JP2022515451A - アシネトバクター・バウマンニの検出のための、非複製的形質導入粒子及び形質導入粒子に基づくレポーター系 - Google Patents

アシネトバクター・バウマンニの検出のための、非複製的形質導入粒子及び形質導入粒子に基づくレポーター系 Download PDF

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Abstract

本発明は、Ａ．バウマンニの検出のための、アシネトバクター・バウマンニ（Ａ．バウマンニ）に特異的な新規バクテリオファージと、該バクテリオファージに由来する非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）の製造方法と、該ＮＲＴＰの使用とに関する。

Description

本発明は、標的細胞を検出するための、非複製的形質導入レポーター分子のパッケージング及び送達のための方法及び組成物に関する。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月２７日出願の米国仮特許出願第６２／７８５，５１０号及び２０１９年９月１３日出願の米国仮特許出願第６２／８９９，９８５号の優先権の利益を主張するものであり、これらは各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、２０１９年１１月２０日作成の「Ｐ３５２２２－ＷＯ ＰＣＴ ｆｉｌｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ」と題された電子テキストファイル（バイトでのサイズ４６ｋｂ）として提出された配列表を含む。
関連技術の説明
形質導入粒子とは、非ウイルス核酸を細胞内に送達することができるウイルスを指す。ウイルスに基づくレポーター系は、細胞の存在を検出するために使用されており、ウイルスの溶原期に依存して細胞からのレポーター分子の発現を可能にしている。このようなウイルスに基づくレポーター系は、レポーター分子を発現する複製可能な導入粒子を使用し、標的細胞に検出可能なシグナルを放出させる。
しかし、ウイルスの溶菌サイクルは、ウイルスに基づくレポーターアッセイに有害であることが示されている。Ｃａｒｒｉｅｒｅ，Ｃ．ら，Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｈａｇｅｓ：Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｄｒｕｇ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９７．３５（１２）：３２３２－３２３９頁。Ｃａｒｒｉｅｒｅらは結核菌／カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）ルシフェラーゼレポーターファージを開発したが、このファージは、３０℃では溶菌サイクルが抑制されるが、３７℃では活性になる。この系を用いて、Ｃａｒｒｉｅｒｅらは、溶菌サイクルが抑制されたファージレポーターを使用したＢＣＧの検出を実証した。
しかし、バクテリオファージに基づくレポーターアッセイには、バクテリオファージの複製機能を抑制するが排除しないということに関連する欠点がある。第一に、バクテリオファージの複製機能を制御することは、限定的なアッセイ条件を課す。例えば、Ｃａｒｒｉｅｒｅらが用いたレポーターファージｐｈＡＥ４０の溶菌サイクルは、このファージを使って非許容温度である３０℃で細胞に感染させると抑制された。この温度要件は、標的細菌の最適温度が３７℃であるという制限条件をレポーターアッセイに課した。これらの制限条件は、最適なアッセイ性能を妨げる。
さらに、ウイルスの複製機能は、制御するのが難しい。形質導入粒子をレポーター系として使用する間は、ウイルスの複製が抑制されている必要がある。例えば、Ｃａｒｒｉｅｒｅらによって報告されたレポーターファージｐｈＡＥ４０の溶解活性は、低下したが排除されず、結果としてアッセイにおいてルシフェラーゼシグナルの低下をもたらした。Ｃａｒｒｉｅｒｅらは、この結果として生じるレポーターシグナルの低下の考えられる原因としてインタクトなファージ発現遺伝子及びアッセイの温度限界などを強調したが、これらは全て、ファージレポーターの溶菌サイクルが排除されなかったという事実に起因する。
ファージの自然な溶原サイクルに依存するレポーターアッセイは、散発的に溶菌活性を示すことが見込まれる。さらに、ファージの溶原サイクルに依存するアッセイは、入ってくるウイルス核酸を標的とする天然の宿主制限系だけではなく、類似のファージで既に溶原化された標的細胞からの重感染免疫の影響を受けやすいため、これらのレポーターファージの宿主域が制限される。
他の例では、形質導入粒子製造系は外来核酸分子をパッケージングするように設計されているが、形質導入粒子は、外来核酸分子と天然の子孫ウイルス核酸分子の組み合わせを含有することが多い。上記の天然ウイルスは、アッセイ性能の妨げとなる溶解活性を示す可能性があり、形質導入粒子を精製するには、ウイルスの溶解活性を排除する必要がある。しかし、この精製は、一般に不可能である。Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａと題された米国特許出願公開第２００９／０１５５７６８号で、Ｓｃｈｏｌｌらは、このような形質導入粒子系の開発について記載している。この系の産物は、レポーター形質導入粒子と天然バクテリオファージとの組み合わせである（図８参照）。この著者らは、形質導入粒子と天然バクテリオファージを超遠心によって分離できることを示しているが、この分離は、超遠心によって分離が可能になるであろう、異なる密度を形質導入粒子と天然ウイルスが示す系においてのみ可能である。この特徴は引用文献に記載されているバクテリオファージＴ７に基づくパッケージング系によって示されているが、これは一般に他のウイルス系に適用可能な特徴ではない。ウイルスパッケージング機構はヘッドフルパッケージングを示すことが通例であり、天然ウイルスと形質導入粒子が超遠心によって分離することができないような区別不能な密度を示す結果となるであろう。また、ウイルスパッケージング系は、適切なウイルス構造のアセンブリのための必要条件として最少量のパッケージングに依存しており、その結果区別不能な密度を有する天然ウイルスと形質導入粒子が生じる。
したがって、ウイルスの溶解機能からの有害作用、並びに、重感染免疫とウイルス核酸分子及びウイルス機能を標的とする宿主制限機構とによって制限される可能性（これらは全て、検出限界を増大させることによりレポーターアッセイの性能を制限し、偽陰性結果をもたらす可能性がある）の影響を受けない、非複製的形質導入粒子が必要とされている。
形質導入粒子が操作された場合でも、形質導入粒子を用いて細胞内の標的核酸分子の存在を検出し、報告する方法には限界がある。いくつかの方法は、細胞の破壊と、溶解物中の転写物を分離し検出するための煩雑な技法を必要とする。検出方法には、抗体、アプタマー又は核酸プローブなど、標識プローブを用いることが含まれる。標的遺伝子に向けられた標識プローブは、意図しない標的への非特異的結合を生じ得るか又は高いシグナル対ノイズ比を有するシグナルを生成し得る。したがって、細胞内の内在性核酸分子の検出及び報告のための特異的、効果的且つ正確な方法が必要とされている。
さらに最近になって、バクテリオファージゲノムにおけるパッケージング開始部位の破壊に起因して複製可能な天然子孫ウイルス核酸分子の生成が大幅に減少した、本明細書でＳｍａｒｔｉｃｌｅｓとも称される非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）にレポーター核酸分子をパッケージングする方法及び系が米国特許第９，３８８，４５３号（その全体が参照により本明細書にして組み入れられる）に記載された。
アシネトバクター・バウマンニ（Ａ．バウマンニ）は、グラム陰性球桿菌であり、院内感染及び世界的流行の主な原因としてますます問題となっている。Ａ．バウマンニによる感染は、敗血症、人工呼吸器関連肺炎、尿路感染、及び創傷感染をもたらす可能性があり（Beggs et al., 2006; Peleg et al. 2008）、特に免疫減弱状態の個体は高リスクである。感染症を引き起こすＡ．バウマンニ株は、抗生物質に対して広範な耐性を示すことが多く、深刻な公衆衛生上の脅威となっていることから、世界保健機関は最近、これを標的とした新規抗生物質の開発リストで重要レベル「優先度１」の病原体としてこれを宣言した（ＷＨＯ、２０１７）。さらに、死亡率は、Ａ．バウマンニ感染症で特に高く、人工呼吸器関連肺炎及び血流感染症の患者では死亡率が３５％と高かった（Antunes et al., 2014）。Ａ．バウマンニ感染で観察された高い死亡率の１つのリスク因子は、不適切な抗生物質治療から生じる（Lemos EV et al., 2014）。
Ａ．バウマンニの迅速な診断は、適切な抗生物質療法を特定し、臨床現場での感染の拡大を制御するために極めて重要である。Ａ．バウマンニ感染を検出するための現在市販されている方法には、表現型法（例：ＶＩＴＥＫ２、ビオメリュー）及びＤＮＡベースの方法（例：１６ｓ ｒＲＮＡのＰＣＲ増幅）（Li P, et al., 2015）が含まれる。しかし、宿主細菌に感染して溶菌ライフサイクルを完了し、細菌の宿主防御機構に遭遇する必要がある天然ファージを使用せずに、生体試料中のＡ．バウマンニの存在を迅速に検出できるアッセイへのニーズがある。
本発明は、Ａ．バウマンニに特異的でこの種内に広い宿主域を有する新規バクテリオファージを含む、組成物に関する。ある実施態様において、この新規バクテリオファージは、マイオウイルス科ファミリーに属するＡｂｉ ３３である。別の実施態様では、この新規バクテリオファージは、サイフォウイルス科ファミリーに属するＡｂｉ ４９又はＡｂｉ １４７である。本発明はまた、これらの新規バクテリオファージのゲノムに由来し、Ａ．バウマンニに対して特異性を示す非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）の製造に関するものでもある。したがって、本発明は、バクテリオファージゲノムを含む組成物に関するものであり、バクテリオファージゲノムは、Ａｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７からなる群から選択されるバクテリオファージに由来し、且つ、バクテリオファージゲノムは、パッケージング関連酵素活性をコードする１又は複数の遺伝子の破壊を含む。ある実施態様において、パッケージング関連酵素活性をコードする１又は複数の遺伝子は、ｔｅｒＳ遺伝子、ｔｅｒＬ遺伝子、又はｔｅｒＳとｔｅｒＬ遺伝子の両方を含む。ある実施態様において、パッケージング関連酵素活性をコードする１又は複数の遺伝子の破壊は、配列番号１、配列番号２又は配列番号３から選択されるヌクレオチド配列の欠失を含む。
本発明はまた、レポーター遺伝子を含むレポータープラスミドを、Ａ．バウマンニ細胞に導入するためのＳｍａｒｔｉｃｌｅｓ非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）にパッケージングするための、細菌細胞パッケージング系に関する。ある実施態様では、このパッケージング系は、宿主のＡ．バウマンニ細胞；パッケージング関連酵素活性をコードする１又は複数の遺伝子の破壊を有するバクテリオファージゲノムを含むか又はそれからなる、宿主Ａ．バウマンニ細胞内の第１の核酸コンストラクト（ここで、破壊はバクテリオファージゲノムのＮＲＴＰへのパッケージングを妨げ、バクテリオファージゲノムはバクテリオファージＡｂｉ ３３のゲノム、バクテリオファージＡｂｉ ４９のゲノム、及びバクテリオファージ１４７のゲノムからなる群から選択される）；及び第１の核酸コンストラクトとは別個の、宿主Ａ．バウマンニ細胞内の第２の核酸コンストラクトであって、レポーター遺伝子を有するレポーター核酸分子と、バクテリオファージゲノムの破壊を補完し且つレポーター核酸分子のレプリコンのＮＲＴＰへのパッケージングを容易にするパッケージング関連酵素活性をコードする１又は複数の遺伝子と含む第２の核酸コンストラクトを含む。ある実施態様において、パッケージング関連酵素活性をコードする１又は複数の遺伝子は、ｔｅｒＳ遺伝子、ｔｅｒＬ遺伝子、又はｔｅｒＳとｔｅｒＬ遺伝子の両方を含む。ある実施態様において、パッケージング関連酵素活性をコードする１又は複数の遺伝子の破壊は、配列番号１、配列番号２又は配列番号３から選択されるヌクレオチド配列の欠失を含む。いくつかの実施態様において、破壊は、欠失、挿入、変異又は置換によるものである。別の実施態様では、レポーター核酸分子は、配列番号４、配列番号５又は配列番号６から選択されるヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、細菌細胞パッケージング系の溶菌期を誘導することと、レポーター分子のレプリコンをパッケージングしてＮＲＴＰを製造することとを含む、前述の細菌細胞パッケージング系からＮＲＴＰを製造する方法に関する。ある実施態様において、パッケージング関連酵素活性をコードする１又は複数の遺伝子は、ｔｅｒＳ遺伝子、ｔｅｒＬ遺伝子、又はｔｅｒＳとｔｅｒＬ遺伝子の両方を含む。ある実施態様において、パッケージング関連酵素活性をコードする１又は複数の遺伝子の破壊は、配列番号１、配列番号２又は配列番号３から選択されるヌクレオチド配列の欠失を含む。別の実施態様では、レポーター核酸分子は、配列番号４、配列番号５又は配列番号６から選択されるヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、前述のＮＲＴＰ製造方法によって製造される、バクテリオファージＡｂｉ ３３に由来するＮＲＴＰ、バクテリオファージＡｂｉ ４９に由来するＮＲＴＰ、バクテリオファージＡｂｉ １４７に由来するＮＲＴＰ、又はこれらの任意の組み合わせを試料に提供する工程、検出可能なシグナルを生成するための条件をレポーター遺伝子に提供する工程、及び検出可能なシグナルの有無を検出して、Ａ．バウマンニの有無を示す工程を含む、試料中のＡ．バウマンニを検出する方法にも関する。ある実施態様では、この方法は、試料にＮＲＴＰを提供する前又は後に、試料に抗菌剤を提供して、検出可能なシグナルの有無を検出し、その試料が抗菌剤に対して耐性又は感受性であるＡ．バウマンニを含むかどうかを示す工程を含む。ある実施態様では、ＮＲＴＰは、配列番号４、配列番号５又は配列番号６から選択されるヌクレオチド配列を含むレポーター核酸分子を含む。
図１ａ：２つのマイオウイルス科ファージの集団を含有するＡｂｉ ３３溶解物のＴＥＭ画像を示す。図１ｂ：サイフォウイルス科ファージを含有するＡｂｉ ４９溶解物のＴＥＭ画像を示す。図１ｃ：サイフォウイルス科ファージを含有するＡｂｉ １４７溶解物のＴＥＭ画像を示す。 欠失／補完戦略を用いたＳｍａｒｔｉｃｌｅｓ非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）技術の模式図を示す。候補ファージの各々を、ｐａｃ部位／ｐａｃ機能を欠失させるように操作し、その後パッケージ関連のＤＮＡ配列及び遺伝子を担持するプラスミドにより補完した。また、相補プラスミドは、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼを担持する。Ｓｍａｒｔｉｃｌｅ ＮＲＴＰは、パッケージング／レポータープラスミドを保有する操作されたプロファージから生成される。 Ａｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７ ＮＲＴＰの製造のためのパッケージング／レポータープラスミドの代表的な模式図である。 Ａ．バウマンニ交差反応性相対光単位（ＲＬＵ）アッセイのグラム（－）株の配置を示している。株の記号は次の通りである：Ｋｐｎ：肺炎桿菌、Ｅｃｏ：大腸菌、Ｋｏｘ：クレブシエラ・オキシトカ、Ｅａｅ：エンテロバクター・エロゲネス、Ｅｃｌ：エンテロバクター・クロアカ、Ｃｆｉ：シトロバクター・フロインデイ、Ｃｋｏ：シトロバクター・コセリ、Ｓｍｓ：霊菌、Ｐａｅ：緑膿菌、Ｐｍｓ：プロテウス・ミラビリス、Ａｂｉ：Ａ．バウマンニ。 図４ａの腸内細菌科及び他のグラム（－）菌に対する交差反応性について試験したＡｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７ Ｓｍａｒｔｉｃｌｅｓ ＮＲＴＰのＲＬＵに基づくカバレッジ（coverage）を示す。ＲＬＵ陽性の結果は観察されなかった。Ｃ１とＧ１のピークは注入スパイク（injection spike）であり、真の陽性シグナルではない。カラム１２のＲＬＵ陽性Ａ．バウマンニ株は、アッセイにおいて陽性対照として用いられ、典型的なＡｂｉ ４９力価を示した。 Ａｂｉパッケージング／レポータープラスミドｐＺＸ０５７の代表的な模式図である。 新規のＡｂｉ ３３ Ｓｍａｒｔｉｃｌｅｓ ＮＲＴＰを生成するための、Ａｂｉ ３３に由来する９２４７ｂｐプラスミドｐＺＸ０５８の代表的な模式図である。 図７－Ｉは、プラスミドｐＺＸ０５８（配列番号４）のアノテーションされたヌクレオチド配列を示す。 図７－ＩＩは、プラスミドｐＺＸ０５８（配列番号４）のアノテーションされたヌクレオチド配列を示す。 図７－ＩＩＩは、プラスミドｐＺＸ０５８（配列番号４）のアノテーションされたヌクレオチド配列を示す。 図７－ＩＶは、プラスミドｐＺＸ０５８（配列番号４）のアノテーションされたヌクレオチド配列を示す。 新規のＡｂｉ ４９ Ｓｍａｒｔｉｃｌｅｓ ＮＲＴＰを生成するための、Ａｂｉ ４９に由来する９４６４ｂｐプラスミドｐＺＸ０６５の代表的な模式図である。 図９－Ｉは、プラスミドｐＺＸ０６５（配列番号５）のアノテーションされたヌクレオチド配列を示す。 図９－ＩＩは、プラスミドｐＺＸ０６５（配列番号５）のアノテーションされたヌクレオチド配列を示す。 図９－ＩＩＩは、プラスミドｐＺＸ０６５（配列番号５）のアノテーションされたヌクレオチド配列を示す。 図９－ＩＶは、プラスミドｐＺＸ０６５（配列番号５）のアノテーションされたヌクレオチド配列を示す。 新規のＡｂｉ １４７ Ｓｍａｒｔｉｃｌｅｓ ＮＲＴＰを生成するための、Ａｂｉ １４７に由来する９７６８ｂｐプラスミドｐＺＸ０６６の代表的な模式図である。 図１１－Ｉ、１１－ＩＩ、１１－ＩＩＩ、及び１１－ＩＶは、プラスミドｐＺＸ０６６（配列番号６）のアノテーションされたヌクレオチド配列を示す。
Ｉ．定義
特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、特に明記されない限り、以下に記載されるように定義される。
本明細書で使用される場合、「レポーター核酸分子」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含むヌクレオチド配列を意味する。レポーター核酸分子は、天然に存在するものでも、人工分子又は合成分子であってもよい。いくつかの実施態様において、レポーター核酸分子は宿主細胞に対して外来性であり、プラスミド又はベクターなどの外来核酸分子の一部として宿主細胞に導入することができる。特定の実施態様において、レポーター核酸分子は、細胞内の標的遺伝子に対して相補的であり得る。他の実施態様では、レポーター核酸分子は、レポーター分子（例：レポーター酵素、タンパク質）をコードするレポーター遺伝子を含む。いくつかの実施態様において、レポーター核酸分子は、「レポーターコンストラクト」又は「核酸レポーターコンストラクト」と称される。
「レポーター分子」又は「レポーター」とは、検出可能又は選択可能な表現型を生物体に付与する分子（例：核酸又はタンパク質）を指す。検出可能な表現型は、例えば比色、蛍光又は発光であり得る。レポーター分子は、発光反応を媒介する酵素（ＬｕｘＡ、ＬｕｘＢ、ＬｕｘＡＢ、Ｌｕｃ、Ｒｕｃ、ｎＬｕｃ）をコードするレポーター遺伝子、比色反応を媒介する酵素（ＬａｃＺ、ＨＲＰ）をコードする遺伝子、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）をコードする遺伝子、親和性ペプチド（Ｈｉｓタグ、３Ｘ－ＦＬＡＧ）をコードする核酸分子、及び選択マーカー（例：ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ｚｅｏＲ、ｈｐｈ、ＣＡＴ、ｅｒｍ）をコードする遺伝子から発現することができる。レポーター分子は、核酸分子又は外来配列（プラスミド）を細胞内にうまく取り込むためのマーカーとして使用することができる。レポーター分子はまた、本明細書に記載されるように、標的遺伝子、標的核酸分子、標的細胞内分子又は細胞の存在を示すために用いることができる。或いは、レポーター分子は、アプタマー又はリボザイムなどの核酸であり得る。
本発明のいくつかの態様において、レポーター核酸分子は、プロモーターに作動可能に連結される。本発明の他の態様において、プロモーターは、他の細胞ではなく特定の細胞（例：特定の種）におけるプロモーターの活性に基づいてレポーター系の反応性及び交差反応性に寄与するように選択又は設計することができる。特定の態様において、レポーター核酸分子は複製開始点を含む。他の態様では、複製開始点の選択は、標的細胞内のレポーター核酸分子の複製が他の細胞ではなく特定の細胞（例：特定の種）における複製開始点の活性に基づいてレポーターシグナル生成に寄与するか又は必要とされる場合、同様にレポーター系の反応性及び交差反応性に寄与することができる。いくつかの実施態様において、レポーター核酸分子は、ウイルス複製中に子孫ウイルスにコンカテマーＤＮＡとしてパッケージングされ得るレプリコンを形成する。
本明細書で使用される場合、「標的転写物」とは、標的遺伝子の転写時に形成されるものと一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡとを含む、標的細胞によって自然に形成されるＤＮＡ配列又はｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の一部を指す。標的転写物は、細胞転写物又は天然に存在する転写物と呼ばれることもある。
本明細書で使用される場合、「転写物」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ鋳型配列又は遺伝子から転写されたヌクレオチド配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の長さを意味する。転写物は、ＲＮＡ鋳型から転写されるｃＤＮＡ配列、又はＤＮＡ鋳型から転写されるｍＲＮＡ配列であり得る。転写物は、タンパク質コーディング又はノンコーディングであり得る。転写物はまた、操作された核酸コンストラクトから転写され得る。
レポーター核酸分子に由来する転写物を「レポーター転写物」と呼ぶことができる。レポーター転写物は、レポーター配列とシス抑制配列とを含み得る。レポーター転写物は相補性の領域を形成する配列を有することができ、その結果、転写物は二本鎖を形成する２つの領域（例：分子間二本鎖領域）を含む。一方の領域は、「シス抑制配列」と呼ばれ、標的転写物及び／又はレポーター配列の一部又は全部に相補性を有する。転写物の第２の領域は、「レポーター配列」と呼ばれ、シス抑制配列と相補性を有し得る。相補性は、完全な相補性であっても実質的な相補性であってもよい。シス抑制配列とレポーター配列の存在及び／又は結合は、レポーター転写物中にコンホメーションを形成することができ、これによりレポーター分子のさらなる発現をブロックすることができる。レポーター転写物は、ヘアピン構造などの二次構造を形成することができ、その結果、互いに相補的なレポーター転写物内の領域は、互いにハイブリダイズすることができる。
核酸分子又は外来配列（例：プラスミド、ベクター、コンストラクト）に言及する際の「細胞に導入する」とは、当業者が理解するように、細胞への取り込み又は吸収を促進することを意味する。核酸コンストラクト又は転写物の吸収又は取り込みは、自発的拡散性又は能動的な細胞プロセスを通じて、又はバクテリオファージ、ウイルス、及び形質導入粒子の使用を含む補助剤又は装置によって起こり得る。この用語の意味は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞に限定されるものではない；核酸分子もまた、生物体の一部である「細胞に導入」されることがある。そのような場合、細胞への導入は、生物体への送達を含むであろう。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために、本発明の核酸分子、コンストラクト又はベクターを組織部位に注射するか、又は全身的に投与することができる。細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ導入には、エレクトロポレーション及びリポフェクションなどの、当技術分野で知られている方法が含まれる。さらなるアプローチは、本明細書に記載されているか、当技術分野で既知である。
「形質導入粒子」とは、非ウイルス核酸分子を細胞内に送達することができるウイルスを意味する。このウイルスは、バクテリオファージ、アデノウイルスなどであり得る。
「非複製的形質導入粒子」又は「ＮＲＴＰ」とは、非ウイルス核酸分子を細胞内に送達することができるが、それ自身の複製されたウイルスゲノムを形質導入粒子内にパッケージングすることができないウイルスを意味する。このウイルスは、バクテリオファージ、アデノウイルスなどであり得る。
「プラスミド」とは、細胞内の染色体ＤＮＡと物理的に分離し、独立して複製することができる小さなＤＮＡ分子である。プラスミドは、細菌では小さな環状の二本鎖ＤＮＡ分子として最も一般的に見られるが、古細菌及び真核生物にも時に存在する。プラスミドは、レプリコンと考えられ、適当な宿主内で自律的に複製することができる。
「ベクター」とは、別の細胞に外来性遺伝物質を人工的に運ぶためのビヒクルとして使用される核酸分子であり、そこで複製及び／又は発現させることができる。
「ウイルス」は、他の生物体の生きている細胞の内部でのみ複製する小さな感染性物質である。ウイルス粒子（ビリオンとして知られる）には、次の２つ又は３つの部分：ｉ）遺伝情報を運ぶＤＮＡ又はＲＮＡ分子のいずれかからつくられる遺伝物質、ｉｉ）これらの遺伝子を保護するタンパク質コート、及び場合によっては、ｉｉｉ）９３８８である脂質のエンベロープが含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「補体」は、破壊された同一配列の存在下にある非破壊配列を指すか、又は破壊されていない配列の破壊された配列に対する関係を指す。ある実施態様において、補体は、機能性であり且つ発現することができる細胞内のポリヌクレオチド上にコードされた遺伝子を含み、破壊前にバクテリオファージ上で破壊された遺伝子と同じ機能を有するタンパク質を発現する。いくつかの実施態様において、補体遺伝子は、破壊前の破壊されたバクテリオファージ遺伝子、すなわち天然バクテリオファージ遺伝子に対して８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を超える配列同一性を有する。いくつかの実施態様において、補体遺伝子は、破壊されたバクテリオファージ遺伝子の破壊前、すなわち天然のバクテリオファージ遺伝子と同一である。いくつかの実施態様において、補体遺伝子は、バクテリオファージから欠失されたポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施態様において、補体遺伝子は、同じ遺伝子がバクテリオファージ中で破壊された、プラスミド上のバクテリオファージのパッケージング機構をコードする遺伝子を指す。したがって、プラスミドは、ポリヌクレオチドを形質導入粒子にパッケージングするのに必要なパッケージング機構を提供するために、変異したパッケージング機構遺伝子を伴ったバクテリオファージの存在下にあることが必要である。
本明細書で使用される場合、用語「パッケージング関連酵素活性」は、ポリヌクレオチドを形質導入粒子にパッケージングするためのパッケージング開始部位配列との相互作用に極めて重要な１又は複数のポリペプチドを指す。いくつかの実施態様において、各ターミナーゼがパッケージング関連酵素活性をコードするこのような相互作用には一対のターミナーゼ遺伝子が必要である。いくつかの実施態様において、酵素活性は、本発明で発見されたＡ．バウマンニバクテリオファージ由来のｔｅｒＳ及び／又はｔｅｒＬ遺伝子によってコードされる。これらの実施態様において、一対のターミナーゼ遺伝子の各々がパッケージング関連酵素活性を発現しており、パッケージング開始部位を有するポリヌクレオチドのパッケージングには両方の機能的なバージョンが必要である。いくつかの実施態様において、パッケージング関連酵素活性に関連する複数の遺伝子のうち１つ遺伝子の破壊は、パッケージング関連酵素活性を排除する。いくつかの実施態様において、一対のターミナーゼ遺伝子の両方は、バクテリオファージゲノム上で破壊されており、したがってバクテリオファージ上の遺伝子をコードするパッケージング関連酵素活性のセット全体を破壊されている。
用語「改善する」とは、例えば病状の予防、重症度若しくは進行の軽減、寛解又は治癒など、病状の治療における治療上有益な結果を意味する。
用語「ｉｎ ｓｉｔｕ」とは、生物体とは別個に成長する生細胞の中で起こるプロセス、例えば組織培養で成長することを指す。
用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、生物体内で起こるプロセスを指す。
用語「哺乳動物」には、本明細書で使用される場合、ヒト及び非ヒトの両方が含まれ、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、及びブタが含まれるが、これらに限定されない。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」及び「Ｕ」はそれぞれ一般に、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルを含むヌクレオチドを表す。「Ｔ」及び「ｄＴ」は本明細書中で互換的に使用され、核酸塩基がチミン、例えばデオキシリボチミンであるデオキシリボヌクレオチドを指す。しかしながら、用語「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」又は「デオキシリボヌクレオチド」はまた、修飾ヌクレオチド（後で詳述する）又は代理置換部分を指すことができることが理解されるであろう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルが、そのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変化させることなく、他の部分によって置換され得ることを十分に認識しているであろう。例えば、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、限定されないが、アデニン、シトシン又はウラシルを含むヌクレオチドと塩基対を形成し得る。したがって、ウラシル、グアニン又はアデニンを含むヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列中で、例えばイノシンを含むヌクレオチドによって置換され得る。このような置換部分を含む配列は、本発明の実施態様である。
本明細書で使用される場合、用語「相補的」とは、第２のヌクレオチド配列に関連して第１のヌクレオチド配列を記述するために使用される場合、当業者が理解しているように、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと特定の条件下でハイブリダイズし、二本鎖構造を形成する能力を指す。相補配列はまた、互いに結合するものとして説明され、結合親和性によって特徴付けられる。
例えば、第１のヌクレオチド配列は、２つの配列がストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする（例えばアニーリングする）場合、第２のヌクレオチド配列と相補的であると説明することができる。ハイブリダイゼーション条件には、アニーリング工程及び／又は洗浄工程のための温度、イオン強度、ｐＨ、及び有機溶媒濃度が含まれる。「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」という用語は、第１のヌクレオチド配列がその標的配列、例えば第２のヌクレオチド配列に優先的にハイブリダイズし、程度は低いが他の配列にもハイブリダイズする、又は全くハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、配列に依存しており、環境パラメーターが異なれば異なる。一般に、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、規定のイオン強度及びｐＨにおけるヌクレオチド配列の熱融点（thermal melting point）（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、第１のヌクレオチド配列の５０％が完全に一致した標的配列にハイブリダイズする（規定のイオン強度とｐＨの下での）温度である。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範な指針は、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－－ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ 第１部、第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（「Ｔｉｊｓｓｅｎ」）に見いだされる。生物体の内部で遭遇する可能性のある生理学的に適切な条件など、他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に従って、２つの配列の相補性の試験に最も適する条件のセットを決定することができるであろう。
これは、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの、第１及び第２のヌクレオチド配列の全長にわたる第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドへの塩基対形成を含む。これら配列は、本明細書中では互いに対して「完全に相補的である」ということが可能である。しかしながら、第１の配列が本明細書中の第２の配列に対して「実質的に相補的」と称される場合、その２つの配列は、完全に相補的であってもよいし、最終的な用途に最も関連する条件下でハイブリダイズする能力を保持しつつ、ハイブリダイゼーションの際に１つ以上、しかし一般的には４、３又は２つ以下のミスマッチ塩基対を形成してもよい。しかし、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションの際に１又は複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、そのようなオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチとはみなされないものとする。例えば、長さが２１ヌクレオチドの１つのオリゴヌクレオチドと長さが２３ヌクレオチドの別のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡであって、より長いオリゴヌクレオチドが、より短いオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡでも、本明細書に記載される場合、「完全に相補的」と称され得る。
本明細書で使用される場合、「相補」配列はまた、非ワトソン・クリック塩基対、並びに／又は非天然及び修飾ヌクレオチドから形成された塩基対を、それらのハイブリダイズする能力に関する上記要件が満たされる限りにおいて、含むか又はそれらから完全に形成されてもよい。このような非ワトソン・クリック塩基対は、Ｇ：Ｕゆらぎ又はフーグスティーン塩基対合を含むが、これらに限定されない。
本明細書中の「相補的」、「完全に相補的」及び「実質的に相補的」という用語は、これらの使用の文脈から理解されるように、ｄｓＲＮＡの２本の鎖の間、又はｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間、一本鎖ＲＮＡ配列の相補鎖間若しくは一本鎖ＤＮＡ配列の相補鎖間の塩基マッチングに関して使用され得る。
本明細書で用いられる場合、「二本鎖構造」は、２つの逆平行で実質的に相補的な核酸配列を含む。核酸コンストラクト内、２つの転写物間、転写物内の２つの領域間、又は転写物と標的配列との間の相補配列は、「二本鎖構造」を形成し得る。一般に、各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳述するように、各鎖又は両鎖は、少なくとも１つの非リボヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチドも含み得る。二本鎖構造を形成している２本の鎖は、１つのより大きなＲＮＡ分子の異なる部分であってもよいし、別々のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が１つのより大きな分子の一部であり、したがって一方の鎖の３’末端と二本鎖構造を形成するそれぞれのもう一方の鎖の５’末端との間の途切れのないヌクレオチド鎖によって連結されている場合、この連結しているＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と呼ばれる。二本鎖が二本鎖構造を形成している一方の鎖の３’末端とそれぞれのもう一方の鎖の５’末端との間で、中断されていないヌクレオチド鎖以外の手段で共有結合している場合、その連結構造は「リンカー」と呼ばれる。これらのＲＮＡ鎖のヌクレオチドの数は、同じでも異なっていてもよい。塩基ペアの最大数は、二本鎖の最も短い鎖のヌクレオチド数から二本鎖に存在するオーバーハングを差し引いたものである。一般に、二本鎖構造の長さは、１５～３０、又は２５～３０、又は１８～２５、又は１９～２４、又は１９～２１、又は１９、２０若しくは２１塩基対である。ある実施態様において、二本鎖の長さは、１９塩基対である。別の実施態様では、二本鎖の長さは２１塩基対である。２つの異なるｓｉＲＮＡを組み合わせて使用する場合、二本鎖の長さは同じでも異なっていてもよい。
本明細書で使用される場合、「相補性領域」という用語は、本明細書に定義されているように、配列、例えば標的配列に対して実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が標的配列に対して完全には相補的でない場合、ミスマッチは、存在する場合、末端領域において最も許容され、一般的に一方の末端領域又は両末端領域内に、例えば５’及び／又は３’末端の６、５、４、３又は２ヌクレオチド内にある。
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「パーセント同一性」という用語は、以下に記載される配列比較アルゴリズムの１つ（例えばＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ又は当業者が利用可能な他のアルゴリズム）を用いて、又は目視によって測定して、最大の対応関係を得るために比較され、配列された場合に同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基を特定のパーセンテージ有する２つ以上の配列又はサブ配列を指す。用途に応じて、パーセント「同一性」は、比較される配列の領域にわたって、例えば機能ドメインにわたって存在することもあれば、代わりに、比較される２つの配列の全長にわたって存在することもある。
配列比較のために、典型的には、１つの配列が参照配列として機能し、これと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。その後、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅの中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、又は目視検査によって（概略は、下記のＡｕｓｕｂｅｌら参照）によって実行することができる。
パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information)（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）で公開されている。
用語「十分量」とは、所望の効果を生じるのに十分な量、例えば、細胞から検出可能なシグナルを生成するのに十分な量を意味する。
用語「治療有効量」は、疾患の症状を改善するのに有効な量である。治療有効量は、予防を治療と考えることができることから、「予防的に有効な量」とすることができる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの」（「ａ」、「ａｎ」）及び「その」（「ｔｈｅ」）は、文脈から判断して明らかにそうでないと分かる以外は、複数の指示物を含むことに留意されたい。
ＩＩ．ウイルスの溶原及び溶菌サイクル
ウイルスは、宿主細胞内で溶原サイクルと溶菌サイクルに入る。溶原サイクルが採用されれば、ファージ染色体は、細菌染色体に組み込まれるか、又は宿主内で安定したプラスミドとして確立され、長期間休眠状態を保つことができる。溶原菌が誘導されると、ファージゲノムは、細菌の染色体から切り出され、溶菌サイクルが始まり、最終的に細胞の溶菌とファージ粒子の放出が起こる。溶菌サイクルにより、新たなファージ粒子が製造され、宿主の溶解によって放出される。
さらに、ファージに基づくレポーターなどのウイルスに基づくレポーターアッセイでは、宿主ベース及びプロファージ由来のファージ耐性機構によって引き起こされるファージ宿主域の制限が原因で反応性が限定されてしまう（すなわち分析的包括性）可能性がある。これらの耐性機構は、天然ファージ核酸を標的とし、ファージのＤＮＡ及び機能を分解するか、さもなければ阻害することができる。このような耐性機構には、ファージＤＮＡを切断する制限系と、ファージ由来の転写物を阻害するＣＲＩＳＰＲ系が含まれる。
溶菌活性及びファージ耐性は両方とも、レポーターファージに基づくアッセイに対して阻害的であり得る。溶菌活性は、検出可能なシグナルを生成する細胞の能力を破壊するか、さもなければ阻害することによって、シグナルを阻害することができ、したがって、検出可能なシグナルの量を減少させるか、又は検出可能なシグナルの生成を妨げることによって、検出限界に影響を及ぼし得る。ファージ耐性機構は、ファージの宿主域を制限し、且つ、ファージに基づくレポーターの包括性を限定することができ、同様に、検出可能なシグナルの量を減少させるか又は検出可能なシグナルの生成を妨げることによって、検出限界に影響を及ぼす。ファージＤＮＡのレポーターファージへの取り込みによって引き起こされる溶菌活性及びファージ耐性の両方とも、これらのファージレポーターを組み込んだアッセイにおいて偽陰性結果をもたらす可能性がある。
ＩＩＩ．非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）の製造方法
非複製的形質導入粒子を製造するための破壊／補完に基づく方法
本明細書に開示されているのは、ウイルス生成中にゲノムパッケージングが開始されるエレメントとしてウイルスパッケージング機構によって認識されるウイルスのゲノムの要素の破壊に基づく、本明細書ではＳｍａｒｔｉｃｌｅｓ系とも呼ばれる非複製的形質導入粒子パッケージング系である。ある実施態様において、この破壊は、バクテリオファージからのパッケージング開始部位を破壊し、ターミナーゼ機能も破壊する。破壊されたエレメントの例には、ｐａｃ型バクテリオファージのｐａｃ部位配列とｃｏｓ型バクテリオファージのｃｏｓ部位配列とが含まれる。ファージ内のパッケージング開始部位配列が破壊されると、ファージは機能性ターミナーゼを生成することができない。一例では、ｐａｃ部位は、ｐａｃＡ遺伝子配列内にコードされており、ターミナーゼ機能には、機能性ＰａｃＡとＰａｃＢの両方が必要である。プラスミドＤＮＡは、前記破壊されたターミナーゼを補完することと、プラスミドＤＮＡ上の認識可能なパッケージング開始部位を含むこととによって、ファージカプシドにパッケージングされる。
パッケージング開始部位は、ウイルス生成に必須な遺伝子のコード領域内にしばしば見いだされる。バクテリオファージゲノムの領域は、パッケージング開始部位を破壊する挿入、置換、欠失又は変異によって破壊され得る。これを達成する破壊の例には、パッケージング開始部位配列を含むバクテリオファージゲノム上の配列を抗生物質耐性遺伝子の配列などの別の配列に置き換える対立遺伝子交換事象、又は小ターミナーゼ遺伝子及び大ターミナーゼ遺伝子の完全な欠失が含まれるが、これらに限定されない。ターミナーゼ遺伝子ｐａｃＡ及びｐａｃＢを採用する例において、ｐａｃＡは、ＰａｃＡ及びＰａｃＢによって媒介されるｐａｃＢ発現及び／又は全体的なターミナーゼ機能も破壊する極性効果を引き起こす方法で破壊され得る。他の例には、ターミナーゼ遺伝子の破壊が含まれ、また、本発明で発見されたＡ．バウマンニバクテリオファージ由来のｔｅｒＳ遺伝子及びｔｅｒＬ遺伝子も含まれ得る。
一例では、パッケージング開始部位が破壊されたウイルスゲノムを用いて、細胞のゲノムが溶原化される。この細胞は、グラム陰性又はグラム陽性であり得る。補完するプラスミド（又はレポーター核酸分子）を細胞に導入し、プラスミドＤＮＡは、少なくともバクテリオファージにおいて破壊された遺伝子、並びにパッケージング開始部位配列と、任意選択的に追加のバクテリオファージ遺伝子及びレポーター遺伝子とを含み、これらは検出可能な及び／又は選択マーカーをコードすることができる。プラスミドは、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，３８８，４５３号において見いだされる方法を用いて構築することができる。プラスミドの１以上の遺伝子は、プロモーター、例えば誘導性プロモーター（バクテリオファージを誘導することによってパッケージングが開始されるときに誘導され得るもの）に作動可能に連結され得る。いくつかの実施態様において、プロモーターは、小ターミナーゼ遺伝子（ｔｅｒＳ）又は大ターミナーゼ（ｔｅｒＬ）遺伝子の天然プロモーターであり得る。天然プロモーターはバクテリオファージによって制御されるため、パッケージングの際に誘導される条件付きプロモーターとして効果的に作用する。
いくつかの例では、変異ウイルスＤＮＡと補完する外来ＤＮＡとの間に相同性がないように破壊／補完を設計することが好ましい。これは、変異ウイルスＤＮＡと補完する外来ＤＮＡとの間の相同性の欠如が、ウイルスゲノムへのパッケージング配列の再導入をもたらす可能性のある、２つのＤＮＡ分子間の相同組換えの可能性を回避するためである。相同性の欠如を達成するための１つの戦略は、パッケージング開始部位配列を含む遺伝子全体（又は個々の遺伝子）をウイルスゲノムから欠失させ、その後、好ましくはウイルスから欠失させたＤＮＡ配列しか正確には含まない外来ＤＮＡ分子でこの遺伝子を補完することである。この戦略では、補完するＤＮＡ分子を設計して、ウイルスから欠失させた遺伝子を発現させる。このような系のもう一つの例は、ｐａｃ型ファージであるバクテリオファージφ８０αを用いて提供される。ファージゲノムは、宿主細菌細胞で溶原化され、ファージゲノムは、ｐａｃ型プロファージφ８０αのｐａｃ部位が欠失した小さなターミナーゼ遺伝子を含む。天然のｐａｃ部位を有する相補的で小さなターミナーゼ遺伝子を含むプラスミドを細胞に形質転換する。溶原化したプロファージの溶菌サイクルが誘導されると、バクテリオファージパッケージング系は、天然のバクテリオファージＤＮＡをパッケージングするのではなく、プラスミドＤＮＡを子孫のバクテリオファージの構造要素にパッケージングする。このように、パッケージング系は、プラスミドＤＮＡを担持する非複製的形質導入粒子を製造する。
ファージは生物圏で最も豊富な生命形態であり（Clokie et al.、 2011）、シーケンシングされた細菌ゲノムの７０％にはプロファージ様の構造が含まれている（Chen, et al.、 2006）。Ｔｏｕｃｈｏｎらは、１３３のアシネトバクター属菌（Acinetobacter spp.）の細菌ゲノムを解析したところ、完全なプロファージ（すなわち細菌ゲノムに組み込まれたファージ）が優勢であることを観察した（Touchon et al., 2014）。この自然界に豊富に存在するプロファージを利用して、この種内でも幅広い宿主域を持つ、Ａ．バウマンニに特異的な新規ファージを分離した。このファージは、非複製的形質導入粒子に変換され、発光アッセイにおいて良好な包含性と排他性が得られた。
Ａ．バウマンニ株の広範な遺伝的多様性及びゲノム可塑性（Sahl, JW et al., 2015; Snitkin et al., 2011）を考慮して、Ａ．バウマンニ細胞上のファージ受容体における潜在的多様性を説明するために、単一アッセイにおいて非複製的形質導入粒子をカクテルとして組み合わせた。その際、アッセイにおけるＡ．バウマンニ株の包括性は干渉作用なしに改善した。このアプローチは、ファージ療法においてファージカクテルが治療的に用いられるのと同じ方法（Chan, BK et al., 2013）で行われた。この技術の利点は、ファージが溶菌ライフサイクルを完了したり、細菌の宿主防御機構に遭遇したりする必要がなく、アッセイが短時間で起こる発光反応とＤＮＡ送達のみを必要とすることである。
レポーター遺伝子は、検出可能なマーカー又は選択マーカーをコードする。一例では、レポーター遺伝子は、発光反応を媒介する酵素（ＬｕｘＡ、ＬｕｘＢ、ＬｕｘＡＢ、Ｌｕｃ、Ｒｕｃ、ｎＬｕｃ）、比色反応を媒介する酵素（ＬａｃＺ、ＨＲＰ）、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）、親和性ペプチド（Ｈｉｓタグ、３Ｘ－ＦＬＡＧ）、及び選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）からなる群から選択される。一実施態様において、レポーター遺伝子は、ｌｕｘＡである。いくつかの実施態様において、耐性マーカーは、抗生物質耐性遺伝子を含む。いくつかの実施態様において、耐性マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）である。いくつかの実施態様において、構成的プロモーターは、ｐＢｌａ（アンピシリン耐性遺伝子のためのプロモーター）を含む。いくつかの実施態様において、バクテリオファージゲノム破壊は、パッケージング開始部位配列を含むバクテリオファージゲノム上の配列を置換又は破壊する対立遺伝子交換事象によって達成される。
一例では、バクテリオファージゲノム上のターミナーゼ遺伝子の対（例えばｔｅｒＳとｔｅｒＬ）を、一方のターミナーゼ遺伝子の発現及び／又は両方のターミナーゼ遺伝子によって媒介される全体的なターミナーゼ機能をも破壊する極性効果を引き起こす方法で破壊することができる。破壊されたバクテリオファージは、バクテリオファージゲノムのターミナーゼ遺伝子、例えばｔｅｒＳとｔｅｒＬを含むプラスミドで補完することができる。変異ウイルスが溶菌サイクルに入っているとき、バクテリオファージのゲノム又は（破壊された場合には）補完するプラスミドのいずれかから生成されたウイルスパッケージングタンパク質は、パッケージング開始部位を含んでいるため、プラスミドＤＮＡのレプリコンをパッケージングユニットにパッケージングし、複製されたプラスミドＤＮＡを担持する非複製的形質導入粒子が生成される。
ＶＩ．レポーター
いくつかの実施態様において、本発明のＮＲＴＰ及びコンストラクトは、レポーター遺伝子を含むレポーター核酸分子を含む。レポーター遺伝子は、レポーター分子をコードすることができ、レポーター分子は検出可能なマーカー又は選択マーカーとすることができる。特定の実施態様において、レポーター遺伝子は、細胞内で発現された場合に検出可能なシグナルを生成するレポーター分子をコードする。
特定の実施態様において、レポーター分子は、限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）又はｍＣｈｅｒｒｙ、及び近赤外蛍光タンパク質などの蛍光レポーター分子としてもよい。
他の実施態様では、レポーター分子は、発光反応を媒介する酵素（ＬｕｘＡ、ＬｕｘＢ、ＬｕｘＡＢ、Ｌｕｃ、Ｒｕｃ、ｎＬｕｃ等）であってもよい。レポーター分子には、細菌ルシフェラーゼ；真核生物ルシフェラーゼ；比色検出に適した酵素（ＬａｃＺ、ＨＲＰ）；親和性ペプチド（Ｈｉｓタグ、３Ｘ－ＦＬＡＧ）などの免疫検出に適したタンパク質；アプタマーとして機能する核酸、又は酵素活性（リボザイム）を示す核酸、又は抗生物質耐性遺伝子（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）などの選択マーカーが含まれ得る。当技術分野で既知の他のレポーター分子は、標的核酸又は細胞を検出するためのシグナルを生成するために使用することができる。
他の態様において、レポーター分子は、核酸分子を含む。いくつかの態様において、レポーター分子は、特異的結合活性を有するアプタマーであるか、又は酵素活性を示すアプタマー（例えばアプタザイム、ＤＮＡザイム、リボザイム）である。
レポーター及びレポーターアッセイは、本明細書のセクションＶで詳述されている。
Ｖ．ＮＲＴＰとレポーターアッセイ
誘導物質レポーターアッセイ
いくつかの実施態様において、本発明は、生細胞内の遺伝子プロモーターを標的とする内在性又は天然の誘導物質と共に使用するためのレポーター分子としての、ＮＲＴＰの使用方法を含む。本発明のＮＲＴＰは、実施例１～２のセクションＩＩＩとそれ以降に記載する方法を用いて操作することができる。
いくつかの実施態様において、この方法は、ＮＲＴＰをレポーターとして使用することを含み、ＮＲＴＰは、標的細胞内の標的遺伝子の発現を制御する誘導性プロモーターに作動可能に連結されるレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子を含むＮＲＴＰを標的細胞に導入すると、レポーター核酸分子中の標的遺伝子プロモーターの誘導を介してレポーター遺伝子の発現が可能となる。
転写物
上述のように、転写物は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ鋳型配列又は遺伝子から転写されるヌクレオチド配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の長さである。転写物は、ＲＮＡ鋳型から転写されるｃＤＮＡ配列、又はＤＮＡ鋳型から転写されるｍＲＮＡ配列であり得る。転写物は、操作された核酸コンストラクトから転写することができる。転写物は、それ自体の中に相補性の領域をもつことができ、その結果、転写物は分子内二本鎖を形成できる２つの領域を含むようになる。一つの領域は、レポーター配列に結合し、その翻訳を阻止する「シス抑制配列」と呼ぶことができる。転写物の第２の領域は、検出可能なマーカー又は選択マーカーなどのレポーター分子をコードする「レポーター配列」と呼ばれる。
本発明の転写物は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長であり得る転写物配列とすることができる。他の実施態様では、転写物は、少なくとも２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００又はそれ以上のヌクレオチド長であり得る。シス抑制配列とレポーター配列は、同じ長さであっても、異なる長さであってもよい。
いくつかの実施態様において、シス抑制配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０又はそれ以上のスペーサーヌクレオチドによってレポーター配列から隔てられている。
ベクター
別の態様において、本発明の転写物（アンチセンス及びセンス配列を含む）は、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現される（例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10;Skillern, A., et al., 国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２２１１３、Ｃｏｎｒａｄ、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２２１１４、及びＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号参照）。これらの配列は、線状コンストラクト、環状プラスミド又はバクテリオファージに基づくベクターを含むウイルスベクターとして導入することができ、これらは、宿主ゲノムに組み込まれた導入遺伝子として取り込まれ、遺伝され得る。転写物は、染色体外プラスミドとして遺伝することを可能にするように構築することもできる（Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292）。
転写配列は、発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写され得る。一実施態様において、シス抑制配列及びレポーター配列は、転写物がステム及びループ構造を有するように、リンカーポリヌクレオチド配列によって連結された逆方向反復として発現される。
組換え発現ベクターを用いて、本発明の転写物を発現させることができる。組換え発現ベクターは、一般に、ＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターである。転写物を発現するウイルスベクターは、限定されないが、アデノ関連ウイルス（概説については、Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)参照）；アデノウイルス（例えば、Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld et al. (1991, Science 252:431-434）、及びRosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155）参照）；又はアルファウイルス、及びその他当技術分野で既知のものに基づいて構築することができる。レトロウイルスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで、上皮細胞を含む多くの異なる細胞型にさまざまな遺伝子を導入するために使用されてきた（例えば、Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-19 ; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150:4104-4115；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０７１３６；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２４６８；ＰＣＴ出願ＷＯ８９／０５３４５；及びＰＣＴ出願ＷＯ９２／０７５７３参照）。細胞のゲノムに挿入された遺伝子を形質導入及び発現することができる組換えレトロウイルスベクターは、組換えレトロウイルスゲノムを、ＰＡ３１７及びＰｓｉ－ＣＲＩＰのような適切なパッケージング細胞株にトランスフェクトすることによって製造することができる（Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349）。組換えアデノウイルスベクターは、感受性宿主（例：ラット、ハムスター、イヌ、及びチンパンジー）中の多種多様な細胞及び組織に感染させるために使用することができ（Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease,166:769）、且つ、感染のために有糸分裂活性細胞を必要としないという利点を有する。
発現させる転写物のコード配列を受け入れることができる任意のウイルスベクター、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例：レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス等に由来するベクターを用いることができる。ウイルスベクターの向性は、他のウイルス由来のエンベロープタンパク質又は他の表面抗原でベクターをシュードタイピングすることによって、又は必要に応じて異なるウイルスカプシドタンパク質を置換することによって改変することができる。
例えば、本発明で特徴的なレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ等からの表面タンパク質でシュードタイプ化することができる。本発明で特徴的なＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するようにベクターを操作することにより、異なる細胞を標的とすることができる。異なるカプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技法は、当業者の範囲内であり、例えば、開示の全体が参照により本明細書に組み込まれるＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅら（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１－８０１を参照されたい。
本発明での使用に適した組換えウイルスベクターの選択、ベクターに転写物を発現させるための核酸配列を挿入する方法、及び目的の細胞にウイルスベクターを送達する方法は、当業者の範囲内である。例えば、Ｄｏｒｎｂｕｒｇ Ｒ（１９９５），Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．２：３０１－３１０；Ｅｇｌｉｔｉｓ Ｍ Ａ（１９８８），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８－６１４；Ｍｉｌｌｅｒ Ａ Ｄ（１９９０），Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ．１：５－１４；Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｗ Ｆ（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２５－３０；及びＲｕｂｉｎｓｏｎ Ｄ Ａら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１－４０６（これらの開示の全体は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
ウイルスベクターは、ＡＶ及びＡＡＶに由来し得る。本発明で特徴的な転写物を発現するのに適したＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、及びベクターを標的細胞に送達する方法は、Ｘｉａ Ｈら（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６－１０１０に記載されている。本発明で特徴的な転写物を発現するのに適したＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、及びベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒら（１９８７），Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６－３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊら（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０－５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒら（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２－３８２６；米国特許５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際特許出願番号ＷＯ９４／１３７８８、及び国際特許出願番号ＷＯ９３／２４６４１に記載されている（これらの開示の全体は参照により本明細書に組み込まれる）。
本発明で特徴的なＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターのいずれかにおける転写物発現を駆動するプロモーターは、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（例：リボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例：ＣＭＶ初期プロモーター又はアクチンプロモーター又はＵ１ ｓｎＲＮＡプロモーター）、又は一般にＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例：Ｕ６ ｓｎＲＮＡ又は７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）、又は原核生物プロモーター、例えばＴ７プロモーター（但し、発現プラスミドがＴ７プロモーターからの転写に必要なＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコードすることを条件とする）であってもよい。プロモーターはまた、導入遺伝子発現を膵臓に向けることができる（例えば、膵臓のためのインスリン調節配列（Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515）参照）。
さらに、転写物の発現は、例えば、特定の生理学的調節因子（例えば循環グルコースレベル又はホルモン）に感受性である調節配列などの誘導可能な調節配列及び発現系を用いることによって正確に調節することができる（Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24）。細胞又は哺乳類における導入遺伝子発現の制御に適したこのような誘導性発現系には、エクジソンによる調節、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学的誘導物質、及びイソプロピル－ベータ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節が含まれる。当業者であれば、ｄｓＲＮＡ導入遺伝子の用途に基づいて、適切な調節／プロモーター配列を選択することができるであろう。
一般に、転写分子を発現できる組換えベクターは、以下に記載するように送達され、標的細胞内に存続する。代替的に、転写物分子の一過性発現を提供するウイルスベクターを使用することができる。このようなベクターは、必要に応じて反復投与することができる。発現すると、転写物は標的ＲＮＡに結合し、その機能又は発現を調節する。転写物発現ベクターの送達は、静脈内投与又は筋肉内投与、患者から外植された標的細胞への投与とその後の患者への再導入、又は所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段によるなど、全身的であり得る。
転写物発現ＤＮＡプラスミドは、典型的には、カチオン性脂質担体（例：オリゴフェクタミン）又は非カチオン性脂質ベースの担体（例：Ｔｒａｎｓｉｔ－ＴＫＯＴＭ）との複合体として標的細胞にトランスフェクトされる。単一のＰＲＯＣ遺伝子又は複数のＰＲＯＣ遺伝子の異なる領域を標的とするｄｓＲＮＡ媒介ノックダウンのための、１週間以上にわたる複数の脂質トランスフェクションもまた、本発明によって企図される。宿主細胞へのベクターの導入の成功は、種々の既知の方法を用いてモニターすることができる。例えば、一過性トランスフェクションは、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光マーカーなどのレポーターを用いてシグナル伝達され得る。ハイグロマイシンＢ耐性のような特定の環境因子（例：抗生物質及び薬物）に対する耐性をトランスフェクト細胞に提供するマーカーを用いることで、ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞の安定したトランスフェクションを確保することができる。
組換えＤＮＡを含むベクターの送達は、非生物系又は生物系により行うことができる。エレクトロポレーション（実施例に記載されている）、リポソーム、ウイルス様粒子、ファージ又はウイルスに由来する形質導入粒子、及びコンジュゲーションを含むが、これらに限定されない。
転写物アッセイ用レポーター
いくつかの実施態様において、核酸コンストラクトは、レポーター配列（例：レポーター遺伝子配列）を含む。レポーター遺伝子は、細胞内で発現するとシグナルを生成するレポーター分子をコードする。いくつかの実施態様において、レポーター分子は、検出可能なマーカー又は選択マーカーとすることができる。特定の実施態様において、レポーター分子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、又は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）などの蛍光レポーター分子とすることができる。他の実施態様では、レポーター分子は、化学発光タンパク質とすることができる。
レポーター分子は、細菌ルシフェラーゼ、真核生物ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、比色検出に適した酵素、免疫検出に適したタンパク質、免疫検出に適したペプチド、又はアプタマーとして機能するか又は酵素活性を示す核酸とすることができる。
選択マーカーをレポーターとして用いることもできる。選択マーカーは、例えば抗生物質耐性遺伝子であってもよい。
以下は、本発明を実施するための具体的な実施態様の例である。これらの実施例は、説明を目的として提供されているものにすぎず、いかなる点においても本発明の範囲を限定するように意図されていない。使用した数字（例えば量、温度など）には正確を期すよう努めてきたが、ある程度の実験誤差と偏差は、当然ながら許容されるものとする。
本発明の実施は、特に指示がない限り、当業者の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技法及び薬理学の従来の方法を使用する。上記技法は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，現行版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３版（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ａ巻及びＢ巻（１９９２）を参照されたい。
実施例１：Ａ．バウマンニ分離株由来の新規バクテリオファージの同定と非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）の製造
材料及び方法
細菌株と増殖条件
ＣＤＣ、パスツール研究所、ＩＨＭＡ社からＡ．バウマンニ臨床分離株２８８株のセットを採取し、生化学的試験及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより自家で種を検証した。Ａ．バウマンニが確認された各分離株は、「Ａｂｉ」とそれに続く受け入れの順序に基づく番号で識別された。分離株を、Ｌｕｒｉａ‐Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス中３７℃、２２５ｒｐｍで攪拌しながら、又はＬＢ寒天プレート上３７℃、定常状態で培養した。パッケージングプラスミドを保有する株は、大腸菌クローニング株又はＡ．バウマンニ分離株それぞれについて１５０μｇ／ｍｌ又は２５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢゴールド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を補充したＬＢ Ｌｅｎｎｏｘ（低塩）ブロス又は寒天中での増殖により選択された。遺伝子破壊されたターミナーゼ領域を有するＡ．バウマンニ株は、２００μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カリフォルニア州カールズバッド）又はフレオマイシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を補充したＬＢ Ｌｅｎｎｏｘ（低塩）ブロス又は寒天中で選択された。
溶原ファージの誘導と精製
Ａ．バウマンニ溶原菌株は、ＬＢブロス中３７℃、２２５ｒｐｍの振盪速度で対数期（ＯＤ６００約０．６～０．８）まで増殖させた後、４μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣを添加して、存在する可能性のある溶原性ファージを誘導した。マイトマイシンＣを３０分間処理した後、細胞を３７５０ｒｐｍで１０分間遠心分離し、新鮮ＬＢブロスに再懸濁させた。振盪速度を１５０ｒｐｍに落として３７℃で４時間、細胞をインキュベートした。ファージ含有上清を３７５０ｒｐｍで１０分間遠心分離して細胞片をペレット化し、０．２μＭフィルターユニットに通し、残存する細胞片を除去した。溶解物は、使用するまで４℃で暗所に保存した。
プラーク法（plaquing method）による宿主域評価
Ａ．バウマンニ臨床分離株２８８株のそれぞれを、５ｍＭ ＣａＣｌ２を補充したＬＢブロス中で増殖させた。ＯＤ６００約０．４～０．６の対数期に達すると、０．５％寒天と５ｍＭ ＣａＣｌ２からなる溶解した上層寒天４ｍｌに３００μｌの細菌培養物を加えた。この上層寒天と細菌培養物との混合物をプレーンのＬＢ寒天プレート上に注ぎ、直ちに５μｌの濾過した溶解物でスポッティングした。このプレートを３７℃で一晩インキュベートし、翌日、定義したプラークの有無をスコア化した。
誘導性新規ファージのファージゲノムＤＮＡシーケンシング
ファージゲノムＤＮＡを新規Ａｂｉ ｐｈｉ ３３、４９、及び１４７ファージから分離し、広範なプラーク形成（ｐｌａｑｕｉｎｇ）宿主域を得た。溶解物を１４，０００ｒｐｍで２時間遠心分離してファージをペレット化し、１ｘ ＳＭバッファー中に再懸濁させた。ファージ溶解物をＤＮａｓｅＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カリフォルニア州カールズバッド）で処理し、ファージＤＮＡ分離キット（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ社、カナダオンタリオ州ソロルド）を用いて処理してファージゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を分離した。ＭｉＳｅｑシーケンシングプラットフォーム（ｌｌｕｍｉｎａ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いる新規ファージゲノムシーケンシング、アセンブリ、及びオープンリーディングフレームの推定アノテーション（putative annotation）のために、精製されたファージｇＤＮＡ試料をＡＣＧＴ社（イリノイ州ホイーリング）に送付した。
透過型電子顕微鏡によるファージの可視化
ファージをペレット化するために、ファージ溶解物を１４，０００ｒｐｍ、室温で２時間遠心分離し、５０～１００μｌのＳＭバッファー中に再懸濁させた。陰性染色及び透過型電子顕微鏡検査のため、試料をコロラド大学ボールダー校のＥｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（米国コロラド州ボールダー）に提出した。
ファージパッケージングのためのＡ．バウマンニプラスミドの構築
プラスミドの構築については、結果のセクションで詳述する。本研究で使用した全てのプラスミドを表１に列挙する。
Figure 2022515451000002
ターミナーゼ領域欠失の設計と構築
Ａｒａｎｄａら（Aranda, et al., 2010）が開発した遺伝子破壊法を用いて、二重交差組換え（double-crossover recombination）を介してターミナーゼ領域を選択マーカーに置き換えた。組換えのための基質は、５’末端で６００ｂｐのｔｅｒＳ上流領域が隣接し、３’末端でｔｅｒＬの下流の６００ｂｐが隣接するゼオシン耐性カセット（ｚｅｏＲ）で構成されていた。これらの配列の各々は、Ａｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７ターミナーゼ領域に対して特異的に設計され、ｇＢｌｏｃｋｓ（ＩＤＴ、カリフォルニア州レッドウッドシティ）として合成され、ｐＣＲ－ＢｌｕｎｔＩＩ－ＴＯＰＯベクターにサブクローン化され、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）でＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ精製キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて線状の組換えＤＮＡを精製し、約５μｇ／ｍｌの濃度になるように濃縮した。
ターミナーゼ領域ノックアウトを作製するためのエレクトロコンピテント細胞の調製
Ａ．バウマンニ株を、Ｊａｃｏｂｓら（Jacobs AC, et al., 2014）から改良した方法を用いてエレクトロコンピテントにした。細菌培養物を、ＬＢ Ｌｅｎｎｏｘブロス５０ｍｌ中で３７℃、２２５ｒｐｍで振盪しながら一晩増殖させた。その培養物を５０ｍｌの円錐管に移し、３７５０ｒｐｍ、室温で１０分間遠心分離して、細胞をペレット化した。その後の全ての工程は、室温で実施された。上清をピペッティングにより除去し、細胞ペレットを１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む２５ｍｌ（培養開始時の量の半分）に穏やかに再懸濁させた。その細胞を３７５０ｒｐｍで１０分間ペレット化し、１０％グリセロールでの洗浄を繰り返した。ペレット化細胞を１０％グリセロール１．５ｍｌに再懸濁させた。
エレクトロポレーションによる遺伝子ノックアウト産物の形質転換
線状、組換えＤＮＡ（≦１０μｌ）を、新鮮なエレクトロコンピテント細胞の５０μｌアリコートと混合した。この混合物を１ｍｍのエレクトロポレーションキュベット（Ｂｕｌｌｄｏｇ）に入れ、でＢｉｏ－Ｒａｄ社のＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒで２５μＦ、１００オーム、１．８ｋＶのパルスをかけた。細胞を９００μｌのＳＯＣブロス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で３７℃で２～３時間インキュベートし、細胞の回収と組換え事象が起こるようにした。ゼオシン又はその誘導体、フレオマイシン２００μｇ／ｍｌを含むＬＢ Ｌｅｎｎｏｘ寒天プレート上に細胞をプレーティングした。
補完するプラスミドによるターミナーゼノックアウト株の形質転換
ターミナーゼノックアウト株を、２００μｇ／ｍｌのゼオシン又はその誘導体、フレオマイシンを含むＬＢ Ｌｅｎｎｏｘ中で一晩増殖させた。Ａｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７ターミナーゼノックアウト株の培養物を、前述のようにエレクトロコンピテントにし、それぞれプラスミドｐ３０７４、ｐ３０７５、及びｐ３０７３で形質転換した。形質転換体をゼオシン２００μｇ／ｍｌとハイグロマイシンＢゴールド２５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ Ｌｅｎｎｏｘ寒天上で選択した。
非複製的形質導入粒子の溶解物を作製するための変異株の誘導
ストリークしたばかりのコロニーから、Ａｂｉ ３３ ΔｔｅｒＳＬ：：ｐ３０７４、Ａｂｉ ４９ ΔｔｅｒＳＬ：：：ｐ３０７５、及びＡｂｉ １４７ ΔｔｅｒＳＬ：：：ｐ３０７３を、２２５ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で２５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢゴールドを含むＬＢ Ｌｅｎｎｏｘブロス中で一晩増殖させた。細胞に３％の一晩培養物をＬＢブロスに接種し、ＯＤ６００が１．６～１．８に達するまで２２５ｒｐｍで撹拌しながら３７℃でインキュベートした。ファージ産生を誘導するために、マイトマイシンＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）４μｇ／ｍｌを、１５０ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で４０分間培養物に添加した。マイトマイシンＣを除去するために、細胞を室温で１０分間３７５０ｒｐｍで遠心分離し、ペレットを新鮮ＬＢブロスに再懸濁させた。その培養物を１５０ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で一晩インキュベートした。細胞破片を除去して各溶解物を精製するために、培養物を５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。非複製的形質導入粒子溶解物含有上清を０．２μｍ Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ Ｎａｌｇｅｎｅ Ｒａｐｉｄ Ｆｌｏｗフィルター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に通し、使用まで４℃で遮光して保存した。
非複製的形質導入粒子を含む溶解物の濃度
粗溶解物を４℃で１０，０００ｘｇで１５分間遠心分離して細胞片を除去し、０．２μｍ Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ Ｎａｌｇｅｎｅ Ｒａｐｉｄ Ｆｌｏｗフィルターを通過させることによって濾過滅菌した。滅菌溶解物を１６～１８時間４℃で３０，０００ｘｇで遠心分離し、形質導入粒子をペレット化した。上清を除去した後、ファージペレットを１ｘ ＳＭバッファー（１００ｍＭ ＮａＣｌ、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、５０ｍＭ トリス－ＨＣｌ）中に１０倍又は２０倍の濃度に再懸濁させ、０．２μｍ Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＴＭ Ｎａｌｇｅｎｅ Ｒａｐｉｄ Ｆｌｏｗフィルターを通して再び濾過滅菌した。
非複製的形質導入粒子を有する標的株における発光の検出
９６ウェル株パネルのグリセロールストックをディープウェルプレートのＬＢ Ｍｉｌｌｅｒブロス５００μｌに接種し、５００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で一晩増殖させた。日培養物（day cultures）は、２５ｍＭのＣａＣｌ２及び５０ｍＭのＭｇＣｌ２を補充した８００μｌのＬＢ Ｍｉｌｌｅｒブロス中での一晩培養物１μｌに約１０７ｃｆｕ／ｍｌの開始細胞負荷量（starting cell load）を接種することによって、調製した。細胞を５００ｒｐｍで攪拌しながら３７℃で１．５時間増殖させた。白色９６ウェルプレートで、日培養物１２０μｌと形質導入粒子５０μｌを混合した。形質導入粒子カクテルアッセイのために、１２０μｌの日培養物を、２５μｌの各３ｘ濃縮Ａｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７形質導入粒子と混合した。アッセイプレートを、１００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で２時間インキュベートし、続いて、最適なｌｕｘＡＢ発現を可能にするために、１００ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で３０分間冷却工程を行った。プレートは、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌ装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サンホセ）で、ノナナールを基質として相対光単位（ＲＬＵ）の発光を読み取った。
形質導入粒子（Ｔｃ）スポッティングによる宿主域評価
Ａｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７形質導入粒子の宿主域を、インキュベートした細胞５μｌをスポッティングすることによって評価した（Ｗｅｓｔｗａｔｅｒの論文参照）。発光アッセイの読み取りの直前に、細胞を、２５０μｇ／ｍｌヒグロマイシンＢを含有するＬＢ Ｌｅｎｎｏｘ寒天プレート上にスポットした。プレートを一晩３７℃でインキュベートし、翌日に細菌増殖（すなわち、ハイグロマイシン耐性を付与するプラスミドを保有する形質導入体）の有無をスコア化した。形質導入体を確認し、任意の天然ハイグロマイシン耐性細胞を除去するために、コロニーをＬＢブロスに再懸濁させ、ＲＬＵ放出について試験した。
結果
広範なプラーク形成宿主域を有する誘導性、溶原性Ａ．バウマンニファージを同定し、特性評価した。
誘導性及び広範な宿主域プロファージ候補を同定し、絞り込むために、ユニークなＡ．バウマンニ臨床分離株２８８株を収集し、細菌のＳＯＳ応答の強力な誘導因子であるマイトマイシンＣで個別に処理し、細菌が保有するあらゆる溶原菌を誘導して溶菌サイクルに変換させた。この調製物からの溶解物を、ファージプラーク法を用いて、同じＡ．バウマンニ株のサブセット上にスポッティングした。プラークの存在をスコア化し、宿主域をスプレッドシートで管理した。累積的に、陽性プラークを有する溶解物を、宿主域及び相補的カバレッジ（complementary coverage）に基づいてランク付けした。宿主域が最も広い溶解物は、Ａｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７と同定され、プラーク形成宿主域はそれぞれ２５％（７２／２８７）、２３％（６１／２６９）、４％（７／１６３）、累積で３２％（９３／２８８）であった。
Ａｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７溶解物由来のファージゲノムＤＮＡを精製し、ファージパッケージング（すなわちターミナーゼ）領域を同定するためにシーケンシングした。Ａｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７の完全なファージゲノムサイズは、それぞれ５３、４０、及び３６ｋｂであった。Ａｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、Ａｂｉ １４７ファージを透過型電子顕微鏡で画像化し、インタクトなファージの存在を確認し、ファージ集団の均一性を調べ、形態に基づいてファージファミリーを同定した。Ａｂｉ ３３溶解物は、マイオウイルス科ファージの不均一な集団を含み、Ａｂｉ ４９及びＡｂｉ １４７溶解物は、サイフォウイルス科ファージの均一な集団を含んでいた（図１ａ、１ｂ、１ｃ）。
非複製的形質導入粒子は、宿主株ターミナーゼ領域の欠失及びファージパッケージングプラスミドでの補完によって作製することができる。
非複製的形質導入粒子技術は、欠失及び相補性に依存して、天然ファージＤＮＡの代わりにレポーターＤＮＡを担持する操作されたプロファージを生成する。すなわち、１）宿主ファージゲノム上の喪失を補完するためのファージパッケージング遺伝子エレメントと２）発光アッセイのためのレポーター遺伝子ｌｕｘＡＢとを有するプラスミドを保有するパッケージング欠損ファージ殻からそれぞれが構成されるＡｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７形質導入粒子を合成した（図２）。宿主であるＡｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７ゲノムでは、ｔｅｒＳＬによってコードされるターミナーゼサブユニットと２５０ｂｐ以下の上流領域が各株についてノックアウトされ、ｚｅｏＲ選択カセットに置き換えられた。プラスミドの骨格をファージパッケージングのために構築し、Ａｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７宿主株上のターミナーゼ領域の喪失を補完した（図３）。欠失したターミナーゼ領域の実際のヌクレオチド配列を表２に示す。
Figure 2022515451000003
Figure 2022515451000004
Figure 2022515451000005
Figure 2022515451000006
各シャトルプラスミド骨格は、大腸菌とＡ．バウマンニについてそれぞれ２つの複製開始点を含んでいた：ｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯベクターに由来するｐＵＣ１８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カリフォルニア州カールズバッド）、アシネトバクター・カルコアセティカスから分離されたｐＷＨ１２６６プラスミドに由来するｐＷＨ１２７７（Hunger M, et al., 1990）。ファージパッケージングプラスミドは、全ての臨床Ａ．バウマンニ分離株におけるほぼ普遍的な抗生物質を選択のために、ｐＭＱ３００プラスミド（ペンシルベニア州ピッツバーグ大学のＲｏｂｅｒｔ Ｍ．Ｑ教授提供）に由来する、ハイグロマイシンＢ耐性をコードするｈｐｈカセットを含んでいた。ファージパッケージングプラスミドｐ３０７３、ｐ３０７４、及びｐ３０７５は、それぞれＡｂｉ １４７、Ａｂｉ ３３、及びＡｂｉ ４９のターミナーゼ領域の上流領域及び完全長ターミナーゼサブユニットｔｅｒＳＬでのクローニングによって生成された。具体的には、ｐ３０７３はＡｂｉ１４７のｔｅｒＳ ＯＲＦの上流２５０塩基対及びｔｅｒＳＬを含み、ｐ３０７４はＡｂｉ ３３のｔｅｒＳ ＯＲＦの上流２５０塩基対及びｔｅｒＳＬを含み、ｐ３０７５はＡｂｉ ４９のｔｅｒＳ ＯＲＦの上流１５０塩基対及びｔｅｒＳＬを含んでいた。プラスミドｐ３０７３は、ビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischerii）由来の野生型ｐＢｌａプロモーター駆動型ｌｕｘＡＢを含み；ｐ３０７４及びｐ３０７５もまた、改善されたルシフェラーゼ活性のためにＬｕｘＡに２つの点突然変異Ｃ１７０Ｒ及びＮ２６４Ｄを有するＶ．フィシェリ由来のｐＢｌａプロモーター駆動型ｌｕｘＡＢを含んでいた。プラスミドｐ３０７３、ｐ３０７４、及びｐ３０７５は、ｌｕｘＡＢの３’末端にｒｒｎＧ転写ターミネーター（ＴＴ）が挿入されていた。ＴＴ領域は、ＯＸＢ１９プラスミド（Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社、英国、オックスフォード）に由来していた。
Ａｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７ Ｓｍａｒｔｉｃｌｅｓのカクテルは、ユニークなＡ．バウマンニ臨床分離株のパネルで高い包括性のアッセイ結果をもたらす。
ファージ誘導法によりＡｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７非複製的形質導入粒子を生成し、遠心分離により３ｘ濃縮した。ユニークなＡ．バウマンニ臨床分離株９６株のパネルを、Ａｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７ Ｓｍａｒｔｉｃｌｅｓと２．５時間インキュベートする前に、約１０７ｃｆｕ／ｍｌの細胞負荷量まで増殖させた。発光反応基質を注入すると、Ａｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７の個々の形質導入粒子により、それぞれ４７％、５４％、５９％の株がＲＬＵ陽性であった（表２）。カクテルとしては、８２％の株がＲＬＵ陽性であったことから、相加効果が認められた（表２）。
Figure 2022515451000007
Ａｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７形質導入粒子をファージ誘導法により生成し、Ａ．バウマンニ株のサブセットを有するグラム陰性細菌株のパネルで交差反応性を試験して、アッセイにおける陽性対照として役立てた（図４ａ）。この菌株パネルを、Ａｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７ Ｓｍａｒｔｉｃｌｅｓと２．５時間インキュベートする前に、約１０７ｃｆｕ／ｍｌの細胞負荷量まで増殖させた。非Ａ．バウマンニ株に対する液体アッセイでは交差反応性は認められなかった（図４ｂ）。
実施例２：安定化パッケージングプラスミドとＮＲＴＰの製造
Ａ．バウマンニ（Ａｂｉ）パッケージングプラスミドの新しいシリーズの構築
溶原菌株Ａｂｉ３３ Δ ｔｅｒＳＬ：：：ｐ３０７４で安定性の問題が観察され、１回の継代後にプラスミドが失われた。同様のプラスミドの不安定性の問題は、他のＳｍａｒｔｉｃｌｅｓ ＮＲＴＰ研究でも観察された。この効果はターミナーゼ遺伝子の上流ｈｐｈプロモーターからの漏出性発現が原因で、プラスミドの自己切断と過剰なターミナーゼ活性によるプラスミドの喪失が生じたのではないかと仮定された。特定のパッケージングプラスミドでは、ターミナーゼがｈｐｈと同じ向きである場合、株は不安定であり、ＳｍａｒｔｉｃｌｅｓはＲＬＵアッセイではカバレッジが低かった。しかし、ターミナーゼの向きをベクター上でｈｐｈと反対方向に反転させると、その後、株の安定性とＳｍａｒｔｉｃｌｅｓのカバレッジが大幅に向上した（データは示されていない）。そこで、１）菌株の安定性、２）プラスミドのファージ頭部へのパッケージング効率、及び結果として３）Ｓｍａｒｔｉｃｌｅｓ ＲＬＵアッセイのカバレッジを改善するために、ｈｐｈ終止コドンの後に転写ターミネーターを追加することによって新しいコンストラクトの骨格を構築した。
空のＡ．バウマンニパッケージングベクターｐＺＸ０５７（図５）を以下のように最適化して構築した：１）ｌｕｘＡ遺伝子を、より活性な酵素であり、アッセイにおいてより高いＲＬＵシグナルを生成する二重変異体ｌｕｘＡに置き換えた；２）ｈｐｈプロモーターからの下流遺伝子の漏出性発現を防止するために、ｈｐｈ遺伝子の後に細菌の転写ターミネーターＴ７及びｒｒｎＧをクローニングした；３）予期せぬ漏出性発現を防止するために、未利用ｌａｃＺ遺伝子（元のベクターからの残存）を除去し、別の二方向二重転写ターミネーターＢＢａ‐Ｂ００１４に置き換えた。ベクター上の２つのクローニング部位を利用して、ベクター地図に示されたターミナーゼ遺伝子領域内でクローニングした。
それぞれ上流に７００ｂｐ、下流に２７０ｂｐの追加の配列をそれぞれ有する完全長のＡｂｉ ３３ ｎｏｄｅ３ ｔｅｒＳ及びｔｅｒＬターミナーゼ遺伝子をクローニング領域１にクローニングすることにより、Ａｂｉ ３３パッケージングベクターｐＺＸ０５８（図６）を生成した。クローニング領域１にＡｂｉ ４９及びＡｂｉ １４７ターミナーゼをクローニングするには技術的な困難があったため、クローニング領域２にターミナーゼをクローニングすることによりｐＺＸ０６５（図８）及びｐＺＸ０６６（図１０）コンストラクトを構築した。具体的には、ｐＺＸ０６５は、完全長Ａｂｉ ４９ ｔｅｒＳとｔｅｒＬに加えて、それぞれ７００ｂｐの上流領域配列、３６６ｂｐの下流領域配列を含んでいた。プラスミドｐＺＸ０６６は、完全長Ａｂｉ １４７ ｔｅｒＳとｔｅｒＬに加えて、４１４ｂｐの上流配列及び２８４ｂｐの下流配列を含んでいた。プラスミドｐＺＸ０５８、ｐＺＸ０６５、及びｐＺＸ０６６のアノテーションされたヌクレオチド配列を、それぞれ図７－Ｉ、－ＩＩ、－ＩＩＩ、－ＩＶ（配列番号４）、図９－Ｉ、－ＩＩ、－ＩＩＩ、－ＩＶ（配列番号５）、図１１－Ｉ、－ＩＩ、－ＩＩＩ、－ＩＶ（配列番号６）に示す。
これらの安定化されたパッケージングプラスミドを用いた新しいＡｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７非複製的形質導入粒子を、実施例１に記載したように生成した。発光反応基質を注入すると、６１％、４２％、及び４１％の株が、それぞれＡｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、Ａｂｉ １４７の個々の形質導入粒子によってＲＬＵ陽性であった。カクテルとしては、７８％の株がＲＬＵ陽性であったことから、相加効果が認められた（Ａ．バウマンニ９５株のうち７４株）。さらに、Ａｂｉ ３３、４９、１４７ Ｓｍａｒｔｉｃｌｅｓ ＮＲＴＰをカクテルとして使用した場合、ＲＬＵで測定したところ、非Ａ．バウマンニ株との交差反応は認められなかった。結果は表４に示しているが、ここで、マイナスのＲＬＵは、試験した計９５の腸内細菌科及びグラム（－）株の排他性を示す。略語は以下の通り：Ａｂｉ（アシネトバクター・バウマンニ）、Ｋｐｎ（肺炎桿菌）、Ｅｃｏ（大腸菌）、Ｅｃｌ（エンテロバクター・クロアカ）、Ｐａｅ（緑膿菌）、Ｋｏｘ（クレブシエラ・オキシトカ）、Ｅａｅ（エンテロバクター・エロゲネス）、Ｃｆｉ（シトロバクター・フロインデイ）、Ｃｋｏ（シトロバクター・コセリ）、Ｓｍｓ（霊菌）。
Figure 2022515451000008
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１０． Ｓａｈｌ Ｊ．Ｗ，Ｄｅｌ Ｆｒａｎｃｏ Ｍ．，Ｐｏｕｒｎａｒａｓ Ｓ．， Ｃｏｌｍａｎ Ｒ．Ｅ，Ｋａｒａｈ Ｎ．，Ｄｉｊｋｓｈｏｏｒｎ Ｌ．，Ｚａｒｒｉｌｌｉ Ｒ．（２０１５）．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｌｏｂａｌｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ＳＴ２５ ｌｉｎｅａｇｅ Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５１５１８８．１０．１０３８／ｓｒｅｐ１５１８８
１１． Ｓｎｉｔｋｉｎ， Ｅｖａｎ Ｓ．，Ａｄｒｉａｎ Ｍ．Ｚｅｌａｚｎｙ，Ｃｌｅｍｅｎｔｅ Ｉ．Ｍｏｎｔｅｒｏ，Ｆｒｉｄａ Ｓｔｏｃｋ，ＬｉｌｉａＭｉｊａｒｅｓ，ＮＩＳＣ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｐａｔｒｉｃｋ Ｒ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｊｕｌｉｅ Ａ．Ｓｅｇｒｅ．Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｄｒｉｖｅｓ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ａｕｇ ２０１１，１０８（３３）１３７５８－１３７６３
１２． Ｃｈａｎ，Ｂ．Ｋ．，Ａｂｅｄｏｎ ＳＴ，Ｌｏｃ－Ｃａｒｒｉｌｌｏ Ｃ．Ｐｈａｇｅ ｃｏｃｋｔａｉｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｐｈａｇｅ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｆｕｔｕｒｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２０１３；８：７６９-８３．
１３． Ａｒａｎｄａ，Ｊ，Ｐｏｚａ Ｍ，Ｐａｒｄｏ ＢＧ，Ｒｕｍｂｏ Ｓ，Ｒｕｍｂｏ Ｃ，Ｐａｒｒｅｉｒａ ＪＲ，Ｒｏｄｒiｇｕｅｚ－Ｖｅｌｏ Ｐ，Ｂｏｕ Ｇ．Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｓｔａｂｌｅ ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ．ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１０ Ｎｏｖ９；１０：２７９．
１４． Ｊａｃｏｂｓ，ＡＣ， Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＭＧ，Ｇｅｂｈａｒｄｔ Ｍ，Ｃｏｒｅｙ ＢＷ，Ｙｉｌｄｉｒｉｍ Ｓ，Ｓｈｕｍａｎ ＨＡ，Ｚｕｒａｗｓｋｉ ＤＶ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１４ Ｎｏｖ３；３５：６Ｇ．２．１－１１．

Claims (13)

  1. バクテリオファージゲノムを含む組成物であって、バクテリオファージゲノムがＡｂｉ ３３、Ａｂｉ ４９、及びＡｂｉ １４７からなる群から選択されるバクテリオファージに由来し、且つ、バクテリオファージゲノムがパッケージング関連酵素活性をコードする１又は複数の遺伝子の破壊を含む、組成物。
  2. パッケージング関連酵素活性をコードする１又は複数の遺伝子が、ｔｅｒＳ遺伝子、ｔｅｒＬ遺伝子、又はｔｅｒＳとｔｅｒＬ遺伝子の両方を含む、請求項１に記載の組成物。
  3. パッケージング関連酵素活性をコードする１又は複数の遺伝子の破壊が、配列番号１、配列番号２又は配列番号３から選択されるヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
  4. レポーター遺伝子を含むレポータープラスミドを、Ａ．バウマンニ細胞に導入するための非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）にパッケージングするための、細菌細胞パッケージング系であって、
    － 宿主のＡ．バウマンニ細胞；
    － パッケージング関連酵素活性をコードする１又は複数の遺伝子の破壊を有するバクテリオファージゲノムを含む、宿主Ａ．バウマンニ細胞内の第１の核酸コンストラクトであって、破壊がバクテリオファージゲノムのＮＲＴＰへのパッケージングを妨げ、バクテリオファージゲノムがバクテリオファージＡｂｉ ３３のゲノム、バクテリオファージＡｂｉ ４９のゲノム、及びバクテリオファージ１４７のゲノムからなる群から選択される第１の核酸コンストラクト；並びに
    － 第１の核酸コンストラクトとは別個の、宿主Ａ．バウマンニ細胞内の第２の核酸コンストラクトであって、レポーター遺伝子を有するレポーター核酸分子と、バクテリオファージゲノムの破壊を補完し且つレポーター核酸分子のレプリコンのＮＲＴＰへのパッケージングを容易にするパッケージング関連酵素活性をコードする１又は複数の遺伝子と含む第２の核酸コンストラクト
    を含む細菌細胞パッケージング系。
  5. パッケージング関連酵素活性をコードする１又は複数の遺伝子が、ｔｅｒＳ遺伝子、ｔｅｒＬ遺伝子、又はｔｅｒＳとｔｅｒＬ遺伝子の両方を含む、請求項４に記載の細菌細胞パッケージング系。
  6. パッケージング関連酵素活性をコードする１又は複数の遺伝子の破壊が、配列番号１、配列番号２又は配列番号３から選択されるヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項４又は５に記載の細菌細胞パッケージング系。
  7. レポーター核酸分子が、配列番号４、配列番号５又は配列番号６から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項４から６のいずれか一項に記載の細菌細胞パッケージング系。
  8. 請求項４から７のいずれか一項に記載の細菌細胞パッケージング系を使用して非複製的形質導入粒子を製造する方法であって、
    ａ） 請求項４から７のいずれか一項に記載の細菌細胞パッケージング系の溶菌相を誘導する工程と
    ｂ） レポーター分子のレプリコンをパッケージングしてＮＲＴＰを製造する工程と
    を含む、方法。
  9. パッケージング関連酵素活性をコードする１又は複数の遺伝子の破壊が、配列番号１、配列番号２又は配列番号３から選択されるヌクレオチド配列の欠失を含む、請求項８に記載の方法。
  10. レポーター核酸分子が、配列番号４、配列番号５又は配列番号６から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項８又は９に記載の方法。
  11. 試料中のＡ．バウマンニを検出する方法であって、
    ａ） 請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法によって製造される、バクテリオファージＡｂｉ ３３に由来するＮＲＴＰ、バクテリオファージＡｂｉ ４９に由来するＮＲＴＰ、バクテリオファージＡｂｉ １４７に由来するＮＲＴＰ、又はこれらの任意の組み合わせを試料に提供する工程；
    ｂ） 検出可能なシグナルを生成するための条件をレポーター遺伝子に提供する工程；及び
    ｃ） 検出可能なシグナルの有無を検出して、Ａ．バウマンニの有無を示す工程
    を含む、方法。
  12. 試料にＮＲＴＰを提供する前又は後に、試料に抗菌剤を提供して、検出可能なシグナルの有無を検出し、前記試料が抗菌剤に対して耐性又は感受性であるＡ．バウマンニを含むかどうかを示すことを含む工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
  13. レポーター核酸分子が、配列番号４、配列番号５又は配列番号６から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
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