JP3249516B2 - 遺伝子治療のためのレトロウイルスのベクター - Google Patents

遺伝子治療のためのレトロウイルスのベクター

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、身体の遺伝子治療において使用することが
できる新規なレトロウイルスのベクターに関する。これ
らのレトロウイルスのベクターは問題の遺伝子のための
挿入部位を含み、そして広範な種類のトランスフェクシ
ョンされた細胞のタイプにおいて問題の遺伝子から誘導
されたタンパク質をコントロールしたレベルで発現する
ことができる。本発明の新規なレトロウイルスのベクタ
ーの１つのクラスは選択可能なマーカーを欠如し、こう
してマーカー遺伝子生成物、例えば、抗体を同時に生成
しないで種々の疾患の状態の処置において、ヒトの身体
の治療のために適当である。本発明のレトロウイルスの
ベクターはある種のパッケージング細胞系において使用
するためにことに適する。
背 景 哺乳動物細胞を遺伝子操作する多数の方法が存在す
る。種々のポリペプチドを大量に生産する必要性および
哺乳動物細胞の中の種々の遺伝学的欠陥を補正する必要
性を含むいくつかの理由のために、哺乳動物細胞を遺伝
子操作することに大きい感心がもたれている。これらの
方法は効率、外来遺伝子の発現のレベル、および全体の
遺伝子操作法の効率のような因子に関して互いに劇的に
異なった。
とくに有用であることが証明された哺乳動物細胞を遺
伝子操作する１つの方法は、レトロウイルスのベクター
による。レトロウイルスのベクターおよびそれらの使用
は多数の刊行物に記載されており、このような刊行物は
次のものを包含する:Manら、Cell 33:153−159（1983）
およびConeおよびMulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
1:6349−6353（1984）。レトロウイルスのベクターはレ
トロウイルスを遺伝子操作することによって生産され
る。
レトロウイルスはRNAウイルスである；すなわち、ウ
イルスのゲノムはRNAである。しかしながら、このゲノ
ムのRNAはDNAコピーに逆転写され、このコピーは形質導
入された細胞の染色体はDNAの中に安定にかつ効率よく
組み込まれる。この安定に組み込まれたDNAコピーはプ
ロウイルスと呼ばれ、そして娘細胞により他の遺伝子と
して遺伝される。第１図に示すように、野生型のレトロ
ウイルスのゲノムおよびプロウイルスのDNAは３つのPsi
遺伝子:gag,polおよびenv遺伝子を有し：これらは２つ
の長い末端の反復（LTR）配列によりフランキングされ
ている。gag遺伝子は内部の構造（ヌクレオカプシド）
タンパク質をエンコードする;Pol遺伝子はRNA特異的DNA
ポリメラーゼ（逆転写酵素）をエンコードする；そして
env遺伝子はウイルスのエンベロープ糖タンパク質をエ
ンコードする。５′および３′のLTRはヴィリオンのRNA
の転写およびポリアデニル化を促進する働きをする。
ゲノムの逆転写に必要な配列（tRNAプライマー結合部
位）および粒子へのウイルスのRNAの効率よい包膜に必
要な配列（Psi部位）が、５′LTR隣接して存在する。Mu
lligan,R.C.,Experimental Manipulation of Gene Expr
ession,M.Inouye（編）、155−173（1983）;Mann,R.
ら、Cell,33:153−159（1983）;Cone,R.D.およびR.C.Mu
lligan,Proceedings of the National Acadcademy of S
ciences U.S.A.81:6349−6353（1984）。
包膜（または感染性ヴィリオンへのレトロウイルスの
RNAのパッケージング）のために必要な配列がウイルス
のゲノムから除去される場合、ゲノムのRNAの包膜を防
止するcis作用性欠陥が生ずる。しかしながら、生ずる
突然変異体はなおすべてのヴィリオンタンパク質の合成
を指令することができる。Mulliganおよび共同研究者ら
は、これらのPsi配列が欠失されたレトロウイルスのゲ
ノム、ならびに染色体の中に安定に組み込まれた突然変
異体のゲノムを含有する細胞系を記載した。Mulligan,
R.C.,Experimental Manipulation of Gene Expression,
M.Inouye（編）、155−173（1983）;Mann,R.ら、Cell,3
3:153−159（1983）;Cone,R.D.およびR.C.Mulligan,Pro
ceedings of the National Acadcademy of Sciences U.
S.A.81:6349−6353（1984）。入手可能なレトロウイル
スのベクターについての追加の詳細およびそれらの使用
は、次のものを含む特許および特許刊行物の中に見いだ
すことができる：欧州特許出願（EPA）第0 178 220号、
米国特許第4,405,712号、Gilboa,Biotechniques 4:504
−512（1986）（これはN2レトロウイルスのベクターを
記載している）。これらの特許および刊行物の教示を引
用によってここに加える。
レトロウイルスのベクターは哺乳動物細胞の修飾にと
くに有用である。なぜなら、レトロウイルスのベクター
がターゲット細胞を「感染」しそしてターゲット細胞の
ゲノムの中に組み込む効率が高いからである。さらに、
レトロウイルスのベクターは広範な種類の種および組織
からの哺乳動物細胞を感染することができるレトロウイ
ルスに基づくことができるので、レトロウイルスのベク
ターは高度に有用である。
レトロウイルスのベクターは哺乳動物細胞のゲノムの
中に挿入することができるので、ヒトおよび動物におけ
る遺伝病の遺伝子治療において使用するためのとくに有
望な候補である。典型的には、遺伝子治療は（１）新し
い遺伝学的材料を患者の細胞にin vivo添加するか、あ
るいは（２）体から患者の細胞を取り出し、新しい遺伝
学的材料を細胞に添加し、そしてこれらの細胞を体の中
に再導入する、すなわち、in vitro遺伝子治療を包含す
る。レトロウイルスのベクターを使用して種々の細胞に
おいて遺伝子治療を実施する方法は、例えば、次に記載
されている：米国特許第4,868,116号、1989年９月19日
発行、および米国特許第4,980,286号、1990年12月25日
発行（上皮細胞）、WO89/07136号、1989年８月10日公開
（肝細胞）、欧州特許（EP）第378,576号、1990年７月2
5日公開（線維芽細胞）、およびWO89/05345号、1989年
６月15日公開およびWO/90/06997号、1990年６月28日公
開（内皮細胞）、それら開示をここに引用によって加え
る。
種々の遺伝子治療技術について有用であるためには、
適当なレトロウイルスのベクターはこれまで入手可能で
なかった特別の特性を必要とする。遺伝子治療において
患者の細胞のin vivo遺伝子操作に使用するベクターの
これらの特別の要件の主要な要求の源は、「患者」の細
胞のゲノムの中にベクターを組み込むための選択を必要
とするレトロウイルスのベクターを通常使用することが
できないためである。例えば、典型的なレトロウイルス
のベクター、例えば、Williamsら、Nature 310:476−48
0（1984）に記載されているMSV DHFR−NEOは、遺伝学的
に修飾された細胞を検出するためのマーカーとしてネオ
マイシン耐性を使用する。こうして、このようなネオマ
イシン耐性のレトロウイルスのベクターを使用すると、
患者を高いレベルのネオマイシンに暴露して、in vivo
の遺伝子治療を通して細胞の遺伝学的修復を実施するこ
とが要求されるであろう。そのうえ、in vivoおよびin
vitroの両者の遺伝子治療において、ヒトの遺伝子の身
体の治療を行うマーカー遺伝子の遺伝子生産物を細胞の
中に生成することが望ましくないことがある。例えば、
サラセミアを治癒するためにヘモグロビン遺伝子の置換
を行うネオマイシンホスホトランスフェラーゼを血球の
中に高いレベルで生成する治療学的理由は存在しない。
したがって、ゲノムの中に効率よく組み込み、問題の遺
伝子生産物を所望のレベルで発現しそして、マーカー生
成物、例えば、抗体を同時に生成または発現しないで、
高い力価で生成されるレトロウイルスを開発することは
望ましいであろう。
発明の要約 本発明は、身体の遺伝子治療において使用することが
できる新規なレトロウイルスのベクターに関する。これ
らのレトロウイルスのベクターは問題の遺伝子のための
挿入部位を含み、そして広範な種類のトランスフェクシ
ョンされた細胞のタイプにおいて問題の遺伝子から誘導
されたタンパク質を所望のレベルで発現することができ
る。
本発明の１つの面において、操作可能な組み合わせに
おいて、問題のレトロウイルスから誘導された５′LTR
および３′LTR、および問題の遺伝子のための挿入部位
からなり、そしてレトロウイルスのベクターの中のgag,
envまたはpol遺伝子の少なくとも１つが不完全である
か、あるいは欠陥のある、レトロウイルスのベクターが
提供される。ベクターは、好ましくは、スプライスドナ
ー部位およびスプライスアクセプター部位を含有し、そ
してスプライスアクセプター部位は問題の遺伝子が挿入
されている部位から上流に位置する。また、ベクター
は、望ましくは、gagの転写プロモーターを含み、gagの
転写プロモーターは挿入部位の中に挿入されたヌクレオ
チド配列の転写体が生成されるように機能的に位置し、
そして転写体はgagの５′未翻訳領域からなる。本発明
の好ましいベクターは選択可能なマーカーを欠如し、こ
うして、マーカー遺伝子生産物、例えば、抗生物質の薬
物のマーカーは同時に生成または同時に発現されないの
で、前記ベクターはヒトの身体の遺伝子治療においてい
っそう望ましいものとなる。
本発明のベクターの中に組み込まれる問題の遺伝子
は、問題のホルモン、酵素、レセプターおよび薬物を生
成する任意の遺伝子であることができる。
レトロウイルスのベクターは、最も適当には、ここに
定義するような、ある種のパッケージング細胞と組み合
わせて使用され、これらのパッケージング細胞はヒトお
よび動物の身体の遺伝子治療のために広範な種類の細胞
のタイプにおいて使用することができる。
本発明のとくに好ましいレトロウイルスのベクター
は、第2C図および第３図に描写されているような、ここ
において「MFG」と同定され、そしてそれを含有するプ
ラスミド、ことにATCC 68,754の同定特性を有するプラ
スミドMFGである。
本発明は、また、前述のものに類似するが、LTR以外
のエンハンサーおよびアルファ−グロビンの転写プロモ
ーター配列をさらに含んで種々の問題の遺伝子の発現を
コントロールするレトロウイルスのベクターに関する。
本発明のこの面は、サイトメガロウイルスからのエンハ
ンサーの使用を特別に提供する。また、エンハンサー配
列が３′LTRから欠失され、こうしてゲノムの中にベク
ターを組み込むとき５′LTRを不活性化するベクターが
提供される。詳しくは、ベクターα−SGCを含有するα
−グロビンのプロモーター、およびことに第４図に描写
されているもの、およびことにATCC No.68,755の同定特
性を有するプラスミドα−SGCが提供される。
本発明は、また、遺伝子の発現のための部位の中に挿
入された発現のための遺伝子を有するレトロウイルスの
ベクターを包含する。特定の例は、これらの有用な生産
物の発現のための部位の中に挿入されたヒトの因子VIII
またはtPAのための遺伝子を含有するMFGおよびα−SGC
を包含する。
図面の説明 第１図は、野生型ネズミ白血病ウイルス（レトロウイ
ルス）のゲノムの概略的表示である。
第２図は、各々が組み換えゲノムを有する、本発明に
おいて有用なレトロウイルスのベクターの概略的表示で
ある。第2a図はpLJであり、そして第2b図はpEmであり、
そして第2C図はMFGであり、そして第2d図はα−SGCであ
る。
第３図は、レトロウイルスのベクターMFGの略線図で
ある。
第４図は、レトロウイルスのベクターα−SGCの略線
図である。
第５図は、tPAを発現するように遺伝学的に増強した
内皮細胞でライニングした合成移植片のイヌの中への移
植後の効能を示すヒストグラムである。
第６図は、因子VIIIのポリペプチドの線図である。第
6b図は因子VIIIのcDNAの線図であり、レトロウイルスの
ベクターの発生に使用した種々構成体の中に使用した制
限酵素の部位を示す。第6c図は、垂直の線として示す欠
失された領域をもつレトロウイルスのベクターの中に挿
入された因子VIIIのcDNAの欠失誘導体の線図である。第
6d図は、Hind III部位とPst I部位との間のＢドメイン
の拡大した線図である。重鎖および軽鎖の接合における
ヌクレオチド配列は線の上に表示されており、そして対
応するアミノ酸番号は線の下に表示されている。
第７図は、アセンブリングした最終のレトロウイルス
のベクター、MFG−因子VIIIの線図である。
第８図は、α−SGC−LacZの組み換えレトロウイルス
の線図である。
第９図（ａ）および第９図（ｂ）は、本発明のMFGベ
クターの構成の略線図を表す。
第10図は、tPA遺伝子の修飾、この修飾を促進するた
めに使用したオリゴヌクレオチドおよびMFGベクターの
中への修飾されたtPA遺伝子の挿入の概略的表示であ
る。
特定の態様の説明 本発明は、いくつかのレトロウイルスのベクターを提
供する。提供されたレトロウイルスのベクターは、
（１）問題のレトロウイルスから誘導された５′および
３′のLTR,LTRのための好ましいレトロウイルス源はモ
ロニーネズミ白血病ウイルスである、および（２）問題
の遺伝子のための挿入部位を含有する。本発明のレトロ
ウイルスのベクターは完全なgag,envまたはpol遺伝子を
含有しないので、レトロウイルスのベクターはターゲッ
ト細胞の中で独立に複製することができない。好ましい
レトロウイルスのベクターはgag解読配列の一部分を含
有し、好ましくは部分的gag解読配列はスプライスドナ
ー部位およびスプライスアクセプター部位を含み、問題
の遺伝子のための部位特異的にスプライスアクセプター
部位が密接しかつそれから上流に位置するように、部分
的gag配列がレトロウイルスのベクターの中に位置する
ように、前記部位は位置する。本発明のベクターのとく
に好ましい態様において、gagプロモーターから開始さ
れた転写体が未翻訳の５′gag配列およびベクターの中
の挿入部位の中に挿入された核酸配列から生成された転
写体を含有するように、gag転写プロモーターは位置す
る。問題のベクターは、好ましくは、選択可能なマーカ
ーを含有しない。このようなベクターの好ましい態様は
「MFG」と表示されるベクターである。
本発明の他の面は、３′LTRの中の機能エンハンサー
要素を欠如し、これによりターゲット生物のゲノムの中
に組み込んだとき５′LTRを不活性化するレトロウイル
スのベクターを提供することである。
本発明の他の面は、本質的に前述した通りであるが、
ベクターの挿入部位の中に挿入された遺伝子の発現をコ
ントロールするためにgagプロモーターを利用する代わ
りに、ヒトα−グロビンを使用する、レトロウイルスの
ベクターを提供することである。レトロウイルスのベク
ターα−SGCを特別に開示する。
本発明の他の面は、問題の遺伝子の発現を増加するた
めにアルファグロビン転写プロモーターを使用するレト
ロウイルスのベクターの中に位置しないエンハンサー配
列を用いることである。エンハンサー配列がアルファ−
グロビンの転写プロモーターから上流に配置されたベク
ターはとくに重要である。本発明の他の面は、このよう
なLTRを含有しないベクターの中のサイトメガロウイル
スから誘導されたエンハンサー配列を提供することであ
る。
本発明の他の面は、レトロウイルスのベクターの中で
挿入部位の中に挿入された発現のための遺伝子を含有す
るレトロウイルスのベクター構成体を提供することであ
る。本発明のレトロウイルスのベクターの中に挿入する
ための遺伝子は、任意の種々のホルモン、酵素、レセプ
ターまたは他の薬物を含む。本発明は、MFGおよびα−S
GCの挿入、すなわち、クローニング部位の中に挿入され
た（独立に）tPAおよび因子VIIIから成る遺伝学的構成
体を特別に提供することである。
この野生型レトロウイルスのゲノムは、ConeおよびMu
lligan、前掲、により、新しい遺伝子を細胞の中に挿入
することができるベクターとして使用するために修飾さ
れた。第２図に示すように、gag,polおよびenv遺伝子の
すべては除去され、そしてneo遺伝子をエンコードするD
NAセグメントはそれらの場所に挿入された。neo遺伝子
は優性の選択可能なマーカーとして働く。組み換えゲノ
ムの一部分を残すレトロウイルスの配列は、LTR,tRNA結
合部位およびPsiパッケージング部位を含む。Cepko,C.
ら、Cell 37:1053−1062（1984）。
発現のための外来遺伝子の挿入のための部位を含有す
る多数のレトロウイルスのベクターを教示することに加
えて、本発明は、また、レトロウイルスのベクターが挿
入部位の中に挿入された遺伝子、すなわち、発現のため
の外来遺伝子または遺伝子を含有する遺伝学的構成体を
提供する。本発明のベクターの中に含めるための外来遺
伝子は、種々のタンパク質をエンコードすることができ
る。問題のタンパク質は、種々のホルモン、成長因子、
酵素、リンホカイン、サイトカイン、レセプターなどを
包含する。用語「外来遺伝子」は、外来遺伝子を含有す
るレトロウイルスのベクターを挿入することができる細
胞に対して内因性の核酸配列を包含する。存在しない
か、減少した量の中に生産されるか、あるいは遺伝病に
悩まされる固体の中で突然変異の形態で生産されるポリ
ペプチドをエンコードする遺伝子は、発現のための遺伝
子として使用するためにとくに重要である。さらに、タ
ーゲット細胞から分泌されるポリペプチドをエンコード
する外来遺伝子を使用して、外来遺伝子によりエンコー
ドされるタンパク質により全身的作用を得ることは重要
である。問題の特定の外来遺伝子は次のものを包含す
る：ヘモグロビン、インターロイキン１、インターロイ
キン２、インターロイキン３、インターロイキン４、イ
ンターロイキン５、インターロイキン６、インターロイ
キン７、インターロイキン８、インターロイキン９、イ
ンターロイキン10、インターロイキン11、など、GM−CS
F、Ｇ−CSF、Ｍ−CSF、ヒト成長因子、インスリン、因
子VIII、因子IX、tPA、LDLレセプター、腫瘍壊死因子、
FDGF,EGF,NGF,EPO、β−グロビンなど、ならびにこれら
のタンパク質の生物学的に活性な突然変異タンパク質。
レトロウイルスのベクターの中に挿入するための発現の
ための遺伝子は種々の種からのものであることができ
る；しかしながら、問題の遺伝子のために好ましい種の
源は、外来遺伝子を含有するレトロウイルスのベクター
をその中に挿入すべき種である。
典型的には、本発明のレトロウイルスのベクターは、
核酸配列をパッケージング細胞系の中にトランスフェク
ションすることによって使用される。パッケージング細
胞系は、これをベクターに変換する過程においてレトロ
ウイルスから欠失されたウイルスの遺伝子機能を含有す
る。こうして、ベクターの挿入部位の中に挿入された発
現のための遺伝子を含むか、あるいは含まない、本発明
のレトロウイルスのベクターをパッケージング細胞系の
中にトランスフェクションすると、所望の遺伝学的構成
体を含有する感染性ウイルス粒子が生成する。理想的に
は、パッケージング細胞系は高い力価の組み換えレトロ
ウイルスを生産することができる。本発明の遺伝学的構
成体とともに使用するために好ましいパッケージング細
胞系は、Psi2,Psi−Am,Psi CRIP、およびPsi CREであ
る。Psi2はレトロウイルスのベクターMFGおよびα−SGC
とともに使用するためにとくに好ましい。
Mulliganおよび共同研究者らにより記載されたPsi2
は、NIH 3T3内皮をpMOV−Psideトランスフェクションす
ることによってつくり、pMOV−Psiはエコトロピックモ
ロニーネズミ白血病ウイルス（Mo−MuLVクローンであ
る。pMOVPsiはすべてのウイルスの遺伝子生産物を発現
するが、ウイルスのゲノムの包膜に必要であるPsi配列
を欠如する。pMOV−Psiは、マウス（および密接に関係
する齧歯類）の細胞上にのみ存在するレセプターを認識
する、エコトロピックのウイルスのエンベロープ糖タン
パク質を発現する。
他の細胞系はPsi−２様パッケージング細胞系であるP
si am系統である。これらのPsi−am細胞系は修飾された
pMOV−Psiゲノムを含有し、ここにおいてエコトロピッ
クエンベロープ糖タンパク質は両種性ウイルス4070Aか
ら誘導されたエンベロープ配列で置換されている。Hart
ley,J.W.およびW.P.Rowe,Journal of Virology,19:19−
25（1976）。結局、それらは両種性宿主範囲をもつ組み
換えウイルスの生産に有用である。Psi am細胞系をつく
るために使用されたレトロウイルスは非常に広い哺乳動
物宿主範囲（両種性宿主範囲）を有し、そしてヒト細胞
を感染させるために使用することができる。組み換えゲ
ノムがPsiパッケージング配列を有する場合、Psi−am細
胞系は組み換えレトロウイルスのゲノムを感染性レトロ
ウイルス粒子の中にパッケージングすることができる。
Cone,R.D.およびMulligan,R.C.Proceedings of the Nat
ional Acadcademy of Sciences U.S.A.81:6349−6353
（1984）。
２つの他のパッケージング細胞系はPsi CRIPおよびPs
i CREとして知られている。これらの細胞系は、それぞ
れ、両種性およびエコトロピック宿主範囲をもつ組み換
えレトロウイルスを高い力価で安定に生産するクローン
を分離するために使用であることが示された。これらの
細胞系は、Danos,O.およびR.C.Mulligan,Proceedings o
f the National Acadcademy of Sciences U.S.A.85:646
0−6464（1988）および米国特許出願第07/239,545号、1
998年９月１日提出、に記載されている。この参考文献
および特許出願の教示を引用によってここに加える。Ps
i CRIPおよびPsi CREは、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（American Type Culture Collecti
on）（米国マリイランド州ロックビレ）に、それぞれ、
受け入れ番号CRL9808およびCRL 9807でブダベスト条約
の規定に従い受託された。
本発明のレトロウイルスのベクターは、次のものを限
定なしに包含する広範な種類の細胞のタイプにおいて使
用することができる：上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞、
内皮細胞、筋芽細胞、星状細胞、リンパ球細胞、メセン
シャル（mesenthial）細胞など。次の特許および特許刊
行物に開示されている細胞のタイプはとくに重要であ
る：米国特許第4,868,116号、1989年９月19日発行、お
よび米国特許第4,980,286号、1990年12月25日発行（上
皮細胞）、PCT/US89/00422,WO89/07136号、1989年８月1
0日公開（肝細胞）、欧州特許（EP）第378,576号、1990
年７月25日公開（線維芽細胞）、およびPCT/US88/0438
3、WO89/05345号、1989年６月15日公開およびWO/90/069
97号、1990年６月28日公開（内皮細胞）、それら開示を
ここに引用によって加える。
本発明のベクターは、次のものを限定なしに包含する
種々の用途において使用することができる：癌、遺伝学
的に基づく病気、心肺の疾患、内分泌学的疾患など。
次の実施例によって、本発明をさらに説明する。これ
らの実施例は本発明を限定することを意図しない。
実施例１（ａ）〜（ｃ）において、本発明のMFGベク
ターを構成のための前駆体を記載する。参考文献の開示
はここに引用によって加える。
実施例I a ベクターの構成 pMOV（pMOVPsi）は次のようにして構成した:3つの精
製したDNA断片を一緒に結合したpMOV Psi−を構成し
た。pMOV Psi＋をXho Iで完全に消化し、次いでEcoR I
で部分的に消化することによって、第１を得た。Chumak
ov,I.ら、Journal of Virology,42:1088−1098（198
2）。MuLVの中の2.0 UにおけるXho I部位から、３′LT
R,3′マウスのフランキング配列、pBR322のすべて、を
通して延び、そしてEcoR I部位において終わる断片を、
電気泳動の分離後にアガロースゲルから精製した。Voge
lstein,B.およびD.Gillespie,Proceedings of the Nati
onal Acadcademy of Sciences USA,761:615−619（197
9）。pMOV Psi＋をBal Iで完全に消化し、次いでpBR322
の中のBal1部位から５′マウスのflk配列および５′を
通してMuLVの0.7 Uに位置するBal I部位に延びる断片を
精製することによって、第２の断片を得た。次いでHind
IIIリンカー（コラボレイティブ・リサーチ）をこの断
片にT4DNAリガーゼに平滑末端結合し、そしてこの断片
を過剰のHind IIIおよびEcoR Iで消化した。このLTRを
含有する断片を電気泳動で分離後にアガロースゲルから
精製した。最終の結合反応において存在する第３の断片
は、MuLVのgag/pol領域がpSV2の中にサブクローニング
されているpSV2gag/polから得た。Mulligan,R.C.,およ
びP.Berg,Science,209:1422−1427（1980）。pSV2−gag
/polをXho IおよびHind IIIで完全に消化し、そしてHin
d III部位（1.0 UのMuLVにおけるPst I部位から変化し
た）から2.0のMuLVにおけるXho Iに延びる断片を電気泳
動で分離後にアガロースゲルから精製した。次いで、こ
れらの３つのDNA断片を等しい量で50μg/mlの合計のDNA
濃度においてリガーゼ緩衝液（50mMのトリス−HCl〔pH
7.8〕、10mMのMgCl2,20mMのジチオスレイトール、1.0mM
のATP,50μg/mlのウシ血清アルブミン）の中で混合し、
そしてT4DNAリガーゼと15℃において18時間インキュベ
ーションした。大腸菌（E.coli）HB101を結合したDNAで
トランスフェクションし、そしてアンピシリン耐性トラ
ンスフェクション体を得た。ある数の形質転換体から得
られたプラスミドDNAを適当な制限エンドヌクレアーゼ
で消化し、そしてアガロースゲルで電気泳動させること
によって所望の構造についてスクリーニングした。Davi
s,R.W.ら、メソッズ・Methods in Enzymology,65:401−
411（1980）。
pMOV−PsiおよびpSV2gpt,XG PRTを発現することがで
きるSV40ハイブリッドベクターを同時形質転換すること
によって、染色体の中に安定に組み込まれたPsi突然変
異体を含有する細胞系をつくった。Mulligan,R.C.,およ
びP.Berg,Science,209:1422−1427（1980）。このよう
にして得られたgpt＋コロニーからの細胞をクローニン
グし、そして３つの系統に推定した:Psi−1,Psi−２お
よびPsi−３。
実施例１（ｂ） pLJ。このベクターの特性は、Korman,A.J.ら、Procee
dings of the National Acadcademy of Sciences USA,8
4:2150（1987）により記載された。このベクターは２つ
の遺伝子を発現することができる：問題の遺伝子および
優性の選択可能なマーカー、例えば、noe遺伝子。問題
の遺伝子を５′に対してちょうど基部のBamH I/Sma I/S
al Iクローニング部位の中に直接の向きでクローニング
し、同時に、neo遺伝子をクローニング部位より３′離
れている（クローニング部位の３′に位置する）内部の
プロモーター（SV40から）に対して基部に配置する。pL
Jからの転写は２の部位において開始する:1）５′LTR、
これは問題の遺伝子の発現のために要求される、および
２）内部のSV40プロモーター、これはneg遺伝子の発現
のために要求される。pLJの構造は第2a図に表されてい
る。
ベクターpLJは第2a図に表されている。pLJにおいて、
問題の遺伝物質は５′LTRのちょうど後に挿入される。
この遺伝物質の発現はLTRから転写され、そしてneo遺伝
子の発現は内部のSV40プロモーターから転写される。
実施例１（ｃ） pEm。この実施例において、野生型ウイルスのgag,pol
およびenvのための全体の解読配列を、発現される唯一
の遺伝子である問題の遺伝子で置換する。pEmベクター
の成分を下に記載する。５′フランキング配列、５′LT
Rおよび400bpの隣接する配列（BamH I部位まで）はpZIP
からのものである。３′フランキング配列およびLTRは
またpZIPからのものである；しかしながら、３′LTRか
ら150bp上流のCla I部位は合成BamH Iと結合されてお
り、そしてベクターの中に存在するBamH Iクローニング
部位の他方の半分を形成する。pBR322のHind III/EcoR
I断片はプラスミドの主鎖を形成する。このベクターは
モロニーネズミ白血病ウイルスの株からクローニングさ
れた配列から誘導される。類似のベクターは、骨髄増殖
性肉腫ウイルスから誘導される配列から構成された。pE
mの構造は第2b図に表されている。
また、選択可能なマーカーをもたないベクターを使用
して、種々の細胞のタイプ、例えば、問題の遺伝物質を
もつ内皮細胞を形質導入することができる。このような
ベクターは基本的には従来記載されたベクターの簡素化
である、この中にこのようなマーカーが存在する。ベク
ターpEmは第2b図に表されている；表されているよう
に、このベクターの主な成分は５′および３′のLTRで
あり、そして問題の遺伝物質は２つのLTRの間に挿入さ
れている。
実施例II MFGベクターの構成 ATCC No.68754の同定特性を有するMFGベクターはpEM
から誘導するが、パッケージング細胞系の中の組み換え
ゲノムの包膜を増加するためにMMLVからのgag配列の103
8bp、およびスプライスアクセプター部位および転写開
始を含有するMOV−９から誘導された350bpを含有する。
Nco IおよびBamH I部位を含有する18bpのオリゴヌクレ
オチドは、MOV−９の直ぐ後に存在し、そして適合性部
位をもつ遺伝子の便利な挿入を可能とする。MMLV LTRは
転写をコントロールし、そして生ずるmRNAは自然gag転
写体の真性の５′未翻訳領域を含有し、これに直ぐに引
き続いて挿入された遺伝子のオープンリーディングフレ
ームが存在する。MFGの構造は第2C図に表されている。M
FGのより詳細な地図は第13図に記載されている。MFGの
構成についての詳細は第９図（ａ）および第９図（ｂ）
に記載されている。
MFGは、半分のGAGレトロウイルスのベクター（半分の
GAGはBenderら、J.Virol.61:1639−1646に記載されてい
る）のXho I/Nde I断片を含有する５′LTRを、Xho I/Ba
mH I H4のヒストンプロモーター断片に結合することに
よって構成した。レトロウイルスのベクターpEMをNde I
およびBamH Iで消化し、そして３′LTRを含有する断片
を既にH4断片に結合された半分のGAGに結合して、適切
な向きに２つのLTRを含有し、そしてまたベクターのウ
イルス部分内にH4を含有する中間のレトロウイルスのベ
クターを生成した。次いで中間のベクターをNde Iで消
化して線状にし、そしてこのベクターのpBR 322部分の
中のNde I部位をポリメラーゼによりフィルインし、そ
して結合により破壊した。このベクターを引き続いてXh
o Iで消化し、そしてXho I部位をNde Iリンカーに接合
した。このベクターを引き続いてBamH Iで切断し、そし
て両者のLTRおよびpBR322配列を含有する大きい断片を
精製した。
Xho IおよびBamH Iを有しそして次の配列： を有するリンカーを合成し、そして清浄化した（cleare
d）中間体のベクターおよびpMOV9からのNde I/Xho I断
片〔Nde Iのへりの次にスプライスアクセプター部位を
含有する〕の両者に結合して、第2C図、第３図および第
９図（ａ）〜第９図（ｂ）に示されているような、円形
のベクター、MFGを形成した。ベクターMFGを含有するプ
ラスミドはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（American Type Culture Collection）受託され、
そして受け入れ番号68,754を有する。
実施例III α−SGCの構成 α−SGCベクター（ATCC受け入れ番号68755）は、α−
グロビン遺伝子バンクからの転写プロモーター配列を利
用してtPA遺伝子の発現を調節する。プロモーター要素
を含有する600塩基対の断片は、転写開始のための配列
および真性のα−グロビンmRNAの５′未翻訳領域をさら
に含有する。サイトメガロウイルス遊離転写エンハンサ
ーを含む360塩基対の断片はα−グロビンのプロモータ
ーより前に存在し、そしてこの要素からの転写を増強す
るために使用される。さらに、MMLVエンハンサーは３′
LTRから欠失される。この欠失は感染のとき５′LTRに転
移され、そしてこの要素の転写の活性化の活性を本質的
に不活性化する。α−SGCの構造は第2d図に表されてい
る。α−SGCのより詳細な記載は第４図に示されてい
る。α−SGCベクターを含有するプラスミドはアメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Typ
e Culture Collection）に受託され、そして受け入れ番
号68,755を有する。
以下の実施例は、内皮細胞とともに本発明のレトロウ
イルスのベクターを使用する実施例を提供する。理解さ
れるように、他の細胞のタイプは同様によく適当であ
り、限定なしに、上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞などを
包含する。
実施例IV 遺伝学的に修飾されたイヌおよびヒトの内皮
細胞によるtPAの発現の増加 組織のプラスミノゲンアクチベーター（tPA）は、血
液のクロットの線維素溶解を促進する内皮細胞により通
常分泌されるタンパク質である。ヒトtPAをエンコード
する組み換えレトロウイルスのベクターを構成し、そし
てイヌ内皮細胞の形質導入に使用して、形質導入された
内皮細胞からの治療的に関係するタンパク質のデリバリ
ーの増強を証明する。
組み換えレトロウイルスのベクターの中にクローニン
グするためのtPA遺伝子の修飾を第10図に示す。ヒト子
宮のtPAの解読配列は、インテグレイテッド・ジェネテ
ィックス・インコーポレーテッド（Integrated Genetic
s Inc.）、マサチュセッツ州フラミングハムから入手し
たpUCに基づくSal I DNA断片内に含有されていた。もと
のcDNAの塩基対６におけるSFaN I部位および塩基対2090
におけるBgl II部位にSal Iリンカーを配置することに
よって、Sal I断片を誘導した。解読配列は塩基対13か
ら塩基対1699に延びる。
このもとのクローンから、この特許の主要部の中に記
載されるMFGおよびα−SGCベクターの中に直接クローニ
ングすることができる断片を誘導した。Sal Iフィルイ
ンをまず合成BamH Iリンカーの付加によりBamH I断片に
転化し、次いで制限酵素Bgl IIで消化して、109塩基対
のBamH I−Bgl II断片および1975塩基対のBgl II−BamH
I断片を生成する。tPA解読配列のミッシング100塩基対
および翻訳開始コドンを再びつくるために、２つの104
塩基対のオリゴヌクレオチドを化学的に合成し、そして
アニーリングして５′末端にNco I部位および３′末端
にBal II部位をもつ断片をつくる。このオリゴヌクレオ
チドを部分的1975塩基対のtPA遺伝子のBgl II部位上に
結合して、もとの分子の同一の解読配列をもつ2079塩基
対のtPA遺伝子をつくるが、これはNco I−BamH I断片と
して容易に得ることができる。それをMFGおよびα−SGC
ベクターの中に直接挿入した（生ずるベクターは、それ
ぞれ、ATCCの受け入れ番号68727および68729を与えられ
た）。これらの操作は標準の分子生物学の技術（Molecu
lar Cloning:A Laboratory Manual,T,Manatis,E.F.Fris
hc、およびJ.Sambrook）により実施し、そして第２図に
線図で示されている。
MFG−tPAおよびα−SGC−tPAをエンコードする組み換
えウイルスを生産する細胞系は、両種性宿主範囲の組み
換えレトロウイルスを生産することができるDanosおよ
びMulliganのPsiパッケージング細胞系からつくった〔P
roceedings of the National Acadcademy of Sciences
U.S.A.85:6460（1988）〕。10μｇの特定のDNAおよび１
μｇのプラスミドpSV2neoを共沈させ、そして標準のリ
ン酸カルシウムトランスフェクション手順によりパッケ
ージング細胞上にトランスフェクションした。安定にト
ランスフェクションしたクローンを、800μg/mlのG418
を含有する選択培地の中で14日間増殖させた後分離し
た。24時間培養の上澄み液を個々のクローンのコンフル
エント単層から収穫し、そしてNIH 3T3細胞の感染に使
用した。24時間の暴露後、培養上澄み液を除去し、そし
て3T3細胞に通常の培地を供給し、そしてさらに72時間
増殖させた。新鮮な培地をこれらの細胞上に６時間の間
配置し、そしてこれらの上澄み液を商業的に入手可能な
ヒトtPAに対して特異的なELISA（Immunobind−５、Amer
ican Diagnostica Inc.,ニューヨーク州ニューヨーク）
を使用してヒトtPAについてアッセイした。このスクリ
ーンから、MFG−tPA組み換えウイルスまたはα−SGC−t
PA組み換えウイルスを生産するパッケージング細胞系の
クローンを選抜しそして、それぞれ、MFG 68およびα−
SGC 22と表示した。
イヌ内皮細胞は、記載されているように、外部の頸静
脈の10cmのセグメントからコラゲナーゼの消化により分
離した〔T.J.Hunter,S.P.Schmidt,W.V.Sharp、および
（1983）Trans.Am.Soc.Artif.Intern.Organs 29:17
7〕。細胞をフィブロネクチン被覆した組織培養皿上で
５％の血漿誘導ウマ血清、50μg/mlの内皮細胞の成長因
子および100μg/mlのヘパリンを含有するM199培地の中
で増殖させた。細胞培養物の純度は、フォン・ウィルブ
ランドの因子の存在および平滑筋の細胞に特異的なα−
アクチンの不存在についての免疫化学的アッセイにより
決定した。形質導入の前日に、内皮細胞をヘパリンを含
まない培地の中に5.5×103細胞/cm2で接種した。次の日
に、内皮細胞を、８μg/mlのポリブレンを添加した各生
産体細胞系から誘導された組み換えウイルスを含有する
上澄み液に、24時間暴露した。ウイルスの上澄み液を除
去し、分析に通常の培地を供給し、そして増殖を分析前
にさらに48時間進行させた。
高分子量のゲノムDNAおよび合計のRNAを内皮細胞の培
養物から標準の技術により分離した（Molecular Clonin
g−A Laboratory Manual,T.Manatis,E.F.Fritshc、およ
びJ.Sambrook）。DNAおよびRNAを、全体のtPAのcDNA断
片から調製した32P標識したDNAプローブとのハイブリダ
イゼーション分析により分析した。標準の技術は電気泳
動分離、フィルターの転移、ハイブリダイゼーション、
洗浄、および32Pの標識つけについて使用した（Molecul
ar Cloning−A Laboratory Manual,T.Manatis,E.F.Frit
shc、およびJ.Sambrook）。形質導入されたイヌ内皮細
胞の中のヒトtPAの生産は、種の特異的免疫化学的染色
で実証された。形質導入された細胞を３％のホルムアル
デヒドの中で10分間室温において固定し、次いで0.1％
のトリトンＸ−100の中で５分間透過化した。次いで、
固定された細胞の単層を順次にヒトtPAに対するネズミ
モノクローナル抗体と、アルカリ性ホスファターゼ接合
ヤギ抗マウス抗体と、そして最後にアルカリ性ホスファ
ターゼに対して特異的な色試薬とインキュベーションし
た。この手順はヒトtPAを発現する細胞を特異的に染色
し、そして普通の光学顕微鏡により可視化することがで
きる。さらに、形質導入された細胞からのtPAの分泌を
コンフルエント細胞単層から決定した。新鮮な培地を細
胞の上に６時間の間配置し、除去し、そして遠心により
清浄にし、そしてヒトtPAの量を商業的に入手可能なELI
SA（Immunobind−5,American Diagnostica）で決定し
た。
形質導入プロセスの効率は、モック形質導入された細
胞またはMFG−tPAで形質導入された細胞の集団の免疫化
学的染色により示された。第５図に示すように、MFG 68
から収穫したウイルスの上澄み液に細胞を１回暴露した
後、細胞の本質的にすべてはヒトtPAを合成しており、
これに対して対照において細胞はまったく合成していな
い。これは形質導入された細胞についていずれかのタイ
プを選択しないで達成された。
免疫学的アッセイを実施して、形質導入された細胞か
ら分泌されているtPAの量を決定した。下に示すよう
に、MFG 68またはα−SGC 22からの組み換えウイルスで
形質導入された細胞は大量のヒトtPAを分泌した。同様
な条件下に、培養中のヒト内皮細胞は典型的にはほぼ1n
gのtPA分泌する〔Hanss,M.およびD.Collen（1987）J.La
b.Clin.Med.109:97−104〕。
内皮細胞がMFG 68およびα−SGC 22からの組み換えウ
イルスで形質導入されたことのそれ以上の確証として、
DNAおよびRNAを形質導入された細胞から分離し、そして
放射線標識したtPA遺伝子に対するハイブリダイゼーシ
ョンにより分析した。DNA分析のオートラジオグラフィ
ーを実施した。ハイブリダイゼーションは未感染の対照
において検出されなかったが、２つの組み換えウイルス
で感染した細胞において適当な分子量の単一のハイブリ
ダイゼーションする種が見られた。これが証明するよう
に、遺伝情報はこれらの形質導入された細胞のゲノムに
転移された。
これらの細胞から分離された合計のRNAのハイブリダ
イゼーション分析は、タンパク質およびDNAの結果を確
証する。再び対照の細胞においてハイブリダイゼーショ
ンは検出されなかったが、形質導入された細胞から誘導
されたRNAにおいて、適当な大きさのハイブリダイゼー
ションのバンドを見ることができる。MFG 68およびα−
SGC 22の組み換えウイルスを生産する細胞からのRNA
を、また、対照として示す。
実施例Ｖ 脈管移植片の表面上の翻訳された形質導入さ
れたイヌ内皮細胞のin vivoの機能 体重20〜325kgの大人の雌の雑種のイヌの外部の頸静
脈から内皮細胞を酵素的に収穫し、実験室において培養
し、そして実施例IVに記載するように純度のための分析
した。各動物から分離された細胞の半分を、前の節に記
載するようにMFG−tPA組み換えウイルスを生産するMFG
68細胞系から収穫したtPAの上澄み液に２回暴露するこ
とによって形質導入した。他方の半分をモック形質導入
した。各集団について実施した増殖曲線は、増殖特性の
差を示した。形質導入された細胞の各バッチから誘導さ
れた培養の上澄み液についてELISAの測定を実施して、t
PAが増強された細胞から分泌されていることを確実にし
た。次いでこれらの細胞を実験室においてほぼ１週間増
殖させて、十分な数の細胞を得た。
細胞を分離した各動物について、発泡テフロンから作
られた２つの脈管移植片（W.L.Gore and Associates.In
c.,アリゾナ州フラグスタッフ）に細胞を接種した。一
方の移植片をモック形質導入された細胞で接種し、そし
て他方を高いレベルのtPAを分泌するように形質導入さ
れた細胞で接種した。各移植片、0.4cm×14cm、を１μg
/cm2のフィブロネクチン（Sigma Chemical Corp.,ミゾ
リー州セントルイス）で予備被覆し、次いで2200,000の
内皮細胞/cmで接種した。次いで移植片を追加の72時間
の培養の間インキュベーションした。移植の前に、末端
を各移植片から切断しそして検査して細胞の被覆を確実
にした。
細胞を収穫した同一のイヌを麻酔し、そして接種した
移植片の10cmのセグメントを大動脈−腸骨のバイパスと
して移植した。各イヌに２つの対側の移植片を与えた；
一方は対照細胞を接種しそして他方は高いレベルのtPA
を分泌するように形質導入された細胞を接種した。移植
後、移植片の性能をＢ−モードのスキャナーで毎日モニ
ターし、このスキャナーは超音波で移植片を探し、そし
てドップラー測定（Accuson,Inc.）により移植片を通る
血液の流れを評価した。血栓の形成を減少する薬物を動
物に投与しなかった。
６匹の異なる動物における移植片の性能の結果分析し
た。結果を第５図に示す。前述の移植のモデルは極端に
厳格なものであり、そして閉鎖性クロットの形成により
急速な移植片の不合格に導く。正常の移植片の機能は充
実の棒で示し、そして不合格であるが、なお機能してい
る移植片は縞のある棒で示す。第１の動物において、対
照移植片および増大したレベルのtPAを分泌する形質導
入された細胞でライニングした移植片（実験）は移植後
24時間でクロットの形成のために不合格であった。他の
５匹の動物のすべてにおいて、増大したレベルのtPAを
分泌する形質導入された細胞でライニングした移植片は
モック形質導入されたのみの細胞をもつ移植片より長く
機能した。この差は24時間から数ヵ月まで変化した。こ
れらの結果が証明するように、治療的効果は形質導入さ
れた内皮細胞を使用してin vivoで達成することができ
る。
実施例VI 形質導入された内皮細胞からのヒト因子VIII
の生産 修飾されたヒト因子VIII遺伝子を含有するレトロウイ
ルスのベクターであるMFG（ATCCの受け入れ番号68726）
で細胞を形質導入することによって、内皮細胞を遺伝学
的に増強してヒト因子VIIIを生産した。修飾された因子
VIIIはAi,A2,A3,Clおよびc2ドメインのための解読配列
のすべてを含有するが、Ｄドメインはアミノ酸743から1
468まで欠失されている。Ｂドメインの除去およびレト
ロウイルスのベクターMFGの中への修飾された因子VIII
の挿入を下に詳細に記載しそして第７図に描写する。
５′および３′の未翻訳配列をもたない全長のcDNA
を、制限部位Nco I（５′）とXho I（３′）との間に挿
入されたプラスミドベクターにおいて得た。Ｂドメイン
を除去するために、因子VIIIのcDNAをＢドメインの５′
および３′の両者の側の配列をスパンする４断片におい
てプラスミドベクターの中にサブクローニングした。因
子VIIIのcDNAの第１断片を、プラスミドベクターpUC9の
中の制限部位Sma IとPst Iとの間にサブクローニングし
た。このプラスミドベクターをSal IおよびPst Iで切断
し、そして５′ホスフェートを仔ウシ腸ホスファターゼ
を使用して除去した。全長のcDNAからの1591塩基対のXh
o I（ヌクレオチド7263）−Nde I（ヌクレオチド5672）
断片、および359塩基対のNde I（ヌクレオチド5672）−
Pst I（ヌクレオチド5313）断片を分離し、そしてSal I
/Pst I消化したプラスミドベクターと結合した。
同一の翻訳のリーディングフレームでアミノ酸742−1
649を接合するＢドメインをエンコードする配列の大部
分を除去するために、168塩基対を包含する５′Hind II
I部位および３′Pst I部位をもつオリゴヌクレオチドを
合成した。オリゴヌクレオチドは、アミノ酸742および
引き続く軽鎖の活性化ペプチドの第１アミノ酸であるア
ミノ酸1649をエンコードするヌクレオチド2427における
Hind III部位から、ヌクレオチド5313におけるPst I部
位へ延びる。プラスミドベクターpUC9を制限酵素Hind I
IIおよびPst Iで消化し、そして５′ホスフェートを仔
ウシ腸ホスファターゼを使用して除去した。オリゴヌク
レオチドを４つの別々の鎖として合成し、キナーゼ処理
し、アニーリングし、そしてプラスミドベクターのHind
IIIとPst Iとの間で結合した。
サブクローニングしたHind III/Pst Iオリゴヌクレオ
チドをプラスミドベクターpUC8の中のPst I/Xho I断片
に対して並置した。このプラスミドを発生させるため
に、新しいポリリンカーをpUC9プラスミドの主鎖の中に
挿入し、この新しいポリリンカーは使用した制限酵素部
位５′Sma I−BamH II−Xho I−Pst I−Hind III−Asp7
18−Nco I−Hpa I3′をエンコードした。このプラスミ
ドベクターを制限酵素BamH IおよびHind IIIで消化し、
そして５′ホスフェートを仔ウシ腸ホスファターゼで除
去した。Pst I/Xho Iサブクローンの部分的Pst I/BamH
I消化物を使用して３′末端の因子VIII断片を分離し、
そしてサブクローニングしたオリゴヌクレオチドのPvu
I/Hind III消化物を使用して重鎖および軽鎖の接合断片
を分離した。それらをプラスミドベクターpUC8の中のBa
mH I部位とHind III部位との間に結合した。
ヌクレオチド2427および7205の間に因子VIII配列を含
有するこのサブクローンをAsp718およびHind IIIで消化
し、そして５′ホスフェートを仔ウシ腸ホスファターゼ
を使用して除去した。制限酵素部位Asp718（ヌクレオチ
ド1961）とHind III（ヌクレオチド2427）との間の因子
VIIIをエンコードする断片を分離し、そしてヌクレオチ
ド1961からヌクレオチド7205における翻訳停止コドンま
での因子VIIIを含有するサブクローン（pF8 3′デル
タ）を発生させた。
修飾された因子VIIIを含有するレトロウイルスのベク
ターの構成を、レトロウイルスのベクターMFGの制限部
位Nco IとBamH Iとの間に因子VIII遺伝子を挿入するこ
とによって実施した。因子VIIIのサブクローニングpF8
3′デルタをSma Iで消化し、そしてオリゴヌクレオチド
のリンカーを使用してBgl II部位に変換した。Asp718/B
gl II断片を３′因子VIIIサブクローンから分離し、そ
して翻訳開始のためのATGを含有する５′因子VIII断片
をNco I（ヌクレオチド151）/Asp718断片（ヌクレオチ
ド1961）として分離した。レトロウイルスのベクターMF
GをNco IおよびBamH Iで消化し、そして５′ホスフェー
トを仔ウシ腸ホスファターゼで除去した。因子VIII断片
をレトロウイルスのベクターの中に結合して最終の因子
VIIIレトロウイルス構成体を生成した、第６図参照。
Bestwickら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5405−5408
（1988））により記載されているように、レトロウイル
スのベクターMFG/因子VIIIを等しい数のエコトロピック
パッケージング細胞Psi CREおよび両種性パッケージン
グ細胞CRIPの中にトランスフェクションすることによっ
て、レトロウイルスの粒子を生産する細胞系を発生させ
た。パッケージング細胞の２つの宿主範囲の間で起こる
重感染の程度をモニターするために、生物学的に活性な
因子VIIIの生産をカビ・ダイアグノスチカ・コーテスト
・フォー・ファクターVIII（Kabi Diagnostica Caoates
t for Factor VIII）（Helena Laboratories、テキサス
州ビーウモント）で測定し、そしてウイルスのRNAの生
産をRNAドットブロット分析により測定した。トランス
フェクション後21日に、トランスフェクションされたパ
ッケージング細胞を両種性パッケージング細胞系Psi CR
IP−HISと同時培養した。CRIP HISパッケージング細胞
系は従来記載されたCRIPパッケージング細胞系の変異型
である。CRIP HISパッケージング細胞系はPsi CRIPパッ
ケージング細胞系と同一であるが、ただしレトロウイル
スのエンベロープ遺伝子をpSV2−HISプラスミドDNA、す
なわち、異なる優性の選択可能なマーカー遺伝子で同時
トランスフェクションすることによって細胞の中に導入
した。形質導入性粒子の均質性両種性レトロウイルスの
ストックの分離のために、パッケージング細胞系を1:1
の比で培養した。両種性パッケージング細胞系CRIP HIS
の重感染は安定性細胞系HIS 19の発生に導き、HIS 19は
修飾された因子VIII遺伝子を効率よく形質導入する組み
換えレトロウイルスを生産する。レトロウイルスを生産
する細胞系の抗生物質の選抜は、高い力価の組み換えレ
トロウイルスを生産する細胞系の分離に要求されない。
細胞系のゲノムのDNAをサザンブロットハイブリダイゼ
ーション分析により特性決定して、生産体の細胞系の中
に存在するレトロウイルスのベクターの組み込まれたコ
ピーの数を決定した。レトロウイルスを生産する細胞系
の中のコピー数はほぼ0.5であり、したがって平均する
とCRIP−HISパッケージング細胞の50％は修飾された因
子VIII遺伝子をもつレトロウイルスのベクターのコピー
を含有する。レトロウイルスのベクターおよび修飾され
た因子VIII遺伝子はパッケージング細胞系の中にDNAの
欠失または置換を含まなくて無傷である。レトロウイル
スのベクターのコピー数は、レトロウイルスを生産する
細胞系の連続的継代で一定に止まる。組み換えレトロウ
イルスの最高の力価を得るために、HIS 19を選択ヒスチ
ジンマイナス培地の中で４回継代し、次いで完全DMEM培
地の中で４回継代した。レトロウイルス粒子を発生させ
るために、HIS 19を５×105〜１×106細胞で10cmの細胞
培養皿の中で接種した。接種後48時間に、ほぼ70％のコ
ンフルエンシイであり、新鮮な培地（DMEM＋10％の仔ウ
シ血清）を形質導入のための組み換えレトロウイルス源
として24時間後に集めるためにプレートに添加した。
修飾された因子VIII遺伝子を頸静脈から分離されたイ
ヌ内皮細胞の中に形質導入した。５％の血漿誘導血清
（ウマ）、100μg/mlのヘパリンおよび50μg/mlの内皮
細胞の成長因子を有する完全M199培地の中で、内皮細胞
を３×1055細胞/10cmの皿で４〜６時間の間接種した。
次いで細胞を５％の血漿誘導血清および100μg/mlの内
皮細胞の成長因子を有するM199培地の中で、形質導入プ
ロセスの効率に悪影響を及ぼすヘパリンの不存在下に、
一夜インキュベーションした。細胞を新鮮な上澄み液＋
ポリブレン（８μg/ml）に24時間暴露した。ウイルスの
上澄み液を除去した後、細胞を５％の血漿誘導血清、10
0μg/mlの内皮細胞の成長因子を有するM199培地の中に
入れて、ほぼ70〜80％のコンフルエンスに増殖させた。
その時、培地を５％の加熱不活性化した胎児ウシ血清
（66℃に２時間加熱した）および50μg/mlのECGFを有す
るM199に変えた。24時間のインキュベーション後、培地
を集め、そしてカビ・コーテストにより生物学的に活性
な因子VIIIについてアッセイした。
このレトロウイルスを生産する細胞系では、内皮細胞
の50％〜75％はスロットブロット分析により分析した。
因子VIII遺伝子はこの頻度において組み換えレトロウイ
ルスへの単一の暴露で、かつ形質導入された細胞の抗生
物質の選抜なしに、形質導入することができる。形質導
入された内皮細胞は、組み換えレトロウイルスのゲノム
の無傷のコピー、および欠失または再配置をもたない修
飾された因子VIII遺伝子を含有する。遺伝学的に増強さ
れた内皮細胞からの生物学的に活性な因子VIIIの生産速
度は400ng/5×106細胞/24時間であった。
実施例VII 内皮のin vivo形質導入 前の実施例に記載するようにつくった組み換えレトロ
ウイルスの標準ストックを使用して、内皮細胞のin viv
o形質導入を証明する予備的データをわれわれは得た。
このアプローチは従来発表された観察（Reidy MA,Schwa
rtz SM,Lab Invest 44:301−308（1981））に基づき、
これによると、動脈表面への定められた損傷は内皮細胞
の小さいストリップを除去し、そしてこの露出された区
域は欠陥のへりからの新しい内皮細胞の増殖および内部
成長により72時間以内に治癒する。細胞分割は組み換え
レトロウイルスによる有効な形質導入のための要件であ
り、そして針金を使用する内皮の損傷は内皮細胞の増殖
を誘発するための潜在的に多数の方法の１つである。わ
れわれの方法は内皮細胞の増殖を誘発し、次いで増殖す
る細胞を組み換えレトロウイルスのベクターを含有する
上澄み液に直接暴露する、定められた損傷のReidyの技
術を使用する。われわれの最初の実験は正常部位で内皮
細胞を首尾よく形質導入し、こうして新しい遺伝学的配
列を首尾よく導入する組織培養技術の必要性を回避する
この方法の能力を記載する。
この方法は２つの外科的手順を要求し、第１の手順は
血管を損傷し（ここで右の腸骨の動脈について記載し
た）そして内皮細胞の増殖を誘発する。第２手順は血管
表面上で複製する細胞に組み換えレトロウイルスをデリ
バリーすると同時に、増殖する細胞がレトロウイルス粒
子へ暴露される間に近位の動脈管系からの血液の流れ防
止する。実施を簡素化するために、この手順を腸骨の動
脈について記載する。
in vivo遺伝子転移を証明するために、α−SGCベクタ
ーに基づく改良されたベクターを用いる1987年に発表さ
れた（Price J,Tyrner D,Cepko C.1987 Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 84:1560160）マーカー遺伝子の概念をわれわ
れは使用した（第2d図および第４図）。β−ガラクトシ
ダーゼをエンコードするlacZ遺伝子をα−SGCベクター
の中に挿入して、第８図に表されているα−SGC−LacZ
を発生させた。この組み換え構成体をt Cripパッケージ
ング細胞系の中にトランスフェクションし、そして高い
力価のα−SGC−LacZ組み換えレトロウイルスを生産す
るt Crip細胞のクローンを実施例VIに記載するように分
離した。α−SGC−LacZ組み換えレトロウイルスのスト
ックをin vivo形質導入のために使用した。
実験動物（ウサギ）を麻酔（ケタミン／キシラジ）
し、両方の鼠径部をそりそして準備し、そして動物を手
術テーブル上に配置した。両側の垂直の鼠径部の切開を
通して、総、浅および深在の大腿動脈を露出させた。右
（損傷すべき側）において、総大腿動脈からの小さい分
岐を結合して、分離した動脈セグメントからの流出が内
部の腸骨の動脈を通してのみ確実に起こるようにした。
必要に応じて、鼠径靱帯を分割し、そして血管を腹膜後
腔の中に入れてすべての側の分岐の完全なコントロール
を確実にする。右の浅大腿動脈（SFA）を深在分枝より
ほぼ1.5cm下において３−０の絹で結合し、SFAのコント
ロールはSFA/深在接合において得られ、そして横方向の
動脈切開をつくった。細い針金（20ゲージのイントラカ
ス（Intracath）のスタイレットを使用した）を二重に
して弾力性を与えて血管壁との接触を確実にし、総大腿
静脈および腸骨動脈を通過させて、Reidyらが記載する
定めた損傷を生成した。針金を除去し、20ゲージのアン
ギオカス（angiocath）を動脈切開で挿入し、そして下
に横たわる筋肉に固定して、次の外科的手順における直
ちのアクセスを可能にした。切開を層状に閉じ、そして
動物を回復させた。
24時間後、α−SGC−LAC−Ｚベクターのcrip生産体か
ら収穫しそして８μg/mlの最終濃度にポリブレンを補充
した上澄み液を含有する組み換えウイルスをin vivoの
形質導入のために使用した。動物を再び麻酔し、そして
両方の切開を無菌の環境において再び開いた。前に露出
した右の腸骨血管を混乱させないで損傷を与えた区域の
上の右の腸骨血管のコントロールを得るために、＃３フ
ォガルティ（FogartyR）バルーン塞栓切除のカテーテル
を左の浅大腿動脈の中の動脈切開を通して挿入し、大動
脈分岐に進行させ、そしてバルーンを膨張させて血流を
遮る。右の深在大腿動脈を閉塞する。組み換えウイルス
を含有する上澄み液（10ml）を、右のSFAの中に前に配
置したアンギオカスを通して手で注射して導入した。上
澄み液は逆方向に右の総大腿動脈から右の外部の腸骨動
脈に流れ、そして右の内部の腸骨動脈の中に入った。右
の内部の腸骨動脈を去ることによって、上澄み液のため
の開いた流出を可能とし、そして十分な10mlの上澄み液
を設置できた。今日まで実施された実験において、上澄
み液を血管壁に４〜８分間暴露した。次いで左側および
右側からのカテーテルを除去し、止血が得られ、そして
切開を閉じた。
10〜14日後、動物を殺す前に麻酔した。麻酔後かつ暴
露前に、末端の血管の直接の触診により評価した。腎臓
下の大動脈および下の大静脈を外科的に露出し、カニュ
ーレ挿入し、そして下端の血管をヘパリン添加したリン
ゲル乳酸塩（2U/ml）で生理学的圧力（90mmHg）でフラ
ッシュした。致死投与量のネンブタールを投与し、そし
て0.1Mのカコジレート中の0.5％のグルタルアルデヒド
の中でその部位で動脈を10分間灌流固定した。大動脈お
よび両方の腸骨動脈を連続的に切除し、そして1mMのMgC
l2を含むリン酸塩緩衝液（PBS）の中ですすいだ。次い
で血管をｘ−gal基質の中で37℃において１〜1.5時間イ
ンキュベーションすることによってlacZ活性のための染
色した。この反応が完結したとき、ｘ−gal溶液を洗浄
除去し、そしてPBSで置換する。
２つの実験をこのプロトコルを使用して実施した。両
者の実験において、細胞質のパターンの選択的な強いブ
ルーの染色により可視化したとき、動脈表面上の細胞の
中のlacZ遺伝子生産物のその部位の発現により示される
ように、in vivoの形質導入は有望であることが証明さ
れた。Reidyらにより記載された損傷のパターンおよび
増殖と一致する強く染色されたブルーの線は、針金で損
傷し、α−SGC−LacZ組み換えウイルスに暴露し、固定
し、そしてlacZ活性について染色した、外部の腸骨動脈
のセグメントの表面上に見いだされる。
生物学的寄託 1991年10月３日に、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（American Type Culture Collection）
米国マリイランド州ロックビレ（ATCC）に、ここに記載
する因子VIIIが挿入されたプラスミドMFGは受託され
た、ATCC受け入れ番号68727を与えられ、ここに記載す
る因子VIIIが挿入されたプラスミドα−SGCはATCC受け
入れ番号68728を与えられ、そしてここに記載するtPAが
挿入されたプラスミドα−SGCはATCC受け入れ番号68729
を与えられた。1991年10月９日に、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（American Type Culture
Collection）米国マリイランド州ロックビレ（ATCC）
に、ここに記載するプラスミドMFGは受託された、ATCC
受け入れ番号68754を与えられ、ここに記載するプラス
ミドα−SGCはATCC受け入れ番号68755を与えられた。こ
れらの寄託は特許手続きの目的のための微生物の寄託の
国際的認識についてのブダベスト条約の規定および規則
（ブダベスト条約）に従いなされた。これは受託日から
30年間の生存能力を有する培養物の維持を保証する。こ
れらの生物は、ブダベスト条約の規定に従い、そして関
係する米国特許の発行のとき制限されない入手可能性を
保証する、出願人とATCCとの合意に従い、ATCCにより入
手可能となるであろう。受託された株の入手可能性は、
政府の権力の下でその特許法に従い承認された権利に違
反して、実施のライセンスとして解釈すべきではない。
同等の実施態様 当業者は、ここに記載した発明の特定の実施態様と同
等の多くの実施態様を認識するか、あるいは日常の実験
を越えない実験を使用して確証することができるであろ
う。このような同等の実施態様は次の請求の範囲により
包含されることを意図する。
フロントページの続き (72)発明者 ギルド，ブレイドン シー. アメリカ合衆国，マサチューセッツ 01742，コンコード，リバーデイル ロ ード 109 (72)発明者 ラフィールド，ロリ エフ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94123，サン フランシスコ，＃５，ビ ーチ ストリート 2249 (72)発明者 コーエン，ローレンス ケー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94611，オークランド，キャボット ド ライブ 5670 (72)発明者 ロビンズ，ポール アメリカ合衆国，ペンシルバニア 15216，マウント ゼバノン，オーバー ルック ドライブ 527 (72)発明者 ミュリガン，リチャード シー. アメリカ合衆国，マサチューセッツ 02138，ケンブリッジ，フランクリン ストリート 441 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA C12N 5/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】下記の構造： を有し、hGH挿入部を含まないレトロウイルスベクタ
    ー。
  2. 【請求項２】前記ベクターが、その挿入部位に挿入され
    た発現のための遺伝子をさらに含む、請求項１に記載の
    レトロウイルスベクター。
  3. 【請求項３】前記発現のための遺伝子が、ホルモン、酵
    素、レセプターおよび薬物から成る群から選択される物
    質をコードする、請求項２に記載のレトロウイルスベク
    ター。
  4. 【請求項４】前記遺伝子が、因子VIIIまたはtPAをコー
    ドする、請求項２に記載のレトロウイルスベクター。
  5. 【請求項５】前記ベクターが、ATCC 68,754の同定特性
    を有するMFGである、請求項１に記載のレトロウイルス
    ベクター。
  6. 【請求項６】前記ベクターが、その挿入部位に挿入され
    た発現のための遺伝子をさらに含む、請求項５に記載の
    レトロウイルスベクター。
  7. 【請求項７】前記遺伝子が、ホルモン、酵素、レセプタ
    ーおよび薬物から成る群から選択される物質をコードす
    る、請求項６に記載のレトロウイルスベクター。
  8. 【請求項８】前記遺伝子が、因子VIII又はtPAをコード
    する、請求項６に記載のレトロウイルスベクター。
  9. 【請求項９】請求項１〜８のいずれか１項に記載のレト
    ロウイルスベクターによりトランスデュースされたパッ
    ケージ用細胞系。
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