JP2022515451A - アシネトバクター・バウマンニの検出のための、非複製的形質導入粒子及び形質導入粒子に基づくレポーター系 - Google Patents

アシネトバクター・バウマンニの検出のための、非複製的形質導入粒子及び形質導入粒子に基づくレポーター系 Download PDF

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Abstract

本発明は、A.バウマンニの検出のための、アシネトバクター・バウマンニ(A.バウマンニ)に特異的な新規バクテリオファージと、該バクテリオファージに由来する非複製的形質導入粒子(NRTP)の製造方法と、該NRTPの使用とに関する。

Description

本発明は、標的細胞を検出するための、非複製的形質導入レポーター分子のパッケージング及び送達のための方法及び組成物に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、2018年12月27日出願の米国仮特許出願第62/785,510号及び2019年9月13日出願の米国仮特許出願第62/899,985号の優先権の利益を主張するものであり、これらは各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、2019年11月20日作成の「P35222-WO PCT filing sequence listing」と題された電子テキストファイル(バイトでのサイズ46kb)として提出された配列表を含む。
関連技術の説明
形質導入粒子とは、非ウイルス核酸を細胞内に送達することができるウイルスを指す。ウイルスに基づくレポーター系は、細胞の存在を検出するために使用されており、ウイルスの溶原期に依存して細胞からのレポーター分子の発現を可能にしている。このようなウイルスに基づくレポーター系は、レポーター分子を発現する複製可能な導入粒子を使用し、標的細胞に検出可能なシグナルを放出させる。
しかし、ウイルスの溶菌サイクルは、ウイルスに基づくレポーターアッセイに有害であることが示されている。Carriere,C.ら,Conditionally replicating luciferase reporter phages:Improved sensitivity for rapid detection and assessment of drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis.Journal of Clinical Microbiology,1997.35(12):3232-3239頁。Carriereらは結核菌/カルメット・ゲラン桿菌(BCG)ルシフェラーゼレポーターファージを開発したが、このファージは、30℃では溶菌サイクルが抑制されるが、37℃では活性になる。この系を用いて、Carriereらは、溶菌サイクルが抑制されたファージレポーターを使用したBCGの検出を実証した。
しかし、バクテリオファージに基づくレポーターアッセイには、バクテリオファージの複製機能を抑制するが排除しないということに関連する欠点がある。第一に、バクテリオファージの複製機能を制御することは、限定的なアッセイ条件を課す。例えば、Carriereらが用いたレポーターファージphAE40の溶菌サイクルは、このファージを使って非許容温度である30℃で細胞に感染させると抑制された。この温度要件は、標的細菌の最適温度が37℃であるという制限条件をレポーターアッセイに課した。これらの制限条件は、最適なアッセイ性能を妨げる。
さらに、ウイルスの複製機能は、制御するのが難しい。形質導入粒子をレポーター系として使用する間は、ウイルスの複製が抑制されている必要がある。例えば、Carriereらによって報告されたレポーターファージphAE40の溶解活性は、低下したが排除されず、結果としてアッセイにおいてルシフェラーゼシグナルの低下をもたらした。Carriereらは、この結果として生じるレポーターシグナルの低下の考えられる原因としてインタクトなファージ発現遺伝子及びアッセイの温度限界などを強調したが、これらは全て、ファージレポーターの溶菌サイクルが排除されなかったという事実に起因する。
ファージの自然な溶原サイクルに依存するレポーターアッセイは、散発的に溶菌活性を示すことが見込まれる。さらに、ファージの溶原サイクルに依存するアッセイは、入ってくるウイルス核酸を標的とする天然の宿主制限系だけではなく、類似のファージで既に溶原化された標的細胞からの重感染免疫の影響を受けやすいため、これらのレポーターファージの宿主域が制限される。
他の例では、形質導入粒子製造系は外来核酸分子をパッケージングするように設計されているが、形質導入粒子は、外来核酸分子と天然の子孫ウイルス核酸分子の組み合わせを含有することが多い。上記の天然ウイルスは、アッセイ性能の妨げとなる溶解活性を示す可能性があり、形質導入粒子を精製するには、ウイルスの溶解活性を排除する必要がある。しかし、この精製は、一般に不可能である。Reporter Plasmid Packaging System for Detection of Bacteriaと題された米国特許出願公開第2009/0155768号で、Schollらは、このような形質導入粒子系の開発について記載している。この系の産物は、レポーター形質導入粒子と天然バクテリオファージとの組み合わせである(図8参照)。この著者らは、形質導入粒子と天然バクテリオファージを超遠心によって分離できることを示しているが、この分離は、超遠心によって分離が可能になるであろう、異なる密度を形質導入粒子と天然ウイルスが示す系においてのみ可能である。この特徴は引用文献に記載されているバクテリオファージT7に基づくパッケージング系によって示されているが、これは一般に他のウイルス系に適用可能な特徴ではない。ウイルスパッケージング機構はヘッドフルパッケージングを示すことが通例であり、天然ウイルスと形質導入粒子が超遠心によって分離することができないような区別不能な密度を示す結果となるであろう。また、ウイルスパッケージング系は、適切なウイルス構造のアセンブリのための必要条件として最少量のパッケージングに依存しており、その結果区別不能な密度を有する天然ウイルスと形質導入粒子が生じる。
したがって、ウイルスの溶解機能からの有害作用、並びに、重感染免疫とウイルス核酸分子及びウイルス機能を標的とする宿主制限機構とによって制限される可能性(これらは全て、検出限界を増大させることによりレポーターアッセイの性能を制限し、偽陰性結果をもたらす可能性がある)の影響を受けない、非複製的形質導入粒子が必要とされている。
形質導入粒子が操作された場合でも、形質導入粒子を用いて細胞内の標的核酸分子の存在を検出し、報告する方法には限界がある。いくつかの方法は、細胞の破壊と、溶解物中の転写物を分離し検出するための煩雑な技法を必要とする。検出方法には、抗体、アプタマー又は核酸プローブなど、標識プローブを用いることが含まれる。標的遺伝子に向けられた標識プローブは、意図しない標的への非特異的結合を生じ得るか又は高いシグナル対ノイズ比を有するシグナルを生成し得る。したがって、細胞内の内在性核酸分子の検出及び報告のための特異的、効果的且つ正確な方法が必要とされている。
さらに最近になって、バクテリオファージゲノムにおけるパッケージング開始部位の破壊に起因して複製可能な天然子孫ウイルス核酸分子の生成が大幅に減少した、本明細書でSmarticlesとも称される非複製的形質導入粒子(NRTP)にレポーター核酸分子をパッケージングする方法及び系が米国特許第9,388,453号(その全体が参照により本明細書にして組み入れられる)に記載された。
アシネトバクター・バウマンニ(A.バウマンニ)は、グラム陰性球桿菌であり、院内感染及び世界的流行の主な原因としてますます問題となっている。A.バウマンニによる感染は、敗血症、人工呼吸器関連肺炎、尿路感染、及び創傷感染をもたらす可能性があり(Beggs et al., 2006; Peleg et al. 2008)、特に免疫減弱状態の個体は高リスクである。感染症を引き起こすA.バウマンニ株は、抗生物質に対して広範な耐性を示すことが多く、深刻な公衆衛生上の脅威となっていることから、世界保健機関は最近、これを標的とした新規抗生物質の開発リストで重要レベル「優先度1」の病原体としてこれを宣言した(WHO、2017)。さらに、死亡率は、A.バウマンニ感染症で特に高く、人工呼吸器関連肺炎及び血流感染症の患者では死亡率が35%と高かった(Antunes et al., 2014)。A.バウマンニ感染で観察された高い死亡率の1つのリスク因子は、不適切な抗生物質治療から生じる(Lemos EV et al., 2014)。
A.バウマンニの迅速な診断は、適切な抗生物質療法を特定し、臨床現場での感染の拡大を制御するために極めて重要である。A.バウマンニ感染を検出するための現在市販されている方法には、表現型法(例:VITEK2、ビオメリュー)及びDNAベースの方法(例:16s rRNAのPCR増幅)(Li P, et al., 2015)が含まれる。しかし、宿主細菌に感染して溶菌ライフサイクルを完了し、細菌の宿主防御機構に遭遇する必要がある天然ファージを使用せずに、生体試料中のA.バウマンニの存在を迅速に検出できるアッセイへのニーズがある。
本発明は、A.バウマンニに特異的でこの種内に広い宿主域を有する新規バクテリオファージを含む、組成物に関する。ある実施態様において、この新規バクテリオファージは、マイオウイルス科ファミリーに属するAbi 33である。別の実施態様では、この新規バクテリオファージは、サイフォウイルス科ファミリーに属するAbi 49又はAbi 147である。本発明はまた、これらの新規バクテリオファージのゲノムに由来し、A.バウマンニに対して特異性を示す非複製的形質導入粒子(NRTP)の製造に関するものでもある。したがって、本発明は、バクテリオファージゲノムを含む組成物に関するものであり、バクテリオファージゲノムは、Abi 33、Abi 49、及びAbi 147からなる群から選択されるバクテリオファージに由来し、且つ、バクテリオファージゲノムは、パッケージング関連酵素活性をコードする1又は複数の遺伝子の破壊を含む。ある実施態様において、パッケージング関連酵素活性をコードする1又は複数の遺伝子は、terS遺伝子、terL遺伝子、又はterSとterL遺伝子の両方を含む。ある実施態様において、パッケージング関連酵素活性をコードする1又は複数の遺伝子の破壊は、配列番号1、配列番号2又は配列番号3から選択されるヌクレオチド配列の欠失を含む。
本発明はまた、レポーター遺伝子を含むレポータープラスミドを、A.バウマンニ細胞に導入するためのSmarticles非複製的形質導入粒子(NRTP)にパッケージングするための、細菌細胞パッケージング系に関する。ある実施態様では、このパッケージング系は、宿主のA.バウマンニ細胞;パッケージング関連酵素活性をコードする1又は複数の遺伝子の破壊を有するバクテリオファージゲノムを含むか又はそれからなる、宿主A.バウマンニ細胞内の第1の核酸コンストラクト(ここで、破壊はバクテリオファージゲノムのNRTPへのパッケージングを妨げ、バクテリオファージゲノムはバクテリオファージAbi 33のゲノム、バクテリオファージAbi 49のゲノム、及びバクテリオファージ147のゲノムからなる群から選択される);及び第1の核酸コンストラクトとは別個の、宿主A.バウマンニ細胞内の第2の核酸コンストラクトであって、レポーター遺伝子を有するレポーター核酸分子と、バクテリオファージゲノムの破壊を補完し且つレポーター核酸分子のレプリコンのNRTPへのパッケージングを容易にするパッケージング関連酵素活性をコードする1又は複数の遺伝子と含む第2の核酸コンストラクトを含む。ある実施態様において、パッケージング関連酵素活性をコードする1又は複数の遺伝子は、terS遺伝子、terL遺伝子、又はterSとterL遺伝子の両方を含む。ある実施態様において、パッケージング関連酵素活性をコードする1又は複数の遺伝子の破壊は、配列番号1、配列番号2又は配列番号3から選択されるヌクレオチド配列の欠失を含む。いくつかの実施態様において、破壊は、欠失、挿入、変異又は置換によるものである。別の実施態様では、レポーター核酸分子は、配列番号4、配列番号5又は配列番号6から選択されるヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、細菌細胞パッケージング系の溶菌期を誘導することと、レポーター分子のレプリコンをパッケージングしてNRTPを製造することとを含む、前述の細菌細胞パッケージング系からNRTPを製造する方法に関する。ある実施態様において、パッケージング関連酵素活性をコードする1又は複数の遺伝子は、terS遺伝子、terL遺伝子、又はterSとterL遺伝子の両方を含む。ある実施態様において、パッケージング関連酵素活性をコードする1又は複数の遺伝子の破壊は、配列番号1、配列番号2又は配列番号3から選択されるヌクレオチド配列の欠失を含む。別の実施態様では、レポーター核酸分子は、配列番号4、配列番号5又は配列番号6から選択されるヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、前述のNRTP製造方法によって製造される、バクテリオファージAbi 33に由来するNRTP、バクテリオファージAbi 49に由来するNRTP、バクテリオファージAbi 147に由来するNRTP、又はこれらの任意の組み合わせを試料に提供する工程、検出可能なシグナルを生成するための条件をレポーター遺伝子に提供する工程、及び検出可能なシグナルの有無を検出して、A.バウマンニの有無を示す工程を含む、試料中のA.バウマンニを検出する方法にも関する。ある実施態様では、この方法は、試料にNRTPを提供する前又は後に、試料に抗菌剤を提供して、検出可能なシグナルの有無を検出し、その試料が抗菌剤に対して耐性又は感受性であるA.バウマンニを含むかどうかを示す工程を含む。ある実施態様では、NRTPは、配列番号4、配列番号5又は配列番号6から選択されるヌクレオチド配列を含むレポーター核酸分子を含む。
図1a:2つのマイオウイルス科ファージの集団を含有するAbi 33溶解物のTEM画像を示す。図1b:サイフォウイルス科ファージを含有するAbi 49溶解物のTEM画像を示す。図1c:サイフォウイルス科ファージを含有するAbi 147溶解物のTEM画像を示す。 欠失/補完戦略を用いたSmarticles非複製的形質導入粒子(NRTP)技術の模式図を示す。候補ファージの各々を、pac部位/pac機能を欠失させるように操作し、その後パッケージ関連のDNA配列及び遺伝子を担持するプラスミドにより補完した。また、相補プラスミドは、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼを担持する。Smarticle NRTPは、パッケージング/レポータープラスミドを保有する操作されたプロファージから生成される。 Abi 33、Abi 49、及びAbi 147 NRTPの製造のためのパッケージング/レポータープラスミドの代表的な模式図である。 A.バウマンニ交差反応性相対光単位(RLU)アッセイのグラム(-)株の配置を示している。株の記号は次の通りである:Kpn:肺炎桿菌、Eco:大腸菌、Kox:クレブシエラ・オキシトカ、Eae:エンテロバクター・エロゲネス、Ecl:エンテロバクター・クロアカ、Cfi:シトロバクター・フロインデイ、Cko:シトロバクター・コセリ、Sms:霊菌、Pae:緑膿菌、Pms:プロテウス・ミラビリス、Abi:A.バウマンニ。 図4aの腸内細菌科及び他のグラム(-)菌に対する交差反応性について試験したAbi 33、Abi 49、及びAbi 147 Smarticles NRTPのRLUに基づくカバレッジ(coverage)を示す。RLU陽性の結果は観察されなかった。C1とG1のピークは注入スパイク(injection spike)であり、真の陽性シグナルではない。カラム12のRLU陽性A.バウマンニ株は、アッセイにおいて陽性対照として用いられ、典型的なAbi 49力価を示した。 Abiパッケージング/レポータープラスミドpZX057の代表的な模式図である。 新規のAbi 33 Smarticles NRTPを生成するための、Abi 33に由来する9247bpプラスミドpZX058の代表的な模式図である。 図7-Iは、プラスミドpZX058(配列番号4)のアノテーションされたヌクレオチド配列を示す。 図7-IIは、プラスミドpZX058(配列番号4)のアノテーションされたヌクレオチド配列を示す。 図7-IIIは、プラスミドpZX058(配列番号4)のアノテーションされたヌクレオチド配列を示す。 図7-IVは、プラスミドpZX058(配列番号4)のアノテーションされたヌクレオチド配列を示す。 新規のAbi 49 Smarticles NRTPを生成するための、Abi 49に由来する9464bpプラスミドpZX065の代表的な模式図である。 図9-Iは、プラスミドpZX065(配列番号5)のアノテーションされたヌクレオチド配列を示す。 図9-IIは、プラスミドpZX065(配列番号5)のアノテーションされたヌクレオチド配列を示す。 図9-IIIは、プラスミドpZX065(配列番号5)のアノテーションされたヌクレオチド配列を示す。 図9-IVは、プラスミドpZX065(配列番号5)のアノテーションされたヌクレオチド配列を示す。 新規のAbi 147 Smarticles NRTPを生成するための、Abi 147に由来する9768bpプラスミドpZX066の代表的な模式図である。 図11-I、11-II、11-III、及び11-IVは、プラスミドpZX066(配列番号6)のアノテーションされたヌクレオチド配列を示す。
I.定義
特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、特に明記されない限り、以下に記載されるように定義される。
本明細書で使用される場合、「レポーター核酸分子」は、DNA又はRNA分子を含むヌクレオチド配列を意味する。レポーター核酸分子は、天然に存在するものでも、人工分子又は合成分子であってもよい。いくつかの実施態様において、レポーター核酸分子は宿主細胞に対して外来性であり、プラスミド又はベクターなどの外来核酸分子の一部として宿主細胞に導入することができる。特定の実施態様において、レポーター核酸分子は、細胞内の標的遺伝子に対して相補的であり得る。他の実施態様では、レポーター核酸分子は、レポーター分子(例:レポーター酵素、タンパク質)をコードするレポーター遺伝子を含む。いくつかの実施態様において、レポーター核酸分子は、「レポーターコンストラクト」又は「核酸レポーターコンストラクト」と称される。
「レポーター分子」又は「レポーター」とは、検出可能又は選択可能な表現型を生物体に付与する分子(例:核酸又はタンパク質)を指す。検出可能な表現型は、例えば比色、蛍光又は発光であり得る。レポーター分子は、発光反応を媒介する酵素(LuxA、LuxB、LuxAB、Luc、Ruc、nLuc)をコードするレポーター遺伝子、比色反応を媒介する酵素(LacZ、HRP)をコードする遺伝子、蛍光タンパク質(GFP、eGFP、YFP、RFP、CFP、BFP、mCherry、近赤外蛍光タンパク質)をコードする遺伝子、親和性ペプチド(Hisタグ、3X-FLAG)をコードする核酸分子、及び選択マーカー(例:ampC、tet(M)、zeoR、hph、CAT、erm)をコードする遺伝子から発現することができる。レポーター分子は、核酸分子又は外来配列(プラスミド)を細胞内にうまく取り込むためのマーカーとして使用することができる。レポーター分子はまた、本明細書に記載されるように、標的遺伝子、標的核酸分子、標的細胞内分子又は細胞の存在を示すために用いることができる。或いは、レポーター分子は、アプタマー又はリボザイムなどの核酸であり得る。
本発明のいくつかの態様において、レポーター核酸分子は、プロモーターに作動可能に連結される。本発明の他の態様において、プロモーターは、他の細胞ではなく特定の細胞(例:特定の種)におけるプロモーターの活性に基づいてレポーター系の反応性及び交差反応性に寄与するように選択又は設計することができる。特定の態様において、レポーター核酸分子は複製開始点を含む。他の態様では、複製開始点の選択は、標的細胞内のレポーター核酸分子の複製が他の細胞ではなく特定の細胞(例:特定の種)における複製開始点の活性に基づいてレポーターシグナル生成に寄与するか又は必要とされる場合、同様にレポーター系の反応性及び交差反応性に寄与することができる。いくつかの実施態様において、レポーター核酸分子は、ウイルス複製中に子孫ウイルスにコンカテマーDNAとしてパッケージングされ得るレプリコンを形成する。
本明細書で使用される場合、「標的転写物」とは、標的遺伝子の転写時に形成されるものと一次転写産物のRNAプロセシングの産物であるmRNAとを含む、標的細胞によって自然に形成されるDNA配列又はmRNA分子のヌクレオチド配列の一部を指す。標的転写物は、細胞転写物又は天然に存在する転写物と呼ばれることもある。
本明細書で使用される場合、「転写物」という用語は、DNA又はRNA鋳型配列又は遺伝子から転写されたヌクレオチド配列(DNA又はRNA)の長さを意味する。転写物は、RNA鋳型から転写されるcDNA配列、又はDNA鋳型から転写されるmRNA配列であり得る。転写物は、タンパク質コーディング又はノンコーディングであり得る。転写物はまた、操作された核酸コンストラクトから転写され得る。
レポーター核酸分子に由来する転写物を「レポーター転写物」と呼ぶことができる。レポーター転写物は、レポーター配列とシス抑制配列とを含み得る。レポーター転写物は相補性の領域を形成する配列を有することができ、その結果、転写物は二本鎖を形成する2つの領域(例:分子間二本鎖領域)を含む。一方の領域は、「シス抑制配列」と呼ばれ、標的転写物及び/又はレポーター配列の一部又は全部に相補性を有する。転写物の第2の領域は、「レポーター配列」と呼ばれ、シス抑制配列と相補性を有し得る。相補性は、完全な相補性であっても実質的な相補性であってもよい。シス抑制配列とレポーター配列の存在及び/又は結合は、レポーター転写物中にコンホメーションを形成することができ、これによりレポーター分子のさらなる発現をブロックすることができる。レポーター転写物は、ヘアピン構造などの二次構造を形成することができ、その結果、互いに相補的なレポーター転写物内の領域は、互いにハイブリダイズすることができる。
核酸分子又は外来配列(例:プラスミド、ベクター、コンストラクト)に言及する際の「細胞に導入する」とは、当業者が理解するように、細胞への取り込み又は吸収を促進することを意味する。核酸コンストラクト又は転写物の吸収又は取り込みは、自発的拡散性又は能動的な細胞プロセスを通じて、又はバクテリオファージ、ウイルス、及び形質導入粒子の使用を含む補助剤又は装置によって起こり得る。この用語の意味は、in vitroの細胞に限定されるものではない;核酸分子もまた、生物体の一部である「細胞に導入」されることがある。そのような場合、細胞への導入は、生物体への送達を含むであろう。例えば、in vivo送達のために、本発明の核酸分子、コンストラクト又はベクターを組織部位に注射するか、又は全身的に投与することができる。細胞へのin vitro導入には、エレクトロポレーション及びリポフェクションなどの、当技術分野で知られている方法が含まれる。さらなるアプローチは、本明細書に記載されているか、当技術分野で既知である。
「形質導入粒子」とは、非ウイルス核酸分子を細胞内に送達することができるウイルスを意味する。このウイルスは、バクテリオファージ、アデノウイルスなどであり得る。
「非複製的形質導入粒子」又は「NRTP」とは、非ウイルス核酸分子を細胞内に送達することができるが、それ自身の複製されたウイルスゲノムを形質導入粒子内にパッケージングすることができないウイルスを意味する。このウイルスは、バクテリオファージ、アデノウイルスなどであり得る。
「プラスミド」とは、細胞内の染色体DNAと物理的に分離し、独立して複製することができる小さなDNA分子である。プラスミドは、細菌では小さな環状の二本鎖DNA分子として最も一般的に見られるが、古細菌及び真核生物にも時に存在する。プラスミドは、レプリコンと考えられ、適当な宿主内で自律的に複製することができる。
「ベクター」とは、別の細胞に外来性遺伝物質を人工的に運ぶためのビヒクルとして使用される核酸分子であり、そこで複製及び/又は発現させることができる。
「ウイルス」は、他の生物体の生きている細胞の内部でのみ複製する小さな感染性物質である。ウイルス粒子(ビリオンとして知られる)には、次の2つ又は3つの部分:i)遺伝情報を運ぶDNA又はRNA分子のいずれかからつくられる遺伝物質、ii)これらの遺伝子を保護するタンパク質コート、及び場合によっては、iii)9388である脂質のエンベロープが含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「補体」は、破壊された同一配列の存在下にある非破壊配列を指すか、又は破壊されていない配列の破壊された配列に対する関係を指す。ある実施態様において、補体は、機能性であり且つ発現することができる細胞内のポリヌクレオチド上にコードされた遺伝子を含み、破壊前にバクテリオファージ上で破壊された遺伝子と同じ機能を有するタンパク質を発現する。いくつかの実施態様において、補体遺伝子は、破壊前の破壊されたバクテリオファージ遺伝子、すなわち天然バクテリオファージ遺伝子に対して80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%を超える配列同一性を有する。いくつかの実施態様において、補体遺伝子は、破壊されたバクテリオファージ遺伝子の破壊前、すなわち天然のバクテリオファージ遺伝子と同一である。いくつかの実施態様において、補体遺伝子は、バクテリオファージから欠失されたポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様において、補体遺伝子は、同じ遺伝子がバクテリオファージ中で破壊された、プラスミド上のバクテリオファージのパッケージング機構をコードする遺伝子を指す。したがって、プラスミドは、ポリヌクレオチドを形質導入粒子にパッケージングするのに必要なパッケージング機構を提供するために、変異したパッケージング機構遺伝子を伴ったバクテリオファージの存在下にあることが必要である。
本明細書で使用される場合、用語「パッケージング関連酵素活性」は、ポリヌクレオチドを形質導入粒子にパッケージングするためのパッケージング開始部位配列との相互作用に極めて重要な1又は複数のポリペプチドを指す。いくつかの実施態様において、各ターミナーゼがパッケージング関連酵素活性をコードするこのような相互作用には一対のターミナーゼ遺伝子が必要である。いくつかの実施態様において、酵素活性は、本発明で発見されたA.バウマンニバクテリオファージ由来のterS及び/又はterL遺伝子によってコードされる。これらの実施態様において、一対のターミナーゼ遺伝子の各々がパッケージング関連酵素活性を発現しており、パッケージング開始部位を有するポリヌクレオチドのパッケージングには両方の機能的なバージョンが必要である。いくつかの実施態様において、パッケージング関連酵素活性に関連する複数の遺伝子のうち1つ遺伝子の破壊は、パッケージング関連酵素活性を排除する。いくつかの実施態様において、一対のターミナーゼ遺伝子の両方は、バクテリオファージゲノム上で破壊されており、したがってバクテリオファージ上の遺伝子をコードするパッケージング関連酵素活性のセット全体を破壊されている。
用語「改善する」とは、例えば病状の予防、重症度若しくは進行の軽減、寛解又は治癒など、病状の治療における治療上有益な結果を意味する。
用語「in situ」とは、生物体とは別個に成長する生細胞の中で起こるプロセス、例えば組織培養で成長することを指す。
用語「in vivo」は、生物体内で起こるプロセスを指す。
用語「哺乳動物」には、本明細書で使用される場合、ヒト及び非ヒトの両方が含まれ、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、及びブタが含まれるが、これらに限定されない。
「G」、「C」、「A」及び「U」はそれぞれ一般に、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルを含むヌクレオチドを表す。「T」及び「dT」は本明細書中で互換的に使用され、核酸塩基がチミン、例えばデオキシリボチミンであるデオキシリボヌクレオチドを指す。しかしながら、用語「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」又は「デオキシリボヌクレオチド」はまた、修飾ヌクレオチド(後で詳述する)又は代理置換部分を指すことができることが理解されるであろう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルが、そのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変化させることなく、他の部分によって置換され得ることを十分に認識しているであろう。例えば、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、限定されないが、アデニン、シトシン又はウラシルを含むヌクレオチドと塩基対を形成し得る。したがって、ウラシル、グアニン又はアデニンを含むヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列中で、例えばイノシンを含むヌクレオチドによって置換され得る。このような置換部分を含む配列は、本発明の実施態様である。
本明細書で使用される場合、用語「相補的」とは、第2のヌクレオチド配列に関連して第1のヌクレオチド配列を記述するために使用される場合、当業者が理解しているように、第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと特定の条件下でハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する能力を指す。相補配列はまた、互いに結合するものとして説明され、結合親和性によって特徴付けられる。
例えば、第1のヌクレオチド配列は、2つの配列がストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする(例えばアニーリングする)場合、第2のヌクレオチド配列と相補的であると説明することができる。ハイブリダイゼーション条件には、アニーリング工程及び/又は洗浄工程のための温度、イオン強度、pH、及び有機溶媒濃度が含まれる。「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」という用語は、第1のヌクレオチド配列がその標的配列、例えば第2のヌクレオチド配列に優先的にハイブリダイズし、程度は低いが他の配列にもハイブリダイズする、又は全くハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、配列に依存しており、環境パラメーターが異なれば異なる。一般に、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、規定のイオン強度及びpHにおけるヌクレオチド配列の熱融点(thermal melting point)(T)よりも約5℃低くなるように選択される。Tは、第1のヌクレオチド配列の50%が完全に一致した標的配列にハイブリダイズする(規定のイオン強度とpHの下での)温度である。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、例えば、Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-- Hybridization with Nucleic Acid Probes 第1部、第2章「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays」、Elsevier,N.Y.(「Tijssen」)に見いだされる。生物体の内部で遭遇する可能性のある生理学的に適切な条件など、他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に従って、2つの配列の相補性の試験に最も適する条件のセットを決定することができるであろう。
これは、第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの、第1及び第2のヌクレオチド配列の全長にわたる第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドへの塩基対形成を含む。これら配列は、本明細書中では互いに対して「完全に相補的である」ということが可能である。しかしながら、第1の配列が本明細書中の第2の配列に対して「実質的に相補的」と称される場合、その2つの配列は、完全に相補的であってもよいし、最終的な用途に最も関連する条件下でハイブリダイズする能力を保持しつつ、ハイブリダイゼーションの際に1つ以上、しかし一般的には4、3又は2つ以下のミスマッチ塩基対を形成してもよい。しかし、2つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションの際に1又は複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、そのようなオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチとはみなされないものとする。例えば、長さが21ヌクレオチドの1つのオリゴヌクレオチドと長さが23ヌクレオチドの別のオリゴヌクレオチドとを含むdsRNAであって、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的である21ヌクレオチドの配列を含むdsRNAでも、本明細書に記載される場合、「完全に相補的」と称され得る。
本明細書で使用される場合、「相補」配列はまた、非ワトソン・クリック塩基対、並びに/又は非天然及び修飾ヌクレオチドから形成された塩基対を、それらのハイブリダイズする能力に関する上記要件が満たされる限りにおいて、含むか又はそれらから完全に形成されてもよい。このような非ワトソン・クリック塩基対は、G:Uゆらぎ又はフーグスティーン塩基対合を含むが、これらに限定されない。
本明細書中の「相補的」、「完全に相補的」及び「実質的に相補的」という用語は、これらの使用の文脈から理解されるように、dsRNAの2本の鎖の間、又はdsRNAのアンチセンス鎖と標的配列との間、一本鎖RNA配列の相補鎖間若しくは一本鎖DNA配列の相補鎖間の塩基マッチングに関して使用され得る。
本明細書で用いられる場合、「二本鎖構造」は、2つの逆平行で実質的に相補的な核酸配列を含む。核酸コンストラクト内、2つの転写物間、転写物内の2つの領域間、又は転写物と標的配列との間の相補配列は、「二本鎖構造」を形成し得る。一般に、各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳述するように、各鎖又は両鎖は、少なくとも1つの非リボヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド及び/又は修飾ヌクレオチドも含み得る。二本鎖構造を形成している2本の鎖は、1つのより大きなRNA分子の異なる部分であってもよいし、別々のRNA分子であってもよい。2本の鎖が1つのより大きな分子の一部であり、したがって一方の鎖の3’末端と二本鎖構造を形成するそれぞれのもう一方の鎖の5’末端との間の途切れのないヌクレオチド鎖によって連結されている場合、この連結しているRNA鎖は「ヘアピンループ」と呼ばれる。二本鎖が二本鎖構造を形成している一方の鎖の3’末端とそれぞれのもう一方の鎖の5’末端との間で、中断されていないヌクレオチド鎖以外の手段で共有結合している場合、その連結構造は「リンカー」と呼ばれる。これらのRNA鎖のヌクレオチドの数は、同じでも異なっていてもよい。塩基ペアの最大数は、二本鎖の最も短い鎖のヌクレオチド数から二本鎖に存在するオーバーハングを差し引いたものである。一般に、二本鎖構造の長さは、15~30、又は25~30、又は18~25、又は19~24、又は19~21、又は19、20若しくは21塩基対である。ある実施態様において、二本鎖の長さは、19塩基対である。別の実施態様では、二本鎖の長さは21塩基対である。2つの異なるsiRNAを組み合わせて使用する場合、二本鎖の長さは同じでも異なっていてもよい。
本明細書で使用される場合、「相補性領域」という用語は、本明細書に定義されているように、配列、例えば標的配列に対して実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が標的配列に対して完全には相補的でない場合、ミスマッチは、存在する場合、末端領域において最も許容され、一般的に一方の末端領域又は両末端領域内に、例えば5’及び/又は3’末端の6、5、4、3又は2ヌクレオチド内にある。
2つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「パーセント同一性」という用語は、以下に記載される配列比較アルゴリズムの1つ(例えばBLASTP及びBLASTN又は当業者が利用可能な他のアルゴリズム)を用いて、又は目視によって測定して、最大の対応関係を得るために比較され、配列された場合に同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基を特定のパーセンテージ有する2つ以上の配列又はサブ配列を指す。用途に応じて、パーセント「同一性」は、比較される配列の領域にわたって、例えば機能ドメインにわたって存在することもあれば、代わりに、比較される2つの配列の全長にわたって存在することもある。
配列比較のために、典型的には、1つの配列が参照配列として機能し、これと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。その後、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith & Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)の局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)の相同性アライメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85:2444(1988)の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装によって(Wisconsin Genetics Software Packageの中のGAP、BESTFIT、FASTA及びTFASTA、Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.)、又は目視検査によって(概略は、下記のAusubelら参照)によって実行することができる。
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、Altschulら,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)に記載されているBLASTアルゴリズムである。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センター(National Center for Biotechnology Information)(www.ncbi.nlm.nih.gov/)で公開されている。
用語「十分量」とは、所望の効果を生じるのに十分な量、例えば、細胞から検出可能なシグナルを生成するのに十分な量を意味する。
用語「治療有効量」は、疾患の症状を改善するのに有効な量である。治療有効量は、予防を治療と考えることができることから、「予防的に有効な量」とすることができる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの」(「a」、「an」)及び「その」(「the」)は、文脈から判断して明らかにそうでないと分かる以外は、複数の指示物を含むことに留意されたい。
II.ウイルスの溶原及び溶菌サイクル
ウイルスは、宿主細胞内で溶原サイクルと溶菌サイクルに入る。溶原サイクルが採用されれば、ファージ染色体は、細菌染色体に組み込まれるか、又は宿主内で安定したプラスミドとして確立され、長期間休眠状態を保つことができる。溶原菌が誘導されると、ファージゲノムは、細菌の染色体から切り出され、溶菌サイクルが始まり、最終的に細胞の溶菌とファージ粒子の放出が起こる。溶菌サイクルにより、新たなファージ粒子が製造され、宿主の溶解によって放出される。
さらに、ファージに基づくレポーターなどのウイルスに基づくレポーターアッセイでは、宿主ベース及びプロファージ由来のファージ耐性機構によって引き起こされるファージ宿主域の制限が原因で反応性が限定されてしまう(すなわち分析的包括性)可能性がある。これらの耐性機構は、天然ファージ核酸を標的とし、ファージのDNA及び機能を分解するか、さもなければ阻害することができる。このような耐性機構には、ファージDNAを切断する制限系と、ファージ由来の転写物を阻害するCRISPR系が含まれる。
溶菌活性及びファージ耐性は両方とも、レポーターファージに基づくアッセイに対して阻害的であり得る。溶菌活性は、検出可能なシグナルを生成する細胞の能力を破壊するか、さもなければ阻害することによって、シグナルを阻害することができ、したがって、検出可能なシグナルの量を減少させるか、又は検出可能なシグナルの生成を妨げることによって、検出限界に影響を及ぼし得る。ファージ耐性機構は、ファージの宿主域を制限し、且つ、ファージに基づくレポーターの包括性を限定することができ、同様に、検出可能なシグナルの量を減少させるか又は検出可能なシグナルの生成を妨げることによって、検出限界に影響を及ぼす。ファージDNAのレポーターファージへの取り込みによって引き起こされる溶菌活性及びファージ耐性の両方とも、これらのファージレポーターを組み込んだアッセイにおいて偽陰性結果をもたらす可能性がある。
III.非複製的形質導入粒子(NRTP)の製造方法
非複製的形質導入粒子を製造するための破壊/補完に基づく方法
本明細書に開示されているのは、ウイルス生成中にゲノムパッケージングが開始されるエレメントとしてウイルスパッケージング機構によって認識されるウイルスのゲノムの要素の破壊に基づく、本明細書ではSmarticles系とも呼ばれる非複製的形質導入粒子パッケージング系である。ある実施態様において、この破壊は、バクテリオファージからのパッケージング開始部位を破壊し、ターミナーゼ機能も破壊する。破壊されたエレメントの例には、pac型バクテリオファージのpac部位配列とcos型バクテリオファージのcos部位配列とが含まれる。ファージ内のパッケージング開始部位配列が破壊されると、ファージは機能性ターミナーゼを生成することができない。一例では、pac部位は、pacA遺伝子配列内にコードされており、ターミナーゼ機能には、機能性PacAとPacBの両方が必要である。プラスミドDNAは、前記破壊されたターミナーゼを補完することと、プラスミドDNA上の認識可能なパッケージング開始部位を含むこととによって、ファージカプシドにパッケージングされる。
パッケージング開始部位は、ウイルス生成に必須な遺伝子のコード領域内にしばしば見いだされる。バクテリオファージゲノムの領域は、パッケージング開始部位を破壊する挿入、置換、欠失又は変異によって破壊され得る。これを達成する破壊の例には、パッケージング開始部位配列を含むバクテリオファージゲノム上の配列を抗生物質耐性遺伝子の配列などの別の配列に置き換える対立遺伝子交換事象、又は小ターミナーゼ遺伝子及び大ターミナーゼ遺伝子の完全な欠失が含まれるが、これらに限定されない。ターミナーゼ遺伝子pacA及びpacBを採用する例において、pacAは、PacA及びPacBによって媒介されるpacB発現及び/又は全体的なターミナーゼ機能も破壊する極性効果を引き起こす方法で破壊され得る。他の例には、ターミナーゼ遺伝子の破壊が含まれ、また、本発明で発見されたA.バウマンニバクテリオファージ由来のterS遺伝子及びterL遺伝子も含まれ得る。
一例では、パッケージング開始部位が破壊されたウイルスゲノムを用いて、細胞のゲノムが溶原化される。この細胞は、グラム陰性又はグラム陽性であり得る。補完するプラスミド(又はレポーター核酸分子)を細胞に導入し、プラスミドDNAは、少なくともバクテリオファージにおいて破壊された遺伝子、並びにパッケージング開始部位配列と、任意選択的に追加のバクテリオファージ遺伝子及びレポーター遺伝子とを含み、これらは検出可能な及び/又は選択マーカーをコードすることができる。プラスミドは、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第9,388,453号において見いだされる方法を用いて構築することができる。プラスミドの1以上の遺伝子は、プロモーター、例えば誘導性プロモーター(バクテリオファージを誘導することによってパッケージングが開始されるときに誘導され得るもの)に作動可能に連結され得る。いくつかの実施態様において、プロモーターは、小ターミナーゼ遺伝子(terS)又は大ターミナーゼ(terL)遺伝子の天然プロモーターであり得る。天然プロモーターはバクテリオファージによって制御されるため、パッケージングの際に誘導される条件付きプロモーターとして効果的に作用する。
いくつかの例では、変異ウイルスDNAと補完する外来DNAとの間に相同性がないように破壊/補完を設計することが好ましい。これは、変異ウイルスDNAと補完する外来DNAとの間の相同性の欠如が、ウイルスゲノムへのパッケージング配列の再導入をもたらす可能性のある、2つのDNA分子間の相同組換えの可能性を回避するためである。相同性の欠如を達成するための1つの戦略は、パッケージング開始部位配列を含む遺伝子全体(又は個々の遺伝子)をウイルスゲノムから欠失させ、その後、好ましくはウイルスから欠失させたDNA配列しか正確には含まない外来DNA分子でこの遺伝子を補完することである。この戦略では、補完するDNA分子を設計して、ウイルスから欠失させた遺伝子を発現させる。このような系のもう一つの例は、pac型ファージであるバクテリオファージφ80αを用いて提供される。ファージゲノムは、宿主細菌細胞で溶原化され、ファージゲノムは、pac型プロファージφ80αのpac部位が欠失した小さなターミナーゼ遺伝子を含む。天然のpac部位を有する相補的で小さなターミナーゼ遺伝子を含むプラスミドを細胞に形質転換する。溶原化したプロファージの溶菌サイクルが誘導されると、バクテリオファージパッケージング系は、天然のバクテリオファージDNAをパッケージングするのではなく、プラスミドDNAを子孫のバクテリオファージの構造要素にパッケージングする。このように、パッケージング系は、プラスミドDNAを担持する非複製的形質導入粒子を製造する。
ファージは生物圏で最も豊富な生命形態であり(Clokie et al.、 2011)、シーケンシングされた細菌ゲノムの70%にはプロファージ様の構造が含まれている(Chen, et al.、 2006)。Touchonらは、133のアシネトバクター属菌(Acinetobacter spp.)の細菌ゲノムを解析したところ、完全なプロファージ(すなわち細菌ゲノムに組み込まれたファージ)が優勢であることを観察した(Touchon et al., 2014)。この自然界に豊富に存在するプロファージを利用して、この種内でも幅広い宿主域を持つ、A.バウマンニに特異的な新規ファージを分離した。このファージは、非複製的形質導入粒子に変換され、発光アッセイにおいて良好な包含性と排他性が得られた。
A.バウマンニ株の広範な遺伝的多様性及びゲノム可塑性(Sahl, JW et al., 2015; Snitkin et al., 2011)を考慮して、A.バウマンニ細胞上のファージ受容体における潜在的多様性を説明するために、単一アッセイにおいて非複製的形質導入粒子をカクテルとして組み合わせた。その際、アッセイにおけるA.バウマンニ株の包括性は干渉作用なしに改善した。このアプローチは、ファージ療法においてファージカクテルが治療的に用いられるのと同じ方法(Chan, BK et al., 2013)で行われた。この技術の利点は、ファージが溶菌ライフサイクルを完了したり、細菌の宿主防御機構に遭遇したりする必要がなく、アッセイが短時間で起こる発光反応とDNA送達のみを必要とすることである。
レポーター遺伝子は、検出可能なマーカー又は選択マーカーをコードする。一例では、レポーター遺伝子は、発光反応を媒介する酵素(LuxA、LuxB、LuxAB、Luc、Ruc、nLuc)、比色反応を媒介する酵素(LacZ、HRP)、蛍光タンパク質(GFP、eGFP、YFP、RFP、CFP、BFP、mCherry、近赤外蛍光タンパク質)、親和性ペプチド(Hisタグ、3X-FLAG)、及び選択マーカー(ampC、tet(M)、CAT、erm)からなる群から選択される。一実施態様において、レポーター遺伝子は、luxAである。いくつかの実施態様において、耐性マーカーは、抗生物質耐性遺伝子を含む。いくつかの実施態様において、耐性マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子(kan)である。いくつかの実施態様において、構成的プロモーターは、pBla(アンピシリン耐性遺伝子のためのプロモーター)を含む。いくつかの実施態様において、バクテリオファージゲノム破壊は、パッケージング開始部位配列を含むバクテリオファージゲノム上の配列を置換又は破壊する対立遺伝子交換事象によって達成される。
一例では、バクテリオファージゲノム上のターミナーゼ遺伝子の対(例えばterSとterL)を、一方のターミナーゼ遺伝子の発現及び/又は両方のターミナーゼ遺伝子によって媒介される全体的なターミナーゼ機能をも破壊する極性効果を引き起こす方法で破壊することができる。破壊されたバクテリオファージは、バクテリオファージゲノムのターミナーゼ遺伝子、例えばterSとterLを含むプラスミドで補完することができる。変異ウイルスが溶菌サイクルに入っているとき、バクテリオファージのゲノム又は(破壊された場合には)補完するプラスミドのいずれかから生成されたウイルスパッケージングタンパク質は、パッケージング開始部位を含んでいるため、プラスミドDNAのレプリコンをパッケージングユニットにパッケージングし、複製されたプラスミドDNAを担持する非複製的形質導入粒子が生成される。
VI.レポーター
いくつかの実施態様において、本発明のNRTP及びコンストラクトは、レポーター遺伝子を含むレポーター核酸分子を含む。レポーター遺伝子は、レポーター分子をコードすることができ、レポーター分子は検出可能なマーカー又は選択マーカーとすることができる。特定の実施態様において、レポーター遺伝子は、細胞内で発現された場合に検出可能なシグナルを生成するレポーター分子をコードする。
特定の実施態様において、レポーター分子は、限定されないが、緑色蛍光タンパク質(GFP)、増強GFP、黄色蛍光タンパク質(YFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)又はmCherry、及び近赤外蛍光タンパク質などの蛍光レポーター分子としてもよい。
他の実施態様では、レポーター分子は、発光反応を媒介する酵素(LuxA、LuxB、LuxAB、Luc、Ruc、nLuc等)であってもよい。レポーター分子には、細菌ルシフェラーゼ;真核生物ルシフェラーゼ;比色検出に適した酵素(LacZ、HRP);親和性ペプチド(Hisタグ、3X-FLAG)などの免疫検出に適したタンパク質;アプタマーとして機能する核酸、又は酵素活性(リボザイム)を示す核酸、又は抗生物質耐性遺伝子(ampC、tet(M)、CAT、erm)などの選択マーカーが含まれ得る。当技術分野で既知の他のレポーター分子は、標的核酸又は細胞を検出するためのシグナルを生成するために使用することができる。
他の態様において、レポーター分子は、核酸分子を含む。いくつかの態様において、レポーター分子は、特異的結合活性を有するアプタマーであるか、又は酵素活性を示すアプタマー(例えばアプタザイム、DNAザイム、リボザイム)である。
レポーター及びレポーターアッセイは、本明細書のセクションVで詳述されている。
V.NRTPとレポーターアッセイ
誘導物質レポーターアッセイ
いくつかの実施態様において、本発明は、生細胞内の遺伝子プロモーターを標的とする内在性又は天然の誘導物質と共に使用するためのレポーター分子としての、NRTPの使用方法を含む。本発明のNRTPは、実施例1~2のセクションIIIとそれ以降に記載する方法を用いて操作することができる。
いくつかの実施態様において、この方法は、NRTPをレポーターとして使用することを含み、NRTPは、標的細胞内の標的遺伝子の発現を制御する誘導性プロモーターに作動可能に連結されるレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子を含むNRTPを標的細胞に導入すると、レポーター核酸分子中の標的遺伝子プロモーターの誘導を介してレポーター遺伝子の発現が可能となる。
転写物
上述のように、転写物は、DNA若しくはRNA鋳型配列又は遺伝子から転写されるヌクレオチド配列(DNA又はRNA)の長さである。転写物は、RNA鋳型から転写されるcDNA配列、又はDNA鋳型から転写されるmRNA配列であり得る。転写物は、操作された核酸コンストラクトから転写することができる。転写物は、それ自体の中に相補性の領域をもつことができ、その結果、転写物は分子内二本鎖を形成できる2つの領域を含むようになる。一つの領域は、レポーター配列に結合し、その翻訳を阻止する「シス抑制配列」と呼ぶことができる。転写物の第2の領域は、検出可能なマーカー又は選択マーカーなどのレポーター分子をコードする「レポーター配列」と呼ばれる。
本発明の転写物は、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24又は25ヌクレオチド長であり得る転写物配列とすることができる。他の実施態様では、転写物は、少なくとも25、30、40、50、60、70、80、90、100、500、1000、1500、2000、3000、4000、5000又はそれ以上のヌクレオチド長であり得る。シス抑制配列とレポーター配列は、同じ長さであっても、異なる長さであってもよい。
いくつかの実施態様において、シス抑制配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60又はそれ以上のスペーサーヌクレオチドによってレポーター配列から隔てられている。
ベクター
別の態様において、本発明の転写物(アンチセンス及びセンス配列を含む)は、DNA又はRNAベクターに挿入された転写単位から発現される(例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10;Skillern, A., et al., 国際PCT公開番号WO00/22113、Conrad、国際PCT公開番号WO00/22114、及びConrad、米国特許第6,054,299号参照)。これらの配列は、線状コンストラクト、環状プラスミド又はバクテリオファージに基づくベクターを含むウイルスベクターとして導入することができ、これらは、宿主ゲノムに組み込まれた導入遺伝子として取り込まれ、遺伝され得る。転写物は、染色体外プラスミドとして遺伝することを可能にするように構築することもできる(Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292)。
転写配列は、発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写され得る。一実施態様において、シス抑制配列及びレポーター配列は、転写物がステム及びループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって連結された逆方向反復として発現される。
組換え発現ベクターを用いて、本発明の転写物を発現させることができる。組換え発現ベクターは、一般に、DNAプラスミド又はウイルスベクターである。転写物を発現するウイルスベクターは、限定されないが、アデノ関連ウイルス(概説については、Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)参照);アデノウイルス(例えば、Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434)、及びRosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155)参照);又はアルファウイルス、及びその他当技術分野で既知のものに基づいて構築することができる。レトロウイルスは、in vitro及びin vivoで、上皮細胞を含む多くの異なる細胞型にさまざまな遺伝子を導入するために使用されてきた(例えば、Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-19 ; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150:4104-4115;米国特許第4,868,116号;米国特許第4,980,286号;PCT出願WO89/07136;PCT出願WO89/02468;PCT出願WO89/05345;及びPCT出願WO92/07573参照)。細胞のゲノムに挿入された遺伝子を形質導入及び発現することができる組換えレトロウイルスベクターは、組換えレトロウイルスゲノムを、PA317及びPsi-CRIPのような適切なパッケージング細胞株にトランスフェクトすることによって製造することができる(Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349)。組換えアデノウイルスベクターは、感受性宿主(例:ラット、ハムスター、イヌ、及びチンパンジー)中の多種多様な細胞及び組織に感染させるために使用することができ(Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease,166:769)、且つ、感染のために有糸分裂活性細胞を必要としないという利点を有する。
発現させる転写物のコード配列を受け入れることができる任意のウイルスベクター、例えば、アデノウイルス(AV);アデノ随伴ウイルス(AAV);レトロウイルス(例:レンチウイルス(LV)、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス);ヘルペスウイルス等に由来するベクターを用いることができる。ウイルスベクターの向性は、他のウイルス由来のエンベロープタンパク質又は他の表面抗原でベクターをシュードタイピングすることによって、又は必要に応じて異なるウイルスカプシドタンパク質を置換することによって改変することができる。
例えば、本発明で特徴的なレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、狂犬病、エボラ、モコラ等からの表面タンパク質でシュードタイプ化することができる。本発明で特徴的なAAVベクターは、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するようにベクターを操作することにより、異なる細胞を標的とすることができる。異なるカプシドタンパク質血清型を発現するAAVベクターを構築するための技法は、当業者の範囲内であり、例えば、開示の全体が参照により本明細書に組み込まれるRabinowitz J Eら(2002),J Virol 76:791-801を参照されたい。
本発明での使用に適した組換えウイルスベクターの選択、ベクターに転写物を発現させるための核酸配列を挿入する方法、及び目的の細胞にウイルスベクターを送達する方法は、当業者の範囲内である。例えば、Dornburg R(1995),Gene Therap.2:301-310;Eglitis M A(1988),Biotechniques 6:608-614;Miller A D(1990),Hum Gene Therap.1:5-14;Anderson W F(1998),Nature 392:25-30;及びRubinson D Aら,Nat.Genet.33:401-406(これらの開示の全体は参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
ウイルスベクターは、AV及びAAVに由来し得る。本発明で特徴的な転写物を発現するのに適したAVベクター、組換えAVベクターを構築する方法、及びベクターを標的細胞に送達する方法は、Xia Hら(2002),Nat.Biotech.20:1006-1010に記載されている。本発明で特徴的な転写物を発現するのに適したAAVベクター、組換えAVベクターを構築する方法、及びベクターを標的細胞に送達するための方法は、Samulski Rら(1987),J. Virol.61:3096-3101;Fisher K Jら(1996),J.Virol,70:520-532;Samulski Rら(1989),J.Virol.63:3822-3826;米国特許5,252,479号;米国特許第5,139,941号;国際特許出願番号WO94/13788、及び国際特許出願番号WO93/24641に記載されている(これらの開示の全体は参照により本明細書に組み込まれる)。
本発明で特徴的なDNAプラスミド又はウイルスベクターのいずれかにおける転写物発現を駆動するプロモーターは、真核生物RNAポリメラーゼI(例:リボソームRNAプロモーター)、RNAポリメラーゼII(例:CMV初期プロモーター又はアクチンプロモーター又はU1 snRNAプロモーター)、又は一般にRNAポリメラーゼIIIプロモーター(例:U6 snRNA又は7SK RNAプロモーター)、又は原核生物プロモーター、例えばT7プロモーター(但し、発現プラスミドがT7プロモーターからの転写に必要なT7 RNAポリメラーゼをコードすることを条件とする)であってもよい。プロモーターはまた、導入遺伝子発現を膵臓に向けることができる(例えば、膵臓のためのインスリン調節配列(Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515)参照)。
さらに、転写物の発現は、例えば、特定の生理学的調節因子(例えば循環グルコースレベル又はホルモン)に感受性である調節配列などの誘導可能な調節配列及び発現系を用いることによって正確に調節することができる(Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24)。細胞又は哺乳類における導入遺伝子発現の制御に適したこのような誘導性発現系には、エクジソンによる調節、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学的誘導物質、及びイソプロピル-ベータ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)による調節が含まれる。当業者であれば、dsRNA導入遺伝子の用途に基づいて、適切な調節/プロモーター配列を選択することができるであろう。
一般に、転写分子を発現できる組換えベクターは、以下に記載するように送達され、標的細胞内に存続する。代替的に、転写物分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用することができる。このようなベクターは、必要に応じて反復投与することができる。発現すると、転写物は標的RNAに結合し、その機能又は発現を調節する。転写物発現ベクターの送達は、静脈内投与又は筋肉内投与、患者から外植された標的細胞への投与とその後の患者への再導入、又は所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段によるなど、全身的であり得る。
転写物発現DNAプラスミドは、典型的には、カチオン性脂質担体(例:オリゴフェクタミン)又は非カチオン性脂質ベースの担体(例:Transit-TKOTM)との複合体として標的細胞にトランスフェクトされる。単一のPROC遺伝子又は複数のPROC遺伝子の異なる領域を標的とするdsRNA媒介ノックダウンのための、1週間以上にわたる複数の脂質トランスフェクションもまた、本発明によって企図される。宿主細胞へのベクターの導入の成功は、種々の既知の方法を用いてモニターすることができる。例えば、一過性トランスフェクションは、例えば緑色蛍光タンパク質(GFP)などの蛍光マーカーなどのレポーターを用いてシグナル伝達され得る。ハイグロマイシンB耐性のような特定の環境因子(例:抗生物質及び薬物)に対する耐性をトランスフェクト細胞に提供するマーカーを用いることで、ex vivoでの細胞の安定したトランスフェクションを確保することができる。
組換えDNAを含むベクターの送達は、非生物系又は生物系により行うことができる。エレクトロポレーション(実施例に記載されている)、リポソーム、ウイルス様粒子、ファージ又はウイルスに由来する形質導入粒子、及びコンジュゲーションを含むが、これらに限定されない。
転写物アッセイ用レポーター
いくつかの実施態様において、核酸コンストラクトは、レポーター配列(例:レポーター遺伝子配列)を含む。レポーター遺伝子は、細胞内で発現するとシグナルを生成するレポーター分子をコードする。いくつかの実施態様において、レポーター分子は、検出可能なマーカー又は選択マーカーとすることができる。特定の実施態様において、レポーター分子は、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、又は赤色蛍光タンパク質(RFP)などの蛍光レポーター分子とすることができる。他の実施態様では、レポーター分子は、化学発光タンパク質とすることができる。
レポーター分子は、細菌ルシフェラーゼ、真核生物ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、比色検出に適した酵素、免疫検出に適したタンパク質、免疫検出に適したペプチド、又はアプタマーとして機能するか又は酵素活性を示す核酸とすることができる。
選択マーカーをレポーターとして用いることもできる。選択マーカーは、例えば抗生物質耐性遺伝子であってもよい。
以下は、本発明を実施するための具体的な実施態様の例である。これらの実施例は、説明を目的として提供されているものにすぎず、いかなる点においても本発明の範囲を限定するように意図されていない。使用した数字(例えば量、温度など)には正確を期すよう努めてきたが、ある程度の実験誤差と偏差は、当然ながら許容されるものとする。
本発明の実施は、特に指示がない限り、当業者の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えDNA技法及び薬理学の従来の方法を使用する。上記技法は、文献で十分に説明されている。例えば、T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993);A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,現行版);Sambrookら,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989);Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan編,Academic Press,Inc.);Remington’s Pharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990);Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)A巻及びB巻(1992)を参照されたい。
実施例1:A.バウマンニ分離株由来の新規バクテリオファージの同定と非複製的形質導入粒子(NRTP)の製造
材料及び方法
細菌株と増殖条件
CDC、パスツール研究所、IHMA社からA.バウマンニ臨床分離株288株のセットを採取し、生化学的試験及びMALDI-TOFにより自家で種を検証した。A.バウマンニが確認された各分離株は、「Abi」とそれに続く受け入れの順序に基づく番号で識別された。分離株を、Luria‐Bertani(LB)ブロス中37℃、225rpmで攪拌しながら、又はLB寒天プレート上37℃、定常状態で培養した。パッケージングプラスミドを保有する株は、大腸菌クローニング株又はA.バウマンニ分離株それぞれについて150μg/ml又は250μg/mlのハイグロマイシンBゴールド(Invivogen、カリフォルニア州サンディエゴ)を補充したLB Lennox(低塩)ブロス又は寒天中での増殖により選択された。遺伝子破壊されたターミナーゼ領域を有するA.バウマンニ株は、200μg/mlのゼオシン(Thermo Fisher Scientific、カリフォルニア州カールズバッド)又はフレオマイシン(Invivogen、カリフォルニア州サンディエゴ)を補充したLB Lennox(低塩)ブロス又は寒天中で選択された。
溶原ファージの誘導と精製
A.バウマンニ溶原菌株は、LBブロス中37℃、225rpmの振盪速度で対数期(OD600約0.6~0.8)まで増殖させた後、4μg/mlのマイトマイシンCを添加して、存在する可能性のある溶原性ファージを誘導した。マイトマイシンCを30分間処理した後、細胞を3750rpmで10分間遠心分離し、新鮮LBブロスに再懸濁させた。振盪速度を150rpmに落として37℃で4時間、細胞をインキュベートした。ファージ含有上清を3750rpmで10分間遠心分離して細胞片をペレット化し、0.2μMフィルターユニットに通し、残存する細胞片を除去した。溶解物は、使用するまで4℃で暗所に保存した。
プラーク法(plaquing method)による宿主域評価
A.バウマンニ臨床分離株288株のそれぞれを、5mM CaClを補充したLBブロス中で増殖させた。OD600約0.4~0.6の対数期に達すると、0.5%寒天と5mM CaClからなる溶解した上層寒天4mlに300μlの細菌培養物を加えた。この上層寒天と細菌培養物との混合物をプレーンのLB寒天プレート上に注ぎ、直ちに5μlの濾過した溶解物でスポッティングした。このプレートを37℃で一晩インキュベートし、翌日、定義したプラークの有無をスコア化した。
誘導性新規ファージのファージゲノムDNAシーケンシング
ファージゲノムDNAを新規Abi phi 33、49、及び147ファージから分離し、広範なプラーク形成(plaquing)宿主域を得た。溶解物を14,000rpmで2時間遠心分離してファージをペレット化し、1x SMバッファー中に再懸濁させた。ファージ溶解物をDNaseI(Thermo Fisher、カリフォルニア州カールズバッド)で処理し、ファージDNA分離キット(Norgen Biotek社、カナダオンタリオ州ソロルド)を用いて処理してファージゲノムDNA(gDNA)を分離した。MiSeqシーケンシングプラットフォーム(llumina、カリフォルニア州サンディエゴ)を用いる新規ファージゲノムシーケンシング、アセンブリ、及びオープンリーディングフレームの推定アノテーション(putative annotation)のために、精製されたファージgDNA試料をACGT社(イリノイ州ホイーリング)に送付した。
透過型電子顕微鏡によるファージの可視化
ファージをペレット化するために、ファージ溶解物を14,000rpm、室温で2時間遠心分離し、50~100μlのSMバッファー中に再懸濁させた。陰性染色及び透過型電子顕微鏡検査のため、試料をコロラド大学ボールダー校のElectron Microscopy Services(米国コロラド州ボールダー)に提出した。
ファージパッケージングのためのA.バウマンニプラスミドの構築
プラスミドの構築については、結果のセクションで詳述する。本研究で使用した全てのプラスミドを表1に列挙する。
Figure 2022515451000002
ターミナーゼ領域欠失の設計と構築
Arandaら(Aranda, et al., 2010)が開発した遺伝子破壊法を用いて、二重交差組換え(double-crossover recombination)を介してターミナーゼ領域を選択マーカーに置き換えた。組換えのための基質は、5’末端で600bpのterS上流領域が隣接し、3’末端でterLの下流の600bpが隣接するゼオシン耐性カセット(zeoR)で構成されていた。これらの配列の各々は、Abi 33、Abi 49、及びAbi 147ターミナーゼ領域に対して特異的に設計され、gBlocks(IDT、カリフォルニア州レッドウッドシティ)として合成され、pCR-BluntII-TOPOベクターにサブクローン化され、Phusion High-Fidelity DNAポリメラーゼ(New England Biolabs、マサチューセッツ州イプスウィッチ)でPCR増幅された。PCR精製キット(New England Biolabs)を用いて線状の組換えDNAを精製し、約5μg/mlの濃度になるように濃縮した。
ターミナーゼ領域ノックアウトを作製するためのエレクトロコンピテント細胞の調製
A.バウマンニ株を、Jacobsら(Jacobs AC, et al., 2014)から改良した方法を用いてエレクトロコンピテントにした。細菌培養物を、LB Lennoxブロス50ml中で37℃、225rpmで振盪しながら一晩増殖させた。その培養物を50mlの円錐管に移し、3750rpm、室温で10分間遠心分離して、細胞をペレット化した。その後の全ての工程は、室温で実施された。上清をピペッティングにより除去し、細胞ペレットを10%(v/v)グリセロールを含む25ml(培養開始時の量の半分)に穏やかに再懸濁させた。その細胞を3750rpmで10分間ペレット化し、10%グリセロールでの洗浄を繰り返した。ペレット化細胞を10%グリセロール1.5mlに再懸濁させた。
エレクトロポレーションによる遺伝子ノックアウト産物の形質転換
線状、組換えDNA(≦10μl)を、新鮮なエレクトロコンピテント細胞の50μlアリコートと混合した。この混合物を1mmのエレクトロポレーションキュベット(Bulldog)に入れ、でBio-Rad社のGene Pulserで25μF、100オーム、1.8kVのパルスをかけた。細胞を900μlのSOCブロス(Invitrogen)中で37℃で2~3時間インキュベートし、細胞の回収と組換え事象が起こるようにした。ゼオシン又はその誘導体、フレオマイシン200μg/mlを含むLB Lennox寒天プレート上に細胞をプレーティングした。
補完するプラスミドによるターミナーゼノックアウト株の形質転換
ターミナーゼノックアウト株を、200μg/mlのゼオシン又はその誘導体、フレオマイシンを含むLB Lennox中で一晩増殖させた。Abi 33、Abi 49、及びAbi 147ターミナーゼノックアウト株の培養物を、前述のようにエレクトロコンピテントにし、それぞれプラスミドp3074、p3075、及びp3073で形質転換した。形質転換体をゼオシン200μg/mlとハイグロマイシンBゴールド250μg/mlを含むLB Lennox寒天上で選択した。
非複製的形質導入粒子の溶解物を作製するための変異株の誘導
ストリークしたばかりのコロニーから、Abi 33 ΔterSL::p3074、Abi 49 ΔterSL:::p3075、及びAbi 147 ΔterSL:::p3073を、225rpmで撹拌しながら37℃で250μg/mlのハイグロマイシンBゴールドを含むLB Lennoxブロス中で一晩増殖させた。細胞に3%の一晩培養物をLBブロスに接種し、OD600が1.6~1.8に達するまで225rpmで撹拌しながら37℃でインキュベートした。ファージ産生を誘導するために、マイトマイシンC(Millipore Sigma、ミズーリ州セントルイス)4μg/mlを、150rpmで撹拌しながら37℃で40分間培養物に添加した。マイトマイシンCを除去するために、細胞を室温で10分間3750rpmで遠心分離し、ペレットを新鮮LBブロスに再懸濁させた。その培養物を150rpmで撹拌しながら37℃で一晩インキュベートした。細胞破片を除去して各溶解物を精製するために、培養物を5000rpmで15分間遠心分離した。非複製的形質導入粒子溶解物含有上清を0.2μm Thermo ScientificTM Nalgene Rapid Flowフィルター(Thermo Fisher)に通し、使用まで4℃で遮光して保存した。
非複製的形質導入粒子を含む溶解物の濃度
粗溶解物を4℃で10,000xgで15分間遠心分離して細胞片を除去し、0.2μm Thermo ScientificTM Nalgene Rapid Flowフィルターを通過させることによって濾過滅菌した。滅菌溶解物を16~18時間4℃で30,000xgで遠心分離し、形質導入粒子をペレット化した。上清を除去した後、ファージペレットを1x SMバッファー(100mM NaCl、8mM MgSO4、50mM トリス-HCl)中に10倍又は20倍の濃度に再懸濁させ、0.2μm Thermo ScientificTM Nalgene Rapid Flowフィルターを通して再び濾過滅菌した。
非複製的形質導入粒子を有する標的株における発光の検出
96ウェル株パネルのグリセロールストックをディープウェルプレートのLB Millerブロス500μlに接種し、500rpmで撹拌しながら37℃で一晩増殖させた。日培養物(day cultures)は、25mMのCaCl及び50mMのMgClを補充した800μlのLB Millerブロス中での一晩培養物1μlに約107cfu/mlの開始細胞負荷量(starting cell load)を接種することによって、調製した。細胞を500rpmで攪拌しながら37℃で1.5時間増殖させた。白色96ウェルプレートで、日培養物120μlと形質導入粒子50μlを混合した。形質導入粒子カクテルアッセイのために、120μlの日培養物を、25μlの各3x濃縮Abi 33、Abi 49、及びAbi 147形質導入粒子と混合した。アッセイプレートを、100rpmで撹拌しながら37℃で2時間インキュベートし、続いて、最適なluxAB発現を可能にするために、100rpmで撹拌しながら30℃で30分間冷却工程を行った。プレートは、SpectraMax L装置(Molecular Devices、カリフォルニア州サンホセ)で、ノナナールを基質として相対光単位(RLU)の発光を読み取った。
形質導入粒子(Tc)スポッティングによる宿主域評価
Abi 33、Abi 49、及びAbi 147形質導入粒子の宿主域を、インキュベートした細胞5μlをスポッティングすることによって評価した(Westwaterの論文参照)。発光アッセイの読み取りの直前に、細胞を、250μg/mlヒグロマイシンBを含有するLB Lennox寒天プレート上にスポットした。プレートを一晩37℃でインキュベートし、翌日に細菌増殖(すなわち、ハイグロマイシン耐性を付与するプラスミドを保有する形質導入体)の有無をスコア化した。形質導入体を確認し、任意の天然ハイグロマイシン耐性細胞を除去するために、コロニーをLBブロスに再懸濁させ、RLU放出について試験した。
結果
広範なプラーク形成宿主域を有する誘導性、溶原性A.バウマンニファージを同定し、特性評価した。
誘導性及び広範な宿主域プロファージ候補を同定し、絞り込むために、ユニークなA.バウマンニ臨床分離株288株を収集し、細菌のSOS応答の強力な誘導因子であるマイトマイシンCで個別に処理し、細菌が保有するあらゆる溶原菌を誘導して溶菌サイクルに変換させた。この調製物からの溶解物を、ファージプラーク法を用いて、同じA.バウマンニ株のサブセット上にスポッティングした。プラークの存在をスコア化し、宿主域をスプレッドシートで管理した。累積的に、陽性プラークを有する溶解物を、宿主域及び相補的カバレッジ(complementary coverage)に基づいてランク付けした。宿主域が最も広い溶解物は、Abi 33、Abi 49、及びAbi 147と同定され、プラーク形成宿主域はそれぞれ25%(72/287)、23%(61/269)、4%(7/163)、累積で32%(93/288)であった。
Abi 33、Abi 49、及びAbi 147溶解物由来のファージゲノムDNAを精製し、ファージパッケージング(すなわちターミナーゼ)領域を同定するためにシーケンシングした。Abi 33、Abi 49、及びAbi 147の完全なファージゲノムサイズは、それぞれ53、40、及び36kbであった。Abi 33、Abi 49、Abi 147ファージを透過型電子顕微鏡で画像化し、インタクトなファージの存在を確認し、ファージ集団の均一性を調べ、形態に基づいてファージファミリーを同定した。Abi 33溶解物は、マイオウイルス科ファージの不均一な集団を含み、Abi 49及びAbi 147溶解物は、サイフォウイルス科ファージの均一な集団を含んでいた(図1a、1b、1c)。
非複製的形質導入粒子は、宿主株ターミナーゼ領域の欠失及びファージパッケージングプラスミドでの補完によって作製することができる。
非複製的形質導入粒子技術は、欠失及び相補性に依存して、天然ファージDNAの代わりにレポーターDNAを担持する操作されたプロファージを生成する。すなわち、1)宿主ファージゲノム上の喪失を補完するためのファージパッケージング遺伝子エレメントと2)発光アッセイのためのレポーター遺伝子luxABとを有するプラスミドを保有するパッケージング欠損ファージ殻からそれぞれが構成されるAbi 33、Abi 49、及びAbi 147形質導入粒子を合成した(図2)。宿主であるAbi 33、Abi 49、及びAbi 147ゲノムでは、terSLによってコードされるターミナーゼサブユニットと250bp以下の上流領域が各株についてノックアウトされ、zeoR選択カセットに置き換えられた。プラスミドの骨格をファージパッケージングのために構築し、Abi 33、Abi 49、及びAbi 147宿主株上のターミナーゼ領域の喪失を補完した(図3)。欠失したターミナーゼ領域の実際のヌクレオチド配列を表2に示す。
Figure 2022515451000003
Figure 2022515451000004
Figure 2022515451000005
Figure 2022515451000006
各シャトルプラスミド骨格は、大腸菌とA.バウマンニについてそれぞれ2つの複製開始点を含んでいた:pCR-Blunt II-TOPOベクターに由来するpUC18(Thermo Fisher Scientific、カリフォルニア州カールズバッド)、アシネトバクター・カルコアセティカスから分離されたpWH1266プラスミドに由来するpWH1277(Hunger M, et al., 1990)。ファージパッケージングプラスミドは、全ての臨床A.バウマンニ分離株におけるほぼ普遍的な抗生物質を選択のために、pMQ300プラスミド(ペンシルベニア州ピッツバーグ大学のRobert M.Q教授提供)に由来する、ハイグロマイシンB耐性をコードするhphカセットを含んでいた。ファージパッケージングプラスミドp3073、p3074、及びp3075は、それぞれAbi 147、Abi 33、及びAbi 49のターミナーゼ領域の上流領域及び完全長ターミナーゼサブユニットterSLでのクローニングによって生成された。具体的には、p3073はAbi147のterS ORFの上流250塩基対及びterSLを含み、p3074はAbi 33のterS ORFの上流250塩基対及びterSLを含み、p3075はAbi 49のterS ORFの上流150塩基対及びterSLを含んでいた。プラスミドp3073は、ビブリオ・フィシェリ(Vibrio fischerii)由来の野生型pBlaプロモーター駆動型luxABを含み;p3074及びp3075もまた、改善されたルシフェラーゼ活性のためにLuxAに2つの点突然変異C170R及びN264Dを有するV.フィシェリ由来のpBlaプロモーター駆動型luxABを含んでいた。プラスミドp3073、p3074、及びp3075は、luxABの3’末端にrrnG転写ターミネーター(TT)が挿入されていた。TT領域は、OXB19プラスミド(Oxford Genetics社、英国、オックスフォード)に由来していた。
Abi 33、Abi 49、及びAbi 147 Smarticlesのカクテルは、ユニークなA.バウマンニ臨床分離株のパネルで高い包括性のアッセイ結果をもたらす。
ファージ誘導法によりAbi 33、Abi 49、及びAbi 147非複製的形質導入粒子を生成し、遠心分離により3x濃縮した。ユニークなA.バウマンニ臨床分離株96株のパネルを、Abi 33、Abi 49、及びAbi 147 Smarticlesと2.5時間インキュベートする前に、約107cfu/mlの細胞負荷量まで増殖させた。発光反応基質を注入すると、Abi 33、Abi 49、及びAbi 147の個々の形質導入粒子により、それぞれ47%、54%、59%の株がRLU陽性であった(表2)。カクテルとしては、82%の株がRLU陽性であったことから、相加効果が認められた(表2)。
Figure 2022515451000007
Abi 33、Abi 49、及びAbi 147形質導入粒子をファージ誘導法により生成し、A.バウマンニ株のサブセットを有するグラム陰性細菌株のパネルで交差反応性を試験して、アッセイにおける陽性対照として役立てた(図4a)。この菌株パネルを、Abi 33、Abi 49、及びAbi 147 Smarticlesと2.5時間インキュベートする前に、約107cfu/mlの細胞負荷量まで増殖させた。非A.バウマンニ株に対する液体アッセイでは交差反応性は認められなかった(図4b)。
実施例2:安定化パッケージングプラスミドとNRTPの製造
A.バウマンニ(Abi)パッケージングプラスミドの新しいシリーズの構築
溶原菌株Abi33 Δ terSL:::p3074で安定性の問題が観察され、1回の継代後にプラスミドが失われた。同様のプラスミドの不安定性の問題は、他のSmarticles NRTP研究でも観察された。この効果はターミナーゼ遺伝子の上流hphプロモーターからの漏出性発現が原因で、プラスミドの自己切断と過剰なターミナーゼ活性によるプラスミドの喪失が生じたのではないかと仮定された。特定のパッケージングプラスミドでは、ターミナーゼがhphと同じ向きである場合、株は不安定であり、SmarticlesはRLUアッセイではカバレッジが低かった。しかし、ターミナーゼの向きをベクター上でhphと反対方向に反転させると、その後、株の安定性とSmarticlesのカバレッジが大幅に向上した(データは示されていない)。そこで、1)菌株の安定性、2)プラスミドのファージ頭部へのパッケージング効率、及び結果として3)Smarticles RLUアッセイのカバレッジを改善するために、hph終止コドンの後に転写ターミネーターを追加することによって新しいコンストラクトの骨格を構築した。
空のA.バウマンニパッケージングベクターpZX057(図5)を以下のように最適化して構築した:1)luxA遺伝子を、より活性な酵素であり、アッセイにおいてより高いRLUシグナルを生成する二重変異体luxAに置き換えた;2)hphプロモーターからの下流遺伝子の漏出性発現を防止するために、hph遺伝子の後に細菌の転写ターミネーターT7及びrrnGをクローニングした;3)予期せぬ漏出性発現を防止するために、未利用lacZ遺伝子(元のベクターからの残存)を除去し、別の二方向二重転写ターミネーターBBa‐B0014に置き換えた。ベクター上の2つのクローニング部位を利用して、ベクター地図に示されたターミナーゼ遺伝子領域内でクローニングした。
それぞれ上流に700bp、下流に270bpの追加の配列をそれぞれ有する完全長のAbi 33 node3 terS及びterLターミナーゼ遺伝子をクローニング領域1にクローニングすることにより、Abi 33パッケージングベクターpZX058(図6)を生成した。クローニング領域1にAbi 49及びAbi 147ターミナーゼをクローニングするには技術的な困難があったため、クローニング領域2にターミナーゼをクローニングすることによりpZX065(図8)及びpZX066(図10)コンストラクトを構築した。具体的には、pZX065は、完全長Abi 49 terSとterLに加えて、それぞれ700bpの上流領域配列、366bpの下流領域配列を含んでいた。プラスミドpZX066は、完全長Abi 147 terSとterLに加えて、414bpの上流配列及び284bpの下流配列を含んでいた。プラスミドpZX058、pZX065、及びpZX066のアノテーションされたヌクレオチド配列を、それぞれ図7-I、-II、-III、-IV(配列番号4)、図9-I、-II、-III、-IV(配列番号5)、図11-I、-II、-III、-IV(配列番号6)に示す。
これらの安定化されたパッケージングプラスミドを用いた新しいAbi 33、Abi 49、及びAbi 147非複製的形質導入粒子を、実施例1に記載したように生成した。発光反応基質を注入すると、61%、42%、及び41%の株が、それぞれAbi 33、Abi 49、Abi 147の個々の形質導入粒子によってRLU陽性であった。カクテルとしては、78%の株がRLU陽性であったことから、相加効果が認められた(A.バウマンニ95株のうち74株)。さらに、Abi 33、49、147 Smarticles NRTPをカクテルとして使用した場合、RLUで測定したところ、非A.バウマンニ株との交差反応は認められなかった。結果は表4に示しているが、ここで、マイナスのRLUは、試験した計95の腸内細菌科及びグラム(-)株の排他性を示す。略語は以下の通り:Abi(アシネトバクター・バウマンニ)、Kpn(肺炎桿菌)、Eco(大腸菌)、Ecl(エンテロバクター・クロアカ)、Pae(緑膿菌)、Kox(クレブシエラ・オキシトカ)、Eae(エンテロバクター・エロゲネス)、Cfi(シトロバクター・フロインデイ)、Cko(シトロバクター・コセリ)、Sms(霊菌)。
Figure 2022515451000008
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Claims (13)

  1. バクテリオファージゲノムを含む組成物であって、バクテリオファージゲノムがAbi 33、Abi 49、及びAbi 147からなる群から選択されるバクテリオファージに由来し、且つ、バクテリオファージゲノムがパッケージング関連酵素活性をコードする1又は複数の遺伝子の破壊を含む、組成物。
  2. パッケージング関連酵素活性をコードする1又は複数の遺伝子が、terS遺伝子、terL遺伝子、又はterSとterL遺伝子の両方を含む、請求項1に記載の組成物。
  3. パッケージング関連酵素活性をコードする1又は複数の遺伝子の破壊が、配列番号1、配列番号2又は配列番号3から選択されるヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項1又は2に記載の組成物。
  4. レポーター遺伝子を含むレポータープラスミドを、A.バウマンニ細胞に導入するための非複製的形質導入粒子(NRTP)にパッケージングするための、細菌細胞パッケージング系であって、
    - 宿主のA.バウマンニ細胞;
    - パッケージング関連酵素活性をコードする1又は複数の遺伝子の破壊を有するバクテリオファージゲノムを含む、宿主A.バウマンニ細胞内の第1の核酸コンストラクトであって、破壊がバクテリオファージゲノムのNRTPへのパッケージングを妨げ、バクテリオファージゲノムがバクテリオファージAbi 33のゲノム、バクテリオファージAbi 49のゲノム、及びバクテリオファージ147のゲノムからなる群から選択される第1の核酸コンストラクト;並びに
    - 第1の核酸コンストラクトとは別個の、宿主A.バウマンニ細胞内の第2の核酸コンストラクトであって、レポーター遺伝子を有するレポーター核酸分子と、バクテリオファージゲノムの破壊を補完し且つレポーター核酸分子のレプリコンのNRTPへのパッケージングを容易にするパッケージング関連酵素活性をコードする1又は複数の遺伝子と含む第2の核酸コンストラクト
    を含む細菌細胞パッケージング系。
  5. パッケージング関連酵素活性をコードする1又は複数の遺伝子が、terS遺伝子、terL遺伝子、又はterSとterL遺伝子の両方を含む、請求項4に記載の細菌細胞パッケージング系。
  6. パッケージング関連酵素活性をコードする1又は複数の遺伝子の破壊が、配列番号1、配列番号2又は配列番号3から選択されるヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項4又は5に記載の細菌細胞パッケージング系。
  7. レポーター核酸分子が、配列番号4、配列番号5又は配列番号6から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項4から6のいずれか一項に記載の細菌細胞パッケージング系。
  8. 請求項4から7のいずれか一項に記載の細菌細胞パッケージング系を使用して非複製的形質導入粒子を製造する方法であって、
    a) 請求項4から7のいずれか一項に記載の細菌細胞パッケージング系の溶菌相を誘導する工程と
    b) レポーター分子のレプリコンをパッケージングしてNRTPを製造する工程と
    を含む、方法。
  9. パッケージング関連酵素活性をコードする1又は複数の遺伝子の破壊が、配列番号1、配列番号2又は配列番号3から選択されるヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項8に記載の方法。
  10. レポーター核酸分子が、配列番号4、配列番号5又は配列番号6から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項8又は9に記載の方法。
  11. 試料中のA.バウマンニを検出する方法であって、
    a) 請求項8から10のいずれか一項に記載の方法によって製造される、バクテリオファージAbi 33に由来するNRTP、バクテリオファージAbi 49に由来するNRTP、バクテリオファージAbi 147に由来するNRTP、又はこれらの任意の組み合わせを試料に提供する工程;
    b) 検出可能なシグナルを生成するための条件をレポーター遺伝子に提供する工程;及び
    c) 検出可能なシグナルの有無を検出して、A.バウマンニの有無を示す工程
    を含む、方法。
  12. 試料にNRTPを提供する前又は後に、試料に抗菌剤を提供して、検出可能なシグナルの有無を検出し、前記試料が抗菌剤に対して耐性又は感受性であるA.バウマンニを含むかどうかを示すことを含む工程をさらに含む、請求項11に記載の方法。
  13. レポーター核酸分子が、配列番号4、配列番号5又は配列番号6から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項11又は12に記載の方法。
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