CN113227404A - 用于检测鲍氏不动杆菌的非复制型转导颗粒和基于转导颗粒的报告系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及对鲍氏不动杆菌(A.Baumannii)具有特异性的新型噬菌体，以及用于产生源自这些噬菌体的非复制型转导颗粒(NRTP)的方法和所述NRTP用于检测鲍氏不动杆菌的用途。

Description

用于检测鲍氏不动杆菌的非复制型转导颗粒和基于转导颗粒 的报告系统

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年12月27日提交的美国临时申请号62/785,510和2019年9月13日提交的美国临时申请号62/899,985的优先权利益，这些临时申请各自借此以全文引用的方式并入本文。

参考序列表

本申请包含作为电子文本文件提交的序列表，该序列表名为“P35222-WO PCT申请序列表”，其字节大小为46KB，并于2019年11月20日创建。

技术领域

本发明涉及用于包装和递送用于检测靶细胞的非复制型转导报告分子的方法和组合物。

背景技术

转导颗粒是指能够将非病毒核酸递送到细胞中的病毒。基于病毒的报告系统已用于检测细胞的存在，并依靠病毒的溶原相使报告分子从细胞中表达出来。这些基于病毒的报告系统使用具有复制能力的转导颗粒，该转导颗粒表达报告分子并使靶细胞发出可检测的信号。

但是，已表明该病毒的裂解性周期对基于病毒的报告测定有害。Carri ère，C.等人，Conditionally replicating luciferase reporter phages：Improved sensitivityfor rapid detection and assessment of drug susceptibility of Mycobacteriumtuberculosis.临床微生物学杂志(Journal of Clinical Microbiology)，1997年，第35卷，第12期：第3232-3239页。Carrière等人开发了结核分枝杆菌(M.tuberculosis)/卡介苗(BCG)荧光素酶报告噬菌体，它们的裂解性周期在30℃被抑制但在37℃被激活。Carrière等人已经使用该系统证明了使用裂解性周期被抑制的噬菌体报告子对BCG的检测。

但是，在基于噬菌体的报告子测定中，存在抑制但不消除噬菌体复制功能的缺点。首先，控制噬菌体的复制功能使得测定条件受限。例如，当在30℃的非容许温度使用Carrière等人使用的报告噬菌体phAE40感染细胞时，该噬菌体的裂解性周期受到阻遏。该温度要求对报告子测定强加了限制条件，因为靶细菌的最佳温度为37℃。这些限制条件阻碍了最佳测定性能。

而且，病毒的复制功能难以控制。在使用转导颗粒作为报告系统时，应抑制病毒的复制。例如，Carrière等人报道的报告噬菌体phAE40的裂解活性减少下降但未被消除，导致测定中荧光素酶信号减少。Carrière等人强调了导致报告信号下降的可能原因，诸如完整的噬菌体表达基因和测定温度限制，所有原因都源于未消除噬菌体报告子的裂解性周期。

依赖于噬菌体的自然溶原性周期的报告子测定可能有望偶尔表现出裂解活性。另外，依赖于噬菌体溶原性周期的测定可能容易受到已经被相似噬菌体溶原化的靶细胞以及靶向传入病毒核酸的天然存在的宿主限制系统的超感染免疫，从而限制了这些报告噬菌体的宿主范围。

在其他实例中，转导颗粒产生系统被设计为包装外源核酸分子，但是转导颗粒通常包含外源核酸分子和天然子代病毒核酸分子的组合。天然病毒可表现出裂解活性，这对于测定性能而言是障碍，并且必须消除病毒的裂解活性以纯化转导颗粒。但是，这种纯化通常是不可能的。在Scholl等人的题为Reporter Plasmid Packaging System forDetection of Bacteria的U.S.2009/0155768 A中描述了这种转导颗粒系统的发展。该系统的产物是报告子转导颗粒和天然噬菌体的组合(参考文献中的图8)。尽管作者提示转导颗粒和天然噬菌体可以通过超速离心分离，但这种分离仅在转导颗粒和天然病毒表现出允许通过超速离心分离的不同密度的系统中才可行。尽管此参考文献中描述的基于T7噬菌体的包装系统具有这种特征，但这并不是通常可用于其他病毒系统的特征。病毒包装机构通常会表现出令人讨厌的包装，这种包装会导致天然病毒和转导颗粒呈现出无法区分的密度，这些密度无法通过超速离心分离。病毒包装系统还依赖于最少的包装量以进行适宜的病毒结构组装，从而导致天然病毒和转导颗粒的密度无法区分。

因此，需要非复制型转导颗粒，其不遭受病毒裂解功能的有害作用，也没有受限于靶向病毒核酸分子和病毒功能的超感染免疫和宿主限制机制的可能性，这些有害作用和可能性全都可能通过增加检测限并导致假阴性结果而限制报告子测定的性能。

即使在已经将转导颗粒工程化改造时，使用转导颗粒检测并报告细胞中靶核酸分子的存在的方法也有局限性。一些方法需要破坏细胞和繁琐的技术来分离和检测裂解物中的转录物。检测方法包括使用经标记的探针诸如抗体、适体或核酸探针。针对靶基因的经标记的探针可导致与非预期靶的非特异性结合，或生成具有高信噪比的信号。因此，需要用于检测和报告细胞中内源核酸分子的特异性的、有效且准确的方法。

最近，在美国专利号9,388,453(通过引用整体并入本文)中描述了用于将报告核酸分子包装入非复制型转导颗粒(NRTP)(本文也称为Smarticles)中的方法和系统，其中，具有复制能力的天然子代病毒核酸分子的产生由于噬菌体基因组中包装起始位点的破坏而大大减少。

鲍氏不动杆菌(A.Baumannii)是革兰氏阴性球菌，并且已经成为越来越多的问题，是医院感染和全球流行的主要原因。鲍氏不动杆菌的感染可能会导致败血症、呼吸机相关性肺炎、尿路感染和伤口感染(Beggs等人，2006；Peleg等人，2008)，并且免疫力低下的人特别危险。引起感染的鲍氏不动杆菌菌株通常对抗生素具有广泛的耐药性，并构成严重的公共卫生威胁，这促使世界卫生组织最近在开发针对它的新抗生素清单上将其宣布为关键水平的“优先1”病原体(WHO，2017)。此外，鲍氏不动杆菌感染的死亡率特别高；在呼吸机相关性肺炎和血液感染的患者中，死亡率高达35％(Antunes等人，2014)。鲍氏不动杆菌感染导致高死亡率的一个危险因素是抗生素治疗不当(Lemos EV等人，2014)。

鲍氏不动杆菌的快速诊断对于标识适当的抗生素治疗和控制临床环境中的感染传播至关重要。当前用于检测鲍氏不动杆菌感染的市售方法包括表型方法(例如，VITEK 2，Biomerieux)和基于DNA的方法(例如，16srRNA的PCR扩增)(Li P，等人，2015)。然而，需要一种能够快速检测生物样品中鲍氏不动杆菌的存在而无需使用天然噬菌体的测定，该天然噬菌体必须感染宿主细菌以完成裂解生命周期并且还遭遇细菌宿主防御机制。

发明内容

本发明涉及包含对于鲍氏不动杆菌具有特异性的新型噬菌体的组合物，该噬菌体在该物种内具有广泛的宿主范围。在一个实施例中，该新型噬菌体是属于肌尾噬菌体科的Abi 33。在另一个实施例中，该新型噬菌体是属于长尾噬菌体科的Abi 49或Abi 147。本发明还涉及非复制性转导颗粒(NRTP)的产生，该非复制型转导颗粒对鲍氏不动杆菌具有特异性并且源自这些新型噬菌体的基因组。因此，本发明涉及一种包含噬菌体基因组的组合物，其中噬菌体基因组源自选自由Abi33、Abi 49和Abi 147组成的组的噬菌体，并且其中噬菌体基因组包含编码包装相关的酶活性的一个或多个基因的破坏。在一个实施例中，编码包装相关的酶活性的一个或多个基因包含terS基因、terL基因或者terS基因和terL基因两者。在一个实施例中，编码包装相关的酶活性的一个或多个基因的破坏包含选自SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的核苷酸序列的缺失。

本发明还涉及一种细菌细胞包装系统，用于将包含报告基因的报告质粒包装到Smarticles非复制型转导颗粒(NRTP)中，以引入鲍氏不动杆菌中。在一个实施例中，该包装系统包含宿主鲍氏不动杆菌细胞；位于宿主鲍氏不动杆菌细胞内部的第一核酸构建体，其包含具有编码包装相关的酶活性的一个或多个基因的破坏的噬菌体基因组或由其组成，其中该破坏阻止噬菌体基因组包装在NRTP中，并且其中噬菌体基因组选自由噬菌体Abi 33的基因组、噬菌体Abi 49的基因组和噬菌体147的基因组组成的组；和位于宿主鲍氏不动杆菌细胞内的与第一核酸构建体分离的第二核酸构建体，所述第二核酸构建体包含报告核酸分子，所述报告核酸分子具有报告基因和编码包装相关的酶活性的一个或多个基因，第二核酸构建体补足噬菌体基因组上的破坏并促进将报告核酸分子的复制子包装在NRTP中。在一个实施例中，编码包装相关的酶活性的一个或多个基因包含terS基因、terL基因或者terS基因和terL基因两者。在一个实施例中，编码包装相关的酶活性的一个或多个基因的破坏包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的核苷酸序列的缺失。在一些实施例中，破坏是通过缺失、插入、突变或替换进行的。在另一个实施例中，报告核酸分子包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的核苷酸序列。

本发明还涉及一种由上述细菌细胞包装系统产生NRTP的方法，该方法包括诱导细菌细胞包装系统的裂解期，并使报告分子的所述复制子被包装以产生所述NRTP。在一个实施例中，编码包装相关的酶活性的一个或多个基因包含terS基因、terL基因或者terS基因和terL基因两者。在一个实施例中，编码包装相关的酶活性的一个或多个基因的破坏包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的核苷酸序列的缺失。在另一个实施例中，报告核酸分子包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的核苷酸序列。

本发明还涉及检测样品中的鲍氏不动杆菌的方法，其包括以下步骤：向样品提供通过上述NRTP产生方法产生的源自噬菌体Abi 33的NRTP、源自噬菌体Abi 49的NRTP、源自噬菌体Abi 147的NRTP或以上的任意组合，为报告基因提供条件以产生可检测的信号；以及检测存在或不存在可检测的信号，以提示存在或不存在鲍氏不动杆菌。在一个实施例中，该方法包括在向所述样品提供NRTP之前或之后的步骤：向所述样品提供抗微生物剂，以及检测存在或不存在可检测的信号以提示所述样品是否含有对所述抗微生物剂具有耐药性或敏感性的鲍氏不动杆菌。在一个实施例中，NRTP包含报告核酸分子，所述报告核酸分子包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的核苷酸序列。

附图说明

图1a显示了含有2个肌尾噬菌体科噬菌体种群的Abi 33裂解物的TEM图像。

图1b显示了含有长尾噬菌体科噬菌体的Abi 49裂解物的TEM图像。

图1c显示了含有长尾噬菌体科噬菌体的Abi147裂解物的TEM图像。

图2显示了使用缺失/互补策略的Smarticles非复制型转导颗粒(NRTP)技术的示意图。对每个候选噬菌体进行工程化改造以令pac位点/pac功能缺失，然后通过携带与包装相关的DNA序列和基因的质粒进行补足。互补质粒还携带荧光素酶作为报告基因。Smarticle NRTP是从带有包装/报告质粒的经工程化改造的原噬菌体中产生的。

图3是用于产生Abi 33、Abi 49和Abi 147NRTP的包装/报告质粒的代表性示意图。

图4a显示了用于鲍氏不动杆菌交叉反应性相对光单位(RLU)测定的革兰氏(-)菌株布局。菌株简写如下：Kpn：肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)，Eco：大肠杆菌(E.coli)，Kox：产酸克雷伯菌(K.oxytoca)，Eae：产气肠杆菌(E.aerogenes)，Ecl：阴沟肠杆菌(E.cloacae)，Cfi：弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)，Cko：克氏柠檬酸杆菌(C.koseri)，Sms：粘质沙雷氏菌(S.marcescens)，Pae：绿脓假单胞菌(P.aerugmosa)，Pms：奇异变形杆菌(P.mirabilis)，Abi：鲍氏不动杆菌(A.baumannii)。

图4b显示了图4a中针对肠杆菌科和其他革兰氏(-)细菌的交叉反应性而测试的Abi 33、Abi 49和Abi 147Smarticles NRTP的基于RLU的覆盖率。没有观察到RLU阳性结果。C1和G1中的峰值是注入尖峰，不是真正的阳性信号。第12列中的RLU阳性鲍氏不动杆菌菌株在测定中用作阳性对照，提示典型的Abi 49滴度。

图5是Abi包装/报告质粒pZX057的代表性示意图。

图6是源自Abi 33以生成新的Abi 33Smarticles NRTP的9247bp质粒pZX058的代表性示意图。

图7-I、7-II、7-III和7-IV显示了质粒pZX058的注释的核苷酸序列(SEQ ID NO：4)。

图8是源自Abi 49以生成新的Abi 49Smarticles NRTP的9464bp质粒pZX065的代表性示意图。

图9-I、9-II、9-III和9-IV显示了质粒pZX065的注释的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。

图10是源自Abi 147以生成新的Abi 147Smarticles NRTP的9768bp质粒pZX066的代表性示意图。

图11-I、11-II、11-III和11-IV显示了质粒pZX066的注释的核苷酸序列(SEQ IDNO：6)。

具体实施方式

I.定义

除非另有说明，否则权利要求和说明书中使用的术语定义如下。

如本文所用，“报告核酸分子”是指包含DNA或RNA分子的核苷酸序列。报告核酸分子可以是天然存在的或人工或合成的分子。在一些实施例中，报告核酸分子对于宿主细胞是外源的，并且可以作为外源核酸分子的一部分(诸如质粒或载体)引入宿主细胞中。在某些实施例中，报告核酸分子可以与细胞中的靶基因互补。在其他实施例中，报告核酸分子包含编码报告分子(例如，报告酶、蛋白质)的报告基因。在一些实施例中，报告核酸分子称为“报告构建体”或“核酸报告构建体”。

“报告分子”或“报告子”是指赋予生物体可检测的或可选择的表型的分子(例如，核酸或蛋白质)。可检测的表型可以是例如比色的、荧光的或发光的。报告分子可以由编码介导发光反应的酶(LuxA、LuxB、LuxAB、Luc、Ruc、nLuc)的报告基因、编码介导比色反应的酶(LacZ、HR)的基因、编码荧光蛋白(GFP、eGFP、YFP、RFP、CFP、BFP、mCherry、近红外荧光蛋白)的基因、编码亲和肽(His-tag、3X-FLAG)的核酸分子和编码可选择的标志物(例如，ampC、tet(M)、zeoR、hph、CAT、erm)的基因。报告分子可以用作将核酸分子或外源序列(质粒)成功摄取到细胞中的标志物。如本文所述，报告分子还可以用于提示靶基因、靶核酸分子、靶细胞内分子或细胞的存在。另选地，报告分子可以为核酸，诸如适体或核酶。

在本发明的一些方面，报告核酸分子与启动子可操作地连接。在本发明的其他方面，基于启动子在特定细胞(例如，特定物种)中而不是在其他细胞中的活性，可以选择或设计启动子以有助于报告系统的反应性和交叉反应性。在某些方面，报告核酸分子包含复制起点。在其他方面，当靶细胞内报告核酸分子的复制有助于产生报告信号或为产生报告信号所需时，基于复制起点在特定细胞(例如，特定物种)中而不是在其他细胞中的活性而选择复制起点可类似地有助于报告系统的反应性和交叉反应性。在一些实施例中，报告核酸分子形成复制子，所述复制子能够在病毒复制过程中作为多联体DNA被包装在子代病毒中。

如本文所用，“靶转录物”是指由靶细胞天然形成的(包括在靶基因转录过程中形成的)DNA序列或mRNA分子的核苷酸序列的一部分和作为初级转录产物的RNA处理产物的mRNA。靶转录物也可以称为细胞转录物或天然存在的转录物。

如本文所用，术语“转录物”是指一定长度的从DNA或RNA模板序列或基因转录的核苷酸序列(DNA或RNA)。转录物可以是从RNA模板转录的cDNA序列或从DNA模板转录的mRNA序列。转录物可以是编码蛋白质的转录物或不编码蛋白质的转录物。转录物也可以从经工程化改造的核酸构建体转录。

源自报告核酸分子的转录物可以被称为“报告转录物”。报告转录物可包括报告序列和顺式阻遏序列。报告转录物可以具有形成互补区域的序列，使得该转录物包括形成双链体的两个区域(例如，分子间双链体区域)。一个区域可以被称为“顺式阻遏序列”，并且与靶转录物和/或报告子序列的一部分或全部互补。转录物的第二个区域称为“报告子序列”，可以与顺式阻遏序列互补。互补可以是完全互补的或基本互补的。顺式阻遏序列与报告子序列的存在和/或结合可在报告转录物中形成构象，其可阻断报告分子的进一步表达。报告转录物可以形成二级结构诸如发夹结构，使得报告转录物中的彼此互补的区域可以彼此杂交。

如本领域技术人员所理解的，当提及核酸分子或外源序列(例如，质粒、载体、构建体)时，“引入细胞内”是指促进摄取或吸收到细胞内。核酸构建体或转录物的吸收或摄取可通过无辅助的扩散或活性细胞过程进行，或通过佐剂或装置(包括通过使用噬菌体、病毒和转导颗粒)进行。该术语的含义不限于体外细胞；核酸分子也可以被“引入细胞内”，其中细胞是活生物体的一部分。在这种情况下，引入细胞内将会包括向生物体的递送。例如，对于体内递送，可以将本发明的核酸分子、构建体或载体注射入组织部位或全身性施用。在体外引入细胞内包括本领域已知的方法，诸如电穿孔和脂转染。其他方法在本文中描述或是本领域已知的。

“转导颗粒”是指能够将非病毒核酸分子递送到细胞中的病毒。该病毒可以是噬菌体、腺病毒等。

“非复制型转导颗粒”或“NRTP”是指能够将非病毒核酸分子递送到细胞内但不能将其自我复制的病毒基因组包装在转导颗粒中的病毒。该病毒可以是噬菌体、腺病毒等。

“质粒”是与细胞内的染色体DNA物理分离并可以独立复制的小DNA分子。质粒最常作为细菌中的环状双链小DNA分子而被发现，有时在古细菌和真核生物中也存在质粒。质粒被认为是复制子，能够在合适的宿主中自主复制。

“载体”是用作将外来遗传物质人工携带到另一个细胞中的媒介物的核酸分子，在所述另一个细胞处，它可以被复制和/或表达。

“病毒”是一种小的感染剂，仅在其他生物体的活细胞内复制。病毒颗粒(称为病毒体)包括两个或三个部分：i)由携带遗传信息的DNA或RNA分子制成的遗传物质；ii)保护这些基因的蛋白质外壳；以及，在某些情况下，iii)脂质包膜9388

如本文所用，术语“互补/补足”是指在已经存在被破坏的相同序列的情况下未破坏的序列，或未破坏的序列与被破坏的序列的关系。在一个实施例中，补体包含编码在细胞中的多核苷酸上的基因，该基因具有功能并能够表达，并且像噬菌体上的被破坏基因在破坏之前的作用一样表达蛋白质。在一些实施例中，补体基因与被破坏的噬菌体基因在破坏之前的序列(即，天然噬菌体基因)具有大于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一些实施例中，补体基因与被破坏的噬菌体基因在破坏之前的序列(即，天然噬菌体基因)相同。在一些实施例中，补体基因包含已经从噬菌体中缺失的多核苷酸序列。在一些实施例中，补体基因是指编码质粒上噬菌体包装机构的基因，其中相同基因已在噬菌体中被破坏。因此，在存在具有突变包装结构基因的噬菌体的情况下，需要质粒提供将多核苷酸包装在转导颗粒中所必需的包装机构。

如本文所用，术语“包装相关的酶活性”是指对于与包装起始位点序列相互作用以将多核苷酸包装在转导颗粒中而言至关重要的一个或多个多肽。在一些实施例中，这样的相互作用需要一对末端酶基因，其中每个末端酶编码包装相关的酶活性。在一些实施例中，酶活性由本发明中发现的来自鲍氏不动杆菌噬菌体的terS和/或terL基因编码。在这些实施例中，一对末端酶基因中的每一个都表达包装相关的酶活性，并且对于具有包装起始位点的多核苷酸的包装而言，这两个功能版本都是需要的。在一些实施例中，与包装相关的酶活性相关联的多个基因之一的破坏消除了包装相关的酶活性。在一些实施例中，这一对末端酶基因均在噬菌体基因组上被破坏，因此破坏了噬菌体上的编码包装相关的酶活性的基因的整个集合。

术语“改善”是指在疾病状态(例如，患病状态)的治疗中的任何治疗有益结果，包括预防、减轻其严重性或者其进展、缓解或治愈。

术语“原位”是指在与活生物体分开生长的活细胞中发生的过程，例如，在组织培养物中生长的过程。

术语“体内”是指在活生物体中发生的过程。

如本文所用，术语“哺乳动物”包括人类和非人类，并且包括但不限于人类、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物和猪。

“G”、“C”、“A”和“U”通常各自代表分别含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。“T”和“dT”在本文可互换使用，是指脱氧核糖核苷酸，其中核碱基为胸腺嘧啶，例如，脱氧核糖胸腺嘧啶。然而，将理解的是，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”或“脱氧核糖核苷酸”也可指经修饰的核苷酸，如下文进一步详述，或替代的替换部分。技术人员众所周知，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其他部分替换，而基本上不改变包含带有这种替换部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对特性。例如但不限于，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸进行碱基配对。因此，在本发明的核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以被含有例如肌苷的核苷酸替换。包含这样的替换部分的序列是本发明的实施例。

如本文所用，当用于描述与第二核苷酸序列有关的第一核苷酸序列时，术语“互补的”是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力，如本领域技术人员应理解的。互补序列也被描述为彼此结合并以结合亲和力为特征。

例如，当两个序列在严格杂交条件下杂交(例如，退火)时，第一核苷酸序列可被描述为与第二核苷酸序列互补。杂交条件包括用于退火和/或洗涤步骤的温度、离子强度、pH和有机溶剂浓度。术语严格杂交条件是指第一核苷酸序列将优先与其靶序列例如第二核苷酸序列杂交，而与其他序列杂交程度较小或根本不杂交的条件。严格的杂交条件是序列依赖性的，并且在不同的环境参数下是不同的。通常，严格的杂交条件选择为比核苷酸序列在限定的离子强度和pH下的热熔点(T_m)低约5℃。T_m是50％的第一核苷酸序列与完美匹配的靶序列杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。在例如Tijssen(1993)生物化学和分子生物学实验室技术-与核酸探针的杂交(Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes)，第I部分，第2章，“杂交原理概述和核酸探针测定策略”(Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays)，爱思唯尔(纽约)(Elsevier，N.Y.)(以下简称“Tijssen”)中找到了核酸杂交的广泛指南。可以应用其他条件，诸如生物体内可能遇到的生理相关条件。技术人员将能够根据经杂交的核苷酸的最终应用来确定最适合于测试两个序列的互补性的一组条件。

这包括将包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在第一和第二核苷酸序列的整个长度上进行碱基配对。这样的序列在本文中可以被称为彼此“完全互补的”。然而，在本文中第一序列相对于第二序列被称为“基本互补的”时，这两个序列可以是完全互补的，或者它们在杂交时可以形成一个或多个，但是通常不超过4个、3个或2个错配碱基对，同时保留在与它们的最终应用最相关的条件下杂交的能力。但是，在两个寡核苷酸设计为在杂交时形成一个或多个单链突出端的情况下，就确定互补性而言，此类突出端不应视为错配。例如，对于本文所述的目的，包含一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸和另一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA，其中较长的寡核苷酸包含与较短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，也可称为“完全互补”。

如本文所用的“互补的”序列还可以包括非Watson-Crick碱基对和/或非天然和修饰核苷酸形成的碱基对或完全由其形成，前提是必须满足上述关于它们的杂交能力的要求。此类非Watson-Crick碱基对包括但不限于G：U Wobble或Hoogstein碱基配对。

关于dsRNA的两条链之间或dsRNA的反义链与靶序列之间、单链RNA序列或单链DNA序列的互补链之间的碱基匹配，可以使用本文中的术语“互补的”、“完全互补的”和“基本互补的”，如从其使用的上下文中应理解的。

如本文所用，“双链体结构”包含两个反平行且基本互补的核酸序列。核酸构建体中的互补序列可以在两个转录物之间、一个转录物内的两个区域之间或转录物与靶序列之间形成“双链体结构”。通常，每条链的大部分核苷酸为核糖核苷酸，但是如本文中详细描述的，每条或两条链也可以包括至少一个非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸和/或经修饰的核苷酸。形成双链体结构的两条链可以是一个较大的RNA分子的不同部分，也可以是独立的RNA分子。在两条链是一个较大分子的一部分并因此通过一条链的3′端与另一条链的5′端之间的不间断核苷酸链连接而形成双链体结构的情况下，连接RNA链被称为“发夹环”。在两条链通过除位于一条链的3′端与另一条链的5′端之间的不间断核苷酸链以外的手段连接而形成双链体结构的情况下，连接结构被称为“连接基”。RNA链可以具有相同或不同数量的核苷酸。碱基对的最大数目是双链体最短链中的核苷酸数目减去双链体中存在的任何突出端。通常，双链体结构的长度为15个至30个，或25个至30个，或18个至25个，或19个至24个，或19个至21个，或19个、20个或21个碱基对。在一个实施例中，双链体的长度为19个碱基对。在另一个实施例中，双链体的长度为21个碱基对。当两种不同的siRNA组合使用时，双链体的长度可以相同也可以不同。

如本文所用，术语“互补区域”是指反义链上与本文定义的序列例如靶序列基本互补的区域。在互补区域与靶序列不完全互补的情况下，错配在末端区域中最能被容忍的，并且如果存在，通常在例如一个末端区域或区域中，例如，5′和/或3′末端的6个、5个、4个、3个或2个核苷酸内。

在两个或多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性百分比”是指当对两个或更多序列或亚序列进行关于最大相关性的比较和比对时，如使用下述系数序列比较算法(例如，BLASTP和BLASTN或技术人员可获得的其他算法)中的一者或通过目视检查所测量的，该序列或亚序列所具有的相同核苷酸或氨基酸残基的具体百分比。取决于应用，“同一性”百分比可以存在于要比较的序列的区域上，例如，存在于功能结构域上，或者另选地，存在于要比较的两个序列的全长上。

对于序列比较，通常以一条序列作为参考序列，用测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入电脑，指定子序列坐标，如有必要，指定序列算法程序参数。然后基于指定的程序参数，序列比较算法计算相对于参考序列的测试序列的序列同一性百分比。

用于比较的最佳序列比对可以例如通过Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，通过Needleman&Wunsch，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，第48卷：第443页，1970年的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性检索方法，通过这些算法的计算机实施(威斯康星大学遗传学计算机组(Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，Wis.)的威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过目视检查(通常参见Ausubel等人，同上)执行。

适用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个实例是BLAST算法，其描述于Altschul等人，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol)，第215卷：第403-410页，1990年。用于执行BLAST分析的软件可通过国立生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开地获得。

术语“足够量”是指足以产生所需效果的量，例如，足以产生来自细胞的可检测的信号的量。

术语“治疗有效量”是有效改善疾病症状的量。治疗有效量可以是“预防有效量”，因为可以将预防视为治疗。

必须注意的是，如在本说明书和所附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”、“该”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。

II.病毒的溶原性周期和裂解性周期

病毒在宿主细胞中经历溶原性周期和裂解性周期。如果采用溶原性周期，则可以将噬菌体染色体整合到细菌染色体中，或者可以将自身建立为宿主中的稳定质粒，在宿主中可以长时间保持休眠状态。如果诱导了溶原，则从细菌染色体上切除噬菌体基因组并启动裂解性周期，最终导致细胞裂解和噬菌体颗粒的释放。裂解性周期导致产生新的噬菌体颗粒，其通过宿主的裂解而释放。

另外，由于基于宿主和源自原噬菌体的噬菌体抗性机制引起的噬菌体宿主范围的限制，基于病毒的报告子(诸如基于噬菌体的报告子)测定，可能遭受有限的反应性(即分析包容性)。这些抗性机制靶向天然噬菌体核酸，其可以导致噬菌体DNA和功能的降解或以其他方式抑制。此类抗性机制包括切割噬菌体DNA的限制系统和抑制源自噬菌体的转录物的CRISPR系统。

裂解活性和噬菌体抗性对于基于报告噬菌体的测定都是抑制性的。裂解活性可通过破坏或以其他方式抑制细胞生成可检测信号的能力来抑制信号，从而通过减少可检测的信号的量或防止可检测的信号的生成来影响检测限。噬菌体抗性机制可以限制噬菌体的宿主范围并限制基于噬菌体的报告子的包容性，通过减少可检测的信号的量或防止可检测的信号的生成而类似地影响检测限。在报告噬菌体中掺入噬菌体DNA引起的裂解活性和噬菌体抗性都可能在掺入这些噬菌体报告子的测定中导致假阴性结果。

III.产生非复制型转导颗粒(NRTP)的方法

基于破坏/互补的用于产生非复制型转导颗粒的方法。

本文公开了非复制型转导颗粒包装系统，在本文中也称为Smarticles系统，其基于病毒的基因组组分的破坏，该病毒的基因组被病毒包装机构识别为在病毒产生过程中自其启动基因组包装的元件。在一个实施例中，这种破坏破坏了来自噬菌体的包装起始位点，并且还破坏了末端酶的功能。被破坏的元件的实例包括pac型噬菌体的pac位点序列和cos型噬菌体的cos位点序列。当噬菌体中的包装起始位点序列被破坏时，噬菌体不能产生功能性末端。在一个实例中，pac位点在pacA基因序列内被编码，并且末端酶功能需要功能性PacA和PacB两者。通过补足所述被破坏的末端酶并在质粒DNA上包括可识别的包装起始位点，将质粒DNA包装入噬菌体衣壳中。

包装起始位点通常在病毒产生必不可少的基因编码区域内发现。可以通过破坏包装起始位点的插入、替换、缺失或突变来破坏噬菌体基因组的区域。实现此目的的破坏的实例包括但不限于等位基因交换事件，该事件用另一序列(诸如抗生素抗性基因的序列)替换噬菌体基因组上的包含包装起始位点序列的序列，或使小型和大型末端酶基因完全缺失。在采用末端酶基因pacA和pacB的实例中，可以以引起极性效应的方式破坏pacA，所述极性效应也破坏pacB表达和/或由PacA和PacB介导的总末端酶功能。其他实例可以包括末端酶基因的破坏，并且还可以包括来自本发明中发现的鲍氏不动杆菌噬菌体的terS基因和terL基因

在一个实例中，细胞的基因组被包装起始位点已被破坏的病毒基因组溶原化。细胞可以是革兰氏阴性或革兰氏阳性的。将互补质粒(或报告核酸分子)引入细胞内，并且质粒DNA至少包括在噬菌体中已被破坏的基因，以及包装起始位点序列，和任选地另外的噬菌体基因和报告基因其可以编码可检测的和/或可选择的标志物。可以使用在美国专利号9,388，453中发现的方法来构建质粒，该专利在此通过引用全文并入。质粒的一个或多个基因可以可操作地连接至启动子，诸如可诱导型启动子(其在当通过诱导噬菌体启动包装时可以被诱导)。在一些实施例中，启动子可以是小末端酶基因(terS)或大末端酶基因(terL)的天然启动子。天然启动子可以被噬菌体控制，并因此有效地充当在包装期间被诱导的条件启动子。

在一些实例中，优选地，设计破坏/互补而使得在突变的病毒DNA和互补外源DNA之间不存在同源性。这是因为突变的病毒DNA与互补外源DNA之间缺乏同源性，避免了两个DNA分子之间同源重组的可能性，这种重组可能导致将包装序列重新引入病毒基因组。为了实现同源性的缺乏，一种策略是从病毒基因组中删除包含包装起始位点序列的整个基因，然后用一个外源DNA分子对该基因进行补足，该外源DNA分子优选包含不超过从病毒中缺失的确切DNA序列。在这种策略中，互补DNA分子设计为表达从病毒中缺失的基因。使用噬菌体φ80α(一种pac型噬菌体)提供了这种系统的另一个实例。噬菌体基因组在宿主细菌细胞中被裂解，并且噬菌体基因组包括一个小的末端酶基因，其中pac型原噬菌体φ80α的pac位点已缺失。将包括具有天然pac位点的互补小末端酶基因的质粒转化到细胞中。当诱导了经溶原化的原噬菌体的裂解性周期时，噬菌体包装系统会将质粒DNA包装到子代噬菌体结构成分中，而不是包装天然噬菌体DNA。包装系统因此产生携带质粒DNA的非复制型转导颗粒。

噬菌体是生物图中最丰富的生命形式(Clokie等人，2011)，经测序的细菌基因组中有70％包含原噬菌体样结构(Chen，等人，2006)。Touchon等人观察到，在分析133种不动杆菌属的细菌基因组时，完整的噬菌体(即整合到细菌基因组中的噬菌体)占主导地位(Touchon等人，2014)。利用自然界中原噬菌体的这种天然丰度来分离鲍氏不动杆菌特异性的新噬菌体，该噬菌体在该物种中具有广泛的宿主范围。这些噬菌体被转化为非复制型转导颗粒，在发光测定中获得了良好的包容性和排他性。

考虑到鲍氏不动杆菌菌株的广泛遗传多样性和基因组可塑性(Sahl，JW等人，2015；Snitkin等人，2011)，在单个测定中将非复制型转导颗粒组合为混合物(cocktail)以说明鲍氏不动杆菌细胞上的噬菌体受体的潜在多样性。在这样做时，鲍氏不动杆菌菌株在测定中的包容性得到改善而没有干扰作用。采用这种方法的方式与在噬菌体疗法中治疗性地使用噬菌体混合物的方式相同(Chan，BK等人，2013)。该技术的优势在于，该测定仅需在短时间内进行DNA递送和发光反应，而噬菌体则无需完成裂解性生命周期或遭遇细菌宿主防御机制。

报告基因编码可检测的标志物或可选择的标志物。在一个实例中，报告基因选自由以下项组成的组：介导发光反应的酶(LuxA、LuxB、LuxAB、Luc、Ruc、nLuc)、介导比色反应的酶(LacZ、HR)、荧光蛋白(GFP、eGFP、YFP、RFP、CFP、BFP、mCherry、近红外荧光蛋白)、亲和肽(His-tag、3X-FLAG)和可选择的标志物(ampC、tet(M)、CAT、erm)。在一个实施例中，报告基因为luxA。在一些实施例中，抗性标志物包含抗生素抗性基因。在一些实施例中，抗性标志物为卡那霉素抗性基因(kan)。在一些实施例中，组成型启动子包含pBla(氨苄青霉素抗性基因的启动子)。在一些实施例中，噬菌体基因组破坏是通过等位基因交换事件完成的，该等位基因交换事件替换或破坏了噬菌体基因组上的包含包装起始位点序列的序列。

在一个实例中，可以以引起极性效应的方式破坏噬菌体基因组上的一对末端酶基因，例如，terS和terL，所述极性效应也破坏末端酶基因之一的表达和/或由末端酶基因介导的整体末端酶功能。被破坏的噬菌体可以与包含噬菌体基因组的末端酶基因(例如，terS和terL)的质粒互补。当突变的病毒处于裂解性周期时，由噬菌体基因组或(如果被破坏)互补质粒产生的病毒包装蛋白因为包含包装起始位点而会将质粒DNA的复制子包装在包装单元中，并且产生携带复制质粒DNA的非复制型转导颗粒。

VI.报告子

在一些实施例中，本发明的NRTP和构建体包含包括报告基因的报告核酸分子。报告基因可以编码报告分子，并且报告分子可以是可检测的或可选择的标志物。在某些实施例中，报告基因编码当在细胞中表达时产生可检测的信号的报告分子。

在某些实施例中，报告分子可以是荧光报告分子，诸如但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、增强的GFP、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、红色荧光蛋白(RFP)或mCherry，以及近红外荧光蛋白。

在其他实施例中，报告分子可以为介导发光反应的酶(LuxA、LuxB、LuxAB、Luc、Ruc、nLuc等)。报告分子可以包括细菌荧光素酶、真核荧光素酶、适用于比色检测的酶(LacZ、HR)、适用于免疫检测的蛋白质诸如亲和肽(His-tag、3X-FLAG)、起适体作用或表现出酶活性(核酶)的核酸、或可选择的标志物诸如抗生素抗性基因(ampC、tet(M)、CAT、erm)。本领域已知的其他报告分子可用于产生信号以检测靶核酸或细胞。

在其他方面，报告分子包括核酸分子。在一些方面，报告分子是具有特异性结合活性或表现出酶活性的适体(例如，aptazyme、DNAzyme、ribozyme)。

报告子和报告子测定在本文第五节中进一步描述。

V.NRTP和报告子测定

诱导物报告子测定

在一些实施例中，本发明包括使用NRTP作为报告分子的方法，其与活细胞内的靶基因启动子的内源诱导物或天然诱导物一起使用。本发明的NRTP可以使用第III节和以下实例1至2中所述的方法进行工程化改造。

在一些实施例中，该方法包括采用NRTP作为报告子，其中NRTP包含与诱导型启动子可操作地连接的报告基因，所述诱导型启动子控制靶细胞内靶基因的表达。当将包括报告基因的NRTP引入靶细胞中时，可以通过在报告核酸分子中诱导靶基因启动子来表达报告基因。

转录物

如上所述，转录物是一定长度的从DNA或RNA模板序列或基因转录的核苷酸序列(DNA或RNA)。转录物可以是从RNA模板转录的cDNA序列或从DNA模板转录的mRNA序列。转录物可以从经工程化改造的核酸构建体转录。转录物可以在其自身内部具有互补区域，使得该转录物包括两个可以形成分子内双链体的区域。一个区域可以称为“顺式阻遏序列”，其与报告序列结合并阻断其翻译。转录物的第二区域称为“报告序列”，其编码报告分子，诸如可检测的或可选择的标志物。

本发明的转录物可以是长度可为5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸的转录物序列。在其他实施例中，转录物的长度可以是至少25个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、500个、1000个、1500个、2000个、3000个、4000个、5000个或更多个核苷酸。顺式阻遏序列和报告序列可以是相同长度或不同长度。

在一些实施例中，顺式阻遏序列与报告序列由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个或更多个间隔核苷酸间隔开。

载体

在另一方面，本发明的转录物(包括反义序列和有义序列)是从插入到DNA或RNA载体中的转录单位表达的(参见，例如，Couture，A等人，TIG.(1996)，12：5-10；Skillem，A.，等人，国际PCT公布号WO 00/22113；Conrad，国际PCT公布号WO 00/22114和Conrad，美国专利号6,054,299)。可以将这些序列作为线性构建体、环状质粒或病毒载体(包括基于噬菌体的载体)引入，可以将其掺入并作为整合到宿主基因组中的转基因遗传。还可以构建转录物以使其作为染色体外质粒遗传(Gassmann，等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1995年，第92卷：第1292页)。

转录物序列可被位于表达质粒上的启动子转录。在一个实施例中，顺式阻遏序列和报告序列被表达为通过连接基多核苷酸序列连接的反向重复序列，使得该转录物具有茎环结构。

重组表达载体可用于表达本发明的转录物。重组表达载体通常是DNA质粒或病毒载体。可以基于但不限于以下项来构建表达转录物的病毒载体：腺相关病毒(作为综述，参见Muzyczka，等人，Curr.Topics Micro.Immunol.，1992年，第158卷：第97-129页)；腺病毒(参见，例如，Berkner，等人，《生物技术》(BioTechniques)，1998年，第6卷：第616页；Rosenfeld等人，1991年，《科学》(Science)，第252卷：第431-434页；和Rosenfeld等人，1992年，《细胞》(Cell)，第68卷：第143-155页)；或甲病毒以及本领域已知的其他病毒。逆转录病毒已被用于在体外和/或体内将多种基因引入包括上皮细胞在内的许多不同的细胞类型中(参见，例如，Eglitis，等人，《科学》(Science)，1985年，第230卷：第1395-1398页；Danos和Mulligan，美国国家科学院院刊，1998年，第85卷：第6460-6464页；Wilson等人，1988年，美国国家科学院院刊，第85卷：第3014-3018页；Armentano等人，1990年，美国国家科学院院刊，第87卷：第6141-6145页；Huber等人，1991年，美国国家科学院院刊，第88卷：第8039-8043页；Ferry等人，1991年，美国国家科学院院刊，第88卷：第8377-8381页；Chowdhury等人，1991年，《科学》(Science)，第254卷：第1802-1805页；van Beusechem.等人，1992，美国国家科学院院刊，第89卷：第7640-19页；Kay等人，1992年，《人类基因治疗》(Human GeneTherapy)，第3卷：第641-647页；Dai等人，1992年，美国国家科学院院刊，第89卷：第10892-10895页；Hwu等人，1993年，《免疫学杂志》(J.Immunol.)，第150卷：第4104-4115页；美国专利号4,868,116；美国专利号4,980,286；PCT申请WO 89/07136；PCT申请WO 89/02468；PCT申请WO 89/05345和PCT申请WO 92/07573)。可以通过将重组逆转录病毒基因组转染到合适的包装细胞系诸如PA317和Psi-CRIP中来生产能够转导并表达被插入细胞基因组种的基因的重组逆转录病毒载体(Comette等人，1991年，《人类基因治疗》(Human Gene Therapy)，第2卷：第5-10页；Cone等人，1984年，美国国家科学院院刊，第81卷：第6349页)。重组腺病毒载体可用于感染易感宿主(例如，大鼠、仓鼠、狗和黑猩猩)中的多种细胞和组织(Hsu等人，1992年，《传染病学杂志》(J.Infectious Disease)，第166卷：第769页)，并且还具有不需要有丝分裂活性的细胞进行感染的优点。

可以使用能够接受要表达的转录物的编码序列的任何病毒载体，例如，源自腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒(例如，慢病毒(LV)、弹状病毒、鼠白血病病毒)、疱疹病毒等的载体。可以通过用包膜蛋白或来自其他病毒的其他表面抗原对载体进行假型化或通过适当地替换不同的病毒衣壳蛋白来修饰病毒载体的趋性。

例如，可以用来自水疱性口炎病毒(VSV)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、莫可拉病毒等的表面蛋白将本发明特定的慢病毒载体假型化。通过工程化改造载体以表达不同的衣壳蛋白血清型，可以使本发明特定的AAV载体靶向不同的细胞。构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术处于本领域技术范围内；参见例如Rabinowitz J E等人，2002年，《病毒学杂志》(J Virol)，第76卷：第791-801页，其全部公开内容通过引用并入本文。

适用于本发明的重组病毒载体的选择、用于将表达转录物的核酸序列插入载体的方法以及将病毒载体递送至目标细胞的方法处于本领域技术范围内。参见，例如，DornburgR(1995)，《基因治疗》(Gene Therap)，第2卷：第301-310页；Eglitis M A(1988)，《生物技术》(Biotechniques)，第6卷：第608-614页；Miller A D(1990)，《人类基因治疗》(Hum GeneTherap.)，第1卷：第5-14页；Anderson W F(1998)，《自然》(Nature)，第392卷：第25-30页；和Rubinson D A等人，《自然遗传学》(Nat.Genet.)，第33卷：第401-406页，其整体公开内容通过引用并入本文。

病毒载体可以衍生自AV和AAV。合适的用于表达本发明特定的转录物的AV载体、用于构建重组AV载体的方法以及用于将该载体递送至靶细胞的方法在Xia H等人(2002)，《自然-生物技术》(Nat.Biotech.)，第20卷：第1006-1010页中描述。用于表达本发明特定的转录物的合适的AAV载体、用于构建重组AV载体的方法以及用于将该载体递送至靶细胞的方法在以下文献中描述：Samulski R等人，1987年，《病毒学杂志》(J.Virol.)，第61卷：第3096-3101页；Fisher K J等人，1996年，《病毒学杂志》(J.Virol.)，第70卷：第520-532页；Samulski R等人，1989年，《病毒学杂志》(J.Virol.)，第63卷：第3822-3826页；美国专利号5,252,479；美国专利号5，139,941；国际专利申请号WO 94/13788和国际专利申请号WO 93/24641，其全部公开内容通过引用并入本文。

本发明特定的DNA质粒或病毒载体中的驱动转录物表达的启动子可以是真核RNA聚合酶I(例如，核糖体RNA启动子)、RNA聚合酶II(例如，CMV早期启动子或肌动蛋白启动子或U1 snRNA启动子)或通常为RNA聚合酶III启动子(例如，U6 snRNA或7SK RNA启动子)；或是原核启动子，例如，T7启动子，前提是表达质粒还编码从T7启动子转录所需的T7 RNA聚合酶。启动子还可将转基因表达引导至胰腺(参见，例如，胰腺的胰岛素调节序列(Bucchini等人，1986年，美国国家科学院院刊，第83卷：第2511-2515页)。

另外，可以通过例如使用诱导型调控序列和表达系统(诸如对某些生理调节剂(例如，循环葡萄糖水平或激素)敏感的调节序列)来精确调节转录物的表达(Docherty等人，1994年，《美国生物实验学学会联合会会刊》(FASEB J.)，第8卷：第20-24页)。适用于控制细胞或哺乳动物中转基因表达的此类诱导型表达系统包括通过蜕皮激素、雌激素、孕酮、四环素、二聚化的化学诱导剂和异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行的调节。本领域技术人员将能够基于dsRNA转基因的预期用途选择合适的调节/启动子序列。

通常，如下所述递送能够表达转录物分子的重组载体，并且该重组载体在靶细胞中持续存在。另选地，可以使用提供转录分子瞬时表达的病毒载体。这样的载体可以根据需要重复施用。转录物一旦表达，便会与靶RNA结合并调节其功能或表达。转录物表达载体的递送可以是全身性的，诸如通过静脉内或肌肉内施用，通过施用至从患者体内移植的靶细胞然后再重新引入患者体内，或通过允许引入期望的靶细胞的任何其他方式。

转录物表达DNA质粒通常以具有阳离子脂质载体(例如，Oligofectamine)或非阳离子脂质基载体(例如，Transit-TKO^TM)的复合物的形式转染到靶细胞中。本发明还考虑了针对dsRNA介导的敲除的多个脂质转染，其在一周或更长时间的时间内靶向单个PROC基因或多个PROC基因的不同区域。可以使用各种已知方法监测将载体成功导入宿主细胞的过程。例如，瞬时转染可以用报告子(诸如荧光标志物，诸如绿色荧光蛋白(GFP))发出信号。可以使用标志物来确保离体细胞的稳定转染，所述标志物为转染的细胞提供了对特定环境因素(例如，抗生素和药物)的抗性，诸如对潮霉素B的抗性。

包含重组DNA的载体的递送可以通过非生物系统或生物系统进行。包括但不限于电穿孔(如实例中所述)、脂质体、病毒样颗粒、源自噬菌体或病毒的转导颗粒以及缀合作用。

用于转录物测定的报告子

在一些实施例中，核酸构建体包含报告序列(例如，报告基因序列)。报告基因编码当在细胞中表达时产生信号的报告分子。在一些实施例中，报告分子可以是可检测的或可选择的标志物。在某些实施例中，报告分子可以为荧光报告分子，诸如绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)或红色荧光蛋白(RFP)。在其他实施例中，报告分子可以是化学发光蛋白。

报告分子可以是细菌荧光素酶、真核荧光素酶、荧光蛋白、适用于比色检测的酶、适用于免疫检测的蛋白、适用于免疫检测的肽或起适体作用或表现出酶活性的核酸。

可选择的标志物也可以用作报告子。可选择的标志物可以是例如抗生素抗性基因。

实例

以下是用于实施本发明的具体实施例的实例。提供实例仅用于说明性目的并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。已努力确保所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但当然应该允许一些实验误差和偏差。

除非另有说明，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。文献中对此类技术进行了充分的阐述。参见，例如，T.E.Creighton，《蛋白质：结构和分子性质》(Proteins：Structures and MolecularProperties)，W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Company)，1993年；A.L.Lehninger，《生物化学》(Biochemistry)，沃斯出版公司，最新版；Sambrook，等人，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，1989年第2版；《酶学方法》(Methods InEnzymology)，S.Colowick和N.Kaplan编辑，美国学术出版社；《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第18版，(Easton，Pennsylvania：MackPublishing Company，1990)；Carey和Sundberg，《高等有机化学》(Advanced OrganicChemistry)，第3版(Plenum Press)，卷A和卷B(1992)。

实例1：来自鲍氏不动杆菌分离株的新噬菌体的标识和非复制型转导颗粒(NRTP) 的产生。

材料和方法

细菌菌株和生长条件

从CDC、巴斯德研究所和IHMA，Inc.收集了一组288个鲍氏不动杆菌临床分离株，并通过生化测试和MALDI-TOF在室内进行了物种验证。验证的每个鲍氏不动杆菌菌株均以“Abi”标识，后跟一个基于登录顺序的数字。将分离株在Luria-Bertani(LB)肉汤中于37℃以225rpm搅拌培养，或在37℃的LB琼脂平板上于静态条件下培养。通过在LB Lennox(低盐)肉汤或补充有150μg/ml或250μg/ml潮霉素B Gold(Invivogen，San Diego，CA)的琼脂中培养，分别从大肠杆菌克隆菌株或鲍氏不动杆菌分离株中筛选出携带包装质粒的菌株。在LBLennox(低盐)肉汤或补充有200μg/ml博莱霉素(zeocin)(赛默飞世尔科技(Thermo FisherScientific)，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)或腐草霉素(Invivogen，圣地亚哥，加利福尼亚州)的琼脂中筛选出具有基因被破坏的末端酶区域的鲍氏不动杆菌菌株。

溶原性噬菌体的诱导和纯化

将鲍氏不动杆菌溶原性菌株在LB肉汤中于37℃和225rpm振荡速度下生长至对数期(OD₆₀₀约0.6至0.8)，然后添加4μg/ml丝裂霉素C以诱导任何可能存在的溶原性噬菌体。丝裂霉素C处理30分钟后，将细胞在3750rpm下离心10分钟，然后重悬于新鲜的LB肉汤中。将细胞在降低的150rpm振荡速度下于37℃温育4小时。将含噬菌体的上清液在3750rpm下离心10分钟以将细胞碎片制粒，然后使其通过0.2μM过滤器，以除去任何残留的细胞碎片。裂解液在黑暗中于4℃储存直至使用。

通过斑块法评估宿主范围

288个鲍氏不动杆菌临床分离株均在补充有5mM CaCl₂的LB肉汤中生长。在达到OD₆₀₀约0.4至0.6的对数期时，将300μl细菌培养物加入4ml的由0.5％琼脂和5mM CaCl₂组成的熔融顶部琼脂中。将顶部琼脂和细菌培养混合物倒在普通的LB琼脂板上，并立即用5μl的经过滤的裂解物点样。将板在37℃温育过夜，并在第二天对存在或不存在所定义的噬斑进行评分。

诱导型新噬菌体的噬菌体基因组DNA测序

从新Abi phi 33、49和147噬菌体中分离出噬菌体基因组DNA，得到广泛的成斑宿主范围。将裂解物以14,000rpm离心2小时以将噬菌体制粒，然后重悬于1×SM缓冲液中。用DNA酶I(Thermo Fisher，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)处理噬菌体裂解物，并用噬菌体DNA分离试剂盒(Norgen Biotek Corp.，Thorold，ON，加拿大)处理，以分离出噬菌体基因组DNA(gDNA)。将纯化的噬菌体gDNA样品发送到ACGT，Inc.(Wheeling，IL)，使用MiSeq测序平台(因美纳(Illumina)，圣地亚哥，加利福尼亚州)对噬菌体基因组进行从新测序、组装和开放阅读框的推定注解。

通过透射电子显微镜观察噬菌体

为了将噬菌体制粒，将噬菌体裂解物在室温以14,000rpm离心2小时，然后重悬于50-100μl SM缓冲液中。将样品提交给科罗拉多大学博尔德电子显微镜服务中心(University of Colorado，Boulder Electron Microscopy Services(Boulder，CO，USA))进行负染色和透射电子显微镜检查。

用于噬菌体包装的鲍氏不动杆菌质粒的构建

质粒构建在“结果”章节中进行了详细说明。表1列出了该研究中使用的所有质粒。

表1

末端酶区域缺失的设计与构建

使用Aranda等人开发的基因破坏方法(Aranda，等人，2010)通过双交换重组用选择标志物代替末端酶区域。用于重组的底物由博莱霉素抗性基因盒(zeoR)组成，其位于terS上游区域600bp的5′末端和terL下游600bp的3′末端。这些序列中的每一个都是专门针对Abi 33、Abi 49和Abi 147末端酶区域设计的，合成为gBlocks(IDT，雷德伍德城，加利福尼亚州)，亚克隆到pCR-BluntII-TOPO载体中，并用Phusion高保真DNA聚合酶(New EnglandBiolabs，Ipswich，MA)进行PCR扩增聚合酶。使用PCR纯化试剂盒(New England Biolabs)纯化线性重组DNA，并浓缩至约5μg/ml的浓度。

用于生成末端酶区域敲除的电感受态细胞的制备

使用从Jacobs等人(Jacobs AC，等人，2014)改编的方法使鲍氏不动杆菌菌株具有电感受态。细菌培养物在37℃于225rpm振荡下在50ml LB Lennox肉汤中生长过夜。将培养物转移到50ml锥形管中，在室温以3750rpm离心10分钟，使细胞制粒。所有后续步骤均在室温进行。通过吸移除去上清液，并将细胞颗粒轻轻重悬于25ml(起始培养物体积的一半)的10％(v/v)甘油中。将细胞在3750rpm下制粒10分钟，然后重复用10％甘油洗涤。将颗粒状的细胞重悬于1.5ml的10％甘油中。

通过电穿孔转化基因敲除产物

将线性重组DNA(≤10μl)与50μl的新鲜电感受态细胞等分小样混合。将该混合物置于1mm电穿孔吸收池(Bulldog)中，并在Bio-Rad Gene Pulser中以25μF、100ohm和1.8kV的频率脉冲。将细胞在900μl SOC肉汤(Invitrogen)中于37℃温育2至3小时，以恢复细胞并发生重组事件。将细胞铺板在含有200μg/ml博莱霉素或其衍生物腐草霉素的LB Lennox琼脂板上。

用互补质粒转化末端酶敲除菌株

将末端酶敲除菌株在含有200μg/ml的博莱霉素或其衍生物腐草霉素的LB Lennox中生长过夜。如前所述使Abi 33、Abi 49和Abi 147末端酶敲除菌株的培养物具有电感受态，并分别用质粒p3074、p3075和p3073转化。在LB Lennox琼脂上选择含有200μg/ml博莱霉素和250μg/ml潮霉素B Gold的转化子。

诱变突变体以创建非复制型转导颗粒的裂解物

将来自新鲜条纹化的菌落中的Abi 33 ΔterSL::p3074、Abi 49 Δ terSL::p3075和Abi 147 Δ terSL::p3073在含有250μg/ml潮霉素B Gold的LB Lennox肉汤中于37℃以225rpm搅拌生长过夜。将细胞用3％过夜培养物接种到LB肉汤中，并在37℃以225rpm搅拌温育，直到OD600达到1.6至1.8。为了诱导噬菌体产生，将4μg/ml的丝裂霉素C(MilliporeSigma，St.Louis，MO)加入培养物中，在37℃以150rpm搅拌40分钟。为了除去丝裂霉素C，将细胞在室温以3750rpm离心10分钟，然后将颗粒重悬在新鲜的LB肉汤中。将培养物在37℃以150rpm搅拌温育过夜。为了除去细胞碎片并纯化每种裂解物，将培养物以5000rpm离心15分钟。含非复制型转导颗粒裂解物的上清液通过0.2μm Thermo Scientific^TM Nalgene快速流过过滤器(Thermo Fisher)，并在4℃避光保存直至使用。

含有非复制型转导颗粒的裂解物的浓度

将粗制的裂解物在10,000xg的溶液中于4℃离心15分钟以去除细胞碎片，并通过0.2μm Thermo Scientific^TM Nalgene快速流过过滤器进行灭菌。将无菌裂解物在30,000xg下于4℃离心16至18小时，以制成转导颗粒。除去上清液后，将噬菌体颗粒重悬于1×SM缓冲液(100mM NaCl、8mM MgSO4、50mM Tris-HCl)中，使其浓度浓缩至10倍或20倍，然后再次通过0.2μm Thermo Scientific^TM Nalgene快速流过过滤器进行过滤灭菌。

使用非复制型转导颗粒检测靶菌株中的发光

将96孔菌株组的甘油原液接种到深孔板中的500μl LB Miller肉汤中，在37℃以500rpm搅拌生长过夜。通过在800μl的补充有25mM CaCl₂和50mM MgCl₂的LB Miller肉汤中接种1μl过夜培养物来制备日间培养物，起始细胞负荷约为107cfu/ml。使细胞在37℃以500rpm搅拌生长1.5小时。在白色96孔板中，将120μl的日间培养液和50μl的转导颗粒混合在一起。对于转导颗粒混合物测定，将120μl的日间培养物与25μl的3倍浓缩的Abi 33、Abi49和Abi 147转导颗粒中的每一者混合。将测定板在37℃以100rpm搅拌温育2小时，随后进行30分钟的在30℃以100rpm搅拌的冷却步骤，以使luxAB达到最佳表达。在SpectraMax L仪器(Molecular Devices，圣何塞，加利福尼亚州)上，以壬醛作为底物，以相对光单位(RLU)发射来读板。

通过转导颗粒(Tc)点样进行宿主范围评估

通过点样5μl与之孵育的细胞来评估Abi 33、Abi 49和Abi 147转导颗粒的宿主范围(请参阅Westwater论文)。即将进行发光测定之前，将细胞点样到含有250μg/ml潮霉素B的LB Lennox琼脂板上。将板在37℃温育过夜，并在第二天对存在或不存在细菌生长进行评分(即，带有赋予潮霉素抗性的质粒的转导子)。为了确认转导子并去除任何天然的潮霉素抗性细胞，将菌落重悬于LB肉汤中并测试RLU发射。

结果

鉴定并表征了具有广泛成斑宿主范围的诱导型溶原性鲍氏不动杆菌噬菌体

为了标识和缩小诱导型广泛宿主范围的原噬菌体候选者，加入了288个独特的鲍氏不动杆菌临床分离株，并分别用丝裂霉素C(一种细菌SOS应答的强力诱导剂)进行处理，以诱导细菌携带的任何溶原转换为裂解性周期。使用噬菌体成斑法，将来自该制备物的裂解物点样到相同鲍氏不动杆菌菌株的子集上。对斑块的存在进行评分并在电子表格中记录宿主范围。累积地，根据宿主范围和互补覆盖率对具有阳性斑的裂解物进行排名。鉴定了宿主范围最广的裂解物，Abi 33、Abi 49和Abi 147的成斑宿主范围分别为25％(72/287)、23％(61/269)和4％(7/163)，累计为32％(93/288)。

将来自Abi 33、Abi 49和Abi 147裂解物的噬菌体基因组DNA纯化并测序，以标识噬菌体包装(即末端酶)区域。Abi 33、Abi 49和Abi 147的完整噬菌体基因组大小分别为53kb、40kb和36kb。通过透射电子显微镜对Abi 33、Abi 49和Abi 147噬菌体成像，以确认完整噬菌体的存在，确定噬菌体种群的同质性，并根据形态学标识噬菌体科。Abi 33裂解物含有异源的肌尾噬菌体科噬菌体；Abi 49和Abi 147裂解物含有均一的长尾噬菌体科噬菌体群体(图1a、图1b、图1c)。

非复制型转导颗粒可通过令宿主菌株末端酶区域缺失并在噬菌体包装质粒上互补来创建。

非复制型转导颗粒技术依靠缺失和互补来生成携带报告DNA而不是其天然噬菌体DNA的经工程化改造的原噬菌体。合成了Abi 33、Abi 49和Abi 147转导颗粒，其中每个颗粒均由携带质粒的包装缺陷型噬菌体外壳组成，即所述质粒具有1)噬菌体包装遗传元件以补充宿主噬菌体基因组上的损失，以及2)报告基因luxAB，用于发光测定(图2)。在宿主Abi33、Abi 49和Abi 147基因组上，敲除每种菌株的由terSL以及≤250bp上游区域编码的末端酶亚基，并用zeoR选择基因盒替换。构建质粒的骨架用于噬菌体包装，以补充Abi 33、Abi49和Abi 147宿主菌株上末端酶区域的损失(图3)。表2显示了缺失的末端酶区域中的实际核苷酸序列。

表2

每个穿梭质粒骨架分别包含用于大肠杆菌和鲍氏不动杆菌的两个复制起点：pUC18，源自pCR-Blunt II-TOPO载体(Thermo Fisher Scientific，Carlsbad，CA)；和pWH1277，源自从醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)分离的pWH1266质粒)(Hunger M，等人，1990)。噬菌体包装质粒包含一个编码潮霉素B抗性的hph基因盒，该基因盒源自pMQ300质粒(由宾夕法尼亚州匹兹堡大学的Robert M.Q.Shanks教授提供)，用于在所有临床鲍氏不动杆菌分离株中进行几乎通用的抗生素选择。噬菌体包装质粒p3073、p3074和p3075是通过分别在Abi 147、Abi 33和Abi 49的末端酶区域的上游区域和全长末端酶亚基terSL中进行克隆而产生的。具体而言，p3073包含来自Abi 147的terS ORF和terSL上游的250个碱基对；p3074包含来自Abi 33的terS ORF和terSL上游的250个碱基对；而p3075包含来自Abi 49的terS ORF和terSL上游的150个碱基对。质粒p3073包含来自费氏弧菌(Vibrio fischerii)的由pBla启动子驱动的野生型luxAB；p3074和p3075也包含来自费氏弧菌(V.fischerii)的由pBla启动子驱动的luxAB，其在LuxA中具有两个点突变，即C170R和N264D，以提高荧光素酶的活性。质粒p3073、p3074和p3075在luxAB的3′端插入了rrnG转录终止子(TT)。TT区域源自OXB19质粒(牛津遗传学有限公司(Oxford GeneticsLtd.)，牛津大学，英国)。

Abi 33、Abi 49和Abi 147Smarticles的混合物在一组独特的鲍氏不动杆菌临床分离株上获得了高包容性测定结果

通过噬菌体诱导方法生成Abi 33、Abi 49和Abi 147非复制型转导颗粒，并通过离心将其进行3倍浓缩。将一组96个独特的鲍氏不动杆菌临床分离株生长至约107cfu/ml细胞负载，然后与Abi 33、Abi 49和Abi 147Smarticles孵育2.5小时。注入发光反应底物后，通过Abi33、Abi 49和Abi 147单个转导颗粒获得的菌株的RLU阳性率分别为47％、54％和59％(表2)。作为混合物，由于82％的菌株为RLU阳性(表2)，因此存在累加作用。

表3

通过噬菌体诱导方法生成Abi 33、Abi 49和Abi 147转导颗粒，并在一组革兰氏阴性细菌菌株与鲍氏不动杆菌菌株的子集上进行交叉反应性测试，以在测定中用作阳性对照(图4a)。将这组菌株生长至约107cfu/ml细胞负载，然后与Abi 33、Abi 49和Abi147Smarticles孵育2.5小时。在液体测定中未观察到针对非鲍氏不动杆菌菌株的交叉反应性(图4b)。

实例2：稳定化的包装质粒和NRTP的产生

新系列鲍氏不动杆菌(Abi)包装质粒的构建

使用溶原性菌株Abi33 Δ terSL::p3074观察到了稳定性问题，该菌株在单次传代后丢失了质粒。在其他Smarticles NRTP研究中也观察到了类似的质粒不稳定性问题。据推测，这种作用可能是由于来自末端酶基因上游hph启动子的泄露表达，导致由于末端酶活性过高造成的质粒自切割和质粒损失。对于某些包装质粒，当末端酶与hph方向相同时，菌株不稳定，并且获得的Smarticles在RLU分析中的覆盖率很低。但是，当将末端酶取向以与hph相反的方向在载体上翻转时，菌株的稳定性和Smarticles的覆盖率显著提高(数据未显示)。因此，通过在hph终止密码子后添加转录终止子来构建新的构建体骨架，以1)改善菌株的稳定性，2)可能地改善将质粒包装在噬菌体头部中的包装效率，以及因此3)改善Smarticles RLU测定法的覆盖率。

通过以下优化构建空的鲍氏不动杆菌包装载体pZX057(图5)：1)将luxA基因替换为双突变体luxA，所述双突变体luxA是活性更高的酶并且在测定中产生更高的RLU信号；2)在hph基因之后克隆细菌转录终止子T7和rmG以阻止下游基因从hph启动子泄露表达；3)去除未利用的lacZ基因(残留自原始载体)并替换为另一种双向双转录终止子BBa-B0014以阻止任何预期之外的泄露表达。如载体图谱所示，使用载体上的两个克隆位点在末端酶基因区域中进行克隆。

Abi 33包装载体pZX058(图6)是通过将分别具有额外的上游700bp和下游270bp的序列的全长Abi33node3 terS和terL末端酶基因克隆到克隆区域1中而生成的。将Abi 49和Abi 147末端克隆到克隆区域1中存在技术困难，因此将末端酶克隆到克隆区域2中来构建pZX065构建体(图8)和pZX066构建体(图10)。具体而言，pZX065包含全长Abi 49terS和terL，分别加上700bp的上游区域序列和366bp的下游区域序列。质粒pZX066含有全长Abi147terS和terL加上414bp的上游序列和284bp的下游序列。质粒pZX058、pZX065和pZX066的带注释的核苷酸序列分别显示在图7-I、图7-II、图7-III、图7-IV(SEQ ID NO：4)、图9-I、图9-II、图9-III、图9-IV(SEQ ID NO：5)和图11-I、图11-II、图11-III、图11-IV(SEQ ID NO：6)上。

如实例1所述，使用这些稳定化的包装质粒生成新的Abi 33、Abi 49和Abi 147非复制型转导颗粒。注入发光反应底物后，通过Abi 33、Abi 49和Abi 147单个转导颗粒获得的菌株的RLU阳性率分别为61％、42％和41％。作为混合物，由于78％的菌株为RLU阳性(95个鲍氏不动杆菌菌株中的74个)，因此存在累加作用。而且，如通过RLU所测量的，使用Abi33、Abi 49和Abi 147Smarticles NRTP作为混合物，没有观察到与非鲍氏不动杆菌菌株的交叉反应。结果显示在表4中，其中阴性RLU提示总共测试的95种肠杆菌科和革兰氏(-)菌株的排他性。缩写如下：Abi(鲍氏不动杆菌)、Kpn(肺炎克雷伯菌)、Eco(大肠杆菌)、Ecl(阴沟肠杆菌)、Pae(铜绿假单胞菌)、Kox(产酸克雷伯菌)、Eae(产气肠杆菌)、Cfi(弗氏存檬酸杆菌)、Cko(克氏存檬酸杆菌)、Sms(粘质沙雷氏菌)。

表4

物种	#所测物种的	RLU+/-；(#阳性的)
			Abi	95	+(74)
Kpn	24	-(0)
			Eco	24	-(0)
Ecl	23	-(0)
			Pae	16	-(0)
Kox	2	-(0)
			Eae	2	-(0)
Cfi	2	-(0)
			Cko	1	-(0)
Sms	1	-(0)

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Claims (13)

1.一种包含噬菌体基因组的组合物，其中所述噬菌体基因组源自选自由Abi 33、Abi49和Abi 147组成的组的噬菌体，并且其中所述噬菌体基因组包含编码包装相关的酶活性的一个或多个基因的破坏。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述编码包装相关的酶活性的一个或多个基因包含terS基因、terL基因或者terS基因和terL基因两者。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的组合物，其中所述编码包装相关的酶活性的一个或多个基因的所述破坏包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的核苷酸序列的缺失。

4.一种细菌细胞包装系统，其用于将包含报告基因的报告质粒包装在非复制型转导颗粒(NRTP)中，以引入鲍氏不动杆菌细胞中，所述包装系统包含：

-宿主鲍氏不动杆菌细胞；

-位于所述宿主鲍氏不动杆菌细胞内部的第一核酸构建体，所述第一核酸构建体包含具有编码包装相关的酶活性的一个或多个基因的破坏的噬菌体基因组，其中所述破坏阻止所述噬菌体基因组包装在所述NRTP中，并且其中所述噬菌体基因组选自由噬菌体Abi 33的基因组、噬菌体Abi 49的基因组和噬菌体147的基因组组成的组；和

-位于所述宿主鲍氏不动杆菌细胞内部并且与所述第一核酸构建体分离的第二核酸构建体，所述第二核酸构建体包含报告核酸分子，所述报告核酸分子包含报告基因和编码包装相关的酶活性的一个或多个基因，所述第二核酸构建体补足所述噬菌体基因组上的所述破坏并且促进将所述报告核酸分子的复制子包装在所述NRTP中。

5.根据权利要求4所述的细菌细胞包装系统，其中所述编码包装相关的酶活性的一个或多个基因包含terS基因、terL基因或者terS基因和terL基因两者。

6.根据权利要求4或5中任一项所述的细菌细胞包装系统，其中所述编码包装相关的酶活性的一个或多个基因的所述破坏包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的核苷酸序列的缺失。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的细菌细胞包装系统，其中所述报告核酸分子包含选自SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的核苷酸序列。

8.一种使用根据权利要求4至7中任一项所述的细菌细胞包装系统产生非复制型转导颗粒(NRTP)的方法，其包括以下步骤：

a)诱导根据权利要求4至7中任一项所述的细菌细胞包装系统的裂解期，以及

b)使报告分子的所述复制子被包装以产生所述NRTP。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述编码包装相关的酶活性的一个或多个基因的所述破坏包含选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的核苷酸序列的缺失。

10.根据权利要求8或9中任一项所述的方法，其中所述报告核酸分子包含选自SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的核苷酸序列。

11.一种检测样品中的鲍氏不动杆菌的方法，其包括以下步骤：

a)向所述样品提供通过根据权利要求8至10中任一项所述的方法产生的源自噬菌体Abi33的NRTP、源自噬菌体Abi49的NRTP、源自噬菌体Abi147的NRTP或以上的任意组合；

b)为所述报告基因提供条件以产生可检测的信号；以及

c)检测存在或不存在所述可检测的信号，以提示存在或不存在鲍氏不动杆菌。

12.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括在向所述样品提供NRTP之前或之后的步骤，所述步骤包括向所述样品提供抗微生物剂，以及检测存在或不存在所述可检测的信号以提示所述样品是否含有对所述抗微生物剂具有耐药性或敏感性的鲍氏不动杆菌。

13.根据权利要求11至12中任一项所述的方法，其中所述报告核酸分子包含选自SEQID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的核苷酸序列。

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