DE3750056T2

DE3750056T2 - Polypeptid-Mutanten des menschlichen TNF und für diese Mutanten codierende DNS.

Info

Publication number: DE3750056T2
Application number: DE3750056T
Authority: DE
Inventors: Ryuji Furuta; Hitoshi Kawashima; Hirotada Kotani; Katuhisa Nakata; Junichi Yamagishi
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-06-20
Filing date: 1987-06-16
Publication date: 1995-04-06
Anticipated expiration: 2007-06-17
Also published as: PH26714A; KR880000471A; US4990455A; EP0251037A2; HUT46065A; DE3750056D1; AU592196B2; DK312387A; EP0251037A3; EP0251037B1; SU1762761A3; AU7450887A; DK312387D0; HU210118B; ATE107362T1

Description

Die Erfindung betrifft neue Polypeptidmutanten des menschlichen Tumornecrosefaktors (nachstehend als TNF bezeichnet) und diese Mutanten codierende DNAs.
TNF ist eine physiologisch wirksame Substanz, die von Carswell et al 1975 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 72, 3666 (1975)] entdeckt wurde. Sie ist dadurch gekennzeichnet, daß sie eine starke cytotoxische Aktivität gegen Tumorzellen in vitro zeigt und einen transplantierten Tumor in vivo necrotisiert [L.J. Old, Cancer Res., 41, 361 (1981)].
1984 bis 1985 wurden DNAs, die TNFs von Kaninchen, Menschen und Mäusen codieren, isoliert [europäische Patentveröffentlichung Nr. 146026, europäische Patentveröffentlichung Nr. 155549, europäische Patentveröffentlichung Nr. 158286 und fransen et al, Nucleic Acids Res., 13, 4417 (1985)], und die vollständigen Primärstrukturen ihrer TNF-Polypeptide wurden erhellt.
Die Isolierung von DNAs, die TNFs codieren, insbesondere von DNA, die den menschlichen TNF codiert, erlaubte die gentechnische Produktion von menschlichem TNF in Mikroorganismen, und verschiedene Eigenschaften von menschlichem TNF wurden ausführlicher studiert. Diese Untersuchungen führten zur Bestimmung, daß menschlicher TNF eine starke cytotoxische Aktivität in vitro und eine Antitumoraktivität in vivo besitzt [D. Pennica et al, Nature, 312, 724 (1984); T. Shirai et al, Nature, 313, 803 (1985); und M. Yamada et al, J. Biotechnology, 3, 141 (1985)].
Untersuchungen zur Mutation von menschlichen TNF-Polypeptiden wurden ebenfalls durchgeführt, und mehrere Patente wurden veröffentlicht (internationale Patentpublikation PCT Nr. WO86/02381, internationale Patentpublikation PCT Nr. W086/04606, europäische Patentpublikation Nr. 168214, europäische Patentpublikation Nr. 155549, die der US-Patentanmeldung Serien Nr. 708846 entspricht, und japanische Patentpublikation Nr. 48632/1987). Die ersten drei Patente betreffen nur die Mutation des menschlichen TNF-Polypeptids aus 157 Aminosäuren oder offenbaren spezifische Mutationen. Die restlichen zwei Patente offenbaren oder betreffen die Mutation eines menschlichen TNF-Polypeptids aus 155 Aminosäuren. Die erfindungsgemäßen menschlichen TNF-Polypeptidmutanten unterscheiden sich jedoch in ihrer Aminosäuresequenz von den in diesen Patenten spezifisch offenbarten Mutanten.
Die genannten Erfinder mutierten in der Tat die Aminosäure bzw. Aminosäuren der Aminosäuresequenz des menschlichen TNF-Polypeptids aus 155 Aminosäureresten und Polypeptide als Ergebnis der Deletion der Aminosäure(n), die mit dem N-Terminus des menschlichen TNF-Polypeptids beginnen, und untersuchten die Eigenschaften der so erhaltenen menschlichen TNF-Polypeptidmutanten. Diese Arbeit führte zu der Entdeckung, daß lösliche Polypeptide nur erhalten werden können, wenn eine spezifische Aminosäure bzw. spezifische Aminosäuren an einer spezifischen Stelle bzw. spezifischen Stellen in den vorstehenden Polypeptiden mutiert wird bzw. werden. Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, eine Gruppe von löslichen, menschlichen TNF-Polypeptidmutanten bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung menschlicher TNF-Polypeptidmutanten, die löslich sind und eine TNF-Aktivität besitzen.
Es wurde auch gefunden, daß andere spezifische Mutanten in der vorstehenden Gruppe überraschenderweise eine ausgezeichnete Antitumoraktivität in vivo trotz ihrer sehr niedrigen cytotoxischen Aktivität in vitro zeigen und daß bei diesen Mutanten die Pyrogenizität, die für die Verwendung als Arzneimittel unerwünscht ist, beträchtlich verringert ist. Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung daher, menschliche TNF-Polypeptidmutanten bereitzustellen, die eine sehr niedrige cytotoxische Aktivität in vitro, aber eine ausgezeichnete Antitumoraktivität in vivo zeigen und verringerte Nebenwirkungen besitzen. Die Tatsache, daß diese Mutanten ausgezeichnete Aktivität in vivo trotz ihrer niedrigen Aktivität in vitro zeigen, zeigt an, daß die Strukturen (aktive Zentren), die für die cytotoxische Aktivität in vitro und die Antitumoraktivität in vivo wesentlich sind, was typische biologische Aktivitäten von TNF sind, nicht immer an der gleichen Stelle in dem TNF-Polypeptidmolekül vorhanden sind. Dies führt auch zu der Annahme, daß die aktiven Zentren verschiedener biologischer Aktivitäten von TNF sich voneinander unterscheiden.
Weitere Aufgaben dieser Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung hervor.
Zur Vereinfachung der Beschreibung werden die folgenden Abkürzungen in der vorliegenden Beschreibung und den Patentansprüchen verwendet.
A: Adenin
C: Cytosin
G: Guanin
T: Thymin
Ala: Alanin
Arg: Arginin
Asn: Asparagin
Asp: Asparaginsäure
Cys: Cystein
Gln: Glutamin
Glu: Glutaminsäure
Gly: Glycin
His: Kistidin
Ile: Isoleucin
Leu: Leucin
Lys: Lysin
Met: Methionin
Phe: Phenylalanin
Pro: Prolin
Ser: Serin
Thr: Threonin
Trp: Tryptophan
Tyr: Tyrosin
Val: Valin
DNA: Desoxyribonucleinsäure
cDNA: komplementäre DNA
dATP: Desoxyadenosintriphosphat
dCTP: Desoxycytidintriphosphat
dGTP: Oesoxyguanosintriphosphat
dTTP: Desoxythymidintriphosphat
kbp: Kilobasenpaare
bp: Basenpaare
SDS: Natriumdodecylsulfat
MG: Molekulargewicht
KD: Kilodalton
SD-Sequenz: Shine-Dalgarno-Sequenz
Meth A Sarcom: Methylcholanthren-induziertes Sarcom
In der vorliegenden Beschreibung ist die Basensequenz, die durch einen Einzelstrang gezeigt wird, die Basensequenz eines Sinnstranges, und das linke Ende ist ein 5'-Terminus und das rechte Ende ein 3'-Terminus. In der Aminosäuresequenz ist das linke Ende ein N-Terminus und das rechte Ende ein C-Terminus.
Die Fig. 1 zeigt die Restriktionsendonuclease-Kartierung von clonierter cDNA, die den menschlichen TNF codiert;
die Fig. 2 und 3 zeigen die Stufen der Konstruktion eines Expressionsplasmids pHNY-32 (in Beispiel 1);
die Fig. 4 zeigt die Stufen der Herstellung eines PL-DNA-Fragments zur Konstruktion eines Expressionsplasmids pHPL-115 (in Beispiel 2);
die Fig. 5 zeigt ein HPLC-Elutionsmuster der Peptidfragmente aus dem Polypeptid TNF-115L durch Spaltung mit Lysylendopeptidase (in Beispiel 2);
die Fig. 6 zeigt die Stufen der Konstruktion eines Expressionsplasmids pHTR91 (in Referenzbeispiel 1).
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I]
worin mindestens einer der folgenden Aminosäureaustausche durchgeführt ist:
31. Ala durch Thr,
32. Asn durch Ala, Cys, Asp, His, Ile, Arg, Ser, Thr, Val oder Tyr,
115. Pro durch Ser, Ala, Phe, Asn, Gly, Tyr, Val, Glu, Met, Ile, Asp, Trp, Leu oder Lys,
und
117. Tyr durch His.
Besonders bevorzugte Mutanten sind Polypeptide mit der Aminosäuresequenz von Formel [I], worin das 32. Asn durch Tyr, His, Asp oder Ser ersetzt ist, das 115. Pro durch Leu, Ser, Asp oder Gly ersetzt ist oder das 117. Tyr durch His ersetzt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch DNAs, die die vorstehenden erfindungsgemäßen Polypeptidmutanten codieren.
Die DNAs, die die neuen erfindungsgemäßen menschlichen TNF-Polypeptidmutanten codieren, können durch Herstellung einer DNA, die den menschlichen TNF oder seinen Vorläufer codiert, nach einem bekannten Verfahren, wie dem Verfahren, das in der europäischen Patentpublikation Nr. 155549 beschrieben ist, oder einem Verfahren der chemischen Synthese und anschließende Herstellung der DNAs, die die vorstehenden Mutanten codieren, durch Punktmutation der so erhaltenen DNA gemäß dem Verfahren von Wang et al. [Science, 224, 1431 (1984)] oder durch Herstellen von DNAs, die die vorstehenden Mutanten codieren, durch Teilersatz der so erhaltenen DNA unter Verwendung geeigneter Restriktionsendonucleasen oder synthetischer Oligodesoxyribonucleotidadaptoren, in den die Basensequenz an der gewünschten Stelle bzw. den gewünschten Stellen künstlich verändert ist, hergestellt werden.
Beispielsweise kann eine DNA, die eine Polypeptidmutante der Formel [I], worin die 115. Aminosäure (Pro) durch Leu ersetzt ist, codiert, nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden.
Eine DNA mit einer Basensequenz, die einen Vorläufer des menschlichen TNF codiert, wird nach dem in der europäischen Patentpublikation Nr. 155549 beschriebenen Verfahren isoliert. Die Basensequenz der DNA, die den Vorläufer des menschlichen TNF codiert, ist in der beigefügten Tabelle 8 gezeigt, und die Sequenz von der 235. Base bis zur 699. Base in dieser Basensequenz entspricht einer Basensequenz, die den menschlichen TNF codiert. Das Codon, das die 115. Aminosäure (Pro) der Aminosäuresequenz des menschlichen TNF codiert, entspricht den 577. bis 579. Basen (CCC) in Tabelle 8. Ein DNA-Fragment, daß dieses Codon enthält, wird mit einer Kombination geeigneter Restriktionsendonucleasen herausgespalten. Getrennt davon wird ein DNA-Fragment, das eine Basensequenz als Folge des Austausches des Codons (CCC) für Pro in dem vorstehenden DNA-Fragment durch das Codon (CTC) für Leu enthält, chemisch synthetisiert. Durch Ersatz des herausgespaltenen DNA-Fragments durch das synthetisierte DNA- Fragment kann eine DNA, die die vorstehende Polypeptidmutante codiert, hergestellt werden.
Genauer, ein DNA-Fragment, entsprechend den 555. bis 603. Basen in der Tabelle 8, wird unter Verwendung beispielsweise der Restriktionsendonucleasen DdeI und PvuII herausgespalten.
Andererseits werden die Oligodesoxyribonucleotidadaptoren mit den folgenden Basensequenzen chemisch synthetisiert.
und
Die so erhaltenen DNA-Adaptoren werden anstelle des herausgespaltenen DNA-Fragments entsprechend den 555. bis 603. Basen in Tabelle 8 eingesetzt.
Durch Insertieren der DNA in einen geeigneten Expressionsvektor, so daß sie eine geeignete Sequenz besitzt, Einschleusen des Vektors in einen geeigneten Wirt und Züchten des so erhaltenen Transformanten nach auf dem Fachgebiet bekannten Techniken können die erfindungsgemäßen Polypeptidmutanten des menschlichen TNF hergestellt werden. Genauer, ein Expressionsvektor zur Herstellung der erfindungsgemäßen Polypeptidmutante kann durch Herstellen eines DNA-Fragments mit einem Translationsstartcodon ATG am 5'-Terminus und einem Terminationscodon am 3'-Terminus in der DNA mit einer Basensequenz, die die erfindungsgemäße Polypeptidmutante selbst codiert, Verknüpfen des DNA-Fragments an einen geeigneten Promotor und die SD-Sequenz und anschließende Insertierung des so erhaltenen Fragments in einen Vektor hergestellt werden. Beispiele für den Promotor sind lac, trp, tac, phoS, phoA, PL und der frühe SV40-Promotor. Beispiele für den Vektor sind Plasmide (z. B. pBR322), Phagen (φ.B. λ-Phagenderivate) und Viren (z. B. SV40). Der Tranformant kann dadurch erhalten werden, daß man den so erhaltenen Expressionsvektor zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptidmutante in einen geeigneten Wirt, beispielsweise E. coli, nach dem Verfahren von Cohen et al [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, E. coli, 2110 (1972)] einschleust. Dann kann durch Züchten des Transformanten unter geeigneten Kulturbedingungen die gewünschte Polypeptidmutante oder eine, in der Met an das N-terminale Ende angefügt ist, hergestellt werden. Die gezüchteten Zellen werden beispielsweise durch Lysozymspaltung, Gefrieren-Auftauen, Aufreißen mit Ultraschall oder unter Verwendung einer French-Presse behandelt und dann zentrifugiert oder filtriert, wodurch ein Extrakt erhalten wird, der die erfindungsgemäße Polypeptidmutante enthält. Die gewünschte Polypeptidmutante kann durch Reinigen des Extrakts gemäß einem allgemeinen Verfahren zur Reinigung von Proteinen (wie Ultrafiltration, Dialyse, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Elektrophorese und Affinitätschromatographie) isoliert werden.
Die Reaktion einer organischen oder anorganischen Säure oder einer Base mit einer erfindungsgemäßen Polypeptidmutante kann dessen Salz ergeben.
Erfindungsgemäße menschliche TNF-Polypeptidmutanten werden nachstehend ausführlicher unter Bezugnahme auf die Versuchsbeispiele beschrieben.
(1) Verschiedene menschliche TNF-Polypeptidmutanten wurden durch Züchten der in den nachstehend angegebenen Beispielen und Referenzbeispielen erhaltenen Transformanten hergestellt.
Genauer, die Transformanten wurden nach dem in Beispiel 1-(2) gezeigten Verfahren gezüchtet, und die verschiedenen menschlichen TNF-Polypeptidmutanten, die in den E. coli-Zellen produziert wurden, wurden in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8), enthaltend 0,1% Lysozym und 30 mM NaCl, extrahiert.
Die Mengen der gewünschten menschlichen TNF-Polypeptidmutanten, die aus den Extrakten isoliert wurden, wurden mittels eines EIAs (Enzymimmunoassay) als die Menge des Polypeptids, die immunologisch mit einem Anti-menschlichen TNF-Antikörper reagierte, bestimmt. Das Verfahren zur Bestimmung der menschlichen TNF-Polypeptidmutante gemäß dem EIA beruht auf dem folgenden Prinzip.
Eine kompetitive Bindungsreaktion für ein Anti-menschliches TNF-Kaninchen-Antiserum wurden zwischen der menschlichen TNF-Polypeptidmutante in einer Assayprobe und menschlichem TNF, der mit p-Galactosidase markiert war, durchgeführt. Dann wurde durch Zugabe von Anti-Kaninchen- IgG-Ziege-Antiserum, das durch Bindung an eine Bakterienzellwand insolubilisiert worden war, ein Komplex aus dem enzymmarkierten menschlichen TNF/Anti-menschlichen TNF-Kaninchen-Antikörper/Anti- Kaninchen-IgG-Ziege-Antikörper gebildet. Das Reaktionsgemisch wurde zentrifugiert, um eine feste Phase zu erhalten. Die Menge des enzymmarkierten menschlichen TNFs in dem vorstehenden Komplex, die an der festen Phase isoliert wurde, wurde unter Verwendung von dessen Enzymaktivität als Index bestimmt.
Genauer, 2-Nitrophenyl-p-D-galactopyranosid wurde als ein Enzymsubstrat verwendet und die Menge des durch die Enzymreaktion gebildeten, gespaltenen Produkts (2-Nitrophenol) des Substrats wurde durch die Absorption bei einer Wellenlänge von 410 nm bestimmt. Die Menge des enzymmarkierten menschlichen TNFs in dem Komplex spiegelt die Menge der menschlichen TNF-Polypeptidmutante in der Assayprobe wider.
Die Menge der menschlichen TNF-Polypeptidmutante in der Assayprobe wurde unter Verwendung einer Standardkurve, die getrennt unter Verwendung von menschlichem TNF aufgestellt worden war, bestimmt.
Bei der Herstellung des Anti-menschlichen TNF-Kaninchen-Antiserums wurde reiner menschlicher TNF, der nach dem Verfahren von Yamada et al [J. Biotechnology, 3, 141 (1985)] hergestellt worden war, als Antigen verwendet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Wenn die Menge der gewünschten menschlichen TNF-Polypeptidmutante, die in dem Zellextrakt nachgewiesen wurde, fast der des menschlichen TNFs, der als Kontrolle verwendet wird, vergleichbar ist, wird die Löslichkeit der Polypeptidmutante als (++) ausgedrückt. Die Löslichkeit wird als (+) ausgedrückt, wenn dessen nachgewiesene Menge kleiner als die Kontrolle ist und als (-), wenn sie viel kleiner als die Kontrolle ist oder die gewünschte Polypeptidmutante nicht nachgewiesen wird.
Es wird angenommen, daß die Polypeptidmutanten mit Löslichkeiten, die als (-) ausgedrückt werden, eine Strukturveränderung erlitten haben und somit in ihrer Löslichkeit deutlich abgenommen haben oder in den E. coli-Zellen instabil waren. Tabelle 3 Löslichkeiten der menschlichen TNF-Polypeptidmutanten Polypeptidmutante Position der Mutation Löslichkeit Tabelle 3 (Fortsetzung) Löslichkeiten der menschlichen TNF-Polypeptidmutanten Polypeptidmutante Position der Mutation Löslichkeit Tabelle 3 (Fortsetzung) Löslichkeiten der menschlichen TNF-Polypeptidmutanten Polypeptidmutante Position der Mutation Löslichkeit
(2) Die Tabelle 4 zeigt die isoelektrischen Punkte und die cyotoxischen Aktivitäten von menschlichem TNF (als Kontrolle) und die verschiedenen menschlichen TNF-Polypeptidmutanten gemäß der Erfindung, die in den nachstehend angegebenen Beispielen erhalten wurden.
Die cytotoxische Aktivität wurde an Maus-LM-Zellen (ATCC, CCL 1.2) nach dem Verfahren von Yamada et al [J Biotechnology, 3, 141 (1985)] bewertet.
Die menschlichen TNF-Polypeptidmutanten, die gemäß der SDS-Polyacrylamidgelelektrophoretischen Analyse als homogen bestimmt wurden [U.K. Laemmli, Nature (London), 227, 680 (1970)] wurden bei diesem Test verwendet. Tabelle 4 Eigenschaften der menschlichen TNF-Polypeptidmutante Isoelektrischer Punkt und cytotoxische Aktivität Polypeptidmutante Isoelektrischer Punkt Cytotoxische Aktivität Menschlicher TNF
(3) Die Tabelle 5 zeigt die Antitumoraktivitäten in vivo von menschlichem TNF (als Kontrolle) und der verschiedenen menschlichen TNF- Polypeptidmutanten, die gemäß den nachstehend angegebenen Beispielen erhalten wurden. Die Antitumoraktivität wurde wie folgt bewertet:
Meth A-Sarcomzellen (2 · 105) wurden in die Bauchhaut von weiblichen BALB/c-Mäusen (8 Wochen alt) transplantiert. Sieben Tage nach der Transplantation wurde das Polypeptid einmal intravenös verabreicht. Die den Tumor necrotisierende Antwort wurde 24 h nach der Verabreichung gemäß den Bewertungsstandards von Carswell et al [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3666 (1975)] bewertet.
Wie in Tabelle 5 gezeigt, ist die Korrelation zwischen der cytotoxischen Aktivität in vitro und der Antitumoraktivität in vivo gegenüber dem transplantierten Tumor gering.
Jedoch zeigen einige menschliche TNF-Polypeptidmutanten beispielsweise die menschliche TNF-Polypeptidmutante, in der die 32. oder 115. Aminosäure vom N-Terminus ersetzt ist, eine starke Antitumoraktivität in vivo, verglichen mit ihrer cytotoxischen Aktivität in vitro und besitzen eine niedrige lethale Toxizität. Tabelle 5 Antitumorwirkung von menschlichen TNF-Polypeptidmutanten auf Meth A-Sar-come, die in Mäuse transplantiert wurden Polypeptid-Dosis Einheit/Maus Nekrotische Antwort Hemmung des Tumorwachstums Menschliches TNF Tabelle 5 (Fortsetzung) Antitumorwirkung von menschlichen TNF-Polypeptidmutanten auf Meth A-Sar-come, die in Mäuse transplantiert wurden Polypeptid-Dosis Einheit/Maus Nekrotische Antwort Hemmung des Tumorwachstums
(4) Mehrere erfindungsgemäße menschliche TNF-Polypeptidmutanten ebenso wie der menschliche TNF wurden auf die Pyrogenizität in Kaninchen getestet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
Der Pyrogenizitätstest wurde durch intravenöse Verabreichung des Polypeptids am Kaninchen und Beobachtung der Veränderung der rektalen Temperatur 4 h nach der Verabreichung durchgeführt. Die Ergebnisse sind wie folgt ausgedrückt:
(-): Anstieg der rektalen Temperatur von nicht mehr als 0,4ºC
(+): Anstieg der rektalen Temperatur von 0,5 bis 0,9ºC
(++): Anstieg der rektalen Temperatur von 1,0ºC oder mehr Tabelle 6 Pyrogenizität von menschlichen TNF-Polypeptidmutanten im Kaninchen Polypeptid Dosis Pyrogenzität menschlicher TNF
(5) Die Wirkung der Polypeptidmutante (TNF-115L) auf den Blutdruck wurde durch Verabreichen in die Schwanzvene von männlichen SHR/NCrj- Ratten (Körpergewicht 264 bis 304 g; Nippon Charles River Co., Ltd.) und Bestimmen des systolischen Blutdrucks der Ratten ohne Anaesthesie mittels einer Vorrichtung zur Messung des arteriellen Drucks für Ratten (Modell KN-209, hergestellt von Natsume Seisakusho) bestimmt. Als Kontrolle wurde auch ein menschlicher TNF verabreicht.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 7 gezeigt. Tabelle 7 Wirkung von TNF-115L auf den Blutdruck in Ratten Polypeptid Veränderungen im Blutdruck Mittelwert h nach Verabreichung Dosierung vorher menschliches TNF
Zur Formulierung der erfindungsgemäßen menschlichen TNF-Polypeptidmutanten können sie in Form einer Lösung oder eines lyophilisierten Produkts vorliegen. Hinsichtlich der Langzeitstabilität liegen sie zweckmäßigerweise in Form von lyophilisierten Produkten vor. Es ist bevorzugt, Träger oder Stabilisatoren den Präparaten zuzusetzen. Beispiele für die Stabilisatoren umfassen Albumin, Globulin, Gelatine, Protamin, Protaminsalze, Glukose, Galactose, Xylose, Mannit, Glucuronsäure, Trehalose, Dextran, Hydroxyethylstärke und nicht-Ionische, grenzflächenaktive Mittel (wie Polyoxyethylen-fettsäureester, Polyoxyethylen-alkylether, Polyoxyethylen-alkylphenylether, Polyoxyethylensorbitan-fettsäureester, Polyoxyethylenglycerin-fettsäureester, Polyoxyethylen-gehärtetes Rhizinusöl, Polyoxyethylen-rhinzinusöl, Polyoxyethylen-polyoxypropylenalkylether, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockcopolymere, Sorbitanfettsäureester, Saccharosefettsäureester und Glycerinfettsäureester).
Die Reihe von erfindungsgemäßen menschlichen TNF-Polypeptidmutanten sind besonders als Antitumormittel, wie vorstehend gezeigt, nützlich.
Solche Polypeptidpräparate werden bevorzugt parenteral oder topisch verabreicht. Parenterale Wege, wie intravenöse oder intramuskuläre Wege, werden verwendet, wenn die Tumorzellen sich über einen weiten Bereich erstrecken oder Metastasen bilden oder wenn die Verhütung der Metastasenbildung beabsichtigt ist. Gegen lokale Tumorgewebe ist die direkte intratumorale Verabreichung bevorzugt. Die Dosis variiert je nach dem Typ der menschlichen TNF-Polypeptidmutanten und dem Typ und der Größe der Tumore, dem Zustand des Patienten und dem Verabreichungsweg. Beispielsweise beträgt sie im Fall von TNF-115L 1 · 103 bis 1 · 108 Einheiten (LM)/kg, bevorzugt 1 · 104 bis 1 · 107 Einheiten (LM)/kg.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher. Es ist jedoch zu verstehen, daß andere erfindungsgemäße menschliche TNF-Polypeptidmutanten auch nach ähnlichen Verfahren hergestellt werden können, und die Erfindung ist in keiner Weise auf diese Beispiele beschränkt.

Beispiel 1

Herstellung der menschlichen TNF-Polypeptidmutante TNF-32Y

(1) Konstruktion eines Expressionsplasmids

Ein Expressionsplasmid (pHNY-32) zur Herstellung eines Polypeptids, bestehend aus 155 Aminosäuren entsprechend der Sequenz von Aminosäure Nr. 1 bis Nr. 155 in der beigefügten Tabelle 9, welches als TNF-32Y bezeichnet wurde, wurde, wie in den Fig. 2 und 3 näher erläutert, konstruiert.
Eine clonierte cDNA, die den menschlichen TNF codiert, wurde durch Spalten mit der Restriktionsendonuclease PstI aus dem rekombinanten Plasmid pHTNF13, hergestellt gemäß dem in der europäischen Patentpublikation Nr. 155549 beschriebenen Verfahren, isoliert.
Die clonierte cDNA wurde weiter mit den Restriktionsendonucleasen AvaI und HindIII gespalten, um ein DNA-Fragment zu isolieren, das den Hauptteil der codierenden Region für das menschliche TNF-Polypeptid enthält. Das isolierte DNA-Fragment wird als TNF-DNA-Fragment bezeichnet.
Das TNF-DNA-Fragment besitzt etwa eine Länge von 600 bp und enthält die Basensequenz entsprechend der stromabwärtigen Region von Base Nr. 250 in Tabelle 8. Dessen volle Basensequenz wurde von Yamada et al [J. Biotechnology, 3, 141 (1985)] beschrieben.
Das TNF-DNA-Fragment wurde weiter mit den Restriktionsendonucleasen HpaII und BglI gespalten, wodurch es in drei DNA-Fragmente gespalten wurde, und diese wurden isoliert. Diese DNA-Fragmente besaßen die Sequenzen entsprechend der Region von Base Nr. 250 bis Nr. 321, die Region von Base Nr. 322 bis 337 bzw. die stromabwärtige Region von Base Nr. 338 in Tabelle 8. Diese DNA-Fragmente wurden als DNA-1-Fragment, DNA-2-Fragment bzw. DNA-3-Fragment bezeichnet.
Dann wurden die DNA-1- und DNA-3-Fragmente unter Verwendung der T4- DNA-Ligase mit dem folgenden chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleotidadaptor [a] kombiniert.
Das ligierte DNA-Fragment wird dann als NY-DNA-Fragment bezeichnet. Das NY-DNA-Fragment wurde stufenweise mit den folgenden zwei chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleotidadaptoren [b] und [c] ligiert.
und
Das so erhaltene DNA-Fragment wird als peptid-codierendes DNA-Fragment bezeichnet.
Ein DNA-Fragment (mit einer Größe von etwa 380 bp), das die trp- Promotorregion enthält, wurde aus einem Plasmid pCT-1 [M. Ikehara et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 8, 5956 (1984)] durch doppelte Spaltung mit den Restriktionsendonucleasen HpaaI und AatII isoliert. Die Basensequenz der trp-Promotorregion des 380 bp langen DNA-fragments wurde von Bennett et al [J. Mol. Biol., 121, 113 (1978)] beschrieben. Das 380 bp lange DNA-Fragment wurde mit dem vorstehend hergestellten, das Peptid codierende DNA-Fragment ligiert. Das ligierte DNA-Fragment wurde als Promotorpeptid-codierendes DNA-Fragment bezeichnet.
Getrennt davon wurde ein Plasmid pBR322 mit den Restriktionsendonucleasen AvaI und PvuII gespalten, und das so erhaltene größere DNA- Fragment (mit einer Größe von etwa 3,7 kbp) wurde durch eine 0,7%ige Agarosegelelektrophorese isoliert. Nach Auffüllen von dessen kohäsiven Enden zu glatten Enden mit der E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und vier Arten von Desoxyribonucleotidtriphosphaten (dGTP, dATP, dTTP und dCTP) wurden beide Enden mit der T4 DNA-Ligase ligiert, wodurch ein neues Plasmid konstruiert wurde, das als pBRS6 bezeichnet wurde.
Das Plasmid pBRS6 wurde mit den Restriktionsendonucleasen AatII und HindIII in zwei DNA-Fragmente gespalten. Das größere DNA-Fragment (mit einer Größe von etwa 3,6 kbp) wurde isoliert und durch die T4 DNA-Ligase mit dem vorstehend hergestellten Promotorpeptid-codierenden DNA-Fragment ligiert, wodurch ein Expressionsplasmid pHNY-32 konstruiert wurde.

(2) Herstellung von TNF-32Y

Das Expressionsplasmid pHNY-32 wurde in E. coli-HB101 nach dem herkömmlichen Verfahren [S.N. Cohen et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)] eingeschleust.
Die Transformante (HB101/pHNY-32) wurde bei 37ºC über Nacht in LB- Brühe [Zusammensetzung: 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% NaCl, pH 7,5] gezüchtet. Die Kultur wurde in 10 Volumina modifiziertes M9-Medium [Zusammensetzung: 1,5% Na&sub2;HPO&sub4;·12H&sub2;O, 0,3% KH&sub2;PO&sub4;, 0,05% NaCl, 0,1% NH&sub4;Cl, 2 mg/l Vitamin B1, 0,45% Casaminosäure, 1 mM MgSO&sub4;, 0,1 mM CaCl&sub2; und 0,4% Glycerin], enthaltend Ampicillin in einer Konzentration von 25 ug/ml bei 37ºC 1 h lang inokuliert.
Dann wurde 3-Indolacrylsäure zugesetzt, wodurch eine Endkonzentration von 20 kg/ml erhalten wurde. Nachdem die Züchtung für weitere 24 h fortgesetzt wurde, wurden die Zellen durch Zentrifugation gewonnen. Die Zellen wurden in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8), enthaltend 0,1% Lysozym und 30 mM NaCl, suspendiert und in einem Eisbad 30 min lang stehengelassen. Nach wiederholter Behandlung der Zellsuspension durch Gefrieren in einem Trockeneis/Ethanolbad und Auftauen bei 37ºC wurde der Zellextrakt durch Zentrifugation gewonnen.
Der Zellextrakt wurde gegen 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,8) dialysiert, und das Dialysat wurde zentrifugiert, wodurch ein geklärter Überstand erhalten wurde. Der Überstand wurde auf eine DEAE-Sepharose-CL-6B- Säule (Pharmacia), die zuvor mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,8) äquilibriert worden war, aufgebracht. Nach Waschen der Säule mit dem gleichen Puffer, um die nicht-adsorbierten Komponenten zu entfernen, wurde das gewünschte Polypeptid (TNF-32Y) in einem linearen NaCl-Gradienten mit einer Konzentration von Null bis 0,3 M in dem gleichen Puffer eluiert. Jede Fraktion wurde der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterworfen, und die Fraktionen, die das Polypeptid mit einem Molekulargewicht von etwa 17 Kilodalton enthielten, wurden gewonnen und vereinigt.
Die vereinigte Fraktion wurde gegen 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,8) dialysiert, und dann wurde sie erneut einer DEAE-Sepharose-CL-6B-Säulenchromatographie, wie vorstehend beschrieben, unterworfen, wobei jedoch die Elution unter den Elutionsbedingungen eines geringeren NaCl-Gradienten durchgeführt wurde.
Die Fraktionen, die das gewünschte Polypeptid enthielten, wurden gewonnen, vereinigt und durch Ultrafiltration mit einem Diaflo unter Verwendung einer YM10-Membran (Amicon) konzentriert.
Schließlich wurde das Konzentrat einer Gelfiltration auf einer Säule aus Bio-Gel-P-6 (Biol-Rad) unter Verwendung einer 5 mM phosphatgepufferten Kochsalzlösung als Elutionsmittel unterworfen, wodurch der gereinigte TNF-32Y erhalten wurde.
Die N-terminale Aminosäuresequenz des gereinigten TNF-32Y wurde durch den automatisierten Edman-Abbau an einem Proteinsequenator (Applied Biosystems, Modell 470A) analysiert.
Als Ergebnis war die N-terminale Aminosäure von TNF-32Y ein Serinrest. D.h., der Methioninrest als Folge des Translationsstartcodons (ATG) war von dem gereinigten Produkt entfernt worden.

Beispiel 2

Herstellung der menschlichen TNF-Polypeptidmutante TNF-115L

(1) Konstruktion eines Expressionsplasmids

Ein Expressionsplasmid (pHPL-115) zur Herstellung eines Polypeptids aus 155 Aminosäuren entsprechend der Sequenz von Aminosäure Nr. 1 bis Nr. 155 in der beigefügten Tabelle 10, welche als TNF-115L bezeichnet wird, wurde, wie in Fig. 4 erläutert, konstruiert.
Das TNF-DNA-Fragment, das, wie in Beispiel 1-(1) beschrieben, hergestellt wurde, wurde mit den Restriktionsendonucleasen PvuII und TagI gespalten, wodurch es in vier DNA-Fragmente gespalten wurde, und diese wurden isoliert. Diese DNA-Fragmente besaßen Sequenzen entsprechend den Regionen von Base Nr. 250 bis 369, der Region von Base Nr. 370 bis 603, der Region von Base Nr. 604 bis Nr. 653 bzw. der stromabwärtigen Region von Base Nr. 654 in Tabelle 8.
Diese DNA-Fragmente wurden als DNA-4-Fragment, DNA-5-Fragment, DNA- 6-Fragment bzw. DNA-7-Fragment bezeichnet. Das DNA-5-Fragment wurde weiter mit der Restriktionsendonuclease DdeI gespalten, um ein DNA-Fragment entsprechend der Sequenz von Base Nr. 370 bis Nr. 554 in Tabelle 8 (bezeichnet als DNA-8-Fragment) zu isolieren.
Das DNA-8-Fragment wurde-mit dem DNA-4-Fragment vereinigt und dann mit den folgenden zwei chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleotidadaptoren [d] und [e] ligiert.
und
An das ligierte DNA-Fragment wurden das DNA-6-Fragment und das DNA- 7-Fragment weiter unter Verwendung der T4-DNA-Ligase ligiert. Das so erhaltene DNA-Fragment wird als PL-DNA-Fragment bezeichnet.
Das Expressionsplasmid pHPL-115 wurde nach dem in Beispiel 1-(1) erwähnten Verfahren, ausgenommen, daß das PL-DNA-Fragment anstelle des NY-DNA-Fragments verwendet wurde, konstruiert.

(2) Herstellung von TNF-115L

Nach dem in Beispiel 1-(2) erwähnten Verfahren wurde die Transformante (HB101/pHPL-115) hergestellt und gezüchtet. Das gewünschte Polypeptid wurde isoliert und aus dem Zellextrakt nach im wesentlichen den gleichen Verfahren, wie in Beispiel 1-(2) erwähnt, gereinigt.

(3) Bestimmung der Aminosäuresequenz

Die Aminosäuresequenzen des gereinigten TNF-115L und seines Peptidfragments wurden durch den automatischen Edman-Abbau an einem Proteinsequenator analysiert.
Das Peptidfragment wurde unter den folgenden Bedingungen hergestellt. 500 ug von gereinigtem TNF-115L wurden mit 10 ug Lysylendopeptidase (EC 3.4.21.50: Wako Pure Chemical Ind.) in 5 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8), enthaltend 4 M Harnstoff in einem Gesamtvolumen von 0,1 ml, inkubiert. Nach der Inkubation bei 35ºC für 15 h wurden die so erhaltenen gespaltenen Peptide durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer SynChropak RP-P300-Säule (250 · 4,6 mm; SynChrom Inc.) unter den Bedingungen einer Elution mit einem linearen Gradienten von 10 bis 50% Acetonitril, enthaltend 0,07% Trifluoressigsäure, in 0,1% Trifluoressigsäure mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min für 60 min isoliert. Das Elutionsmuster ist in Fig. 5 gezeigt. Die Peptidfragmente wurden auf jeder der Fraktionen Nr. 1 bis Nr. 7 in Fig. 5 isoliert und der Aminosäuresequenzanalyse durch den automatischen Edman-Abbau unterworfen.
Die Aminosäureteilsequenz des Peptidfragments Nr. 6 wurde zu Pro-X- Tyr-Glu-Leu-Ile-Tyr-Leu-Gly-Gly-Val-Phe-Gln-Leu-Glu bestimmt. Das Zeichen "X" zeigt eine Aminosäure, die durch diese Analyse nicht bestimmt werden konnte.
Die wie vorstehend bestimmte Aminosäuresequenz entsprach vollständig der Sequenz von der Aminosäure Nr. 111 bis Nr. 125 in der Tabelle 10.
Es wurde bestätigt, daß die Aminosäure an der 115. Position vom N- Terminus von TNF-115L ein Leucinrest war.
Die N-terminale Aminosäure des gereinigten TNF-115L war ein Serinrest, was anzeigt, daß ein Methioninrest als Folge des Translationsstartcodons (ATG) entfernt wurde.

Beispiel 3

Herstellung von anderen menschlichen TNF-Polypeptidmutanten-1

(1) Konstruktion der Expressionsplasmide

Ein Expressionsplasmid zur Produktion eines Polypeptids, bestehend aus 155 Aminosäuren und mit einer Aminosäuresequenz entsprechend der Sequenz von der Aminosäure Nr. 1 bis Nr. 155 in der Tabelle 1, worin ein Asparaginrest in der 32. Position vom N-Terminus durch eine andere Aminosäure, beispielsweise His, Asp und Ser, ersetzt war, wurde nach dem in Beispiel 1-(1) erwähnten Verfahren konstruiert, ausgenommen, daß einer der nachstehend gezeigten, chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleotidadaptoren anstelle des synthetischen Adaptors [a] verwendet wurde:
(für den Austausch durch His),
(für den Austausch durch Asp),
(für den Austausch durch Ser).

(2) Herstellung der menschlichen TNF-Polypeptidmutante

Jedes der in Abschnitt (1) erhaltenen Expressionsplasmide wurde in E. coli HB101 nach dem herkömmlichen Verfahren eingeschleust, und der Transformant wurde nach dem in Beispiel 1-(2) beschriebenen Verfahren gezüchtet.
Das gewünschte Polypeptid wurde aus dem Zellextrakt im wesentlichen nach dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 1-(2) erwähnt, gereinigt.
Es wurden die folgenden menschlichen TNF-Polypeptidmutanten erhalten.
TNF-32H: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 32. Asn durch His ersetzt ist.
TNF-32D: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 32. Asn durch Asp ersetzt ist.
TNF-32S: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 32. Asn durch Ser ersetzt ist.

Beispiel 4

Herstellung von anderen menschlichen TNF-Polypeptidmutanten-2

(1) Konstruktion der Expressionsplasmide

Ein Expressionsplasmid zur Herstellung eines Polypeptids aus 155 Aminosäuren und mit einer Aminosäuresequenz entsprechend der Sequenz von Aminosäure Nr. 1 bis Nr. 155 in Tabelle 1, worin ein Prolinrest in der 115. Position vom N-Terminus durch eine andere Aminosäure, beispielsweise Ser, Asp und Gly ersetzt ist, wurde nach dem in Beispiel 2-(1) Verfahren konstruiert, ausgenommen, daß einer der nachstehend gezeigten, chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleotidadaptoren anstelle des synthetischen Adaptors [d] verwendet wurde:
(für den Austausch durch Ser),
(für den Austausch durch Asp),
(für den Austausch durch Gly).

(2) Herstellung von menschlichen TNF-Polypeptidmutanten

Jedes der in Abschnitt (1) erhaltenen Expressionsplasmide wurde in E. coli HB101 nach dem herkömmlichen Verfahren eingeschleust, und der Transformant wurde nach dem in Beispiel 1-(2) beschriebenen Verfahren gezüchtet.
Das gewünschte Polypeptid wurde isoliert und aus dem Zellextrakt durch im wesentlichen das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 1-(2) beschrieben, gereinigt.
Es wurden die folgenden menschlichen TNF-Polypeptidmutanten erhalten.
TNF-115S: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 115. Pro durch Ser ersetzt ist.
TNF-115D: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 115. Pro durch Asp ersetzt ist.
TNF-115G: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 115. Pro durch Gly ersetzt ist.

Beispiel 5

Herstellung der menschlichen TNF-Polypeptidmutante TNF-117H mit der Bezeichnung TNF-117H

(1) Konstruktion der Expressionsplasmide

Ein Expressionsplasmid zur Herstellung eines Polypeptids aus 155 Aminosäuren und mit einer Aminosäuresequenz entsprechend der Sequenz von Aminosäure Nr. 1 bis Nr. 155 in Tabelle 1, worin ein Tyrosinrest in der 117. Position vom N-Terminus durch eine andere Aminosäure, beispielsweise His, ersetzt war, wurde nach dem in Beispiel 2-(1) erwähnten Verfahren konstruiert, ausgenommen, daß der nachstehend gezeigte, chemisch synthetisierte Oligodesoxyribonucleotidadaptor anstelle des synthetischen Adaptors [e] verwendet wurde:

(2) Herstellung von TNF-117H

Das in Abschnitt (1) erhaltene Expressionsplasmid wurde in E. coli HB101 nach dem herkömmlichen Verfahren eingeschleust, und der Transformant wurde nach dem in Beispiel 1-(2) beschriebenen Verfahren gezüchtet.
Das gewünschte Polypeptid wurde isoliert und aus dem Zellextrakt nach im wesentlichen dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 1-(2) erwähnt, gereinigt.

Beispiel 6

Herstellung von anderen menschlichen TNF-Polypeptidmutanten-3

Gemäß Beispiel 1 wurden Expressionsplasmide zur Herstellung der folgenden Polypeptide konstruiert. Escherichia coli wurde mit den Expressionsplasmiden transformiert. Die Transformanten wurden gezüchtet, und die Polypeptide wurden isoliert und gereinigt.
TNF-31T: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 31. Ala durch Thr ersetzt ist.
TNF-32G: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 32. Asn durch Gly ersetzt ist.

Beispiel 7

Herstellung von anderen menschlichen TNF-Polypeptidmutanten-4

Gemäß Beispiel 1 wurden die Expressionsplasmide zur Herstellung der folgenden Polypeptide konstruiert. Escherichia coli wurde mit den Expressionsplasmiden transformiert. Die Transformanten wurden gezüchtet, wodurch die Polypeptide produziert wurden.
TNF-32A: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 32. Asn durch Ala ersetzt ist.
TNF-32C: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 32. Asn durch Cys ersetzt ist.
TNF-321: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 32. Asn durch Ile ersetzt ist.
TNF-32R: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 32. Asn durch Arg ersetzt ist.
TNF-32T: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 32. Asn durch Thr ersetzt ist.
TNF-32V: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 32. Asn durch Val ersetzt ist.
TNF-115A: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 115. Pro durch Ala ersetzt ist.
TNF-115F: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 115. Pro durch Phe ersetzt ist.
TNF-115N: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 115. Pro durch Asn ersetzt ist.
TNF-115Y: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 115. Pro durch Tyr ersetzt ist.
TNF-115V: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 115. Pro durch Val ersetzt ist.
TNF-115E: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 115. Pro durch Glu ersetzt ist.
TNF-115M: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 115. Pro durch Met ersetzt ist.
TNF-115I: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 115. Pro durch Ile ersetzt ist.
TNF-115K: Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I], worin das 115. Pro durch Lys ersetzt ist.

Referenzbeispiel 1

Konstruktion eines Expressionsplasmids zur Herstellung von menschlichem TNF

Die clonierte cDNA, die den menschlichen TNF codiert, wurde durch Spalten mit der Restriktionsendonuclease PstI aus dem gemäß dem in der europäischen Patentpublikation Nr. 155549 beschriebenen Verfahren hergestellten rekombinanten Plasmid pHTNF13 isliert.
Die clonierte cDNA wurde mit der Restriktionsendonuclease EcoRI gespalten, um einen Teil der nicht-codierenden Region stromabwärts der TNF- codierenden Region abzuspalten. Das so erhaltene DNA-Fragment (etwa 1,1 kbp) wurde in ein größeres DNA-Fragment insertiert, das aus einem Plasmid pBR322 durch Spaltung mit den Restriktionsendonucleasen PstI und EcoRI hergestellt worden war, wodurch ein rekombinantes Plasmid einschließlich der TNF-cDNA und eines Tetracyclinresistenzgens, das als pHT113 bezeichnet wurde, hergestellt wurde.
Das rekombinante Plasmid pHT113 wurde mit Restriktionsendonucleasen AvaI und SalI gespalten, wodurch es in drei Fragmente (Größe: etwa 0,8 kbp, 1,3 kbp und 2,6 kbp) gespalten wurde. Das 1,3 kbp-DNA-Fragment einschließlich des Hauptteils der codierenden Region für den menschlichen TNF und eines Teils des Tetracyclinresistenzgens wurde isoliert (nachstehend als AvaI-SalI-Fragment bezeichnet). Das AvaI-SalI-Fragment wurde mit dem folgenden, chemisch synthetisierten Oligodesoxyribonucleotidadaptor [f] ligiert.
Das so erhaltene DNA-Fragment wird als HTNF-Adaptorfragment bezeichnet.
Getrennt davon wurde ein DNA-Fragment (35 bp) einschließlich eines Teils der trp-Promotorregion aus einem Plasmid pDR720 [P-L-Biochemicals; D.R. Russel et al, Gene, 20, 231 (1983)] durch Spalten mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und HpaI herausgeschnitten. Die Nucleotidsequenz des isolierten 35 bp-DNA-Fragments lautet wie folgt:
Das 35 bp-DNA-Fragment wurde mit einem chemisch synthetisierten Adaptor der folgenden Formel:
ligiert.
Das so erhaltene DNA-Fragment wird als trp-Promotorfragment bezeichnet.
Ein Plasmid pBR322 wurde mit den Restriktionsendonucleasen EcoRI und SalI gespalten, und dann wurde das größere DNA-Fragment (etwa 3,7 kbp) isoliert.
Ein Expressionsplasmid zur Herstellung von einem menschlichen TNF aus 155 Aminosäuren entsprechend der Aminosäuresequenz von der Aminosäure Nr. 79 bis Nr. 233 in Tabelle 8 wurde durch sequentielle Ligierung der drei DNA-Fragmente des HTNF-Adaptorfragments des trp-Promotorfragments und des größeren pBR322-Fragments (etwa 3,7 kbp), wie in Fig. 6 gezeigt, konstruiert.
Das Expressionsplasmid wurde als pHTR91 bezeichnet.
Gemäß Beispiel 1-(2) wurde das Plasmid in Escherichia coli eingeschleust. Der Transformant wurde unter Bildung von menschlichem TNF gezüchtet. Tabelle 8 Tabelle 8 (Fortsetzung) Tabelle 8 (Fortsetzung) Tabelle 9 Tabelle 9 (Fortsetzung) Tabelle 10 Tabelle 10 (Fortsetzung)

Claims

1. Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der Formel [I],

worin mindestens einer der folgenden Aminosäureaustausche durchgeführt ist:

31ste Ala durch Thr,

32ste Asn durch Ala, Cys, Asp, Mis, Ile, Arg, Ser, Thr, Val oder Tyr,

115te Pro durch Ser, Ala, Phe, Asn, Gly, Tyr, Val, Glu, Met, Ile, Asp, Trp, Leu oder Lys, und

117te Tyr durch His.

2. Polypeptid nach Anspruch 1, worin in der Aminosäuresequenz der Formel [I] mindestens einer der folgenden Aminosäureaustausche durchgeführt ist:

32ste Asn durch Tyr, His, Asp oder Ser,

115te Pro durch Leu, Ser, Asp oder Gly, und

117te Tyr durch His.

3. Polypeptid nach Anspruch 1, worin in der Aminosäuresequenz der Formel [1] das 32ste Asn durch Tyr ersetzt ist.

4. Polypeptid nach Anspruch 1, worin in der Aminosäuresequenz der Formel [I] das 115te Pro durch Leu ersetzt ist.

5. DNA mit einer Basensequenz, die ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 codiert.