JPS62142121A - 抗腫瘍活性物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、抗腫瘍活性物質、詳しくは腫瘍細胞に対して
特異的にその増殖を抑制する作用を有する物質、その製
造法、該物質を含む抗腫瘍剤及び該物質をコードする遺
伝子に関づる。

従　　来　　の　　技　　術 従来より、生体内には腫瘍細胞に直接動いて、その増殖
を選択的に抑制し、該腫瘍１１１胞を生体系より消去す
る作用を有する物質の存在することが知られている。之
等の抗腫瘍活性物質としては、例えばインターフェロン
（（ＦＮ）、リンフォトキシン（ＬＴ）　、ガン壊死因
子（ＴＮ　Ｆ　、　ＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏｔｉｚｉｎｇ
　　Ｆａｃｔｏｒ　）等が報告されている（Ｅｖａｎｓ
　　Ｃ，ｌ−１，、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍ＋ｕｎｏｌ。

Ｉ　ｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、　１２　、１８１　（１９８
２）　）　、之等の抗腫瘍活性物質は、腫瘍細胞の増殖
を抑制する作用を有するところから、抗ＩＩＩ瘍剤とし
て利用できると考えられ、またそれらに対応するとされ
る遺伝子構造が明らかにされつつあり、遺伝子工学的手
法によるそれらの生産も種々研究されつつある（Ｎａｔ
ｕｒｅ、Ｖｏｌ、３１２．２０／２７．　Ｉ）７２１　
（１９８４）；同Ｖｏ１．３１２．２０／２７、ｐ　７
２４　（１９８４）等）。

発明が解決しようとする問題点 本発明の目的は、上記報告された各種の抗腫瘍活性物質
とは、その性状、特性等を異にする新しい抗腫瘍活性物
質を提供することにある。

本発明の他の目的は、上記新規な抗腫瘍活性物質を、哺
乳動物由来の免疫担当細胞から製造する技術を提供する
ことにある。

本発明の他の目的は、上記抗腫瘍活性物質を、遺伝子工
学的手法により製造する技術を提供することにある。

本発明の他の目的は、上記抗腫瘍活性物質を含有する抗
腫瘍剤を提供することにある。

更に本発明の他の目的は、上記抗腫瘍活性物質を遺伝子
工学的手法により製造するための遺伝子、これを挿入し
た発現ベクター及び該ベクターを組込んだ組換え微生物
を提供することにある。

上記目的及びその他の本発明の特徴を、以下に詳述する
。

問題点を解決するための手段 本発明の抗腫瘍活性物質（以下ｒＧ　Ｉ　ＦＪという）
は、後記する実施例に記載した方法により測定される腫
瘍細胞増殖抑制活性（以下ｒＧＩＦ活性」という）を有
し、下記一般式（１）で表わされる一次構造のポリペプ
チドＡをその構成蛋白として含む点において特徴付けら
れる。

（ポリペプチドＡ）　　（一般式（１））％式％（］ ［１０ （式中、ＸはＣｙｓ又は３ｅｒを示ず。ＺはＨを示づか
又は下記アミノ酸配列 Ｍｅｔ　　ＬＶｓ　　Ｃｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　
Ｇｌｎ　　ＡＳＤ　　Ｌｅｕ　　ＡＳｐｌｅｕ　　Ｃｙ
ｓＰｒｏ　　ｌｅｕ　　ＡＳＩ）　　Ｇｌｙ　　ＧＩＶ
　　Ｉｌｅ　　（ｇｉｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ａｒ（ｌ　　
［Ｉｅ　　３ｃｒＡｓｐ　　　Ｈｉｓ　　　Ｈｉｓ　　
　Ｔｙｒ　　　Ｓｅｒ　　　Ｌｙｓ　　　Ｇｌｙ　　　
Ｐｈｅ　　　Ａｒｏ　　　Ｇｌｎ　　　ＡｌａＡｌａ　
　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　Ｖａｔ　　Ｖａｌ　　Ａｌａ　
　Ｍｅｔ　　Ａｓｐ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ａｒ０Ｌ
ｙｓ　　Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　ｃ
ｙｓ　　ｐｒｏ　　Ｇｌｎ　　Ｔｈｒ　　ｐｈｅ　　Ｑ
ｌｎＧｌｕ　　Ａｓｎ　　Ａｓｐ　　Ｌ　ｅｕ　　Ｓｅ
ｒ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈ
ｅ　　１ｉｅＰｈｃ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　
　Ｐｒｏ　　Ｉｌｅ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｐ　
　Ｔｈｒ　　ＴｒｐＡｓｐ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｕ　　Ａ
ｌａ　　Ｔｙｒ　　Ｖａｌ　　Ｈｉｓ　　Ａｓｐで示さ
れるペプチド又はそのＮ末端側からこの配列に従い１も
しくはそれ以上のアミノ酸を欠失するペプチド又はアミ
ノ酸を表わす。〕 本明細占においてペプチドにおけるアミノ酸の表示は、
ＩＵＰＡＣにより採択されているアミノ酸命名法におけ
る略号乃至当該分野で慣用されている略号によるアミノ
酸残基の表示法に従うものとし、塩基配列における核酸
の表示も同様とする。

本発明ＧＩＦは、その蛋白の一次構造が１５３個のアミ
ノ酸配列からなる下記ポリペプチドエ（上記式中ＸがＣ
ｙＳ及びＺが１−１のもの）をそのＵ本とするものであ
るが、該蛋白の一次構造は、上記ポリペプチド■のＮ末
端に上記Ｚで表わされるように１〜８５個のアミノ酸配
列から選択される任意のペプチド鎖又はアミノ酸（ＡＳ
ｏ−）を有するものであってもよい。上記蛋白の代表的
具体例としては、下記ポリペプチド■、■、■及びＩＶ
を例示できる。

〔ポリペプチドエ〕

Ａｌａ　　ｐｒｏ　　Ｖａｔ　　Ａｒｃ）　　Ｓｅｒ　
　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　Ｃｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　
　ＡｒａＡＳＩ）　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｎ　　
Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　ｌｅｕ　　Ｖａｔ　　Ｍｅｔ　　
Ｓｃｒ　　ＧｌｙＰｒＯＴｙｒ　　Ｇｌｕ　　Ｌｅｕ　
　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　ｌｅｕ　　ｌ−１ｉｓ　　ｌｅ
ｕ　　Ｇｌｎ　　ＧｌｙＧｌｎ　　Ａｓｐ　　Ｍｅｔ　
　Ｇｌｕ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｎ　　Ｖａｌ　　Ｖａｔ　
　Ｐｈｅ　　Ｓｃｒ　　ＭｅｔＳｅｒ　　Ｐｈｅ　　Ｖ
ａｌ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｓ
ｅｒ　　Ａｓｎ　　ＡＳＤ　　Ｌｙｓｌｌｅ　　Ｐｒｏ
　　Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ
　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｎ１ｅｕ　　
Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　３ｅｒ　　Ｃｙｓ　　Ｖａｔ　　
Ｌｅｕ　　ＬＶＳ　　ＡＳＩ）　　Ａｓｐ　　ＬｙｓＰ
ｒｏ　　Ｔｈｒ　　ｌｃｕ　　Ｑｌｎ　　１−ｅｕ　　
Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　ＡＳｐＰｒｏ　　Ｌｙ
ｓＡｓｎ　　Ｔｙｒ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　
　Ｌｙｓ　　Ｍｅｔ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　ＡｒｇＰ
ｈｃＶａｔ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ　　ＬＶＳ　　Ｉｌｅ
　　Ｇｌｕ　　Ｉｌｅ　　Ａｓｎ　　Ａｓｎ　　ＬＶＳ
　　ＬｅｕＧｌｕ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　
Ａｌａ　　Ｇｌｎ　　Ｐｈｅ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ　　
Ｔｒｐ　　Ｔｙｒｌｌｅ　　Ｓｃｒ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅ
ｒ　　Ｇｌｎ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　　Ｍｅ
ｔ　　Ｐｒｏ　　ＶａｌＰｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　
　Ｇｌｙ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　
　Ｇｌｎ　　Ａｓｐ　　ｌ１ｅＴｈｒ　Ａｓｐ　　Ｐｈ
ｅ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｎ　　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　　Ｓ
ｅｒ　Ｓｅａ〔ポリペプチド■〕 Ｍｅｔ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　Ｃｙｓ　　
Ｐｒｏ　　Ｇｌｎ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｎ　　
Ｇｌｕ△ｓｎ　　ＡＳｏ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈ
ｒ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　Ｉｌ
ｅ　　ＰｈｅＧｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｐｒｏ　
　Ｉｌｅ　　ＰＩ）ｅ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｐ　　Ｔｈｒ
　　Ｔｒｐ　　ＡｓｐＡＳｎ　　Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　
Ｔｌ／ｒ　　Ｖａｔ　　１−ＩＩｓ　　ＡＳＩ）　　Ａ
ｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　Ａｒｑ３ｅｒ　　ｌｃｕ
　　ＡＳｎ　　ｃｙｓ　　Ｔｈｒ　　ＬｅＬＩ　　Ａｒ
（Ｉ　　Ａｓｐ　　Ｓｅｒ　　Ｑｌｎ　　ＧｉｎＬｙＳ
　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｔｌ　　Ｖａｔ　　Ｍｅｔ　　Ｓｅ
ｒ　　ＧＩＶ　　Ｐｒｏ　　Ｔｙｒ　　Ｑｌｕ　　１−
ｅｕＬＶＳ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｈｉｓ　　ｌｅｕ
　　Ｑｌｎ　　Ｇｌ’／　　Ｇｌｎ　　Ａｓｐ　　Ｍｅ
ｔ　　ＱｌｕＧｌｎ　　Ｇｌｎ　　Ｖａｔ　　Ｖａｔ　
　Ｐｈｅ　　Ｓｅｒ　　Ｍｅｔ　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　
　Ｖａｌ　　ＧｌｎＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　
Ａｓｎ　Ａｓｐ　　Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ
　　ＡｌａＬｅｌｌ　　ＧＩＶ　　ＬＱＵ　　Ｌｙｓ　
　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　ＡＳｎ　　ＬＯｕ　　Ｔｙｒ　
　ｌｅｕ　　３ｅｒＣｙｓ　　Ｖａｌ　　ｌｅｕ　　Ｌ
ＶＳ　　ＡＳＤ　　ＡＳＤ　　Ｌｙｓ　　ｐｒｏ　　Ｔ
ｈｒ　　ｌｅｕ　　ＧｉｎＬｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ
　　Ｖａｌ　　ＡＳＤ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｎ
　　Ｔｙｒ　　Ｐｒｏ　　ＬＶＳＬｙｓ　　Ｌｙｓ　　
Ｍｅｔ　　ＧＩＬＩ　　ＬＶＳ　　Ａｒｑ　　Ｐｈｅ　
　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ　　ＬｙｓＩｌｅ　　Ｇ
ｌｕ　　Ｉｌｅ　　Ａｓｎ　　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ　　５ｅｒＡｌａ
　　Ｇｌｎ　　Ｐｈｅ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ　　Ｔｒｐ
　　Ｔｙｒ　　［ｌｅ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　５ｅｒ
Ｇｌｎ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　　Ｍｅｔ　　
ｐｒｏ　　ｖａｌ　　ｐｈｅ　　ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　
ＧＩＶＴｈｒ　　ＩＪｓ　　Ｇｌｌ／　　ＧＩＶ　　Ｇ
ｌｎ　　ＡＳＩ）　　ｌｉｅ　　Ｔｈｒ　　ＡＳｐＰｈ
ｅ　　ＴｈｒＭｅｔ　　Ｇｌｎ　　Ｐｈｅ　　Ｖａｌ　
　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ〔ポリペプチド■〕 Ｍｅｔ　　ＡＳＩＩ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ａｒ（］
　　ｉｙｓ　　Ｍ（！ｔ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　ｐｒ
ｏ　　ＣＶＳＰｒｏ　　Ｇｌｎ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　
　Ｇｌｎ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　　Ａｓｐ　　Ｌｃｕ　
　Ｓｅｒ　　ＴｈｒＰｈｅ　　Ｐｈｅ　　Ｐｒｏ　　Ｐ
ｈｅ　　Ｉｌｅ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｇ
ｌｕ　　Ｐｒｏ　　ｌ１ｅＰｈｅＰｈｅ　　Ａｓｐ　　
Ｔｈｒ　　Ｔｒｐ　　Ａｓｐ　　Ａｓｎ　　Ｇｌｕ　　
Ａｌａ　　Ｔｙｒ　　Ｖａｔｌ−１ｔｓ　　ＡＳＩ）　
　Ａｌａ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　Ａｒｇ　　３ｅｒ　
　ＬｅｌＪ　　ＡＳｎ　　ＣＶＳ　　ＴｈｒＬｅｕ　　
ＡｒＱ　　ＡＳｐＳｅｒ　　Ｑｌｎ　　Ｇｌｎ　　Ｌ　
ＶＳ　　Ｓｅｒ　　Ｌ　ｅｌｌ　　Ｖａｔ　　Ｍｅ［Ｓ
ｅｒ　　Ｇｌｙ　　Ｐｒｏ　　Ｔｙｒ　　ＧＩＵ　　ｌ
ｃｕ　　Ｌｙｓ　　Ａｌａ　　ｌｅｕ　　ｌ−１ｉｓ　
　１ｅｕＧｌｎ　　Ｑｌｙ　　Ｇｌｎ　　ＡＳｐＭｅｔ
　　ＧＩＬＩ　　Ｇｌｎ　　Ｇｌｎ　　Ｖａｌ　　Ｖａ
ｌ　　ＰｈｅＳｅｒ　　Ｍｅｔ　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　
　Ｖａｌ　　Ｇｉｎ　　ＧＩＶ　　ＧＩＵ　　ＧＩＬＩ
　　Ｓｅｒ　　ＡｓｎＡＳｐ１１／Ｓ　　Ｉｌｃ　　ｐ
ｒｏ　　Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｌ
ｃｕ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｕｉｙｓ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ
　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　３ｅｒ　　Ｃｙｓ　　Ｖａｌ
　　ｌｅｕ　　１−ｙｓ　　ＡＳｌｌＡＳｐＬｙｓ　　
Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｎ　　１−ｅｕ　
　Ｇｌｕ　　Ｓｃｒ　　Ｖａｔ　　ＡｓｐＰｒｏ　　Ｌ
ｙｓ　Ａｓｎ　　Ｔｙｒ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ｌｙ
ｓ　　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　　Ｇｌｕ　　ＬｙｓＡｒａ　　
Ｐｈｅ　　Ｖａｔ　　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ｉ
ｌｅ　　Ｇｌｕ　　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　ＡｓｎＬｙｓ　　
１−ｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　Ａ
ｌａ　　Ｇｌｎ　　Ｐｈｅ　　ｐｒｏ　ＡｓｎＴｒｐ　
　王ｙｒ　　ｌｉｅ　　Ｓｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　
　Ｇｌｎ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　　ＭｅｔＰ
ｒｏ　　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　Ｇｌ
ｙ　　Ｔｈｒ　　ｉｙｓ　Ｇｌｙ　ａｌｙ　ＧｌｎＡｓ
ｐ　　Ｉｌｅ　　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　　Ｐｈｃ　　Ｔｈｒ
　Ｍｅｔ　　Ｇｌｎ　　Ｐｈｅ　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒｅ
ｒ 〔ポリペプチドＩＶ） Ｍｅｔ　　Ｌｌ／Ｓ　　Ｃｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　
　Ｑｌｎ　　ＡＳＩ）　　Ｌｅｕ　　ＡＳＤ　　ｌｅｕ
　　ＣｙｓＰｒｏ　　ｌｅｕ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｙ　　
Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　　Ｇｌｎ　　Ｌｃｕ　　Ａｒａ　　
Ｉｌｅ　　５ｅｒＡＳＤ　　ｌ−１ｉｓ　　Ｈｉｓ　　
Ｔｙｒ　　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｐｈｅ　　
Ａｒａ　　Ｇｌｎ　　ＡｌａＡｌａ　　Ｓｅｒ　　Ｖａ
ｌ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｍｅｔ　　Ａｓ
ｐ　　Ｌｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ａｒ。

ｌｙｓ　　Ｍｅｔ　　ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　ｐｒｏ　　
ｃｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｑｌｎ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　
ＧｌｎＧｌｕ　　Ａｓｎ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅ
ｒ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈ
ｅ　　ｌ１ｅＰｈｅ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　
　Ｐｒｏ　　Ｉｌｅ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｐ　
　Ｔｈｒ　　ＴｒｐＡＳＤ　　ＡＳｎ　　Ｇｌｕ　　Ａ
ｌａ　　Ｔｙｒ　　ｖａｌ　　Ｈｉｓ　　Ａｓｐ　　Ａ
ｌａ　　ｐｒｏ　　ＶａｌＡｒｇ　　３ｅｒ　　１−ｅ
ｕ　　ＡＳｎ　　Ｃｙｓ　　Ｔｈｒ　　ｌｅｕ　　Ａｒ
ｇＡｓｐ　　３ｃｒ　　ＧｌｎＧｌｎ　　Ｌｙｓ　　Ｓ
ｅｒ　　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　Ｍｅｔ　　Ｓｅｒ　　Ｇ
ｌｙ　　ｐｒｏ　　Ｔｙｒ　　Ｇｌｕｌｅｕ　　ｌｙｓ
　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　ｌ−１ｉｓ　　ｌ、ｅｕ　　
Ｇｌｎ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　Ａｓｐ　　Ｉｖｌｃｔ
Ｇｌｕ　　Ｇｌｎ　　Ｇｉｎ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　
Ｐｈｅ　　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　Ｖ
ａｌＧｌｎ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ
　　Ａｓｎ　　Ａｓｐ　　Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　　Ｐｒｏ
　　ＶａｌＡｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　
Ｌｙｓ　　Ｇｌｕ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　
Ｔｙｒ　　Ｌ　ｅｕ３ｅｒ　　Ｃｙｓ　　Ｖａｌ　　Ｌ
ｅｕ　　Ｌｙｓ　　ＡＳＩ）　　ＡＳＩ）　　Ｌｙｓ　
　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　１ｃｕＧｌｎ　　ｌｅｕ　　Ｇ
ｌｕ　　Ｓｅｒ　　Ｖａｌ　　ＡＳＩ）　　Ｐｒｏ　　
Ｌｙｓ　　Ａｓｎ　　Ｔｙｒ　　Ｐｒ。

Ｌｌ／Ｓ　　ＬＶＳ　　ＩＪＳ　　Ｍｅｔ　　Ｑｌｕ　
　Ｌｙｓ　　Ａｒｃ　　Ｐｈｅ　　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ　
　ＡｓｎＬｙｓ　　Ｉｌｅ　　Ｇｌｕ　　（ｌｅ　　Ａ
Ｓｎ　　Ａｓｎ　　ｔ−ｙｓ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　
Ｐｈｅ　　ＧｌｕＳｅｒ　　Ａｌａ　　Ｑｌｎ　　Ｐｈ
ｅ　　Ｐｒｏ　　ＡＳｎ　　ｌ”ｒｐ　　Ｔｙｒ　　Ｉ
ｌｅ　　３ｅｒ　　ＴｈｒＳｅｒ　　Ｇｌｎ　　Ａｌａ
　　Ｇｌｕ　　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　
　Ｐｈｅ　　Ｌｅｕ　　ＧｌｙＧｌｙ　　Ｔｈｒ　　Ｌ
ｙｓ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ｇｌｎ　　Ａｓｐ　　Ｉ
ｌｅ　　Ｔｈｒ　　Ａｓｐ　　ＰｈｅＴｈｒ　　Ｍｅｔ
　　Ｇｌｎ　　Ｐｈｅ　　Ｖａｌ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ
本発明ＧＩＦは、後記するように哺乳動物の免疫担当細
胞から単離することができ、この天然型ＧＩＦの遺伝子
解析により、その前駆体の存在が明らかにされており、
上記式（１）で表わされるポリペプチドＡ及びポリペプ
チドエ〜ＩＶのアミノ酸配列は、この解析結果から誘導
されたものである。

更に本発明ＧＩＦには、ＧＩＦ活性を有するかぎりにお
いて、上記一般式（１）で表わされるポリペプチドＡ及
びポリペプチドエ〜ＩＶで表わされるアミノ酸配列のＮ
末端又はＣ末端に１個若しくはそれ以上のアミノ酸を付
加したもの又は上記アミノ酸配列から１個若しくはそれ
以上のアミノ酸を欠失乃至買換した蛋白の一次構造を有
するものも包含される。

以下、本発明ＧＩＦにつぎ、これをその製造法より詳述
する。

本発明ＧＩＦは、例えば哺乳動物由来の免疫担当細胞の
培益により誘導産生される。ここで起源細胞として用い
られる免疫担当細胞としては、哺乳動物に由来する限り
特に制限はなく、哺乳動物種としても限定されず、例え
ばヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ウサギ、マウス等
のいずれでもよい。代表的な免疫担当細胞としては、例
えばＴ−細胞、Ｂ−細胞、ヌル細胞、ナチュラル　キラ
ー細胞等のリンパ球細胞、単核細胞、マクロファージ等
の亀核球細胞等及びそれらの細胞系統（ｃｅｌｌｌｉｎ
ｅ）を例示できる。上記リンパ球細胞の例としては、例
えば上記各哺乳動物の牌臓、扁桃腺、肺、血液、リンパ
箇等の組織より分離されるリンパ球細胞を例示すること
ができる。２等免疫担当細胞の分離は、常法に従い例え
ば目的とする■１胞を含む組織を粉砕し、粗雑物を炉別
し、遠心分離する方法等によることができる。

本発明者らの研究によれば、上記起源細胞とする免疫１
１１当細胞の種類やこれを提供する哺乳動物の種類にか
かわらず、得られるＧＩＦの右するＧＩＦ活性は種特異
性を有しないことが確認されている。従って本発明ＧＩ
Ｆはその製造に際して起源細胞に制約を受けず、この点
からも医療分野での利用に好適である。

上記各種免疫担当細胞の培養は、この種細胞培養に通常
使用される培地を用いて、好ましくは抗腫瘍物質誘導剤
の存在下に実施され、これにより本発明物質がその培養
上清中に産生される。上記培地としては、例えばＣＥＭ
培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、ＤＭ−１６０培地、イ
ーグルの最小必須培地（Ｅａｇｌｅ　ｓ　　ＭＥＭ）　
、オートクレーブ可能ＭＥＭ、フィッシャーの培地（Ｆ
　１ｓｈｅｒ　ｓＭｅｄｉｕｍ　）　、Ｆ　−１０，Ｆ
　−１２培地、Ｌ−１５培地、ＮＣＴＣ−１０９培地、
ＲＰＭＩ−１６４０培地等を単独で用いるか又は必要に
応じて２等培地に牛胎児血清（ＦＣ８）等の血清やアル
ブミン等の血清成分を添加した培地等を例示できる。免
疫担当細胞の上記培地に対する使用量は、通常１Ｘ１０
’〜ｌＸ１０７個／−程度とするのが好ましい。

この細胞浮遊液に添加存在させることができる抗腫瘍物
質誘導剤としては、通常のもの、例えば１２−Ｏ−テト
ラデカノイルフォルボール−１３−アセテ−１へ（ＴＰ
Ａ）、フイ１−へモアグルチニン（ＰＩ−ＩＡ）、：ｌ
ンカナバリンＡ（ＣＯｎＡ）、細菌リポポリサッカライ
ド（Ｌ　Ｐ　Ｓ　）　、ボックライードマイト−ジエン
（ＰＷＭ）、プロティンＡ（Ｐ　ｒｏＡ　）等を例示で
きる。その使用量は、通常０．０００１〜０．１％（Ｗ
／Ｖ％、以下同じ）、好ましくは０．００１％ｌｙＪ後
の濃度とするのがよい。培養は、通常の方法、例えば炭
酸ガス培養法により実施でき、３０〜４０℃程度、好ま
しくは３７℃程度で、１〜５日間を要して行なわれる。

培養終了後、培養上清は、常法に従い遠心分離等の分離
手段により分離される。

上記方法により得られる培養上清からの本発明ＧＩＦの
分離は、基本的には、この種バイオロジカル物質からの
蛋白様物質の分離に利用される通常の方法と同様にして
、例えば目的とするＧＩＦの物理的、化学的性質等を利
用した各種の処理操作に従い実施できる。〔例えば「生
化学データーブックｆｆＪＤ＋）１１７５〜１２５９、
第１版第１刷、１９８０年６月２３日、株式会社東京化
学同人発行参照〕。該方法としては、具体的には例えば
通常の蛋白沈澱剤による処理、限外濾過、分子ふるいク
ロマトグラフィー（ゲル濾過）、液体クロア１−グラフ
ィー、遠心分離、電気泳動、７フイニテイークロマトグ
ラフイー、透析法、之等の組合せ等を採用できる。

特に好ましい分離方法においては、まず培養上清より予
め目的とするＧＩＦを部分精製する。この部分精製は、
例えば、アレトン、メタノール、エタノール、プロパツ
ール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の有機溶媒や
酢酸、過塩素酸（ＰＣＡ）、１〜リクロロ酢酸（ＴＣＡ
）等の酸を蛋白沈澱剤として用いる処理、硫酸アンモニ
ウム、ｌａＭナトリウム、リン酸ナトリウム等の塩析剤
を用いる処理及び／又は透析膜、平板膜、中空繊維膜等
を用いる限外濾過処理等により行なわれる。

之等の各処理の操作及び条件は、通常のこの種方法のそ
れらと同様のものとすればよい。

次いで上記で得られた粗精製物を、ゲル濾過に付すこと
により目的物質の活性が認められる両分を収得する。こ
こで用いられるゲル濾過剤としては、特に限定はなく、
例えばデキス１〜ランゲル、ポリアクリルアミドゲル、
アガロースゲル、ポリアクリルアミド−アガロースゲル
、セルロース等を素材とするものをいずれも利用できる
。之等の具体例としては、セファデックスＧタイプ、同
ＬＨタイプ、セファロースタイブ、セファクリルタイプ
（以上、ファルマシア社）、セルロファイン（チッソ（
株）、バイオゲルＰタイプ、同へタイプ（ＬＫＢ社）、
ＴＳＫ−Ｇタイプ（東洋曹達（掬）等の市販品を例示で
きる。

上記ゲル濾過によれば、分子量１万〜２万５千の画分に
本発明物質の活性が認められる。

本発明物質は、上記ゲル濾過により得られる両分を、例
えばハイドロキシアパタイトカラムを用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィー、ＤＥＡＥ法等のイオン交換カ
ラムクロマトグラフィー、クロマトフオーカシング法、
逆相高速液体クロマ１〜グラフイー等に付すことにより
、又は之等各操作の組合せにより更に精製することがで
き、均質な物質として単離することができる。

上記クロマトフオーカシング法は、公知の各種方法によ
り実施できる。カラムとしては、例えばＰＢＥ９４　（
ファルマシア社製）等を、開始緩衝液としては、例えば
イミダゾール−塩酸等を、また溶出液としては、例えば
ポリバッファー７４（ファルマシア社製）−塩Ｍ　（ｐ
　Ｈ４，０＞等を使用できる。

また、上記逆相高速液体クロマトグラフィーは、例えば
ＣＬハイボアー逆相１−（ＰＬＣカラムくバイオ−ラド
社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　　１ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）
　）等を用いて、移動剤としてアセトニトリル、トリフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水等及び之等の混合溶媒を用い
て実施できる。

かくして得られるＧＩＦは、前記ポリベフヂドエをその
構成蛋白とする天然型ＧＩＦ（即ち成熟ＧＩＦ）である
。

また、本発明ＧＩＦは遺伝子工学的手法によって、叩ち
ＧＩＦをコードする遺伝子を利用し、これを微生物のベ
クターに組込んで該微生物細胞内でＷ製、転写、翻訳さ
せることによって、製造することができる。この方法は
、特に大ｍ生産が可能である点より有利である。

上記遺伝子工学的手法によるＧＩＦの製造において、用
いられる遺伝子は、ＧＩＦをコードすることにより特徴
付けられる。本発明は、かかる新規な遺伝子をも提供す
るものである。

上記遺伝子の代表例は、前記ポリペプチドＡ１殊にポリ
ペプチドＩをコードするものであるが、特にこれに限定
されず、本発明のＧＩＦをコードしており且つその利用
によりＧＩＦが発坦、製造される限りいかなるものでも
よく、また各種公知の遺伝暗号（ａｅｎｅｔｉｃ　ｃｏ
ｄｅ）が採用されていてもよい。

上記遺伝子には、例えばそのＤＮＡ鎖中に制限酵素Ｍｓ
ｐＩ、ｔ−１ｉｎｄ［［［及びｐｖｕｌＩで切断される
個所をこの順序で配置された部分を含むことで特徴付け
られるヒトリンパ球由来細胞より分離されるメツセンジ
ャーＲＮＡ　（以下ｒｍＲＮＡＪという）より調製され
たものが含まれる。これはより具体的には、前記ポリペ
プチド■〜ＩＶに対応する以下の塩塁配列工、■、■及
びＩＶとして特定される塩基配列を有する遺伝子である
。

〔ＭＡ口配列■〕

ＧＣＡ　　ＣＣＴ　　ＧＴＡ　　ＣＧＡ　　ＴＣＡ　　
ＣＴＧ　　ＡＡＣＴＧＣ△ＣＧ　　ＣＴＣＣＧＧ　　Ｇ
ＡＣＴＣＡ　　ＣＡＧ　　ＣＡＡ　　ＡＡＡＡＧＣＴＴ
Ｇ　　ＧＴＧ　　ＡＴＧ　　ＴＣＴ　　ＧＧＴ　　ＣＣ
Ａ　　ＴＡＴＧＡＡ　　ＣＴＧ　　ＡＡＡ　　ＧＣＴ　
　ＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡ　　ＣＡＧ　　ＧＡ
Ｔ　　ＡＴＧ　　ＧＡＧ　　ＣＡＡ　　ＣＡＡ　　ＧＴ
ＧＧＴＧ　　ＴＴＣＴＣＣＡＴＧ　　ＴＣＣＴＴＴ　　
ＧＴＡ　　ＣＡＡＧＧＡ　　ＧＡＡ　　ＧＡＡ　　ＡＧ
Ｔ　　ＡＡＴ　　ＧＡＣＡＡＡ　　ＡＴＡＧＣＴ　　Ｇ
ＴＧ　　ＧＣＣＴＴＧ　　ＧＧＣＣＴＣＡＡＧ　　ＧＡ
ＡＡＡＧ　　ＡＡＴ　　ＣＴＧ　　ＴＡＣＣＴＧ　　Ｔ
ＣＣＴＧＣＧＴＧＴＴＧ　　ＡＡＡ　　ＧＡＴ　　ＧＡ
Ｔ　　ＡＡＧ　　ＣＣＣＡＣＴ　　ＣＴＡＣＡＧ　　Ｃ
ＴＧ　　ＧＡＧ　　ＡＣＴ　　ＧＴＡ　ＧＡＴ　　ＣＣ
ＣＡＡＡＡＡＴ　　ＴＡＣ：　　ＣＣＡ　　ＡＡＧ　　
ＡＡＧ　　ＡＡＧ　　ＡＴＧ　　ＧＡＡＡＡＧ　　ＣＧ
Ａ　　ＴＴＴ　　ＧＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＧ　　ＡＴＡ
ＧＡＡ　　ＡＴＣＡＡＴ　　ＡＡＣＡＡＧ　　ＣＴＧ　
　ＧＡＡ　　ＴＴＴＧＡＧ　　ＴＣＴ　　ＧＣＣＣＡＧ
　　ＴＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＡＧＯＡＣ
ＣＴＣＴ　　ＣＡＡ　　ＧＣＡ　　ＧＡＡＡＡＣＡＴＧ
　　ＣＣＣＧＴＣＴＴＣＣ１−Ｇ　　ＧＧＡ　　ＧＧＧ
ＡＣＣＡＡＡ　　ＧＧＣＧＧＣＣＡＧ　　ＧＡＴ　　Ａ
ＴＡ　　ＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧ　　ＣＡＡ　
　ＴＴＴ　　ＧＴＧ　　ＴＣＴＣＣ 〔塩基配列■〕 ＡＴＧ　　ＣＴＧ　　ＧＴＴ　　ＣＣＣＴＧＣＣＣＡ　
ＣＡＧ　　ＡＣＣＴＴＣＣＡＧ　　ＧＡＧ　　ＡＡＴ　
　ＧＡＣＣＴＧ　　ＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴ　　ＣＣ
ＣＴＴＣＡＴＣＴＴＴ　　ＧＡＡ　　ＧＡＡＧＡＡ　　
ＣＣＴ　　ＡＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＡＣＡ　　ＴＧＧ
ＧＡＴ　　ＡＡＣＧＡＧ　　ＧＣＴ　　ＴＡＴ　ＧＴＧ
　　ＣＡＣＧＡＴＧＣＡ　　ＣＣＴ　　ＧＴＡ　　ＣＧ
Ａ　　ＴＣＡ　　ＣＴＧ　　ＡＡＣＴＧＣＡＣＧ　　Ｃ
ＴＣＣＧＧ　　ＧＡＣＴＣＡ　　ＣＡＧ　　ＣＡＡ　　
ＡＡＡ△ＧＣＴＴＧ　　ＧＴＧ　　ＡＴＧ　　ＴＣＴ　
　ＧＧＴ　　Ｃ，ＣＡ　　ＴＡＴＧＡＡ　　ＣＴＧ　　
ＡＡＡ　　ＧＣＴ　　ＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡ
　　ＣＡＧ　　ＧＡＴ　　ＡＴＧ　　ＧＡＧ　　ＣＡＡ
　　ＣＡＡ　　ＧＴＧＧＴＧ　　ＴＴＣＴＣＣＡＴＧ　
　ＴＣＣＴＴＴ　　ＧＴＡ　　ＣＡＡＧＧＡ　　ＧＡＡ
　　ＧＡＡ　　ＡＧＴ　　ＡＡＴ　　ＧＡＣＡＡＡ　　
ＡＴＡＣＣＴ　　ＧＴＧ　　ＧＣＣＴＴＧ　　ＧＧＣＣ
ＴＣＡＡＧ　　ＧＡＡＡＡＧ　　ＡＡＴ　　ＣＴＧ　　
ＴＡＣＣＴＧ　　ＴＣＣＴＧＣＧｒＧＴＴＧ　　ＡＡＡ
　　ＧＡＴ　　ＧＡＴ　　ＡＡＧ　　ＣＣＣＡＣＴ　　
ＣＴＡＣＡＧ　　ＣＴＧ　　ＧＡＧ　　ＡＧＴ　　ＧＴ
Ａ　　ＧＡＴ　　ＣＣＣＡＡＡＡＡＴ　　ＴＡＣＣＣＡ
　　ＡＡＧ　　ＡＡＧ　　ＡＡＧ　　ＡＴＧ　　ＧＡＡ
ＡＡＧ　　ＣＧＡ　　ＴＴＴ　　ＧＴＣＴＴＣＡＡＣＡ
ＡＧ　　ＡＴＡＧＡＡ　　ＡＴＣＡＡＴ　　ＡＡＣＡＡ
Ｇ　　ＣＴＧ　　ＧＡＡ　　ＴＴＴＧＡＧ　　ＴＣＴ　
　ＧＣＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＡＡＣｒＧＧＴＡＣＡＴＣ
ＡＧＣＡＣＣＴＣＴ　　ＣＡＡ　　ＧＣＡ　　ＧＡＡＡ
ＡＣＡＴＧ　　ＣＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＧ　　ＧＧＡ　
　ＧＧＧＡＣＣＡＡＡ　　ＧＧＣＧＧＣＣＡＧ　　ＧＡ
Ｔ　　ＡＴＡ　　ＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧ　　
ＣＡＡ　　ＴＴＴ　　ＧＴＧ　　ＴＣＴＣＣ 〔塩基配列■〕 ＡＴＧ　　ＧＡＣＡＡＧ　　ＣＴＧ　　ＡＧＧ　　ＡＡ
Ｇ　　ＡＴＧ　　ＣＴＧＧＴＴ　　ＣＣＣＴＧＣＣＣＡ
　　ＣＡＧ　　ＡＣＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧ　　ＡＡＴ　
　ＧＡＣＣＴＧ　　ＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴＣＣＣＴ
ＴＣＡＴＣＴＴＴ　　ＧＡＡ　　ＧＡＡ　　ＧＡＡ　　
ＣＣＴＡＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＡＣＡ　　ＴＧＧ　　
ＧＡＴ　　ＡＡＣＧＡＧ　　ＧＣＴ　　ＴＡＴ　　ＧＴ
Ｇ　　ＣＡＣＧＡＴ　　ＧＣＡ　　ＣＣＴＧＴＡ　　Ｃ
ＧＡ　　丁ＣＡ　　ＣＴＧ　　ＡＡＣＴＧＣＡＣＧ　　
σ「ＣＣＧＧ　　ＧＡＣＴＣＡ　　ＣＡＧ　　ＣＡＡ　
　ＡＡＡ　　ＡＧＣＴＴＧＧＴＧ　　ＡＴＧ　　ＴＣＴ
　　ＧＧＴ　　ＣＣＡ　　ＴＡＴ　　ＧＡＡ　　ＣＴＧ
ＡＡＡ　　ＧＣＴ　　ＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧ　　Ｇ
ＧＡ　　ＣＡＧＧΔＴ　　ＡＴＧ　　ＧＡβ　ＣＡＡ　
　ＣＡＡ　　ＧＴＧ　　ＧＴＧ　　ＴＴＣＴＣＣＡＴＧ
　　ＴＣＣ下ＴＴ　　ＧＴＡ　　ＣＡＡ　　ＧＧＡ　　
ＧＡＡＧＡＡ　　ＡＧＴ　　ＡＡＴ　　ＧＡＣＡＡＡ　
　ＡＴＡ　　ＣＣＴ　　ＧＴＧＧＣＣＴＴＧ　　ＧＧＣ
ＣＴＣＡＡＧ　　ＧＡＡ　　ＡＡＧ　　ＡＡＴＣＴＧ　
　ＴＡＣＣＴＧ　　ＴＣＣＴＧＣＧＴＧ　　ＴＴＧ　　
ＡＡＡＧＡＴ　　ＧＡＴ　　ＡＡＧ　　ＣＣＣＡＣＴ　
　ＣＴＡ　　ＣＡＧ　　ＣＴＧＧＡＧ　　ＡＧＴ　　Ｇ
ＴＡ　　ＧＡＴ　　ＣＣＣＡＡＡ　　ＡＡＴ　　ＴΔＣ
ＣＣＡ　　ＡＡＧ　　ＡＡＧ　　ＡＡＧ　　ＡＴＧ　　
ＧＡＡ　　ＡＡＧ　　ＣＧＡＴＴＴ　　ＧＴＣＴＴＣＡ
ＡＣＡＡＧ　　ＡＴＡ　　ＧＡＡ　　ＡＴＣΔＡＴ　　
ＡＡＣＡＡＧ　　ＣＴＧ　　ＧＡＡ　　ＴＴＴ　　ＧＡ
Ｇ　　ＴＣＴＧＣＣＣＡＧ　　ＴＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧ
Ｇ　　ＴＡＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＴＣＴ　　ＣＡＡ　　
ＧＣＡ　　ＧＡＡ　　ＡＡＣＡＴＧＣＣＣＧＴＣＴＴＣ
ＣＴＧ　　ＧＧＡ　　ＧＧＧ　　Ａｃｅ　　ＡＡＡＧＧ
ＣＧＧＣＣＡＧ　　ＧＡＴ　　ＡＴＡ　　ＡＣＴ　　Ｇ
ＡＣ下ＴＣＡＣＣＡＴＧ　　ＣＡＡ　　ＴＴＴ　ＧＴＧ
　　ＴＣＴ　ＴＣＣ〔塩基配列ＩＶ） ＡＴＧ　　ＡＡＧ　　ＴＧＣＴＣＣＴＴＣＣＡＧ　　Ｇ
ＡＧ　　ＣＴＧＧＡＣＣＴＣＴＧＣＣＣＴ　　ＣＴＧ　
　ＧＡＴ　　ＧＧＣＧＧＣＡＴＣＣＡＧ　　ＣＴＡ　　
ＣＧＡ　　ＡＴＣＴＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡＣＡＧ
ＣＡＡＧ　　ＧＧＣＴＴＣＡＧＧ　　ＣＡＧＧＣＣＧＣ
Ｇ　　ＴＣＡ　　ＧＴＴ　　Ｇ−ｒＴ　　ＧＴＧ　　Ｇ
ＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧ　　ＣＴＧ　　ＡＧＧ　　ＡＡ
Ｇ　　ＡＴＧ　　ＣＴＧ　　ＧＴＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡ
　　ＣＡＧ　　ＡＣＣＴＴＣＣＡＧ　　ＧＡＧＡＡＴ　
　ＧＡＣＣＴＧ　　ＡＧＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴ　　ＣＣ
ＣＴＴＣＡＴＣＴＴＴ　　ＧＡＡ　　ＧＡＡ　　ＧＡＡ
　　ＣＣＴ　　ＡＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＡＣＡ　　Ｔ
ＧＧ　　ＧＡＴ　　ＡＡＣＧＡＧＧＣＴ　　ＴＡＴ　　
ＧＴＧ　　ＣＡＣＧＡＴ　　ＣＣＡ　ＣＣＴ　　ＧＴＡ
ＣＧＡ　　ＴＣＡ　　ＣＴＧ　　ＡＡＣＴＧＣＡＣＧ　
　ＣＴＣＣＧＧＧＡＣＴＣＡ　　ＣＡＧ　　ＣＡＡ　　
ＡＡＡ　　ＡＧＣＴＴＧ　　ＧＴＧＡＴＧ　　ＴＣＴ　
　ＧＧＴ　　ＣＣＡ　　ＴＡＴ　　ＧＡＡ　　ＣＴＧ　
　ＡＡＡＧＣＴ　　ＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧ　　ＧＧ
Ａ　　ＣＡＧ　　ＧＡＴＡＴＧ　　ＧＡＧ　　ＣＡＡ　
　ＣＡＡ　　ＧＴＧ　　ＧＴＧ　　ＴＴＣＴＣＣＡＴＧ
　　ＴＣＣＴＴＴ　　ＧＴＡ　　ＣＡＡ　　ＧＧＡ　　
ＧＡＡ　　ＧＡＡＡＧＴ　　ＡＡＴ　　ＧＡＣＡＡＡ　
　ＡＴＡ　　ＣＣＴ　　ＧＴＧ　’ＧＣＣＴＴＧ　　Ｇ
ＧＣＣＴＣＡＡＧ　　ＧＡＡ　　ＡＡＧ　　ＡＡＴ　　
ＣＴＧＴＡＣＣＴＧ　　ＴＣＣＴＧＣＧＴＧ　　ＴＴＧ
　　ＡＡＡ　　ＧＡＴＧＡＴ　　ＡＡＧ　　ＣＣＣＡＣ
Ｔ　　ＣＴＡ　　ＣＡＧ　　ＣＴＧ　　ＧＡＧＡＧＴ　
　ＧＴＡ　　ＧＡＴ　　ＣＣＣＡＡＡ　　ＡＡＴ　　Ｔ
ＡＣＣＣＡＡＡＧ　　ＡＡＧ　　ＡＡＧ　　ＡＴＧ　　
ＧＡＡ　　ＡＡＧ　　ＣＧＡ　　ＴＴＴＧＴＣＴＴＣＡ
ＡＣＡＡＧ　　ＡＴＡ　ＧＡＡ　　ＡＴＣＡＡＴＡＡＣ
ＡＡＧ　　ＣＴＧ　　ＧＡＡ　　ＴＴＴ　　ＧＡＧ　　
ＴＣＴ　　ＧＣＣＣＡＧ　　ＴＴＣＣＣＣＡＡＣＴＧＧ
　　ＴＡＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＴＣＴ　　ＣＡＡ　　Ｇ
ＣＡ　　ＧＡＡ　　ＡＡＣＡＴＧ　　ＣＣＣＧＴＣＴＴ
ＣＣＴＧ　　ＧＧＡ　　ＧＧＧ　　ＡＣＣＡＡＡ　　Ｇ
ＧＣＧＧＣＣＡＧ　　ＧＡＴ　　ＡＴＡ　　ＡＣＴ　　
ＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧ　　ＣＡＡ　　ＴＴＴ　　Ｇ
ＴＧ　　ＴＣＴ　　ＴＣＣ本発明方法において用いられ
る上記遺伝子の製造方法は、特に制限はなく、以下に示
ず各種の方法に従うことができる。即ち、該方法として
は例えばＧＩＦ生産能を有するリンパ球由来細胞より得
られるｍ　ＲＮＡより調製されたｃ　ＤＮＡを、エシェ
リヒア・コリー（Ｅ　５ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）
のプラスミド　ベクター等の適当なベクターに接続して
、微生物細胞内で増幅させ、ＧＩＦを発現し得るクロー
ンを単離し、この単離されたクローンが有するプラスミ
ド中に挿入されているＤＮＡを分離する方法、水明ｍ書
に開示したＧＩＦ及びその遺伝情報に基づいて、例えば
ホスホアイト　トリエステル法（ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ　）　、　３１０゜１０５　（１９８４））等の常
法に従って、核酸の化学合成を行なう方法、或いは上記
各方法を併用する方法等を例示できる。

尚、上記において遺伝暗号の選択は任意でよく、例えば
利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮した常法に従え
ばよい。またそれら遺伝子がコードづるＧ［Ｆの一部の
アミノ酸の置換や配列の改変等には、例えばサイト−ス
ペシフィック　ミュークジエネシス（Ｓ　ｉｔｅ　−Ｓ
　ｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍ　ｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８１　、５６６
２−５６６６　（１９８４））等の方法を採用するのが
簡便である。

本発明に利用する遺伝子の製造法において、上記ｍ　Ｒ
ＮＡを経る方法につき、より詳細に説明すれば次の通り
である。

上記遺伝子の入手のための起源細胞としては、ＧＩＦ生
産能を有するｌｌ＋ｔｉ乳動物由来の免疫担当細胞（Ｇ
　［Ｆ産生細胞）を好適に利用できる。該ＧＩＦ産生細
胞の具体例は、前記した通りである。

ＧＩＦをコードするｍ　ＲＮＡを含むＲＮＡは、上記Ｇ
ＩＦ産生細胞から常法に従い抽出される。

該抽出に先だって、ＧＩＦ産生細胞は、一般にＧＩＦ産
生条件下におかれる。これは、該細胞をこの種細胞培養
に通常使用される培地を用いて、好ましくは抗腫瘍物質
誘導剤の存在下に、培展することにより行なわれる。上
記培地、ＧＩＦ産生細胞の上記培地に対する使用機、抗
腫瘍物質誘導剤、その使用量、培養方法等は前記したそ
れらと同様とすることができる。ＲＮＡの抽出は、ＧＩ
Ｆ活性が培養上清中に出現する頃の細胞について行なう
のがよい。

上記ＲＮＡの抽出は、適当な界面活性剤、例えばＳＯ３
，ＮＰ−４０、トリトン×１００、デオキシコール酸等
を用いて、或いはホモシナイナーを用いる方法や凍結融
解等の物理的方法によって、細胞を部分的又は完全に破
壊、可溶化した後、染色体ＤＮＡを、ポリトロン（Ｐ　
ｏｌｙｔｏｒｏｎ　　ｍｏｄｅｌＣＨ−６０１０、キネ
マチイカ（Ｋ　ｉｎｅｍａｔｉｃａ　）　。

スイス社製〕等のミキサーもしくは注射筒を用い、ある
程度せん断し、その後、蛋白質と核酸分画とを分別する
操作により行なわれる。この操作には、特にフェノール
・クロロホルム抽出もしくは超遠心を用いるＣ３　Ｃ；
９重層法〔グリシンら（Ｑ　１ｉｓｉｎ、ｅｔ　　ａｔ
）　、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　）　、　１３．２６３３　（１９７４）及びヂルグウ
インら（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　、　Ｊ、　Ｍ、、ｅｔａｌ
、）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　）　。

１８．５２９４　（１９７９））等が一般に用いられる
。

また上記各方法においては、ＲＮ　ａｓｅによるＲＮＡ
の分解を防ぐために、ＲＮ　ａｓｅインヒビター、例え
ばヘパリン、ポリビニル硫酸、ジエチルピロカーボネー
ト、バナジルリボヌクレオシド複合体、ベントナイト、
マカロイド等を添加しておくのがよい。

上記抽出操作に従い得られるＲＮＡからのｍ　ＲＮＡの
分離精製は、抽出物を例えばオリゴｄｌ−セルロース（
Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ［ｎ
ｃ、）、ポリＵ−セファロース（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ
社）、セファロース２８（ファルマシア社）等の吸着カ
ラムを用いる方法により又はバッチ法により実施できる
。

かくして得られるｍ　ＲＮＡからの、ＧＩＦに対応する
目的のｍ　ＲＮＡの精製濃縮及び同定は、次の如くして
行ない得る。即ち、例えばＧＩＦに対する抗体を用いて
ポリゾームからｌｌｌＲＮＡを沈澱させる方法により実
施できる。また、蔗糖密度勾配遠心等によって分画し、
その分画につき、蛋白質の翻訳系、例えばアフリカッメ
ガエルの卵母細胞への注入やウサギ網状赤血球ライゼー
ト又は小麦胚芽等の無細胞系で蛋白質に翻訳させ、その
蛋白質のＧＩＦ活性を調べることにより、目的とするｍ
　ＲＮＡの存在を確認する方法によっても行なうことが
できる。更に目的ｍ　ＲＮＡの確認は、上記ＧＩＦ活性
測定に代えて、ＧＩＦに対する抗体を用いる免疫法によ
っても行ない得る。

上記により得られる精製ｒａ　ＲＮＡは、通常不安定で
あり、安定な相補ＤＮＡ　（ｃ　ＤＮＡ）の型に代えら
れ、目的遺伝子の増幅を可能とするために微生物由来の
レプリコンに接続される。インビトロでの、上記ｍ　Ｒ
ＮＡのｃＤＮ△への変換、即ちｃ　ＤＮＡの合成は、一
般に次のようにして行なうことができる。

即ら、まずオリゴｄ王をプライマーとしくこのブライマ
ーは遊離のオリゴｄＴもしくは既にベクターブライマー
に付加されたオリゴｄ王のいずれでもよい）、ｍＲＮＡ
を鋳型としてｄ　ＮＴＰ（ｄ　ＡＴＰ、ｄ　ＧＴＰ、ｄ
　ＣＴＰ又はｄ　ＴＴＰ）の存在下で、逆転写酵素を用
いてｍ　ＲＮＡに相補的な一本鎖ｃ　ＤＮＡを合成する
。次のステップは、上記において遊離のオリゴｄＴを用
いたか、ベクタープライマに付加されたオリゴｄＴを用
いたかにより、各々以下の如く異なる。

前者の場合、ｌ型としたｍＲＮＡをアルカリ処理等によ
り分解して除去し、その後一本ｍＤＮＡを鋳型として逆
転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ＤＮＡ
を作成する。次に得られる二本鎖ＤＮＡの両端をエキソ
ヌクレアーゼで処理し、そのそれぞれに適当なリンカ−
ＤＮＡ又はアニーリング可能な組合せの塩基を複数付加
し、これを適当なベクター、例えばＥＫ系プラスミドベ
クター（ストリンジェント型若しくはリラックス型のい
ずれでもよい）やλｇｔ系ファージベクターに組込む。

また、後者の場合、鋳型としたｒａ　ＲＮＡを残存させ
たまま、上記と同様のリンカ−を付与した閉環状プラス
ミドと、リンカ−ＤＮＡ　ｌばしば動物細胞で自立複製
できる領域とｍ　ＲＮＡの転写プロモーター領域を含む
ＤＮＡ断片が用い得る）とを、アニーリングさせて閉環
状とした後、ｄＴＮＰ存在下で、ＲＮ　ａｓｅとＤＮＡ
ポリメラーゼとを共存させて、Ｉｎ　ＲＮＡをＤＮＡ鎖
に置換し、完全なプラスミドＤＮＡを作成できる。

上記のごとくして得られるＤＮＡは、ベクターの宿主微
生物に導入され、該微生物を形質転換できる。

宿主微生物としては、エシェリヒア　コリーが代表的で
あるが、特にこれに限定されず、その他にバチルス・ズ
ブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）、サ
ツカロミセスφセレビシアエ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等も使用することができ
る。

ＤＮＡの宿主微生物への導入及びこれによる形質転換の
方法としては、一般に用いられている方法、例えば主と
して対数増殖期にある細胞を集め、ＣａＣＱ２処理して
自然にＤＮＡを取り込みやすい状態にして、プラスミド
を取り込ませる方法等を採用できる。上記方法において
は、通常知られているように形質転換の効率を一層向上
させるためにＭ（Ｉｃ（１２やＲｂＣ（ｌを更に共存さ
せることもできる。また、微生物細胞をスフェロプラス
ト又はプロトプラスト化してから形質転換させる方法も
採用することができる。

上記により得られる形質転換株から、目的のＧＩＦのｃ
　ＤＮＡを有する株を選出する方法としては、例えば以
下に示す各種方法を採用できる。

（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリ
ーニング法 目的蛋白質のアミノ酸配列の全部又は一部が解明されて
いる（該配列は、複数個連続した特異的配列であれば、
目的蛋白のどの領域のものでもよい）場合、該アミノ酸
に対応するオリゴヌクレオチドを合成しくこの場合、コ
ドン使用頻度を用いて導いた塩基配列又は考えられる塩
Ｖ配列の組合せの複数個のどちらでもよく、また後者の
場合、イノシンを含ませてその種類を減らすこともでき
る）、これをプローブ（３２Ｐ又は３５３でラベルする
）として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセ
ルロースフィルターとハイブリダイゼーションし、得ら
れたポジティブ株を検索して、これを選出する。

（２）動物細胞でＧＩＦを産生させてスクリーニングす
る方法 形質転換株を培養し、遺伝子を増幅させ、その遺伝子を
動物細胞にトランスフェクトしくこの場合、自己複製可
能でｍ　ＲＮＡ転写プロモーター領域を含むプラスミド
若しくは動物細胞染色体にインチグレー１−するような
プラスミドのいずれでもよい）、遺伝子にコードされた
蛋白質を産生させ、その培養上清若しくは細胞抽出物の
ＧＩＦ活性を測定するか、又はＧＩＦに対する抗体を用
いてＧＩＦを検出するかにより、元の形質転換株より目
的のＧＩＦをコードするｃ　ＤＮＡを有する株を選出す
る。

（３）インダクション特異的な形質転換株を選出する方
法 ＧＩＦは、前記したようにＬＰＳやＴＰＡ等の抗腫瘍物
質誘導剤によって、特・異的にその産生が誘発される。

インダクション特異的な株を選出するには、コロニー　
ハイブリダイゼーションのプローブとして、ＧＩＦを誘
導していない産生株（インダクションマイナス）からの
ｍ　ＲＮＡと、上記薬剤を用いてＧＩＦを誘導させ（イ
ンダクションプラス）且つ該ＧＩＦをコードするｒ＊　
ＲＮＡが増幅しているｍ　ＲＮＡ　（該ｍ　ＲＮＡから
合成したＣ　ＤＮＡでもよい）との両者を用い、これら
をハイブリダイゼーションさせ、その強弱により、イン
ダクション特異的な転換株を選出する（プラス・マイナ
ス法）。

また、インダクションマイナスのｍ　ＲＮＡ　（又はそ
れから作成されるｃ　ＤＮＡ）とインダクションプラス
のｍ　ＲＮＡから作成されたＱ　ＤＮＡ　（又はｍ　Ｒ
ＮＡそのもの）とのハイブリダイゼーションを行なって
後、ハイブリダイゼーションしなかったｍＲＮＡ（又は
ｃ　ＤＮＡ）をプローブとし、コロニー　ハイブリダイ
ゼーションを行なって、インダクション特異的な株を選
出する（セレクテイブ・ハイブリダイピージョン法）。

目的株の選出は、ｃ　ＤＮＡ若しくはｍ　ＲＮＡの検索
により行ない得る。

＜４）ＧＩＦに対する抗体を用いて選出する方法予め、
ｃ　ＤＮＡを形質転換株内で蛋白質を発現し得るベクタ
ーに組込み、形質転換株内で蛋白質を産生させ、ＧＩＦ
に対する抗体及び該抗体に対する第二抗体を用いて、Ｇ
ＩＦ産生株を検出し、目的株を得る。

（５）セレクテイブ・ハイブリダイゼーション・トラン
スレーションの系を用いる方法 形質転換株から得られるｃ　ＤＮＡを、ニトロセルロー
スフィルター等にプロットし、ＧＩＦ産生細胞からのｍ
　ＲＮＡをハイブリダイゼーションさせた後、ｃ　ＤＮ
Ａに対応するｍ　ＲＮＡを回収する。

回収されたｍ　ＲＮＡを蛋白翻訳系、例えばアフリカッ
メガエルの卵母細胞への注入や、ウサギ網状赤血球ライ
ゼートや小麦胚芽等の無細胞系で蛋白質に翻訳させ、そ
の蛋白質のＧＩＦ活性を調べるか、又はＧＩＦに対する
抗体を用いて検出して、目的の株を得る。

１ｑられた目的の形質転換株よりＧＩＦをコードするＤ
ＮＡを採取する方法は、公知の方法、例えば細胞よりプ
ラスミドＤＮＡに相当する両分を分離し、該プラスミド
ＤＮＡよりｃ　ＤＮＡ領域を切り出すことにより行ない
得る。

上記各方法に従い得られるＧＩＦのｃ　ＤＮＡの構造及
び塩基配列は、例えばマキサム−ギルバート（Ｍ　ａｘ
ａｒＡ−Ｇ　ｉ　Ｉｂｅｒｔ　）の化学的修飾法（Ｍ　
ｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍ、６５．４９９−５６０　（１９８０））及
びＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終
結法（ＭｅＳＳｉｒ＋ＣＩ　　Ｊ、　ａｎｄ　Ｖｉｅｉ
ｒａ、Ｊ、　。

Ｇｅｎｅ、１９．２６９−２７６　（１９８２））にて
決定できる。

尚、上記の如くして得られる形質転換体の一例として、
後記実施例で得られるＧＩＦ遺伝子を含むプラスミドｐ
ＧＩＦ−αを、エシェリヒア　コリーχ１７７６にトラ
ンスフオームさせた形質転換体を、［Ｅ　５ｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ　　ｃｏｌｉχ１７７６／ｐＧ［Ｆ−α］なる
名称で工業技術院微生物工業技術研究所に［微工研条寄
第９４８号（ＦＥＲＭＢＰ−９４８）として寄託してい
る。従って上記ＧＩＦＴ伝子の調製に当っては、この形
質転換体を利用づるのがより簡便であり好ましい。

ＧＩＦをコードする遺伝子の利用によれば、遺伝子組換
え技術に従い、ＧＩＦを大量に収得することができる。

上記技術においては該遺伝子が宿主細胞中で発現でき得
るような組換えＤＮＡを作成する。該組換えＤＮＡの作
成は、当該技術分野における通常の方法に従うことがで
き、本明細書に開示のＧＩＦの遺伝情報に基づいて容易
に実施できる。個々の具体的操作については一部既に詳
述したが、以下により具体的に詳述する。

宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいずれをも
用いることかできる。該真核生物の細胞には、を椎動物
、酵母等の細胞が含まれ、を椎動物細胞としては、例え
ばサルの細胞であるＣＯ３細胞（Ｙ、　Ｇ、ｌｕｚｍａ
ｎ、　Ｃｅ１１．２３．１７５−１８２（１９８１））
やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞のジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ欠損株（Ｇ。

Ｕｒｌａｕｂ　ａｎｄ　Ｌ　、Ａ、　Ｃｈａｓｉｎ　、
　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、　７７．４２１６−４２
２０（１９８０））等がよく用いられているが、之等に
限定される訳ではない。を椎動物細胞の発現ベクターと
しては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置する
プロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル
化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、
これは更に必要により複製起源を保有していてもよい。

該発現ベクターの例としては、ＳＶ４０の初期プロモー
ターを保有すルＥ）　５Ｖ２ｄｈｆｒ（Ｓ、　Ｓａｂｒ
ａｍａｎｉ、　Ｒ。

Ｍｕｌｌｉｇａｎ　ａｎｄ　　ｐ、Ｂｅｒｇ、ＭＯｌ、
Ｃｅ１１．Ｂ　ｉｏｌ、。

１．８５４−７６４）等を例示できるが、これに限定さ
れない。

また真核微生物としては酵母が一般によく、用いられて
おり、その中でもサツカロミセス属酵母が有利に利用で
きる。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、
例えば酸性ホスファターゼ遺伝子に対するプロモーター
を持つｐ　ＡＭ８２　（Ａ。

Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ　ｅｔ　　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。

ＵＳＡ、８０．１−５　（１９８３））等を好ましく利
用できる。

原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく
用いられている。本発明では例えば該宿主国中で複製可
能なプラスミドベクターを用い、このベクター中にＧＩ
Ｆの遺伝子が発現できるようにＧＩＦＴ伝子の上流にプ
ロモーター及びＳＤ（シャイン・アンド・ダルガーノ）
塩基配列、更に蛋白合成開始に必要なＡＴＧを付与した
発現プラスミドが使用できる。上記宿主菌としての大腸
菌としては、エシェリヒア・コリー（１：、ｃｏｌｉ）
Ｋ１２株等がよく用いられ、ベクターとしては一般にｐ
ＢＲ３２２がよく用いられるが、これに限定されず、公
知の各種の菌株及びベクターがいずれも利用できる。プ
ロモーターとしては、例えばトリプトファン・プロモー
ター、ＰＬプロモーター、ｌａｃプロモーター、１ρＯ
プロモーター等を使用することができ、いずれの場合に
もＧＩＦ遺伝子を発現させることができる。

トリプトファン・プロモーターを用いる場合を例にとり
詳述すれば、発現ベクターとしてトリプトファン・プロ
モーター及びＳＤ配列を持つベクターｐＴＭ１（今本文
男、代謝、Ｖｏｌ、２２゜２８９　（１９８５））を使
用し、ＳＤ配列の下流に存在する制限Ｐｓ素ＣＩａＩ部
位に、必要に応じてＡＴＧを付与したＧ［Ｆをコードす
る遺伝子を連結、させればよい。この方法により例えば
前記ポリペプチドＩを製造する場合、より具体的には、
まずＧＩＦのｃ　ＤＮＡを持つ例えば後記実施例に示す
プラスミドｐＧＩＦ−αを、制限酸素ＡＣＣＩ及びＭｓ
ｐＩで切断してポリベプチドエをコードする遺伝子の大
部分と３″非翻訳領域の一部を含むＤＮＡフラグメント
を単離する。このＤＮＡフラグメントではポリペプチド
Ｉのアミノ末端側の１０アミノ酸残塁をコードする遺伝
子領域が不足している。従って、上記方法では次いでト
リプトファン・プロモーターを持つ発現ベクターｐＴＭ
１の制限酵素Ｃ１ａＩ部位に連結することができ、且つ
翻訳開始コドンＡＴＧを持ち、更にポリベプチドエのア
ミノ末端側から１０アミノ酸残基をコードし得る合成り
ＮＡリンカ−を作成し、このリンカ−を用いて、トリプ
トファン・プロモーターの下流にポリペプチド■遺伝子
を挿入して発現プラスミドを調製する。該プラスミドを
ＣａＣＱ２処理によりＤＮＡを取り込みやすい状態とし
た大腸菌へ形質転換させ、目的の形質転換株を常法に従
い培養することにより、ポリペプチドＩを収得できる。

上記形質転換株の培養は、一般にはトリプトファン・プ
ロモーターが働くようにするためにカザミノ酸を添加し
たＭ９最小培地を用いて行なわれ、該培地中には培養中
の適当な時期にインドールアクリル酸等のトリプトファ
ン・プロモーターの働きを強めるための薬剤を添加する
こともできる。かくして培養された大腸菌内には、ポリ
ペプチド■が大ｌに産生、蓄積される。

上記に具体的に例示した以外のすべての本発明ＧＩＦの
製造方法も、上記方法と略々同様にして行なうことがで
きる。

上記により、目的の組換え微生物の細１抱内又は細ｊ抱
外に生産されるＧＩＦは、常法に従い分離され、ＧＩＦ
の物理的、化学的性質等を利用した各種の処理操作に従
い単離、精製することができる。

該処理操作の具体例は、前記した通りである。

本発明方法に従い得られるＧＩＦは、その有するＧＩＦ
活性及び種々の腫瘍細胞に対して特異的にその増殖を抑
制する作用により、単独でヒト及びその伯の動物の抗腫
瘍剤として有用であり、またガンの化学療法剤として、
特に各種抗悪性腫瘍剤との併用による寛解強化療法、寛
解維持療法に有利に用いられる。更に該ＧＩＦは、毒性
が極めて低く、この低毒性の面でも上記用途に右利であ
る。

ＧＩＦを抗腫瘍剤として用いるに当り、該抗腫瘍剤はＧ
ＩＦの有効分を、薬理的に許容される通常の無毒性担体
と共に含有する各種の薬理組成物の形態に調製され、該
形態に応じた各種投与経路により投与される。その製剤
形態としては、通常液状形態、即ち溶液、懸濁液、乳濁
液等を例示でさ、之等は一般に経口、静脈、皮下又は筋
肉内投与される。之等はまた使用前に適当な通常の担体
の添加によって液状となし得る乾燥品として提供するこ
ともできる。該抗腫瘍剤の投与量は、患各の年齢、性別
や疾患の程度等により異なるが、通常蛋白椿として約０
．１〜１１００Ｉｌ１／ｋＱ／臼を１〜数回に分けて投
与するのが好ましい。

大−一」Ｌ−一ノー 以下、本発明を更に詳細に説明するため実施例を挙げる
。

尚、ＧＩＦ活性は次の方法により測定した。

ＧＩＦ活性の測定 ９６ウエルマイクロプレート（コーニング社）に種々の
濃度に希釈した供試液０．１ｍｌを入れ、次に各ウェル
にヒトメラノーマ細胞Ａ３７５を２×１０４個／−の濃
度で含有する１０％ＦＣ８を含むイーグルスＭＥＭ浮遊
液０．１−を加え、炭酸ガス培養器（ナフコ社製）内で
４日間培養する。

培養終了後、０．０５％ニュウトラルレツド（和光紬薬
社製）０．０５ｍ１２を各ウェルに加え、３７℃で２時
間培養する。上澄液を除去した後、リン酸緩衝整理食塩
水０．３−を各ウェルに静かに加えてウェルを洗浄する
。洗浄液を除去した後、各ウェルにリン酸１ナトリウム
−エタノール等量混合液ｏ、１ｍ１２を加え、マイクロ
ミキサーで数分間振盪し、細胞内に取込まれた色素量を
、９６ウ工ルーマイクロタイトレーシヨンプレート用光
度計（タイターチェックマルチスキャン、フロララボラ
トリーズ社製）を用いて、吸光度５４０ｍμにて測定し
、増殖抑制活性を求める。対照群（コントロール群）の
細胞増殖の５０％抑制を示ず試験群、即ち対照Ｉ！Ｙの
吸光ｆｆｊ測定値の１／２の吸光度測定値を示す試験群
、の希釈倍数の逆数をとり、これをＧＩＦ活性単位とす
る。従って例えばこのＧＩＦ活性が１０単位の場合、こ
の供試液は１０倍希釈してもなお細胞増殖を５０％抑制
する活性を有する。

実施例１ （Ｉ）天然型ＧＩＦの製造 ヒト末梢血リンパ球を、２％牛脂児血清（Ｆｅ２）加Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地に懸濁させ、１×１０６個／−の
濃度の細胞浮遊液に調製した。

この液に抗腫瘍物質誘導剤であるＰ　ＨＡ　−Ｐ（イン
ゲンマメレクチン、ディフコ（Ｄ　１ｒｃｏ）社製）を
０．２％の濃度となるように加え、３７°Ｃで３日間炭
酸ガス培養器（ＮＡＰＣＯ５３００、ナフコ社！！Ｊ）
内で培養し、培養液を遠心分離（２０００ａ　ｘ１０分
）して培養上清を得た。得られた培養上清を以下原料液
とする。

原料液を、硫酸アンモニウム沈澱法（日本生化学金線、
生化学実験講座第１巻、東京化学同人）により分画した
。硫酸アンモニウム濃度５０〜８０％の両分にＧ［Ｆ活
性を有する沈澱が認められた。

この沈澱物をＡｃ　Ａ５４　（ＬＫＢ社）ゲルクロマト
グラフィー（８０ｃｍｘ４．４ｃｍ直径、移動租０．０
２％ポリエチレングリコール（分子量６０００）を含む
リン酸塩緩衝液＜　ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ　
　５ａｌｉｎｅ）　、流速３０ｍｆ２／ｈｒ）に付し、
分子量１万〜２．５万の画分にＧＩＦ活性を認めた。

この両分にはＴＮＦ、ＩＦＮ、Ｃ８Ｆの活性は、認めら
れなかった。

上記ゲルクロマトグラフィーの結果を第１図に示す。図
において横軸はフラクションＮｏ、を示し、縦軸は下記
各測定法に従って求められた各種生理活性及びＯＤ２　
ａ　ｏでの吸光度をそれぞれ示す。

また図には参考のため各フラクションに相当する分子量
を矢印を付して示した。図中（１）はＣ８Ｆ活性を、（
２）はＩＦＮ活性を、（３）はＩＬ−２活性を、（４）
は本発明ＧＩＦ活性を、（５）はＢＣＤＦ活性を、及び
（６）はＴＮＦ活性をそれぞれ示す曲線であり、（７）
は吸光度曲線である。

活性測定 各生理活性の測定は、次の方法によった。

０ＧＩＦ（上記方法に従う）。

０ＴＮＦ　（Ｌ９２９細胞株を使用し、Ａ、）（ｈａｎ
らの方法（Ｈｕｍａｎ　　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ、　
Ａｃａｄｅｍｉｃｐｒｅｓｓ　、　ｐ２３〜３２　（１
９８２）　）に従い活性測定）。

０１ＦＮ（ヒト羊膜由来ＦＬｉＯ胞とシンドビスウイル
ス（Ｓｉｎｄｂｉｓ　　ｖｉｒｕｓ　）を使用した系に
おいてインターフェロン活性測定（須藤哲夫、大久保礼
子、飯塚雅彦、小林茂保、第４２回ウィルス抑制因子研
究会、１９８２年）にて活性測定）。

ｏ　Ｃ８Ｆ　（ｃｏｌｏｎｙ　　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎ
ｇ　ｆａｃｔｏｒ；ファラ（Ｊ、　Ｊ、　Ｆａｒｒａｒ
　）らの方法（Ｊ　、　　ｌ　ｍｍｕｎｏｌ、。

１２７．１９８３　（１９８１））に従いＢＡＬＢ／Ｃ
系マウス骨髄細胞を使用して活性測定）。

ｏ　Ｌ　Ａ　Ｆ　（Ｌ　ｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ａｃｔｉ
ｖａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ、オツベンハイン（Ｊ　、
　Ｊ　、　０ｐｐｅｎｈｅｉｎ）らの方法（Ｊ、　　Ｉ
ｎ＋１ｕｎｏ１．．１１６．１４６６　（１９７６）　
）に従い、Ｃ３）−１／ＨｅＪ系マウスの胸腺細胞を利
用して活性測定）。

０ＩＬ−２（インターロイキン−２、ギリス（Ｓ。

Ｑｉｌｌｉｓ　）とスミス（Ｋ　、　Ａ　、　Ｓ　ｍ１
ｔｈ）の方法Ｌ１．　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２０．２
０２７　（１９７８）　）に従い、Ｉ［−２依存性マウ
スＴ細胞（ＣＴＬＬ２）を使用して活性測定）。

０ＢＣＤＦ（Ｂ細胞分化因子、３−ｃｅｌｌｄｉｒｒｅ
ｒｅｎｔｔａｔ；ｏｎ　ｆａｃｔｏｒ、岸本らの方法〔
Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１２７．４１２　（１９８１）　）
に従い、ＣＥＳＳ細胞株を使用して活性測定）。

次いで上記画分につき、ＰＢＥ９４　（ファルマシア社
製）ゲルを使用してクロマトフオーカシングを行なった
。即ら、開始緩衝液として０．０２５Ｍイミダゾール−
ｊＸＡ酸（ｐＨ４）を用い、また溶出液としてポリバッ
ファー７４−塩酸（ｐＨ１４）を用いて上記画分を分画
し、得られる各フラクションのＧ［Ｆ活性を測定した。

その結果、等電点（ＰＩ）６．４〜６．６の領域にＧＩ
Ｆ活性が存在した。この領域にはＢＣＤＦ活性は認めら
れなかった。

このクロマトフオーカシング分析結果を第２図に示す。

図において横軸はフラクションＮｏ、を、縦軸は０Ｄ２
８０の吸光度（曲線（１）で示される）、ＢＣＯＦ活性
（曲線（２）で示される）、本発明ＧＩＦ活性（曲線（
３）で示される）及びｐ］」（曲１（４）で示される）
をそれぞれ示す。

更に上記ＧＩＦ活性画分を、逆相高速液体クロマトグラ
フィー（Ｃｔハイボアー逆相カラム（ＲＰ３０４）、バ
イオ−ラド社製、直径４，６Ｘ２５０ｍｍ、移動相；Ａ
液＝０．１％−ｒＦＡ、Ｂ液＝０．１％ＴＦＡ＋７０％
アセト二１〜リル、濃度勾配：Ａ液１００％から８０分
間でＢ液１００％とする、流速１ｍｆ２／分）に付し、
アセトニトリルが４４±３％の両分を得た。この両分に
はＩＬ−２の活性は認められなかった。またＧＩＦ活性
とＬ　Ａ　Ｆ活性とは一致しなかった。

上記により、本発明の天然型ＧＩＦを単離した。

上記逆相高速液体クロマトグラフィーの分析結果を第３
図に示す。図において横軸は保持時間（分）を、縦軸は
曲線（１）で示されるアセトニトリルの濃度、曲線（２
）で示される２　８０　ｎ１ｌｌにおける蛋白の吸光度
（ＯＤ　２８０）　、曲線（３）で示される本発明ＧＩ
Ｆ活性、曲線（４）で示されるＬＡＦ活性及び曲線（５
）で示されるＩＬ−２活性をそれぞれ示す。

（Ｉ［）天然型ＧＩＦの製造 ヒト末梢血リンパ球を、１％牛脂児血清（ＦＣ８）、０
．１μｇ／−インドメタシン、２０ｍＭ　　Ｎ−２−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−Ｎ’　−２−エタンスルホ
ン酸（ＨＥＰＥＳ）及び１０μｇ／ｍ１２ＬＰｓ　（デ
ィフコ社製）を加えたＲＰＭ　Ｉ−１６４０培地ニテ、
１ｘｌＯｅ個／ｍＱの濃度の細胞浮遊液に調製した。

この液を、３７°Ｃで２０〜２４時間炭酸ガス１８養器
（ナフコ社製、へ△ＰＣＯ５３００）内で培養し、培養
液を遠心分離（１００００ｒｐｍ　ｘ３０分）して培養
上清２４３００ｍＱを得、次いでこれをベリコン膜〈分
子量カットオフ、１００００：ミリポ７−　（Ｍ　１ｌ
ｌｉｐｏｒｅ）社製）を用いて１０倍に濃縮した。得ら
れた培養上清濃縮液を以下原料液という・。

原料液を、上記（１）と同様に硫酸アンモニウム沈澱法
により水冷下に分画した。硫酸アンモニウム濃度５０〜
８０％の両分にＧＩＦ活性を有する沈澱が認められた。

これを生理食塩水に溶解し、生理食塩水で透析した。

上記！ａ酸アンモニウム分画物を４回に分けて各々４℃
でウルトロゲルＡｃ　Ａ５４　（ＬＫＢ社）を用いたゲ
ルクロマトグラフィーに付した。その条件は次の通りで
ある。

カラム：　８８ｃｍｘ　４　、４ｃｍ直径溶離液：０．
０２％ポリエチレングリコール（分子量６０００）及び
０．０２％ Ｎａ　Ｎ３を含むリン酸塩緩衝生理食塩液（ＰＢＳ） 流　速：３０ｍ１２／時間 フラクション容積：１５ｍ１２／３０分／チューブ各回
とも分子量約１万〜２．５万の画分くフラクションＮｏ
、５７〜６５）にＧＩＦ活性を認め、これを集めた。

この活性画分を、次いで水冷下、ＹＭ−５膜（アミコン
社製）を用いて濃縮し、溶媒を５０ｍＭ酢酸ナトリウム
（ｐｉ−１５，５）とした。濃縮少、マイレックスＧＶ
（０，２２μｍ　：ミリボア社製）で濾過した。

上記で得られた活性画分濃縮処理試料を、２回に分Ｃプ
てジルソン　ハイパーミュエーション　リキッド　クロ
マ！・グラフィー　システム（ジルソン（Ｇｉｌｓｏｎ
）社製）によるイオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ−
ＨＰＬＣ）にかけた。その条件は次の通りである。

力７ム：　ＩＥＸ−５３５ＣＭ　（６，ＯＸｌ　５０ｎ
ｖ、東洋曹達社製） 溶離液Ａ：５０ｍＭ−酢酸ナトリウム（ｐｌ」５．５） 溶離液Ｂ　：Ｑ、５Ｍ−Ｎａ　ＣＱ含有５０ｍＭ−酢酸
ナトリウム（ｐト１５．５） 流　速：０．５或／分 フラクション容積： リテンションタイム ０〜６０　分・・・２ｍＱ／４分／チューブ６０〜１２
０分・・・０．５ｍＧ／分／チューブ１２０〜１８０分
・・・２＋１１１２／４分／チューブ濃度勾配二　　時
間（分）　　　％Ｂ 上記ＣＭ−ＨＰＬＣの結果、ＧＩＦ活性画分は、リテン
ションタイム９０〜９１分に認められた。

上記によるＧｆＦ活性画分（フラクションＮｏ。

４５）を、次いで逆相高速液体クロマトグラフィーに付
した。その条件は、次の通りである。

カラム二０４ハイボアー逆相カラム（ＲＰ３０４、バイ
オ−ラド社、直径４．６ Ｘ２５０１＋１１１＞ 溶離液：Ａ液＝０．１％ＴＦＡ Ｂ液＝アセトニトリル：１％ＴＦＡ （９：　１　） 流　速：１１＋１ｆｌ！／分 チャートスピード： リテンションタイム ０〜５０分・・・５分／Ｃｌ１１ ５０〜８０分・・・２分／ｃｍ 濃度勾配二　　時間（分）　　　％Ｂ フラクション容積：２ｍ１２／２分／チューブ上記クロ
マトグラフィーの結果を第４図に示す。

図において横軸はリテンションタイム（分）を、縦軸は
ＧＩＦ活性（曲線１　）　、２８０ｎｍｌＣオＬｔル蛋
白の吸光度（Ａ２８゜、曲線２）及び溶離液の濃度勾配
（％Ｂ１曲線３）をそれぞれ示す。

リテンションタイム６３．９〜６５．３分に、ＧＩＦ活
性に一致ザる単一の蛋白の吸光度ピークを示すＧＩＦが
得られた。

その比活性は２．１Ｘ１０７単位／ｍ（ｌ蛋白であった
。

１ａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、　Ｋ、の方法（Ｎａｔｕｒｅ　
、　２７７゜６８０　（１９７０））に従い、上記（Ｉ
［）で得たＧＩＦの５Ｏ８−ＰＡＧＥを行なった。その
条件は次の通りである。

試　料：上記ＧＩＦ活性画分１０μＱを乾固した後、ラ
エメリーのサンプル　バッフ ァー（１／２０体積の２−メルカプト エタノールを合む）に溶解し、１００ ℃で４分間処理した。

ゲ　ル：厚さ０．７５ｍｍの１５％ポリアクリルアミド
ゲルを使用した。

電気泳動［？：バイオーラド社製プロチアンを用いた。

泳動条件：２０ｍＡの定電流で２時間泳動させた。

泳動後のゲルをパイオーラド社製シルバースタインキッ
ト（Ｓｉｌｖｅｒ　５ｔａｉｎ　ｋｉｔ　）を用イテ染
色した。その結果を第５図に示す。

第５図においてレーン■は以下の分子量マーカーの結果
であり、レーン■は上記ＧＩＦ試料の結果であり、レー
ン■は０．１％ＴＦＡＩＯμＱを、ＧＩＦ活性画分に代
えて用いて上記レーン■に用いた試料と同じ処理をした
ものの結果を示す。

〈レーン■における分子ｍマーカー〉 ９４に：フオスフオリラーゼ　ｂ ６７に：アルブミン ４３に：オバルブミン ３０に二カルボニック　アンバイトラーゼ２０．１にニ
トリプシン　インヒビター１４．４に：α−ラクトアル
ブミン 上記第５図より、ＧＩＦは、分子量約１８Ｋに単一のバ
ンドとして泳動されることが判る。

等電点電気泳動法（ＩＥＦ） 上記（ＩＩ）で１９たＧＩＦの等電点電気泳動を、ｐ　
Ｈ範囲３，５〜９．５のアンフオラインＰＡＧプレー１
〜（ＬＫＢ社製）及びモデル１４１５（パイオーラド社
製）を用いて行なった。

その条件は次の通りである。

試　料二上記ＧＩＦ活性画分１０μＱを、２５１１１Ｍ
のナトリウムフォスフェートバッファー（ｐＨ７，４）
で５倍希釈して 用いた。

電極液：陽極液＝１Ｍ　　ＨＧＰＯ＆ 陰極液＝１Ｍ　　ＮａＯＨ 泳動条件：定電力ＩＷ／ｃｍゲル幅でゲル分間冷却下（
１０℃）に泳動させた。

染　色：染色は、シルバー　スタイン　キットで行なっ
た。

上記泳動の結果を第６図に示す。該図においてレーン■
及び■は、分子量マーカー２０μＱの結果であり、レー
ン■は上記ＧＩＦ試料５０μＱの結果であり、レーン■
は、０．１％ＴＦＡ１０μＱをレーン■の試料と同様に
して希釈したもの（バッファー）５０μＱの結果を示す
。

また上記泳動後、ゲルを５ｍｍ又は２ｍｍ間隔でスライ
スシ、１ｏ％ＦＣ８加ＲＰＭ　ｌ　１６４０培地１鵬に
て振盪抽出（２日）し、ＧＩＦ活性の測定に供した。等
電点は、泳ｉＩＩ後のｏ　Ｈの測定結果から弾出した。

上記結果を第７図に示す。第７図において横軸はスライ
スしたゲルＮｏ、を、縦軸はｐＨ勾配（破線で示される
）及びＧＩＦ活性（実線のグラフ）を示す。

第６図及び第７図よりＧＩＦの等電点（ｐｌ）は、７．
０２〜６．８８であり、この位置に単一のバンドとして
現れることが判る。

アミノ酸組成比 上記（ＩＩ）で得たＧＩＦを、加水分解（４Ｎ−メタン
スル本ン酸、２４時間）後、オルトフタルアルデヒド（
ＯＰＡ）法により、アミノ酸アナライザー（日立製作新
製）を用いて分析した。

その結果Ｇ［Ｆは、Ｐｈｅを基準として、以下のモル比
で各アミノ酸を含有するものと認められた。

尚、上記分析条件下においては、Ｐｒｏ及びＣｙｓは測
定できない。また３ｅｒ及びＴｈｒは同条件で一般に約
５〜１０％程度分解、することが知られている。

ア　　ミ　　　）　　酸　　　　　　　　モ　　ル　　
比Ａｓｐ及び／又はＡｓｎ　　　　１７．６Ｓｅｒ　　
　　　　１２．１ Ｔｈｒ　　　　　　５．７ Ｇｌｕ及び／又はＧｌｎ　　　　２３．１Ｇｌｙ　　　
　　　８．１ △ｌａ　　　　　　５．２ Ｖａｌ　　　　　　１１．８ Ｍｅ（５・６ １１ｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　４．８Ｌ
ｅｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　１５．４Ｔｙ
ｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　３．９Ｐｈｅ
　　　　　　　　　　　　　　　　　（９）ＬｙＳ　　
　　　　　　　　　　　　　　１５．３ｌ−１ｉｓ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　１．１Ｔｒｐ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ）、８Ａｒｇ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　３．０アミノ酸配列 上記（Ｉ）で得たＧＩＦのＮ端アミノ酸配列を、気相シ
ークエンサー（アプライドバイオシステムズ社製）によ
り決定した。

その結果ＧＩＦのＮ喘２０個のアミノ酸配列は、以下の
ものであると認められた。

Ａ　ｌａ−Ｐｒｏ−Ｖａｔ−Ａｒｑ−８ｅｒ−Ｌ　ｅｕ
−Ａｓｎ−Ｃｙｓ　−Ｔ　ｈｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｒ
（１−Ａ　ｓｐ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　Ｉｎ
　−ＬＶＳ　−Ｓｅｒ　−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｍｅｔ尚、
Ｎ末端より８番目のアミノ酸は、Ｐ　Ｔ　ｌ−（アミノ
酸として検出されなかったことがらＣＶＳと推定した。

生理活性 上記（Ｉｆ）で得たＧＩＦを、前記各種生理活性の測定
試験に供した結果、ＴＮＦ、ＩＮＦ。

Ｃ３Ｆ、ＩＬ−２及びＢＣＤＦのいずれの活性も認めら
れず、之等生理活性物質とは明確に区別される異なる物
質であることが判ると共に、極めて均質であることが確
認された。

各秤レクチンカラムに対する親和性試験上記＜Ｉ）及び
（ＩＩ）で得たＧＩＦの糖結合特異性を調べるために、
以下に示される各レクチンを用いてアフィニティークロ
マトグラフィー〔供試試料３６２４単位１０．０６ｍｇ
１０．５ｍＧ、ゲル容積１−１洗浄液：　ＰＢＳ−−０
，００５％ＰＥＧ　（但しＳＪＡについては０．０５Ｍ
トリス−０，１５ＭＮａ　Ｃａ　、ｐ　Ｈ８，７を使用
）、溶出液：各洗浄液に下記第１表に示す糖を添加した
溶液〕により２等レクチンカラムに対するＧＩＦの結合
性を調べた。

結果を下記第１表に示す。尚各レクチンはいずれもイー
、ワイ、ラボラトリ−（Ｅ、Ｙ。

Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）社より入手した。

第　　１　　表 レクチン ＣｏｎＡ　　　　Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ　ＡＷＧＡ
　　　　Ｗｈｅａｔ　　ＱｅｒｌＡｇ（Ｉｌｕｔｉｎｉ
ｎＵ　Ｅ　Ａ　−Ｉ　　Ｕ　ｌｅｘ　ｅｕｒｏｐｅｕｓ
　　Ａ　ｇｑｌｕｔｉｎｉｎＤＢＡ　　　　Ｄｏｌｉｃ
ｈｏｓｂＨＩｏｒｕｓ　　ＡｇｑｌｕｔｉｎｉｎＷ　Ｆ
　Ａ　　　　Ｗ　１ｓｔａｒｉａ　ｆｌｏｒｉｂｕｎｄ
ａＡ　ｕｌｕｔｉｎｉｎ Ｐ　Ｎ　Ａ　　　　Ｐ　ｅａｎｕｔ　Ａ　ｇｇｌｕｔｉ
ｎｉｎＳ　Ｂ　Ａ　　　　Ｓ　ｏｙｂｅａｎ　　Ａ　ａ
ａｌｕｔｉｎｉｎＳ　Ｊ　Ａ　　　　Ｓ　ｏｐｈｏｒａ
　　ｊａｐｏｎｉｃａ　　Ａ　ｏｇｌｕｔｉｎｉｎレク
チン　　　　　認識される糖鎖 ＣｏｎＡ　　　　（Ｘ−Ｍａｎ＞α−Ｇ＋ｃＷＧＡ　　
　　ＧｌｃＮＡｅβ１−４ＧｌｃＮＡｃＵＥＡ−Ｉ　　
（同　上） ＤＢＡ　　　　α−ＧａｌＮＡｃ ＷＦＡ　　　　（同　上） ＰＮＡ　　　　β−Ｇａｌ ＳＢＡ　　　　ａ−ＧａｌＮＡｃ　＞β−ＧａｌＮＡｃ
ＳＪＡ　　　　β−ＧａｌＮＡｃ　＞β−Ｑａｌ上記（
Ｉ）で得たＧＩＦについての結果を、また第８図に示す
。図において縦軸は供試試料中に存在するＧＩＦ活性聞
を１００％として、各レクチンカラムに吸着せず、通過
した両分（Ｗ）及びカラムに吸着し、溶出液により溶出
された画分（Ｅ）に含まれる活性量の割合を示し、横軸
は各レクチンカラムにおける各両分（Ｗ及びＥ）を示す
。

第８図よりＧＩＦは、上記各レクチンのいずれにも親和
性を示さず、従ってこれらの一般的糖鎖は結合していな
いことが認識された。

また上記（ＩＩ）で得たＧＩＦについての結果も、上記
第８図と同様であった。

安　　定　　性 ＧＩＦの安定性試験を以下の通り行なった。尚、ＧＩＦ
としては上記（Ｉ）で得たもの及び（Ｉ［）で得たもの
をそれぞれ用いたがいずれの場合も同様の結果を与えた
。

ａ、温度安定性 ＧＩＦを第２表に示す各条件下で処理し、その温度安定
性を調べた。即ち上記ゲル濾過画分３５０３単位／−を
各温度でインキュベーションし、処理後の活性量を対照
群に対する残存活性％として求めた。結果を下記第２表
に示す。

第　　２　　表 処　理　条　件　　対照群に対する残存活性％３７℃、
１時間　　　　　　９７％ ５６℃、３０分間　　　　　　０％ ７０℃、３０分間　　　　　　０％ ８０℃、３０分間　　　　　　０％ ４℃、１時間　　　　　　１００％（対照群）ｂ、ｐＨ
安定性 上記ａと同様にしてＧＩＦを第３表に示す各条件（ｉＨ
度は４℃一定とした）下で処理し、そのｐ　Ｈ安定性を
同様にして求めた。結果を下記第３表に示す。

第　　３　　表 処　理　条　件　　対照群に対する残存活性％ｐＨ７，
４，５時間　　　１００％（対照群）ｐＨ２，０，５時
間　　　　６０％ ｐｌ−１４．０．５時間　　　　８０％ｐＨ６，０，５
時間　　　　９０％ ｐ　Ｈ８，０，５時間　　　　９５％ ｐＨ９，５，５時間　　　　７５％ Ｃ１蛋白分解Ｍ素に対する安定性 上記ａと同様にしてＧＩＦの各種蛋白分解酵素に対する
安定性を下記第４表に示す条件下に調べた。結果を同表
に示ず。尚、トリプシンとしてはシグマ社製トリプシン
　タイプ■、１２７００ＢＡＥＥ単位／ｍ（＋蛋白）を
１ｍ（＋／ｍＱの濃度で用いた。またプロナーゼとして
は科研化学社製プロナーゼ（４５００００、ｕ　、ｋ　
／ｇ蛋白）を１　ｍｇ／鵬の濃度で利用した。

第　　４　　表 処　　理　　条　　件　　　　　　　　　　　　　残存
活性％リン酸緩衝生理食塩水（ｐｌ」 ７．４）処理（３７°Ｃ１２時間）　　１００％（対照
群） １ヘリプシン処理（３７℃、２時間）　　　０％プロナ
ーゼ処理（３７℃、２時間）　　　０％上記第４表より
、ＧＩＦはトリプシン処理及びプロナーゼ処理により失
活することが判る。

ＧＩＦ活性の用量作用曲線 （ａ　＞上記（Ｉ）で得たＧＩＦ試料１４４．６単位／
ｍ１２（蛋白濃度７２３　ｎｏ／鵬）を用いて、各種希
釈倍率にお（プるＧＩＦ活性の用量作用曲線を求めた。

結果を第９図に示す。図において横軸は試料の希釈倍率
を、縦軸はＧＩＦ活性（腫瘍細胞増殖抑制率）を示す。

第９図より、ＧＩＦは数＋ｎ（１／−の用量で５０％程
度腫瘍細胞の増殖を抑制することが判る。

（ｂ　）前記（Ｉｔ）で得た天然型ＧＩＦの各種癌細胞
に対する抗腫瘍活性を、以下のコロニー抑制試験及び増
殖抑制試験により試験した。

コロニー抑制試験 １２ウ工ル組織培養プレート（コースタ−（Ｃｏｓｔｅ
ｒ　）社製）を用い、該プレートの各ウェルに各種供試
癌細胞を１０％ＦＣ８含有ＲＰＭ１１６４０培地に２Ｘ
１０２〜５ＸｉＯ２細胞／ウエル（５００μＱ／ウエル
）となる濃度で懸濁させ゛た液を分注する。

上記各ウェルに、ＧＩＦ試料を最終濃度が１．６〜１０
００単位／鵬となる所定量で加える。

またＧＩＦ試料無添加の対照を作成する。

上記各ウェルを３７°Ｃで５％炭酸ガス存在下に、１週
間培養する。その後、培地をアスピレータ−で除去し、
ＣａＣＱ２含有ＰＢＳ　（ＰＢＳ′）　で２回洗浄し、
１００％メタノールで生成したコロニーを固定し、次に
コロニーをギムザ染色して計数する。

コロニー抑制率（％）は、次式により算出される。

コロニー抑制率（％）＝ １−試料のコロニー数　Ｘ１００ 対照のコロニー数 供試筋［１胞として、Ａ−５４９（ヒト肺癌細胞、ｈｕ
ｌａｎ　ｌｕｎｇ　　ｃａｎｃｅｒ　　ｃｅｌｌ、ＡＴ
ＣＣＣＣＬ１８５）を用いた結果を第１０図に示す。図
において横軸はＧＩＦＩｍ度く単位／ＩＩＩＱ）を、縦
軸はコロニー抑制率（％）を示す。

増殖抑制試験 ９６ウ工ル組織培養プレート（コーニング（Ｃｏｒｎｉ
ｎｇ）社製）を用い、該プレートの各ウェルに各種供試
癌細胞を１０％ＦＣ３含有ＲＰＭ１１６４０培地に２Ｘ
１０３〜５×１０３細胞／ウエル（１００μＱ／ウエル
）となる濃度で懸濁させた液を分注する。

上記各ウェルに、ＧＩＦ試料を最終濃度が１〜１０００
単位／−培地となるように各々１００μＱづつ分注する
。またＧＩＦ試料無添加の対照を作成する。

上記各ウェル内細胞を３７℃で５％炭酸ガス存在下に４
〜５時間培養後、ウェルに更に０．０５％ニュートラル
レッドを５０μＱづつ加え、３７℃で５％炭酸ガス存在
下に、１時間インキュベートし、その後、各ウェルをＣ
ａＣＱ２不含ＰＢＳ（ＰＢＳ−＞で洗浄し、色素抽出緩
衝液１００μＱづつを加え、各ウェルの５４０ｎＩ１１
における吸光度（０，Ｄ、’）を測定する。

増殖抑制率（％）は、次式により算出される。

試料のＯＤ 増殖抑制率（％）　＝　１−−　Ｘ　１００対照の００ 供試癌細胞として、ＡＣＨＮ　（ヒト腎臓アデノカルシ
ノーマ、ｈｕｎ＋ａｎ　ｒｅｎａｌ　ａｄｅｎｏｃａｒ
ｃｉｎｏｍａ。

ＡＴＣＣＣＲＬ１６１１）を用いた結果を第１１図に、
また５Ｋ−ＢＲ−３（ヒトプレストアゾツカ／Ｌ、シノ
ーマ、ｈｕｍａｎ　ｂｒｅａｓｔａｄｅｎｏｃａｒｃｉ
ｎｏｍａ、　Ａ　Ｔ　ＣＣＨＴ　Ｂ　３０　）を用いた
結果を第１２図にそれぞれ示す。各図において横軸はＧ
　Ｉ　Ｆ　ｆＪ度（単位／−）を、縦軸は増殖抑制率（
％）を示す。

ＧＩＦ蛋白の一時構造の決定 （１）ヒト末梢血を採血し、フィコール・ハイバークの
密度勾配遠心法’（Ｅ　ｕｒ、　Ｊ　、　　Ｉ　ｍｍｕ
ｎｏｌ、　４　。

８０８　（１９７４））により末梢血リンパ球１　、９
　ｘ　１０１ａｍｔＡ％り。

このリンパ球を４Ｘ１０８／ｍ１２の細胞ａ度で、ヒト
血清５％を含むＲＰＭ１１６４０培地に懸濁させ、直径
９ｃｍのシャーレに分注後、５％炭酸ガス中、３７℃で
１時間培養した。その後、シャーレ底部に付着していな
い細胞を除去し、ウシ胎児血清１０％、ＴＰＡ　（ジグ
７　（Ｓ　１（ｌｎ＋ａ）社製）０．５ｎ（１／−及び
ＬＰＳ　（ディ７＝＋（［）ｉｒｃｏ）社製）１０μｇ
／鯨を含むＲＰＭ１１６４０培地にて細胞を刺激した。

５％炭酸ガス中、３７℃で４時間培養した後、ＰＢＳ及
び０．０２％ＥＤＴＡにて付着性リンパ球９Ｘ１０’個
を得た。

上記においてシャーレ底部に付着した細胞を同様の培養
条件でＬＰ８１０μ（］／ＩＩＩＱで刺激した後、経時
的に培養上清中のＧＩＦ活性を測定した。

結果を第１３図に示した。図において横軸は培養時間（
時間）であり、縦軸はＧ［Ｆ活性（単位／舖）である。

第１３図より、ＬＰＳ刺ｉ１１に４時間後より、Ｇ［Ｆ
活性が培養上清中に出現し、従ってＧＩＦ蛋白質を産生
ずるｍ　ＲＮＡは、ＬＰＳ刺激４時間後のヒト付着性細
胞より調製すればよいことが判る。

（２）上記（１）に従い、ＴＰＡ　　０．５ｑｇ／１２
及びＬＰＳ１０μＯ／＋１１１２で４時間誘導したヒト
付着性リンパ球９Ｘ１０８細胞を、６Ｍ−グアニジンチ
オシアネート溶液（６Ｍ−グアニジンイソチオシアネー
ト、５ｍＭクエン酸ナトリウム（１）Ｈ７、Ｏ）　、０
．１Ｍ２−メルカプトエタノール、０．５％ザルコシル
（Ｓａｒｋｏｓｙｌ　）　３０ｍ１２にて溶解侵、Ｇ１
８Ｇ注射針をつけた５０−注射筒を用いてＤＮＡをせん
断した。この溶液に塩化セシウム（Ｃｓ　ＣＱ　）１２
（ｌを添加し、完全に溶解させた後、その６．４−ずつ
を５．７Ｍ　　Ｃ３ＣＱ（５，７ＭＣｓ　ＣＱ−０，１
ＭＥＤＴＡ）４−に重層し、ベックマンローター（３ｅ
ｃｋｍａｎ　　Ｓ　Ｗ　−４０Ｔ　ｉ　ｒｏｔｏｒ　）
にて２５℃で３１５００ｒｌ）ｌで２０時間遠心した。

沈澱したＲＮＡのベレットを７０％エタノールで洗浄後
、ＴＥ溶液（１０ｍＭトリス−１−ＩＣＱ　、ｐ　Ｈ７
，５，１ｍ　ＭＥＤＴＡ）に溶解し、１／９容の３Ｍ酢
酸ナトリウム（ｐＨ５，２）及び２．２容のエタノール
を加えて、−７０℃で１時間放置した。４℃にて１５０
００ｐｐｍで２０分間遠心し、ＲＮＡを回収し、ＴＥ溶
液に溶解させた。

かくして付着性リンパ球約９ｘ１０Ｂｍ胞から、全ＲＮ
Ａ２５０μｑを得た。

次に、上記で得たＲＮＡからｍ　ＲＮＡを取得するため
に、オリゴ（ｄＴ）−セルロース（Ｃｏｆ　１ａｂｏｒ
ａｔｉｖｅ　　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｌ　ｎｃ、）を用い
てカラムクロマトグラフィーを行なった。吸着は、１０
１Ｍトリス・ＨＣ（１（１）Ｈ７，５）、０．５ＭＮａ
　Ｃ１２，１ｍＭＥＤＴＡにて行ない、カラムを同溶液
にて洗浄後、１１０ｌ１１トリス・Ｉ−Ｉ　ＣＱ（１）
Ｈ７，５）及び１ｍＭＥＤＴＡにてＲＮＡを溶出させた
。

この結果、溶出されたｔａ　ＲＮＡ＆は、１７．５μｇ
であった。

（３）上記（２）で１ｑたｍ　ＲＮＡから、次いでｃ　
ＤＮＡを、インビトロで合成し、オカヤマーベルグのプ
ラスミドベクター（Ｑｋａｙａｍａ、　Ｈ，ａｎｄＢｅ
ｒｃ＋、Ｐ、、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　２
．１６１（１９８２））を用いて組換え体ＤＮＡを作成
し、これをエシェリヒア　コリーに１−ランスホームし
て、ｃ　ＤＮＡライブラリーを作製した。各手法は次の
通りである。

（３−１）ベクター・プライマーとリンカ−ＤＮＡの調
製 ｐ　ＢＲ３２２−８Ｖ４０　（０，７１〜０．８６）Ｄ
ＮＡ４００μｑを、ＫｐｎＩ　（ＮＥＢ）７００単位で
、３７℃で５時間消化し、０．２５ＭＥＤＴＡ　（ｐ　
Ｈ８，０）４０μＱと１０％５ＤＳ２０μＱとの混液で
反応を停止させた後、等容のフェノール−クロロホルム
（１：１）で抽出し、エタノールにてＤＮＡを沈澱させ
、遠心侵、７０％エタノールで洗浄し、ＤＮＡを回収し
た。得られたＤＮＡを１４０１ＩＩＭカコジル酸ナトリ
ウム。

３０ｍＭトリス−ＨＣｌ２　　（ｐ　Ｈ６，８＞、　　
１１ｍＭＣｏ　ＣＱ２．０．１ｍ　Ｍ　　ＤＴＴ及び０
．２５ｍ　　Ｍ　　　ｄ　　ＴＴＰ　　（α−３２Ｐ−
ｄＴＴＰ　　　Ｏ，５μＣ１を含む）２００μＱに溶解
させ、ターミナルトランスフェラーゼ（ＴＴａｓｅ　、
　Ｐ　Ｌ　）　４００単位にて３０分間ｄＴ鎖の伸長を
行なわせ、０．２５Ｍ　　ＥＤＴＡ２０μＱと１０％５
ＤＳ１０μＱとを加えて反応を停止させ、フェノール−
クロロホルム抽出を４回繰返した後、エタノール沈澱に
てＤＮＡを回収した。この結果、ｄＴ鎖は約７０塩基伸
長された。

次に、上記で得たＤＮＡを、ＨｐａＩ（ＮＥＢ）１７単
位を用いて、３７℃で６時間消化し、アガロースく低融
点アガロース、ＢＲＬ、１％）電気泳動にて約２．７ｋ
ｂのＤＮＡ断片の回収を行なった。

電気泳動後、エチジウムブロマイド０．５μｇ／ｍ１２
にてＤＮＡを染色し、ＵＶ照削下で約２，７ｋｂの断片
を含むアガロースを切り出し、５倍容の２０ＩＩＩＭト
リス・ＨＣＱ　（ｐ　Ｈ８，０）−１ｍ　ＭＥＤＴＡを
加え、６５℃で５分間でアガロースを溶解後、フェノー
ル抽出、フェノール−クロロホルム（１：１）抽出及び
クロロホルム抽出を順次行ない、エタノール沈澱にてＤ
ＮＡを回収した。

次にオリゴ（ｄＡ）セルＯ−ス力ラムクロマトグラフイ
ーでベクターブライマーＤＮＡの精製を行なった。上記
ＤＮＡを１０１Ｍトリス・ＨＣＱ（ｐ　Ｈ７，３＞−１
ｍ　ＭＥＤＴＡ−ＩＭＮａ　ＣＱ緩衝液１ｍ１２に溶か
し、氷冷した後、同緩衝液で平衡化したカラムに載せ、
同緩衝液１−で洗浄後、室温に戻して、１０１Ｍトリス
・）−ＩＣＱ（１）ｌ−１７，３）−１＋Ｍ　　ＥＤＴ
Ａで、ＤＮＡを溶出した。溶出のピーク画分を集め、エ
タノール沈澱にてＤＮＡを回収後、１０＋Ｍトリス・ｔ
−１ｃＱ（ｐＨ７，３）−ｉｍｌｖＩ　　ＥＤＴＡｌｏ
ｏ、ｃｌに溶かし、４℃で保存した。

リンカ−ＤＮＡを次の通り調製した。即ち、１）ＢＲ３
２２−８Ｖ４０　（０，１９〜０．３２＞ＤＮＡ１００
μｇを、ＰｓｔＩ　（ＮＥＢ）１２０ｍ位で、３７℃下
、１．５時間消化後、反応を停止させ、フェノール−ク
ロロホルム抽出、エタノール沈澱を行なった。ＤＮＡを
回収し、１４０ｍＭカコジル酸ナトリウム、３０ｍ１ｖ
ｌリス・ＨＣＱ（Ｄ　Ｈ６，８）　、ＩＩＩ　ＭＣｏ　
ＣＱ２．０．１ｍ　ＭＤＴＴ、０．２５ｍ　Ｍｄ　ＧＴ
Ｐ　（１μｃｉのα−３２Ｐ−ｄ　ＧＴＰを含む）５０
μＱに溶解し、ＴＴａｓｅ６０１１１位を２０分間作用
させた。この結果、１８残基のｄＧ鎖が付加された。反
応停止後、ＤＮＡを回収し、ＨｉｎｄＩ［Ｉ（宝酒造）
５０ｍ位で消化し、前記したようにアガロース（１，８
％）電気泳動で約０．２８ｋｂのＤＮＡ断片を回収し、
２、“３μ９のリンカ−ＤＮＡを得た。

（３−２）ｃ　ＤＮＡの合成とＣＤＮＡライブラリーの
作製 ＲＮＡ５μ９を減圧乾燥した後、５ｍＭトリス・ＨＣＱ
　（＋）Ｈ８，３）１０μＱに溶解し、６５℃で５分間
加熱した。直ちに３７℃に移し、反応混合液２０μＱ（
５０ＩＩＭトリス・ＨＣｌ２（１）ｌ−１８，３）、８
ｍＭ　　ＭＯＣＱ２．３０ｍＭＫＣＱ。

０．３ｎ＋　ＭＤＴＴ、２ｍ　Ｍｄ　ＮＴＰ、１０μＣ
１α−３２Ｐ−ｄ　ＣＴＰ）を加え、５分間３７℃にて
保温した。

ＲＴａｓｅ（リバーストランスクリプターゼ、生化学工
業社製）１０ｍ位を加え、３７℃で１５分間反応させた
後、再度ＲＴａＳ０１０単位を加え、更に１５分間保温
した。０．２５ｍＭＥＤＴＡ（ｐ　８．Ｏ＞２μＱと１
０％５Ｏ８１μＱとを加えて反応を停止させた後、フェ
ノール−クロロホルム抽出を行ない、４Ｍ酢酸アンモニ
ウム２０μＱとエタノール８０μＱとを加え、１５分間
−７０℃で凍らせた後、室温で融解し、１５０００ｒｐ
ｍ　、４℃で１０分間遠心し、沈澱させた。沈澱を１０
ｍＭトリス・ＨＣｌ２（ｐＨ７，３）２０μＱに溶かし
、４Ｍ酢酸アンモニウム１９μＱとエタノール８０μＱ
とを加え、再沈澱させた。

沈澱を回収し、７０％エタノールで洗った後、１４０ｍ
Ｍカコジル酸ナトリウム、３０ｍＭトリス＝、１−ｆＣ
Ｑ（＋）８６．８）　、ｉｍＭ　　Ｃｏ　ＣＧ！２．０
．１ｍＭ　　ＤＴＴＳｏ、２μｇボＩＪ　Ａ及び６６μ
Ｍ（α−３２Ｐ）ｄＣＴＰ（１０μＣｉ）の１５１１Ｑ
に溶解した。ＴＴａｓｅ　　（Ｐ、Ｌ、）１８ｍ位を加
え、３７℃で５分間反応させた後、０°Ｃに急冷し、０
．２５Ｍ　　ＥＤＴＡｌ、３μＱと１０％Ｓ［）Ｓ　　
Ｏ，６５μＱとで反応を停止させ、フェノール−クロロ
ホルム抽出及びエタノール沈澱を行なった。

沈澱を遠心して回収後、Ｈｉｎｄｌ［Ｉ（宝酒造）４ｍ
位で３７℃で２時間消化し、反応停止後、フェノール−
クロロホルム抽出し、エタノール沈澱を行なった。沈澱
を回収後、１０ｍＭトリス・Ｈ（１（＋）ｌ−１７，３
）及び１＋＋＋　ＭＥＤＴＡの１０μＱに溶かし、エタ
ノール３μＱを加え、−２０°Ｃで保存した。

上記で得た試料１μＱをリンカ−Ｄ　Ｎ　Ａ　５　ｎｑ
と共に、１０ｍＭトリス−ＨＣＱ　（１）Ｈ７，５）−
１＋ｎ　ＭＥＤ−ｒＡ−０，ＩＭＮａ　ＣＱ　１０ｔｔ
Ｑ中で、６５°Ｃで２分間、次いで４２℃で３０分間保
温した後、０℃に冷却した。これに２０ｍＭトリス・Ｈ
（、Ｑ（ｐＨ７，５）　、４ｍ　Ｍ　　ＭｇＣＯ２、Ｉ
　Ｑｍ　Ｍ　（ＮＨ４）２　ＳＯ２，０，１Ｍ　　ＫＣ
Ｑ　。

０．１１Ｍ　　β−ＮＡＩ）、５０Ｍｇ／凶ＢＳＡ及び
６単位／ｍ１２エシェリヒア　コリーＤＮＡリガーゼの
混合溶液を９０μＱ加え、全液量を１００μＱとし、１
２℃で一夜保存した。

次いで、１０ｍＭ　　ｄ　ＮＴＰ　　０．５．ｃｌ。

１０ｍＭ　　ＮＡＤ　　Ｏ，５６μｌＥ、コリーＤＮＡ
リガ−ゼエ（ベーリンガーマンハイム社製）０．５μＱ
及びＲＮａｓｅ　Ｈ（ＰＬ）　０．２μＱを加え、１２
℃及び２５℃で順次１時間ずつ保温した後、−２０℃で
凍結保存した。

エシェリヒア　コリーＨ８１０１株を、ＬＢ培地（バク
トートリブトン１０ｇ、バクトーイースト抽出物５ｇ及
びＮａ　ＣＱ　１０Ｑ　／Ｑ　）にて、ＯＤｓ　ｓ　ｏ
　＝０．４５ｔｒ培養し、５分間水冷後、４℃で８００
０　ｒｐｍで５分間遠心して菌体を回収した。菌体のベ
レットを氷冷した３０１１１Ｍ酢酸カリウム、１００ｍ
Ｍ　　ＲｂＣＱ、１０＋Ｍ（：、ａ　ＣＱ２．５０１１
　Ｍ　　Ｍｎ　ＣＱ　、　１５％グリセリンに懸濁させ
、０℃で５分間保ち、４℃、８０００ｒｐｍ、５分間遠
心し、得られた菌体を、１０ｎ＋Ｍ　　ＭＯＰＳ（モル
ホリノプロパンスルホニツクアシッド）、７５１Ｍ　　
Ｃａ　Ｃｌ２２．１０ｍＭ　　ＲｂＣＱ、１５％グリセ
リンに再度懸濁させ、０℃にて１５分間保温して、コン
ピテント細胞を作製した。かくして得られたコンピテン
ト細胞は、その後−７０℃で保存した。

凍結菌液を室温で融解し、４００μＱの菌液に対して上
記ＤＮＡ試料２０μＱを加え、３０分間Ｏ℃に放置した
後、４２℃で９０秒間熱シヨツクを与え、再び０℃で１
〜２分間静置した。これに［Ｂ培地２ｍ１２を加え、３
７℃で３０分間保温し、５０容のＬＢ培地に植菌し、３
７℃で６時間培養した後、５０μｑ／−になるようにア
ンピシリンを加え、更に一夜培養し、ＣＤＮＡライブラ
リーを作製した。このｃ　ＤＮＡライブラリーは、５０
％グリセリン中で一２０℃にて保存した。

＜３−３）合成プローブの作製 前記で決定された天然型ＧＩＦのアミノ酸配列（Ｎ末端
より２０残基）より、下記核酸配列を導いた。

Ａｌａ　　−Ｐｒｏ　　−Ｖａｌ　　−△ｒｇ　　−８
ｅｒ　　−（ｅｕ　　−Ａｓｎ　−Ｃｙｓ　−５’　Ｇ
ＣＣＣＣＣＧＴＧ　ＡＧＧ　ＴＣＣＣＴＧ　ＡＡＣＴＧ
Ｃ３’　ＣＧＧ　ＧＧＧ　ＣＡＣＴＣＣＡＧＧ　ＧＡＣ
ＴＴＧ　ＡＣＧＴｈｒ　　−Ｌｅｕ　　−Ａｒａ　　−
Ａｓｐ　　−８ｅｒ　　−Ｇｌｎ　　−Ｇｌｎ　　−Ｌ
ｙｓ　　−ＡＣＣＣＴＧ　　ＡＧＧ　　ＧＡＣＴＣＣＣ
ＡＧ　　ＣＡＧ　　ＡＡＧＴＧＧ　　ＧＡＣＴＣＣＣＴ
Ｇ　　ＡＧＧ　　ＧＴＣＧＴＣＴＴＣ８ｅｒ　　−Ｌｅ
ｕ　　−Ｖａｌ　　−ＭｅｔＴＣＣ″ＣＴＧ　　ＧＴＧ
　ＡＴＧ−３’ＡＧＧ　　ＧＡＣＣＡＣＴＡＣ−５’ 上上記塩基列は、ヒトコドン使用頻度〔ヌクレ−１”／
り　アシッド　リサーチ（Ｎ　ｕｃｌｅｉｃ　　Ａ　ｃ
ｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ　、　９．　ｒ　４３−７４　（
１９８１）より決定した。

上記式に示した塩基配列に対する相補的な塩基配列（最
下段に示す）を、ＧＩＦをコードするｃ　ＤＮＡを有す
る形質転換株の選出のためのプローブとして利用するた
め、以下の方法により合成した。即ち、Ｎ、Ｎ−ジアル
キルメチルホスボロアミダイト誘導体を綜合ユニットと
して用いた、固相ホスファイト　トリエステル法（Ｎ　
ａｔｕｒｅ。

３１０．１０５　（１９８４））にて、自動合成機（３
８０Ａ　　　ＤＮＡ　　　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、Ａ
ｐｐｌｉｅｄＢ　１Ｏ３Ｖｓｔｅｌｌｌｓ　　Ｉ　ｎｃ
、、Ｆｏｓｔｅｒ　　Ｃｉｔｙ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ
９４４０４、ＵＳＡ）を用いて、目的とする完全保ｌＤ
ＮＡを合成した。続いて該完全保護ＤＮＡを２８％アン
モニア水で５５℃で１０時間処理することにより、５′
末端のＯＨ基に結合している保護基としてのＤＭＴｒ　
　（ジメトキシトリチル）基以外の保護基（Ａ、ＧｌＣ
のアミノ基のアシル基をさす）を脱保護させ、部分保護
ＤＮＡ（ＤＭＴｒ体）を得た。次いでこのＤＭＴｒ体を
Ｃ＋ａを担体とする逆相１−Ｉ　Ｐ　ｌ−Ｃにより精製
した後、８０％酢酸で室温で１０分間処理して上記ＤＭ
Ｔｒ基を脱離させ、続いて得られる塩基を、７Ｍ尿素を
含む１０％ポリアクリルアミドゲル電゛気泳動及びパイ
オーゲルＰ−３０（バイオ−ラド社）により精製して、
目的のＤＮＡ　（６０＋＋＋ｅｒ　）を得た。

上記で得たＤＮＡ６μｇを、５０μＱの反応溶液（５０
ＩＩＩＭトリス・Ｉ−ＩＣＱ　（ｐ　Ｈ７，６）、１１
０１ｎ　　Ｍ（ｌ　ＣＱ２．１０ｍＭ　　２−メルカプ
トエタノール、０．２ｍ（１／ｍ１２子牛胸腺ＤＮＡ、
５０μＣｉ　　（α−３２Ｐ）−ＡＴＰ）中で、Ｔ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）１２単位と、３７℃
にて１時間反応させ、ＤＮＡの５′末端をラベルした。

ラベルされたＤＮＡと未反応の３２ｐを分別するために
、バイオゲルＰ−３０（バイオ−ラド社）によるカラム
クロマトグラフィーを行なった。ラベルされたＤＮＡ画
分を１／９容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５容のエタノ
ールにて沈澱させ、遠心して、回収後、１０ｎ＋Ｍｌ〜
リスーＨＣＱ　（ｐ　Ｈ８，０）−１１１１Ｍ　　ＥＤ
ＴＡ４００μＱに溶解し、−２０℃で保存した。

得られたプローブの比活性は１０’ｃｐｍ／μｇＤＮＡ
以上であった。

（３−４）ｃ　ＤＮＡライブラリーのスクリーニンアン
ビシリン５０μａ／ｎ＋Ｑを含むＬＢ寒天培地上に径８
０ＩｌｌＩＩｌのニトロセルロースフィルター（ミリボ
ア）−ＩＡＩＦＯ８２５０）を置き、この上にフィルタ
ー当り５０００コロニーになるように希釈した前記ｃ　
ＤＮＡライブラリー菌液を播き、３７℃にて一夜培養し
た。フィルターは、合計２４枚を作製した。

コロニーの出現したフィルターに新しいニトロセルロー
スフィルターを載せることによって、レプリカフィルタ
ーを作製した。

元のフィルター（マスターフィルター）を、４℃にて保
存し、レプリカフィルターを、上記した寒天培地上で３
７℃で６時間培養後、クロラムフェニコール２００μｇ
／−を含む１Ｂ寒天培地上に移し替え、３７℃で一夜培
養した。

フィルターを、０．５Ｎ　　Ｎａ　ＯＨ１１Ｍトリス・
ＨＣｌ２　（１）　＋１８．　Ｏ）及び１Ｍトリス・Ｈ
ＣＱ　（ｐＨ８，０）−１，５Ｍ　　ＮａＣＱの順で処
理し、風乾後、８０℃真空下で２時間ベーキングを行な
った。

ベーキング済みのフィルターを、１．２ＭＮａＣＱ１０
．１２Ｍクエン酸３ナトリウム、１０ｍＱ／ＭＩＩＱフ
ィコール（Ｆ　１ｃｏｌｌ　）　、１０ｍｃｌ／ｍＱポ
リビニルピロリジン、１０ｍ（１／＋ｎ２８ＳＡ、０．
１％ＳＯ８及び０．１ｍ（１／ＩＩＩＱサルモン　スペ
ラム（Ｓ　ａｌｍｏｎ　Ｓ　ｌｌｅｒｍ）　Ｄ　Ｎ　Ａ
の２０ｍｆ２中で（−￥く１１ＬＩしながら、６８℃に
て一夜保温した。ＦＪ’ａを１．２ＭＮａ　ＣＱ　、０
．１２Ｍクエン酸３ナトリウム、１０１１１（１／−フ
ィコール（Ｆｉｃｏｌｌ　＞　、１０ｍ（１／ＩＩＩＱ
ポリビニルピロリジン、１０ｍ（＋／ｍ１２ＢｓＡ、０
．１％ＳＤＳ及び１’０６ｃｐｍ　／ｍＱ７’ｍ−７’
ＣＭえ、４２°Ｃで一昼夜軽り娠盪し、ハイブリダイゼ
ーションを行なった。

ハイブリダイゼーションの終わったフィルターを取り出
し、１．２ＭＮａ　ＣＱ、０．１２Ｍり工ン酸ナトリウ
ム、０．１％ＳＤＳにて室温で３回洗浄し、その後、６
０℃で同溶液にてフィルターのバックグラウンドのカウ
ントがＧＭササ−イメーターで２００　ｃｐｍになるま
で洗浄した。

フィルターを風乾後、増感紙を用いてＸ線フィルム（フ
ジＲＸ）に−７０℃にて２日間オートラジオグラムを行
なった。

フィルムを現像後、シグナル領域に存在するコロニーを
マスターフィルターよりかき取り、上記の方法を繰返し
てポジティブシグナルを有するコロニーの単離を行なっ
た。

その結果、強いシグナルを有するクローンニー２を単離
した。

（３−５）クローンの解析 クローンＩ−２の有するプラスミドｐＧＩＦ−αのｃ　
ＤＮＡの制限酵素地図を作製した。

その結果を第１４図に示す。

第１４図よりｃ　ＤＮＡ中には、ＮＣ０Ｉ（日本ジーン
）、ＨｉｎｄｌＩｌ（日本ジーン）、ＰｖｕｌＩ（日本
ジーン）及びＡＣＣＩ（日本ジーン）により切断される
個所がそれぞれ１個所ずつ存在し、５′末端よりその順
序で２等制限酵素による切断個所が存在していることが
確認された。また、ｃ　ＤＮＡの良さは、約１．５ｋｂ
であり、分子徂約１８にのＧＩＦを充分にコードできる
長さであることが確認された。

次に、ｐＧＩＦ−αのｃ　ＤＮＡの塩基配列を、マキサ
ム−ギルバートの化学修飾法（Ｍｅ【ｈ。

Ｅｎｚｙｍ、６５．４９９−５６０．１９８０）及びＭ
１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法
（Ｍｅｓｓｉｒ＋ｏ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｖｉｅｉｒａ　
、　Ｊ　、。

Ｇｅｎｅ　、　１９．２６９−２７６　＜１９８２）　
）にて決定した。その結果を下記式に示す。

ＣＴＴＡＴＴＡＣＡＧＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧＧＡＴＧＡ
ＣＴＴＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧＧＣＣＣＴ
ＡＡＡＣＡＧＡＴＧＡＡＧＭｅｔ　　Ｌｙｓ ＴＧＣＴＣＣＴＣＣＣＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＣＣＴＣＴ
ＧＣＣＣＴＣＴＧＣｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌ
ｎ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　ＡＳｐ　　Ｌｅｕ　　Ｃｙ
ｓ　　Ｐｒｏ　　ＬｅｕＧＡＴＧＧＣＧＧＣＡＴＣＣＡ
ＧＣＴＡＣＧＡＣＴＣＴＣＣＧＡＣＣＡＣＡｓｐ　　Ｇ
ｌｙ　　Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　　Ｇｌｎ　　Ｌｅｕ　　Ａ
ｒｃ＋　　Ｉｌｅ　　Ｓｅｒ　　Ａｓｐ　　ＨｉｓＣΔ
ＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣ
ＧＣＧＴＣＡｌ−１ｉｓ　　Ｔｙｒ　　３ｅｒ　　Ｌｙ
ｓ　　ａｌｙ　　Ｐｈｅ　　Δｒｇ　　Ｇｌｎ　　Ａｌ
ａ　　Ａｌａ　　５ｅｒＧＴＴＧＴＴＧＴＧＧＣＣＡＴ
ＧＧＡＣＡＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＶａｔ　　Ｖ
ａｌ　　Ｖａｔ　　Ａｌａ　　Ｍｅｔ　　ＡＳＤ　　Ｌ
ｙｓ　　Ｌｃｕ　　Ａｒ（ｌ　　Ｌｙｓ　　ＭｅｔＣＴ
ＧＧＩ−ＴＣＣＣＴＧＣＣＣＡＣＡＧＡＣＣＴＴＣＣＡ
ＧＧΔＧＡＡＴＬＯＬＩ　　Ｖａｌ　　Ｐｒｏ　　ＣＶ
Ｓ　　ｐｒｏ　　Ｑｌｎ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌ
ｎ　　Ｇｌｕ　　７！ｉ、５ｎＧＡＣＣＴＧＡＧＣＡＣ
ＣＴＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡＡＳＩ
）　　Ｌ（！Ｕ　　３ｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　ｐ
ｈｅ　　ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　Ｉｌｅ　　Ｐｈｅ　　Ｑ
ｌｕＧＡＡＧＡＡＣＣＴＡＴＣＴＴＣＴＴＣＧＡＣＡＣ
ＡＴＧＧＧＡＴＡＡＣＧｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｐｒｏ　　
Ｉｌｅ　　Ｐｈｃ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｎ　　Ｔｈｒ　　
Ｔｒｐ　　Ａｓｐ　　ＡｓｎＧＡＧＧＣＴＴＡＴＧＴＧ
ＣＡＣＧＡＴＧＣＡＣＣＴＧＴＡＣＧＡＴＣＡＣＴＧＡ
ＡＣＴＧＣＡＣＧＣＴＣＣＧＧＧＡＣＴＣＡＣＡＧＣＡ
ＡＡＡＡＬｅｕ　　Ａｓｎ　　Ｃｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｌ
ｅｕ　　Ａｒｏ　　Ａｓｎ　　３ｅｒ　　（３１ｎ　　
Ｇｌｎ　　１ｙｓＡＧＣＴＴＧＧＴＧＡＴＧＴＣＴＧＧ
ＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＣＴＧＡＡ△３ｅｒ　　ｌｅｕ　
　Ｖａｌ　　Ｍｅｔ　　３ｅｒ　　ＧＩＶ　　ｐｒｏ　
　Ｔｙｒ　　Ｇｌｕ　　１−ｅｕ　　１−ｙｓＧＣＴＣ
ＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴＡＴＧＧＡ
ＧＣＡ△Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　ｌ−１ｉｓ　　ｌｅｕ　
　Ｇｌｎ　　Ｑｌｙ　　Ｇｌｎ　　ＡＳＤ　　Ｍｅｔ　
　（３１ｕ　　ＧｌｕＣＡＡＧＴＧＧＴＧＴＴＣＴＣＣ
ＡＴＧ王ＣＣＴＴＴＧＴＡＣΔＡＧＧＡＧｌｎ　　Ｖａ
ｔ　　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ　　３ｅｒ　　Ｍｅｔ　　３ｃ
ｒ　　Ｐｈｅ　　Ｖａｌ　　ＧＩｎ’　ＧｌｙＧＡＡＧ
ＡＡＡＧＴＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＴＡＣＣＴＧＴＧＧＣ
ＣＴＴＧＱｌｕ　　Ｇｌｕ　　３ｅｒ　　ＡＳｎ　　Ａ
ＳＩ）　　Ｌｙｓ　　Ｉｌｅ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ　　
Ａｌａ　　１−ｅｕＧＧＣＣＴＣＡＡＧＧＡＡＡＡＧＡ
ＡＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧ−ｒＣＣＴＧＣ（３１ｙ　　ｌ
ｅｕ　　シｙＳ　　Ｇｌｕ　　１−ｙｓ　　Ａｓｎ　　
Ｉ−ｕｅ　　Ｔｙｒ　　１−ｅｕ　　３ｃｒ　　Ｃｙｓ
ＧＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡＴＧＡＴＡＡＧＣＣＣＡＣＴＣ
ＴΔＣＡＧＣＴＧＶａｌ　　ＬｅＵ　　［ｙｓ　　ＡＳ
Ｉ）　　ＡＳｐＬｙｓ　　Ｐｒｏ　　Ｔｌ１ｒ　　１−
ｃｕ　　Ｈｌｎ　　１ｃｕＧＡＧＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣ
ＣＣＡＡＡＡＡＴ−Ｉ−ΔＣＣＣ△△ＡＧＡＡＧＧｌｕ
　　Ｓｃｒ　　Ｖａｌ　　Ａｓｎ　　ｔ〕ｒｏ　　Ｌｙ
ｓ　　Ａｓｎ　　Ｔｙｒ　　Ｐｒｏ　　ｔ−ｙｓ　　Ｌ
−ｙＳＡＡＧＡＴＧＧＡＡΔＡＧＣＧＡＴＴＴＧ−ｒＣ
ＴＴＣＡＡＣＡＡＧ△丁−△しＶＳ　　Ｍｅｔ　　Ｇｌ
ｕ　　Ｌｙｓ　　Ａｒ（Ｊ　　Ｐｈｃ　　Ｖａｌ　　Ｐ
ｈｅ　　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　ｌ１ｅＧＡＡＡＴＣＡＡ
ＴＡＡＣＡＡＧＣＴＧＧ△△ＴＴＴＧＡＧＴＣＴＧＣＣ
Ｇｌｕ　　［ｌｃ　　Ａｓｎ　　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　
Ｌｃｕ　　Ｇｌｕ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ　　Ｓｅｒ　　
Δ１ａ実施例２ ＜Ｔ）組換えＧＩＦ（ｒ−ＧｆＦ）の製造上記実施例１
（■）の（３−５）で得たクローンＩ−２の有するプラ
スミドｐＧＩＦ−αを、制限酵素ト１ｇ１Ａ　Ｉ　（Ｎ
　Ｅ　Ｂ　）及びＡＣＣＩ（日本ジーン）で切断してポ
リペプチド１をコードする遺伝子５８１ベースベアーズ
（ｂｐ）を切り出し、その５′末端及び３′末端をヌク
レエース　マングビーン（Ｎｕｃｌｅａｓｅ　、　Ｍｕ
ｎｑ　Ｂｅａｎ　、　ＰｈａｒｍａｃｉａＰ　−Ｌ　　
Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）で削った。このフラグ
メン］〜をＭ１３ファージＲＦｎｐ１０のＳｍａＩサイ
トにクローニングし、エシェリヒア　コリーＪＭ　　１
０５に感染させて培養し、ジングルストランド（８８）
−ＤＮＡを得た。

次に得られた５Ｓ−ＤＮＡにＭ１３ユニバーサルブライ
マー及びデオキシＮＴＰＳ　　（宝酒造）の存在下で、
ＤＮＡポリメラーゼ■（クレノーフラグメント）　　（
Ｄ　Ｎ　Ａ　　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩ、Ｋ　ｌｅｎｏ
ｗＦｒａｇｍｏｎｔ　、宝酒造）を働かせてダブルスト
ランド（ｄｓ）−１）ＮＡを合成し、続いて制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ及びＢａｍ１−ＩＩ（日本ジーン）で切断して
目的の制限酵素サイトをもつＤＮＡフラグメン１へを得
た。

このフラグメントをエクスプレッションベクターｐ　Ｉ
ＮｎＩＡ−３（バイオ　テクノロジー（ＢｌｏＴｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ　）　、　Ｖｏｌ、　２　、８１−８５（
１９８４））のＥＣ０ＲＩ及びＢａｍＨＩサイｉ〜ニ挿
入して、所望のプラスミドｏ　ＩＮＩ［Ｉｆ−ＧＩＦ−
αを得た。

以上の概略を第１５図に示す。

上記で得たベクタープラスミドを、エシェリヒア　コリ
ー）−Ｉ８１０１にトランスフオームさせて、所望の形
質転換体を得た。

上記形質転換体をＬ−ブロス培地（アンピシリン５０μ
ａ／ｍＱを含む）で、３７°Ｃで振盪培養し、増殖が０
Ｄ６５０ｎｌｌｌで０．２となった時、培地にイソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉ　ＰＴＧ）
を最終濃度２ｍＭ加え、その添加の２時間、５時間及び
６．５時間接に、培養液各１戒をサンプリングし、遠心
弁１ｔ１ｔ　（１００００ｒｐｍ　。

５分）し、菌体を集め、Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ−リゾチーム−
トリトンＸ１００（最終濃度１％、Ｔｒｉ℃ｏｎ　Ｘ１
０Ｘ１００）１で溶菌後、超音波処理し、サンプルとし
、その有するＧＩＦ活性を検討した。

対照としてベクタープラスミドｏ　ＩＮＩ［［Ａ−３を
用いて同様の方法で試験を行ない、ＧＩＦ活性を調べた
。

結果を下記第５表に示す。

第　　５　　表 エシェリヒア　コ　　ＩＰＴＧ　　　ＧＩＦ活性リーす
Ｂ１０１に　　添加後　　　（単位／トランスフオーム
　　時間　　　　　　噌培養液）させたＤＮＡ　　　　
　（時間） ｐ　［ＮＩＩ［ｆ−５２４２００ 第５表より、プラスミドｐｌＮＩ［［ｆ−ＧＩＦ−αで
トランスフオームざぜた形質転換微生物の培養により目
的とするＧＩＦの製造を行ない＋ｒＪることが判る。

（１’Ｉ）ｒ−ＧＩＦの製造 下記オリゴデオキシヌクレオチド（Ｉ）及び（ｎ）を以
下のようにして合成した。

５’　　　ＣＧＡＴＡＡＴＧＧＣＴＣＣＴＧＴＡＣＧＴ
ＴＣＴＣＴＧＡＡＣＴＧｃＡｃＴｃＴＣ３’　　　　　
　　　　　　　　（Ｉ）５”ＣＧＧＡＧＡＧＴＧＣＡＧ
ＴＴＣＡＧＡＧＡＡＣＧＴＡＣＡＧＧＡＧＣＣ△ＴＴＡ
Ｔ　　　３’　　　　　　　　　　　　　（ＩＩ）即ち
、マクロポーラスシリカに結合した５′−〇−ジメトキ
シトリチル及びＮ−保護デオキシヌクレオシド（アプラ
イド　バイオシステムズ社製）を出発原料とし、３′側
より５′側へ５’　−０−ジメトキシトリチル及びＮ−
保護デオキシモノヌクレオシド−３′−ホスホアミダイ
トを縮合単位として、自動合成機（アプライド　バイオ
システムズ社製、３８０Ａ　　ＤＮＡシンセサイザー）
を用いて順次、ヌクレオチド鎖を延長させた。続いてチ
オフェノールを用いた処理による脱メチル化及び２８％
アンモニアを用いた室温での処理により、シリカよりヌ
クレオチドを脱離させ、完全保護オリゴヌクレオチドを
得た。以上の操作はすべて自動合成機を用いて行なった
（　Ｈｕｎｋａｐｉ　ｌ　ｌｅｒ等、Ｎａｒｕｒｅ　、
３１０，１０５　（１９８４））。

次いで、得られた完全保護オリゴヌクレオチドを２８％
アンモニア水２較で５５℃で１０時間処理してＮ−保護
基を脱離させ、５’　−０−ジメトキシトリチルオリゴ
ヌクレオチドを得た。この１１５聞を用いて、０ＤＳ（
山村化学研究所社製）を担体とする逆相高速液体クロマ
トグラフィーにより精製後、８０％酢酸１５０μＱで室
温で２０分間処理して粗オリゴヌクレオチドを得た。こ
れをＯＤＳを担体とする逆相高速液体クロマトグラフィ
ーにより更に精製して、目的とするオリゴヌクレオチド
を得た。

前記実施例１の（Ｉ［）の（３−５）で得たプラスミド
ｐＧＩＦ−αを、制限酵素ＡＣＣＩ及びＣＩａＩにより
切断後、約１．２キロベースペアー（ｋｂｐ）のＤＮＡ
断片をアガロースゲル電気泳動により単離精製した。こ
のＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラーゼ■（クレノー断片）
を用いて、制限酵素ＡｃｃＩ及びＣＩａＩ切断部分を平
滑末端とした。

一方Ｂａ１ｌｌｌ−ＩＩリンカ−（５’　　　ＣＧＧＡ
ＴＣＣ０３′）の５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナ
ーゼによりリン酸化し、これを先の平滑末端としたＤＮ
Ａ断片に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した後、制
限酵素３ａｍＨＩで切断し、更に制限酵素ＭｓｐＩで切
断し、得られた反応物をアガロースゲル電気泳動に付し
て、約５４０ベースベア（ｂｐ）のＭｓｐＩ−ＢａｍＨ
Ｉ　　ＤＮＡ１ｇ１片を単離精製した。

次に上記で合成した合成オリゴデオキシヌクレオチド（
Ｉ）及び（ＩＩ）の各５′末端を、Ｔ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼによりリン酸化し、上記で得たＭｓ［−［３
ｄｍｌ−ＩＩ　　ＤＮＡ断片に、Ｔ４ＤＮＡリガーピを
用いて連結後、制限酵素ＢａｍＨ１及びＣ１ａ■で切断
し、得られた反応物をアガロースゲル電気泳動に付して
、約５８０ｂｐのＣＩａＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片を単
離精製した。

他方、プラスミドｐＴＭＩ（今本文男１代謝。

Ｖｏｌ、２２．２８９　（１９８５））を、制限酵素Ｂ
ａ１ｌｌＨＩ及びＣ１ａＩで切断後、アガロースゲル電
気泳動によりｔｒｐプロモーター領域を含む約４．４ｋ
ｂｐのＤＮＡ断片を単離精製した。このＤＮＡ断片と、
先に調製した約５８０ｂｐのＣｌａＩ−ＢａｍＨＩＤＮ
Ａ断片とを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結して所望のプラ
スミドｐｔｒｐＱ　［Ｆ−αを得た。

該プラスミドをエシェリヒア・コリーＨ８１０１にトラ
ンスフオームざぜ、目的のトランスフォーマントを、ボ
イリング法（ｂｏｉｌｉｎｇ　ｎ＋ｃｔｈｏｄ）により
得られるプラスミドＤＮＡの制限酵素分析により選択し
た（ＴｏＭａｎｉａｔｉｓ　、　Ｅ、　Ｆ。

］二　ｒｉｔｓｃｈ　　　ａｎｄ　　Ｊ　　、　　Ｓａ
ｍｂｒｏｏｋ　　、　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣＩｏｎｊ
ｎｇ、　ｐｐ３６６　、　Ｃｏ１ｄ　３　ｐｒｉｎｇ　
Ｈａｒｆｏｒｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ、（１９８２））
　　。

以上の概略を第１６図に示す。

また上記トランスフォーマントに組込まれたプラスミド
ｐｔｒｐＧ　Ｉ　Ｆ−αは、これをエシェリヒア・コリ
ーχ１７７６にトランスフオームさせ、該形質転換体を
［５ｃｈｃｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉχ１７７６／ｐｔ
ｒｌ）Ｇ　Ｉ　Ｆ　−（Ｘなる名称ｒ１９８５年１２月
１２日に工業技術院微生物工業研究所に微工研条奇第９
４９号（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−９４９）として寄託されて
いる。

上記形質転換体（エシェリヒア・コリー［−１８１０１
／１）ｔｒｐＧ　［Ｆ−１を、アンピシリン５０μ！Ｉ
Ｉ／１１１１２及びＬ−１〜リブトファン２０μｇ／喧
を含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス
及び０．５％ＮａＣＱ）１０ｍｉｌｉ中で、３７℃で一
晩振盪培養し、この１ｍ１２をアンピシリン５０μａ／
ｍＱ及び１％カザミノ酸を含むＭ９最小培地（０，６％
Ｎａ　２　ＨＰＯｔ　、０．３％ＫＨ２ＰＯａ　　、０
．　０５％ＮａＣｌ０．１　％ＮＨ４ＣＱ　、　２１１
１　Ｍ　　ＩＶＨＩ　ＳＯ４，０，２％グルコース及び
０．１ｍ　ＭＣａ　ＣＱ２　）５０ｍｆｌに植菌し、３
７℃で振盪培養し、５５０ｍμでの吸光度（０，０，）
が１．０となった時点で菌体を集め、１５％シュークロ
ース−５０ｍＭｔ−リス−ＨＣＱ（ｐ　Ｈ８，０）−５
０ｍ　Ｍ　　ＥＤＴＡ　（ｐ　１−１８．０）の溶液５
ｍ１２に懸濁させ、１０ｍｇ／　ｍＱリゾチーム（１０
ＩＩＭトリス・ＨＣＱ（ｐ　１」８．０）で溶解した溶
液）５００μＱを加え、更に０．３％トリトンＸ１００
−１８７．５０１ＭＥＤＴ△（ｐＨ８，０）−１５０ｍ
　Ｍｌ−リス・ＨＣＱ（ｐ　Ｈ８，０）の溶液５纜を加
え、室温で１５分間放置後、更によく懸濁させ、遠心分
離によって菌体抽出物上清を得た。

この菌体抽出物上清につきＧＩＦ活性の測定を行なった
結果は第６表に示す通りであり、培養物１−当り２×１
０６単位の活性が認められた。

第　　６　　表 検　　　　　体　　　　　　　　　　　　ＧＩＦ活性（
単位／ｍ１２培養液） 対照１〈アラレイ培地）　　検出されず対照２（エシェ
リヒア・ コリート１８１０１抽出物）　検出されずエシェリヒア
・コリー １−ＩＢ１０１／ｐｔｒｐＧＩＦ　　　２Ｘ１０６上記
で得た菌体抽出物上清を５Ｏｎ＋Ｍ酢酸ナトリウム緩衝
液（１）ｌ−１５，５）で透析後、ジルソンハイパーミ
ュエーション　リキッド　クロマトグラフィー　システ
ム（ジルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）社製）によるイオン交換
クロマ１〜グラフイー（ＣＭ−ｉ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ）に
かけた。その条件は次の通りである。

カラム：　ＩＥＸ−５３５ＣＭ　（６，Ｏｘｌ　５０ｍ
ｎ＋、東洋曹達社製） 溶離液Ａ　：　５０ｍ　Ｍ−酢酸ナトリウム（ｐ　　ト
１５．　　５） 溶離液Ｂ　：　０．５Ｍ−Ｎａ　ＣＱ含右５０ｍＭ−酢
酸ナトリウム（ｐｌ−（５，５） 流　速：０．５１１１ｉ２／分 フラクション容積： リテンションタイム ０〜６０　分・・・２ｍＱ／４分／デユープ６０〜１２
０分・・・０．５ｍＱ／分／チューブ１２０〜１８０分
・・・２噌／４分／チューブ濃度勾配二　時間（分）　
　　％Ｂ 逆相高速液体クロマトグラフィー 上記ＣＭ−ＨＰＬＣで得たＧＩＦ活性画分（リテンショ
ンタイム９０〜９１分）を、次いで逆相高速液体クロマ
トグラフィーに付した。その条件は、次の通りである。

カラム：Ｃ□ハイボアー逆相カラム （ＲＰ３０４）バイオ−ラド社、直径 ４．６Ｘ２５０ｍｍ 溶離液：Ａ液−０，１％ＴＦＡ、 Ｂ液＝アセトニトリル：１％ＴＦＡ （９：　１　） 流　速：１１ＴＩＩ２／分 チャートスピード： リテンションタイム ０〜５０分・・・５分／ｃｍ ５０〜８０分・・・２分／ｃｍ 濃度勾配二　時間（分）　　　％Ｂ フラクション容積：２ｍＧ／２分／チューブリテンショ
ンタイムが６３．９〜６５．３分に、ＧＩＦ活性に一致
する単一の蛋白の吸光度ピークを示すｒ−ＧＩＦが得ら
れた。

その比活性は２．７Ｘ１０７単位／ｍｃ＋蛋白であった
。

尚、前記実施例１の（Ｉ＞に示した天然型ＧＩＦの逆相
高速液体クロマトグラフィーの分析結果（第３図）によ
れば、該天然型ＧＩＦ活性はＬＡＦ活性とは一致しない
ものの、ＬＡＦ活性は極めてブロードにＷＡ察されＧＩ
Ｆ活性画分にも認められることから、上記で得たｒ−Ｇ
ＩＦについて再度これがＬＡＦ活性を有するか否かを試
験したところ、該ｒ−ＧＩＦはＬＡＦ活性を有すること
が確認された。

ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、　Ｋ、の方法（Ｎａｔｕｒｅ　
、　２７７　。

６８０　（１９７０））に従い、上記（ＩＩ）で得たｒ
−ＧＩＦの５ＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。その条件は次
の通りである。

試　料：上記逆用高速液体クロマトグラフィーにおける
ＧＩＦ活性画分を乾固した後、ラエメリーの１ナンブル
　バッファー （１／２０体積の２−メルカプトエタ ノールを含む（２ＭＥ＋　）又は含まない（２ＭＥ−’
））に溶解し、１００°Ｃで４分間処理した。

ゲ　ル：厚さ１．５ｍｍの１５％ポリアクリルアミドゲ
ルを使用した。

電気泳動装置：バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製プ
ロチアンを用いた。

泳動条件：４０ｍＡの定電流で２時間泳動させた。

泳！ｌｌ後のゲルをバイオ−ラド社製シルバースタイン
キット（３１１ｖｅｒ　５ｔａｉｎ　ｋｉｔ　）を用い
て染色した。その結果を第１７図（２ＭＥ＋の場合）及
び第１８図（２ＭＥ−の場合）に示す。

各図において、レーン■は以下の分子量マーカーの結果
であり、レーン■〜■はいずれも上記ＧＩＦ試料の結果
であり、またレーン■は天然型Ｇ［Ｆの結果である。但
しレーン■では試料１１．７ｎ（ｌを、レーン■では試
料２３．３ｎｏを、レーン■では試料４６．６ｎｇを、
レーン■では試料７０ｎａを、またレーン■では試料１
１７ｎｇを各々用いた。

〈レーン■における分子量マーカー〉 ９４に：フオスフオリラーゼ　ｂ ６７に：アルブミン ４３に：オバルブミン ３０に二カルボニック　アンバイトラーゼ２０．１に：
Ｉ−リブシン　インヒビター１４．４に：α−ラクトア
ルブミン 上記結果より、ｒ　−’Ｇ　Ｉ　Ｆは２ＭＥ÷下におい
ては約１７にの位置に、また２ＭＥ−下においては約１
７．５にの位置にそれぞれ単一のバンドとして泳動され
ることが判る。

等電点電気泳動法（ＩＥＦ） ｒ−ＧＩＦの等電点電気泳動を、ｐＨ範囲３．５〜９．
５のアンフオラインＰＡＧプレート（Ｌ　Ｋ　Ｂ社製）
及びモデル１４１５　（パイオーラド社製）を用いて行
なった。その条件は次の通りである。

試　料：前記ｒ−ＧＩＦの製造＜ＩＩ）で得た形質転換
体を浸透圧ショックで壊した後の上清（１０ｍＭｌ〜リ
スーＨＣ１１）Ｈ ８，０）を、蒸留水で１００（８希釈したちの１０μＱ
利用した。

電極液：陽極液＝１Ｍ　　Ｈ３Ｐ０゜ 陰極液＝ＩＭＮａＯ１−１ 泳動条件：定電力１Ｗ／ＣＩゲル幅で９０分間冷却下（
１０℃）に泳動させた。

染　色：染色は、シルバー　スタイン　キラｉ〜で行な
った。

上記泳動後、ゲルを５＋ｕ＋ｎ又は２．５ｍｍ間隔でス
ライスし、１０％ＦＣ８加ＲＰＭ１１６４０培地１ｍＱ
にて振盪抽出（２日）し、ＧｔＦ活性の測定に供した。

等電点は、泳動後のｌ）　Ｈの測定結果から悼出した。

ｒ−ＧＩＦの等電点（ｐｌ）は約６．５〜６．９であり
、この位置に単一のバンドとして泳動された。

ｒ−ＧＩＦのアミノ酸組成比 上記（ＩＩ）の逆相高速液体クロマ］〜グラフィーによ
り得られたｒ−ＧＩＦの３０１１Ｑを、ｉ２ｍｍＸ１２
０ｍｍのパイレックス製肉厚硬質試験管の底部に注意深
く入れ、水酸化ナトリウム粒を入れたデシケータ−にて
減圧乾燥した。乾燥試料の入った試験管に４Ｎ−メタン
スルホン酸〔０，２％の３−（２−アミノエチル）イン
ドール含有、ピース＜　ｐ　１ｃｒｃｃ　＞社’１）５
０μＱを加え、０．１〜０．２ｎｒｍＨｑで１分間脱気
後、減圧封管した。加水分解は１１８℃のヒーター中で
２４時間を要して行なった。間管後、４Ｎ＝水酸化ナト
リウム４６μＱで中和し、希釈用クエン酸緩衝液で４５
０μＱとした。

アミノ酸分析は、アミノ酸アナテ仲アー（日立製作新製
、日立８３５型分析計）を用い、上記試料溶液２５０μ
Ｑを注入して行なった。分離されたアミノ酸は、オルト
フタルアルデヒド法で検出した。また定量は、試料の前
後に分析した標準アミノ酸で作成した検は線によって行
なった。

その結果を、Ｐｈｅを基準（９モル）として、各アミノ
酸の含有モル比で下記第７表に示す。尚、上記分析条件
下においては、Ｐｒｏ及びＣｙｓは測定できない。また
３ｅｒ、　Ｔｈｒ及びＭｅｔについては、上記分析条件
下での回収率を０内に示した。

第　　７　　表 ア　　ミ　　ノ　　酸　　　　　　　　　　モ　　ル　
　比ＡＳｒ）及び／又はＡｓｎ　　　　１７．１３ｅｒ
　　　　　　１０．９　（８０％）Ｔｈｒ　　　　　　
５．４　（９０％）Ｑｌｕ及び／又はＱ　Ｉｎ　　　　
２３゜８Ｇｌｙ　　　　　　８．３ Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　５，０Ｖ
ａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．８Ｍｅ
ｔ　　　　　　　　　　　　　　　　　５．　５　　（
９０％）１１ｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
４．９ＬｅｌＪ　　　　　　　　　　　　　　　　１５
．ＩＴｙｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　３．９
Ｐｈｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　（９）Ｌ１
２　　　　　　　　　　　　　　　１４．９Ｈｉｓ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　Ｏ，９Ｔｒｐ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　０．８Ａｒ（］　　　
　　　　　　　　　　　　　　　３・　０ｒ−Ｇ（Ｆの
アミノ酸配列 上記（ＩＩ）の逆相高速クロマトグラフィーで得たｒ−
ＧＩＦの１５０μＱを、アプライドバイオシステムズ社
製プロテインシークエンサーにて分析した。生じたＰＴ
Ｈ−アミノ酸を、３３％アセトニトリル水溶液１００〜
５０μＱにて適宜希釈し、その５μＱをウォータースフ
１０Ｂオートサンプラーにて注入した。クロマトグラフ
ィーのシステムは、ペックマン１１２型ポンプ２台を、
４２１型コントローラーで作動させた。カラムはウルト
ラスフェア−０ＤＳ−５μｍの充填された２＋１１＋１
Ｘ２５０１＋１１１１を用い、カラムヒーターにて５５
℃に保った。流速は０．３ｍＱ／分とし、２０ｍＭ酢酸
ナトリウムとアセトニトリルとの混合液を用い、グラジ
ェント溶出法で分離し、２６９　ｎｍでモニターした。

分析は４５分とした。

２０サイクルの分析の結果、前記（Ｉｔ）で得たｒ−Ｇ
ＩＦのＮ末端２０個のアミノ酸配列は、以下のものであ
ると認められた。

Ａ　ｌａ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｖ　ａｌ　−Ａ　ｒｏ　−Ｓ
　ｅｒ　−Ｌ　ｅｕ　−Ａ　ｓｎ　−ＣＶＳ−Ｔ　ｈｒ
−Ｌ　ｅｕ−Ａ　ｒｌＪ−Ａ　５ｌ）−Ｓ　ｅｒ−Ｇ　
１ｎ−Ｇｌｎ　−Ｌｌ／Ｓ−３ｅｒ　−Ｌｃｕ−Ｖａｔ
−Ｍｅｔ　−尚、Ａｒ（＋はＨＰＬＣ系を若干変更して
別途確認した。３ｅｒはｎ１生物の一つで確認し、更に
３２２ｎｍでの確認も行なった。サイクル８では有意の
ビーりが認められず、Ｃｙｓであると推定された。

上記結果から前記（Ｉ［＞でｉＦ４たｒ−ＧＩＦは、ポ
リペプチド１に一致するものと認められる。尚、アミノ
酸配列から計算されたｒ−ＧＩＦの分子量は、１７３７
６．５９である。

抗腫瘍活性試験くインビボ） 上記実施例２の（ＩＩ）で得たｒ−Ｇ［Ｆのインビボに
おける抗腫瘍活性試験を以下の通り行なった。

（１）腫瘍細胞Ａ３７５の１００Ｃ）０００細胞を、Ｂ
ＡＬＢ／Ｃヌードマウスの皮下に接種（ｓ、ｃ、　）し
た（第Ｏ日日）。次いで、第１０日目〜第１５日目に、
ｒ−Ｇ［Ｆの１０万単位／体重を１日１回各々実験初物
の肺癌細胞内に投与した。実験動物名６匹を１試験群と
した。対照（コントロール）群にはｌ）　Ｂ　Ｓのみを
同様に投与した。

試験結果を第１９図に示す、該図において横軸は師瘍細
胞接伸後日数（ロ）を、縦軸は腫瘍重量（ｇ）を示し、
曲線（１）は対照群を、曲！２　（２）はｒ−ＧＩＦ投
与群をそれぞれ示す。また腫ｆＬ；Ａ重量は、ＳＤ士平
均（ｍｅａｎ）で示されており、曲線（１）における＊
はスチュデンツＴ−テストにおけるｐ＜Ｑ、０５を、＊
＊は同テストにおけるＰ＜０．０１を示す。

（２）腫瘍細胞ＭｅｔｈＡの２０００００　ＩＩＩ胞を
、ＢＡＬ［３／ｃヌードマウスに皮内接種（ｉ、ｄ、）
　した（第Ｏ日日）。次いで、第７日日と第８８目に、
ｒ−ＧＩＦの１０万単位／体重を各１同突Ｍ動物のＩｌ
！Ｉ瘍細胞内に投与した。実験動物名７匹を１試験群と
した。対照（コントロール）群にはＰＢＳのみを同様に
投与した。

試験結果を第２０図に示す。該図において横軸は腫瘍細
胞接種後日ａ（日）を、縦軸は腫瘍重量（（＋　）を示
し、曲線（１）は対照群を、曲線（２）はｒ−ＧＩＦ投
与群をそれぞれ示す。また腫瘍重量は、ＳＤ士平均（ｍ
ｅａｎ）で示されており、曲線（１）における＊＊はス
チュデンツＴ−テストにおけるＰ＜０．０１を示す。

上記試験においては、ｒ−ＧＩＦ投与群実験動物の５匹
において腫瘍の退行が認められた。

実施例３ 実施例２で得られたプラスミドｐＧＩＦ−αを利用して
、該実施例２と同様の操作を行なうことにより所望のｒ
−ＧＩＦ、例えばポリペプチド■、■及びＩＶを製造で
きる。

例えばポリペプチドＩＶは、以下の方法により製造でき
る。即ち、先ずプラスミドｐＧ［Ｆ−αから、ｌ−１ｇ
１ＡＩ−ＮｃｏＩ　　ＤＮＡフラグメント（約０．１ｋ
ｂｌ））及びＮｃｏＩ−８ｔｕＩ　　ＤＮＡフラグメン
ト（約０．８ｋｂｌ））の２つのフラグメントを単離す
る。次いでポリペプチドＩＶのアミン末端領域の４アミ
ノ酸コドンを有し、且つプラスミドｐＴＭＩのｔｒｐプ
ロモーターの下流に結合できるように構築した合成オリ
ゴヌクレオチドを、上記Ｈｇ１ＡＩ−ＮｃｏＩ　　ＤＮ
Ａフラグメン１へと連結させる。更にかくして得られた
ＤＮＡフラグメン１−と上記ＮｃｏＩ−３ｔｕＩ　　Ｄ
ＮＡフラグメントとを、順次、プラスミドベクターのｔ
ｒｐプロモーターの下流に結合させる。

かくして、エシェリヒア・コリー内で、ｔｒｐプロモー
ターの制御下に、ポリペプチドＩＶを発現する所望のプ
ラスミドを構築する。

該プラスミドを、プラスミドｐｔｒｐＧＩ　Ｆ−αの代
りに利用して、実施例２と同一操作を繰返すことにより
、目的のポリペプチドＩＶを収得できる。

実施例４ ｐｔｒｐ、Ｇ　Ｉ　Ｆ−αを用いて、サイト−スペシフ
ィック　ミュータジエネシス（３ｉｊｃ　−３ｐｅｃｉ
ｆｉｃＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）　　（Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、８１　。

５６６２−５６６６　（１９８４））の方法に従い、ポ
リペプチドエのアミン末端から７１番目のＣｙｓをＳｅ
ｒに変更したＧＩＦ　（７１３ｅｒ−ｒ−ＧＩＦ）を以
下の通り製造した。

即ち、Ｍ１３１ｎｌｌｌｌファージベクターを、−重鎖
（ｓｓ）ＤＮＡ鋳型とした。プラスミドｐｔｒｐＧ　Ｉ
　Ｆ−αより、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ　　ＤＮＡフラ
グメントを切り出し、Ｍ１３ｍｐ１１ファージのＥＣ０
ＲＩとＢａｍＨＩの制限酵素サイ１へにクローニングし
、これから−重鎖（ｓｓ＞ＤＮＡ　（Ｍ１３−ＧＩＦ−
α）を得、これをミュータジエネシスの鋳型として用い
た。

合成オリゴヌクレオチド（ＣＴＧＴＣＣＴＣＡＧＴＧＴ
ＴＧ（プライマー）〕を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナー
ゼでリン酸化し、これをｓｓＭ　１３−ＧＦ−α　ＤＮ
Ａとハイブリダイズし、アニーリング後、ＤＮＡポリメ
ラーゼエ、クレノーフラグメント及びＴ／ｌＤＮＡリガ
ービで各々処理し、１５°Ｃで１８時間インギュベート
した。

１（Ｉられたｆ）　Ｎ△をＪＭ１０５コンピテント細胞
に１〜ランスフオームし、生じたファージプラークを、
寒天プレート上に５０コロニー植菌し、３７℃で１８時
間培養した。生育したコロニーを含むフィルターを通常
の方法によりアルカリ変性し、乾燥後、８０℃で２時間
ベークした。上記ＤＮＡをプレハイブリダイズした後、
このものと、上記ブライマーを３２ｐ−ｒ　−ＡＴＰで
ラベルした３２ｐ−プローベとを、室温でハイブリダイ
ズさせた。ハイブリダイズさせたフィルターを、６×Ｓ
ＳＣバツフアーで、室温で１０分間、次いで３７°Ｃで
１０分間各々洗浄し、乾燥後、−７０’Ｃで１８８時間
オーミルラジオグラフィー行なった。

変異した５クローンの内から代表としてＭ１３−Ｇ’　
Ｉ　Ｆ　−７１ｓを選びこれをＪＭ１０５に感染させて
培養し、ｓｓＤ　Ｎ　Ａ及びＲＦ　　ＤＮＡを調製し　
Ｉこ　。

上記で１！７たｓｓＤ　Ｎ　ＡのＭ１３デオキシヌクレ
オチド　シーフェンシングにより目的の遺伝子の寞５ｖ
のＵ（ＣルＲを行なった。

また上記ＲＦ　　ＤＮＡにおいて、新しくできた制限酵
素［）ｄｅＩサイトも確認できた。

ＪＭ１０５で増殖させたＲＦ　　ＤＮＡより、ＥＣＯＲ
Ｉ／ＢａｍＨＩフラグメントを調製し、これを前記実施
例２の（Ｉｆ）と同様にして発現プラスミドに組込み、
所望の７１Ｓｅｒ−ｒ　−Ｇ　Ｉ　Ｆ発現プラスミド（
ｐｔｒｐＧＩＦ−α−７１８）を得た。

このプラスミドを用いて、前記実施例２の（ＩＩ）と同
様にして、菌体抽出物上清を得、該上清のＧ［Ｆ活性を
測定した。

結果を下記第８表に示す。

第　　８　　表 検　　　　　体　　　　　　　　　　　　ＧＩＦ活性（
単位／鵬培養液） 対照（エシェリヒア・ コリーＨＢ１０１／ｐｔｒｐ　　４７３．８Ｘ１０３Ｇ
　Ｉ　Ｆ−α） エシェリヒア・コリー １−ＩＢ１０１／１）ｔｒｉ）ＧＩＦ　　４３４．６Ｘ
１０３−α−７１Ｓ抽出物

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１の（Ｉ）に示す天然型ＧＩＦのゲルク
ロマトグラフィー分析結果を示す。第２図は同例のＧＩ
Ｆのクロマトフオーカシング分析結果を示す。第３図は
同例のＧＩＦの逆相高速液体クロマトグラフィー分析結
果を示す。 第４図は実施例１の（ＩＩ）に示す天然型ＧＩＦのゲル
クロマトグラフィー分析結果を示す。第５図は同例のＧ
［Ｆの５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動の結果を示す。第
６図は同例のＧＩＦの等電点電気泳動の結果を示す。第
７図は上記等電点電気泳動によるＧＩＦ活性とＩ））−
１との関係を示すグラフである。第８図は同例のＧＩＦ
の各種レクチンカラムに対する親和性を調べたグラフで
ある。第９図は同例のＧＩＦの各種希釈倍率におけるＧ
ＩＦ活性を求めたグラフである。第１０図は同例のＧ［
Ｆの癌細胞に対するコロニー抑制試験の結果を示すグラ
フである。第１１図及び第１２図は同例のＧＩＦの各種
癌細胞に対する増殖抑制試験の結果を示ザグラフである
。第１３図は同例に示すＧＩＦの培養時間と活性との関
係を示すグラフである。 第１４図は実施例２に用いるクローンＩ−２の有するプ
ラスミドｐＧＩＦ−αの制限酵素地図を示す。第１５図
は実施例２の（Ｉ）に従い上記１）ＧＩＦ−αをベクタ
ープラスミドｐ　ＩＮＤＩＡ−３に組込んでプラスミド
ｐ　［ＮＩ［ｒ−Ｇ［Ｆ−αを構築する概略図を示す。 第１６図は実施例２の（ＩＩ）に従いｐＧＩＦ−αとプ
ラスミドｐＴＭＩとからプラスミド　ｐｔｒｐＧＩＦ−
αを構築する概略図を示す。第１７図及び第１８図は実
施例２の（１［）で得られた組換えＧＩＦの５Ｏ８−Ｐ
ＡＧＥゲル電気泳肋の結果を示ず。第１９図及び第２０
図は、実施例２の（１１）で得られた組換えＧＩＦのイ
ンビボにおける抗腫瘍活性を調べたグラフである。 （以　上） 第　５　図 一、／”’　　　４−ノ一 二・　〇　　− ■■戸′■■ 第８　♂ 第９図 試胴壽状倍半 第１０　　図 Ｈ頭Ｇ　Ｉ　Ｆ　ｉ１７　（ＩＪ／ｒｒｌｔ）−１’；
　　１１　　図 対照ＧＩＦ　５ｊＬ度（／ｍ＋） 第１２図 対照　　ＧＩＦ　Ｊ歴　屋　　　（竪１）ご曲　　　゛ 第１３閲 請肴時間（時間） 第１７　〆 第１８　　図 第１９図 Ｔ、ＳＤ 發；　Ｐ＜　０．０５ ４４伸　：Ｐ＜０．０１ ｆ＠２０図 種廿；Ｐ＜０．０１

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記一次構造のポリペプチドＡをその構成蛋白と
   して含み、腫瘍細胞増殖抑制活性を有することを特徴と
   する抗腫瘍活性物質ＧＩＦ。 【遺伝子配列があります】 〔式中、ＸはＣｙｓ又はＳｅｒを示す。ＺはＨを示すか
   又は下記アミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 で示されるペプチド又はそのＮ末端側からこの配列に従
   い１もしくはそれ以上のアミノ酸を欠失するペプチド又
   はアミノ酸を表わす。〕