JP6708721B2 - 非複製的形質導入粒子及び形質導入粒子に基づくレポーターシステム - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／７７９，１７７号、２０１３年１０月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／８９７，０４０号、及び２０１４年２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９３９，１２６号の利益を主張し、これらの仮特許出願はそれぞれ参照によってその全体が本明細書に援用される。
本発明は、細胞内の標的遺伝子を検出するための、細胞内への非複製的形質導入レポーター分子のパッキング及び送達のための、方法及び組成物に関する。
形質導入粒子は、細胞内に非ウイルス核酸を送達することが可能なウイルスに関連している。ウイルスに基づくレポーターシステムは、細胞の存在を検出するために用いられており、細胞からのレポーター分子の発現を可能とするのにウイルスの溶原期（lysogenic phase）に依存している。これらの、ウイルスに基づくレポーターシステムは、レポーター分子を発現し、標的細胞に検出可能なシグナルを放出させる複製可能な形質導入粒子を利用している。
しかし、ウイルスの溶菌サイクルは、ウイルスに基づくレポーターアッセイに有害であることが示されている。Carriere, C. et al., Conditionally replicating luciferase reporter phages: Improved sensitivity for rapid detection and assessment of drug susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology, 1997. 35(12): p. 3232-3239。Ｃａｒｒｉｅｒｅらは、３０℃では抑制されるが３７℃では活性化される溶菌サイクルを有する、結核菌（M. tuberculosis）／カルメット・ゲラン桿菌（bacillus Calmette-Guerin）（ＢＣＧ）ルシフェラーゼレポーターファージを開発した。このシステムを用いることで、Ｃａｒｒｉｅｒｅらは、抑制された溶菌サイクルを有するファージレポーターを使用するＢＣＧの検出を実証している。
しかし、バクテリオファージに基づくレポーターアッセイにおいて、バクテリオファージの複製機能を抑制（除去ではない）することに関連する不都合が存在する。第一に、バクテリオファージの複製機能の制御はアッセイ条件の限定を強いる。例えば、Ｃａｒｒｉｅｒｅらが使用したレポーターファージｐｈＡＥ４０の溶菌サイクルは、前記ファージが非許容温度である３０℃で細胞に感染させるために使用された場合に抑制された。標的細菌の最適温度が３７℃であったという点で、この温度要求はレポーターアッセイに限定条件を課していた。これらの限定条件は最適なアッセイ遂行の妨げとなる。
さらに、ウイルスの複製機能は制御が困難である。ウイルスの複製は、形質導入粒子がレポーターシステムとして使用される際は抑制されるべきである。例えば、Ｃａｒｒｉｅｒｅらによる報告で、レポーターファージｐｈＡＥ４０の溶菌活性が除去ではなく減少された結果、アッセイにおけるルシフェラーゼシグナルの減少が起こった。Ｃａｒｒｉｅｒｅらは、インタクトなファージによって発現される遺伝子及びアッセイの温度限定等の、レポーターシグナルの減少結果の考えられる原因を明らかにしたが、これらは全て、ファージレポーターの溶菌サイクルが除去されなかったということに由来している。
ファージの天然の溶原サイクルに依存するレポーターアッセイは、散発的に溶菌活性を示すことが予測され得る。さらに、ファージの溶原サイクルに依存するアッセイは、同様のファージで既に溶原化された標的細胞からの重感染免疫、並びに入ってくるウイルス核酸を標的とすることでこれらのレポーターファージの宿主範囲を制限する自然発生的な宿主制限系を引き起こす傾向があり得る。
他の例では、形質導入粒子生成系は外来核酸分子をパッケージングするように設計されているが、形質導入粒子はしばしば、外来核酸分子と天然の子孫ウイルス核酸分子の組み合わせを含有する。前記天然ウイルスはアッセイ遂行の障害となる溶菌活性を示す可能性があり、形質導入粒子を精製するためには、前記ウイルスの溶菌活性は排除されなければならない。しかし、この精製は通常は不可能である。Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａという表題の米国特許出願公開第２００９／０１５５７６８Ａ号において、Ｓｃｈｏｌｌらはこのような形質導入粒子システムの開発について記載している。前記システムの産物は、レポーター形質導入粒子及び天然バクテリオファージの組み合わせである（前記参考文献における図８）。前記著者らは形質導入粒子及び天然バクテリオファージが超遠心によって分離可能であることを示しているが、この分離は、形質導入粒子及び天然ウイルスが超遠心による分離を可能とするであろう異なる密度を示すシステムにおいてのみ可能である。この特徴は前記参考文献に記載されるバクテリオファージＴ７に基づくパッケージングシステムによって示されるが、これは他のウイルスシステムに一般に適用可能な特徴ではない。ウイルスのパッケージング機構は、天然ウイルス及び形質導入粒子に超遠心で分離できない区別不能な密度を示させるであろう充満した（headful）パッケージングを示すことが一般的である。また、ウイルスのパッケージングシステムは、区別不能な密度を有する天然ウイルス及び形質導入粒子をもたらす、適切なウイルス構造構築に必要なものとして、最低限のパッケージングに依存している。
これらのことから、検出限界を増加させ偽陰性結果を生じさせることによりレポーターアッセイの遂行を制限し得る、ウイルスの溶菌機能からの有害作用、並びに、重感染免疫並びにウイルス核酸分子及びウイルス機能を標的とする宿主制限機構によって制限される可能性の影響を受けない、非複製的形質導入粒子が必要とされている。
形質導入粒子が設計された場合であっても、形質導入粒子を用いて細胞内の標的核酸分子の存在を検出及びレポートする方法には限界がある。いくつかの方法は、細胞の破壊、並びに可溶化液中の転写物を単離及び検出するための面倒な方法を必要とする。破壊の方法には、抗体、アプタマー、又は核酸プローブ等の標識プローブの使用が含まれる。標的遺伝子に対する標識プローブは、意図されない標的に対する非特異的結合をもたらすか、又は高い信号雑音比を有するシグナルを生じる可能性がある。従って、細胞内の内在核酸分子を検出及びレポートするための、特異的、効果的且つ正確な方法が必要とされる。
従って、細胞内のレポーター分子のパッケージング及び発現を可能とする非複製的形質導入粒子を生成し、一方で複製可能な子孫ウイルスを排除するための方法及びシステムが必要とされる。発現されたレポーター分子を用いて細胞内の分子を検出する効果的且つ正確な方法も必要とされる。
細菌細胞が、パッケージング開始部位配列をコードするバクテリオファージ遺伝子を欠失している溶原化されたバクテリオファージゲノム、ここで、前記バクテリオファージ遺伝子の欠失はバクテリオファージ核酸分子の前記非複製的形質導入粒子中へのパッケージングを妨げる；及び、第二バクテリオファージ遺伝子を含むレポーター核酸分子、ここで、前記第二バクテリオファージ遺伝子はパッケージング開始部位配列をコードし、前記レポーター核酸分子の複製物の前記非複製的形質導入粒子中へのパッケージングを促進し、前記第二バクテリオファージ遺伝子は前記遺伝子によってコードされるタンパク質を発現することが可能であり、前記レポーター核酸分子の複製物は前記非複製的形質導入粒子中へのパッケージングに適しているレプリコンを形成する、を含む、レポーター核酸分子を非複製的形質導入粒子中にパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムが本明細書で開示される。
いくつかの実施形態では、前記レポーター核酸分子はプロモーターに機能的に連結されている。別の実施形態では、前記プロモーターは、前記細菌細胞内で前記レポーター核酸分子から発現されるレポーター分子の反応性への寄与のために選択される。一実施形態では、前記レポーター核酸分子は複製開始点を含む。さらに別の実施形態では、前記レプリコンは、前記非複製的形質導入粒子中へのパッケージングに適しているコンカテマーを含む。
一実施形態では、前記第一バクテリオファージ遺伝子及び前記第二バクテリオファージ遺伝子のそれぞれは、腸内細菌科バクテリオファージＰ１のｐａｃＡ遺伝子を含み、前記パッケージング開始部位配列を含む。一実施形態では、前記第二バクテリオファージ遺伝子は配列番号９の配列を含む。別の実施形態では、前記レプリコンは腸内細菌科バクテリオファージＰ１溶解性レプリコンを含む。ある実施形態では、前記レプリコンは、Ｃ１リプレッサーにより制御されるＰ５３プロモーター、プロモーターＰ５３アンチセンス、ｒｅｐＬ遺伝子、及びｋｉｌＡ遺伝子のインフレーム欠失を含む。一実施形態では、前記レプリコンは配列番号３の配列を含む。
さらに別の実施形態では、前記第一バクテリオファージ遺伝子及び前記第二バクテリオファージ遺伝子のそれぞれは、前記パッケージング開始部位配列を含む小ターミナーゼ（ｔｅｒＳ）遺伝子を含む。一実施形態では、ｔｅｒＳ遺伝子は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）バクテリオファージφ１１又はφ８０α ｔｅｒＳ遺伝子を含む。
別の実施形態では、前記レプリコンは、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ｐＴ１８１プラスミド複製開始点に由来する。さらに別の実施形態では、前記レプリコンは配列番号５の配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第二バクテリオファージ遺伝子のパッケージング開始部位配列はｐａｃ部位を含む。他の実施形態では、前記第二バクテリオファージ遺伝子のｐａｃ部位は配列番号７の配列を含む。一態様では、前記第二バクテリオファージ遺伝子のパッケージング開始部位配列はｃｏｓ部位を含む。別の態様では、前記第二バクテリオファージ遺伝子のパッケージング開始部位配列はコンカテマー接合部を含む。
別の態様では、プラスミドは前記レポーター核酸分子を含む。一態様では、前記第二バクテリオファージ遺伝子はプロモーターに機能的に連結されている。別の実施形態では、前記プロモーターは誘導性プロモーター又は構成的プロモーターである。一実施形態では、前記バクテリオファージは腸内細菌科バクテリオファージＰ１を含む。さらに別の実施形態では、前記バクテリオファージは黄色ブドウ球菌（S. aureus）バクテリオファージφ８０α又はバクテリオファージφ１１を含む。一態様では、前記細菌細胞は大腸菌（E. coli）細胞を含む。別の態様では、前記細菌細胞は黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞を含む。さらに別の実施形態では、前記細菌細胞はグラム陰性細胞を含む。他の実施形態では、前記細菌細胞はグラム陽性細胞を含む。
別の態様では、前記レポーター核酸分子はレポーター遺伝子を含む。一態様では、前記レポーター遺伝子は検出可能マーカー及び／又は選択マーカーをコードする。ある態様では、前記レポーター遺伝子は、発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｃ、ｎｌｕｃ）、比色反応を媒介する酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）、親和性ペプチド（Ｈｉｓタグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）、及び選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）からなる群から選択される。別の態様では、前記レポーター核酸分子はアプタマーを含む。さらに別の態様では、前記レポーター核酸分子は前記レポーター核酸分子内の第二配列に相補的な核酸転写物配列を含む。
一実施形態では、前記核酸転写物配列は細胞転写物に相補的である。別の実施形態では、前記核酸転写物配列はシス抑制配列を含む。さらに別の実施形態では、前記レポーター核酸分子の複製物は、前記レポーター核酸分子の前記複製物内の第二配列に相補的であり、細胞転写物に相補的であり、シス抑制配列を含む、核酸転写物配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の前記細菌細胞に、前記レポーター核酸分子とパッケージングされた非複製的形質導入粒子を生成するための前記バクテリオファージの溶解期を誘導する条件を提供し；そして前記レポーター核酸分子を含む前記非複製的形質導入粒子を単離することを含む、レポーター核酸分子を非複製的形質導入粒子中にパッケージングするための方法。一実施形態では、前記非複製的形質導入粒子は複製されたバクテリオファージゲノムを含有しない。別の実施形態では、前記溶解期の誘導は、前記細菌細胞の前記ゲノムからの前記ゲノムアイランド核酸分子の除去を引き起こす。
別の実施形態では、本明細書に記載の方法から生成された前記レポーター核酸分子の複製物を含む前記非複製的形質導入粒子を含む、組成物。
本発明は、レポーター核酸分子を非複製的形質導入粒子中にパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムを含み、前記細菌細胞は、第一バクテリオファージパッケージング開始部位配列を含む溶原化されたバクテリオファージゲノム（前記第一バクテリオファージパッケージング開始部位配列は前記非複製的形質導入粒子中へのバクテリオファージ核酸分子のパッケージングを妨げる変異を含む）；及び第二バクテリオファージパッケージング開始部位配列を含むレポーター核酸分子（前記第二バクテリオファージパッケージング開始部位配列は前記変異を欠いており、前記レポーター核酸分子の複製物の前記非複製的形質導入粒子中へのパッケージングを促進し、前記レポーター核酸分子の前記複製物は前記非複製的形質導入粒子中へパッケージングするためのレプリコンを形成する）を含む。
一実施形態では、前記レポーター核酸分子はプロモーターに機能的に連結されている。別の実施形態では、前記プロモーターは、前記細菌細胞内の前記レポーター核酸分子から発現されるレポーター分子の反応性への寄与のために選択される。さらに別の実施形態では、前記レポーター核酸分子は複製開始点を含む。一実施形態では、前記レプリコンは前記非複製的形質導入粒子中へのパッケージングに適しているコンカテマーを含む。別の態様では、前記第一バクテリオファージパッケージング開始部位配列及び前記第二バクテリオファージパッケージング開始部位配列のぞれぞれは、小ターミナーゼ遺伝子由来のパッケージング開始部位配列を含む。一態様では、前記第一バクテリオファージパッケージング開始部位配列及び前記第二バクテリオファージパッケージング開始部位配列のぞれぞれは、腸内細菌科バクテリオファージＰ１のｐａｃＡ遺伝子由来のｐａｃ部位配列を含む。別の態様では、前記第一バクテリオファージパッケージング開始部位配列は配列番号２を含む。さらに別の態様では、前記第二バクテリオファージパッケージング開始部位配列は配列番号１を含む。一実施形態では、前記レプリコンは腸内細菌科バクテリオファージＰ１溶解性レプリコンを含む。別の実施形態では、前記レプリコンは、Ｃ１リプレッサーにより制御されるＰ５３プロモーター、プロモーターＰ５３アンチセンス、ｒｅｐＬ遺伝子、及びｋｉｌＡ遺伝子のインフレーム欠失を含む。別の態様では、前記レプリコンは配列番号３の配列を含む。ある態様では、前記第一バクテリオファージパッケージング開始部位配列及び前記第二バクテリオファージパッケージング開始部位配列のぞれぞれは、黄色ブドウ球菌（S. aureus）バクテリオファージφ１１又はφ８０αの小ターミナーゼ（ｔｅｒＳ）遺伝子由来のｐａｃ部位配列を含む。別の態様では、前記レプリコンは黄色ブドウ球菌（S. aureus）ｐＴ１８１プラスミド複製開始点に由来する。さらに別の態様では、前記レプリコンは配列番号５の配列を含む。一態様では、前記第一バクテリオファージパッケージング開始部位配列は配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第二バクテリオファージパッケージング開始部位配列は配列番号１の配列を含む。他の実施形態では、前記パッケージング開始部位配列はｐａｃ部位を含む。別の実施形態では、前記パッケージング開始部位配列はｃｏｓ部位を含む。さらに別の実施形態では、前記パッケージング開始部位配列はコンカテマー接合部を含む。いくつかの実施形態では、前記第一バクテリオファージパッケージング開始部位配列内の前記変異はサイレント変異を含む。別の実施形態では、前記第一バクテリオファージパッケージング開始部位配列内の前記変異は、前記パッケージング開始配列の切断を妨げる。別の実施形態では、プラスミドは前記レポーター核酸分子を含む。一実施形態では、前記バクテリオファージは腸内細菌科バクテリオファージＰ１を含む。
別の実施形態では、前記バクテリオファージは黄色ブドウ球菌（S. aureus）バクテリオファージφ１１又はφ８０αを含む。一実施形態では、前記細菌細胞は大腸菌（E. coli）細胞を含む。別の実施形態では、前記細菌細胞は黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞を含む。いくつかの実施形態では、前記細菌細胞はグラム陰性細菌細胞を含む。一態様では、前記細菌細胞はグラム陽性細菌細胞を含む。別の態様では、前記レポーター核酸分子はレポーター遺伝子を含む。さらに別の態様では、前記レポーター遺伝子は検出可能マーカー及び／又は選択マーカーをコードする。
他の態様では、前記レポーター遺伝子は、発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｃ、ｎｌｕｃ）をコードする遺伝子、比色反応を媒介する酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）をコードする遺伝子、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）をコードする遺伝子、親和性ペプチド（Ｈｉｓタグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）をコードする核酸分子、及び選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）をコードする遺伝子からなる群から選択される。別の態様では、前記レポーター核酸分子はアプタマーを含む。他の態様では、前記レプリコンは、バクテリオファージパッケージング機構によって前記非複製的形質導入粒子中にパッケージングされる。いくつかの実施形態では、前記レポーター核酸分子は前記レポーター核酸分子内の第二配列に相補的な核酸転写物配列を含む。別の実施形態では、前記核酸転写物配列は細胞転写物に相補的である。
一態様では、前記核酸転写物配列はシス抑制配列を含む。別の態様では、前記前記レポーター核酸分子の複製物は、前記レポーター核酸分子の前記複製物内の第二配列に相補的であり、細胞転写物に相補的であり、シス抑制配列を含む、核酸転写物配列を含む。
ある態様では、本明細書に記載の前記細菌細胞に、前記レポーター核酸分子とパッケージングされた非複製的形質導入粒子を生成するための前記バクテリオファージの溶解期を誘導する条件を提供し；そして前記レポーター核酸分子を含む前記非複製的形質導入粒子を単離することを含む、レポーター核酸分子を非複製的形質導入粒子中にパッケージングするための方法。
他の態様では、前記非複製的形質導入粒子は複製されたバクテリオファージゲノムを含有しない。一態様では、前記前記溶解期の誘導は、前記細菌細胞の前記ゲノムからの前記ゲノムアイランド核酸分子の除去を引き起こす。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の前記方法から生成される前記レポーター核酸分子の複製物を含む前記非複製的形質導入粒子を含む組成物を含む。
一態様では、本発明は、レポーター核酸分子を非複製的形質導入粒子中にパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムを含み、前記細菌細胞は、前記非複製的形質導入粒子中へのバクテリオファージ核酸分子のパッケージングを妨げる第一バクテリオファージ遺伝子のパッケージング開始部位配列の欠失を含む、第一バクテリオファージ遺伝子を含む溶原化されたバクテリオファージゲノム；及び前記非複製的形質導入粒子中への前記レポーター核酸分子の複製物のパッケージングを促進する第二パッケージング開始部位配列を含み、前記第二バクテリオファージ遺伝子がタンパク質をコードし、前記レポーター核酸分子の前記複製物が前記非複製的形質導入粒子中へパッケージングするためのレプリコンを形成する、第二バクテリオファージ遺伝子を含むレポーター核酸分子を含む。
別の態様では、前記レポーター核酸分子はプロモーターに機能的に連結されている。一態様では、前記プロモーターは、前記細菌細胞内の前記レポーター核酸分子から発現されるレポーター分子の反応性への寄与のために選択される。ある態様では、前記レポーター核酸は複製開始点を含む。別の態様では、前記レプリコンは前記非複製的形質導入粒子中へのパッケージングに適しているコンカテマーを含む。一態様では、前記第一バクテリオファージ遺伝子及び前記第二バクテリオファージ遺伝子のそれぞれは、腸内細菌科バクテリオファージＰ１のｐａｃＡ遺伝子を含み、前記パッケージング開始部位配列を含む。別の態様では、前記第一バクテリオファージ遺伝子は配列番号６の配列を含む。ある態様では、前記第二バクテリオファージ遺伝子は配列番号７の配列を含む。一態様では、前記レプリコンは腸内細菌科バクテリオファージＰ１溶解性レプリコンを含む。さらに別の態様では、前記レプリコンはＣ１リプレッサーにより制御されるＰ５３プロモーター、プロモーターＰ５３アンチセンス、ｒｅｐＬ遺伝子、及びｋｉｌＡ遺伝子のインフレーム欠失を含む。別の態様では、前記レプリコンは配列番号３の配列を含む。他の態様では、前記第一バクテリオファージ遺伝子及び前記第二バクテリオファージ遺伝子のそれぞれは、前記パッケージング開始部位配列を含む小ターミナーゼ（ｔｅｒＳ）遺伝子を含む。一態様では、前記ｔｅｒＳ遺伝子は黄色ブドウ球菌（S. aureus）バクテリオファージφ１１又はφ８０α ｔｅｒＳ遺伝子である。別の態様では、前記第一バクテリオファージ遺伝子は配列番号８の配列を含む。さらに別の態様では、前記第二バクテリオファージ遺伝子は配列番号９の配列を含む。一態様では、前記レプリコンは黄色ブドウ球菌（S. aureus）ｐＴ１８１プラスミド複製開始点に由来する。一実施形態では、前記レプリコンは配列番号５の配列を含み、別の実施形態では、前記第二バクテリオファージ遺伝子のパッケージング開始部位配列はｐａｃ部位を含む。さらに別の実施形態では、前記第二バクテリオファージ遺伝子のパッケージング開始部位配列はｃｏｓ部位を含む。
ある実施形態では、前記第二バクテリオファージ遺伝子のパッケージング開始部位配列はコンカテマー接合部を含む。一実施形態では、プラスミドは前記レポーター核酸分子を含む。別の実施形態では、前記第二バクテリオファージ遺伝子はプロモーターに機能的に連結されている。さらに別の実施形態では、前記プロモーターは誘導性プロモーター又は構成的プロモーターである。ある実施形態では、前記バクテリオファージは腸内細菌科バクテリオファージＰ１を含む。一実施形態では、前記バクテリオファージは黄色ブドウ球菌（S. aureus）バクテリオファージφ８０α又はバクテリオファージφ１１を含む。他の実施形態では、前記細菌細胞は大腸菌（E. coli）細胞を含む。別の実施形態では、前記細菌細胞は黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞を含む。一実施形態では、前記細菌細胞はグラム陰性細胞を含む。別の実施形態では、前記細菌細胞はグラム陽性細胞を含む。
別の態様では、前記レポーター核酸分子はレポーター遺伝子を含む。一態様では、前記レポーター遺伝子は検出可能マーカー及び／又は選択マーカーをコードする。別の態様では、前記レポーター遺伝子は、発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｃ、ｎｌｕｃ）をコードする遺伝子、比色反応を媒介する酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）をコードする遺伝子、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）をコードする遺伝子、親和性ペプチド（Ｈｉｓタグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）をコードする核酸分子、及び選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）をコードする遺伝子からなる群から選択される。一実施形態では、前記レポーター核酸分子はアプタマーを含む。別の実施形態では、前記レプリコンは、バクテリオファージパッケージング機構によって前記非複製的形質導入粒子中にパッケージングされる。さらに別の実施形態では、前記レポーター核酸分子は前記レポーター核酸分子内の第二配列に相補的な核酸転写物配列を含む。一実施形態では、前記核酸転写物配列は細胞転写物に相補的である。別の実施形態では、前記核酸転写物配列はシス抑制配列を含む。ある実施形態では、前記レポーター核酸分子の複製物は、前記レポーター核酸分子の前記複製物内の第二配列に相補的であり、細胞転写物に相補的であり、シス抑制配列を含む、核酸転写物配列を含む。
本発明は、請求項８６〜１２５のいずれかに記載の前記細菌細胞に、前記レポーター核酸分子とパッケージングされた非複製的形質導入粒子を生成するための前記バクテリオファージの溶解期を誘導する条件を提供し；そして前記レポーター核酸分子を含む前記非複製的形質導入粒子を単離することを含む、レポーター核酸分子を非複製的形質導入粒子中にパッケージングするための方法を含む。一実施形態では、前記非複製的形質導入粒子は複製されたバクテリオファージゲノムを含有しない。別の実施形態では、前記溶解期の誘導は、前記細菌細胞の前記ゲノムからの前記ゲノムアイランド核酸分子の除去を引き起こす。
いくつかの態様では、本発明は、本明細書に記載の前記方法から生成される前記レポーター核酸分子の複製物を含む前記非複製的形質導入粒子を含む組成物を含む。
別の態様では、本発明は、レポーター核酸分子を非複製的形質導入粒子中にパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムを含み、前記細菌細胞は、パッケージング遺伝子を欠失しており、前記非複製的形質導入粒子を形成するタンパク質をコードする遺伝子を含む、溶原化されたバクテリオファージゲノム；並びにレポーター核酸分子及びパッケージング遺伝子を含むゲノムアイランド核酸分子を含む。一態様では、前記パッケージング遺伝子は小ターミナーゼ（ｔｅｒＳ）遺伝子を含む。ｔｅｒＳ遺伝子は黄色ブドウ球菌（S. aureus）バクテリオファージφ８０α ｔｅｒＳ遺伝子又はバクテリオファージφ１１ ｔｅｒＳ遺伝子を含む。
一態様では、前記ｔｅｒＳ遺伝子は配列番号９の配列を含む。別の態様では、前記ゲノムアイランド核酸分子はＳａＰＩｂｏｖ２ゲノムアイランド核酸分子を含む。さらに別の態様では、前記ゲノムアイランド核酸分子は、ＳａＰＩ、ＳａＰＩ１、ＳａＰＩ２、ＳａＰＩｂｏｖ１及びＳａＰｉｂｏｖ２ゲノムアイランド核酸分子からなる群から選択される。別の実施形態では、前記レポーター核酸分子はプロモーターに機能的に連結されている。さらに別の実施形態では、前記レポーター核酸分子は複製開始点を含む。いくつかの実施形態では、前記バクテリオファージは黄色ブドウ球菌（S. aureus）バクテリオファージφ８０α又はバクテリオファージφ１１を含む。他の実施形態では、前記細菌細胞は黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞を含む。一実施形態では、前記ゲノムアイランド核酸分子は、インテグラーゼ遺伝子を含み、前記インテグラーゼ遺伝子が、前記ゲノムアイランド核酸分子の、前記細菌細胞の細菌ゲノムからの切除及び前記細菌細胞の細菌ゲノムへの組込みのためのインテグラーゼタンパク質をコードする。別の実施形態では、前記インテグラーゼ遺伝子は配列番号１０の配列を含む。さらに別の実施形態では、前記ゲノムアイランド核酸分子は前記細菌細胞の細菌ゲノムに組み込まれる。
ある態様では、前記ゲノムアイランド核酸分子は、複製可能であり、前記細菌細胞内のバクテリオファージパッケージング機構によるパッケージングに適している分子レプリコンを形成する。別の態様では、前記核酸分子はコンカテマーを形成する。さらに別の態様では、前記複製されたゲノムアイランド核酸分子は前記非複製的形質導入粒子中にパッケージング可能である。ある態様では、前記パッケージング遺伝子はｐａｃ部位配列を含む。別の態様では、前記パッケージング遺伝子はｃｏｓ部位配列を含む。さらに別の実施形態では、前記パッケージング遺伝子はコンカテマー接合部を含む。
他の実施形態では、前記レポーター核酸分子はレポーター遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記レポーター遺伝子は選択マーカー及び／又は選択マーカーをコードする。別の実施形態では、前記レポーター遺伝子は、発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｃ、ｎｌｕｃ）、比色反応を媒介する酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）、親和性ペプチド（Ｈｉｓタグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）、及び選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）からなる群から選択される。ある実施形態では、前記レポーター核酸分子はアプタマーを含む。他の実施形態では、前記ゲノムアイランド核酸分子はインテグラーゼ遺伝子を欠失している。別の実施形態では、本発明は、プロモーターに機能的に連結されているインテグラーゼ遺伝子を含む細菌遺伝子を含み、前記インテグラーゼ遺伝子は、前記ゲノムアイランド核酸分子の、前記細菌細胞の細菌ゲノムからの切除及び前記細菌細胞の細菌ゲノムへの組込みのためのインテグラーゼタンパク質をコードする。一実施形態では、前記レポーター核酸分子は前記レポーター核酸分子内の第二配列に相補的な核酸転写物配列を含む。他の実施形態では、前記核酸転写物配列は細胞転写物に相補的である。さらに他の実施形態では、前記核酸転写物配列はシス抑制配列を含む。別の実施形態では、前記前記レポーター核酸分子の複製物は、前記レポーター核酸分子の前記複製物内の第二配列に相補的な核酸転写物配列を含む。他の実施形態では、前記核酸転写物配列は細胞転写物に相補的である。他の実施形態では、前記核酸転写物配列はシス抑制配列を含む。
本発明は、レポーター核酸分子を非複製的形質導入粒子中にパッケージングするための方法を含み、前記方法は、請求項１３０〜１６０のいずれかに記載の前記細菌細胞に、前記レポーター核酸分子とパッケージングされた非複製的形質導入粒子を生成するための前記バクテリオファージの溶解期を誘導する条件を提供し；そして前記レポーター核酸分子を含む前記非複製的形質導入粒子を単離することを含む。いくつかの実施形態では、前記非複製的形質導入粒子は、複製されたバクテリオファージゲノムを含有しない。一実施形態では、前記溶解期の誘導は、前記細菌細胞の前記ゲノムからの前記ゲノムアイランド核酸分子の除去を引き起こす。
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の前記方法から生成される前記レポーター核酸分子の複製物を含む前記非複製的形質導入粒子を含む組成物を含む。
また本発明は、試料中の細菌細胞の有無を検出するための方法を含み、前記方法は、非複製的形質導入粒子が前記細菌細胞に形質導入を生じさせることが可能であり、レポーター遺伝子が前記細菌細胞内で発現可能であるような条件下で、レポーター分子をコードしバクテリオファージゲノムを欠くレポーター遺伝子を含む非複製的形質導入粒子を試料中に導入し；前記レポーター分子の活性化のための条件を提供し；そして前記発現されたレポーター分子から伝達されるレポーターシグナルの有無を検出すること、ここで前記レポーターシグナルの存在は前記細菌細胞の存在を正確に示す、を含む。
一実施形態では、前記方法は、標準物質を基準にして少なくとも８０％の検出特異性、標準物質を基準にして少なくとも９０％の検出特異性、又は標準物質を基準にして少なくとも９５％の検出特異性を達成する。別の実施形態では、前記方法は、標準物質を基準にして少なくとも８０％の検出感度を達成する、標準物質を基準にして少なくとも８５％の検出感度、又は標準物質を基準にして少なくとも９０％の検出感度、又は標準物質を基準にして少なくとも９５％の検出感度を達成する。さらに別の実施形態では、前記方法は、標準物質を基準にして、少なくとも９５％の検出特異性及び少なくとも９０％の検出感度を達成する。別の実施形態では、前記標準物質はゴールド・スタンダード（Gold standard）である。さらに別の実施形態では、前記細菌細胞はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）細胞を含む。他の実施形態では、前記細菌細胞はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＭＳＳＡ）細胞を含む。
別の実施形態では、前記レポーター遺伝子は検出可能マーカー又は選択マーカーをコードする。一実施形態では、前記レポーター遺伝子は、発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｃ、ｎｌｕｃ）をコードする遺伝子、比色反応を媒介する酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）をコードする遺伝子、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）をコードする遺伝子、親和性ペプチド（Ｈｉｓタグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）をコードする核酸分子、及び選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）をコードする遺伝子からなる群から選択される。一実施形態では、前記レポーター遺伝子は構成的プロモーターに機能的に連結されている。
別の態様では、前記レポーターシグナルは、１，０００コロニー形成単位（ＣＦＵ）未満の検出限界（ＬｏＤ）で試料から検出され得る。他の態様では、前記レポーターシグナルは、１００コロニー形成単位（ＣＦＵ）未満の検出限界（ＬｏＤ）で試料から検出され得る。一態様では、前記レポーターシグナルは、１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）未満の検出限界（ＬｏＤ）で試料から検出され得る。他の態様では、前記レポーターシグナルは、５ＣＦＵ未満の検出限界（ＬｏＤ）で試料から検出され得る。別の態様では、前記レポーターシグナルは、３ＣＦＵ以下の検出限界（ＬｏＤ）で試料から検出され得る。
一実施形態では、前記方法は、抗生物質を前記試料に所定濃度で加え、前記レポーターシグナルの有無を検出することにより、前記細菌細胞が前記抗生物質に対して耐性であるか又は感受性であるかを決定することを含む。別の実施形態では、前記方法は、異なる所定濃度の抗生物質を前記試料に加え、前記レポーターシグナルの量を検出することにより、前記抗生物質に対する前記細菌細胞の最小阻止濃度を決定することを含む。
一態様では、本発明は、少なくとも２つの高次構造 (conformation)を形成可能な核酸レポーター転写物をコードする核酸コンストラクトを含む組成物を含み、前記少なくとも２つの高次構造は、第一ｓｕｂ配列及び第二ｓｕｂ配列を含む分子内二本鎖領域を含む、レポーター発現を妨げる第一高次構造、並びに前記分子内二本鎖領域を欠き、レポーター遺伝子発現を可能にする第二高次構造を含み、前記第一高次構造及び前記第二高次構造間の変換は、前記第一ｓｕｂ配列及び／又は前記第二ｓｕｂ配列への細胞転写物の競合的結合によって仲介される。
別の態様では、本発明は前記核酸コンストラクトを含む非複製的形質導入粒子を含む。さらに別の態様では、前記第一ｓｕｂ配列及び／又は前記第二ｓｕｂ配列への前記細胞転写物の前記競合的結合は、前記核酸レポーターコンストラクトの前記第二高次構造をもたらす。一態様では、前記第一ｓｕｂ配列又は前記第二ｓｕｂ配列はシス抑制配列を含む。別の態様では、前記シス抑制配列は前記細胞転写物の一部に相補的又は実質的に相補的な配列を含む。他の態様では、前記第一ｓｕｂ配列又は前記第二ｓｕｂ配列はレポーター遺伝子配列を含む。さらに別の態様では、前記レポーター遺伝子配列はリボソーム結合部位を含む。他の態様では、前記レポーター遺伝子配列は検出可能な分子をコードする。別の態様では、前記検出可能マーカーは蛍光分子又は発光もしくは比色反応を媒介することが可能な酵素を含む。一実施形態では、前記レポーター遺伝子配列は選択マーカーをコードする。別の実施形態では、前記選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子を含む。
他の実施形態では、前記第一ｓｕｂ配列及び前記第二ｓｕｂ配列は、前記核酸コンストラクト上で互いにシス配置されることで前記分子内二本鎖領域を形成する。ある実施形態では、前記第一ｓｕｂ配列及び前記第二ｓｕｂ配列は、互いに相補的又は実質的に相補的であることで前記分子内二本鎖領域を形成する。一実施形態では、前記第一高次構造の前記第一ｓｕｂ配列又は前記第二ｓｕｂ配列は、転写エンハンサー配列を含み、前記転写エンハンサー配列が前記レポーター遺伝子配列のコード領域の上流に存在する。別の実施形態では、前記核酸レポーター転写物の前記第一高次構造は、切断酵素への結合が可能である。他の実施形態では、前記核酸レポーター転写物の前記第一高次構造は細胞酵素による分解の標的である。他の態様では、前記第一高次構造は非結合性分子内領域を含む。別の態様では、前記非結合性分子内領域は、前記第一ｓｕｂ配列の３’及び前記第二ｓｕｂ配列の５’に配置されている。他の態様では、前記非結合性分子内領域はＹＵＮＲ配列を含み、Ｙはピリミジンであり、Ｕはウラシルであり、Ｎはあらゆるヌクレオチドであり、Ｒはプリンである。
一実施形態では、前記第一ｓｕｂ配列又は前記第二ｓｕｂ配列は前記細胞転写物の改変配列を含む。別の実施形態では、前記改変配列はヌクレオチド置換を含む。さらに別の実施形態では、前記改変配列は前記細胞転写物の配列挿入、欠失又は逆位を含む。
前記方法は、遺伝子レポーター配列を含む核酸レポーター転写物をコードする核酸コンストラクトであって、前記核酸レポーター転写物の少なくとも２つの高次構造を形成することが可能な前記核酸コンストラクトを含む組成物を含み、ここで、前記高次構造は、前記核酸レポーター転写物の前記レポーター遺伝子配列の翻訳を妨げる第一の不安定な高次構造、及び前記第一の不安定な高次構造と細胞転写物との結合から生じる第二の安定な高次構造（前記第二の安定な二次高次構造は前記核酸レポーター転写物の前記レポーター遺伝子配列の翻訳を可能にする）である。
一実施形態では、前記組成物は前記核酸コンストラクトを含む非複製的形質導入粒子を含む。別の実施形態では、前記細胞転写物は前記核酸レポーター転写物の３’ＵＴＲ配列で結合する。一実施形態では、前記第二の安定な二次高次構造は、前記第一の不安定な二次高次構造の配列の一部の切断によって形成される。別の実施形態では、前記レポーター遺伝子配列は検出可能な分子をコードする。いくつかの実施形態では、前記検出可能マーカーは、蛍光分子又は発光もしくは比色反応を媒介することが可能な酵素を含む。他の実施形態では、前記レポーター遺伝子配列は選択マーカーをコードする。別の実施形態では、前記選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子を含む。
本発明はまた、レポーター遺伝子配列を含む核酸レポーター転写物をコードし、前記核酸コンストラクトのさらなる転写を妨げる第一高次構造、及び前記第一高次構造と細胞転写物との結合によって形成される第二高次構造（前記第二高次構造は前記核酸コンストラクトの転写を可能にする）を含む、前記核酸レポーター転写物の少なくとも２つの高次構造を形成することが可能な、核酸コンストラクトを含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、前記組成物は前記核酸コンストラクトを含む非複製的形質導入粒子を含む。別の実施形態では、前記核酸レポーター転写物はシス抑制配列を含む。
一実施形態では、前記核酸レポーター転写物はレポーター遺伝子配列を含む。別の実施形態では、前記第一高次構造は、前記レポーター遺伝子配列への前記シス抑制配列の結合から形成される。いくつかの実施形態では、前記第一高次構造は切断酵素の基質である。一実施形態では、前記核酸レポーター転写物の前記第一高次構造は、転写終結構造を形成する配列を含む。他の実施形態では、転写終結構造を形成する前記配列への前記細胞転写物の結合は、前記核酸レポーター転写物の一部の切断及び前記第二高次構造の形成をもたらす。
本発明は、本明細書に記載の前記核酸レポーター転写物をコードする核酸配列に機能的に連結された制御配列を含むベクターを含む。
本発明は、細胞内の標的転写物を検出するための方法を含み、前記方法は、前記細胞に本明細書に記載の前記核酸レポーターコンストラクトを導入し；そして前記細胞からの出力シグナルの有無を検出することを含み、前記出力シグナルの前記存在により前記細胞内の標的転写物の存在が示される。前記方法は、前記標的転写物の前記存在の検出に基づいて、細菌細胞の存在を検出することを含む。
一実施形態では、本明細書に記載の前記核酸レポーターコンストラクトを導入し；そして試料からの出力シグナルの有無を検出することを含み、前記出力シグナルの前記存在により前記試料中の細菌細胞の存在が示される、試料中の細菌細胞の存在を検出するための方法。
本発明は、細胞及び本明細書に記載の前記核酸レポーターコンストラクトを含む試料を保持するための区画；並びに前記試料からの出力シグナルの有無を検出するための説明書を含み、出力シグナルの存在により前記細胞内の標的転写物の存在が示される、キットを含む。
本発明は、レポーター遺伝子に機能的に連結された、細菌細胞に内在する誘導因子タンパク質によって誘導可能な第一プロモーターを含む核酸レポーターコンストラクトを含む非複製的形質導入粒子を含む組成物を含む。
本発明は、試料中の細菌細胞の存在を検出するための方法を含み、前記方法は、前記試料を、前記細菌細胞に内在する誘導因子タンパク質によって誘導可能な、レポーター遺伝子に機能的に連結された第一プロモーターを含む核酸レポーターコンストラクトを含む非複製的形質導入粒子と接触させ；そして、前記レポーター遺伝子からの出力シグナルの有無を検出することを含み、前記出力シグナルの前記存在により前記試料中の前記細菌細胞の存在が示される。
一実施形態では、前記第一プロモーターは、前記細菌細胞内の標的核酸分子に機能的に連結した誘導性プロモーターと同一である。
本発明は、核酸レポーターコンストラクトがレポーター分子をコードするレポーター遺伝子を含み、非複製的形質導入粒子が細菌細胞に侵入可能である、核酸レポーターコンストラクトを含む非複製的形質導入粒子；及び非ケージ化されると前記細胞内の前記レポーター分子に反応することが可能である、前記細菌細胞に外因性であるケージ化基質を含む、組成物。
本発明は試料中の細菌細胞の存在を検出するための方法を含み、前記方法は、前記試料を、ケージ化基質及び核酸レポーターコンストラクトを含む非複製的形質導入粒子と接触させ、ここで、核酸レポーターコンストラクトがレポーター分子をコードするレポーター遺伝子を含み、前記細胞に外因性であるケージ化基質は非ケージ化されると前記細菌細胞内の前記レポーター分子に結合することが可能であり；そして、前記レポーター分子からの出力シグナルの有無を検出すること、を含み、前記出力シグナルの存在により前記試料中の前記細菌細胞の存在が示される。
一実施形態では、前記細胞内の標的酵素は、前記ケージ化基質と結合することで非ケージ化基質を生成する。いくつかの実施形態では、前記非ケージ化基質は、前記レポーター分子と反応することで前記出力シグナルを生成する。
本発明はまた、核酸レポーターコンストラクトが細菌細胞内の標的分子に結合して複合体を形成することが可能な切替可能分子をコードする、核酸レポーターコンストラクトを含む非複製的形質導入粒子；及び前記細胞に侵入し前記複合体と結合することで前記細胞からの検出可能なシグナルを生み出すことが可能な基質を含む組成物を含む。
本発明は、試料中の細菌細胞の存在を検出するための方法を含み、前記方法は、前記試料を、基質及び切替可能分子をコードする核酸レポーターコンストラクトを含む非複製的形質導入粒子と接触させ、切替可能分子は前記細胞内の標的分子と結合して複合体を形成することが可能であり、基質は前記複合体と結合して基質結合型複合体を形成することが可能であり；そして、前記基質結合型複合体からの出力シグナルの有無を検出することを含み、前記出力シグナルの存在により前記試料中の前記細菌細胞の存在が示される。一実施形態では、前記切替可能分子の前記標的分子への結合により前記切替可能分子内の立体構造変化が生じる。別の実施形態では、前記切替可能分子内の前記立体構造変化によって、前記基質が前記複合体に結合することが可能となる。
本発明のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の記述及び添付図面への留意によって、より正確に理解される。
図１は、本発明の一実施形態に係る、サイレント変異／相補性に基づくＰ１プラスミドパッケージングシステムの設計及び機能の一例を示している。 図２は、本発明の一実施形態に係るｐＧＷＰ１０００１ベクターの模式図を示している。 図３は、本発明の一実施形態に係る、ｐａｃ部位欠失／相補性プラスミドパッケージングシステムの設計及び機能の一例を示している。 図４は、本発明の一実施形態に係るｐＧＷ８０Ａ０００１ベクターの模式図を示している。 図５は、本発明の一実施形態に係る、バクテリオファージによるゲノムアイランド（ＧＩ）パッケージングの過程を示している。 図６は、本発明の一実施形態に係る、ＧＩに基づくパッケージングシステムの設計及び機能の一例を示している。 図７は、本発明の一実施形態に係る、インテグラーゼ遺伝子を欠失しているＧＩに基づくパッケージングシステムの設計及び機能を示している。 図８は、本発明の一実施形態に係る、インテグラーゼ遺伝子を欠失しているＳａＰＩｂｏｖ２に基づくパッケージングシステムの設計及び機能を示している。 図９は、本発明の一実施形態に係る、生細胞内での標的遺伝子プロモーターに対する誘導因子の検出にＮＲＴＰを用いるためのシステムを示している。 図１０は、本発明の一実施形態に係る、フェシウム菌（Enterococcus faecium）（又は大便連鎖球菌（E. faecalis））内のバンコマイシン耐性（ｖａｎＡ）遺伝子のプロモーターの誘導因子ＶａｎＲを検出するために構築されたレポーター核酸分子（例えば、プラスミド）を含むレポーターシステムを示している。前記レポータープラスミドは、ｖａｎＡ遺伝子プロモーターに機能的に連結されたレポーター遺伝子を保有している。 図１１は、本発明の一実施形態に係る、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）の毒素Ａ遺伝子及び毒素Ｂ遺伝子（それぞれｔｃｄＡ及びｔｃｄＢ）のプロモーターの誘導因子ＴｃｄＤを検出するために構築されたレポーター核酸分子を含むレポーターシステムを示している。前記レポーター核酸分子は、ｔｃｄＡ遺伝子プロモーターに機能的に連結されたレポーター遺伝子を含む。 図１２は、本発明の一実施形態に係る、黄色ブドウ球菌（S. aureus）のプロテインＡ遺伝子（ｓｐａ）のプロモーターの誘導因子ＳａｒＳを検出するために構築されたレポーター核酸分子を含むレポーターシステムを示している。前記レポーター核酸分子は、ｓｐａ遺伝子プロモーター（Ｐspa）に機能的に連結された細菌ルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｘＡ及びｌｕｘＢを含む。 図１３は、本発明の一実施形態に係る、標的細胞内酵素によって非ケージ化され得るケージ化基質分子を使用する生細胞内の細胞内酵素を検出するためのシステムを含む、レポーターシステムを示している。 図１４は、本発明の一実施形態に係る、β−ラクタマーゼ酵素検出システムの設計及び機能を示している。 図１５は、本発明の一実施形態に係る、標的分子に結合した後に検出可能なシグナルを生み出すことが可能である切替可能分子を使用する、生細胞内の細胞内分子を検出するためのレポーターシステムを示している。 図１６は、本発明の一実施形態に係る、バクテリオファージ／切替可能アプタマー（ＳＡ）に依存する細胞内分子レポーターシステムの設計及び機能を示している。 図１７は、本発明の一実施形態に係る、レポーター転写物上のレポーター配列の５’ＵＴＲ（非翻訳領域）を標的とし得るシス抑制機構を使用する、システムの一例を示している。 図１８は、本発明の一実施形態に係る、レポーター転写物内のレポーター配列のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を標的とするシス抑制機構に基づく、細胞内の標的転写物の存在を検出するためのシステムの一例を示している。 図１９は、本発明の一実施形態に係る、レポーター転写物内のレポーター配列のコード領域（「ＡＵＧ」）を標的とするシス抑制機構に基づく、細胞内の標的転写物の存在を検出するための例示的なシステムを図示している。 図２０は、本発明の一実施形態に係る、不安定なレポーター転写物を用いる抑制機構に基づく、細胞内の標的転写物の存在を検出するためのシステムの一例を図示している。 図２１は、本発明の一実施形態に係る、３６種のテトラサイクリン感受性ＭＲＳＡがｐＧＷ８０Ａ０００１を保有する形質導入粒子に暴露され、その後５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有する培地プレート上に播種された、形質導入アッセイの結果を示している。 図２２は、本発明の一実施形態に係る、形質導入粒子で形質導入された８０のＭＲＳＡ臨床分離株及び２８のメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（S. aureus）（ＭＳＳＡ）臨床分離株から測定された発光を示している。 図２３は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）が４、８、１６、３２、６４、及び１２８μｇ／ｍＬのセフォキシチンにおいて増殖された結果を示している。 図２４は、４、８、１６、３２、６４、及び１２８μｇ／ｍＬセフォキシチンの存在下でのＮＲＴＰアッセイによって得られたＲＬＵ値を示している。図２４のＸ軸は、ＭＳＳＡ ＲＬＵカットオフ値に設定されている。 図２５は、Ｍｆｏｌｄにより算出された最も低いエネルギー配置に基づいて作製され、ＶＡＲＮＡを用いて可視化された、ｍｅｃＡ転写物の二次構造を示している。 図２６は、ＹＵＮＲコンセンサス配列を含有するｍｅｃＡ転写物の末端ループ２３（Ｔ２３）を示している。 図２７は、ｌｕｘＡＢ遺伝子の５’末端に付加され、ｌｕｘＡ遺伝子のＲＢＳ配列（「ＡＡＧＧＡＡ」）をブロックするステムループ構造を形成するように設計された、シス抑制配列を示している。 図２８は、標的転写物及びレポーター転写物のシス抑制配列の間の塩基対形成の図を示している。 図２９は、本発明の一実施形態に係る、標的ｍｅｃＡ遺伝子配列の一例を示している。 図３０は、本発明の一実施形態に係る、レポーター転写物を設計するために使用され得る例示的なｍｅｃＡ転写物配列（配列番号１６）を示している。 図３１は、本発明の一実施形態に係る、レポーター転写物を設計を設計するために使用され得るｌｕｘＡＢ遺伝子座ＤＮＡ配列の一例である。 図３２は、本発明の一実施形態に係る、レポーター転写物を設計するために使用され得るｌｕｘＡＢ転写物配列（配列番号１８）の一例である。 図３３は、本発明の一実施形態に係る、レポーター転写物において使用され得るｌｕｘＡＢシス抑制転写物配列（配列番号１９）の一例である。 図３４は、本発明の一実施形態に係る、レポーター転写物をコードするベクターを含み、細胞内に内在性ｍｅｃＡ転写物が存在しない、細胞の一例を示している。 図３５は、細胞内に導入されるベクターを示しており、前記ベクターは、シス抑制配列及びレポーター配列（ｌｕｘＡ遺伝子及びｌｕｘＢ遺伝子）を含むレポーター転写物をコードしている。細胞内に存在するｍｅｃＡ転写物がシス抑制配列に結合すると、阻害性ヘアピンループが広がり、ｌｕｘＡ遺伝子のＲＢＳが露出される。レポーター配列（ｌｕｘＡ及びｌｕｘＢ）の翻訳が起こることが可能であり、ｌｕｘＡＢ酵素の形成がもたらされる。ｌｕｘＡＢ酵素は検出可能な発光シグナルを生み出す。このように、転写物レポーターベクターは、細胞内の内在性ｍｅｃＡ転写物の存在を報告する。
Ｉ．定義
特許請求の範囲及び本明細書で使用される用語は、特に記載がない限り以下に記載される通りに定義される。
本明細書で使用される場合、「レポーター核酸分子」は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を含むヌクレオチド配列を指す。レポーター核酸分子は天然分子又は人工分子又は合成分子であり得る。いくつかの実施形態では、レポーター核酸分子は、宿主細胞に対し外来性であり、プラスミド又はベクター等の外来核酸分子の一部として宿主細胞内に導入され得る。ある実施形態では、レポーター核酸分子は細胞内の標的遺伝子に相補的であり得る。他の実施形態では、前記レポーター核酸分子はレポーター分子（例えば、レポーター酵素、タンパク質）をコードするレポーター遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、レポーター核酸分子は「レポーターコンストラクト」又は「核酸レポーターコンストラクト」と称される。
「レポーター分子」又は「レポーター」は、生物に検出可能な表現型又は選択可能な表現型を与える分子（例えば、核酸又はタンパク質）を指す。検出可能な表現型は、例えば比色、蛍光又は発光であり得る。レポーター分子は、発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｃ、ｎｌｕｃ）、比色反応を媒介する酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）をコードする遺伝子、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）をコードする遺伝子、親和性ペプチド（Ｈｉｓタグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）をコードする核酸分子、及び選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）をコードする遺伝子をコードするレポーター遺伝子から発現され得る。レポーター分子は、細胞内への核酸分子又は外来配列（プラスミド）の取り込みの成否のマーカーとして使用され得る。レポーター分子はまた、本明細書に記載の標的遺伝子、標的核酸分子、標的細胞内分子、又は細胞の存在を示すために使用され得る。あるいはレポーター分子は、アプタマー又はリボザイム等の核酸であり得る。
本発明のいくつかの態様では、レポーター核酸分子はプロモーターに機能的に連結されている。本発明の他の態様では、プロモーターは、特定の細胞（例えば、特定の種）に存在し他の細胞には存在しないプロモーターの活性に基づくレポーターシステムの反応性及び交差反応性に寄与するために選択又は設計され得る。ある態様では、レポーター核酸分子は複製開始点を含む。他の態様では、複製開始点の選択は、標的細胞内でのレポーター核酸分子の複製が、特定の細胞（例えば、特定の種）に存在し他の細胞には存在しない複製開始点の活性に基づくレポーターシグナル生成に寄与する、又はそれに必要である場合、レポーターシステムの反応性及び交差反応性に同様に寄与し得る。いくつかの実施形態では、レポーター核酸分子は、ウイルス複製の間に子孫ウイルス中にコンカテマーＤＮＡとしてパッケージングされることが可能なレプリコンを形成する。
本明細書で使用される場合、「標的転写物」は、ＤＮＡ配列のヌクレオチド配列の一部、又は標的細胞によって自然発生的に形成されるｍＲＮＡ分子（例えば、標的遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子）、及び一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを指す。標的転写物はまた、細胞転写物（cellular transcript）又は自然発生転写物（naturally occurring transcript）とも称され得る。
本明細書で使用される場合、用語「転写物」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ鋳型配列又は遺伝子から転写された、ある長さのヌクレオチド配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を指す。転写物は、ＲＮＡ鋳型から転写されたｃＤＮＡ配列又は鋳型ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ配列であり得る。転写物は、タンパク質をコードしていてる場合もあるし、コードしていない場合もある。また、転写物は操作された核酸コンストラクトからも転写され得る。
レポーター核酸分子由来の転写物は「レポーター転写物」と称され得る。レポーター転写物はレポーター配列及びシス抑制配列を含み得る。レポーター転写物は、転写物が二本鎖（例えば、分子間二本鎖領域）を形成する２つの領域を含むように、相補的な領域を形成する配列を有し得る。一方の領域は「シス抑制配列」と称されることがあり、標的転写物及び／又はレポーター配列の一部又は全てに対して相補性を有する。転写物の第二の領域は「レポーター配列」と称され、シス抑制配列に対して相補性を有し得る。相補性は、完全な相補性である場合もあるし、実質的な相補性である場合もある。シス抑制配列がレポーター配列と一緒に存在する、及び／又はレポーター配列と結合すると、レポーター転写物内に高次構造が形成される場合があり、この高次構造によってレポーター分子のさらなる発現が阻止され得る。レポーター転写物は、互いに相補的であるレポーター転写物内領域が互いにハイブリダイズするように、ヘアピン構造等の二次構造を形成し得る。
「細胞内に導入する」とは、核酸分子又は外来配列（例えば、プラスミド、ベクター、コンストラクト）への言及である場合、当業者によって理解される通り、細胞内への取り込み又は吸収を促進することを意味する。核酸コンストラクト又は転写物の吸収又は取り込みは、助力のない拡散プロセスもしくは能動的な細胞プロセスを介して、又は補助的な作用剤もしくは装置によって（例えば、バクテリオファージ、ウイルス、及び形質導入粒子の使用を介して）、起こり得る。この用語の意味はインビトロにおける細胞に限定されず；核酸分子は、生体の一部である「細胞内に導入」されてもよい。そのような例では、細胞内への導入は生物への送達を含み得る。例えば、インビボにおける送達において、本発明の核酸分子、コンストラクト又はベクターは、組織部位に注入されるか、又は全身投与され得る。インビトロにおける細胞内への導入は、エレクトロポレーション及びリポフェクション等の当該技術分野において既知の方法を含む。さらなるアプローチが本明細書に記載されるか、又は当該技術分野において公知である。
「形質導入粒子」は、細胞内に非ウイルス核酸分子を送達することが可能なウイルスを指す。前記ウイルスはバクテリオファージ、アデノウイルス等であり得る。
「非複製的形質導入粒子」は、細胞内に非ウイルス核酸分子を送達することが可能なウイルスを指すが、それ自身の複製されたウイルスゲノムを形質導入粒子内にパッケージングしない。前記ウイルスはバクテリオファージ、アデノウイルス等であり得る。
「プラスミド」は、細胞内の染色体ＤＮＡから物理的に分離され、前記染色体ＤＮＡとは独立して複製可能である、小型ＤＮＡ分子である。プラスミドは、小型の環状二本鎖ＤＮＡ分子として細菌内に存在するのが最も一般的であり、古細菌及び真核生物内に存在する場合もある。プラスミドは、適切な宿主内で自動的に複製可能であるレプリコンとみなされる。
「ベクター」は、外来遺伝物質を、それを複製及び／又は発現可能な別の細胞内に人工的に運ぶために、ビヒクルとして使用される核酸分子である。
「ウイルス」は、他の生物の生細胞の内側でのみ複製する小型の感染体である。ウイルス粒子（ビリオンとして知られている）は２つ又は３つの部分を含む：ｉ）遺伝情報を運ぶＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子でつくられる遺伝物質；ｉｉ）これらの遺伝子を保護するタンパク質外被；及び、場合によって、ｉｉｉ）タンパク質外皮を取り囲む脂質外被。
「ＭＲＳＡ」は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を指す。
「ＭＳＳＡ」はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を指す。
用語「改善する」とは、その予防、重症度もしくは進行の軽減、寛解、又は治癒を含む、病状（例えば、病状）の治療における治療上有益なあらゆる結果を指す。
用語「イン・サイチュ(in situ)」は、生体から分離されて増殖している（例えば、組織培養液内で増殖している）生細胞において起こるプロセスを指す。
用語「インビボ」は、生体内で起こるプロセスを指す。
本明細書で使用される用語「哺乳動物」は、ヒト及び非ヒトの両方を含み、例えば、限定はされないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、及びブタが挙げられる。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」及び「Ｕ」の各々は、通常、塩基としてそれぞれグアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルを含有するヌクレオチドを表す。「Ｔ」及び「ｄＴ」は本明細書では同義的に使用され、核酸塩基がチミンであるデオキシリボヌクレオチド（例えば、デオキシリボチミン）を指す。しかし、当然のことながら、用語「リボヌクレオチド」又は「ヌクレオチド」又は「デオキシリボヌクレオチド」は、以下にさらなる詳細がある改変ヌクレオチド、又は代替の置換部分も指し得る。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、及びウラシルが、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変化させることなく他の部分によって置換され得ることを十分に理解している。例えば、限定はされないが、イノシンを塩基として含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、又はウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合し得る。そのため、ウラシル、グアニン、又はアデニンを含むヌクレオチドは、本発明のヌクレオチド配列において、例えば、イノシンを含有するヌクレオチドによって置換され得る。このような置換部分を含む配列が本発明の実施形態である。
本明細書で使用される場合、用語「相補的」とは、第二ヌクレオチド配列に関連して第一ヌクレオチド配列を記載するのに用いられる場合、前記第二ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと、ある特定の条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成する、前記第一ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの能力を指し、これは当業者によって理解される通りである。また相補的配列は、互いに結合しているものと記述され、結合親和性によって特徴付けられる。
例えば、第一ヌクレオチド配列は、前記２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ（例えば、アニーリング）する場合、第二ヌクレオチド配列に相補的であると記載され得る。ハイブリダイゼーション条件には、アニーリングステップ及び／又は洗浄ステップの、温度、イオン強度、ｐＨ、及び有機溶剤濃度が含まれる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件という用語は、その条件下では、第一ヌクレオチド配列がその標的配列（例えば、第二ヌクレオチド配列）に優先的にハイブリダイズし、他の配列にはより小さな程度にハイブリダイズする、又は全くハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は配列依存的であり、異なる環境パラメーターの下では異なる。一般的に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、所定のイオン強度及びｐＨで、ヌクレオチド配列の熱融解温度（Ｔm）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔmは、第一ヌクレオチド配列の５０％が完全一致した標的配列にハイブリダイズする、（所定のイオン強度及びｐＨにおける）温度である。核酸のハイブリダイゼーションの詳細な手引きは、例えば、Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes part I, chap. 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, N.Y. ("Tijssen")に記載されている。生物内で遭遇し得るような、生理的に適切な条件等の他の条件を適用され得る。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に基づいて、２つの配列の相補性を試験するのに最も適した条件セットを決定することができる。
これは、第一ヌクレオチド配列及び第二ヌクレオチド配列の全長にわたる、第二ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドに対する、第一ヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの塩基対形成を含む。このような配列は、本明細書では、互いに対して「完全に相補的」であると称すされ得る。しかし、本明細書において第一配列が第二配列に対し「実質的に相補的」であると称される場合、これら２つの配列は完全に相補的であってもよく、あるいは、それらの最終適用に最も適した条件下でハイブリダイズする能力を保持しつつ、ハイブリダイゼーション時に一つ又は複数の、しかし通常は４つ、３つ又は２つ以下の不適正塩基対を形成してもよい。しかし、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション時に一つ又は複数の一本鎖オーバーハングを形成するように設計されている場合、このようなオーバーハングは、相補性の決定に関してミスマッチとはみなさないものとする。例えば、２１ヌクレオチド長のあるオリゴヌクレオチド及び２３ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドを含み、長い方のオリゴヌクレオチドは短い方のオリゴヌクレオチドに完全に相補的な２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡであっても、本明細書に記載される目的のために、「完全に相補的」と称され得る。
「相補的な」配列は、本明細書で使用される場合、ハイブリダイズする能力に関する上記要求が満たされる限りでは、非ワトソン・クリック塩基対並びに／又は非天然ヌクレオチド及び改変ヌクレオチドから形成される塩基対も含むか、又は全体的にそれらから形成され得る。このような非ワトソン・クリック塩基対には、限定はされないが、Ｇ：Ｕ Ｗｏｂｂｌｅ又はＨｏｏｇｓｔｅｉｎ塩基対形成が含まれる。
本明細書における用語「相補的」、「完全に相補的」及び「実質的に相補的」は、それらが使用される文脈から理解される通り、２本鎖ｄｓＲＮＡ間の塩基一致、又はｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖及び標的配列間の塩基一致、一本鎖ＲＮＡ配列の相補鎖又は一本鎖ＤＮＡ配列間の塩基一致に対して使用され得る。
本明細書で使用される場合、「二本鎖構造」は、２本の逆平行の実質的に相補的な核酸配列を含む。核酸コンストラクト内の相補的配列は、２つの転写物間で、転写物内の２つの領域間で、又は転写物と標的配列との間で、「二本鎖構造」を形成し得る。通常、各々の鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳細に記載されているように、各々又は両方の鎖は、少なくとも１つの非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチド及び／又は改変ヌクレオチドも含み得る。二本鎖構造を形成する２本の鎖は、１本の巨大なＲＮＡ分子の異なる部分であってもよく、あるいは別々のＲＮＡ分子であってもよい。２本の鎖が１つの巨大分子の一部であり、それ故に、二本鎖構造を形成している一方の鎖の３’末端及びそれぞれ他の鎖の５’末端の間の中断のないヌクレオチド鎖によって連結されている場合、連結しているＲＮＡ鎖は「ヘアピンループ」と称される。前記２本の鎖が、二本鎖構造を形成している一方の鎖の３’末端及びそれぞれ他の鎖の５’末端の間の中断のないヌクレオチド鎖以外の手段で、共有結合的に連結されている場合、連結している構造は「リンカー」と称される。ＲＮＡ鎖は、同じ数のヌクレオチドを有していてもよいし、異なる数のヌクレオチドを有していてもよい。塩基対の最大数は、二本鎖の最も短い鎖におけるヌクレオチドの数から、二本鎖内に存在するあらゆるオーバーハングを引いたものとなる。通常、二本鎖構造は、１５〜３０塩基対長又は２５〜３０塩基対長、又は１８〜２５塩基対長、又は１９〜２４塩基対長、又は１９〜２１塩基対長、又は１９塩基対長、２０塩基対長、又は２１塩基対長である。一実施形態では、二本鎖は１９塩基対長である。別の実施形態では、二本鎖は２１塩基対長である。２本の異なるｓｉＲＮＡが組み合わされて使用される場合、二本鎖の長さは同一になるか又は異なり得る。
本明細書で使用される場合、用語「相補的領域」は、ある配列、例えば、本明細書で定義される標的配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖上の領域を指す。相補的領域が標的配列に完全には相補的でない場合、ミスマッチは末端領域において最も許容され、存在する場合は、通常、１つ又は複数の末端領域、例えば、５’末端及び／又は３’末端の６、５、４、３、又は２ヌクレオチド以内に存在する。
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列との関連における、用語「同一性」パーセントとは、下記の配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ又は当業者が利用可能な他のアルゴリズム）の１つを用いて、又は目視検査によって測定され、最大一致となるように比較及びアラインメントされた場合に、特定の割合の同一ヌクレオチド又は同一アミノ酸残基を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。適用に応じて、「同一性」パーセントは、比較されている配列のある領域にわたって（例えば、機能ドメインにわたって）存在していてもよいし、あるいは、比較される２本の配列の完全長にわたって存在していてもよい。
配列比較では典型的に、一方の配列は試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムが使用される場合、試験配列及び参照配列がコンピューターに入力され、必要であれば部分配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。配列比較アルゴリズムは次に、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを算出する。
比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（ウィスコンシン・ジェネティック・ソフトウェアパッケージ（Wisconsin Genetics Software Package）（ジェネティック・コンピューター・グループ（Genetics Computer Group）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、マディソン、ウィスコンシン州））のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡのコンピューター処理による実行によって、又は目視検査（一般的には、以下のAusubel et al.を参照）によって実行することができる。
配列同一性パーセント及び配列類似性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムの一例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)で記述されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通じて公的に利用可能である。
用語「充分な量」は、所望の効果を生むのに充分な量（例えば、細胞から検出可能なシグナルを生み出すのに十分な量）を意味する。
用語「治療有効量」は、疾患の症状を改善するのに有効な量である。予防は治療と見なされ得るため、治療有効量は「予防有効量」であり得る。
本明細書及び添付の請求項で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈によって特に明示されない限り、複数の指示対象を含むことを注意しなければならない。
ＩＩ．ウイルスの溶原サイクル及び溶菌サイクル
ウイルスは宿主細胞内で溶原サイクル及び溶菌サイクルを起こす。溶原サイクルがとられた場合、ファージ染色体は、細菌の染色体内に組み込まれるか、又は宿主内で安定なプラスミドとして自身を確立させ、そこで長期間休止状態を維持し得る。溶原菌が誘導されると、ファージゲノムは細菌染色体から切除され、溶菌サイクルを開始し、その結果、細胞の溶解及びファージ粒子の放出が起こる。溶菌サイクルは、宿主の溶解によって放出される新しいファージ粒子の生産をもたらす。
ある特定の溶原ファージは溶菌活性を示すことがあり、溶菌活性の性質は宿主細菌によって異なり得る。この現象を説明するため、１０種のＭＲＳＡ臨床分離株に対する２種の溶原性黄色ブドウ球菌（S. aureus）ファージの溶菌活性をプラークアッセイにより調べた（表１）。ファージφ１１は１０種中１０種の臨床ＭＲＳＡ分離株に対し溶菌活性を示し、φ８０αは１０種中６種の臨床ＭＲＳＡ分離株に対し溶菌活性を示した。従って、ファージの天然の溶原サイクルに依存するレポーターアッセイは、散発性に溶菌活性を示すこと予測することができる。
さらに、ファージに基づくレポーター等の、ウイルスに基づくレポーターアッセイは、宿主に基づくファージ耐性機構及びプロファージに由来するファージ耐性機構によって生じるファージ宿主範囲の限定による、反応性の限定（すなわち、分析包括性（analytical inclusivity））の影響を受け得る。これらの耐性機構は天然のファージ核酸を標的とし、その結果、ファージＤＮＡ及び機能の分解ないし阻害が起こり得る。このような耐性機構には、ファージＤＮＡを切断する制限系及びファージ由来転写物を阻害するＣＲＩＳＰＲ系が含まれる。
溶菌活性及びファージ耐性は共に、レポーターファージに基づくアッセイの妨げとなり得る。溶菌活性は、検出可能なシグナルを生み出す細胞の能力において細胞を破壊ないし阻害することにより、検出可能なシグナルの量を減少させる又は検出可能なシグナルの生成を妨げることで検出限界に影響を与えることによって、シグナルを阻害し得る。ファージ耐性機構は、ファージの宿主範囲を限定し、ファージに基づくレポーターの包括性を限定する可能性があり、同様に、検出可能なシグナルの量を減少させる又は検出可能なシグナルの生成を妨げることで検出限界に影響を与える。レポーターファージ内のファージＤＮＡの組込みによって生じる溶菌活性及びファージ耐性は共に、これらのファージレポーターを組み入れたアッセイにおいて、偽陰性結果をもたらし得る。
ＩＩＩ． 非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を生産するための方法
Ａ． 非複製的形質導入粒子を作製するための破壊／相補性に基づく方法
１） サイレント変異／相補性パッケージングシステム
本発明は、サイレント変異／相補性に基づく方法を用いてＮＲＴＰを生産するための方法を含む。
この非複製的形質導入粒子パッケージングシステムは、ウイルスパッケージング機構によってウイルス産生中にゲノムパッケージングが開始される成分として認識されるウイルスゲノムの成分に、サイレント変異を導入することに基づいている。このような成分の例としては、ｐａｃ型バクテリオファージのｐａｃ部位配列及びｃｏｓ型バクテリオファージのｃｏｓ部位配列が挙げられる。
これらのパッケージング開始部位はしばしば、ウイルス産生に必須である遺伝子のコード領域内に存在しているため、ｐａｃ部位がウイルスパッケージング機構によってパッケージング開始部位として認識されなくなるように、サイレント変異は導入される。一方で、この変異は、前記部位がコードされる遺伝子を破壊しない。パッケージング部位配列が破壊されると、変異したウイルスは溶菌サイクルを起こすことはできるが、そのゲノムＤＮＡをそのパッケージングユニット内にパッケージングすることができない。
プラスミドＤＮＡ等の外来性レポーター核酸分子は、変異したパッケージング開始部位配列を有するウイルスゲノムで溶原化された宿主細胞内に導入することができる。外来性レポーター核酸分子は、天然のパッケージング開始部位配列を含み得る。外来性レポーター核酸分子は、細胞内に導入され、細胞内で複製され得る。変異型ウイルスが溶菌サイクルを起こすと、発現されたウイルスパッケージング機構が、天然のパッケージング開始部位配列を有する外来性レポーター核酸分子をウイルスのパッケージングユニット内にパッケージングする。ウイルスゲノムは、そのパッケージング開始部位配列が変異されているため、パッケージングユニット内にパッケージングされない。ある実施形態では、パッケージング開始部位配列内の変異は、パッケージング開始配列の切断を妨げるがパッケージング開始部位配列を包含する遺伝子産物の発現は阻害しないサイレント変異を含む。これにより、複製された外来核酸分子を有する非複製的形質導入粒子（例えば、ウイルスの構造成分）が産生される。
このような系の一例は、ｐａｃ型ファージであるバクテリオファージＰ１に基づいている。一実施形態では、天然Ｐ１ｐａｃ部位を含むプラスミドが、細胞に形質転換される。前記細胞はＰ１プロファージゲノムにより溶原化される。Ｐ１プロファージゲノムは、Ｐ１のｐａｃＡ遺伝子内にコードされたｐａｃ部位配列内にサイレント変異を含む。プロファージの溶菌サイクルが誘導されると、前記系は、プラスミドＤＮＡを有するＰ１に基づく形質導入粒子の産生をもたらす。この系に適したサイレント変異の一例は、２００２年１１月７日に出願された米国特許出願公開第２００５／０１１８７１９号（全体が参照によって援用される）に記載されている。一例は、以下に記載される配列番号２にも見出される（サイレント変異を有するＰ１ ｐａｃ部位、小文字は変異した塩基を示す）。
図１は、本発明の一実施形態に係る、サイレント変異／相補性に基づくＰ１プラスミドパッケージングシステム１００の設計及び機能の一例を示している。この系では、大腸菌（E. coli）細胞１０１は、パッケージング開始部位配列（例えば、ｐａｃ部位）内にサイレント変異を含むＰ１プロファージ１０２によって溶原化される。前記細胞は天然ｐａｃ部位１０３を含むプラスミドによって形質転換され、前記プラスミドが細胞内で複製されて、プラスミドコンカテマー１０４が形成される。プラスミドはまた、レポーター分子をコードするレポーター遺伝子を含み得る。Ｐ１プロファージの溶菌サイクルが誘導されると、Ｐ１プロファージが細菌ゲノムから切除され、Ｐ１構造成分（例えばカプシドタンパク質）１０５が発現される。Ｐ１構造成分は、天然ｐａｃ部位（例えば、プラスミドＤＮＡ）を含有し、プラスミドＤＮＡ１０６（例えば、レポーター遺伝子）を有する非複製的形質導入粒子を産生するＤＮＡのみをパッケージングする。
サイレント変異／相補性に基づくＰ１プラスミドパッケージングシステムで使用されるベクターの一例が、図２に示される。サイレント変異／相補性に基づくＰ１プラスミドパッケージングシステムの菌株及びベクターを構築する方法についての詳細は、下記の実施例１に詳細に記載されている。
２） 欠失／相補性に基づくパッケージングシステム
本発明は、欠失／相補性に基づく方法を用いてＮＲＴＰを生産するための方法を含む。
この非複製的形質導入粒子パッケージングシステムは、ウイルスパッケージング機構によってウイルス産生中にゲノムパッケージングが開始される成分として認識される、ウイルスゲノムの成分の欠失に基づいている。このような成分の例としては、ｐａｃ型バクテリオファージのｐａｃ部位配列及びｃｏｓ型バクテリオファージのｃｏｓ部位配列が挙げられる。これらのパッケージング開始部位はしばしば、ウイルス産生に必須である遺伝子のコード領域内に見出される。いくつかの実施形態では、パッケージング開始部位のみが欠失され、これは、変異ウイルスに溶菌サイクルを起こすことを可能にするが、前記ウイルスにそのゲノムＤＮＡをパッケージングすることは可能にしない。例えば、配列番号６は、欠失したｐａｃ部位配列を有するＰ１ ｐａｃＡ遺伝子の一例である（小文字は欠失したｐａｃ部位配列を示す）。他の実施形態では、パッケージング開始部位を含む遺伝子全体が欠失される。例えば、配列番号８は、ｔｅｒＳ遺伝子の欠失を示している（小文字は欠失した配列を示している）。
一例では、細胞のゲノムは、パッケージング開始部位が欠失されたウイルスゲノムにより溶原化される。相補的プラスミドが細胞に導入され、このプラスミドＤＮＡは、ウイルスゲノム内の欠失したパッケージング開始部位配列を補完するパッケージング開始部位配列を有する遺伝子を含んでいる。変異型ウイルスが溶菌サイクルを起こすと、ウイルスのパッケージングタンパク質は、プラスミドＤＮＡのレプリコンを、そのパッケージング開始部位により、パッケージングユニット内にパッケージングし、複製されたプラスミドＤＮＡを有する非複製的形質導入粒子が産生される。
いくつかの実施形態では、欠失／相補性は、変異したウイルスＤＮＡと相補的な外来ＤＮＡとの間に相同性がないように設計されることが好ましい。これは、変異したウイルスＤＮＡと相補的外来ＤＮＡとの間の相同性の欠如により、ウイルスゲノム中へのパッキング配列の再導入をもたらし得る、この２つのＤＮＡ分子の間の相同組換えの可能性が回避されるためである。相同性の欠如を達成するための、１つの戦略は、ウイルスゲノムからパッケージング開始部位配列を含有する遺伝子全体を除去して、この遺伝子をウイルスから除去されたＤＮＡ配列のみを含有する外来ＤＮＡ分子で補完するというものである。この戦略では、相補的ＤＮＡ分子はウイルスから除去された遺伝子を発現するように設計される。
このようなシステムの別の例は、ｐａｃ型ファージであるバクテリオファージφ８０αを用いて提供される。前記ファージゲノムが宿主細菌細胞内で溶原化され、このファージゲノムには、ｐａｃ型プロファージφ８０αのｐａｃ部位が除去された小ターミナーゼ遺伝子が含まれている。天然ｐａｃ部位を有する相補的小ターミナーゼ遺伝子を含むプラスミドが、細胞に形質転換される。溶原化されたプロファージの溶菌サイクルが誘導されると、バクテリオファージパッケージングシステムは、天然バクテリオファージＤＮＡをパッケージングするのではなく、プラスミドＤＮＡを子孫バクテリオファージ構造成分の中にパッケージングする。このことから、パッケージングシステムによって、プラスミドＤＮＡを有する非複製的形質導入粒子が生産される。
図３は、本発明の一実施形態に係る、ｐａｃ部位欠失／相補性プラスミドパッケージングシステム３００の設計及び機能の一例を示している。細菌細胞３０１が、小ターミナーゼ（ｔｅｒＳ）遺伝子を欠失しているｐａｃ型ファージ３０２によって溶原化される。前記細胞が、ファージ内のｔｅｒＳ遺伝子欠失を補完する小ターミナーゼ遺伝子を含むローリングサークル複製プラスミド３０３によって形質転換される。小ターミナーゼ遺伝子はパッケージング開始部位配列（例えば、ｐａｃ部位）を含有する。プラスミド３０３はまた、レポーター分子をコードするレポーター遺伝子を含んでいてもよい。
小ターミナーゼタンパク質及び巨大ターミナーゼタンパク質を含むタンパク質複合体は、ｐａｃ部位における、又はｐａｃ部位付近の二本鎖ＤＮＡ分子を認識し切断することができ、これにより、プラスミドＤＮＡ分子のファージカプシド内へのパッケージングが可能となる。前記細胞内のプロファージが誘導されると、ファージの溶菌サイクルによって、ファージの構造タンパク質３０４及びファージの巨大ターミナーゼタンパク質３０５が産生される。相補的プラスミドが複製され、小ターミナーゼタンパク質３０６が発現される。ｔｅｒＳ遺伝子（及びレポーター遺伝子）を含有する複製されたプラスミドＤＮＡ３０７がファージカプシド内にパッケージングされ、プラスミドＤＮＡ３０８のみを含有する非複製的形質導入粒子が得られる。図４は、ｐａｃ部位欠失／相補性プラスミドパッケージングシステムで使用される、得られたベクターの一例を示している。ｐａｃ部位欠失／相補性プラスミドパッケージングシステムの成分及び構築についてのさらなる詳細は、下記の実施例２に記載されている。
Ｂ． 病原性アイランドに基づくパッケージングシステム
病原性アイランド（ＰＴＩ）は、ゲノムアイランドとして知られる水平伝播した遺伝因子の一部である。黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）内には、誘導されることである特定の常在プロファージを切除し、ある特定の常在プロファージによって複製する、高度移動性ＰＴＩの特定のファミリーが存在している。これらのＰＴＩは、小頭型ファージ様粒子内にパッケージングされ、ファージのプラーク形成力価に比例した頻度で伝播する。このプロセスはＳａＰＩ除去複製パッケージング（ＥＲＰ）サイクルと称され、高頻度のＳａＰＩ伝播は、従来の一般的形質導入（ＣＧＴ）と特別するために、ＳａＰＩ特異的伝達（ＳＰＳＴ）と称される。ＳａＰＩは、バクテリオファージの遺伝子構成に対応し、他の全ての水平伝播されたゲノムアイランドと明らかに異なる、高度に保存された遺伝子構成を有する。ＳａＰＩ１にコードされたインテグラーゼ及びＳａＰＩｂｏｖ２にコードされたインテグラーゼは、対応する成分の除去及び組込みの両方に必要であり、他のＳａＰＩについても同様であると考えられる。ファージ８０αはいくつかの異なるＳａＰＩ、例えば、ＳａＰＩ１、ＳａＰＩ２、及びＳａＰＩｂｏｖ１を誘導することができ、一方、φ１１はＳａＰＩｂｏｖ１を誘導することはできるが、その他の２つのＳａＰＩのいずれも誘導することができない。
図５は、バクテリオファージによるゲノムアイランド（ＧＩ）パッケージング（５００）の天然プロセスを示している。天然において、適切なプロファージ（５０３）で溶原化されＧＩ（５０４）を有する細菌細胞（５０１）は、ＧＩコンカテマーを有するファージ粒子（５１２）を産生することができる。このプロセスでは、ファージがその溶菌サイクルを引き起こすと、ファージゲノムが細菌ゲノム（５０２）から切除され（図示されず）、それが次にカプシド成分（５０５）及び巨大ターミナーゼタンパク質（ＴｅｒＬ）（５０６）を含むバクテリオファージタンパク質を発現する。また、プロファージ誘導は、ＧＩインテグラーゼタンパク質（ｉｎｔ）（５０７）の発現を介したＧＩ除去も引き起こす。ファージゲノムの切除（図示されず）と同様に、ＧＩが環状化し（５０８）、それ自身の小ターミナーゼタンパク質（ＴｅｒＳ）を発現し（５０９）、複製を開始してＧＩコンカテマーを形成する（５１０）。ファージＴｅｒＬ遺伝子及びＧＩ ＴｅｒＳ遺伝子が組み合わされ、ＧＩゲノム内のｐａｃ部位配列を介してＧＩコンカテマーと結合してそれを切断し得、次に、ＧＩコンカテマーがファージカプシド内にパッケージングされて（５１１）、ＧＩコンカテマーを有するファージ粒子（５１２）が生じ得る。
天然のシステムでは、図５に示されるように、結果として得られるファージ産生からもたらされた可溶化液は、天然ファージ粒子、及びＧＩ含有ファージ粒子の両方を含む。天然ファージ粒子は、ファージゲノムコンカテマー内のｐａｃ部位の認識による、天然ファージゲノムのパッケージングの結果物である。
１） ゲノムアイランド（ＧＩ）パッケージングシステムの設計及び機能
ＮＲＴＰを生産するための本発明の方法は、ＧＩに基づくパッケージングシステムを含む。
プラスミドパッケージングシステムと比較すると、天然のＧＩ−パッケージングシステムは、パッケージングされたＤＮＡが細菌ゲノム内のゲノム領域に由来することから、細菌宿主によるプラスミドの保持を必要としないという利点がある。
いくつかの実施形態では、本発明は、レポーター核酸分子を非複製的形質導入粒子中にパッケージングするための細菌細胞パッケージングシステムを含み、前記細菌細胞は、パッケージング遺伝子を欠失した溶原化されたバクテリオファージゲノム、並びに、核酸分子の可動化にバクテリオファージ（例えば、ヘパー（heper）ファージ）を必要とし、レポーター核酸分子及びパッケージング遺伝子を含む、ゲノムアイランド、潜在性ファージ（criptic phage）、又は他の核酸分子を含む。ゲノムアイランドに基づくシステムは、例えば、黄色ブドウ球菌（S. aureus）病原性アイランド（ＳａＰＩｓ）、大腸菌（E. coli）潜在性ファージＰ４及びヘルパーファージＰ２、並びに腸球菌（Enterococci）潜在性ファージＰ７及びヘルパーファージＰ１に基づき得る。
ＧＩパッケージングシステムを活用することで、外来核酸配列をバクテリオファージにパッケージングすることができる。これは、ＧＩ内にそのような外来核酸配列を組み込むことによって達成することができる。
天然ファージをこのプロセスから排除するために、プロファージの小ターミナーゼ遺伝子が欠失され得る。小ターミナーゼ遺伝子配列は天然ファージのｐａｃ部位配列を含有しており、この欠失は、天然ファージＤＮＡのパッケージングを阻止するという効果を有する。他の実施形態では、小ターミナーゼ遺伝子のｐａｃ部位のみが欠失され得る。パッケージングされるＧＩは、それ自身のｐａｃ部位及び適切な小ターミナーゼタンパク質を発現する小ターミナーゼ遺伝子を含んでおり、ＧＩ ＤＮＡのみがこのシステムのパッケージングに許容される。
図６は、本発明の一実施形態に係る、ＧＩに基づくパッケージングシステム（６００）の設計及び機能の一例を示している。このシステムでは、細菌細胞（６０１）は、そのゲノムが小ターミナーゼ遺伝子を欠失した適切なプロファージ（６０３）によって溶原化されており、前記細胞のゲノム（６０２）はＧＩ（６０４）を有する。前記ファージがその溶菌サイクルを引き起こすと、ファージゲノムが細菌ゲノム（６０２）から切除される（図示されず）。ファージゲノムは、カプシド成分（６０５）及び巨大ターミナーゼタンパク質（ＴｅｒＬ）（６０６）を含む、バクテリオファージタンパク質を発現する。また、プロファージ誘導は、ＧＩインテグラーゼタンパク質（ｉｎｔ）（６０７）の発現を介したＧＩ除去も引き起こす。ファージゲノムの切除（図示されず）と同様に、ＧＩが環状化し（６０８）、それ自身の小ターミナーゼタンパク質（ＴｅｒＳ）を発現し（６０９）、複製してＧＩコンカテマーを形成する（６１０）。ファージＴｅｒＬ遺伝子及びＧＩ ＴｅｒＳ遺伝子が組み合わされ、ＧＩゲノム内のｐａｃ部位配列を介してＧＩコンカテマーと結合してそれを切断する。次に、ＧＩコンカテマーがファージカプシド内にパッケージングされることで（６１１）、ＧＩコンカテマーを有するファージ粒子（６１２）が得られ得る。このシステムでは、ファージＤＮＡは、ファージのｐａｃ部位配列を含有するｔｅｒＳ遺伝子を欠失しており、発現されたＧＩ ＴｅｒＳタンパク質及びファージＴｅｒＬタンパク質によって認識され得ないため、ファージ粒子内にパッケージングされない。
パッケージングされたＧＩ ＤＮＡを含有するファージ粒子が受容細胞に投与されると、ファージは受容細胞の表面に結合し、次にパッケージングされたＧＩ ＤＮＡコンカテマーを細胞内に導入する。細胞内に入ると、ＧＩは再度そのインテグラーゼタンパク質を発現し、次にＧＩは受容細胞のゲノム内の特定部位にインテグレートし得る。外来ＤＮＡ配列がパッケージング前にＧＩ内に含まれている場合、前記パッケージングシステムによって、外来ＤＮＡ配列を受容細胞に送達し、これらの外来ＤＮＡ配列を受容細胞のゲノム内に組み込むことが可能となる。
２） インテグラーゼを欠くＧＩに基づくパッケージングシステム
別の実施形態では、上記のパッケージングシステムは、パッケージングされたＧＩ ＤＮＡが受容細胞のゲノム内にインテグレートできないように設計される。これは、ＧＩ内のインテグラーゼ遺伝子を欠失させ、ＧＩからトランスにインテグラーゼ遺伝子の発現を引き起こすことによりこの欠失を補完することによって、達成され得る。このように、インテグラーゼタンパク質はパッケージング宿主細胞におけるＧＩの除去に利用することができ、バクテリオファージ内にパッケージングされたＧＩ ＤＮＡは、インテグラーゼ遺伝子を含有せず、インテグラーゼタンパク質を発現することができず、そのため送達されたＧＩの組込みが阻止される。
図７は、本発明の一実施形態に係る、ｉｎｔ遺伝子を欠くＧＩに基づくパッケージングシステム（７００）の設計及び機能を示している。このシステムでは、細菌細胞（７０１）はその小ターミナーゼ遺伝子が欠失した適切なプロファージ（７０３）で溶原化される。前記細胞のゲノム（７０２）は、インテグラーゼ（ｉｎｔ）遺伝子が欠失したＧＩ（７０４）を有しており、適切なプロモーターに機能的に連結された欠失されたｉｎｔ遺伝子（７０５）も有している。ｉｎｔ遺伝子はＧＩからトランスにインテグラーゼタンパク質（Ｉｎｔ）を発現し得る（７０６）。前記ファージがその溶菌サイクルを引き起こすと、ファージゲノムが細菌ゲノム（７０２）から切除され（図示されず）、それが次にカプシド成分（７０７）及び巨大ターミナーゼタンパク質（ＴｅｒＬ）（７０８）を含むバクテリオファージタンパク質を発現する。また、プロファージ誘導は、インテグラーゼタンパク質（７０７）の発現を介したＧＩ除去も引き起こす。ファージゲノムの切除（図示されず）と同様に、切除されたＧＩが環状化し（７９）、それ自身の小ターミナーゼタンパク質（ＴｅｒＳ）を発現し（７１０）、複製を開始してＧＩコンカテマーを形成する（７１１）。ファージＴｅｒＬ遺伝子及びＧＩ ＴｅｒＳ遺伝子がＧＩ ＤＮＡ内のｐａｃ部位配列を介してＧＩコンカテマーと結合してそれを切断し得、次に、ＧＩコンカテマーがファージカプシド内にパッケージングされて（７１２）、ＧＩコンカテマーを有するファージ粒子が生じ得る（７１３）。このシステムでは、ファージＤＮＡは、ファージのｐａｃ部位配列を含有するｔｅｒＳ遺伝子を欠失しており、発現されたＧＩ ＴｅｒＳタンパク質及びファージＴｅｒＬタンパク質によって認識され得ないため、パッケージングされない。
ｉｎｔ遺伝子を欠失したパッケージングされたＧＩ ＤＮＡを含有するファージ粒子が受容細胞に投与されると、ファージは受容細胞の表面に結合し、次にパッケージングされたＧＩ ＤＮＡコンカテマーを細胞内に導入する。細胞内に入ると、インテグラーゼ遺伝子の欠失によりＧＩはそのインテグラーゼタンパク質を発現することができず、その後にＧＩは受容細胞のゲノム内の特定部位にインテグレートすることができない。外来ＤＮＡ配列がパッケージング前にＧＩ内に含まれている場合、前記パッケージングシステムによって、外来ＤＮＡ配列を受容細胞に送達することが可能となり、送達されたＤＮＡ配列はＧＩ組込みのための特定部位において受容細胞のゲノム内にインテグレートしない。
３） インテグラーゼを欠くＳａＰＩｂｏｖ２に基づくパッケージングの設計及び機能
いくつかの実施形態では、ＮＲＴＰを生産する方法は、ＧＩに基づくパッケージングシステムにおいてＧＩ ＳａＰＩｂｏｖ２及びバクテリオファージφ１１を用いる。別の実施形態は、他のＳａＰＩ ＧＩの、及び他の適切なバクテリオファージ、例えば、ＳａＰＩのＳａＰＩ１、ＳａＰＩ２、ＳａＰＩｂｏｖ１、及びＳａＰＩｂｏｖ２並びにバクテリオファージ８０α、並びに、ＳａＰＩのＳａＰＩｂｏｖ１及びＳａＰＩｂｏｖ２並びにバクテリオファージφ１１を用い得る。下記の詳細に基づいて、当業者は、セクションＩＩＡに記載される、ｉｎｔ遺伝子を欠失していないＧＩに基づくパッケージングシステムを開発する方法を知ることができるだろう。
図８は、本発明の一実施形態に係る、ｉｎｔ遺伝子を欠失しているＳａＰＩｂｏｖ２に基づくパッケージングシステム（８００）の設計及び機能を示している。この系では、黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞（８０１）が小ターミナーゼ遺伝子が欠失したφ１１（８０３）によって溶原化される。前記細胞のゲノム（８０２）はインテグラーゼ（ｉｎｔ）遺伝子が欠失したＳａＰＩｂｏｖ２（８０４）を有しており、また、恒常的に発現されるＰｃｌｐＢ遺伝子プロモーター（８０５）と機能的に連結した欠失したｉｎｔ遺伝子を有している。ｉｎｔ遺伝子は、ＳａＰＩｂｏｖ２からトランスにインテグラーゼタンパク質（Ｉｎｔ）を発現することができる（８０６）。ファージがその溶菌サイクルを引き起こすと、ファージゲノムが細菌ゲノム（８０２）から切除され（図示されず）、それが次にカプシド成分（８０５）及び巨大ターミナーゼタンパク質（ＴｅｒＬ）（８０６）を含むバクテリオファージタンパク質を発現する。また、プロファージ誘導は、インテグラーゼタンパク質（８０７）の発現を介したＳａＰＩｂｏｖ２除去も引き起こす。ファージゲノムの切除（図示されず）と同様に、切除されたＳａＰＩｂｏｖ２が環状化し（８０９）、それ自身の小ターミナーゼタンパク質（ＴｅｒＳ）を発現し（８１０）、複製を開始してＳａＰＩｂｏｖ２コンカテマーを形成する（５１１）。ファージＴｅｒＬ遺伝子及びＳａＰＩｂｏｖ２ ＴｅｒＳ遺伝子がＳａＰＩｂｏｖ２ＤＮＡ内のｐａｃ部位配列を介してＳａＰＩｂｏｖ２コンカテマーと結合してそれを切断し得、次に、ＳａＰＩｂｏｖ２コンカテマーがファージカプシド内にパッケージングされて（８１２）、ＳａＰＩｂｏｖ２コンカテマーを有するファージ粒子が生じ得る（８１３）。このシステムでは、ファージＤＮＡは、ファージのｐａｃ部位配列を含有するｔｅｒＳ遺伝子を欠失しており、発現されたＳａＰＩｂｏｖ２ ＴｅｒＳタンパク質及びファージＴｅｒＬタンパク質によって認識され得ないため、パッケージングされない。
ＩＶ． レポーター
いくつかの実施形態では、本発明のＮＲＴＰ及びコンストラクトは、レポーター遺伝子を含むレポーター核酸分子を含む。レポーター遺伝子はレポーター分子をコードし得、レポーター分子は検出可能マーカー又は選択マーカーであり得る。ある実施形態では、レポーター遺伝子は、細胞内で発現された際に検出可能なシグナルを生み出すレポーター分子をコードする。
ある実施形態では、レポーター分子は、蛍光レポーター分子、例えば、限定はされないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）又はｍＣｈｅｒｒｙ、並びに近赤外蛍光タンパク質であり得る。
他の実施形態では、レポーター分子は、発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｃ、ｎｌｕｃ等）であり得る。レポーター分子には、細菌ルシフェラーゼ、真核生物ルシフェラーゼ、比色検出に適した酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）、免疫検出に適したタンパク質（例えば、親和性ペプチド（Ｈｉｓタグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ））、アプタマーとして機能する、又は酵素活性を示す核酸（リボザイム）、又は選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ））が含まれ得る。当該技術分野において公知の他のレポーター分子をシグナル発生に用いることで、標的核酸又は標的細胞を検出することができる。
他の態様では、レポーター分子は核酸分子を含む。いくつかの態様では、レポーター分子は、特異的な結合活性を有する、又は酵素活性を示すアプタマーである（例えば、アプタザイム（aptazyme）、ＤＮＡザイム、リボザイム）。
レポーター及びレポーターアッセイは本明細書のセクションＶにさらに記述される。
Ｖ． ＮＲＴＰ及びレポーターアッセイ
Ａ． 誘導因子レポーターアッセイ
本発明は、生細胞内の遺伝子プロモーターを標的とする外来性又は天然の誘導因子と共に使用するための、レポーター分子としてのＮＲＴＰの使用法を含む。本発明のＮＲＴＰは、セクションＩＩＩ及び下記の実施例１〜６に記載される方法を用いて操作することができる。
いくつかの実施形態では、前記方法はＮＲＴＰをレポーターとして使用することを含み、前記ＮＲＴＰは、標的細胞内の標的遺伝子の発現を制御する誘導性プロモーターに機能的に連結されたレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子を含むＮＲＴＰが標的細胞内に導入されると、レポーター遺伝子の発現が、レポーター核酸分子内の標的遺伝子プロモーターの誘導を介して可能となる。
図９は、２つの遺伝子、誘導因子（９０２）をコードする遺伝子及び標的遺伝子（９０３）を有する標的細胞のゲノム遺伝子座（９００）を示している。標的細胞の標的遺伝子のプロモーター（９０６）に機能的に連結されたレポーター遺伝子（９０５）を誘導するレポーター核酸分子（９０４）も示されている。レポーター核酸分子（９０４）は、ＮＲＴＰを介して細胞内に導入され得る。天然細胞において、誘導因子遺伝子（９０２）が発現され誘導因子タンパク質（９０７）が産生されると、誘導因子タンパク質（９０７）は標的遺伝子に機能的に連結された標的遺伝子プロモーター（９０６）を誘導することが可能であるため、標的遺伝子の発現及び標的遺伝子産物（９０８）の産生を引き起こす。
レポーター核酸分子（９０４）が標的生物内に存在すると、誘導因子（９０７）はレポーター核酸分子（９０４）内に存在する標的遺伝子プロモーター（９０６）を誘導するも可能であるため、レポーター遺伝子（９０５）の発現を引き起こし、それにより、検出可能なシグナルを生み出すことが可能なレポーター分子（９０９）の産生がもたらされる。
そのため、レポーター分子（９０９）からの検出可能なシグナルの生成は、標的細胞内の誘導因子タンパク質（９０７）の存在に基づいて、細胞の存在を示すものとなる。
１） ＶａｎＲレポーターシステム
一実施形態では、レポーターシステムはレポーター核酸分子を含むＮＲＴＰ（例えば、プラスミド）を含む。レポーター核酸分子は、フェシウム菌（Enterococcus faecium）（又は大便連鎖球菌（E. faecalis））内のバンコマイシン耐性（ｖａｎＡ）遺伝子のプロモーターの誘導因子であるＶａｎＲを検出するように構築され得る。レポータープラスミドは、ｖａｎＡ遺伝子プロモーターに機能的に連結されたレポーター遺伝子を有する。
図１０はＶａｎＲレポーターシステムの設計及び機能を要約したものである。図１０は、フェシウム菌（E. faecium）に存在し得るトランスポゾンＴｎ１５４６（１００１）の一領域を示している。Ｔｎ１５４６トランスポゾンは、ｖａｎＲ誘導因子遺伝子（１００２）及びｖａｎＡ標的遺伝子（１００３）を含み得る。ＮＲＴＰ内にパッケージングされ細胞内に導入され得るレポーター核酸分子（１００４）も図に示されている。レポーター核酸分子（１００４）は、ｖａｎＡ遺伝子を含むｖａｎＨＡＸオペロンの発現を制御するプロモーターＰH（１００６）に機能的に連結されたレポーター遺伝子（１００５）を含む。天然細胞において、ｖａｎＲ遺伝子（１００２）が発現されＶａｎＲタンパク質（１００７）が産生されると、ＶａｎＲは、Ｔｎ１５４６トランスポゾン内のＰH（１００６）を誘導することが可能であるため、ｖａｎＡ遺伝子の発現を引き起こし、それによりＶａｎＡタンパク質（１００８）を産生する。レポーター核酸分子（１００３）（ベクター）が標的生物内に存在すると、ＶａｎＲは、レポーター核酸分子（１００３）内のＰH（１００６）を誘導することも可能であるため、レポーター分子（１００９）の発現を引き起こす。そのため、レポーター分子の産生は標的細胞内のＶａｎＲの存在を示すものとなる。
ＶＲＥアッセイの開発に適したプロモーターの例としては、ｖａｎＡ遺伝子プロモーター及びｖａｎＢ遺伝子プロモーターが挙げられる。Arthur, M., et al., The VanS sensor negatively controls VanR-mediated transcriptional activation of glycopeptide resistance genes of Tn1546 and related elements in the absence of induction. J. Bacteriol., 1997. 179(1): p. 97-106。
２） ＴｃｄＤレポーターシステム
このシステムの別の実施形態では、ＮＲＴＰを用いてレポーター核酸分子が細胞に導入される。レポーター核酸分子は、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）の毒素Ａ遺伝子及び毒素Ｂ遺伝子（それぞれ、ｔｃｄＡ及びｔｃｄＢ）のプロモーターの誘導因子であるＴｃｄＤを検出することを目的に構築され得る。レポーター核酸分子は、ｔｃｄＡ遺伝子プロモーターに機能的に連結されたレポーター遺伝子を含む。
図１１は、本発明の一実施形態に係る、ＴｃｄＤレポーターシステムの設計及び機能を要約したものである。図１１は、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）内に存在し得るトランスポゾンＰａＬｏｃ（１１０１）の一領域を示している。ＰａＬｏｃトランスポゾンは、ｔｃｄＤ遺伝子（１１０２）及びｔｃｄＡ標的遺伝子（１１０３）を含有し得る。ＮＲＴＰを用いて細胞内に導入されるレポーター核酸分子（１１０４）（例えば、ベクター）も図に示されている。レポーター核酸分子（１１０４）は、ｔｃｄＡ遺伝子プロモーター（ＰtcdA）（１１０６）に機能的に連結されたレポーター遺伝子（１１０５）を含む。
天然細胞において、ｔｃｄＤ遺伝子が発現されＴｃｄＤタンパク質（１１０７）が産生されると、ＴｃｄＤは、ＰａＬｏｃトランスポゾン（１１０１）内のＰtcdA（１１０６）を誘導することが可能であるため、ｔｃｄＡ遺伝子（１１０３）の発現を引き起こし、それにより毒素Ａタンパク質（１１０８）を産生する。
レポーター核酸分子（１１０４）が標的生物内に存在すると、ＴｃｄＤは、レポーターベクター内のＰtcdA（１１０６）を誘導することも可能であるため、レポーター分子（１１０９）の発現を引き起こす。そのため、レポーター分子（１１０９）の産生は標的細胞内のＴｃｄＤの存在を示すものとなる。
クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）アッセイの開発に適したプロモーターの例としては、ｔｃｄＡ遺伝子プロモーター及びｔｃｄＢ遺伝子プロモーターが挙げられる。Karlsson, S., et al., Expression of Clostridium difficile Toxins A and B and Their Sigma Factor TcdD Is Controlled by Temperature. Infect. Immun., 2003. 71(4): p. 1784-1793。
標的細胞及び誘導因子
標的細胞には、真核生物標的及び原核細胞標的並びに関連誘導因子が含まれ得る。
ベクター送達系
組換えＤＮＡを含有するベクターの送達は、非生物学的システム又は生物学的システムによって実行され得る。リポソーム、ウイルス様粒子、ファージ又はウイルス由来の形質導入粒子、及び接合を含むが、これらに限定はされない。
３） バクテリオファージに基づくＳａｒＳレポーターシステム
本発明の別の実施形態では、レポーター核酸分子は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）におけるプロテインＡ遺伝子（ｓｐａ）のプロモーターの誘導因子であるＳａｒＳを検出することを目的に構築される。レポーター核酸分子は、ＮＲＴＰ内で細胞に導入することができ、ｓｐａ遺伝子プロモーター（Ｐspa）に機能的に連結された細菌ルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｘＡ及びｌｕｘＢを含む。レポーター核酸分子は、例えば、ＮＲＴＰを介して黄色ブドウ球菌（S. aureus）に送達される。ＳａｒＳが細胞内に存在する場合、ＳａｒＳはｌｕｘＡＢ遺伝子の発現を誘導するため、発光シグナルを生み出すことが可能なルシフェラーゼ酵素が産生される。
図１２は、本発明の一実施形態に係る、ＳａｒＳレポーターシステム設計及び機能を要約したものである。図１２は、ｓａｒＳ遺伝子（１２０２）及びｓｐａ遺伝子（１２０３）を含有する黄色ブドウ球菌（S. aureus）ゲノム（１２０１）の一領域を示している。ＮＲＴＰによって細胞に送達され、ｓｐａ遺伝子（１２０３）の発現を制御するプロモーターＰspa（１２０６）に機能的に連結されたｌｕｘＡＢレポーター遺伝子（１２０５）を含む、レポーター核酸分子（例えば、ベクター）（１２０４）も、図に示されている。
天然細胞において、ｓａｒＳ遺伝子（１２０２）が発現されＳａｒＳタンパク質（１２０７）が産生されると、前記タンパク質は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ゲノムトランスポゾン内のＰspa（１２０６）を誘導することが可能であるため、ｓｐａ遺伝子（１２０３）の発現を引き起こし、プロテインＡ（１２０８）を産生する。
レポーター核酸分子（１２０４）が標的生物内に存在すると、ＳａｒＳ（１２０７）は、レポーター核酸分子（１２０４）内のＰspa（１２０６）を誘導することも可能であるため、ｌｕｘＡＢの発現を引き起こし、それにより、発光シグナルを生み出し得るルシフェラーゼ酵素（１２０９）の産生をもたらす。そのため、ルシフェラーゼの産生は標的細胞内のＳａｒＳの存在を示すものとなる。
Ｂ． 酵素レポーターアッセイ
本発明は、本発明の一実施形態に係る、標的細胞内酵素によって非ケージ化され得るケージ化基質分子を利用する、生細胞内の細胞内酵素を検出するためのシステムを含む。
図１３は、細胞内酵素検出システムの設計及び機能を示している。レポーター分子発現ベクター（１３０１）は、ＮＲＴＰ（図示されず）によって標的細胞（１３０２）に送達される。レポーター分子発現ベクター（１３０１）はＮＲＴＰを介して標的細胞（１３０２）に進入しレポーター分子遺伝子（１３０３）を標的細胞（１３０２）に送達することが可能であり、その後、レポーター分子（１３０４）がレポーター分子遺伝子（１３０３）から発現され得る。ケージ化基質（１３０５）も標的細胞（１３０２）に添加され、標的細胞（１３０２）に進入することが可能である。標的細胞内酵素（１３０７）が標的細胞（１３０６）内に存在する場合、前記酵素（１３０７）はケージ化基質（１３０５）のケージング成分を除去することが可能であるため、非ケージ化基質（１３０８）が生成される。非ケージ化基質（１３０８）はその後細胞（１３０２）内のレポーター分子（１３０４）と反応することが可能であり、この反応の産物が検出可能なシグナル（１３０９）をもたらす。
標的細胞及び酵素
標的細胞には、真核生物標的及び原核細胞標的、並びに関連酵素（例えば、黄色ブドウ球菌（S. aureus）に存在するβ−ラクタマーゼ）が含まれ得る。
ベクター送達系
組換えＤＮＡを含有するベクターの送達は、非生物学的システム又は生物学的システムによって実行され得る。リポソーム、ウイルス様粒子、ファージ又はウイルス由来の形質導入粒子、及び接合を含むがこれらに限定はされない。
レポーター分子及びケージ化基質
種々のレポーター分子及びケージ化基質を、Daniel Sobek, J.R., Enzyme detection system with caged substrates, 2007, Zymera, Incに記載されるものとして使用することができる。
１） バクテリオファージに基づくβ−ラクタマーゼレポーター
一実施形態では、レポーター分子発現ベクターは、前記ベクターが細菌細胞内に送達され得るように、ＮＲＴＰによって運搬され得る。発現されるレポーター分子はウミシイタケルシフェラーゼであり得、ケージ化基質は、標的細胞に内因性であるβ−ラクタマーゼ酵素がケージ化されたルシフェリンからケージ化化合物を切断し非ケージ化ルシフェリンを放出することができるような、ケージ化されたウミシイタケ属ルシフェリンであり得る。
図１４は、本発明の一実施形態に係る、β−ラクタマーゼ酵素検出システムの設計及び機能を示している。バクテリオファージに基づくＮＲＴＰ（１４０１）によって運搬されるウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクターが、標的黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞（１４０２）に添加される。ウミシイタケルシフェラーゼ発現ベクターは、前記ベクターを含むＮＲＴＰを利用して標的細胞（１４０２）に進入することができる。ＮＲＴＰがウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（１４０３）を標的細胞（１４０２）内に送達し、その後ウミシイタケルシフェラーゼ（１４０４）がその遺伝子から発現され得る。また、ケージ化ウミシイタケ属ルシフェリン（１４０５）が標的細胞（１４０２）に添加され、前記ルシフェリンは標的細胞（１４０２）内に進入することができる。細胞内β−ラクタマーゼ（１４０７）が標的細胞（１４０２）内に存在する場合、前記酵素がケージ化されたルシフェリン（１４０６）のケージ化成分を除去し、それにより非ケージ化ルシフェリン（１４０８）が生成される。その後、非ケージ化ルシフェリン（１４０８）は前記細胞（１４０２）内のウミシイタケルシフェラーゼ（１４０４）と反応し得、この反応の産物が発光をもたらす（１４０９）。
このように、β−ラクタマーゼを含有する標的細胞がＮＲＴＰ及びケージ化ルシフェリンに曝されると、前記細胞は前記細胞に存在するβ−ラクタマーゼの存在を示す発光シグナルを示す。
Ｃ． 細胞内分子レポーター
本発明は、標的分子に結合した後に検出可能なシグナルを生み出すことが可能な切替可能分子を利用する、生細胞内の細胞内分子を検出するためのシステムを含む。
図１５は、切替可能分子（ＳＭ）に基づく細胞内分子検出システムの設計及び機能を示している。ＳＭ発現ベクター（１５０１）はＮＲＴＰ内で標的細胞（１５０２）に送達される。ＳＭ発現ベクター（１５０１）は、標的細胞（１５０２）に進入し、ＳＭ遺伝子（１５０３）を標的細胞（１５０２）内に送達することができる。その後、ＳＭタンパク質（１５０４）がＳＭ遺伝子（１５０３）から発現され得る。その後、ＳＭタンパク質（１５０４）が前記細胞内の標的分子（１５０５）に結合し、それによりＳＭ標的分子複合体（１５０６）が形成され得る。標的分子（１５０５）へのＳＭ（１５０４）の結合は、結合したＳＭを基質の結合に適したものにする、ＳＭ（１５０４）における立体構造変化をもたらす。基質（１５０８）が前記細胞（１５０７）に添加され、前記基質は前記細胞（１５０２）内に進入することができる。また、前記細胞（１５０２）内の結合型ＳＭは、基質と結合し、それによりＳＭ標的分子−基質複合体（１５０９）を形成することができる。そして、標的分子結合型ＳＭによる基質（１５０８）の結合は、検出可能なシグナルを生み出す効果を有する（１５１０）。このことから、前記システムによって生み出された検出可能なシグナルは、細胞内の標的分子の存在を示すものである。
標的細胞及び分子
種々の真核生物標的及び原核細胞標的が使用可能であり、切替可能アプタマーに基づくＳＭは、Samie Jaffrey, J.P., Coupled recognition/detection system for in vivo and in vitro use, 2010, Cornell Universityに記載されるように、種々の核酸及びアミノ酸に基づく細胞内分子標的を標的とするように設計することができる。
ベクター送達系
組換えＤＮＡを含有するベクターの送達は、非生物学的システム又は生物学的システムによって実行され得る。リポソーム、ウイルス様粒子、ファージ又はウイルス由来の形質導入粒子、及び接合が含まれるが、これらに限定はされない。
１） 非複製的形質導入粒子／切替可能アプタマーに基づく細胞内分子レポーターシステム
この方法の一例では、切替可能分子発現ベクターが、前記ベクターが細菌細胞内に送達され得るように、バクテリオファージに基づく形質導入粒子によって運搬され得る。発現される切替可能分子は、細胞内標的分子への結合後に立体構造変化を起こすように設計された切替可能アプタマーであり得る。立体構造変化は、アプタマーに、アプタマーが結合した際に強化蛍光を発するフルオロフォアと結合することを可能にする。
図１６は、バクテリオファージ／切替可能アプタマー（ＳＡ）に基づく細胞内分子レポーターシステムの設計及び機能を示している。ＮＲＴＰ（１６０１）によって運搬されるＳＡ発現ベクターが標的細胞（１６０２）に添加される。ＮＲＴＰ（１６０１）は、ＳＡ発現ベクター及びＳＡ発現遺伝子（１６０３）を標的細胞（１６０２）内に送達することができる。その後、ＳＡタンパク質（１６０４）がＳＡ遺伝子（１６０３）から発現され得る。その後、ＳＡタンパク質（１６０４）が前記細胞内の標的分子（１６０５）に結合し、それによりＳＡ標的分子複合体（１６０６）が形成され得る。標的分子（１６０５）へのＳＡ（１６０４）の結合は、結合したＳＡをフルオロフォア（１６０８）の結合に適したものにする、ＳＡにおける立体構造変化をもたらす。フルオロフォア（１６０７）が前記細胞に添加され、前記フルオロフォアは前記細胞（１６０８）内に進入することができる。また、前記細胞内の結合型ＳＡは、フルオロフォアと結合し、それによりＳＡ標的分子−フルオロフォア複合体（１６０９）を形成することができる。そして、標的分子結合型ＳＡによるフルオロフォアの結合は、フルオロフォア（1610）の蛍光を増強する効果を有する（１５１０）。このことから、前記システムによって生み出された検出可能な蛍光シグナルは、細胞内の標的分子の存在を示すものである。
Ｄ． 転写物レポーターアッセイ
本発明は、標的転写物が細胞内に存在する場合にレポーター分子の発現を引き起こすことによって生細胞内の標的転写物を検出するためのアンチセンスＲＮＡに基づく方法を含む、レポーターアッセイを含む。
遺伝子発現を阻害するための当該技術分野におけるある特定の細胞内方法は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）等の低分子干渉ＲＮＡを使用することにより、細胞内の転写遺伝子を標的にする。ｄｓＲＮＡは、細胞内に送達され細胞内で発現されるアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、ｄｓＲＮＡ鎖は、一方の鎖（典型的にはアンチセンス鎖）が標的遺伝子配列（ＲＮＡ転写物）に結合して標的遺伝子配列の発現を阻止する、トランス作動性の阻害機構を介して作用する。二本鎖ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られる、高度に保存された制御機構において遺伝子発現を阻止（ノックダウン）することが示されている。国際公開第９９／３２６１９号（Fire et al.）では、線虫（C. elegans）内の遺伝子の発現を阻害するための、少なくとも２５ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡの使用が開示されている。ｄｓＲＮＡは、他の生物、例えば、植物（例えば、国際公開第９９／５３０５０号、Waterhouse et al.；及び国際公開第９９／６１６３１号、Heifetz et al.を参照）、ショウジョウバエ（例えば、Yang, D., et al., Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200を参照）、及び哺乳動物（国際公開第００／４４８９５号、Limmer; and DE 101 00 586.5, Kreutzer et al.）において、標的ＲＮＡを分解することも示されている。しかし、標的遺伝子へのｄｓＲＮＡの鎖の結合は非特異的であり得る。同様の機構が検出システムに適用された場合、この非特異的結合は高い偽陽性率をもたらす可能性があり、これにより、検出システムが臨床的に有用な検出システムの開発に不適切なものとなる。
以前のトランス作動性阻害機構は、臨床的に有用な検出システムの開発に不適切であることが示されている。例えば、いくつかの方法は、前記アッセイの９０％感度を達成する場合、高レベルの非特異的シグナル及び最大９０％の偽陽性率をもたらす。米国特許第８，３２９，８８９号を参照されたい。トランス活性化ＲＮＡ転写物と共にマーカーのリボソーム結合部位がシス抑制配列によってブロックされる、シス抑制型マーカー転写物（例えば、緑色蛍光タンパク質マーカー）を使用する、遺伝子発現の転写後調節のためのある特定の方法が開発された。トランス活性化ＲＮＡ転写物がシス抑制型マーカー転写物に結合すると、シス抑制型マーカー転写物のヘアピン構造が変化し、マーカー遺伝子の上流リボソーム結合部位が露出され、マーカー遺伝子の転写及び発現が可能となる。しかし、これらの方法は内在性転写物の検出のために以前に使用されておらず、細胞内の遺伝子の発現を調節するための基本的な切り替え機構を上回る好結果にもならなかった。
１） 核酸分子の相互作用及び機構
本発明の方法は、転写レベル調節機構（例えば、細胞におけるアンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）機構）を利用することで、細胞内に核酸分子を送達する。アンチセンス機構には、標的転写物の発現の減少、排除、増加、活性化、又は変化をもたらす、配列特異的なｍＲＮＡ認識の全ての形態が含まれる。Good, L., Translation Repression By Antisense Sequences. Cellular and Molecular Life Sciences, 2003. 60(5): p. 854-861, and Lioliou, E., RNA-mediated regulation in bacteria: from natural to artificial systems, New Biotechnology. 2010. 27(3): p. 222-235を参照されたい。自然発生的なａｓＲＮＡは３つ全ての生物界に存在しており、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の破壊、抑制及び活性化、並びにＲＮＡのプロセシング及び転写に影響を与える。Sabine, B., Antisense-RNA regulation and RNA Interference. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression, 2001. 1575(1-3): p. 15-25を参照されたい。この機構は、治療への応用を目的としたタンパク質合成の阻害に活用されている。
アンチセンスＲＮＡは、細胞内で転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）鎖に相補的な一本鎖ＲＮＡである。ａｓＲＮＡが細胞内に導入されることで、相補的なｍＲＮＡへの塩基対形成及び翻訳機構の物理的な妨害により、相補的ｍＲＮＡの翻訳が阻害され得る。アンチセンスＲＮＡが相補的なｍＲＮＡ標的配列にアニーリングし、リボソーム接近又はリボソームのリードスルーの立体障害の結果として、ｍＲＮＡ標的配列の翻訳が破壊される。
アンチセンスＲＮＡ機構は、最も典型的にはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を標的とすることでｍＲＮＡに結合しそれを分解することによる、二本鎖ＲＮＡ断片（ｄｓＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とも呼ばれる）が触媒により媒介される遺伝子サイレンシングを引き起こす関連プロセスである、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と異なっている。ｍＲＮＡ又はＤＮＡへのｄｓＲＮＡ分子の一方の鎖のアニーリングは、細胞内のリボヌクレアーゼによって、又はアンチセンス化合物それ自身による標的ＲＮＡの切断によって、二本鎖ＲＮＡ、ハイブリッドＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖、又はｔＲＮＡ前駆体に類似した二本鎖ＲＮＡの迅速な分解をもたらし得る。
ＲＮＡｉ経路は多くの真核生物に存在しており、長二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子をｓｉＲＮＡと称される〜２０ヌクレオチドの短二本鎖断片に切断するダイサー酵素によって開始される。それぞれのｓｉＲＮＡは、２本の一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、すなわちパッセンジャー鎖及びガイド鎖に巻き戻される。パッセンジャー鎖は分解され、ガイド鎖はＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内に組み込まれる。転写後の遺伝子サイレンシングにおいて、ガイド鎖はメッセンジャーＲＮＡ分子内の相補的配列と塩基対合し、ＲＩＳＣ複合体の触媒成分であるアルゴノートと称されるタンパク質によって切断が誘導される。
本発明の機構の核酸相互作用に関して、レポーター転写物及び標的転写物の間の相互作用は、両方の転写物に存在するループ（例えば、「キシング複合体（kissing complex）」）間、又はループ及び一本鎖（ｓｓ）領域間の塩基対形成に依存し得る。場合によっては、キッシング複合体形成が相互作用の所望の効果を媒介するのに充分であり、他の場合では、一次接触の普及が所望の効果に繋がる相互作用をもたらす。
２） 転写レベル調節を介したレポーターコンストラクト翻訳のシス抑制及びトランス活性化のための機構
以下の記述は、本発明の実施形態に係る、使用され得る種々の抑制／活性化機構に基づく転写レポーターシステムを説明している。図１７〜２０のそれぞれにおいて、ベクターはレポーター配列を含むレポーターコンストラクトを含んでおり、シス抑制配列による抑制の標的とされ得る領域を含む、レポーターコンストラクト上の領域がそれぞれの図に示されている。以下の記述は、転写減衰、翻訳減衰、及び転写物の不安定化を含む種々の阻害機構、並びに立体構造変化及び切断を含む種々の活性化機構の非限定例を提供している。
図１７は、レポーター転写物（１７０３）上のレポーター配列（１７０２）の５’ＵＴＲ（非翻訳領域）（１７０１）を標的とし得るシス抑制機構を用いるシステム（１７００）の一例を示している。レポーター配列（１７０２）内の領域（５’ＵＴＲ（１７０１）、ＲＢＳ、コード領域及び３’ＵＴＲ）も示されている。シス抑制配列（１７０５）は、レポーター配列の上流、レポーター配列の５’ＵＴＲ（１７０１）までである。ＲＮＡポリメラーゼ（１７０４）は、ベクター（１７０６）からレポーターコンストラクト（１７０３）の配列を転写する。
転写中のいくつかの時点において、転写プロセスは、転写されたシス抑制配列（１７０５）内の相互作用に起因する、レポーター転写物（１７０３）内の転写終結（ＴＴ）ステムループ構造（１７０７）の形成によって停止される。転写終結（１７０７）構造は、ＲＮＡポリメラーゼ（１７０４）のベクター（１７０６）転写を停止する（１７０８）。いくつかの実施形態では、転写終結タンパク質（例えば、大腸菌（E. coli）のＮｕｓＡ）がＲＮＡポリメラーゼに、及び／又は転写終結（１７０７）構造に結合することで、レポーターコンストラクトの転写が終結される。
標的転写物（１７０９）が細胞内に存在する場合、標的転写物（１７０９）はレポーター転写物（１７０３）に結合する。いくつかの実施形態では、標的転写物及びレポーター転写物の間の結合は、各配列内のヌクレオチドの塩基対形成によるものである。標的転写物（１７０９）及びレポーター転写物（１０３）の間の相互作用は、転写終結（ＴＴ）ステムループ構造（１７０７）の切断（１７１０）を引き起こす。レポーター転写物（１７０３）の切断は、例えば、ＲＮａｓｅＩＩＩ等の細胞酵素によって生じ得る。この場合、標的転写物の二次構造は、二次構造のｓｓＲＮＡ領域間のＲＮＡｓｅＩＩＩコンセンサス配列、例えば、５’−ｎｎＷＡＷＧＮＮＮＵＵＮ−３’又は５’−ＮＡＧＮＮＮＮＣＷＵＷｎｎ−３’の存在について解析され、「Ｎ」及び「ｎ」があらゆるヌクレオチドであり、「Ｗ」はＡ又はＵであり、「Ｎ」は比較的厳密なワトソン・クリック型塩基対の要求を示し、一方「ｎ」は最低限の塩基対形成の要求を示している。このようなコンセンサス配列が標的転写物上に存在する場合、転写終結構造のループ（１７０７）は前記ＲＮＡｓｅＩＩＩコンセンサス配列に相補的となるように設計され得、それにより、各ＲＮＡ分子内のｓｓＲＮＡがハイブリダイズする際、ＲＮＡｓｅＩＩＩ切断部位が形成されて、転写終結構造（１７０７）の切断が可能となる。ｍｅｃＡ転写物では、ヌクレオチド１，４０４から開始されるループＴ２３は、そのようなアプローチに適した配列ＣＡＧＡＵＡＡＣＡＵＵＵＵを有する。
いくつかの実施形態では、レポーター転写物が転写後に切断されるように、切断部位がレポーターコンストラクト内で操作される。提供される例では、切断は転写ターミネーター構造内のループの位置のすぐ隣で生じ得る。転写はＲＮＡポリメラーゼ（１０４）によって再開される（１７１１）。転写終結（ＴＴ）ステムループ構造（１７０７）の切断は、レポーター配列（１７０２）の残りの転写及び続く翻訳を可能にする。これにより、翻訳されたレポーター分子からの検出可能マーカー又は選択マーカーの産生がもたらされる。
原核生物では、転写終結構造（１７０７）は、７〜２０塩基対長であり、シトシン−グアニン塩基対が豊富であり、且つウラシル残基の鎖が後に続く、ステムループ構造を有するＲｈｏ依存的機構を包含する。ＮｕｓＡが転写終結ステムループ構造（１７０７）に結合すると、ポリウラシル配列の転写中にＲＮＡポリメラーゼの停止が引き起こされる。弱いアデニン−ウラシル結合はＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の不安定化のエネルギーを低下させ、ＲＮＡ−ＤＮＡ二本鎖の巻き戻し及びＲＮＡポリメラーゼからの解離を可能にする。真核生物では、転写終結構造（１７０７）はタンパク質因子によって認識され、新規転写物の切断及びその後のポリアデニル化を包含する。
図１８は、レポーター転写物（１７０３）内のレポーター配列（１７０２）のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）（１８０１）を標的とするシス抑制機構に基づく、細胞内の標的転写物の存在を検出するためのシステム（１８００）の一例を示している。ＲＢＳ（１８０１）は、タンパク質翻訳を開始する際にリボソーム（１８０２）が結合するｍＲＮＡの配列である。シス抑制配列（１７０５）は、ＲＢＳ（１８０１）に結合するように設計される（例えば、シス抑制配列（１７０５）はＲＢＳ配列（１８０１）に相補的である）。ＲＢＳ（１８０１）がシス抑制配列（１７０５）に結合し、隔離状態（リボソーム（１８０２）が接近し難い）となることで、レポーター転写物（１７０３）の翻訳が阻止される。細胞由来の標的転写物（１０９）がレポーター転写物（１７０３）に結合すると、標的転写物（１７０９）はＲＢＳ配列（１８０１）に対しより高い結合親和性するようになり、シス抑制配列（１７０５）配列及びＲＢＳ配列（１８０１）の間の結合を解放するような、レポーター転写物（１７０３）内の立体構造変化が生じる。これにより、リボソーム（１８０２）のＲＢＳ（１８０１）への結合が可能となることで、レポーター転写物（１７０３）の翻訳が可能となる。
図１９は、レポーター転写物（１７０３）内のレポーター配列（１７０２）のコード領域（「ＡＵＧ」）（１９０１）を標的とするシス抑制機構に基づく、細胞内の標的転写物の存在を検出するための例示的なシステム（１９００）を説明している。シス抑制配列（１７０５）は、レポーター配列（１７０２）のコード領域（１９０１）と結合するように（例えば、相補的）、構築される。「ＡＵＧ」開始コドンがコード領域の一部（１９０１）として示される。シス抑制配列（１７０５）及びコード領域（１９０１）の結合は、レポーターコンストラクト（１７０３）の切断（１９０２）に繋がる高次構造をもたらす。レポーター転写物（１７０３）の切断により翻訳が阻止される。
標的転写物（１７０９）が細胞内に存在する場合、標的転写物（１７０９）は、レポーター転写物（１７０３）内の立体構造変化を引き起こすように、シス抑制配列（１７０５）に結合する。この立体構造変化は、シス抑制配列（１７０５）及びレポーター配列（１７０２）のコード領域（１９０１）の間の相互作用を阻止又は排除し、それにより、レポーター配列（１７０２）の翻訳が可能となる。
図２０は、不安定なレポーター転写物（２００１）を用いる抑制機構に基づく、細胞内の標的転写物の存在を検出するためのシステム（２０００）の一例を図示している。レポーター転写物（２００１）は、レポーター転写物（２００１）の翻訳を妨げる不安定な高次構造を形成するように、不安定であるように設計される。レポーター転写物（２００１）は、エキソソーム複合体又はデグラドソームの活性等の、種々の因子による急速な分解を受け易い場合に、不安定であると定義される。細胞内の標的転写物（１７０９）が不安定なレポーター転写物（２００１）の一部に結合する。この例では、前記転写物の不安定化に関与する部分はレポーター配列の３’ＵＴＲ（２００５）に位置しており、前記３’ＵＴＲ（２００５）はレポーターコンストラクト（１７０３）のシス抑制配列のように機能する。標的転写物（１７０９）とレポーター配列の３’ＵＴＲ（２００５）との結合は、レポーター転写物（２００１）を安定化させ、レポーター転写物（２００１）の翻訳（２００４）を可能にする切断事象（２００３）をもたらす。切断は標的転写物（１７０９）の結合後に生じ、転写物の不安定化に関与する配列の一部を除去する働きをする。この例では、標的転写物（１７０９）がレポーター配列の３’ＵＴＲ（４０５）に結合するが、前記システム（４００）は５’ＵＴＲ、５’ＵＴＲの上流、又は３’ＵＴＲの下流で結合及び切断が生じるように設計される場合もある。結合及び切断は、レポーター配列（１７０２）の翻訳に必要な領域の外側であれば、どこで生じてもよい。
いくつかの実施形態では、シス抑制配列それ自体は、互いに結合し得る（例えば、互いに相補的な）２つの配列を含み、シス抑制配列の２つの配列の結合により生じるレポーター転写物の高次構造が、レポーター転写物内のレポーター配列の翻訳を妨げる。
３） 抑制／活性化機構の天然システム及び合成システム
図１７〜２０に図示されるそれぞれの例で使用される個々の機構（すなわち、立体構造変化及び切断）を示す、いくつかの、天然、及び合成により生産される転写レベル機構が報告されている。
転写終結は、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）介在性転写減衰において観察されている。一例では、ＲＮＡＩＩＩ／ｒｅｐＲ ｍＲＮＡ間の２つのループ-ループ相互作用の後に、安定な二本鎖の形成が起こる。この複合体がＲｈｏ依存性ターミネーター構造を安定化させて、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）による伸長を停止させる。
ＲＢＳ隔離機構が、合成リボスイッチシステムの開発によって報告されている。このシステムでは、ＲＢＳに相補的な配列がＲＢＳの上流に配置され、前記２つの領域間にリンカー配列を存在させている。ｍＲＮＡの転写の後、前記２つの相補的領域はハイブリダイズし、リボソームのドッキングを妨げるヘアピンを生じる。翻訳を活性化させるために、ＲＢＳ配列を有する合成トランス活性化ＲＮＡが、ハイブリダイズしたＲＮＡに結合し、ＲＢＳを露出させ、翻訳に利用可能にする。
ＲＮＡの切断による翻訳の阻害は、ａｓＲＮＡ ＭｉｃＣがｏｍｐＤ ｍＲＮＡのコード領域内の配列を標的にする天然システムにおいても報告されている。Ｈｆｑによって促進される前記相互作用は、ＲＮａｓｅ ＥによるｍＲＮＡの切断を引き起こす。
さらに別の天然機構は、切断事象を示すことで、翻訳を阻害するのではなく、翻訳を活性化する。大腸菌(E. coli)ＧａｄＹ ａｓＲＮＡは、ｇａｄＸＷオペロンの２つの遺伝子の間の遺伝子間領域を標的にする。ＧａｄＹ及びｇａｄＸの３’ＵＴＲ間の安定なヘリックスの形成の後、ＲＮａｓｅ切断が転写物で生じ、ｇａｄＸ転写物を安定化させ、それによりｇａｄＸ転写物の翻訳が可能となる。
４） レポーター配列のシス抑制及び標的転写物の結合による立体構造変化の機構
本発明で使用される一般機構は、続く２つの機構：（１）核酸分子の二次構造における立体構造変化、及び（２）切断事象をもたらし得る、分子間の核酸分子相互作用である。立体構造変化がレポーター転写物への標的転写物の結合によって誘導されるような、シス抑制された高次構造及び抑制解除された高次構造の間の立体構造変化を起こすことが可能な、レポーター転写物を設計するための方法が本明細書に記載される。
上記のように、レポーター転写物は、レポーター配列を含み、レポーター遺伝子のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）のシス抑制によってレポーター遺伝子配列の翻訳が阻止されるように設計され得る。
いくつかの実施形態では、以下の手段が本発明のレポーター転写物を設計するために使用され得る。
１） ＲＮＡ二次構造は、ニューヨーク州立大学オルバニー校のＴｈｅ ＲＮＡ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｒｔｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって維持されるサーバーで利用可能なＭｆｏｌｄ（Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-15, (2003)）（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form）等の、二次構造プログラムを用いて計算される。
２） 分子間ＲＮＡ相互作用は、奈良先端科学技術大学院大学（ＮＡＩＳＴ）大学院情報科学研究科、慶応義塾大学生命情報学科、日本（http://rna.naist.jp/ractip/）によって維持されるサーバーで利用可能な、整数計画法（Integer Programming）を用いたＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用予測（ＲａｃｔＩＰ）等の、ソフトウェアプログラムを用いて計算される。
３） ＲＮＡ二次構造は、ＲＮＡの二次構造の描画専用のＪａｖａ（登録商標）軽量アプレットである、ＲＮＡの可視化アプレット（Visualization Applet for RNA）（ＶＡＲＮＡ）（http://varna.lri.fr/）を用いて可視化される。
標的転写物の二次構造は、Ｍｆｏｌｄによって算出される最も低いエネルギー配置に基づいて作製され、ＶＡＲＮＡによって可視化され得る。
レポーター転写物への結合に理想的であり得る標的転写物内のｓｓＲＮＡ領域又は標的領域が同定され得る。いくつかの例では、標的転写物の二次構造は、レポーター配列の一部に結合し得るコンセンサス配列又はループ配列を含む。例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（S. aureus）のｍｅｃＡ転写物には、レポーター転写物のシス抑制配列への結合に使用され得るコンセンサスＹＵＮＲ配列（「ＵＵＧＧ」）を含む末端ループが存在する。標的転写物の二次構造の解析によって、シス抑制配列への結合に適したものであり得る、これらの一つ又は複数のｓｓＲＮＡ領域が明らかとなり得る。この後、レポーター転写物のシス抑制配列が、これらの一つ又は複数のｓｓＲＮＡ領域へ結合するように設計され得る。
いくつかの実施形態では、シス抑制配列は、レポーター転写物内のレポーター配列のＲＢＳに結合し、レポーター転写物内でステムループ構造を形成することで、シス抑制配列がレポーター配列のＲＢＳへのＲＮＡポリメラーゼの結合を阻止するように、設計され得る。シス抑制配列が標的転写物のｓｓＲＮＡ領域に結合した後、レポーター配列のＲＢＳが露出され、レポーター配列の翻訳が開始され得る。
いくつかの実施形態では、レポーター転写物のシス抑制配列は、レポーター配列の５’末端に配置されるように設計され、レポーター配列内にステムループ構造を生むことで、レポーター配列のＲＢＳ配列が阻止されるように設計され得る。シス抑制するステムループ構造は、Ｍｆｏｌｄによって算出されるレポーター転写物の最も低いエネルギー配置に基づいて、ＲＢＳ配列をブロックするように設計され、ＶＡＲＮＡによって可視化され得る。標的転写物及びレポーター転写物のシス抑制配列の間の分子間相互作用の予測は、ＲａｃｔＩＰによって算出され、ＶＡＲＮＡによって可視化され得る。以下の図２８に示すように、標的転写物及びレポーター転写物のシス抑制配列の間の塩基対形成を可視化するための図が描画され得る。
前記相互作用は、標的配列及びシス抑制配列において、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０以上のヌクレオチド間の塩基対形成を含み得る。２つの配列間の相補的結合は、完全に相補的、実質的に相補的、又は部分的に相補的であり得る。塩基対形成は、例えば、図２８に示されるように、標的配列及びシス抑制配列内の連続したヌクレオチド配列又は領域に渡るものであり得る。
５） シス抑制転写物又はレポーター転写物の切断機構
本発明で使用される一般機構は、続く２つの機構：（１）核酸分子の二次構造における立体構造変化、及び（２）切断事象をもたらし得る、分子間の核酸分子相互作用である。切断事象を用いるレポーター転写物を設計するための方法及びシステムが本明細書に記載される。
いくつかの実施形態では、切断機構がシス抑制又はトランス活性化のために本発明のシステム及び方法で使用され得る。例えば、上記の図１７、図１９及び図２０のように、システムはレポーター転写物の核酸配列を切断酵素（ＲＮａｓｅ）に暴露することにより、又は配列特異的ＲＮＡａｓｅによって認識される一本鎖配列を隔離することにより、切断機構を利用するように設計され得る。
一例では、リボヌクレアーゼＥ（ＲＮＡｓｅ Ｅ）部位がレポーター転写物内に設計され得る（「*」は切断部位を示す）：（Ｇ、Ａ）Ｎ（Ｃ、Ａ）Ｎ（Ｇ）（Ｇ、Ｕ、Ａ）*（Ａ、Ｕ）（Ｃ、Ｕ）Ｎ（Ｃ、Ａ）（Ｃ、Ａ）。Kaberdin et al., Probing the substrate specificity of E. coli RNase E using a novel oligonucleotide-based assay. Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No. 16 (doi: 10.1093/nar/gkg690)を参照されたい。
シス抑制システムでは、シス抑制配列がレポーター転写物の設計に組み込まれることで、転写された際に、レポーター転写物の高次構造が、所望の切断されるべき部位でＲＮＡｓｅ Ｅ認識モチーフ配列を含有する一本鎖領域を露出させる得る。いくつかの実施形態では、切断部位は、例えば、切断部位がレポーター遺伝子のコード領域内に存在する場合、レポーター転写物の転写の抑制に関与し得る。
トランス抑制解除システムにおいて、シス抑制された転写物が標的転写物に結合するように設計されることで、その相互作用が、ＲＮＡｓｅ Ｅ部位を含有する一本鎖領域を隔離するレポーター転写物で立体構造変化を引き起こし得る。
前記システムは、シス抑制機構が上記の転写終結構造等のシス抑制配列の高次構造によって生じる特定の二次構造によるものであるように、設計され得る。この例では、切断事象はレポーター配列を抑制解除する働きを有する。これは、シス抑制配列を天然プラスミド又は他の細胞転写物と相互作用（結合）するように設計することで、前記相互作用が、切断され得るＲＮＡｓｅ Ｅ部位を含有する一本鎖領域の発生をもたらして、シス抑制配列をレポーター転写物から除去することによって、達成され得る。
いくつかの実施形態では、切断事象がレポーターの発現に用いられる場合、ＲＮＡｓｅ Ｅ部位は、レポーター転写物を存続可能にするために５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲに充分な配列長を有するレポーター配列のコード領域の外側に存在するように設計される。この場合、ＲＮＡｓｅ Ｅ部位は、原核生物システムにおいては開始コドンの少なくとも０、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、又はそれより多い塩基対上流、及び真核生物システムにおいては開始コドンの少なくとも１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、もしくはそれより多い塩基対上流、又は終止コドンの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、もしくはそれより多い塩基対下流に存在するように設計される。他の実施形態では、切断事象がレポーターの抑制に用いられる場合、ＲＮＡｓｅ Ｅ部位は、レポーター配列のコード領域内に存在するように設計され、あるいはレポーターの発現を阻害するために配置される。
６） 転写物
上記のように、転写物は、ＤＮＡ又はＲＮＡ鋳型配列又は遺伝子から転写されたある長さのヌクレオチド配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）である。転写物は、ＲＮＡ鋳型から転写されたｃＤＮＡ配列又は鋳型ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡ配列であり得る。転写物は、操作された核酸コンストラクトから転写され得る。転写物は、それ自体の内部に相補性を有する領域を有することで、分子内二本鎖を形成し得る２つの領域を含み得る。一方の領域は、レポーター配列に結合しレポーター配列の翻訳を阻止する「シス抑制配列」と称され得る。転写物の第二の領域は、検出可能マーカー又は選択マーカー等のレポーター分子をコードする「レポーター配列」と称される。
本発明の転写物は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチド長であり得る転写物配列であり得る。他の実施形態では、転写物は、少なくとも２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、５００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００又はより多いヌクレオチド長であり得る。シス抑制配列及びレポーター配列は同じ長さであっても異なる長さであってもよい。
いくつかの実施形態では、シス抑制配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、又はより多いスペーサーヌクレオチドによってレポーター配列から隔てられる。
７） ベクター
別の態様では、本発明の転写物（例えば、アンチセンス配列及びセンス配列）は、ＤＮＡベクター又はＲＮＡベクター内に挿入された転写単位から発現される（例えば、Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al.、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２２１１３、Ｃｏｎｒａｄ、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２２１１４、及びＣｏｎｒａｄ、米国特許第６，０５４，２９９号を参照）。これらの配列は、直鎖コンストラクト、環状プラスミド、又はウイルスベクター（例えば、バクテリオファージに基づくベクター）として導入され得、宿主ゲノム内に組み入れられ、宿主ゲノム内に組み込まれた導入遺伝子として遺伝し得る。また転写物は、染色体外プラスミドとして遺伝することを可能にするように構築され得る（Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292）。
転写物配列は、発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写され得る。一実施形態では、シス抑制配列及びレポーター配列がリンカーポリヌクレオチド配列によって連結された逆方向反復として発現されることで、転写物がステム構造及びループ構造を有する。
組み換え発現ベクターが、本発明の転写物を発現するために使用され得る。組み換え発現ベクターは、一般的にはＤＮＡプラスミド又はウイルスベクターである。転写物を発現するウイルスベクターは、限定はされないが、アデノ随伴ウイルス（総説として、Muzyczka, et al., Curr. Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)); adenovirus (例えば、Berkner, et al., BioTechniques (1998) 6:616)、Rosenfeld et al.(1991, Science 252:431-434)、及びRosenfeld et al. (1992), Cell 68:143-155を参照）；又はアルファウイルス属、並びに当該技術分野において公知の他のウイルスに基づいて構築され得る。レトロウイルスは、種々の遺伝子を多くの様々な細胞型（例えば、上皮細胞）にインビトロ及び／又はインビボで導入するために使用されている（例えば、Eglitis, et al., Science (1985) 230:1395-1398; Danos and Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 85:6460-6464; Wilson et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentano et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:61416145; Huber et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferry et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhury et al., 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-19 ; Kay et al., 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwu et al., 1993, J. Immunol. 150:4104-4115；米国特許第４，８６８，１１６号；同第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願国際公開第８９／０７１３６号；同第８９／０２４６８号；同第８９／０５３４５号；及び同第９２／０７５７３号を参照）。細胞のゲノム内に挿入された遺伝子を形質導入及び発現することが可能な組換えレトロウイルスベクターは、組換えレトロウイルスゲノムをＰＡ３１７及びＰｓｉ−ＣＲＩＰ等の適切なパッケージング細胞株に形質移入することによって作製され得る（Comette et al., 1991, Human Gene Therapy 2:5-10; Cone et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349）。組換えアデノウイルスベクターは、感受性宿主（例えば、ラット、ハムスター、イヌ、及びチンパンジー）内の種々様々な細胞及び組織に感染させるために使用することができ（Hsu et al., 1992, J. Infectious Disease, 166:769）、感染のために有糸分裂活性を有する細胞を必要としないという利点も有する。
発現される転写物のためにコード配列を受け入れることが可能なあらゆるウイルスベクター、例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（ＬＶ）、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス、及び同種ものに由来するベクターが使用可能である。ウイルスベクターの向性は、他のウイルス由来のエンベロープタンパク質又は他の表面抗原でベクターを偽型することによって、又は必要に応じて、異なるウイルスカプシドタンパク質を置換することによって、改変することができる。
例えば、本発明で注目されるレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラ、及び同種のものに由来する表面タンパク質で偽型され得る。本発明で注目されるＡＡＶベクターは、様々なカプシドタンパク質血清型を発現するように前記ベクターを操作することによって、様々な細胞を標的とするように作製することができる。様々なカプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技術は、当該技術分野における技術の範囲内であり；例えば、Rabinowitz J E et al. (2002), J Virol 76:791-801（この開示の全体が参照によって本明細書に援用される）を参照されたい。
本発明での使用に適した組換えウイルスベクターの選択、ベクター内に転写物を発現させるために核酸配列を挿入するための方法、及びウイルスベクターを目的細胞に送達する方法は、当該技術分野における技術の範囲内である。例えば、Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30; and Rubinson D A et al., Nat. Genet. 33: 401-406（これらの開示の全体が参照によって本明細書に援用される）を参照されたい。
ウイルスベクターはＡＶ及びＡＡＶに由来し得る。本発明において注目される転写物を発現するのに適したＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、及びベクターを標的細胞内に送達するための方法は、Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010に記載されている。本発明において注目される転写物を発現するのに適したＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、及びベクターを標的細胞内に送達するための方法は、Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher K J et al. (1996), J.Virol, 70: 520-532; Samulski R et al.(1989), J.Virol. 63: 3822-3826；米国特許第５，２５２，４７９号；同第５，１３９，９４１号；国際特許出願第ＷＯ９４／１３７８８号；及び同第ＷＯ９３／２４６４１号（これらの開示の全体が参照によって本明細書に援用される）に記載されている。
本発明において注目されるＤＮＡプラスミド又はウイルスベクター内の転写物発現を駆動するプロモーターは、真核生物のＲＮＡポリメラーゼＩ（例えば、リボソームＲＮＡプロモーター）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（例えば、ＣＭＶ初期プロモーター又はアクチンプロモーター又はＵ１ ｓｎＲＮＡプロモーター）、もしくは一般的にはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６ ｓｎＲＮＡ又は７ＳＫ ＲＮＡプロモーター）、又は、発現プラスミドがＴ７プロモーターからの転写に必要とされるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼもコードするという条件で、原核生物のプロモーター、例えばＴ７プロモーターであり得る。プロモーターはまた、導入遺伝子発現を膵臓に配向付け得る（例えば、the insulin regulatory sequence for pancreas(Bucchini et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2511-2515）を参照）。
さらに、転写物の発現は、例えば、ある特定の生理的制御因子（例えば、循環グルコースレベル、又はホルモン）に感受性である制御配列等の、誘導可能な調節配列及び発現系を用いることによって、正確に制御され得る（Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24）。細胞又は哺乳動物における導入遺伝子発現の調節に適した、このような誘導可能な発現系は、エクジソン、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学誘導物質、及びイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による制御を含む。当業者であれば、ｄｓＲＮＡ導入遺伝子の用途に応じて、適切な制御／プロモーター配列を選択することができる。
一般的に、転写物分子を発現することが可能な組換えベクターは下記のように送達され、標的細胞内に保持される。あるいは、転写物分子の一過性発現を与えるウイルスベクターを用いることができる。そのようなベクターは必要に応じて繰り返し投与することができる。発現された後、転写物は標的ＲＮＡに結合し、標的ＲＮＡの機能又は発現を調節する。転写物発現ベクターの送達は、全身的、例えば、静脈内投与もしくは筋内投与、患者から外植された標的細胞への投与及びそれに続く患者への再導入、又は所望の標的細胞内への導入を可能にする他のあらゆる手段であり得る。
転写物発現ＤＮＡプラスミドは、典型的には、陽イオン性脂質担体（例えば、オリゴフェクタミン）又は非陽イオン性脂質系担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞に形質移入される。１週間以上の期間に亘る単一のＰＲＯＣ遺伝子又は複数のＰＲＯＣ遺伝子の異なる領域を標的とするｄｓＲＮＡ介在性ノックダウンのための多重脂質トランスフェクション（multiple lipid transfection）も、本発明に基づいて企図されている。宿主細胞内へのベクターの導入の成否は、種々の既知の方法を用いてモニターすることができる。例えば、一過性導入は、蛍光マーカー（例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））等のレポーターによって示され得る。エキソビボにおける細胞の安定なトランスフェクションは、形質移入された細胞にハイグロマイシンＢ耐性等の特定の環境因子（例えば、抗生物質及び薬剤）に対する耐性を与えるマーカーを用いることで確実することができる。
組換えＤＮＡを含有するベクターの送達は、非生物学的システム又は生物学的システムによって実行され得る。リポソーム、ウイルス様粒子、ファージ又はウイルス由来の形質導入粒子、及び接合を含むが、これらに限定はされない。
８） 転写物測定法のためのレポーター
いくつかの実施形態では、核酸コンストラクトは、レポーター配列（例えば、レポーター遺伝子配列）を含む。レポーター遺伝子は、細胞内で発現された際にシグナルを生み出すレポーター分子をコードしている。いくつかの実施形態では、レポーター分子は検出可能マーカー又は選択マーカーであり得る。ある実施形態では、レポーター分子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、又は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）等の蛍光レポーター分子であり得る。他の実施形態では、レポーター分子は化学発光タンパク質であり得る。
レポーター分子は、細菌ルシフェラーゼ、真核生物ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、比色検出に適した酵素、免疫検出に適したタンパク質、免疫検出に適したペプチド、又はアプタマー（apatamer）として機能するもしくは酵素活性を示す核酸であり得る。
選択マーカーはレポーターとしても使用され得る。選択マーカーは、例えば、抗生物質耐性遺伝子であり得る。
９） 転写物レポーターアッセイの細胞及び標的遺伝子
検出に使用され得る細胞の例としては、黄色ブドウ球菌（S. aureus）、大腸菌（E. coli）、肺炎桿菌（K. pneumoniae）等のグラム陽性菌及びグラム陰性菌、ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）等の真菌、及びヒト、他の哺乳動物、昆虫、無脊椎動物、又は植物由来の細胞を含む他の真核細胞が挙げられる。
標的転写物は、コードしているかしていないかにかかわらず、あらゆる内在性転写物を含み得る。標的転写物は真核細胞及び原核細胞に由来し得、例えば、黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞におけるｍｅｃＡ転写物（ＭＲＳＡを示す）、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）におけるｔｃｄＢ転写物（毒素産生性クロストリジウム・ディフィシルを示す）、及び子宮頸部上皮細胞におけるＨＰＶ Ｅ６／Ｅ７転写物（子宮頸がんを示す）が挙げられる。ＨＩＶ、ＨＰＶ等を含む、ウイルス等の感染体と関連する遺伝子も同様に標的となり得る。標的遺伝子の他の例には、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）等の非翻訳ＲＮＡ、並びにｓｎｏＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、及びｐｉＲＮＡ及びｎｃＲＮＡ等のＲＮＡが含まれる。
以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の実施例である。実施例は説明のみを目的として提供され、本発明の範囲をなんら限定するものではない。使用される数字（例えば、量、温度等）に関する正確さを確実にする努力は為されているが、いくらかの実験誤差及び偏差は当然許容されるべきである。
本発明の実施は、特に記載がない限り、当業者の技能の範囲内の、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の常法を使用する。このような技術は文献中で充分に説明されている。例えば、T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992)を参照されたい。
実施例１：サイレント変異／相補性パッケージングシステム
以下は、非複製的形質導入粒子を作製するためのサイレント変異／相補性に基づくパッケージングシステムの設計及び構築の一例である。
パッケージングシステムを開発するために使用された材料が以下に記載される。
菌種：
Ｎ１７０６、大腸菌（E. coli）Ｋ−１２ Ｐ１ ｃ１−１００ Ｔｎ９溶原菌
ベクター：
Ｙ１４４３９（ｐＢＨＲ１骨格）
以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号（Ｎ．Ｂ．、受入番号で言及される配列は、本願の優先日としてデータベースに収載されるものである）又は配列番号は、ベクター骨格及びカセット配列に使用され得る：
Ｘ０６７５８（細菌ルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｘＡＢ）
配列番号１（天然Ｐ１ ｐａｃ部位）
配列番号３（Ｃ１リプレッサーにより制御されるＰ５３プロモーター、プロモーターＰ５３アンチセンス、ｒｅｐＬ遺伝子、及びｋｉｌＡ遺伝子のインフレーム欠失を含有するＰ１溶解性レプリコン）
配列番号４（ｌｕｘＡＢ発現を駆動するＰｂｌａｓｔプロモーター）
Ｎ１７０６（ｐａｃ）の構築：ｐａｃＡ変異株：
ｐａｃＡ変異型配列の例示的な配列が配列番号２に示され、以下の略式配列表に示される。変異は、遺伝子合成を介して変異型配列を構築し、次にＮ１７０６内の天然配列を対立遺伝子交換アプローチを介して変異型配列と置換することにより、達成され得る。
ＧＷＰ１０００１レポーターベクターの構築：
ＧＷＰ１０００１ベクターは、広範なグラム陰性活性を示すｐＢＨＲ１複製開始点、カナマイシン及びクロラムフェニコールに対する２つの選択マーカー、天然バクテリオファージＰ１ ｐａｃ部位配列、構成的ブラスティシリン（blasticillin）プロモーター（Ｐｂｌａｓｔ）に機能的に連結されたビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）由来のｌｕｘＡ遺伝子及びｌｕｘＢ遺伝子、並びにＣ１リプレッサーにより制御されるＰ５３プロモーター、プロモーターＰ５３アンチセンス、ｒｅｐＬ遺伝子、及びｋｉｌＡ遺伝子のインフレーム欠失を含有するＰ１溶解性レプリコンを含有する。
図２は得られるベクター（ＧＷＰ１０００１、配列番号１１）を示しており、前記ベクターは、天然源からのＰＣＲを介して、又は遺伝子合成及び従来の制限酵素に基づくクローニングもしくはギブソン構築（Gibson assembly）等の別の技術を介したベクター構築を介して、カセットを得ることを含む、当業者に公知の種々の方法で構築することができる。
サイレント／相補性パッケージングシステム：
前記パッケージングシステムは、ベクターｐＧＷＰ１０００１で補足されたｐａｃＡ変異株Ｎ１７０６（ｐａｃ）を含む。当業者に公知である通り、このシステムを構築する方法は、ベクターｐＧＷＰ１０００１でＮ１７０６（ｐａｃ）を形質転換することによって達成され得る。ベクターｐＧＷＰ１０００１は、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンの存在下で形質転換体を増殖させることによって、形質転換Ｎ１７０６（ｐａｃ）の培養物内に維持され得る。
プラスミドＤＮＡを保有する形質導入粒子の作製：
ベクターｐＧＷＰ１０００１を保有する非複製的形質導入粒子は、４２℃での熱誘導を介してＮ１７０６（ｐａｃ）形質転換体から作製され得る。４２℃でのインキュベーションはＰ１溶菌サイクルの誘導をもたらし、Ｐ１溶菌サイクルでは、図１に示されるように、プロファージが、Ｎ１７０６ゲノムから切除され、ファージ構造要素を産生し、溶解性レプリコンによって形成されたｐＧＷＰ１０００１コンカテマーＤＮＡを子孫ファージ粒子内にパッケージングする。次に、得られた細胞可溶化液が収集され、前記細胞可溶化液は、それぞれｐＧＷＰ１０００１ＤＮＡの直鎖コンカテマーを含有するバクテリオファージＰ１粒子から成る非複製的形質導入粒子を含有する。
実施例２：欠失／相補性パッケージングシステム
以下は、非複製的形質導入粒子を作製するための欠失／相補性に基づくパッケージングシステムの設計及び構築の一例である。
パッケージングシステムを開発するために使用された材料が以下に記載される。
菌種：
ＲＮ４２２０は、ＮＣＴＣ８３２５の非溶原性誘導体であり、大腸菌(E. coli)ＤＮＡの効率的な受容者である、制限欠損黄色ブドウ球菌（S. aureus）株である。ＲＮ４２２０は、Kreiswirth, B.N. et al., The toxic shock syndrome exotoxin structural gene is not detectably transmitted by a prophage. Nature, 1983. 305(5936): p. 709-712に最初に記載された。
ＲＮ１０６１６はＲＮ４２２０をバクテリオファージφ８０αで溶原化することによって得られる（Ubeda, C. et al., Specificity of staphylococcal phage and SaPI DNA packaging as revealed by integrase and terminase mutations. Molecular Microbiology, 2009. 72(1): p. 98-108）。
ＳＴ２４は、小ターミナーゼ遺伝子ｔｅｒＳを、ＲＮ１０６１６内の溶原化されたバクテリオファージφ８０αから欠失させることによって得られる（Ubeda, C. et al., Specificity of staphylococcal phage and SaPI DNA packaging as revealed by integrase and terminase mutations. Molecular Microbiology, 2009. 72(1): p. 98-108）。
ベクター：
本発明のいくつかの実施形態でカセットの供給源プラスミドとして使用され得るプラスミドの例は、Charpentier, E., et al., Novel Cassette-Based Shuttle Vector System for Gram-Positive Bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 2004. 70(10): p. 6076-6085に記載されている。
以下のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号がカセット配列に使用され得る：
配列番号５（黄色ブドウ球菌（S. aureus）ｐＴ１８１プラスミド開始点又は複製コピー数多型ｐＴ１８１ｃｏｐ−６２３ ｒｅｐＣ）
Ｍ２１１３６（ｔｅｔＡ（Ｍ））
配列番号１２（ＰclpBプロモーター配列）
配列番号９（φ１１小ターミナーゼ（ｔｅｒＳ）遺伝子配列）
Ｌ０９１３７（ａｍｐ ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ）
Ｘ０６７５８（ｌｕｘＡＢ）
Ｍ６２６５０（転写終結）
ｔｅｒＳ欠失：
ｔｅｒＳノックアウト株ＳＴ２４の構築は、φ８０α小ターミナーゼ遺伝子のコード配列の大部分を除去するインフレーム欠失をもたらす対立遺伝子交換に基づく戦略を介して達成され得る。この戦略の詳細は、Ubeda, C. et al., Specificity of staphylococcal phage and SaPI DNA packaging as revealed by integrase and terminase mutations. Molecular Microbiology, 2009. 72(1): p. 98-108に記載されている。
ｔｅｒＳノックアウト株の例示的な配列が、配列番号１３に示されている（以下の配列表に示される）。配列番号１３は、φ８０α ｔｅｒＳ欠失及び相補性を示すＲＮ１０６１６ゲノム配列遺伝子座である。
ベクター構築：
ＧＷ８０Ａ０００１ベクターは、大腸菌(E. coli)／黄色ブドウ球菌（S. aureus）シャトルベクターである。前記ベクターは、黄色ブドウ球菌（S. aureus）（ｐＴ１８１ｃｏｐ−６２３ ｒｅｐＣ）及び大腸菌（E. coli）（ＣｏｌＥ１ｏｒｉ）の複製開始点、それぞれ大腸菌（E. coli）及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）の選択のためのアンピシリン（ａｍｐ）耐性及びテトラサイクリン（ｔｅｔ（Ｍ））耐性の選択マーカー、自身のプロモーターを含むφ１１小ターミナーゼ（ｔｅｒＳ）遺伝子配列、構成的黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＰclpBプロモーターに機能的に連結されたビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）由来のｌｕｘＡ遺伝子及びｌｕｘＢ遺伝子、並びに転写終結配列（ＴＴ）を含有する。
図４は得られるベクター（ｐＧＷ８０Ａ０００１、配列番号１４）を示しており、前記ベクターは、当業者に公知の種々の方法で構築することができる。一例では、ｔｅｔ（Ｍ）カセット及びｌｕｘＡＢ遺伝子は、一般に入手可能なｐＣＮ３６ベクター及びｐＣＮ５８ベクターからのＰＣＲ増幅を介して得ることができる（Charpentier, E., et al.）。ＰclpBは黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＮ４２２０からのＰＣＲ増幅によって得ることができ、ｔｅｒＳはＲＮ１０６１６からのＰＣＲ増幅を介して得ることができる。ベクター骨格は一般に入手可能なベクターｐＣＮ４８からｅｒｍＣ遺伝子を除去することにより得ることができ（Charpentier, E., et al.）、最終的なベクターｐＧＷ８０Ａ０００１の種々の成分は、適切に設計された制限酵素に基づくクローニングを介してこのベクター骨格上に構築することができる。
欠失／相補性パッケージングシステム：
前記パッケージングシステムは、ＧＷ２４株を作製するためにベクターｐＧＷ８０Ａ０００１で補足されたｔｅｒＳノックアウト株ＳＴ２４を含み得る。当業者に公知である通り、このシステムを構築する方法は、ベクターｐＧＷ８０Ａ０００１でＳＴ２４を形質転換することによって達成され得る。ベクターｐＧＷ８０Ａ０００１は、５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンの存在下で形質転換体を増殖させることによって、形質転換ＳＴ２４の培養物内に維持され得る。
プラスミドＤＮＡを保有する形質導入粒子の作製：
ベクターｐＧＷ８０Ａ０００１を保有する非複製的形質導入粒子は、大腸菌（E. coli）において最初に実証された、現在では溶原化された細菌からプロファージを得るための標準的な技術である、マイトマイシンＣ誘導法を介してＧＷ２４から作製され得る（Otsuji, N. et al., Induction of Phage Formation in the Lysogenic Escherichia coli K-12 by Mitomycin C. Nature, 1959. 184(4692): p. 1079-1080.）。このプロファージ誘導法はφ８０α溶菌サイクルの誘導をもたらし、φ８０α溶菌サイクルでは、図２に示されるように、プロファージが、ＧＷ２４から切除され、ファージ構造要素を産生し、溶解性レプリコンによって形成されたｐＧＷ８０Ａ０００１コンカテマーＤＮＡを子孫ファージ粒子内にパッケージングする。次に、得られた細胞可溶化液が収集され、前記細胞可溶化液は、それぞれｐＧＷ８０Ａ０００１ＤＮＡの直鎖コンカテマーを含有するバクテリオファージφ８０α粒子から成る非複製的形質導入粒子を含有する。
実施例３：インテグラーゼを欠くＳａＰＩｂｏｖ２に依存したパッケージングシステム
以下は、非複製的形質導入粒子を作製するためのＳａＰＩｂｏｖ２に基づくパッケージングシステムの設計及び構築の一例である。
パッケージングシステムを開発するために使用された材料が以下に記載される。
以下の材料を用いて、インテグラーゼを欠くＳａＰＩｂｏｖ２に基づくパッケージングシステムを開発することができる。
菌種：
ＲＮ４５１は、バクテリオファージφ１１で溶原化された黄色ブドウ球菌（S. aureus）株である。
ＪＰ２１３１はＳａＰＩｂｏｖ２で溶原化されたＲＮ４５１である。Maiques, E. et al., Role of Staphylococcal Phage and SaPI Integrase in Intra- and Interspecies SaPI Transfer. J. Bacteriol., 2007. 189(15): p. 5608-5616を参照されたい。
ＪＰ２４８８は、ＳａｐＩｂｏｖ２からｉｎｔ遺伝子が欠失された（ＳａＰＩｂｏｖ２Δｉｎｔ）、ＪＰ２１３１株である（Maiques, E. et al., Role of Staphylococcal Phage and SaPI Integrase in Intra- and Interspecies SaPI Transfer. J. Bacteriol., 2007. 189(15): p. 5608-5616）。
バクテリオファージ：
バクテリオファージφ１１は、大腸菌（E. coli）において最初に記述された、現在では溶原化された細菌からプロファージを得るための標準的な技術である、マイトマイシンＣ誘導法を介して黄色ブドウ球菌（S. aureus）株ＲＮ０４５１から得ることができる（Otsuji, N. et al., Induction of Phage Formation in the Lysogenic Escherichia coliK-12 by Mitomycin C. Nature, 1959. 184(4692): p. 1079-1080）。
プロモーター：
ＰclpBをこの実施例のプロモーターとして使用することができる。ｃｌｐＢ遺伝子プロモーターは、ｉｎｔ遺伝子の発現を調節するために使用される構成的プロモーターである。黄色ブドウ球菌（S. aureus）ｃｌｐＢ（ＰclpB）遺伝子プロモーター配列は、２００４年に最初に記述された。（Frees, D., et al., Clp ATPases are required for stress tolerance, intracellular replication and biofilm formation in Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology, 2004. 54(5): p. 1445-1462）。また、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ｃｌｐＢ（ＰclpB）遺伝子プロモーター配列は、２００４年に、プラスミド内の遺伝子発現を調節するために最初に使用された（Arnaud, M., A. Chastanet, and M. Debarbouille, New Vector for Efficient Allelic Replacement in Naturally Nontransformable, Low-GC-Content, Gram-Positive Bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 2004. 70(11): p. 6887-6891）。前記プロモーターは、２００４年に記述されたプライマーを用いて黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＮ４２２０から得ることができる（同著）。
φ１１／ＳａＰＩｂｏｖ２Δｉｎｔ共溶原菌（co-lysogen）（ＲＮ４５１（φ１１ ＳａＰＩｂｏｖ２Δｉｎｔ））の作製：
ＪＰ２４８８株（φ１１ ＳａＰＩｂｏｖ２Δｉｎｔ）は、ＪＰ２４８８をφ１１で溶原化することによって作製することができる。
φ１１ ｔｅｒＳの欠失（ＲＮ４５１（φ１１ΔｔｅｒＳ ＳａＰＩｂｏｖ２Δｉｎｔ））：
ＲＮ４５１株（φ１１ΔｔｅｒＳ ＳａＰＩｂｏｖ２Δｉｎｔ）は、Tormo, M.A. et al., Staphylococcus aureus Pathogenicity Island DNA Is Packaged in Particles Composed of Phage Proteins. J. Bacteriol., 2008. 190(7): p. 2434-2440に記載されているように、ＲＮ４５１（φ１１ＳａＰＩｂｏｖ２Δｉｎｔ）からφ１１ ｔｅｒＳ遺伝子を欠失させることによって作製することができる。
黄色ブドウ球菌（S. aureus）ゲノム内へのＰclpB−ｉｎｔの組込み（ＲＮ４５１（φ１１ΔｔｅｒＳ ＳａＰＩｂｏｖ２Δｉｎｔ ＰclpB−ｉｎｔ））：
ＲＮ４５１（φ１１ΔｔｅｒＳ ＳａＰＩｂｏｖ２Δｉｎｔ ＰclpB−ｉｎｔ）は、まず標準的な分子生物学的手法によってＰclpB及びｉｎｔを融合し、次に、ＲＮ４５１（φ１１ΔｔｅｒＳ ＳａＰＩｂｏｖ２Δｉｎｔ）のゲノム内にＰclpB−ｉｎｔ融合物を挿入し、次に、φ１１領域及びＳａＰＩｂｏｖ２領域の外側に挿入されたＰclpB−ｉｎｔを有するクローンを選択することによって、作製することができる。
ＳａＰＩｂｏｖ２Δｉｎｔ ＰclpB−ｉｎｔコンカテマーのみを保有するφ１１粒子の作製：
ＳａＰＩｂｏｖ２Δｉｎｔ ＰclpB−ｉｎｔコンカテマーのみを保有するφ１１粒子は、Otsuji, N. et al., Induction of Phage Formation in the Lysogenic Escherichia coliK-12 by Mitomycin C. Nature, 1959. 184(4692): p. 1079-1080に記載されているような、ＲＮ４５１（φ１１ΔｔｅｒＳ ＳａＰＩｂｏｖ２Δｉｎｔ ＰclpB−ｉｎｔ）のマイトマイシンＣ誘導によって作製することができる。前記細胞可溶化液は、ＧＩ由来ＤＮＡの直鎖コンカテマーを保有するバクテリオファージφ１１構造タンパク質からそれぞれ成る非複製的形質導入粒子を含有している。
上記の材料並びに当該技術分野における周知の分子生物学的手法及び遺伝学的手法を用いて本発明のＮＲＴＰを構築する方法は、当業者によって理解される。
実施例４：ｔｅｒＳ欠失／相補性に基づくＳａｒＳレポーター形質導入粒子
以下は、ｔｅｒＳ欠失／相補性に基づく非複製的形質導入粒子を使用する、誘導因子レポーターに基づくＳａｒＳレポーターシステムの一例である。
レポーター遺伝子：細菌ルシフェラーゼ（ｌｕｘＡＢ）。
ｌｕｘＡ遺伝子及びｌｕｘＢ遺伝子はビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）由来である。ｌｕｘＡ遺伝子及びｌｕｘＢ遺伝子は転写プロモーターを欠失しており、それぞれ自身のリボソーム結合部位を含有している。
Ｓｐａ遺伝子プロモーター（Ｐspa）：
ｓｐａ遺伝子プロモーターがｌｕｘＡＢ遺伝子の発現を調節するために使用される。
Ｐspa−ｌｕｘＡＢ融合物の構築：
ｌｕｘＡＢ遺伝子は、ｌｕｘＡＢ遺伝子がＰspaプロモーターに機能的に連結されるように、Ｐspaプロモーター配列に融合することができる。
ｌｕｘＡＢ発現レポーターベクターの構築
ｌｕｘＡＢ発現レポーターベクターは、下記のＰspa−ｌｕｘＡＢ融合産物を以下に示されるシャトルベクターのＭＣＳに組み込むことによる、標準的な分子生物学的手法を介して、構築することができる。
黄色ブドウ球菌（S. aureus）（ｐＴ１８１ｃｏｐ−６２３ ｒｅｐＣ）及び大腸菌（E. coli）（ＣｏｌＥ１ｏｒｉ）複製開始点、アンピシリン（ａｍｐ）耐性及びテトラサイクリン（ｔｅｔ（Ｍ））耐性のための遺伝子、構成的プロモーター（ＰclpB）の制御下のφ１１小ターミナーゼ（ｔｅｒＳ）遺伝子、多重クローニング部位（ＭＣＳ）、並びに転写終結配列（ＴＴ）を保有する、大腸菌(E. coli）／黄色ブドウ球菌（S. aureus）シャトルベクター。
カセット配列のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：
Ｊ０１７６４（ｐＴ１８１レプリコン）
Ｍ２１１３６（ｔｅｔＡ（Ｍ））
現在利用不可な受入番号（ＰclpB）
ＡＦ４２４７８１領域：１６５２６．．１６９６６（ｔｅｒＳ）
Ｌ０９１３７（ａｍｐ ＣｏｌＥ１ ｏｒｉ）
Ｍ６２６５０（ＴＴ）
インビトロ操作を行うための、及び操作の検証のためのベクターの増殖は、大腸菌（E. coli）Ｔｏｐ１０を介して達成することができ、その後、最終的な改変ベクターを黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＮ０４５１ΔｔｅｒＳに導入することができる。シャトルベクターを保有する形質導入粒子は、１９５９年に大腸菌（E. coli）において最初に記述された、現在では溶原化細菌からプロファージを得るための標準的な技術であるマイトマイシンＣ誘導法によって、ＲＮ０４５１ΔｔｅｒＳ形質転換体から作製することができる（Otsuji, N., et al., Induction of Phage Formation in the Lysogenic Escherichia coliK-12 by Mitomycin C. Nature, 1959. 184(4692): p. 1079-1080）。次に、得られた細胞可溶化液が収集され、前記細胞可溶化液は、それぞれ、標的黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞内のＳａｒＳの存在を報告することが可能なプラスミドＤＮＡの直鎖コンカテマーを保有するバクテリオファージφ１１構造タンパク質から成る非複製的形質導入粒子を含有する。
実施例５：ｔｅｒＳ欠失／相補性に基づくβ−ラクタマーゼレポーター形質導入粒子
以下は、ｔｅｒＳ欠失／相補性に基づく非複製的形質導入粒子を使用する、細胞内酵素レポーターに基づくβ−ラクタマーゼレポーターシステムの一例である。
レポーター遺伝子：ウミシイタケルシフェラーゼ（ｒｕｃ）
プロモーター：プロモーターはPblaZであり得る。構成的βラクタマーゼプロモーターは、ｒｕｃ遺伝子の発現を駆動するために使用され得る。
ケージ化基質：
Daniel Sobek, J.R., Enzyme detection system with caged substrates, 2007, Zymera, Incに記載されるような、ケージ化されたセレンテラジン−リン酸塩。
ＰblaZ−ｒｕｃ融合物の構築：
ｒｕｃ遺伝子は、ｒｕｃ遺伝子がＰblaZプロモーターに機能的に連結されるように、ＰblaZプロモーター配列に融合することができる。
ｒｕｃ発現レポーターベクターの構築：
ｒｕｃ発現レポーターベクターは、上記のセクションＶ、Ａ、３）、ｉ）に示されるシャトルベクターのＭＣＳにＰblaZ−ｒｕｃ融合産物をを組み込むことによる、標準的な分子生物学的手法を介して、構築することができる。
インビトロ操作を行うための、及び操作の検証のためのベクターの増殖は、大腸菌（E. coli）Ｔｏｐ１０を介して達成することができ、その後、最終的な改変ベクターを黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＮ０４５１ΔｔｅｒＳに導入することができる。シャトルベクターを保有する形質導入粒子は、１９５９年に大腸菌（E. coli）において最初に記述された、現在では溶原化細菌からプロファージを得るための標準的な技術であるマイトマイシンＣ誘導法によって、ＲＮ０４５１ΔｔｅｒＳ形質転換体から作製することができる（Otsuji, N., et al., Induction of Phage Formation in the Lysogenic Escherichia coliK-12 by Mitomycin C. Nature, 1959. 184(4692): p. 1079-1080）。次に、得られた細胞可溶化液が収集され、前記細胞可溶化液は、それぞれ、φ１１宿主範囲内の生存黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞内でウミシイタケルシフェラーゼを発現可能なプラスミドＤＮＡの直鎖コンカテマーを保有するバクテリオファージφ１１構造タンパク質から成るＮＲＴＰを含有する。
実施例６：ｔｅｒＳ欠失／相補性に基づく細胞内分子レポーター形質導入粒子
以下は、ｔｅｒＳ欠失／相補性に基づく非複製的形質導入粒子を使用する、細胞内分子レポーターに基づくレポーターシステムの一例である。
プロモーター：プロモーターはＰblaZであり得る。
構成的βラクタマーゼプロモーターは、ｒｕｃ遺伝子の発現を駆動するために使用され得る。
切替可能アプタマー：
切替可能アプタマーは、Samie Jaffrey, J.P., Coupled recognition/detection system for in vivo and in vitro use, 2010, Cornell Universityに記載されているように、設計及び構築することができる。
フルオロフォア基質：
上記の切替可能アプタマーと関連して対応するフルオロフォア基質は、Samie Jaffrey, J.P., Coupled recognition/detection system for in vivo and in vitro use, 2010, Cornell Universityに記載されているように、設計及び構築することができる。
ＰblaZ−ＳＡ融合物の構築：
ＳＡ遺伝子は、ＳＡ遺伝子がＰblaZプロモーターに機能的に連結されるように、ＰblaZプロモーター配列に融合することができる。
ＳＡ発現レポーターベクターの構築：
ＳＡ発現レポーターベクターは、上記の実施例４に示されるシャトルベクターのＭＣＳにＰblaZ−ＳＡ融合産物をを組み込むことによる、標準的な分子生物学的手法を介して、構築することができる。インビトロ操作を行うための、及び操作の検証のためのベクターの増殖は、大腸菌（E. coli）Ｔｏｐ１０を介して達成することができ、その後、最終的な改変ベクターを黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＲＮ０４５１ΔｔｅｒＳに導入することができる。シャトルベクターを保有する形質導入粒子は、１９５９年に大腸菌（E. coli）において最初に記述された、現在では溶原化細菌からプロファージを得るための標準的な技術であるマイトマイシンＣ誘導法によって、ＲＮ０４５１ΔｔｅｒＳ形質転換体から作製することができる（Otsuji, N. et al., Induction of Phage Formation in the Lysogenic Escherichia coli K-12 by Mitomycin C. Nature, 1959. 184(4692): p. 1079-1080）。次に、得られた細胞可溶化液が収集され、前記細胞可溶化液は、それぞれ、φ１１宿主範囲内の生存黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞内でＳＡを発現することが可能なプラスミドＤＮＡの直鎖コンカテマーを保有するバクテリオファージφ１１構造タンパク質から成る非複製的形質導入粒子を含有する。
実施例７：非複製的形質導入粒子に基づくレポーターシステム
上記の非複製的形質導入粒子は、レポーター分子（例えば、ｌｕｘＡＢ）の発現を介して生存細菌の存在を検出するためのレポーターシステムで使用することができる。この形質導入粒子がレポーターベクター（例えば、ｐＧＷ８０Ａ０００１）を形質導入粒子の宿主範囲内の細胞に導入すると、プロモーター（例えば、ＰclpB）が細胞転写装置によって認識される細胞は、その細胞内のレポーター分子の発現を駆動することができる。
黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞の存在を検出するためのレポーターとしての非複製的形質導入粒子の機能性を試験するために、種々のＭＳＳＡ／ＭＲＳＡレポーターアッセイが開発された。一実施形態では、非複製的形質導入粒子は黄色ブドウ球菌（S. aureus）特異的バクテリオファージから開発され、構成的プロモーターの制御下の細菌ルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｘＡＢが組み込まれた。非複製的形質導入粒子がレポーター核酸を黄色ブドウ球菌（S. aureus）内に送達した際、構成的プロモーターは、生存黄色ブドウ球菌（S. aureus）の存在を報告するのに適したｌｕｘＡＢを発現した。
さらに、抗生物質セフォキシチンが、黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞を含有する試料への形質導入粒子の添加の前、同時、又は後に添加された。前記細胞が表現型的にセフォキシチンに対して耐性でなかった場合（すなわち、ＭＲＳＡでなかった場合）、発光が減少又は消失され、これは、細胞がＭＳＳＡであったことを示している。しかし、細胞が表現型的にセフォキシチンに対して耐性であった場合（すなわち、ＭＲＳＡであった場合）、増加した又は検出可能な発光が観察され、これは、細胞がＭＲＳＡであったことを示している。
非複製的形質導入粒子に基づく生細胞レポーターアッセイの機能
レポーターとしての非複製的形質導入粒子の機能をアッセイした。バクテリオファージφ８０αに基づく非複製的形質導入粒子の形質導入宿主範囲を１０１の臨床的ＭＲＳＡ分離株において調べた。改変ＴＳＢ中で増殖させた各細菌分離株の培養物を非複製的形質導入粒子を含有するＧＷ２４細胞可溶化液に暴露し、テトラサイクリンを含有する固体培地上でその混合物を培養することによって、形質導入アッセイを行った。
この実施例では、非複製的形質導入粒子はテトラサイクリン選択マーカーを保有していた。非複製的形質導入粒子で形質導入された細胞は、テトラサイクリンに対し耐性であることが予測された。さらに、液体培地中の各細菌分離株を非複製的形質導入粒子を含有する細胞可溶化液に暴露し、その混合物をあるインキュベーション時間の後に細菌ルシフェラーゼ発光活性について評価することによる、発光アッセイによって、形質導入を調べた。
形質導入アッセイは、φ８０αに基づく非複製的形質導入粒子が、１０１のＭＲＳＡ臨床分離株の全てに形質導入し、黄色ブドウ球菌（S. aureus）ではないブドウ球菌には形質導入しないことが可能であることを示した。
図２１は、３６のテトラサイクリン感受性ＭＲＳＡをｐＧＷ８０Ａ０００１を保有する形質導入粒子に暴露し、次に５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有する培地プレート上に播種した、形質導入アッセイの結果を示している。これらの結果は、３６全てのＭＲＳＡ株が、ｐＧＷ８０Ａ０００１による形質導入のために、テトラサイクリンを含有する培地上で増殖したことを示している。ＭＲＳＡ分離株を形質導入粒子への暴露無しでテトラサイクリン含有培地上に播種した対照実験は、増殖をしめさなかった（図示されず）。さらに、形質導入されたＭＲＳＡ株からのプラスミド単離によって、単離されたプラスミドの配列決定により確認された、ｐＧＷ８０Ａ０００１プラスミドの回復が示された。このように、これらの形質導入の結果によって、レポータープラスミドの複製開始点が試験ＭＲＳＡ分離株の全てにおいて活性を示すことが示された。
図２２は、形質導入粒子で形質導入された、８０のＭＲＳＡ臨床分離株及び２８のメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（S. aureus）（ＭＳＳＡ）臨床分離株から測定された発光を示している。この実験では、ＭＲＳＡ及びＭＳＳＡの培養物を６００ｎｍでの光学濃度０．１に増殖させ、次に、改変ＴＳＢ中で増殖させた１００μＬの培養物を、形質導入粒子を含有するＧＷ２４細胞可溶化液１０μＬと混合し、さらに、発光についてアッセイする前に４時間、３７℃でインキュベートした。細菌ルシフェラーゼを発現する細胞内で発光反応を引き起こすアルデヒドである、１０μＬの１ｍＭデカナール溶液を加えることにより、発光測定を行った。予想された通り、黄色ブドウ球菌（S. aureus）特異的非複製的形質導入粒子で形質導入されたＭＲＳＡ及びＭＳＳＡの両方から、発光が観察された。さらに、形質導入粒子の添加と同時にセフォキシチンを細胞培養物に加えた場合、発光はＭＲＳＡからは観察されたがＭＳＳＡからは観察されず、これによって、ＭＳＳＡの存在及びＭＲＳＡの存在の両方について報告する形質導入粒子の能力が示された。このように、これらの発光の結果から、ｌｕｘＡＢ発現を駆動するプロモーターが、試験された黄色ブドウ球菌（S. aureus）単離株の全てに対し活性を示すことが示される。
非複製的形質導入粒子に基づく生細胞レポーターＭＲＳＡアッセイ-形質導入粒子試薬製剤の最適化
非複製的形質導入粒子試薬の製造及び製剤を、最終製剤に対して最適化した。要約すると、ＧＷ２４の過酸化物誘導を含む、ＴＳＢ培地を使用する、１５Ｌスケールの発酵を行った。１５Ｌの発酵槽バッチを、２００ｍＬの一晩種培養物から播種した（１．３％（ｖ／ｖ）の接種率）。前記培養物を、光学濃度０．８で、過酸化水素で誘導し、誘導後に２５℃に冷却し、ｐＨ調節も溶存酸素（ＤＯ）調節も行わなかった。細胞片からファージ形質導入粒子を取り除くことを目的として、翌朝、タンジェンシャルフロー・フィルトレーション（ＴＦＦ）によって培養上清を回収した。次に、前記物質をさらに濃縮し、ゼラチン無しのＳＭ緩衝液中へのダイアフィルターにかけ、２〜８℃で保存し、その後、最終的な除菌及び貯蔵を行った。
前記プロセスの抜粋を以下に要約する。
様々な他の試薬及び製剤を当業者に公知であるように使用して、前記製剤を得ることができる。
非複製的形質導入粒子に基づく生細胞レポーターＭＲＳＡアッセイ-増殖培地製剤の最適化
増殖培地製剤をＮＲＴＰに基づく生細胞レポーターＭＲＳＡアッセイに最適化した。ＮＲＴＰに基づくＭＲＳＡアッセイにおいて発光を生み出すために、培地は、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）増殖に対し平衡する必要があり、ＮＲＴＰ形質導入を支持するための適切な濃度の陽イオン及び添加物を含有する。この開発研究の前のアッセイで使用されるＴＳＢｍｏｄ培地は、培地の安定性に影響を与える沈殿問題を有することが知られていた。増殖培地製剤は、室温で１年間を目標として、最終製剤の安定性を必要とする。
方法／手順：ＭＲＳＡアッセイのための細胞調製
アッセイの基礎培地を表２に示されるように試験のために調製し、ＭＲＳＡアッセイのための調製における代表的な一連の培地改変を表３に示す。
各培地調製物に、以下の表４に従ってＮＲＴＰ及びセフォキシチンを添加してＮＲＴＰ培地試薬を作製した。：
ＭＲＳＡアッセイを以下のステップで実行した：
解析
ＮＲＴＰに基づく生細胞レポーターＭＲＳＡアッセイの結果
カットオフＲＬＵの決定：
各ブランクレプリケート（４）の全ての時点（２５）にわたるＲＬＵの平均値及び標準偏差を算出した。平均ブランクＲＬＵ＋３つの標準偏差として各プレートのカットオフを算出した。
相対的改善の決定：
ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏから各試料（全ての希釈におけるブランク、ＭＳＳＡ及びＭＲＳＡ）の最大ＲＬＵをエクスポートし、カットオフＲＬＵと比較した。試料がファージ濃度のカットオフよりも大きなデータポイントを２つ有していた場合、最大ＲＬＵ値を解析に使用した。
これらの値を、特定の最大ＲＬＵをその対照条件（解析されている希釈における、ＴＳＢ Ｍ１オリジナル培地中のその株）の最大ＲＬＵで除算することによって正規化した。得られた割合を、表５に示されるように、各培地条件及び各希釈について、１０のＭＲＳＡにわたって平均した。２つの希釈にわたる平均も表に示す。
結論
ＢＳＳ２−Ｍ５６は、試験された種々の培地にわたる平均で最良の性能を示した。ＨＥＰＥＳ緩衝液に基づく培地は、トリス塩酸緩衝培地よりも良好な性能を有した。ＨＥＰＥＳは、トリス塩酸とは対照的に、生物学的に好ましい緩衝系であることが知られている。Ｂ２に基づく基本／ブロスは、ＴＳＢに基づくブロスよりも良好な性能を有した。
種々の他の試薬及び製剤を当業者に公知であるように用いて、製剤を得ることができる。他の適切な製剤を上記と同様の実験によって開発した。他の適切な製剤の例は以下の表６、表７、及び表８に挙げられる。
非複製的形質導入粒子に基づく生細胞レポーターＭＲＳＡアッセイ-基質試薬製剤の最適化
ＭＲＳＡアッセイで発酵を生み出すために、基質試薬はルシフェラーゼの基質としてアルデヒドを含んでいなければならない。最初に開発された脂肪族アルデヒド製剤（ＴＳＢ中４．２ｍＭトリデカナール）は、安定ではなく、溶液ではなく不均一なエマルジョンを形成した。本実施例は、６ヵ月間の室温又は２〜８℃での安定性を目的とする、これらの問題に取り組む基質試薬製剤の開発を要約したものである。
本実施例は、最終製剤に対する基質試薬を開発するためにとられたステップを記載している。
方法／手順
全てのスクリーニング実験及び安定性実験は、ＬｕｘＡＢ発現プラスミドを有する黄色ブドウ球菌（S. aureus）株ＲＮ４２２０から成る「モデル系」を用いて試験した。典型的な調製法及び試験法は以下の通りであった。
実際のアッセイの結果が新規製剤をスクリーニングするために使用されたモデル系と同様であることを裏付けるために、全ての確認実験をＭＲＳＡアッセイを用いて試験した。
基質試薬製剤の開発のための実験を設計して、以下を改善した。
解析及び結果
動態反応を各試料についてプロットしたところ、３つのレプリケートの各リードポイントにおける平均値にラインが適合する。典型的に、結果は、おおよそ１０，０００ＣＦＵ／ｍＬ又は２，０００ＣＦＵ／アッセイに相当する、０．１ＯＤモデル系細菌の１：２０００希釈で、示した。
参照基質試薬のそれに対する正規化した最大ＲＬＵを、安定性実験について解析した。それぞれの安定性の時点において、各試料の最大ＲＬＵを参照基質最大ＲＬＵに対して正規化した。正規化した最大ＲＬＵを時点の始めから終りまでプロットし、９５％ＣＩを有する線形回帰をプロットした。
結論
最終基質試薬製剤を作製するために参照製剤から調整された重要なパラメーターを、表９に要約する。
２つの異なる保存温度に対して、２つの基質試薬製剤を調製した（１つは２〜８℃での保存、１つは１８〜２４℃での保存）。
２〜８℃で保存された最終基質試薬製剤
製剤：０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋４．２ｍＭトリデカナール＋０．５％ビタミンＥ酢酸塩＋１００ｐｐｍ消泡剤Ｙ３０＋０．５％トリエタノールアミン＋８２％０．１Ｍクエン酸＋１８％０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３）＋０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００。前記製剤は２〜８℃で１ヵ月後に沈殿せず、ＭＲＳＡ株を０日目と同じに検出することができた。
１８〜２４℃で保存された最終基質試薬製剤
製剤：０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００＋６．３ｍＭトリデカナール＋１００ｐｐｍ消泡剤Ｙ３０＋０．５％トリエタノールアミン＋８２％０．１Ｍクエン酸＋１８％０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３）＋２％ａ−トコフェロール−ＰＥＧ１０００コハク酸塩＋０．０５％ＰｒｏＣｌｉｎ３００。前記製剤は１８〜２４℃で１ヵ月後に沈殿せず、ＭＲＳＡ株を０日目と同じに検出することができた。
種々の他の試薬及び製剤を当業者に公知であるように使用して、製剤を得ることができる。
非複製的形質導入粒子に基づく生細胞レポーターＭＲＳＡアッセイの分析性能
アッセイの検出限界の分析並びに非標的生物に曝された場合のアッセイの交差反応性及び微生物干渉の分析を含む、最適化されたＮＲＴＰ ＭＲＳＡアッセイの分析性能を調べた。
Ａ） 検出限界アッセイ
ＮＲＴＰアッセイの検出限界を、ブランク試料から決定された閾値のものを上回る相対発光量（ＲＬＵ）シグナルを生み出すことができた種々の株を代表するＭＲＳＡ細胞の最小量を決定することにより、評価した。ＭＲＳＡ株には、ＳＣＣｍｅｃＩ型、ＩＩ型、及びＩＶ型、並びにｍｅｃＡ遺伝子変異体ｍｅｃＣを保有するＭＲＳＡ株（従来のＦＤＡ承認ＭＲＳＡ ＰＣＲアッセイが検出できなかったＭＲＳＡの株）が含まれた。
以下の主要物質を臨床成績試験で使用した。
増殖培地試薬：ＢＳＳ−Ｍ５６
基質試薬：上記のように１８〜２４℃で保存される最終基質試薬製剤。
形質導入粒子試薬：１０μｇ／ｍＬ（すなわち２倍濃度）セフォキシチン及び２倍濃度の上記のような形質導入粒子試薬を含むＢＳＳ−Ｍ５６ベース。
ＬｏＤ試験プロトコル：
一晩培養：各ＭＲＳＡ株及びＭＳＳＡ負の対照株について、２ｍＬのＴＳＢにＴＳＡプレート上で先に培養された株の１コロニーを播種した。一晩ＭＲＳＡ培養物は５μｇ／ｍＬセフォキシチンを含んだ。全ての試料を振盪培養器内で３７℃で一晩インキュベートした。
一日培養（Day Culture）：各一晩培養物の２０μＬを２ｍＬの増殖培地試薬を含有する新しい培養試験管中に移した。次に、接種菌液を、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．１に達するまで、およそ１時間４５分、撹拌しながら３７℃でインキュベートした。
連続希釈：
ａ）１０００μＬの各試料を、２ｍＬ深底ウェル９６ウェルプレートのＡ列に分注した。
ｂ）次に、残りの列（Ｂ〜Ｈ）に９００μＬの増殖培地試薬を加えた。
ｃ）次に、Ａ列から１００μＬ取りＢ列で混合する等して１０倍連続希釈物を作製し、Ｈ列が１０-7希釈のＡ列物質の試料を含有するようした。
細菌負荷の計数：Ｅ列の各ウェルの５μＬをＴＳＡプレート上にスポットし、次にそれを傾けて、液体のスポットをプレート上に広げた（後にコロニー計数法を容易にするため）。（Ｅ列はＡ列の１０-4希釈である）。次に、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。
アッセイ準備：
ａ） 白色９６ウェルアッセイプレートのウェルに、１００μＬの２×形質導入粒子試薬を加えた。
ｂ） 次に、Ｆ列及びＧ列（すなわち、それぞれＡ列の１０-5倍希釈及び１０-6倍希釈）を用いて、各試料が４連でプレートに加えられるように、形質導入粒子試薬を含有する９６ウェルアッセイプレートのウェルを充填した。
ｃ） 次に、プレートを通気性シールで密封し、５０ｒｐｍで適度に振盪しながら３７℃で４時間インキュベートした。
４時間後、プレートを恒温器から取り出し、その後すぐに、５０μｌの基質試薬を注入し、１分間の発光を測定して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌ上で発光を測定した。
解析：
各試料から得られた発光データをＲＬＵ対時間としてプロットした。ブランク試料を用いて、以下の式を用いてブランク試料の全ての時点から算出されるカットオフを決定した：（平均ブランクＲＬＵ＋３*ＳＤブランクＲＬＵ）。
次に、ブランク試料カットオフを上回るＲＬＵ値が生み出された最高希釈の試料を決定するために、各試料について基質注入後の平均ピークＲＬＵを得た。ブランク試料カットオフを上回るＲＬＵ値が生み出された最高希釈でのコロニー形成単位（ＣＦＵ）計数を、計数試験から決定し、このＣＦＵ計数を本試験のＬｏＤとして報告した。
結果：
試験された全てのＭＲＳＡ試料のＬｏＤは、１０ＣＦＵ未満であることが決定された。表１１は、本試験で得られた最も低いＬｏＤの結果の要約である。
試験された全てのＭＲＳＡ株は、ブランク試料から算出されたカットオフを上回るＮＲＴＰアッセイで検出された１０ＣＦＵよりも少ないという結果になった。ＭＳＳＡはブランク試料カットオフを上回るＲＬＵ値を生み出さなかった。
ブランク試料カットオフを上回るＲＬＵ値が生み出された最高希釈でのＲＬＵ値が示され、各試料について試験された４つのレプリケートの平均ＲＬＵ値及び標準偏差としてプロットされた。横軸はブランク試料カットオフに設定され、各ＲＬＵデータポイントを与えた試料のＣＦＵ計数は前記データで上書きされる。全てのＭＲＳＡ試料はカットオフを上回るＲＬＵ値を与えたが、ＭＳＳＡは与えなかった。
交差反応性及び微生物干渉試験
交差反応性及び微生物干渉試験を行った。この試験の目的は、この試験で使用されたファージ又は基質とのこれらの株の交差反応性又は干渉が存在するかどうかを確かめるために、臨床試料中に一般的に遭遇し、ＭＲＳＡアッセイにおけるバクテリオファージφ８０αの宿主範囲に存在し得ることが知られている一連の菌種を試験することであった。
臨床試料を用いた以前の実験は、ＢＢＬ（商標）ＣＨＲＯＭａｇａｒ（商標）Ｓｔａｐｈ ａｕｒｅｕｓプレート上に播種された場合の青色及び白色のコロニーの存在から示される、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococci faecalis）及び表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）の存在を伴う、偽陽性結果となった。さらに、リステリア菌（Listeria monocytogenes）及びリステリア・イノキュア（Listeria innocua）が、ＭＲＳＡアッセイにおける交差反応性にも寄与し得る、ファージφ８０αの感染性又は浸透性宿主範囲内であり得る。本試験は、生存能ＭＲＳＡアッセイを用いて交差反応性／干渉について、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococci faecalis）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）及びリステリア・イノキュア（Listeria innocua）を試験した。各株を、アッセイ体積においておよそ１０6、１０7又は１０8細胞の多細胞数で、試験した。株の自家発光（autoluminescence）の可能性に対処するために、ＧＷ２４可溶化液の添加無しで試験を行った。
実験１では、種々の株（ＭＳＳＡ−Ｓ１２１、ＮＲＳ＃９−スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Staphylococcus haemolyticus）、ＮＲＳ＃６−表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、ＡＴＣＣ１２２２８−表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）、ＡＴＣＣ１５３０５−ストレプトコッカス・サプロフィチカス（Staphylococcus saprophyticus）、ＡＴＣＣ２９２１２−エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus. faecalis）、ＡＴＣＣ６０１９３−カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、ＡＴＣＣ１２４５３−プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis））が、通常のアッセイ条件下の多細胞数での発光について、試験した。
実験２：実験１で発光性であった一部の株を、バックグラウンド発光を消光するための種々の濃度の種々の抗生物質の存在下で、再アッセイした。
実験３：大便連鎖球菌（E. faecalis）及びＳ３２（ＭＲＳＡ）を、ＧＷ２４可溶化液無し、且つインキュベーション無しで、上記のように開発された種々の基質製剤を用いて、試験した。
実験４：ＡＴＣＣ３３０９０−リステリア・イノキュア（Listeria innocua）及びＡＴＣＣ１９１１１−リステリア菌（Listeria monocytogenes）を、バックグラウンドシグナル及び非特異的発光について試験し、大便連鎖球菌（E. faecalis）及び表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）と共に上記のように開発された種々の基質製剤を用いて、再試験した。
実験５：大便連鎖球菌（E. faecalis）を、上記のように開発された最終基質製剤を用いて再試験した。
この試験で試験された基質試薬製剤を表９にまとめる。
方法／手順：
以下はＭＲＳＡアッセイのために行われたステップである。
Ａ） 実験１〜５のために増殖された株
アッセイの前日、凍結された１回使用ストックからＴＳＢ中１：５０希釈で深底９６ウェルプレート内で一晩培養を開始し、１５時間超、オービタルシェーカー上、３７℃でインキュベートした。ＴＳＢ（３９２μＬ）中の細菌（８μＬ）。
培養物の吸光度をＶｅｒｓａｍａｘで測定した。ＴＳＢをＳｏｆｔｍａｘＰｒｏ上のテンプレートにブランクとしてセットした。光学濃度（ＯＤ）を６００ｎｍで測定した。
アッセイ当日、細胞をＯＤ０．５に再懸濁してアッセイをセットアップした。実験１〜５のためにＢＳＳ−Ｍ５６を準備した。
Ｂ） 全ての実験１、２、４及び５のために形質導入粒子培地試薬を調製した（実験３では形質導入粒子試薬は使用されなかった）：１５μｇ／ｍＬセフォキシチン＋上記のように３０倍からのＧＷ２４可溶化液ストック。
Ｃ）試料調製：株の一晩培養物から種々の希釈物を作製した。全ての株は、希釈されたＢＳＳ Ｍ５６であった。
Ｄ） ＭＲＳＡアッセイを実験１〜５のために実行した。
培地を、５μｇ／ｍｌのファージ及びセフォキシチンと共に、又はそれら無しで、アッセイプレートに充填した。２．５μＬの細胞を加えた。アッセイプレートを、プレートに蓋をして、スピードをおよそ１００ｒｐｍに設定したオービタルシェーカー上で、３７℃で４時間、インキュベートした。
次に、アッセイプレートを以下の標準的なアッセイパラメーターでＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌ上で測定した。
速動態発光
０．５秒間隔で２０時点を読んだ。基質を、５ベースラインリードを含む、２５０μｌ／秒で、５０μＬ／ウェルで、Ｍインジェクターで注入した。インキュベーション温度を設定せず、室温で読んだ。
ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌに基質試薬を加え、その後アッセイを実行した。
結果を以下により分析した。
Ａ） 全てのレプリケート及び時点にわたってブランクＲＬＵを平均し、３つの標準偏差を加えることによって、カットオフを決定した。
Ｂ） ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏを用いて各試料の最大ＲＬＵを決定した。
Ｃ） 最大ＲＬＵがカットオフＲＬＵよりも大きいかどうかを決定し、もしそうであれば、試料データを分析に使用した。
結果の概要
実験１：種々の株を元の基質製剤を用いて交差反応性及び干渉について試験し、試験されたこれらのうち、ＮＲＳ＃９−スタフィロコッカス・ヘモリチカス（S. haemolyticus）、ＮＲＳ＃６−表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）及び大便連鎖球菌（E. faecalis）は、ＭＲＳＡアッセイで偽陽性であった。
実験２：試験された３つの株のうち、ＮＲＳ＃９及び大便連鎖球菌（E. faecalis）は、試験された全てのセフォキシチン条件で、ＭＲＳＡ陽性であった。形質導入粒子試薬がアッセイに使用されなかった場合、３つ全ての株（ＮＲＳ＃９、大便連鎖球菌（E. faecalis）、ＮＲＳ＃６）は陽性であったが、これは、非特異的発光が形質導入粒子試薬依存性ではなかく、株及び基質試薬依存性であったことを示している。Ｃａｒｂ（カルベンシリン（Carbencillin））は、試験された全ての濃度で、偽陽性シグナルの除去に効果的であった。
実験３：大便連鎖球菌（E. faecalis）は、形質導入粒子試薬無しで陽性シグナルを与えた。ＭＲＳＡ株Ｓ３２も、形質導入粒子試薬無しで陽性シグナルを与えた。この結果は、基質試薬がバックグラウンド発光を引き起こすことを示すものであった。基質４はアッセイにおけるバックグラウンドシグナルの除去に効果的であった。
実験４：リステリア種はＭＲＳＡアッセイで使用されたバクテリオファージの宿主範囲内であり得るため、ＡＴＣＣ３３０９０−リステリア・イノキュア（Listeria innocua）株、ＡＴＣＣ１９１１１−リステリア菌（Listeria monocytogenes）株を、形質導入粒子試薬及び基質試薬を用いて発光について試験した。元の基質製剤を用いて、形質導入粒子試薬有り又は無しで、リステリア・イノキュア（L. Innocua）からの発光を測定したところ、発光が潜在的に基質との非特異的反応によるものであることが示された。基質５はリステリアからの発光の除去には有効であったが、大便連鎖球菌（E. faecalis）からの発光の除去には有効でなかった。
実験５：基質６を用いて大便連鎖球菌（E. faecalis）を再試験した。０．５ＯＤでの細胞の高負荷での、２つの異なる日での２つの独立した実行において、アッセイは偽陽性結果を与えた。
結論
交差反応性試験は、高負荷のいくつかの細菌種からのバックグラウンド発光を示した。発光（light output）は形質導入粒子試薬を必要とせず、リン酸イオンを用いるある特定の基質製剤が非特異的シグナルに寄与した。交差反応性種からの発光が形質導入粒子試薬の使用から観察されなかったことから、φ８０αが交差反応性種に進入する場合、発光は、これらの種の内部での、細菌ルシフェラーゼ遺伝子に機能的に連結された黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＰｃｌｐＢプロモーターの活性の欠如及び／又は黄色ブドウ球菌（S. aureus）ｐＴ１８１複製開始点の活性の欠如から阻害される。
緩衝液を製剤中二塩基性のリン酸ナトリウムからクエン酸ナトリウム及びクエン酸で置換することは、大便連鎖球菌（E. faecalis）を除く全ての試験された交差反応性種からバックグラウンド発光を除去した。αトコフェロール−ＰＥＧ１０００コハク酸塩の追加成分を含む基質６は、残りの非特異的シグナルを大便連鎖球菌（E. faecalis）から除去した。
非複製的形質導入粒子に基づく生細胞レポーターＭＲＳＡアッセイの臨床成績−ＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ上への直接播種に関する結果
φ８０αに基づくｌｕｘＡＢ発現非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を用いてＭＲＳＡスクリーニング検査を開発した。前記アッセイは、ＭＲＳＡを含有することが疑われる臨床試料にＮＲＴＰを加え、前記試料を３７℃で４時間インキュベートし、次に、光電子増倍管を用いて発光を測定しながら、試料にアルデヒドを注入することによりインキュベートされた試料をアッセイすることから成る。アッセイの感度及び特異性を決定するために、アッセイの結果を、参照としてのＭＲＳＡの検出のために設計された市販の色素生産性培地の結果と比較した。共に生存ＭＲＳＡ細胞の存在を必要とし、共にＭＲＳＡ表現型の発現に依存することから、ＮＲＴＰに基づくアッセイは、培地に基づく参照とよく相関することが予測された。結果は参照との良好な相関を示した。
この試験の目的は、ＭＲＳＡスクリーニングのために採取されたレムナント鼻腔スワブ試料の検査から、ＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩを基準にして、ＮＲＴＰに基づくＭＲＳＡアッセイの性能を決定することであった。
範囲：
臨床機関によってＭＲＳＡ調査のために患者から採取された非特定化された鼻腔スワブ試料を、直接播種を介して、及び培地富化とそれに続く播種を介して、ＮＲＴＰに基づくＭＲＳＡアッセイ、ＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ、ＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＳＡ及び血液寒天ＴＳＡを用いて、ＭＲＳＡの存在について試験した。ＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩを基準にしてＮＲＴＰに基づくＭＲＳＡアッセイの感度及び特異性を算出するために、ＮＲＴＰに基づくＭＲＳＡアッセイの結果をＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩアッセイの結果と比較した。
以下の主要物質を臨床成績試験で使用した。
増殖培地試薬：ＢＳＳ−Ｍ５６
基質試薬：上記のように１８〜２４℃で保存される最終基質試薬製剤
形質導入粒子試薬：１０μｇ／ｍＬ（すなわち２倍濃度）セフォキシチン及び２倍濃度の上記のように形質導入粒子試薬を含むＢＳＳ−Ｍ５６ベース。
方法／手順
臨床試料の説明：液体アミーズ（ｌｉｑｕｉｄ Ａｍｉｅｓ）（２２００９３−ＢＤ ＢＢＬ（商標）ＣｕｌｔｕｒｅＳｗａｂ（商標）液体アミーズ）を含有する試料輸送管を、臨床機関によって採取された非特定化されたレムナント鼻腔スワブを採取するための臨床機関に提供した。鼻腔スワブを提供された試料輸送管中に配置する前に、臨床機関は、スワブを培地プレート上に画線することにより直接培養ＭＲＳＡスクリーニングを実施するためにスワブを使用した。より具体的には、前鼻孔検体を臨床機関の内部標準手順で、臨床機関の標準的な採取スワブを用いて、採取した。次に臨床機関は、スワブを用いて直接培養スクリーニングを実施した。次に、レムナントスワブを試料輸送管に加え、その中で、スワブの先端を試料輸送管内のアミーズ緩衝液に浸した。次に、試料を室温で２〜２４時間維持し、その後さらなる処理を行った。
試料の取扱い：受け取り後、試料を、試料輸送管アミーズ緩衝液中のスワブ浸漬を確実にするために垂直に、安全キャビネット内で室温で一晩保管した。一晩保管した後、試料を以下の通りにさらに処理した。
臨床試料調製
１ｍＬピペットを用いて、３００μｌの増殖培地試薬を１５ｍＬファルコンチューブに加えた。
レムナント鼻腔スワブから得られたスワブを元の輸送管から取り出し、対応するファルコンチューブ内の増殖培地試薬中に浸した。次に、スワブ内容物を、増殖培地試薬中で前後に４〜６回回転させることで、ファルコンチューブ内の増殖培地試薬中に溶出させた。次に、スワブを元の輸送管内に戻し、試験終了まで２〜８℃で保管し、一方、ファルコンチューブ内の溶出した臨床試料は、１．５ｍＬチューブに移し、さらなる処理を行うまで室温で維持した。
ＮＲＴＰ ＭＲＳＡアッセイの実行：以下の試料を白色９６ウェルアッセイプレート内に直接添加した。
臨床試料：１連（singlet）での、各臨床試料の溶出物質１００μｌ。
ＭＲＳＡ陽性対照：３連での、９８μＬの増殖培地試薬中への既知のＭＲＳＡ分離株の完全混合０．１ＯＤ培養物２μｌ。
ＭＳＳＡ負の対照：３連での、９８μＬの増殖培地試薬中への既知のＭＳＳＡ分離株の完全混合０．１ＯＤ培養物２μｌ。
ブランク：３連での増殖培地試薬１００μｌ。
各試料に、１００μＬの形質導入粒子試薬を加えた。次に、アッセイプレートを３７℃に設定された恒温器内に配置し、オービタルシェーカー上で４時間振盪した。４時間後、プレートを恒温器から取り出し、その後すぐに、５０μｌの基質試薬を注入し、１分間の発光を測定して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌ上で発光を測定した。
臨床試料ＣＦＵ計数のための細菌播種：以下の通りの直接的及び富化培養を介して、ＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ、ＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＳＡ及び血液寒天（ＴＳＡ ＩＩ）上の細菌コロニー数を決定するために、各溶出臨床試料を播種した。直接播種によって、生物のＣＦＵ数を決定した。ＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ上に播種することによって、ＭＲＳＡのＣＦＵ数を決定した。ＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＳＡプレート上に播種することによって、黄色ブドウ球菌（S. aureus）のＣＦＵ数を決定した。血液寒天ＴＳＡ上に播種することによって、血液寒天ＴＳＡによって増殖が支援されるあらゆる生物のＣＦＵ数を決定した。生物の負荷が使用されたプレートの検出限界未満であるために、直接播種がコロニーを生み出さなかった場合、溶出臨床試料の一部を振盪しながら３７℃で一晩、ＴＳＢ中でインキュベートした後、富化した培養物をＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ上に再度播種することによる、試料富化も行った。全てのプレートを３７℃で２０〜２４時間インキュベートした。インキュベーション後、各プレート上に出現しているあらゆるコロニーのＣＦＵ数を記録した。
解析：溶出臨床試料当たりのＭＲＳＡ、黄色ブドウ球菌（S. aureus）、及び全生物の存在及びＣＦＵ負荷を、それぞれＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ、ＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＳＡ、及び血液寒天ＴＳＡ上で得られたＣＦＵ数に基づいて算出した。
ＮＲＴＰアッセイ分析：各試料から得られたデータをＲＬＵ対時間としてプロットした。
カットオフ決定：アッセイのカットオフを、以下の式を用いてブランク試料の全ての時点から算出した：（平均ブランクＲＬＵ＋３*ＳＤブランクＲＬＵ）。
ＭＲＳＡ陽性の決定：基質注入後の各時点のＲＬＵがアッセイカットオフを上回るか下回るかを決定した。注入後の２つ以上のデータポイントがアッセイカットオフを上回っていた場合、試料を「ＭＲＳＡ陽性」と表した。
結果：ＮＲＴＰアッセイのＭＲＳＡ陽性結果を、ＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ上に播種する直接的及び富化培養の結果と比較した。ＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩに関して、ＮＴＲＰアッセイの感度及び特異性を決定するために、以下の計算を行った。
ＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ上への直接播種に関する結果
表１１は、以下の結果が、ＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ上への直接播種に関して、ＮＲＴＰアッセイと比較して得られたことを示している。
上記データに基づき、ＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ上への直接播種に関するアッセイの感度及び特異性は以下のように算出された。
感度＝１００％
特異性＝９２％
非複製的形質導入粒子に基づく生細胞レポーターＭＲＳＡアッセイの臨床成績−富化培養、その後のＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ上への播種に関する結果
ＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ上の直接播種に関する結果に基づき、富化培養、その後のＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ上の播種に関して、全ての臨床試料を再試験した。後続の試験の理論的根拠は、偽陽性結果が、直接播種と比較した場合に、ＮＲＴＰアッセイによって検出された真陽性に実際になり得るが、直接播種によって失われた可能性があるという可能性に基づくものであった。残りの溶出スワブ試料の一部を、上記のようにＮＲＴＰアッセイによって再試験した。また、残りの溶出スワブ試料の別の一部を、富化培養、その後のＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ上への播種によって試験した。富化培養試験は、１００μＬの残りの溶出スワブ物質を２ｍＬのＴＳＢに加え、振盪しながら３７℃で１８〜２４時間インキュベートすることから成る。得られた培地を次に、培養物中のＭＲＳＡの存在を決定するために、ＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ上に画線した。表１２は、直接播種及び富化とその後の播種アッセイの両方から得られたデータの概要である-ＮＲＴＰアッセイ又はＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ上でＭＲＳＡ陽性結果を出した試料のみを示す。
表１２：ＮＲＴＰアッセイの結果と、直接播種及び富化培養とその後のＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ上への播種との比較
ＮＲＴＰアッセイ又はＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ上でＭＲＳＡ陽性結果を出した試料のみを示す。
表１３は、以下の結果が、臨床試料の富化培養、その後のＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ上への播種に関して、ＮＲＴＰアッセイと比較して得られたことを示している。
上記データに基づき、富化培養とその後のＣＨＲＯＭＡｇａｒ ＭＲＳＡ ＩＩ上への播種に関する、アッセイの感度及び特異性は、以下のように算出された。
感度＝１００％
特異性＝９８．３％
実施例８：抗菌薬感受性試験のためのＮＲＴＰに基づくアッセイ−最小阻止濃度の発光量に対する相関
別の例では、黄色ブドウ球菌（S. aureus）のセフォキシチン感受性アッセイを開発して、セフォキシチン耐性黄色ブドウ球菌（S. aureus）の増殖を阻害するのに必要なセフォキシチンの最小阻止濃度を決定した。セフォキシチン耐性黄色ブドウ球菌（S. aureus）からセフォキシチン感受性を区別する、上記のようなＭＲＳＡセフォキシチン耐性アッセイと異なり、本実施例におけるＭＲＳＡセフォキシチン感受性アッセイは、セフォキシチン存在下で黄色ブドウ球菌（S. aureus）の増殖を阻害するのに必要なセフォキシチンの最小量を決定するためのアッセイの開発を記述している。
以下の主要物質を臨床成績試験に用いた。
増殖培地試薬：ＢＳＳ−Ｍ５６
基質試薬：実施例７に記載されるように１８〜２４℃で保存される最終基質試薬製剤。
形質導入粒子試薬：１０μｇ／ｍＬ（すなわち２倍濃度）セフォキシチン及び２倍濃度の実施例７に記載されるような形質導入粒子試薬を含むＢＳＳ−Ｍ５６ベース。
ＭＩＣ試験プロトコル
一晩培養：各ＭＲＳＡ株（ＮＲＳ３５及びＳ７）及びＭＳＳＡ負の対照株（ＭＳＳＡ１２１）について、２ｍＬのＴＳＢにＴＳＡプレート上で先に培養された株の１コロニーを播種した。一晩ＭＲＳＡ培養物は５μｇ／ｍＬセフォキシチンを含んだ。全ての試料を振盪培養器内で３７℃で一晩インキュベートした。
一日培養（Day Culture）：各一晩培養物の２０μＬを２ｍＬの増殖培地試薬を含有する新しい培養試験管中に移した。次に、接種菌液を、ＯＤ（６００ｎｍ）が０．１に達するまで、およそ１時間４５分、撹拌しながら３７℃でインキュベートした。
播種を介したＭＩＣ決定：
ａ）一日培養のそれぞれを、４、８、１６、３２、６４、及び１２８μｇ／ｍＬのセフォキシチンを含有するＴＳＡプレート上に画線した。
ｂ）プレートを３７℃で１８時間でインキュベートして、増殖を決定した。
ＮＲＴＰアッセイの準備：
ａ） 白色９６ウェルアッセイプレートのウェルを、１００μＬの２×形質導入粒子試薬で満たした。
ｂ） 一日培養物のそれぞれについて、次に、５つのウェルを１００μＬの一日培養物で満たした。
ｃ） 一日培養物のそれぞれについて、ウェル中のセフォキシチン濃度が４、８、１６、３２、６４、及び１２８μｇ／ｍＬになるように、セフォキシチンを各ウェルに加えた。
ｄ） 次に、プレートを通気性シールで密封し、５０ｒｐｍで適度に振盪しながら３７℃で４時間インキュベートした。
４時間後、プレートを恒温器から取り出し、その後すぐに、５０μｌの基質試薬を注入し、１分間の発光を測定して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌ上で発光を測定した。
解析：
各試料からの基質試薬添加後の最大発光値をプロットした。ＭＳＳＡ試料のＲＬＵ値を用いて、以下の式を用いて算出されるカットオフを決定した：（平均ＭＳＳＡ ＲＬＵ＋３*ＳＤ ＭＳＳＡ ＲＬＵ）。
結果：
図２３は、４、８、１６、３２、６４、及び１２８μｇ／ｍＬのセフォキシチンにおいての黄色ブドウ球菌（S. aureus）増殖の結果を示している。図２４は、４、８、１６、３２、６４、及び１２８μｇ／ｍＬのセフォキシチンの存在下でのＮＲＴＰアッセイによって得られたＲＬＵ値を示している。図２４のＸ軸はＭＳＳＡ ＲＬＵカットオフ値に設定されている。
図２３を見て分かるように、ＭＲＳＡ ＮＲＳ２５は１２８μｇ／ｍＬセフォキシチンのＭＩＣを示し、一方、ＭＲＳＡ Ｓ７は６４μｇ／ｍＬセフォキシチンのＭＩＣを示した。同様に、ＭＲＳＡ ＮＲＳ２５は６４μｇ／ｍＬセフォキシチンまでのセフォキシチン濃度までＭＳＳＡ ＲＬＵカットオフを上回るかなりの発光を示し、一方、ＭＲＳＡ Ｓ７は３２μｇ／ｍＬまでのセフォキシチン濃度までＭＳＳＡ ＲＬＵカットオフを上回る発光を示した。
上記データに基づき、ＮＲＴＰアッセイは、アッセイから得られたＲＬＵ値がＭＩＣ結果と相関していることから、ＮＲＴＰアッセイが抗生物質感受性アッセイを開発するのに使用可能であることを示している。
実施例９：転写物レポーターアッセイ：ＭｒｓａのｍｅｃＡ遺伝子転写物によって活性化されるＬｕｘａｂ翻訳のＲＢＳをブロックするシス抑制による立体構造変化の機構
上記のように、レポーター転写物は、レポーター遺伝子配列の翻訳がレポーター遺伝子のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）のシス抑制によって阻害されるように、設計することができる。
本発明のレポーター転写物を設計するために以下の手段を使用した。
１） ＲＮＡ二次構造は、Ｍｆｏｌｄ（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form）等の、二次構造プログラムを用いて計算した。
２） 分子間ＲＮＡ相互作用は、整数計画法（Integer Programming）を用いたＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用予測（ＲａｃｔＩＰ）（http://rna.naist.jp/ractip/）等の、ソフトウェアプログラムを用いて計算した。
３） ＲＮＡ二次構造は、ＲＮＡの可視化アプレット（Visualization Applet for RNA）（ＶＡＲＮＡ）（http://varna.lri.fr/）を用いて可視化した。
図２５は、Ｍｆｏｌｄにより算出された最も低いエネルギー配置に基づいて作製され、ＶＡＲＮＡを用いて可視化された、ｍｅｃＡ転写物の二次構造を示している。末端ループ２３（Ｔ２３）は、ｍｅｃＡ転写物配列の塩基１，４８７〜１，４９０から成るＹＵＮＲ配列ＵＵＧＧを含有している。ｍｅｃＡ遺伝子転写物の二次構造の解析は、レポーター及びｓｓＲＮＡ領域の間での相互作用を介して抑制解除され得るシス抑制ｌｕｘＡＢレポーターを設計するのに適したいくつかのｓｓＲＮＡ領域を明らかにした。
図２６で詳細に示されるように、ｍｅｃＡ転写物の末端ループ２３（Ｔ２３）はＹＵＮＲコンセンサス配列を含有している。ＹＵＮＲ（ピリミジン−ウラシル−ヌクレオチド−プリン）(pYrimidine-Uracil-Nucleotide-puRine)コンセンサス配列は、天然系における分子間ＲＮＡ複合体の重要な標的であることが示されている。シス抑制配列がレポーター配列のＲＢＳへのＲＮＡポリメラーゼの結合を阻止するように、シス抑制配列を、レポーター配列のＲＢＳと共にステムループ構造を形成するように設計した。シス抑制ステムループ構造のループとｍｅｃＡ転写物のＴ２３との結合後に、レポーター配列は露出された。
図２７に示すように、シス抑制配列（２７０１）を、ｌｕｘＡＢ遺伝子の５’末端に付加し、ｌｕｘＡ遺伝子のＲＢＳ配列（「ＡＡＧＧＡＡ」）（２７０２）をブロックするステムループ構造を形成するように設計した。シス抑制ステムループ構造は、Ｍｆｏｌｄによって算出され、ＶＡＲＮＡを用いて可視化される、ｌｕｘＡＢ転写物の５’末端にシス抑制配列を含むｌｕｘＡＢ転写物の最も低いエネルギー配置に基づいて、ｌｕｘＡ ＲＢＳ（「ＡＡＧＧＡＡ」）配列をブロックすることが予測された。
ｌｕｘＡ遺伝子の開始コドンＡＵＧまでの、シス抑制されたｌｕｘＡＢ遺伝子の最初の６１個のヌクレオチドを図７に示す。ＲＢＳ配列「ＡＡＧＧＡＡ」は塩基４７〜５２を含む。レポーター転写物のこの末端ループは、ＹＵＮＲ配列を含有するｍｅｃＡ転写物の末端ループ２３（Ｔ２３）と相互作用（結合）するように設計された。
シス抑制配列の末端ループは、シス抑制ステムループ構造由来のループ及びｍｅｃＡ転写物のＴ２３の相互作用を介したシス抑制されたｌｕｘＡＢ転写物及びｍｅｃＡ転写物のハイブリダイゼーションが、ｌｕｘＡ遺伝子のＲＢＳの露出をもたらすように、ｍｅｃＡ転写物のＴ２３と相互作用するように設計された。図２８は、ＲａｃｔＩＰによって算出されＶＡＲＮＡによって可視化された、ｍｅｃＡ Ｔ２３配列及びｌｕｘＡＢ転写物上のシス抑制配列の間の予測された分子間相互作用を示している。線は、ｍｅｃＡ転写物及びシス抑制されたｌｕｘＡＢ転写物の間の塩基対形成を示している。２つの配列間の相互作用は、ｌｕｘＡ ＲＢＳ配列ＡＡＧＧＡＡの露出、及びそれによるｌｕｘＡＢレポーターの抑制解除をもたらす。
実施例１０：転写物レポーターアッセイ：ｍｅｃＡ-ｌｕｘＡＢレポーターシステムを用いて標的転写物又は標的遺伝子を検出する方法
別の実施例では、ｍｅｃＡ−ｌｕｘＡＢレポーターシステムを用いて標的ｍｅｃＡ遺伝子を検出する方法が提供される。ここで、ｍｅｃＡは標的転写物であり、ｌｕｘＡＢはレポーター分子である。
１． レポーターコンストラクトの構築
ｌｕｘＡＢをコードするレポーターコンストラクトを含むベクターは、レポーターコンストラクトを、大腸菌（E. coli）及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）の両方において増殖可能なシャトルベクターに組み込むことによる、標準的な分子生物学的手法を介して、構築することができる。前記ベクターは、大腸菌（E. coli）内で機能的な複製開始点、及び大腸菌（E. coli）内で発現され、前記ベクターで形質転換され選択的条件下で増殖される大腸菌（E. coli）細胞を増殖させるのに適した選択マーカーを含有し得る。前記ベクターはまた、黄色ブドウ球菌（S. aureus）内で機能的な複製開始点、及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）内で発現され、前記ベクターで形質転換され選択的条件下で増殖される大腸菌（E. coli）細胞を増殖させるのに適した選択マーカーを含有し得る。インビトロ操作を実行するための、及び操作の確認のためのベクターの増殖は、大腸菌（E. coli）の適切な実験室内クローニング株によって達成することができ、その後、最終的な改変ベクターを黄色ブドウ球菌（S. aureus）株に導入することができる。
レポーターコンストラクトは、前記コンストラクトを転写しレポーター転写物を産生するために、黄色ブドウ球菌（S. aureus）細胞に最初に導入され得る。
２． シス抑制されたレポーター転写物の構築
ｍｅｃＡ標的転写物に結合し得るシス抑制されたレポーター転写物を構築するための方法が提供される。レポーター転写物は標準的な分子生物学的手法によって構築することができる。ｌｕｘＡ遺伝子及びｌｕｘＢ遺伝子はレポーター遺伝子として機能し、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harveyi）に由来し得る。これらの遺伝子は転写プロモーターを欠失しており、それぞれ、自身のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を含有している。ｌｕｘＡ遺伝子及びｌｕｘＢ遺伝子の両方が細胞内で翻訳された場合、ｌｕｘＡタンパク質及びｌｕｘＢタンパク質は複合体化して活性型ルシフェラーゼ酵素（ＬｕｘＡＢ）を形成する。Farinha, M.A. and A.M. Kropinski, Construction of broad-host-range plasmid vectors for easy visible selection and analysis of promoters. J. Bacteriol., 1990. 172(6): p. 3496-3499を参照されたい。
シス抑制配列はｌｕｘＡＢ遺伝子の上流且つプロモーターの下流に位置し得、ｌｕｘＡ ＲＢＳに相補的な配列を含む。リンカー配列が、シス抑制配列及びｌｕｘＡ配列の相補的領域を分離している可能性がある。ベクターの転写後、シス抑制配列及びｌｕｘＡ ＲＢＳ配列の相補的領域は複合体化し、リボソームのドッキング、すなわち翻訳を阻害するステムループを形成する。
レポーター転写物のステムループは、天然ｍｅｃＡ転写物配列（細胞に対し内在性）と相互作用する際に、不安定化して開鎖複合体を形成するように設計される。ｌｕｘＡ遺伝子配列の翻訳を活性化させるために、天然ｍｅｃＡ転写物は、シス抑制されたレポーター転写物に結合し、ｌｕｘＡ遺伝子のＲＢＳを隔離する阻害性ステムループを開口するトランス活性化ＲＮＡとして機能する。ＲＢＳがシス抑制配列によって隔離されなくなると、ｌｕｘＡの翻訳が起こり得る。レポーターコンストラクトの転写は、レポーター配列をシス抑制配列の上流の構成的プロモーターに機能的に連結することによって、達成される。
標的ｍｅｃＡ遺伝子配列の一例を図２９に示す。前記配列は、ｍｅｃＡ遺伝子座ＤＮＡ配列（黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）亜種アウレウス（subsp. aureus）ＳＡ４０由来、全ゲノムＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００３６０４．１；配列番号１５）であり得、レポーター配列及びシス抑制配列を含むレポーターコンストラクトを作製するのに使用することができる。−１０位（２９０１）、転写開始部位（２９０２）、ＲＢＳ（２９０３）、コード領域（灰色、９０４）及び転写終結配列（２９０５）が示される。
図３０は、本発明の一実施形態に係る、レポーター転写物（配列番号１６）を設計するために使用され得る、例示的なｍｅｃＡ転写物配列を示している。ＲＢＳ（３００１）及びコード配列（３００２）はｍｅｃＡについて示されている。
図３１は、本発明の一実施形態に係る、レポーター転写物を設計するために使用され得る、ｌｕｘＡＢ遺伝子座ＤＮＡ配列の一例である。ｌｕｘＡＢ遺伝子座ＤＮＡ配列は、ルシフェラーゼα及びβサブユニットのビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）遺伝子のｌｕｘＡ及びｌｕｘＢから得られた（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ０６７５８．１）（配列番号１７）。−１０位（３１０１）、転写開始部位（３１０２）、ｌｕｘＡのＲＢＳ（３１０３）、ｌｕｘＡコード配列（３１０４）（灰色陰影）、ｌｕｘＢのＲＢＳ（３１０５）、及びｌｕｘＢコード配列（灰色陰影）（３１０６）が示されている。
図３２は、レポーター転写物を設計するために使用され得るｌｕｘＡＢ転写物配列の一例である（配列番号１８）。ｌｕｘＡのＲＢＳ（３２０１）、ｌｕｘＡコード配列（３２０２）（灰色陰影）、ｌｕｘＢのＲＢＳ（３２０３）、及びｌｕｘＢコード配列（灰色陰影）（３２０４）が示されている。
図３３は、レポーター転写物で使用され得る、ｌｕｘＡＢシス抑制された転写物配列の一例である（配列番号１９）。シス抑制配列（点線ボックス）（３３０１）、ｌｕｘＡのＲＢＳ（３３０２）、ｌｕｘＡコード配列（３３０３）（灰色陰影）、ｌｕｘＢのＲＢＳ（３３０４）、及びｌｕｘＢコード配列（灰色陰影）（３３０５）が示されている。
３． レポーター転写物を用いてｍｅｃＡ標的転写物の有無を検出するための方法
本発明のレポーター転写物を用いて細胞内のｍｅｃＡ標的転写物の有無を検出するための例が提供される。図３４は、細胞（３４０１）内に内在性ｍｅｃＡ転写物が存在しない（例えば、細胞のゲノムがｍｅｃＡ遺伝子を含有していない）、レポーター転写物（１４１０）をコードするベクター（３４００）を含む細胞の一例を示している。この場合、シス抑制配列（３４２０）はｌｕｘＡＢ遺伝子のＲＢＳ（３４３０）に結合する。いくつかの実施形態では、シス抑制配列（３４２０）は、ｌｕｘＡ遺伝子のＲＢＳ、ｌｕｘＢ遺伝子のＲＢＳ、又は両方の一部又は全てに結合し得る。この結合事象は、ｌｕｘＡＢ遺伝子の翻訳を遮断及び阻止し、レポーター分子（例えば、ルシフェラーゼ）が細胞ないで産生されない。従って、シグナルは検出されず、これは、細胞内のｍｅｃＡ遺伝子の不在を示している。
別の例では、前記細胞は内在性ｍｅｃＡ転写物を含んでいる（例えば、細胞のゲノムがｍｅｃＡ遺伝子を含有している）。図３５は、細胞（３４０１）内に導入されるベクター（３４００）を示している。前記ベクター（３４００）はレポーター転写物（３４１０）をコードしており、前記レポーター転写物は、シス抑制配列（３４２０）及びレポーター配列（ｌｕｘＡ遺伝子及びｌｕｘＢ遺伝子）を含んでいる。細胞内に存在するｍｅｃＡ転写物（３５１０）がシス抑制配列（１４２０）に結合すると、阻害性ヘアピンループが開口し、ｌｕｘＡ遺伝子のＲＢＳ（３４３０）が露出される。レポーター配列（ｌｕｘＡ及びｌｕｘＢ）の翻訳が起こり、ｌｕｘＡＢ酵素（３５２０）の形成がもたらされ得る。ｌｕｘＡＢ酵素（３５２０）は検出可能な発光シグナル（３５３０）を生み出す。このように、転写物レポーターベクター（３４００）は、細胞（３４０１）内の内在性ｍｅｃＡ転写物（３５１０）の存在を報告する。
本発明は特に、好ましい実施形態及び様々な交互の（alternate）実施形態に関して示され記述されたが、形態及び詳細における様々な変更を、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、それになすことが可能であることは、当業者に理解される。
本明細書の本文内で引用された全ての参考文献、交付済み特許及び特許出願は、全ての目的においてそれらの全体が参照によって本明細書に援用される。
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略式配列表
配列番号１
天然Ｐ１ ｐａｃ部位
CCACTAAAAAGCATGATCATTGATCACTCTAATGATCAACATGCAGGTGATCACATTGCGGCTGAAATAGCGGAAAAACAAAGAGTTAATGCCGTTGTCAGTGCCGCAGTCGAGAATGCGAAGCGCCAAAATAAGCGCATAAATGATCGTTCAGATGATCATGACGTGATCACCCGC
配列番号２
サイレント変異を有するＰ１ ｐａｃ部位、小文字は変異した塩基を示す
CCACTAAAAAGCATGATaATaGAcCACTCTAAcGAcCAACATGCAGGgGAgCACATTGCGGCTGAAATAGCGGAAAAgCAgAGgGTgAATGCCGTTGTCAGTGCCGCAGTCGAGAATGCGAAGCGCCAAAATAAGCGCATAAAcGAcCGTTCAGAcGAcCATGACGTtATtACCCGC
配列番号３
Ｃ１リプレッサーにより制御されるＰ５３プロモーター、プロモーターＰ５３アンチセンス、ｒｅｐＬ遺伝子、及びｋｉｌＡ遺伝子のインフレーム欠失を含有するＰ１溶解性レプリコン
CACTATAGGGCGAATTGGCGGAAGGCCGTCAAGGCCGCATTTGGGCCCGGCGCGCCGGATCCGCTAGCTCTAGACTGGCAGGTTTCTGAGCAGATCGTCCAACCCGATCTGGATCGGGTCAGAAAAATTTGCTCTAATAAATTTCGTTTTCTAAGTGCAAAGAATCACCATTTCGAGCTGGTGATTGAAGGTTGATGCAAATTTGGAGAAAAAATGCAACAAACATTCAATGCGGATATGAATATATCAAACCTTCATCAAAATGTCGATCCTTCAACCACTCTGCCCGTTATTTGTGGTGTTGAAATTACGACCGACCGCGCTGGCCGTTACAACCTTAATGCTCTACACAGAGCGAGCGGACTCGGTGCCCATAAAGCGCCAGCTCAATGGCTAAGAACGCTGTCAGCTAAACAGCTCATCGAAGAGCTTGAAAAAGAAACTATGCAGAATTGCATAGTTTCGTTCACAAGCAATGGAAGCAGGATTTCTTTCACGACTCGTATAACCGGCAAAGGTCAGCAGTGGCTGATGAAGCGATTGCTTGATGCTGGTGTGCTGGTACCTGTCGCGGCAACGCGCTAACAGACGTAGTAAGAACCACCAGCATTGTAATGCTGGCTAAAGTCACTTTCCTGAGCTGTATAACGATGAGCGATTTTACTTTTTCTGGCTATGAATTGGCCTGCTTTGTAACACACTCCGGTCTATCCCGTAGCGCCGGGCATATCCTGTCGCAATGTGCAAATCTCGCGGCAACAACCAGTGAATACTTCATTCACAAGCCTCACCGCCTGATCGCGGCAGAAACTGGTTATAGCCAATCAACCGTCGTTCGTGCATTCCGTGAAGCTGTAAACAAAGGAATTCTGTCTGTAGAGATTGTTATCGGCGATCACCGTGAACGTCGCGCTAACCTGTACCGGTTTACACCATCCTTTTTGGCCTTCGCACAACAAGCCAAAAATGCGCTGATAGAAAGCAAATTAAAGATCTCTTCAGCGGCAACCAAGGTTAAAGCTGTTCTCGCTAAGACATTGGCTTTATTTAATTTTTTATCCACACCCCCATGTCAAAATGATACCCCCTCCCCCTGTCAGGATGACGTGGCAATAAAGAATAAGAAGTCACAAGTTAAAAAAACAAAAAGATCAGTTTCCGGCGGTGCCGGAACAACCAGCCTCAAAAAATTGACTTCATGGATCGCTAAGGCAAAAGCAAAGGCTGACAATCTGCGGTTATCCAAAAAACGCACTCAAAAACATGAGTTCAAGCAGAAAGTAGAGGCGGCTGCGCGGAAATATGCTTACCTGAAGAACAAGCGTTCGCCTGATATTGGCGGGATATCAAACTTCGATAACCTACCGCATTGCATGACGGTAAACGAAGCTCTTAATGCGGTTTTAGCCAAAAATAAAGATAACGAACAATGGGGTATACCGGCAGGATTCAGAGGGTAATGAATTGCTCTAATTATAACCATGCATACTTTCAACACCTCTAGTTTGCCATGAGGCAAACTCATAGGTGTCCTGGTAAGAGGACACTGTTGCCAAAACTGGACGCCCCATTATTGCAATTAATAAACAACTAACGGACAATTCTACCTAACAATAAGTGGCTTAAAAAAACCCGCCCCGGCGGGTTTTTTTATCTAGAGCTAGCGGATCCGGCGCGCCGGGCCCTTCTGGGCCTCATGGGCCTTCCGCTCACTGCCCGCTTTCCAG
配列番号４
Ｐｂｌａｓｔプロモーター配列
CGTCAGGTGGCACTTTTCGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAGGAAGAGT
配列番号５
黄色ブドウ球菌（S. aureus）ｐＴ１８１プラスミド開始点又は複製コピー数変異体ｐＴ１８１ｃｏｐ−６２３ ｒｅｐＣ
TTTGCGGAAAGAGTTAGTAAGTTAACAGAAGACGAGCCAAACCTAAATGGTTTAGCAGGAAACTTAGATAAAAAAATGAATCCAGAATTATATTCAGAACAGGAACAGCAACAAGAGCAACAAAAGAATCAAAAACGAGATAGAGGTATGCACTTATAGAACATGCATTTATGCCGAGAAAACTTATTGGTTGGAATGGGCTATGTGTTAGCTAACTTGTTAGCGAGTTGGTTGGACTTGAATTGGGATTAATCCCAAGAAAGTACCGGCTCAACAACCCATAAAGCCCTGTAGGTTCCGNCCAATAAGGAAATTGGAATAAAGCAATAAAAGGAGTTGAAGAAATGAAATTCAGAGAAGCCTTTGAGAATTTTATAACAAGTAAGTATGTACTTGGTGTTTTAGTAGTCTTAACTGTTTACCAGATAATACAAATGCTTAAATAAAAAAAGACTTGATCTGATTAGACCAAATCTTTTGATAGTGTTATATTAATAACAAAATAAAAAGGAGTCGCTCACGCCCTACCAAAGTTTGTGAACGACATCATTCAAAGAAAAAAACACTGAGTTGTTTTTATAATCTTGTATATTTAGATATTAAACGATATTTAAATATACATCAAGATATATATTTGGGTGAGCGATTACTTAAACGAAATTGAGATTAAGGAGTCGATTTTTTATGTATAAAAACAATCATGCAAATCATTCAAATCATTTGGAAAATCACGATTTAGACAATTTTTCTAAAACCGGCTACTCTAATAGCCGGTTGGACGCACATACTGTGTGCATATCTGATCCAAAATTAAGTTTTGATGCAATGACGATCGTTGGAAATCTCAACCGAGACAACGCTCAGGCCCTTTCTAAATTTATGAGTGTAGAGCCCCAAATAAGACTTTGGGATATTCTTCAAACAAAGTTTAAAGCTAAAGCACTTCAAGAAAAAGTTTATATTGAATATGACAAAGTGAAAGCAGATAGTTGGGATAGACGTAATATGCGTATTGAATTTAATCCAAACAAACTTACACGAGATGAAATGATTTGGTTAAAACAAAATATAATAAGCTACATGGAAGATGACGGTTTTACAAGATTAGATTTAGCCTTTGATTTTGAAGATGATTTGAGTGACTACTATGCAATGTCTGATAAAGCAGTTAAGAAAACTATTTTTTATGGTCGTAATGGTAAGCCAGAAACAAAATATTTTGGCGTGAGAGATAGTAATAGATTTATTAGAATTTATAATAAAAAGCAAGAACGTAAAGATAATGCAGATGCTGAAGTTATGTCTGAACATTTATGGCGTGTAGAAATCGAACTTAAAAGAGATATGGTGGATTACTGGAATGATTGCTTTAGTGATTTACATATCTTGCAACCAGATTGGAAAACTATCCAACGCACTGCGGATAGAGCAATAGTTTTTATGTTATTGAGTGATGAAGAAGAATGGGGAAAGCTTCACAGAAATTCTAGAACAAAATATAAGAATTTGATAAAAGAAATTTCGCCAGTCGATTTAACGGACTTAATGAAATCGACTTTAAAAGCGAACGAAAAACAATTGCAAAAACAAATCGATTTTTGGCAACATGAATTTAAATTTTGGAAATAGTGTACATATTAATATTACTGAACAAAAATGATATATTTAAACTATTCTAATTTAGGAGGATTTTTTTATGAAGTGTCTATTTAAAAATTTGGGGAATTTATATGAGGTGAAAGAATAATTTACCCCTATAAACTTTAGCCACCTCAAGTAAAGAGGTAAAATTGTTTAGTTTATATAAAAAATTTAAAGGTTTGTTTTATAGCGTTTTATTTTGGCTTTGTATTCTTTCATTTTTTAGTGTATTAAATGAAATGGTTTTAAATGTTTCTTTACCTGATATTGCAAATCATTTTAATACTACTCCTGGAATTACAAACTGGGTAAACACTGCATATATGTTAACTTTTTCGATAGGAACAGCAGTATATGGAAAATTATCTGATTATATAAATATAAAAAAATTGTTAATTATTGGTATTAGTTTGAGCTGTCTTGGTTCATTGATTGCTTTTATTGGGCCCACCTAGGCAAATATGCTCTTACGTGCTATTATTTAAGTGACTATTTAAAAGGAGTTAATAAATATGCGGCAAGGTATTCTTAAATAAACTGTCAATTTGATAGCGGGAACAAATAATTAGATGTCCTTTTTTAGGAGGGCTTAGTTTTTTGTACCCAGTTTAAGAATACCTTTATCATGTGATTCTAAAGTATCCAGAGAATATCTGTATGCTTTGTATACCTATGGTTATGCATAAAAATCCCAGTGATAAAAGTATTTATCACTGGGATTTTTATGCCCTTTTGGGTTTTTGAATGGAGGAAAATCACATGAAAATTATTAATATTGGAGTTTTAGCTCATGTTGATGCAGGAAAAACTACCTTAACAGAAAGCTTATTATATAACAGTGGAGCGATTACAGAATTAGGAAGCGTGGACAAAGGTACAACGAGGACGGATAATACGCTTTTAGAACGTCAGAGAGGAATTACAATTCAGACAGGAATAACCTCTTTTCAGTGGGAAAATACGAAGGTGAACATCATAGACACGCCAGGACATATGGATTTCTTAGCAGAAGTATATCGTTCATTATCAGTTTTAGATGGGGCAATTCTACTGATTTCTGCAAAAGATGGCGTACAAGCACAAACTCGTATATTATTTCATGCACTTAGGAAAATGGGGATTCCCACAATCTTTTTTATCAATAAGATTGACCAAAATGGAATTGATTTATCAACGGTTTATCAGGATATTAAAGAGAAACTTTCTGCCGAAATTGTAATCAAACAGAAGGTAGAACTGTATCCTAATATGTGTGTGACGAACTTTACCGAATCTGAACAATGGGATACGGTAATAGAGGGAAACGATAACCTTTTAGAGAAATATATGTCCGGTAAATCATTAGAAGCATTGGAACTCGAACAAGAGGAAAGCATAAGATTTCAGAATTGTTCTCTGTTCCCTCTTTATCATGGAAGTGCAAAAAGTAATATAGGGATTGATAACCTTATAGAAGTTATTACTAATAAATTTTATTCATCAACACATCGAGGTCCGTCTGAACTTTGCGGAAATGTTTTCAAAATTGAATATACAAAAAAAAGACAACGTCTTGCATATATACGCCTTTATAGTGGAGTACTACATTTACGAGATTCGGTTAGAGTATCAGAAAAAGAAAAAATAAAAGTTACAGAAATGTATACTTCAATAAATGGTGAATTATGTAAGATTGATAGAGCTTATTCTGGAGAAATTGTTATTTTGCAAAATGAGTTTTTGAAGTTAAATAGTGTTCTTGGAGATACAAAACTATTGCCACAGAGAAAAAAGATTGAAAATCCGCACCCTCTACTACAAACAACTGTTGAACCGAGTAAACCTGAACAGAGAGAAATGTTGCTTGATGCCCTTTTGGAAATCTCAGATAGTGATCCGCTTCTACGATATTACGTGGATTCTACGACACATGAAATTATACTTTCTTTCTTAGGGAAAGTACAAATGGAAGTGATTAGTGCACTGTTGCAAGAAAAGTATCATGTGGAGATAGAACTAAAAGAGCCTACAGTCATTTATATGGAGAGACCGTTAAAAAATGCAGAATATACCATTCACATCGAAGTGCCGCCAAATCCTTTCTGGGCTTCCATTGGTTTATCTGTATCACCGCTTCCGTTGGGAAGTGGAATGCAGTATGAGAGCTCGGTTTCTCTTGGATACTTAAATCAATCATTTCAAAATGCAGTTATGGAAGGGGTACGCTATGGTTGCGAACAAGGATTATATGGTTGGAATGTGACGGATTGTAAAATCTGTTTTAAGTACGGTTTATACTATAGCCCTGTTAGTACTCCAGCAGATTTTCGGATGCTTACTCCTATTGTACTGGAGCAAGCCTTTAGAAAAGCTGGAACAGAATTGTTAGAGCCATATCTTAGTTTTAAAGTTTATGCACCACAGGAATATCTTTCNCGGGCATATAACGATGCTCCCAAATATTGTGCAAATATCGTAAATACTCAACTGAAAAATAATGAGGTCATTATTATTGGAGAAATTCCTGCTCGATGTATTCAAGATTATCGCAATGATTTAACTTTTTTTACAAATGGGCTTAGTGTTTGTTTAGCAGAGCTAAAAGGATATCAGGTTACCACTGGCGAACCTGTTTGCCAGACCCGTCGTCTAAATAGTCGGATAGATAAAGTAAGATATATGTTCAATAAAATAACTTAGTGCGTTTTATGTTGTTATATAAATATGGTTTCTTATTAAATAAGATGAAATATTCTTTAATATAGATTTGAATTAAAGTGGAAAGGAGGAGATTGTTATTATAAACTACAAGTGGATATTGTGTCCTATTTGTGGAAATAAAACAAGACTACGAATACGAGTGGATACTATACTTAAAAATTTCCCTTTATACAGCCCCAAATGTAAGAACGAAACTTTAATTAATGTTCAAAAAATGAATATAATAACAATCAAAGAGCCAGACGCCAAGACGCAGAGCCGATAATTTGAGAAATGAAACTCTCATCTTATCGGCTCTTTTTGTTTATCTGAATTTTACTGACTAGCCTTCAATATTTCC
配列番号６
Ｐ１ ｐａｃＡ遺伝子、小文字は欠失したｐａｃ部位配列を示す
GTGACCTGGGACGATCACAAGAAGAATTTTGCTCGCCTGGCGCGAGATGGTGGTTACACCATCGCACAGTATGCCGCCGAGTTTAATCTTAACCCTAATACCGCACGTCGTTATCTCCGTGCCTTCAAAGAAGACACCAGGACTACGGACAGCCGCAAGCCAAATAAGCCAGTCAGGAAGccactaaaaagcatgatcattgatcactctaatgatcaacatgcaggtgatcacattgcggctgaaatagcggaaaaacaaagagttaatgccgttgtcagtgccgcagtcgagaatgcgaagcgccaaaataagcgcataaatgatcgttcagatgatcatgacgtgatcacccgcGCCCACCGGACCTTACGTGATCGCCTGGAACGCGACACCCTGGATGATGATGGTGAACGCTTTGAATTCGAAGTTGGCGATTACCTGATAGATAACGTTGAAGCGCGGAAGGCCGCGCGCGCTATGTTGCGTCGGTCCGGGGCCGATGTTCTGGAAACCACTCTTCTGGAAAAGTCTCTTTCTCATCTCCTTATGCTGGAGAACGCCAGGGATACGTGTATTCGCCTGGTGCAGGAAATGCGCGATCAGCAAAAAGACGATGATGAAGGTACTCCGCCTGAATACCGTATCGCGAGCATGCTAAACAGCTGTTCCGCGCAGATAAGCAGCCTGATCAACACCATTTACAGCATCCGGAATAACTATCGAAAAGAAAGCCGGGAGGCGGAAAAGCACGCTTTATCTATGGGGCAAGCTGGCATTGTTAAGCTGGCATACGAACGAAAGCGTGAAAATAACTGGTCAGTGCTGGAAGCGGCTGAATTCATCGAGGCGCATGGAGGAAAAGTGCCGCCCCTGATGCTGGAGCAAATCAAAGCCGATCTGCGTGCTCCTAAGACCAATACCGATGATGAGGAAAACCAAACAGCATCTGGCGCTCCATCACTTGAAGATCTGGATAAAATCGCGCGAGAACGGGCCGCCAGCCGCCGCGCTGATGCCGCATTGTGGATTGAGCATCGTAGAGAAGAAATTGCCGATATCGTCGATACAGGTGGTTATGGTGATGTCGATGCGGAAGGCATATCAAACGAAGCATGGCTTGAACAGGATCTGGACGAAGACGAGGAGGAAGACGAAGAAGTTACCCGCAAACTGTACGGGGATGATGATTAA
配列番号７
天然Ｐ１ ｐａｃＡ遺伝子
GTGACCTGGGACGATCACAAGAAGAATTTTGCTCGCCTGGCGCGAGATGGTGGTTACACCATCGCACAGTATGCCGCCGAGTTTAATCTTAACCCTAATACCGCACGTCGTTATCTCCGTGCCTTCAAAGAAGACACCAGGACTACGGACAGCCGCAAGCCAAATAAGCCAGTCAGGAAGCCACTAAAAAGCATGATCATTGATCACTCTAATGATCAACATGCAGGTGATCACATTGCGGCTGAAATAGCGGAAAAACAAAGAGTTAATGCCGTTGTCAGTGCCGCAGTCGAGAATGCGAAGCGCCAAAATAAGCGCATAAATGATCGTTCAGATGATCATGACGTGATCACCCGCGCCCACCGGACCTTACGTGATCGCCTGGAACGCGACACCCTGGATGATGATGGTGAACGCTTTGAATTCGAAGTTGGCGATTACCTGATAGATAACGTTGAAGCGCGGAAGGCCGCGCGCGCTATGTTGCGTCGGTCCGGGGCCGATGTTCTGGAAACCACTCTTCTGGAAAAGTCTCTTTCTCATCTCCTTATGCTGGAGAACGCCAGGGATACGTGTATTCGCCTGGTGCAGGAAATGCGCGATCAGCAAAAAGACGATGATGAAGGTACTCCGCCTGAATACCGTATCGCGAGCATGCTAAACAGCTGTTCCGCGCAGATAAGCAGCCTGATCAACACCATTTACAGCATCCGGAATAACTATCGAAAAGAAAGCCGGGAGGCGGAAAAGCACGCTTTATCTATGGGGCAAGCTGGCATTGTTAAGCTGGCATACGAACGAAAGCGTGAAAATAACTGGTCAGTGCTGGAAGCGGCTGAATTCATCGAGGCGCATGGAGGAAAAGTGCCGCCCCTGATGCTGGAGCAAATCAAAGCCGATCTGCGTGCTCCTAAGACCAATACCGATGATGAGGAAAACCAAACAGCATCTGGCGCTCCATCACTTGAAGATCTGGATAAAATCGCGCGAGAACGGGCCGCCAGCCGCCGCGCTGATGCCGCATTGTGGATTGAGCATCGTAGAGAAGAAATTGCCGATATCGTCGATACAGGTGGTTATGGTGATGTCGATGCGGAAGGCATATCAAACGAAGCATGGCTTGAACAGGATCTGGACGAAGACGAGGAGGAAGACGAAGAAGTTACCCGCAAACTGTACGGGGATGATGATTAA
配列番号８
ｔｅｒＳ遺伝子、小文字は欠失した配列を示す
ATGAACGAAAAACAAAAGAGATTCGCAGATGAATATATAATGAATGGATGTAATGGTAAAAAAGCAGCAATTTCAGCAggttatagtaagaaaacagcagagtctttagcaagtcgattgttaagaaatgttaatgtttcggaatatattaaagaacgattagaacagatacaagaagagcgtttaatgagcattacagaagctttagcgttatctgcttctattgctagaggagaacctcaagaggcttacagtaagaaatatgaccatttaaacgatgaagtggaaaaagaggttacttacacaatcacaccaacttttgaagagcgtcagagatctattgaccacatactaaaagttcatggtgcgtatatcgacaaaaaagaaattactcagaagaatattgagattaatattAGATCTATTGACCACATACTAAAAGTTCATGGTGCGTATATCGACAAAAAAGAAATTACTCAGAAGAATATTGAGATTAATATTGGTGAGTACGATGACGAAAGTTAA
配列番号９
天然ｔｅｒＳ遺伝子を含有する配列
AATTGGCAGTAAAGTGGCAGTTTTTGATACCTAAAATGAGATATTATGATAGTGTAGGATATTGACTATCTTACTGCGTTTCCCTTATCGCAATTAGGAATAAAGGATCTATGTGGGTTGGCTGATTATAGCCAATCCTTTTTTAATTTTAAAAAGCGTATAGCGCGAGAGTTGGTGGTAAATGAAATGAACGAAAAACAAAAGAGATTCGCAGATGAATATATAATGAATGGATGTAATGGTAAAAAAGCAGCAATTTCAGCAGGTTATAGTAAGAAAACAGCAGAGTCTTTAGCAAGTCGATTGTTAAGAAATGTTAATGTTTCGGAATATATTAAAGAACGATTAGAACAGATACAAGAAGAGCGTTTAATGAGCATTACAGAAGCTTTAGCGTTATCTGCTTCTATTGCTAGAGGAGAACCTCAAGAGGCTTACAGTAAGAAATATGACCATTTAAACGATGAAGTGGAAAAAGAGGTTACTTACACAATCACACCAACTTTTGAAGAGCGTCAGAGATCTATTGACCACATACTAAAAGTTCATGGTGCGTATATCGACAAAAAAGAAATTACTCAGAAGAATATTGAGATTAATATTGGTGAGTACGATGACGAAAGTTAAATTAAACTTTAACAAACCATCTAATGTTTTCAACAG
配列番号１０
ＳａＰｉｂｏｖ２インテグラーゼ遺伝子
TCATAAATATTTAACTATTTCTTTCTGTGTACTAGGGTACAAATGACCGTATCGGTTATATACTTCATTACTATCAGCATGGCCTAAACGCTGTGCTATTACCATGATACTTGCGCCATGATTGACTAGCATAGACGCATGGCTATGTCTTAACTCATGAATTACAATTCTAGGGAATGTCTGACCGTCTGGTAGTTGTTCATCTAATACTTTTAATGCAGCGGTAAACCAACGATCTATAGTTGATTCACTATAAGCTTTGAAGAATGTACCGAATAATACATAATCATCTTTATATACATTGTTTTCTTTGTACCATTTTAAATATTCTTTGATATCATTCATCATGTGAACAGGTAAGTATATATCACGTATTGCTGCTTTTGTTTTAGGGGCTGTCACTTCACCGTGATAGTCTGTTTTGTTAATATGTATGAAATCATCATCATAGTTAATATCACGCCATGTGAGGGCTCTAATTTCGCCCTTACGTGCACCAGAGTAAAACAGTAGCTTAAAGAATAACTTTTGTTGTTGTGTAGCTAAAGCCTCATAGAATTGATTGAATTGTTCTAATGTCCAATAGTTCAAACGCTTATTTGATTCTATTTCAAAGTTACCTACTAGAGAGGCTACATTTTGCTTTAGATCATGAAACTTCATAGCATGGTTAAGTAACGATACTAAGAACACGTGCATTTTCTTTAGGTACTCTCCAGAGTGTCCCTCTTTTAACTTCGTATTCTGAAACTTCATAATATCTTGTGTAGTCATATTAAACACGTCCATAGACTTAAAATAGGGTAGCAAATGGTTGTTTGTATGTGTCTTTAATGCTTTCACACTAGATGACTTACGACGTGCAGAATACCACTCTATATACTCATCTACGAGCTTATCAAAGGGCAGTTTGTTTATCTGTCCTACACCCTCTAACTCGTCCATAATTTCATTACATTTCTTCAATGCCTCTTTACGCTGTTTAAAGCCACTCTTTTTTATTTCTTTACGTTGATTAAATTTATCATAGTATTTTATACGAAAATAGTATGTACCACGTTTAGCGTCTTTATATATGTTGTGGGATAGGTTTAAGTTGTGTTCTATGGGAATCAC
配列番号１１
ｐＧＷＰ１０００１完全配列
CTCGGGCCGTCTCTTGGGCTTGATCGGCCTTCTTGCGCATCTCACGCGCTCCTGCGGCGGCCTGTAGGGCAGGCTCATACCCCTGCCGAACCGCTTTTGTCAGCCGGTCGGCCACGGCTTCCGGCGTCTCAACGCGCTTTGAGATTCCCAGCTTTTCGGCCAATCCCTGCGGTGCATAGGCGCGTGGCTCGACCGCTTGCGGGCTGATGGTGACGTGGCCCACTGGTGGCCGCTCCAGGGCCTCGTAGAACGCCTGAATGCGCGTGTGACGTGCCTTGCTGCCCTCGATGCCCCGTTGCAGCCCTAGATCGGCCACAGCGGCCGCAAACGTGGTCTGGTCGCGGGTCATCTGCGCTTTGTTGCCGATGAACTCCTTGGCCGACAGCCTGCCGTCCTGCGTCAGCGGCACCACGAACGCGGTCATGTGCGGGCTGGTTTCGTCACGGTGGATGCTGGCCGTCACGATGCGATCCGCCCCGTACTTGTCCGCCAGCCACTTGTGCGCCTTCTCGAAGAACGCCGCCTGCTGTTCTTGGCTGGCCGACTTCCACCATTCCGGGCTGGCCGTCATGACGTACTCGACCGCCAACACAGCGTCCTTGCGCCGCTTCTCTGGCAGCAACTCGCGCAGTCGGCCCATCGCTTCATCGGTGCTGCTGGCCGCCCAGTGCTCGTTCTCTGGCGTCCTGCTGGCGTCAGCGTTGGGCGTCTCGCGCTCGCGGTAGGCGTGCTTGAGACTGGCCGCCACGTTGCCCATTTTCGCCAGCTTCTTGCATCGCATGATCGCGTATGCCGCCATGCCTGCCCCTCCCTTTTGGTGTCCAACCGGCTCGACGGGGGCAGCGCAAGGCGGTGCCTCCGGCGGGCCACTCAATGCTTGAGTATACTCACTAGACTTTGCTTCGCAAAGTCGTGACCGCCTACGGCGGCTGCGGCGCCCTACGGGCTTGCTCTCCGGGCTTCGCCCTGCGCGGTCGCTGCGCTCCCTTGCCAGCCCGTGGATATGTGGACGATGGCCGCGAGCGGCCACCGGCTGGCTCGCTTCGCTCGGCCCGTGGACAACCCTGCTGGACAAGCTGATGGACAGGCTGCGCCTGCCCACGAGCTTGACCACAGGGATTGCCCACCGGCTACCACTATAGGGCGAATTGGCGGAAGGCCGTCAAGGCCGCATTTGGGCCCGGCGCGCCGGATCCGCTAGCTCTAGACCTCTAGACCAGCCAGGACAGAAATGCCTCGACTTCGCTGCTGCCCAAGGTTGCCGGGTGACGCACACCGTGGAAACGGATGAAGGCACGAACCCAGTGGACATAAGCCTGTTCGGTTCGTAAGCTGTAATGCAAGTAGCGTGCCCGTTCCGGGCCTTTTGACATGTGACTTTCGTTACCCTCGCGTCAAAAAGAGTTTTTACGAAAGGAAGCATAAGTGACCTGGGACGATCACAAGAAGAATTTTGCTCGCCTGGCGCGAGATGGTGGTTACACCATCGCACAGTATGCCGCCGAGTTTAATCTTAACCCTAATACCGCACGTCGTTATCTCCGTGCCTTCAAAGAAGACACCAGGACTACGGACAGCCGCAAGCCAAATAAGCCAGTCAGGAAGCCACTAAAAAGCATGATCATTGATCACTCTAATGATCAACATGCAGGTGATCACATTGCGGCTGAAATAGCGGAAAAACAAAGAGTTAATGCCGTTGTCAGTGCCGCAGTCGAGAATGCGAAGCGCCAAAATAAGCGCATAAATGATCGTTCAGATGATCATGACGTGATCACCCGCGCCCACCGGACCTTACGTGATCGCCTGGAACGCGACACCCTGGATGATGATGGTGAACGCTTTGAATTCGAAGTTGGCGATTACCTGATAGATAACGTTGAAGCGCGGAAGGCCGCGCGCGCTATGTTGCGTCGGTCCGGGGCCGATGTTCTGGAAACCACTCTTCTGGAAAAGTCTCTTTCTCATCTCCTTATGCTGGAGAACGCCAGGGATACGTGTATTCGCCTGGTGCAGGAAATGCGCGATCAGCAAAAAGACGATGATGAAGGTACTCCGCCTGAATACCGTATCGCGAGCATGCTAAACAGCTGTTCCGCGCAGATAAGCAGCCTGATCAACACCATTTACAGCATCCGGAATAACTATCGAAAAGAAAGCCGGGAGGCGGAAAAGCACGCTTTATCTATGGGGCAAGCTGGCATTGTTAAGCTGGCATACGAACGAAAGCGTGAAAATAACTGGTCAGTGCTGGAAGCGGCTGAATTCATCGAGGCGCATGGAGGAAAAGTGCCGCCCCTGATGCTGGAGCAAATCAAAGCCGATCTGCGTGCTCCTAAGACCAATACCGATGATGAGGAAAACCAAACAGCATCTGGCGCTCCATCACTTGAAGATCTGGATAAAATCGCGCGAGAACGGGCCGCCAGCCGCCGCGCTGATGCCGCATTGTGGATTGAGCATCGTAGAGAAGAAATTGCCGATATCGTCGATACAGGTGGTTATGGTGATGTCGATGCGGAAGGCATATCAAACGAAGCATGGCTTGAACAGGATCTGGACGAAGACGAGGAGGAAGACGAAGAAGTTACCCGCAAACTGTACGGGGATGATGATTAATTAAAAAAACCCGCCCCGGCGGGTTTTTTTATCTAGAGCTAGCGGATCCGGCGCGCCGGGCCCTTCTGGGCCTCATGGGCCTTCCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGCACTATAGGGCGAATTGGCGGAAGGCCGTCAAGGCCGCATTTGGGCCCGGCGCGCCGGATCCGCTAGCTCTAGACTGGCAGGTTTCTGAGCAGATCGTCCAACCCGATCTGGATCGGGTCAGAAAAATTTGCTCTAATAAATTTCGTTTTCTAAGTGCAAAGAATCACCATTTCGAGCTGGTGATTGAAGGTTGATGCAAATTTGGAGAAAAAATGCAACAAACATTCAATGCGGATATGAATATATCAAACCTTCATCAAAATGTCGATCCTTCAACCACTCTGCCCGTTATTTGTGGTGTTGAAATTACGACCGACCGCGCTGGCCGTTACAACCTTAATGCTCTACACAGAGCGAGCGGACTCGGTGCCCATAAAGCGCCAGCTCAATGGCTAAGAACGCTGTCAGCTAAACAGCTCATCGAAGAGCTTGAAAAAGAAACTATGCAGAATTGCATAGTTTCGTTCACAAGCAATGGAAGCAGGATTTCTTTCACGACTCGTATAACCGGCAAAGGTCAGCAGTGGCTGATGAAGCGATTGCTTGATGCTGGTGTGCTGGTACCTGTCGCGGCAACGCGCTAACAGACGTAGTAAGAACCACCAGCATTGTAATGCTGGCTAAAGTCACTTTCCTGAGCTGTATAACGATGAGCGATTTTACTTTTTCTGGCTATGAATTGGCCTGCTTTGTAACACACTCCGGTCTATCCCGTAGCGCCGGGCATATCCTGTCGCAATGTGCAAATCTCGCGGCAACAACCAGTGAATACTTCATTCACAAGCCTCACCGCCTGATCGCGGCAGAAACTGGTTATAGCCAATCAACCGTCGTTCGTGCATTCCGTGAAGCTGTAAACAAAGGAATTCTGTCTGTAGAGATTGTTATCGGCGATCACCGTGAACGTCGCGCTAACCTGTACCGGTTTACACCATCCTTTTTGGCCTTCGCACAACAAGCCAAAAATGCGCTGATAGAAAGCAAATTAAAGATCTCTTCAGCGGCAACCAAGGTTAAAGCTGTTCTCGCTAAGACATTGGCTTTATTTAATTTTTTATCCACACCCCCATGTCAAAATGATACCCCCTCCCCCTGTCAGGATGACGTGGCAATAAAGAATAAGAAGTCACAAGTTAAAAAAACAAAAAGATCAGTTTCCGGCGGTGCCGGAACAACCAGCCTCAAAAAATTGACTTCATGGATCGCTAAGGCAAAAGCAAAGGCTGACAATCTGCGGTTATCCAAAAAACGCACTCAAAAACATGAGTTCAAGCAGAAAGTAGAGGCGGCTGCGCGGAAATATGCTTACCTGAAGAACAAGCGTTCGCCTGATATTGGCGGGATATCAAACTTCGATAACCTACCGCATTGCATGACGGTAAACGAAGCTCTTAATGCGGTTTTAGCCAAAAATAAAGATAACGAACAATGGGGTATACCGGCAGGATTCAGAGGGTAATGAATTGCTCTAATTATAACCATGCATACTTTCAACACCTCTAGTTTGCCATGAGGCAAACTCATAGGTGTCCTGGTAAGAGGACACTGTTGCCAAAACTGGACGCCCCATTATTGCAATTAATAAACAACTAACGGACAATTCTACCTAACAATAAGTGGCTTAAAAAAACCCGCCCCGGCGGGTTTTTTTATCTAGAGCTAGCGGATCCGGCGCGCCGGGCCCTTCTGGGCCTCATGGGCCTTCCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGCCAGCCTTCGACCACATACCCACCGGCTCCAACTGCGCGGCCTGCGGCCTTGCCCCATCAATTTTTTTAATTTTCTCTGGGGAAAAGCCTCCGGCCTGCGGCCTGCGCGCTTCGCTTGCCGGTTGGACACCAAGTGGAAGGCGGGTCAAGGCTCGCGCAGCGACCGCGCAGCGGCTTGGCCTTGACGCGCCTGGAACGACCCAAGCCTATGCGAGTGGGGGCAGTCGAAGGCGAAGCCCGCCCGCCTGCCCCCCGAGACCTGCAGGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAAT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ACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGGAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAA
AGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAACGTCTCATTTTCGCCAAAAGTTGGCCCAGGGCTTCCCGGTATCAACAGGGACACCAGGATTTATTTATTCTGCGAAGTGATCTTCCGTCACAGGTATTTATTCGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGCCCGCGTTCCTGCTGGCGCTGGGCCTGTTTCTGGCGCTGGACTTCCCGCTGTTCCGTCAGCAGCTTTTCGCCCACGGCCTTGATGATCGCGGCGGCCTTGGCCTGCATATCCCGATTCAACGGCCCCAGGGCGTCCAGAACGGGCTTCAGGCGCTCCCGAAGGT
配列番号１２
黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＰclpBプロモーター配列
GTCTAGTTAATGTGTAACGTAACATTAGCTAGATTTTTTTATTCAAAAAAATATTTACAAATATTAGGAAATTTAAGTGTAAAAGAGTTGATAAATGATTATATTGGGACTATAATATAATTAAGGTC
配列番号１３
φ８０α ｔｅｒＳ欠失及び相補性を示すＲＮ１０６１６ゲノム配列遺伝子座。ｔｅｒＳ＝括弧書きされた文、欠失＝下線、相補的＝太字
配列番号１４
ｐＧＷ８０Ａ０００１完全配列
GGCGCCATGGTTAAGGGCCCTTTGCGGAAAGAGTTAGTAAGTTAACAGAAGACGAACCAAAACTAAATGGTTTAGCAGGAAACTTAGATAAAAAAATGAATCCAGAATTATATTCAGAACAGGAACAGCAACAAGAACAACAAAAGAATCAAAAACGAGATAGAGGTATGCACTTATAGAACATGCATTTATGCCGAGAAAACTTATTGGTTGGAATGGGCTATGTGTTAGCTAACTTGTTAGCGAGTTGGTTGGACTTGAATTGGGATTAATCCCAAGAAAGTACCAACTCAACAACACATAAAGCCCTGTAGGTTCCGACCAATAAGGAAATTGGAATAAAGCAATAAAAGGAGTTGAAGAAATGAAATTCAGAGAAGCCTTTGAGAATTTTATAACAAGTAAGTATGTACTTGGTGTTTTAGTAGTCTTAACTGTTTACCAGATAATACAAATGCTTAAATAAAAAAAGACTTGATCTGATTAGACCAAATCTTTTGATAGTGTTATATTAATAACAAAATAAAAAGGAGTCGCTCACGCCCTACCAAAGTTTGTGAACGACATCATTCAAAGAAAAAAACACTGAGTTGTTTTTATAATCTTGTATATTTAGATATTAAACGATATTTAAATATACATCAAGATATATATTTGGGTGAGCGATTACTTAAACGAAATTGAGATTAAGGAGTCGATTTTTTATGTATAAAAACAATCATGCAAATCATTCAAATCATTTGGAAAATCACGATTTAGACAATTTTTCTAAAACCGGCTACTCTAATAGCCGGTTGGACGCACATACTGTGTGCATATCTGATCCAAAATTAAGTTTTGATGCAATGACGATCGTTGGAAATCTCAACCGAGACAACGCTCAGGCCCTTTCTAAATTTATGAGTGTAGAGCCCCAAATAAGACTTTGGGATATTCTTCAAACAAAGTTTAAAGCTAAAGCACTTCAAGAAAAAGTTTATATTGAATATGACAAAGTGAAAGCAGATAGTTGGGATAGACGTAATATGCGTATTGAATTTAATCCAAACAAACTTACACGAGATGAAATGATTTGGTTAAAACAAAATATAATAAGCTACATGGAAGATGACGGTTTTACAAGATTAGATTTAGCCTTTGATTTTGAAGATGATTTGAGTGACTACTATGCAATGTCTGATAAAGCAGTTAAGAAAACTATTTTTTATGGTCGTAATGGTAAGCCAGAAACAAAATATTTTGGCGTGAGAGATAGTAATAGATTTATTAGAATTTATAATAAAAAGCAAGAACGTAAAGATAATGCAGATGCTGAAGTTATGTCTGAACATTTATGGCGTGTAGAAATCGAACTTAAAAGAGATATGGTGGATTACTGGAATGATTGCTTTAGTGATTTACATATCTTGCAACCAGATTGGAAAACTATCCAACGCACTGCGGATAGAGCAATAGTTTTTATGTTATTGAGTGATGAAGAAGAATGGGGAAAGCTTCACAGAAATTCTAGAACAAAATATAAGAATTTGATAAAAGAAATTTCGCCAGTCGATTTAACGGACTTAATGAAATCGACTTTAAAAGCGAACGAAAAACAATTGCAAAAACAAATCGATTTTTGGCAACATGAATTTAAATTTTGGAAATAGTGTACATATTAATATTACTGAACAAAAATGATATATTTAAACTATTCTAATTTAGGAGGATTTTTTTATGAAGTGTCTATTTAAAAATTTGGGGAATTTATATGAGGTGAAAGAATAATTTACCCCTATAAACTTTAGCCACCTCAAGTAAAGAGGTAAAATTGTTTAGTTTATATAAAAAATTTAAAGGTTTGTTTTATAGCGTTTTATTTTGGCTTTGTATTCTTTCATTTTTTAGTGTATTAAATGAAATGGTTTTAAATGTTTCTTTACCTGATATTGCAAATCATTTTAATACTACTCCTGGAATTACAAACTGGGTAAACACTGCATATATGTTAACTTTTTCGATAGGAACAGCAGTATATGGAAAATTATCTGATTATATAAATATAAAAAAATTGTTAATTATTGGTATTAGTTTGAGCTGTCTTGGTTCATTGATTGCTTTTATTGGGCCCACCTAGGCAAATATGCTCTTACGTGCTATTATTTAAGTGACTATTTAAAAGGAGTTAATAAATATGCGGCAAGGTATTCTTAAATAAACTGTCAATTTGATAGCGGGAACAAATAATTAGATGTCCTTTTTTAGGAGGGCTTAGTTTTTTGTACCCAGTTTAAGAATACCTTTATCATGTGATTCTAAAGTATCCAGAGAATATCTGTATGCTTTGTATACCTATGGTTATGCATAAAAATCCCAGTGATAAAAGTATTTATCACTGGGATTTTTATGCCCTTTTGGGTTTTTGAATGGAGGAAAATCACATGAAAATTATTAATATTGGAGTTTTAGCTCATGTTGATGCAGGAAAAACTACCTTAACAGAAAGCTTATTATATAACAGTGGAGCGATTACAGAATTAGGAAGCGTGGACAAAGGTACAACGAGGACGGATAATACGCTTTTAGAACGTCAGAGAGGAATTACAATTCAGACAGGAATAACCTCTTTTCAGTGGGAAAATACGAAGGTGAACATCATAGACACGCCAGGACATATGGATTTCTTAGCAGAAGTATATCGTTCATTATCAGTTTTAGATGGGGCAATTCTACTGATTTCTGCAAAAGATGGCGTACAAGCACAAACTCGTATATTATTTCATGCACTTAGGAAAATGGGGATTCCCACAATCTTTTTTATCAATAAGATTGACCAAAATGGAATTGATTTATCAACGGTTTATCAGGATATTAAAGAGAAACTTTCTGCCGAAATTGTAATCAAACAGAAGGTAGAACTGTATCCTAATATGTGTGTGACGAACTTTACCGAATCTGAACAATGGGATACGGTAATAGAGGGAAACGATAACCTTTTAGAGAAATATATGTCCGGTAAATCATTAGAAGCATTGGAACTCGAACAAGAGGAAAGCATAAGATTTCAGAATTGTTCTCTGTTCCCTCTTTATCATGGAAGTGCAAAAAGTAATATAGGGATTGATAACCTTATAGAAGTTATTACTAATAAATTTTATTCATCAACACATCGAGGTCCGTCTGAACTTTGCGGAAATGTTTTCAAAATTGAATATACAAAAAAAAGACAACGTCTTGCATATATACGCCTTTATAGTGGAGTACTACATTTACGAGATTCGGTTAGAGTATCAGAAAAAGAAAAAATAAAAGTTACAGAAATGTATACTTCAATAAATGGTGAATTATGTAAGATTGATAGAGCTTATTCTGGAGAAATTGTTATTTTGCAAAATGAGTTTTTGAAGTTAAATAGTGTTCTTGGAGATACAAAACTATTGCCACAGAGAAAAAAGATTGAAAATCCGCACCCTCTACTACAAACAACTGTTGAACCGAGTAAACCTGAACAGAGAGAAATGTTGCTTGATGCCCTTTTGGAAATCTCAGATAGTGATCCGCTTCTACGATATTACGTGGATTCTACGACACATGAAATTATACTTTCTTTCTTAGGGAAAGTACAAATGGAAGTGATTAGTGCACTGTTGCAAGAAAAGTATCATGTGGAGATAGAACTAAAAGAGCCTACAGTCATTTATATGGAGAGACCGTTAAAAAATGCAGAATATACCATTCACATCGAAGTGCCGCCAAATCCTTTCTGGGCTTCCATTGGTTTATCTGTATCGCCGCTTCCGTTGGGAAGTGGAATGCAGTATGAGAGCTCGGTTTCTCTTGGATACTTAAATCAATCATTTCAAAATGCAGTTATGGAAGGGGTACGCTATGGTTGCGAACAAGGATTATATGGTTGGAATGTGACGGATTGTAAAATCTGTTTTAAGTACGGTTTATACTATAGCCCTGTTAGTACTCCAGCAGATTTTCGGATGCTTACTCCTATTGTACTGGAGCAAGCCTTTAGAAAAGCTGGAACAGAATTGTTAGAGCCATATCTTAGTTTTAAAGTTTATGCACCACAGGAATATCTTTCACGGGCATATAACGATGCTCCCAAATATTGTGCAAATATCGTAAATACTCAACTGAAAAATAATGAGGTCATTATTATTGGAGAAATTCCTGCTCGATGTATTCAAGATTATCGCAATGATTTAACTTTTTTTACAAATGGGCTTAGTGTTTGTTTAGCAGAGCTAAAAGGATATCAGGTTACCACTGGCGAACCTGTTTGCCAGACCCGTCGTCTAAATAGTCGGATAGATAAAGTAAGATATATGTTCAATAAAATAACTTAGTGCGTTTTATGTTGTTATATAAATATGGTTTCTTATTAAATAAGATGAAATATTCTTTAATATAGATTTGAATTAAAGTGGAAAGGAGGAGATTGTTATTATAAACTACAAGTGGATATTGTGTCCTAGTTGTGGAAATAAAACAAGACTACGAATACGAGTGGATACTATACTTAAAAATTTCCCTTTATACAGCCCCAAATGTAAGAACGAAACTTTAATTAATGTTCAAAAAATGAATATAATAACAATCAAAGAGCCAGACGCCAAGACGCAGAGCCGATAATTTGAGAAATGAAACTCTCATCTTATCGGCTCTTTTTGTTTATCTGAATTTTACTGACTAGCCTTCAATATTTCCGCGGCCAGCTTACTATGCCATTATTAAGCTTGTAATATCGGAGGGTTTATTAATTGGCAGTAAAGTGGCAGTTTTTGATACCTTAAATGAGATATTATGATAGTGTAGGATATTGACTATCGTACTGCGTTTCCCTACCGCAAATTAGGAATAAAGGATCTATGTGGGTTGGCTGATTATAGCCAATCCTTTTTTAATTTTAAAAAGCGTATAGCGCGAGAGTTGGTGGTAAATGAAATGAACGAAAAACAAAAGAGATTCGCAGATGAATATATAATGAATGGATGTAATGGTAAAAA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ATTGCCTTTTTGGCGCGCCTATTCTAATGCATAATAAATACTGATAACATCTTATATTTTGTATTATATTTTGTATTATCGTTGACATGTATAATTTTGATATCAAAAACTGATTTTCCCTCTATTATTTTCGAGATTTATTTTCTTAATTCTCTTTAACAAACTAGAAATATTGTATATACAAAAAATTATAAATAATAGATGAATAGTTTAATTATAGGTGTTCATCAATCGAAAAAGC
AACGTATCTTATTTAAAGTGCGTTGCTTTTTTCTCATTTATAAGGTTAAATAATTCTCATATATCAAGCAAAGTGACA
配列番号１５（ｍｅｃＡ遺伝子座ＤＮＡ配列（黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）亜種アウレウス（subsp. aureus）ＳＡ４０由来、全ゲノムＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００３６０４．１））
TATACTACAAATGTAGTCTTATATAAGGAGGATATTGATGAAAAAGATAAAAATTGTTCCACTTATTTTAATAGTTGTAGTTGTCGGGTTTGGTATATATTTTTATGCTTCAAAAGATAAAGAAATTAATAATACTATTGATGCAATTGAAGATAAAAATTTCAAACAAGTTTATAAAGATAGCAGTTATATTTCTAAAAGCGATAATGGTGAAGTAGAAATGACTGAACGTCCGATAAAAATATATAATAGTTTAGGCGTTAAAGATATAAACATTCAGGATCGTAAAATAAAAAAAGTATCTAAAAATAAAAAACGAGTAGATGCTCAATATAAAATTAAAACAAACTACGGTAACATTGATCGCAACGTTCAATTTAATTTTGTTAAAGAAGATGGTATGTGGAAGTTAGATTGGGATCATAGCGTCATTATTCCAGGAATGCAGAAAGACCAAAGCATACATATTGAAAATTTAAAATCAGAACGTGGTAAAATTTTAGACCGAAACAATGTGGAATTGGCCAATACAGGAACAGCATATGAGATAGGCATCGTTCCAAAGAATGTATCTAAAAAAGATTATAAAGCAATCGCTAAAGAACTAAGTATTTCTGAAGACTATATCAAACAACAAATGGATCAAAATTGGGTACAAGATGATACCTTCGTTCCACTTAAAACCGTTAAAAAAATGGATGAATATTTAAGTGATTTCGCAAAAAAATTTCATCTTACAACTAATGAAACAGAAAGTCGTAACTATCCTCTAGAAAAAGCGACTTCACATCTATTAGGTTATGTTGGTCCCATTAACTCTGAAGAATTAAAACAAAAAGAATATAAAGGCTATAAAGATGATGCAGTTATTGGTAAAAAGGGACTCGAAAAACTTTACGATAAAAAGCTCCAACATGAAGATGGCTATCGTGTCACAATCGTTGACGATAATAGCAATACAATCGCACATACATTAATAGAGAAAAAGAAAAAAGATGGCAAAGATATTCAACTAACTATTGATGCTAAAGTTCAAAAGAGTATTTATAACAACATGAAAAATGATTATGGCTCAGGTACTGCTATCCACCCTCAAACAGGTGAATTATTAGCACTTGTAAGCACACCTTCATATGACGTCTATCCATTTATGTATGGCATGAGTAACGAAGAATATAATAAATTAACCGAAGATAAAAAAGAACCTCTGCTCAACAAGTTCCAGATTACAACTTCACCAGGTTCAACTCAAAAAATATTAACAGCAATGATTGGGTTAAATAACAAAACATTAGACGATAAAACAAGTTATAAAATCGATGGTAAAGGTTGGCAAAAAGATAAATCTTGGGGTGGTTACAACGTTACAAGATATGAAGTGGTAAATGGTAATATCGACTTAAAACAAGCAATAGAATCATCAGATAACATTTTCTTTGCTAGAGTAGCACTCGAATTAGGCAGTAAGAAATTTGAAAAAGGCATGAAAAAACTAGGTGTTGGTGAAGATATACCAAGTGATTATCCATTTTATAATGCTCAAATTTCAAACAAAAATTTAGATAATGAAATATTATTAGCTGATTCAGGTTACGGACAAGGTGAAATACTGATTAACCCAGTACAGATCCTTTCAATCTATAGCGCATTAGAAAATAATGGCAATATTAACGCACCTCACTTATTAAAAGACACGAAAAACAAAGTTTGGAAGAAAAATATTATTTCCAAAGAAAATATCAATCTATTAACTGATGGTATGCAACAAGTCGTAAATAAAACACATAAAGAAGATATTTATAGATCTTATGCAAACTTAATTGGCAAATCCGGTACTGCAGAACTCAAAATGAAACAAGGAGAAACTGGCAGACAAATTGGGTGGTTTATATCATATGATAAAGATAATCCAAACATGATGATGGCTATTAATGTTAAAGATGTACAAGATAAAGGAATGGCTAGCTACAATGCCAAAATCTCAGGTAAAGTGTATGATGAGCTATATGAGAACGGTAATAAAAAATACGATATAGATGAATAACAAAACAGTGAAGCAATCCGTAACGATGGTTGCTTCACTGTTTT
配列番号１６（ｍｅｃＡ転写物配列）
UAGUCUUAUAUAAGGAGGAUAUUGAUGAAAAAGAUAAAAAUUGUUCCACUUAUUUUAAUAGUUGUAGUUGUCGGGUUUGGUAUAUAUUUUUAUGCUUCAAAAGAUAAAGAAAUUAAUAAUACUAUUGAUGCAAUUGAAGAUAAAAAUUUCAAACAAGUUUAUAAAGAUAGCAGUUAUAUUUCUAAAAGCGAUAAUGGUGAAGUAGAAAUGACUGAACGUCCGAUAAAAAUAUAUAAUAGUUUAGGCGUUAAAGAUAUAAACAUUCAGGAUCGUAAAAUAAAAAAAGUAUCUAAAAAUAAAAAACGAGUAGAUGCUCAAUAUAAAAUUAAAACAAACUACGGUAACAUUGAUCGCAACGUUCAAUUUAAUUUUGUUAAAGAAGAUGGUAUGUGGAAGUUAGAUUGGGAUCAUAGCGUCAUUAUUCCAGGAAUGCAGAAAGACCAAAGCAUACAUAUUGAAAAUUUAAAAUCAGAACGUGGUAAAAUUUUAGACCGAAACAAUGUGGAAUUGGCCAAUACAGGAACAGCAUAUGAGAUAGGCAUCGUUCCAAAGAAUGUAUCUAAAAAAGAUUAUAAAGCAAUCGCUAAAGAACUAAGUAUUUCUGAAGACUAUAUCAAACAACAAAUGGAUCAAAAUUGGGUACAAGAUGAUACCUUCGUUCCACUUAAAACCGUUAAAAAAAUGGAUGAAUAUUUAAGUGAUUUCGCAAAAAAAUUUCAUCUUACAACUAAUGAAACAGAAAGUCGUAACUAUCCUCUAGAAAAAGCGACUUCACAUCUAUUAGGUUAUGUUGGUCCCAUUAACUCUGAAGAAUUAAAACAAAAAGAAUAUAAAGGCUAUAAAGAUGAUGCAGUUAUUGGUAAAAAGGGACUCGAAAAACUUUACGAUAAAAAGCUCCAACAUGAAGAUGGCUAUCGUGUCACAAUCGUUGACGAUAAUAGCAAUACAAUCGCACAUACAUUAAUAGAGAAAAAGAAAAAAGAUGGCAAAGAUAUUCAACUAACUAUUGAUGCUAAAGUUCAAAAGAGUAUUUAUAACAACAUGAAAAAUGAUUAUGGCUCAGGUACUGCUAUCCACCCUCAAACAGGUGAAUUAUUAGCACUUGUAAGCACACCUUCAUAUGACGUCUAUCCAUUUAUGUAUGGCAUGAGUAACGAAGAAUAUAAUAAAUUAACCGAAGAUAAAAAAGAACCUCUGCUCAACAAGUUCCAGAUUACAACUUCACCAGGUUCAACUCAAAAAAUAUUAACAGCAAUGAUUGGGUUAAAUAACAAAACAUUAGACGAUAAAACAAGUUAUAAAAUCGAUGGUAAAGGUUGGCAAAAAGAUAAAUCUUGGGGUGGUUACAACGUUACAAGAUAUGAAGUGGUAAAUGGUAAUAUCGACUUAAAACAAGCAAUAGAAUCAUCAGAUAACAUUUUCUUUGCUAGAGUAGCACUCGAAUUAGGCAGUAAGAAAUUUGAAAAAGGCAUGAAAAAACUAGGUGUUGGUGAAGAUAUACCAAGUGAUUAUCCAUUUUAUAAUGCUCAAAUUUCAAACAAAAAUUUAGAUAAUGAAAUAUUAUUAGCUGAUUCAGGUUACGGACAAGGUGAAAUACUGAUUAACCCAGUACAGAUCCUUUCAAUCUAUAGCGCAUUAGAAAAUAAUGGCAAUAUUAACGCACCUCACUUAUUAAAAGACACGAAAAACAAAGUUUGGAAGAAAAAUAUUAUUUCCAAAGAAAAUAUCAAUCUAUUAACUGAUGGUAUGCAACAAGUCGUAAAUAAAACACAUAAAGAAGAUAUUUAUAGAUCUUAUGCAAACUUAAUUGGCAAAUCCGGUACUGCAGAACUCAAAAUGAAACAAGGAGAAACUGGCAGACAAAUUGGGUGGUUUAUAUCAUAUGAUAAAGAUAAUCCAAACAUGAUGAUGGCUAUUAAUGUUAAAGAUGUACAAGAUAAAGGAAUGGCUAGCUACAAUGCCAAAAUCUCAGGUAAAGUGUAUGAUGAGCUAUAUGAGAACGGUAAUAAAAAAUACGAUAUAGAUGAAUAACAAAACAGUGAAGCAAUCCGUAACGAUGGUUGCUUCACUGUUUU
配列番号１７（ｌｕｘＡＢ遺伝子座ＤＮＡ配列（ルシフェラーゼα及びβサブユニットのビブリオ・フィシェリ（Vibrio fischeri）遺伝子ｌｕｘＡ及びｌｕｘＢ由来 − ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ０６７５８．１））
GGCTTAAATAAACAGAATCACCAAAAAGGAATAGAGTATGAAGTTTGGAAATATTTGTTTTTCGTATCAACCACCAGGTGAAACTCATAAGCTAAGTAATGGATCGCTTTGTTCGGCTTGGTATCGCCTCAGAAGAGTAGGGTTTGATACATATTGGACCTTAGAACATCATTTTACAGAGTTTGGTCTTACGGGAAATTTATTTGTTGCTGCGGCTAACCTGTTAGGAAGAACTAAAACATTAAATGTTGGCACTATGGGGGTTGTTATTCCGACAGCACACCCAGTTCGACAGTTAGAAGACGTTTTATTATTAGATCAAATGTCGAAAGGTCGTTTTAATTTTGGAACCGTTCGAGGGCTATACCATAAAGATTTTCGAGTATTTGGTGTTGATATGGAAGAGTCTCGAGCAATTACTCAAAATTTCTACCAGATGATAATGGAAAGCTTACAGACAGGAACCATTAGCTCTGATAGTGATTACATTCAATTTCCTAAGGTTGATGTATATCCCAAAGTGTACTCAAAAAATGTACCAACCTGTATGACTGCTGAGTCCGCAAGTACGACAGAATGGCTAGCAATACAAGGGCTACCAATGGTTCTTAGTTGGATTATTGGTACTAATGAAAAAAAAGCACAGATGGAACTCTATAATGAAATTGCGACAGAATATGGTCATGATATATCTAAAATAGATCATTGTATGACTTATATTTGTTCTGTTGATGATGATGCACAAAAGGCGCAAGATGTTTGTCGGGAGTTTCTGAAAAATTGGTATGACTCATATGTAAATGCGACCAATATCTTTAATGATAGCAATCAAACTCGTGGTTATGATTATCATAAAGGTCAATGGCGTGATTTTGTTTTACAAGGACATACAAACACCAATCGACGTGTTGATTATAGCAATGGTATTAACCCTGTAGGCACTCCTGAGCAGTGTATTGAAATCATTCAACGTGATATTGATGCAACGGGTATTACAAACATTACATGCGGATTTGAAGCTAATGGAACTGAAGATGAAATAATTGCTTCCATGCGACGCTTTATGACACAAGTCGCTCCTTTCTTAAAAGAACCTAAATAAATTACTTATTTGATACTAGAGATAATAAGGAACAAGTTATGAAATTTGGATTATTTTTTCTAAACTTTCAGAAAGATGGAATAACATCTGANGAAACGTTGGATAATATGGTAAAGACTGTCACGTTAATTGATTCAACTAAATATCATTTTAATACTGCCTTTGTTAATGAACATCACTTTTCAAAAAATGGTATTGTTGGAGCACCTATTACCGCAGCTGGTTTTTTATTAGGGTTAACAAATAAATTACATATTGGTTCATTAAATCAAGTAATTACCACCCATCACCCTGTACGTGTAGCAGAAGAAGCCAGTTTATTAGATCAAATGTCAGAGGGACGCTTCATTCTTGGTTTTAGTGACTGCGAAAGTGATTTCGAAATGGAATTTTTTAGACGTCATATCTCATCAAGGCAACAACAATTTGAAGCATGCTATGAAATAATTAATGACGCATTAACTACAGGTTATTGTCATCCCCAAAACGACTTTTATGATTTTCCAAAGGTTTCAATTAATCCACACTGTTACAGTGAGAATGGACCTAAGCAATATGTATCCGCTACATCAAAAGAAGTCGTCATGTGGGCAGCGAAAAAGGCACTGCCTTTAACATTTAAGTGGGAGGATAATTTAGAAACCAAAGAACGCTATGCAATTCTATATAATAAAACAGCACAACAATATGGTATTGATATTTCGGATGTTGATCATCAATTAACTGTAATTGCGAACTTAAATGCTGATAGAAGTACGGCTCAAGAAGAAGTGAGAGAATACTTAAAAGACTATATCACTGAAACTTACCCTCAAATGGACAGAGATGAAAAAATTAACTGCATTATTGAAGAGAATGCAGTTGGGTCTCATGATGACTATTATGAATCGACAAAATTAGCAGTGGAAAAAACAGGGTCTAAAAATATTTTATTATCCTTTGAATCAATGTCCGATATTAAAGATGTAAAAGATATTATTGATATGTTGAACCAAAAAATCGAAATGAATTTACCATAATAAAATTAAAGGCAATTTCTATATTAGATTGCCTTTTTAAATTTC
配列番号１８（ｌｕｘＡＢ転写物配列）
AAUCACCAAAAAGGAAUAGAGUAUGAAGUUUGGAAAUAUUUGUUUUUCGUAUCAACCACCAGGUGAAACUCAUAAGCUAAGUAAUGGAUCGCUUUGUUCGGCUUGGUAUCGCCUCAGAAGAGUAGGGUUUGAUACAUAUUGGACCUUAGAACAUCAUUUUACAGAGUUUGGUCUUACGGGAAAUUUAUUUGUUGCUGCGGCUAACCUGUUAGGAAGAACUAAAACAUUAAAUGUUGGCACUAUGGGGGUUGUUAUUCCGACAGCACACCCAGUUCGACAGUUAGAAGACGUUUUAUUAUUAGAUCAAAUGUCGAAAGGUCGUUUUAAUUUUGGAACCGUUCGAGGGCUAUACCAUAAAGAUUUUCGAGUAUUUGGUGUUGAUAUGGAAGAGUCUCGAGCAAUUACUCAAAAUUUCUACCAGAUGAUAAUGGAAAGCUUACAGACAGGAACCAUUAGCUCUGAUAGUGAUUACAUUCAAUUUCCUAAGGUUGAUGUAUAUCCCAAAGUGUACUCAAAAAAUGUACCAACCUGUAUGACUGCUGAGUCCGCAAGUACGACAGAAUGGCUAGCAAUACAAGGGCUACCAAUGGUUCUUAGUUGGAUUAUUGGUACUAAUGAAAAAAAAGCACAGAUGGAACUCUAUAAUGAAAUUGCGACAGAAUAUGGUCAUGAUAUAUCUAAAAUAGAUCAUUGUAUGACUUAUAUUUGUUCUGUUGAUGAUGAUGCACAAAAGGCGCAAGAUGUUUGUCGGGAGUUUCUGAAAAAUUGGUAUGACUCAUAUGUAAAUGCGACCAAUAUCUUUAAUGAUAGCAAUCAAACUCGUGGUUAUGAUUAUCAUAAAGGUCAAUGGCGUGAUUUUGUUUUACAAGGACAUACAAACACCAAUCGACGUGUUGAUUAUAGCAAUGGUAUUAACCCUGUAGGCACUCCUGAGCAGUGUAUUGAAAUCAUUCAACGUGAUAUUGAUGCAACGGGUAUUACAAACAUUACAUGCGGAUUUGAAGCUAAUGGAACUGAAGAUGAAAUAAUUGCUUCCAUGCGACGCUUUAUGACACAAGUCGCUCCUUUCUUAAAAGAACCUAAAUAAAUUACUUAUUUGAUACUAGAGAUAAUAAGGAACAAGUUAUGAAAUUUGGAUUAUUUUUUCUAAACUUUCAGAAAGAUGGAAUAACAUCUGAAGAAACGUUGGAUAAUAUGGUAAAGACUGUCACGUUAAUUGAUUCAACUAAAUAUCAUUUUAAUACUGCCUUUGUUAAUGAACAUCACUUUUCAAAAAAUGGUAUUGUUGGAGCACCUAUUACCGCAGCUGGUUUUUUAUUAGGGUUAACAAAUAAAUUACAUAUUGGUUCAUUAAAUCAAGUAAUUACCACCCAUCACCCUGUACGUGUAGCAGAAGAAGCCAGUUUAUUAGAUCAAAUGUCAGAGGGACGCUUCAUUCUUGGUUUUAGUGACUGCGAAAGUGAUUUCGAAAUGGAAUUUUUUAGACGUCAUAUCUCAUCAAGGCAACAACAAUUUGAAGCAUGCUAUGAAAUAAUUAAUGACGCAUUAACUACAGGUUAUUGUCAUCCCCAAAACGACUUUUAUGAUUUUCCAAAGGUUUCAAUUAAUCCACACUGUUACAGUGAGAAUGGACCUAAGCAAUAUGUAUCCGCUACAUCAAAAGAAGUCGUCAUGUGGGCAGCGAAAAAGGCACUGCCUUUAACAUUUAAGUGGGAGGAUAAUUUAGAAACCAAAGAACGCUAUGCAAUUCUAUAUAAUAAAACAGCACAACAAUAUGGUAUUGAUAUUUCGGAUGUUGAUCAUCAAUUAACUGUAAUUGCGAACUUAAAUGCUGAUAGAAGUACGGCUCAAGAAGAAGUGAGAGAAUACUUAAAAGACUAUAUCACUGAAACUUACCCUCAAAUGGACAGAGAUGAAAAAAUUAACUGCAUUAUUGAAGAGAAUGCAGUUGGGUCUCAUGAUGACUAUUAUGAAUCGACAAAAUUAGCAGUGGAAAAAACAGGGUCUAAAAAUAUUUUAUUAUCCUUUGAAUCAAUGUCCGAUAUUAAAGAUGUAAAAGAUAUUAUUGAUAUGUUGAACCAAAAAAUCGAAAUGAAUUUACCAUAAUAAAAUUAAAGGCAAUUUCUAUAUUAGAUUGCCUUUU
配列番号１９（シス抑制ｌｕｘＡＢ転写物配列）
AAAGGCAUGAAAAAACUUGGUAUCUUCACCAACACCUAGCUUUUUGAAGGAAUUGAGUAUGAAGUUUGGAAAUAUUGGUUGUUCGUAUCAACCACCAGGUGAAACUCAUAAGCUAAAGGCAUGAAAAAACUAGGUGAUCUUCACCAACACCUAGUUUUUUCAAGGAAUUGAGUAUGAAGUUUGGAAAUAUUUGUUUUUCGUAUCAACCACCAGGUGAAACUCAUAAGCUAAGUAAUGGAUCGCUUUGUUCGGCUUGGUAUCGCCUCAGAAGAGUAGGGUUUGAUACAUAUUGGACCUUAGAACAUCAUUUUACAGAGUUUGGUCUUACGGGAAAUUUAUUUGUUGCUGCGGCUAACCUGUUAGGAAGAACUAAAACAUUAAAUGUUGGCACUAUGGGGGUUGUUAUUCCGACAGCACACCCAGUUCGACAGUUAGAAGACGUUUUAUUAUUAGAUCAAAUGUCGAAAGGUCGUUUUAAUUUUGGAACCGUUCGAGGGCUAUACCAUAAAGAUUUUCGAGUAUUUGGUGUUGAUAUGGAAGAGUCUCGAGCAAUUACUCAAAAUUUCUACCAGAUGAUAAUGGAAAGCUUACAGACAGGAACCAUUAGCUCUGAUAGUGAUUACAUUCAAUUUCCUAAGGUUGAUGUAUAUCCCAAAGUGUACUCAAAAAAUGUACCAACCUGUAUGACUGCUGAGUCCGCAAGUACGACAGAAUGGCUAGCAAUACAAGGGCUACCAAUGGUUCUUAGUUGGAUUAUUGGUACUAAUGAAAAAAAAGCACAGAUGGAACUCUAUAAUGAAAUUGCGACAGAAUAUGGUCAUGAUAUAUCUAAAAUAGAUCAUUGUAUGACUUAUAUUUGUUCUGUUGAUGAUGAUGCACAAAAGGCGCAAGAUGUUUGUCGGGAGUUUCUGAAAAAUUGGUAUGACUCAUAUGUAAAUGCGACCAAUAUCUUUAAUGAUAGCAAUCAAACUCGUGGUUAUGAUUAUCAUAAAGGUCAAUGGCGUGAUUUUGUUUUACAAGGACAUACAAACACCAAUCGACGUGUUGAUUAUAGCAAUGGUAUUAACCCUGUAGGCACUCCUGAGCAGUGUAUUGAAAUCAUUCAACGUGAUAUUGAUGCAACGGGUAUUACAAACAUUACAUGCGGAUUUGAAGCUAAUGGAACUGAAGAUGAAAUAAUUGCUUCCAUGCGACGCUUUAUGACACAAGUCGCUCCUUUCUUAAAAGAACCUAAAUAAAUUACUUAUUUGAUACUAGAGAUAAUAAGGAACAAGUUAUGAAAUUUGGAUUAUUUUUUCUAAACUUUCAGAAAGAUGGAAUAACAUCUGAAGAAACGUUGGAUAAUAUGGUAAAGACUGUCACGUUAAUUGAUUCAACUAAAUAUCAUUUUAAUACUGCCUUUGUUAAUGAACAUCACUUUUCAAAAAAUGGUAUUGUUGGAGCACCUAUUACCGCAGCUGGUUUUUUAUUAGGGUUAACAAAUAAAUUACAUAUUGGUUCAUUAAAUCAAGUAAUUACCACCCAUCACCCUGUACGUGUAGCAGAAGAAGCCAGUUUAUUAGAUCAAAUGUCAGAGGGACGCUUCAUUCUUGGUUUUAGUGACUGCGAAAGUGAUUUCGAAAUGGAAUUUUUUAGACGUCAUAUCUCAUCAAGGCAACAACAAUUUGAAGCAUGCUAUGAAAUAAUUAAUGACGCAUUAACUACAGGUUAUUGUCAUCCCCAAAACGACUUUUAUGAUUUUCCAAAGGUUUCAAUUAAUCCACACUGUUACAGUGAGAAUGGACCUAAGCAAUAUGUAUCCGCUACAUCAAAAGAAGUCGUCAUGUGGGCAGCGAAAAAGGCACUGCCUUUAACAUUUAAGUGGGAGGAUAAUUUAGAAACCAAAGAACGCUAUGCAAUUCUAUAUAAUAAAACAGCACAACAAUAUGGUAUUGAUAUUUCGGAUGUUGAUCAUCAAUUAACUGUAAUUGCGAACUUAAAUGCUGAUAGAAGUACGGCUCAAGAAGAAGUGAGAGAAUACUUAAAAGACUAUAUCACUGAAACUUACCCUCAAAUGGACAGAGAUGAAAAAAUUAACUGCAUUAUUGAAGAGAAUGCAGUUGGGUCUCAUGAUGACUAUUAUGAAUCGACAAAAUUAGCAGUGGAAAAAACAGGGUCUAAAAAUAUUUUAUUAUCCUUUGAAUCAAUGUCCGAUAUUAAAGAUGUAAAAGAUAUUAUUGAUAUGUUGAACCAAAAAAUCGAAAUGAAUUUACCAUAAUAAAAUUAAAGGCAAUUUCUAUAUUAGAUUGCCUUUU

Claims (9)

  1. 試料中の細菌細胞の有無を検出するための方法であって、
    （ａ）前記試料を複数の非複製的形質導入粒子（ＮＲＴＰ）を含む溶解物と接触させることで、前記複数のＮＲＴＰに前記試料中の１又は複数の細菌細胞を形質導入させるステップ；
    ここで前記複数のＮＲＴＰは以下のとおりにして生産される：
    (i) 細菌細胞パッケージングシステムの溶菌期を誘導させる、
    ここで前記細菌細胞パッケージングシステムは、
    宿主細菌細胞；
    非機能性パッケージング開始部位配列を有するバクテリオファージゲノムを含む、当該宿主細菌内の第一核酸コンストラクト、ここで当該非機能性パッケージング開始部位配列はバクテリオファージゲノムのＮＲＴＰへのパッケージングを阻止する；並びに
    前記宿主細胞内にあり、かつ前記第一核酸コンストラクトとは独立した第二核酸コンストラクトであって、レポータ核酸分子プラスミドを含み、ここで当該プラスミドはレポータ遺伝子と当該レポータ核酸分子プラスミドのレプリコンのＮＲＴＰ中へのパッケージングを促進する機能性パッケージング開始部位配列を含むバクテリオファージ遺伝子とを有する、第二核酸コンストラクト、を含み、
    ここで、前記第二核酸コンストラクト上の前記バクテリオファージ遺伝子内の前記機能性パッケージング開始部位配列は、前記第一核酸コンストラクト上の前記バクテリオファージゲノム内の前記非機能性パッケージング開始部位配列を補完する；
    (ii)前記レポータ核酸分子プラスミドのレプリコンをパッケージングさせてＮＲＴＰにする；
    （ｂ）前記レポータ遺伝子の発現のための条件を供与するステップ；
    （ｃ）前記レポータ遺伝子により産生されるシグナルの有無を検出するステップ、ここで前記シグナルの不在は前記細菌細胞の不在を示す；
    を含む方法。
  2. 前記細菌細胞が黄色ブドウ球菌（S. aureus）である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記細菌細胞がメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＭＲＳＡ）又はメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＭＳＳＡ）である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記試料に抗生物質を所定の濃度で加え、前記レポータ遺伝子により産生されるシグナルの有無を検出することで前記試料が当該抗生物質に対し耐性であるか感受性かを決定することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記試料に様々な予め決定された濃度の抗生物質を加え、前記レポータシグナルの量を検出することで前記細菌細胞の前記抗生物質に対する最小阻止濃度を決定することをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記第二核酸コンストラクト上の前記バクテリオファージ遺伝子がターミナーゼ遺伝子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記ターミナーゼ遺伝子がφ１１又はφ８０αの小ターミナーゼ（ｔｅｒＳ）遺伝子である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ターミナーゼ遺伝子がＰ１ｐａｃＡターミナーゼ遺伝子である、請求項６に記載の方法。
  9. 前記レポータ遺伝子が、発光反応を媒介する酵素（ｌｕｘＡ、ｌｕｘＢ、ｌｕｘＡＢ、ｌｕｃ、ｒｕｃ、ｎｌｕｃ）をコードする遺伝子、比色反応を媒介する酵素（ｌａｃＺ、ＨＲＰ）をコードする遺伝子、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、近赤外蛍光タンパク質）をコードする遺伝子、親和性ペプチド（Ｈｉｓタグ、３Ｘ−ＦＬＡＧ）をコードする核酸分子、及び選択マーカー（ａｍｐＣ、ｔｅｔ（Ｍ）、ＣＡＴ、ｅｒｍ）をコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
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