KR950000712B1 - 인터로이킨1활성을가지는폴리펩티드의제조방법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

인터로이킨 1활성을 가지는 폴리펩티드의 제조방법

제 1 도는 토끼 IL-1 cDNA의 클로우닝에 있어서 히브리다이제이션 트랜스래이션의 시험결과를 나타내는데, 여기서 점선은 대조표준에서의³H-티미딘 취입량을 의미하며,

제 2 도는 인간 IL-1 염색체 유전자의 구조 및 그의 제한 효소 제도(mapping)를 나타내며(실시예 3),

제 3 도는 내지 제 5 도는 형질발현 벡터 pHLP101의 구축단계를 나타내며(실시예 4),

제 6 도는 실시예 4에서 얻은 IL-1(209)의 SDS-폴리아미드겔 전기영동 패턴을 나타내며,

제 7 도는 형질발현벡터 pHLP383의 구축단계를 나타내며(실시예 5),

제 8 도는 형징발현백터 pHLP385의 구축단계를 나타내며(실시예 7),

제 9 도는 형질발현벡터 pHLP373의 구축단계를 나타내며(실시예 10),

제 10 도는 형질발현벡터 pRLP383의 구축단계를 나타낸다(실시예 15).

본 발명은 인터로이킨 1(interleukin 1)활서을 갖는 폴리펩티드를 코우드하는 DNA. 안에 삽입된 상기 DNA를 갖는 벡터, 이 벡터로 형질전환된 숙주, 형질전환된 숙주의 배양에 의해 생성되는 인터로이킨 1활성을 갖는 폴리펩티드, 폴리펩티드의 유도체, 상기 폴리펩티드 또는 유도체를 포함하는 의약조성물, 항암제 또는 항감염제, 및 그의 제법에 관한 것이다.

종전기술은 다음과 같다.

게리(Gery)씨등은 대식세포(macrophage)의 배지에서 미토겐(mitogen)에 의한 쥐 흉선세포분열 작용을 촉진시키는 물질의 존재를 증명하였는데, 이것을 "림프구 활성화인자(LAF)"라고 불렀다. 1979년 이래로, 이것은 "인터로이킨1"("IL-1"이라 약기함)으로 칭하였고, 이후 본명세서에서는 인터로이킨 1으로 부른다.

IL-1은 T 및 B림프세포의 증식분화를 촉진시키며 T림프세포에 더 작용하고 이로써 림포킨, 특히 림포킨 2(T세포 증식인자)의 생성을 촉진하는 효과가 있고 그러므로 항체생성 및 세포성면역의 조절에 대한 중요한 역할을 하는 인자이다[Staruch, M.J., et al., J. Immunol., 130, 2191(1983)] 또한 IL-1은 프로스타글란딘 E 또는 콜라게나제의 생성, 섬유아세포의 증식촉진 및 인터로이킨 2 또는 인터페론에 의한 NK(natural killer)세포 활성화 작용의 증강의 효과가 있음이 보고되어있다[Simon, P.L.et al., "Lymphokines"Vol.6, 47(1982), Academic Press, Inc.].

따라서, IL-1은 면역응답 뿐만 아니라 생체내에서 방어 및 수복등에 관여하며, 따라서 임상적 용도가 기대되고 있다.

IL-1은 대식세포, 말초 단핵세포 및 대식세포형세포(예를들면 쥐 P388D₁세포), 또는 단구성 또는 골수성 백혈병 세포등을 적당한 유도제의 존재하에 배양시킨다음 배지로부터 분리시킴으로써 제조하였으나 IL-1의 구조는 명백하지가 않았다.

인간 IL-1은 사람의 단구성 백혈병세포(예를들면 U 937세포) 또는 사람의 말초단핵세포의 배지로부터 분리되었고 그 분자량은 11,300 및 15,000달톤임이 보고되어있다.[Mizel, S.B., et al., J.Immunol., 131, 1834(1983) ; Schmidt, J.A., J.Exp.Med., 160, 772(1984)].

최근에, 쥐 IL-1 폴리펩티드를 코우드하는 cDNA는 P388D₁세포로부터 클론화되었고 쥐 IL-1 폴리펩티드는 156개의 아미노산으로 구성되고 대장균(Escherichia coli)에 IL-1활성을 가짐이 보고되었다[Lomedico, P.T.et al., Nature, 312, 458(1984)]. 또한 인간 IL-1 폴리펩티드를 코우드하는 cDNA는 사람의 단핵세포로부터 클론화되었고 그의 형질발현을 성공하였다[Auron, P.E.et al., Prec.Natl.Acad.Sci. USA, 81, 7907 (1984)].

그러나 본 발명의 폴리펩티드 및 그들을 코우드하는 DNA들은 상기 공지의 생성물과는 명백히 다르다.

토끼 IL-1폴리펩티드 및 그것을 코우드하는 DNA에 관한 보고는 없다.

본 발명을 요약하면 다음과 같다.

본 발명은 유전자공학 기법에 의한 IL-1의 생성에 대한 연구를 의도하였고 인간 IL-1 및 토끼 IL-1을 코우드하는 DNA를 클로우닝 하는 것과 클론화 DNA를 포함하는 형질발현벡터로 숙주를 형질전환시키는 것에서 성공하였고 형질전환된 숙주는 IL-1 또는 IL-1 활성을 갖는 물질을 생성할 수 있음을 확인하였다.

즉, 본 발명자는 대식세포형 세포로 분화된 사람의 세포 또는 토끼 대식세포를 IL-1을 생성하기에 적합한 유도제의 존재하에 배양하고 이로써 세포에 IL-1 mRNA를 축적시키며 mRNA를 주형(template)으로 사용함으로써 cDNA라이브러리를 제작하고, 그로부터 인간 또는 토끼 DNA을 코우드하는 DNA를 클로우닝하며, 상기 DNA의 전체 뉴클레오티드 배열을 결정하고, 클론화 DNA를 형질발현벡터에 삽입한 다음 숙주를 벡터로 형질전환시켜 IL-1활성을 갖는 원하는 폴리펩티드를 생성할 수 있는 형질전환된 숙주를 제공함으로써 인간 또는 토끼 IL-1 활성을 갖는 폴리펩티드의 생성에 성공하였다. 연구의 과정에서, 본 발명자는 인간 또는 토끼 IL-1이 전구체로서 형성된다는 것과 상기 IL-1 전구체의 C-말단에 159개의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드는 잠재적인 IL-1활성을 가지며 분자량이 18,000이고 PI가 5.3임을 발견하였다. 이러한 발견을 기초로, 본 발명자는 이 폴리펩티드는 성인 IL-1임과 더 나아가서, 성숙한 토끼 IL-1은 호모로지(homology)로부터 판단한바, 토끼 IL-1 전구체의 C-말단에 155개의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드임을 밝혔다.

본 발명에서, 상기 인간 IL-1 전구체의 C-말단에 159개의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드와 상기 토끼 IL-1 전구체의 C-말단에 155개의 아미노산으로 구성되는 폴리펩티드를 성인 IL-1 및 성숙한 토끼 IL-1으로 각각 칭한다.

더욱이, 159개의 아미노산으로 구성되는 성인 IL-1의 배열보다 더적은 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드도 또한 성인 IL-1 폴리펩티드와 같이 IL-1활성을 나타낸다. 게다가, 인간 IL-1과 토끼 IL-1폴리펩티드에 코우드하는 뉴클레오티드 배열간에와, 인간 및 토끼 IL-1 폴리펩티드의 유도된 아미노산 배열간에 높은 호모로지가 발견되었다.

이로부터 인간 및 토끼 IL-1 폴리펩티드는 같은 유전자로부터 계동 발생적으로 유도됨과 공통영역의 상당한 부분들은 그들의 생물학적 활성에 필요한 배열임을 제안할 수 있다.

본 발명의 목적은 IL-1 활성을 갖는 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기한 바와같이 DNA로 삽입된 벡터를 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 상기 재결합 벡터로 형질전환된 숙주를 제공하는 것이다. 발명의 더 이상의 목적은 위에 제시한 형질전환된 숙주의 배양에 의하여 생성되는 IL-1 활성을 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 발명의 또다른 목적은 폴리펩티드로부 얻은 유도체(물질)을 제공하는 것이다. 발명의 또다른 목적은 활성성분으로서 상기 폴리펩티드를 포함하는 의약 조성물을 제공하는 것이다. 발명의 더 이상의 다른 목적은 DNA, 벡터, 형질전환된 숙주 및 폴리펩티드의 제조방법을 제공하는 것이다. 발명의 이들 목적과 다른 목적 및 이점은 본분야 숙련자에게 다음의 설명으로서 명백해질 것이다.

기술을 간단히 하기 위해, 다음의 약호를 본 명세서와 청구범위에 사용하고 있다.

A : 아데닌

C : 시토신

G : 구아닌

T : 티민

Ala ; 알라닌

Alg ; 알기닌

Asn : 아스파라진

Asp : 아스파르트산

Cys : 시스테인

Gln : 글루타민

Glu : 글루타민산

Gly : 글리신

His : 히스티딘

Ile : 이소로이신

Leu : 로이신

Lys : 리신

Met : 메티오닌

Phe : 페닐알라닌

Pro : 프롤린

Ser : 세린

Thr : 트레오닌

Trp : 트립토판

Tyr : 티로신

Val : 발린

DNA : 데옥시리보핵산

cDNA : 상보 DNA

sscDNA : 단쇄 cDNA

dscDNA : 이중쇄 DNA

RNA : 리보핵산

mRNA : 전령 RNA

폴리(A)mRNA : 폴리(A)-함유 mRNA

dATP : 데옥시아데노신 삼인산

dCTP : 데옥시시티딘 삼인산

dGTP : 데옥시구아노신 삼인산

dTTP : 데옥시티미딘 삼인산

올리고(dC) : 올리고데옥시시티딜산

올리고(dG) : 올리고데옥시구아닐산

올리고(dT) : 올리고 데옥시티미딜산

폴리(A) : 폴리아데닐산

폴리(U) : 폴리우리딜산

폴리(dC) : 폴리데옥시시티딜산

폴리(dG) : 폴리데옥시구아닐산

ATP : 아데노신 삼인산

EDTA : 에틸렌디아민테트라아세트산

kb : 킬로염기

kbp : 킬로염기쌍

bp : 염기쌍

본 명세서 및 청구범위에서 단쇄에 의해 나타낸 뉴클레오티드 배열은 지각쇄(sense strand)의 뉴클레오티드 배열이며 왼쪽말단은 5'-말단이고 오른쪽 말단은 3'-말단이다.

아미노산 배열에서는 왼쪽말단은 N-말단이고 오른쪽 말단은 C-말단이다.

[Ⅰ] DNA

(A) DNA의 명명

본 발명 DNA는 첨부된 표 1-1에 보인 식[Ⅰ-1]로 나타낸 아미노산 배열에 해당하는 핵산배열을 갖거나 포함하는 DNA들인데, 표 1-1에서 N-말단의 1 내지 16개, 바람직하게는 1내지 15개의 아미노산잔기 및/또는 C-말단의 1 내지 7, 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산 잔기는 삭제될 수도 있으며, 또한 첨부된 표 2-1에 보인 식[Ⅰ-2]로 나타낸 아미노산 배열을 N-말단에 갖는 상기 식[Ⅰ-1]로 나타낸 아미노산 배열에 해당하는 뉴클레오티드 배열을 갖거나 포함하는 배열을 갖거나 포함하는 DNA들인데, 표 2-1에서 식[Ⅰ-2]의 아미노산 배열의 N-말단의 아미노산 잔기는 삭제 될 수도 있다.

이들 DNA는 인간 IL-1을 코우드하는 인간유전자 또는 cDNA로부터 유도된 것들이다.

식[Ⅰ-1]으로 나타낸 아미노산 배열에 해당하는 뉴클레오티드 배열로 구성되는 DNA는 성인IL-1을 코우드하며 식 [Ⅰ-2]로 나타낸 아미노산 배열에 해당하는 뉴클레오티드 배열과 5'-말단에 결합된 상기 뉴클레오티드 배열로 구성되는 DNA는 인간 IL-1전구체를 코우드한다.

본 발명 DNA는 첨부된 표 3-1에 보인 식 [A-1]으로 나타낸 아미노산 배열에 해당하는 뉴클레오티드 배열을 갖거나 포함하는 DNA를 또한 포함하는데, 이것은 첨부 표 4-1에 보인 식 [A-2]로 나타낸 아미노산배열을 N-말단에 더 가질수 있는데, 여기서 식 [A-2]의 상기 아미노산 배열의 N-말단의 아미노산 잔기는 삭제될 수 있다.

이들 DNA는 토끼 IL-1을 코우드하는 토기유전자 또는 cDNA로부터 유도된 것이다. 식 [A-1]으로 나타낸 아미노산 배열에 해당하는 뉴클레오티드 배열로 구성되는 DNA는 성숙한 토끼 IL-1을 코우드하고 식 [A-2]로 나타낸 아미노산 배열에 해당하는 뉴클레오티드 배열과 5'-말단에 결합된 상기 뉴클레오티드 배열로 구성되는 DNA는 토끼 IL-1전구체를 코우드한다.

본 발명의 바람직한 DNA는

(ⅰ) 식 [Ⅰ-1]으로 나타낸 아미노산 배열에 해당하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 DNA.

(ⅱ) N-말단의 두 아미노산 잔기가 삭제되어 있는 식 [Ⅰ-1]로 나타낸 아미노산 배열에 해당하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 DNA.

(ⅲ) N-말단의 10개의 아미노산 잔기가 삭제되어 있는 식 [Ⅰ-1]로 나타낸 아미노산 배열에 해당하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 DNA.

(ⅳ) N-말단의 14 또는 15개의 아미노산 잔기가 삭제되어 있는 식 [Ⅰ-1]로 나타낸 아미노산 배열에 해당하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 DNA.

(ⅴ) C-말단의 4개의 아미노산 잔기가 삭제되어 있는 식 [Ⅰ-1]로 나타낸 아미노산 배열에 해당하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 DNA.

(ⅵ) C-말단의 5개의 아미노산 잔기가 삭제되어 있는 식 [Ⅰ-1]로 나타낸 아미노산 배열에 해당하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 DNA.

(ⅶ) N-말단의 15개의 아미노산 잔기와 C-말단의 4개의 아미노산 잔기가 삭제되어 있는 식 [Ⅰ-1]으로 나타낸 아미노산 배열에 해당하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 DNA.

또한, 식 [Ⅰ-1]으로 나타낸 아미노산배열에 해당하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 DNA도 본 발명의 바람직한 DNA로서 포함된다.

상기 DNA들은 5'-말단에 개시 코돈(codon) 및/또는 3'-말단에 종결코돈을 가질 수 있다.

식 [Ⅰ-1]과 [A-1]으로 나타낸 아미노산 서열에 해당하는 전형적인 뉴클레오티드 배열은 표 1-2 및 3-2에 각각 나타낸 식 [Ⅱ-1] 및 [B-1]으로 나타낸 뉴클레오티드 배열이다.

식 [Ⅰ-2]와 [A-2]에 나타낸 아미노산 배열에 해당하는 전형적인 뉴클레오티드 배열은 표 2-2 및 4-2에 각각 나타낸 식 [Ⅱ-2] 및 [B-2]로 나타낸 뉴클레오티드 배열이다.

본 발명 DNA는 다음의 DNA들을 포함함을 이해하여야 한다.

IL-1활성을 갖는 폴리펩티드를 코우드 하는 DNA, 인간 또는 토끼 IL-1 유전자 또는 cDNA로부터 유도된 IL-1활성을 갖는 폴리펩티드를 코우드하는 DNA, 성인 또는 토끼 IL-1 폴리펩티드 또는 그의 전구체를 코우드하는 cDNA, 인간 또는 토끼 제놈 라이브러리로부터 제조된 성인 또는 토끼 IL-1 폴리펩티드를 코우드하는 DNA, 성인 IL-1 폴리펩티드를 코우드하는 DNA의 화학적 또는 효소학적 수정으로부터 결과되는 DNA, 성인 또는 토끼 il-1 폴리펩티드를 코우드 하는 DNA와 실질적으로 같은 것이 부분적으로 또는 전적으로 합성된 DNA, 성인 IL-1 폴리펩티드, 수정된 폴리펩티드 또는 토끼 IL-1 폴리펩티드를 코우드하는 변성코돈을 갖는 DNA, 성인 IL-1 폴리펩티드, 그의 수정된 폴리펩티드 또는 토끼 IL-1 폴리펩티드를 코우드하며 개시코돈 및/또는 종결코돈 및/또는 개시코돈의 상류의 신-달가르노(Shine-Dalgarno)배열로 이어지는 프로모터를 갖는 DNA, 인간 IL-1 폴리펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드배열과 토끼 IL-1 폴리펩티드를 코우드 하는 뉴클레오티드 배열 사이에 크게 동종(同種)부분을 갖는 뉴클레오티드 배열을 최소한 포함하는 DNA, 인간 또는 토끼 IL-1 전구체 폴리펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 배열로부터 S'-말단영역의 일부의 삭제로 결과되는 DNA.

(B) DNA의 생성

발명 DNA의 제조방법을 이하에 기술하기로 한다.

본 발명에 따라, 인간 IL-1 폴리펩티드와 토끼 IL-1 폴리펩티드를 코우드하는 DNA는 사람 또는 토끼 대식세포(또는 대식세포형세포)를 유도제와 함께 배양하고, 유도된 세포로부터 IL-1 mRNA를 포함하는 분율을 분리하고 분율로부터 cDNA 라이브러리를 제조하고, cDNA 라이브러리로부터 IL-1 cDNA를 클로우닝함으로써 생성될 수 있다.

즉, 다음의 단계를 통하여 생성될 수 있다.

a) 대식세포 또는 대식세포형 세포를 유도제와 함께 배양하는 단계, b) 유도된 세포로부터 IL-1 mRNA를 포함하는 분율을 분리시키는 단계, c) 역전사효소를 사용하여 mRNA로부터 단쇄 cDNA(ssvDNA)를 제조한다음 그것을 이중쇄 DNA(dsDNA)로 전환시키는 단계, d) dscDNA를 벡터에 삽입 시키는 단계, e) 재결합벡터를 숙주에 도입시켜 형질전환시키고 cDNA(집락)라이브러리를 구축하는 단계, f) 단계 a) 내지 e)에 의해 구축되는 라이브러리로부터 IL-1 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 클로우닝 시키는 단계.

원한다면, 위와같이 생성된 DNA의 수정은(단계 g로서)본 발명의 다른 DNA를 제공할 수 있다.

한편, 인간 또는 토끼 IL-1 폴리펩티드를 코우드하는 cDNA는 제놈라이브러리(예를들면, 박테리오페이지 샤론 4A에 삽입된 DNA단편)으로부터 인간 또는 토끼 IL-1 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 클로우닝하고 이어서 인트론(intron)영역들을 제거함으로써 또한 얻어질 수 있다.

본 발명의 cDNA를 제조하는 방법은 인간 IL-1 폴리펩티드 또는 그의 수정된 폴리펩티드를 코우드하는 DNA에 관해서 더 상세히 기술하기로 한다. 토끼 IL-1 폴리펩티드를 코우드하는 DNA의 제조방법은 인간 IL-1 폴리펩티드의 경우와 거의 같은 것이다.

이하에 기술되는 방법의 각 단계에 대한 조작 및 조건은 본분야에서 공지되어 있고 본발명 방법은 이들 특정한 방법에 결코 제한되지 않는다.

(1) 인간 IL-1 mRNA의 제조

단계 a : 인간 IL-1 mRNA는 예를들면, 다음의 방법에 의해 사람의 백혈병세포로부터 얻어질 수 있다.

사람의 백혈병세포는 1×10⁵내지 5×10⁶세포/ml의 세포밀도로 뿌리고, 그것들을 대식세포형세포로 분화하기 위한 유도제로 배양시킨다. 유도제의 양은 그의 형태, 백혈병세포의 종류, 배양조건등에 의존하여 다양하다. 아래에 기술된 바와같이 유도제를 사용하는 경우에, 일반적으로 그의 최종농도는 바람직하게는 약 100 내지 2,000ng/ml이다. 배양은 35 내지 38℃, 바람직하게는 약 37℃에서 약 5 내지 10%의 이산화탄소를 포함하는 공기중의 약 90 내지 100%의 습도에서 약 24 내지 72시간동안 수행된다.

위의 단계에 사용될 수 있는 사람의 백혈병세포는 유도제로 자극함으로써 대식세포형 세포로 분화된 모두 인간백혈병 세포이다. 예로는 HL-60 세포(ATCC, CCL 240), THP-1 셀 m 모노-1-207 세포 및 백혈병을 가진 환자로부터 얻은 주세포를 포함한다.

분화를 위한 유도제로서, 포르볼 에스테르, 메제레인(mezerein) 및 레티노인산과 같은 디테르펜류를 사용할 수 있다.

포유동물세포배양에 적합한 각종 배지가 배지로서 사용될 수 있다. 예로는 RPMI-1640, 이글스 MEM 배지 및 덜베코(Dulbecco)의 수정된 MEM 배지를 포함한다[상기 배지의 조성에 대해서는 예를들어서 Y. Sohmura, Kodansha(1982) 편집의 "세포배양편람" 그리고 J.Paul "세포 및 조직배양", E.＆S. 리빙스톤 Ltd.(1970)을 참조할 것]

바람직하게는 소태아혈청 또는 송아지혈청과 같은 동물혈청을 약 1 내지 20%의 양으로 배지에 가한다.

다음의 실험들은 백혈병세포가 대식세포형 세포로 분화되고 접시에 부착된 것을 확인한 후 행하게 된다.

그러나, 폐, 혈액, 복부, 태반, 지라 및 다른 조직으로부터 수집된 사람의 대식세포를 사용하는 경우에는 상기와 같은 분화 단계는 생략될 수 있다.

단계 b : 상기한 배양후, 배지와 비부착세포를 흡인에 의해 제거한다. 다음에, IL-1의 합성을 위한 유도체(예를들면, 그램음성 박테리움으로부터 유도된 엔도톡신, 포르볼 에스페르 및 메제레인과 같은 디테르팬)와 단백질 합성억제제(예를들면, 시클로헥시이미드)를 포함하는 배지를 접시에 가하고 배양을 3 내지 8시간 동안 더 계속하여 대식세포에 IL-1 mRNA를 축적시킨다. 엔도톡신의 양은 일반적으로 약 0.1 내지 1000 마이크로그램/ml(최종농도 : 아래와 같음), 바람직하게는 약 1 내지 100 마이크로그램/ml이다. 르스볼 에스테르의 양은 약 1 내지 2000ng/ml이다. 시클로헥시이미드의 양은 바람직하게는 0.1 내지 50마이크로그램/ml이다.

배양후, 총 RNA를 예를들면 치르귄(Chirgwin)씨 등의 방법[Biochemistry, 18, 5294(1979)]과 같은 종래의 방법으로 세포로부터 추출한 다음 올리고(dT)-셀룰로오스 또는 폴리(U)-세팔로오스 상에서 어피니티컬럼 크로마토그라피에 의해 또는 배치(batch)법에 의해 폴리(A) mRNA를 포함하는 분율을 분리시킨다. 인간 IL-1 mRNA로 농축된 mRNA 분율을 폴리(A) mRNA 분율의 산-요소 아가로오스 겔 전기영동 또는 수크로오스 밀도구배 원심분리에 의해 얻을 수 있다.

결과되는 mRNA 분율이 인간 IL-1 폴리펩티드를 코우드하는 mRNA를 포함하는 원하는 것임을 확인하기 위해 mRNA는 단백질로 번역시키고 그의 생물학적 활성을 시험한다. 이것은 예를들어서 그것을 제노퍼스 래비스(Xenopus laevis)의 란모세포에 주입시키거나 망상적혈구분해질(reticulocyte lysate) 또는 소맥배아의 세포없는 단백질 합성계와 같은 적합한 단백질 합성계에 첨가함으로써 번역된 단백질이 IL-1 활성을 가짐을 확인함으로써 수행될 수 있다.

(2) 사람 IL-1 cDNA의 클로우닝

단계 c : 위의 (1)에서 얻은 mRNA 분율을 주형으로서 사용하고 올리고(dT)를 프라이머로서 사용하여 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP의 존재하에 역전사효소(예를들면, 조류 미엘로블라스토시스 바이러스(AMV)로부터 유도된 것)을 사용함으로써 sscDNA를 합성한다.

다음에, sscDNA 주형으로서 사용하고, 역전사 효소 또는 대장균 DNA 폴리머라제 Ⅰ(큰분율)을 사용함으로써 dscDNA를 합성한다.

단계 d 및 e : 결과 dscDNA를 종래의 방법, 예를들면, 폴리(dG)-폴리(dC) 단일중합체 신장법(Nelson, T.S. "Methods in Enzymology", 68, 41(1979), Academic Press Inc. NewYork)에 의해 플라스미드 pBR322의 제한효소 Pst 1 절단부위로 삽입시킨다. 결과된 재결합 플라스미드를 코헨등의 방법 [ Proc Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110(1972)]에 따라 대장균 x1776과 같은 숙주에 도입시켜 그것을 형질절환 시키고, 테트라사이클린 내성 콜로니를 선별함으로써 cDNA(콜로니) 라이브러리를 제작한다.

단계 f : 인간 IL-1 폴리펩티드를 코우드하는 cDNA 삽입체를 포함하는 재결합 플라스미드를 품고있는 원하는 클론을 선별하기 위해 다음의 방법을 사용하게 된다.

만일 적합한 DNA 분율, 예를들면 동물(사람이 아닌) 인간 IL-1 폴리펩티드에 해당하는 화학적으로 합성한 cDNA 분율 또는 화학적으로 합성한 DNA 분율을 미리 얻을 수 있다면, 위의 cDNA 라이브러리는 프로브로서 32p로 표지된 위의 DNA 분율을 사용함으로써 콜로니 히브리다이제이션 측정(assay)[Hanahan, D., et al., Gene, 10, 63(1980)]을 받게하고 사용한 DNA 프로브에 상보적인 뉴클레오티드 배열을 갖는 cDNA 삽입체를 포함하는 재결합 플라스미드를 품고있는 원하는 클론을 선별한다.

만일 상기와 같은 이러한 적합한 인간 IL-1 프로브가 얻어진다면, 예를들어서, 이하에 기술된 방법에 따라 유도-플러스 및 유도-마이너스 프로브를 사용하는 콜로니 히브리다이제이션에 의해서와 mRNA 히브리다이제이션-트랜스레이션 측정에 의해서 원하는 클론을 거른다.

32p-표지된 cDNA를 상기 (1)에서 얻은 인간 인간 IL-1 mRNA를 포함하는 mRNA 분율을 주형으로서 사용하여 합성하고 유도-플러스 프로브로 사용한다. 따로, 비-유도된 대식세포를 출발물질로 사용하는 것을 제외하고는 상기 (1)에 기술된 바와같은 방법으로 얻은 mRNA 분율을 주형으로 사용함으로써 32p-표지된 cDNA를 합성한다. 이 32p-표지된 cDNA는 유도-마이너스 프로브로서 사용된다. 상기 cDNA 라이브러리로부터, 유도 플러스 프로브와 강하게 히브리다이즈되나 유도-마이너스 프로브와는 히브리다이즈되지 않는 플라스미드 클론이 선별된다.

선별된 클론이 인간 인간 IL-1 폴리펩티드를 코우드하는 삽입된 cDNA를 품고 있음을 확인하기 위해 mRNA 히브리다이제이션-트랜스레이션 측정을 수행한다. 플라스미드 DNA는 위의 선별된 클론으로부터 분리되고, 가열 또는 알칼리 처리에 의해 단쇄 DNA로 전환되며, 니트로셀룰로오스 필터상에 고정된다.

위의 (1)에 언급한 방법에 따라 얻은 인간 IL-1 mRNA를 포함하는 mRNA 분율을 필터에 가하여 고정된 DNA와 히브리다이즈시킨다. 다음에, 히브리다이즈된 mRNA를 용출, 회수한다. 회수된 mRNA를 제노퍼스래비스의 란모세포에 주입시켜 회수된 mRNA가 인간 IL-1 폴리펩티드로 코오드되는지를 결정한다.

상기 방법들은 인간 IL-1 mRNA에 상보적인 뉴클레오티드 배열을 포함하는 cDNA 분율을 갖는 재결합 플라스미드를 품고있는 형질 전환체를 제공한다.

얻어진 클론화 cDNA가 인간 IL-1 폴리펩티드의 전코우드 영역을 포함하지 않을 때에는, 더 큰 크기의 cDNA를 상기한 바와같이 선별된 형질전환체로부터 클론화 cDNA 분율을 프로브로서 사용하여 cDNA를 거름(screening)으로써 선별한다.

인간 IL-1 폴리펩티드의 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드를 코우드하는 클론화, cDNA는 예를들면, 맥삼-길버트법[Maxam-Gilbert method, proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74, 560(1977)] 또는 M13 페이지(phage)를 사용하는 디데옥시법[Sanger, F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 74, 5463(1977), 및 Messing, J., Methods in Enzymology, 101, 20(1983)]에 따라 결과된 클론화 cDNA 단편 몇 개의 뉴클레오티드 배열을 분석함으로써 최종적으로 입증할 수 있다.

단계 g(수정) : 원한다면, 상기한 바와같이 얻은 클론화 cDNA를 공지된 기법에 의해 수정하여 하나 또는 그 이상의 코돈이 삭제되거나 및/또는 다른 코돈 또는 변성된 코돈으로 치환된 뉴클레오티드 배열을 갖거나 또는 포함하는 DNA를 형성시킬 수 있다.

수정은 예를들면 DNA를 적합한 제한 효소(restriction endonuclease)로 분열시키고 적합한 엑소 뉴클레아제 및/또는 엔도뉴클레아제 단독으로 또는 조합하여 하나 또는 그 이상의 코돈을 분할함으로써 수행되고 변성된 코돈, 예를들면 포스포트리에스테르법[Ohtsuka, E., et al., Hetero cycles, 15, 395(1981)]에 의해 화학적으로 합성된 것들로 치환함으로써 또는 어떠한 코돈의 공급이 없이 결찰법에 의해 삭제된 하나 또는 그 이상의 코돈을 갖는 DNA를 제조함으로써 수행된다.

[Ⅱ] 폴리펩티드

상기 [Ⅰ]에서 제조한 DNA들은 형질발현벡터에 적당히 삽입되고 숙주는 상기 형질발현벡터로 형질전환된다. 그후, 형질전환된 숙주를 배양하여 원하는 폴리펩티드를 생성시킨다.

(A) 폴리펩티드의 명명

인간 IL-1 유전자 또는 cDNA로부터 유도된 DNA를 사용함으로써 생성된 폴리펩티드는 첨부된 표 1-1에 보인 식[Ⅰ-1]로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드인데 여기서 N-말단에서 하나 내지 16개의 아미노산 잔기 및/또는 C-말단에서 하나 내지 7개, 바람직하게는 하나 내지 5개의 아미노산 잔기가 삭제될 수 있다.

게다가, 토기 IL-1 유전자 또는 cDNA로부터 유도된 DNA를 사용함으로써 생성된 폴리펩티드는 첨부된 표 3-1에 보인 [A-1]으로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드이다.

본 발명의 바람직한 폴리펩티드는 다음과 같다.

(1) 식[Ⅰ-1]로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드.

(2) N-말단에서 2개의 아미노산이 삭제되어 있는 식[Ⅰ-1]으로 나타낸 아미노산배열을 갖는 폴리펩티드.

(3) N-말단에서 10개의 아미노산잔기가 삭제되어 있는 식[Ⅰ-1]으로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드.

(4) N-말단에서 14 또는 15개의 아미노산 잔기가 삭제되어 있는 식[Ⅰ-1]으로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드.

(5) C-말단에서 4개의 아미노산 잔기가 삭제되어 있는 식[Ⅰ-1]로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 펩티드.

(6) C-말단에서 5개의 아미노산 잔기가 삭제되어 있는 식[Ⅰ-1]로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드.

(7) N-말단에서 15개의 아미노산 잔기 그리고 C-말단에서 4개의 아미노산 잔기가 삭제되어 있는 식[Ⅰ-1]으로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드, 그리고

(8) 식[A-1]으로 나타낸 아미노산 배열을 갖는 폴리펩티드.

본 발명의 폴리펩티드는 다음의 폴리펩티드를 포함함을 이해하여야 한다.

IL-1 활성을 지니는 폴리펩티드, 인간 또는 토끼 IL-1 유전자 또는 cDNA으로부터 유도된 IL-1 활성을 지니는 폴리펩티드, 삽입된 본 발명 DNA를 갖는 형질발현벡터로 형질전환된 숙주를 배양시킴으로써 생성된 폴리펩티드, 인간 또는 토끼 IL-1 폴리펩티드, 인간 IL-1 폴리펩티드의 수정된 폴리펩티드, 숙주내의 인간 또는 토끼 IL-1 폴리펩티드의 변성된 물질, 인간 IL-1 폴리펩티드 및 토끼 IL-1 폴리펩티드 사이에 크게 동종의 부분을 최소한 갖는 폴리펩티드.

(B) 폴리펩티드의 생성

본 발명 폴리펩티드의 제조방법을 이하에 기술하기로 한다.

본 발명에 따라 인간 IL-1 폴리펩티드 또는 그의 수정된 폴리펩티드 및 토끼 IL-1 폴리펩티드(이후부터, 경우에 따라 이들 폴리펩티드들을 전부 단순히 '폴리펩티드'라 칭한다)는 다음의 단계들로 생성될 수 있다.

ⅰ)폴리펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 배열을 갖거나 또는 포함하는 DNA를 형질발현벡터에 삽입시키는 단계, ⅱ) 재결합 벡터를 숙주에 도입시키는 단계, ⅲ) 재결합벡터로 형질전환된 숙주를 배양시켜 폴리펩티드를 생성시키는 단계, ⅳ) 배양된 세포를 수집하고 그들로부터 생성된 폴리펩티드를 추출하는 단계, ⅴ) 단백질에 대한 종래의 정제방법으로 폴리펩티드를 정제하는 단계.

원한다면, 위의 단계들을 통해 생성된 폴리펩티드는 수정하여 본 발명의 다른 폴리펩티드, 또는 그의 유도체 또는 염을 생성시킬 수 있다.

폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 사용함으로써 폴리펩티드를 제조하는 방법의 상세한 설명은 다음과 같다.

단계 ⅰ: 폴리펩티드의 제조를 위한 형질발현벡터는 폴리펩티드를 코우드하는 클로우닝된 DNA를 삽입시킴으로써 얻어질 수 있다. 형질전환된 미생물에서 증식하는 모든 벡터들을 사용할 수 있다. 예로는 플라스미드(대장균 플라스미드 pBR322와 같은 것), 페이지(람브다페이지(lambda phage) 유도체와 같은 것) 및 바이러스(SV40과 같은것)를 포함한다.

이것들은 단독으로 또는 조합하여, 예를들면 pBR322-SV40 히브리드 플라스미드로서 사용될 수 있다. DNA의 삽입부위는 적당히 선택될 수 있다. 환언하면, 적합한 벡터의 적합한 부위는 종래의 방법으로 적합한 제한효소로 분열시킬 수 있고 적합한 길이의 클로우닝된 DNA를 분열부위에 삽입시킬 수 있다.

더 상세히는, 폴리펩티드(비융합형)의 생성을 위한 형질발현벡터는, 개시코돈 ATG가 5'-말단에 가해지고 종결코돈(TAA, TAG 또는 TGA)이 3'-말단에 가해지는 폴리펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 DNA 단편을, 적합한 프로모터 및 산달가르노 배열로 DNA 단편 아래로 계속하여 결합시키고 벡터에 삽입시킴으로써 구축된다.

융합형 폴리펩티드의 제조를 위한 형질발현벡터는 종결코돈이 3'-말단에 가해지는 폴리펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 배열을 갖는 DNA 단편을 벡터에 삽입시켜 번역 해독체계가 융합되는 구조유전자의 것과 부합하도록 함으로써 구축될 수 있다.

프로모터의 예들은 lac, trp, tac, phoS, phoA, PL 및 SV40 초기 프로모터이다.

단계 ⅱ 미생물, 동물 또는 식물세포와 같은 숙주에 형질발현벡터를 도입시킴으로써 형질전환체를 얻는다. 예를들면, 대장균은 코헨 씨등[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110(1972)]의 방법으로 형질전환된다. 다음에, 형질전환체를 배양함으로써 폴리펩티드 또는 N-말단에 메티오닌이 있는 폴리펩티드가 생성된다. 생성물은 형질발현벡터를 구축하는 방법에 의존하여 숙주세포의 세포질내에나 아니면 세포질외에 축적시킬 수 있다. 폴리펩티드가 세포질외에 분비되도록 하기 위해서는 알칼리성 폴리파타제 유전자(phoA) 또는 인산결합 단백질 유전자(phoS)와 같은 분비형 단백질을 코우드하는 유전자를 사용하고, 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 적합한 부위에서 상기 유전자로 정확한 번역 해독체계로 시그날 펩티드를 코우드하는 DNA 영역으로 계속해서 결합시킴으로써 형질발현벡터를 구축할 수 있다.

단계 ⅲ 및 ⅳ 결과 형질전환체는 원하는 폴리펩티드가 충분히 생성될 때까지 형질전환체에 적합한 조건하에서 배양시킨다. 다음에, 폴리펩티드를 배양물로부터 추출한다. 생성된 폴리펩티드가 세포질에 축적될 때, 라이소자임 소화 및 동결융해 또는 초음파 파쇄에 의하여, 또는 프렌치 프레스를 사용함으로서 숙주세포를 파괴시킨 다음 원심분리 또는 여과하여 추출물을 수집한다.

세포질내에 축적시킬때는 이것은 예를들어서 윌스키등의 방법[J. Bacteriol., 127, 595(1976)]에 의하여 추출될 수 있다.

단계 ⅴ 이와 같이 얻은 폴리펩티드는 단백질에 대한 종래의 정제방법으로, 예를들면, 염석, 한외여과, 투석, 이온교환 크로마토그라피, 겔여과, 전기영동, 어피니티 크로마토그라피 등의 조합에 의해 정제할 수 있다.

전술한 방법에 의하여, 폴리펩티드 및/또는 폴리펩티드의 N-말단에 메티오닌이 있는 폴리펩티드를 제조할 수 있다.

[Ⅲ] 폴리펩티드의 수정

폴리펩티드의 수정으로부터 결과되는 물질은 폴리펩티드의 N-말단 및/또는 C-말단에 아미노산 또는 펩티드(둘 또는 그이상의 아미노산으로 구성되는)의 첨가로 결과되는 폴리펩티드 ; 폴리펩티드로부터 하나 또는 그 이상의 아미노산의 삭제로부터 결과되는 폴리펩티드 ; 아스파라진 또는 글루타민 잔기의 각각, 아스파르트산 또는 글루타민산 잔기로의 변화, 또는 아스파르트산 또는 글루타민산 잔기의 각각 아스파라진 또는 글루타민 잔기로의 변화로부터 결과되는 폴리펩티드를 포함하고, 또한 분자내의 작용기를 사용함으로써 N-말단의 아미노잔기 또는 C-말단의 카르복시잔기를 형성시킨 에스테르, 아실유도체 또는 산아미드, 그리고 아미노잔기 또는 카르복시잔기를 사용함으로써, 예를들어서, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 알기닌, 카페인, 프로카인, 염산, 글루콘산 등과 형성된 그들의 염과 같은 폴리펩티드의 유도체를 포함한다.

이러한 유도체의 수정 또는 제조는 공지의 기법에 의해, 예를들면 "단백질의 화학적 수정" ["Chemical Modification of Proteins" by Means, G. E and Feeney, R. E., Holdenday, Inc., California(1971)]에 기술된 방법에 따라 수행된다.

본 발명 폴리펩티드는 집합물(aggregate)로서 존재할 수 있고, 또는 숙주내에서 또는 분리의 과정에서 변화되어 있을 수도 있다. 시스테인 잔기가 본 발명 폴리펩티드의 성분인 경우에 이 잔기는 분자사이에 S-S 결합으로 구성될 수도 있다. 이들 변화된 폴리펩티드도 또한 본 발명에 포함된다.

인간 또는 토끼 IL-1 전구체를 코우드하는 DNA 또는 성인 또는 토끼 IL-1을 코우드하는 뉴클레오티드 배열 상부영역을 포함하는 DNA로 삽입된 벡터가 있는 숙주의 형질전환의 경우에, 형질전환된 숙주는 경우에 따라 전구체 폴리펩티드, 성숙한 폴리펩티드의 N-말단에서 성숙한 폴리펩티드를 갖거나 또는 갖지 않고 상부 DNA에 해당하는 폴리펩티드와 결합된 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 이들 폴리펩티드로 또한 본 발명에 포함된다.

[Ⅳ] 폴리펩티드의 화학적 및 물리적 특성

성인 IL-1 폴리펩티드 및 그의 수정된 폴리펩티드의 화학적 및 물리적 특성을 아래에 기술하기로 한다.

(A) 분석방법

분자량

분자량은 도데실황산 나트륨(SDS)-폴리아크릴아미드 겔(겔 농도 ; 12.5%) 전기영동에 의해 측정하였다.

시료용액을4% SDS, 10% 2-메르캅토에탄올, 20% 글리세롤 및 0.02% 브로모페놀 블루를 포함하는 같은 부피의 0.125M 트리스-HCl(pH 6.8) 완충액과 혼합하고, 이어서 실온에서 30분간 방치하였다. 혼합실시예 5-(2)에서 얻은 폴리펩티드이다.

IL-1(157)은 표 5의 아미노산 No. 115 내지 아미노산 No. 271의 아미노산 배열에 해당하는 실시예 6-(2)에서 얻은 폴리펩티드이다.

IL-1(149)는 표 5에서 아미노산 No. 123 내지 아미노산 No. 271의 아미노산 배열에 해당하는 실시예 7-(2)에서 얻은 폴리펩티드이다.

IL-1(144)는 표 5의 아미노산 No. 127 또는 128 내지 아미노산 No. 271의 아미노산 배열에 해당하는 실시예 8-(2)에서 얻은 폴리펩티드이다.

IL-1(155-C)는 표 5의 아미노산 No. 113 내지 아미노산 No. 267의 아미노산 배열에 해당하는 실시예 10-(2)에서 얻은 폴리펩티드이다.

[표 a]

성인 IL-1 폴리펩티드의 특성

[표 b]

IL-1(157), IL-1(149) 및 IL-1(144)

[표 c]

IL-1(155-c)의 특성

상기 표들에서, Glx 는 Glu 또는 Gln을 나타내고 Asx는 Asp 또는 Asn을 나타내며 Y는 Arg 또는 Met-Arg를 나타낸다.

[Ⅴ] 조제 및 용도

본 발명의 폴리펩티드 또는 물질을 조제하기 위해, 그들은 용액 또는 동결건조된 생성물의 형태로 될 수 있다. 장기간 안정성의 견지에서, 그들은 동결 건조된 생성물의 형태가 바람직하다. 제제에 부형제 또는 안정제를 가하는 것이 바람직하다. 안정제의 예들은 알부민, 글로부린, 젤라틴, 프로타민, 프로타민염, 글루코오스, 갈락토오스, 크실로오소, 만니톨, 글루쿠론산, 트레알로스, 덱스트란, 히드록시에틸 스타아치, 및 기이온성 계면활성제(예를들면, 폴리옥시 에틸렌지방산 에스테르, 폴리옥시메틸렌 알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬 페닐에테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 글리세린 지상산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 아주까리경화유, 폴리옥시에틸렌 아주까리유, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬에테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체, 소르비탄 지방산 에스테르, 수크로오스 지방산 에스테르 및 글리세린 지방산 에스테르)를 포함한다.

본 발명 폴리펩티드 또는 물질은 그들이 동물에 이식된 종양을 퇴축시키고 동물의 치명적인 세균성 감염을 경감시키기 때문에 항암제 또는 항감염제로서 유용하다.

이러한 제조는 바람직하게는 비 경구적으로 또는 국소적으로 투여한다. 종양세포 또는 병원체가 몸의 넓은 부위에 확장되어 있을때나 종양의 전이 또는 세균성감염의 방지를 의도할 때 정맥내, 피하 및 근육내 경로와 같은 비경구적 경로가 사용된다. 국소 종양조직 또는 국소 감염에 대해서는 국소투여가 바람직하다. 투여량은 종양 또는 감염의 형태 및 크기, 환자의 조건 및 투여경로에 의존하여 변동한다. 인도메타신과 같은 소염제가 투여될 수 있다.

[Ⅵ] 실시예

다음의 실시예들은 본 발명을 더욱 상세히 예시한다. 그러나 본 발명은 결코 이들 실시예에 한정되지 않음을 이해하여야 한다.

다음의 실시예들을 더 잘 이해하기 위해, 제 1 도 내지 제 10 도 및 표 5 내지 8이 본 명세서에 첨부되어 있다.

[실시예 1]

사람 IL-1을 코우드하는 cDNA의 클로우닝 및 시퀀싱

(1) 인간 전골수구성 백혈병(HL-60) 세포로부터 인간 IL-1 mRNA의 제조.

HL-60 세포를 분화유도체로서 500mg/ml 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트와 500mg/ml 레티노인산과 함께 10% 태아 소혈청을 포함하는 RPMI-1640 배지 100ml에 1*10 세포 접시의 세포밀도로 패트리접시(8cm 직경)에 뿌렸다. 5% 이산화탄소를 포함하는 충분히 습한 분위기에서 37℃에서 배양후, 배지 및 비-부착 세포를 흡인에 의해 제거하였다. 분화된 세포가 부착된 접시에, 유도제로서 10마이크로그램/ml 엔도톡식(대장균으로부터 유도된 리보플리사카라이드, 이후부터 "LPS"로 칭한다)과 1마이크로그램/㎖ 시클로헥시이미드(단백질합성억제제)가 보충된 10% 소태아 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배지 10ml를 가하고 5시간 동안 더 배양시켰다. 배지를 흡인에 의해 제거시키고, 접시에 부착된 유도세포를 0.5% N-라우로일 사르코신산 나트륨, 5mM 시트르산나트륨 및 0.1M 2-메르캅토 에탄올을 포함하는 6M 구아니디늄 티오시아네이트에 세포 용해시키고 균일화 시켰다. 균질물을 0.1M EDTA를 포함하는 5.7M 염화세슘 용액상에 얹고 초원심 분리기(RPS 27-2로터, 히다찌고끼, 일본)를 사용하여 26,500rpm에서 20시간동안 원심분리하여 펠릿으로서 총 RNA 분율을 얻었다. 펠릿을 0.35M NaCl, 20mM 트리스-HCl(pH 7.4) 및 20mM EDTA를 포함하는 소량의 7M 요소 용액에 용해시키고 에탄올로부터 침전에 의해 회수하였다. HL-60 1.5*10⁸개의 세포로부터 총 RNA 1.7mg을 얻었다. 총 RNA 분율을 1mM EDTA(이후부터, "TE 용액"으로 칭한다)을 포함하는 10mM 트리스-HCl(pH 7.4) 완충액 2ml에 용해시키고 용액을 65℃에서 5분간 가열하였다. NaCl 용액을 0.5M의 최종농도에 가하고, 용액을 0.5M Nacl을 포함하는 TE 용액과 사전에 평형화된 올리고(dT)-셀룰로오스 컬럼상에 적용시켰다. 폴리(A) mRNA를 약 75마이크로그램의 수율로 TE 용액을 가진 컬럼으로부터 용출시켰다.

폴리(A) mRNA를 약 150mg/란모세포의 투여량으로 제노피스 래비스의 란모세포에 주입하고 10개의 란모세포를 22℃에서 24시간동안 바아스(Barth) 배지 100 마이크로 리터에서 배양시켰다. 란모세포를 균일화 시키고 원심분리하였다. 상징액을 아래에 기술된 방법에 따라 IL-1 활성의 측정을 받게했다.

5% 소태아 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배지를 배지로서 사용한다. 시료는 적당한 농도로 배지로 희석한다. 희석액 50마이크로리터를 96웰 다중-웰판(플로우 Labs., USA)]의 각 웰에 가한다. 또한, 50 마이크로그램/ml 피로헤마글루티닌-P(Difco Labs., USA) 50마이크로리터 및 C3H/He(6-10 주생)로부터 수집한 티모사이트 현탄액(1*10⁷세포/ml) 10마이크로리터를 웰에 가한다. 평균을 5% 이산화탄소를 포함하는 충분히 습한 분위기에서 37℃에서 배양시킨다. 배양 2일후,³H-티미딘 1마이크로큐리를 각 웰에 가하고 판을 18시간동안 더 배양시킨다. 티모사이트 세포는 티페르펙셀 하베스터(Titertek Cell Harvester : Flow Labs.)를 사용하여 하베스터필터(Flow Labs.)상에서 수집한다. 세포에 취입( )된³H-티미딘의 방사능을 계수한다.

LAF(림포사이트 활성인자)활성을 시험시료의 대신에 배지를 사용하여 대조표준의³H-티미딘 취입과 비교하여³H-티미딘 취입의 증가로 구한다.

상기한 방법을 다음의 모든 실시예에서 IL-1 활성에 대한 측정으로서 사용하였다.

상기와 같이 제조된 상징액의 320-배희석용액은³H-티미딘 약 15,000-18,000의 취입을 나타내었다.

이것은 폴리(A) mRNA 제제가 IL-1 mRNA를 함유함을 가리킨다.

(2) cDNA의 합성

상보 DNA는 상기(1)에서 얻은 풀리(A) mRNA를 주형으로 사용하면서 구블러 및 호프만[Gubler ＆ Hoffman, Gene, 25, 263(1983)]의 방법에 따라 합성하였다.

폴리(A) mRNA 6마이크로그램을 증류수 6마이크로리터에 용해시킨 다음 거기에 100mM 수산화 메틸수은 용액 0.6마이크로리터를 가하였다. 실온에서 10분간 방치후, 리본 뉴클레아제 억제제(RNasin

, 프로메가 바이오텍제품, USA)를 포함하는 500mM 2-메르캅토에탄올 용액 1.7마이크로리터를 혼합물에 가하였다. 실온에서 5분간 방치후, 10mM MgCl₂, 1.2mM dGTP, 1.25mM dATP, 1.25mM dTTP, 0.5mM dCTP, 170nM 알파-³²-P-dCTP(비방사능, 750Ci/mmole), 올리고(dT) 12-18 4 마이크로그램 및 120단위의 AMV 역전사효소를 포함하는 50mM 프리스-HCl(pH 8.3) 완충액 32마이크로리터를 혼합물에 가하고 42℃에서 60분간 배양시켰다. EDTA를 첨가함으로써 반응을 중지시켰다. 반응혼합물을 페놀-클로로포름 1 : 1)으로 추출하고 아세트산 암모늄을 수층에 가하여 최종농도 2.5M로 하였다. 결과 sscDNA-mRNA 히브리드를 에탄올로부터의 침전에 의해 수층에서 회수하였다.

sscDNA-mRNA 히브리드 침전을 5mM MgCl₂, 10mM(NH₄)₂SO₄, 100mM KCl, 0.15mM 베타-니코틴아미드-아데닌 디뉴클레오티드, 소혈청알부민 5마이크로그램, 각각 0.04mM의 4종의 데옥시리보 뉴클레오티드 삼인산, dGTP, dATP, dTTP 및 dCTP 1.25단위의 대장균 리보뉴클레아제 H 및 24단위의 대장균 DNA 폴리머라제 I를 포함하는 20mM 트리스-HCl(pH 7.5) 완충액 100마이크로리터에 용해시켰다. 반응혼합물을 12℃에서 60분간 배양시킨 다음 2.5단위의 대장균 DNA 리가제를 가하고 22℃에서 60분간 더 배양시켜 dscDNA를 합성하였다. EDTA를 가함으로써 반응을 중시켰다. dscDNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고 상기한 바와같이 메탄올로부터 침전에 의해 회수하였다.

(3) 올리고(dC)-테일 부가 cDNA의 제조

상기한 바와같이 얻은 dscDNA를 2mM CoCl₂, 0.2mM 디티오프레이톨, 0.1mM 알파-³²P-dCTP(비방사능, 1CL/mmole) 및 10단위의 터미널 데옥시 뉴클레오티딜 트랜스퍼라제를 포함하는 100mM 카코딜산 나트륨(pH 7.2) 완충액 100마이크로리터에 용해시키고, 37℃에서 30분간 배양시켜 dscDNA의 3'-말단에 올리고(dC) 테일이 부가되도록 하였다. EDTA를 가하여 반응을 중지시켰다. 올리고(dC)-테일 부가 dscDNA를 페놀/클로로포름으로 추출하였고 에탄올로부터 침전에 의해 회수하였다. 올리고(dC)-테일부가 dscDNA를, ml당 2마이크로그램의올리고(dc)-테일부가 dscDNA를 포함하도록 1mM EDTA와 100mM NaCl을 포함하는 10mM 트리스-HCl(pH 7.4) 완충액에 용해시켰다.

(4) 재결합 플라스미드의 제작.

올리고(dG)-테일부가 pBR 322DNA(베데스다 Res.Labs.Inc., USA의 제품) 및 상기 (3)에서 얻은 올리고(dC)-테일부가 dscDNA를, 총부피 1.5ml에 각각 1.5마이크로그램 및 0.09마이크로그램을 포함하도록 1mM EDTA와 100mM NaCl을 포함하는 10mM 트리스-HCl(pH 7.4) 완충액에 용해시켰다. 혼합물을 65℃에서 10분간, 57℃에서 2시간 그리고 45℃에서 2시간동안 연속해서 배양시켜 어니일링을 수행하고 재결합 플라스미드를 제작하였다.

(5) 형질 전환체의 선별

대장균 X 1776 (株)를 상기와 같이 얻은 재결합 플라스미드로 형질전환시켰다.

상세히는, 대장균 X 1776을 37℃에서 600mm의 흡광도가 0.5에 이를때까지 100마이크로그램 ml의 디아미노피멜산과 40마이크로그램/ml의 티미딘이 보충된 L브로스(L broth, 조성 : 1ℓ당 트립톤 10g, 효모 5g, NaCl 5g 및 글루코오스 1g, pH 7.2) 20ml에서 배양시켰다. 세포를 4℃에서 원심분리에 의해 수집하고 50mM CaCl₂를 포함하는 10mM 트리스-HCl(pH 7.3) 완충액 10mM로 세척하였다. 세포를 위에 사용한 것과 같은 완충액 2ml에 재부유시키고 0℃에서 5분간 방치해두었다. 세포 현탁액 0.2ml에 상기와 같이 얻은 재결합 플라스미드 용액 0.1ml를 가하였다. 혼합물을 0℃에서 15분간 방치해둔 다음 42℃에서 2분간 유지하였다.

다음에, 위에 사용한 것과 같은 보충된 L브로스 0.5ml를 가하고 1시간 동안 흔들면서 배양을 수행하였다. 배양액의 일부를 취하여, 15마이크로그램/ml의 테트라 사이클린을 포함하는 보충된 L브로스 한천 평판상에 펴 바르고 37℃에서 약 12시간 동안 배양시켰다.

테트라사이클린 내성 형질전환체를 선별함으로써 cDNA 라이브러리를 제작하였다.

(6) 클로우닝

사람 IL-1을 코우드 하는 cDNA를 포함하는 재결합 플라스미드를 품고있는 형질 전환체를 실시예 2에서 얻은 토끼 IL-1을 코우드하는 클론화 cDNA를 프로브로써 사용하는 클로니 히브리다이 제이션 측정에 의해 상기(5)에서 얻는 DNA 라이브러리로부터 선별하였다.

상세히는, 토끼 IL-1을 코우드하는 클론화 cDNA(약 1.1kbp)를 제한효소 PstI로 소화시킴으로써 실시예 2-(6)에 보인바와 같이 재결합 플라스미드 pRL 15로부터 분리시키고³²P로 표시하였다. 이 표시된 cDNA를 상기한 바와같이 클로니 히브리다이 제이션 측정에 의해 사람 IL-1을 코우드하는 cDNA를 포함하는 플라스미드를 갖는 형질 전환체를 선별하기 위해 cDNA 라이브러리를 거르기 위한 프로브로써 사용하였다.

표시된 프로브와 강하게 히브리다이즈될 수 있는 cDNA를 갖는 5개의 클론이 약 20,000클론으로부터 선별되었다.

또한 크기가 2kbp 또는 그 이상의 cDNA를 포함하는 재결합 플라스미드를 품고 있는 2개의 클론이 선별되었고 그들은 mRNA 히브리다이제이션-트랜스레이션 측정을 받게 하였다.

플라스미드 DNA를 선별된 클론 각각으로부터 추출하였고 열변성후 니트로셀룰로오스 필터에 고정시켰다. 상기(1)에서 얻은 사람 IL-1 mRNA를 포함하는 폴리(A) mRNA 분율을 필터에 가하고 50℃에서 5시간 동안 배양시켜 히브리다이 제이션을 수행하였다. 히브리다이즈된 mRNA를 회수하고 제노피스 래비스의 란모세포에 주입시켜 회수된 mRNA가 IL-1 mRNA 인지를 결정하였다. 이 시험에 의해, 인지를 결정하였다. 이 시험에 의해, 이들 2개의 클론은 사람 IL-1 mRNA와 강하게 히브리다이즈 될 수 있는 cDNA를 포함함을 확인하였다.

이들 두클론중, 크기가 약 2.1kbp의 cDNA를 포함하는 재결합 플라스미드를 품고있는 한 클론을 클론화 cDNA(플라스미드 No. pHL4 ; 클론 No. x1776/pHL4로 칭함)를 시켄싱하기 위해 선별하였다.

(7) 클론화 cDNA의 뉴클레오티드 배열의 결정

상기(6)에서 선별된형질전환체(x1776/pHL4)를 디아미노피멜산 및 티미딘이 보충된 L브로스에서 배양시켰다.

세포를 윌키씨등(Wilkie et al, Nucleic Acids Res., 7m 859(1979)의 방법에 따라, 처리하여 플라스미드 DNA를 얻었다.

플라스미드 DNA를 제한효소 Pst I으로 분열시키고 정제하여 클론화 cDNA 삽입체를 얻었다. 클론화 DNA는 단일 제한효소 또는 두종류의 다음의 제한효소, SacI, ResI, HindIII, HincII, Fnu4HI, HinfI, BalI 및 EcoRI로 더 분열시켰다.

결과 cDNA 단편은 크기가 약 150-700bp인 것을 분리시키고 그들의 뉴클레오티드 배열의 결정에 사용하였다.

뉴클레오티드 배열의 결정은 M13 시켄싱킷드(Amersham International pic)와 클로우닝 벡터로서 M 13mp 18과 M 13mp 19(P-L Biochemicals 제품)을 사용함으로써 "M13 클로우닝 및 시켄싱 핸드북(Amersham International pic)"의 원문에 따라 디데옥시법으로 행하였다.

표 5는 사람 IL-1을 코우드하는 뉴클레오티드 배열과 뉴클레오티드 배열로부터 유도된 아미노산 배열을 나타내는데, 여기서 제 1 내지 3번 염기의 코돈은 개시코돈 ATG 이며 제 814 내지 816번 염기의 코돈은 중지코돈 TAG이다.

인간 IL-1을 코우드하는 뉴클레오티드는 표 5에서 271개의 아미노산(아미노산 No. 1-271)으로 구성되는 전구체 폴리펩티드를 코우드한다.

성인 IL-1 폴리펩티드는 그의 전구체의 C-말단으로부터 159아미노산에 해당하는 폴리펩티드인데, 표 5에서 제 337 내지 813번 염기로부터 뉴클레오티드 배열에서 코우드된다.

[실시예 2]

토끼 IL-1을 코우드하는 cDNA의 클로우닝 및 시켄싱

(1) 토기 페포 대식세포로부터 토끼 IL-1 mRNA의 제조

체중 약 2.5-3.0kg의 토끼에 토끼당 100mg의 투여량으로 프로피오니 박테리움 아크네스(Propio-nibacterium acnes)의 건조된 사균체를 주입시키고 8일 후 살해하였다.

폐를 동물의 기관에 삽입된 관을 통해 인산염 완충 식염수로 반복세척하고 페포 대식세포를 수집하였다.

페포대식세포를 10% 소태아 혈청을 포함하는 RPMI-1640 배지에 부유시키고 1×10⁷세포/접시의 세포밀도에서 페트리접시(8cm직경)에 뿌렸다. 그것들을 5% 이산화탄소를 포함하는 충분히 습한 분위기에서 37℃에서 사전 배양시켰다.

1시간 배양후, LPS, TPA(포트볼-12-미리스테이트-13-아세테이트) 및 시클로헥시이미드를 접시에 가하여 그들의 최종농도가 각각 10마이크로그램/ml, 10ng/ml 및 1마이크로그램/ml가 되도록 하였다. 배양을 4시간동안 더 계속하였다. 배지를 흡인에 의해 제거하고 접시에 부착된 대식세포를 0.5% N-라우로일 사르코신산나트륨, 5mM 시트르산나트륨 및 0.1M 2-메르캅토에탄올을 포함하는 6M 구아니디늄 티오시아 네이트에 세포용해 및 균일화시켰다.

균질물을 0.1M EDTA를 포함하는 5.7M 염화세슘 용액의 쿠숀상에 얹고 초원심분리(RPS 27-2로터, 히다찌 고끼)를 사용하면서 26,500rpm에서 20시간 동안 원심분리하여 총 RNA분율을 펠릿으로서 얻었다.

펠릿을 0.35M NaCl, 20mM 트리스-HCl(pH 7.4) 및 20mM EDTA를 포함하는 소량의 7M 요소용액에 용해시키고, 에탄올로부터의 침전에 의해 회수하였다.

총 RNA 분율을 TE 용액 2ml에 용해시키고 용액을 65℃에서 5분간 가열하였다.

NaCl 용액을 가하여 최종농도 0.5M로 하였고, 용액을 0.5M NaCl을 포함하는 TE 용액과 사전에 평형화된 올리고(dI)-셀룰로오스 컬럼상에 적용시켰다. 폴리(A) mRNA를 TE용액으로 컬럼으로부터 용출하였다.

폴리(A) mRNA는 토끼 폐포 대식세포의 1.3×10⁹개의 세포로부터 약 300마이크로그램의 수율로 얻었다.

결과 폴리(A) mRNA를 레흐락씨등[Lehrach et al, Biochemistry, 16, 4743(1977)]의 방법에 따라 아가로오스 겔 전기영동(pH4에서 6M 요소의 존재하에 겔 농도 1%)을 받게하였고, 토끼 IL-1mRNA를 포함하는 폴리(A) mRNA분율을 그래이씨등 Gray et. al., Nature, 295, 503(1982)의 방법에 의해 약 2.6-3.7kb 크기에 해당하는 겔분율로부터 회수하였다(이후부터 0140농축폴리(A)mRNA"로 칭함)농축(enriched) 폴리(A) mRNA 약 34마이크로그램을 폴리(A)mRNA 200마이크로그램으로부터 얻었다.

농축폴리(A)mRNA를 마이크로리터당 0.2마이크로그램의 농도에서 증류수에 용해시키고 용액을 란모세퍼당 약 50nl의 투여량으로 제노퍼스 래비스의 란모세포에 주입하였고 10개의 란모세포를 22℃에서 24시간 동안 바스배지[Barth's medium, J.B. Gurdon, J. Embryol. Exp. Morphol. 20 401(1968)] 100마이크로리터에서 배양시켰다. 란모세포를 균일화시키고 원심분리하였다.

상징액을 IL-1 활성의 측정을 받게했다.

위와같이 제조한 상징액 100-배 및 400-배 희석액 각각은 7,979cpm 및 2,187cpm의 쥐 티모사이트로의 취입을 각각 나타내었다.

농축 폴리(A) mRNA제제는 IL-1mRNA를 포함함을 가리킨다.

(2) cDNA의 합성

상보 DNA는 상기(1)에서 얻은 농축 폴리(A) mRNA를 주형으로 사용하면서 구블러 및 호프만[Gubler ＆ Hoffman ; Gene, 25, 263(1983)]의 방법에 따라 합성하였다.

농축 폴리(A) mRNA 4 마이크로그램을 10mM MgCl₂, 10mM 디티오트레이틀, 4mM 피로인산나트륨 1.25mM dGTP, 1.25mM dATP, 1.25mM dTTP, 0.5mM dCTP, 170nM 알파-³²P-dCTP(비방사능, 750Ci/mmole), 올리고(dt)12-18 5마이크로그램 및 AMV로부터 유도된 120 단위의 역전사 효소를 포함하는 50mM 트리스-HCl(pH 8.3)완충 액 50마이크로리터에 용해시키고, 42℃에서 60분간 배양하였다.

EDTA를 가함으로써 반응을 중지시켰다. 반응혼합물을 페놀/클로로포름(1 : 1)으로 추출하고, 아세트산암모늄을 수층에 가하여 최종농도 2.5M로 하였다.

결과 sscDNA-mRNA히브리드를 에탄올로부터의 침전에 의해 수층으로부터 회수하였다.

sscDNA-mRNA 히브리드 침전을 5mM MgCl₂, 10mM(NH₄)₂SO₄, 100mM KCl, 0.15mM-베타-니코틴아미드-아데닌 디뉴클레오티드, 소혈청알부민 5마이크로그램, 각각 0.04mM의 4종의 데옥시 리보뉴클레오티드 삼인산, dGTP, dATP, dTTP 및 dCTP 12.5 단위의 대장균 리보튜클레아제 H 및 50단위의 대장균 DNA 폴리머라제 1을 포함하는 20mM 트리스-HCl(7.5)완충액 10마이크로리터에 용해시켰다.

반응혼합물을 12℃에서 60분간 배양시키고 22℃에서 60분간 더 배양시켜 dsc DNA를 합성하였다. EDTA를 가함으로서 반응을 중지시켰다. dsc DNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고 상기한 바와 같이 에탄올로부터 침전에 의해 회수하였다.

(3) 올리고(dc)-테일부가 cDNA의 제조

상기한 바와같이 얻은 dsc DNA를 2mM CoCl₂, 0.2mM 디티오르레이틀, 0.1mM 알파³²P-dCTP(비방사능, 1Ci/mmole) 및 10단위의 터미날 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제를 포함하는 카코딜산 나트륨(pH 7.2)완충액 100마이크로리터에 용해시키고, 37℃에서 30분간 배양시켜 dscDNA의 3'-말단에 올리고(dc)테일이 부가되도록 하였다.

EDTA를 가함으로써 반응을 중지시켰다.

올리고(dc)-테일부가 dscDNA를 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로부터의 침전에 의해 회수하였다.

올리고(dc)-테일부가 dscDNA를 1mM EDTA와 100mM NaCl을 포함하는 10mM 트리스-HCl(pH 7.4) 완충액에 용해시켜 ml당 2마이크로그램의 올리고(dc)-테일부가 dscDNA가 포함되도록 하였다.

(4) 재결합 플라스미드의 제작

올리고(dG)테일부가 pBR322DNA(Bethesda Res, Labs. Inc., USA)와 상기(3)에서 얻은 올리고(dc)-테일부가 dscDNA를 1mM EDTA와 100mM NaCl을 포함하는 10mM 트리스-HCl(pH 7.4) 완충액에 용해시켜 그들이 총부피 1.5ml에 각각 1.5마이크로그램과 0.09마이크로그램으로 포함되도록 하였다.

혼합물을 65℃에서 10분간 57℃에서 2시간, 45℃에서 2시간 연속적으로 배양시켜 어니일링을 수행하고 재결합 플라스미드를 제작하였다.

(5) 형질전환체의 선별

대장균 x1776주를 위와같이 얻는 재결합플라스미드로 형질전환시켰다.

상세히는, 대장균 x1776을 600nm에서의 흡광도가 0.5에 이를 때 까지 디아미노피멜산 100 마이크로그램/ml와 티미딘 40마이크로그램/ml이 보충된 L브로스(조성 : 리터당 트립톤 10g, 효모 5g, NaCl 5g 및 글루코오스 1g ; pH7.2) 20ml에서 37℃에서 배양시켰다.

세포를 4℃에서 원심분리에 의해 수집하고 50mM CaCl₂를 포함하는 10mM 트리스-HCl(pH 7.3) 완충액 10ml로 세척하였다. 세포를 위해 사용한 것과 같은 완충액 2ml에 재부유시키고 0℃에서 5분간 방치하였다.

세포현탄액 0.2ml에 위와같이 얻은 재결합 플라스미드용액 0.1ml를 가하였다. 혼합물을 0℃에서 15분간 방치한 다음 42℃로 2분간 유지하였다.

다음에, 위에 사용한 바와같은 보충된 L브로스 0.5ml를 가하고 1시간 동안 흔들면서 배양을 수행하였다. 배양액의 일부를 취해 테트라사이클린 15마이크로그램/ml를 포함하는 보충된 L브로스 한천평판에 펴 바르고 37℃에서 12시간 동안 배양하였다.

cDNA 라이브러리를 테트라사이클린에 내성인 형질전환체를 선별함으로써 제조하였다.

(6) 클로우닝

토끼 IL-1을 코우드하는 cDNA를 포함하는 플라스미드를 갖는 형질전환체에 대한 cDNA 라이브러리를 거르기 위하여 콜로니 히브리다이제이션 측정을³²P-표지된 유-플러스 및 유도-마이너스 cDNA 프로브를 사용하면서 하나한 및 메셸슨[Hanahan ＆ Meselson ; Gene, 10, 63(1980)]의 방법에 의해 행하였다.

유도플러스 및 유도마이너스³²P-표지된 sscDNA 프로브 각각을 상기(1)에 기술된 방법에 의해 LPS, TPA 및 시클로헥시이미드로 유도된 란모대식세포와 비유도 란모대식세포 각각으로부터 산-요소 아가 로오스 겔 전기영동에 의해 분별된 농축 폴리(A) mRNA 분율을 주형으로써 사용하여 상기(2)에 기술된 방법에 의해 각각 합성하였다.

이 시험에 의하여, 유도-플러스 프로브와 강하게 히브리다이즈 되었으나 유도-마이너스 프로브와 히브리다이즈되지 않은 재결합 플라스미드를 품고있는 형질전환체의 콜로니를 선별하였다.

약 5,000개의 콜로니로부터 648개의 콜로니가 선별되었다.

다음에 선별된 콜로니의 Ieu군을(각 군에 10개의 콜로니를 포함함) 만니아티스씨 등의 "분자클로우닝"(T.Maniatis et al. (ed) " Molecular Cloning", 329(1980), Cold Spring Harbor Lab.)에 기술된 방법에 의해 mRNA 히브리다이 제이션-트랜스레이션 측정을 받게 하였다. 플라스미드 DNA를 각군으로부터 추출하고 제한효소 EcoRI로 소화시킴으로써 직쇄화시키고 열변성후 니트로셀룰로오스 필터에 고정시켰다.

상기(1)에서 얻은 토끼 IL-1 mRNA를 포함하는 폴리(A) 분율을 필터에 가하고 50℃에서 5시간 동안 배양시켜 히브리다이제이션을 수행하였다.

히브리다이즈된 mRNA를 회수하고 제노피스 래비스의 란모세포에 주입시켜 회수된 mRNA가 토끼 IL-1 mRNA인지를 결정하였다.

본 시험의 결과로써, 한군(H-1603으로 칭함)은 토끼 IL-1 mRNA와 강하게 히브리다이즈된 cDNA를 포함하는 플라스미드를 가짐을 발견하였다(제 1-a 도 참조). H-1603군의 각 콜론은 위와같이 mRNA 히브리다이제이션-트랜스레이션 측정을 더 시키고 한 클론은 토끼 IL-1 mRNA와 강하게 히브리다이즈 되었음을 발견하였다(제 1-b 도 참조). 이 선별된 클론은 PRL15라 칭하였다. 삽입된 cDNA는 제한효소 PstI으로 소화시킴으로써 재결합 플라스미드 PRL15로부터 절단해 내었고 이것은³²로 표시되었다.

이³²P-표지된 cDNA를 프로브로써 사용함으로써 위와같이 선별된 648 콜로니를 다시 콜로니 히브리다이제이션 측정에 의해 걸러내었다.

이 시험의 결과로써, 8개의 콜론이³²-표지된 프로브와 히브리다이즈되었다.

(7) 클론화 cDNA의 뉴클레오티드 배열의 결정

재결합 플라스미드 pRL15를 제한효소 Pst I으로 분열시키고 정제하여 콜론화 cDNA 삽입제를 얻었다.

클론화 cDNA를 단일 제한효소로 또는 두종류의 다음의 제한효소들, HaeIII, HincIII, AccI, PvuII, AvalII 및 RsaI을 조합하여 더 분열시켰다. 결과 cDNA단편은 크기가 약 100-600bp이며 뉴클레오티드 배열 결정에 사용하였다.

뉴클레오티드 배열의 결정은 M13 시켄싱 킷트(Amersham International plc)와 M13mp 18과 M13mp 19(P-L Biochemicals 제품)를 클로우닝벡터로써 사용함으로써 "M13 클로우닝 및 시켄싱 핸드북(Amersham International plc)"의 원문에 따라 디데옥시법에 의해 행하였다.

표 7은 뉴클레오티드 배열 및 토끼 IL-1을 코우드하는 뉴클레오티드 배열로부터 유도된 아미노산 배열을 나타낸다.

제 1 내지 3번 염기의 코돈은 개시코돈 ATC이고 제 802 내지 804번 염기의 코돈은 중지코돈 TAA이다.

토끼 IL-1을 코우드하는 DNA는 267개의 아미노산잔기(표 7에서 아미노산 제 1-267번)로 구성되는 전구체 폴리펩티드를 코우드한다.

성숙한 토끼 IL-1 폴리펩티드는 그의 전구체의 C-말단으로부터 155개의 아미노산에 해당하는 폴리펩티드인데 이것은 표 7의 제 337 내지 801번 염기의 뉴클레오티드 배열에서 코우드된다.

인간 및 토끼 IL-1 전구체 폴리펩티드를 코우드하는 뉴클레오티드 배열간의 호모토지와, 인간 및 토끼 IL-1 전구체 폴리펩티드의 유도된 아미노산 배열간의 호모로지를 표 8-1과 표 8-2에 각각 나타내었다.

뉴클레오티드 배열 및 아미노산 배열에서의 호모로시는 각각 약 79% 내지 64%이다.

[실시예 3]

인간제놈 IL-1 유전자의 클로우닝 및 시켄싱

인간제놈 IL-1 유전자는 아래에서 제조된 바와 같이³²P-표지된 DNA 단편을 프로브로서 사용하면서 벤톤 및 데이비스의 플레이크 히브리다이 제이션법 Science, 196, 180(1977)에 의해 인간제놈 라이브러리 즉, 만니아티스[Dr. T. Maniatis, Harvard University, Department of Biochemistry and Molecular Biology, USA ; Lawn, R.M. et al., Cell, 15, 1157(1978)] 씨에 공급된 박테리오페이지 샤론 4A에 삽입된 HeaIII-AlnI 소화된 사람 DNA 단편으로부터 걸러내었다. 실시예 1-(6)에서 얻은 재결합 플라스미드 pHL4로부터, 표 5의 제 5번 염기로부터 그 아래에 해당하는 약 847bp 크기의 DNA 단편을 제한효소 BalI 와 HincII로 이중소화에 의해 절단하고 닉(nick)-트랜스레이션법에 의해³²P로 표지하였다.

그결과, 프로브와 강하게 히브리다이즈된 뉴클레오티드 배열을 포함하는 6개의 페이지 쿨론을 약 600,000페이지 플레이크의 라이브러리로부터 분리하였다.

이들 클론들을 실시예 1-(6)에서 얻은 재결합 플라스미드 pHL4의 cDNA 삽입체로부터 제한효소 HincII와 HindIII로 절단시킨³²P-표지된 DNA 단편(크기 약 1.1kbp)을 사용하면서 히브리다이제이션법에 의해 사람 IL-1의 모든 엑손(exons)을 커버한 클론에 대해 더 걸러내었다.

상기 HincII-HindII DNA 단편은 사람 IL-1 cDNA의 3'-비코우드 영역의 대부분을 포함한다.

상기와 같이 선별된 6개의 클론중에서 4개의 클론이 이 프로브와 강하게 히브리다이즈되었다.

재결합 페이지 DNA를 각 클론으로부터 분리시키고 제한효소 제도에 의해 특징을 나타내었다. 한 클론(λHL#4)을 뉴클레오티드 시켄싱에 대해 선별하였다.

제 2 도는 엑손과 인트론(introns)을 포함하는 인간IL-1 염색제 유전자의 구조를 나타낸다. 표 6은 인간 IL-1 전구체를 코우드하는 영역의 뉴클레오티드 배열과 인간 IL-1 전구체에 해당하는 아미노산 배열을 나타낸다. 이 표에서 인트로영역은 점선으로 나타내었다.

위에서 얻은 인간 IL-1을 코우드하는 뉴클레오티드 배열은 실시예 1에서 언급한바 인간 IL-1을 코우드하는 클론과 cDNA의 뉴클레오티드 배열과 완전히 일치한다.

[실시예 4]

인간 IL-1을 폴리펩티드의 제조

(1) 인간 IL-1 생성 형질전환체의 제작

인간 IL-1을 생성하는 것으로 지정된 형질발현 플라스미드를 제 3~5 도에 예시한바 trp 프로모터를 사용함으로써 제작하였다.

인간 IL-1을 코우드하는 클론화 cDNA를 실시예 1-(6)에 언급한바 재결합 플라스미드 pHL4로부터 분리시켰다.

cDNA 20마이크로그램을 50nM NaCl, 6mM MgCl₂및 6mM 2-메르캅토에탄올을 포함하는 10mM 트리스-HCl(pH 7.5) 완충액 10마이크로리터에 용해시키고 240단위의 제한효소 HindIII를 가한 다음, 37℃에서 60분간 배양시켰다.

다음에, 0.2M NaCl 100마이크로리터와 100단위의 제한효소 Sca I을 가하고 또한 37℃에서 60분간 배양시켰다. 배양을 마칠무렵 반응혼합물에 NaCl을 가하여 최종농도 0.3M을 제공하고 결과 DNA 단편을 2부피의 에탄올로 침전에 의해 회수하였다.

인간 IL-1에 대한 코우드영역을 포함하는 약 1.6kbp DNA 단편을 5% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해, 약 5마이크로그램의 수율로 분리시켰다.

이 DNA 단편을 T4 리가제에 의해 화학적으로 합성된 올리고 데옥시리보뉴클레오티드 어댑터와 결합시켰다.

The 합성어댑터는 다음의 식으로 나타낸다.

5'-CGTCCATGTCCA

3'-AGGTACAGGTTCGA [a]

결과 DNA 단편은 HIL-어댑터 단편으로 칭한다.

trp 프로모터 영역은 제한효소 EcoRI 와 HpaI으로 이중소화에 의해 trp 프로모터벡터 pDR 720[Russell, D.R., et al., Gene, 20 231 (1982)P-L Biochemicals 제품]으로부터 절단해내고 trp 프로모터영역을 포함하는 35bp DNA 단편을 분리하였다.

다음의 식으로 나타낸 합성 어댑터를 T4 리가제에 의해 35bp DNA 단편의 두딘단에 결합시켰다.

결과 DNA 단편은 "trp 프로모터 단편"으로 칭한다.

5'-AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAT

3'-TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCCATAGC [b]

따로, 플라스미드 pBR322 20 마이크로그램을 50mM NaCl, 6mM MgCl₂, 6mM 2-메르캅토에탄올 및 180단위의 제한효소 HindIII를 포함하는 10mM 트리스-HCl(pH 7.5) 완충액 100마이크로리터에 용해시키고 37℃에서 60분간 배양시켰다. 결과 DNA를 페놀/클로로포름으로 추출에 의해 에탄올로부터 침전에 의해 회수하였다. 그리고 이 DNA 단편을 TE 용액 20마이크로리터에 용해시켰다. 용액 10마이크로리터에 12.5mM MgCl₂, 0.125mM 디티오트레이톨, 0.25mM dGTP, 0.25mM dATP, 0.25mM dTTP, 0.25mM dCTP, 소혈청알부민 2.5마이크로그램 및 2.6단위의 대장균 DNA 폴리머라제 I(큰단편)를 포함하는 6.25mM 트리스-HCl(pH 7.2) 완충액 40마이크로리터를 가하고 20℃에서 60분간 배양시켰다. 결과 DNA 단편을 페놀/클로로포름으로 추출 및 에탄올로부터의 침전에 의해 회수하였다.

DNA 단편을 TE 용액 20마이크로리터에 용해시켰다. 상기 방법은 제한효소 HindIII로 소화시킨다음 무딘단에 양말단을 수정한 직쇄화된 이중쇄 DNA 단편을 제공하였다. 다음에 DNA 단편을 제한효소 EcoR I로 두 단편으로 절단하였다.

암피실린 내성의 유전자를 포함하는 더 큰 DNA 단편(약 4.3kbp)을 분리시켰다(이후부터 "pBR322-Amp^r단편"이라 칭함).

미리 제조된 HIL-어댑터 단편을 이들의 단편의 Cla I 점착단에서 T4 리가제에 의해 trp 프로모터 단편과 결합시켰다.

EcoR I 점착단과 무딘단을 갖는 결과 DNA 단편을 T4 리가제를 사용함으로써 pBR322-Amp^r단편과 결합시켜 인간 IL-1의 생성을 위한 형질발현 플라스미드(pHLP101)를 제작하였다.

결과 형질발현 플라스미드 pHLP101을 다음의 방법에 의해 대장균 HB101에 도입시켰다.

대장균을 L 브로스 5ml에 접종하고 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 결과 배양액을 L 브로스 10ml에 접종시키고 650nm에서 배양액의 탁도가 0.6에 이를때까지 37℃에서 더 배양시켰다.

얼음물에서 30분간 방치후, 세포를 원심분리에 의해 수집하고 50mM CaCl₂50ml중에 부유시키고 이어서 0℃에서 60분간 방치하였다. 다음에 세포를 원심분리에 의해 수집하고 20% 글리세롤을 포함하는 50mM CaCl₂10ml에 다시 부유시켰다.

형질발현 플라스미드 pHLP101을 상기한바, 칼슘처리된 대장균 HB101과 혼합시키고 얼음물에서 20분간 배양시킨 다음 42℃에서 1분간 그리고 실온에서 10분간 더 배양시키고, LB 브로스를 가하였다. 혼합물을 37℃에서 60분간 흔들었다.

결과 세포현탁액의 일부를 20마이크로그램/ml의 임피실린을 포함하는 LB 한천판에 뿌리고 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 다음에, 암피실린내성 클로니를 선별하여 형질전환체를 얻었다.

형질전환체중 하나는 HB101/pHLP101이라 이름하였고 인간 IL-1의 생성에 사용하였다.

(2) 인간 IL-1 폴리펩티드의 생성

형질전환체(HB101/pHLP101)를 LB 브로스내에서 37℃에서 하룻밤 배양하였다.

배양액의 10분지 1밀리리터를 수정된 M9 배지(조성 : 1.5% Na₂HPO₄, 12H₂O, 0.3% KH₂PO₄, 0.05% NaCl, 0.1% NH₄Cl, 2mg/리터 비타민 B₁, 0.5 가사미노산, 2mM MgSO₄, 0.1mM CaCl₂및 0.5% 글루코오스) 10ml에 접종하고 37℃에서 1시간동안 배양하였다.

다음에, 3-인돌아크릴산을 가하여 최종농도 20마이크로그램/ml로 하고 배양을 24시간동안 더 계속하였다.

다음에 세포를 원심분리에 의해 수집하였다. 세포를 0.1% 라이소자임과 30mM NaCl을 포함하는 50mM트리스-HCl(pH 8.0) 완충액 1ml에 부유시키고 0℃에서 30분간 방치하였다.

또한, 드라이아이스/에탄올욕에서 동결시키고 37℃로 해동시키기를 6회 되풀이 하였다. 그리고 세포 잔해를 원심분리에 의해 제거하여 정화된 세포용해물을 제공하였다.

세포용해물의 IL-1 활성을 실시예 1-(1)에 언급한 방법에 따라 구하였다.

세포용해물의 16-배 희석액은 8,103cpm의³H-티미딘 취입을 나타내었는데, 이것은 대조표준보다 3배 또는 그 이상 더 높은 취입에 해당하였다.

이것은 위와같이 제조한 세포용해물은 인간 IL-1 폴리펩티드를 포함함을 가리킨다.

세포용해물의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 패턴을 실시예 5-(2)에서 얻은 성인 IL-1 폴리펩티드와 비교함으로써 제 6 도에 나타내었다.

대장균 HB101/pHLP101에 의해 생성된 생성물은 표 5에서 제 63 내지 271번 아미노산에 해당하는 209개의 아미노산 잔기로 구성되는 폴리펩티드인 것으로 기대된다. 기대하는 분자량은 N-말단 메티오닌이 제거되었다면 이론상으로 23,642이어야 한다. 그러나 IL-1 활성은 세단편으로 검출되었다.

IL-1 활성을 갖는 주피이크는 18킬로달톤(KD)에 해당하는 위치에서 검출되었다. 18KD 폴리펩티드는 표 5에서 제 113번 아미노산에서 제 271번 아미노산에 이르는 영역에 해당하는 성인 IL-1이 될 수도 있다.

이 결과는 생성물은 대장균내에서 효소에 의해 성인 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드로 점차적으로 가공될 수도 있다.

[실시예 5]

성인 IL-1 폴리펩티드의 생성

(1) 형질전환체를 생성하는 성인 IL-1의 제작

표 5에 나타낸 제 113 내지 271번 아미노산에 해당하는 159개의 아미노산으로 구성되는 성인 IL-1 폴리펩티드를 생성하는 형질발현 플라스미드(pHLP383)을 제 7 도에 예시한 바와같이 제작하였다.

성인 IL-1을 코우드하는 cDNA를 실시예 1-(6)에 언급한 바 재결합 플라스미드 pHL4로부터 제한효소 Pst I으로 소화에 의해 분리시켰다.

cDNA를 제한효소 Alu I 으로 더 소화시켜 표 6에서 제 351번 염기로부터 아래의 DNA에 해당하는 약 533bp 크기의 DNA 단편을 얻었다. 또한, DNA 단편을 제한효소 BstN I로 소화시켜 표 5에서 제 351 내지 808번 염기에 해당하는 DNA 단편을 분리시켰다.

결과 DNA 단편을 다음의 식으로 나타낸 화학적으로 합성한 올리고 데옥시 리보뉴클레오티드 어댑터로 T4 리가제에 의해 연속적으로 결합시켰다.

5'-CGATTATGTCATCACCTTTTAG

3'-TAATACAGTAGTGGAAAATC [c]

및 5'-AGGCGTGATGA

3'-CCGCACTACTTCGA [d]

상기한 바와같이 159개의 아미노산으로 구성되는 성인 IL-1 폴리펩티드를 코우드하는 DNA 단편의 5' 말단에 개시코돈 ATG와 3' 말단에 이중 중지코돈 TGATGA를 갖는 DNA 단편을 제작하였다 이후부터 "HIL-1 단편"이라 칭한다).

trp 프로모터영역을 포함하는 약 380개의 bp DNA를 제한효소 Hpa I 및 AatII로 이중소화에 의해 플라스미드 pCT-1[Ikehara, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USa, 81, 5956(1984)]로부터 절단해내고 분리시켰다. 단편은 다음의 식으로 나타낸 화학적으로 합성한 올리고 데옥시 리보뉴클레오티드 어댑터로 T4 리가제에 의해 결합시켰다.

5'-AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAGGAGGTTAT

3'-TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTCCTCCAATAGC [e]

결과 DNA 단편을 T4 리가제에 의해 앞서 만든 HIL-1 단편과 결합시켰다(이후부터 "프로모터-HIL-1 단편"이라 지칭함).

별도로, 플라스미드 PBR를 제한효소 Ava I 및 RvuII로 소화시키고 그래서 얻어진 큰쪽의 DNA 단편(약 3.7kbp의 크기)을 0.7% 아가로오스 겔 전기영동법에 의해 분리하였다.

그의 점착단 및 무딘단을 대장균(E.coli) DNA 폴리머라제(큰단편) 및 4종의 데옥시 리보뉴클레오티드 삼인산으로 충전한 뒤 양단을 T4 리가제에 의해 결합하여 새로운 플라스미드 PBRS6으로 명명를 만들었다.

플라스미드 PBRS6을 제한효소 AatII 및 HindIII으로 절단하여 두 단편이 되게한 뒤 큰쪽의 DNA 단편(약 3.6kbp)을 분리해냈다. 그다음, 이 단편을 T4 리가제에 의해 앞서 만든 프로모터-HIL-1 단편과 결합하여 형질발현 플라스미드 pHLP383을 만들었다.

얻어진 형질발현 플라스미드 pHLP383을 실시예 4-(1)에 기재한 방법으로 대장균 HB101속에 도입하였다.

서인 IL-1 생성용 형질전환체를 HB101/pHLP383로 명명하였다.

(2) 성인 IL-1 폴리펩티드의 생성

형질전환체(HB101/pHLP383)를 LB 브로스중에서 하룻밤 배양했다. 배양물 10밀리리터를 1리터의 수정 시킨 M9 배지속에 투입하여 37℃에서 1시간동안 배양했다.

다음에 3-인돌 아크릴산을 최종 농도가 20μg/ml가 되게 가하고 다시 배양을 24시간동안 더 계속했다.

다음의 세포를 원심분리하여 수집했다. 세포를 0.1% 라이소자임 및 30mM NaCl을 함유하는 50mM 트리스-HCl(pH 8.0) 완충액 100ml중에 현탁시켜 0℃에서 30분간 방치했다. 그런다음 그 현탁액을 드라이아이스/에탄올 욕중에서 동결시키고 37℃에서 해동시켰다.

이 동결·해동조작을 6회 반복한 뒤 10% 폴리에틸렌이민 용액 2ml을 세포 현탁액에 가하고 방치시켰다. 세포잔재는 원심분리로 제거하여 청정한 추출물을 얻었다.

추출물을 같은 부피의 포화 황산 암모늄용액과 섞었다. 방치후 원심분리로 침전물을 수집회수했다. 침전물을 20mM 트리스-HCl(pH 8.0) 완충액 약 100ml속에 녹이고 동 완충액에 대하여 투석시켰다. 투석물을 미리 같은 완충액으로 평형화시킨 DEAE-세파로오 CL-6B 컬럼에 도입했다.

컬럼은 같은 완충액으로 씻은뒤 0에서 0.5M까지의 선형농도구배의 NaCl액들로 용리했다.

IL-1 활성을 가진 부분(분획)을 수집하여 합했다. 그런 뒤 한외 여과로 농축하고 세파크릴 S-200 컬럼을 사용하여 겔여과 시켰다.

IL-1 활성을 가진 부분을 수집하여 합하였다. 상기한 DEAE-세파로오스 CL-6B 컬럼 크로마토그래피와 세파크릴 S-200 겔 여과의 과정을 반복함으로써 순수한 정제물을 얻었다.

최종적으로 1리터 배양물에서 얻은 세포추출물로부터 약 15mg의 순수한 인간 IL-1 폴리펩티드를 얻었다.

정제물의 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석에 의해서는 IL-1 활성을 가진 단일 단백질만이 검출되었고 다른 불순물은 검출되지 않았다.

정제된 성인 IL-1 폴리펩티드의 화학적 및 물리화학적 성질은 앞의 표(a)에 표시되어 있다.

정제된 인간 IL-1 폴리펩티드 용액(약 40μg/ml)의 IL-1 활성을 구했으니 그 결과를 다음표에 수록했다.

[표 d]

IL-1 활성

정재된 성인 IL-1 폴리펩티드는 인산염 완충-염수에 약 1% 용해하였다.

(3) 성인 IL-1 폴리펩티드의 항종양효과

위에서 얻어진 정제된 성인 IL-1 폴리펩티드를 새앙쥐에게 이식한 B-16 혹종과 Meth A 육종에 대한 항종양 효과를 조사하였다.

B-16 혹종을 갖고있는 새앙쥐에 대한 항종양효과는 다음 방법으로 평가하였다.

C57BL/6 새앙쥐 암컷(6주)에게 0.1ml의 20% 수질을 피부내에 이식하였다. 종양을 이식한지 제 7일째에 실시예 5-(2)에서 얻은 성인 IL-1 폴리펩티드를 종양질에, 근육내에 또는 정맥내에 투여하였다. 사용된 성인 IL-1 폴리펩티드 제제의 내독소함량은 단백질 1mg당 0.08ng이하이었다.

결과적으로 이식된 B-16 혹종의 성장은 종양질내에 3마이크로 gr/쥐 일의 용량으로 7일간 연속적 투여에 의하여 상당히 퇴화하여서, 성장 저지율이 79%에 이름을 나타내었다.

또한 그의 용량을 10배까지 상승시킴으로써 이식된 B-16 혹종은 7마리의 쥐중 6마리에서 완전히 퇴화하였다.

30마이크로 gr/쥐/일의 용량으로 7일간 정맥내와 근육내에 주사한 경우, 종양을 이식한지 제 7일째로부터 이식된 B-16 혹종의 성장은 각각 45%와 68%의 저지율로 상당히 억제되었다.

Meth A 육종을 갖고있는 새앙쥐에 대한 항종양 효과는 다음과 같은 방법으로 평가하였다.

BALB/C 새앙쥐 암컷(8주생)에게 2×10⁵Meth A 육종 세포를 피내(皮內)이식하였다. 종양을 이식한지 제 7일째에 인도메타신을 2mg/kg의 용량으로 미리 경구투여하였다.

30분후에 성인 IL-1 폴리펩티드를 10마이크로 gr/쥐의 용량으로 1회 근육내에 주사한 다음, IL-1 주사한지 6시간과 24시간후에 2회, 동일용량으로 경구투여 하였다.

그결과, 이식된 Meth A 육종은 성정이 상당히 저지되어, 성인 IL-1 폴리펩티드를 인도메타신으로 처리한 것과 하지않은 것의 각각 96%와 62%의 성장 저지율을 나타내었다. 완전퇴화율은 각각 3/7과 2/7이었다.

(4) 성인 IL-1 폴리펩티드의 항감염효과.

체중 약 20g인 std-ddy 새앙쥐 수컷을 쥐 1마리당 1.5×10Klibsiella Pneumoniae P-5709 세포를 복강내에 감염시켰다.

성인 IL-1 폴리펩티드를 표(e)에 기재된 것과 같이 감염전 지정된 날에 지지된 용량으로 1일 1회 근육내(im)에 주사하였다.

사망률은 주사한지 14일후에 평가하였다.

성인 IL-1 폴리펩티드는 다음표에 나타내는 바와 같이 감염에 대하여 예방 및 치료효과를 나타내었다.

[표 e]

실험감염에 대한 예방 및 치료효과

비고 : -3d, -1d, Oh 및 24h는 각각 감염전 3일, 감염전 1일, 감염직후, 감염 24시간 후를 의미한다.

[실시예 6]

인간 IL-1(157) 폴리펩티드의 수정된 폴리펩티드의 제조.

(1) 인간 IL-1(157) 폴리펩티드 생성형질 전환체의 구성

표 5에 기재된 제 115 내지 271번 아미노산에 해당하는 157개의 아미노산으로 구성되는 인간 IL-1 폴리펩티드를 생성하는 형질발현 플라스미드(pHLP 384)는 IL-1(157) 폴리펩티드로서 나타내었으며, 이것은 합성 어댑터[c] 대신에 다음에 나타내는 화학합성의 올리고 데옥시리보뉴클레오티드 어댑터를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 5-(1)에서 기술한 것과 기본적으로 동일한 방법에 따라 구성시켰다.

5'-CGATTATGCCTTTTAG

3'-TAATACGGAAAATC [f]

결과된 형질발현 플라스미드 pHLP 384를 실시예 4-(1)에 기술된 방법에 의해 대장균 HB101에 도입시켰다.

인간 IL-1(157)폴리펩티드 생성용 형질전환체는 HB 101/pHLP 384로 명명하였다.

(2) 인간 IL-1(157) 폴리펩티드

형질전환체(HB 101/pHLP 384)를 LB 브로스 내에서 하룻밤 배양시켰다. 배양액 10밀리리터를 수정된 M9 배지 1리터에 접종시키고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다음에, 3-인돌아크릴산을 가하여 최종농도 20마이크로그램/ml로하고 배양을 24시간 동안 더 계속하였다.

다음에, 세포를 원심분리에 의해 수집하였다. 세포를 0.1% 라이소자임과 30mM NaCl을 포함하는 50mM 트리스-HCl(pH 8.0) 완충액 100ml에 부유시키고 0℃에서 30분간 방치시켰다.

다음에, 현탁액을 드라이아이스/에탄올욕에서 동결시키고 37℃에서 해동시켰다. 이 동결-해동과정을 6의 반복하고 10% 폴리에틸렌이민 용액 2ml를 세포현탁액에 가하고 방치해두었다.

세포잔해를 원심분리에 의해 제저하여 정화된 추출물을 얻었다.

추출물을 같은 부피의 포화 황산암모늄용액과 혼합하였다. 방치후, 침전을 원심분리에 의해 수집하였다. 침전을 20mM 트리스-HCl(pH 8.0)완충액 약 100ml에 용해시키고 같은 완충액에 대해 투석하였다.

투석물을 같은 완충액으로 미리 평형화시킨 DEAE 세파로오스 CL-6H 컬럼에 적응시켰다. 컬럼을 같은 완충액으로 세척하고 NaCl의 선형 구비 0내지 0.5M로 용출하였다.

IL-1 활성을 갖는 분율을 수집하고 합하였다.

다음에, 한외여과에 의해 농축시키고 세파크릴 S-200 컬럼을 사용함으로써 겔여과를 행하였다.

IL-1 활성을 갖는 분율을 수집하고 합하였다.

결과 용액을 IL-1 활성을 나타내었는데 1×10⁴-배 시료 희석액을 측정했을 때 45,394cpm의³H-티미딘 취입을 나타내었다.

인간 IL-1(157)폴리펩티드의 화학적 및 물리화학적 특성은 앞서 표(b)에 나타낸 바와 같다.

[실시예 7]

인간 IL-1 폴리펩티드의 수정된 폴리펩티드의 생성.

(1) 인간 IL-1(149) 생성 형질전환체의 제작

표 5에 보인 제 123 내지 271번 아미노산에 해당하는 149 아미노산으로 구성되는 인간 IL-1 폴리펩티드를 생성하는 형질발현 플라스미드(pHLP 385)는 IL-1(149) 폴리펩티드로 칭하였고 제 8 도에 예시한 바와 같이 구축되었다.

실시예 5-(1)에서 얻은 재결합 플라스미드 pHLP 383은 제한효소 EcoR I 와 HindIII로 소화시켜 표 5의 No. 398 염기로부터 아래의 영역의 뉴클레오티드 배열에 해당하는 약 422bp DNA 단편을 분리하였다. 결과 DNA 단편은 다음의 식으로 나타낸 화학적으로 합성된 올리고 데옥시티보 뉴클레오티드 어댑터와 T4 리가제를 사용함으로써 결합시켰다.

5'-CGATTATGAAATACAACTTTATGAGGATCATCAAATACG

3'-TAATACTTTATGTTGAAATACTCCTAGTAGTTTATGCTTAA [g]

따로, 재결합 플라스미드 pHLP 383 제한 효소 Cla I과 HindIII로 분열시키고 trp 프로모터 영역의 일부, 암피실린 내성 유전자 및 테트라사이클린 내성유전자를 포함하는 결과된 더큰 DNA 단편을 분리 하였다.

이 DNA 단편에 미리 제조한 DNA 단편을 T4 리가제에 의해 결합시켜 149 아미노산으로 구성되는 상기 폴리펩티드를 생성하기 위한 형질발현 플라스미드 pHLP 385를 구축하였다.

결과된 형질발현 플라스미드 pHLP 385는 실시예 4-(1)에 기술된 방법에 의해 대장군 HB 101에 도입시켰다.

인간 IL-1(149)폴리펩티드 생성용 형질발현체는 HB 101/pHLP 385라 명명하였다.

(2) 인간 IL-1(149) 폴리펩티드의 생성

실시예6-(2)에 언급한 방법에 따라 형질전환체(HB 101/pHLP 385)를 배양시킨 다음 원하는 폴리펩티드를 세포추출물로부터 분리시켰다.

얻어진 폴리펩티드는 1×10⁴-배 시료 희석액을 측정했을 때 27,766cpm의³H-티미딘 취입을 나타내는 IL-1 활성을 가졌다.

화학적 및 물리화학적 특성은 앞서 표(b)에 나타낸 바와 같다.

[실시예 8]

인간 IL-1 폴리펩티드의 수정된 폴리펩티드의 생성

(1) 인간 IL-1(144)생성 형질전환체의 제작.

표 5에 나타낸 제 127 또는 128 내지 271번 아미노산에 해당하는 아미노산으로 구성되는 인간 IL-1 폴리펩티드를 생성하는 형질 발현 플라스미드(pHLP 386)는 IL-1(144)폴리펩티드로 칭하였고 실시예 7-(1)에 언급한 방법에 따라 구축하되, 합성 어댑터(g)의 대신에 아래에 나타낸 화학적으로 합성된 올리고데옥시 리보뉴클레오티드 어댑터를 사용하였다.

5'-CGATTATGAGGATCATCAAATACG

3'-TAATACTCCTAGTAGTTTATGCTTAA [h]

결과된 형질발현 플리스미드 pHLP 386을 실시예 4-(1)에 기술된 방법에 의해 대장균 HB 101에 도입시켰다.

인간 IL-1(144) 폴리펩티드의 생성을 위한 형질전환체를 HB 101/pHLP 386으로 명명하였다.

(2) 인간 IL-1(144)폴리펩티드의 생성

실시예 6-(2)에 언급한 방법에 따라 형질전환체(HB 101/pHLP 386)을 배양한다음, 원하는 폴리펩티드를 세포 추출물로부터 분리시켰다.

얻어진 폴리펩티드는 1×10³배 시료 희석액을 측정했을 때 15,092cpm의³H-티미딘 취입을 나타내는 IL-1 활성을 가졌다.

인간 IL-1 폴리펩티드의 화학적 및 생리화학적 특성은 앞서 표(b)에 나타낸 바와 같다.

[실시예 9]

인간 IL-1 폴리펩티드의 수정된 폴리펩티드의 생성

(1) 인간 IL-1(143) 폴리펩티드 생성 형질전환체의 제작

표 5에 나타낸 제 129 내지 271번 아미노산에 해당하는 143 아미노산으로 구성되는 인간 IL-1 폴리펩티드를 생성하기 위한 형질발현 폴리스미드(pHLP 387)는 IL-1(143) 폴리펩티드로 칭하였는데, 실시예 7-(1)에 언급한 방법에 따라 구축하되, 합성어댑터(g)의 대신에 아래에 나타낸 화학적으로 합성한 올리고 데옥시 리보뉴클레오티드어댑터를 사용하였다.

5'-CGATTATGATCATCAAATACG

3'-TAATAGTAGTAGTTTATGCTTAA [i]

결과된 형질발현 플라스미드 pHLP 387을 실시예 4-(1)에 기술된 방법에 의해 대장균 HB101에 도입시켰다. 인간 IL-1(143) 폴리펩티드의 생성을 위한 형질전환체를 HB101/pHLP387이라 명명하였다.

(2) 인간 IL-1(143) 폴리펩티드의 생성

실시예 6-(2)에 언급한 방법에 따라 형질전환체(HB101/pHLP387)을 배양한 다음 원하는 폴리펩티드를 세포추출물로부터 분리시켰다.

얻어진 폴리펩티드는 10-배시료 희석액을 측정했을 때 12,700cpm의³H-티미딘 취입을 나타내는 IL-1 활성을 가졌다.

[실시예 10]

인간 IL-1의 폴리펩티드의 수정된 폴리펩티드의 생성

(1) 인간 IL-1(155-C) 생성 형질전환체의 제작

표 5에 나타낸 제 113 내지 267번 아미노산에 해당하는 155 아미노산으로 구성되는 인간 IL-1 폴리펩티드를 생성하는 형질발현 플라스미드를 제 9 도에 예시한 바와 같이 제작하였다.

인간 IL-1을 코우드하는 클론화 cDNA를 실시예 1-(6)에 언급한 재결합 플라스미드 pHL4로부터 제한효소 Pst I으로 소화하여 분리시켰다. cDNA는 제한효소 Alu I으로 더 소화시켜 표 5에서 제 351번 염기로부터 아래로 DNA에 해당하는 약 533bp 크기의 DNA 단편을 얻었다. 또한 DNA 단편을 제한효소 Sau 96 I으로 소화하여 표 5의 제 351 내지 769번 염기에 해당하는 DNA단편을 분리시켰다. 결과된 DNA 단편은 다음의 식으로 나타낸 화학적으로 합성한 올리고데옥시 리보뉴클레오티드 어댑터로 T4 리가제를 사용함으로써 연속적으로 결합시켰다.

5'-CGATTATGTCATCACCTTTTAG

3'-TAATACAGTAGTGGAAAATC [c]

및

5'-GGCCACCCTCTATCACTGACTTTCAGATACTGTGATGA

3'-GTGGGAGATAGTGACTGAAAGTCTATGACACTACTTCGA [j]

상기한 바와 같이 155 아미노산으로 구성되는 인간 IL-1 폴리펩티드를 코우드 하는 DNA 단편의 5' 말단에서 개시코든 ATG를 갖고 그의 3' 말단에서 이중 중지코든 TGATGA를 갖는 DNA 단편을 구축하였다. (이후부터 "HIL-155 단편"이라 칭함)

trp 프로모터 영역을 포함하는 약 380 bp DNA 단편을 제한효소 hPA I과 AstII로 이중소화시킴으로써 플라스미드 pGT-1으로부터 절단해내고 분리시켰다. DNA 단편을 다음 일반식으로 나타낸 화학적으로 합성한 올리그 데옥시리보뉴클레오티드 어댑터로 T4 리가제에 의해 결합시켰다.

5'-AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAGGAGGTTAT

3'-TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTCCTCCAATAGG [k]

결과 DNA 단편을 T4리가제에 의해 미리 제조한 HIL-155 단편과 결합시켰다(이후부터 "프로모터-HIL-155 단편으로 칭함).

따로, 플라스미드 pBR 322를 제한효소 Ava I 과 PvuII로 소화시키고, 결과된 더 큰 DNA 분율(크기 약 3.7kbp)을 0.7% 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 그의 점착단을 대장균 DNA 폴리머라제 I 큰단편)과 4종의 데옥시리보뉴클레오티드 삼인산을 가진 무딘단에 충전시킨 후, 양단을 T4 리가제로 결합시켜 플라스미드를 구축하였다.(pBRS6로 칭함).

플라스미드 pBRS6을 제한효소 AstII와 HindIII로 두 단편으로 분열시키고 더큰 DNA단편(약 3.6kbp)을 분리하였다. 다음에, 이 단편을 형질발현 플라스미드 pHLP 373을 구축하기 위해 미리 제조한 프로모터 HIL-155 단편으로 T4 리가제에 의해 결합시켰다.

결과된 형질발현 플라스미드 pHLP373을 실시예 4-(1)에 기술된 방법에 의해 대장균 HB101에 도입시켰다.

인간 IL-1(1550) 폴리펩티드의 생성을 위한 형질발현체를 HB101/pHLP373으로 명명하였다.

(2) 인간 IL-1(155-C)폴리펩티드의 생성

형질전환체(HB101/pHLP373)를 LB 브로스에서 하룻밤 배양하였다. 배양액 10밀리리터를 수정된 M9 배지 1리터에 접종시키고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다음에, 3-인돌 아크릴산을 가하여 최종 농도 20마이크로그램/ml로 하였고, 배양을 24시간 더 계속하였다. 다음에, 세포를 원심분리에 의해 수집하엿다. 세포를 0.1% 라이소자임과 30mM NaCl을 포함하는 50mM 트리스-HCl(pH 8.0) 완충액 100ml에 부유시키고 0℃에서 30분간 방치해두었다.

또한, 드라이아이스/에탄올 욕에서 동결시키고 37℃에서 해동시키기를 6회 되풀이하였다. 그리고, 세포잔해를 원심분리로 제거하여 청정한 추출물을 제공하였다.

세포추출물은 1×10⁵-배 시료희석액을 측정하였을 때 27,109cpm의³H-티미딘 취입을 나타내는 IL-1 활성을 가졌다.

인간 IL-1(155-C)폴리펩티드의 화학적 및 물리화학적 측정을 앞서 표(C)에 나타내었다.

[실시예 11]

인간 IL-1 폴리펩티드의 수정된 폴리펩티드의 제조.

(1) 인간 IL-1(152-C) 생성 형질변환체의 구축 및 제법

표 5에 표시한 제 113번 내지 264번의 아미노산에 해당하는 152개의 아미노산으로 구성되어 있는 인간 IL-1 폴리펩티드(이것은 IL-1(152-C)폴리펩티드로 지칭함)를 합성 어댑터[j] 대신에 아래에 표시한 화학적으로 합성한 올리고 데옥시리보뉴클레오타이드 어댑터를 사용한 것을 제외하고는 실시예 10-(1)과 같은 방법에 의해서 생성하였다.

5'-GGCCACCCTCTATCACTGACTTATGATGA

3'-GTGGGAGATAGTGAGTGAATAGTAGTTCGA [l]

얻어진 재결합 플라스미드 pHLP 358 실시예 4-(1)에 기재한 방법으로 대장균 HB101속에 도입했다.

인간 IL-1(152-C)폴리펩티드를 생성하는 형질 변환체를 HB101 pHLP358로 명명했다.

실시예 6(2)에 기재한 방법에 의해 형질 변환체(HB101/pHLP358)를 배양하고 그런 뒤 세포추출물로부터 소망하는 폴리펩티드를 분리해냈다.

[실시예 12]

인간 IL-1 폴리펩티드의 수정된 폴리펩티드의 제조.

(1) 인간 IL-1(154-C)생성형질변환체의 제조.

표 5에 표시한 113번에서 266번까지의 아미노산에 대응하는 154개의 아미노산으로 구성된 인간 IL-1 폴리펩티드를 생성하는 형질발현 플라스미드(pHLP363)(IL-1(154-C) 폴리펩티드로 지칭함)를 합성 어댑터[j] 대신에 화학적 합성 올리고 데옥시리보뉴클레오타이드를 사용한 것을 제외하고는 실시예 10-(1)에 기재한 것과 같은 방법에 의해 생성했다.

5'-GGCCACCCTCTATCACTGAGTTTCAGATATGATGA

3'-GTGGGAGATAGTGAGTGAAAGTCTATAGTACTTCGA [m]

얻어진 형질 발현플라스미드 pHLP363을 실시예 4-(i)에 기재한 방법에 의해 대장균 HB101 속에 도입했다. 인간 IL-1(154-C)의 생성용 형질변환체를 HB101/pHLP363으로 명명했다.

(2) 인간 IL-1(154-C)폴리펩티드의 제조.

실시예 6-(2)에 기재된 방법에 의해 형질변환체(HB101/pHLP363)를 배양한 뒤 원하는 폴리펩티드를 세포 추출물로부터 분리해냈다.

세포용해물은³H-티미딘 취입 11,058cpm 나타내는 IL-1 활성을 가졌다.

1×10²배의 희석 시료를 분석했다. IL-1 활성을 가진 수득 폴리펩티드의 분자량은 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기 영동법에 의해 약 17,500달튼으로 추정되었다.

[실시예 13]

인간 IL-1 폴리펩티드의 수정된 폴리펩티드의 제조.

(1) 인간 IL-1(153-C) 생성 형질변환체의 생성.

표 5에 표시된 113번에서 265번까지의 아미노산에 대응하는 153개의 아미노산으로 되어있는 인간 IL-1 폴리펩티드(IL-1(153-C)폴리펩티드로 지칭함) 제조용 형질발현 플라스미드(pHLP353)를 합성 어댑터[j]대신에 하기한 화학합성 올리고데옥시리보뉴클레오타이드 어댑터를 사용한 것을 제외하고는 실시예 10-(1)에 언급한 방법에 의해서 생성하였다.

5'-GGCCACCCTCTATCACTGACTTTGAGTGATGA

3'-GTGGGAGATAGTGACTGAAAGTCACTACTTCGA [n]

얻어진 형질발현 플라스미드 pHLP353을 실시예 4-(1)에 기재한 방법에 의해 대장균 HB101속에 도입했다.

인간 IL-1(153-C) 생성용 형질변환체는 HB101/pHLP353으로 명명했다.

(2) 인간 IL-1(153-C)폴리펩티드의 제조.

실시예 6-(2)에 기재한 방법에 의해 형질변환체(HB101/pHLP353)를 배양하고 그런 뒤 소망하는 폴리펩티드를 세포추출물로부터 분리해냈다.

세포 용해액은 IL-1 활성을 가졌고³H-티미딘 취입 3,875cpm을 나타냈다.

10배 희석시료를 분석했다. IL-1활성을 가진 수득 폴리펩티드의 분자량은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 측정으로 약 17,500달톤으로 추정되었다.

[실시예 14]

인간 IL-1 폴리펩티드의 수정된 폴리펩티드의 제조.

(1) 형질 변환체를 생성하는 인간 IL-1(140-NC)의 생성.

표 5에 표시된 128번 내지 267번의 아미노산에 대응하는 140개 아미노산으로 되어 있는 인간 IL-1 폴리펩티드를 생성하기 위한 형질발현 플라스미드(pHLP376)를 만들었다.

실시예 8-(1)에서 얻은 형질발현 플라스미드 pHLP386을 제한효소 EcoR I 및 HindIII으로 소화시키고 얻어진 큰 쪽의 DNA 단편을 분리해 냈다.

별도로 실시예 10-(1)에서 얻은 형질발현 플라스미드 pHLP373을 제한효소 EcoR I 및 HindIII으로 소화하여 얻어진 작은 DNA 단편을 분리해냈다. 그런 뒤 상기 양 DNA 단편을 라가제로 결합하여 140개의 아미노산으로 되어 있는 위의 폴리펩티드(pHLP376으로 지정됨)생성용의 형질발현 플라스미드를 만들었다.

얻어진 재결합 플라스미드 pHLP376을 실시예 4-(1)에 기재한 방법에 의해 대장균 HB101내에 도입했다. 인간 IL-1(140-NC)의 생성용 형질변환체는 HB101/pHLP376으로 명명했다.

(2) 인간 IL-1(140-NC) 폴리펩티드의 제조.

형질변환체(HB101/pHLP376)를 LB브로스중에서 하룻밤 배양했다. 배양액 10ml를 1ℓ의 수정된 M9 배 지중에 접종하고 37℃에서 1시간동안 배양했다. 그런 뒤 3-인돌 아크릴산을 가해 최종 농도가 20mg/ml가 되게 하고 배양을 24시간동안 다시 계속했다. 그리고, 세포를 원심분리로 수집했다. 세포를 0.1%라이소자임과 3.0mM NaCl를 함유하는 50mM 트리스 HCl(pH 8.0) 완충액 100ml속에 현탁시키고 0℃에서 30분간 방치했다. 다시, 드라이 아이스/에탄올 욕중에서 등결시키고 37℃에서 해동시키는 것을 6회 반복하였다. 그리고 세포잔해를 원심분리로 제거하여 청정한 추출물을 얻었다.

세포 추출물은 IL-1 활성을 가졌고³H-티미딘 취입 12,493cpm을 나타냈다.

1×10²배 희석시표를 분석했다. IL-1 활성을 가진 수득 폴리펩티드의 분자함유 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 측정으로 약 16,000달톤인 것으로 추정되었다.

[실시예 15]

성숙토끼 IL-1 폴리펩티드의 제조.

성숙토끼 IL-1 제조용 형질발현 플라스미드를 제 10 도에 표시된 trp 프로모터를 사용하여 만들었다.

성숙토끼 IL-1에 대한 코우드 부분을 함유하는 클론화 cDNA 삽입체는 제한효소 Pst I로 소화시킴에 의해 실시예 2-(6)에서 얻은 재결합 플라스미드 pRL15로부터 분리해냈다. cDNA는 다시 제한효소 HincII 및 BglII로 소화시켜 DNA 단편(약 509bp의 크기)을 분리했다. 그런뒤 509bp-DNA 단편을 제한효소 Dpn I로 부분 소화시키고 성숙토끼 IL-1에 대한 코우드 부분의 거의 전부를 함유하는 얻어진 DNA를 5% 폴리아크릴아미드겔 전기영동법으로 분리해냈다.

이 DNA 단편을 T4 리가제에 의해 화학적 합성 올리고데옥시티보 뉴클레오타이드 어댑터와 결합했다.

합성 어댑터는 다음 식으로 표시된다.

5'-CGATTATG

3'-TAATAG [o]

및

5'-GATCTCATGATGA

3'-AGTACTACTTCGA [p]

얻어진 DNA 단편은 RIL-어댑터 단편이라 칭한다.

별도로, trp 프로모터 부분을 함유하는 약 380bp DNA 단편을 제한효소 Hpa I 및 AatII로 이중소화시킴에 의해 플라스미드 pCT-1에서 짤라내어 분리했다. DNA 단편을 T4 리가제에 의해 다음식으로 표시되는 화학적으로 합성된 올리고데옥시리보 뉴클레오타이드 어댑터와 결합했다.

5'-AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAGGAGGTTAT

3'-TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTCCTCCAATAGC [e]

얻어진 DNA 단편을 T4 리가제에 의해 앞서만든 RIL-1 어댑터 단편과 실시예 5-(1)에서 얻은 플라스미드 pBRS6의 AstII-HindIII k3.6bp DNA 단편과 차례로 결합하여 형질발현 플라스미드 pRLP383을 만들었다.

실시예 4-(1)에 기재한 방법에 따라 형질발현 플라스미드 pRLP383을 대장균 HB101속에 도입하고 형질전환체를 배양함으로써, 표 7에 표시된 113번에서 267번까지의 아미노산에 대응하는 155종의 아미노산으로 구성된 성숙토끼 IL-1 폴리펩티드를 얻을 수 있을 것이다.

[표 1-1]

[I-1]

[표 1-2]

[II-1]

[표 2-1]

[II-2]

[표 3-1]

[II-2]

[표 3-1]

[A-1]

[표 3-2]

[B-1]

[표 4-1]

[A-2]

[표 4-2]

[표 5a] 인간

[표 5b]

[표 6a] 인간

[표 6b]

[표 7a] 토끼

[표 7b]

[표 8-1a]

[표 8-1b]

[표 8-2a]

[표 8-2b]

Claims (3)

1. 첨부된 표 1-1에 나타난 식[I-1]로 나타낸 아미노산배열로 이루어진 인간인터로이킨 1 폴리펩티드, 그것의 대립유전자 돌연변이 폴리펩티드, 또는 상기 식[I-1]로 나타낸 아미노산배열중 N-말단에서 1 내지 16개의 아미노산잔기 및/또는 C-말단에서 1내지 7개의 아미노산잔기가 삭제되어 있는 아미노산배열로 이루어진 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 발현벡터에 삽입시켰고, 그 재조합벡터로 숙주를 형질전환시킨 후 그 형질전환체를 배양하는 것으로 이루어진 것을 특징으로 하는 인터로이킨 1활성을 가지는 폴리펩티드의 제조방법.

제 1 항에 있어서, 상기 DNA가 식[I-1]로 나타낸 아미노산배열로 이루어진 인간인터로이킨 1 폴리펩티드를 코우드화하는 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.

제 1 항에 있어서, 상기 DNA가 식[I-1]로 나타낸 아미노산배열중 N-말단에서 1내지 15개의 아미노산잔기 및/또는 C-말단에서 1내지 5개의 아미노산 잔기가 삭제되어 있는 아미노산배열로 이루어진 폴리펩티드를 코우드화하는 DNA인 것을 특징으로 하는 방법.

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