒｐＧＩＦ−α−７１Ｓ〕を得た。

【０２４９】このプラスミドを用いて、前記実施例２の
（II）と同様にして、菌体抽出物上清を得、該上清のＧ
ＩＦ活性を測定した。

【０２５０】結果を表８に示す。

【０２５１】

【表８】

【０２５２】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ： 配列の型：核酸 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 CTTATTACAG TGGCAATGAG GATGACTTGT TCTTTGAAGC TGATGGCCCT AAACAG ATG 59 Met -85 AAG TGC TCC TCC CAG GAC CTG GAC CTC TGC CCT CTG GAT GGC GGC ATC 107 Lys Cys Ser Phe Gln Asp Leu Asp Leu Cys Pro Leu Asp Gly Gly Ile -80 -75 -70 CAG CTA CGA CTC TCC GAC CAC CAC TAC AGC AAG GGC TTC AGG CAG GCC 155 Gln Leu Arg Ile Ser Asp His His Tyr Ser Lys Gly Phe Arg Gln Ala -65 -60 -55 GCG TCA GTT GTT GTG GCC ATG GAC AAG CTG AGG AAG ATG CTG GTT CCC 203 Ala Ser Val Val Val Ala Met Asp Lys Leu Arg Lys Met Leu Val Pro -50 -45 -40 TGC CCA CAG ACC TTC CAG GAG AAT GAC CTG AGC ACC TTC TTT CCC TTC 251 Cys Pro Gln Thr Phe Gln Glu Asn Asp Leu Ser Thr Phe Phe Pro Phe -35 -30 -25 ATC TTT GAA GAA GAA CCT ATC TTC TTC GAC ACA TGG GAT AAC GAG GCT 299 Ile Phe Glu Glu Glu Pro Ile Phe Phe Asp Thr Trp Asp Asn Glu Ala -20 -15 -10 -5 TAT GTG CAC GAT GCA CCT GTA CGA TCA CTG AAC TGC ACG CTC CGG GAC 347 Tyr Val His Asp Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp 1 5 10 TCA CAG CAA AAA AGC TTG GTG ATG TCT GGT CCA TAT GAA CTG AAA GCT 395 Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala 15 20 25 CTC CAC CTC CAG GGA CAG GAT ATG GAG CAA CAA GTG GTG TTC TCC ATG 443 Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Glu Gln Val Val Phe Ser Met 30 35 40 TCC TTT GTA CAA GGA GAA GAA AGT AAT GAC AAA ATA CCT GTG GCC TTG 491 Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu 45 50 55 60 GGC CTC AAG GAA AAG AAT CTG TAC CTG TCC TGC GTG TTG AAA GAT GAT 539 Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp 65 70 75 AAG CCC ACT CTA CAG CTG GAG AGT GTA GAT CCC AAA AAT TAC CCA AAG 557 Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys 80 85 90 AAG AAG ATG GAA AAG CGA TTT GTC TTC AAC AAG ATA GAA ATC AAT AAC 605 Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn 95 100 105 AAG CTG GAA TTT GAG TCT GCC CAG TTC CCC AAC TGG TAC ATC AGC ACC 653 Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr 110 115 120 TCT CAA GCA GAA AAC ATG CCC GTC TTC CTG GGA GGG ACC AAA GGC GGC 701 Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly 125 130 135 140 CAG GAT ATA ACT GAC TTC ACC ATG CAA TTT GTG TCT TCC TAAAGAGAGC 750 Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser 145 150 153 TGTACCCAGA GAGTCCTGTG CTGAATGTGG ACTCAATCCC TAGGGCTGGC AGAAAGGGAA 810 CAGAAGGTTT TTGAGTACGG CTATAGCCTG GACTTTCCTG TTGTCTACAC CAATGCCCAA 870 CTGCCTGCCT TAGGGTAGTG CTAAGACGAT CTCCTGTCCA TCAGCCAGGA CAGTCAGCTC 930 TCTCCTTTCA GGGCCAATCC CAGCCCTTTT GTTGAGCCAG GCCTCTCTCT CACCTCTCCT 990 ACTCACTTAA AGCCCGCCTG ACAGAAACCA GGCCACATTT TGGTTCTAAG AAACCCTCCT 1050 CTGTCATTCG CTCCCACATT CTGATGAGCA ACCGCTTCCC TATTTATTTA TTTATTTGTT 1110 TGTTTGTTTT GATTCATTGG TCTAATTTAT TCAAAGGGGG CAAGAAGTAG CAGTGTCTGT 1170 AAAAGAGCCT ACTTTTTATT AGCTATGGAA TCAATTCAAT TTGGACTGGT GTGCTCTCTT 1230 TAAATCAAGT CCTTTAATTA AGACTGAAAA TATATAAGCT CAGATTATTT AAATGGGAAT 1290 ATTTATAAAT GAGCAAATAT CATACTGTTC AATGGTTCTC AAATAAACTT CACTAAAAAA 1350 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 1374

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の(Ｉ)に示す天然型ＧＩＦのゲルクロ
マトグラフィー分析結果を示す。

【図２】同例のクロマトフォーカシング分析結果を示
す。

【図３】同例の逆相高速液体クロマトグラフィー分析結
果を示す。

【図４】実施例１の(II)に示す天然型ＧＩＦのゲルクロ
マトグラフィー分析結果を示す。

【図５】同例のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動の結果を
示す。

【図６】同例の等電点電気泳動の結果を示す。

【図７】上記等電点電気泳動によるＧＩＦ活性とｐＨと
の関係を示すグラフである。

【図８】同例の各種レクチンカラムに対する親和性を調
べたグラフである。

【図９】同例の各種希釈倍率におけるＧＩＦ活性を求め
たグラフである。

【図１０】同例の癌細胞に対するコロニー抑制試験の結
果を示すグラフである。

【図１１】同例の各種癌細胞に対する増殖抑制試験の結
果を示すグラフである。

【図１２】同例の各種癌細胞に対する増殖抑制試験の結
果を示すグラフである。

【図１３】同例に示す天然型ＧＩＦの培養時間と活性の
関係を示すグラフである。

【図１４】実施例２に用いるクローンＩ−２の有するプ
ラスミド−ｐＧＩＦ−αの制限酵素地図を示す。

【図１５】実施例２の（Ｉ）に従い上記ｐＧＩＦ−αを
ベクタープラスミドｐＩＮIIIＡ−３に組込んでプラス
ミドｐＩＮIIIｆ−ＧＩＦ−αを構築する概略図を示
す。

【図１６】実施例２の（II）に従い上記ｐＧＩＦ−αと
プラスミドｐＴＭＩとからプラスミドｐｔｒｐＧＩＦ−
αを構築する概略図を示す。

【図１７】実施例２の（II）で得られた組換えＧＩＦの
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動の結果を示す。

【図１８】実施例２の（II）で得られた組換えＧＩＦの
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動の結果を示す。

【図１９】実施例２の（II）で得られた組換えＧＩＦの
インビボにおける抗腫瘍活性を調べたグラフである。

【図２０】実施例２の（II）で得られた組換えＧＩＦの
インビボにおける抗腫瘍活性を調べたグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号 特願昭60−220882 (32)優先日 昭60(1985)10月３日 (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (72)発明者 洪 英満 鳴門市撫養町北浜字宮ノ東21−９ メゾン 北浜506号 (72)発明者 河合 一吉 鳴門市撫養町南浜字蛭子前東20−２新星ビ ル301号 (72)発明者 嶽肩 世津子 徳島市川内町加賀須野1090−18 (72)発明者 石井 清士 徳島県板野郡藍住町住吉字逆藤39−46 (72)発明者 柳原 康夫 徳島市川内町大松891−６ (72)発明者 平井 嘉勝 徳島県板野郡北島町新喜来字江古川５−49

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記アミノ酸配列をその構成蛋白質として
   含み、腫瘍細胞増殖抑制活性を有することを特徴とする
   均質な物質として単離された抗腫瘍活性物質ＧＩＦ。 Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Cys Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
2. 【請求項２】逆相高速液体クロマトグラフィーにおい
   て、ＧＩＦ活性に一致する単一のタンパクの吸光度ピー
   クを示し、２−メルカプトエタノール存在下のＳＤＳ−
   ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
   において、分子量１７Ｋ乃至１８Ｋの位置に単一バンド
   として泳動され、等電点電気泳動（ＩＥＦ）における等
   電点（ｐＩ）が約６．５乃至７．０２を示す特許請求の
   範囲第１項記載のＧＩＦ。
3. 【請求項３】下記アミノ酸配列をその構成蛋白質として
   含み、腫瘍細胞増殖抑制活性を有することを特徴とする
   抗腫瘍活性物質ＧＩＦをコードする遺伝子。 Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Ser Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser
4. 【請求項４】下記アミノ酸配列をその構成蛋白質として
   含み、腫瘍細胞増殖抑制活性を有することを特徴とする
   抗腫瘍活性物質ＧＩＦをコードする遺伝子 Ala Pro Val Arg Ser Leu Asn Cys Thr Leu Arg Asp Ser Gln Gln Lys Ser Leu Val Met Ser Gly Pro Tyr Glu Leu Lys Ala Leu His Leu Gln Gly Gln Asp Met Glu Gln Gln Val Val Phe Ser Met Ser Phe Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys Ile Pro Val Ala Leu Gly Leu Lys Glu Lys Asn Leu Tyr Leu Ser Ser Val Leu Lys Asp Asp Lys Pro Thr Leu Gln Leu Glu Ser Val Asp Pro Lys Asn Tyr Pro Lys Lys Lys Met Glu Lys Arg Phe Val Phe Asn Lys Ile Glu Ile Asn Asn Lys Leu Glu Phe Glu Ser Ala Gln Phe Pro Asn Trp Tyr Ile Ser Thr Ser Gln Ala Glu Asn Met Pro Val Phe Leu Gly Gly Thr Lys Gly Gly Gln Asp Ile Thr Asp Phe Thr Met Gln Phe Val Ser Ser で形質転換された宿主細胞を、該遺伝子の発現可能な条
   件下で培養し、産生するＧＩＦを回収することを特徴と
   するＧＩＦの製造方法。