JP2914692B2 - 内皮細胞の遺伝子修飾 - Google Patents

内皮細胞の遺伝子修飾

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Description

【発明の詳細な説明】 説明 技術背景 内皮は、縁と縁で互いに結合している偏平な透明な細
胞の単一層であり、その結果これらの細胞は細胞の膜を
形成している。内皮細胞は、中胚葉（embryonic mesobl
ast or mesoderm）から発達中に生じる。それらは目の
前眼房において漿膜（serous membranes）の自由表面及
び脳及び脊髄の表面に生じる。更に、それらは、心臓、
血管及びリンパ管の内膜を形成する。
近年開発された方法を用いて、異種間の（interspeci
es）遺伝子組換えを行うことが可能である。異なる生物
学的種類由来の遺伝子を選ばれた生物中で複製及び発現
させることができる。故に、他の種類の生物の特徴であ
る代謝又は合成機能（例えば、ホルモン合成、タンパク
質合成、窒素固定）を特定する微生物遺伝子を特定のウ
イルス又はプラスミドレプリコンに連結することによ
り、これらの遺伝子を微生物に導入することが可能であ
る。1970年代の後期以来、クローン化DNA配列を哺乳動
物細胞に導入するための一般的方法の開発に向けて進歩
があった。しかしながら、現時点では、目的に選ばれた
遺伝物質を内皮細胞に安定に導入しそして内皮細胞にそ
れを発現させ、かくしてコードされたタンパク質又はポ
リペプチドを生産するする有効な方法に対する要求があ
る。
本発明の要約 本発明は、遺伝子工学的に作り出された内皮細胞、特
に、例えば目的の遺伝物質を含む組み換えゲノムを持っ
たレトロウイルスベクターによって、内皮細胞に導入さ
れた目的の選ばれた遺伝物質（DNA又はRNA）を発現する
遺伝子工学的に作り出された内皮細胞に関する。本発明
は、このような遺伝物質を内皮細胞に安定に導入する方
法及びこの遺伝子工学的に作り出された内皮細胞を使用
する方法にも関する。
本発明の内皮細胞には、内皮細胞で生産することを所
望される生成物（例えばタンパク質又はポリペプチド）
をコードする目的の遺伝物質が安定に導入されている。
この修飾された内皮細胞は、導入された遺伝物質を発現
する（コードされた生成物を生産する）。目的のこの遺
伝物質は、本明細書では以後導入された遺伝物質と呼
ぶ。導入された遺伝物質は、目的の選ばれたDNA（例え
ば目的の生成物をコードしている遺伝子のすべて又は一
部）又は目的のRNAであることができる。それは、例え
ば、普通の内皮細胞中に存在しそして普通の内皮細胞に
より発現されるDNA又はRNA;内皮細胞中に普通は存在し
ないDNA又はRNA;内皮細胞地中に普通は存在するが、生
物学的に有意なレべル（即ち、それがコードしているタ
ンパク質又はポリペプチドの普通の生物学的作用を生じ
るのに十分なレベル）には内皮細胞中で発現されないDN
A又はRNA;内皮細胞中に存在しそして内皮細胞中で発現
されるように修飾されたDNA又はRNA;内皮細胞中で発現
されるように修飾されうるDNA又はRNAであることがで
き、これらは単独又は組み合わせでであることができ
る。本発明の内皮細胞は、選択可能なマーカーをコード
している遺伝物質を発現することもでき、かくして導入
された遺伝物質を発現する細胞を同定及び選択するため
の手段を提供する。導入された遺伝物質を含む内皮細胞
は、形質導入された内皮細胞と呼ぶ。
特に、内皮細胞中では生物学的に有意なレベルには発
現されない目的のポリペプチド又はタンパク質をコード
している遺伝物質を包含する遺伝物質で内皮細胞に安定
に形質導入するのにレトロウイルスベクターが使用され
た。このようにして導入された遺伝物質には、主要な選
択可能なマーカーをコードしている遺伝物質も包含され
た。目的のポリペプチドをコードしているDNAと主要な
選択可能なマーカーをコードしているDNAを含む遺伝物
質が培養される内皮細胞に導入された。これらの遺伝子
が導入された内皮細胞（即ち、レトロウイルスベクター
の使用により形質導入された内皮細胞）によるこれらの
遺伝子の発現も又証明された。
形質導入された内皮細胞が含んでいる導入された遺伝
物質を発現する該形質導入された内皮細胞を移植する方
法も又本発明の目的である。本発明の形質導入された内
皮細胞は、人口移植組織（例えば、個体の１つの部位か
ら他の部位に移植された脈管；豚などの他の動物から個
体に移植された脈管；血管再形成術に使用されるダクロ
ン及びポリテトラフルオロエチレンなどの合成材料から
製造された脈管）を改良するため及び現在経口的に投与
されている予防及び治療又は処置に有用なポリペプチド
又はタンパク質の組織送給（constitutive delivery）
を与えるために特に有用である。
本発明の内皮細胞には多くの利点がある。例えば、本
発明の内皮細胞は、移植組織の内表面に内皮細胞が接種
（seed）又は結合する能力を高め又は改良すること；移
植組織をライニングするのに使用される内皮細胞を、該
内皮細胞が増殖するように修飾すること；又は現在入手
可能な移植組織で起こる、移植組織端部を狭め、最終的
に閉塞させる移植組織端部で平滑筋細胞の増殖の問題を
克服することにより、内皮細胞でライニングされた人口
移植組織の特性を改良するようにデザインすることがで
きる。更に、本発明の形質導入された内皮細胞、薬剤、
ホルモン又は酵素送給システム（delivery system）を
得るのに使用することができる。
例えば、重要器官又は四肢を灌流する疾患のある動脈
の代わりに人口動脈移植片が使用される。しかしなが
ら、最近入手可能な移植片は通常合成材料から製造され
ており、多くの合併症にかかりやすく、その最悪のもの
は高率の再狭窄（re−stenosis）又は閉塞（occlusio
n）である。動物での研究においては、移植前に自己由
来の内皮細胞で移植片をライニングすることによって
は、付随する疾患性の結果を伴う移植片再閉塞を減少さ
せるが阻止はしないことが示唆される。内皮細胞は移植
された移植片に関してそれらの性能を改良するように本
発明に従って修飾することができる。例としては、管腔
内血餅形成を防止するトランスメンブラン血栓融解剤の
分泌又は発現、平滑筋肥大による内腔狭窄を防止する平
滑筋増殖の抑制剤の分泌、内皮細胞増殖を刺激しそして
移植片内腔の内皮細胞ライニングの速度又は期間を改良
するための内皮細胞マイトジェン又はオートクリン因子
（autocrine factor）の発現及び／又は分泌が包含され
る。
追加の用途は、動脈弁の性能／長寿命を改良する試み
において、形質導入された内皮細胞で人口心臓弁の表面
を被覆することである。
固有のポリペプチドをコードしている導入された遺伝
物質を含む内皮細胞でライニングされた血管移植組織
は、コードされたポリペプチドを合成し、かくしてその
ポリペプチドの連続送給システメとして作用する。この
ようにして、ホルモン又は他のポリペプチドが、移植組
織を受けた個体の血流中に直接分泌される。
重要な利点は、現在では静脈内に、筋肉内に又は皮下
に投与される治療タンパク質（例えば、ホルモン、酵
素、血餅形成因子）を投与するのに、本発明の遺伝子工
学的に作り出された内皮細胞を使用することができる。
ということである。更に、一般に単離されたポリペプチ
ド（例えばインシュリン）に必要なことである。個体に
投与する前のポリペプチドの長々しい（そしてしばしば
コストのかかる）精製の必要がない。本発明に従って修
飾された内皮細胞は、普通に生産されるとおりのポリペ
プチドホルモンを生成する。
遺伝子工学的に作り出された内皮細胞のライニング人
口動脈移植組織の使用の他の利点は、特定の器官又は四
肢への治療レベルの分泌生成物の送給を目標にすること
ができることである。分泌された生成物は、移植された
動脈により灌流される組織に高濃度で送給され、それに
より目標とした解剖学的部位に所望の効果を達成する。
この生成物は、次いで、心臓に戻る間に静脈循環器中で
非治療レベルに希釈されるであろう。例えば、血管形成
性因子を生産する本発明の形質導入された内皮細胞を含
む１個又はそれより多くの脈管を、循環が弱っていて
（例えば真性糖尿病の合併症として）足への血流が不十
分である個体の足に移植することができる。この結果、
移植された脈管の部位の近くに高濃度のコードされた生
成物（血管形成性因子）をもたらし、かくして生成物の
治療学的に利用性を最大とする。血液が末端から流れる
につれて、血管形成性因子の濃度は非治療レベルに減少
する。
本発明の送給システムの他の重要な利点は、連結送給
システムである故に、ポリペプチドホルモンが非常に短
い半減期を有することが制限とはならないということで
ある。例えば、ヒト成長ホルモン（HGH）の半減期は約1
9分であり、傍甲状腺ホルモンの半減期は約21/2−５分
であり、天然インシュリン（純粋インシュリン）の半減
期は約３−４分である。
遺伝子はレトロウイルスベクターを使用して内皮細胞
に導入されるので、それらはレトロウイルスベクター制
御に基づく（に従う）ことができ、このような場合に
は、目的の遺伝子はレトロウイルスプロモーターから転
写される。プロモーターは、RNA合成を開始するRNAポリ
メラーゼ分子により認識される特異的ヌクレオチド配列
である。別法として、目的の遺伝物質の転写を引き受け
る追加のプロモーター要素（組換えレトロウイルスに導
入されたプロモーターに加えて）を持ったレトロウイル
スベクターを使用することができる。例えば、外部因子
又はcueによりモジュレートされた追加のプロモーター
が存在する構築物を使用することができ、それによりそ
の外部因子又はcueを活性化させることにより内皮細胞
によって生産されるポリペプチドのレベルを制御するこ
とが可能である。例えば、熱ショックタンパク質は、プ
ロモーターが温度により調節される遺伝子によりコード
されたタンパク質である。金属含有タンパク質メクロチ
オニンをコードする遺伝子のプロモーターは、カドミウ
ム（Cd++）イオンに応答性である。外部cueにより影響
されるこのプロモーター又は他のプロモーターの導入
は、遺伝子工学的に作り出された内皮細胞によるポリペ
プチドの生産を調節することも可能とする。
図面の簡単な説明 第１図は、野性型ネズミ白血病ウイルス（レトロウイ
ルス）ゲノムの略図である。
第２図は、本発明に有用な組換えゲノムを各々が有し
ているレトロウイルスベクターの略図である。第2a図は
pLJであり、第2b図はpEMである。
第３図は、第2a図で示されたpLJベクター及びヒト傍
甲状腺ホルモン遺伝子を使用する組換えレトロウイルス
ベクターの構築の略図である。
第４図は、低密度リポタンパク質受容体（LDLR）を発
現するレトロウイルスで感染されたウシ大動脈内皮細胞
の、蛍光標識LDLの取り込みについて分析した映像であ
る。パネルＡ−位相差顕微鏡下での未感染ウシ大動脈内
皮細胞；パネルＢ−：蛍光照明下の未感染ウシ大動脈内
皮細胞；パネルＣ−位相差顕微鏡下の感染ウシ大動脈内
皮細胞；パネルＤ−蛍光照明下の感染ウシ大動脈内皮細
胞。
第５図は、β−ガラクトシダーゼを発現するレトロウ
イルスで感染したウシ大動脈内皮細胞の、その場の組織
化学的染色を使用してその発現をぶんせくした映像であ
る。パネルＡ−β−ガラクトシダーゼ活性について染色
された未感染ウシ大動脈内皮細胞；パネルＢ−β−ガラ
クトシダーゼ活性について染色された感染サレタ未選択
ウシ大動脈内皮細胞。
本発明の詳細な説明 目的の遺伝物質を内皮細胞に導入し、得られる遺伝子
工学的に作り出された内皮細胞で発現させた。説明した
方法に従って内皮細胞に導入される目的の遺伝物質は、
目的の選ばれたDNA（例えば目的の生成物をコードして
いる遺伝子のすべて又は一部）又は目的のRNAであるこ
とができる。それは、例えば、普通の内皮細胞中に存在
しそして普通の内皮細胞により発現されるDNA又はRNA;
内皮細胞中に普通は存在しないDNA又はRNA;内皮細胞地
中に普通は存在するが、生物学的に有意なレベル（即
ち、それがコードしているタンパク質又はポリペプチド
の普通の生理学的作用を生じるのに十分なレベル）には
内皮細胞中で発現されないDNA又はRNA;内皮細胞中に存
在しそして内皮細胞中で発現されうるように修飾された
DNA又はRNA;内皮細胞中で発現されるように修飾されう
るDNA又はRNAであることができ、これらは単独又はこれ
らの組み合わせであってもよい。目的のこの遺伝物質は
本明細書では導入された遺伝物質と呼ぶ。本発明の内皮
細胞は、導入された遺伝物質を発現する。本発明の内皮
細胞により発現される導入された遺伝物質（即ち、DNA
又はRNA）は、目的のポリペプチド又はタンパク質をコ
ードしている遺伝物質（目的の遺伝物質）である。本発
明の内皮細胞は、選択可能なマーカーをコードしている
遺伝子も含みそして発現させることができる。例えば、
ヒト内皮細胞に普通に存在しそしてヒト内皮細胞により
発現されるDNAである目的の遺伝物質は、異常内皮細胞
（例えば、異常な量の該DNAを含むか、又はこのような
遺伝物質を含有するが十分に発現はしない）に導入する
ことができ、その結果、これらの異常内皮細胞は所望の
タンパク質又はポリペプチドを生産することができる。
実施された他の例では、ホルモンをコードしている遺
伝物質を、組換えゲノムを持ったウイルスを含む培地に
内皮細胞を暴露することにより（即ち内皮細胞を感染さ
せることにより）内皮細胞に導入した。使用した培地
は、プロデューサー細胞（例えば、Psi am又はアンフォ
トロピックプロデューサー（ampotropic producer））
を増殖させた培地を回収することにより得られる。即
ち、プロデューサー細胞を、仔ウシ血清（CS）10％及び
ペニシリン及びストレプトマイシンを含むダルベッコの
修飾されたイーグルの培地（Dulbecco′s Modified Eag
le′s medium）中で集密的密度（confluent density）
に組織培養で増殖させた。新たな培地を加え、その後に
（例えば、約12時間後）培地を回収する。集密的プロデ
ーサー細胞の10cmプレートから約10mlの培地を回収す
る。使用済み培地（spent media）（又はウイルススト
ック）を、0.45ミクロンのミリポアフィルター（Milipo
re filter）フィルターを通して過して、離れたプロ
デューサー細胞を除去し、そして直ちに細胞を感染させ
るのに使用するか又は−70℃で保存する。内皮細胞（受
容内皮細胞）の集密以下のプレート（subconfluent pla
te）から除去し、ポリブレン（Polybrene）（アルドリ
ッヒ）8mcg/mlを含むウイルスストック（例えば、5ml/1
0cmプレート）で迅速に置き換える。その後（例えば、
約12時間後）、これを除去しそして新たな培地で置き換
える。かくして、使用された培地はウイルス上澄液であ
る。感染性ウイルスの組換えゲノムは、内皮細胞に導入
される、目的の遺伝物質を含む。組換えゲノムは主要な
選択可能なマーカーをコードしている遺伝物質も有する
ことができる。結果として、内皮細胞により普通は生物
学的に有意なレベルでは発現されないポリペプチド及び
随意に主要な選択可能なマーカーを発現する内皮細胞が
製造された。
特に、Psi am細胞で生産された感染性ウイルスを含む
培地に内皮細胞を暴露する。この感染性ウイルスは、目
的の遺伝物質を有する組換えゲノムを含む。１つの例に
おける組換えゲノムは、ヒト傍甲状腺ホルモン（hPTH）
をコードしている遺伝物質を含む。場合により、それは
主要な選択可能なマーカー（例えば、バクテリアに対す
るネオマイシン耐性及び哺乳動物細胞におけるG418耐性
をコードするneo遺伝子）も含むことができる。結果と
して、内皮細胞は形質導入される。即ち、目的の遺伝物
質（この場合にはhPTH及び随意にneo遺伝子をコードし
ているDNA）は内皮細胞に安定に導入される。形質導入
された内皮細胞は、コードされたhPTHを発現し、そして
neo遺伝子が存在するならば、それも発現して、選択可
能なマーカーを持った細胞を生じさせる。
別法として、組換えゲノムが目的の遺伝物質（例え
ば、目的の遺伝子又はその一部、あるいは目的のRNA）
を含んでいる感染性ウイルスを含有する培地に暴露する
結果として、内皮細胞は形質導入される。下記するよう
に、内皮細胞は、分泌生成物（ヒト傍甲状腺ホルモン又
はhPTH）をコードする遺伝子；膜受容体（低密度リポタ
ンパク質受容体又はLDLR）；及び細胞内酵素（β−ガラ
クトシダーゼ）をコードしている遺伝子で形質導入され
た。
導入された遺伝物質を発現する内皮細胞を、組織培養
容器中で集密状態まで増殖させ；内皮細胞を増殖させた
培養容器から取り出し；身体に導入するか又は身体に移
植する。これらは、幾つかの方法の１つにより受容者に
導入することができる。例えば、形質導入された内皮細
胞を人口脈管の内腔に接種することができる。内皮細胞
は集密化するまで増殖し、脈管の内腔を覆うであろう。
これらは、新脈管内膜（天然の脈管の脈管内膜及び媒体
（即ち、平滑筋細胞の深い層を持った内皮細胞の被覆）
に類似する良く組織化された構造）と呼ばれたライニン
グを形成する。
別法として、内皮細胞は、カテーテルの使用により生
体内で血管の表面に移植することができる。それらは、
膜腔、胸膜腔、心膜腔などの、漿膜によりライニングさ
れている体腔に導入することも可能である。この場合
に、内皮細胞を漿膜に接種しそして体腔に生成物を分泌
するであろう。次いで生成物はリンパ系を介して吸収さ
れるであろう。
実施された他の例は、自己由来のレトロウイルス形質
導入内皮細胞を接種された血管移植片を犬に移植するこ
とである。アンフォトロピックな宿主範囲を持った複製
欠陥性レトロウイルスを使用して内皮細胞のゲノムにレ
ポーター遺伝子を安定に導入した。lacZ遺伝子をレポー
ター遺伝子として使用した。その理由は、その発現生成
物であるβ−ガラクトシダーゼはその細胞の細胞質を青
に染める酵素組織化学的アッセイの使用によりその場で
検出することができるからである。
成熟雑種犬から採取した外頸部静脈を内皮細胞のソー
スとして使用し、これを２連続継代培養により10−14日
間の間試験管内で平板培養した。各動物からの細胞を２
つのアリクォートに分け、そして複製欠陥性レトロウイ
ルスで感染させるか又はモック感染させた（mock infec
ted）。小さな直径のダクロン移植片に自己由来のクロ
ット法（autologous clotmethod）により内皮細胞を集
密以下の密度で接種し、そして、これを細胞を採取した
犬に頸動脈間移植片（carotid interposition grafts）
として外科的に移植した。各犬は遺伝子工学的に修飾さ
れた細胞を接種された移植片及びモック感染した細胞を
接種された対側移植片（contralateral graft）を受け
取った。移植から５週間後、移植片を回収しそして分析
した。
更に詳細に特徴付けることを可能とするために移植片
の一部の内腔表面から細胞を酵素的に採取した。細胞の
初代培養を確立しそして分析の前に約２−３週間試験管
内で増大させた（expande）。遺伝子工学的に修飾され
た細胞をこの母集団においてサザーン分析法及びウイル
ス発現β−ガラクトシダーゼに対する細胞化学的アッセ
イにより同定した。移植片から採取されそして試験管内
で増大した細胞の大部分は、分化した（differetiate
d）内皮機能を保持していた（95％未満）。しかしなが
ら、ウイルス指令のβ−ガラクトシダーゼを発現するか
又はプロウイルス配列を含んだ細胞の割合は、接種時点
で分析した培養物に比べて２−10倍一貫して減少した。
この相異は、一部は、間隙での又は吻合部からの増殖に
よる内在性細胞による移植片の部分的再母集団（repopu
lation）による。
この検討の結果は、自己由来の遺伝子工学的に修飾さ
れた内皮細胞を接種された血管移植片を移植することが
実行可能であることを証明する。形質導入された細胞
は、移植片の内腔で少なくとも２週間は生き残りそして
移された遺伝子は機能し続ける。
内皮細胞の単離 多くの種の脊椎動物の毛細管及び大きい脈管（例え
ば、動脈、静脈）からの内皮細胞の単離及び維持は、文
献に十分記載されている。例えば、マクギール及びオル
キンは、小動物の大きい脈管からの内皮細胞培養しそし
て継代する簡単な方法を述べている。マクギール、アー
ル・ダブリュ（McGuire,R.W.）及びアール・ダブリュ、
オルキン（R.W.,Orkin）、バイオテクニックス（Biotec
hniques）、5:546−554（1987）。
しばしば仔ウシ大動脈が内皮細胞のソースである。本
明細書で述べた最初の研究はその場合である。大動脈か
ら内皮細胞を単離するためのプロトコルを下記する。採
取したばかりの大動脈の切片を、無菌条件下に、コラゲ
ナーゼを含む（例えば0.5mg/ml）溶液中に37℃で15−20
分間入れる。次いで大動脈を組織培養培地（例えば、PR
MI1640）で２回洗浄し、ブーイズ等の方法に従って穏や
かな撹拌により、内皮細胞の内腔シートを完全培地（15
mmヘペス、pH7.4、ペニシリン／ストレプトマイシン及
び20％ウシ胎児血清を含有するRPMI）中に取り出す。ブ
ーイズ・エフ・エム（Booyse F.M.）等、トロンボシス
・ダイアス・ヘモール（Thrombosis Diath.Haemorr
h）、34:825−839（1975）。細胞パッチ（cell patche
s）を完全培地中で組織培養フラスコに移す。
細胞は分裂し、最終的にプレートを覆う。プレートが
集密状態になったとき、細胞を標準組織培養法を使用し
て継代することができる。培養物の純度は、内皮細胞に
より特異的に吸収される蛍光標識アセチル化LDLの吸収
により評価される。培養物が純粋でなかったならば（即
ち、平滑筋細胞又は線維芽細胞などの内皮細胞以外の細
胞で汚染されている）、内皮細胞を限界希釈法によりク
ローニングしそして増殖させて純粋な培養物を得る。内
皮細胞の寿命は培養物により限定されるが、解剖学的ソ
ース及び供与者の動物に依存して顕著に変わる。ウシ大
動脈内皮細胞は少なくとも15−20継代にわたり培養物に
おいて維持された。
レトロウイルスベクター レトロウイルスはRNAウイルスである。即ち、ウイル
スゲノムはRNAである。しかしながら、このゲノムRNAは
DNA中間体に逆転写され、このDNA中間体は感染細胞の染
色体DNAに非常に効率良く組み込まれる。この組み込ま
れたDNA中間体はプロウイルスと呼ばれる。第１図に示
されたように、レトロウイルスゲノム及びプロウイルス
DNAは、３つの遺伝子:gag、pol及びenvを有しており、
これらの遺伝子は２つの長い末端反復（LTR）配列によ
りフランクされている（flanked）。gag遺伝子は内部構
造（ヌクレオカプシド）タンパク質をコードしており、
pol遺伝子はRNA依存性DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）
をコードしており、env遺伝子はウイルスエンベロープ
糖タンパク質をコードしている。５′及び３′LTRは、
ピリオンRNAの転写及びポリアデニル化を促進する作用
をする。
５′LTRに隣接しているのは、ゲノムの逆転写のため
に必要な配列（tRNAプライマー結合部位）及びウイルス
RNAを有効にカプシドで包んで粒子とするのに必要な配
列である。ムリガン、アール・シー（Mulligan.R.
C.）、遺伝子発現の実験操作（Experimental Manipulta
ion of Gene Expression）、エム・イノウエ（編者）、
155−173（1983）；マン、アール（Mann,R.,）等、セ
ル、33:153−159（1983）；コーン、アール・デイ（Con
e,R.D.）及びアール・シー・ムリガン、プロシーディン
グス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス、ユー・エス・エー、81:6349−6353（1984］。
カプシドに包む（又はレトロウイルスRNAを包んで感
染性ビリオンとする）ために必要な配列がウイルスゲノ
ムから欠けているならば、その結果は、ゲノムRNAをカ
プシドに包むことを妨害するシス欠陥（cisdefect）で
ある。しかしながら、得られる突然変異体は依然として
すべてのビリオンタンパク質の合成を指令することがで
きる。ムリガン及び共同研究者は、これらのPsi配列が
欠失したレトロウイルスのゲノム及び染色体に安定した
組み込まれたこの突然変異体を含む細胞系を記載してい
る。ムリガン、アール・シール（Mulligan,R.C.）、遺
伝子発現の実験操作（Experimental Manipulation of G
ene Expression）、エム・イノウエ（編者）、155−173
（1983）；マン、アール（Mann,R.,）等、セル、33:153
−159（1983）；コーン、アール・デイ（Cone,R.D.）及
びアール・シー・ムリガン、プロシーディングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス、ユ
ー・エス・エー、81:6349−6353（1984）。これらの刊
行物の教示を本明細書に加入する。
ムリガン及び共同研究者により延べられたように、Ps
i2細胞系は、下記のようにして構築された。ウイルスRN
Aをカプシドに包んでビリオンとすることに関係した領
域又はゲノム（第１図のPsi配列）が欠失している突然
変異体ネズミ白血病ウイルス（MuL V）ゲノムを構築し
た。このゲノムはDNAコトランスフォーメイションによ
りNIH3T3に安定に導入された。そしてカプシドで包むた
めに使用されるウイルスタンパク質のすべてを生産する
安定な形質転換体であるが、まだ未成熟な（budded）非
感染性粒子を単離した。MuL Vの突然変異体は、推定env
mRN4 5′スプライス部位とPr65yagのコード配列を開始
するAUGとの間で感染性プロウイルスDNAクローンから35
1ヌクレオチドを欠失させることにより構築した。この
欠失はBal1部位からPst1部位までなされ、そして欠失の
店でHindIII部位が発生した。
pMOV.（pMOVPsi-）は下記の如く構築した。３つの生
成したDNA断片を一緒に連結してpMOVPsi-を構築いた。
第１のものは、pMOVPsi+をXhoIで完全に消化し、続いて
Eco RIで部分的に消化することにより得られた。シュマ
コフ・アイ（Chumakov I.）等、ジャーナル・オブ・ビ
ロロジー、42:1088−1098（1982）。MuLVの2.0Uにおけ
るXho I部位から、３′LTR、３′マウスフランキング配
列、pBR322のすべてを通って延びていてEco RI部位で終
わっている断片を、電気泳動分離の後アガロースゲルか
ら精製した。フォーゲルシュタイン、ビー（Vogelstei
n,B）及びデイ・ギレスピー（D.Gillespie）、プロシー
ディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス・ユー・エス・エー、761:615−619（197
9）。第２断片は、pMOVPsi+をBalIで完全に消化し、続
いてpBR322のBalI部位から５′マウスフランキング配列
及び５′LTRを通ってMuLVの0.7Uに位置したBalI部位ま
で延びている断片を精製することにより得られた。次い
で、この断片にHindIIIリンカー［コラポレイティブ・
リサーチ社（Collaborative Research）］をT4DNAリガ
ーゼによりブラント連結し、断片を過剰のHindIII及びE
co RIで消化した。LTR含有断片を電気泳動分離後にアガ
ロースゲルから精製した。最終連結反応で存在する第３
断片は、MuL Vのgag/pol領域からpSV2にサブクローニン
グされているpSV2−gag/polから得られた。ムリガン、
アール・シー及びピー・ベルグ（P.Berg）、サイエン
ス、209:1422−1427（1980）。pSV2−gag/polをXhoI及
びHindIIIで完全に消化し、HindIII部位（MuLVの1.0Uの
PstI部位から変化した）からMuL Vの2.0UのXhoI部位ま
で延びている断片を電気泳動分離後にアガロースゲルか
ら精製した。次いでろこれらの３つのDNA断片を、リガ
ーゼ緩衝液（トリス−HCl（pH7.8）50mM、MgCl210mM、
ジチオスレイトール2mM、ATP1.0mM、ウシ血清アルブミ
ン50μg/ml）中で全DNA濃度50μg/mlの等モル量で混合
し、そして15℃で18時間T4DNAリガーゼと共にインキュ
ベーションした。E.coliHB101を、前記連結したDNAでト
ランスフェクションし、アンピシリン耐性トランスフェ
クタントを得た。多数の形質転換体から得られたプラス
ミドDNAを、適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化
及びアガロースゲルを通す電気泳動により所望の構造に
ついてスクリーニングした。ダビス、アール・ダブリュ
（Davis,R.W.）等、メソッズ・イン・エンザイモロジー
（Methods in Enzymology）、６54:404−411（1980）。
染色体に安定に組み込まれたPsi-突然変異体を含む細
胞系は、pMOV−Psi-とpSV2gpt、XG PRT発現能力のあるS
V40ハブリッドベクター、のコトランスフェクションに
より製造された。ムリガン、アール・シー及びピー・ベ
ルグ、サイエンス、209:1422−1427（1980）。このよう
にして得られたgpt+コロニーからの細胞をクローニング
しそして３つの系統:Psi−１、psi−２及びPsi−３とし
て確立した。ムリガン及び共同研究者により述べられた
Psi2細胞系は、エコトロピックモロネイネズミ白血病ウ
イルス（Mo−MuLV）クローン［ecotropic Moloney muri
ne leukemia virus（Mo−MuLV）clone］であるpMOV−Ps
i-により、NIH3T3内皮細胞をトランスフフェクションす
ることにより作り出された。pMOV−Psi-は、ウイルス遺
伝子生成物のすべてを発現するが、ウイルスゲノムをカ
プシドに包むのに必要なPsi配列に欠けている。pMOV−P
si-は、マウス（及び密接に関連した齧歯動物）細胞に
のみ存在している受容体を認識するエコトロピックウイ
ルスエンベロープ糖タンパク質を発現する。
他の細胞系はPsi am系統であり、これはPsi−２類似
パッケージング細胞系（Psi−２−like packaging cell
lines）である。これらのPsi am細胞系は、修飾された
pMOV−Psiゲノムを含み、このpMOV−Psiゲノムにおいて
は、エコトロピックエンベロープ糖タンパク質は、アン
フォトロピックウイルス4070A由来のエンベロープ配列
で代替されている。ハートレイ、ジェイ・ダブリュ（Hf
rtley,J.W.）及びダブリュ・ピー・ロウエ（W.P.Row
e）、ジャーナル・オブ・ビロロジー（Journal of viro
logy）、19:19−25（1976）。結果として、これらは、
アンフォトロピック宿主範囲を持った組換えウイルスの
製造に有用である。Psi am細胞系を製造するのに使用さ
れるレトロウイルスは、非常に広い哺乳動物宿主範囲
（アンフォトロピック宿主範囲）を有しており、そして
ヒト細胞を感染させるのに使用することができる。組換
えゲノムがPsiパッケージング配列を有するならば、Psi
am細胞系は、組換えレトロウイルスゲノムをパッケー
ジングして感染性レトロウイルス粒子とすることができ
る。コーン、アール・（Cone,R）及びムリガン、アー
ル．、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス、ユー・エヌ・エー、81:6
349−6353（1984）。
上記レトロウイルスゲノムは、新しい遺伝子を細胞に
導入することができるベクターとして使用するために、
コーン及びムリガンにより修飾された。第２図に示され
たように、gag、pol及びenv遺伝子はすべて除去され、
そしてneo遺伝子をコードしているDNA断片がそれらの位
置に挿入された。neo遺伝子は、主要な選択可能なマー
カーとして作用する。組換えゲノムの一部のままである
レトロウイルス配列は、LTRs、tRNA結合部位及びPsiパ
ッケージング部位を含む。セプコ、シー（Cepko,C.）
等、セル、37:1053−1062（1984）。
本発明の形質導入された内皮細胞を製造するのに使用
された追加のベクター構築は、第２図に示されておりそ
して下記に詳細に説明する。
pLJ・このベクターの特徴は、コールマン、エー・ジ
ェイ（Korman,A.J.）等、プロシーディングス・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス、ユー
・エス・エー、84:2150（1987）。このベクターは、２
つの遺伝子、即ち、目的の遺伝子及びNeo遺伝子のよう
な主要な選択可能なマーカー、を発現することができ
る。目的の遺伝子は、５′LTRからちょっと離れたとこ
ろにあるBamHI/Smal/Sallクローニング部位へのダイレ
クトオリエンテーション（direct orientation）におい
てクローニングされ、一方、Neo遺伝子は、クローニン
グ部位（クローニング部位の３′が位置している）より
３′が遠い内部プロモーター（SV40からの）より離れて
いる。PLJからの転写は、２つの部位、即ち、１）目的
の遺伝子の発現を引き受ける５′LTR及び２）neo遺伝子
の発現を引き受ける内部SV40プロモーター、において開
始される。pLJの構造は第2a図に表される。
ベクターpLJを第2a図に示す。pLJにおいては、目的の
遺伝物質は、５′LTRにすぐ続いて挿入される。この遺
伝物質の発現は、LTRから転写され、neo遺伝子の発現
は、内部SV40プロモーターから転写される。
pEm・野性型ウイルスのgag、pol及びenvの全コード配
列は、唯一の発現される遺伝子である目的の遺伝子で置
き換えられる。５′フランキング配列、５′LTR及び400
bpの連続的配列（BamHI部位まで）は、pZIPからのもの
である。３′フランキング配列及びLTRも又pZIPからの
ものであり、３′から上流のCLaI部位150bpは、合成Bam
HIリンカーと連結され、そしてベクター中に存在してい
るBamHIクローニング部位の他の半分を形成する。pBR32
2のHindIII/EcoR1断片は、プラスミド骨格を形成する。
このベクターは、モロネイネズミ白血病ウイルスの株か
らクローニングされた配列から誘導される。類似したベ
クターが、骨髄増殖性肉腫ウイルス由来の配列から構築
された。pEMの構造は第2b図に示されている。
目的の遺伝物質で内皮細胞に形質導入するのに、選択
可能なマーカーを持たないベクターを使用することもで
きる。このようなベクターは、基本的には、このような
マーカーが存在している前記したベクターの単純化した
ものである。ベクターpEmは第2b図に示されている。示
されているように、このベクターの主成分は、５′及び
３′LTR及び２つのLTR間に挿入された目的の遺伝物質で
ある。
内皮細胞への遺伝物質の導入及び遺伝物質の発現の評価 組換えゲノムを持った組換えアンフォトロピックレト
ロウイルスを生産する細胞系を使用して、内皮細胞を感
染させる。上述の如く、組換えゲノムは、様々な成分を
含むことができるが、一般には、２つのLTRと、gag、po
l及びenv配列の代わりに、第２プロモーター配列から成
る。或る場合には、それは選択可能なマーカー（例えば
neo）も含む。
目的の遺伝物質を内皮細胞に導入するのに使用される
べきウイルスストックを、上記の如く採取し、８マイク
ログラム/ml（mcg/ml）のポリブレン（アルドリッヒ）
を補充し、内皮細胞の培養物に加える。ウイルスの力価
が高い（例えば約106cfu/ml）ならば、その場合には、
実質的にすべての内皮細胞は感染しており、選択（例え
ば、組換えゲノムを含むベクターが導入されている内皮
細胞の）は必要ない。力価が非常に低ければ、その場合
には、neo又はhisなどの選択可能なマーカーを持ったレ
トロウイルスベクターを使用することが必要である。選
択可能なマーカーが使用される場合には、ウイルスに暴
露した後、細胞を集密状態まで増殖させ、選択培地に分
割する（例えば、選択可能なマーカーがneoであるなら
ば（G418を含む培地、選択可能なマーカーがhisである
ならば、ヒスチジノールを含みそしてヒスチジンを含ま
ない培地）。
neo遺伝子は、バクテリア中でネオマイシン耐性及び
哺乳動物中で抗生物質G418に対する耐性をコードしてい
るトランスポゾンTn5由来のバクテリア遺伝子である。
このneo遺伝子は、主要な選択可能なマーカーとして作
用し、哺乳動物中でその存在は、細胞を、G418の存在下
に増殖する細胞に転化する。（もしそれが存在しなけれ
ば、細胞はG418の存在下では死ぬ）。結果として、哺乳
動物中でのこの遺伝子の存在は、G418を含む培地中で細
胞を培養することにより決定することができる。この組
換えゲノムを有する組換えレトロウイルスを、neoウイ
ルスと呼ぶ。
neo遺伝子を持った組換えレトロウイルスベクターは
クローニング部位を有する。結果として、目的の遺伝物
質は、ベクターに導入し、内皮細胞に導入して組換えレ
トロウイルスで形質導入された内皮細胞（導入された遺
伝物質を有する内皮細胞と呼ぶ）により発現させること
ができる。
レトロウイルスベクターによって内皮細胞中で、目的
の実質的にいかなる遺伝子も発現させることが可能であ
るべきである。３つの異なるクラスのタンパク質、即
ち、分泌されたホルモンペプチド（ヒトPTH又はhPT
H）、膜受容体（LDL又はLDLRに対する受容体、及び細胞
内酵素（β−ガラクトシダーゼ）、をコードしている遺
伝子を発現するレトロウイルスベクターが構築された。
内皮細胞に導入されたときの組換えウイルスの効率の良
い発現が証明された。これは実施例で詳細に説明する。
他のタンパク質又はポリペプチドをコードしている遺伝
物質の導入 他のタンパク質又はポリペプチドをコードしている遺
伝子も、適当なレトロウイルスベクターによって内皮細
胞に導入することができる。例えば、ヒト成長ホルモン
（HGH）をコードしている遺伝子又はインシュリンをコ
ードしている遺伝子を、内皮細胞に導入することができ
る。このような遺伝子は、単独で又はneo遺伝子などの
選択可能なマーカーをコードしている遺伝子と共に内皮
細胞に導入することができる。HGHは、普通は視床下部
によってのみ分泌される約29,000ダルトンのポリペプチ
ドである。インシュリンは、血流中のグルコースレベル
を調節するポリペプチドである。
これらの遺伝子及び他の遺伝子は、hPTHのところで述
べたのと同じ方法で内皮細胞に導入することができ、そ
して得られる形質導入された内皮細胞は、身体の適当な
部位に移植又は適用することができる。
ポリペプチドをコードしている遺伝物質の導入における
他の主要な選択可能なマーカーの使用 neo遺伝子以外の主要な選択可能なマーカーを使用し
て、遺伝物質を内皮細胞に導入することも可能である。
例えば、HisD遺伝子をこの目的で使用することができ
る。HisD遺伝子は、サルモネラからのバクテリア遺伝子
であり、ヒスチジノールをヒスチジンに転化するポリペ
プチドであるヒスチジノールデヒドロゲナーゼをコード
している。ヒスチジンは必須アミノ酸であり、ヒスチジ
ノールは、ヒスチジンのアルコール類似体でありそして
適当な代謝条件下にヒスチジンに転化されうる。もしも
細胞を、ヒスチジノールを含むがヒスチジンが欠けてい
る培地で増殖させるならば、HisD遺伝子を持ったこれら
の細胞はヒスチジノールをヒスチジンに転化することが
できる。ヒスチジンはそれらの細胞の機能に必須である
ので、HisD遺伝子を持った（従ってヒスチジンを作るこ
とができる）これらの細胞は生き残り、この遺伝子が欠
如している細胞は生き残らないであろう。HisD遺伝子を
持ったレトロウイルスベクターを使用して、ケラチノサ
イトを感染させた。HisDを含むケラチノサイトは、ヒス
チジンが欠如しているのがヒスチジノールを含んでいる
培地でこれらの細胞を増殖させることにより選択され
た。予想されるように、HisD遺伝子を持ったケラチノサ
イトは、コロニーを形成しそして集密状態まで増殖し、
この遺伝子を持たない細胞はそうではなかった。事実、
このような細胞は、neo遺伝子が含まれている細胞より
もはるかに高頻度で生じた。これらの同じ方法が、目的
のDNAを含む内皮細胞を選択するのに有用である。
この研究の結果として、独立の主要な選択可能なマー
カー（例えばneo遺伝子とHisD遺伝子）を使用して、新
しい遺伝物質を内皮細胞に導入することも可能である。
２つの異なるサブユニットを持ったポリペプチドの場合
には、例えば、別個の主要な選択可能なマーカーを使用
して、２つのサブユニットをコードしている遺伝情報を
導入することができる。更に、活性になるために特異的
に切断されるか又はプロセッシングされる必要のあるポ
リペプチド（例えばインシュリン及び傍甲状腺ホルモ
ン）の場合には、２つ又はそれより多くの主要な選択可
能なマーカーを使用することができる。必要なプロセッ
シング酵素をコードしている遺伝子は、このようなプロ
セッシングを必要とするポリペプチドホルモンをコード
している遺伝子と共に導入することができる。これは、
内皮細胞がそのポリペプチドホルモンをプロセッシング
することを可能とするであろう。
目的の遺伝物質を内皮細胞に導入するための他のベヒク
ル レトロウイルスベクター以外のベヒクルを使用して内
皮細胞を遺伝子工学的に作り出すか又は修飾することも
可能である。目的の遺伝情報を、内皮細胞中で目的の遺
伝物質を発現することができるウイルスにより内皮細胞
に導入することができる。例えば、SV40、ヘルペスウイ
ルス、アデノウイルス及びヒト乳頭腫ウイルスをこの目
的で使用することができる。
目的の遺伝物質が受容細胞に安定に導入されないで染
色体外で（episomally）発現される（受容細胞ゲノムか
ら離れているか又は別個である）ように、目的の遺伝物
質を内皮細胞に導入することも可能である。
導入された遺伝物質を有する内皮細胞の使用 血管移植片又は移植組織の性能の改良 多くの重要な疾患状態には、生命維持器官に供給する
動脈の狭窄又は閉塞が関与する。このような疾患状態に
最もよく関係した病因学的機構はアテローム性動脈硬化
症である。例としては、冠状動脈狭窄による狭心症及び
心筋梗塞；脳血管疾患による一時的虚血性発作及び卒
中；腎臓血管高血圧及び最終的には腎臓動脈狭窄による
腎不全；及び末梢動脈の血管疾患により引き起こされ、
その最も重い形態では切断に至ることがある下肢の跛行
（claudication of the lower extremities）が含まれ
る。個体をアテローム性動脈硬化障害にかかりやすくな
る原因（例えば、高血圧、喫煙及び高血圧）が排除され
ない限り、これらの疾患状態の自然の病歴（natural hi
story）は、通常アテローム性動脈硬化症が進行して、
永久的な損傷又は死に至るということである。
進行性アテローム性動脈硬化疾患に対して受け入れら
れそして広く使用されている治療方法は、ダクロンなど
の合成材料で作られた人口血管で、主要な狭窄又は閉塞
部位にバイパスを付けることである。350,000以上の血
管移植片が毎年移植されている。この方法に伴う１つの
大きな問題は、人口血管が非常に凝塊形成性（thrombog
enic）であり（即ち、それが血餅を発生させる傾向があ
る）、これにより非常に高率の再狭窄が起こるというこ
とである。自己由来の内皮細胞を人口血管の内腔に接種
することによりこの問題を減少させることが可能となっ
た。内皮細胞でライニングされた移植片は凝塊形成性が
多分少ないであろう。修飾された内皮細胞が特に有用な
のは、このような状況においてである。
内皮細胞は、本発明の方法に従って遺伝子工学的に修
飾されて、内皮細胞ライニング人口移植組織に関するそ
の性能を改良することができる。内皮細胞ライニング人
口移植組織を使用するための現存の方法は、いくつかの
重要な技術上の問題により面倒であるが、その大部分は
遺伝子工学的に作り出された内皮細胞の使用により克服
することができる。
第１には、集密以下の密度で細胞を接種したとき、移
植片をライニングする内皮細胞の集密状態の層を達成す
ることが可能である。これは、部分的には、この環境で
の内皮細胞の限定された増殖能力による。更に、利用可
能な自己由来の内皮細胞の限られた量は、最も重要な臨
床状況において集密的密度での移植片を接種を妨げる
（現在利用可能な技術を使用して）。しかしながら、内
皮細胞増殖因子などの内皮細胞マイトジェンを発現する
レトロウイルで内皮細胞を感染させることにより、内皮
細胞を遺伝子工学的に修飾しその増殖能力を高めること
ができる。最初は、形質導入された内皮細胞を集密以下
の密度で移植組織に接種し、その後に生体外又は生体内
で集密的ライニングを達成することが可能である。自己
由来の細胞の量が限られているために不可能であった内
皮細胞ライニング人口移植の多くの用途が、今や可能と
なった。更に、修飾された内皮細胞は、競合細胞（平滑
筋細胞又は内在性内皮細胞などの）に対する選択的利点
を持っており、これによって、形質導入された内皮細胞
の過剰増殖を競合細胞により阻止する。
内皮化された移植組織の他の問題は、人口血管の壁と
内腔表面との間で平滑筋細胞が増殖することにより、人
口血管の内腔が次第に狭くなることである。これを阻止
するための１つの方法は、平滑筋細胞の増殖を抑制する
生成物を分泌する遺伝子を内皮細胞に導入することであ
る。間葉及び／又は上皮細胞の増殖を抑制する多くのタ
イプのオートクリン：パラクリン増殖因子が、最近同定
されそしてそれらの遺伝子がクローニングされた。この
ような遺伝子は、本発明の方法を用いて内皮細胞に導入
することができる。得られる形質導入された内皮細胞
は、細胞増殖抑制剤を生成する。
内皮化された移植法の他の技術的問題は、人口移植片
に対する内皮細胞の結合（プレーティング）効率が比較
的低いということである。これを改良しようとした従来
の方法は、移植片表面の組成を改良することに向けら
れ、限られた成功しか収めなかった。本発明の方法を使
用すると、膜受容体をコードしている遺伝子を内皮細胞
に導入することが可能である。次いで人口血管の内腔
を、受容体に対するリガンドで被覆し、それにより、膜
受容体リガンド相互作用により内腔表面への内皮細胞の
結合を促進させることができる。
本発明の遺伝子工学的に作り出された内皮細胞を使用
して、内皮細胞ライニング人口移植片の血栓形成性を減
少させることができる。血餅形成の機構は、血小板付
着、続いてフィブリンの沈でん及び血餅の伝播であると
考えられている。これは、血栓融解剤（例えば、組織プ
ラスミノーゲン活性化因子（TPA）又はストレプトキナ
ーゼなどの、血餅を溶解する作用物質）を分泌する遺伝
子工学的に作り出された内皮細胞を移植片に接種するこ
とにより最小とするか又は場合によりなくすることがで
きる。更に有効な方法は、分泌されるよりはむしろ、内
皮細胞膜に結合する修飾された形態のTPAをデザインす
るべきであろう。この場合に、血栓融解剤は血管内腔内
に濃縮され、そこでより大きい効果を及ぼすであろう。
四肢又は器官に生成物を送給するための修飾された内皮
細胞の使用 本発明は、人口器官を含む動脈により灌流される四肢
又は器官に有利な因子を分泌する遺伝子を内皮細胞に導
入することもできる。例えば、普通の臨床問題は、人工
血管の部位に対して遠位の小血管の広範な狭窄部の存在
である。これは、真性糖尿病に関連した血管疾患の特徴
である。移植組織を持った大きい血管の再血管形成は、
疾患のあるた四肢又は器官への灌流の再構成を不完全に
する。弱っていない近接組織からの側枝循環の発達を促
進させることにより、弱った組織への血管流量を増加さ
せることができる。これは、或る程度は自然に起こる。
しかしながら、疾患区域の内皮細胞が血管形成を促進す
る因子（１種又は１種より多くの）を分泌するならば、
側枝形成の全体のプロセスは促進されそして更に十分に
発展させることができるよう。これらの血管形成性因子
の多くのものの遺伝子はクローニングされておりそして
内皮細胞に導入することができる（例えば、ゲノムが目
的の遺伝子を含んでいるレトロウイルスを使用して）。
血管形成性因子の送給を、移植片を含む血管により供給
されている器官又は四肢を標的とすることができる。こ
れらの因子の有効濃度は疾患のある組織では比較的高い
が、一般的循環系では低いであろう。その理由は、それ
は心臓に戻る際に静脈循環系で希釈されからである。か
くして、全身系の副作用なしに、疾患のある器官又は四
肢での治療効果を得ることが可能であろう。
弱った器官又は四肢への血管流を更に促進するたるめ
の他の方法は、すべての輸入血管を最大に拡張すること
である。経口又は非経口薬剤でこれを行おうとしても、
多くの全身系副作用を伴うため、治療の利点は殆ど得ら
れなかった。これは、部分的には、血管拡張剤は適当な
組織を標的としないことに原因がある。心房ナトリウム
排せい因子（atrial naturetic factor）などの強力な
血管拡張剤を分泌するように作り出された内皮細胞はこ
れに替わるやり方である。この応用においては、疾患の
ある器官又は四肢を、非常に高濃度の血管拡張剤を含む
動脈血で灌流することができる。これにより、全体の血
管灌流が増加する。しかしながら、血管拡張剤は、心臓
に戻る際に非薬理学的レベルに希釈され、それにより、
非選択的方法で投与した場合に起こる血管拡張剤の多く
の全身系副作用をなくする。
本発明は、内皮細胞が内皮細胞において普通は生物学
的に有意な量では生産されない選ばれたタンパク質又は
ポリペプチドを生産しそしてそれらを血流又は身体の他
の区域（例えば中枢神経系）に分泌するように、内皮細
胞を遺伝子工学的に作り出すことを可能とする。このよ
うにして形成された内皮細胞は、必要な物質を周期的に
投与する（摂取又は注射により）ことを必要とする現行
の養生法に替わる連続薬剤送給系として作用することが
できる。
例えば、それは、インシュリンの連続的送給を与える
のに使用することができる。インシュリンは、現時点で
は、膵臓から単離され、長々と精製され、次いで身体に
注射されなければならず、これによりそのインシュリン
生産又は利用は損なわれる。本方法では、インシュリン
は連続薬剤送給システムを介して身体に導入することが
でき、結果として、インシュリンを毎日注射する必要が
ない。
遺伝子工学的に作り出された内皮細胞は、血液凝固因
子の生産に使用することもできる。血友病者は、血液凝
固に関与するVIII因子と呼ばれるタンパク質を欠いてい
る。VIII因子は現在は注射により投与されている。VIII
因子をコードしている遺伝子を持った内皮細胞を使用し
て、内皮細胞がVIII遺伝子を生産する移植組織を作るこ
とができる。移植組織としてのこの組織は血流中にこの
因子を分泌するであろう。
目的の遺伝物質を内皮細胞に導入することは、遺伝的
疾患の処理及び後天的疾患の処理に特に価値がある。遺
伝的疾患の場合には、この方法を使用して遺伝子修飾さ
れた内皮細胞及び代謝シンク（metabolic sink）として
作用することができる他の細胞を得る。即ち、このよう
な内皮細胞は、潜在的に毒性の物質を分解するように作
用するであろう。例えば、形質導入された内皮細胞は尿
素サイクル疾患を処理するのに使用される。本発明の内
皮細胞は、本発明の内皮細胞は、普通は身体により生産
される生成物（例えば酵素又はホルモン）が生産されな
いか又は不十分な量で生産される遺伝子疾患の処理に使
用することもできる。この場合に、欠けている物質又は
不十分に生産される物質をコードしている遺伝子で形質
導入された内皮細胞を使用して、それを十分な量で生産
することができる。例えば、これは、α−１アニトリプ
シン（alpha−1 anitrypsin）を生産させるのに使用す
ることができる。これし因子VIII及び因子IXの生産にも
使用することができ、かくして血友病を処理するのに有
用である。
遺伝子工学的に作り出された内皮細胞（即ち、目的の
遺伝物質で形質導入された内皮細胞）の使用により処理
されうる多くの後天的疾患がある。例えば、普通は慢性
の疾患に存在しそしてしばしば慢性腎不全（例えば血液
透析患者の）と関連した貧血を処理するのに、このよう
な細胞を使用することができる。この場合に、エリスロ
ポイエチン（erythropoietin）をコードしている遺伝子
を導入されている内皮細胞は、骨髄を刺激してエリスロ
ポイエシス（即ち、赤血球の生産）を増加させることに
より貧血を直すであろう。
本発明の内皮細胞は、血栓の形成を防止する活性化因
子として低用量の組織プラスミノーゲン活性化因子を投
与するのに使用することもできる。この場合に、TPAを
コードしている遺伝物質を導入されている内皮細胞は、
血栓の防止が望まれる個体に移植されるであろう。これ
は、例えば、冠状動脈疾患、脳血管疾患、末梢血管閉塞
疾患、肺塞栓（pulmonary emboli）に見られるような静
脈（例えば表在性）血栓症又は深在性静脈血栓症などの
ような、よく生じる疾患に対する予防薬として有用であ
ろう。カルシトニンをコードしているDNAを含む内皮細
胞は、骨代謝の進行性慢性疾患であるパジェット病（Pa
get′s Disease）の処理に使用することができる。現在
の処理は、カルシトニンの皮下投与によっている。
インターロイキン（例えば、IL−１、IL−２、IL−
３）を生産しそして分泌するように作り出された内皮細
胞は、種々の情況において使用することができる。例え
ば、現在使用されている治療法（例えば化学療法）の或
るものは、結果としてしばしば、骨髄の直後に抑制によ
り引き起こされる好中球減少症（血液中に存在する好中
球の数が異常に低い）を誘発するということである。例
えば、実質的にすべての化学療法剤及び（AIDS）後天性
免疫不全症候群の処理に使用されるAZTの使用は、好中
球減少症をもたらす。この状態は、生命に危険のある多
数の感染症をもたらす。これらの場合に、例えば、IL−
３をコードしている遺伝物質を含む内皮細胞の移植によ
るIL−３の投与を使用して、好中球数を増加させること
ができる。更に、血小板の生産を刺激するトロンボポイ
エチンの投与を、血小板数が低い多数の症状の処理に使
用することができる。これらの場合に、トロンボポイエ
チンの遺伝子で形質導入された内皮細胞を、個体に適用
／移植することができる。コードされている生産物の生
産及び分泌は、血小板の生産を刺激する。
遺伝物質を導入されている内皮細胞の他の関連した用
途はエイズの処理である。免疫系を刺激するインターロ
イキン２及びインターロイキン３は、エイズの処理に潜
在的に価値がある。これらは、これらの２つのポリペプ
チド（現在では周期的注射により投与されている）を生
産するように遺伝子工学的に作り出された内皮細胞を有
する脈管移植組織により送給することができる。
本発明の他の使用は酵素欠損疾患の処理である。この
場合に、内皮細胞に導入された遺伝子によりコードされ
ている生産物は、分泌されず（例えばホルモンがそうで
ある）、むしろ、それは細胞内に残る酵素である。個体
が特定の酵素を欠如しておりそして種々のアミノ酸又は
他の代謝物を代謝することができないような多数の遺伝
子疾患がある。これらの酵素の正しい遺伝子を、内皮細
胞移植組織の導入することができ、この移植組織は、次
いでその代謝機能を行うであろう。例えば、疾患のある
個体が酵素アデノシンデアミナーゼを欠損している遺伝
子疾患がある。この酵素は、プリンを尿酸に分解するこ
とに関与している。本発明を用いて、血液が移植組織を
施している区域を通過するにつれて、血液を解毒するの
に十分に高いレベルで欠けている酵素を生産することが
できる移植組織を製造することが可能である。
本発明は、獣医学的用途も有する。例えば、薬剤（例
えば抗生物質）及びホルモンを送給するのにそれらを使
用することができる。このようにしない場合には、これ
らの薬剤及びホルモンは、動物の飼料に配合することに
より与えられ、又は飲料水に加えるか又は周期的に（例
えば毎日又はそれより少ない頻度で）注射される。本発
明の修飾された内皮細胞の使用は、この修飾された細胞
から形成された組織を動物に適用し、そしてある量のコ
ードされたタンパク質を継続して与え、かくしてその物
質の毎日の／周期的な投与の必要を無くすることができ
るという利点を有する。
本発明を下記の実施例により説明するが、これらの実
施例はいずれにせよ本発明を限定するものではない。
実施例１ 形質導入された内皮細胞でのヒト傍甲状腺ホルモンの
生産pLJのBamHIクローニング部位に、目的の遺伝物質を
挿入することができる。目的の遺伝物質は、上記の如く
DNAであることができる。
特に、ヒト傍甲状腺ホルモン（hPTH）をコードしてい
る遺伝子のコピーを、この部位に（例えばpLJに）下記
の方法でクローニングした。pLJプラスミドをBamHIで消
化し、次いで酵素仔ウシ腸ホスファターゼで処理した。
これに続いて、線状ベクターをアガロースゲルで分別し
そしてガラスビーズを用いて精製した。更に、ヘンディ
ー等により記載された、pBR322にクローニングされたヒ
トPTHの完全なcDNAを含むプラスミドから、ヒトPTH遺伝
子を含むBamHI断片を製造した。ヘンディー（Hendy）
等、プロシーデングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス、ユー・エス・エー・、78:736
5−7369（1981）。
翻訳されない５′の17bp、全コード（all coding）及
び翻訳されない３′の3lbp配列を含むPTHcDNAのサブ断
片を、最初のプラスミドをDdeI及びHinfIで消化しそし
て600bp断片を単離することにより、単離した。この断
片をリン酸塩中のデオキシヌクレオシドの存在下にDNA
ポリメラーセと共にインキュベーションして、凹んだ端
部に充てんした。BamHIリンカーを、T4DNAリガーゼによ
りブラント末端に連結した。この連結混合物をBamHIで
消化することにより、真正なBamHI制限断片を生じさせ
た。次いで、これをpBR322のBamHI部位にサブクローニ
ングした（subcloned）。このpBR322は、ベクター構築
においてhPTHのソースとして使用されるプラスミドであ
る。
等量のpLJ線状骨格とBamHIPTH断片を、T4DNAリガーゼ
の存在下に一緒に加えた。得られる混合物を、２つの断
片を連結するのに適当な条件下に維持した。連結混合物
を使用して、バクテリアHB101を形質転換し、これを次
いでカナマイシンを含む寒天上で平板培養した。マニア
チス、テイ等、分子クローニング：実験質操作（Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual）、コールド・スプ
リング・ハーバー・ラボラトリー、250−251、504頁；
ポリバー、エフ・（Bolivar,F.）及びケイ・バックマン
（K.Backman）、：メソッズ・イン・エンザイモロジー
（Methods in Enzymology）、アール・ブウ（R.Wu）
（編）、68巻、アカデミック・プレス、ニューヨーク
（1979）。得られるコロニーを組換えプラスミドについ
て分析した。
傍甲状腺ホルモンは、身体のカルシウムの調節の役割
を有するポリペプチドである。hPTH遺伝子はヒト内皮細
胞中に存在するが、それは生物学的に有意なレベルはこ
れらの細胞中では発現されない。hPTHなどのポリペプチ
ドホルモン又は生物学的に有意なレベルでは内皮細胞に
より普通は生産されない他の物質を生産することができ
る内皮細胞を、固体の表面に移植するか又は固体中に移
植することができ、これらはホルモン又は他の物質の連
続的供給系として作用する。
hPTHをコードしているDNA及び選択可能なマーカー（n
eo遺伝子のような）をコードしているDNAを含んだ組換
えウイルス構築体を生産するPsi am細胞を使用して、上
記の如きウイルスストックを生成させた。このウイルス
ストックを回収し、hPTH遺伝子を含むウイルスで形質導
入させれるべき内皮細胞をこのストックと共にインキュ
ベーションした。この場合に、選択可能なマーカーを使
用して、G418を含む培地で培養することにより、形質導
入された内皮細胞を同定しそして選択する。ウイルス力
価が十分に高ければ、実質的にすべての細胞が感染して
おり、選択可能なマーカー及び適当な培地を使用する選
択は必要ない。
hPTH遺伝子を有する組換えレトロウイルスで形質導入
された内皮細胞のhPTH遺伝子を発現する能力を、下記の
如くして試験管内で評価した。ウシ大動脈から確立され
そしてhPTH遺伝子を含むウイルスに感染した内皮細胞に
よるhPTHの試験管内生産を評価した。このウシ大動脈内
皮細胞は、仔ウシの大動脈からの外植片由来のものであ
った。この細胞は、限られた寿命を有しており、二次培
養物と呼ばれる。
ウシ大動脈内皮細胞をウイルスで感染させそして上記
の如くネオマイシン中では選択されなかった。形質導入
されたウシ大動脈内皮細胞を、10cmの組織培養皿に接種
し、そして集密状態に増殖させた。次いで新たな培養培
地（10％CS及びペニシリン及びストレプトマイシンを有
するDME）を加え、この時点を以後ゼロ時間と呼ぶ。24
時間の終わりに、培地を除去しそして細胞をヒトPTHに
ついてアッセイした。
アリクォートを、元のままのhPTHを測定するラジオイ
ムノアッセイ（ニコルス）を使用してhPTHの存在につい
て分析した。この方法は、（36B−2170、7/26変更され
た有効な）カリフォルニア州、サンジュリアンカプスト
ラノ、のニコル・インスティテュート・ダイアグノスチ
ック社（Nichols Institute Diagnostics）の、血清中
のヒトの元のままの傍甲状腺ホルモンの定量的決定（Qu
antitive Determination of Human Intact Parathyroid
Hormone in Serum）のためのアレグロ・インタクトPTH
/イムノアッセイシステム（Allegro Intact pth/Immuno
assay Sysrtem）に記載されている。この教示を本明細
書に加入する。このアッセイは、約１ナノグラム/ml血
清（ng/ml）の感度を有し、そして仔ウシPTHと交差反応
しないという点でヒトPTHに対して特異的であることが
示された。実験の結果を、時間に対して、RIAにより測
定したhPTHの生産として報告する。
本発明の方法に従ってhPTHをコードしているDNAで形
質導入されたウシ大動脈からの内皮細胞は、ブタペスト
条約の要件を満足する適当な条件下に、寄託番号CRL960
1の下に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（American Type Culture Collection）（メリーラ
ンド州、ロックビル）に寄託された。
実施例２ 形質導入された内皮細胞におけるヒトLDLレポーター
の生産ヒトLDL受容体（LDLR）のcDNAをpEMベクターに挿
入した。LDLRのcDNAは、下記の如くして、pEMに挿入す
るために調製した。ベクターpTZl［テキサス・ヘルス・
サイエンス・センターの大学、ゴールドスタイン博士か
ら入手）から、HindIIIで消化することにより、LDLRcDN
Aを切り出した。LDLRコード配列のすべてを含む2.6kbの
このHindIII断片を、クレノウフラグメントでブラント
末端とし、BclIオイゴヌクレオチドリンカー（NEBから
の）を、T4DNAリガーゼにより前記cDNAに連結した。最
後に、この連結混合物を過剰の酵素BclIで消化し、断片
をアガロースゲルで分別しそして精製した。これを、下
記の如くして、pEMのBamHIクローニング部位に挿入し
た。pEMをBamHIで消化し、線状化したプラスミドを、仔
ウシ腸フスファターゼで消化した。等量のリンカー付き
LDLRインサート及びpEMバックボーンを混合し、そしてT
4DNAリガーゼで連結した。この連結混合物を使用して、
HB101を形質転換しそして上記適当なレトロウイルスベ
クターについてアンピシリン耐性コロニーを分析した。
pEM−LDLRベクターを、Psi−am細胞系にトランスフェク
ションし、そして多量の組換えウイルスを生産するクロ
ーンを同定した。ウイルスストックを使用して、PTHに
ついて述べられたようにウシ大動脈内皮細胞の培養物を
感染させた。LDLR発現の試験管内評価を下記の如くして
行った。対照又は形質導入されたウシ大動脈内皮細胞の
集密状態のプレートを、10μg/mlの濃度の蛍光標識［マ
サチューセッツ州、スターフトンの、バイオメディカル
・テク社（Biomedical Tech Inc）から得られた］と結
合させたLDLと共に約８時間インキュベーションした。
これに続いて、細胞をPBSで洗浄した。PBS中の0.5％グ
タルアルデヒドでに固定した。次いでこれらを蛍光標識
されたLDL（＊LDL）の取り込みについて蛍光顕微鏡下に
可視化した。この実験の結果を第４図に示す。簡単に言
うと、内在性LDLRのレベルは、未感染培養物中の＊LDL
取り込み（4B参照）の相対的欠如により証明されるとお
り、低い。しかしながら、LDLRウイルスで感染させた培
養物では、全細胞の約30％が検出可能な量の＊LDLを取
り込んでおり、それにより外因性LDLRの有効な発現を証
明する（4D参照）。
実施例３ 形質導入された内皮細胞でのβ−ガラクトシダーゼの
生産大腸菌からのβ−ガラクトシダーゼをコードしてい
る遺伝子をpLJに挿入し、このベクターをPsi−am細胞系
にトランスフェクションして、高力価レトロウイルスベ
クターを生成させた。このベクターの構築及びプロデュ
ーサー細胞系の単離は、プライス及び共同研究者により
記載されている。プライス（Price）等、プロシーディ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス・ユー・エス・エー、84:156−160（1987）。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードしているウイルス
のストックを使用して、前述の如く、ウシ大動脈内皮細
胞を感染させた。感染した培養物を、その場での組織化
学的染色を用いて、β−ガラクトシダーゼ発現について
分析した。プライス等の上記文献参照。培養物をG418中
で選択する前後に分析した。この実験で使用したレトロ
ウイルスベクターは、β−ガラクトシダーゼ及びG418に
対する耐性を与えるneo遺伝子の両方を発現する。この
組織化学的染色は、プライス等により記載された如くし
て行った。簡単に言うと、細胞培養物をPBS中の0.5％グ
ルタルアルデヒド中で５分間固定し、PBSで洗浄し、そ
して反応混合物に少なくとも12時間暴露させた。この反
応混合物は、加水分解されると青色に変わりそして細胞
中に沈でんするβ−ガラクトシダーゼに対する基質を含
んでいる。結果として、ウイルスコードされたβ−ガラ
クトシダーゼを発現する細胞は、青色に変わるであろ
う。この実験の結果を第５図に示す。ウイルスに暴露し
なかった培養物では、β−ガラクトシダーゼ活性は検出
されなかった（第5A図）。感染した細胞は、細胞の約30
％においてβ−ガラクトシダーゼ活性を示す（第5B
図）。これらの形質導入された細胞は、G418の存在下に
それらをインキュベーションすることにより選択され
た。
実施例４ 犬に移植された血管移植片の表面での形質導入された
内皮細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの生産 体重20−25kgの成熟雑種犬の外部頸静脈から酵素的に
内皮細胞を採取した。各動物からの細胞を２つのアリク
ォートに分けた。１つは複製欠陥レトロウイルス（下記
参照）で感染させるためであり、他方は模擬感染させる
ためである。酵素的に採取した細胞をフィブロネクチン
で被覆したフラスコで平板培養しそして10−14日間２継
代にわたりウマ血清由来の５％血漿、ペニシリン、スト
レプトマイシン、ヘパリン及びECGFを補充されたM199培
地中に保持した。
この期間中、細胞を、ポリブレン（８μg/ml）を補充
された新たなウイルスのストックに３日毎に暴露した
（18時間／暴露）。第２継代の終わりに、細胞を回収
し、アリクォートを直ちに分析し、凍結保存するか又
は、イェイト（Yates）の４段階法の改変（0.75×106個
の細胞を自己由来の血液に第２工程及び第３工程で加え
た）に従って、6cm×4mmの編まれたダクロンTM移植片
［マサチューセッツ州、ビレリカのシーアール・バード
社（CR Bard）］に接種するのに使用した。動物を麻酔
し、そして両頸動脈の6cmのセグメントを上記の接種さ
れた移植片で置き換えた。各動物は、感染した内皮細胞
を接種された移植片とモック感染した細胞を接種された
対側移植片を受け取った。移植から５週間後、動物を麻
酔し、そして移植片を採取し、分析した。アンフォトロ
ピツクな宿主範囲を持った複製欠陥レトロウイルスを使
用して、内皮細胞のゲノムDNAにレポーター遺伝子を安
定に導入した。1acZ遺伝子がレポーター遺伝子として使
用した。その理由は、lacZ遺伝子の発現生成物である。
β−ガラクトシダーゼは、細胞の細胞質を青に染色する
酵素組織化学アッセイの使用によりその場で検出するこ
とができるからである。（実施例３）。レトロウイルス
感染の効率は、プロウイルス配列を検出するサザーン分
析と、感染した細胞をその場で検出するウイルスで発現
されたβ−ガラクトシダーゼの細胞化学的染色により評
価された、 これらの研究には、２つの組換えレトロウイルスが使
用された。BAGベクターは、プライス等、プロシーディ
ングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス、ユー・エス・エー、84:156−160（1987）に
より以前に記載されている。LacZ遺伝子を含むBAGウイ
ルスは、５′LTR（長い末端繰り返し配列）からβ−ガ
ラクトシダーゼを、及び、原核生物においてはカナマイ
シンに対する耐性を与えそして真核生物においてはG418
に対する耐性を与えるプロモーター由来のSV40から選択
可能なマーカー（Neo）を発現する。BAGウイルスに暴露
された内皮細胞の約５−15％が感染しており（表IIに要
約）、アミノグリコシドG418を補充された培地でのこれ
らの培養物の培養は、形質導入された細胞を有効に選択
した。
BALベクターは、LDLRcDNA配列に大腸菌β−ガラクト
シダーゼ遺伝子に対するコード化配列で置き換えたこと
を除いては、既に述べられたBA−LDLRベクター由来のも
のである。LacZ遺伝子を含む高力価BALウイルスは、ニ
ワトリβ−アクチン由来のプロモーターからβ−ガラク
トシダーゼを発現する。サザーン分析及びβ−ガラクト
シダーゼに対するその場でその細胞化学的染色により測
定して、BALウイルスに暴露した細胞の約50％が形質導
入されていた。
サザーン分析においては、高分子量のDNAを単離し、
アリクォート（10μｇ）をKpnIで消化し、１％アガロー
スゲルで分別し、ゼータバインドに移し、そしてファイ
ンバーグ（Feinberg）及びボルト（Volt）の方法に従っ
て高い特異的活性に標識されていた1200bpClaI/ECORI断
片でプローブした。
培養した細胞化学的特徴は、位相差顕微鏡及び蛍光顕
微鏡により証明された。レトロウイルス感染内皮細胞は
DIL−AC−LDLの取り込み及びウイルス指令の（viral−d
irected）β−ガラクトシダーゼの発現について、接種
の時点及び移植された移植片から取り出された後に分析
された。DIL−AC−LDLをイノキュレートされた（inocul
ated）接種前（pre−seeded）及び移植後の（post−imp
lantation）細胞を、位相差顕微鏡及び蛍光顕微鏡を使
用して評価した。接種前及び移植後の細胞は、ウイルス
指令のβ−ガラクトシダーゼの発現についても分析され
た。
接種の時点で、培養物は、内皮細胞の特異的機能（即
ち、アセチル化LDLの取り込みフォン・ビルブランド因
子の存在）及び、平滑筋細胞に対して特異的な抗原の存
在について分析された。これらの分析は、各単離物から
の細胞の98％以上が内皮細胞の機能を有していることを
示した。
この実験システムは、移植片再母集団（graft repopu
lation）を検討するのに使用された前記した犬モデルを
修正したものであった。犬１−３はBAG感染した未選択
内皮細胞を接種されていた移植組織を受け取り、犬４−
７は、BAL感染した未選択内皮細胞を接種された移植組
織を受け取った。これらの実験が進行中に、犬４−７か
らの内皮細胞もBAGウイルスで感染させそして、BAG形質
導入細胞を選択するアミノグリコシドであるG418の存在
又は不存在において培養で増殖させた。５週間後、移植
片を分析のために外植し（explant）、そして新しい移
植片を犬４−７に移植した（犬４′−７′と呼ぶ）。こ
れらの犬の各々は、BAGウイルスで感染されそしてG418
で選ばれた内皮細胞を接種された移植片、及び、BAG感
染未選択内皮細胞を接種された対側移植片を受け取っ
た。この第２の組の移植片は５週間後に再び外植され
た。
表IIは、これらの実験の結果を要約する。動物４′乃
至７′は、動物４乃至７に関して行った第２の実験を表
す（テキスト参照）。BAG−Ｕは、形質導入された細胞
についてG418での選択を行なかったBAG感染内皮細胞を
表す。BAG−Ｓは、形質導入された細胞についてG418で
選択されたBAG感染内皮細胞を表す。BALは、BAL感染内
皮細胞を表す。MOCKは、モック（MOCK）感染細胞を表
す。Ｅは、β−ガラクトシダーゼ染色により測定した感
染の効率の指示である。５週間後の移植片の開通性（pa
tency）は、（Ｙ）イエス又は（Ｎ）ノーで示される。
移植片のカバレッジ（coverage）は、走査型電子顕微鏡
により測定した、再母集団形成した表面の百分率の指示
である。
外植された移植片の分析は、22の内18から５週間後も
開通したままであることを示した。走査型電子顕微鏡写
真は、18の開通移植片の内14の内腔表面の内皮状の形態
を持った細胞のライニングを示した。内皮細胞ライニン
グは、存在する場合には、不完全であり（全表面の50−
90％）そしてクリンプしたダクロン移植片のピークに沿
って少数の細胞が見られる分布でつぎはぎ状であった。
各移植片の一部を固定し、ウイルス由来のβ−ガラクト
シダーゼを発現する細胞を染色しそして750倍の倍率を
持つ高拡大能の解剖顕微鏡を通して可視化した。開通性
のままでありそして内皮細胞を保持している感染内皮細
胞を接種された各移植片は、脈管の内腔にβ−ガラクト
シダーゼ陽性細胞を含んでいた。モック感染内皮細胞を
接種された対側移植片は陽性染色細胞を示さなかった。
移植片のその場の分析を、ウイルス形質導入細胞につ
いて行った。遺伝子工学的に作り出された移植組織の長
手方向切片を、ウイルス発現β−ガラクトシダーゼを発
現する細胞について分析した。移植片を長手方向に切断
し、一部を0.5％グルタルアルデヒド中で５分間固定
し、PBSで３回洗浄し、ｘ−ガル（ｘ−gal）溶液中で２
時間インキュベーションし、そしてライツ（Leits）解
剖顕微鏡で内腔表面り顕微鏡写真を撮った。移植片を正
面で（enface）可視化し、接種パターンのいくつかの興
味深い点を観察した。形質導入細胞の密度あ、ひだ付き
移植片のより深い表面で最大であった。これを、鋸歯状
表面の裂け目をライニングしそして走査型電子顕微鏡写
真により可視化された表面内腔再母集団形成の変動と相
関関係のある青色染色細胞のリングとして可視化した。
更に、遠位又は近位吻合物の近くに関して形質導入細胞
の密度又はパターンの局所的変動があった。最後に、各
場合に、β−ガラクトシダーゼ陽性の内腔細胞の割合
は、接種されたβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞の調製物
よりも質的に低いようであった。
細胞を、移植片の一部を内腔表面から採取して、より
詳細に特徴付けた。細胞の一次培養物を確立しそして分
析の前に約２−３週間試験管内で増大させた。遺伝子工
学的に修飾された内皮細胞は、サザーン分析及びウイル
ス発現β−ガラクトシダーゼの細胞化学的分析によりこ
の母集団の細胞において同定された。移植片から採取さ
れそして試験管内で増大された細胞の大部分は分化した
内皮機能を保持していた（95％未満）。しかしながら、
ウイルス指令のβ−ガラクトシダーゼを発現するか又は
プロウイルス配列を含んだ細胞の割合は、接種の時点で
分析された培養物に比較して、一貫して減少していた。
この相異は、一部は、間隙での又は吻合部からの増殖に
より内在性細胞を持った移植片の部分的再母集団によ
る。
工業的利用性 本発明は、進行したアテローム性動脈硬化症を処理す
うるのにしばしば使用される合成材料から製造された血
管移植片又は移植組織の性能（例えば、期間、開通性、
血餅形成性）を改良する点での工業的用途を有する。そ
れは、ホルモン、酵素及び薬剤を必要とする。ヒトを含
めて哺乳動物にこれらの物質を与えるのに有用である。
例えば、本発明によらなければ静脈内、筋肉内又は皮下
投与されるであろうホルモンの連続的供給を与えるのに
使用することができる。それは、長期にわたり必要とさ
れるこのような物質を与えるのに特に価値がある。
均等物 当業者は、ルーチンな実験を行うだけで、本明細書に
特定的に記載された本発明の特定の態様に対する多くの
均等物を認識又は確認するであろう。このような均等物
は、下記の請求の範囲の範囲内に包含されることを意図
する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウイルソン，ジエイムズ・エム アメリカ合衆国ミシガン州48103 アナ ーバー・リバーパインズドライブ3686 (72)発明者 マリガン，リチヤード・シー アメリカ合衆国マサチユセツツ州02138 ケンブリツジ・フランクリンストリー ト441 (56)参考文献 特開 昭62−49857（ＪＰ，Ａ) 特公 昭61−10136（ＪＰ，Ｂ２) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏ ｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，803 （1984），Ｐ．１−６ Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅ ｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，97（1983− ７），Ｐ．15−21 Ｓｃｉｅｎｃｅ，237（1987−９− 18），ｐ．1476−1479 Ｎａｔｕｒｅ，310（1984−８−９）, ｐ．476−480 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (23)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】形質導入された治療用内皮細胞であって、
    該細胞が目的生成物をコード化している安定的に導入さ
    れた組換え遺伝物質を含み、該遺伝物質を発現して該コ
    ード化された生成物を生成できる内皮細胞。
  2. 【請求項２】該内皮細胞がヒト内皮細胞である請求項１
    の内皮細胞。
  3. 【請求項３】安定的に導入された目的生成物をコード化
    している遺伝物質を含み、該遺伝物質を発現して該コー
    ド化された生成物を生成できる内皮細胞を使用して治療
    用薬剤を製造する方法。
  4. 【請求項４】該内皮細胞がヒト内皮細胞である請求項３
    の方法。
  5. 【請求項５】導入された遺伝物質がDNAまたはRNAであっ
    て、（ａ）通常は内皮細胞では生じない、（ｂ）通常は
    内皮細胞で生じるが該細胞内で生物学的に有意には発現
    されない、（ｃ）通常は内皮細胞で生じ，内皮細胞にお
    いて発現されるように修飾されている、あるいは（ｄ）
    内皮細胞で発現されるように修飾され得るDNAまたはRNA
    の単独あるいはそれらの組み合わせである請求項１の内
    皮細胞。
  6. 【請求項６】導入された遺伝物質が（ａ）ホルモン、
    （ｂ）酵素（ｃ）薬物（ｄ）主鎖選択可能マーカー、
    （ｅ）該細胞から分泌される蛋白質またはポリペプチド
    または（ｆ）膜受容体をコード化している請求項１ない
    し５のいずれかの内皮細胞。
  7. 【請求項７】酵素が細胞内酵素であり、選択可能なマー
    カーが抗生物質耐性をコード化している請求項６の内皮
    細胞。
  8. 【請求項８】ホルモンがヒト唾液線ホルモンであり、細
    胞内酵素がβ−ガラクトシダーゼであり、選択可能なマ
    ーカーがneo遺伝子であり、膜受容体が低密度リポ蛋白
    受容体である請求項７の内皮細胞。
  9. 【請求項９】ホルモン、酵素または薬物を（ａ）内皮細
    胞を体内に導入することによってあるいは（ｂ）内皮細
    胞を体表面に塗布することによって体に投与するための
    請求項８の内皮細胞。
  10. 【請求項１０】目的生成物をコード化する遺伝物質が形
    質導入によって安定的に取り込まれる請求項１ないし９
    のいずれかの内皮細胞。
  11. 【請求項１１】形質導入が、（ａ）目的生成物をコード
    化する遺伝物質、（ｂ）レトロウイルスから誘導され
    た、LTR配列、tRNA結合部位およびPsiパッキング部位お
    よび（ｃ）真核生物起源の少なくとも１つのプロモータ
    ーからなる組み換えゲノムを有するレトロウイルスによ
    る請求項10の内皮細胞。
  12. 【請求項１２】真核生物起源の少なくとも１つのプロモ
    ーターが外部ファクターによってモジュレートされ得る
    請求項11の内皮細胞。
  13. 【請求項１３】遺伝物質が血栓崩壊性蛋白質またはその
    一部分をコード化しており、合成人工脈管に塗布してそ
    の血栓形成性を低下させる請求項１ないし12のいずれか
    の内皮細胞。
  14. 【請求項１４】該遺伝物質が組織プラスミノーゲン活性
    化因子またはストレプトキナーゼをコード化している請
    求項13の内皮細胞。
  15. 【請求項１５】遺伝物質が内皮細胞マイトジェンまたは
    内皮細胞成長因子をコード化しており、内皮細胞の増殖
    に適した条件下に人工脈管の内部表面に塗布して該内部
    表面をライニングする内皮細胞の集密層を形成するため
    の請求項１ないし12のいずれかの内皮細胞。
  16. 【請求項１６】人工脈管の内部表面に下部集密層として
    接種して、目的生成物をコード化している導入された遺
    伝物質を発現させる内皮細胞を有する該脈管の内部表面
    上にライニングを形成するするための請求項１ないし15
    のいずれかの内皮細胞。
  17. 【請求項１７】遺伝物質がリガンドを結合できる膜受容
    体をコード化している請求項１ないし12の内皮細胞であ
    って、該細胞はリガンドを担持している人工脈管の表面
    に接種されることによって、該リガンドと膜受容体を結
    合させるのに適した条件下に該内皮細胞と該人工脈管の
    表面活性剤との結合が強化される内皮細胞。
  18. 【請求項１８】遺伝物質が平滑筋細胞の生育を阻害する
    生成物をコード化している、人工血管移植片にける平滑
    筋細胞の生育を阻害するための請求項１ないし12のいず
    れかの内皮細胞。
  19. 【請求項１９】下記段階からなる請求項１ないし18のい
    ずれかの内皮細胞を製造する方法： （ａ）培養された内皮細胞を、目的の遺伝物質からなる
    組み換えゲノムを有する感染性レトロウイルスを含む培
    地と接触させ、そして （ｂ）培養された内皮細胞および該感染性組み換えレト
    ロウイルスを含む培地を組み換えレトロウイルスによる
    内皮細胞の感染に適した条件下に維持する。
  20. 【請求項２０】下記段階からなる請求項１ないし18のい
    ずれかの内皮細胞を製造する方法： （ａ）培養された内皮細胞を目的の生成物をコード化し
    ている遺伝物質によって形質導入し、そして （ｂ）形質導入された内皮細胞をそれらの生育に適した
    条件下に培養する。
  21. 【請求項２１】下記段階からなる請求項１ないし18のい
    ずれかの内皮細胞を製造する方法： （ａ）内皮細胞を、目的の生成物をコード化している目
    的の遺伝物質からなる組み換えゲノムを有する感染性レ
    トロウイルスを含む培地とインジッツで接触させ、そし
    て （ｂ）上記内皮細胞および該感染性組み換えレトロウイ
    ルスを含む培地を組み換えレトロウイルスによる内皮細
    胞の感染に適した条件下に維持する。
  22. 【請求項２２】下記段階からなる、ホルモン、酵素、蛋
    白質またはポリペプチドを人間以外の動物の体に与える
    方法： （ａ）内皮細胞を、ホルモン、酵素、蛋白質またはポリ
    ペプチドをコード化している目的の遺伝物質からなる組
    み換えゲノムを有する感染性レトロウイルスとインジッ
    ツで接触させ、そして （ｂ）上記内皮細胞および該感染性組み換えレトロウイ
    ルスを組み換えレトロウイルスによる内皮細胞の感染に
    適した条件下に維持し；それによって、感染された細胞
    がホルモン、酵素、蛋白質またはポリペプチドを発現す
    る。
  23. 【請求項２３】請求項16の内皮細胞からなる、哺乳動物
    への移植および該哺乳動物での組み込まれた遺伝物質の
    発現のための、ライニングされた人工脈管。
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