HU210118B

HU210118B - Method for producing new human tnf polypeptide mutanst

Info

Publication number: HU210118B
Application number: HU872805A
Authority: HU
Inventors: Junichi Yamagishi; Katuhisa Nakata; Hitoshi Kawashima; Ryuji Furuta; Hirotada Kotani
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co
Priority date: 1986-06-20
Filing date: 1987-06-19
Publication date: 1995-02-28
Also published as: EP0251037A2; DK312387D0; EP0251037B1; DE3750056T2; PH26714A; SU1762761A3; DE3750056D1; AU7450887A; HUT46065A; US4990455A; ATE107362T1; KR880000471A; DK312387A; EP0251037A3; AU592196B2

Description

A találmány tárgya eljárás új humán nekrózis faktor (TNF) polipeptid mutánsok előállítására.

A TNF fiziológiailag aktív anyag, amelyet Carswell és munkatársai 1975-ben fedeztek fel (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72, 3666 /1975/). Jellemzője, hogy tumorsejtekben erős in vitro citotoxikus hatást és transzplantált tumornál erős in vivő nekrotizáló hatást fejt ki (L. J. Old, Cancer Rés., 41, 361 /1981/).

1984 - és 1985-ben nyúl, humán és egér TNF kódoló DNS-eket zioláltak (146 026., 155 549. és 158 286. számú európai közrebocsátási irat, valamint Fransen és munkatársai: Nucleic Acids Rs., 13, 4417 /1985/) és felderítették a TNF polipeptidek teljes primer szerkezetét.

ATNF-t kódoló DNS, elsősorban a humán TNF-t kódoló DNS izolálása lehetővé tette a humán TNF mikroorganizmusokban géntechnológiai úton történő előállítását és a humán TNF számos tulajdonságának mélyreható tanulmányozását. Ezek a vizsgálatok vezettek arra a felismerésre, hogy a humán TNF erős in vitro citotoxikus hatással és in vivő antitumor hatással rendelkeznek (D. Pennica és munkatársai: Natúré, 312, 724 /1984/); T. Shirai és munkatársai: Natúré, 313, 803 /1985/ és M. Amada és munkatársai: J. Biotechnology, 3, 141 /1985/).

Vizsgálták a humán TNF polipeptidek mutációját is (WO86/02381 és W086/04606. számú PCT közzététel, 168 214. és 155 549. számú európai közrebocsátási irat, 48632/1987. számú japán közrebocsátási irat). Az első három irodalom a 157 aminosavból álló humán TNF polipeptid mutációjának tehetőségét említi vagy adott mutánsokat ismertet. Az utóbbi két irodalom a 155 aminosavból álló humán TNF polipeptid mutációját ismerteti. A találmány szerinti humán TNF polipeptid mutánsok aminosav szekvenciájukban eltérnek az ismert mutánsoktól.

Vizsgálataink során 155 aminosavból álló humán TNF polipeptid aminosav szekvenciájában aminosavakat cseréltünk ki és a humán TNF polipeptid N-terminális szakaszáról aminosavakat töröltünk, majd vizsgáltuk a kapott humán TNF polipeptid mutánsok tulajdonságait. Ennek során azt találtuk, hogy oldható polipeptid csak úgy nyerhető, ha a fenti polipeptidek adott aminosavjain és adott helyein hajtjuk végre a mutációt.

A találmány feladata tehát, hogy oldható humán TNF polipeptid mutánsokat dolgozzunk ki.

A találmány feladata továbbá, hogy oldható és TNF aktivitással rendelkező humán TNF polipeptid mutánsokat dolgozzunk ki.

Azt találtuk, hogy a fenti mutánsok egy része a humán TNF-el közel azonos in vitro és in vivő citotoxikus és antitumor hatással rendelkezik. A találmány tárgya továbbá tehát, hogy kiváló in vitro és in vivő citotoxikus és antitumor hatással rendelkező humán TNF polipeptid mutánsokat dolgozzunk ki.

Azt találtuk továbbá, hogy a fenti mutánsok másik része kiváló in vivő antitumor hatást és emellett nagyon alacsony in vitro citotoxikus hatást mutat, azonban a mutánsok pirogenitása, amely a gyógyászati alkalmazást korlátozza, erősen lecsökken. A találmány tárgya továbbá tehát, hogy nagyon alacsony in vitro citotoxikus hatással és kiváló in vivő antitumor hatással és csökkentett mellékhatással rendelkező humán TNF polipeptid mutánsokat dolgozzunk ki. Abból a tényből, hogy ezek a mutánsok kiváló in vivő hatás mellett alacsony in vitro hatást mutatnak, arra lehet következtetni, hogy az in vitro citotoxikus hatásért és az in vivő antitumor hatásért felelős szerkezetek (aktív centrumok) a TNF polipeptid molekulán belül nem mindig azonos helyen találhatók. Fentiek alapján feltételezhető tehát, hogy a TNF egyes biológiai aktivitásaiért felelős aktív centrumok eltérnek egymástól.

Az egyszerűség kedvéért a leírásban és az igénypontokban a következő rövidítéseket alkalmazzuk:

A: adenin

C: citozin

G: guanin

T: timin

Ala: alanin

Arg: arginin

Asn: aszparagin

Asp: aszpartinsav

Cys: cisztein

Gin: glutamin

Glu: glutaminsav

Gly: glicin

His: hisztidin

Ile: izoleucin

Leu: leucin

Lys: lizin

Met: metionin

Phe: fenilalanin

Pro: prolin

Ser: szerin

Thr: treonin

Trp: triptofán

Tyr: tirozin

Val: valin

DNS: dezoxiribonukleinsav cDNS: komplementer DNS dATP: dezoxiadenozin-trifoszfát dCTP: dezoxicitidin-trifoszfát dGTP: dezoxiguanozin-trifoszfát sTTP: dezoxitimidin-trifoszfát kbp: kilo bázis pár bp: bázis pár

SDS: nátrium-dodecilszulfát

MW: molekulatömeg

KD: kilodalton

SD szekvencia: Shine-Dalgarno szekvencia

Meth A szarkoma: metil-kolantrén indukált szarkoma.

A leírásban egyes szállal megadott bázis szekvenciák az érzékeny szál bázis szekvenciáját mutatják, ahol a baloldali vég az 5’-vég és a jobboldali a 3’-vég. Az aminosav szekvenciákban a baloldali vég az N-terminális és a jobboldali a C-terminális.

A találmány tárgya tehát eljárás 1. táblázat szerinti (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid vagy ebből egy vagy legfeljebb nyolc egymást követő N-terminális aminosav törlésével nyerhető polipeptid előállítására, ahol

HU 210 118 Β

1. táblázat

Ser	Ser	Ser	Arg	Thr	Pro	Ser	Asp	Lys	Pro
Val	Alá	His	Val	Val	Alá	Asn	Pro	Gin	Alá
Glu	Gly	Gin	Leu	Gin	Trp	Leu	Asn	Arg	Arg
Alá	Asn	Alá	Leu	Leu	Alá	Asn	Gly	Val	Glu
Leu	Arg	Asp	Asn	Gin	Leu	Val	Val	Pro	Ser
Glu	Gly	Leu	Tyr	Leu	Ile	Tyr	Ser	Gin	Val
Leu	Phe	Lys	Gly	Gin	Gly	Cys	Pro	Ser	Thr
His	Val	Leu	Leu	Thr	His	Thr	Ile	Ser	Arg
Ile	Alá	Val	Ser	Tyr	Gin	Thr	Lys	Val	Asn
Leu	Leu	Ser	Alá	Ile	Lys	Ser	Pro	Cys	Gin
Arg	Glu	Thr	Pro	Glu	Gly	Alá	Glu	Alá	Lys
Ppo	Trp	Tyr	Glu	Pro	Ile	Tyr	Leu	Gly Gly
Val	Phe	Gin	Leu	Glu	Lys	Gly	Asp	Arg	Leu
Ser	Alá	Glu	Ile	Asn	Arg	Pro	Asp	Tyr	Leu
Asp	Phe	Alá	Glu	Ser	Gly	Gin	Val	Tyr	Phe
Gly	Ile	Ile	Alá	Leu

az aminosav szekvenciában az alábbi helyettesítések közül legalább egy megvalósul:

16. Alá helyett Val,

31. Alá helyett Thr,

32. Asn helyett Alá, Cys, Asp, His, Ile, Arg, Ser, Thr, Val vagy Tyr,

34. Leu helyett Ile,

36. Alá helyett Val,

48. Val helyett Met,

73. Leu helyett Pro,

82. Alá helyett Asp,

85. Tyr helyett His,

89. Val helyett Ile,

94. Alá helyett Thr,

97. Ser helyett Asn,

98. Pro helyett His vagy Leu,

103. Thr helyett Pro,

113. Tyr helyett Cys,

115. Pro helyett Leu, His, Gin, Ser, Alá, Phe, Asn, Gly, Tyr, Val, Glu, Met, Ile, Asp, Trp, Lys, Arg,

117. Tyr helyett His,

118. Leu helyett Gin,

131. Ser helyett Ile,

132. Alá helyett Thr,

141. Asp helyett Tyr,

143. Alá helyett Val,

144. Glu helyett Lys,

145. Ser helyett Cys,

146. Gly helyett Glu és

153. Ile helyett Leu.

A fenti mutánsok közül kiváló in vitro citotoxikus hatással és in vivő antitumor hatással rendelkeznek például azok, amelyek (I) képletű aminosav szekvenciájában az alábbi helyettesítések található:

16. Alá helyett Val,

36. Alá helyett Val,

73. Leu helyett Pro,

98. Pro helyett His vagy Leu,

103. Thr helyett Pro,

115. Pro helyett His vagy Gin,

131. Ser helyett Ile vagy

143. Alá helyett Val.

A fenti mutánsok közül alacsony in vitro citotoxikus hatással és kiváló in vivő antitumor hatással rendelkeznek például azok, amelyek (I) képletű aminosav szekvenciájában az alábbi helyettesítések találhatók:

31. Alá helyett Thr,

32. Asn helyett Alá, Cys, Asp, His, Ile, Arg, Ser, Thr, Val vagy Tyr,

115. Pro helyett Ser, Alá, Phe, Asn, Thr, Gly, Tyr, Val, Glu, Met, Ile, Asp, Trp, Leu vagy Lys,

117. Tyr helyett His.

Különösen előnyös mutánsok azok, amelyek (I) képletű aminosav szekvenciájában az alábbi helyettesítések találhatók:

32. Asn helyett Tyr, His, Asp vagy Ser,

115. Pro helyett Leu, Ser, Asp vagy Gly,

117. Tyr helyett His.

A fenti polipeptid mutánsokat kódoló DNS a 2. táblázatbeli (A) képlettel írható le.

2. táblázat
:5'i	TCA	TCT	TCT	CGA	ACC	CCG	AGT	GAC	AAG
CCT	GTA	GCC	CAT	GTT	GTA	GCA	AAC	CCT	CAA
GCT	GAG	GGG	CAG	CTC	CAG	TGG	CTG	AAC	CGC
CGG	GCC	AAT	GCC	CTC	CTG	GCC	AAT	GGC	GTG
GAG	CTG	AGA	GAT	AAC	CAG	CTG	GTG	GTG	CCA
TCA	GAG	GGC	CTG	TAC	CTC	ATC	TAC	TCC	CAG
GTC	CTC	TTC	AAG	GGC	CAA	GGC	TGC	CCC	TCC
ACC	CAT	GTG	CTC	CTC	ACC	CAC	ACC	ATC	AGC
CGC	ATC	GCC	GTC	TCC	TAC	CAG	ACC	AAG	GTC
AAC	CTC	CTC	TCT	GCC	ATC	AAG	AGC	CCC	TGC
CAG	AGG	GAG	ACC	CCA	GAG	GGG	GCT	GAG	GCC
AAG	CCC	TGG	TAT	GAG	CCC	ATC	TAT	CTG	GGA
GGG	GTC	TTC	CAG	CTG	GAG	AAG	GGT	GAC	CGA
CTC	AGC	GCT	GAG	ATC	AAT	CGG	CCC	GAC	TAT
CTC	GAC	TTT	GCC	GAG	TCT	GGG	CAG	GTC	TAC
TTT	GGG	ATC	ATT	GCC	CTG-(3')	. .	• [A]

A találmány szerinti DNS-re példaként említhető: (a) olyan DNS, amelynek 2.táblázat szerinti bázis szekvenciájában az alábbi helyettesítések találhatók:

16. Ala-t kódoló GCA helyett Val-t kódoló GTA,

31. Ala-t kódoló GCC helyett Thr-t kódoló ACC,

32. Asn-t kódoló AAT helyett Ala-t kódoló GCT, 32. Asn-t kódoló AAT helyett Cys-t kódoló TGC, 32. Asn-t kódoló AAT helyett Asp-t kódoló GAT, 32. Asn-t kódoló AAT helyett His-t kódoló CAC, 32. Asn-t kódoló AAT helyett Ile-t kódoló ATC,

32. Asn-t kódoló AAT helyett Arg-t kódoló CGA, 32. Asn-t kódoló AAT helyett Ser-t kódoló AGC, 32. Asn-t kódoló AAT helyett Thr-t kódoló ACT,

32. Asn-t kódoló AAT helyett Val-t kódoló GTC,

32. Asn-t kódoló AAT helyett Tyr-t kódoló TAT,

34. Leu-t kódoló CTC helyett Ile-t kódoló ATC,

36. Ala-t kódoló GCC helyett Val-t kódoló GTC, 48. Val-t kódoló GTG helyett Met-t kódoló ATG, 73. Leu-t kódoló CTC helyett Pro-t kódoló CCC, 82. Ala-t kódoló GCC helyett Asp-t kódoló GAC, 85. Tyr-t kódoló TAC helyett His-t kódoló CAC,

89. Val-t kódoló GTC helyett Ile-t kódoló ATC,

94. Ala-t kódoló GCC helyett Thr-t kódoló ACC,

97. Ser-t kódoló AGC helyett Asn-t kódoló AAC,

HU 210 118 Β

98. Pro-t kódoló CCC helyett His-t kódoló CAC, 98. Pro-t kódoló CCC helyett Leu-t kódoló CTC. 103. Thr-t kódoló ACC helyett Pro-t kódoló CCC, 113. Tyr-t kódoló TAT helyett Cys-t kódoló TGT. 115. Pro-t kódoló CCC helyett His-t kódoló CAC. 115. Pro-t kódoló CCC helyett Gln-t kódoló CAG, 115. Pro-t kódoló CCC helyett Ser-t kódoló TCC. 115. Pro-t kódoló CCC helyett Ala-t kódoló GCC, 115. Pro-t kódoló CCC helyett Phe-t kódoló TTC, 115. Pro-t kódoló CCC helyett Asn-t kódoló AAC, 115. Pro-t kódoló CCC helyett Thr-t kódoló ACC, 115. Pro-t kódoló CCC helyett Gly-t kódoló GGC, 115. Pro-t kódoló CCC helyett Tyr-t kódoló TAC, 115. Pro-t kódoló CCC helyett Val-t kódoló GTC, 115. Pro-t kódoló CCC helyett Glu-t kódoló GAG, 115. Pro-t kódoló CCC helyett Met-t kódoló ATG, 115. Pro-t kódoló CCC helyett Ile-t kódoló ATC, 115. Pro-t kódoló CCC helyett Asp-t kódoló GAC, 115. Pro-t kódoló CCC helyett Trp-t kódoló TGG, 115. Pro-t kódoló CCC helyett Leu-t kódoló CTC, 115. Pro-t kódoló CCC helyett Lys-t kódoló AAG, 115. Pro-t kódoló CCC helyett Arg-t kódoló CGC,

117. Tyr-t kódoló TAT helyett His-t kódoló CAT,

118. Leu-t kódoló CTG helyett Gln-t kódoló CAG,

131. Ser-t kódoló ACG helyett Ile-t kódoló ATC,

132. Ala-t kódoló GCT helyett Thr-t kódoló ACT,

141. Asp-t kódoló GAC helyett Tyr-t kódoló TAC,

143. Ala-t kódoló GCC helyett Val-t kódoló GTC,

144. Glu-t kódoló GAG helyett Lys-t kódoló AAG,

145. Ser-t kódoló TCT helyett Cys-t kódoló TGT,

146. Gly-t kódoló GGG helyett Glu-t kódoló GAG,

153. Ile-t kódoló ATT helyett Leu-t kódoló CTG. .

(b) fenti DNS, amelyben az 5’-véghez ATG transzlációs iniciátor kód és/vagy a 3’-véghez terminátor kód kapcsolódik.

A találmány szerinti új humán TNF mutánsokat kódoló DNS előállítható például úgy, hogy először humán TNF-t kódoló DNS-t vagy annak prekurzorát állítjuk elő ismert módon, például a 155 549. számú európai közrebocsátási iratban ismertetett módon vagy kémiai szintézis útján. Ezután a kapott szekvenciát pont mutációval Wang és munkatársai módszerével (Science, 224,1431 /1984/), vagy megfelelő restrikciós endonukleáz és bázis szekvenciájában a kívánt helyen mesterségesen megváltoztatott szintetikus olidodezoxiribonukleotid adapter segítségével parciálisán megváltoztatva alakítjuk a fenti mutánst kódoló DNS-sé.

így például az olyan (I) képletű polipeptid mutánst, amelyben a 115. aminosavat (Pro) Leu helyettesíti, kódoló DNS előállítható az alábbi módon:

Humán TNF prekurzort kódoló bázis szekvenciájú DNS-t izolálunk a 155 549. számú európai közrebocsátási iratban ismertetett módon. A humán TNF prekurzort kódoló DNS bázis szekvenciáját a 8. táblázat mutatja, ahol a 235-699. bázis közötti szakasz megfelelő a humán TNF-t kódoló bázis szekvenciájának. A humán TNF aminosav szekvenciájának 115. aminosavját (Pro) kódoló kód a 8. táblázat 577-579. bázisának (CCC) felel meg. A fenti kódot tartalmazó DNS fragmenst megfelelő restrikciós endonukleázok kombinációjával hasítjuk. Ettől külön, a Pro-t kódoló CCC helyett Leukódot (CTC) tartalmazó DNS fragmenst szintetizálunk kémiai úton. A szintetizált DNS fragmenst a hasított DNS fragmenssel szubsztituálva a fenti polipeptid mutánst kódoló DNS-t kapunk.

Részletesebben, a 8. táblázat szerint 155-603. bázisnak megfelelő DNS fragmens Ddel és Pvull restrikciós endonukleázzal hasítjuk.

Eljárhatunk úgy is, hogy alábbi bázis szekvenciájú oligodezoxiribonukleotid adaptert szintetizálunk kémiai úton.

5'-TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCTCAT-3'

3'-CCGGTTCGGGACCATACTCGA-5' és

5'-CTATCTGGGAGGGGTCTTCCAG-3'

3' -GTAGATAGACCCTCCCCAGAAGGTC-5'

A kapott DNS adaptert a 8. táblázat-beli 555-603. bázisoknak megfelelő, hasított DNS fragmenssel szubsztituáljuk.

A DNS megfelelő kifejező vektorba történő beépítésével a vektor megfelelő gazdasejtbe történő bevezetésével és a kapott transzformáns ismert módon történő tenyésztésével a találmány szerinti humán TNF polipeptid mutánsokat kapunk.

Részletesebben, a találmány szerinti polipeptid mutáns előállításához szükséges kifejező vektort állítjuk elő úgy, hogy 5’-végén ATG transzlációs iniciátor kódot és 3’-végén terminátor kódot tartalmazó DNS fragmenst állítunk elő, amelynek bázis szekvenciája a találmány szerinti polipeptid mutánst kódolja, majd ezt megfelelő promoterhez és SD szekvenciához kapcsoljuk és a kapott fragmenst vektorba építjük be. A promoter példájaként említhető lac, trp, tac, phoS, phoA, PL és SV40 korai promóter. A vektor példájaként említhető plazmid (például pBR322), fág (például lambda fág származék) és vírus (például SV40). A transzformáns előállításához a kapott kifejező vektort megfelelő gazdasejtbe, például E. coliba ültetjük be Cohen és munkatársai módszere (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69,2110/1972/) szerint. Ezután a transzformánst megfelelő körülmények között tenyésztve a kívánt polipeptid mutáns vagy annak olyan származékát kapjuk, amelynek N-terminális végéhez Met kapcsolódik. A tenyésztett sejtek kezelhetők például lizozim emésztéssel, fagyasztással-olvasztással, ultrahangos kezeléssel vagy francia préssel, majd centrifugálással, majd szűréssel kapjuk a találmány szerinti polipeptid mutánst tartalmazó extraktumot. A kívánt polipeptid mutáns az extraktum tisztításával izolálható, amit a fehéijetisztítás ismert módszereivel, így ultraszűréssel, dialízissel, ioncserés kromatográfiával, gélszűréssel, elektroforézissel és affinitás kromatográfiával végzünk.

A találmány szerinti polipeptid mutáns szerves vagy szervetlen savval vagy bázissal sóvá alakítható.

A találmány szerinti humán TNF polipeptid mutánsokat a példákra hivatkozva az alábbiakban ismertetjük közelebbről:

(1) A példák és összehasonlító példák szerint összeállított transzformánsokat tenyésztve különböző humán TNF polipeptid mutánsokat állítunk elő.

Közelebbről, a transzformánsokat az 1(2). példában

HU 210 118 Β leírt módon tenyésztjük és az E. coli-han kapott humán TNF polipeptid mutánsokat 0,1% lizozimot és 30 mmól/liter nátrium-kloridot tartalmazó 50 mmól/liter Tris-HCl puferrel (pH = 8) extraháljuk.

Az extraktumból kinyert humán TNF polipeptid mutáns mennyiségét EIA (enzyme immunoassay) segítségével az antihumán TNF antitesttel immunológiailag reagáló polipeptid mennyiségeként mérjük. A humán TNF polipeptid mutánsnak EIA segítségével történő' meghatározása az alábbi elveken nyugszik:

Anti-humán TNF nyúl antiszérum kompetitív kötést hozunk létre a vizsgálati mintában található humán TNF polipeptid mutáns és β-galaktozidázzal megjelölt humán TNF között. Ezután baktériumos sejtfalhoz kötött anti-nyúl- IgG kecske antiszérum hozzáadásával enzimmel jelölt humán TNF/antihumán TNF nyúl antitest/anti-nyúl IgG kecske antitest komplexet kapunk. A reakcióelegyet szilárd fázis keletkezéséig centrifugáljuk. Az enzimmel jelölt humán TNF mennyiségét a komplexben, amely a szilárd bázisban található, enzimaktivitása alapján határozzuk meg.

Enzimszubsztrátumként 2-nitrofenil^-D-galaktopiranozidot alkalmazunk és az enzimreakcióval kapott szubsztrát emésztett termékének (2-nitrofenol) menynyiségét 410 nm hullámhossznál mért abszorpció segítségével határozzuk meg. A komplexben lévő enzimmel jelölt humán TNF mennyisége összhangban van, a vizsgálati mintában lévő' humán TNF polipeptid mutáns mennyiségével.

A vizsgálati minta humán TMF polipeptid mutáns mennyiségét humán TNF segítségével külön felvett standard görbéről határozzuk meg.

Az anti-humán TNF nyúl antiszérum előállításához antigénként Yamaha és munkatársai által kidolgozott módszerrel (J. Biotechnology 3, 141 /1985/) előállított humán TNF-t alkalmazunk.

Az eredményeket a 3. táblázat tartalmazza.

Ha a sejtextraktumban meghatározott humán TNF polipeptid mutáns mennyisége összehasonlítható a kontrollként alkalmazott humán TNF mennyiségével, a polipeptid mutáns oldékonyságát (++)-tel jelöljük. Az oldékonyságot (+)-tel jelöljük, ha a mennyisége kisebb, mint a kontrolié és (-)-szal, ha mennyisége sokkal kisebb, mint a kontrolié vagy nem determinálható.

Feltehető, hogy a (-) jellel jelölt oldékonyságú polipeptid mutáns szerkezeti változást szenvedett és így jelentős mértékben csökkent az oldékonysága, vagy az E. coli sejtben nem volt stabil.

3. táblázat

Polipeptid mutánsok		Mutáció helyzete	Oldékonyság
TNF-12T	12	Alá—>Thr	(-)
TNF-13Y	13	His—>Tyr	(-)
TNF-14A	14	Val -»Alá	(-)
TNF-16V	16	Alá—>Val	(++)
TNF-17T	17	Asn—>Thr	(+)

Polipeptid mutánsok		Mutáció helyzete	Oldékonyság
TNF-24F	24	Leu—>Phe	(+)
TNF-26R	26	Trp —> Arg	(-)
TNF-31T	31	Alá—>Thr	(++)
TNF-32A	32	Asn—>Ala	(++)
TNF-32C	32	Asn-»Cys	(++)
TNF-32D	32	Asn—>Asp	(++)
TNF-32H	32	Asn—»His	(++)
TNF-32I	32	Asn—>Ile	(++)
TNF-32R	32	Asn—>Arg	(++)
TNF-32S	32	Asn—>Ser	(++)
TNF-32T	32	Asn-»Thr	(++)
TNF-32V	32	Asn—> Val	(++)
TNF-32Y	32	Asn-»Tyr	(++)
TNF-32G	32	Asn—>Gly	(++)
TNF-32L	32	Asn—>Leu	(++)
TNF-34I	34	Leu—»Ile	(++)
TNF-35P	35	Leu—>Pro	(-)
TNF-36V	36	Ala-»Val	(++)
TNF-44D	44	Asn—>Asp	(-)
TNF-45P	45	Gin—>Pro	(-)
TNF-48M	48	Val—>Met	(++)
TNF-50P	50	Ser—> Pro	(-)
TNF-54C	54	Tyr—>Cys	(-)
TNF-54H	54	Tyr—>His	(-)
TNF-58P	58	Ser—>Pro	(-)
TNF-59L	59	Gin—»Leu	(-)
TNF-60D	60	Val—>Asp	(-)
TNF-60G	60	Val—>Gly	(-)
TNF-62S	62	Phe—>Ser	(-)
TNF-67S	67	Cys—>Ser	(++)
TNF-70Y	70	Thr—>Tyr	(++)
TNF-73P	73	Leu—>Pro	(++)
TNF-82D	82	Ala->Asp	(++)
TNF-85H	85	Tyr—>His	(++)
TNF-89I	89	Val—>Ile	(++)
TNF-93P	93	Ser—> Pro	(-)
TNF-94T	94	Ala->Thr	(++)
TNF-97N	97	Ser—» Asn	(++)
TNF-98H	98	Pro—>His	(++)
TNF-98L	98	Pro—> Leu	(++)
TNF-99S	99	Cys—>Ser	(++)
TNF-103P	103	Thr—>Pro	(++)
TNF-113C	113	Tyr—>Cys	(++)
TNF-115H	115	Pro—>His	(++)

HU 210 118 Β

Polipeptid mutánsok		Mutáció helyzete	Oldékonyság
TNF-115Q	115	Pro—>Gln	(-W·)
TNF-115S	115	Pro—>Ser	(++)
TNF-115A	115	Pro->Ala	(++)
TNF-115F	115	Pro—>Phe	(+)
TNF-115N	115	Pro->Asn	(++)
TNF-115T	115	Pro—>Thr	(++)
TNF-115G	115	Pro—>Gly	(++)
TNF-115Y	115	Pro—>Tyr	(++)
TNF-115V	115	Pro—> Val	(++)
TNF-115E	115	Pro—>Glu	(++)
TNF-115M	115	Pro—>Met	(+)
TNF-115I	115	Pro—>Ile	(++)
TNF-115D	115	Pro—>Asp	(++)
TNF-115W	115	Pro—>Trp	(++)
TNF-115L	115	Pro—>Leu	(++)
TNF-115K	115	Pro—>Lys	(++)
TNF-115R	115	Pro—> Arg	(+)
TNF-117H	117	Tyr—>His	(++)
TNF-118Q	118	Leu—>Gln	(++)
TNF-121G	121	Val—>Gly	(-)
TNF-124Q	124	Leu—>Gln	(-)
TNF-128A	128	Asp—>Ala	(-)
TNF-128N	128	Asp—>Asn	(-)
TNF-131I	131	Ser—»IIe	(++)
TNF-132T	132	Alá—>Thr	(++)
TNF-135D	135	Asn—>Asp	(+)
TNF-138Y	138	Asp—>Tyr	(+)
TNF-141Y	141	Asp—»Tyr	(++)
TNF-143V	143	Alá—>Val	(++)
TNF-144K	144	Glu—>Lys	(++)
TNF-145C	145	Ser—>Cys	(++)
TNF-146E	146	Gly—>Glu	(++)
TNF-148D	148	Val—>Asp	(-)
TNF-148G	148	Val—>Gly	(-)
TNF-150L	150	Phe—>Leu	(-)
TNF-151E	151	Gly—>GIu	(-)
TNF-153L	153	lle—>Leu	(++)
TNF-1151^^7			(++)
TNF-115LAN8- Ser67			(++)
TNF-115LAN8			(++)

(2) A 4. táblázat humán TNF (kontroll) és több találmány szerinti, az alábbi példákkal előállított humán TNF polipeptid mutáns izoelektromos pontját és citotoxikus aktivitását mutatja.

A citotoxikus aktivitást egér L-M sejteken (ATZCC, CCL 1.2) Yamaha és munkatársai módszerével (J. Biotechnology, 3, 141 /1985/) határoztuk meg.

A vizsgálatokhoz SDS-poliakrilamid gél elektroforézis analízis (U. K. Laemmli; Natúré, London, 227, 680 /1970/) szerint homogén humán TNF polipeptid mutánsokat alkalmazunk.

4. táblázat

Mutáns polipeptid	Izoelektromos pont (pl)	Citotoxikus aktivitás (egység/pg)
Humán TNF	5,9	2 080
TNF-16V	5,7	310
TNF-31T	5,8	12
TNF-32Y	5,9	0,18
TNF-32H	6,1	32
TNF-32D	5,5	1,1
TNF-32S	5,8	1,0
TNF-32G	5,8	8,7
TNF-32L	5,8	0,43
TNF-36V	5,9	122
TNF-73P	6,0	234
TNF-98H	6,4	1 330
TNF-103P	6,2	215
TNF-115L	5,9	12
TNF-115S	5,8	23
TNF-115T	5,8	38
TNF-115H	6,0	220
TNF-115R	7,0	0,22
TNF-115D	5,7	6,8
TNF-115G	5,9	37
TNF-117H	6,3	31
TNF-131I	5,9	1 890
TNF-143V	5,8	243
TNF-144K	7,5	1,3
TNF-146E	5,6	0,18
TNF-115LAN8	5,9	10

(3) Az 5. táblázat humán TNF (kontroll) és az alábbi példákkal előállított humán TNF polipeptid mutánsok in vivő antitumor aktivitását mutatja.

Az antitumor aktivitást az alábbiak szerint határoztuk meg:

BALB/c nőstény egerek (8 hetes kor) alhasi bőrébe Meth A szakróma sejteket (2 χ 10⁵) ültettünk be. A beültetés után 7 nappal intravénásán adagoljuk a polipeptidet. A tumor elpusztítását 24 órával az adagolás után Carswell és munkatársai standardjával (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3666 /1975/) határozzuk meg.

Mint az 5. táblázatból látható, a beépített tumorral szemben mutatott in vitro citotoxikus aktivitás és in

118 B 2

HU vivő antitumor aktivitás között alig van összefüggés, így például a TNF-121I a humán TNF-fel azonos in vitro citotoxikus hatást és in vivő antitumor hatást mutat. Ezzel szemben más humán TNF polipeptid mutánsok, például az a humán TNF polipeptid mutáns, amelyben az N-terminális 32., 115. vagy 143. aminosav ki van cserélve, in vitro citotoxikus hatásához képest igen erős in vivő antitumor hatást, és emellett alacsony letális toxicitást mutat.

5. táblázat

Polipeptid dózis (egység/egér)	Nekrotikus válasz	Tumornövekedés aránya (%)
	-		+	+++
Humán TNF:
600	1	5	0	0	55
2 000	0	4	2	0	80
6 000	0	0	6	0	87
20 000	0	0	0	6	100
TNF-16V:
93	6	0	0	0	61
310	4	2	0	0	64
930	0	4	2	0	90
3 100	0	0	6	0	86
9 300	0	0	3	3	100
TNF-31T:
35	7	0	0	0	49
115	2	5	0	0	79
TNF-32Y:
5	4	3	0	0	26
18	3	4	0	0	46
TNF-32D:
11	4	0	0	0	63
33	0	5	0	0	82
110	0	1	3	1	81
TNF-32S:
10	5	0	0	0	17
30	1	4	0	0	68
100	0	1	4	0	97
TNF-32H:
32	4	1	0	0	45
96	1	4	0	0	73
320	0	3	2	0	100
TNF-36V:
120	2	4	0	0	49
370	0	4	2	0	83
1 200	0	0	2	4	93
3 700	0	0	0	6	93
TNF-73P:

Polipeptid dózis (egység/egér)	Nekrotikus válasz	Tumornövekedés aránya (%)
	-		+	+++
230	5	2	0	0	8
700	0	7	0	0	66
2 300	0	5	2	0	90
TNF-98H:
1 300	2	5	0	0	70
4 000	0	5	2	0	81
13 000	0	0	1	6	94
TNF-103P:
215	0	1	6	0	70
645	0	0	4	3	100
TNF-115L:
12	5	1	0	0	70
35	2	4	0	0	73
117	0	5	1	0	78
350	0	2	4	0	91
1 170	0	0	5	1	93
TNF-115S:
23	3	3	0	0	74
69	0	4	2	0	81
230	0	2	4	0	91
690	0	0	5	1	84
2 300	0	0	1	5	100
TNF-115H:
220	5	1	0	0	72
660	0	5	1	0	80
2 200	0	1	5	0	96
TNF-115T:
38	2	3	0	0	54
114	2	3	0	0	83
' 380	1	2	2	0	91
1 140	0	0	5	0	100
TNF-115D:
68	0	5	0	0	57
204	0	2	3	0	100
TNF-115G:
110	0	5	0	0	68
370	0	1	4	0	98
1 100	0	0	1	4	100
TNF-117H:
31	4	3	0	0	51
92	1	6	0	0	88
310	0	0	7	0	93
TNF-131I:
5 700	0	0	2	3	83

HU 210 118 Β

Polipeptid dózis (egység/egér)	Nekrotikus válasz	Tumornövekedés aránya (%)
	-		+	+++
TNF-1311:
5 700	0	0	2	3	83
19 000	0	0	1	3	98
TNF-143V:
730	0	5	0	0	42
2 400	0	4	1	0	65
7 300	0	1	3	1	100

(4) Néhány találmány szerinti humán INF polipeptid mutáns és humán TNF pirogenitását nyulakon vizsgáltuk. Az eredményeket a 6. táblázat mutatja.

A pirogenitás vizsgálatához a polipeptidet intravénásán nyulaknak adagoltuk és az adagolás után 4 órán keresztül vizsgáltuk a rektális hőmérséklet változását. Az eredményeket az alábbiak szerint értékeltük:

- a rektális hó'mérséklet emelkedése kisebb, mint

0,4 ’C + a rektális hőmérséklet emelkedése 0,5-0,9 ’C közé esik ++ a rektális hőmérséklet emelkedése nagyobb, mint

1,0 ’C.

6. táblázat

Polipeptid	Dózis (gg/kg)	Pirogenitás
Humán TNF:	0,52	(+)
TNF-16V:	0,52	(-)
	5,2	(-)
	52	(+)
TNF-32Y:	0,56	(-)
	5,6	(-)
	56	(-)
TNF-32H:	0,50	(-)
	5,0	(-)
	50	(-)
TNF-36V:	0,50	(-)
	5,0	(+)
	50	(+)
TNF-73P:	0,51	(-)
	5,1	(+)
	51	(++)
TNF-115L:	0,67	(-)
	6,7	(-)
	67	(+)
TNF-115S:	0,52	(-)
	5,2	(+)
	52	(+)

Polipeptid	Dózis (gg/kg)	Pirogenitás
TNF-115H:	0,50	(-)
	5,0	(+)
	50	(+)
TNF-117H:	0,52	(-)
	5,2	(-)
	52	(+)

(5) A polipeptid mutánsnak (TNF-115L) a vérnyomásra gyakorolt hatása vizsgálathoz a mutánst SHR/NCrj hím patkányok ((testtömeg 264-304 g, Nippon Charles River Co., Ltd.) farki vénájába adagoltuk és a patkányok szisztolés vérnyomását anasztézis nélkül patkányokon alkalmazható artériás vérnyomásmérővel (KN-209 model, Natsume Seisakoshu) határoztuk meg. Kontrollként azonos módon humán TNF-t adagoltunk. Az eredményeket a 7. táblázat tartalmazza.

7. táblázat

Polipeptid adag (gg/kg)	Vérnyomás változása (az adagolás után órákkal)
előtt	5 óra	24 óra
Humán TNF:
100	193 ±3,1 Hgmm	183 ±2,0 Hgmm	170 ±3,2 Hgmm
TNF-115L:
100	189 + 3,0 Hgmm	195 ±2,5 Hgmm	191 ±2,6 Hgmm
1 000	189 ±3,0 Hgmm	178 ±2,7 Hgmm	184 ±2,2 Hgmm
5 000	190 ± 1,5 Hgmm	186 ± 2,1 Hgmm	189 ±2,5 Hgmm
10 000	191 ±2,1 Hgmm	185 ±2,4 Hgmm	188 ±3,6 Hgmm

A találmány szerinti humán TNF polipeptid mutáns oldat vagy liofilizált termék formájában kiszerelhető. Hosszú idejű stabilitás szempontjából előnyös a liofilizált termék. A készítményt előnyösen oldószer vagy stabilizátor segítségével állítjuk elő. Stabilizátorként alkalmazható például albumin, glubolin, zselatin, protamin, protaminsó, glükóz, galaktóz, xilóz, mannitol, glükuronsav, trealóz, dextrán, hidroxietil-keményítő és nemionos felületaktív anyag (így polioxietilén-zsírsavészter, polioxietilén-alkil-éter, polioxietilén-alkil-feniléter, polioxietilén-szorbitán-zsírsav-észter, polioxietilén-glicerin, zsírsav-észter, polioxietilén-keményítettkasztorolaj, polioxietilén-kasztorolaj, polioxietilén-polioxpropilén-alkil-éter, polioxietilén-polioxpropilénblokk-kopolimer, szorbitán-zsírsav-észter, cukróz-zsírsav-észter és glicerin-zsírsav-észter.

A találmány szerinti humán TNF polipeptid mutánsok antitumor szerként alkalmazhatók.

A polipeptid készítményt előnyösen parenterálisan vagy tropikálisan alkalmazzuk. Parenterális, így intravénás vagy intramuszkuláris adagolást alkalmazunk, ha a tumoros sejtek nagykiterjedésűek vagy áttételesek,

HU 210 118 Β vagy ha az áttételt kell megakadályozni. Lokális tumorszövetek ellen közvetlen intratumoros adagolást is alkalmazunk. A dózis az alkalmazott humán TNF polipeptid mutánstól, a tumor típusától és méretétől, a beteg állapotától és az adagolás módjától függ. A dózis például TNF-115L esetében 1 x 10³—1 x 10⁸ egység/kg, előnyösen 1 x 10⁴—1 x 10⁷ egység/kg.

Az 1. ábra a humán TNF kódoló klónozott cDNS hasítási térképét mutatja.

A 2. és 3. ábra a pHNY-32 kifejező plazmid előállítát (1. példa) mutatja.

A 4. ábra a pHPL-115 kifejező plazmid előállítához szükséges PL-DNS fragmens előállítását (2. példa) mutatja.

Az 5. ábra a TNF-115L polipeptidből lizil-endopeptidázzal végzett emésztéssel nyert peptid fragmensek HPLC segítségével felvett elúciós sémáját (2. példa) mutatja.

A 6. ábra a pHPL-147 kifejező plazmid előállítását (3. példa) mutatja.

A 7. ábra a pHPL-Ser67 kifejező plazmid előállítását (4. példa) mutatja.

A 8. ábra a pHPL-147-S67 kifejező plazmid előállítását (5. példa) mutatja.

A 9. ábra a pHTR91 kifejező plazmid előállítását (1. összehasonlító példa) mutatja.

A 10. ábra a pHT147 kifejező plazmid előállítását (2. összehasonlító példa) mutatja.

All. ábra a pHT392 kifejező plazmid előállítását (3. összehasonlító példa) mutatja.

A találmányt közelebbről az alábbi példákkal mutatjuk be.

Az egyes eljárásokkal természetesen a találmány szerinti más TNF polipeptid mutánsok is előállíthatok, és a találmány nem korlátozódik a példákra.

1. példa

TNF-32Y humán TNF polipeptid mutáns előállítása (1) A kifejező plazmid előállítása

A 9. táblázat 1-155. aminosav-szekvenciájának megfelelő 155 aminosavat tartalmazó polipeptid előállításához szükséges kifejező plazmidot (pHNY-32) a

2. és 3. ábrán ábrázolt módon állítjuk elő.

A humán TNF-t kódoló klónozott cDNS-t PstI restrikciós endonukleázzal történő emésztéssel a 155 549. számú európai közrebocsátási irat szerint előállított pHTNF13 rekombináns plazmidból izoláljuk.

A klónozott cDNS-t Aval és Hindii! restrikciós endonukleázzal tovább emésztve izoláljuk a humán TNF polipeptidet kódoló szakasz nagy részét tartalmazó DNS fragmenst. Az izolált DNS fragmenst TNFDNS fragmensnak nevezzük.

A TNF-DNS fragmens mintegy 600 bp nagyságú és a 8. táblázatban megadott 250-dik bázis előtti bázis szekvenciájának felel meg. Teljes bázis szekvenciáját Yamaha és munkatársai írják le (J. Biotechnology, 3, 141 /1985/).

A TNF-DNS fragmenst Hpall és Bgll restrikciós endonukleázzal tovább emésztve három DNS fragmenst kapunk, amelyeket izolálunk. A DNS fragmensek szekvenciája megfelel a 8. táblázat szerinti 250321. bázisszakasznak, 322-337. bázisszakasznak és a 338. bázis előtti szakasznak. Ezeket a DNS fragmenseket DNS-1 fragmensnek, DNS-2 fragmensnek és DNS-3 fragmensnek jelöljük.

A DNS-1 és DNS-3 fragmenseket T4 DNS ligáz segítségével a kémiailag szintetizált (a) oligo-dezoxiribonukleotid adapterrel kombináljuk.

A ligáit DNS fragmenst NY-DNS fragmensnek jelöljük. Az NY-DNS fragmenst egymás után a kémiailag szintetizált (b) és (c) oligo-dezoxi-ribonukleotid adapterekkel ligájuk.

A kapott DNS fragmenst peptid-kódoló DNS fragmensnek jelöljük.

A pCT-1 plazmidból (M. Ikehara és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci., USA 81, 5956 /1984/) Hpal és Aatü restrikciós endonukleázzal végzett kettős emésztéssel trp promoter szakaszt tartalmazó DNS fragmenst (mintegy 380 bp nagyságú) izolálunk. A fenti 380 bp-s DNS fragmens trp promoter szakaszának bázisszekvenciáját Bennett és munkatársai ismertetik (J. Mól. Bioi., 121, 113 /1978/). A 380 bp-s DNS fragmenst a fenti peptid-kódoló DNS fragmenssel ligáljuk. A ligáit DNS fragmenst promoter peptid-kódoló DNS fragmensnek jelöljük.

Ettől külön, a pBR322 plazmidot Aval és Pvull restrikciós endonukleázzal hasítjuk, és a kapott nagy DNS fragmenst (mintegy 3,7 kbp) 0,7%-os agaróz gél elektroforézissel izoláljuk. A tapadós véget E. coli DNS polimeráz I (Klenow fragmens) és négy dezoxiribonukleotid-trifoszfát (dGTP, dATP, dTTP és dCTP) segítségével tompa véggé alakítjuk, majd mindkét véget T4 DNS ligázzal ligáivá pBRS6 jelű új plazmidot kapunk.

A pBRS6 plazmidot AAtlI és HindlII restrikciós endonukleázzal két DNS fragmensre hasítjuk.

A nagyobb DNS fragmenst (mintegy 3,6 kbp nagyságú) izoláljuk és T4 DNS ligáz segítségével a promoter peptid-kódoló DNS fragmenssel ligáivá pHNY-32 kifejező plazmidot kapunk.

(2) TNF-32Y előállítása

A pHNY-32 kifejező plazmidot szokásos módon (S. N. Cohen és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 /1972/) E. coli HB101 törzsbe visszük be.

A transzformánst (HB101/pHNY-32) egy éjszakán keresztül 37 °C hőmérsékleten LB közegen (összetétel: 1% tripton, 0,5% élesztő extraktum, 1% nátrium-klorid, pH = 7,5) tenyésztjük. A tenyészetet 37 °C hőmérsékleten 1 órára 25 mikrogramm/ml ampicillint tartalmazó 10-es térfogatú módosított M9 közegre (összetétel: 1,5% Na₂HPO₄ x 12H₂O, 0,3% KH₂PO₄, 0,05% NaCl, 0,1% NH₄C1, 2 mg/liter B, vitamin, 0,45% kazaminosav, 1 mmól/liter MgSO₄, 0,1 mmól/liter CaCl₂ és 0,4% glicerol) oltjuk át.

Eztuán 20 mikrogramm/ml koncentrációig 3-indolakrilsavat adunk hozzá. 24 órás tenyésztés után a ter9

HU 210 118 Β méket centrifugálással összegyűjtjük. A sejteket 0,1 % lizozimot és 30 mmól/liter NaCl-t tartalmazó 50 mmól/liter trisz-HCl pufferben (pH = 8) szuszpendáljuk, majd 30 percen keresztül jeges fürdőre állítjuk. Ezután a sejtszuszpenziót száraz jég/etanol fürdőn gyorsan fagyasztjuk és 37 °C hőmérsékleten megolvasztjuk, végül a sejtextraktumot centrifugálással öszszegyűjtjük.

A sejtextraktumot 20 mmól/liter trisz-HCl pufferrel (pH = 7,8) dializáljuk, és a dializátumból centrifugálással kinyerjük a tiszta felülúszót. A felülúszót előzetesen 20 mmól/liter trisz-HCl pufferrel (pH = 7,8) egyensúlyba hozott DEAE-szefaróz CL-6B oszlopra (Pharmacia) visszük fel. Az oszlopról az előbbi pufferrel kimossuk a nem adszorbeált részeket, majd a kívánt polipeptidet (TNF-32Y) a fenti pufferrel eluáljuk, amelyhez 0-0,3 mól/liter között lineárisan változó koncentrációban nátrium-kloridot adagoltunk. A frakciókat SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel vizsgáljuk és a mintegy 17 kilodalton móltömegű polipeptidet tartalmazó frakciókat összegyűjtjük.

Az egyesített frakciókat 20 mmól/liter trisz-HCl pufferrel (pH = 7,8) dializáljuk és DEAE-szefaróz CL6B oszlopon a megadott módon ismét kromatografáljuk, az elúciót azonban kisebb nátrium-klorid koncentráció-változással végezzük.

A kívánt polipeptidet tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és YM10 membrán (Amicon) segítségével Diaflo ultraszűrőn koncentráljuk.

A koncentrált terméket Bio-Gél P-6 (Bio-Rad) oszlopon 5 mmól/liter foszfát pufferolt sóoldattal eluálva gélszűrjük, amelynek során tisztított TNF-32Y-t kapunk.

A tisztított TNF-32Y N-terminális aminosav szekvenciáját automatikus Edman fehérjeanalizátoron (Applied Biosystems, Model 470A) analizáljuk.

A mérési eredmények szerint a TNF-32Y N-terminális aminosava egy szerin-maradék, vagyis a tisztított termékről lehasad az ATG transzlációs iniciátorkódnak megfelelő metionin-maradék.

2. példa

TNF-115L humán polipeptid TNF mutáns előállítása (1)A kifejező plazmid előállítása

A10. táblázat szerinti 1-155. aminosavnak megfelelő szekvenciájú és 155 aminosavból álló polipeptid, továbbiakban TNF 115L előállításához szükséges kifejező plazmidot (pHPL-115) a 4. ábra szerint állítjuk elő.

Az 1(1). példa szerinti TNF-DNS fragmenst Pvi/II és Taql restrikciós endonukleázzal emésztve négy DNS fragmensre hasítjuk és azokat izoláljuk. A DNS fragmensek a szekvenciája megfelel a 8. táblázat 250-369. bázisszakaszának, 370-603. bázisszakaszának, 604653. bázisszakaszának, 604-653. bázisszakaszának és a 654. alatti bázisszakasznak.

Ezeket a DNS fragmenseket a DNS-4 fragmensnek, a DNS-5 fragmensnek, DNS-6 fragmensnek és DNS-7 fragmensnek jelöljük. A DNS-5 fragmenst Ddel restrikciós endonukleázzal emésztve a 8. táblázat 370-554. bázisszakaszának megfelelő szekvenciájú DNS fragmenst (továbbiakban DNS-8 fragmens) izolálunk.

A DNS-8 fragmenst a DNS-4 fragmenssel kombináljuk és két kémiailag szintetizált (d) és (e) oligo-dezoxi-ribonukleotid adapterrel ligáljuk.

A ligáit DNS fragmenshez T4-DNS ligáz segítségével ligáljuk a DNS-6 fragmenst és a DNS-7 fragmenst. A kapott DNS fragmenst PL-DNS fragmensnek jelöljük.

pHPL-115 kifejező plazmidot állítunk elő az 1(1). példában leírt módon, azzal a különbséggel, hogy NYDNS fragmens helyett PL-DNS fragmenst használunk.

(2) TNF-115L előállítása

Az 1(2). példában leírt módon transzformánst (HB101/pHPL-115) állítunk elő és tenyésztjük. A kívánt polipeptidet izoláljuk és a sejtextraktumból lényegében az 1(2). példában leírt módon tisztítjuk.

(3) Az aminosav-szekvencia meghatározása

A tisztított TNF-115L és peptid-fragmenseinek aminosav szekvenciáját automatikus Edman fehérjeanalizátorral analizáljuk.

A fehéijefragmenst az alábbi körülmények között állítjuk elő. 500 mikrogramm tisztított TNF-115L-t 10 mikrogramm lizin-endopeptidázzal (EC 3. 4. 21. 50: Wako Pure Chemical Ind.) 0,1 ml össztérfogatban 4 mól karbamidot tartalmazó 5 mmól/liter Trisz-HCl pufferben (pH = 8) inkubálunk. Az inkubálást 35 °C hőmérsékleten 15 órán keresztül végezzük, majd a kapott emésztett peptideket SynChropak RP-P300 (250 x 4,6 mm,

SynChrom Inc.) oszlopon 10-50% között lineárisan változó koncentrációjú acetonitrillel, amely 0,07/ trifluorecetsavat tartalmaz, 0,1% trifluor-ecetsavban 1 mm/perc térfogatárammal 60 perc alatt HPLC segítségével izoláljuk. Az elúciós mintát az 5. ábra mutatja. Az 5. ábra 1-7 frakcióinak peptid-fragmenseit izoláljuk és az aminosav szekvenciát automatikus Edman analizátoron vizsgáljuk.

A vizsgálatok szerint a 6. számú pepiid fragmens parciális aminosav-szekvenciája

Pro-X-Tyr-Glu-Leu-De-Tyr-Leu-Gly-Gly-Val-P he-Gln-Leu-Glu.

Az „X”-szel jelölt aminosavat az analízis során nem tudtuk azonosítani.

A meghatározott aminosav szekvencia megegyezik a

10. táblázat 111-125. aminosavainak szekvenciájával.

Feltehető, hogy a TNF-115L N-terminális végétől számított 115. aminosav egy leucin-maradék.

A tisztított TNF-115L N-terminális aminosavja egy szerin-maradék, vagyis lehasadt a transzlációs iniciátor kódnak (ATG) megfelelő metionin-maradék.

3. példa

TNF-115LAN8 humán polipeptid mutáns előállítása (1) A kifejező plazmid előállítása

A 10. táblázat 9 (Lys) - 155 (Leu) aminosavainak megfelelő szekvenciával rendelkező 147 aminosavból

HU 210 118 Β álló polipeptid, továbbiakban TNF-115-LAN8, előállításához szükséges kifejező' plazmid (pHPL-147) előállítását mutatja a 6. ábra.

A pHPL-155 kifejező plazmidot a 2(1). példában leírt módon állítjuk elő, majd Clal és BstEll restrikciós endonukleázzai hasítva két DNS fragmensre vágjuk. A nagyobb fragmens a 10. táblázatbeli 380. bázis alatti szakaszt (TNF-115L C-terminális szakaszát kódoló rész), tetraciklin rezisztens gént, amplicillin rezisztens gént és trp promoter szakaszt tartalmaz, amelyet vektor DNS fragmensnek jelölünk.

A kisebb fragmens a 10. táblázatbeli 1-379. bázisnak megfelelő szekvenciát tartalmazza. Ezt a fragmenst HgiM restrikciós endonukleázzai tovább emésztve olyan DNS fragmenst kapunk, amely a 219-379. bázisnak felel meg, amelyet Hgi-DNS fragmensnek jelölünk.

Ettől külön, pHT147 kifejező plazmidot állítunk elő a 2. összehasonlító példában leírt módon, majd Clal és HgiM restrikciós endonukleázzai emésztve olyan DNS fragmenst kapunk (mintegy 200 bp nagyságú), amelynelk szekvenciája a 10. táblázatbeli 25-218. bázisnak felel meg. Ezt a DNS fragmenst ΔΝ8 DNS fragmensnek jelöltük. ΑΔΝ8 DNS fragmenst T4 DNS ligáz segítségével Hgi-DNS fragmenssel ligáljuk, majd a ligáit DNS fragmenst a fenti vektor DNS fragmenssel kombinálva kapjuk a pHPL-147 kifejező plazmidot.

(2) TNF-115LAN8 előállítása

Az 1(2). példában leírt módon transzformáns /HB101/pHPL147/ állítunk elő és tenyésztjük. A kívánt polipeptidet izoláljuk, majd a sejtextraktumból lényegében az 1(2). példában leírt módon tisztítjuk.

A tisztított TNF-115LAN8 N-terminális végén a transzlációs iniciátor kód (ATG) hatására metionin-maradék található, amelyet automatikus Edman analizátorral mutattunk ki.

4. példa

TNF-115L-Ser67 humán TNF polipeptid mutáns előállítása (1) A kifejező plazznid előállítása

A 10. táblázat 1-115. aminosavainak megfelelő szekvenciájú, ahol a 67. cisztein maradékot szerin maradék helyettesíti, és 155 aminosavból álló polipeptid, továbbiakban TNF-115 Ser67 előállításához szükséges kifejező plazmidot pHPL-Ser67 állítunk elő a 7. ábrán ábrázolt módon.

A 3. összehasonlító példa szerint előállított pHTP392 kifejező plazmidot Clal, HgiM és Hpal restrikciós endonukleázzai emésztve olyan DNS fragmenst (mintegy 226 bp nagyságú) izolálunk, amely 10. táblázat szerinti 1-218. bázisnak megfelelő szekvenciát mutat, de a 200. és 201. helyen G és C helyett C és T található. A DNS fragmenst Ser67 DNS fragmensnek jelöljük.

A Ser67 DNS fragmenst a 3(1). példa szerint előállított Hgi-DNS fragmenssel ligáljuk, a ligáit DNS fragmenst a 3(1). példa szerint előállított vektor DNS fragmenssel kombináljuk, amelynek során pHPLSer67 kifejező plazmidot kapunk.

(2) TNF-115L-Ser67 előállítása

Az 1(2). példában leírt módon transzformáns (HB101/pHPL-Ser67) állítunk elő és tenyésztjük. A kívánt polipeptidet izoláljuk és a sejt extraktumból lényegében az 1(2). példában leírt módon tisztítjuk. A transzlációs iniciátor kódnak (ATG) megfelelő metionin-származék a tisztított TNS-115L-Ser67 N-terminális végén nem mutatható ki automatikus Edman analizátor segítségével. Az' N-terminális aminosav szerinmaradék.

5. példa

TNF-115LNN8-Ser67 humán TNF polipeptid mutáns előállítása (1) A kifejező plazmid előállítása

A 10. táblázat 9-155. aminosavjának megfelelő szekvenciájú, ahol a 67. cisztein-maradékot szerin maradék helyettesíti, és 147 aminosavból álló polipeptid, továbbiakban TNF-115LAN8-Ser67, előállításához szükséges kifejező plazmid (pHPL147-S67) előállítását a 8. ábra ábrázolja.

A 4(1). összehasonlító példában leírt módon előállított pHPL-Ser67 kifejező plazmidot Clal és őííEII restrikciós endonukleázzai emésztve két fragmenst kapunk. A nagyobb DNS fragmens azonos a 3. példa szerinti vektor DNS fragmenssel. A kisebb DNS fragmenst Rsal restrikciós endonukleázzai tovább emésztve olyan DNS fragmenst izolálunk, amely a 10. táblázatbeli 161-379. bázisnak megfelelő szekvenciát tartalmazza, ezt Rsa-DNS fragmensnek jelöljük.

Ettől külön, a 3(1). példában leírt módon előállított pHPL-147 kifejező plazmidot Clal és Rsal restrikciós endonukleázzai emésztve olyan DNS fragmenst (mintegy 114 bp nagyságú) izolálunk, amely a 10. táblázatbeli 25-160. bázisnak megfelelő szekvenciát tartalmazza.

A fenti 144 bp DNS fragmenst T4 DNS ligáz segítségével Rsa-DNS fragmenssel ligáljuk és a kapott DNS fragmenst a vektor DNS fragmenssel kombinálva pHPL-147-S67 kifejező plazmidot kapunk, amely felhasználható a TNF-115LAN8-Ser67 előállítására.

(2) TNF-115LN8-Ser67 előállítása

Az 1(2). példában leírt módon transzformánst (HB101/pHBL147-S67) állítunk elő és tenyésztjük. A kívánt polipeptidet izoláljuk a sejtextraktumból és lényegében az 1(2). példában leírt módon tisztítjuk.

A transzlációs iniciátor kód (ATG) hatására a TNF115LAN8-Ser67 N-terminális végén metionin-maradék mutatható ki automatikus Edman analizátorral.

6. példa

Más humán TNF polipeptid mutánsok előállítása (19) (1) A kifejező plazmid előállítása

Az 1. táblázat 1-155. aminosavjának megfelelő szekvenciájú, amelyben az N-terminális végétől számított 32. aszparagin-maradékot más aminosav he11

HU 210 118 Β lyettesíti, például His, Asp és Ser. és 115 aminosavból álló polipeptid előállításához szükséges kifejező' plazmidot állítunk eló' az 1(1). példában leírt módon, amelynek során kémiailag szintetizált oligo-dezoxiribonukleotid adapterként az (a) adapter helyett His esetén (a’), Asp esetén (a”) és Ser esetén (a’”) adaptert alkalmazunk.

(2) Humán TNF polipeptid mutáns előállítása

A kapott kifejező' plazmidokat E. coli HB101 törzsbe vezetjük be az ismert módon és a transzformánst az 1(2). példában leírt körülmények között tenyésztjük. A kívánt polipeptidet lényegében az 1(2). példában leírt módon tisztítjuk a sejtextraktumból. Ennek során a következő' humán TNF polipeptid mutánsokat kapjuk;

TNF-32H; (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 32. Asn helyett His áll;

TNF-32D: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 32. Asn helyett Asp áll;

TNF-32S: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 32. Asn helyett Ser áll.

7. példa

Más humán TNF polipeptid mutánsok előállítása (2) (1) A kifejező plazmid előállítása

Az 1. táblázat 1-155. aminosavjainak megfelelő szekvenciájú, ahol az N-terminális végtől számított 115. helyen prolin maradék helyett más aminosav, például Ser, Asp és Gly áll, és 155 aminosavat tartalmazó polipeptid előállításához szükséges kifejező plazmidot állítunk elő a 2(1). példában leírt módon, amelynek során kémiailag szintetizált oligo-dezoxiribonukleotid adapterként a (d) adapter helyett Ser esetén (d’), Asp esetén (d”) és Gly esetén (d’”) adaptert alkalmazunk.

(2) Humán TNF polipeptid mutánsok előállítása

A kapott kifejező plazmidokat E. coli HB101 törzsbe vezetjük be az ismert módon és a transzformánsokat az 1(2). példában leírt módon tenyésztjük.

A kívánt polipeptidet lényegében az 1(2). példában leírt módon izoláljuk és tisztítjuk a sejtextraktumból. Ilymódon a következő humán TNF peptid mutánsokat kapjuk.

TNF-115S: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 115. Pro helyett Ser áll;

TNF-115D: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 115. Pro helyett Asp áll;

TNF-115G: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 115. Pro helyett Gly áll.

8. példa

TNF-117H humán TNF polipeptid mutáns előállítása (1) A kifejező plazmid előállítása

Az 1. táblázat 1-155. aminosavjainak megfelelő szekvenciájú, amelyben az N-terminális végtől számított 117. helyeken a tirozin maradék helyett más aminosav, például His áll, és 155 aminosavat tartalmazó polipeptid előállításához szükséges kifejező plazmidot állítunk elő a 2(1). példában leírt módon, amelynek során kémiailag szintetizált oligo-dezoxi-ribonukleotid adapterként az (e’) adaptert alkalmazzuk az (e) adapter helyett.

(2) TNF-117H előállítása A kifejező plazmidot ismert módon E. coli HB101 törzsbe vezetjük be, és a transzformánst az 1 (2). példában leírt módon tenyésztjük.

A kívánt polipeptidet lényegében az 1(2). példában leírt módon izoláljuk és tisztítjuk a sejtextraktumból.

9. példa

Más humán TNF polipeptid mutánsok előállítása (3) Az 1. példában leírt módon az alábbi polipeptidek előállításához szükséges kifejező plazmidokat állítunk elő. A kifejező plazmidot Escherichia coliba transzformáljuk. A transzformánsokat tenyésztjük, majd a polipeptideket izoiájuk és tisztítjuk.

TNF-16V: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 16. Alá helyett Val áll;

TNF-31T: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 16. Alá helyett Thr áll;

TNF-32G: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 32. Asn helyett Gly áll;

TNF-32L: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 32. Asn helyett Leu áll;

TNF-36V: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 36. Alá helyett Val áll;

TNF-73P: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 73. Leu helyett Pro áll;

TNF-82D: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 82. Alá helyett Asp áll;

(pl 5,3 - izoelektromos pont: 5,39)

TNF-85H: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 85. Tyr helyett His áll;

(pl 6,4 - izoelektromos pont: 6,4)

TNF-98H: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 98. Pro helyett His áll;

TNF-103P: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 103. Thr helyett Pro áll;

TNF-115T; (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 115. Pro helyett Thr áll;

TNF-115H: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 115. Pro helyett His áll;

TNF-115R: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 115. Pro helyett Arg áll;

TNF-131I: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 131. Ser helyett Ile áll;

TNF-141Y: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 141. Asp helyett Tyr áll;

TNF-143V: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 143. Alá helyett Val áll;

TNF-144K: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 144. Glu helyett Lys áll;

TNF-146E: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 146. Gly helyett Glu áll.

HU 210 118 Β

10. példa

Más humán TNF polipeptid mutánsok előállítása (4) Az 1. példában leírt módon az alábbi polipeptidek előállításához szükséges kifejező plazmidot álltunk elő. A kifejező plazmidot Escherichia coliba transzformáljuk. A transzformánsokat tenyésztjük és a polipeptidet izoláljuk. TNF-32A: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 32. Asn helyett Alá áll;

TNF-32C: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 32. Asn helyett Cys áll;

TNF-32I: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 32. Asn helyett Ile áll;

TNF-32R: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 32. Asn helyett Arg áll;

TNF-32T: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 32. Asn helyett Thr áll;

TNF-32V: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 32. Asn helyett Val áll;

TNF-34I: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 34. Leu helyett Ile áll;

TNF-48M: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 48. Val helyett Met áll;

TNF-89I: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 89. Val helyett Ile áll;

TNF-94T: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 94. Alá helyett Thr áll;

TNF-97N: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 97. Ser helyett Asn áll;

TNF-98L: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 98. Pro helyett Leu áll;

TNF-113C: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 113. Tyr helyett Cys áll;

TNF-115Q: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 115. Pro helyett Gin áll;

TNF-115A: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 115. Pro helyett Alá áll;

TNF-115F: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 115. Pro helyett Phe áll;

TNF-115N: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 115. Pro helyett Asn áll;

TNF-115Y: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 115. Pro helyett Tyr áll;

TNF-115V: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 115. Pro helyett Val áll;

TNF-115E: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 115. Pro helyett Glu áll;

TNF-115M: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 115. Pro helyett Met áll;

TNF-115I: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 115. Pro helyett Ile áll;

TNF-115W: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 115. Pro helyett Trp áll;

TNF-115K: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 115. Pro helyett Lys áll; '

TNF-118Q: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 118. Leu helyett Gin áll;

TNF-132T: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 132. Alá helyett Thr áll;

TNF-145C: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 145. Ser helyett Cys áll;

TNF-153L: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 153. Ile helyett Leu áll.

1. összehasonlító példa

Humán TNF előállításához szükséges kifejező plazmid előállítása

Humán TNF-t kódoló klónozott cDNS-t izolálunk Pstl restrikciós endonukleázzal történő emésztéssel a 155 549. számú európai közrebocsátási iratban ismertetett módon előállított pHTNE13 rekombináns plazmidból.

A klónozott cDNS-t EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztve a TNF kódoló szakasz alatti nemkódoló szakaszt kihasítjuk. A kapott DNS fragmenst (mintegy 1,1 kbp) a pBR322 plazmidból Pstl és EcoRI restrikciós endonukleázzal történő emésztéssel előállított nagyobb DNS fragmensbe építjük be és így TNF cDNS-t és tetraciklin-rezisztens gént tartalmazó rekombináns plazmidot kapunk, amelynek jele pHT113.

A pHT113 rekombináns plazmidot Aval és SaR restrikciós endonukleázzal emésztve három fragmensre (mintegy 0,8 kbp, 1,3 kbp és 2,6 kbp) hasítjuk. Az 1,3 kbp DNS fragmenst, amely tartalmazza a humán TNF-t kódoló szakasz nagy részét és a tetraciklin-rezisztens gén egy részét, izoláljuk (továbbiakban Aval- SaR fragmens. Az Aval- SaR fragmenst a kémiailag szintetizált oligodezoxi-ribonukleotid adapterrel ligáljuk. A kapott DNS fragmenst HTNF-adapter fragmensnek jelöljük.

Attól külön, a trp promoter szakaszt tartalmazó DNS fragmenst (35 bp) EcoRI és Hpál restrikciós endonukleázzal emésztve lehasítjuk a pDR720 plazmidból (P-L Biochemicals; D. R. Russell, és munkatársai: Gene, 20, 231 /1983/). Az izolált 35 bp DNS fragmens nukleotid szekvenciája a következő:

5'-AATTCCCCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTT-3' '-GGGGACAACTGTTTAATTAGTAGCTTGATCAA-5'

A 35 bp DNS fragmenst a kémiailag szintetizált (g) adapterre ligáljuk.

A kapott DNS fragmenst trp promoter fragmensnek jelöljük.

A pBR322 plazmidot EcoRI és SaR restrikciós endonukleázzal emésztjük és a nagyobb DNS fragmenst (mintegy 3,7 kbp) izoláljuk.

A 8. táblázat szerinti 79-233. aminosavnak megfelelő aminosav szekvenciájú és 155 aminosavból álló humán TNF előállításához szükséges kifejező plazmidot a fenti három DNS fragmens, a HTNF adapter fragmens, a trp promoter fragmens és a nagyobb pBR322 fragmens (mintegy 3,7 kbp) sorozatos ligálásával kapjuk a 9. ábrán ábrázolt módon.

A kapott kifejező plazmidot pHTR91 -gyei jelöljük.

2. összehasonlító példa

Módosított humán TNF polipeptid (147) előállításához szükséges kifejező plazmid előállítása A 8. táblázat szerinti 84-233. aminosavnak megfelelő szekvenciájú és 147 aminosavból álló módosított humán TNF polipeptid (továbbiakban TNF 147 polipeptid) előállításához szükséges kifejező plazmid (pHT147) előállítását a 10. ábra mutatja.

HU 210 118 Β pHTR91 rekombináns plazmidot állítunk elő az 1. összehasonlító példában leírt módon, majd Clal és Bab. restrikciós endonukleázzal emésztve négy DNS fragmensre hasítjuk. Két kisebb DNS fragmenst (mintegy 113 bp és 0,6 kbp) 5%-os poliakrilamid gél elektroforézis segítségével izolálunk. A legkisebb DNS fragmenst (113 bp) Ddel restrikciós endonukleázzal tovább emésztve két ffagmensre (47 bp és 66 bp) hasítjuk és a 47 bp DNS fragmenst izoláljuk, továbbiakban 47 bp fragmens.

A 47 bp fragmenst. két kémiailag szintetizált (h) és (i) adapterrel ligáljuk. Ezután a kapott DNS fragmenst kémiailag szintetizált (j) adapterrel ligáljuk. A ligáit DNS fragmenst 5’-DNS ífagmensnek jelöljük.

Ettől külön, trp promoter szakaszt tartalmazó DNS fragmenst (mintegy 380 bp) izolálunk a pCT-1 plazmidból (M. Ikehara és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Csi. USA 81, 5956 /1984/) Hpa és AaíII restrikciós endonukleázzal történő kettős emésztéssel.

A fenti 380 bp DNS fragmens trp promoter szakaszának bázis szekvenciáját Bennett és munkatársai ismertetik (J. Mól. Bioi. 72/, 113 /1978/). Ezt a DNS fragmenst T4 DNS ligáz segítségével 5’-DNS fragmenssel kombináljuk.

A ligáit DNS fragmenst promoter 5’-DNS fragmensnek jelöljük.

A humán TNF polipeptid C-terminális szakaszának megfelelő bázis szekvenciát tartalmazó DNS fragmenst (487 bp) Bab és Hindii! restrikciós endonukleázzal történő kettős emésztéssel lehasítjuk az 1. összehasonlító példában leírt módon előállított pHTR91 rekombináns plazmidról, majd izoláljuk.

Ezt a DNS fragmenst T4 DNS ligáz segítségével a promoter 5’-DNS fragmenssel ligáljuk. A ligáit DNS fragmenst promoter TNF(147)-DNS fragmensnek jelöljük.

Ettől külön, az 1(1). példa szerinti pBRS6 plazmid vektort AöíII és HindlII restrikciós endonukleázzal két fragmensre hasítjuk. A nagyobb DNS fragmenst (mintegy 3,6 bkp) izoláljuk, és T4 DNS ligáz segítségével a promoter TNF(147)-DNS fragmenssel ligáljuk, amelynek során a TNF(147)-polipeptid előállításához szükséges pIH 147 kifejező plazmidot kapjuk.

3. összehasonlító példa

TNF 67S humán TNF polipeptid mutáns előállításához szükséges kifejező plazmid előállítása Az 1. táblázat szerinti 1-155. aminosavnak megfelelő szekvenciájú, amelyben N-terminális végtől számított 67. cisztein-maradékot szerin-maradék helyettesíti és 115 aminosavból álló polipeptid (továbbiakban TNF-67S) előállításához szükséges kifejező plazmidot (pHTP392) a 11. ábrán ábrázolt módon állítjuk elő.

Az 1. összehasonlító példában leírt módon előállított pHTR91 rekombináns plazmidot Aval és HindlII restrikciós endonukleázzal emésztve a 8. táblázat szerinti 250. bázis alatti szakasznak megfelelő bázis szekvenciát tartalmazó, mintegy 600 bp nagyságú DNS fragmenst izolálunk. A 600 bp DNS fragmenst ΑναΠ és

HgiÁÍ restrikciós endonukleázzal tovább emésztve három DNS fragmensre (mintegy 162 bp, 41 bp és 375 bp) hasítjuk és a 162 bp DNS fragmenst és a 375 bp DNS fragmenst poliakrilamid gél elektroforézissel izoláljuk.

Ezeket a DNS fragmenseket T4 DNS ligáz segítségével a kémiailag szintetizált (k) és (1) oligo-dezoxi-ribonukleotid adapterrel ligáljuk.

A kapott DNS fragmenst ezután egymás után a kémiailag szintetizált (j) és (m) oligo-dezoxi-ribonukleotid adapterrel ligáljuk. A kapott DNS fragmenst TNF-Ser67 DNS fragmensnek jelöljük.

trp promoter szakaszt tartalmazó DNS fragmenst (mintegy 380 bp) izolálunk a pCT-1 plazmidból Hpal és Aatll restrikciós endonukleázzal történő kettős emésztéssel a 2. összehasonlító példában leírt módon.

Ezt a DNS fragmenst T4 DNS ligáz segítségével a TNF-Ser67 DNS fragmenssel kombináljuk. A ligáit DNS fragmenst promoter TNF-Ser67 DNS fragmensnek jelöljük.

Ettől külön, az 1(1). példában leírt módon előállított pBRS6 plazmid vektort Aatll és HindlII restrikciós endonukleázzal két fragmensre hasítjuk. A nagyobb DNS fragmenst (mintegy 3,6 kbp) izoláljuk és T4 DNS ligáz segítségével a promoter TNF-Ser67 DNS fragmenssel ligáivá a TNF-67S előállításához szükséges pHTP392 kifejező plazmidot kapjuk.

A plazmidot az 1(2). példában leírt módon Escherichia coliba vezetjük be és a transzformáns tenyésztővel TNF-67S-t kapunk.

4. összehasonlító példa

Az 1(1). és 1(2). példában leírt módon a következő polipeptidek előállításához szükséges kifejező plazmidot állítunk elő: A polipeptideket Escherichia Coliban állítjuk elő a kifejező plazmid segítségével.

TBF-70Y: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 70. Thr helyett Tyr áll;

TBF-99S: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 99. Cys helyett Ser áll.

5. összehasonlító példa

Az 1(1). és 1(2). példában leírt módon a következő polipeptidek előállításához szükséges kifejező plazmidot állítunk elő. A polipeptideket Escherichia coli segítségével állítjuk elő a kifejező plazmidok felhasználásával. Ezek a polipeptidek oldható polipeptidként nem extrahálhatók, vagy csak kis mennyiségben extrahálhatók. TNF-12T: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 12. Alá helyett Thr áll;

TNF-13Y: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 13. His helyett Tyr áll;

TNF-14A: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 14. Val helyett Alá áll;

TNF-17T: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 17. Asn helyett Thr áll;

TNF-24F: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 24. Leu helyett Phe áll;

TNF-26R: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 26. Trp helyett Arg áll;

HU 210 118 Β

TNF-35P: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 35. Leu helyett Pro áll;

TNF-44D: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 44. Asn helyett Asp áll;

TNF-45P: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 45. Gin helyett Pro áll;

TNF-50P: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 50. Ser helyett Pro áll;

TNF-54C: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 54. Tyr helyett Cys áll;

TNF-54H: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 54. Tyr helyett His áll;

TNF-58P: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 58. Ser helyett Pro áll;

TNF-59L: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 59. Gin helyett Leu áll;

TNF-60D: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 60. Val helyett Asn áll;

TNF-60G: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 60. Val helyett Gly áll;

TNF-62S: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 62. Phe helyett Ser áll;

TNF-93P: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 93. Ser helyett Pro áll;

TNF-121G: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 121. Val helyett Gly áll;

TNF-124Q: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 124. Leu helyett Gin áll;

TNF-128A: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 128. Asp helyett Alá áll;

TNF-128N: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 128. Asp helyett Asn áll;

TNF-135D: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 135. Asn helyett Asp áll;

TNF-138Y: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 138. Asp helyett Tyr áll;

TNF-148D: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 148. Val helyett Asp áll;

TNF-148G: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 148. Val helyett Gly áll;

TNF-150L: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 150. Phe helyett Leu áll;

TNF-151E: (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid, ahol a 151. Gly helyett Glu áll.

8. táblázat

GACCCAGG

-30 -20 -10 -1

CTCCACCCTCTCTCCCCTGGAAAGGACACC 1 10 20 30

ATGAGCACTGAAAGCATGATCCGGGACGTG

MetSerThrGluSerMetlleArgAspVal

50 60

GAGCTGGCCGAGGAGGCGCTCCCCAAGAAG

GluLeuAlaGluGluAlaLeuProLysLys

80 90 | I I

ACAGGGGGGCCCCAGGGCTCCAGGCGGTGC

ThrGlyGlyProGlnGlySerArgArgCys

100 110 120

TTGTTCCTCAGCCTCTTCTCCTTCCTGATC

LeuPheLeuSerLeuPheSerPheLeuIle

40

130 140 150

GTGGCAGGCGCCACCACGCTCTTCTGCCTG

ValAlaGlyAlaThrThrLeuPheCysLeu | 50

160 170 180

CTGCACTTTGGAGTGATCGGCCCCCAGAGG 25 LeuHisPheGlyValIleGlyProGlnAiy

190 200 210

GAAGAGTTCCCCAGGGACCTCTCTCTAATC GluGluPheProArgAspLeuSerLeuIle

220 230 240

III

AGCCCTCTGGCCCAGGCAGTCAGATCATCT

SerProLeuAlaGlnAlaValArgSerSer

250 260 270|

TCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCTGTAGCC

SerArgThrProSerAspLysProValAla

90

280 290 300

I I I

CATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCTGAGGGG

HisValValAlaAsnProGlnAlaGluGly

1

100

310 320 330

CAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGGGCCAAT 55 GlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArgAlaAsn

110

340 350 360

GCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAGCTGAGA

HU 210 118 Β

AlaLeuLeuAlaAsnGlyValGluLeuAry

120

370 380 390

GATAACCAGCTGGTGGTGCCATCAGAGGGC

AspAspGlnLeuValValProSerGluGly

130

400 410 420

CTGTACCTCATCTACTCCCAGGTCCTCTTC LeuTryLeuIleTyrSerGlnValLeuPhe

140

430 440 450

AAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACCCATGTG

LysGlyGlnGlyCysProSerThrHisVal

150

460 470 480

I I I

CTCCTCACCCACACCATCAGCCGCATCGCC

LeuLeuThrHisThrlleSerArglleAla

160

490 500 510

I I I

GTCTCCTACCAGACCAAGGTCAACCTCCTC

ValSerTyrGlnThrLysValAsnLeuLeu

170

520 530 540

I I I

TCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAGAGGGAG

SerAlalleLysSerProCysGlnArgGlu

180

550 560 570

I I I

ACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAGCCCTGG ThrProGluGlyAlaGluAlaLys ProTry

190

580 590 600

I I I

TATGAGCCCATCTATCTGGGAGGGGTCTTC

TyrGluProIleTyrLeuGlyGlyValPhe

200

610 620 630

I I I

CAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTCAGCGCT

GlnLeuGluLysGlyAspArgLeuSerAla

210

640 650 660

GAGATCAATCGGCCCGACTATCTCGACTTT

Glul 1 eAsnAr gProAspTyeLeuAspPhe

220

670 680 690

III

GCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTTGGGATC

AlaGluSerGlyGlnValTyrPheGlylle

230

700 710 720

I I I

ATTGCCCTGTGAGGAGGACGAACATCCAAC

IleAlaLeu

730 740 | |

CTTCCCAAACGCCTCCCCTGC

9. táblázat

10 20 30 | I I

TCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCT

SerSerSerArgThrProSerAspLysPro

40 50 60

GTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCT

ValAlaHisValValAlaAsnProGlnAla

I

20

80 90

GAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGG

GluGlyGlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArg

I

100 110 120

GCCTATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAG 40 AlaTyrAlaLeuLeuAlaAsnGlyValGlu

130 140 150

CTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCA LeuArgAspAsnGlnLeuValValProSer

160 170 180 | | |

GAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTC

GluGlyLeuTyrLeuIleTyrSerGlnVal

190 200 210

CTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACC LeuPheLysGlyGlnGlyCys ProSerThr

70

HU 210 118 Β

220 230 240	SerSerSerArgThrProSerAspLysPro
CATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGC HisValLeuLeuThrHisThrlleSerArg	10 40 50 60 c 1
1 80 250 260 270	□ III GTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGCT ValAlaHisValValAlaAsnProGlnAla
ATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAAC IleAlaValSerTyrGlnThrLysValAsn	20 10 70 80 90 I I I
90 280 290 300	I I I GAGGGGCAGCTCCAGTGGCTGAACCGCCGG GluGlyGlnLeuGlnTrpLeuAsnArgArg
CTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAG LeuLeuSerAlalleLysSerProCysGln 1	I 15 30 100 110 120 1 1 1
100 310 320 330	1 1 1 GCCTATGCCCTCCTGGCCAATGGCGTGGAG AlaTyrAlaLeuLeuAlaAsnGlyValGlu 20 1
AGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAG ArgGluThrProGluGlyAlaGluAlaLys	40 130 140 150
110 340 350 360	CTGAGAGATAACCAGCTGGTGGTGCCATCA 25 LeuArgAspAsnGlnLeuValValProSer
CCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGG ProTrpTyrGluProIleTyrLeuGlyGly	50 160 170 180 1 1 1
1 120 370 380 390	1 1 1 30 GAGGGCCTGTACCTCATCTACTCCCAGGTC GluGlyLeuTyrLeuIleTyrSerGlnVal
GTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTC ValPheGlnLeuGluLysGlyAspArgLeu	60 190 200 210 35 \| \| \|
130 400 410 420	CTCTTCAAGGGCCAAGGCTGCCCCTCCACC LeuPheLysGlyGlnGlyCys ProSerThr
AGCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTC SerAlaGluIleAsnArgProAspTyrLeu	70 40 220 230 240 1 1 1
140 430 440 450	CATGTGCTCCTCACCCACACCATCAGCCGC HisValLeuLeuThrHisThrlleSerArg
GACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTT AspPheAlaGluSerGlyGlnValTyrPhe	1 45 80 250 260 270 1 1 1
150 460	ATCGCCGTCTCCTACCAGACCAAGGTCAAC IleAlaValSerTyrGlnThrLysValAsn 50 \|
GGGATCATTGCCCTGTGA GlyllelleAlaLeu 1	90 280 290 300 1 1 1
155	1 1 ¹ CTCCTCTCTGCCATCAAGAGCCCCTGCCAG
10. táblázat	55 LeuLeuSerAlalleLysSerProCysGln
1 10 20 30	100 310 320 330
TCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAAGCCT	1 1 1 60 AGGGAGACCCCAGAGGGGGCTGAGGCCAAG

HU 210 118 Β

ArgGluThrProGluGlyAlaGluAlaLys

110

340 350 360

CCCTGGTATGAGCCCATCTATCTGGGAGGG

ProTrpTyrGluProIleTyrLeuGlyGly

120

370 380 390

GTCTTCCAGCTGGAGAAGGGTGACCGACTC

ValPheGlnLeuGluLysGlyAspArgLeu

130

400 410 420

AGCGCTGAGATCAATCGGCCCGACTATCTC Ser AlaGlul1eAsnArgProAspTyrLeu

140

430 440 450

GACTTTGCCGAGTCTGGGCAGGTCTACTTT

AspPheAlaGluSerGlyGlnValTyrPhe

150

460

GGGATCATTGCCCTGTGA

GlyllelleAlaLeu ***

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid vagy ebből egy vagy legfeljebb nyolc egymást követő N-terminális aminosav törlésével nyerhető polipeptid előállítására, ahol

Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Alá His Val Val Alá Asn Pro Gin Alá Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Alá Asn Alá Leu Leu Alá Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Alá Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Alá Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Alá Glu Alá Lys Ppo Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Alá Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Alá Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile Ile Alá Leu . . . [I]

az (I) aminosav szekvenciában legalább egy az alábbi helyettesítés található:

16. Alá helyett Val,

31. Alá helyett Thr,

32. Asn helyett Alá, Cys, Asp, His, Ile, Arg, Ser, Thr, Val vagy Tyr,

34. Leu helyett Ile,

36. Alá helyett Val,

48. Val helyett Met,

73. Leu helyett Pro,

82. Alá helyett Asp,

85. Tyr helyett His,

89. Val helyett Ile,

94. Alá helyett Thr,

97. Ser helyett Asn,

98. Pro helyett His vagy Leu,

103. Thr helyett Pro,

113. Tyr helyett Cys,

115. Pro helyett Leu, His, Gin, Ser, Alá, Phe, Asn, Gly, Tyr, Val, Glu, Met, Ile, Asp, Trp, Lys vagy Arg,

117. Tyr helyett His,

118. Leu helyett Gin,

131. Ser helyett Ile,

132. Alá helyett Thr,

141. Asp helyett Tyr,

143. Alá helyett Val,

144. Glu helyett Lys,

145. Ser helyett Cys,

146. Gly helyett Glu és

153. Ile helyett Leu.

azzal jellemezve, hogy a polipeptidet kódoló bázis szekvenciájú DNS-t kifejező vektorba építjük be, a kapott kifejező vektort gazdasejtbe vezetjük, azt tenyésztjük, és a kapott polipeptidet izoláljuk és kívánt esetben tisztítjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid előállítására, amelynek aminosav szekvenciájában legalább egy alábbi helyettesítés található:

31. Alá helyett Thr,

32. Asn helyett Alá, Cys, Asp, His, Ile, Arg, Ser, Thr, Val vagy Tyr,

115. Pro helyett Ser, Alá, Phe, Asn, Thr, Gly, Tyr, Val, Glu, Met, Ile, Asp, Trp, Leu vagy Lys,

117. Tyr helyett His, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet kódoló bázis szekvenciájú DNS-t egy kifejező plazmidba építjük be, a kapott kifejező vektort gazdasejtbe vezetjük, azt tenyésztjük, és a kapott polipeptidet izoláljuk és kívánt esetben tisztítjuk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) képletű aminosav szekvenciájú polipeptid előállítására, amelynek aminosav szekvenciájában legalább egy alábbi helyettesítés található:

32. Asn helyett Tyr, His, Asp vagy Ser,

115. Pro helyett Leu, Ser, Asp vagy Gly, és

117. Tyr helyett His, azzal jellemezve, hogy a polipeptidet kódoló bázis szekvenciájú DNS-t kifejező plazmidba építjük be, a kapott kifejező plazmidot Escherichia coliba vezetjük be, a kapott transzformánst tenyésztjük, és a kapott polipeptidet izoláljuk, és kívánt esetben tisztítjuk.