DE69128893T2

DE69128893T2 - Genetische veränderung von endothelzellen

Info

Publication number: DE69128893T2
Application number: DE69128893T
Authority: DE
Inventors: Louis Birinyi; Allan Callow; Lawrence Cohen; Richard Mulligan; Lori Rafield; James Wilson
Original assignee: New England Medical Center Hospitals Inc; Brigham and Womens Hospital Inc; Whitehead Institute for Biomedical Research; Howard Hughes Medical Institute; Cell Genesys Inc
Current assignee: Cell Genesys Inc
Priority date: 1990-10-31
Filing date: 1991-10-31
Publication date: 1998-09-10
Anticipated expiration: 2011-11-01
Also published as: DE69123981T3; WO1992007573A1; ATE147102T1; ES2096750T3; EP0556345A4; EP0556345B2; DE69128893D1; WO1992007943A1; JPH07503121A; CA2095153C; JPH06503968A; EP0556345B1; EP0556345A1; AU656544B2; JP3418982B2; EP0568537A1; EP0568537A4; EP0568537B1; DE69123981T2; CA2095153A1

Description

Sponsoren

Hierin beschriebene Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Institutes of Health, des Howard Hughes Medical Institute und des Whitehead Institute for Biomedical Research unterstützt.

Grundlagen

Das Endothel ist eine einzelne Schicht abgeflachter, transparenter Zellen, deren Ränder miteinander verbunden sind und als Ergebnis eine Zellmembran bilden. Endothelzellen entstehen während der Entwicklung aus dem embryonalen Mesoblast oder Mesoderm. Sie kommen auf den freien Oberflächen seröser Membranen vor, in der vorderen Augenkammer und auf der Oberfläche des Gehirns und des Rückenmarks. Zusätzlich bilden sie die auskleidende Membran des Herzens, der Blutgefäße und der Lymphgefäße.
Durch die Verwendung von in vergangenen Jahren entwickelter Verfahren ist es möglich, genetische Rekombination zwischen Spezies zu erzielen. Aus unter schiedlichen biologischen Klassen stammende Gene besitzen die Fähigkeit zu replizieren und in einem ausgewählten Mikroorganismus exprimiert zu werden. Deshalb ist es möglich durch Kopplung der Gene an ein besonderes virales oder Plasmid Replicon, Gene in einen ausgewählten Mikroorganismus einzuführen, die eine für eine andere Organismusklasse charakteristische metabolische oder synthetische Funktion spezifizieren (z.B. Hormonsynthese, Proteinsynthese, Stickstoff-Fixierung).
Seit Ende der späten 70er sind Fortschritte in der Entwicklung allgemeiner Verfahren zur Einführung klonierter DNS Sequenzen in Säugerzellen gemacht worden. Dennoch gibt es gegenwärtig einen Bedarf eines effektiven Verfahrens zur stabilen Einführung von ausgewähltem genetischen Material von Interesse in Endothelzellen und diese zu befähigen, dies zu exprimieren, und somit das codierte Protein oder Polypeptid herzustellen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die hierin beschriebene Erfindung bezieht sich auf den in den Ansprüchen dargelegten Inhalt.
Endothelzellen dieser Erfindung besitzen in sich genetisches Material von Interesse stabil inkorporiert, das ein Produkt codiert (z.B. ein Protein, Polypeptid oder funktionelle RNS), desses Herstellung in den Endothelzellen erwünscht ist. Die veränderten Endothelzellen exprimieren das inkorporierte genetische Material (stellen das codierte Produkt her). Dieses genetische Material von Interesse wird hierin als inkorporiertes genetisches Material bezeichnet. Das inkorporierte genetische Material kann jede beliebige ausgewählte DNS von Interesse (z.B. alles oder ein Teil eines ein Produkt von Interesse codierendes Gen) oder RNS von Interesse sein. Es kann zum Beispiel vorhandene DNS oder RNS sein, die in normalen Endothelzellen vorliegt und von diesen exprimiert wird; DNS oder RNS, die normalerweise nicht in Endothelzellen vorkommt; DNS oder RNS, die normalerweise in Endothelzellen vorkommt, aber in diesen nicht Mengen exprimiert wird, die biologisch signifikant sind (d.h. Mengen, die ausreichen, um die normalen physiologischen wirkungen des Proteins oder des Polypeptides, das es codiert, herzustellen); DNS oder RNS, die in Endothelzellen vorkommt und verändert worden ist, so daß sie in Endothelzellen exprimiert wird; und jede beliebige DNS oder RNS, die verändert werden kann, um in Endothelzellen exprimiert zu werden, alleine oder in jeglicher Kombination davon. Endothelzellen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls einen selektierbaren Marker codierendes genetisches Material exprimieren, und somit ein Mittel zur Verfügung stellen, mit dessen Hilfe Zellen identifiziert und für in vitro ausgewählt werden können, die das inkorporierte genetische Material exprimieren. Inkorporiertes genetisches Material enthaltenende Endothelzellen werden als transduzierte Endothelzellen bezeichnet.
Insbesondere sind retrovirale Vektoren verwendet worden, um Endothelzellen mit genetischem Material stabil zu transduzieren, einschließlich genetischem Material das ein Polypeptid oder Protein von Interesse codiert, das normalerweise nicht in biologisch signifikanten Mengen in Endothelzellen exprimiert wird. Das auf diese Weise eingeführte genetische Material kann auch genetisches Material umfassen, das einen dominanten selektierbaren Marker codiert. Genetisches Material einschließlich ein Polypeptid von Interesse allein codierende DNS und ein Polypeptid von Interesse und einen dominanten selektierbaren Marker codierende DNS ist in kultivierte Endothelzellen eingeführt worden. Die Expression dieser Gene durch die Endothelzellen, in die diese inkorporiert worden sind (d.h. durch die Verwendung retroviraler Vektoren transduzierte Endothelzellen), ist ebenfalls gezeigt worden.
Da Gene in Endothelzellen unter Verwendung eines retroviralen Vektors eingeführt werden können, können sie unter (abhängig von) retroviraler Vektorkontrolle sein. In einem solchen Fall wird das Gen von Interesse von einejn retroviralen Promotor aus transcribiert. Wahlweise können retrovirale Vektoren mit zusätzlichen Promotorelementen verwendet werden (zusätzlich zum im rekombinanten Retrovirus inkorporierten Promotor), die verantwortlich für die Transcription des genetischen Materials von Interesse sind. Zum Beispiel kann ein Konstrukt verwendet werden, in dem ein zusätzlicher Promotor durch einen externen Faktor oder Reiz beeinflußt wird, und die Kontrolle des Polypeptidgehaltes ermöglicht, der von durch diesen externen Faktor oder Reiz aktivierte Endothelzellen hergestellt wurde. Zum Beispiel sind Hitzeschock-Proteine Proteine, die von Genen codiert werden, bei denen der Promotor durch Temperatur reguliert wird. Der Promotor des Gens, das das Metall-enthaltende Protein Metallothionein codiert, reagiert auf Cadmium (Cd++) Ionen. Inkorporation dieses Promotors oder anderer durch externe Reize beeinflußte Promotoren, macht es möglich, die Polypeptid-Produktion durch bearbeitete Endothelzellen zu regulieren.
Endothelzellen können auf zwei allgemeine Weisen ui vitro oder in vivo transduziert werden. Beide Arten erfordern die Verwendung eines Verfahrens für den Transfer genetischen Materials von Interesse in Endothelzellen, wie zum Beispiel durch die Verwendung eines rekombinanten retroviralen Vektors oder eines anderen Vektors. Für in vitro Transduktion werden in Gewebekulturgefäßen angezüchtete Endothelzellen einem Vektor, wie zum Beispiel einem rekombinanten das genetische Material von Interesse codierendes Retrovirus, ausgesetzt, und dadurch transduzierte Endothelzellen hergestellt. Mit dem genetischen Material in vitro transduzierte Endothelzellen werden dann unter Verwendung von einem einer Vielzahl bekannter Verfahren transplantiert. Solche Verfahren umfassen, sind aber nicht begrenzt auf, Transplantation synthetischer Gefäße oder prothetischer Klappen, die mit transduzierten Endothelzellen ausgekleidet sind, oder die Transplantation einer zur Beherbergung transduzierter Endothelzellen entworfenen Vorrichtung oder Matrix. Wahlweise kann die Transduktion in vivo durch Appuzieren des Verfahrens für den Transfer genetischen Materials von Interesse auf Endothelzellen in einem Gewebe oder Organ durchgeführt werden. Für in vivo Transduktion werden in einem Gewebe oder Organ anwesende Endothelzellen zum Beispiel einem genetisches Material von Interesse codierenden, rekombinanten Virus ausgesetzt. Solche Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf die ortsgerichtete Verabreichung eines rekombinanten Retrovirus in ein spezifisches Organ, Extremität oder Blutgefäß (z.B. via einem Katheter). Anders als bei in vitro transduzierten Endothelzellen würden diese in vivo transduzierten Endothel zellen keine Verfahren für ihre nachfolgende Transplantation erfordern.
Die Endothelzellen der Erfindung sind insbesondere zur Verbesserung prothetischer Implantate nützlich (z.B. aus synthetischen Materialien wie zum Beispiel Dacron oder Gortex bestehende Gefäße), die in der vasculären rekonstruktiven Chirugie verwendet werden. Zum Beispiel werden prothetische arterielle Transplantate verwendet, um krankhafte Arterien zu ersetzen, die vitale Organe oder Extremitäten durchströmen. Dennoch sind die gegenwärtig erhältlichen Transplantate gewöhnlich aus synthetischem Material hergestellt und neigen zu vielen Komplikationen, von denen die Schlimmste eine hohe Restenose- oder Okklusionsrate darstellt. Tierversuche lassen vermuten, daß das Auskleiden des Transpiantates mit autologen Endothelzellen vor der Implantation Transplantat-Reokklusion mit dessen begleitenden morbiden Folgen verringern, aber nicht verhindern kann.
Dennoch können Endothelzellen gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung in einer Weise verändert werden, daß ihre Leistung im Zusammenhang mit einem implantierten Transplantat verbessert wird. Beispiele umfassen Sekretion oder Expression eines thrombolytischen Agens, um intraluminale Gerinnselbildung, Sekretion eines Inhibitors glatter Muskelproliferation zu verhindern, um durch glatte Muskelhypertrophie verursachte luminale Stenose zu verhindern und Expression und/oder Sekretion eines Endothelzell-Mitogens oder autokrinen Faktors, um Endothelzell-Proliferation zu stimulieren und den Ausmaß oder die Dauer des Auskleidens der Innenfläche des Transplantates mit Endothelzellen zu verbessern.
In einer ähnlichen Anwendung können Endothelzellen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um die Oberfläche prothetischer Herzklappen zu bedecken, um das Risiko der Emboliebildung durch eine weniger thrombogene Gestaltung der Klappenoberfläche zu erniedrigen.
Durch das Verfahren der betreffenden Erfindung transduzierte Endothelzellen oder ein mit transduzierten Endothelzellen ausgekleidetes Gefäßimplantat können ebenfalls verwendet werden, um eine konstitutive Synthese und Lieferung von Polypeptiden oder Proteinen zur Verfügung zu stellen, die nützlich in der Vorbeugung und Behandlung von Erkrankungen sind. Auf diese Weise wird das Polypeptid direkt in den Blutkreislauf des Individuums sezerniert. Im Gegensatz dazu schließen gegenwärtig verfügbare Verfahren parenterale Verabreichung des gewünschten Polypeptides ein.
Zusätzlich gibt es keine Erfordernis für eine extensive (und oftmals kostspielige) Reinigung des Polypeptides vor dessen Verabreichung an ein Individuum, wie es im allgemeinen bei einem isolierten Polypeptid (z.B. Insulin) notwendig ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung veränderte Endothelzellen stellen das Polypeptid-Hormon her, wie es normalerweise hergestellt werden würde.
Ein weiterer Vorteil der Verwendung gentechnisch veränderter Endothelzellen ist, daß man die Bereitstellung therapeutischer Mengen eines sezernierten Produktes an ein spezifisches Organ oder Extremität steuern kann. Zum Beispiel kann ein mit in vitro transduzierten Endothelzellen ausgekleidetes Gefäßimplantat in ein spezifisches Organ oder Extremität implantiert werden; oder die Endothelzellen einer besonderen Extremität, Organs oder Gefäßes können in vivo transduziert werden. Das sezernierte Produkt der transduzierten Endothelzellen wird in hohen Konzentrationen an das durchströmte Gewebe geliefert, wobei eine erwünschte Wirkung an einem gezielten anatomischen Ort erreicht wird. Dieses Produkt wird dann in der venösen Zirkulation während seiner Rückkehr zum Herz bis zu nicht-therapeutischen Mengen verdünnt.
Ein anderer wichtiger Vorteil des Liefersystems dieser Erfindung ist, da es ein kontinuierliches Liefersystem ist, daß die kurzen Halbwertszeiten der Hormon-Polypeptide keine Einschränkung darstellen. Zum Beispiel ist die Halbwertszeit des humanen Wachstumshormons (HGH) ungefähr 19 Minuten und des Parathyroid- Hormons ungefähr 2 1/2 bis 5 Minuten.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Abbildung 1 ist eine schematische Darstellung eines Wildtyp Maus Leukämie Virus (retroviralen) Genoms.
Abbildung 2 ist eine schematische Darstellung retroviraler Vektoren, mit einem in der vorliegenden Erfindung nützlichen, rekombinanten Genom. Abbildung 2a ist pLJ und Abbildung 2b ist pEm, Abbildung 2c ist MFG und Abbildung 2D ist α-SGC.
Abbildung 3 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion eines rekombinanten retroviralen Vektors unter Verwendung des in Abbildung 2a dargestellten pLJ Vektors und des humanen Parathyroid-Hormon Gens.
Abbildung 4 umfaßt Photographien boviner aortaler Endothelzellen, die mit einem Low-Density Lipoprotein- Rezeptor (LDLR) exprimierenden Retrovirus infiziert sind und bezüglich der Aufnahme Fluoreszenz-markiertem LDL untersucht werden. Spur A - nicht-infizierte bovine aortale Endothelzellen unter Phasenkontrast; Spur Bnicht-infizierte bovine aortale Endothelzellen unter Fluoreszenz-Illumination; Spur C - infizierte bovine aortale Endothelzellen unter Phasenkontrast; Spur D - infizierte bovine aortale Endothelzellen unter Fluoreszenz-Illumination.
Abbildung 5 umfaßt Photographien boviner aortaler Endothelzellen, die mit einem beta-Galactosidase exprimierenden Retrovirus infiziert sind, und unter Verwendung einer in situ histochemischen Färbung bezüglich dessen Expression untersucht werden. Spur A - nicht-infizierte bovine aortale Endothelzellen gefärbt bezüglich beta- Galactosidase-Aktivität; Spur B - infizierte nicht-selektierte bovine aortale Endothelzellen gefärbt bezüglich beta-Galactosidase-Aktivität.
Abbildung 6 ist eine illustrierte Darstellung, die die Transplantation genetisch veränderter Endothelzellen in Hunde schildert.
Abbildung 7 ist eine schematische Darstellung der Modifikation des tPA Gens und der verwendeten Oligonucleotide, um die Modifikation zu vereinfachen und der Insertion des veränderten tPA Gens in den in Abbildung 2c beschriebenen Vektor MFG.
Abbildung 8 ist eine Photographie einer durch die Expression des Faktor VII-verwandten Antigens identifizierten Endothelzellenkultur.
Abbildung 9a ist eine Photographie caniner Endothelzellen, die mit einem tPA exprimierenden Retrovirus infiziert sind. Es wird eine dunkle cytoplasmatische Färbung in solchen Zellen, die tPA exprimieren, sichtbar. Abbildung 9b ist eine Photographie von Kontrollzellen, die nicht mit dem tPA Retrovirus infiziert wurden.
Abbildung 10 ist eine Photographie eines Autoradiogramms eines Southern Blots zellulärer genomischer DNS, das die stabile Integration der MFG-tPA und α-SGC- tPA rekombinanten Retroviren in die Endothelzellen zeigt.
Abbildung 11 ist eine Photographie eines Autoradiogramms eines Northern Blots zellulärer RNS, das die Expression der RNSs aus den MFG-tPA und α-SGC-tPA rekombinanten Retroviren zeigt.
Abbildung 12 ist ein Histogramm, das die Wirksamkeit synthetischer, mit genetisch veränderten Endothelzellen ausgekleideten Transplantaten nach Implantation in Hunde tPA zu exprimieren, zeigt.
Abbildung 13a ist ein Diagramm des Faktor VIII Polypeptides. Abbildung 13b ist ein Diagramm der Faktor VIII cDNA, das die Restriktionsenzym Stellen darstellt, die in den verschiedenen Konstrukten verwendet wurden, um den retroviralen Vektor herzustellen. Abbildung 13c ist ein Diagramm des Deletions-Derivates der in den retroviralen Vektor eingefügten Faktor VIII cDNA mit der dele tierten Region als vertikale Linien dargestellt. Abbildung 13d ist ein erweitertes Diagramm der B-Domäne- Deletion zwischen den Hind III und Pst I Stellen. Die Nucleotidsequenz bei der Verbindung der schweren Kette und der leichten Kette ist über der Linie angezeigt und die entsprechenden Aminosäurenummern sind unter der Linie angezeigt.
Abbildung 14 ist ein Diagramm des zusammengefügten endgültigen retroviralen Vektors, MFG-Faktor VIII.
Abbildung 15 ist eine Photographie eines Autoradiogramms eines Southern Blots zellulärer genomischer DNS, das die stabile Integration des MFG-Faktor VIII Retrovirus in Endothelzellen zeigt.
Abbildung 16 ist ein Diagramm des α-SGC-LacZ rekombinanten Retrovirus.
Abbildung 17a ist eine Photographie geringer Vergrößerung einer in vivo mit dem a-SGC-LacZ Retrovirus transduzierten Arterie. Abbildung 17b ist eine Photographie großer Vergrößerung der gleichen. Abbildung 17c ist ein Segment einer nicht-transduzierten Arterie.
Abbildung 18 ist eine Karte des retroviralen Vektors α-SGC.
Abbildung 19 ist eine Karte des retroviralen Vektors MFG.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Es ist genetisches Material von Interesse in Endothelzellen inkorporiert worden und in den resultierenden gentechnisch veränderten Endothelzellen exprimiert worden. Gemäß dem beschriebenen Verfahren kann in Endothelzellen inkorporiertes genetisches Material von Interesse jede beliebig ausgewählte DNS von Interesse sein (z.B. alles oder ein Teil eines Gens, das ein Produkt von Interesse codiert) oder jede beliebig ausgewählte RNS von Interesse. Zum Beispiel kann es DNS oder RNS sein, die in normalen Endothelzellen vorkommt und exprimiert wird; DNS oder RNS, die normalerweise nicht in Endothelzellen vorkommt; DNS oder RNS, die normalerweise in 2-Endothelzellen vorkommt, aber nicht in ihnen in Mengen exprimiert wird, die biologisch signifikant sind (ausreichende Mengen, um den normalen physiologischen Effekt des Von ihr codierten Proteins oder Polypeptids herzustellen); DNS oder RNS, die in Endothelzellen vorkommt und auf eine solche Weise verändert worden ist, daß sie in solchen Zellen exprimiert werden kann; und jede beliebige DNS oder RNS, die verändert werden kann, um in Endothelzellen exprimiert zu werden, alleine oder in jeder beliebigen Kombination davon. Dieses genetische Material von Interesse wird hierin als inkorporiertes genetisches Material bezeichnet.
Endothelzellen der vorliegenden Erfindung exprimieren das inkorporierte genetische Material. Zum Beispiel exprimieren die Endothelzellen der vorliegenden Erfindung genetisches Material, das ein Polypeptid oder ein Protein von Interesse codiert (genetisches Material von Interesse). Endothelzellen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls ein selektierbaren Marker codierendes Gen umfassen und exprimieren. Endothelzellen, die inkorporiertes genetisches Material exprimieren, werden hierin als transduzierte Endothelzellen bezeichnet.
Genetisches Material von Interesse, das aus DNS besteht, die normalerweise in Endothelzellen vorkommt und exprimiert wird, kann in Endothelzellen mit dem Ergebnis inkorporiert werden, daß diese in der Lage sind, das erwünschte Protein, Polypeptid oder RNS zu überproduzieren.
Wie in Detail hierin beschrieben, ist genetisches Material, in Endothelzellen eingeführt worden, indem diese einem Medium, das ein Virus mit rekombinanten Genom enthält, ausgesetzt wurden (d.h. durch deren Infektion). Das verwendete Medium war ein viraler Überstand, der durch Ernten des Mediums, in dem rekombinantes Virus produzierende Zellen angezüchtet worden sind, erhalten wurde. Dies bedeutet, Produzentenzellen sind in Gewebekultur in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium (DME) mit 10% Kälberserum (CS) und Penicilin und Streptomycin bis zu einer konfluenten Dichte angezüchtet worden. Frisches Medium wurde hinzugefügt und nachfolgend (z.B. ungefähr 12 Stunden später) wurde das Medium geerntet. Ungefähr 10 ml des Mediums wurde aus einer 10 cm Platte mit konfluenten Produzentenzellen geerntet. Das geerntete Medium (oder virale Stammkultur) wurde durch einen 0,45 Micron Millipore Filter futriert, um anhaftende Produ zentenzellen zu entfernen, und wurde unmittelbar verwendet, um Zellen zu infizieren oder wurde bei -70ºC gelagert. Von einer subkonfluenten Platte von Endothelzellen (Empfänger-Endothelzellen) wurde Medium entfernt und rasch durch virale Stammkultur (z.B. 5 ml/10 cm Platte), die 8 mcg/ml Polybren (Aldrich) enthielt, ersetzt. Nachfolgend (z.B. 12 Stunden später) wurde diese entfernt und durch frisches Medium ersetzt.
Das rekombinante Genom des infektiösen Virus umfaßt das genetische Material von Interesse, das in Endothelzellen inkorporiert ist. Das rekombinante Genom kann ebenfalls genetisches Material besitzten, das einen dominanten selektierbaren Marker codiert. Wie hierin beschrieben, sind transduzierte Endothelzellen, die ein normalerweise nicht durch solche Zellen exprimiertes Polypeptid in biologisch signifikanten Mengen und wahlweise einen dominanten selektierbaren Marker exprimieren, hergestellt worden.
In einem Fall umfaßte das rekombinante Genom humanes Parathyroid-Hormon (hPTH) codierendes genetisches Material. In einem anderen Fall umfaßte das rekombinante Genom ebenfalls ein einen dominanten selektierbaren Marker codierendes Gen (z.B das neo Gen, das in Bakterien Neomycin-Resistenz und in Säugerzellen G418-Resistenz codiert). Folglich wurden die Endothelzellen transduziert -- das bedeutet, das genetische Material von Interesse (in diesem Fall hPTH und wahlweise das neo Gen codierende DNS) wurde stabil in die Endothelzellen eingeführt. Die transduzierten Endothelzellen exprimieren das codierte hPTH alleine oder zusätzlich zum neo-Resistenzprotein, was Zellen mit einem selektierbaren Merkmal zur Folge hatte.
In einem anderen Fall umfaßte das rekombinante Genom nur das genetische Material von Interesse (z.B. Faktor VIII Gerinnungs-Protein oder Gewebe-Plasminogen- Aktivator (tPA) und kein dominanten selektierbaren Marker codierendes Gen (z.B. neo Gen). Folglich exprimierten die transduzierten Endothelzellen das Faktor VIII Protein oder tPA in Abwesenheit des dominanten selektierbaren Markergens.
Wie unten beschrieben sind Endothelzellen transduziert worden mit Genen, die sezernierte Produkte codieren (z.B: humanes Parathyroid-Hormon (hPTH) (siehe Beispiel 1), Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA) (siehe Beispiel 5) und humanes Gerinnungsfaktor VIII Protein (siehe Beispiel 6); einem Gen, das einen Membranrezeptor codiert (z.B. Low-Density Lipoprotein-Rezeptor (LDLR) (siehe Beispiel 2); und ein Gen, das ein intrazelluläres bakterielles Enzym codiert (z.B. beta-Galactosidase) (siehe Beispiel 3).
Die Transduktion von Endothelzellen kann entweder in vitro oder in vivo durchgeführt werden. Zum Beispiel kann in vivo Transduktion von Endothelzellen unter Verwendung eines rekombinanten Retrovirus durchgeführt werden, das in ein Individuum via ortsgerichtete Verabreichung des rekombinanten Retrovirus in ein spezifisches Organ, Extremität oder Blutgefäß (z.B. via einem Katheter, wie in Beispiel 8 beschrieben) eingeführt wird. Die in vivo Transduktion von Endothelzellen hat mehrere Vorteile, wovon einer das Fehlen der Notwendigkeit eines Verfahrens ist, die transduzierten Endothelzellen zu transplantieren. In vitro transduzierte Endothelzellen werden erst in Gewebekulturgefäßen angezüchtet, aus dem Gewebekulturgefäß entfernt und in den Körper eingeführt oder implantiert.
Invitro transduzierte Endothelzellen können in den Empfänger durch eines mehrerer Verfahren eingeführt werden. Zum Beispiel können transduzierte Endothelzellen auf den Innenraum eines prothetischen Gefäßes ausgesät werden, wo sie dann bis zur Konfluenz, den Innenraum des Gefäßes bedeckend, wachsen werden. Die Zellen bilden die Auskleidung dessen, das als Neointima bezeichnet worden ist, einer gut organisierten Struktur, die dem Intima und Medium eines nativen Gefäßes ähnelt (d.h. eine Endothelzelihülle mit tieferen Schichten aus glatten Muskelzellen). Die Durchführbarkeit dieses Versuches ist durch Experimente gezeigt worden, in denen vasculäre, mit autologen Retrovirus-transduzierten Endothelzellen besäte Transplantate in Hunde implantiert wurden.
Aus ausgewachsenen Mischlingshunden geerntete Vena jugularis externa wurden als Endothelzellen-Quelle verwendet, die in vitro während einer 10-14 tägigen Periode in zwei seriellen Passagen ausplattiert wurden. Zellen aus jedem Tier wurden in zwei Aliquots aufgeteilt und wurden entweder mit einem replikationsdefekten das Reportergen beta-Galactosidase enthaltenen Retrovirus infiziert oder wurden schein-infiziert. Dacron Transplantate geringen Durchmessers wurden bei subkonfluenten Dichten mit Endothelzellen mit Hilfe des autologen Gerinnungs- Verfahrens besät und chirurgisch als caroticus Interpositions-Transpiantat in Hunde implantiert, aus denen die Zellen geerntet wurden; jeder Hund erhielt ein mit genetisch veränderten Zellen besätes Transplantat und ein contralaterales mit schein-infizierten Zellen besätes Transplantat. Fünf Wochen nach Implantation wurden die Transplantate geerntet und untersucht.
Es wurden Zellen aus der Innenraumoberfläche eines Teils des Transpiantates enzymatisch geerntet, um eine detailliertere Chararkterisierung zu zulassen. Primärkulturen der Zellen wurden etabliert und in vitro für ungefähr 2-3 Wochen vor der Untersuchung expandiert. Genetisch veränderte Endothelzellen wurden in dieser Population durch Southern-Analyse und durch den cytochemischen Assay für Vektor-exprimierte beta-Galactosidase, die von dem lacz Gen codiert wird, identifiziert.
Die Mehrheit (weniger als 95%) der von dem Transplantat geernteten und in vitro expandierten Zellen behielten differenzierte Endothelfunktionen bei. Dennoch, der Anteil der Zellen, die viral gesteuerte beta-Galactosidase exprimierten oder provirale Sequenzen enthielten war gleichmäßig 2-10 fach verringert im Vergleich zu Kulturen, die zur Zeit der Aussaat untersucht wurden. Dieser Unterschied wird zum Teil durch die teilweise Wiederbesiedelung der Transplantate mit endogenen Zellen durch Wachstum durch Zwischenräume oder durch die Anastomose verursacht. Die transduzierten Zellen verharrten für mindestens fünf Wochen auf dem Transplantat-Innenraum und das transferrierte Gen funktionierte weiterhin.
Wahlweise können Endothelzellen, die in vitro transduziert worden sind, in vivo durch die Verwendung eines Katheters auf ein Blutgefäß transplantiert werden. Es ist ebenso möglich, transduzierte Endothelzellen in Körperhöhlen einzuführen, die mit serosalen Membranen ausgekleidet sind, wie zum Beispiel die Bauchhöhle, der Pleuraraum und die Perikardhöhle. In diesem Fall besäen die Endothelzellen die serolsale Auskleidung und sezernieren das Produkt in die Höhle. Das Produkt wird dann via dem lymphatischen System absorbiert.

Isolierung von Endothelzellen

Die Isolierung und Halten von Endothelzellen aus Kapillaren und großen Gefäßen (z.B. Arterien, Venen) vieler Vertebraten-Spezies ist in der Literatur gut beschrieben worden. Zum Beispiel beschreiben Mcguire und Orkin ein einfaches Verfahren der Kultivierung und der Passage von Endothelzellen aus großen Gefäßen kleiner Tiere. McGuire, R.W. und R.W. Orkin, Biotechnipues, 5: 546-554 (1987).
Häufig ist Kälber-Aorta die Quelle der Endothelzellen. Ein typisches Protokoll für die Endothelzellen- Isolierung aus einer großen Arterie wird unten beschrieben. Sektionen frisch geernteter Aorten werden unter sterilen Bedingungen in eine Kollagenase enthaltende Lösung (z.B. 0,5 mg/ml) für 15-20 Minuten bei 37ºC gehalten. Die Aorten werden dann zwei Mal mit Gewebekulturmedium (z.B. RPMI 1640) gewaschen und die innere Endothelzellschicht wird in Vollständiges Medium (15 mm Hepes, pH 7,4, Penicillin/Streptomycin und 20% fetales Kälberserum enthaltendes RPMI) durch leichtes Schütteln aufgenommen, gemäß dem Verfahren nach Booyse et al. Booyse, F.M. et al., Thormbosis Diath, Haemorrh., 34: 825-839 (1975). Die Zellhäufchen werden im kompletten Medium in Gewebekulturflaschen überführt.
Die Zellen teilen sich und bedecken schließlich die Platte; wenn die Platte konfluent ist, können die Zellen unter Verwendung der Standard-Gewebekultur-Verfahren passagiert werden. Die Reinheit der Kulturen wird durch Aufnahme Fluoreszenz-markierten acetylierten LDL bewertet, das spezifisch von Endothelzellen aufgenommen wird. Wenn die Kulturen nicht rein sind (d.h. verunreinigt mit anderen Zellen als Endothelzellen, wie zum Beispiel glatte Muskelzellen oder Fibroblasten), werden Endothelzellen durch Grenzverdünnung kloniert und expandiert, um reine Kulturen zu erhalten. Die Lebensdauer der Endothelzellen in Kultur ist begrenzt, varruert aber beachtlich in Abhängigkeit von der anatomischen Quelle und Donortier. Bovine aortale Endothelzellen sind für mindestens 15-20 Passagen in Kultur gehalten worden.
Canine Endothelzellen können aus expiantierten Segmenten der Vena jugular externa isoliert werden, und humane Zellen aus Segmenten von entweder den umbilakalen oder Saphena-Venen. Alle Zellen können von der Gefäßwand durch publizierte Verfahren mit beteiligter Kollagenase Behandlung befreit werden, was reproduzierbar reine Kulturen humaner Endothelzellen hervorbringt, was aber gemischte Kulturen glatter Muskel- und Endothelzellen aus caninen Venen herstellen kann (Hunter, T.J. et al.. Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 29: 177-182 (1983); Watkins, M.T. et al., J. Surg. Res.. 36: 588-596, (1984). Um das Potential der Überwucherung mit glatten Muskelzellen zu begrenzen, können die caninen Endothelzellen in aus Serum abstammendes Plasma kultiviert werden, ein in glatten Muskelzell-Mitogenen niedriger Medienzusatz. Alle Kulturen können durch immunhistochemische Verfahren überwacht werden, die glatte Muskelzellen mit einem monoklonalen Antikörper identifizieren, der Muskel-spezifische Aktin-Isoformen erkennt, und Endothelzellen mit einem Antiserum, das Faktor VIII verwandtes Antigen erkennt (Wagner, D.D., et al.. J. Cell Biol. 95: 355-360, 1982), als auch wie oben diskutiert mit markiertem acetylierten LDL.

Retrovirale Vektoren

Retroviren sind RNS Viren; das bedeutet, das virale Genom ist RNS. Diese genomische RNS wird trotzdem revers transcribiert in eine DNS Kopie, die stabil und effizient in die chromosomale DNS transduzierter Zellen integriert wird. Diese stabil integrierte DNS Kopie wird als Provirus bezeichnet und wird an Tochterzellen wie jedes andere Gen vererbt. Wie in Abbildung 1 gezeigt, besitzen das Wildtyp retrovirale Genoiu und die provirale DNS drei Gene: Das -gag, das pol und das env, die von zwei langen terminalen Wiederholungssequnzen (LTR) flankiert sind. Das gag Gen codiert die inneren strukturellen (Nucleokapsid) Proteine; das pol Gen codiert die RNS-abhängige DNS Polymerase (reverse Transcriptase) und das env Gen codiert virale Hüllglycoproteine. Die 5 und 3 LTRs dienen die Transcription und Polyadenylierung der Virion RNSs zu fördern.
An die 5' LTR sind Sequenzen benachbart, die notwendig für die reverse Transcription des Genoms (die tRNS Primer-Bindestelle) und für effiziente Einkapselung der viralen RNS in Partikel (die Psi-Stelle) sind. Mulligan, R.C., In: Experimental Manipulation of Gene Expression. M. Inouye (ed), 155-173 (1983); Mann, R., et al., Cell, 33: 153-159 (1983); Cone, R.D. und R.C. Mulligan, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 81: 6349-6353 (1984).
Wenn die für die Einkapselung (oder Verpackung der retroviralen RNS in infektiöse Virionen) notwendigen Sequenzen im viralen Genom fehlen, ist das Resultat ein cis-wirkender Defekt, der die Einkapselung der genomischen RNS verhindert. Dennoch ist die resultierende Mutante immernoch in der Lage, die Synthese aller Virionproteine zu steuern. Muilligan und Mitarbeiter haben retrovirale Genome beschrieben, aus denen diese Psi- Sequenzen deletiert worden sind, als auch das mutante Genom stabil in das Chromosom integriert enthaltende Zellinien. Mulligan, R.C., In: Experimental Manipulation of Gene Exdression. M. Inouye (ed), 155-173 (1983); Mann, R., et al.. Cell, 33: 153-159 (1983); Cone, R.D. und R.C. Mulligan, Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A., 81: 6349-6353 (1984). Das Wesenliche dieser Veröffentlichungen gilt durch die Referenzen als eingefügt.
Wie von Mulligan und Mitarbeitern beschrieben, wurde die Psi 2 Zellinie auf die folgende Weise konstruiert: es wurde ein mutantes Maus Leukämie Virus (MuLV) Genom konstruiert, in dem der Bereich oder das Genom, das an der Einkapselung der viralen RNS in Virionen beteiligt ist, deletiert (die Psi-Sequenzen in Abbildung 1) ist. Dieses Genom wurde stabil in NIH3T3 Zellen durch DNS Kotransfektion eingeführt, und stabile Transfektanten, die alle viralen für die Einkapselung verwendeten Proteine herstellten, und sogar knospende nicht-infektiöse Partikel wurden isoliert. Die MuLV Mutante wurde konstruiert durch Deletion von 351 Nucleotiden eines infektiösen proviralen DNS Klons, zwischen der putativen env mRNS 5' Speißstelle und dem AUG, das die codierende Sequenz für Pr 65 gag initiiert. Die Deletion wurde von einer Bal I Stelle zu einer Pst I Stelle geschaffen und eine HindIII Stelle wurde am Deletionsort erzeugt.
pMOV. (pMOVPsi) wurde wie folgt konstruiert: Drei gereinigte DNS Fragmente wurden zusammen ligiert, um pMOV Psi- zu konstruieren. Das erste wurde durch vollständigen Verdau von pMOV Psi+ mit Xho I, gefolgt von einem partiellen Verdau mit EcoRI, erhalten. Chumakov, I. et al., Journal of Virology, 42: 1088-1098 (1982). Das von der Xho I Stelle bei 2,0 U in MuLV durch die 3' LTR, 3' Maus flankierende Sequenz, alles von pBR322 reichende und bei der EcoRI Stelle endende Fragment wurde aus einem Agarosegel nach elektrophoretischer Auftrennung gereinigt. Vogelstein, B. und D. Gillespie, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 761: 615-619 (1979). Das zweite Fragment wurde durch den vollständigen Verdau von pMOV Psi+ mit Bal I erhalten, gefolgt von der Reinigung des Fragmentes, das sich von der Bal I Stelle in pBR322 durch die 5' Maus flankierende Sequenz und 5' LTR bis zur Bal I Stelle bei 0,7 U von MuLV erstreckt. HindIII Linker (Collaborative Research) wurden dann mit T4 DNS Ligase an dieses Fragment an stumpfe Enden ligiert, und das Fragment wurde mit einem HindIII und EcoRI Überschuß verdaut. Das LTR-enthaltende Fragment wurde aus einem Agarosegel nach elektrophoretischer Auftrennung gereinigt. Das dritte in der endgültigen Ligationsreaktion vorkommende Fragment wurde aus pSV2gag/pol erhalten, wo die gag/pol Region von MuLV in pSV2 subkioniert worden war. Mulligan, R.C. und P. Berg, Science, 209: 1422-1427 (1980). pSV2- gag/pol wurde mit Xho I und HindIII vollständig verdaut, und das sich von der HindIII Stelle (hergestellt aus der Pst I Stelle bei 1,0 U von MuLV) bis zur Xho 1 Stelle bei 2,0 U von MuLV erstreckende Fragment wurde nach elektrophoretischer Auftrennung aus einem Agarosegel gereinigt. Diese drei DNS Fragmente wurden dann in äquimolaren Mengen bei einer Gesammt-DNS Konzentration von 50 ug/ml vermischt. In Ligasepuffer (50 mM Tris-HCL [pH 7,8), 10 mM MgCl&sub2;, 20 mM Dithiothreitol, 1,0 mM ATP, 50 ug/ml bovines Serumalbumin) und mit T4 DNS Ligase für 18 Std. bei 15ºC inkubiert. E.coli HB101 wurde mit der ligierten DNS transfiziert und Ampicillin-resistente Mutanten wurden gewonnen. Die gewonnene Plasmid DNS einiger Transformanten wurde bezüglich der gewünschten Struktur durch Verdau mit geeigneten Restriktionsendonucleasen und Agarosegel-Elektrophorese durchsucht. Davis, R.W. et al., Methods in Enzymology, 65: 404-411 (1980).
Es wurden Zellinien, die die Psi-Mutante stabil in das Chromosom integriert enthalten, durch Kotransfektion von pMOV-Psi und pSV2gpt, einem zur XG PRT Expression fähigen SV40 Hybrid-Vektor, hergestellt. Mulligan, R.C. und P. Berg, Science, 209: 1422-1427 (1980). Auf diese Art gewonnene Zellen aus gpt+ Kolonien wurden kloniert und in drei Linien etabliert: Psi-1, Psi-2 und Psi-3.
Die von Mulligan und Mitarbeitern beschriebene Psi 2 Zellinie wurde durch Transfektion von NIH 3T3 Endothelzellen mit pMOV-Psi, das ein ecotroper Moloney Maus Leukämie Virus (Mo-MuLV) Klon ist, erzeugt. pMOV-Psi exprimiert alle viralen Genprodukte, hat aber nicht die Psi Sequenz, die für die Einkapselung des viralen Genoms notwendig ist. pMOV-Psi- exprimiert ein ecotropes virales Hüllglycoprotein, das einen Rezeptor, der nur auf Maus(und nahe verwandten Nager-) Zellen vorhanden ist, erkennt.
Eine andere Zellinie ist die Psi am Linie, die Psi- 2-ähnliche Verpackungszellinien sind. Diese Psi-am Zellinien enthalten ein verändertes pMOV-Psi-Genom, in dem das ecotrope Hüllglycoprotein durch Hüll-Sequenzen ersetzt worden ist, die aus dem amphotropen Virus 4070A stammen. Hartley, J.W. und W.P. Rowe, Journal of Virology: 19-25 (1976). Folglich sind sie für die Herstellung eines rekombinanten Virus mit amphotropem Wirtsbereich nützlich. Das zur Herstellung der Psi am Zellinie verwendete Retrovirus hat einen sehr breiten Säuger-Wirtsbereich (einen amphotropen Wirtsbereich) und kann verwendet werden, humane Zellen zu infizieren. Wenn das rekombinante Genom die Psi-Verpackungssequenzen enthält, ist die Psi-am Zellinie fähig, rekombinante retrovirale Genome in infektiöse retrovirale Partikel zu verpacken. Cone, R. und Mulligan, R.C. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 81: 6349-6353 (1984).
Zwei andere Verpackungszellinien sind als Psi CRIP und Psi CRE bekannt. Es ist gezeigt worden, daß diese Zellinien nützlich für die Isolierung von Klonen sind, die stabil hohe Titer an rekombinanten Retroviren mit amphotropen und beziehungsweise ecotropen Wirtsbereichen stabil herstellen. Diese Zellinien werden beschrieben in Danos, O. und R.C. Mulligan, Proceedings of the National Academv of Sciences. USA, 85: 6460-6464 (1988) und in U.S. Patentanmeldung Seriennummer 07/239,545 eingereicht am 1. September 1988. Das Wesentliche dieser Referenz und der Patentanmeldung gilt durch die Referenz als eingefügt. Psi CRIP und Psi CRE sind in der American Type Culture Collection, Rockeville, MD, unter den Hinterlegungsnummern CRL 9808 und beziehungsweise CRL 9807 abgelegt worden, unter den Bedingungen des Vertrags von Budapest.
Das wildtyp retrovirale Genom ist von Cone und Mulligan für die Verwendung als ein Vektor mit der Fähigkeit neue Gene in Zellen einzuführen, verändert worden. Wie in Abbildung 2 gezeigt, sind die pol und die env Gene entfernt worden, und ein neo Gen codierendes DNS Segment ist an ihrer Stelle eingefügt worden. Das neo Gen dient als ein dominanter selektierbarer Marker. Die retroviralen Sequenzen, die Teil des rekombinanten Genoms bleiben, umfassen die LTRs, die tRNS Bindestelle und die Psi-Verpackungsstelle. Cepko, C. et al.. Cell, 37: 1053- 1062 (1984).
Zusätzliche Vektor-Konstruktionen, die zur Herstellung transduzierter Endothelzellen der vorliegenden Erfindung verwendet worden sind, werden in Abbildung 2 dargestellt und sind im Detail unten beschrieben.
pLJ. Die Charakteristiken dieses Vektors sind in Korman, A.J. et al. Proceedings of the National Academv of Sciences, USA. 84: 2150 (1987) beschrieben worden. Dieser Vektor ist in der Lage, zwei Gene zu exprimieren: das Gen von Interesse und einen dominanten selektierbaren Marker, wie zum Beispiel das neo Gen. Das Gen von Interesse wird in direkter Orientierung in eine BamHI/SmaI/SalI Klonierungsstelle, gerade distal zu einer LTR, kloniert, während das neo Gen distal zu einem internen Promotor (aus 5V40) positioniert wird, der weiter 3' als die Klonierungsstelle ist (befindet sich 3' von der Klonierungsstelle). Transcription von PLJ wird an zwei Stellen initiiert: 1) die 5' LTR, die für die Expression des Gens von Interesse verantwortlich ist und 2) der interne SV40 Promotor, der für die Expression des neo Gens verantwortlich ist. Die Struktur von pLJ ist in Abbildung 2a dargestellt.
Vektor pLJ ist in Abbildung 2a dargestellt. In pLJ ist das genetische Material von Interesse der 5 LTR folgend eingefügt. Expression dieses genetischen Materials wird von der LTR aus transcribiert, und Expression des neo Gens wird von einem internen SV40 Promotor aus transcribiert.
pEM. In diesem einfachen Vektor wird die gesammte codierende Sequenz für gag, pol und env des Wildtyp Virus durch das Gen von Interesse ersetzt, das das einzige exprimierte Gen ist. Die Komponenten des pem Vektors werden unten beschrieben. Die 5' flankierende Sequenz, 5' LTR und 400 bp der angrenzenden Sequenz (bis zur BamHI Stelle) ist aus pZIP. Die 3' flankierende Sequenz und LTR sind ebenfalls aus pZIP. Dennoch ist die dal Stelle 150 bp stromaufwärts von der 3' LTR mit synthetischen BamHI Linkem ligiert worden und bildet die andere Hälfte der im Vektor vorhandenen BamHI Klonierungsstelle. Das HindIII/EcoRI Fragment von pBR322 bildet das Rückgrat des Plasmids. Dieser Vektor stammt von Sequenzen ab, die von einem Moloney Maus Leukämie Virus Stamm kloniert wurden. Ein analoger Vektor ist von Sequenzen konstruiert worden, die von dem myeloproliferativen Sarcoma Virus abstammen. Die Struktur von pem wird in Abbildung 2b dargestellt.
Vektoren ohne einen selektierbaren Marker können ebenfalls verwendet werden, um Endothelzellen mit genetischem Material von Interesse zu transduzieren. Solche Vektoren sind im Grunde Vereinfachungen der kürzlich beschriebenen Vektoren, in denen ein solcher Marker ist. Vektor pem wird in Abbildung 2b dargestellt; wie dargestellt, sind die Hauptkomponenten des Vektors die 5' und 3' LTR und das genetische Material von Interesse eingefügt zwischen den beiden LTRs.

MFG

Der MFG Vektor (ATCC Hinterlegungsnr. 68754) ähnelt dem pEm Vektor, enthält aber 1038 Basenpaare der gag Sequenz aus MMLV, um die Einkapselung der rekombinanten Genome in den Verpackungszellinien zu erhöhen, und 350 aus MOV-9 stammende Basenpaare, der die Speißakzeptor- Sequenz und den Transcriptionsstart enthält. Ein 18 Basenpaar NcoI und BamHI Stellen enthaltendes Oligonucleotid folgt direkt der MOV-9 Sequenz und erlaubt die bequeme Insertion von Genen mit kompatiblen Stellen. Die MMLV LTR kontrollieren Transcription und die resultierende mRNS enthält den authentischen 5' untranslatierten Bereich des nativen gag Transcriptes, direkt gefolgt von dem offenen Leserahmen des eingefügten Gens. Die Struktur von MFG wird in Abbildung 2c dargestellt. Eine detailliertere Karte von MFG wird in Abbildung 19 bereitgestellt.
MFG wurde durch Ligation des 5' LTR enthaltenden XhoI/NdeI Fragments des half-GAG retroviralen Vektors (half-GAG wird beschrieben in Bender, et al.. J. Virol. 61: 1639-1646) an ein XhoI/BamHI H4 Histon Promotor Fragment konstruiert. Der retrovirale Vektor PEMB wurde mit NdeI und BamHI verdaut, und das 3' LTR enthaltende Fragment wurde an das bereits an das H4 Fragment ligierte half-GAG Fragment ligiert, um einen intermediären Retrovirus Vektor herzustellen, der 2 LTRs in der richtigen Orientierung enthält und ebenfalls das H4 Fragment innerhalb des viralen Teils des Vektors enthält. Der intermediäre Vektor wurde dann durch Verdau mit NdeI lineansiert und die NdeI Stelle im pB322 Teil des Vektors wurde durch Polymerase aufgefüllt und durch Ligation zerstört. Der Vektor wurde anschließend mit XhoI verdaut und die XhoI Stelle wurde an einen NdeI Linker gekoppelt. Der Vektor wurde anschließend mit BamHI gespalten und das große Fragment, das beide LTRs und die pBR322 Sequenz enthielt, wurde gereinigt.
Ein Linker mit XhoI und BamHI mit der folgenden Sequenz: wurde synthetisiert und sowohl an die BamHI Stelle an dem gereinigten intermediären Vektor und an ein NdeI/XbaI Fragment aus pMOV9 (welches eine Spleißakzeptor-Stelle nahe dem NdeI Ende enthält) ligiert, um einen zirkulären Vektor zu bilden, MFG wie in Abbildungen 2c und 19 veranschaulicht.

αSGC

Der αSGC Vektor (ATCC Hinterlegungsnummer 68755) benutzt transcriptionelle Promotorsequenzen aus dem α- Globin Gen, um die Expression des tPA Gens zu regulieren. Das 600 Basenpaar Fragment, das das Promotorelement umfaßt, enthält zusätzlich die Sequenzen für die transcriptionelle Initiation der 5' untranslatierten Region der authentischen α-Globin mRNS. Ein 360 Basenpaar Fragment, das den transcriptionellen Enhancer aus cytomeglovirus umfaßt, geht dem a-Globin Promotor voraus und wird verwendet, um die Transcription von diesem Element zu verstärken. Zusätzlich ist der MMLV Enhancer aus der 3' LTR deletiert. Diese Deletion wird zu der 5' LTR nach Infektion transferriert und inaktiviert im wesentlichen die transcriptionelle Aktivierungs-Aktivität des Elementes. Die Struktur von α-SGC wird in Abbildung 2d dargestellt.
Eine detailliertere Beschreibung von α-SGC wird in Abbildung 18 bereitgestellt.

Einführung von genetischem Material in Endothelzellen und Bewertung der Expression des genetischen Materials

Das von der Verpackungszellinie hergestellte rekombinante amphotrope Retrovirus wird verwendet, um Endothelzellen zu infizieren. Wie oben beschrieben, kann das rekombinante Genom des amphotropen Retrovirus eine Vielfalt an Komponenten umfassen, ist aber im allgemeinen von zwei LTRs umschlossen, und besitzt an Stelle der gag, der pol und der env Sequenzen eine zweite Promotor sequenz. In manchen Fällen beinhaltet es ebenfalls ein Gen, das einen selektierbaren Marker codiert (z.B. neo).
Virale Stammkulturen, die zur Einführung von genetischem Material von Interesse in Endothelzellen verwendet werden, werden wie oben beschrieben unter Zusatz von 8 Microgramm per Milliliter (mcg/ml) Polybren (Aldrich) geerntet und werden den Endothelzellkulturen zugefügt. Wenn der Virustiter hoch ist (z.B. ungefähr 10&sup6; CFu per ml), werden praktisch alle Endothelzellen infiziert werden, und es wird keine Selektion (z.B. von Endothelzellen, in denen der Vektor, einschließlich des rekombinanten Genoms, eingeführt worden ist) benötigt. Wenn der Titer sehr niedrig ist, dann ist es notwendig, einen retroviralen Vektor zu verwenden, der einen selektierbaren Harker besitzt, wie zum Beispiel neo. Wenn nach Aussetzung mit dem Virus ein selektierbarer Marker verwendet wird, werden die Zellen bis zur Konfluenz angezüchtet, und in selektive Medien aufgeteilt (z.B. Medien, die das Antibiotikum G418 enthalten).
Das neo Gen ist ein vom Transposon Tn5 abstammendes bakterielles Gen, das Neomycin-Resistenz in Bakterien und Resistenz gegen das Antibiotikum G418 in Säugerzellen codiert. Dieses neo Gen verhält sich wie ein dominanter selektierbarer Marker; seine Gegenwart in einer Säugerzelle wandelt die Zelle in eine um, die in Anwesenheit von G418, einem Antibiotikum, das im allgemeinen Zelltod verursacht, wachsen wird. Folglich kann die Anwesenheit dieses Gens in einer Säugerzelle durch Kultivierung der Zellen in Medien, die G418 enthalten, bestimmt werden. Das rekombinante Retrovirus mit diesem rekombinanten Genom wird als das neo Virus bezeichnet.
Die rekombinanten retroviralen Vektoren, mit dem neo Gen haben ebenfalls eine Klonierungsstelle. Folglich kann genetisches Material von Interesse in den in Endothelzellen inkorporierten Vektor eingeführt werden, zusammen mit dem neo Gen und von mit dem rekombinanten Retrovirus transduzierten Endothelzellen (bezeichnet als Endothelzellen mit inkorporiertern genetischen Material) exprimiert werden.
Es sollte möglich sein, praktisch jedes beliebige Gen von Interesse in Endothelzellen mit Hilfe eines retroviralen Vektors zu exprimieren. Es sind retrovirale Vektoren konstruiert worden, die Gene exprimieren, die drei verschiedene Proteinklassen codieren: ein sezerniertes Hormon oder Polypeptid (z.B. hPTH, tPA oder Faktor VIII), einen Membranrezeptor (Rezeptor für LDL, LDLR) und ein intrazelluläres Enzym (beta-Galactosidase).
Effiziente Expression des rekombinanten retroviralen Vektors inkorporiert in Endothelzellen ist gezeigt worden und ist in Detail in den Beispielen beschrieben.

Einführung von genetischem Material. das andere Proteine oder Polypeptide codiert

Gene, die andere Proteine oder Polypeptide codieren, können ebenfalls in Endothelzellen mit Hilfe eines geeigneten retroviralen Vektors eingeführt werden. Zum Beispiel kann ein humanes Wachstumshormon (hGH) codierendes Gen, ein Gerinnungsfaktor IX codierendes Gen oder ein Insulin codierendes Gen in Endothelzellen eingeführt werden. Solche Gene können in Endothelzellen alleine, oder in Kombination mit einem Gen, das einen selektierbaren Marker codiert, wie zum Beispiel das neo Gen, eingeführt werden.
Diese Gene, wie auch andere können in Endothelzellen auf die gleiche Weise, wie oben für das hPTH Gen beschrieben, eingeführt werden und die resultierenden transduzierten Endothelzellen können implantiert werden oder auf eine geeignete Stelle im Körper aufgetragen werden.

Andere Vehikel und Mittel zur Einführung von genetischem Material von Interesse in Endothelzellen

Es ist ebenfalls möglich, andere Vehikel als Retroviren zu verwenden, um Endothelzellen gentechnisch zu bearbeiten oder zu verändern. Genetische Information von Interesse kann in Endothelzellen mittels eines jeden beliebigen Virus eingeführt werden, das das genetische Material von Interesse in solchen Zellen exprimieren kann. Zum Beispiel kann SV40, Herpesvirus, Adenovirus und humaner Papillomavirus für diesen Zweck verwendet werden. Es ist ebenfalls möglich, genetisches Material von Interesse in Endothelzellen auf eine Weise einzuführen, daß es nicht stabil in den Empfängerzellen inkorporiert ist, sondern episomal exprimiert wird (verbleibt distinkt oder getrennt vom Empfängerzell-Genom).
Zusätzlich können chemische oder physikalische Mittel verwendet werden, um genetisches Material von Interesse in Endothelzellen einzuführen. Ein Beispiel eines chemischen Mittels ist das allgemein verwendete Calciumphosphat Transfektions-Verfahren und ein Beispiel für ein physikalisches Mittel ist Elektroporation, wobei die Zellen einer elektrischen Ladung ausgesetzt werden, die den Eintritt von genetischem Material von Interesse in die Zelle ermöglicht.

Verwendungen von Endothelzellen mit inkorporiertem genetischen Material

Verbesserung der Durchführung von Gefäßtransplantaten oder -implantaten

An vielen wichtigen Erkrankungsstadien ist Stenose oder Okklusion von Arterien beteiligt, die vitale Organe versorgen. Der gewöhnlich in solche Erkrankungsstadien am häufigsten mit einbegriffene pathologische Mechanismus ist Atherosklerose. Beispiele umfassen Angina pectoris und durch Koronararterien-Erkrankung verusachten myocardialen Infarkt; transiente ischämische Anfälle und durch zererbrale Gefäßerkrankung verursachte Schlaganfälle, renale vasculäre Hypertonie und schließlich durch renale Arteriostenose verursachtes Nierenversagen; und Claudicatio der unteren Extremitäten, die durch Gefäßerkrankungen der peripheren Arterien verursacht wird und in ihrer schlimmsten Form Amputation zur Folge haben kann. Wenn die Agenzien, die ein Individuum für atheriosklerotische Lesionen anfällig machen, nicht eliminiert werden (z.B. Hypertonie, Zigaretten Rauchen), ist der natürliche Werdegang dieser Erkrankungsstadien gewöhnlich das Fortschreiten der atherioskierotischen Lesionen und resultieren in permanenter Schädigung oder Tod.
Ein akzeptierter und weit verbreiteter therapeutischer Ansatz gegen fortgeschrittene atheriosklerotische Erkrankungen ist es, die Stelle der bedeutesten Stenose der Okklusion mit einem aus synthetischen Material, wie Dacron oder Gortex, hergestellen prothetischen Gefäß zu umgehen. Mehr als 350000 Gefäßtransplantate werden jedes Jahr implantiert. Ein Hauptproblem bei diesem Ansatz ist, daß das prothetische Gefäß extrem thrombogen ist (d.h. ist hat die Neigung, Gerinnsel zu entwickeln), was zu einer sehr hohen Restenose-Rate führt. Es ist möglich gewesen, dieses Problem durch Besäen des Innenraumes des prothetischen Gefäßes mit autologen Endothelzellen zu verringern; mit Endothelzellen ausgekleidete Transplantate sind vermutlich weniger thrombogen. Das bedeutet, daß in diesem Ansatz veränderte Endothelzellen besonders nützlich wären.
Endothelzellen können gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung genetisch verändert werden, um ihre Leistung im Zusammenhang mit einem mit Endothelzellen ausgekleideten prothetischen Implantat zu verbessern.
Existierende Protokolle zur Verwendung von mit Endothelzellen ausgekleideten prothetischen Implantaten sind aufgrund mehrerer signifikanter technologischer Probleme kompliziert, von denen die meisten durch die Verwendung gentechnisch veränderter Endothelzellen bewältigt werden können.
Ein Problem der mit Endothelzellen versehenen Implantate ist, daß der Innenraum prothetischer Gefäße eine durch glatte Muskelzell-Proliferation zwischen der prothesenwand und der Innenraumoberfläche verursachte progressive Verengung durchmacht. Eine Art, wodurch dies verhindert werden kann, ist die Einführung eines Gens in Endothelzellen, das ein Produkt sezerniert, das das Wachstum glatter Muskelzellen inhibiert. Viele Typen autokriner/parakriner Wachstumsfaktoren, die die Proliferation der Mesenchym- und/oder Endothelzellen kontrollieren, sind vor kurzem indentifiziert und ihre Gene kloniert worden. Solche Gene können in Endothelzellen unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung eingeführt werden. Die resultierenden transduzierten Endothelzellen stellen den Zellwachstums- Inhibitor her.
Ein weiteres technisches Problem der Protokolle der mit Endothelzellen versehenen Implantate ist, daß die Binde-(Verkleidungs-) Effizienz der Endothelzellen an das prothetische Transplantat relativ gering ist. Vorhergehende Versuche, dies zu verbessern, sind auf die Veränderung der Zusammensetzung der Transplantatoberfläche ausgerichtet gewesen und waren von begrenztem Erfolg. Unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist es möglich, ein Gen in Endothelzellen einzuführen, das einen Membranrezeptor codiert. Der Innenraum des prothetischen Gefäßes kann dann mit dem Ligand für den Rezeptor beschichtet werden, wodurch die Bindung der Endothelzellen an die Innenraumoberfläche durch die Membranrezeptor/Ligand Interaktion erleichtert wird.
Gentechnisch veränderte Endothelzellen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um die Thrombogenität der mit Endothelzellen ausgekleideten prothetischen Transplantate zu verringern. Es wird angenommen, daß der Mechanismus der Gerinnselbildung Blutplättchenadhesion gefolgt von Fibrinablagerung und Gerinnselvermehrung ist. Dies könnte durch Besäen des Transpiantates mit gentechnisch veränderten Endothelzellen, die ein thrombolytisches Agens sezernieren (z.B. ein Agens, das Gerinnsel auflöst, wie zum Beispiel Gewebe-Plasminogen-Aktivator (TPA) oder Streptokinase), minimiert oder möglicherweise eliminiert werden.

Verwendung veränderter Endothelzellen. um ein Produkt zu einer Extremität oder einem Organ zu liefern

Diese Erfindung kann ebenfalls verwendet werden, um in Endothelzellen Gene einzuführen, die Faktoren sezernieren, die nützlich für die von der Arterie, die die Prothese enthält, durchströmte Extremität oder Organ wären. Zum Beispiel ist ein gewöhnliches klinisches Problem die Gegenwart extensiver Verengungen kleiner Gefäße distal zum Ort des prothetischen Gefäßes. Dies ist charakteristisch für die mit Diabetes mellitus assoziierte Gefäßerkrankung. Revascularisierung größerer Gefäße mit Implantaten führt zur unvollständigen Rekonstitution der Perfusion zur betroffenen Extremität oder Organ.
Eine Art der Förderung des vasculären Flusses zu einem gefährdeten Organ oder Extremität ist das maximale Erweitern aller afferenten Gefäße. Versuche dies mit oralen oder parenteralen Arzneien zu tun, hatten geringen therapeutischen Nutzen zur Folge, begleitet von vielen systemischen Nebenwirkungen. Dies ist zum Teil durch die Tatsache bedingt, daß der Vasodilatator nicht an das passende Gewebe gerichtet wird. Endothelzellen, die bearbeitet wurden, um einen potenten Vasodilatator wie zum Beispiel einen atrialen natriuretischen Faktor, zu sezernieren, ist ein alternativer Versuch. In dieser Anwendung können transduzierte Endothelzellen unmittelbar am betroffenen Organ oder Extremität implantiert oder durch in vivo Transduktion hergestellt werden, und somit folglich im betroffenen Organ oder Extremität sein, das von arteriellem Blut durchströmt wird, das eine sehr hohe Vasodilatatorkonzentration enthält. Dies resultiert in einem Anstieg der gesamten vasculären Perfusion. Dennoch, der Vasodilatator wird nach Rückkehr zum Herz auf nichtpharmakologische Mengen verdünnt und beugt dadurch die vielen systemischen Nebenwirkungen der Vasodilatatoren vor, die bei einer systemischen nicht-selektiven Art der Verabreichung vorkommen.

Verwendung von veränderten Endothelzellen als ein Liefersystem

Die vorliegende Erfindung macht es möglich, Endothelzellen auf eine solchen Weise gentechnisch zu verändern, daß sie ein ausgewähltes Protein oder Polypeptid herstellen, wie zum Beispiel ausgewählte Polypeptide oder Proteine, die normalerweise nicht in biologisch signifikanten Mengen in Endothelzellen hergestellt werden, und diese in den Blutkreislauf oder in einen anderen Körperbereich (z.B. das zentrale Nervensystem) sezernieren. Die auf diese Weise gebildeten Endothelzellen dienen als ein fortlaufendes Medikamenten-Liefersystem, um das gegenwärtige Dosierungsschema zu ersetzen, das eine regelmäßige Verabreichung (durch Injektion, Infusion) der benötigten Substanz erfordert.
Zum Beispiel kann es verwendet werden, um eine fortlaufende Bereitstellung von Insulin zur Verfügung zu stellen, das gegenwärtig aus dem Pankreas isoliert, umfassend gereinigt und dann in deren Körper, deren Insulin-Produktion oder Verwertung beeinträchtigt ist, injeziert werden muß. Auf diese Art kann Insulin in den Körper via einem fortlaufenden Medikamenten-Lierfersystem eingeführt werden, und folglich gäbe es keinen Bedarf an täglichen Insulin-Injektionen.
Gentechnisch veränderte Endothelzellen können ebenfalls zur Herstellung von Gerinnungsfaktoren verwendet werden. Hämophilen fehlt ein als Faktor VIII benanntes Protein, das an der Gerinnung beteiligt ist. Faktor VIII wird jetzt durch Injektion verabreicht. Dennoch, transduzierte Endothelzellen mit Faktor VIII codierenden Genen können Faktor VIII in vivo herstellen und liefern.
Inkorporation von genetischem Material von Interesse in Endothelzellen kann insbesondere wertvoll in der Behandlung von Erbkrankheiten und der Behandlung von erworbenen Krankheiten sein. Im Fall der Erbkrankheiten wird dieser Ansatz verwendet, um genetisch veränderte Endothelzellen und andere Zellen, die als metabolische "Entsorger" verwendet werden können, bereitzustellen. Das bedeutet, solche Endothelzellen wurden zum Abbau einer potentiellen toxischen Substanz dienen, die sich in großen Mengen im Patienten angereichert hat. Zum Beispiel können das Gen Adenosindesaminase codierende transduzierte Endothelzellen in der Behandlung einer vererbbaren Form einer schweren kombinierten Immundefizienz verwendet werden, die durch eine Defizienz im Enzym Adenosindesaminase verursacht wird, was die Anreicherung toxischer Purinnucleoside zur Folge hat. Endothelzellen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in der Behandlung von genetischen Krankheiten verwendet werden, bei denen ein Produkt (z.B. ein Enzym oder Hormon), das normalerweise vom Körper hergestellt wird, nicht hergestellt wird oder in unzureichenden Mengen gemacht wird. Hier können mit einem die fehlende oder inadequat hergestellte Substanz codierenden Gen transduzierte Endothelzellen verwendet werden, um es in ausreichenden Mengen herzustellen. Zum Beispiel kann dies in der Herstellung von alpha-1 Anitrypsin verwendet werden, das fehlende Protein oder mangelhafte Protein ist eine vererbbare Form von Emphysema.
Es gibt viele erworbene Erkrankungen für die eine Behandlung durch Verwendung gentechnisch veränderter Endothelzellen (d.h. mit genetischem Material von Interesse transduzierte Endothelzellen) bereitgestellt werden kann. Zum Beispiel können solche Zellen in der Behandlung von Anämie, die gewöhnlich in chronischen Erkrankungen vorkommt und oft mit chronischem Nierenversagen assoziiert ist (z.B. in Hämodialyse Patienten), verwendet werden. In diesem Fall würden Endothelzellen mit in ihnen inkorporiertem Erythropoetin codierenden Gen die Anämie durch Erthropoetin-Sekretion korregieren und somit das Knochenmark stimulieren, Erythropoese zu steigern (d.h. Herstellung roter Blutzellen). Transduzierte Endothelzellen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls verwendet werden, um niedrige systemische Dosen des Gewebe-Plasminogen-Aktivators als ein Aktivator zur Verhinderung der Thrombi-Bildung zu verabreichen. In diesem Fall würden Endothelzellen mit inkorporiertem genetischen Material, das tPA codiert, Gerinnung in einem Individuum, in dem Thrombus-Verhinderung erwünscht ist, hemmen. Dies wäre zum Beispiel als eine Prophylaxe gegen häufige Störungen nützlich, wie zum Beispiel Koronararterien-Erkrankung, cerebrovasculäre Erkrankung, periphere vasculäre okklusive Erkrankung, Venen- (z.B. superfiziale) thrombose, wie bei Lungenembolie beobachtet, oder tiefe Venenthrombose. Endothelzellen, die Calcitonin codierende DNS enthalten, können in der Behandlung des Paget Syndroms, einer progressiven, chronischen Störung des Stoffwechsels des Knochen, verwendet werden. Die gegenwärtige Behandlung stützt sich auf subkutane Calcitonin-Verabreichung.
Um Interleukine (z.B. IL-1, IL-2, IL-3) herzustellen und zu sezernieren bearbeitete Endothelzellen können in mehreren Zusammenhängen verwendet werden. Zum Beispiel ist das Ergebnis einiger der jetzt verwendeten Therapien (z.B. Chemotherapie) eine oftmals durch direkte Suppression des Knochenmarks verursachte Neutropenie- Induktion (die Anwesenheit einer abnormal geringen Anzahl Neutrophiler im Blut). Zum Beispiel hat eine Verwendung praktisch aller chemotherapeutischen Agenzien, wie auch in der Behandlung von (AIDS) erworbener Immuninsuffizienz verwendetes AZT, Neutropenie zur Folge. Dieser Zustand hat zahlreiche lebensbedrohliche Infektionen zur Folge. In diesen Fällen kann Verabreichung von zum Beispiel IL-3 durch Implantation von Endothelzellen, die IL-3 codierendes genetisches Material enthalten und somit IL-3 exprimieren und sezernieren, verwendet werden, um die Anzahl der Neutrophilen zu erhöhen. Zusätzlich kann die Verabreichung von Thrombopoetin, das die Herstellung der Blutplättchen stimuliert, in der Behandlung vieler Zustände verwendet werden, bei denen die Anzahl der Blutplättchen niedrig ist. In diesem Fall können mit dem Gen für Thrombopoetin transduzierte Endothelzellen die Herstellung der Blutplättchen stimulieren.
Ein anderer verwandter Ansatz von Endothelzellen mit inkorporiertem genetischen Material ist die Behandlung von AIDS. Interleukin 2 und Interleukin 3, die das Immunsystem stimulieren, sind potentiell wertvoll in der Behandlung von AIDS. Diese Moleküle könnten von Endothelzellen bereitgestellt werden, die gentechnisch verändert worden sind, damit sie diese zwei Polypeptide herstellen (die jetzt durch regelmäßige Injektion verabreicht werden).
Eine andere Verwendung der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung von Enzymmangelkrankheiten. In diesem Fall wird das Produkt, das von dem in Endothelzellen eingeführten Gen codiert wird, nicht sezerniert (wie es Hormone werden); vielmehr ist es ein Enzym, das in der Zelle verbleibt. Es gibt zahlreiche Fälle genetischer Erkrankungen, bei denen einem Individuum ein besonderes Enzym fehlt und nicht fähig ist, verschiedene Aminosäuren oder andere Metabolite zu metabolisieren. Die korrekten Gene für diese Enzyme könnten via transduzierte Endothelzellen eingeführt werden. Zum Beispiel gibt es eine genetische Erkrankung, bei der den Betroffenen das Enzym Adenosindesaminase fehlt. Dieses Enzym ist im Purinabbau zu Harnsäure beteiligt. Es könnte möglich sein, unter Verwendung der vorliegenden Erfindung, transduzierte Endothelzellen herzustellen, die das fehlende Enzym in ausreichend großen Mengen exprimieren, um das Blut beim Passieren des Bereiches, in dem die transduzierten Zellen im Körper vorkommen, zu entgiften.
Die vorliegende Erfindung hat ebenfalls veterinäre Anwendungen. Transduzierte Endothelzellen können zum Beispiel zur Lieferung von Substanzen wie Medikamente und Hormone an Tiere verwendet werden, die andernfalls durch regelmäßige Injektionen bereitgestellt werden würden (z.B. täglich oder weniger häufig). Die Verwendung der veränderten Endothelzellen der vorliegenden Erfindung hat den Vorteil der Anwesenheit veränderter Zellen innerhalb des Tieres und wird Mengen des codierten Proteins auf einer fortlaufenden Basis bereitstellen, und somit die Notwendigkeit täglicher/regelmäßiger Verabreichung der Substanz beseitigen.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die allerdings nicht als Einschränkung zu verstehen sind.

BEISPIEL 1 Produktion von humanem Parathyroid-Hormon in transduzierten Endothelzellen

In die BamHI Klonierungsstelle von pLJ kann genetisches Material von Interesse inseriert werden. Das genetische Material von Interesse kann wie oben beschriebene DNS sein.
Insbesondere ist eine Kopie des Gens, das das humane Parathyroid-Hormon (hPTH) codiert, in diese Stelle (z.B. in pLJ) auffolgende Weise kloniert worden: Das pLJ Plasmid wurde mit BamHI verdaut und anschließend mit Kälber-Intestinal-Phosphatase behandelt. Im Anschluß daran wurde der lineare Vektor auf Agarosegel fraktioniert und unter Verwendung von Glasperlen gereinigt. Zusätzlich wurde das BamHI Fragment, das das PTH Gen enthält, aus dem von Hendy etal. beschriebenen Plasmid präpariert, das eine vollständige cDNS von in pBR322 doniertem humanen PTH enthält. Hendy, G.N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7365-7369 (1981). Siehe Abbildung 3.
Ein Subfragment der PTH cDNS, das 17 bp der 5' nicht-translatierten enthält, alles codierende und 155 bp der 3' nicht-translatierten Sequenz wurde durch Verdauen des Ausgangsplasmids mit DdeI und HinfI isoliert und das 600 bp Fragment isoliert. Das Fragment wurde mit DNS Polymerase in Gegenwart von Desoxynedeosiden in Phosphaten inkubiert, um die überhängenden Enden aufzufüllen. BamHI Linker wurden an die stumpfen Enden mit T4 DNS Ligase ligiert. Ein authentisches BamHI Restriktionsfragment wurde durch Verdau dieser Ligationsmischung mit BamHI erzeugt. Dieses wurde dann in die BamHI Stelle von pBR322 subkioniert, dieses Plasmid dient als Quelle von hPTH in der Vektor-Konstruktion.
Gleiche Mengen an dem pLJ linearen Rückgrat und an BamHI PTH Fragment wurden in Gegenwart von T4 DNS Ligase zusammengegeben. Die resultierende Mischung wurde unter fur eine Ligation der beiden Fragmente geeigneten Bedingungen gehalten. Die Ligationsmnischung wurde zur Transformierung von Bakterienstamm HB101 verwendet, der dann auf Kanamycin-haltigem Agar auspiattiert wurde. Maniatis, T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Seiten 250-251, 504; Bolivar, F. und K. Backman, In: Methods Enzymology, R. Wu (ed.), Vol 68, Academic Press, N.Y. (1979). Die resultierenden Kolonien wurden auf das rekombinante Plasmid untersucht.
Parathyroid-Hormon ist ein Polypeptid, das eine Rolle in der Calciumregulation im Körper spielt. Obwohl das hPTH Gen in menschlichen Endothelzellen vorhanden ist, wird es in diesen Zellen nicht in signifikanten Mengen exprimiert. Endothelzellen, die in der Lage sind, ein Polypeptid zu produzieren wie beispielsweise hPTH oder eine andere Substanz, die normalerweise von solchen Zellen in biologisch signifikanten Mengen nicht gebildet wird, können auf ein Individuum verpflanzt oder in einem Individuum implantiert sein und als ein kontinuierliches Synthese- und Überbringungssystem für das Hormon oder für eine andere Substanz dienen.
Die Psi am Zellen, die das rekombinante Virus- Konstrukt produzieren, das die hPTH-codierende DNS und einen selektierbaren Marker (wie beispielsweise das neo Gen) codierende DNS enthält, wurden zur Herstellung einer viralen Stammkultur, wie oben beschrieben, verwendet. Die virale Stammkultur wurde geerntet; Endothelzellen, die mit dem Virus, das das hPTH Gen enthält, transduziert werden sollen, wurden mit der Stamrnkultur inkubiert. In diesem Fall wird ein selektierbarer Marker zur Identifizierung und Selektion auf transduzierte Endothelzellen mittels Kultivierung auf G418 haltigen Medien eingesetzt. Falls der Virus-Titer hinreichend hoch ist, werden im wesentlichen alle Endothelzellen infiziert und eine Selektion unter Verwendung eines selektierbaren Markers und geeigneter Medien ist nicht erforderlich.
Die Fähigkeit von Endothelzellen, die mit dem rekombinanten Retrovirus mit dem hPTH Gen transduziert sind, das hPTH Gen zu exprimieren, wurde folgendermaßen in vitro bewertet: Die bovinen aortalen Endothelzellen stammten von einem Explantat aus der Aorta eines Kalbs. Die Zellen haben eine begrenzte Lebensdauer und werden als Sekundärkulturen bezeichnet. Bovine aortale Endothelzellen wurden mit Virus infiziert und nicht in Neomycin selektiert, wie oben beschrieben. Transduzierte bovine aortale Endothelzellen wurden in 10 cm Gewebekulturschalen ausgesät und bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Frisches Kulturmedium (DME mit 10% CS und Penicillin und Streptomycin) wurde dann zugegeben; dieser Zeitpunkt ist später als Zeitpunkt null bezeichnet. Nach 24 Stunden wurde das Medium entfernt und die Zellen auf human PTH Produktion getestet.
Die Aliquote wurden auf Vorhandensein von hPTH unter Verwendung eines Radioimmunassays (Nichols), der intaktes hPTH mißt, analysiert. Diese Technik ist beschrieben in Allegrotm Intact PTH/Immunoassay for the Quantitative Determination of Human Intact Parathyroid Hormone in Serum, Nichols, Institute Diagnostics, San Juan Capistrano, CA (36B-2170, Effective 7/86 Revised), das wesentliche ist hier mit der Referenz angeführt. Der Test besitzt eine Empfindlichkeit von ungefähr einem Nanogramm/Milliliter Serum (ng/ml) und zeigte sich für humanes PTH spezifisch, weil er nicht mit PTH vom Kalb kreuzreagiert. Die Versuchsergebnisse sind als die Produktion von hPTH, wie mittels RIA gemessen, gegen die Zeit angegeben. Ergebnisse sind in Tabelle I gezeigt. Tabelle 1 hPTH Produktion in transduzierten BAE Zellen Zelle
*BAE = bovine aortale Endothelzellen
Endothelzellen aus der bovinen Aorta, die mit hPTH codierender DNS gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung transduziert sind, sind bei der American Type Culture Collection (Rockville, MD) unter der Hinterlegungsnummer CRL9601 hinterlegt worden.

BEISPIEL 2 Produktion von humanem LDL Rezeptor in transduzierten Endothelzellen

Die CDNS für humanen LDL Rezeptor (LDLR) wurde in den pem Vektor inseriert. Die cDNS für LDLR wurde für Insertion in den pEM folgendermaßen prapariert. LDLR cDNS wurde aus dem Vektor pTZ1 (von Dr. Goldstein, University of Texas Health Science Center, zur Verfügung gestellt) durch Verdau mit HindIII ausgeschnitten. Am 2,6 kb HindIII Fragment, das sämtliche LDLR codierende Sequenzen enthält, wurden mit Klenow Fragment stumpfe Enden hergestellt und BclI Oligonucleotid-Linker (von NEB) wurden an die cDNS mit T4 DNS Ligase ligiert. Zuletzt wurde die Ligationsmischung mit einem Überschuß an Enzym BclI verdaut und das Fragment auf einem Agarosegel fraktioniert und gereinigt. Dieses Fragment wurde in die BamHI Klonierungsstelle von pem folgendermaßen inseriert. pern wurde mit BamHI verdaut und das linearisierte Plasmid wurde mit Kälber-Intestinal-Phosphatase verdaut. Gleiche Mengen des mit Linkem versehenen LDLR Inserts und pem Rückgrat wurden gemischt und mit T4 DNS Ligase ligiert. Die Ligationsmischung wurde zur Transformierung von HB101 verwendet und Ampicillin-resistente Kolonien wurden auf den geeigneten retroviralen Vektor untersucht. Der pEm- LDLR Vektor wurde in die Psi-am Zellinie transfiziert und Klone, die hohe Mengen an Virus produzierten, wurden identifiziert. Virale Stammkulturen wurden verwendet, um bovine aortale Endothelzellkulturen zu infizieren, wie es für PTH beschrieben ist.
Eine in vitro Bewertung der LDLR Expression wurde folgendermaßen durchgeführt: Konfluente Platten von Kontrollzellen oder transduzierten bovinen aortalen Endothelzellen wurden mit LDL, das mit einem fluores zenten Marker konjugiert war (von Biomedical Tech Inc., Stoughton, MA, erhalten), in einer Konzentration von 10 ug/ml ungefähr 8 Stunden inkubiert. Im Anschluß daran wurden die Zellen mit PBS gewaschen und in 0,5% Glutaraldehyd in PBS fixiert. Sie wurden dann unter einem Fluoreszenzmikroskop aufgrund der Aufnahme von fluores zent markiertem LDL (*LDL) sichtbar gemacht. Die Versuchsergebnisse sind in Abbildung 4 dargestellt. Zusammengefaßt: die Menge an endogenem LDLR ist gering, wie durch das relative Ausbleiben einer * LDL Aufnahme in nichtinfizierten Kulturen (siehe 4B) festzustellen ist. Allerdings in mit dem LDLR Virus infizierten Kulturen nehmen rund 30% aller Zellen detektierbare Mengen an *LDL auf, was eine effiziente Expression von exogenem LDLR belegt (siehe 4D).

BEISPIEL 3 Produktion von beta-Galactosidase in transduzierten Endothelzellen

Das beta-Galactosidase codierende Gen aus E. coli wurde in pLJ inseriert und dieser Vektor wurde in die Psi-am Zellinie transfiziert, was zu einer Produktion von retroviralen Stammkulturen mit einem hohen Titer führte. Die Konstruktion dieses Vektors und Isolierung der Produzenten-Zellinie ist von Price und Mitarbeitern beschrieben worden. Price, J. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences. USA, 84: 156-160 (1987). Das beta-Galactosidase Gen codierende Virus-Stammkulturen wurden verwendet, um bovine aortale Endothelzellen, wie zuvor beschrieben, zu infizieren. Die infizierten Kulturen wurden auf beta-Galactosidase-Expression unter Verwendung einer in situ histochemischen Färbung analysiert. Siehe Price et al., oben. Kulturen wurden vor und nach Selektion in G418 analysiert. Der in diesem Versuch verwendete retrovirale Vektor exprimiert sowohl beta-Galactosidase als auch das neo Gen, das eine Resistenz gegen G418 verleiht. Die histochemische Färbung wurde durchgeführt wie von Price et al. beschrieben. Zusammengefaßt, die Zellkulturen wurden in 0,5% Glutaraldehyd in PBS 5 Minuten fixiert, mit PBS gewaschen und einer Reaktionsmischung mindestens 12 Stunden exponiert. Die Reaktionsmischung enthält ein Substrat für beta-Galactosidase, welches, wenn es hydrolysiert ist, nach blau umschlägt und in der Zelle ausfällt. Folglich wird jede Zelle, die die viral codierte beta-Galactosidase exprimiert, blau gefärbt. Die Versuchsergebnisse sind in Abbildung 5 dargestellt. Keine beta-Galactosidase Aktivität wird in Kulturen detektiert, die keinem Virus exponiert waren (Abbildung 5A); infizierte Kulturen zeigen beta-Galactosidase Aktivität in etwa 30% der Zellen (Abbildung SB). Diese transduzierten Zellen werden durch Inkubation in Gegenwart von G418 selektiert.

BEISPIEL 4 Produktion von beta-Galactosidase in transduzierten Endothelzellen auf der Oberfläche von transpiantierten Gefäßtransdlantatetn in vivo

Eine bildliche Darstellung eines typischen Protokolls für eine Transduktion und Transplantation von Endothelzellen ist in Abbildung 6 gezeigt. Endothelzellen wurden enzymatisch von externen Jugularvenen von ausgewachsenen Mischlingshunden, die 20-25 kg wogen, geerntet. Zellen eines jeden Tieres wurden in 2 Aliquote aufgeteilt; ein Aliquot wurde mit einem replikationsdefekten Retrovirus (siehe unten) infiziert, und das andere Aliquot wurde scheininfiziert. Die enzymatisch geernteten Zellen wurden zur Etablierung von Primärkulturen verwendet. Endothelzellen wurden auf Fibronectin-beschich tete Kolben auspiattiert und in M199 Medium, supplementiert mit 5% Plasma, gewonnen aus Pferdeserum, Penicillin, Streptomycin, Heparin und ECGF während zweier seriellen Passagen über einen 10-14 tägigen Zeitraum gehalten.
Während dieses Zeitraumes wurden die Zellen frischen Virus-Stammkulturen, supplementiert mit Polybren (8 ug/ml), alle 3 Tage (18 h/Exposition) exponiert. Nach Beendigung der zweiten Passage wurden die Zellen geerntet und Aliquote wurden direkt analysiert, kryokonserviert oder zum Besäen von 6 cm x 4 mm verwobenen Dacron TM Transplantaten (CR BARD, Billerica, MA) gemäß einer Modifikation des 4-Schritt-Verfahrens von Yates (0,75 x 10&sup6; Zellen wurden zu dem autologen Blut während des zweiten und dritten Schritts gegeben) verwendet. Die Tiere wurden narkotisiert und 6 cm lange Segmente von beiden Carotisarterien wurden durch die besäten Transplantate, wie beschrieben, ersetzt. Jedes Tier erhielt ein Transplantat, das mit infizierten Endothelzellen besät war, und ein contralaterales Transplantat, das mit schein infizierten Zellen besät war. Fünf Wochen nach Implantation wurden die Tiere narkotisiert und die Transplantate geerntet und untersucht.
Replikationsdefekte Retroviren mit einem amphotropen Wirtsbereich wurden verwendet, um ein Reportergen in die genomische DNS der Endothelzellen stabil einzuführen. Das lacZ Gen wurde als Reportergen verwendet, da dessen Expressionsprodukt, beta-Galactosidase, durch die Verwendung von histochemischen Enzymtests, die das Zellcytoplasma blau färben, in situ detektiert werden kann. (Beispiel 3). Die Effizienz der retroviralen Infektion wurde mittels Southern Analyse, die provirale Sequenzen detektiert, und mittels der cytochemischer Färbung auf viral exprimierte beta-Galactosidase, die infizierte Zellen in situ detektiert, abgeschätzt.
Zwei rekombinante Retroviren wurden in diesen Untersuchungen verwendet. Der BAG Vektor ist zuvor schon von Price et al., Proceedings of the National Academy of Sciences. USA, 84: 156-160 (1987) beschrieben worden. Das das lacZ Gen enthaltende BAG Virus exprimiert beta- Galactosidase von der 5' LTR (Lange Terminale Wiederholungssequenz) und einen selektierbaren Marker (neo) von einem von SV40 abstammenden Promotor, der eine Resistenz gegen Kanamycin in Prokaryoten und gegen G418 in Eukaryoten verleiht. Ungefähr 5-15% der dem BAG Virus exponierten Endothelzellen wurden infiziert (zusammengefaßt in Tabelle II); eine Kultivierung dieser Kulturen in Medien, die mit dem Aminoglycosid G418 supplementiert waren, selektierte effektiv auf transduzierte Zellen.
Der BAL Vektor stammte von dem zuvor beschriebenen BA-LDLR Vektor ab, außer LDLR cDNS Sequenzen, die durch die für das E. coli beta-Galactosidase Gen codierenden Sequenzen ersetzt waren. Der höhere Titer des BAL Virus, das das Lac Z-Gen enthält, exprimiert beta-Galactosidase von einem Promotor aus, der von Hühner beta-Actin abstammt. Ungefähr 50% der dem BAL Virus exponierten Zellen wurden transduziert, wie mittels Southern Analyse und mittels in situ cytochemischer Färbung auf beta-Galactosidase gemessen wurde.
In einer Southern Analyse wurde DNS mit hohem Molekulargewicht isoliert und ein Aliquot (10 ug) wurde mit Kpn I verdaut, auf einem 1% Agarosegel fraktioniert, auf Zetabind transferiert und mit einem 1200 bp ClaI/EcoRI Fragment, das mit einer hohen spezifischen Aktivität gemäß dem Verfahren von Feinberg und Volt markiert worden war, sondiert. Eine cytochemische Charakterisierung von kultivierten Endothelzellen wurde sowohl durch Phasenkontrast- als auch Fluoreszenzmikrographien gezeigt. Retrovirus-infizierte Endothelzellen wurden zum Zeitpunkt des Aussäens und nach Entnahme von dem implantierten Transplantat auf Aufnahme von DIL-AC-LDL und auf Expression von Virus gesteuerter beta-Galactosidase untersucht. Vor Aussäen und nach Implantation der Zellen, die mit DIL-AC-LDL angeimpft gewesen sind, wurden diese mittels Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikrographien bewertet. Vor Aussäen und nach Implantation der Zellen wurden diese ebenfalls auf die Expression von viral gesteuerter beta-Galactosidase untersucht.
Zum Zeitpunkt des Aussäens wurden die Kulturen auf Endothelzell-spezifische Funktionen (d.h. Aufnahme von acetyliertem LDL und das Vorhandensein des Von Willebrand Faktors) und auf das Vorhandensein von Antigenen, die für glatte Muskelzellen spezifisch sind, untersucht. Diese Untersuchungen zeigten, daß mehr als 98% der Zellen eines jeden Isolats funktionsfähige Endothelzellen waren.
Der Versuchsorganismus war eine Modifikation eines zuvor beschriebenen Hundemodells, das zur Untersuchung der Transplantat-Wiederbesiedelung eingesetzt worden ist. Die Hunde 1-3 erhielten Implantate, die mit BAG-infizierten, nicht-selektierten Endothelzellen besät worden waren, wohingegen Hunde 4-7 anfangs Implantate erhielten, die mit BAG-infizierten, nicht-selektierten Endothel zellen besät worden waren. Im Verlauf dieser Versuche wurden ebenfalls Endothelzellen der Hunde 4-7 mit dem BAG Virus infiziert und in Kultur in Anwesenheit oder Abwesenheit von G418, einem Aminoglycosid, das auf BAG- transduzierte Zellen selektiert, vermehrt worden. Nach 5 Wochen wurden die Transplantate für eine Untersuchung entnommen und neue Transplantate wurden den Hunden 4-7 (als Hunde 4'-7' bezeichnet) implantiert. Jeder dieser Hunde erhielt ein Transplantat, das mit Endothelzellen, die mit BAG Virus infiziert und in G418 selektiert waren, besät war und ein contralaterales Transplantat, das mit BAG-infizierten, nicht-selektierten Endothelzellen besät war. Der zweite Satz Transplantate wurde wiederum nach 5 Wochen entnommmen.
Tabelle II faßt die Ergebnisse dieser Versuche zusammen. Tiere 4' bis 7' repräsentieren den zweiten Versuch, der mit den Tieren 4 bis 7 durchgeführt wurde (siehe Text). BAG-U repräsentiert BAG-infizierte Endothelzellen, die nicht mit G418 auf transduzierte Zellen selektiert wurden. BAG-S repräsentiert BAG-infizierte Endothelzellen, die mit G418 auf transduzierte Zellen selektiert wurden. BAL repräsentiert BAL-infizierte Endothelzellen. MOCK repräsentiert scheininfizierte Zellen. E ist ein Hinweis auf die Infektionseffizienz, wie sie mittels beta-Galactosidase-Färbung ermittelt wurde. Potenz des Transplantats nach 5 Wochen ist mit (Y) ja oder (N) nein angegeben. Die Bedeckung des Transplantats ist ein Hinweis auf die prozentuale Wiederbesiedelung der Oberfläche wie mittels Rasterelektronenmikroskopie bestimmt wurde. Tabelle II Zusammenfassung der Implantationsversuche
Eine Analyse der entnommenen Transplantate ergab, daß nach 5 Wochen 18 von 22 offen blieben. Rasterelektronenmikroskopie zeigte eine Auskleidung mit Zellen mit Endothel-ähnlicher Morphologie auf der Lumenoberfläche von 14 von 18 Transplantaten. Wenn vorhanden, war die Endothelzell-Auskleidung unvollständig (50-90% der Gesamtoberfläche) und von unregelmäßiger Verteilung mit wenigen Zellen, die entlang der Spitzen des geränderten Dacron Transplantats zu beobachten waren. Ein Teil von jedem Transplantat wurde fixiert, auf Zellen gefärbt, die viral gesteuerte beta-Galactosidase exprimieren und mit einem Hochleistungspräpariermikroskop mit einer 750fachen Vergrößerung sichtbar gemacht. Jedes Transplantat, das mit infizierten Endothelzellen besät worden war, verblieb offen und behielt luminale Zellen und enthielt beta- Galactosidase positive Zellen auf dem Gef äßlumen. contralaterale Transplantate, die mit scheininfizierten Endothelzellen besät worden waren, zeigten niemals positiv gefärbte Zellen.
Eine in situ Analyse der Transplantate wurde für Virus-transduzierte Zellen durchgeführt. Längsschnitte der genetisch veränderten Implantate wurden auf Zellen untersucht, die viral-exprimierte beta-Galactosidase exprimieren. Transplantate wurden der Länge nach geschnitten und ein Teil in 0,5% Glutaraldehyd 5 Minuten fixiert, in PBS dreimal gewaschen und zwei Stunden in x- Gal Lösung inkubiert und die luminale Oberfläche mit einem Leitz Präpariermikroskop photographiert. Die Transplantate wurden vorderseitig sichtbar gemacht und mehrere interessante Aspekte des Besäungsmusters wurden beobachtet. Die Dichte der transduzierten Zellen war in den tieferliegenden Schichten des geränderten Transplantats am größten. Dies wurde bei geringer Vergrößerung als Ringe blau gefärbter Zellen sichtbar gemacht, die die Risse der gezackten Oberfläche säumen und mit der Variation der Endothelzellwiederbesiedelung der Oberfläche, wie mittels Rasterlektronenmikroskopie sichtbar gemacht wurde, übereinstimmt. Zusätzlich gab es keine regionalen Schwankungen in der Dichte oder im Muster von transduzierten Zellen hinsichtlich der Nähe zu der distalen oder proximalen Anastomose. Schließlich schien in jedem Fall der Anteil von luminalen Zellen, die beta-Galactosidase positiv waren, qualitativ geringer als das Präparat mit beta-Galactosidase positiven Zellen, die ausgesät waren.
Die Zellen wurden enzymatisch von der Lumenoberfläche von Teilen der Transplantate geerntet, um eine genauere Charakterisierung zu erlauben. Primärkulturen von Zellen wurden etabliert und ungefähr 2-3 Wochen vor der Untersuchung in vitro vermehrt. Genetisch veränderte Endothelzellen wurden in dieser Zeilpopulation mittels Southern Analyse und mittels cytochemischen Tests auf viral-exprimierte beta-Galactosidase identifiziert. Der Großteil der von dem Transplantat geernteten und in vitro vermehrten Zellen behielt eine differenzierte Endothel funktion (weniger als 95%). Allerdings war der Anteil von Zellen, die viral gesteuerte beta-Galactosidase exprimierten oder provirale Sequenzen enthielten, beständig vermindert im Vergleich zu Kulturen, die zum Zeitpunkt des Aussäens untersucht wurden. Dieser Unterschied liegt zum Teil an der partiellen Wiederbesiedelung von Transplantaten mit endogenen Zellen durch ein Wachstum durch Interstitien oder von den Anastomosen.

BEISPIEL 5 Vermehrte Expression von tPA durch genetisch veränderte canine und humane Endothelzellen

Die in den oben genannten Beispielen dargestellten Daten zeigen, daß ein retroviral-vermittelter Gentransfer bei bovinen, caninen und humanen Endothelzellen leicht angewandt werden kann. Die Daten zeigen ebenfalls, daß dieser zu einer normalen Expression von intrazellulären und sezernierten Proteinen führt. Der Einsatz eines retroviral-vermittelten Gentransfers für die Expression eines therapeutisch relevanten Proteins ist im folgenden Abschnitt angegeben.
Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA) ist ein Protein, das normalerweise von Endothelzellen sezerniert wird und die Fibronolyse von Blutgerinnseln fördert. Humanes tPA codierende retrovirale Vektoren wurden konstruiert und zur Transduktion von caninen Endothelzelle verwendet, um die vermehrte Überbringung eines therapeutischen relevanten Proteins von transduzierten Endothelzellen zu zeigen.
Die Modifikationen des tPA Gens zur Klonierung in die retroviralen Vektoren sind in Abbildung 7 gezeigt. Die codierenden Sequenzen von humanem Uterus tPA waren innerhalb eines Sal I DNS Fragments eines auf pUC basierenden Plasmids enthalten, das von Integrated Genetics Inc., Framingham, MA, zur Verfügung gestellt wurde. Das Sal I Fragment war abgeleitet durch Anbringen von Sal I Linker an die SFaN I Stelle bei Basenpaar 6 und an die Bgl Stelle bei Basenpaar 2090 der ursprünglichen cDNS. Die codierende Sequenz erstreckt sich von Basenpaar 13 bis Basenpaar 1699.
Von diesem ursprünglichen Klon wurde ein Fragment abgeleitet, das in den MFG und α-SGC Vektor, wie im Hauptteil des Patents beschrieben, direkt kloniert werden konnte. Das Sal I Fragment wurde zuerst in ein Bam HI Fragment umgewandelt durch die Addition von synthetischen Bam HI Linker und dann mit dem Restriktionsenzym Bgl II verdaut, um ein 109 Basenpaar Bam HI bis Bgl II Fragment und ein 1975 Basenpaar Bgl II bis Bam HI Fragment zu gewinnen. Um die fehlenden 100 Basenpaare der tPA codierenden Sequenzen und das Translationsstartcodon wieder zu erzeugen, wurden zwei 104 Basenpaare lange Oligonucleotide synthetisiert und annealt, um ein Fragment mit einer Nco I Stelle am 5' Ende und einer Bgl II Stelle am 3' Ende zu bilden. Dieses Oligonucleotid wurde in die Bgl II Stelle des partiellen 1975 Basenpaare langen tPA Gen ligiert, um ein 2079 Basenpaare langes tPA Gen mit der identischen codierenden Sequenz des ursprünglichen Moleküls herzustellen, aber dieses kann leicht als ein Nco I bis Bam HI Fragment erhalten werden. Es wurde direkt in die MFG und α-SGC Vektoren inseriert (die resultierenden Vektoren erhielten die ATCC Hinterlegungsnummern 68726 beziehungsweise 68729). Diese Manipulationen wurden mittels molekularbiologischer Standardverfahren (Molecular Cloning -A laboratory Manual, T. Maniatis, E.F. Frisch und J. Sambrook) durchgeführt und sind in Abbildung 7 graphisch dargestellt.
Zellinien, die einen MFG-tPA und α-SGC-tPA codierenden rekombinanten Virus produzieren, waren aus der Psi crip Verpackungszellinie von Danos und Mulligan hergestellt, die in der Lage sind, einen rekombinanten Retrovirus mit amphotropen Wirtsbereich zu produzieren [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460 (1988)]. 10 ug der spezifizierten DNSN und 1 ug Plasmid pSV2neo wurden gemeinsam gefällt und in die Verpackungszellen mit Hilfe von Calciumphosphat-Transfektionsstandardverfahren transfiziert. Stabil transfizierte Klone wurden nach 14 tägigem Wachstum in 800 ug/ml G418 haltigen Selektivmedien isoliert. 24 Stunden-Kulturüberstände wurden von konfluenten Einzeischichten einzelner Klone erhalten und zur Infektion von NIH 3T3 Zellen verwendet. Die Kulturüberstände wurden nach 24 stündiger Exposition entfernt, und die 3T3 Zellen wurden mit normalen Medien erneut gefüttert und weitere 72 Stunden wachsen gelassen. Frische Medien wurde 6 Stunden auf diese Zellen verbracht und diese Überstände wurden auf humanes tPA mit einem kommerziell erhältlichen ELISA (Immunobind-5, American Diagnostica Inc., N.Y., N.Y.), das spezifisch für humanes tPA ist, getestet. Aus dieser Durchmusterung wurden Klone der Verpackungszellinie, die entweder das MFG-tPA rekombinante Virus oder α-SGC-tPA rekombinante Virus produzieren, selektiert und als MFG 68 beziehungsweise α- SGC 22 bezeichnet.
Canine Endothelzellen wurden aus 10 cm Segmenten der äußeren Jugularvene mittels Collagenase-Verdau, wie beschrieben, isoliert [T.J. Hunter, S.P. Schmidt, W.V. Sharp und (1983) Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs 29:177). Die Zellen wurden auf Fibronectin-beschichteten Gewebekulturschalen in M199 Medium, das 5% aus equinem Serum abstammendes Plasma, 50 ug/ml Endothelzellen- Wachstumsfaktor und 100 Mg/ml Heparin enthielt, vermehrt. Die Reinheit der Zellkulturen wurde mittels eines immunhistochemischen Tests auf Anwesenheit des Von Willebrand Faktors und die Abwesenheit von für glatte Muskelzellen spezifischen α-Actin bestimmt. Am Tag vor der Transduktion wurden die Endothelzellen mit 5,5 x 10³ Zellen/cm² in Medium ohne Heparin ausgesät. Am darauffolgenden Tag wurden die Endothelzellen 24 Stunden Überständen exponiert, die von jeder Produzentenzellinie abstammenden rekombinanten Virus enthielten, und es wurde jeweils 8 ug/ml Polybren zugegeben. Die viralen Überstände wurden entfernt, die Zellen mit normalen Medien gefüttert und weitere 48 Stunden vor der Analyse wachsen gelassen.
Genomische DNS mit hohem Molekulargewicht und Gesamt-RNS wurden aus den Endothelzellkulturen mittels Standardverfahren isoliert (Molecular Cloning-A Laboratory Manual, T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook). Die DNS und RNS wurden mittels Hybridisierungsanalyse mit einer ³²P-markierten Sonde, die aus dem vollständigen tPA cDNS Fragment hergestellt wurde, analysiert. Standardverf ahren wurden zu elektrophoretischen Trennung, Filtertransfer, Hybridisierung, Waschen und ³²P-Markierung (Molecular Cloning-A Laboratory Manual, T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook) angewandt. Die Produktion von humanem tPA in transduzierten caninen Endothelzellen wurde mit einer Species-spezifischen immuncytochemischen Färbung gezeigt. Transduzierte Zellen wurden in 3% Formaldehyd 10 Minuten bei Raumtemperatur fixiert und dann in 0,1% Triton X-100 5 Minuten permeabilisiert. Die fixierte Zelleinzelschicht wurde dann aufeinanderfolgend mit einem murinen monoklonalen Antikörper gegen humanen tPA, mit einem alkaline Phosphatase konjugiertem Ziege anti-Maus Antikörper und schließlich mit einem für alkaline Phosphatase spezifischen Farbreagenz inkubiert. Dieses Verfahren färbt spezifisch die Zellen, die humanen tPA exprimieren, und die dann mit herkömmlicher Lichtrnikroskopie sichtbar gemacht werden können. Zusätzlich wurde die tPA Sekretion von transduzierten Zellen von konfluenten Zelleinzelschichten bestimmt. Frische Medien wurden 6 Stunden auf die Zellen verbracht, entfernt und mittels Zentrifugation gereinigt und die Menge an humanern tPA mit einem kommerziell erhältlichen ELISA (Immunobind-5, American Diagnostica) bestimmt.
Die Effizienz des Transduktionsverfahrens wird mit immuncytochernischer Färbung einer Zellpopulation gezeigt, die entweder scheintransduziert oder mit MFG-tPA transduziert sind. Wie in Abbildung 9 gezeigt, synthetisieren im wesentlichen alle Zellen nach einer einzigen Exposition mit einem Virusüberstand, der von MFG 68 geerntet wurde, humanen tPA, im Gegensatz zu Zellen der Kontrolle. Dies wurde ohne Selektion auf einen beliebigen Typ transduzierter Zellen erreicht.
Ein immunologischer Test wurde durchgeführt, um die Menge an tPA zu bestimmen, die von transduzierten Kulturen sezerniert wurden. Wie unten gezeigt, sezernierten mit MFG 68 oder α-SGC 22 transduzierte Zellen große Mengen an humanem tPA. Unter ähnlichen Bedingungen sezernieren humane Endothelzellen in Kultur typischerweise ungefähr 1 ng tPA [Hanss, M. und D. Collen (1987) J. Lab. Clin. Med. 109: 97104). Tabelle III
Als eine weitere Bestätigung, daß die Endothelzellen mit dem rekombinanten Virus von MFG 68 und α-SCG 22 transduziert gewesen waren, wurde DNS und RNS aus transduzierten Zellen isoliert und durch Hybridisierung an ein radiornarkiertes tPA Gen analysiert. Ein Autoradiogramm der DNS Analyse ist in Abbildung 10 gezeigt.
Es wurde keine Hybridisierung in der nicht-infizierten Kontrolle festgestellt, aber einzelne Hybridisierungsbanden von dem geeigneten Molekulargewicht wurde in den Zellen beobachtet, die mit den beiden rekombinanten Vektoren infiziert waren. Dies zeigt, daß die genetische Information in das Genom dieser transduzierten Zellen transferiert wurde.
Eine Hybridisierungsanalyse der gesamten RNS, die aus diesen Zellen isoliert war, bestätigt die Protein- und DNS-Ergebnisse und ist in Abbildung 11 gezeigt. Es wurde wiederum keine Hybridisierung in den Kontrollzellen detektiert, aber in der RNS, die aus den transduzierten Zellen stammte, können Hybridisierungsbanden mit den geeigneten Größen beobachtet werden. RNS aus den rekombinanten Virus MFG 68 und α-SGC 22 produzierenden Zellen ist auch als Kontrolle gezeigt.

BEISPIEL 6 In vivo Funktion von transduzierten caninen Endothelzellen, die auf die Oberfläche von Gefäßtransplantaten transplantiert sind

Endothelzellen wurden von der äußeren Jugularvene von ausgewachsenen weiblichen Mischlingshunden, die 20-25 kg wogen, enzymatisch geerntet und im Labor kultiviert und auf Reinheit, wie in Beispiel 5 beschrieben, untersucht. Eine Hälfte der von jedem Tier isolierten Zellen wurde durch zwei Exposition mit Überständen, die von der MFG 68 Zellinie, die das rekombinante Virus MFG tPA produziert, geerntet wurden, wie in dem vorhergehenden Abschnitt beschrieben wurde, transduziert. Die andere Hälfte wurde scheintransduziert. Von jeder Population aufgenommene Wachstumskurven zeigten keinen Unterschied in den Wachstumscharakteristika. ELISA Messungen wurden von Kulturüberständen gemacht, die von dem jeweiligen Ansatz transduzierter Zellen abstammten, um sicherzustellen, daß tPA von den veränderten Zellen sezerniert war. Diese Zellen wurden dann im Labor ungefähr eine Woche vermehrt, um eine hinreichende Anzahl an Zellen zu erhalten.
Für jedes Tier, von dem Zellen isoliert worden waren, wurden zwei Gefäßtransplantate, die aus expandiertem Teflon hergestellt waren (W.L. Gore und Associates, Inc. Flagstaff, AZ) mit Zellen besät. Ein Transplantat war mit scheintransduzierten Zellen besät und das andere mit Zellen, die transduziert waren, um hohe Mengen an tPA zu sezernieren. Jedes Transplantat, das 0,4 cm x 14 cm maß, war mit 1,5 ug/cm² Fibronectin (Sigma Chemical Corp., St. Louis, MO) vorbeschichtet und dann mit 2.200.000 Endothelzellen/cm besät. Die Transplantate waren dann zusätzlich 72 Stunden kultiviert. Vor der Implantierung wurden die Enden von jedem Transplantat abgeschnitten und auf Sicherstellung der Zellbedeckung untersucht.
Die selben Hunde, von denen die Zellen geerntet worden waren, wurden narkotisiert und 10 cm Segmente der besäten Transplantate wurden als Aorta-Iliac Bypässe implantiert. Jeder Hund erhielt zwei contralaterale Transplantate; eines mit Kontrollzellen besät, das andere mit Zellen besät, die transduziert worden waren, um hohe Mengen an tPA zu sezernieren. Im Anschluß an die Implantation wurde die Qualität der Transplantate täglich mit einem B-Mode Scanner, der das Transplantat mit Ultraschall ortet und den Blutfluß durch das Transplantat mittels Doppler-Messungen (Accuson, Inc.) mißt, kon trolliert. Es wurden zur Minimierung der Thrombusbildung keine Medikamente den Tieren verabreicht.
Die Ergebnisse der Transplantat-Qualität in 6 verschiedenen Tieren sind in Abbildung 12 gezeigt. Das oben beschriebene Implantierungsmodell ist sehr stringent und führt zum schnellen Versagen des Transplantats durch Verschluß aufgrund von Gerinnselbildung. Eine normale Transplantatfunktion ist mit einem weißen Balken angegeben und ein Transplantat, das versagt aber noch funktioniert ist mit einem schraffierten Balken gekennzeichnet In dem ersten Tier versagten aufgrund von Gerinnselbildung 24 Stunden nach Implantierung das Kontrolltransplantat und das Transplantat, das mit transduzierten Zellen, die erhöhte Mengen an tPA (experimentell) sezernieren, ausgekleidet war. In allen anderen fünf Tieren funktionierte das Transplantat, das mit transduzierten Zellen, die erhöhte Mengen an tPA sezernieren, ausgekleidet waren länger als das Transplantat mit Zellen, die nur scheintransfiziert worden waren. Dieser Unterschied schwankte zwischen 24 Stunden bis zu mehreren Monaten. Diese Ergebnisse zeigen, daß ein therapeutischer Effekt in vivo mit transduzierten Zellen erzielt werden kann.

BEISPIEL 7 Produktion von humanem Faktor VIII von transduzierten Endothelzellen

Endothelzellen wurden genetisch verändert, um humanen Faktor VIII durch Transduktion der Zellen mit einem retroviralen Vektor, MFG, der ein modifiziertes human Faktor VIII Gen (ATCC Hinterlegungsnummer 68726) enthält, zu produzieren. Die modifizierte Faktor VIII cDNS enthält sämtliche codierenden Sequenzen für die A1, A2, A3, C1 und C2 Domänen, allerdings ist die B Domäne von Aminosäure 743 bis 1648 deletiert. Das Entfernen der B Domäne und die Insertion des modifizierten Faktor VIII Gens in den retroviralen Vektor MFG ist detailliert unten beschrieben und in Abbildung 13 skizziert.
Eine vollständige cDNS ohne die 5' und 3' nichttranslatierten Sequenzen wurde in einem Plasmid-Vektor, zwischen den Restriktionsstellen Nco I (5') und Xho I (3') inseriert, erhalten Für das Entfernen der B Domäne wurde die Faktor VIII cDNS in einen Plasmid-Vektor in 4 Fragmenten subkloniert, die sich über die Sequenzen sowohl der 5' als auch der 3' Seite der B Domäne erstrecken. Das erste Fragment der Faktor VIII cDNS wurde zwischen den Restriktionsstellen Sal I und Pst I in den Plasmid-Vektor PUC 9 subkloniert.Der Plasmid-Vektor wurde mit Sal I und Pst I geschnitten und die 5' Phosphate wurden unter Verwendung von Kälber-Intestinale- Phosphatase entfernt. Ein 1591 Basenpaare langes Xho I (Nucleotid 7263) bis Nde I (Nucleotid 5672) Fragment und ein 359 Basenpaare langes Nde I (Nucleotid 5672) bis Pst I (Nucleotid 5313) Fragment der vollständigen CDNS wurden isoliert und mit dem Sal I/Pst I verdauten Plasmid-Vektor ligiert
Um den Großteil der Sequenzen, die die B Domäne codieren, die Aminosäuren 742 bis 1649 in dem selben Translationsleserahmen verbindet, zu entfernen, wurden 4 Oligonuceotide mit einer 5' Hind III Stelle und einer 3' Pst I Stelle synthetisiert, die 168 Basenpaare abdecken. Die Oligonucleotide erstrecken sich von der Hind III Stelle bei Nucleotid 2427, das die Aminosäure 742 codiert gefolgt von Aminosäure 1649, die die erste Aminosäure des Aktivierungspeptids der leichten Kette ist, bis zu der Pst I Stelle bei Nucleotid 5313 Der Plasmid-Vektor wurde mit den Restriktionsenzymen Hind III und Pst I verdaut, und die 5' Phosphate wurden unter Verwendung von Kälber- Intestinale-Phosphatase entfernt. Die Oligonucleotide wurden als 4 seperate Stränge synthetisiert, mit Kinase behandelt, annealt und zwischen die Hind III Stelle und die Pst 1 Stelle des Plasmid-Vektors ligiert.
Das subklonierte Hind III/Pst I Oligonucleotid wurde benachbart zu den Pst I/Xho I Fragmenten in einen Plasmid-Vektor pUC F8 eingefügt. Um dieses Plasmid zu erzeugen, wurde ein neuer Polylinker in ein pUC 9 Plasmidrückgrat inseriert, mit dem neuen verwendeten Polylinker, der die Restriktionsenzymstellen 5' Sma I-Bam HI-Xho I-Pst I-Hind III-Asp 718-Nco I-Hpa 3' codiert. Der Plasmid-Vektor wurde mit den Restriktionsenzymen Bam HI und Hind III verdaut und die 5' Phosphate wurden mit Kälber-Intestinale-Phosphatase entfernt. Ein partieller Pst I/Bam HI Verdau des Pst I/Xho I Subklons wurde verwendet, um das 3' terminale Faktor VIII Fragment zu isolieren, und ein Pst I/Hind III Verdau der subklonierten Oligonucleotide wurde verwendet, um das Verbindungsfragment der leichten und schweren Kette zu isolieren. Sie wurden in den Plasmid-Vektor pUC F8 zwischen die BamHI und Hind III Stelle ligiert.
Dieser Subkion, der die Faktor VIII Sequenzen zwischen Nucleotid 2427 und 7205 enthält, wurde mit Asp 718 und Hind III verdaut und die 5' Phosphate wurden unter Verwendung von Kälber-Intestinale-Phosphatase entfernt. Ein Fragment, das Faktor VIII zwischen der Restriktionsenzymstelle Asp 718 (Nucleotid 1961) und Hind III (Nucleotid 2427) codiert, wurde isoliert und in den Plasmid-Vektor ligiert, um einen Subklon (pF8 3' delta) zu erzeugen, der die Faktor VIII Sequenzen von Nucleotid 1961 bis zu dem Translationsstopcodon bei Nucleotid 7205 enthält.
Die Konstruktion des retroviralen Vektors des modifizierten Faktor VIII Gens wurde durch Inserieren des Faktor VIII Gens zwischen die Restriktionsstellen Nco I und Bam HI des retroviralen Vektors MFG ausgeführt. Der Faktor VIII Subklon pF8 3' delta wurde mit Sma I verdaut und in eine Bgl II Stelle unter Verwendung eines Oligonucleotidlinkers umgewandelt. Ein Asp 718/Bgl II Fragment wurde aus dem 3' Faktor VIII Subklon isoliert, und ein 5' Faktor VIII Fragment, das das ATG zur Initiation der Transiation enthält, wurde als eine Nco I (Nucleotid 151)/Asp 718 Fragment (Nucleotid 1961) isoliert. Der retrovirale Vektor MFG wurde mit Nco I und Bam HI verdaut und die 5' Phosphate wurden unter Verwendung von Kälber- Intestinale-Phosphatase entfernt. Die Faktor VIII Fragmente wurden in den retroviralen Vektor ligiert, und es wurde das endgültige Faktor VIII retrovirale Konstrukt erhalten, siehe Abbildung 14.
Die Zellinie, die die retroviralen Partikel produziert, wurde durch Transfektion des retroviralen Vektors MFG/Faktor VIII in die gleiche Anzahl an ecotropen Verpackungszellen Psi CRE und amphotropen Verpackungszellen Psi CRIP, wie von Bestwick et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988 85:5404-5408) beschrieben, erzeugt. Um das Ausmaß der sich ereignenden Superinfektion zwischen den beiden Wirtsbereichen der Verpackungszellen zu kontrollieren, wurde die Produktion des biologisch aktiven Faktors VIII unter Verwendung des Kabi Diagnostica Coatest for Factor VIII, Helena Laboratories, Beaumont, Texas, gemessen und die Produktion von viraler RNS wurde mit einer RNS Dot Blot-Analyse gemessen. 21 Tage nach Transfektion wurde die Mischung transfizierter Verpackungszellen mit der amphotropen Verpackungszellinie Psi CRIP-HIS cokultiviert. Die Psi CRIP HIS Verpackungszellinie ist eine Variante der zuvor beschriebenen Psi CRIP Verpackungszellinie. Die Psi CRIP MIS Verpackungszellinie ist mit der Psi CRIP identisch außer, daß das retrovirale Hüllgen in die Zelle durch Cotransfektion mit pSV2-HIS Plasmid DNS, ein anderes dominantes selektierbares Markergen, eingeführt wurde. Die Verpackungszellinien wurden in einem 1:1 Verhältnis zur Isolierung einer homogenen amphotropen retroviralen Stammkultur von transduzierenden Partikel kultiviert. Die Superinfektion der amphotropen Verpackungszellinie Psi CRIP HIS hat zu einer Erzeugung einer stabilen Zellinie, HIS 19, geführt, die einen rekombinanten Retrovirus produziert, der das modifizierte human Faktor VIII Gen effizient transduziert. Eine antibiotische Selektion der Retrovirus produzierenden Zellinie war nicht erforderlich, um eine Zellinie zu isolieren, die einen hohen Titer an rekombinantem Virus produziert. Die genomische DNS der Zellinie ist durch eine Southern Blot Hybridisierungsanalyse charakterisiert worden, um die in der Produzenten-Zellinie vorhandene Anzahl an integrierten Kopien des retroviralen Vektors zu bestimmen. Die Kopienzahl in der Retrovirus produzierenden Zellinie liegt bei ungefähr 0,5, daraus ergibt sich, daß im Durchschnitt 50% der Psi CRIP-HIS Verpackungszellinie eine Kopie des retroviralen Vektors mit dem modifizierten Faktor VIII Gen enthalten. Der retrovirale Vektor und das modifizierte Faktor VIII Gen sind intakt ohne jegliche Deletionen oder Rearrangements der DNS in der Verpackungszellinie. Die Kopienzahl des retroviralen Vektors bleibt mit der kontinuierlichen Passage der Retrovirus produzierenden Zellinie konstant. Um den höchsten Titer an rekombinantem Retrovirus zu erhalten, erfuhr HIS 19 drei Passagen in selektiven Histidin minus Medien und anschließend vier Passagen in kompletten DMEM Medien. Zur Erzeugung der retroviralen Partikel wurde HIS 19 mit 5x10&sup5; - 1x10&sup6; Zellen in einer 10 cm Zellkulturschale ausgesät. 48 Stunden nach Aussäen und ungefähr 70% Konfluenz wurde frisches Medium (DMEM + 10% Kälberserum) zu den Platten für eine Sammlung 24 Stunden später als Quelle des rekombinanten Retrovirus für eine Transduktion gegeben.
Das modifizierte Faktor VIII Gen wurde in canine Endothelzellen, die aus der Jugularvene isoliert waren, transduziert. Die Endothelzellen wurden 4-6 Stunden mit 3x10&sup5; Zellen pro 10 cm Schale in komplettem M199 Medium mit 5% Plasma, aus Serum (Pferd) gewonnen, 100 ug/ml Heparin und 50 u/ml Endothelzellen-Wachstumsfaktor ausgesät. Die Zellen wurden dann über Nacht in M199 Medium mit 5% Plasma, aus Serum gewonnen, und 100 ug/ml Endothelzellen-Wachstumsfaktor und ohne Heparin, das sich nachteilig auf die Effizienz des Transduktionsverfahrens auswirkt, inkubiert. Die Zellen wurden frischem viralen Überstand plus Polybren (8 ug/ml) 24 Stunden exponiert. Nach Entfernen des viralen Überstands wurden die Zellen in M199 Medium mit 5% Plasma, aus Serum gewonnen, 100 ug/ml Endothelzellen-Wachstumsfaktor gegeben, um sie zu ungefähr 70-80% Konfluenz wachsen zu lassen. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Medium gegen M199 Medium mit 5% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (auf 66 ºC 2 Stunden erhitzt) und 50 ug/ml ECGF ausgetauscht. Nach einer anschließenden 24 stündigen Inkubation wurde das Medium gesammelt und auf biologisch aktiven Faktor VIII mittels Kabi Coatest getestet.
Mit dieser Retrovirus produzierenden Zellinie wurden zwischen 50% unf 75% der Endothelzellen transduziert, wie mittels Southern Blot Analyse bestimmt wurde. Das Faktor VIII Gen kann mit dieser Häufigkeit mit einer einzigen rekombinanter Retrovirus-Exposition transduziert werden und ohne antibiotische Selektion der transduzierten Zellen. Die transduzierten Endothelzellen enthalten eine intakte Kopie des rekombinanten retroviralen Genoms und des modifizierten Faktor VIII Gens ohne jegliche Deletionen oder Rearrangements, wie in Abbildung 15 gezeigt ist. Die Produktionsrate des biologisch aktiven Faktors VIII von den genetisch veränderten Endothelzellen lag bei 400 ng/5x10&sup6; Zellen/24 h.

BEISPIEL 8 In vivo Transduktion des Endothels

Mit Hilfe der rekombinanten Retrovirus Stammkulturen, die wie in den zuvor beschriebenen Beispielen hergestellt wurden, haben wir vorläufige Daten erhalten, die die in vivo Transduktion von Endothelzellen zeigen. Die Anwendung basiert auf der zuvor veröffentlichten Beobachtung (Reidy MA, Schwartz SM, Lab Invest 44:301-308 (1981)), daß eine definierte Verletzung einer Arterienoberfläche, bei der ein kleiner Streifen Endothelzellen entfernt wird, dieser freigelegte Bereich innerhalb von 72 Stunden durch Proliferation und Einwachsen neuer Endothelzellen vom Defektrand her heilt. Die Zellteilung ist für eine effektive Transduktion durch rekombinante Retroviren erforderlich und die Verletzung des Endothels mit einem Draht ist eine der vielen Möglichkeiten, um eine Endothelzellproliferation zu induzieren. Unser Verfahren verwendet Reidy's Technik einer definierten Verletzung, um eine Endothelzellproliferation zu induzieren und dann die proliferierenden Zellen Überständen, die rekombinante retrovirale Vektoren enthalten, direkt zu exponieren. Unsere ersten Experimente dokumentieren, daß dieses Verfahren in der Lage ist, Endothelzellen erfolgreich in situ zu transduzieren, und so die Notwendigkeit von Gewebekulturtechniken für eine erfolgreiche Einführung neuer genetischer Sequenzen möglicherweise zu umgehen.
Dieses Verfahren erfordert zwei chirurgische Eingriffe, beim ersten Eingriff wird die Blutgefäßoberfläche (hier für die rechte Arteria iliaca beschrieben) verletzt, was die Proliferation von Endothelzellen induziert Beim zweiten Eingriff wird der rekombinante Retrovirus auf die Zellen übertragen, die auf der Gefäßoberfläche replizieren, während der Blutstrom von der proximalen arteriellen Verzweigung unterbrochen ist, solange die proliferierenden Zellen den retroviralen Partikeln exponiert sind. Wegen der Einfachheit der Durchführung wird das Verfahren für Arteriae iliacae beschrieben.
Um den Gentransfer in vivo zu demonstrieren, verwendeten wir das 1987 veröffentlichte Markergen-Konzept (Price J, Turner D, Cepko C. 1987 Procc Natl. Acad. Scic USA 84:156-160.) (siehe Beispiel 3) mit einem verbesserten, auf dem a-SGC Vektor basierenden Vektor (Abbildungen 2d und 18). Das die beta-Galactosidase codierende LacZ Gen wurde in den α-SGC Vektor inseriert, um den α-SGC- LacZ Vektor zu erzeugen, der in Abbildung 16 dargestellt ist. Dieses rekombinante Konstrukt wurde in die Psi Crip Verpackungszellinie transfiziert und ein Klon der Psi Crip Zellen, die hohe Titer an rekombinantern α-SGC-LacZ Retrovirus produzieren, wurden, wie in Beispiel 5 beschrieben, isoliert. Die rekombinanten α-SGC-LacZ Retrovirus-Stammkulturen wurden fur eine in vivo Transduktion verwendet.
Die Versuchstiere (Kaninchen) wurden narkotisiert (Ketamin/Xylazin), beide Leisten wurden rasiert und vorbereitet, und die Tiere auf einem Operationstisch positioniert. Durch bilaterale vertikale Leistenschnitte wurde die Arteria communis, A. superficialis und die A. profunda femoris freigelegt. Auf der rechten Seite (die Seite, die verletzt werden soll) wurden kleine Abzweigungen der Arteria communis fernoris abgebunden, um sicherzustellen, daß ein Abfließen aus dem isolierten arteriellen Abschnitt nur durch die Arteria iliaca interna erfolgen würde. Falls notwendig, wurde das Leistenband geteilt und dem Gefäß in das Retroperitoneum gefolgt, um eine vollständige Kontrolle aller Seitenverzweigungen sicherzustellen. Die rechte Arteria superficialis femoris (SFA) wurde mit 3-0 Seide ungefähr 1,5 cm unterhalb des Abgangs der Profunda abgebunden, eine Kontrolle der SFA wurde an der SFA/Profunda Verbindung erreicht und eine diagonale Arteriotomie gemacht. Ein feiner Draht (die Sonde eines 20er Intracath wurde verwendet), der doppelt genommen wurde, um für die Elastizität zu sorgen, die den Kontakt mit der Gefäßwand sicherstellt, wurde durch die Arteria communis femoris und Arteria iliaca retrograd geführt, um die definierte von Reidy et al. beschriebene Verletzung herzustellen. Der Draht wurde entfernt, ein 20er Angiocath wurde in die Arteriotomie eingeführt und am darunterliegenden Muskel fur einen unmittelbaren Zugang beim nächsten chirugischen Eingriff gesichert. Die Schnitte wurden schichtweise verschlossen und die Tieren durften sich zu erholen.
Vierundzwanzig Stunden später wurde ein rekombinantes Virus enthaltender Überstand, der von einem crip Produzenten des α-SGC-Lac-Z Vektors geerntet wurde und mit Polybren auf eine Endkonzentration von 8 ug/ml supplementiert war, zur in vivo Transduktion verwendet. Die Tiere wurden wieder narkotisiert und beide Schnitte in einer sterilen Umgebung wieder geöffnet. Um eine Kontrolle der rechten iliaca Gefäße oberhalb des Bereichs, der verletzt worden war, ohne Behinderung des zuvor freigelegten rechten iliaca Gefäßes zu erhalten, wurde ein #3 Fogarty Ballon Embolektomie-Katheter durch eine Arteriotomie in die linke Arteria superficialis fernoris eingeführt, zu der Aortagabelung geführt und der Ballon aufgepumpt, um den Blutstrom zu unterbrechen. Die rechte Arteria profunda femoris wurde verschlossen. Der das rekombinante Retrovirus enthaltende Überstand (10 ml) wurde per Handinjektion durch den zuvor in die rechte SFA plazierten Angiokath eingeführt. Der Überstand floß auf retrograde Weise von der rechten Arteria communis femoris zu der rechten Arteria iliaca externa und in die rechte Arteria iliaca interna. Durch offen lassen der rechten Arteria iliaca interna war ein Ausfließen des Überstandes möglich und die gesamten 10 ml Überstand konnten eingeträufelt werden. In den bis heute durchgeführten Experimenten sind die Überstände für Zeiträume von vier bis acht Minuten der Gefäßwand exponiert worden. Die Katheter der linken und rechten Seite wurden dann entfernt, eine Hämostase erreicht und die Schnitte verschlossen.
Zehn bis vierzehn Tage später wurden die Tiere vor dem Töten narkotisiert. Nach der Narkose und vor der Freilegung wurde die Durchgängigkeit durch direktes Abtasten des distalen Gefäßes sichergestellt. Die infrarenale Aorta und Vena cava inf erior wurden chirurgisch freigelegt, eine Kanüle gelegt, und die Gefäße der unteren Extremitäten mit heparinisierter Ringer Lactat- Lösung (2 U/ml) mit physiologischem Druck (90 mm Hg) gespült. Eine letale Nembutal-Dosis wurde verabreicht und die Arterien in situ in 0,5% Glutaraldehyd in 0,1 Cacodylat 10 Minuten perfusionsfixiert. Die Aorta und beide Arteriae iliacae wurden zusammenhängend ausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Sahne (PBS) mit 1 mM Mgcl&sub2; gespült. Die Gefäße wurden dann auf LacZ Aktivität durch Inkubation in dem X-Gal Substrat für 1-1,5 Stunden bei 37ºC gefärbt. Als die Reaktion abgeschlossen war, wurde die X-Gal Lösung ausgewaschen und durch PBS ersetzt, photographiert und in Abbildung 17 gezeigt.
Zwei Experimente sind mit diesem Protokoll abgeschlossen worden. Beide Experimente zeigten eine erfolgreiche in vivo Transduktion, wie durch in situ Expression des LacZ Genprodukts in Zellen auf der Oberfläche der Arterien gezeigt wurde, was durch die selektive starke Blaufärbung in einem cytoplasmatischen Muster visualisiert wurde (Abbildung 17). Abbildung 17 A und B ist ein Segment der Arteria iliaca externa, die mit einem Draht verletzt wurde, dem α-SGC-LacZ rekombinanten Virus exponiert, fixiert und auflacz Aktivität gefärbt und in geringer Vergrößerung (Abbildung 17 A) und großer Vergrößerung (Abbildung 17 B) photographiert wurde. Man beachte die Anordnung intensiv gefärbter blauer Zellen, was mit dem Verletzungs- und Proliferationsmuster, wie von Reidy et al. beschrieben, übereinstimmt. Abbildung 17 C ist eine Photographie mit kleiner Vergrößerung der selben Arterie distal zu der Virusinjektionsstelle, die identisch fixiert und gefärbt worden ist. Dieser Bereich zeigt nur eine leichte und diffuse Hintergrundfärbung.

Hinterlegungen

Am 3 Oktober 1991 haben die Anmelder bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) das Plasmid MFG mit der Faktor VIII Insertion, hier mit der ATCC Hinterlegungsnr. 68726 beschrieben, das hier beschriebene Plasmid MFG mit der tPA Insertion mit der ATCC Hinterlegungsnr. 68727, das hier beschriebene Plasmid α-SGC mit der Faktor VIII Insertion mit der ATCC Hinterlegungsnr. 68728 und das hier beschriebene Plasmid α-SGC mit der tPA Insertion mit der ATCC Hinterlegungsnr. 68729 hinterlegt. Am 9. Oktober 1991 haben die Anmelder bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA (ATCC) das hier beschriebene Plasmid MFG mit der ATCC Hinterlegungsnr. 68754 und das hier beschriebene Plasmid α-SGC mit der ATCC Hinterlegungsnr. 68755 hinterlegt. Diese Hinterlegungen wurden entsprechend den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und zugrunde liegender Vorschrifteri (Budapester Vertrag) getätigt. Dies sichert den Erhalt einer Kultur für 30 Jahre vom Zeitpunkt der Hinterlegung an. Die Organismen sind von der ATCC entsprechend den Bestimmungen des Budapester Vertrags erhältlich und unterliegen einer Vereinbarung zwischen Anmeldern und ATCC, was eine uneingeschränkte Verfügbarkeit nach Erteilung des einschlagigen U.S. Patents sicherstellt. Die Verfügbarkeit der hinterlegten Stämme ist nicht als eine Erlaubnis zur Verwertung der Erfindung entgegen den Rechtsansprüchen aufzufassen, die mit Genehmigung einer Regierung in Übereinstimmung mit deren Patentrechten gewährt werden.

Entsprechungen

Der Fachmann erkennt viele Entsprechungen oder kann diese mit Hilfe üblicher Experimente zu den spezifischen Anwendungen der hier beschriebenen Erfindung feststellen. Diese Entsprechungen liegen beabsichtigterweise im Rahmen der folgenden Ansprüche.

Claims

1. Transduzierte Endothelzellen mit darin inkorporiertem genetischen Material von Interesse, wobei die transduzierten Endothelzellen zu einer in vivo Expression des von dem genetischen Material von Interesse codierten Polypeptids oder Proteins in der Lage sind, und besagtes genetisches Material einen retroviralen Vektor umfaßt, worin besagter retroviraler Vektor umfaßt: eine erste retrovirale LTR; einen Teil einer gag Sequenz, die eine Spleiß-Donor-Stelle umfaßt und eine Psi Verpackungssequenz, die 3' zu besagter LTR positioniert sind; eine Spleiß-Akzeptor-Stelle, die 3' zu besagter Spleiß-Donor lokalisiert ist; eine insertionsstelle für ein Gen von Interesse, die der Spleiß-Akzeptor-Stelle unmittelbar folgt; und eine zweite retrovirale LTR, die 3' zu besagter Insertionsstelle lokalisiert ist; wobei besagter Vektor kein vollständiges gag, pol, env oder selektierbares Markergen enthält

2. Transduzierte menschliche Endothelzellen mit darin inkorporiertem genetischen Material von Interesse, wobei die transduzierten menschlichen Endothelzellen zu einer ill vivo Expression des von dem genetischen Material von Interesse codierten Polypeptids oder Proteins in der Lage sind, worin besagtes genetisches Material von Interesse einen wie in Anspruch 1 beschriebenen retroviralen Vektor umfaßt.

3. Transduzierte Endothelzellen nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das genetische Material von Interesse aus DNS gewählt ist, die in normalen Endothelzellen vorhanden und von diesen exprimiert ist; DNS, die normalerweise in Endothelzellen nicht vorkommt; DNS, die normalerweise in Endothelzellen vorkommt, aber in diesen nicht in Mengen exprimiert ist, die biologisch signifikant sind; und jede beliebige DNS, die genetisch modifiziert sein kann, so daß sie in Endothelzellen transduziert und exprimiert sein kann.

4. Transduzierte Endothelzellen nach Anspruch 3, in denen das genetische Material von Interesse:

(a) ein Protein oder Polypeptid codiert, das aus einem Hormon, einem Rezeptor, einem Enzym und einem Polypeptid mit therapeutischem Wert gewählt ist; oder

(b) menschliches Parathyroid-Hormon, Gewebe-Plasminogen-Aktivator, Faktor VIII, Low-Density Lipoprotein-Rezeptor oder beta-Galactosidase codiert.

5. Transduzierte Endothelzellen (z.B. menschliche Zellen) mit darin inkorporiertem genetischen Material von Interesse, worin das genetische Material von Interesse von RNS revers transcribiert wurde, die als Teil eines wie in Anspruch 1 beschriebenen retroviralen Vektors bereitgestellt wurde, wobei die transduzierten Endothelzellen in der Lage sind, die inkorporierte DNS von Interesse zu exprimieren.

6. Ein Verfahren zur Herstellung transduzierter Endothelzellen, die inkorporiertes genetisches Material von Interesse exprimieren, das mindestens ein Protein von Interesse oder mindestens ein Polypeptid von Interesse codiert, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

a) in-Kontakt-Bringen von Endothelzellen mit Medien, die einen infektiösen rekombinanten Retrovirus mit einem rekombinanten Genom, das die DNS von Interesse umfaßt, enthalten, worin besagtes genetisches Material den wie in Anspruch 1 definierten retroviralen Vektor umfaßt; und

b) Halten der Endothelzellen und der Medien, die das wie in a) beschriebene infektiöse rekombinante Retrovirus enthalten, unter für eine Infektion der Endothelzellen in vitro mit dem rekombinanten Retrovirus geeigneten Bedingungen, wobei dadurch transduzierte Endothelzellen gebildet werden.

7. Verwendung des wie in Anspruch 1 definierten retroviralen Vektors zur Herstellung transduzierter Endothelzellen, die inkorporiertes genetisches Material von Interesse exprimieren, das mindestens ein Protein von Interesse oder mindestens ein Polypeptid von Interesse zur therapeutischen Verwendung codiert, wobei die Therapie die Schritte umfaßt:

a) Verletzen von Endothelgewebe in vivo, um die Proliferation von Endothelzelle zu induzieren;

wobei dadurch proliferierende Endothelzellen gebildet werden; und

b) in-Kontakt-Bringen der proliferierenden Endothelzellen mit einem wie in Anspruch 1 definierten infektiösen rekombinanten Retrovirus.

8. Verwendung eines wie in Anspruch 1 definierten retroviralen Vektors zur Herstellung eines Proteins oder Polypeptids zur therapeutischen Verwendung,

wobei die Therapie die Schritte Bereitstellen des Proteins oder Polypeptids dem Körper durch Transduzieren von Endothelzellen in vivo mit dem retroviralen Vektor umfaßt, wobei das Protein oder Polypeptid zum Beispiel ein Hormon, ein Enzym, ein Rezeptor oder ein Medikament ist.

9. Endothelzellen zur therapeutischen Verwendung, z.B. Bereitstellen eines Proteins oder Polypeptids dem Körper, und hergestellt durch

a) Transduzieren von Endothelzellen in vitro mit genetischem Material, das Hormone, Enzyme, Rezeptoren und Medikamente codiert, und worin besagtes genetisches Material einen wie in Anspruch 1 definierten retroviralen Vektor umfaßt und aus MFG wie oben beschrieben mit Bezug auf Abb. 19 oder α-SGC wie oben beschrieben mit Bezug auf Abb. 18 gewählt ist;

b) Einführen der transduzierten Endothelzellen in den Körper oder Applizieren der transduzierten Endothelzellen auf eine Körperoberfläche.

10. Endothelzellen zur therapeutischen Verwendung, z.B. Bereitstellen eines Proteins oder Polypeptids dem Körper, die die Schritte umfaßt:

a) Infizieren von Endothelzellen in vitro mit einem rekombinanten Retrovirus, wobei das rekombinante Retrovirus ein rekombinantes Genom besitzt, das einen wie in Anspruch 1 definierten retroviralen Vektor umfaßt und aus MFG wie oben beschrieben mit Bezug auf Abb. 19 oder α-SGC wie oben beschrieben mit Bezug auf Abb. 18 gewählt ist;

b) Einführen der transduzierten Endothelzellen in den Körper oder Applizieren der transduzierten Endothelzellen auf die Körperoberfläche; und zum Beispiel worin das Protein oder Polypeptid aus der Gruppe gewählt ist bestehend aus: einem Hormon, einem Enzym, einem Rezeptor und einem Medikament.

11. Verwendung eines wie in Anspruch 1 definierten retroviralen Vektors zur Herstellung eines Proteins oder Polypeptids zur therapeutischen Verwendung, wobei die Therapie den Schritt des Bereitstellens des Proteins oder Polypeptids dem Körper durch Infizieren von Endothelzellen 111 vivo mit dem retroviralen Vektor umfaßt, wobei der Vektor ein rekombinantes Genom besitzt, das umfaßt:

a) genetisches Material, das das Protein oder Polypeptid codiert;

b) die langen terminalen Wiederholungssequenzen, die TRNS-Bindungsstelle und die Psi-Verpackungsstelle, die von einem Retrovirus stammen; und

c) mindestens einen Promotor eukaryontischen Ursprungs; und zum Beispiel worin das Protein oder Polypeptid aus der Gruppe gewählt ist bestehend aus: einem Hormon, einem Enzym, einem Rezeptor und einem Medikament.

12. Ein in vitro Verfahren zur Reduktion der Thrombogenität eines synthetischen prothetischenen Gefäßes, wobei das Verfahren das Auftragen von Endothelzellen, die mit genetischen Material transduziert sind, das ein thrombolytisches Protein oder einen Teil davon codiert, auf das Gefäß umfaßt; worin besagtes genetisches Material mit einem wie in Anspruch 1 definierten retroviralen Vektor eingeführt ist; und zum Beispiel worin das genetische Material Gewebeplasminogen-Aktivator oder Streptokinase codiert.

13. Ein Verfahren zur Herstellung einer konfluenten Schicht von Endothelzellen, die die Innenfläche eines synthetischen prothetischenen Gefäßes auskleiden, wobei das Verfahren ein Auftragen von Endothelzellen, die ein Endothelzellen-Mitogen codierendes, inkorporiertes genetisches Material umfassen, auf die Innenfläche des Gefäßes unter für eine Endothelzellproliferation geeigneten Bedingungen umfaßt, worin besagtes genetisches Material einen wie in Anspruch 1 definierten retroviralen Vektor umfaßt und aus MFG wie oben beschrieben mit Bezug auf Abb. 19 oder α-SGC wie oben beschrieben mit Bezug auf Abb. 18 gewählt ist, und zum Beispiel worin das genetische Material einen Endothelzellen-Wachstumsfaktor codiert.

14. Ein in vitro Verfahren zur Verstärkung der Bindung von Endothelzellen an die Oberfläche eines synthetischen Gefäßes, das die Schritte umfaßt:

a) Auftragen eines Liganden auf die Gefäßoberfläche, um eine Ligand-tragende Oberfläche herzustellen;

b) Aussähen transduzierter Endothelzellen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, die inkorporiertes genetisches Material, das einen den Liganden bindenden Membran-Rezeptor umfaßt, auf die Ligand-tragende Oberfläche; und

c) Halten des Gefäßes unter Bedingungen, die für ein Binden von Ligand und Membran-Rezeptor geeignet sind.

15. Ein in vitro Verfahren zur Hemmung des Wachstums glatter Muskelzellen in einem synthetischen Gefäßimplantat, wobei das Verfahren ein Auftragen von Endothelzellen, die inkorporiertes genetisches Material umfassen, das ein das Wachstum glatter Muskelzellen hemmendes Produkt codiert, auf das Implantat umfaßt, worin besagtes genetisches Material den wie in Anspruch 1 definierten retroviralen Vektor umfaßt.

16. Ein Verfahren zur Herstellung eines prothetischenen Gefäßes mit Endothelzellen, die inkorporiertes genetisches Material von Interesse exprimieren, auf der Innenfläche des Gefäßes, wobei das Verfahren ein Auskleiden der Innenfläche des Gefäßes mit Endothelzellen, die mit dem in vitro Verfahren nach Anspruch 6 hergestellt sind, umfaßt.

17. Ein Verfahren zur Herstellung eines prothetischenen Gefäßes, das mit Endothelzellen, die inkorporiertes genetisches Material von Interesse exprimieren, ausgekleidet ist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

a) in-Kontakt-Bringen kultivierter Endothelzellen mit Medien, die ein infektiöses rekombinantes Retrovirus mit einem rekombinantem Genom enthalten, das genetisches Material von Interesse umfaßt, worin besagtes genetisches Material von Interesse einen wie in Anspruch 1 definierten retroviralen Vektor umfaßt;

b) Halten der kultivierten Endothelzellen mit Medien, die ein infektiöses rekombinantes Retrovirus enthalten, unter für eine Infektion der Endothelzellen mit einem wie in a) beschriebenen rekombinanten Retrovirus geeigneten Bedingungen; und

c) Auskleiden der Innenfläche eines prothetischenen Gefäßes mit den in b) infizierten Endothelzellen unter für ein Halten der Endothelzellen geeigneten Bedingungen.