JPS61149092A - ヒトインタ−ロイキン１をコ−ドする新規ｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト　インターロイキンｌ又はその主要部をコ
ードするクローン化ＤＮＡ　、該ＤＮＡを組み込んだベ
クター、該ベクターにより形質転換された宿主、並びに
該宿主を培養することにより生産されるヒト　インター
ロイキン１及びそれと実質的に同等の生物活性を有する
物質に関する。

Ｇｅｒｙらはヒト　マクロファージの培養上清中に、マ
イトーゲンによるマウス胸腺細胞分裂作用を促進させる
物質を見い出し、これをリンパ球活性化因子（ｌｙｍｐ
ｈｏｃｙｔｅ　ａｃｔｉｖａｔｌｇ　ｆａｃｔｏｒ。

以下ＬＡＦと略記する）と名付けたが、　１９７９年以
降、インターロイキ／１（以下、ＩＬ−１と略記する）
の名称が用いられている。従って本明細書においてもこ
のような物質をインターロイキン１として扱う。

ＩＬ−１はＴ細胞やＢ細胞の増殖分化を促進させ、また
Ｔ細胞に作用してリンホカイン、特にインターロイキン
２（Ｔ細胞増殖因子）のｉＣ生を促進させる効果を有し
、抗体産生や細胞性免疫の調節にｍ要な役割を果たす因
子の一つと考えられている［５ｔａｒｕｃｈ、Ｍ、Ｊ、
、　ａｔ　ａｌ、、Ｊ、１ｍｍｕｎｏｌ。

１３０．２１９１（１９８３）］。その他、プロスタグ
ランジンＥやコラゲナーゼの産生促進、繊維芽細胞の増
殖促進、又はインターロイキン２やインターフェロンの
存するＮＫ　（ナチュラル　キラー）細胞活性化作用を
増強させる効果があると報告されている［Ｓｉｍｏｎ、
Ｐ、Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、、“Ｌｙｓｐｈｏｋｉｎｅｓ
”ｖｏｌ、８．ｐ、４７（１９８２）　　八ｃａｄｅｍ
ｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ　　Ｉｎｃ、］　　ｅこのようにＩ
Ｌ−１は免疫応答のみならず、生体の防御やその修復等
にも関与する生体物質であり、免疫不全症に対する治療
薬や抗Ｕ瘍剤としての臨床応用が期待されている。

ＩＬ−１のこれまでの取得方法は、主としてマクロファ
ージや末梢単核細胞又はマクロ７７一ジ様株化細胞（例
えばマウスＰ３８ＢＤ　Ｉ細胞）や単球性又は付置性白
血病細胞等を適当な誘導剤の存在下で培養し、その培養
上清中より単離するものである。

ヒ）ＩＬ−１は、ヒト単球性白血病株化細胞であるＵ９
３７細胞及びヒト末梢単核細胞の培養上清から分離精製
され、その分子量が１１．３００及び１５．０００グル
トンであると報告されている［Ｍ＋ｚｅｌ、Ｓ、［Ｉ，
、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、１ｒｓｕｎｏ１．．１３１＋１８
３４（１９８３）：Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｊ、＾、、Ｊ、Ｅ
ｘｐ、Ｍｅｄ、、１６ル７７２（１９８４＞］。

最近、マウスＰ３８８Ｄ　Ｉ細胞を用いマウスＩＬ−１
をコードするｃＤＮＡをクロー二／グし、ＩＬ−１活性
を有する１５６個のアミノ酸から成るポリペプチドを大
腸菌で生産させることに成功したと報告されているＣ　
Ｌｏｍｅｄｉｃｏ　Ｐ、Ｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔ
ｕｒｅ。

３１２．４５８（１９８４）］。

本発明者らは、遺伝子組み換え技術を応用してヒ）ＩＬ
−１を製造すべく鋭意研究を続けた結果、ヒトＩＬ−１
をコードするクローン化ＤＮＡのＱｌ離に成功し、この
クローン化ＤＮＡを組み込んだ組み換え体プラスミドで
形質転換された微生物がＩＬ−１を産生ずることを確認
し、本発明を完成した。

更に詳述すれば、本発明者らはヒト臼型病細胞をｉｎ　
ｖｉｔｒｏで分化誘導剤と共に培養し、マクロファージ
様細胞に分化させた細胞を１１．−１産生のための誘導
剤と共に培養し、該細胞中に目。

−１ｍＲＮＡを産生蓄積させ、このｍＲＮＡを鋳型とし
てｃ　ＤＮＡライブラリーを作製し、この中からヒトＩ
Ｌ−１をコードするＤＮＡのクローン化に成功し、その
塩基配列を決定した。そして、該クローン化ＤＮＡを形
質発現ベクターに組み込ませ、該ベクターで形質転換さ
れた宿主中にヒトＩＬ−１活性を有するポリペプチドを
産生せしめることに成功した。この研究過程において、
ヒ）ＩＬ−１が前駆体としてつくられること及びその全
アミノ酸配列を明らかセした。

本発明に係るヒトＩＬ−１前駆体をコードするＤＮＡは
下記式［Ｉ］の塩基配列で表わされる。

（Ｓ’）ＡＴＧ　ＧＣＣＡＡＡ　ＧＴＴ　ＣＣＡ　ＧＡ
ＣＡＴＧ　ＴＴＴ　ＧＡＡ　ＧＡＣＣＴＧ　ＡＡＧ　Ａ
ＡＣＴＧＴ　ＴＡＣＡＧＴ　ＧＡＡ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　
ＧＡＡＧＡＣＡＧＴ　ＴＣＣＴＣＣＡＴＴ　ＧＡＴ　Ｃ
ＡＴ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＣＴＧＡＡＴ　ＣＡ６ＡＡＡ　
ＴＣＣＴＴＣＴＡＴ　ＣＡＴ　ＧＴＡ　ＡＧＣＴＡＴＧ
ＧＣＣＣＡ　ＣＴＣＣＡＴ　ＧＡＡ　ＧＧＣＴＧＣＡＴ
Ｇ　ＧＡＴ　ＣＡＡＴＣＴ　　ＧＴＧ　　ＴＣＴ　　Ｃ
ＴＧ　　ＡＧＴ　　ＡＴＣＴＣＴ　　ＧＡＡ　　ＡＣＣ
ＴＣＴＡＡΔ　ＡＣＡ　ＴＣＣＡＡＧ　　ＣＴＴ　　Ａ
ＣＣＴＴＣＡＡＧ　　ＧＡＧ　　ＡＧＣＡＴＧ　　ＧＴ
に　　ＧＴＡ　　ＧＴＡ　　ＧＣＡ　　ＡＣＣＡＡＣＧ
ＧＧ　　ＡＡＧ　　ＧＴＴＣＴＧ　　ＡＡＧ　　ＡＡＧ
　　ＡＧＡ　　ＣＧＧ　　ＴＴＧ　　ＡＧＴ　　ＴＴＡ
　　ＡＧＣＣＡＡＴＣＣＡＴＣＡＣＴ　　ＧＡＴ　　Ｇ
ＡＴ　　ＧＡＣＣＴＧ　　ＧＡＧ　　ＧＣＣＡＴＣＧＣ
ＣＡＡＴ　　ＧＡＣＴＣＡ　　ＧＡＧ　　ＧＡＡ　　Ｇ
ＡＡ　　ＡＴＣＡＴＣＡＡＧＣＣＴ　　ＡＧＧ　　ＴＣ
Ａ　　ＴＣＡ　　ＣＣＴ　　ＴＴＴ　　ＡＧＣＴＴＣＣ
ＴＧ　　ＡＧＣＡＡＴ　　ＧＴＧ　　ＡＡＡ　　ＴＡＣ
ＡＡＣＴＴＴ　　ＡＴＧ　　ＡＧＧ　　ＡＴＣＡＴＣＡ
ＡＡ　　ＴＡＣＧＡＡ　　ＴＴＣＡＴＣＣＴＧ　　ＡＡ
Ｔ　　ＧＡＣＧＣＣＣＴＣＡＡＴ　　ＣＡＡ　　ＡＧＴ
　　ＡＴＡ　　ＡＴＴ　　ＣＧＡ　　ＧＣＣＡＡＴ　　
ＧＡＴ　　ＣＡＧＴＡＣＣＴＣＡＣＧ　　ＧＣＴ　　Ｇ
ＣＴ　　ＧＣＡ　　ＴＴＡ　ＣＡＴ　　ＡＡＴ　　ＣＴ
ＧＧＡＴ　　ＧＡＡ　　ＧＣＡ　　ＧＴＧ　　ＡＡＡ　
　ＴＴＴ　　ＧＡＣＡＴＧ　　ＧＧＴ　　ＧＣＴＴＡＴ
　　ＡＡＧ　　ＴＣＡ　　ＴＣＡ　　ＡＡＧ　　ＧＡＴ
　　ＧＡＴ　　ＧＣＴ　　ＡＡＡ　　ＡＴＴＡＣＣＧＴ
Ｇ　　ＡＴＴ　　ＣＴＡ　　ＡＧＡ　　ＡＴＣＴＣＡ　
　ＡＡＡ　　ＡＣＴ　　ＣＡＡＴＴＧ　　ＴＡＴ　　Ｇ
ＴＧ　　ＡＣＴ　　ＧＣＣＣＡＡ　　ＧＡＴ　　ＧＡＡ
　　ＧＡＣＣＡＡＣＣＡ　　ＧＴＧ　　ＣＴＧ　　ＣＴ
Ｇ　　ＡＡＧ　　ＧＡＧ　　ＡＴＧ　　ＣＣＴ　　ＧＡ
Ｇ　　ＡＴＡＣＣＣＡＡＡ　　ＡＣＣＡＴＣＡＣＡ　　
ＧＧＴ　　ＡＧＴ　　ＧＡＧ　　ＡＣＣＡＡＣＣＴＣＣ
ＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧ　　ＧＡＡ’　ＡＣＴ　　ＣＡ
ＣＧＧＣＡＣＴ＾ＡＧ　　ＡＡＣＴＡＴ　　ＴＴＣＡＣ
Ａ　　ＴＣＡ　　ＧＴＴ　　ＧＣＣＣＡＴ　　ＣＣＡＡ
ＡＣＴＴＧ　　ＴＴＴ　　ＡＴＴ　　ＧＣＣＡＣＡ　　
ＡＡＧ　　ＣＡＡ　　ＧＡＣＴＡＣＴＧＧ　　ＧＴＧ　
　ＴＧＣＴＴＧ　　ＧＣＡ　　ＧＧＧ　　ＧＧＧ　　Ｃ
ＣＡ　　ＣＣＣＴＣＴＡＴＣＡＣＴ　　ＧＡＣＴＴＴ　
　ＣＡＧ　　ＡＴＡ　　ＣＴＧ　　ＧＡＡ　ＡへＣＣへ
ＧＧＣＧ（３’）　　　　　　　　　［Ｉ］上記式ＣＩ
］で示される塩基配列を存するＤＮＡは下記式［Ａ］で
表わされるポリペプチドをコードする。

Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　ＡｓＰ　Ｍ
ｅｔ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　ＡｓｐＬｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ
　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　
ＧｌｕＡｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ａｓ
Ｐ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ＬｅｕＡｉｎ　Ｇｌｎ　
Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｓ
ｅｒ　ＴｙｒＧｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ
　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　ＭｅＬＡｓｐ　Ｇ１ｎ５ｅｒ　Ｖａ
ｌ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ目ｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔ
ｈｒ　５ｃｒＬｙｓ　’ｒ’ｈｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌ
ｅｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｙｅ　Ｇｌｕ　ＳｅｒＭｅｔ
　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　
Ｇｌｙい＋ｓ　ＶｉｌＬｃｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ
　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇ１ｎ５
ｅｒ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　ＡｓＰ　ＡｓＰ　ＡｓＰ　Ｌｅ
ｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　１１ｅＡｌａ　　八ｓｎ　　Ａｓ
ｐ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　Ｇｌｕ　　ｌｌ
ｅ　　Ｉｌｅ　　い１Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ
　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　５ｅｒＡ
＋ｎ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａ＋＋ｎ　Ｐｈｅ　Ｍ
ｅｔ　Ａｒｇ　ｌｉｅ　ｌｉｅＬｙ＋＋　　Ｔｙｒ　　
Ｇｌｕ　　Ｐｈｅ　　ｌｌｃ　　Ｌｅｕ　　Ａｓｎ　　
Ａｓｐ　　Ａｌａ　　ＬｅｕΔｓｎ　　Ｇｌｎ　　Ｓｃ
ｒ　　ｌｉｅ　　Ｉｌｃ　　Ａｒｇ　Ａｌａ　　Ａｓｎ
　　Ａｓｐ　　ＧｌｎＴｙｒ　　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　
Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　　Ｈｉｓ　　
Ａｓｎ　　ＬｅｕＡｓｐ　　Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　Ｖａ
ｌ　　Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　　Ａｓｐ　　Ｍｅｔ　　Ｇｌ
ｙ　　ＡｌａＴｙｒ　　Ｌｙｓ　　Ｓｅｒ　　Ｓｅｒ　
　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ　　ＡｓＰ　　Ａｌａ　　Ｌｙｓ　
　ｌ＋ｅＴｈｒ　　Ｖａｔ　　Ｉｌｅ　　Ｌｅｕ　　Ａ
ｒｇ　　Ｉｌｅ　　Ｓｅｒ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　Ｇ
ｉｎＬｅｕ　　Ｔｙｒ　　Ｖｉｌ　　Ｔｈｒ　　Ａｌａ
　　Ｇｌｎ　　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　　ＡｓＰ　　ＧｌｎＰ
ｒｏ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　　Ｌｅｕ　　Ｌｙｓ　　Ｇ
ｌｕ　　Ｍｅｔ　　Ｐｒｏ　　Ｇｌｕ　　ｌ１ｅＰｒｏ
　　Ｌｙｓ　　Ｔｈｒ　　ｌｉｅ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ
　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　ＡｓｎＬｅｕ　　
Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　Ｐｈｅ　　Ｔｒｐ　　Ｇｌｕ　　
Ｔｈｒ　　Ｈｌｓ　　Ｇｌｙ　　ＴｈｒＬｙｓ　　Ａｓ
ｎ　　Ｔｙｒ　　Ｐｈｅ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｖｌ
ｌ　　Ａｌａ　　Ｈｉｓ　　Ｐｒ。

Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｐｈｅ　　ｌｉｅ　　Ａｌａ　　
Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｎ　　Ａｓｐ　　Ｔｙｒ７ｒ
ｐ　　Ｖａｔ　　Ｃｙ＠　Ｌｅｕ　　Ａｌａ　　Ｇｌｙ
　　Ｇｌｙ　　Ｐｒｏ　　Ｐｒｏ　　５ｅｒ１１ｅ　　
Ｔｈｒ　　ＡｓＰ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｎ　　Ｉｌｅ　　
Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ａｇｎ　　ＧｌｎＡ　ｌ　ａ　　
　　　　　　　　　　　［Ａ］ヒ）　［、−１の生物活
性発現には、必ずしも式［Ａ］で表わされるポリペプチ
ドの全構造を必要としない。このことは式［Ａ］中、Ｃ
末端から２０９残基のアミノ酸から成るポリペプチドは
ＬＡＦ活性をイｆしていることからも明らかである。

従って、式［Ａ］で表わされる。１！リペゾ・ｆ・トは
ヒトＩＬ−１の前駆体であり、その生物活性に必須な部
分はそのＣ末端側に存在すると考えられる。

本発明に係るヒトＩＬ−１又はその主要部をコードす’
６ＤＮＡには、式［Ａ］に対応する塩基配列の全部もし
くは一部を存するＤＮＡ及びその部分的に修飾されたＤ
ＮＡ並びにこれらの対立逍伝子変異体ＤＮＡが包含され
るものと理解されるべきである。以下これらのＤＮＡを
“本発明に係るＤＮＡ　”　とｉｔ称する。

更に、本発明に係るＤＮＡを組み込んだ形質発現ベクタ
ーで形質転換された宿主により産生されるポリペプチド
又はその分解物がヒトＩＬ−１と実質的に同等な生物活
性を存するか或いは潜在的にそのような活性を「する限
り、これらのポリペプチドは本発明に係るポリペプチド
に包含されるものと理解されるべきである。以下これら
のポリペプチドを“本発明に係るポリペプチド”と総称
する。

なお、上述の部分的に修飾されたＤＮＡとは、式［Ｉ１
で表わされる全塩基配列又はその部分的塩基配列におい
て、一部のコドンが欠失及び／又は他のコドンで置き換
えた塩基配列、及び／又は他のコドンが挿入及び／又は
付加された塩基配列をイイするＤＮＡを意味する。

（以下余白） 以下に本発明に係るＤＮＡ及び本発明に係る。１′リペ
ブチドの製造法について説明する。

本発明に係るヒトＩＬ−１をコードするＤＮＡは、ヒト
白血病細胞を分化誘導剤と共に培養し、マクロファージ
様細胞に分化させた細胞又はヒトマクロファージ或いは
ヒト末稍単咳はを誘導剤と共に培養し、該細胞からヒ）
　ＩＬ−１ｍＲＮＡを含む両分を分離し、これをもとに
してｃ　ＤＮＡライブラリーを作製し、これよりヒトＩ
Ｌ−１ｃＤＮＡをクロー／化することにより製造するこ
とができる。

このヒトＩＬ−１をコードする１）ＮＡは従来既知の手
法を用いて、該ＤＮＡの塩基配列の一部のコドンが欠失
及び／又は他のコドンで置き換えた塩基配列、及び／又
は他の塩基配列が挿入及び／又は（＝Ｆ加された塩基配
列を存するＤＮＡに修飾することかできる。更に、Ｊ亥
ＤＮＡ又はその修飾体ＤＮＡはさらにそのコドンの一部
を対応する縮重コドンと置き換えることも可能である。

本発明によれば、 （１）　　ヒトマクロファージ又はマクロファージ様細
胞を誘導剤と共に培養する。

（２）　　＝’ｉ細胞からヒ）ＩＩ、−１ｍＲＮＡを含
む両分を分離する。

１３１　　ａ’亥ｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用
いてｓ　ｓ　ｃ　ＤＮＡを合成し、次いでｄｓｃＤＮＡ
に変換する。

＋４１　　ｊｆｄｓｃＤＮＡをベクターに組み込む。

（５）　　該組み換え体を宿主に導入し、形質転換せし
めｃＤＮＡライブラリーを作製する。

（６）該ライブラリーからヒトＩＬ−１をコードするｃ
　ＤＮＡをクローニングする。

（′７）　　所望により、該クローン化ｃ　ＤＮＡを改
築する。

ことによりヒトＩＬ−１又はその主要部をコードする塩
基配列を含むクローン化ＤＮＡを製・造することができ
る。

また本発明によれば、上記のヒトＩＬ−１ｃＤＮＡ又は
それから４かれるＤＮＡを組み込んだ形質発現ベクター
により形質転換した宿主を培養し、その宿主中又は培地
中にヒ）　ＩＬ−１の生物活性或いはＦ２）花店性をイ
ｆするポリペプチドを産生せしめることができる。

以下に本発明に係るＤＮＡの製造ＪＪ法並びに本発明に
係るポリペプチドの製造方法をより具体的に説明する。

本発明に係るＤＮＡの製造 ■、ヒトＩＬ−１ｍＲＮＡの調製 ヒト白血病細胞を用いる場合には、該細胞を１ＸＩＯ’
〜５ＸＩＯ＠個／■１の細胞密度で播き、これに分化誘
導剤を添加する。分化誘導剤の添加量は、その種類、細
胞の種類、培養条件等により異なるが、一般に約１００
〜２，０００ｎｇ／　ａｔ　（最終濃度）が好ましい。

ヒト白血病細胞を分化誘導剤と共に３５〜３８℃、好ま
しくは約３７℃、約５〜１０％炭酸ガス含「空気中、温
度約９０〜１００％で約２４〜７２時間培養する。

ここで使用しうるヒト白血病細胞としては分化誘導剤の
作用によりマクロファージ様細胞に分化するヒト白血病
株細胞はすべて用いることができる。例えばｌ−Ｉ　Ｌ
　−６０細胞（＾ＴＣＣ，ＣＣＬ２４０）　、　ＴＨＰ
−１細胞、　Ｍｏｎｏ−１−２０７細胞が挙げられる。

また、白血病患者から分離した初代細胞も同様に用いる
ことができる。

分化誘導剤としては、例えばホルボールエステル類、メ
ゼレイ／の様なジテルペン系化合物が挙げられる。

培地としては、高等動物細胞の培養に適した各柿合成培
地が用いられ、例えばＲＰＭＩ−１６４０゜イーグルの
ＭＥＭ培地、ダルペフコ変法によるＭＥＭ培地［宗村庚
修編［細胞培養マニュアル」、講談社（＋９８２）及び
Ｃｅ１ｌ　ａｎｄ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、Ｊ
、Ｐａｕｌ。

Ｅ、＆Ｓ、Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ　Ｌｔｄ、（１９７
０）参照］が挙げられる。

培地には全培養液量の約１〜２０％の動物血清（例えば
牛胎児血清、子牛血清）を加えておくのが好ましい。

細胞が培養容器面に付着し、マクロファージ様細胞に分
化したことを確認した後、以下の操作を行なう。なお、
白血病細胞を用いることなく、肺。

＋ｆｎ液、腹腔、胎盤、牌臓等の組織から採取したヒト
マクロファージを用いる場合には上記の分化誘４傑作は
省略できる。

１ユ記の培養を行った後、培？！ｉ液及び７？遁細胞を
吸引除去する。次いで、ＩＬ−１の産生を誘導する誘導
剤（例えばダラム陰性菌より得られたエアトドキシン）
と、蛋白合成阻害剤（例えばシクロへキシミド）を加え
、更に３〜８時間培養することにより、ヒ）　ＩＬ−１
ｍＲＮＡを該分化細胞中に蓄積させる。エントドキシ／
の場合の添加量は一般に約０．１〜ｌ０００μｇ／−ｌ
、好ましくは約１〜１００μｇ／■１であり、シクロへ
キシミドの場合の好ましい添加量は０．１〜５０μｇ／
■ｌである。

培養終了後、該細胞より、例えばＣｈｉｒｇｗｉｎらの
方法［旧ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１８．５２９４（１９
７９＞１により全ＲＮＡを抽出し、次いでこれを常法に
従ってオリゴ（ｄＴ）セルロース又はポリ（Ｕ）セフ１
０−スなどを用いる吸着カラムクロマトグラフィーに付
すか又はバフヂ法によりポリ（Ａ）　ｍＲＮＡ画分を分
離する。このポリ（Ａ）　ｍＲＮＡ画分を酸性尿素アガ
ロースゲル電気泳動又はシフ糖密度勾配遠心分離に付す
ことによりヒト［、−１ｍＲＮＡを濃縮精製するととが
できる。

ここに得られたｍＲＮＡ画分が目的とするヒトＩＬ−１
をコードするｍＲＮＡを含むものであることを確認する
ためには該ｍＲＮＡ画分をタンパクに翻訳させてその生
物活性を調べればよい。例えば該ｍＲＮＡ　ｉ！分をア
フリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓ）の
卵母細胞に注入するか、又は調伏赤血球ライセード、小
麦胚芽のような適当な蛋白合成系に添加してタンパクに
翻訳させ、そのタンパクがＬＡＦ活性を存することを確
認すればよい。

■６ヒトＩＬ−１ｃＤＮＡのクローニング■の工程で得
られたｍＲＮＡ画分を鋳型とし、オリゴ（ｄＴ）をプラ
イマーとして、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ。

ｄＣＴＰ、　　ｄＴＴＰの存在下で逆転写酵素（例えば
トリ骨髄性白血病ウィルス由来逆転写酵素）によりｍＲ
ＮＡと相補的な５ｓｃＤＮＡを合成し、次いでとのｓ　
ｓ　ｃ　ＤＮＡを鋳型にして、逆転写酵素あるいは大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼ■（ラージフラグメント）等を用
いてｄｓｃＤＮＡを合成する。ここに得られたｄ　ｓ　
ｃ　ＤＮＡを、ポリ（ｄＧ）−ポリ（ｄＣ）ホモポリマ
ー伸長法［Ｎｃｌｓｏｎ、Ｔ、Ｓ、、　”Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　；ｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”。

０８．４＋（１９７９）、八ｃａｄｅ＊ｉｃ　　Ｐｒｅ
ｓｓ　　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　　Ｙｏｒｋ参　１１ｆ　　
コのような常法に従って、例えばプラスミドＰｒ３Ｒ３
２２の制限酵素Ｐｓｔｌ切断部位に組み込ませる。

得られた組み換え体プラスミドを、例えばＣｏｈｃｎら
の方法［ｒ’ｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ
＾、６９．２１１０（＋９７２）参照］に準じて例えば
Ｅ、ｃｏｌｉχ１７７６株のような宿主に４人して形質
転換させ、テトラサイクリノ耐性株を選択してｃ　ＤＮ
Ａライブラリーを作製する。

このｃＤＮＡライブラリーからヒトＩＬ−１をコードす
るｃＤＮＡが組み込まれた組み換え体プラスミドを含む
形質転換体を得るには、次の方法を用いることができる
。例えばヒト以外の動物からＩＬ−１をコードするｃ　
ＤＮ、Ａが得られればそのｃ　ＤＮＡをプローブとして
用い、コロニーハイブリダイゼータ１ノ試験［ＩＩａｎ
ａｈａｎ、Ｄ、、ｅｔ　ａｌ、　Ｇｅｎｅ、１０，１３
３（１９８０＞］を行うことによりＭｃＤＮＡプローブ
と相同性のある塩基配列を含むｃ　ＤＮＡを有するクロ
ーンをＭｃＤＮＡライブラリーから釣り上げることがで
きる。

また、上述したような適当なプローブがない場合には、
プラス−マイナス法によるコロニーハイプリダイゼーシ
謬ン試験でスクリーニングすればよい。即ち、■の工程
で得られたヒトＩＬ−１ｍＲＮＡ画分を鋳型として２２
　ｐ　＊識ｃ　ＤＮＡを合成し、これを誘導プラス・プ
ローブとする。別途に、分化誘導操作及び／又はエンド
トキシン等による誘導操作を省略した無処理の細胞から
全ＲＮＡを抽出し、さらに■に示したのと同じ操作によ
り調製したポリ（Ａ）　ｍＲＮＡ　ｌｉ分を鋳型として
、２２　ｐ標識ｃ　ＤＮＡを合成し、これをｉｓマイナ
ス・プローブとする。

上記のｃ　ＤＮＡライブラリーの中から、誘導プラス・
プローブと強く結合し、ｉｓマイナス・プローブとは結
合しないクローンをコロニーハイブリグイゼータ２フ試
験［＋１ａｎａｈａｎ、Ｄ、、ｅｔ　ａｔ、Ｇｅｎｅ、
１０゜ｆ１３（１９８０）］により選択する。

ここに得られたクローンがヒトＩＬ−１をコードするｃ
　ＤＮＡを含有する組み換え体プラスミドにより形質転
換された宿主のクロー／であることを確認し、且つさら
にスクリーニングするために、以下のハイブリダイゼー
ション　トランスレージ・。

７試験を行う。即ち、上記の選択されたクローンからプ
ラスミドＤＮＡを分離し、加熱又はアルカリ変性により
単鎖ＤＮＡとしニトロセルミースフイルターに固定する
。これにヒトＩＬ−１ｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ　ｆｉ１
ｍ分を加えハイブリダイズさせた後、結合したｍＲＮＡ
を溶出回収する。これをアフリカ７メガエルの卵母細胞
に注入し、回収された上記のｍＲＮＡがヒトＩＬ−１を
コードしているか否かを試験すればよい。

以上の方法により、ヒ）　ＩＬ−１ｍＲＮＡと相補性の
ある塩基配列を含むＤＮＡ断片が組み込まれたプラスミ
ドを有する形質転換体のクローンを得ることができる。

このようにして得られるいくつかのクローノ化ＤＮＡ断
片ニツイて例えばＭａＫａｌ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法［Ｐｒ
ｏｃ。

Ｎａｔ、＾ｃａｄ、ｓｃ　ｉ　、υＳ＾、７４．５６０
（１９７？＞］又はＭ１３ファージを用いるジデオキシ
法［Ｓａｎｇｅｒ、Ｐ、、ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｚ＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ八、７４．５４６３（
１９７７）及びＩＩＩｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ園ｏｌｏｇｙ、ｌｏｔ
、２０（１９８３）］に従って塩ｐ配列を解析すること
によりヒトＩＬ−１のアミノ酸配列を含むポリペプチド
をコードする塩基配列を打するクローン化ｃ　ＤＮＡを
最終的に得ることができる。

かくして得られたクローン化ＤＮＡは、必要により常法
に従い、 （１）　その塩基配列の一部のフド／が欠失した塩基配
列、及び／又は （２）　その塩基配列の一部のコドンが他のコドンで置
き換った塩基配列 を有し又は含むＤＮＡに改築することができる。

また、上記ＤＮＡは、その一部のコドンを対応する縮重
コドンと置き換えてもよい。

本発明に係るポリペプチドの製造 上記の様にして得られた本発明に係るりｃＩ−７化ＤＮ
Ａを適当な形質発現ベクターに組込んで本発明のポリペ
プチド生産用ベクターを得ることができる。ベクターと
しては、形質転換させる微生物中で増殖するものはずべ
て用いることができる。

例えばプラスミド（大腸菌ゾシスミド、ｐ旧５３２２な
ど）、ファージ（ラムダファージ誘４体など）。

ウィルス（ＳＶ４０など）が挙げられる。これらは単独
で、又はそれらの組み合せ、例えばｐｎＲ３２２−８Ｖ
４０ハイブリツド　プラスミドなどの形で用いてもよい
、そのＤＮＡの組み込み部位も任ａに選択することがで
きる。即ち、適当な形質発現ベクターの適当な位置を常
法により適当な制限酵素を作用させて開裂させ、その開
裂部位に該クローン化ＤＮＡを適当な長さに処理して組
み込むことができる。

、　　更に詳細には、前記式［Ａ］のアミノ酸配列又は
その主要°部を「し又は含育するアミノ酸配列をコード
するＤＮＡに、必要に応じてその５′末端に開始コドン
　ＡＴＧを付加し、そして３′末端に終止コドン（ＴＡ
Ａ、　ＴＡＧ又はＴＧＡ　）を含む塩基配列をもつＤＮ
Ａ断片を、適当なプロモーター及びシャイン・ダルカー
ノ（ＳＤ）配列に続いて結合させ、ベクター（例゛えば
プラスミド）に組み込むことにより、Ｊ１融合型の該ポ
リペプチド生産用の形質発現ベクターを構築する。また
、融合型の該ボリベプグ・ド生産用の形質発現ベクター
は、宿主中で発現し得るオペ口／の構造遺伝子の翻訳領
域の途中に読み枠をあわせて、上記の塩基配列を含むＤ
ＮＡ断片を挿入すればよい。

プロモーターとしては、例えばｌａｃ、　ｔｒｐ、　ｔ
ａｃ。

ｐｈｏＳ、　ｐｈｏＡ、　　ＰＬ、　　ＳＶ４０初期プ
ロモーター等が挙げられる。

これらの形質発現ベクターを微生物又は動植物細胞のよ
うな宿主、例えば大腸菌に、例えばＣｏｈｅｎらの方法
［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕｓ＾、ｆ１
９．２１１０（１９７２）］により導入することにより
形質転換体を得、次いで該形質転換体を培養することに
より目的とするポリペプチド又はそのＮ末端にメチオニ
／が結合したポリペプチドを産生させることができる６
Ｍ生産物は使用したプロモーターと形質発現ベクターの
構築法により、宿主中の細胞質内又は細胞質外のいずれ
にも蓄積させることができる。細胞質外に分泌させるに
は、分泌型蛋白の遺伝子２例えばアルカリボスフ１ター
ゼ遺伝子（ｐｈｏ＾）やり７酸ｖ１合蛋自逍伝子（ｐｈ
ｏＳ）を用い、それらのングナルベプチドをコードする
領域に続いて１」的とするポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを結合させた形質発現ベクターを構築すればよい。

このようにして得られた形質転換体を、それぞれの形質
転換体に応じた適当な培養条件下で、目的のポリペプチ
ドが十分に産生されるまで培養したのち、培養物からポ
リペプチドを抽出する。ａ生したポリペプチドが細胞質
内に蓄積される場合は例えば、リゾチーム消化と凍結融
解や超音波破砕、フレ７チプレス等により宿主細胞を破
壊したのち、遠心分離又は濾過にて抽出液を集める。ま
た、竺すプラスムにＭ植される場合は、例えば１ｌｉｌ
ｌｓｋｙらの方法［Ｊ、Ｄａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　１
２７，５９５（１１１７６）］に従って抽出することが
できる。

このようにして得られた粗製のポリペプチドは一般的な
蛋白の精製法、例えば限外濾過、透析。

イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動、
アフィニティクロマトグラフイー等の組み合わせにより
ｆ＋’ｉ製することかできる。更に、得られたポリペプ
チドを酵累等で処即して、他の、１：リベプヂドに誘導
するとともできる。

本発明に係るポリペプチドの製剤化にあたっては、溶液
及び凍結乾燥品のいずれでも良いが、長期安定性の点か
ら凍結乾燥品が望ましい。そして賦形剤や安定化剤を添
加するのが好ましい。安定化剤としては、例えばアルブ
ミン、グロブリフ。

ゲラチ／、プロタミ７．プロタミ／塩、グルコース、ガ
ラクトース、キシロース、マ／ニフト、グルクロ／酸、
トレハロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデ／プ
ン、非イオン界面活性剤（ポリオキシエチレン脂肪酸エ
ステル、ポリオキシエチレ７アルキルエーテル、ポリオ
キシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエ
チレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン
グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン硬化ヒ
マシ油、ポリオキンエチレンヒマシ油、ポリオキ／エチ
レ／ポリオキシプロビレ／アルキルニーフル、ポリＡキ
シエチレ／ポリＡ１／ゾ１−ビレ／ブロックポリマー、
ソルビタ／脂肪ｆｆ１＝スノル、シｙＮ脂肪酸エステル
、グリセリフ脂肪酸エステル）笠が挙げられる。

本明細書では記（ｙの簡略化のために以下の略記を使用
する。

Ａ　　　　　アデニン Ｃシトシ／ Ｇ　　　　　グアニン Ｔ　　　　チミン Ａｌａ　　　　　アラニン Ａｒｇ　　　　　アルギニン Ａｓｎ　　　　　　アスパラギン Ａｓｐ　　　　　　アスパラギン酸 Ｃｙｓ　　　　　システィン Ｇｌｎ　　　　　　グルタミン Ｇｌｕ　　　　　　グルタミン酸 Ｇｌｙ　　　　　グリシ７ 旧Ｓ　　　　　ヒスチジ／ １１ｅ　　　　　　イソロイシン Ｌｃｕ　　　　　　Ｌｌイシン １、ｙｓ　　　　　　　リジシ Ｍａｔ　　　　　　メチオニノ Ｐｈｅ　　　　　　フエニルアラニン Ｐｒｏ　　　　　　プロリン Ｓｃｒ　　　　　セリン Ｔｈｒ　　　　　スレオニ／ Ｔｒｐ）リプトノ１ノ Ｔｙｒ　　　　　チロシ／ Ｖａｌ　　　　　バリン ＤＮＡ　　　　　　デオキシリボ核酸 ｃ　ＤＮＡ　　　　　相補ＤＮＡ ５ｓｃＤＮＡ　　　単鎖ｃ　ＤＮＡ ｄｓｃＤＮＡ　　　二重鎖ｃ　ＤＮＡ ＲＮＡ　　　　　　リボ核酸 ｍＲＮＡ　　　　　伝令ＲＮＡ ｄＡＴＰ　　　　　デオキシアデニル酸三り７ＭｄＣＴ
Ｐ　　　　　デオキンシチジノ三リン酸ｄＧＴＰ　　　
　　デオキングア７ン／三すノ酸ｄＴＴＰ　　　　　デ
オキシチミジン三り／酸オリゴ（ｄＣ）　　　オリゴデ
オキシチミル酸ポリゴ（ｄＧ）　　　オリ′ｔデＡトシ
グγニル酸オリゴ（ｄＴ）　　　オリゴデオキシチミジ
ル酸ポリ（Ａ）　　　　　ポリアデニル酸 ポリ（Ｕ）　　　　ポリウリジル酸 ポリ（ｄＡ）　　　　ポリデオキシアデニル酸ポリ（ｄ
　Ｃ）　　　　ポリデオキシシチジル酸ポリ（ｄＧ）　
　　　ポリデオキシグアニル酸ポリ（ｄＴ）　　　　ポ
リデオキシチミジル酸ＡＴＰ　　　　　アデノシン三リ
ン酸 ＥＤＴＡ　　　　　エチレンジアミン四酢酸ｋｂ　　　
　　　キロ塩基 ｋｌ＞ｐ　　　　　キロ塩基対 ｂｐ　　　　　　塩基対 以下に実施例、参考例及び試験例を挙げて本発明を更に
具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。

また下記の実施例等の説明の理解を容易にするため第１
〜３図を示した。

第１〜３図は形質発現ベクターｐＨＬＩ’ｌｏＩの構築
１（°−を小ず◎ （以下余白） 実施例１ ヒトＩＬ−１をコードするｃｌ）ＮＡのり１−ニノグ及
び塩基配列の決定 １１Ｌ−６０細胞をペトリディフシュ（直径８ＣＩ）に
ｌＸｌ０’個／　ｌ０ｍ１／　ｄｉｓｈの条件で播いた
。培養液には１０％牛脂児而清含イｆのＲＩ’ＭＩ−１
６４０培地を用い、分化誘導剤としてホルボール−１２
−ミリステート−Ｉ３−アセテートとビクミノＡＩ！！
ｔをいずれも最終濃度として５００ｎｇ／■Ｉになるよ
うに添加した。３７℃で５％炭酸ガス含ｔＴ空気中、１
Ｍ度８０〜１００％で２日間培養したのち、培養液と浮
遊細胞を吸引除去した。分化した細胞が付むしたディツ
シュに１０％牛脂児血１ｎ含イｒＲＰＭＩ−１６４０培
地に誘導剤としてエントドキシ／（大腸菌由来のりボボ
リサブカライド）をｌＯμｇ／■Ｉ濃度に、蛋白合成阻
害剤としてシクロへキシミドを１Ｍｇ／■１濃度に添加
した培ｊｌｌｌの１０１を加え、更に５時間培養した。

培養終了後、培養液を吸引除去し、ディツシュ上に残っ
た分化細胞を０，５％ラウ１イル→Ｊ°ル：Ｉシ／ｒＬ
ｆＪ、ナトリウノ、＋　　５　ｍＭクエノ酸ナトリウム
及び０．１Ｍ　２−メルカプトエク／−ルを含む６Ｍグ
アニジルチオシアネート液で溶解し、ホモジナイズした
。このホモジネートをＯ，ＩＭ　ＥＤＴＡ含佇５．７Ｍ
塩化セシウム水溶液上に重層し、超遠心分離機（ＲＰＳ
２７−２０一クー２日立工Ｉｔ）を用い２８，５００μ
ｊｍで２０時間遠心し全ＲＮＡ画分をベレツトとして得
た。これを０．３５Ｍ　　ＮａＣｌ、　２０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ及び２０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む７Ｍ尿素液の少量に
溶解し、エタノール沈殿として回収した。ＨＬ−６０細
胞の１．５ＸＩＯ’個より全ＲＮＡとして１．７■ｇが
得られた。

この全ＲＮＡ画分を１　ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ
Ｔｒｊｓ−ＩＩＣＩ　緩衝液（ｐＨ７，４）　　（以下
ＴＥ液という）２１に溶解し、６５℃で５分間加熱した
。これにＮａＣｌ溶液を０．５Ｍとなるように加え−た
後、あらかじめ０．５Ｍ　ＮａＣＩを含むＴＥ液で平衡
化したオリゴ（ｄＴ）セルゴースカラムに付し、吸着し
たポリ（Ａ）　ｍＲＮＡをＴＥ液で溶出することにより
、７５μｇのポリ（Ａ　）　ｍ　ＲＮ　Ａを得た。この
、１゛す（Δ）　ｍＲＮＡをアフリノＪノメガエルの卵
（コｌ細訃１にマイクロインジェクタ１フ法で７を人し
、その１０個を１００μｊのパース培養液［Ｇｕｒｄｏ
ｎ、Ｊ、Ｂ、、Ｊ。

Ｅｍｂｒｙｏｌ、Ｅｘｐ、Ｍｏｒｐｈｏｌ、、２０．４
０１（１９０８）］中、２２°Ｃで２４時間培養し、ホ
モジナイズした後、その遠心分離上清液を検液として、
　ＬＡＦ活性を測定した（１１１！定法は試験例■項参
照）。その結果、卵母細胞１個当たり、ポリ（Ａ）　ｍ
ＲＮＡの約１５０ｎｇを注入し、上記培養条件で培養し
て？１）た検液の３２０倍希釈液で約１５，０００〜＋
８，０ＯＯｃｐ箇の　’　ｌ−１−チミン／の取り込み
を認め、該ポリ（Ａ）　ｍＲＮＡ調製品中にＩＬ−１ｍ
ＲＮＡが含まれていることを確認した。

ここで得られたポリ（Ａ）　ｍＲＮＡを以下の実験に用
いた。

（２１ｃＤＮＡの合成 （１）項で得られたポリ（Ａ）ｍＲＮＡを＠Ｄ型として
Ｇｕｂｌｅｒらの方法［Ｇｅｎｅ、２５，２０３（＋９
８３）］に阜じてｃ　ＤＮＡを合成した。該ポリ（Ａ）
　ｍＲＮＡ　（６ｕｇ＞を６μｌ　Ｏ）　Ｊ留水に溶解
させ、これに０．６μｌの１００ｍＭ水酸化メチル水銀
水溶液を添加し室温で１０分間放置した。次いで、２０
単位のＲＮＡ分解酵素阻害剤（ＲＮａｓｉｎ＠　、Ｐｒ
ｏｓｅｇａ　Ｄｉｏｔｅｃ社製品）を金製品００ｍＭ　
２−メルカプトエタノール液の蔦、７μｌを添加した。

室温で５分間装置したのち、更にｌ０ｍＭ　ＭｇＣｌ２
．１．２５ｍＭ　ｄＧＴＰ、　１．２５ｍＭ　ｄＡＴＰ
。

１．２５ｍＭ　ｄＴＴＰ、　０．５ｍＭ　ｄＣＴＰ、　
０．１７μＭ　ａ−”Ｐ−ｄＣＴＰ　（比活性、　７５
０Ｃｉ／＠−０１８）　、　４８ｇオリゴ（ｄＴ）　Ｉ
ｔ−ｔｓ、　１２０単位トリ骨髄性白血病ウィルス由来
逆転写酵素を含む３２μＩの５０ｍＭＴｒｉｓ−ト夏Ｃ
Ｉ　　（１）８８．３）緩衝液を添加し、４２℃で６０
分間反応させた後、　ＥＤＴＡを加えて反応を停止させ
た。フェノール／クロロホルム混液（１：　ｌ）で抽出
し、その水層に酢酸アンモニウムを終濃［２，５Ｍにな
るように加え、エタノールにより反応生成物（ｓｓｃＤ
ＮＡ−ｍＲＮＡ　１１合体）を沈殿させた。このｓｓｃ
ＤＮＡ−ｍＲＮＡ　ｖ１合体を下記組成の反応Ｔａ衝液
１００μｌに溶解した。

反応！ｌｌ液液組成 ５　ｍＭ　ＭＭＣＩ２．　　ｌ０ｍＭ　　（Ｎｌｌａ）
２ＳＯ４，１００ｍＭＫＣｌ、　０．１５ｍＭβ−二；
１チアγミド　アデニ７　ジヌクレオチド、４０μＭ　
ｄＧＴＰ、　４０μＭｄＡＴＩ’、　４０μＭ　ｄＴＴ
Ｐ、　４０μＭ　ｄＣＴＰ、及び５μｇウシ血清アルブ
ミン、　１．２５単位大腸菌リボヌクレアーゼＨ，２４
単位大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■を含む２０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣＩ　（ＰＩ−１７，５）緩衝液。

該溶解液を１２℃で６０分間反応させ、これに２．５単
位の大腸！　ＤＮＡリガーゼを添加し、更に２２℃で６
０分間反応させた。ＥＤＴＡを加えて反応を停止させた
後、上記と同様にフェノール／クロロホルム混液で抽出
し、エタノールにより反応生成物（ｄｓｃＤＮＡ　）を
沈殿させ、回収した。

ａ）　オリゴ（ｄＣ）テール付加ｃ　ＤＮＡの調製■項
で得られたｄ　ｓ　ｃ　ＤＮＡを下記組成の反応緩衝液
１００μｌに溶解させ、３７℃で３０分間反応させ、ｄ
　ｓ　ｃ　ＤＮＡにオリゴ（ｄＣ）テールを付加させた
。

反応ｍ新液組成： ２　ｍＭ　ＣｏＣ１＊、　０．２ｍＭジチオスレイトー
ル。

０．１ｍＭａ−”ｌ’−ｄｃＴＩ）　（比活性Ｉ　ＣＩ
／　−ｗｏｌａ）及びＩＯ中位ターミナルデオキシヌク
レオチジルトラ／ス７エラーゼを含有する１００ｍＭカ
コジル酸ナトリウム（ＰＨ７，２）　。

反応はＥＤＴＡ水溶液を添加して停止させ、フェノニル
／クロロホルム混液で抽出し、オリゴ（ｄＣ）テール付
加ｄ　ｓ　ｃ　ＤＮＡをエタノールにより沈殿させ回収
した。これを１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び！００ｍＭＮａｃ
Ｉを含む１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　ｓ　−）ＩＣ１（ｐｌ（
７，４）ｗ！街液にて、２μｇ７’ａｌの濃度に溶解さ
せた。

４）　組み換え体プラスミドの作製 オリゴ（ｄＧ）付加ｐＢＲ３２２（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　
Ｒｅｓ、Ｌａｂｓ。

ｌｎｃ、ｌｌ）と（３）項で得られたオリゴ（ｄ　Ｃ）
付加ｄｓｃＤＮＡを１．５１の１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び
１００ｍＭ　ＮａＣ１を含むｌ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ
Ｉ　（ＰＨ７，４）　１１１衝液中、それぞれ１．５μ
ｇ及び０．０９μｇ含むように溶解混合させた後、６５
℃で１０分間、５７℃で２時間、さらに４５℃で２時間
加温しアニーリングを行い、組み換え体プラスミド溶液
を調製した。

４）項で得られた組み換え体ゾシスミド溶液を用い、Ｅ
、ｃｏｌ＋χ１７７０株を形式転換させた。叩ち、Ｅ、
ｃｏ目χ１７７６株を、ジアミノピメリンａ１００ａｇ
／■１及びチミジン４０μｇ／■Ｉを補ったし一ブロス
（組成＝１１当りトリプトン１０ｇ、酵母エキス５　ｇ
　、ＮａＣ１５ｇ、　　ブドウ糖１　ｇ　、　　ｐｔｔ
　７．２）　２０ｍ１中、３７℃で吸光度（６００ｎ■
）が０．５となるまで培養し、国体を遠心分離し、　５
０ｍＭ　ＣａＣｌ＊含ｆｒｌ。

ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩＩＩ衡液（ＰＨ７，３）　１０ｍ
１にて洗１した。

集めた国体を同じ緩衝液２１に懸濁させ、０℃で５分間
静置した。この懸濁液０．２１に上記組み換え体プラス
ミド溶液０．亘■１を添加混合し、０℃で１５分間静置
し、更に４２℃で２分間保持した後、上記の培養で用い
たのと同一組成の【５−プロス０．５１を加えて１時間
振盪培養を行った。この培養液の一部を取り、上記組成
に加えてテトラサイクリン（１５μｇ／ｍｌ）が添加さ
れたｉ、−ブロス寒天平板に広げ３７℃で約１２時間培
養し、テトラサイクリン耐性菌を選択してｃ　ＤＮＡラ
イブソ　　リ　−　を　イ／１　５Ｊ　Ｌ　　ｔこ　。

（６）　　り１１−二７グ ６）項で得られたｃＤＮＡライブラリーからヒトＩＬ−
１をコードするｃ　ＤＮＡを含むプラスミドを打する形
質転換体をスクリーニングするため、参考例に示したウ
サギＩＬ−１をコードすると思われるクローン化ｃ　Ｄ
ＮＡをプローブとして用い、コロニーハイブリグイゼー
タ９ン試験を行った。

参考例に示した方法により得た組み換え体プラスミドＰ
ＲＬ１５から制限酵素シ■、夏により組み込まれたｃ　
ＤＮＡ断片（約１．１ｋｂｐ）を切り出し、これをＰに
て標識しプローブとした。

約２万個のクローンから、該″ＰｍＰｍ−−ブと強く結
合する塩基配列を含むｃ　ＤＮＡを有するクロー７’ｌ
ｔ５個選び出した。この５クローンの中から２　ｋｂｐ
以上の大きさのｃ　ＤＮＡが挿入された組み換え体プラ
スミドを含む２クローンを選び、ハイブリダイゼーショ
ン　トランスレージ讐ノ試験を行った［　１Ｊａｎｉａ
ｔｔｓ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、、“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣＩ
ｏｎ＋ｎｇ”３２９（１９８θ）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、］　ｅ名りｌｌ−７より
プラスミドＤＮＡを抽出し、ニドＩ＋セルｊｌ−ス　フ
ィルター十に加熱変Ｈさせたのチ固定し、これに上記（
１）項で得たヒ）ＩＩ、−１ｍＲＮＡを含む両分を含む
ポリ（Ａ）　ｍＲＮＡを加え、５０℃で５時間反応させ
、ハイブリダイズさせた。

結合したｍＲＮＡを溶出回収した後、アフリカ７メガエ
ルの卵母細胞に注入し、回収されたｍＲＮＡがＩＬ−１
をコードするものであるか否かについて検定した。この
試験により、いずれのクローンについてもヒトＩＬ−１
ｍＲＮＡと強くハイブリダイズするｃＤＮＡが組み込ま
れたプラスミドを含むことを確認した。

この２クローンから約２．１ｋｂＰの大きさのｃＤＮＡ
が押入された組み換え体プラスミド（プラスミド番号ｐ
ＨＬ４　；クローン番号χ１７７Ｇ／　ｐＨＬ４　）に
ついて、クローン化ｃ　ＤＮＡを１１１＠Ｌ下記の方法
で塩基配列を決定した。

■　クローン化ｃ　ＤＮＡの塩基配列の決定（ｅ項で選
択された形質転換体（χ１７７０／　ｐＨＬ４）をジア
ミノピメリン酸及びチミジンを添加したＬ−ゾロス［６
）項＃照］で培養し、その菌体からＷ　ｉ　ｌｋ　ｉｅ
らの方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、？
。

８５９（１９７９）］に従って、プラスミドＤＮＡを得
た。

このプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔ　Ｉで分解し、
分離精製してクローン化ｃＤＮＡを得た。

制限酵素５ａｃＩ　、　ＲｓａＩ　、旧ｎｄｎ１．旧ｎ
ｃ■。

Ｆｎｕ４ＨＩ、旧ｎｔ　Ｉ　＋　Ｂａｌ　Ｉ及びＥｃｏ
ＲＩを用い、それぞれ単独又は２！ｉの制限酵素の組み
合せにより、上記クローン化ｃＤＮＡを分解し、１５０
〜７００ｂｐのＤＮＡ断片を切り出し、分離精製して塩
基配列解析に用いた。

各ＤＮＡ断片の塩基配列はＭ１３ファージを用いるジデ
オキシ法にて決定した。Ｍ１３■ｐ１８及びＭ　１３ｍ
ｐ１９　　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ−Ｌ　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ社製）をクローニングベクターとし、Ｍ
１３シークエンシングキット（＾ｍｅｒｓｈａａ　Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃ社製）を用い、″Ｍ１
３クローニング及びシーフェンシングへンドブフク”（
＾曹＠ｒｓｈ！■Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｐｌｃ
社製）に従って実施した。

その塩基配列及びその塩基配列から推測されるアミノ酸
は下記第１表に示すとおりである。

第１〜３番の塩基が開始コドｙＡＴＧであり、第８１４
−８１０番の塩基は終止コドンＴＡＧである。

このアミノ酸配列からは、典型的なシグナルペプチドの
配列［Ｗｏｎ　Ｈｅ１Ｊｎｅ、Ｇ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉ
ｏｃｈａｍ、。

凰３３，１７（１９８３）］は存在しない、これはマウ
スＩＬ−１の例にも認められている［　Ｎａｔｕｒｅ、
３１２．　。

４５８（１９８４＞］　。

（以下余白） ｔｔＩ１表 ＣＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＣ
ＡＴＴＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＴＴＧＡＧＴＣＡＧＣＡＡ
ＡＧＡＡＧＴＣＡＡＧＰ　ｒ　ＯＬ　Ｖ　Ｓ　Ｉハｒｌ
　Ｉｅ’ｌ’ｈｒ（ｊｌｙ５ｃｒＧＩｕ’ｌハ「八ｓｎ
［註］※※※は終止フドノを示す。

（以下余白） 実施例２ ヒ）ＩＬ−１ポリペプチドの生産 （１２ヒトＩＬ−１生産用形質転換体の作製ｔｒｐプロ
モーターを用いて、ヒトＩＬ−１生産用形質発現ベクタ
ーを第１〜３図に示すように構築した。

実施例１−■項に示すごとく組み換え体プラスミドｐＨ
Ｌ４からヒトＩＬ−１をコードする塩基配列を含むクロ
ー）化ｃ　ＤＮＡを得た。該ｃＤＮＡ（２０ｕｚ＞を１
００ｕｌの反応１＠衝液［５０ｍＭ　ＮａＣｌ　。

６　ｍＭ　ＭｇＣＩ２及び６　ｍＭ　２−メルカプトエ
タノールを含むｌ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐａｔ
　７．５）　Ｂ衝液］に溶解し、制限酵素Ｉ目ｎｄｍ　
（２４０単位）にて３７℃で００分間反応させた後、更
に１００μｌの０．２ＭＮａＣｌを加え、制限酵素Ｓｅ
ａ　Ｉ　（１００単位）にて３７℃で６０分間反応させ
た。次いで、ＮａＣｌを終Ω度０，３Ｍになるように加
え、更に２倍容のエタノールを添加し、ＤＮＡ断片を沈
殿させ回収した。これを５％ポリアクリルアミドゲル電
気泳動に付しヒトＩＬ−１をコードする領域を含む約１
．０ｋｂｐＯ）　１）ＮＡ　＋ＩＩＴ　Ｉ’ｌを分離精
製し、約５μＨ得ラオＬだ。

このＤＮＡ断片に次の式 で示される合成オリゴヌクレオチド　アダプターをＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。ここに得られたＤ
ＮＡ断片を、以下ＨＩＬ−アダプター断片という。

一方、ｔｒｐプロモーター　ベクターｐＤＲ？２０［Ｒ
ｕ５ｓｅｌｌ、Ｄ、Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、２
ら２３１（＋９８２）　；Ｉ’ｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ−
Ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｗｉｃａｌｓ社製］に制限酵素　　。

社製−Ｒ１とシソ−Ｉを作用させ、トエプロモーター領
域の一部を含むＤＮＡ断片（３５ｂｐ）を切り出し、そ
の１ＩｐａＩにより切断された平滑末端に続いて、これ
に次の式 で示される合成オリゴヌクレオチド　アダプターをＴ４
ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。

ここに得られたＤＮＡ断片を、以下υ」−プロモーター
断片という。

別途に、プラスミ　ドｐ　ＩＩ　Ｒ：１２２の２０ｔす
τを１００１ｚｌ！の上記反応緩衝液に溶解し、制限酵
素１ｌｉｎｄＴ［Ｉ　（１８０単位）にて、３７℃で１
３０分間反応させたのち、７□ノール／クロロホルム混
液によるｈ１１出後、エタノール沈殿としてＤＮＡを回
収し、これを２０μａのＴＥ液（実施例１−（１）項参
照）に溶解した。

該溶解液の１０μｌをとり、これに４０μｐの反応緩衝
液［Ｉ２，５ｍＭ　ＭｇＣＩ２　、０．１２５ｍＭジチ
オスレイト　−　ル　、　　　０．２５ｍＭ　　ｄＧＴ
Ｐ　　、　　　０．２５ｍＭ　　ｄＡＴｌ’　　。

０．２５ｍＭ　ｄＴＴｒ’　、　０．２５ｍＭ　ｄＣＴ
Ｐ　、　２．５４ｇのウシ血清アルブミン、及び２．６
１１位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ！　（ラージフラグ
メント）を含む１３２．５ｍＭ’Ｔｒｌｓ−）ＩＣＩ　
（ｐＨ７，２）　Ｂ樹液］を添加し、２０°Ｃにて６０
分間反応させた後、反応生成物をフェノール／クロロホ
ルム混液による抽出、次いでエタノールにより沈殿させ
回収し、これを２０μｍ（ＤＴＩ’、液に溶解した０以
上の操作により、ｐ［ＩＲ３２２ＤＮＡを制限酵素１Ｈ
ｎｄｌｌ＋で開裂させ、次いで得られた直鎖二重鎖ＤＮ
Ａの末端を平滑末端に修復したｌ）Ｎ　Ａか得られた。

更に、該ＤＮＡを制限酊＆：１・ｅｏＲＩにより２つの
断片に切断し、γノピンリ／耐性逍伝子を含む大きなり
ＮＡ断片（約４．３ｋｂｐ）を単離精製した（以下、こ
のＤＮＡ断片をｐ［ＩＲ３２２−＾叶１断片という、、
）。

上記１−１１　Ｌ−アダプター断片とり」、プロモータ
ー断片のそれぞれ制限酵素Ｃ１ａｌの粘着末端をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼを用いて結合させた。このようにして得ら
れた両端にそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩの粘着末端と、
平滑末端をもつＤＮＡ断片を、上記ｐＢＲ３２２−Ａｍ
ｐｒ断片ドア４ＤＮＡ　’）　ｉｆ　　＋　ヲ用イテ結
合させ、ヒトＩＬ−１生産用形質発現ベクター（ｐＨＬ
ＰＩ０１＞を構築した。

この形質発現ベクターを下記の方法によりＥ、ｃｏｌｉ
　ｌ１ｎ１０１に４人し形質転換体を得た。即ち、Ｅ、
ｃｏｌｉ’ｌｌ［ＩＩＯＩをＬブロス（組成：ｌｌ当た
り、トリプトン１０ｇ、酵母エキス５　ｇ、　ＮａＣｌ
　５　ｇ。

ブドウＮ　１　ｇ　：　ｐＨ７，２）の５璽ｌに接種し
、３７℃で一夜培養した。その菌体懸濁液の１ｍｌを１
００１の■７ブロスに接種し、濁度（吸光度０５０ｎｓ
）が０．６になるまで３７℃で培養した。氷水中で３０
分間静置後、菌体を遠心分離により集め、これ′ｉ：’
５０ｍ１の５０ｍＭ　ＣａＣ＋２に懸濁し、０℃で００
分間静置した。次いで、遠心分離により菌体を集め、２
０％グリセリンを含む５０ｍＭ　ＣａＣＩ　ｘの１０１
に再肪濁した。

この懸濁液に上記の形質発現ベクターｐＨＬＰＩＱ＋を
添加し、これを氷水中で２０分間、４２℃で１分間、室
温で１０分間イノキュベートした後、ＬＩ３ブロス（組
成は次項参照）を加え、３７℃で６０分間振盪した。そ
の菌体懸濁液の一部を２５μｇ／ｍｌア／ピシリンを含
むＬＢ寒天平板に（ａき、３７°Ｃで一夜培養した後、
アンビシリフ耐性クロー７を選択して形質転換体を得た
。この形質転換体を１ＩｎｌｏＩ／ｐＨｌ、ＰＩＯＩと
名づけた。

■　ヒトＩＬ−１ポリペプチドの生産 （０で得た形質転換体ＨＩＩＩＯＩ／ｐＨＬＰＩｏＩを
ＬＢブａス（組成：１１当たり、トリプト７１０ｇ、酵
１（工、トス５！【及びＮａＣｌ　ｌｏｇ　、　　ｐＨ
７，５）中３７°Ｃで一夜振りま培養した。その菌体懸
濁液のＯ，１ｍｌを１０１の改良Ｍ９培地（組成＝１．
５％Ｎａ２１１１’０４”＋２１１２０．０．３％Ｋ１
１２１’０４，０．０５％ＮａＣ＋、０．１％ＮＨ４Ｃ
ｌ　、　　２　ｍｇ／　１ビタミンＢ＋、０．５％カザ
ミノ酸、　　２　ｍＭ　ＭｇＳＯ４，０，１ｍＭ　Ｃａ
Ｃ１ｚ　、　０．５％ブドウ結）に接種し、３７℃で１
時間培養し、次いでイ／ドール−３−アクリル酸を終濃
度２０μｇ／園１になるように加え、更に２４時間培養
を継続した後、遠心分離により菌体を集めた。菌体を１
■！の３０ｍＭ　ＮａＣ１を含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ　（ＰＨ８，０）　ａ新液に再懸濁し、０℃で３
０分間静置した後、ドライアイス／エタノール浴での凍
結と３７℃での融解を６回繰り返した。次いで、遠心分
離により菌体！ｌ？ｌ［を除き、清澄な上清液を得た。

この上清液を検体として、試験例に示すごと＜　ＬＡＦ
活性を測定した。

試験例 ＬＡＦ　（す７８球活性化因子）活性測定（１）　　検
液の調製 実施例２−■項で得られた形質転換体からの抽出上清液
を除菌フィルター（Ｍｉｃｒｏｒｌｏｗ＠ｌ　、孔径０
．２ａｍ、　Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｓ、）で−過したものを
以１・のｌ、ＡＩ？活性測定用の検液とした。

■　ＬＡＰ活性の測定法 検液を培地にて適当な濃度に希釈する。その希釈液の５
０μｌを９６穴組織培養用マイクロプレー）　（Ｆｌｏ
ｗ　Ｌａｂｓ、）のｗｅｌｌに入れる。これに５０ｔＨ
Ｈ／５ｌｏｌｆのフィトヘマグルチニン（Ｄｉｆｃｏ　
Ｌａｂｓ、）液の５０μｌを添加する。更に、Ｃ３１ｑ
ｌｌｅ系マウス（Ｏ′〜ＩＯ！１令）から採取した胸腺
細胞の懸濁液（ＩＸＩＯ’個／■１）の１００　ｕ　１
を添加し、３７℃で５％炭酸ガス存在下で２日間培養す
る。

培地には５％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ−１８４０培地
を用いる。上記２日間の培養の後、　’Ｈ−チミジンの
ＩｇＣｉを添加し、更に１ａＬｚ間培養する。細胞をタ
イターチック・セルハーベスクー（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｓ
、）により、ガラス繊維製フィルター（ＦｌｏｗＬλｂ
ｓ、）上に補集し、細胞中に取り込まれた　”ｌ−１−
チミジン量（ｃｐｓ）を計測する。

検液の代わりに培地を添加した測定系における’　Ｈ−
チミジンの取り込み量を基準として、ＳＦ！−チミジノ
取り込みムＬの増加によりＬＡＩ−活性を＝ｆ価する。

（３）　　測定結果 （１１項で調製した形質転換体（１譬［Ｉ１０１／ＰＨ
ＬＰＩＯＩ）の抽出液及び陰性対照液としてプラスミド
ｐＢＲ３２２を含むＥ、ｃｏｌｉ　ＨＢＩＯＩ　（Ｈ旧
０１／ＰＢＲ３２２）を実施例２−（２）項で示した条
件で培養し、得られたその菌体抽出液をそれぞれ検液と
した。

その結果、検液の代わりに培地を添加した測定系での　
ＪＨ−チミジンの取り込み量は、　３．５０２ｃｐ−で
あった、陰性対照検液を添加した系（最終希釈倍数−１
６倍）での取り込み量は５７Ａｃｐ■であり、　Ｅ、ｃ
ｏｌｉ抽出液の添加により有意な抑制が認められた。

このような測定系において、形質転換体（１１８重０１
／ｐ１１ＬＰ＋０１）の抽出液では最終希釈１０倍で８
，１０３ｃｐ−の　３Ｈ−チミジンの取り込みを認め、
ＬＡＦ活性が検出された。

＃名例 ウサギ菖１．−１　ｃＤＮＡの調製 別当たり１００■ｇの投与量で静脈内に注入し、８日後
に屠殺した。直ちに開胸気管切開し、気管内に挿入した
チューブを介してりンＷａ緩衝化生理食塩液を用い肺洗
浄を繰り返し、肺胞マクロファージを検地した。この肺
胞マクロファージを！θ％牛脂児血清含をのＲＰＭＩ−
１６４０培地に懸濁させてペトリディッシュ（直径８ｃ
■）に１枚当たりＩＸ１６’個となるように播き、３７
℃で５％炭酸ガス含有空気中、湿度９０〜１００％で前
培養した。１時間の前培養の後、エンドトキシン（大腸
菌由来のりボポリサフカライド）　、　ＴＰＡ　（ホル
ボール−＋２−ミリステート−璽３−アセテート）及び
シクロへキシミドをそれぞれ最終０度がＩＯμｇ／　ｍ
ｌ、　５００ｎｇ／　ｍｌ及びｌｕｇ／ｍｌとなるよう
に添加混和し、更に培養を継続した。

４時間後に培養液を吸引除去し、ディッシュ」−に残っ
たマクＩ＋　−／　７−シを０５％シウＩ＋イルザルコ
７ノ酸−１′）リウｌ、と５　ｍＭクエン酸ナトリウム
及び０．１Ｍ２−メルカプトエタノールを含有する６Ｍ
グアニジルチオシアネート液で溶解しホモジナイズした
。このホモジネートを０．ＩＭＥＤＴＡ含仔５，７含塩
５セシウム水溶液上に重層し、超遠心分離１ｍ　（ＲＰ
Ｓ２７−２０−ター、日立１機〕を用い２６，５００ｒ
ｐ−で２０時間遠心し全ＲＮＡ画分をベレフトとして得
た。これを０．３５Ｍ　ＮａＣＪ　、　２０ｍＭＴｒｉ
ｓ及び２０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む７Ｍ尿素液の少量に溶
解し、エタノール沈殿として回収した。

この全ＲＮＡ画分から実施例１−（１）に示した方法に
従って、オリゴ（ｄＴ）セルロースを用いる吸着カラム
クロマトグラフィーによりポリ（Ａ）ｍＲＮＡを得た。

ここで得たポリ（Ａ）　ｍＲＮＡをアガロースゲル電気
泳動（ゲル濃度１％、６ＭＲ素存在下、ｐト１４）に付
し、２．６〜３．７ｋｂの分子サイズに相当する泳動位
置からポリ（Ａ）　ｍＲＮＡを回収した。

■　ｃ　ＤＮＡライブラリーの作製 （１１項で得られた。１！す（八）　ｍＲＮＡを鋳へ１
として、実施例１−（２）から６）に示したｈ法に準じ
て、ｃ　ＤＮＡライブラリーを作製した。

（３）　　りｉ−二／グ 上記のｃ　ＤＮＡライブラリーについて、ウサギＩＬ−
１をコードするｃ　ＤＮＡを含むプラミドを持つ形質転
換体をスクリーニングするため１２Ｐ標識ｃ　ＤＮＡプ
ローブを用いるコロニー・ハイブリダイゼータ９ン試験
をＩＩ　ａ　ｎ　ａ　ｈ　ｈ　ｎらの方法［Ｇ　ｅ　ｎ
　ｅ　＋鳳０゜６３（１９８０）Ｅに従って行った。エ
ントドキシ／。

ＴＰＡ及びシクロヘキシミドと共に培１１［上記（１）
項参照］した肺胞マクロファージ及びこれらの誘導操作
を省略−した肺胞マクロア１−ジからそれ４れ上記（１
）項の方法で得たポリ（Ａ）　ｍＲＮＡを鋳型として、
実施例１−（２）項の方法で合成し、′２　ｐで標識し
たｃ　ＤＮＡをそれぞれｌＩＪｇプラス及び誘導マイナ
スプローブとした。この試験により誘導プラスのプロー
ブと結合し、ＸｓＪｇマイナスのプローブとはハイブリ
ダイズしない塩基配列を含む組み換え体プラスミドをイ
ｒする形質転換体を選別した。約５　、０００個のクロ
ーンから６４８個のクローンが選び出された。

次いで、これらの選択されたりローンについてハイブリ
ダイゼーション・トランスレージ、ン試験を上記（凰）
項で得たポリ（Ａ）　ｍＲＮＡを用い実施例１−　（６
１項に示した方法に従って行った。その結果、ウサギＩ
Ｌ−１ｍＲＮＡと強くハイプリダイスするｃ　ＤＮＡを
含む組み換え体プラスミドを含む８クローンを見い出し
た。これらのうち、ウサギＩＬ−１ｍＲＮＡと最も強く
ハイブリダイズしたクローン、即ち回収されたｍＲＮＡ
をアフリカ７メガエルの卵母細胞に注入した時、その卵
母細胞中に最も多くのＩＬ−１が検出されたクローンを
選び出した。このクローンの有する組み換え体プラスミ
ドをｐＲＬＩ５と名づけた。

【図面の簡単な説明】

第１〜３図は形質発現ベクターｐＨＬ１３０５の構築工
程を示す。

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト　インターロイキン１のアミノ酸配列もしく
   はその主要部をコードする塩基配列を有し又は含むＤＮ
   Ａ。
2. （２）下記式［Ａ］で示されるアミノ酸配列もしくはそ
   の主要部に対応する塩基配列を有し又は含むＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】［Ａ］
3. （３）下記式［ I ］で示される塩基配列もしくはその
   主要部を有し又は含むＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】［ I ］
4. （４）下記式［Ｂ］で示されるアミノ酸配列に対応する
   塩基配列を有し又は含むＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】［Ｂ］
5. （５）下記式［II］で示される塩基配列を有し又は含む
   ＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】［II］
6. （６）特許請求の範囲第（４）項記載のＤＮＡの５′末
   端に開始コドンＡＴＧが結合してなるＤＮＡ。
7. （７）特許請求の範囲第（４）項記載のＤＮＡにおいて
   、その一部のコドンが修飾されてなるＤＮＡ。
8. （８）特許請求の範囲第（１）項〜第（７）項記載のい
   ずれかのＤＮＡを組み込んだベクター。
9. （９）ベクターが形質発現ベクターである特許請求の範
   囲第（８）項記載のベクター。
10. （１０）ベクターが大腸菌中で増殖し得るベクターであ
    る特許請求の範囲第（８）項又は第（９）項記載のベク
    ター。
11. （１１）ベクターが大腸菌プラスミドである特許請求の
    範囲第（８）項〜第（１０）項記載のいずれかのベクタ
    ー。
12. （１２）特許請求の範囲第（８）項〜第（１１）項記載
    のいずれかのベクターで形質転換された宿主。
13. （１３）形質転換された宿主が微生物である特許請求の
    範囲第（１２）項記載の宿主。
14. （１４）形質転換された宿主が大腸菌である特許請求の
    範囲第（１２）項又は第（１３）項記載の宿主。
15. （１５）ヒト　インターロイキン１のアミノ酸配列もし
    くはその主要部を有するポリペプチド又はヒト　インタ
    ーロイキン１と実質的に同等の生物活性を有するその分
    解物。
16. （１６）下記式［Ａ′］で小されるアミノ酸配列又はそ
    の主穴部を有するポリペプチド。 【アミノ酸配列があります】［Ａ′］
17. （１７）下記式［Ｂ］で示されるアミノ酸配列を有する
    ポリペプチド。 【アミノ酸配列があります】［Ｂ］
18. （１８）アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端に他の
    アミノ酸又はペプチドが結合してなる特許請求の範囲第
    （１５）項〜第（１７）項記載のポリペプチド。
19. （１９）アミノ酸配列のＮ末端にメチオニンが結合して
    なる特許請求の範囲第（１５）項〜第（１７）項記載の
    ポリペプチド。
20. （２０）ヒト　マクロファージを誘導剤と共に培養し、
    該細胞からヒト　インターロイキン１ｍＲＮＡを含む画
    分を分離し、これをもとにして作製したｃＤＮＡライブ
    ラリーよりヒト　インターロイキン１ｃＤＮＡをクロー
    ン化することを特徴とする該ｃＤＮＡの製造法。
21. （２１）ヒト　マクロファージとしてヒト白血病細胞を
    用い分化誘導剤と共に培養しマクロファージ様細胞に分
    化させた該分化細胞を用いることを特徴とする特許請求
    の範囲第（２０）項記載のＤＮＡの製造法。
22. （２２）ヒト白血病細胞として培養可能な株化細胞を用
    いる特許請求の範囲第（２１）項記載のＤＮＡの製造法
    。
23. （２３）ヒト白血病株細胞としてＨＬ−６０細胞を用い
    る特許請求の範囲第（２１）項又は第（２２）項記載の
    ＤＮＡの製造法。
24. （２４）特許請求の範囲第（２０）項〜第（２３）項記
    載のいずれかの製造法により得た該クローン化ｃＤＮＡ
    を形質発現ベクターに組み込み、これにより形質転換さ
    れた宿主を培養し、産生されるヒト　インターロイキン
    １ポリペプチドを採取することを特徴とする該ポリペプ
    チドの製造法。
25. （２５）ヒト　インターロイキン１のアミノ酸配列もし
    くはその主要部をコードする塩基配列を有し又は含むＤ
    ＮＡを形質発現ベクターに組み込み、これを用いて形質
    転換された宿主を培養し、産生されるヒト　インターロ
    イキン１活性を有するポリペプチドを採取することを特
    徴とする該ポリペプチドの製法。
26. （２６）ヒト　インターロイキン１活性を有するポリペ
    プチドを含有する培地。