JP3203599B2 - 感染性タンパク質デリバリーシステム - Google Patents

感染性タンパク質デリバリーシステム

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、細胞へのタンパク質のデリバリーを行うた
めのDNA組換え技術の利用に関する。特に、本発明は、
細胞に１または複数の所望のタンパク質をデリバリーす
るための高および低力価組換えレトロウイルスベクター
の利用、またはタンパク質の存在から利益を得るであろ
う宿主生物に関する。腫瘍壊死因子、インターロイキ
ン、特にインターロイキンII、および細胞に多剤耐性を
付与するタンパク質を含む様々なタンパク質をデリバリ
ーすることができる。
この分野の調査が不適当であり且つ役立たないであろ
う所望の標的細胞への、タンパク質、特に医学的に有益
な用途を有するタンパク質のデリバリーを行うのに非常
に多数のアプローチが用いられている。しかしながら、
事実上は、現在使用されている全てのデリバリーシステ
ムが被検体生物の循環系に対する関門を貫通するという
問題を扱い、そしてタンパク質での処置に向けられる特
定細胞による取り込みの問題を扱っていないことに注目
すべきである。よって、それらの関門の通過を保証する
最も単純な形態である活性成分の溶液の静注では、タン
パク質の供給は単に血液中を循環する活性成分を生じる
だけであり、処置または致死することが望まれる細胞の
細胞質または核中への道をタンパク質が見出すことを保
証する特別な機構への用意がない。例えば抗体の利用に
より、特定の細胞を標的することができる一方、細胞膜
を通る浸透は、細胞により通常使われるかまたは適当な
処理部位が必ず細胞外であるどんな機構によっても行わ
れる。
もちろん、ウイルス粒子が通常の感染経路において外
来の核酸およびタンパク質を細胞中に導入することがで
きることは確立されている。遺伝子療法の目的で標的哺
乳類細胞中に遺伝物質を輸送するためにウイルス粒子を
使用することは主要なアプローチであり、この技術を発
展させるために現在追求されつつある。例えばMcCormic
k,D.,Bio/Technology（1985）３:689−693を参照のこ
と。加えて、Lang,R.A.ら、Cell（1985）43:531−542
は、GM−CSFを有する同様な系を使ってマウス血液細胞
系中に自己分泌増殖を誘導することができた。Langの研
究では、GM−CSFをコードするcDNAを、ウイルスLTR（lo
ng−terminal repeat）のプロモーター／エンハンサー
の調節下においてモロニーマウス白血病ウイルスベース
のベクター中に挿入し、そしてΨ２パッケージング細胞
系中にトランスフェクトせしめることにより感染性無ヘ
ルパーウイルスを生産した。生産されたGMVウイルス
は、造血細胞系においてGM−CSF生産を行うことができ
た。しかしながら、この能力は、デザインされたタンパ
ク質薬剤を無傷の生物体に輸送するのに今まで利用され
ていない。
特にレトロウイルスが外来遺伝子挿入のためのベクタ
ーとして使われており、レトロウイルスの生物学はかな
りの程度解明されている。レトロウイルスはタンパク質
エンベロープに被包された一本鎖RNAゲノムから成る。
５′から３′まで読み取るゲノムそれ自体は、キャッ
プ、５′非翻訳領域、RNAをタンパク質中にパッケージ
ングするのに必要である“Ψ”と称するRNAのセグメン
ト、即ちパッケージング部位、次いで幾つかのタンパク
質、即ちレトロウイルスコアタンパク質（gag）、DNA転
写産物から成る中間段階を促進する逆転写酵素（pol）
およびウイルスエンベロープまたはキャプシドタンパク
質（env）のコード配列、それらの後方の幾つかの３′
非翻訳配列を含む。上記３つのタンパク質は、ウイルス
ゲノムの感染性に必要であり、パッケージング部位は追
加の感染性ウイルスを生産するのに必要である。
レトロウイルスは、RNAのタンパク質コード領域の二
本鎖cDNAコピーを含む「プロウイルス」段階を経験す
る。しかしながら、この段階では、非翻訳３′および
５′領域は、このタンパク質コードcDNAのいずれかの末
端において、DNA転写を行う適当なプロモーターおよび
エンハンサー配列並びにコード部分に関して作用可能な
位置に転写終結配列を得るために変更される。
通常感染では、プロウイルス二本鎖cDNAを宿主細胞ゲ
ノム中に組み込み、そしてそこから、そのタンパク質夾
膜中にパッケージングされたRNAゲノムを含む追加のウ
イルス粒子の生産を行うことができる。この方法を行う
ためには、Ψパッケージング部位がプロウイルス中に存
在することが重要である。
変更されたウイルスが宿主細胞に感染するとウイルス
の発現系を使用するように、レトロウイルスのタンパク
質コード配列を所望のタンパク質のものに置き換えるこ
とができる別のものが見出された。米国特許第4,405,71
2号およびLang（前掲）を参照のこと。しかしながら、
これを行うために、変更ウイルスゲノムは、キャプシド
タンパク質を合成しそして外来DNAのRNA転写産物をパッ
ケージングすることができるヘルパーウイルスを必要と
した。
従って、「遺伝子療法」のために、プロウイルスDNA
形を適当なベクター中に挿入し、そしてヘルパーウイル
スの助けをかりてウイルスエンベロープ中にパッケージ
ングする。一般的概説については、Anderson,W.F.,Scie
nce（1984）226:401−409;Coffin,J.,“Genome Structu
re",RNA Tumor Viruses,第12巻、Weissら編，第２版（1
985）Cold Spring Harbor,NYを参照のこと。
遺伝子療法の研究に最もよく使われるレトロウイルス
は、マウス肉腫ウイルス（MSV）またはモロニーマウス
白血病ウイルス（MoMLV）である［Mann,R.ら、Cell（19
83）33:153−159］。それらのレトロウイルスのプロウ
イルス形を単離し、増幅のために大体標準的な細菌クロ
ーニングベクター中に挿入する。次いでパッケージング
部位と共に、調節配列を含むLTRにより隣接されたgag,p
olおよびenvをコードするmRNAを含むプロウイルス挿入
断片を操作し、タンパク質をコードするRNAを含む領域
を所望の外来遺伝子と置き換える。このDNAを、完全な
ウイルスまたはパッケージング部位のみを欠く欠陥ウイ
ルスにより感染されている宿主細胞中にトランスフェク
トせしめれば、変更プロウイルスから合成されるRNAは
別の細胞の再感染のためにウイルス粒子中にパッケージ
ングされる。これは、感染による細胞中への所望の活性
成分または薬剤をコードするDNAの導入機構を提供す
る。
これに取り掛かるには２つの方法がある。１つのアプ
ローチでは、細胞中に共存する未変更ウイルスからの感
染を有する細胞中に変更プロウイルスDNAをトランスフ
ェクトする。通常のウイルスベクターはパッケージング
された物質を合成し、そして変更プロウイルスにより生
産される或る種のmRNAは正常のウイルスRNAと同様な方
法でパッケージングされ、次いでタンパク質の生産のた
めこのmRNAを用いて標的細胞をトランスフェクトするこ
とができる。しかしながら、それらの利用されるウイル
スエンベロープと共に、「デリバリートラック」ウイル
スから分離されなければ、幾らかの数の正常のウイルス
RNAが再パッケージングされ、これがこのウイルス生産
循環の生産物により感染された宿主細胞において追加の
ウイルス感染を簡単に引き起こすであろう。
より有用なアプローチでは、所望の遺伝子を含むプロ
ウイルスクローニングベクターを使って、全くウイルス
ゲノムRNAを含まない欠陥ウイルスエンベロープ、要す
るに空のデリバリートラック、を生産するように遺伝子
修飾されている細胞をトランスフェクトする。それらの
細胞は、Ψパッケージング部位を欠く変更レトロウイル
スのプロウイルス形の組み込みにより得られ、幾つかの
そのような細胞系はそれらを必要とする全てに利用可能
である。Ψ−１またはΨ−２と命名された２つの系がMa
nn,R.ら、Cell（1983）33:153−159（前掲）に詳細に記
載されており、これはΨパッケージング部位が削除され
ているMoMLVプロウイルス挿入断片を含むプラスミドを
用いて宿主NIH 3T3繊維芽細胞をトランスフェクトせし
めることにより作製される。Ψ−２細胞は、生殖の過程
において生来のウイルスのウイルスエンベロープに対応
する細胞当たり幾つかの空のウイルスエンベロープを明
らかに生産する。それらの細胞を外来遺伝子とパッケー
ジング部位Ψの両方を含むプロウイルスDNAによりトラ
ンスフェクトせしめると、それらは外来遺伝子を含むプ
ロウイルスDNAからのmRNA転写産物を空のエンベロープ
中にパッケージングし、通常MoMLVの宿主であるいずれ
かの細胞（この場合マウス）に感染するとができる変更
ウイルスを生じる。しかしながら、この組換え変更ウイ
ルスは、それが「感染する」細胞において追加の変更
（または他の）ウイルス粒子の生産を引き起こすことが
できないという点で欠陥性であることに注目すべきであ
る。「感染された」細胞において該遺伝子がコードする
タンパク質の生産を引き起こすことができるが、追加の
ウイルス粒子が全く生産されないため、この感染は追加
の細胞に広がることができない。
本発明において医薬の調製のためにΨ−２よりもっと
有用であるのは、Cone,R.D.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.
（USA）（1984）81:6349−6353から入手できるΨ−AM系
である。それらの系は、pMAV−Ψ−と称するベクターを
用いてNIH 3T3細胞をトランスフェクトすることによっ
ても得られる。しかしながら、pMAV−Ψ−は、MoMLVのg
ag−pol配列と両向性ウイルス4070A由来のエンベロープ
配列をコードするハイブリッドである。それらの細胞系
により生産される空のキャプシドは、同時トランスフェ
クトされた変更プロウイルスDNAのRNA転写物をパッケー
ジングし、ヒト、ラットおよびマウス細胞系を認識しそ
してそれに感染するプソイドウイルスを生産する。
gag配列を有するレトロウイルスベクターはそれらの
配列を欠くウイルスよりも高い力価を示すことが最近観
察されている。Benderら、1987、J.of Virology 61
（５）:1639−1646。そのような高力価ウイルスは、遺
伝子療法のための標的である種々の細胞／組織の効率的
感染を促進する。それらのウイルスの高力価は、今まで
ウイルス粒子へのウイルスRNAのパッケージングに関与
すると考えられていなかったgas領域配列の存在に関係
し、より効率的なパッケージングに備えることができる
と考えられる。とにかく、そのような高力価ウイルスは
遺伝子療法における用途を有するだろう。
従って、該技術は、過去において、遺伝子療法または
自己分泌増殖因子の作製にのみ使用していた感受性細胞
中に遺伝子を運ぶためのシステムを提供する。それらの
方法は、必然的にレトロウイルスベクターに対する標的
細胞の生体外暴露を使用する。本発明では、常用の投与
法を使って細胞を標的するための医薬を運ぶ同様なシス
テムを集め、高度に行き止まりの局在化された「感染」
をもたらす。
本発明は、非常に珍しい医薬組成物およびウイルス感
染を受けやすい生物体の細胞に活性薬剤をデリバリーす
る方法に向けられる。１つの態様では、該医薬組成物
は、薬剤で処理しようとする目的生物体において一時的
で且つ非複製の細胞感染を引き起こすことができるエン
ベロープタンパク質を含むデリバリーウイルスから成
る。それらの医薬組成物は、血流中への注入により、ま
たは望ましくない細胞、例えば腫瘍細胞の塊中への局所
注入により投与される。あるいは、ウイルス感染を受け
やすい細胞を宿主生物体から除去し、適当なウイルスで
感染せしめ、次いで宿主生物体に戻し、そこでそれらが
所望のタンパク質薬剤を分泌することもできる。
第一の観点では、本発明は、デリバリーレトロウイル
スを含んで成るドラッグデリバリーシステムに関する。
レトロウイルスは、レトロウイルスに由来する調節配列
とΨパッケージング部位に作用可能に連結された所望の
活性タンパク質成分、および標的宿主細胞だけが「感
染」されてこの感染が他の細胞に広がらないようにウイ
ルス粒子による標的細胞の感染を成し遂げることができ
るエンベロープタンパク質をコードするRNAを含んで成
る「ゲノム」を有する。
本発明の第二の観点では、高力価のレトロウイルスド
ラッグデリバリーシステムが記載され、ここでこのシス
テムの高力価特徴はベクター中に存在するgag配列の存
在から誘導される。このベクターは、高力価のウイルス
を要求する細胞または組織、好ましくは浸潤性腫瘍リン
パ球または骨髄細胞を形質転換せしめるのに特に有用で
ある。
本発明の第三の観点では、１または複数の薬剤がデリ
バリーされそして腫瘍壊死因子、プロホルモンもしくは
ホルモンのいずれか、インターロイキン−２、または薬
剤耐性を付与するタンパク質、例えば多剤耐性タンパク
質（MDR）を含むことができる高力価レトロウイルスド
ラッグデリバリーシステムが記載される。
本発明の第四の観点は、レトロウイルスが高度に細胞
分泌性の形態の腫瘍壊死因子をコードするDNAを担持し
ている、レトロウイルスドラッグデリバリーシステムの
記載である。
本発明の第五の観点は、目的の脊椎動物宿主に１また
は複数の活性タンパク質を投与する方法であって、この
ドラッグデリバリーシステムを局所的にまたは全身的に
投与することを含んで成る方法に関する。または、上述
したように、該ドラッグデリバリーシステムはウイルス
感染を受けやすい細胞に投与することができ、この場合
感染は試験管内で起こり、そして感染された細胞が宿主
生物体に戻され、そこでそれが所望のタンパク質を生産
する。
本発明の第六の観点は、細胞の感染を引き起こすのに
高力価のレトロウイルスを必要とする脊椎動物宿主細胞
に活性タンパク質をデリバリーする方法であって、該タ
ンパク質を該細胞に、結果として脊椎動物宿主に投与す
ることを含んで成る方法に関する。
本発明の第七の観点は、上記ドラッグデリバリーシス
テムの調製に重要である材料および方法に関する。それ
らは、所望の活性タンパク質をコードするDNA配列を含
んで成るプロウイルスDNAを包含する。好ましい分子
は、癌化学療法において使用することができるもの、例
えば腫瘍壊死因子、IL−２、多剤耐性タンパク質等であ
る。それらの配列は、レトロウイルスに由来しそしてレ
トロウイルス由来のLTRにより隣接された調節配列（パ
ッケージング部位を含む）に、またはタンパク質薬剤の
発現に正常に応答できる相同の調節配列に、作用可能に
連結され得る。
別の態様では、本発明の一般的方法は、前項のプロウ
イルスDNAによりトランスフェクトされたΨ細胞、また
はそれらが生産するプソイドウイルス粒子により感染さ
れた細胞を移植し、所望のタンパク質のその場での生産
を成し遂げることにより、行うこともできる。従って、
同時トランスフェクトされたΨ細胞およびそれらが生産
する変更ウイルスにより感染された細胞は、本発明の観
点でもある医薬組成物を提供する。
本発明の更なる観点は、上述のΨパッケージング細胞
により生産されるデリバリーウイルス粒子を単離するこ
とを含んで成るその組成物の調製方法である。
図１は、γインターフェロンシグナルペプチドをコー
ドするDNA配列、および成熟TNFをコードするDNA配列の
一部分である。
図２は、pFVX TNFによりコードされる35S−メチオニ
ン標識TNFの免疫沈殿分析である。レーンＡ、トランス
フェクトされてない細胞；レーンＢ、pFVX TNFによりト
ランスフェクトされた細胞。メチオニンは25kD前駆体の
みを標識し、17kDの「成熟」形は標識しない（アミノ酸
配列から推定される）。
図３は、pFVX TNFによりコードされる35S−システイ
ン標識TNFの免疫沈殿分析である。レーンＡ、トランス
フェクトされてない細胞；レーンＢ、pFVX TNFによりト
ランスフェクトされた細胞。システインは25kD前駆体と
17kD成熟形の両方を標識する（アミノ酸配列から推定さ
れる）。
図４は、レトロウイルス感染された35S−システイン
標識3T3細胞のTNFの免疫沈澱分析である。レーンＡ、NI
H 3T3細胞由来の上清；レーンＢ、NIH 3T3細胞の細胞質
溶解物；レーンＣ、FVX TNFレトロウイルスにより感染
された細胞由来の上清（TNF−Ｖ）；およびレーンＤ、
同レトロウイルスにより感染された細胞由来の細胞質溶
解物。26kD形のTNFは細胞質溶解物中に認められず分泌
されないが、17kD「成熟」形または分泌形のTNFは細胞
質抽出物と上清の両方に認められることに注目のこと。
図５は、TNFレトロウイルスゲノムの構造および生物
活性を示す。レーンＡ、FVX TNFレトロウイルスゲノム
の制限地図；レーンＢ、pFVX TNFによりトランスフェク
トされたpsi−am細胞のプラークアッセイ。該アッセイ
は下記のようにして行った。
G418耐性コロニーを有する培養皿の上に、7.3×104細
胞/cm2の密度でL929細胞を重層した。30分後細胞が接着
したら培地を吸引し、そして10％ FCSと0.9％ Nobble寒
天が補足されたDMEMを細胞の上に重層した。18〜24時間
インキュベーション後、L929細胞の溶解帯により囲まれ
た細胞をクローニング用シリンダーにより単離し、そし
て大量培養に拡大した。
図６は、感染性ドラッグデリバリーレトロウイルスpL
MDRL6,pLTNFL6およびpLIL−2L6の作製方法を示す。
図７は、pLTNFL6プラスミドまたはpLTNFL6由来の高力
価レトロウイルスのいずれかでトランスフェクトまたは
感染された細胞の免疫沈澱分析を示す。レーンＡ、26kD
と17kDの両方のTNFをコードする高力価レトロウイルス
によりトランスフェクトされたPA317細胞；レーンＢ、
未感染のNIH 3T3細胞；レーンＣ、pLTNFL6でトランスフ
ェクトされたPA317細胞の細胞培養上清中に存在する高
力価レトロウイルスLTNFL6クローン８によりトランスフ
ェクトされたNIH 3T3細胞。
図８は、TNFレトロウイルスLTNFL6で感染された35Sシ
ステイン標識ヒト黒色腫細胞の免疫沈澱分析を示す。レ
ーンＡ、LTNFL6でトランスフェクトされたPA317細胞；
レーンＢおよびＣ、それぞれ未感染のNIH 3T3細胞およ
びpLTNFL6ウイルスにより感染されたNIH 3T3細胞；レー
ンＤおよびＥ、それぞれ未感染のヒト黒色腫細胞および
pLTNFL6ウイルスにより感染されたヒト黒色腫細胞。
図９は、pLTNFL6ウイルスにより感染された腫瘍浸潤
リンパ球（TIL）のPCR分析を示す。レーンＡ、未感染の
TIL;レーンＢおよびＣ、感染されたヒトTIL;レーンＤ、
pLTNFL6によりトランスフェクトされたPA317;レーンE,F
およびＧ、それの1:10,1:100および1:1000希釈物。
図10は、優性選択可能なネオマイシン耐性マーカーお
よびTNFをコードする２遺伝子感染性ドラッグデリバリ
ーレトロウイルスの作製方法を示す。
図11のパネルＡは26kD TNFをコードするcDNA配列の制
限地図を示し、パネルＢは26kD TNFのヒドロパシープロ
ットを示し、そしてパネルＣは該分子のDNA配列および
アミノ酸配列を示す。
図12は、26kD TNFをコードするcDNA配列の制限地図、
および様々な変異タンパク質（ミューテイン）を生産す
るために削除された該分子の領域を示す。
表Ｉは種々のTNF構成物の細胞毒性活性を示す。
I. 発明実施の形態 A.定義 本明細書で使用する時、「ドラッグデリバリーウイル
ス粒子」とは、ゲノムが１または複数の「活性成分」タ
ンパク質コード配列に作用可能に連結されたレトロウイ
ルス核酸由来の調節配列を含むRNAである、変更された
レトロウイルスについて言う。該ゲノムは、処理しよう
とする被検体と適合性であって且つ被検体中に含まれた
ゲノムにより「感染」を引き起こすことができるタンパ
ク質エンベロープ中にパッケージングされる。この場合
の感染は、細胞中への所望のRNAの進入およびタンパク
質の生産にのみ及ぶ。追加の感染性ウイルスは全く生産
されない。
「高力価ドラッグデリバリーウイルス粒子」または
「高力価レトロウイルス」とは、少なくとも105〜106cf
u/mlの力価におけるレトロウイルスの生産を可能にする
当業界において既知のベクターを言う。この種のウイル
スの例は、Benderら、前掲中に示されている。
「行き止まり」感染は、ウイルスエンベロープが細胞
質中への変更ウイルスの進入を促進し、そして含まれた
ゲノムが発現されるが、新規ウイルス粒子は生産されな
いような変更された感染形態を言う。
「調節配列」とは、所望の活性タンパク質に作用可能
に連結されたコード配列の発現による所望の活性タンパ
ク質成分の生産に必要且つ十分である、例えばプロモー
ターおよびしばしばエンハンサーを含む核酸配列を言
う。
本発明のドラッグデリバリーレトロウイルスの場合、
RNAゲノムおよびそのプロウイルス相当物もΨパッケー
ジング部位を含む。
本明細書中で使用する「腫瘍壊死因子」または「TN
F」とは、この既知の哺乳類サイトカインの生来形と組
換え形の両方について言う。THFは文献中で「カケクチ
ン」および「TNF−ａ」といった他の名称によって言及
されている。「組換えTNF」または「rTNF」とは、生来
のTNF同一のまたは実質的に同一のアミノ酸配列を有す
る組換えDNA（またはその部分）の発現により生産さ
れ、そしてTNFの試験管内および生体内生物活性を保持
しているタンパク質（ミューテインを含む）を言う。生
来のおよび組換え哺乳類TNF（ヒトTNFを含む）の単離お
よび生産は、当業界において既知である。例えば、Cars
wellら、1975,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,72:3666−3670;
Williamsonら、1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:5397
−5401;Wangら、1985,Science,228:149−154;Beutler
ら、1985,J.Exp.Med.,161:984;Beutlerら、1985,Scienc
e,229:869;Beutlerら、1985,Nature,316:552;Pennicia
ら、1984,Nature,312:724;Aggarwalら、1985,J.Biol.Ch
me.,260:2345を参照のこと。
TNFに関しては、「プロホルモン」および「成熟ホル
モン」なる用語は次の意味を有する。プロホルモンは26
kD分子について言及し、一方成熟ホルモンは76アミノ酸
リーダー配列の除去から生じる17kD分子について言う。
プロホルモンは膜結合型であり自由に循環しないことが
知られているが、成熟ホルモンは膜結合せず、自由に循
環する。TNFの定義に含まれるのは、プロホルモンと成
熟ホルモン形、更には76アミノ酸リーダー配列が除去さ
れておりそして成熟ホルモンの分泌を促進する別のリー
ダー配列により置き換えられている別の形態のTNFであ
る。多数のリーダー配列がこの機能を行うだろうが、Gr
ay,P.ら、1982,Nature,295:503により記載されたγイン
ターフェロンリーダー配列が好ましい。
「核酸配列」は、時々、DNAとRNA断片の両方を包含す
る総称的用語として本明細書で使われるだろう。本発明
の物質がレトロウイルスゲノムおよびそれらのプロウイ
ルス相当物、特に機能的配列は、RNAとDNA形の両方で存
在するだろう。対応する遺伝子座は、DNAとRNAの両方に
おけるそれらの存在について交換できるように言及され
る。というのは、通常の感染過程ではそのような機能が
実際に交換できると理解されるであろうからである。例
えば、Ψパッケージング部位は明らかにパッケージング
しようとするRNAゲノムにおいて作用可能である。しか
しながら、対応する配列はプロウイルスDNA中に存在す
る。同様に、プロモーター、エンハンサーおよびターミ
ネーター配列も、僅かに異なる形態であるが、ゲノムRN
AおよびプロウイルスDNAの両方に存在する。ウイルス生
活環の様々なファージ中でのそれらの機能の相互交換性
は当業者により理解されており、従ってむしろDNAおよ
びRNA状態に関してはそれらを言及するのに厳密でない
用語法がしばしば使用される。
本発明の医薬組成物は、Ψヘルパープロウイルスによ
り形質転換されているトランスフェクトされた中間細胞
により生産されるドラッグデリバリーウイルス粒子を含
み、従って空のエンベロープを生産する。この組成物の
調製において使われるそれらの細胞を言及する際の簡易
化のため、それらの細胞を「パッケージング」細胞と呼
称する。
得られたデリバリーウイルス粒子は、試験管内におい
て野生型細胞を感染せしめるのに使用することもでき、
例えば、標的宿主中での所望のタンパク質の生産を引き
起こすことができる能力のモデルとして使用することが
できる。それらの感染細胞は本明細書中では「テスタ
ー」細胞と呼称される。
B.一般的記載 本発明の組成物の調製における重大な中間体は、投与
しようとするタンパク質薬剤のコード配列を含むプロウ
イルスDNAベクターである。好ましい態様のタンパク質
薬剤は、腫瘍細胞に対して細胞毒性または細胞増殖抑制
性であるもの、好ましくは腫瘍壊死因子（TNF）および
インターロイキン−２（IL−２）、または効果的な化学
療法において使用できる薬剤、例えば多剤耐性タンパク
質である。そのような活性タンパク質成分をコードする
DNAは、任意の便利な源から得ることができ、そして選
択されるタンパク質に応じて、化学的に合成するか、cD
NAライブラリーから回収するか、ゲノムDNAから単離す
るか、または当業界で既知の手段により他の方法で得る
ことができる。
本発明の方法に従って投与することができるタンパク
質は、処置しようとする被検体中の感染細胞に対して所
望の効果を有する任意のタンパク質を包含する。本発明
のドラッグデリバリーシステムの利点は、特にタンパク
質が標的細胞の細胞質中で作用する時に体験される。例
えば、腫瘍壊死因子（TNF）は腫瘍細胞を選択的に殺す
ことができるが、その効果を発揮するのに細胞膜を通過
する必要がある。他のタンパク質、例えばリボトキシン
および種々のコロニー刺激因子もまた細胞内で作用す
る。
２つの遺伝子を発現するように作製されたレトロウイ
ルスベクターが予防的または治療的価値を有する２つの
タンパク質を含むか、または１遺伝子が２つの遺伝子構
成物によりトランスフェクトされた細胞の同定を促進す
るであろう優性選択可能マーカーを発現できることが適
当であろう。適当なマーカーの例は、ネオマイシン遺伝
子配列の存在により細胞に付与されるG418に対する耐性
であろう。
本発明のシステムは、その機能が標的細胞の外側で行
われるか、または細胞表面上のレセプターへの結合によ
り機能する物質に適用できる。しかしながら、この場合
には、ドラッグデリバリーウイルス粒子は、ドラッグデ
リバリーウイルス粒子より感染されたテスター細胞また
はトランスフェクトされたパッケージング細胞の移植片
として間接的に投与される。例えば、それ自身血流中で
血液中の可溶性酵素に対して直接に作用する組織プラス
ミノーゲン活性化因子またはウロキナーゼを、それらの
移植細胞によりその場で生産することができる。
外来タンパク質をコードするDNAは当業界において入
手可能であり、そして所望であれば便利な操作のために
リンカー配列とひとまとめにして得ることができる。該
デリバリーシステムの性質は、プロウイルスによりトラ
ンスフェクトされた環境中ではイントロンがプロセシン
グされ得るので、ゲノム配列とcDNA配列の両方を使用で
きるようなものである。タンパク質薬剤は、所望するタ
ンパク質の任意の形態、例えば活性形、成熟形、融合タ
ンパク質、プレタンパク質またはプレプロタンパク質を
指定するようにデリバリーウイルス粒子中でコードされ
得る。下記に示す実施例では、TNF,IL−２またはMDRタ
ンパク質をコードするcDNAクローンがコード配列の源と
して使用される。しかしながら、これは例示的にすぎ
ず、他の任意の所望のコード配列も使用することができ
る。更に、上記分子のうちの１つがG418耐性といった選
択可能マーカーと共に発現される２遺伝子ウイルスを作
製することができる。
ウイルス伝達ベクターは、レトロウイルス、例えば常
用されるマウス肉腫ウイルス（MSV）、モロニーマウス
白血病ウイルス（MoMLV）、ハーベイ肉腫ウイルス（HaS
V）または種々の他のレトロウイルスの適当なプロウイ
ルス形の単離によって得られる。幾つかの標的細胞／組
織については、それらが感染状態になるのに高力価のレ
トロウイルスを要求することが知られている。そのよう
な場合、好ましいレトロウイルスはgag配列を含むも
の、いわゆるgag＋ベクターである。そのようなベクタ
ーの例は、Benderら、前掲；およびMillerら、Current
Communications in Molecular Biology----Viral Vetor
s,122頁,Cold Spring Harbor（GluzmanおよびHughes編,
1988）により記載されたものである。ウイルス粒子自体
に関連づけられるタンパク質が構成物中に欠失している
ので、ヒトにおいて病気を引き起こす感染性レトロウイ
ルス、例えば肝炎ウイルス、HTLV IおよびLAV Iに由来
する成分でも使うことができる。しかし、もちろん、処
置しようとする被検体の中で心理的抵抗の可能性がある
そのような物質を使用することは必要でない。更に、感
染性宿主範囲は、組換えプロウイルスまたはパッケージ
ングΨ型細胞形のいずれかに外来ウイルスエンベロープ
糖タンパク質遺伝子（即ち、狂犬病、VSV等）を導入す
ることにより変えることができる。
選択されたレトロウイルスのプロウイルス形は、該ウ
イルスを組織培養において増殖させ、プロウイルスDNA
を単離し、このプロウイルスDNAをλファージクローニ
ングベクター中にクローニングし、そしてファージが組
み込まれる感受性細菌宿主中で組換えベクターを増殖さ
せることにより得られる。プロウイルスDNAを切り出
し、再単離する。次いでプロウイルスDNAに適当なリン
カーを提供し、そして増幅のため細菌クローニングベク
ターに挿入する。適当な細菌クローニングベクターとし
ては、pBR322,pMLまたはpUCシリーズのベクターが挙げ
られる。それらは、制限部位を削除または変更するなど
のために修飾することが必要なことがある。クローニン
グベクターを制限し、次いでリンカーにより組み立てら
れたプロウイルスDNAの挿入断片を提供する。
生来のプロウイルスDNA挿入断片は、LTR（long termi
nal repeat）配列により隣接されたウイルスタンパク質
コード配列を含み、該LTRの一方の近位にパッケージン
グ部位を含む。パッケージング部位と他方のLTRとの間
のタンパク質コード配列を適当な制限および／またはエ
ンドヌクレアーゼ消化により削除し、そしてリンカーま
たはポリリンカー配列により置き換える。適当な部位が
既に介在領域中に入手可能であってもよく、または入手
できない場合には、当業者で公知であるような部位特異
的突然変異誘発を使って得ることができる。
増幅後、変更プロウイルスを含むベクターを適当な制
限酵素で開裂せしめ、所望のコード配列の挿入のために
該ベクターを開環させる。パッケージング部位以外の調
節配列はLTR中に存在するので、リンカー中への所望の
タンパク質薬剤コード配列の挿入は、それを該調節によ
り作用可能な連鎖中に置く。得られた変更ウイルス粒子
はウイルスタンパク質の代わりに所望のタンパク質の発
現系になるが、この変更ウイルスゲノムを感染性である
ようにするパッケージング部位をまだ保持している。
それらのドラッグデリバリープロウイルスDNAを公知
技術により増幅し、単離し、Ψパッケージング細胞にト
ランスフェクト用DNAの源を提供する。
所望であれば、変更ウイルス粒子、高または低力価ウ
イルス粒子中の挿入コード配列は、マーカー配列を更に
含むことができる。２遺伝子レトロウイルスベクターを
使用する場合、１遺伝子はネオマイシン耐性をコード
し、従ってG418に対する耐性を付与することができる。
挿入配列の発現に有意な減少が観察される場合、適当な
マーカー、最も適切にはG418耐性マーカーを含むベクタ
ーによる形質転換と同時にΨパッケージング細胞のトラ
ンスフェクションを行うことができる。もちろん、任意
の適当なマーカーを使うことができ、そのようなマーカ
ーとしては、例えば、ミコフェノール酸に対する耐性を
付与するEco gptおよびメトトレキセート耐性を付与す
るDHFRが挙げられる。
変更プロウイルス粒子は、必要ならマーカープラスミ
ドと一緒に、標準的トランスフェクション技術、例えば
リン酸カルシウム沈澱を使って、受容体パッケージング
細胞中にトランスフェクトされる。形質転換体はそれら
の特定細胞種に適当な培養において増殖される。下記に
例示されるΨ−3T3細胞は、野生型3T3細胞に通常使われ
る条件下で培養される。もちろん、好結果の形質転換体
を選択するために培地に選択的成分、例えばG418を含め
てもよい。
適宜培地または細胞溶解物中のタンパク質濃度を評価
することにより、トランスフェクトされたパッケージン
グ細胞が変更ウイルス粒子中の挿入コード断片によりコ
ードされるタンパク質を好結果に生産することを示すこ
とができる。
パッケージングされた組換えウイルス粒子を得るため
に、パッケージング細胞からの上清を、例えば0.45μｍ
フィルターを使って、細胞から分離する。例えばウイル
ス粒子を収穫するための高速遠心によって濾液からウイ
ルスが得られ、または濾液それ自体が使われる。濃縮さ
れたウイルス粒子または濾液を医薬組成物として製剤化
する。
更に、ウイルス粒子調製物は、空のウイルス夾膜を全
く生産しないテスター細胞系、例えばパッケージング細
胞の野生型相当物、またはウイルスによる感染に対し
て、好ましくは組換えウイルス粒子により生産されるタ
ンパク質に対しても感受性である任意の細胞系を使うこ
とにより、標的細胞へのドラッグデリバリーを成し遂げ
る適確性について評価することができる。このテスター
細胞により生産される所望のタンパク質の量を評価する
ことができ、そして適応な細胞の場合には、この評価は
細胞に対する該タンパク質の直接効果によることができ
る。
パッケージング細胞とテスター細胞の両方を、タンパ
ク質薬剤の源をその場で提供する移植片として使用する
こともできる。
LTRがプロモーターとエンハンサーを包含するレトロ
ウイルスの転写調節要素のほとんどを含むことに注目す
ることが重要である。よって、挿入されたタンパク質薬
剤DNA配列がウイルス調節要素の支配下で転写され得る
が、ウイルス調節要素が特定のタンパク質薬剤の転写を
調節するプロモーター／エンハンサーにより置き換えら
れていうウイルスベクターも本発明に包含するつもりで
ある。
薬剤をコードするDNA配列がそれらの通常の調節要素
の支配下にある種々のタンパク質薬剤の発現を得るため
の少なくとも２つの基本的アプローチが存在する。
第一のアプローチは、レトロウイルスの３′レトロウ
イルスLTR中のプロモーター、エンハンサーおよびプロ
モーター、またはエンハンサーを、異種ウイルスまたは
細胞の遺伝子由来のプロモーター、エンハンサーおよび
プロモーター、またはエンハンサーと置換することを伴
う。トランスフェクションすると、そのようなプロウイ
ルスは野生型レトロウイルスLTRから自分自身を発現す
るだろう。レトロウイルス生活環の性質によるウイルス
救援後、３′LTR中の異種発現要素の置換は新たに組み
込まれたプロウイルスの５′LTRにおいて不滅化される
ようになる。よって組換えレトロウイルス中に挿入され
た外因性遺伝子の発現は、組換えプロウイルスの３′LT
R中に独創的に存する異種発現要素から誘導される。
第二のアプローチは、制限エンドヌクレアーゼ消化に
よるかまたは部位特異的突然変異誘発の適用を通した、
３′LTR中に存するエンハンサーとプロモーターまたは
単にプロモーターの削除を伴う。そのようなベクターが
感染性レトロウイルスとして救援される時、得られた感
染性プロウイルスは５′と３′LTRの両方の中の発現要
素を欠く。この場合、発現不全は、組換えプロウイルス
のLTRの間の、発現させようとする遺伝子のすぐ５′側
への、外因性プロモーター、またはプロモーター／エン
ハンサー組合せ、またはプロモーター／エンハンサー組
合せ＋追加のシス作用性要素（例えばHTVL−１のU5要
素）の挿入により補完される。それらの状況下では、感
染および遺伝子伝達後、伝達された遺伝子は新たに近位
のプロモーターにより課される制御調節を受ける。LTR
中の発現要素の欠失は、LTRプロモーターからの妨害が
全くないことを保証する。
上記のアプローチを使って、対応するタンパク質の転
写を指図する、IL−２プロモーターまたはIL−２レセプ
タープロモーターといった様々なプロモーターを有する
レトロウイルスを生産することができる。
C.効用および投与 本発明のドラッグデリバリーシステムは、それらがタ
ンパク質薬剤の効果を及ぼすことができる細胞中にタン
パク質薬剤を伝達することの最終結果において効果的で
ある。伝達はウイルス感染によって起こるため、単にド
ラッグデリバリーウイルス粒子を標的細胞と並置するこ
とが必要であるに過ぎない。標的細胞が、例えば固形腫
瘍中に局在化する場合には、本発明の組成物を直接固形
腫瘍中に注入することができる。しかし、白血病のよう
に細胞が広く分散している場合または例えば赤血球細胞
もしくは骨髄細胞を標的しようとする場合、全身的静注
が要求される。
あるいは、細胞を試験管内で感染させ、そしてタンパ
ク質薬剤を発現する宿主生物体に感染細胞を戻すことに
より、薬剤をデリバリーすることができる。この方法
は、骨髄細胞および皮膚繊維芽細胞といった特定のタイ
プの細胞を必要とする遺伝子療法に特に有用である。
本明細書に記載のドラッグデリバリーシステムの注目
に値する適用は、腫瘍浸潤リンパ球、またはタンパク質
薬剤を腫瘍細胞に運搬するビヒクルとして作用する他の
機能的に類似した細胞タイプの感染を伴うだろう。好ま
しくは、タンパク質薬剤はIL−２またはTNFである。膜
結合型であり且つ細胞毒性であるTNFのミューテインが
最も好ましい。例えば、下記に記載されるように、プロ
ホルモンのTNF欠失ミューテインTNFΔ（１→12）および
TNFΔ（１＋12）は経膜タンパク質であり、よって細胞
表面に堅固に付着される。両方とも細胞毒性でる。該ミ
ューテインのいずれかを腫瘍浸潤リンパ球（TIL）中に
発現させることができる。選択される細胞がTILである
場合、それらの内因性腫瘍細胞毒性活性に加えてTNFミ
ューテインに起因する細胞毒性のため、それらは高度に
細胞毒性であろう。この方式において使用すると、TNF
ミューテインΔ（１→12）に関連する追加の利点は、そ
れが膜結合型でありそして細胞外環境中に放出されない
ため、非特異的な細胞毒性がほとんどまたは全くないと
いうことであると認識されよう。同様な利点がΔ（１＋
12）ミューテインに関係づけられる。該ミューテインか
ら約17kDの分子が遊離されるけれども、それは非細胞毒
性である。
ウイルス粒子は、当業界において既知であるようにし
て、等張食塩溶液または他の適当な医薬賦形剤中への懸
濁により、薬剤の投与に適当な典型的方法での注射のた
めに調製される。
パッケージング細胞またはテスター細胞の移植は、そ
れらを適当な適合性製剤、例えば生理的食塩水中に製剤
化し、そしてそれらを所望の場所に注入することにより
行われる。該細胞は、封入技術を使って製剤化すること
もできる。（例えば、米国特許第4,391,309号を参照の
こと）。
D.標準法 使用する宿主細胞に依存して、そのような細胞に適当
な標準的技術を使って形質転換が行われる。Cohen,S.
N.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）（1972）69:2110により
記載された塩化カルシウムを使ったカルシウム処理、ま
たはManiatisら、Molecular Cloning A Laboratory Man
nual（1982）Cold Spring Harbor Press,p.254に記載の
PdCl2法は、原核細胞または実質的な細胞壁を含む他の
細胞に使用する。そのような細胞壁を持たない哺乳類細
胞には、GrahamおよびVan der Eb,Virology,1978,52:54
6のリン酸カルシウム沈澱法が好ましい。
所望のコード配列および調節配列を含む適当なベクタ
ーの作製は、当業界で公知である標準的連結および制限
技術を使用する。単離したプラスミド、DNA配列または
合成オリゴヌクレオチドを所望の形で開裂し、操作し、
そして再連結する。
部位特異的突然変異誘発は、当業界において一般に知
られている条件下で１または複数の適当な制限酵素で処
理することによって行われ、その詳細はそれらの市販の
制限酵素の製造業者により指定されている。例えば、Ne
w England Biolabsの商品カタログを参照のこと。一般
に、約１μｇのプラスミドまたはDNA配列を約20μの
緩衝液中で１単位の酵素により開裂させる。本明細書中
の実施例では、典型的には、DNA配列の完全消化を保証
するために過剰の制限酵素を使用する。37℃で約１時間
〜２時間のインキュベーション時間が実行可能である
が、変更を行うことができる。各インキュベーション
後、フェノール／クロロホルム抽出によりタンパク質を
除去し、この後エーテル抽出してもよく、そしてエタノ
ール沈澱により水性画分から核酸を回収し、そして10mM
Tris,1mM EDTA,pH7.5中に再懸濁する。所望であれば、
標準技術を使ったポリアクリルアミドゲルまたはアガロ
ースゲル電気泳動により開裂断片のサイズ分離を行うこ
ともできる。サイズ分離の一般的記載はMethods in Enz
ymology,1980,65:499−560中に見つかる。
制限開裂断片は、４種のデオキシヌクレオチド三リン
酸（dNTP）の存在下での大腸菌（E.coli）DNAポリメラ
ーゼＩの大断片（クレノウ断片）での処理により、20〜
25℃において約15〜25分間のインキュベーション時間を
使って50mMTris,pH7.6,50mM NaCl,6mM MgCl2,6mM DTTお
よび５〜10μM dNTP中で平滑末端にすることができる。
クレノウ断片は５′粘着末端をフィルインするが、４種
のdNTPが存在しても３′一本鎖を後ろに突き出す。所望
であれば、粘着末端の性質により要求される限定内でdN
TPのうちの１つまたは選択したdNTPのみを供給すること
により、選択的修復を行うことができる。クレノウでの
処理後、混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、
そしてエタノール沈澱後、Sephadex G−50スピンカラム
に流す。適当な条件下でのS1ヌクレアーゼ処理は、任意
の一本鎖部分の加水分解をもたらす。
合成オリゴヌクレオチドは、Matteucciら、1981,J.A
m.Chem.Soc.,103:3185のトリエステル法により、または
市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を使って調製さ
れる。アニーリング前のまたは標識のための一本鎖のキ
ナーゼ処理は、過剰の、例えば0.1ナノモルの基質に対
して約10単位のポリヌクレオチドキナーゼを使って、50
mM Tris,pH7.6,10mM MgCl2,5mMジチオトレイトール,1〜
2mM ATP,1.7ピコモルのγ32P−ATP（2.9mCi/ミリモ
ル）,0.1mMスペルミジン,0.1mM EDTAの存在下で達成さ
れる。
連結は、次のの標準条件および温度のもとで15〜30λ
容量で行われる:20mM Tris−Cl,pH7.5,10mM MgCl2,5mM
DTT,33μg/mlのBSA,10mM〜50mM NaCl,および40μM ATP,
0.01〜0.02（Weii）単位のT4 DNAリガーゼ,4℃（「粘着
末端」連結について）または1mM ATP,0.3〜0.6（Weii）
単位のT4 DNAリガーゼ,14℃（「平滑末端」連結につい
て）のいずれかである。分子間「粘着末端」連結は、通
常33〜100μg/mlの全DNA濃度（５〜100nMの全末端濃
度）において行われる。分子間平滑末端連結（通常は10
〜30倍モル過剰のリンカーを使用する）は１μＭの全末
端濃度において行われる。
「ベクター断片」を使うベクター作製では、５′リン
酸を除去しそしてベクターの再連結を防ぐために普通は
ベクター断片を細菌アルカリホスファターゼ（BAP）で
処理するBAP消化は、pH8において約150mM Tris中でNa+
とMg2+の存在下で、ベクター１μｇあたり約１単位のBA
Pを使って60℃にて約１時間行う。核酸断片を回収する
ため、調製物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エ
タノール沈澱し、そしてSephadex G−50スピンカラムへ
の適用により脱塩する。あるいは、所望でない断片の追
加の制限酵素消化によって二重消化されているベクター
において再連結を防ぐことができる。
配列の変更を必要とするcDNAまたはゲノムDNA由来の
ベクターの部分については、部位特異的プライマー指令
突然変異誘発が使用される。これは、所望の変異を表す
限定された不整合以外は突然変異誘発せしめようとする
一本鎖ファージDNAに相補的な合成プライマーオリゴヌ
クレオチドを使って行われる。簡単に言えば、合成オリ
ゴヌクレオチドを、ファージに相補的な鎖の合成を指令
するプライマーとして使用し、そして得られた二本鎖DN
Aを用いて、ファージを含む宿主細菌を形質転換せしめ
る。形質転換された細菌の培養物を表面寒天プレートに
塗布し、ファージを含む単一細胞からプラーク形成させ
る。
理論的には、新規プラークの50％が、一本鎖の変異形
としてファージを含み、50℃が元の配列を有するだろ
う。得られたプラークを、正確な整合のハイブリダイゼ
ーションを可能にするが元の鎖との不整合がハイブリダ
イゼーションを妨害するのに充分であるような温度にお
いて、リン酸化された合成プライマーとハイブリダイズ
せしめる。プローブとハイブリダイズするプラークを選
択し、培養し、そしてDNAを回収する。部位特異的突然
変異方法の詳細は、特定の実施例において後述される。
更に詳しくは、突然変異誘発は、当業界で既知の多数
の方法を使って行うことができる。それらの技術はSmit
h,1985,Annual Review of Genetics,19:423に記載され
ており、そして該技術の幾つかの変形がMethods in Enz
ymology,154，パートE,WuおよびGrossman編（1987）,1
7,18,19および20章に記載されている。好ましい方法
は、ギャップ含有二本鎖部位特異的突然変異誘発法の変
形である。一般的方法はKramerら、上記のMethods in E
nzymologyの17章に記載されている。
常用のM13突然変異誘発法は、突然変異させようとす
るクローニングされた標的コード配列を有する一本鎖M1
3 DNAに、短い合成オリゴヌクレオチドをアニーリング
することを伴う。オリゴヌクレオチドは標的細胞に安全
ではないがほとんど相補的であり、少なくとも１つの誤
対合ヌクレオチドを含む。アニーリング反応後、一本鎖
DNAの残りの部分をフィルインし、変異の発現に備えて
適当な宿主細胞中にトランスフェクトできるヘテロ二本
鎖DNAを提供しなければならない。ギャップ含有二本鎖
法では、標的領域と一本鎖M13 DNAの残部が暴露されて
いる従来法とは異なり、標的領域のみが暴露されている
部分DNA二本鎖が作製される。従来法と同様に、短いオ
リゴヌクレオチドを標的領域にアニールし、伸長し、そ
して連結せしめてヘテロ二本鎖を生成する。しかしなが
ら、ギャップ含有二本鎖法では一本鎖DNAの小部分のみ
がハイブリダイゼーションに利用できるので、オリゴヌ
クレオチドはM13ゲノム中の望ましくない部位にはアニ
ールしない。更にこの方法は、標的領域の片側のDNAの
ごく小さい領域のみをフィルインすればよいので、ヘテ
ロ二本鎖の形成中にほとんど誤りを導入しないという追
加の利点を有する。
更に詳しくは、ギャップ含有二重鎖法は、例えば終止
コドンアンバー変異といった適当な選択可能マーカーを
担持する適当なM13ファージ中に標的DNA配列をクローニ
ングすることを伴う。終止コドンアンバー変異は、該変
異の作用を抑制することができない宿主細胞中での陰性
選択に備える。好ましくは、該ファージは、重大なファ
ージ遺伝子中に２つのアンバーコドンを含むM13mp9であ
る。26kD TNFをコードする配列をM13mp9アンバー＋中に
クローニングし、そして標準法を使ってそこから一本鎖
DNAを調製する。次に、アンバーコドンを欠く遺伝子操
作されたM13誘導体であるM13 GAPからの二本鎖複製可能
形DNAをHinc II制限酵素で開裂させる。M13 GAPの塩基
配列はM13mp18に類似しているが、塩基対6172と6323の
間の配列およびアンバーコドンの両方を欠く。この欠失
はM13mpシリーズの多重クローニング部位に隣接し、ユ
ニークHinc II部位を生成する。ギャップ含有二本鎖DNA
は、標準的DNA/DNAハイブリダイゼーション技術を使っ
て形成され、そしてアンバーコドンを有する一本鎖DNA
およびアンバーコドンとTNFコード配列の両方を欠くHin
c II消化M13 GAPからの第二鎖DNAから成る。暴露される
ギャップ含有二本鎖の部分のみが26kD TNF標的配列であ
る。所望のオリゴヌクレオチドをギャップ含有二本鎖DN
Aにアニールさせ、そして残ったギャップをDNAポリメラ
ーゼでフィルインし、DNAリガーゼを使ってニックを塞
いでヘテロ二本鎖を生ぜしめる。このヘテロ二本鎖を好
ましくは誤対合修復不全宿主中にトランスフェクトし、
そして混合ファージを生産させる。当業界で公知のよう
にして、プラスミドの作製方法に依存して、アンピシリ
ン、テトラサイクリンもしくは他の抗生物質耐性により
または他のマーカーを使って、好結果の形質転換体を選
択する。次いで所望によりクロラムフェニコール増幅
（Clewell,D.B.,1972,J.Bacteriol.,110:667）の後に、
Clewell,D.B.ら、1969,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），6
9:1159の方法に従って、形質転換体からプラスミドを調
製する。単離したDNAは、Messingら、1981,Nucleic Aci
ds.Res.,９:309により更に記載されているようなSange
r,F.ら、1977,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA），74:5463の
ジデオキシ法により、またはMaxamら、1980,Methods in
Enzymology,65:499の方法により、制限分析および／ま
たは配列決定される。
本明細書中でクローニングおよび発現に使われる宿主
株は次のものである。
クローニングおよび配列決定は、大腸菌HB101株を宿
主として使用した。
M13ファージ組換えには、ファージ感染を受けやすい
大腸菌株、例えば大腸菌K12 DG98株を使用する。DG98株
は1984年７月13日にATCCに寄託されており、受託番号19
65を有する。
E.実施例 次の実施例は本発明の例示としてここに提供され、本
発明を限定するものと解釈してはならない。
実施例１ TNFを含む変更プロウイルス粒子の調製 ヒトTNFのコード配列は、1987年６月30日発行の米国
特許第4,677,063号（これは参考として本明細書中に組
み込まれる）に詳細に記載されたcDNAクローンであるク
ローンpB11から得た。それは米国特許第4,677,063号に
示されたクローンpB11から誘導することもできる。この
クローンはまた、1984年10月15日にATCCにATCC＃39894
のもとに寄託されている。
同じく上記刊行物に記載されておりそして1984年11月
８日にATCC＃3988で寄託されているプラスミドpAW711
も、TNFの源として使用することができる。
パッケージング部位と共にプロウイルス形のレトロウ
イルス調節配列を含むベクターは、pEVXの誘導体であ
る。pEVXは、pML（Kriegler,M.ら、1984,Cell,38:483−
491）のEcoR I部位に挿入されたMoMLV由来のLTRおよび
Ψ部位を含む。pEVXのSma I/Bal Iセグメントを、５′L
TRの３′部分とHaSVゲノムの５′部分を含むハーベイ肉
腫ウイルス（HaSV）由来の978bp Sma I/Sma I断片で置
き換えることにより変更してスプライス部位を削除し
た。得られた構成物をSst IIで完全消化しそしてBgl II
で部分消化し、必須でないHaSV領域を欠く669bp断片を
得た。この断片をゲル精製し、Sma I/Bal I消化されたp
EVXに再連結せしめた。得られたベクターpFVXMは、MoML
V由来のLTR断片の間にポリリンカーを含み、そしてこの
ウイルス由来のパッケージング部位を含むが、上流LTR
中のスプライス供与部位を欠く。pFVXMはアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）に受託番号
67,103のもとに寄託されている。
pFVXMベクターを大腸菌（E.coli）HB101株中で増幅
し、プラスミドDNAを単離する。pB11を同様に大腸菌
（E.coli）HB101株中で増幅し、プラスミドDNAとして再
び単離する。これら２つのプラスミドDNA調製物をPst I
で処理する（pB11からTNFコード領域を切除するため、
およびpFVXMをポリリンカー領域中で開環させるた
め）。標準条件を使って断片の連結を行い、連結混合物
を用いて大腸菌HB101をAmpRに形質転換せしめた。再び
プラスミドDNAを単離し、制限分析により挿入断片の正
しい方向を確かめた。正しい方向のTNFコード配列を有
する組換えプラスミドをpFVXMTNFと命名し、これを用い
て後述のようにして適当なパッケージング細胞をトラン
スフェクトせしめる。１つのそのようなベクターpFVXMT
NF6はより詳細に下記に記載される。
同様にして、例えば、pFVXMをPst Iで消化し、リシン
Ａ毒素、CSF−１およびウロキナーゼをコードするDNA配
列（各々必要な時には適当なPst Iリンカーが提供され
る）に連結することができる。更に望ましいのは、白血
球インターフェロン、好ましくはWeckらのNucleic Acid
s Res.,1981,９（22）:6153およびGoeddel,D.N.N.への
米国特許第4,678,751号に記載されたようなハイブリッ
ドインターフェロン分子をコードするベクターである。
特に好ましいのは、LeIF−AD（Bgt）と命名されたハイ
ブリッドインターフェロンである。得られたベクター
を、それぞれpFVXMRA,pFVXMCSF,pFVXMUKおよびpFVXMIF
と命名する。リシンＡ毒素をコードするDNA配列はヨー
ロッパ特許出願第237,676号に記載されており、一方mCS
FおよびウロキナーゼをコードするcDNA配列はそれぞれ
米国特許第4,847,201号、第4,868,119号およびEPO 92,1
82号、並びにJacobsら、1986,DNA,４（２）:139−146に
記載されている。
pFXVMTNF中に存在するTNF配列は、部分的に欠失され
たプロホルモンに関係する76アミノ酸リーダー配列を有
するか、または成熟形のTNFを大量生産する別のリーダ
ー配列に置き換えることができることは認識されるだろ
う。例えば、この構成物は、pFXVMTNFからTNF Pst I断
片を取り出し、そしてそれを適当なM13ベクター中にサ
ブクローニングした後、適当なオリゴヌクレオチドを用
いて突然変異誘発せしめることにより、作製することが
できる。
26kD TNFをコードする断片をpFXVMTNFから切り出し、
M13mp19アンバー中へのサブクローニング後、γ−イン
ターフェロンシグナルペプチドをコードする下記のオリ
ゴヌクレオチド（Cetus番号CP383）を使って突然変異誘
発せしめた。
γ−インターフェロンシグナルペプチドを含む変異原性
構成物をM13ベクターから切り出し、pUC.FVXMΔHIIIと
称するpFVXMの誘導体中にクローニングし、pUC.FVXMΔH
III TNFγsigを作製した。後者の構成物は受託番号6812
1のもとにアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョンに寄託されており、そして更にシータス・マスター
・カルチャー・コレクションに寄託され3688を与えられ
ている。γ−インターフェロンシグナルペプチドを有す
る成熟形のTNFをコードするDNAを図１に示す。17kD分子
をコードするDNAの一部のみが描写されている。下記は1
7kD TNFに連結したγ−インターフェロンシグナルペプ
チドを示す。
pUC.FVXMΔHIIIは、それが５′−LTRの上流の1110塩
基対を欠くこと以外はpFVXMと同じである。pUC.FVXMΔH
III TNFγsigによりトランスフェクトされたNIH−3T3細
胞から得られた溶解物および上清の両方の細胞抽出物の
免疫沈澱後のSDS−PAGEは、検出可能な26kD TNFを全く
示さないが、かなりの量の17kD分子を示した。
17kDまたは26kD TNFに加えて、それらの分子のミュー
テインをコードするレトロウイルスを作製することがで
きる。好ましいミューテインはTNFを膜結合型の細胞毒
性形態に維持するものである。より好ましくは、成熟形
のTNF（即ち17kDTNF）の最初の12アミノ酸を欠失してい
るミューテインTNFΔ（１→12）、または最初と12番目
のアミノ酸を欠失しているミューテインTNFΔ（１＋1
2）である。それらの２つのミューテインとは異なり、T
NFΔ（１＋13）は膜結合型であるが細胞毒性ではない。
従って、それは下記に与えられる幾つかの実施例におい
て対照として使われる。アミノ酸のナンバリングは、図
11中に示されたTNFのプロホルモン形のアミノ酸配列に
対応する。該ミューテインは、標準的な突然変異誘発技
術および突然変異誘発を行うのに下記のオリゴヌクレオ
チドを使って生成することができる。
簡単に言えば、次の反応溶液と条件を使って上記オリ
ゴヌクレオチドをリン酸化する:3μの10×KB緩衝液、
３λの10mM rATP（0.1M rATP原液の1:10希釈液）、２λ
の変異原性オリゴヌクレオチド（100ピコモル／λ）、2
1λのH2Oおよび１λのポリヌクレオチドキナーゼ（10単
位／λ）。反応を37℃で45分間、次いで65〜68℃で５分
間行う。次に、24λのリン酸化オリゴヌクレオチドを56
λのH2Oで希釈し、２ピコモル／λを与える。
下記のようにしてギャップ含有二本鎖を形成させ、次
いで該オリゴヌクレオチドをアニーリングさせる。次の
試薬を総容量40λにおいて混合する:8λの５×GDB緩衝
液、0.50ピコモルのssDNA、および0.10ピコモルのHinc
II線状化M13 GAP RF DNA。10λを更なる使用のために取
り出し、残りの30λを100℃で３分間、65℃で５分間、
次いで室温で30分間と順次処理し、そして反応混合物を
氷上に置く。次に、10λのギャップ含有二本鎖と10λの
対照のギャップ不含有物質を、アガロースゲル上での電
気泳動にかけ、ギャップ含有二本鎖形成を調べる。該ゲ
ルが第三のバンドの存在を示すと仮定すればギャップ含
有二本鎖が形成されており、16λのギャップ含有二本鎖
反応混合物と４λの希釈されたリン酸化オリゴヌクレオ
チドとを混合し、そしてこの混合物を65℃に３分間加熱
し、次いで室温に20分間冷却することにより、リン酸化
オリゴヌクレオチドを該二本鎖にアニールせしめること
ができる。
TNFΔ（１＋12）およびTNFΔ（１＋13）を製造するた
めに、２つのリン酸化オリゴヌクレオチドを同一ギャッ
プ含有二本鎖にアニールせしめた。CP 495,CP 497およ
びCP 499を上述のようにリン酸化し、ただし４ピコモル
／λの濃度に希釈した。TNFΔ（１＋12）を製造するた
めには、２λのCP 495と２λのCP 497を16λのギャップ
含有二本鎖に添加してアニールせしめた。TNFΔ（１＋1
3）を製造するためには、２λのCP 495と２λのCP 499
を16λのギャップ含有二本鎖に添加してアニールせしめ
た。
次の試薬を総容量40λにおいて混合することから成る
適当な伸長および連結反応により、ヘテロ二本鎖を完成
させた:10λのギャップ含有二本鎖およびプライマー、
４λの10×PEL緩衝液、４λのdNTPs（10mM原液から作っ
た0.25mM溶液）、３λのATP（10λの0.1M ATP原液＋149
0λのH2O＝0.662mM）、17λのH2O、１λのクレノウ（５
単位／λ）、および１λのT4 DNAリガーゼ（0.6Weiss単
位／λ;1×PELで原液を希釈）。反応を16℃で２時間行
った後、10λの伸長／連結混合物を用いて200λの解凍
したコンピテントHB2154細胞を形質転換せしめた。細胞
を０℃で30分間、次いで42℃で1.5分間維持した後、様
々な容量の形質転換混合物（例えば50λ、10λなど）を
100λのHB2151細胞の新鮮な一晩培養物＋3.0λの軟寒天
に塗抹した。
プラークハイブリダイゼーション法を使って、得られ
たプラークをスクリーニングした。様々なそういった方
法が既知であり、好ましい方法の詳細に従う。プレート
を二重複製ニトロセルロース濾紙（Ｓ＆S ba−85型）上
にプレートを転写し、そして0.5N NaOH＋1.5M NaCl;1.0
M NaCl＋0.5M TrisHCl,pH7.4;および２×SSC（standard
saline citrate）で順次５分間処理することにより、D
NAを濾紙に固定させる。
二重複製フィルターを、フィルター１枚あたり10mlの
ハイブリダイゼーション緩衝液〔５×SSC,pH7.0,5×デ
ンハルト溶液（ポリビニルピロリドン＋フィコールおよ
びウシ血清アルブミン;1×各0.02％）、50mMリン酸ナト
リウム緩衝液pH7.0,5mM EDTA,0.1％ SDSおよび100μg/m
lのサケ精子DNA〕を使って55℃で２時間プレハイブリダ
イズせしめる。プレハイブリダイゼーション緩衝液を除
去し、所望する緊縮性に応じた条件下で、試料を適当な
リン酸化プローブ、即ち上記に示したようなリン酸化オ
リゴヌクレオチドをハイブリダイズせしめる。約２×10
6cpm/ml全容量が使用される。典型的な中程度の緊縮条
件は、42℃の温度と50％ホルムアミド、１〜5ml/フィル
ターのDNAハイブリダイゼーション緩衝液含有プローブ
を使った24〜36時間である。より高い緊縮性には、高温
および短時間が使われる。好ましいハイブリダイゼーシ
ョン条件は、５×SSC,5×デンハルト溶液,50mM NaPO4,p
H7.0,5mM EDTA,0.1％ SDSおよび100μg/mlのサケ精子DN
A中で、スクリーニングを行うのに使用するオリゴヌク
レオチドのTMより100℃下において、プローブをフィル
ターにハイブリダイズせしめることから成る。次に、該
フィルターを各回30分間室温にて２×SSC,0.1％ SDSで
２回洗浄し、次いでスクリーニングに使用するオリゴヌ
クレオチドのTMより５℃下において２×SSCおよび0.1％
SDSで１回洗浄し、そして風乾する。最後に、フィルタ
ーを−76℃で36時間オートラジオグラフィーにかける。
オートラジオグラフィーは、着目のミューテインを有す
るウイルスを含むプラークを暴露する。
二重変異体についてスクリーニングするために、１組
のフィルターを１つのスクリーニングオリゴヌクレオチ
ドで探査し、そして複製組のフィルター（同一プレート
から上げたもの）を適当なスクリーニングオリゴヌクレ
オチドで探査した。得られたオートラジオグラフを整列
し、両方のスクリーニングオリゴヌクレオチドにハイブ
リダイズしたプラークを採取し、配列決定した。
種々のTNFミューテインを含む変異誘発された構成物
をM13ベクターから切り出し、そして感染性レトロウイ
ルスを生産する幾つかの可能なベクターのうちの１つに
クローニングした。典型的なベクターとしては、pFVXM,
pUCFVXMΔHIII,高力価レトロウイルスベクター、好まし
くは実施例５に記載のpLNL6、または２遺伝子レトロウ
イルスを生じるベクター、好ましくは実施例７に記載の
pLNSX,pLXSNおよびpLNCXが挙げられる。最後の３つのベ
クターは全てネオマイシン耐性配列を担持している。
実施例２ TNFをコードするドラッグデリバリーレトロウイルス粒
子の生産 実施例１に記載のようにして調製したpFVXM−TNF（10
μｇ）を、抗生物質G418に対する耐性を付与するマーカ
ー配列を含む１μｇのpSV2−NEO（Southernら,1982,J.M
ol.Appl.Gen.,１:327−341）と混合する。Wiglerら,197
8,Cell,14:725のリン酸カルシウム法の変形を使ってト
ランスフェクションを行った。簡単に言えば、無菌の1m
M Tris,pH8.1,0.1mM EDTAで希釈した10μｇの担体DNA
を、50〜1,000ng/100mmペトリ皿のプラスミドDNAと一緒
に100mmペトリ皿に添加し、次いで2.5M CaCl2を添加し
た。この混合物を徹底的に攪拌して均質混合物にし、そ
して同容量の２×HEPES（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピ
ペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）緩衝液,pH7.1
を添加した。この混合物も攪拌して均質混合物にし、そ
の後沈澱を形成させておいた。30分後、1mlの該懸濁液
を、10％ウシ胎児血清が補足されたDMEM 10mlの入った
100mmペトリ皿中のpsi AM細胞に添加した。培養物を37
℃で16時間インキュベートし、次いで培地を新鮮な増殖
培地で置き換えた。次に、増殖培地を、Gibcoから入手
したG418 400μg/mlが補足された新鮮な増殖培地で再び
置き換えた。最初の増殖期間後、400μg/mlのG418を含
む選択培地上で細胞を増殖させ、そして耐性コロニーを
採取し、TNF生産について試験するために24ウエルの組
織培養皿に移した。
細胞性タンパク質を35S−システインまたは35S−メチ
オニンのいずれかで標識した。まず細胞を、システイン
またはメチオニンを欠くが５％透析済ウシ胎児血清を含
むDMEM上で37℃で30分間培養し、システインまたはメチ
オニン飢餓を行った。約400Ci/ミリモルの比活性を有す
る100μCiの35S−システインまたは35S−メチオニンを
添加し、皿に細胞を37℃で２時間インキュベートした。
上清を除去し、取っておいた。細胞を溶解緩衝液で溶解
させ、溶解物上清を遠心により回収した。清澄化された
溶解物と培養上清の両方を次のようにしてTNFの存在に
ついて試験した。
ウサギにおいて調製した組換えTNFに対するポリクロ
ーナル抗血清を遠心管中の各試験物質に添加し、そして
振盪しながら４℃で１時間インキュベートした。この
後、Sepharose CL4Bに結合されたプロテインＡの50％懸
濁液を添加し、次いで４℃で30分間インキュベートし
た。
遠心機中でビーズをペレット化し、洗浄した。SDS中
で煮沸することにより沈澱物質をビーズから取り外し
た。可溶化されたTNF含有溶液を電気泳動のため12.5％
ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、タンパク質を固定
し、染色並びにオートラジオグラフィーにより読み取っ
た。この結果を図２および３に示す。
図２は、35S−メチオニンでの標識の結果を示す。標
識は、溶解物中の26kDのプロセシングされてないタンパ
ク質のリーダー配列中にのみ出現し、成熟の17kDの分泌
形（メチオニン残基を含まない）中には全く存在しな
い。
図３は、35S−システイン標識の結果を示す。予想通
り、プロセシングされてない形と成熟形の両方が標識さ
れる。
下記のＬ−929アッセイを使って細胞上清もTNFについ
てアッセイした。TNF活性を示すそれらの上清の能力
は、ウサギ抗−TNF抗血清とのプレインキュベーション
により完全に破壊された。
実施例３ ドラッグデリバリーウイルス粒子の回収 培地中にTNFを分泌する実施例２の細胞からの上清を
0.45μｍのMilliporeフィルターを通して濾過し、細胞
が移らないようにした。同様に、上清を3,000×ｇで遠
心して細胞または細胞破片をペレット化することもでき
る。その上清は、TNF−Ｖと命名された組換えウイルス
粒子を含む。
実施例４ テスター細胞の行き止まり感染 実施例２で調製したTNF−Ｖを使って、４μg/mlのポ
リブレンと共にCO2恒温槽中で37℃にて一晩インキュベ
ートすることにより、１×105NIH 3T3またはRAT2細胞を
感染せしめた。35S−システイン標識を使って細胞上清
および溶解物をTNF生産について分析した。感染細胞に
ついての結果を図４に示す、17kDと26kD形の両方のTNF
が標識を含む。
それらの細胞からの上清もまた、Ｌ−929細胞毒性ア
ッセイによりTNF活性を示した。この活性は、ウサギ抗
−TNF抗血清とのインキュベーションにより除去され
た。
TNF活性についてのアッセイ 図５は、TNFレトロウイルスゲノムの構造および生物
活性を示す。レーンＡはFVX TNFの制限地図であり、そ
してレーンＢはpFVXMでトランスフェクトされたpsi−am
細胞のプラークアッセイである。TNFの生物活性をアッ
セイするために、Ｌ−929アッセイ系を使った。Ｌ−929
細胞をミクロタイタープレート中で単層として一晩調製
する。プレートを横切って試験試料を倍々希釈し、UV照
射し、次いで上記の調製した細胞単層に添加する。ウエ
ル中の培地を１μg/mlアクチノマイシンＤに調整する。
プレートを37℃で18時間インキュベートし、次いでプレ
ートを顕微鏡下で視覚的に採点する。各ウエルに、ウエ
ル中の細胞死の程度を示す50,75または100％の点数を与
える。TNF活性１単位は、50％の死滅が起こる希釈度の
逆数として定義される。
加えて、このアッセイのより高感度の変形を開発し
た。この変形は、試験試料とアクチノマイシンＤで処理
した時、予め標識した細胞からの35S標識ペプチドの放
出をモニタリングするものである。該アッセイのこの変
形を使って、効能を定量することができ、例えば卵母細
胞翻訳物質の相対的効能を評価することができる。簡単
に言えば、活発に増殖しているＬ−929培養物を、２％
の透析済ウシ胎児血清が補足されたメチオニン不含有培
地中で35Sメチオニン（200μCi/ml）により３時間標識
する。次いで細胞を洗浄し、96ウエルプレート中に添加
し、一晩インキュベートし、そして翌日試験試料の倍々
希釈液と１μg/mlのアクチノマイシンＤで処理する。次
いで培養物を37℃で18時間インキュベートする。各ウエ
ルからの100λ上清アリコートを別の96ウエルプレート
に移し、酸（TCA）沈澱させ、そしてグラスファイバー
フィルター上に収集する。フィルターを95％エタノール
で洗浄し、乾燥し、そしてカウントする。NP40洗剤対照
を各アッセイに含め、細胞からの放射能の最大放出を測
定する。次いで処理細胞と未処理対照との間の計数の差
を、NP40処理細胞と未処理対照との差により割った比
率、即ち下式： により、35S放出％を算出する。
より高いTNF効能はこの比率の値が高い。
実施例５ タンパク質薬剤コード配列を含む変更高力価プロウイル
ス粒子の調製 ヒトTNF,IL−２およびMDRをコードする配列を高力価
レトロウイルスベクターpLNL6中にクローニングした。
このベクターはBenderら,1987,J.of Virol.61（５）:16
39−1646に記載されている。図６は感染性ドラッグデリ
バリーレトロウイルスpLMDRL6,pLTNFL6およびpLIL−216
の作製方法を示す。
MDR配列/pLMDRL6の単離 pLMDRL6の作製における最初の段階は、MDRをコードす
るDNA配列の単離である。MDRをコードするDNA配列はPCT
/US87/00758に記載されている。MDRタンパク質をコード
する全長cDNA配列はこのPCT明細書の表５に示されてい
る。これをまず市販のベクターpGEM3Z（ｆ−）中にXba
I−Cla I断片としてクローニングした。これを成し遂げ
るため、Cla I−Hind IIIリンカーアダプターをCla I−
Xba I MDR断片に連結せしめた。この構成物をpGEM3Z
（ｆ−）中のXba I−Hind III部位に連結せしめ、pGEM3
Z（ｆ−）MDRを得た。
pGEM3Z（ｆ−）MDRを使って、高力価ベクターpLMDRL6
を次のようにして製造した。50μｇのpGEM3Z（ｆ−）MD
Rを、33mM Tris−酢酸,pH7.9から成るTris−酢酸緩衝液
（66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mMジ
チオトレイトール）中で全量500λにおいて200単位のCl
a I（New England Bio Labs）で消化した。この反応を3
7℃で60分間行い、その後DNAをフェノール抽出し、そし
て2.5M酢酸アンモニウムを含むエタノール溶液中でエタ
ノール沈澱せしめた。この沈澱物を400λの水に再懸濁
し、Cla I消化されたpGEM3Z（ｆ−）MDRを次のようにし
てEcoR Iでの第二消化にかけた。
エタノール沈澱させ再懸濁した450λの物質に、50λ
の10×Tris酢酸緩衝液および38単位のEcoR I（New Engl
and Bio−labs）を添加した。この混合物を37℃で60分
間インキュベートし、そしてこれを前記の通りフェノー
ル抽出し、エタノール沈澱せしめた。エタノール沈澱物
を100λのTris−EDTA緩衝液（10mM Tris,pH8.0,1mM EDT
A）に再懸濁した。水中の0.25％ブロモフェノールブル
ー、0.25％キシレンシアノール（15％フィコール）400
型から成る20λの負荷緩衝液を添加することにより電気
泳動用試料を調製した。この試料を40mM Tris−酢酸,pH
8.0（2mM EDTA）電気泳動用緩衝液から成るTris−酢酸
緩衝液中で１％アガロース調製ゲル上で電気泳動した。
電気泳動後、4.2kbのEcoR I−Cla I断片を含むゲル断
片をゲルから切り出し、そして標準的ガラスビーズ精製
技術を使ってDNAを単離した。
pLMDRL6の調製 高力価レトロウイルスベクターpLNL6を、上記4.2kb M
DR EcoR I−Cla I断片を挿入するために次のように準備
した。採用した方法は、pGEM3Z（ｆ−）MDRベクター中
への該断片の挿入に使った方法と同様であった。簡単に
言えば、50μｇのpLNL6をCla Iで次に38単位のEcoR Iで
消化した。これは4.7kbのCla I−EcoR I断片を与え、標
準的な電気泳動技術を使って該断片を単離した。次に、
4.2kb MDR EcoR I−Cla I断片と4.7kb Cla I−EcoR I p
LN6断片とを連結せしめ、高力価MDR発現ベクターpLMDRL
6を作製した。この方法は、4mM ATPおよび400単位のT4
DNAリガーゼ（New England Bio Labs）を含むTris−酢
酸緩衝液中で全量25λにおいて、１μｇのMDR EcoR I−
Cla I断片を１μｇの4.7kb EcoR I−Cla I pLN6断片と
連結せしめることから成る。この反応を４℃で16時間進
行させ、次いで連結混合物をTE緩衝液により1:4希釈し
た。この混合物５λをコンピテントDH5α細胞（Bethesd
a Research Labs）中に形質転換せしめた。８個のクロ
ーンを採取し、一晩増殖させ、下記の通りにMDR挿入断
片の存在について分析した。
８個のクローンそれぞれの一晩増殖物1mlを遠心分離
機中で遠心し、上清を除去し、そして細菌ペレットを、
200λのフェノール、170λのTE緩衝液および30λの６×
負荷緩衝液から成る破砕用緩衝液を使って破砕した。こ
の試料を攪拌し、５分間遠心し、そして上清をTAE緩衝
液中、0.8％アガロースゲル上で50ボルトで16時間電気
泳動した。最も遅く移動したクローンを更なる分析のた
め選択し、該クローンのうちの１つであるクローン５を
ミニプレプ制限消化による分析のため選択した。クロー
ン５は制限分析の結果に基づくとプラスミドpLNL6・MDR
を有することが示された。
両向性MDRウイルスの生産 pLMDRLベクターを使って、下記の通りにMDR配列を含
む両向性ウイルス粒子を生産した。約４×105個のPSI−
２細胞を100mmの組織培養皿に塗抹し、16時間後、PSI−
２細胞中へのベクターpLMDRL6のトランスフェクション
３時間前に、PSI−２細胞に新鮮な培地を再供給し、そ
してリン酸カルシウム媒介遺伝子伝達を介して細胞をト
ランスフェクトせしめた。
次のようにして、PSI−２細胞から収集したウイルス
粒子を含む培地によりPA317細胞を感染させた。60mmの
組織培養皿あたり５×105個のPA317細胞を接種し、一晩
細胞を増殖させた。トランスフェクトされたPSI−２細
胞から培地を除去し、細胞に4mlの新鮮培地を再供給し
た。PSI−２細胞を培地中に一晩ウイルス粒子を分泌さ
せておき、その後培地を収得し、8,000rpmで５分間遠心
した。その上清を使ってPA317細胞を感染させた。感染
は、PA317細胞から細胞培養培地を除去し、そして該細
胞を４μg/mlのポリブレンの存在下で2mlのPSI−２上清
と共にインキュベートすることから成る。24時間後、PA
317細胞を継代培養し、３〜４×104細胞/100mm組織培養
プレートに接種した。継代培養の48時間後、それらの細
胞を20μg/mlのビンブラスチンへの暴露により多剤耐性
について選択した。７〜10日後、コロニーが出現した。
トランスフェクトされない対照においてはコロニーは全
く出現しなかった。個々のコロニーを採取すると、それ
らは連続継代において20μg/mlのビンブラスチンに耐性
であることがわかった。このようなコロニー由来の上清
は、通常の薬剤感受性細胞の感染時に、１×105cfu/ml
の力価を有する薬剤耐性を付与することがわかった。
pLTNF6 pLTNF6を作製するのに使用するTNFコード配列は、米
国特許第4,677,063号に記載のプラスミドB11から得られ
た。このTNF配列はPst I断片中に存在するので、Pst I
消化によって取り出し、そして市販のベクターpGEM−３
（Promega）のPst I部位に挿入し、pGEMTNF14を作製し
た。
pLTNFL6の調製 ベクターpLTNFL6は複数の段階において作った。第１
に、上記のベクターpLMDRL6中のMDR配列を、TNFをコー
ドするベクターpGEMTNF14からの配列と同様にして切り
出した。MDR配列を欠くベクター断片とこのTNF配列を平
滑末端にし、そして連結せしめてpLTNFL6を作製した。
より詳しくは、これが必要とするのは、200単位のBam
H I（New England Bio Labs）、200単位のHind III（N
ew England Bio Labs）及び90単位のCla−Ｉにより、TA
緩衝液中で、最終容量500入にて37℃で２時間、50μｇ
のpLNL・MDRを消化することによってMDR配列を切り出す
ことである。このインキュベーション期間に続いてMDR
コード配列を欠いているベクター断片を、10λの10mM d
NTP（dATP,dCTP,dGTP及びdTTP）並びに63単位のT4DNAポ
リメラーゼ（Promega）を添加しそしてこの混合物を更
に37℃で20分間、次に68℃で更に10分間インキューベー
トすることにより、平滑末端にした。次に本質的には前
記の方法を用いて、反応消化物をフェノール抽出し、エ
タノール沈澱させ、そして１％アガロースゲル上で電気
泳動した。4.7kbの平滑末端断片をゲルから切り出し、
そして標準的なガラスビーズ精製方法を用いて単離し
た。
同様に、50μｇのpGEM TNF14をTA緩衝液中で200単位
のPst Iにより、最終審査500λにて37℃で２時間消化し
た。この反応消化物を上記と同様に処理し、そして１％
のアガロースゲル上で分画した。TNFコード配列を有す
る1.1kbのコード断片をゲルから切り出し、そして上記
の通りガラスビーズを使って単離した。この断片を次の
ようにして平滑末端にした。１μｇのこの断片を、0.05
mM dNTP及び0.15単位のT4DNAポリメラーゼを含むTA緩衝
液30λ中でインキュベートした。混合物は37℃で20分
間、その後68℃で更に10分間インキュベートした。この
平滑末端断片をガラスビーズを用いて精製し、そしてこ
れを平滑末端化された4.7kbのベクター断片への連結準
備のため、水の中に再懸濁した。
連結反応は以下の通りに行った。1.1kbの平滑末端化T
NF断片0.8μｇを4.7kbの平滑末端化断片1.0μｇと、全
容量25λのTA緩衝液中で混合した。該緩衝液は4mM ATP
及び400単位のT4DNAリガーゼ（NEB）を含んだ。連結を
４℃にて16時間行い、その後連結混合物をTE緩衝液で1:
4希釈し、次いで５λのこの混合物を用いて100λのコン
ピテントDH5α細胞を形質転換せしめた。次に、種々の
希釈度の形質転換細胞混合物をニトロセルロースフィル
ターに塗布し、そして50μg/mlのアンピシリンを含む培
養プレート上でインキュベートせしめた。37℃で16時間
後、第２セットのニトロセルロースフィルターを用いて
このプレートを複製塗布した。この新しいニトロセルロ
ースフィルターはマスタープレートとして働く。細菌DN
Aをフィルターに固定化するため、もとのフィルターを
標準的アルカリ溶解法を利用して処理した。次に、TNF
を含むコロニーを、以下の配列： ５′−TCA GCT CCA GCC CAT TGG−３′を有する末端
標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて同定した。
ハイブリダイゼーションは、フィルターを５×SSC,4
×デンハルト、50mM NaPO4,pH6.8,0.1％ドデシル硫酸ナ
トリウム及び100μg/mlのサケ精子DNA中でプレインキュ
ベートすることより成る。このフィルターを１時間プレ
インキュベートし、次にリン酸化プローブを含む同溶液
15ml中で１時間インキュベートした。20ピコモルのプロ
ーブを用い、55℃のTmにて、約120rpmで振盪しながら反
応を行った。インキュベーション時間の後、フィルター
を以下の通り減少する濃度のSSC溶液により洗浄した。
第１洗浄は0.1％SDSを含む６×SSCから成り、第２洗浄
は0.1％SDSを含む４×SSC、そして第３洗浄は0.1％SDS
を含む２×SSCから成った。第１及び第２洗浄は２回繰
り返し、洗浄時間は15分間であった。第３洗浄は１回行
い、これも15分間の洗浄時間であった。全ての洗浄は60
℃にて、120rpmの攪拌により行った。洗浄後、フィルタ
ーを風乾し、そして−70℃でオートラジオグラフィーに
かけた。オートラジオグラフ結果に基づき、８個のクロ
ーンをマスタープレートから採取し、そして200μg/ml
のアンピシリンが補足されたR2培地3.5mlに接種した。
細菌を標準的な条件下で増殖させ、プラスミドDNAを単
離しそしてEcoR Iにより制限し、正しい方向においてTN
F断片が挿入されているものを同定した。EcoR I消化
は、10×緩衝液（0.33Mトリス−酢酸,pH7.9;0.66M酢酸
カリウム;0.10M酢酸マグネシウム;5mMジチオトレイトー
ル）31.5λ、RNase（10mg/ml）2.5λ、ガラス蒸留水265
λ及びEcoR I 13λ（20単位／λ;New England Biolab
s）中で行った。反応混合物がEcoR Iを含まない対照実
験を実施した。反応は、１λの適切なクローンと34λの
反応混合物を混ぜ合わせることにより開始させ、その後
37℃で１時間インキュベートした。反応消化物を１％TE
AEゲル上に流した。３つのクローン、TNF3,TNF6及びTNF
7は、3180,1613及び900塩基対数を有する期待の断片を
示した。従って、TNFコード配列についての予測配向と
一致するそれらの結果に基づき、ベクターpLTNFL6と一
致するTNF3を更なる研究のために選んだ。TNF3を増殖さ
せて大規模のプラスミド調製物を作り、そしてTNFコー
ド配列の方向を確認するためEcoR Iを用いる制限消化に
より分析した。
pLTNFL6によるPA317細胞のトランスフェクション PA317細胞のトランスフェクションは、10mlの培地を
含む100mmの組織培養皿当り３×105個の細胞を接種する
ことにより行った。細胞を24時間増殖させ、次いで培地
を除去し、そして次の溶液:10μｇのpLTNFL6、１μｇの
β−アクチン−ネオマイシンベクター、10μｇの剪断さ
れたLTK担体DNA、及び500λの２×HBS（10mM KCl,11mM
D−グルコース、1.4mM Na2HPO4,42mM Hepes及び171mM N
acl,pH7.05）を添加することによりトランスフェクトせ
しめた。最終容量950λとなるように水を加えた。次に5
0λの2.5M CaCl2を加え、そしてこの２つを直ちに15秒
間渦動攪拌した。沈澱が形成された後、試験管を室温で
30分間インキュベートした。次に溶液全体をPA317細胞
を含む100mmの組織培養皿に加え、そしてこの皿を37℃
で１夜インキュベートした。その後、この培地を新鮮培
地を交換し、更に37℃で24時間インキュベートし、そし
て細胞をトリプシン処理し、そして400μg/mlのG418が
補足された培地に逐次1:4希釈度にて平板培養した。培
地を３〜４日毎に交換し、そしてトランスフェクション
の15日後、クローニングシリンダーを用いてクローンを
単離し、そして得られたクローンを大量培養において増
殖させ、そして米国特許第4,677,063号に記載の通り又
は本質的には上記の通り、L929アッセイを使ってTNF発
現についてアッセイした。試験した10個のクローンのう
ち５個が、トランスフェクトされたPA317細胞を増殖せ
しめた２日後に約13から70単位よりわずかに高いTNF/ml
までの値を示した。
PA317pLTNFL6トランスフェクト細胞が感染性ウイルス
粒子を生産できることを示すため、トランスフェクト細
胞を10％ウシ胎児血清が補足されたダルベッコ改良イー
グル培地に３×105細胞/100ml皿の密度において接種
し、そして16時間インキュベートした。その後、培地を
除去し、そしてあらゆる細胞破片及び全細胞を除去する
ために3,000×ｇで５分間遠心することによってウイル
スを集めた。ウイルス粒子を含む得られた培地上清を感
受性細胞培養物の感染に使用した。
種々の細胞タイプを感染せしめ、これにはNIH3T3細
胞、ヒト腫瘍浸潤リンパ球（TIL細胞）又はヒト黒色腫
細胞が含まれる。ヒトTIL及び黒色腫細胞はRosenberg,
S.A.ら、1986,Science,233:1318;Topalian,S.ら、1988,
J.Clin Oncol.,６:839;Belldegrun,A.ら,1988,Cancer R
es.,48:206;又はRosenberg,.ら、1988,New Eng.J.Med.
に記載された通りに得られた。感受性細胞の感染は、細
胞培養培地を除去し、そして感染を促進させるために４
μg/mlのポリブレンが補足されたウイルス粒子含有培地
上清で置き換えることから成った。16時間後、新鮮培地
を培養物に加え、そして免疫沈澱によるTNFの検出を可
能にするために培養物を代謝物に標識した。
該細胞及びTNFを生産することが分っている対照細胞
系の代謝的標識は、以下の細胞タイプ、TNF6−8,NIH 3T
3及びPA317については、カルシウム又はマグネシウムを
含まないリン酸塩緩衝化塩溶液中で培養物を２回すす
ぎ、そしてシステインを含まない最少必須培地中で細胞
を37℃にてインキュベートすることから成る。黒色腫細
胞ロスウェルパークメモリアルインスティテュート（Ro
swell Park Memorial Institute）システイン不含有培
地中でインキュベートした。使用した培地のタイプにか
かわらず、培地は５％の透析済ウシ胎児が補足された。
次に、細胞培養皿から培地を吸引除去し、そしてそれを
100−300μCi/mlの［35S］システイン含有培地で置き換
えることにより、37℃で３時間細胞を［35S］システイ
ンで標識した。100mm皿当り2mlの放射性培地を用いた。
標識期間の間培養物を攪拌し、その後培地を吸引し、
そして20mMのTris,pH8.0,200mM LiCl,1mM EDTA及び0.5
％NP−40から成る溶解緩衝液1ml中で細胞を溶解せしめ
た。この溶解緩衝液の添加後、この細胞培養皿を４℃で
５分間インキュベートし、そしてTNFの存在を決定する
ために溶解物を免疫沈澱せしめた。
免疫沈澱は、ヒト組換えTNFに対して生起されたウサ
ギ抗−TNF血清を用いて、溶解物中に存在するTNFを沈澱
せしめることから成る。溶解物をTNF抗体と反応させる
前、これをプロテインＡ−Sepharose CL−4Bビーズの50
％懸濁液30λに連続攪拌下で４℃で１時間予備吸着させ
た。試験管を遠心してビーズをペレット化し、そして3.
75λのウサギ抗−TNF血清が加えてある別の試験管に上
清を移し入れた。この試験管を攪拌しながら４℃で１時
間インキュベートし、そして14,000rpmにて15秒間遠心
した。上清を取り出し、そして別の試験管の中に移し入
れ、その後30λのプロテインＡ−Sepharose CL−48ビー
ズを上清に加え、次に混合物を攪拌しながら４℃で１時
間インキュベートした。次いでビーズをペレット化し、
そして溶解緩衝液で２回、そして緩衝液Ｂ（20mM Tris,
pH8.0,100mM NaCl,0.5％NP40）で２回洗浄した。洗浄
は、ビーズを7,000rpmで８秒間ペレット化し、上清を捨
て、そして1mlの適当な洗浄液を加えることから成る。
最後に、最後の洗浄の後、ビーズに結合している物質を
４％SDS,15％グリセロール、6.25mM Tris pH6.8、0.1％
ブロモフェノールブルー及び1mM DTTより成るゲル電気
泳動用負荷緩衝液30λを添加することにより電気泳動に
かけた。電気泳動用緩衝液を加えたら直ちにこの試料を
５分間煮沸し、そして12％ポリアクリルアミドゲル上で
電気泳動にかけた。図７及び８に結果を示す。図７は、
LTNFL6プラスミドまたはLTNFL6由来の高力価TNFレトロ
ウイルスのいづれかによりトランスフェクトまたは感染
された細胞の免疫沈澱分析を示す。レーンＡは、26kD及
び17kD TNFの両者をコードする高力価レトロウイルスLT
NFL6によりトランスフェクトされたPA317細胞であり；
レーンＢは未感染のNIH3T3細胞であり；そしてレーンＣ
は、LTNFL6によりトランスフェクトされたPA317細胞の
細胞培養上清中に存在する高力価TNFレトロウイルスLTN
FL6クローン８により感染されたNIH 3T3細胞である。
図８は、TNFレトロウイルスLTFL6により感染された35
S−システイン標識ヒト黒色腫細胞の免疫沈澱分析であ
る。レーンＡはLTNFL6によりトランスフェクトされたPA
317細胞；レーンＢ及びＣは、それぞれ未感染のNIH 3T3
細胞およびpLTNFL6ウイルスにより感染されたNIH 3T3細
胞；そしてレーンＤ及びＥはそれぞれ未感染のヒト黒色
腫細胞およびpLTNFL6ウイルスにより感染されたヒト黒
色腫細胞である。
ヒトTIL中へのTNFをコードするDNA配列の組込みの確
認は、pLTNFL6により感染されたヒトTIL中に存在する50
0塩基対のセグメントのポリメラーゼ連鎖反応増幅によ
り得られた。
この反応は標準的PCR技術及び以下のオリゴヌクレオ
チドプライマー、 を用いることにより行った。
図９に結果を示す。レーンＡは非感染のTIL、そして
レーンＢ及びＣは感染TILを示す。レーンＤは正の対照
であり、pLTNFL6によりトランスフェクトされたPA317細
胞を示す。500塩基対のTNF配列の増幅は、TIL細胞がTNF
レトロウイルスにより感染されていることを確証する。
更に、実質的に前記と同様に行った免疫沈澱は、該TI
L細胞がTNFを分泌しているを示した。
pLIL−2L6 下記の点以外は、pLNL・MDR又はpLNL・TNFを作製する
のに使ったものと本質的に同じ材料及び方法を使って、
ベクターPLIL−216を作製した。
第１に、IL−２をコードする配列はPst Iフラグメン
ト上にある。これは発明者Markらの米国特許第4,518,58
4号に詳細に記載されている。
第２に、IL−２配列を含む形質転換細菌を探査するの
に用いるオリゴヌクレオチドは以下の配列を有する； ハイブリダイゼーション条件は、MDR又はTNF配列を含
むクローンを同定のに使ったのと本質的に同じである
が、但しTmは69℃であった。IL−２クローンについての
スクリーニングはオートラジオグラフィーにより８個の
クローンの存在を示し、即ち、EcoR I及びStu Iでの二
重消化において制限した時、適切な方向のIL2コード配
列を有するクローンを示した。EcoR I及びStu I消化は1
0×TA 31.5λ、RNase A（10mg/ml）2.5λ、ガラス蒸留
水252λ、EcoR I（20単位／λ）13λ、及びStu I（８単
位／λ）13λから成る溶液中で行った。
実施例６ pLMDRL6の適用 癌の化学療法処置の有効性は、副作用を伴わないで患
者に投与することができる用量により部分的に制限され
ている。このような副作用は、患者の免疫応答に必要な
正常リンパ系細胞の減少を含む。従って、レトロウイル
スpLMDRL6の重要な用途は、正常リンパ系細胞における
薬剤耐性を確実にする能力にあり、これによって一層多
量の化学療法剤が投与できるようになる。
リンパ系細胞に薬剤耐性を付与する方法及びその利点
は、腫瘍浸潤リンパ球又はTILを生体内においてpLMDRL6
により感染せしめ、そしてこれらの細胞を化学療法的に
感受性の腫瘍負荷を経験している免疫学的受容性宿主動
物に戻すことにより実証されうる。TILを得るための方
法及びTILをMDR両向性ウイルスにより感染せしめる方法
は上記に与えられている。感染TIL細胞を動物に戻す
と、有効数の細胞が腫瘍塊に付着するか又はこれを浸潤
する。その後、動物に腫瘍負荷の治療に有効な１又は複
数の化学療法剤を投与する。トランスフェクトされたTI
L細胞は腫瘍に対して毒性である濃度の化学療法剤に耐
性であるため、医師はTIL細胞を殺さずに付与すること
ができる投与量を起えて、腫瘍に対して有効な化学療法
剤の投与量を徐々に増加させることができる。こうし
て、患者本来の抗−腫瘍防御は損害を免れ、そして実
際、腫瘍を高められた投与量の化学療法剤に暴露するこ
とによって増強される。
実施例７ ２遺伝子レトロウイルスDNA構製物 ネオマイシン遺伝子及びTNFの両方を発現できるレト
ロウイルスを作製した。この２遺伝子レトロウイルスベ
クターを製造するため作製方法を図10に示す。ベクター
pLNSX,pLXSN及びpLNCXの全てがネオマイシン遺伝子配列
を保有している。更に、これらのベクターはMillerとRo
smanの1989,Biotechniques,７（９）:980に記載されて
いる。
このTNF構成物は、ベクターpUC.FVXMΔH III TNFγ s
igに存在するγ−インターフェロンシグナルペプチドを
コードするヌクレオチド配列を含んだ。該方法は、150
μｇのpGEMTNF14及び150μｇのpUC.FVXMΔH III TNFγ
sigを600単位のPst I（New England Biolabs）により消
化することから成った。消化は33mM Tris−酢酸、pH7.
9,66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mMジ
チオトレイトールから成る制限酵素緩衝液1500μｌ中で
37℃にて60分間行った。消化物をフェノール抽出し、エ
タノール沈澱し、そしてTris−酢酸電気泳動用緩衝液
（40mM Tris,1mM EDTA,5mM酢酸ナトリウム,pH7.5）中で
１％アガロースゲル上で分画した。1070bpの野生型TNF
断片及び902bpのTNF γ sig断片のそれぞれをガラスビ
ーズによって単離した。
それぞれのPst I断片をT4 DNAポリメラーゼによる処
理によって断片化した。各断片４μｇを6.3ユニットのT
4 DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）と、33mMト
リス−酢酸、pH7.9、66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグ
ネシウム、0.5mMジチオトレイトール並びにそれぞれ0.1
0mMのdATP,dCTP,dTTP及びdGTPから成る125μｌの容量に
おいて、37℃で10分間、次いで68℃で５分間処理した。
各平滑末端断片をガラスビーズ単離により精製した。
各ベクター４μｇを、平滑末端を作り上げる適切な酵
素により、100μｌの容量（33mMトリス−酢酸、pH7.9,6
6mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mMジチオ
トレイトール）において以下の通りに消化した:pLNCXは
10単位のHpa I（NEB）により、pLNSXは16単位のSTU I
（NEB）により、pLXSNは10単位のHpa I（NEB）により37
℃で60分間の処理。
各消化ベクターを、16μg/mlのベクター及び16μg/ml
のTNFフラグメント、33mMトリス−酢酸、pH7.9,66mM酢
酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mMジチオトレ
イトール、4mM ATP、16,000単位/mlのT4 DNAリガーセ
（NEB）を含む連結混合物25μｌ中において各平滑末端
化TNF断片と連結せしめた。連結は16℃で16時間のイン
キュベーショによる。連結せしめたDNAを用いてコンピ
ーテントDH5 α細胞（Bethesda Research Labs）を製造
者の指示に従って形質転換せしめた。得られたコロニー
を、プローブとしてTNFオリゴヌクレオチドプライマーC
P365（５′−TCAGCTCCACGCCATTGG−３′）を用いる標準
的な方法によりスクリーニングした。配向性は制限エン
ドヌクレアーゼアッセイにより確認した。
TNF遺伝子を保有する１つのプラスミドpLTNFSNをPA31
7細胞の中にトランスフェクトし、そしてこのトランス
フェクトクローンを単離した。LTNFSN−22と命名したク
ローンのうちの１つからウイルスを取り出した。これ
は、標準的な手法を使って、1.6×106neorcfu/mlの力価
を有し且つ62単位のTNF/mlを生産するものとして特徴付
けられた。
ネオマイシン耐性及びIL−２の両方をコードする２遺
伝子ウイルスを、前記のベクターpLNSX,pLXSN及びpLNCX
を用いて作製した。この方法は以下の点、即ちIL−２を
コードするPst I断片を平滑末端化し、そして該ベクタ
ーに挿入すること以外は同じである。IL−２断片は発明
者Markerらの米国特許第4,518,584号に記載されてい
る。IL−２コロニーをオリゴヌクレオチドKD12を用いて
スクリーニングした。
IL−２遺伝子を保有するプラスミドの１つpLIL 2SNを
PA317細胞にトランスフェクトせしめ、そしてこのトラ
ンスフェクトクローンを単離した。２つのクローンから
ウイルスを取出し、pLIL 2SN−16及びpLIL 2SN−20と命
名した。これはそれぞれ以下の力価、2.0×105及び2.2
×105のneorcfu/mlを示し、そして約８単位/mlのIL−２
をそれぞれ生産した。
最後に、TNF突然変異タンパク質TNFΔ（１→12）を用
いて２遺伝子構成物を作製した。簡単に述べると、pFVX
MΔH III TNFΔ12由来のPst I断片を平滑末端化し、そ
してpLXSNのHpa I部位にクローニングしてpLTNFΔ12SN
を作製した。
実施例８ TNFとネオマイシンの相乗作用 TNF及びネオマイシン耐性をコードするウイルス粒子
により感染された細胞の驚くべき特性は、抗生物質G418
をこの感染直後に加えた場合のG418による選別に対する
それらの高められた感受性にある。このことは、ウイル
ス粒子pLTNFSN−22による細胞感染及び該細胞をG418に
おける選別に直ちにかけることにより示される。感染に
適する標的細胞はPA317であり、そしてG418の適切な濃
度は400μg/mlである。
これらの条件を用い、pLTNFSN−22を保有する細胞の
約60％が、G418の存在下において、この選別培地中にて
24時間の時点にて殺される。一方、同一のウイルスでは
あるがTNF配列を含まないものにより感染された細胞は1
0％以下が殺される。
特定の理論に固執するつもりはないが、G418の存在下
におけるTNFを発現せしめる細胞の感受性は、感染細胞
がネオマイシン耐性表現型を発現するのに十分な時間を
有さないために起きるものと考えられる。これは即ち、
通常細胞をTNF殺傷に耐性にするタンパク質の合成をG41
8が阻害することを可能にしている。従って、G418の存
在下において、細胞はTNFにより殺される。
この仮説は、pLTNFSN−22により感染された細胞に感
染の48時間迄にG418選別を適用しない場合、その後の24
時間の間に細胞死がほとんど起きないことにより支持さ
れる。
もしTNFウイルス粒子を有する細胞がG418を用いて、
又はその他の類似の抗生物質選別を用いて有効に単離さ
れるならば、ネオマイシン遺伝子がこの感染細胞にG418
耐性を付与するのに十分なる発現時間があるものと当業
者により理解されるであろう。
実施例９ TNF突然変異タンパク質の細胞毒性特性 前記のオリゴヌクレオチドを用いて作った、以下のTN
FのTNF欠失ミューテインをその細胞毒性活性について試
験した:TNFΔ（１→12）,TNFΔ（１＋12）及びTNFΔ
（１＋13）。これはそれぞれ、最初の12個のアミノ酸の
欠失、１および12番目のアミノ酸の欠失、並びに１及び
13番目のアミノ酸欠失を意味する。NIH 3T3細胞を、β
−アクチン−ネオ及びpUC.FVXMΔH III TNFプラスミド
系列の１つと共にトランスフェクトせしめ、その後400
μg/mlのG418中で選別した。細胞毒性活性は、100mlの
組織培養皿上に、G418耐性不均一集団の一連の希釈液を
接種することにより測定した。約20−50個のコロニーが
出現したら、培地を吸引除去し、そしてこのコロニーに
10％の仔牛血清が補足されたダルベッコ改良イーグル培
地中の約４×106個のL929細胞を積載した。細胞を30分
間平板培養させた後、培地を吸引し、そして細胞の上に
10mlのダルベッコ改良イーグル培地、0.9％のノーブル
（Noble）寒天（Difco）及び10％のウシ胎児血清より成
る溶液を重層した。この組成物を重層する前迄45℃で溶
融状態に保ち、冷却してこの細胞上に重層させた。次
に、この寒天を室温で30分間固化せしめ、そしてプレー
トを37℃で48時間インキュベートし、その後寒天を取り
除き、10mlのリン酸塩緩衝化塩溶液を加え、その後12％
グルタルアルデヒド、１％メチレンブルーを含む溶液1m
lを加えた。後者の溶液は、細胞のコロニー形成を可能
にしながら細胞を固定し且つ染色し、従って致死ゾーン
を容易に識別することができる。最後にプレートを室温
で60分間インキュベートし、そして水の中ですすぎ、風
乾した。
細胞毒性活性は、トランスフェクトされたコロニーの
周辺の致死領域として評価した。２種類の致死領域が観
察された：拡散型及び非散型領域。非拡散型領域は、TN
Fミューテインが膜に結合したままであり、トランスフ
ェクトコロニーから広がってL929の致死を引き起こさな
いことを示唆する。一方、拡散型致死は、TNFミューテ
インが細胞から広がり、そして広い領域にわたって致死
を引き起こすさとを示唆する。
表Ｉはこの結果を要約する。細胞毒性活性について試
験したミューテインの他に、比較の目的でベクター対
照、野生型TNF及びTNFγ−sigも試験した。この表から
明らかな通り、ベクター対照及びTNFΔ（１＋13）のみ
がL929積層アッセイにより細胞毒性を示さないことが分
った。更に、野生型TNF及びTNFγ−sigは細胞毒性活性
を有するが、その活性はトランスフェクトコロニーのま
わりに拡散型のパターンを示し、従って野生型TNF及びT
NFγ−sigはトランスフェクトコロニーから分泌される
ことを示した。一方、TNFΔ（１→12）及びTNFΔ（１＋
12）は非拡散型致死パターンを示した。このことは、そ
れらの分子が細胞表層に結合したまま且つL929細胞との
直接的な接触によって該細胞の致死を引き起こすことを
示す。
即時型（instant）ミューテインの細胞毒性活性を評
価するため、そして特にTNFΔ（１→12）及びTNFΔ（１
＋12）の細胞表層の局在化を確認するため、第２の実験
を行った。この実験は２つの部分より構成される。第１
に、種々のTNFミューテインを保有する細胞を、当業界
においてよく知られている方法を用いて細胞表層放射性
ヨウ素化せしめた。この結果が示すには、驚くべきこと
に両方のミューテインが細胞表層に結合していた。第２
に、TNFミューテインのそれぞれを発現するトランスフ
ェクト細胞を培養培地中で増殖させ、そして35S−シス
テインにより標識し、その後培地を回収し、そして抗−
TNFポリクローナル抗体により免疫沈澱せしめた。この
ような抗体及び免疫沈澱方法は当業界において既知であ
る。この免疫沈澱物を12％ポリアクリルアミド/SDSゲル
上で泳動し、そしてTNFΔ（１＋12）及びTNFΔ（１＋1
3）によりトランスフェクトされた細胞に関して、約17k
Dの分子が免疫沈澱されることが観察された。TNFΔ（１
→12）由来の培地においてはなにも検出されなかった。
上記の結果を一緒に考察すると以下のことがわかる:T
NFΔ（１→12）は膜結合し、細胞培養培地中に分泌され
ず、そしてこの膜結合型は細胞毒性である。TNFΔ（１
＋12）も膜結合しており、且つこの膜結合型は細胞毒性
である。驚くべきことに、このトランスフェクト細胞に
より約17kDの分子も分泌された。最後に、TNFΔ（１＋1
3）は膜に結合して現われるが、この膜結合型は細胞毒
性でなかった。この構成物も約17kDの分子を分泌した。
TNFΔ（１＋12）及びTNFΔ（１＋13）によりトランス
フェクトされた細胞により分泌される約17kDの分子量を
有す可溶性分子が細胞毒性活性を有するかどうか調べる
ための実験を行った。この実験は、適切に形質転換され
た3T3細胞を増殖せしめ、そして該細胞と分泌分子を含
む培地とを分けることにより行なわれる。培地を前記の
通りにL929細胞においてアッセイすると、細胞毒性活性
を有さないことが示された。従って、この分泌された17
kD分子は野生型17kD TNFと異なり、細胞毒性でなかっ
た。
図12は26kDのTNFをコードするcDNA配列、及び種々の
ミューテインを作製するために削除された分子の領域の
制限地図である。
実施例10 ネオマイシン耐性及びIL−２又はTNFをコードする２遺
伝子レトロウイルスについての治療用途 前記のウイルス粒子pLIL2SN−16を、標準技術を用い
て単離したヒトTIL細胞を感染せしめることにより腫瘍
治療に利用した。この方法は、Rosenberg,Sら,1986,Sci
ence,233:1318;Topalian,Sら,1988,J.Clin.Oncol.,６:8
39;Belldegrun,Aら,1989,Cance Res.,48:206;又はRosen
berg,Sら,1988,New England J.Med.に記載されている。
感受性培養物の感染は、細胞培養培地を除去し、そして
感染を促進せしめるために４μg/mlのポリブレンが添加
されたウイルス粒子含有培養上清で置き換えることから
成る。
TIL細胞を洗浄して細胞破片、ポリブレン、その他を
除去して癌患者への点滴注入に適するようにした。感染
TIL細胞の投与量は異なることができ、最適投与量は担
当医師により経験的に決定することができる。感染TIL
細胞の複数の点滴注入が十分な治療のために望ましいこ
とが期待される。初期治療及びその後に続き、患者の腫
瘍塊をモニターし、そして有意なる縮小が４週間の時点
で現れた。
実質的に同じ方法を用い、TNFミューテインTNFΔ（１
→12）をコードするレトロウイルス粒子によってTIL細
胞を感染させることができる。これは、pLTNFΔ12SNを
適切な宿主細胞中にトランスフェクトせしめ、そしてそ
の細胞培養培地中に分泌されるウイルス粒子を単離する
ことによって作られるレトロウイルス粒子を用いること
による。
以下の材料はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション、Rockville,MD,USA（ATCC）に、特許手続上の
微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約（ブ
タペスト条約）に従って寄託され、そしてこれらはブタ
ペスト条約に従って保管され且つ入手できる。このよう
な菌株の入手可能性は、特許法に従って政府当局のもと
に認められる権利に反して本発明を実施する承諾である
と解釈してはならない。
以下の材料はATCCに寄託され、そして表示のATCC寄託
番号が付けられている。これらはシータスコーポレーシ
ョン、Emeryville,California,USA（本出願の譲受人）
のマスターカルチャーコレクション（CMCC）にも寄託さ
れ、そして表示のCMCC寄託番号が与えられている。
以上の明細書は、当業者が本発明を実施するのに十分
であると考えられる。本明細書中の材料の寄託は、本明
細書に含まれる記載が、最良の実施態様を含む本発明の
いずれかの局面の実施に不十分であるという容認を構成
するものではなく、またこの寄託を、寄託材料が表す特
定の実例に請求の範囲を限定するものと解釈してはなら
ない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ４８８，７０６ (32)優先日 平成２年３月２日(1990．3．2) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８１１８ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８１１９ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８１２０ 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ６８１２１ 前置審査 (56)参考文献 特表 昭62−500631（ＪＰ，Ａ) 国際公開89／9271（ＷＯ，Ａ１) Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．，Ｓｕｐｐｌ．12Ｂ（1988）ｐ. 171，Ａｂｓ．Ｈ105 Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅ ｄ．，Ｖｏｌ．319，Ｎｏ．25（1988) ｐ．1676−1680 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/10 C12N 15/867 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】組換えタンパク質を発現し得る形質転換さ
    れた生体外ヒト腫瘍浸潤リンパ球（TIL）細胞であっ
    て、該組換えタンパク質は直接的または間接的に細胞毒
    性であり、該TIL細胞は、組換えタンパク質を保有しそ
    して発現するためのビヒクルとして作用し、該TIL細胞
    はそのDNA中に複製欠陥レトロウイルスベクター由来の
    プロウイルスDNA配列が挿入されており、該プロウイル
    スDNA配列は、組換えタンパク質をコードする組換えDNA
    配列を含み、該組換えDNA配列は、該TIL細胞中での該組
    換えタンパク質の発現のためのプロモーターに作用可能
    に連結されており、該組換えタンパク質はプロホルモン
    TNFであり、ここで該プロホルモンTNFが、成熟形のTNF
    の最初の12アミノ酸を欠失しているTNFであるTNFΔ（１
    →12）、成熟形のTNFの最初と12番目のアミノ酸を欠失
    しているTNFであるTNFΔ（１＋12）、またはＮ末端にγ
    −インターフェロンシグナルペプチドを有する成熟形の
    TNFであるTNF γ sigである、形質転換された生体外
    ヒト腫瘍浸潤リンパ球（TIL）細胞。
  2. 【請求項２】前記プロホルモンTNFが、成熟形のTNFの最
    初の12アミノ酸を欠失しているTNFであるTNFΔ（１→1
    2）である、請求項１に記載の形質転換された生体外ヒ
    ト腫瘍浸潤リンパ球（TIL）細胞。
  3. 【請求項３】前記プロホルモンTNFが、成熟形のTNFの最
    初と12番目のアミノ酸を欠失しているTNFであるTNFΔ
    （１＋12）である、請求項１に記載の形質転換された生
    体外ヒト腫瘍浸潤リンパ球（TIL）細胞。
  4. 【請求項４】前記プロホルモンTNFが、Ｎ末端にγ−イ
    ンターフェロンシグナルペプチドを有する成熟形のTNF
    であるTNF γ sigである、請求項１に記載の形質転換
    された生体外ヒト腫瘍浸潤リンパ球（TIL）細胞。
  5. 【請求項５】タンパク質を発現し得る形質転換された生
    体外ヒトTIL細胞であって、該タンパク質は直接的また
    は間接的に細胞毒性であり、該形質転換された生体外ヒ
    トTIL細胞はゲノムDNAを含み、該ゲノムDNAには複製欠
    陥レトロウイルスベクター由来のプロウイルスDNA配列
    が挿入されており、該プロウイルスDNA配列は、直接的
    または間接的に細胞毒性である組換えタンパク質をコー
    ドする組換えDNA配列を含み、該組換えDNA配列は該TIL
    細胞中で該組換えタンパク質の発現のためのプロモータ
    ーに作用可能に連結されており、該組換えタンパク質は
    プロホルモンTNFであり、ここで、該プロホルモンTNF
    が、成熟形のTNFの最初の12アミノ酸を欠失しているTNF
    であるTNFΔ（１→12）、成熟形のTNFの最初と12番目の
    アミノ酸を欠失しているTNFであるTNFΔ（１＋12）、ま
    たはＮ末端にγ−インターフェロンシグナルペプチドを
    有する成熟形のTNFであるTNF γ sigである、形質転
    換された生体外ヒト腫瘍浸潤リンパ球（TIL）細胞。
  6. 【請求項６】前記プロホルモンTNFが、成熟形のTNFの最
    初の12アミノ酸を欠失しているTNFであるTNFΔ（１→1
    2）である、請求項５に記載の形質転換された生体外ヒ
    ト腫瘍浸潤リンパ球（TIL）細胞。
  7. 【請求項７】前記プロホルモンTNFが、成熟形のTNFの最
    初と12番目のアミノ酸を欠失しているTNFであるTNFΔ
    （１＋12）である、請求項５に記載の形質転換された生
    体外ヒト腫瘍浸潤リンパ球（TIL）細胞。
  8. 【請求項８】前記プロホルモンTNFが、Ｎ末端にγ−イ
    ンターフェロンシグナルペプチドを有する成熟形のTNF
    であるTNF γ sigである、請求項５に記載の形質転換
    された生体外ヒト腫瘍浸潤リンパ球（TIL）細胞。
  9. 【請求項９】ATCC受託番号第68121号を有する、pU.C.
    FVXM Δ HIII TNF γ sigであって、ここで該プラ
    スミドは、腫瘍細胞に対して細胞毒性または細胞増殖抑
    制性であるタンパク質をコードするDNA配列を含む、pU.
    C. FVXM Δ HIII TNF γ sig。
  10. 【請求項１０】Ｎ末端にγ−インターフェロンシグナル
    ペプチドを有する成熟形のTNFであるTNF γ sigをコ
    ードするDNA配列を含む、ベクター。
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Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5716826A (en) * 1988-03-21 1998-02-10 Chiron Viagene, Inc. Recombinant retroviruses
US5997859A (en) * 1988-03-21 1999-12-07 Chiron Corporation Method for treating a metastatic carcinoma using a conditionally lethal gene
US6569679B1 (en) 1988-03-21 2003-05-27 Chiron Corporation Producer cell that generates adenoviral vectors encoding a cytokine and a conditionally lethal gene
US6133029A (en) * 1988-03-21 2000-10-17 Chiron Corporation Replication defective viral vectors for infecting human cells
US5662896A (en) 1988-03-21 1997-09-02 Chiron Viagene, Inc. Compositions and methods for cancer immunotherapy
EP0897987B1 (en) * 1989-10-24 2001-02-28 Chiron Corporation Secretion of human protein linked to gamma interferon signal peptide
CA2042093C (en) * 1990-05-09 2002-12-24 Gyula Hadlaczky Cell line carrying an excess of mammalian centromeres
WO1991019803A1 (en) * 1990-06-19 1991-12-26 Applied Biotechnology, Incorporated Self assembled, defective, nonself-propagating viral particles
US5817491A (en) * 1990-09-21 1998-10-06 The Regents Of The University Of California VSV G pseusdotyped retroviral vectors
US5512421A (en) * 1991-02-19 1996-04-30 The Regents Of The University Of California Generation, concentration and efficient transfer of VSV-G pseudotyped retroviral vectors
ATE188740T1 (de) * 1991-02-19 2000-01-15 Univ California Viruspartikel mit veraendertem wirtspektrum
WO1993010218A1 (en) * 1991-11-14 1993-05-27 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vectors including foreign genes and negative selective markers
US5436243A (en) * 1993-11-17 1995-07-25 Research Triangle Institute Duke University Aminoanthraquinone derivatives to combat multidrug resistance
JPH09503920A (ja) 1993-11-18 1997-04-22 チロン ビアジーン，インコーポレイティド 条件致死遺伝子を利用する組成物及び方法
US5807746A (en) * 1994-06-13 1998-09-15 Vanderbilt University Method for importing biologically active molecules into cells
US6824767B2 (en) 1994-11-07 2004-11-30 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
US6599719B2 (en) 1994-11-07 2003-07-29 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acid molecules encoding tumor necrosis factor-gamma-alpha
US20030198640A1 (en) * 1994-11-07 2003-10-23 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for treating inflammatory bowel diseases relating to human tumor necrosis factor-gamma-beta
US5665591A (en) * 1994-12-06 1997-09-09 Trustees Of Boston University Regulation of smooth muscle cell proliferation
US6077697A (en) 1996-04-10 2000-06-20 Chromos Molecular Systems, Inc. Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
US20030033617A1 (en) * 1996-04-10 2003-02-13 Gyula Hadlaczky Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
US20020160970A1 (en) * 1996-04-10 2002-10-31 Gyula Hadlaczky Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
US6025155A (en) * 1996-04-10 2000-02-15 Chromos Molecular Systems, Inc. Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
US6544523B1 (en) * 1996-11-13 2003-04-08 Chiron Corporation Mutant forms of Fas ligand and uses thereof
US20020111325A1 (en) * 1997-11-03 2002-08-15 Human Genome Sciences, Inc. VEGI, an inhibitor of angiogenesis and tumor growth
AU5124500A (en) * 1999-04-30 2000-11-17 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
WO2000069909A1 (en) 1999-05-14 2000-11-23 The United States Of America Through The Department Of Veterans Affairs Isolation and characterization of epidermal growth factor related protein
US7049410B2 (en) * 1999-05-14 2006-05-23 Majumdar Adhip P N Antibodies to a novel EGF-receptor related protein (ERRP)
US6432409B1 (en) * 1999-09-14 2002-08-13 Antigen Express, Inc. Hybrid peptides modulate the immune response
US20030235594A1 (en) * 1999-09-14 2003-12-25 Antigen Express, Inc. Ii-Key/antigenic epitope hybrid peptide vaccines
US9289487B2 (en) * 1999-09-14 2016-03-22 Antigen Express, Inc. II-key/antigenic epitope hybrid peptide vaccines
US7687461B2 (en) * 2000-03-02 2010-03-30 Xencor, Inc. Treatment of TNF-α related disorders with TNF-α variant proteins
US7446174B2 (en) 2001-03-02 2008-11-04 Xencor, Inc. Protein based TNF-α variants for the treatment of TNF-α related disorders
US7101974B2 (en) 2000-03-02 2006-09-05 Xencor TNF-αvariants
US20070172449A1 (en) * 2000-03-02 2007-07-26 Xencor, Inc. TNF-alpha VARIANT FORMULATIONS FOR THE TREATMENT OF TNF-alpha RELATED DISORDERS
US7056695B2 (en) 2000-03-02 2006-06-06 Xencor TNF-α variants
US7244823B2 (en) * 2000-03-02 2007-07-17 Xencor TNF-alpha variants proteins for the treatment of TNF-alpha related disorders
US7662367B2 (en) * 2000-03-02 2010-02-16 Xencor, Inc. Pharmaceutical compositions for the treatment of TNF-α related disorders
US20040022787A1 (en) 2000-07-03 2004-02-05 Robert Cohen Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID
DK1322752T3 (da) * 2000-09-28 2010-07-19 Bioriginal Food & Science Corp FAD4, FAD5, FAD5-2, og FAD6-medlemmer af fedtsyredesaturasefamilien og anvendelser deraf
US20030086903A1 (en) * 2001-11-02 2003-05-08 Genvec, Inc. Therapeutic regimen for treating cancer
JP2006515744A (ja) 2002-09-17 2006-06-08 アンテイジエン・エクスプレス・インコーポレーテツド Ｉｉ−Ｋｅｙ／抗原性エピトープハイブリッドペプチドワクチン
US7179645B2 (en) * 2002-09-24 2007-02-20 Antigen Express, Inc. Ii-Key/antigenic epitope hybrid peptide vaccines
RU2377253C2 (ru) * 2002-12-02 2009-12-27 Амген Фремонт,Инк. Антитела, специфичные к фактору некроза опухолей, и их применение
US20040121971A1 (en) * 2002-12-20 2004-06-24 Gang Chen Therapeutic use of tumor necrosis factor-alpha mutein
DE10339905B4 (de) * 2003-08-29 2009-04-23 Kist-Europe Forschungsgesellschaft Mbh Implantierbarer Mikrozellprozessor zur Krankheitsbehandlung
GB0325494D0 (en) * 2003-10-31 2003-12-03 Sbl Vaccin Ab Expression system
WO2005051432A1 (en) * 2003-11-14 2005-06-09 Genvec, Inc. Therapeutic regimen for treating cancer
CA2582353A1 (en) 2004-10-06 2006-04-20 University Of Rochester Treatment of pulmonary hypertension using an agent that inhibits a tissue factor pathway
WO2006078853A2 (en) 2005-01-20 2006-07-27 University Of Rochester Thioredoxin interacting protein (txnip) as regulator of vascular function
WO2006099875A1 (en) 2005-03-23 2006-09-28 Genmab A/S Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
EP2385065A1 (en) 2007-11-01 2011-11-09 Perseid Therapeutics LLC Immunosuppressive polypeptides and nucleic acids
WO2009067216A1 (en) * 2007-11-20 2009-05-28 Beth Israel Deaconess Medical Center Transfection reagent
CA2750922A1 (en) * 2009-01-28 2010-08-05 Antigen Express, Inc. Li-key hybrid peptides that modulate the immune response to influenza
US8772238B2 (en) 2009-03-18 2014-07-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of ixolaris, a tissue factor inhibitor, for the treatment of cancer
EP2440234A4 (en) 2009-06-10 2013-11-06 Univ New York IMMUNOLOGICAL TARGETING OF PATHOLOGICAL TAU PROTEINS
US9605844B2 (en) * 2009-09-01 2017-03-28 Cree, Inc. Lighting device with heat dissipation elements
ES2743507T3 (es) 2009-11-02 2020-02-19 Univ Emory Inmunoterapia resistente a fármaco para el tratamiento de un cáncer
WO2012092341A1 (en) 2010-12-28 2012-07-05 University Of Rochester Methods of modifying insulin signaling using biliverdin reductase (bvr) and bvr derived peptides
ES2791760T3 (es) 2011-09-07 2020-11-05 Sinai School Medicine Ceramidasa y diferenciación celular
EP2908853B1 (en) 2012-10-21 2018-12-05 University Of Rochester Thy1 (cd90) as a therapy to control adipose tissue accumulation
US9822418B2 (en) 2013-04-22 2017-11-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Mutations in PDGFRB and NOTCH3 as causes of autosomal dominant infantile myofibromatosis
KR20180086183A (ko) 2015-09-03 2018-07-30 더 유에이비 리서치 파운데이션 유전자 조작 약물 내성 t 세포 및 이것의 사용 방법
WO2017079442A1 (en) 2015-11-04 2017-05-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Methods of treating tumors and cancer, and identifying candidate subjects for such treatment
US11246868B2 (en) 2016-04-26 2022-02-15 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Treatment of hippo pathway mutant tumors and methods of identifying subjects as candidates for treatment

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4405712A (en) * 1981-07-01 1983-09-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services LTR-Vectors
US4678751A (en) * 1981-09-25 1987-07-07 Genentech, Inc. Hybrid human leukocyte interferons
US4603112A (en) * 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4769330A (en) * 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
IL68366A (en) * 1982-04-15 1990-08-31 Genentech Inc Process for expressing a gene encoding a protein comprising the enzymatic portion of human urokinase in a microorganism or cell culture
US4650764A (en) * 1983-04-12 1987-03-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Helper cell
US4518584A (en) * 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
GB8324800D0 (en) * 1983-09-15 1983-10-19 Pasteur Institut Antigens
FR2559159B1 (fr) * 1984-02-02 1986-09-12 Inst Nat Sante Rech Med Vecteurs viraux de clonage et d'expression d'une proteine dans une cellule eucaryote, comportant au moins une partie du genome d'un retro-virus; cellules eucaryotes transfectees; procede utilisant de telles cellules et proteines obtenues
US5288852A (en) * 1984-03-06 1994-02-22 Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd. Human tumor necrosis factor polypeptides
US4663281A (en) * 1984-03-22 1987-05-05 Mass Institute Of Technology Enhanced production of proteinaceous materials in eucaryotic cells
US4879226A (en) * 1984-04-06 1989-11-07 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Novel human physiologically active polypeptide
WO1985005629A1 (en) * 1984-05-25 1985-12-19 Dana-Farber Cancer Institute Ltr vectors, methods of preparation and use
US4738922A (en) * 1984-05-25 1988-04-19 Dana Farber Cancer Institute Trans-acting transcriptional factors
WO1985005618A1 (en) * 1984-06-06 1985-12-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for preparing interferon derivative
WO1986000930A1 (en) * 1984-07-20 1986-02-13 Worcester Foundation For Experimental Biology Retroviral vaccines and vectors and methods for their construction
WO1986000922A1 (en) * 1984-07-30 1986-02-13 The Salk Institute For Biological Studies Retroviral gene transfer vectors
GB8424757D0 (en) * 1984-10-01 1984-11-07 Pasteur Institut Retroviral vector
EP0200748B1 (en) * 1984-10-15 1991-02-06 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4677063A (en) * 1985-05-02 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4677064A (en) * 1984-11-09 1987-06-30 Cetus Corporation Human tumor necrosis factor
US4725669A (en) * 1984-11-09 1988-02-16 President And Fellows Of Harvard College Assay for detecting infection by human T-cell lymphotropic virus-III
EP0368367A1 (en) * 1984-12-21 1990-05-16 Biogen, Inc. Purification, production and use of tumor necrosis factors
US4847201A (en) * 1985-02-05 1989-07-11 Cetus Corporation DNA encoding for CSF-1 and accompanying recombinant systems
EP0196864A3 (en) * 1985-03-25 1988-03-23 Cetus Corporation Alkaline phosphatase-mediated processing and secretion of recombinant proteins, dna sequences for use therein and cells transformed using such sequences
JP2703893B2 (ja) * 1985-07-05 1998-01-26 ホワイトヘッド・インスティテュ−ト・フォ−・バイオメディカル・リサ−チ 外来遺伝子物質を発現する上皮細胞
US4980286A (en) * 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US5604293A (en) * 1985-09-12 1997-02-18 Scios Inc. Recombinant human basic fibroblast growth factor
US4894439A (en) * 1986-05-22 1990-01-16 Cetus Corporation N-terminal derivatives of tumor necrosis factor purified by microporous PTFE membranes
US5091309A (en) * 1986-01-16 1992-02-25 Washington University Sindbis virus vectors
ATE116367T1 (de) * 1986-02-04 1995-01-15 Den Ichi Mizuno Für antitumor-polypeptide kodierende dns, die polypeptide und diese polypeptide enthaltenden antitumor-wirkstoffe.
US4822605A (en) * 1986-02-18 1989-04-18 Exovir, Inc. Compositions and methods employing the same for the treatment of viral and cancerous skin lesions and the like
ATE169672T1 (de) * 1986-03-07 1998-08-15 Chiron Corp Rekombinantes ricin-toxin
US5206352A (en) * 1986-03-28 1993-04-27 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Compositions for clones containing DNA sequences associated with multidrug resistance in human cells
US4752565A (en) * 1986-04-07 1988-06-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Cell line producing AIDS viral antigens without producing infectious virus particles
FR2606029B2 (fr) * 1986-04-08 1989-02-03 Transgene Sa Vecteur viral et adn recombinant codant pour une glycoproteine du virus agent causal du s.i.d.a., culture cellulaire infectee par ce vecteur, procede de preparation de la glycoproteine, glycoproteine obtenue, vaccin et anticorps obtenus
CA1310924C (en) * 1986-04-24 1992-12-01 Francis P. Mccormick Infective drug delivery system
US4861719A (en) * 1986-04-25 1989-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA constructs for retrovirus packaging cell lines
US4868119A (en) * 1986-12-11 1989-09-19 Genetics Institute, Inc. Hematopoietic growth factors
DE3750056T2 (de) * 1986-06-20 1995-04-06 Dainippon Pharmaceutical Co Polypeptid-Mutanten des menschlichen TNF und für diese Mutanten codierende DNS.
JPS6332486A (ja) * 1986-07-25 1988-02-12 Teijin Ltd 新規生理活性ポリペプチド
FR2606030B1 (fr) * 1986-10-31 1989-10-20 Pasteur Institut Retrovirus recombinant defectif, son procede de fabrication et ses applications, notamment pour l'etude de l'interaction des retrovirus sauvages avec des lignees cellulaires infectables par celui-ci
EP0279582A3 (en) * 1987-02-17 1989-10-18 Pharming B.V. Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
WO1988006625A2 (en) * 1987-02-26 1988-09-07 Cetus Corporation Arginine-depleted human tumor necrosis factor
US5276019A (en) * 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4980289A (en) * 1987-04-27 1990-12-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Promoter deficient retroviral vector
DE3854313D1 (de) * 1987-05-29 1995-09-21 Dana Farber Cancer Inst Inc Cis-Wirkung-Repressionen-Sequenzen, Cis-Wirkung-Antirepressionen-Sequenzen, Vektoren, Verfahren zur Vorbereitung und Anwendung.
EP0317649A4 (en) * 1987-06-17 1990-11-28 Teijin Limited Novel plasmid, microbial cells, process for preparing polypeptide with oncostatic activity, and secreted polypeptide with oncostatic activity
US4873316A (en) * 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
ATE83008T1 (de) * 1987-07-21 1992-12-15 Du Pont Merck Pharma Verfahren fuer die herstellung von in tierischen zellen stabilen und lebensfaehigen rekombinanten viralen vektoren.
US5306631A (en) * 1987-08-21 1994-04-26 University Of Colorado Foundation, Inc. Compositions and method for inhibition of HIV production
WO1989001973A2 (en) * 1987-09-02 1989-03-09 Applied Biotechnology, Inc. Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens
US5175385A (en) * 1987-09-03 1992-12-29 Ohio University/Edison Animal Biotechnolgy Center Virus-resistant transgenic mice
US5246924A (en) * 1987-09-03 1993-09-21 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Method for treating hepatitis B virus infections using 1-(2'-deoxy-2'-fluoro-beta-D-arabinofuranosyl)-5-ethyluracil
JP3015383B2 (ja) * 1987-09-11 2000-03-06 ホワイトヘツド・インスチチユート・フオー・バイオメデイカル・リサーチ 形質導入した線維芽およびそれらの使用
WO1989005349A1 (en) * 1987-12-09 1989-06-15 The Australian National University Method of combating viral infections
DE3851153T2 (de) * 1987-12-11 1995-01-05 Hughes Howard Med Inst Genetische modifizierung von endothelialen zellen.
AU3069189A (en) * 1988-02-05 1989-08-25 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Retroviral packaging cell lines and processes of using same
CN1038306A (zh) * 1988-03-21 1989-12-27 维吉恩公司 重组反转录病毒
JPH0797997B2 (ja) * 1988-04-28 1995-10-25 帝人株式会社 新規生理活性ポリペプチド
US5262309A (en) * 1988-09-22 1993-11-16 Teijin Limited Terminal modifications of tumor necrosis factor
DE3841762A1 (de) * 1988-12-12 1990-06-13 Basf Ag Neue tnf-peptide
US5399346A (en) * 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5126132A (en) * 1989-08-21 1992-06-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Tumor infiltrating lymphocytes as a treatment modality for human cancer
EP0897987B1 (en) * 1989-10-24 2001-02-28 Chiron Corporation Secretion of human protein linked to gamma interferon signal peptide
US5032519A (en) * 1989-10-24 1991-07-16 The Regents Of The Univ. Of California Method for producing secretable glycosyltransferases and other Golgi processing enzymes
US5281475A (en) * 1991-10-17 1994-01-25 W. L. Gore & Associates, Inc. Continuous polytetrafluoroethylene fibers
GB2268853A (en) * 1992-07-09 1994-01-19 Secr Defence Colour television display projection device

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｓｕｐｐｌ．１２Ｂ（１９８８）ｐ．１７１，Ａｂｓ．Ｈ１０５
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．３１９，Ｎｏ．２５（１９８８）ｐ．１６７６−１６８０

Also Published As

Publication number Publication date
EP0497922A1 (en) 1992-08-12
US5849586A (en) 1998-12-15
ATE199398T1 (de) 2001-03-15
EP0897987A2 (en) 1999-02-24
AU3664695A (en) 1996-03-21
DE69033911D1 (de) 2002-03-14
JPH05504681A (ja) 1993-07-22
US6071512A (en) 2000-06-06
AU661652B2 (en) 1995-08-03
US5863797A (en) 1999-01-26
US5889156A (en) 1999-03-30
AU6956691A (en) 1991-05-31
EP0897987A3 (en) 1999-03-03
EP0497922B1 (en) 2002-01-30
EP0897987B1 (en) 2001-02-28
DE69033710D1 (de) 2001-04-12
WO1991006658A3 (en) 1991-10-17
ATE212672T1 (de) 2002-02-15
DE69033710T2 (de) 2001-06-13
CA2067821A1 (en) 1991-04-25
US5324655A (en) 1994-06-28
US5874077A (en) 1999-02-23
JP2000270883A (ja) 2000-10-03
WO1991006658A2 (en) 1991-05-16

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