JPH04507041A - 遺伝工学により修飾された内皮細胞およびその利用方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 遺伝工学により修飾された内皮細胞およびその利用方法この発明は、遺伝工学に より修飾された細胞およびその使用方法に関する。更に詳しくは、この発明は遺 伝子工学により修飾された内皮細胞およびその治療薬としての利用に関する。

従来、遺伝子工学により修飾された哺乳動物細胞に関する有用な提案は多数ある 。一般的に、哺乳動物細胞への遺伝物質の導入にはレトロヴイールスが用いられ て来た。すなわち、レトロヴイールスのベクターを用いて、骨髄および造血細胞 を遺伝工学的技法を用いて修飾する方法に関する有用な提案がなされて来た。一 般的に、その様な細胞の使用に際し、ある種の遺伝子の発現能力の多様性および ／または非効率的な遺伝子伝達等の難点が存在した。また、遺伝子治療（ｇｅｎ ｅ　ｔｈｅｒａｐｙ）において、繊維芽細胞、リンパ細胞、表皮細胞および肝臓 細胞等について、生存期間が長（、かつ、遺伝形質発現が安定化された遺伝子工 学により修飾された細胞を利用する提案がなされて来た。

この発明の目的は、遺伝工学により修飾された内皮細胞の取得、およびその利用 として異型のタンパク質生成能の獲得である。異型のタンパク質とは、具体的に は治療薬である。

この発明の特徴の一つは、治療薬として利用される少なくとも一種の異型のタン パク質をコードする少な（とも１個の遺伝子により形質転換された内皮細胞を与 えることである。この発明のもう一つの特徴は、治療薬として利用される少なく とも一種の異型のタンパク質をコードする少な（とも１個の遺伝子により形質転 換された内皮細胞を含有させた固体状支持体を与えることである。好ましくはこ の支持体は、血液親和性であって、例えばグラフト（植接用片）として使用され る。

更にこの発明のもう一つの特徴は、治療薬として利用される少なくとも一種の異 型のタンパク質をコードする少なくとも１個の遺伝子により形質転換された内皮 細胞を、血管中に移植することである。

更に詳しくは、この発明で用いる内皮細胞は、哨乳動物起源の細胞である。この 内皮細胞は、哺乳動物の血管から採取されたものである。ここで言う”血管”と は、動脈、静脈および毛細血管を包括する言葉として用いている。従って、遺伝 工学により修飾された内皮細胞は、太い血管および／または細い血管の全ての内 皮細胞を含む。

哺乳動物の内皮細胞は、人間あるいは人間以外の動物起源のものである。人間起 源の内皮細胞が、とくに好ましい。

この発明で用いる内皮細胞は、治療薬として利用される少なくとも】種の異型の タンパク質をコードする少なくとも１個の遺伝子により形質転換された内皮細胞 である。この細胞は、形質転換されて治療薬を分泌するか、あるいは形質転換さ れて治療薬を細胞内あるいは細胞上に蓄積するものである。

哺乳動物の内皮細胞は、少な（とも一種の治療薬を生産する遺伝子を含有してい る適切なベクターあるいは形質発現手段により形質転換されたものである。この ベクターは、哺乳動物細胞における形質発現に必要なプロモーターを含有してい る；このベクターは、例えば、ＳＶ４０．　ＬＴＲ，メタロチオネインｌ１ｅｔ ａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ　）　、ＰＧＫ　；　ＣＭＶ；　ＡＤＡ；　ＴＫ等で ある。このベクターは、また、内皮細胞より治療薬を分泌することを指令するの に適切な単一ないし複数のシグナル塩基配列を含有している。この発明で用いる 適切なプロモーターの使用は、当分野ではよく知られた技術なので、この明細書 に記載しているものに限定されない。

この発明で用いる形質発現手段あるいはベクターは、ヴイールスのベクターが適 切であるが、とくにレトロヴイールスのベクターが好ましい。治療薬を生産する 遺伝子を含有するように修飾することができる適切なベクターとして、ハーベイ 肉腫ヴイールス、　ＲＯＵＳ肉騰ヴイールス、ＭＰＳＶ　、モロニー鼠白血病ヴ イールス、ＤＮＡヴイールス（アデノヴイールス）等がある。この発明でベクタ ーの代わりに用いる形質発現手段は、プラスミツドの形態のものである。この発 明で用いる形質発現手段として、ベクター以外のものも用いられ、例えばりボゾ ーム融合、燐酸カルシウム・トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｆｏｎ ）あるいは硫酸デキストラン・トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏ ｎ）　；エレクトロボレイション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏ−ｒａｔｉｏｎ）　、　 リボフエクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ　）、タングステン顆粒（ｔａｎｇ ｓｔｅ口ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）等が用いられるる。

この発明において形質転換に用いられる適切な形質発現手段は、当分野ではよく 知られた技術なので、この明細書に記載されているものに限定されない。

内皮細胞の形質転換のために用いる形質発現手段どして、レトロヴイールスのベ クターを使用する際には、該ヴイールスの内皮細胞中でのレプリカ（ｒｅｐｌｉ ｃａｔｉｏｎ　）の機会を消滅するか、および／または最小とする処理をしなけ ればならない。

ヴイールスのレプリカが皆無であるヴイールスベクター粒子を生成するヘルパー 細胞を与える方法に関しては、様々な方法が知られている。例えば、ｌＪａｒｋ ｏｗｉｔｚ、　ａｔ　ａｌ、、　”Ａ　ｓａｆｅＰａｃｋａｇｉｎｇ　Ｌｉｎｅ 　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ：　Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ　Ｖｉｒａｌ 　Ｇｅｎｅｓｏｎ　Ｔｗｏ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｐｌａｓ＋＋＋ｉｄｓ、”　 Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、　６２゜Ｎｏ、　４．ｐｇ ｓ、　１１２０−１１２４　（Ａｐｒｉｌ　１９８８ｉ；　１ｌａｔａｎａｂｅ 、ｅｔ　ａｌ、。

Ｃ，ｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　）ｆｅｌｐｅｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅ 　ｆｏｒ　ＡｖｉａｎＲｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓｉｓ　Ｖｉｒｕ ｓ　ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕ ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ３１．　Ｖｏｌ、　３．　Ｎｏ、　１２．　ｐｇｓ、　２ ２４１−２２４９（Ｄｅｃ、１９８３）；　Ｄａｎｏｓ、ｅｔ　ａｌ、、　”５ ａｆｅ　ａｎｄ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　Ｇｅｎｅｒａｔｊｏｎｏｆ　Ｒｅｃｏｍ ｂｉｎａｎｔ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　ｗｉｔｈ　Ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ 　ａｎｄＥｃｏｔｒｏｐｉｃ　Ｈｏ５ｔ　Ｒａｎｇｅｓ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、、　Ｖｏｌ、８５．ｐｇｓ。

６４６０−６４６４　ｆｓｅｐｔ、１９８８１；　ａｎｄ　Ｂｏｓｓｅｌｍａｎ 、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　Ｃｈ−ｉ＠ｅｒｊｃ　Ｈｅ１ｐ ｅｒ　Ｐｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄＦａｃｔｏｒｓ　Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ　Ｇ ｅｎｅｒａｔｉ−ｏｎ　ｏｆ　（：ｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｖｉｒｕｓ；Ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏ１ｏｎｅｙ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｌｅｕ−ｋｅｍｉａ　Ｖｉ ｒｕｓ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌＧｅｎｅｓ　ｖｉａ　ｔｈｅ　Ｍｅｔａｌｌｏｔ ｈｉｏｎｅｉｎ　Ｐｒ−ｏｍｏｔｅｒ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａ＋司Ｃｅ１ｌｕ ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、７．　Ｎｏ　５．　ｐｇｓ、　１７９７− １８０６１Ｍａｙ　１９８７）等の論文において、ヴイールス粒子中にレプリカ するヴイールスを含有する機会を最小とするヘルパー細胞の生成方法が開示され ている。この方法およびその他の方法は、レトロヴイールスのベクターを用いて 内皮細胞を遺伝工学的に形質転換する時に用いられる。

この発明の方法により、遺伝工学的技法を用いて形質転換される内皮細胞は、哨 乳動物から分離され、上述の様に、この内皮細胞は、動脈、静脈あるいは毛細血 管等の適切な器官から分離される。哺乳動物の血管より内皮細胞を採取する方法 は、一般によく知られている技法であり、後述する実施例において、その代表的 な方法が開示される。

この発明で述べる治療薬の生産を指令する遺伝子を遺伝工学的技法を用いて導入 した内皮細胞について更に詳細に説明する。しかし、それによりこの発明は制限 されることはない。

例えば、この発明の内皮細胞には、治療薬ではないタンパク質の生成を指令する 遺伝子、例えばベータガラクトシダーゼｆｂｅｔａ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓ ｅ　）等のマーカー（ｍａｒｋｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ）などを遺伝工学的技法を 用いてに導入することができる。

適切なベクター、好ましくはレトロヴイールスのベクターを用いて治療薬の生産 を指令する遺伝子を内皮細胞中に遺伝工学的技法を用いて導入する。後述の実施 例中に、このレトロヴイールスのベクターを、内皮細胞中に遺伝工学的技法を用 いて導入する代表的な方法が記述されている。また、この様な一般的な方法およ びその他の方法が、哺乳動物の内皮細胞中に治療薬の生産を指令する遺伝子以外 の各種遺伝子を導入する場合においても用いられている。一方、実施例に見られ る様に、この方法における基本的工程として、適切なプロモーターおよび治療薬 の生産を指令する遺伝子ＤＮＡをレトロヴイールスのべりターに導入する工程を 含んでいる。更に、このレトロヴイー・ルスのベクターは、適切なプロモーター および治療薬の生産を指令する遺伝子の外に、例えばネオマイシン非感受性遺伝 子、あるいは遺伝子の形質発現を促進する核酸塩基配列等の選択遺伝子を含有し ている。

この適切なベクターは、この発明が目的とする治療薬中の少な（とも一つの生産 を指令する遺伝子を含有しており、これは、遺伝工学において、通常用いられる 技法により、哺乳動物の内皮細胞中に導入される。

この発明の一つの特徴は、遺伝工学により修飾された内皮細胞、特に少なくとも 一種の治療薬の生産を指令するる少なくとも１個の遺伝子により形質転換された 内皮細胞は、固体状支持体に固定化されることである。この固体状支持体は、と くに血液に親和するものであって、遺伝工学により修飾された内皮細胞を包接し た後、この発明の治療薬により治療を受ける患者の血液と接触させて使用する。

例えば、この固体状支持体は、体外からの血液循環装置に装着するか、あるいは 血管中に移植した状態で使用するのが好ましい［”血管中に移植した状態”中に は、手術により形成した血管のバイパスあるいは切り替え路（シャント）も含ま れる］。この移植は、グラフトの方式をとるのが普通でる〔”グラフト”中には 、シャントあるいはバイパスも含まれる］。しかしながら、この固体状支持体は 、平板状、紐状、寒天状等の様々な形態を呈する。

ある種の治療薬の生産を指令する遺伝子を含む遺伝工学により修飾された哺乳動 物の内皮細胞は、哺乳動物の血管中に移植される。この発明に基づいて、遺伝工 学的技法により修飾を受ける哺乳動物の内皮細胞は、哺乳動物より採取され、か つ、修飾を受けた後、同種の哺乳動物の血管中に移植される。遺伝工学的技法に よる修飾を受けた哺乳動物の内皮細胞は、該細胞の分離起源である哺乳動物その もの、即ち自分の器官あるいは組織中に移植されるのが好ましい。従って、治療 を受ける患者の血管から内皮細胞を採取し、それを、少なくとも１種の治療薬の 生産を命じる遺伝子を含有するように遺伝工学により修飾し、および該被修飾細 胞を、内皮細胞を採取した元の患者の血管中に返還移植するのが好ましい。この 様にして、自分の細胞であって、かつ、それが遺伝工学により修飾された後、患 者に移植されて、治療に必要な薬をｉｎ　ｖｉｖｏで生産させる治療方法、即ち 遺伝子治療法に利用するのが好ましい。

この発明で用いる遺伝工学により修飾された内皮細胞は、固体状支持体に含有せ しめた状態で血管中に移植するか、あるいは固体状支持体を用いることなく直接 、血管上に移植するかして使用される。遺伝工学により修飾された内皮細胞は、 また、固体状支持体に含有せしめた後、体外血液循環装置に装着して患者の血液 と接触させることもできる。

この発明で用いる遺伝工学により修飾された哺乳動物の内皮細胞は、該細胞を含 有するグラフトとして血管中に移植して使用する。この遺伝工学により修飾され た哺乳動物の内皮細胞を含有するグラフトは、その細胞の分離源である元の血管 中に挿入される。この様にして、この発明の一つの特徴に基づいて。

それが人間を含む哺乳動物であり、かつ、遺伝的修飾に供する細胞の分離源であ る元の哺乳動物への返還において優れている、遺伝工学により修飾された内皮細 胞を含有するグラフトが得られる。

この発明で用いるグラフトは、種々様々の形をしたグラフトの一つであり、その サイズは様々である。即ち、このグラフトは、動脈、静脈、あるいは毛細血管に 移植する。適切なグラフトとして、どの形およびサイズを選ぶかにっては、この 分野ではよく知られているので、この明細書に記載されているものにより限定さ れない。大抵の場合、人ニゲラフトが適しているが、この発明の意図するところ は、細胞の分離源である元の血管に対して、遺伝工学により修飾された内皮細胞 を含有するグラフトを通じて細胞を再び元の血管へ返還することができることで ある。従って、”グラフト”は天然的なもの及び人工的なものの両方からなる。

この発明に基づく遺伝工学により修飾された内皮細胞を適切なグラフト上に接種 することにより該細胞をグラフトに供給することができる。実施例において、代 表的なグラフトおよびその製造方法を述べる。しかし、グラフトについては、こ の分野ではよく知られているので、それによりこの発明が制限されることはない 、他のグラフトおよび内皮細胞をグラフトに接種するその他の方法については、 この分野ではよく知られた方法であり、それらの方法も、この発明において用い ることができる。例えば、Ｈｅｒｒｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　Ｅｄｓ、　Ｅｎｄｏ ｔｈｅｌｉａｌ　Ｓｅｅｄｉｎｇ　１ｎＶａｓｃｕｌａｒ　Ｓｕｒｇｅｒｙ　ｆ Ｇｒｕｎｅ　＆　５ｔｒａｔｔｏｎ、　Ｉｎｃ、　０ｒｌａｎｄｏ、１９８７） ；ＺＬｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ　Ｅｄｓ、　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏ ｎ　ｏｆ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｇｒａｆｔｓ。

１ｓｔ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐｓ　ｏｎ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　ｉｎ　Ｖａｓ−ｃｕｌａｒ　Ｓｕｒｇｅｒｙ、　Ｖｊ ｅｎｎａ、　Ｎｏｖ、　５−６　ｉＫａｒｇｅｒ、Ｂａ５ｅｌ、１９８６１であ る。これらの報告中にはグラフトの代表的材料として、ポリスチレン（例：ＤＡ ＣＲＯＮｌ　；圧延したポリテトラフルオロエチレン（ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌ ｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ　）　ｆＧｏｒｅ−Ｔｅｘｔ；ポリウレタン（ｐｏｌ ｙｕｒｅｔｈａｎｅｓ）　；ポリウレタン被覆物；フロリダ州マイアミにあるコ ルビタ社の製品でるシリコーンで被覆されたポリウレタン：内皮細胞をステント （５ｔｅｎｔ）　（植皮固定鋳型）に固着可能とする基質で被覆した管状のスロ ットを有するステンレス製ステント（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａ、ｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏ ｎ社製）；および天然の血管等が用いられている。

グラフトに遺伝工学により修飾された内皮細胞を含有させた後、宿主の血管中に 挿入される。適切な血管中にグラフトを移植する方法についてはこの分野ではよ く知られており、その様な方法は、いずれもこの発明において使用し得る。

患者の血管より内皮細胞を採取し、それを遺伝工学により修飾した後、固体状支 持体に固着することなく、直接、元の患者の血管に戻すこともできる。

遺伝工学により修飾し、適切な治療薬を生産するようにさせた内皮細胞は、血液 中にその治療薬を分泌することができるが、この場合その治療薬は、その内皮細 胞を移植した血管中の細胞および組織の近辺に作用するか、あるいは移植部位か ら離れた血管中の細胞および組織に作用するかのどちらかである。

これとは別に、その治療薬は、移植した遺伝工学により修飾された内皮細胞から 分泌されることなく、細胞内あるいは表面に蓄積した状態で、血管の細胞および 組織に浸透する物質を介して作用することもある。そのの様に作用する治療薬と しては、例えば、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ　）は移植した細胞内に蓄積 し、難治の複合免疫疾患において血液中に蓄積するアデノシンを不活性化する。

また、フェニールアラニンデヒドロゲナーゼは移植した細胞内に蓄積し、フェニ ールケト尿症における有毒代謝産物であるフェニールアラニンを不活性化する。

以上説明した様１乙この発明の内皮細胞とは、異型のタンパク質を少なくとも１ 種、好ましくは治療薬、の生産を指令する遺伝子により形質転換されたものであ る。ここで用いる治療薬とは、広義の言葉であって、宿主に生理的利益を与える 全ての薬剤あるいは物質を意味している。かかる治療薬は、１種あるいは１種以 上のタンパク質である。その代表例としては、ＣＤ−４；ファクターＶＩＩＩ、 ファクターＩｘ、ホンウィルブランド因子。

ＴＰＡ　、ウロキナーゼ、ヒルディン、インターフェロン；ＩＩ！瘍壊死因子、 インターロイキン、造血細胞成長因子（ＧＣ３Ｆ、　６ＭＣ５Ｆ。

ＩＬ３．エリスロボイエチン、免疫抗体、グルコセレブ口シダーゼ、ＡＤＡ；フ ェニールアラニンハイドロキシラーゼ、人間成長ホルモン、インシュリン等があ る。これらの治療薬の生産を指令する遺伝子の調整方法については、当分野でよ （知られた技法であるから、上記の遺伝子によりこの発明が制限されるものでは ない。

この発明の遺伝工学により修飾された内皮細胞の利用については、遺伝工学によ り修飾された各種の内皮細胞の混合物、例えば−の治療薬の生産を指令する遺伝 子により遺伝工学的に修飾された内皮細胞と、それとは別の治療薬の生産を指令 する遺伝子により遺伝工学的に修飾された内皮細胞の混合物を用いることができ る。また、独立の内皮細胞に対して１種以上の遺伝イを用いて遺伝工学により修 飾することも可能である。

この発明の遺伝工学により修飾された内皮細胞は、単独で血管中に移植されるか 、あるいは遺伝工学により修飾された別種の内皮細胞と組み合わせて移植される か、あるいは平滑筋の細胞、線維芽細胞、神経膠細胞、上皮細胞等の内皮細胞以 外の細胞の遺伝工学的被修飾細胞と組み合わせて移植される。

この発明においては、遺伝工学により修飾された内皮細胞は、その細胞が生産す る治療薬を、直接、血液中に分泌する。

この場合、遺伝工学により修飾された内皮細胞が直ちに循環血液と接触するので 、その治療薬の効果保持および搬送が迅速化される。

この発明の遺伝工学により修飾された内皮細胞に対して、細胞の増殖を高める遺 伝子および／または形質発現頻度を高める遺伝子を含むベクターを、選択し、導 入することによって、患者の治療に必要な治療薬を十分量、血管中で生産させる ことができる。また、患者の血管に移植する遺伝工学により修飾された内皮細胞 の数を決定する際には、治療薬の半減期、血管の体積、遺伝工学により修飾され た内皮細胞の治療薬の生産速度、および患者に対する最適投与量等の因子を考慮 しなければならない。この様な遺伝工学により修飾された内皮細胞およびその修 飾に用いるベクターの選択は、生産する治療薬の種類に依存するが、その選択は 、当分野ではよ（知られた技術であるから、この明細書に記載されている選択技 術によってこの発明が制限されることはない。

図１ａ　−１ｄは、この発明で使用するベクターの模式図を示している。以下、 実施例においてこの発明を更に詳細に説明するが、それによりこの発明が制限を 受けることはない。また、この実施例においては、特別に規程しない限り、制限 酵素による切断法、切断片の接合法、形質転換法等については、Ｍａｎｉａｔ、 ｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｅｄｓ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　 Ｉ−ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ”に記載されている方法を用いた。

実施例　Ｉ Ａ、　ラット成長ホルモンを生産する内皮細胞を遺伝工学的技法で作成するのに 必要な、レトロヴイールスベクターＰＧ２Ｎ　（本明細書添付図）を構築するた めに、ＳＶ４０で始動されるネオマイシン非感受性遺伝子およびラット成長ホル モンｃＤＮＡを、レトロヴイールスベクターｐＢ２　（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 ｏｆ　Ｍｏ１．ｅｃｕｌａｒ　Ｈｅｍａ−ｔｏｌｏｇｙ、　ＮＩＨより入手）に 導入した。ラット成長ホルモンｃＤＮＡは、プラスミツドＲＧＨ−１，［Ｎａｔ ｕｒｅ　２７０，４９４　（１，９７７１１を制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ　 Ｉ　およびＭａｅ　ＴＩＩ　（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ＋ｍ　Ｒｉ ｏｅｈｅａｉｉｃａｌｓ社製）で切断して取得した。コノラット成長ホルモンｃ ＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動法で分離した後、ガラスビーヅ（ジェネクリ ーン＋Ｂｉｏｌ旧、　ＬａＪｏｌｌａ社製、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）対し吸着 ／脱着を行って精製した。該ｃＤＮＡを、更にＤＮＡポリメラーゼ（ＫＬｅｎｏ ｗ、’　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏ］、ａｂｓ社製）の高分子フラグメン トとヌクレオタイド三燐酸を用いて精製した。次いでこの高分子フラグメントを ジエネクリーンで精製した。

このＢ２ベクターは、Ｎ２中のＮｅｏＲ遺伝子［Ｍ、Ａ、　Ｅｇｌｉｔｉｓ、　 Ｐ。

にａｎｔｏｆｆ、　Ｅ、　Ｇ１１ｂｏａ、　Ｗ、Ｆ、　Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　５ ｃｉｅｎｃｅ　２３０．１３９５ｆ１９−８５１；　Ｄ、　Ａｒｍｅｎｔａｎｏ 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６１．１６４７　ｆ１９８７１：お よび本明細書添付図に示したもの］を、マルチプルクローニング位置で、置換す るために構築した。先ずＮ２をＥｃｏ　ＲＩで切断して、隣接のＭｏＭＬＶフラ ンキング塩基配列を伴った５°ＬｔＲおよび３’ＬＴＲの両方を解放させた。３ “ＬＴＲのフラグメントは、プラスミツドＧＥＭ４　（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏ ｔｅｃｈ社製）のＥｃｏＲＩの位置に挿入した。次いで、フランキングギャグ塩 基配列を伴った５　’　ＬＴＲのフラグメントを、Ｃ１ａ　Ｉで切断し、それに リンカ−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩを添加した後、該フラグメントをｐＧＥＭ４の位置に 挿入した。

このｐＢ２ベクターを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｃＴＩ　（ＮｅｗＥｎｇｌ ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で切断した後、仔牛のアルカリフォスファターゼ （Ｂｏｅｈｒｉｒ＋ｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製 ）を用いて燐酸化した。このｐ口２プラスミツドをジエネクリーンで精製した。

このｐＢ２ベクターおよびラット成長ホルモンｅＩ）ＮＡをリガーゼＴ４　（Ｎ ｅｗ　Ｅｎｇｌａｒ＋ｄ　Ｂｌｎｌａｂｓ社製）を用いて接合した。

次いで、この接合物をバクテリアＤＨ５（Ｂｅｔｈｅｓ　ｄａ　Ｒｅ５ｅａｃｈ １、ａｂｓ社製）中に形質転換した。このバクテリアのコロニーについて、ラッ ト成長ホルモンｃＤＮＡ含有ベクターを含有するコロニーなスクリーニングした 。この新しいベクターをｐＧ２と称した。次いで、ｐＧ２をＢａｍＨＩ　（Ｎｅ ｖｉ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で切断し、ジェネクリーン（Ｂｉ ｏ　１０１）で精製し、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　 Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて更に精製した。３４０箇の塩基対を有する５Ｖ− ４０で始動させたネオマイシン非感受性遺伝子フラグメントを、ｐＳＶ２ＣＡＴ プラスミツド（ＡＴＣＣアクセツションＮｏ、　３７１５５　）のＰｖｕ　ＩＩ および旧ｎｄ　ＩＩＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ、ａｎｄＢｉｏｌａｂｓ社製）によ る切断物中からアガロースゲル電気泳動法を用いて分離し、ジエネクリーンで精 製した。次いで、この５ｖ４０−ネオマイシン非感受性フラグメントを、リガー ゼＴ４　（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いてｐＧ２と接合 し、それを、バクテリアＤＨ５（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　Ｌａｂｓ 社製）中に形質転換した。このバクテリアのコロニーをスクリーニングして取得 した構築プラスミツドをｐＧＮ２と称した。

本明細書の添付図中に示したＳＡＸベクターは、Ｐｒｏｅ、　Ｎａ、ｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：　６５６３　［１９８６１中に記載の方 法で取得した。

本実施例で用いたりコンビナンドベクター（Ｎ２．　ＳＡＸ、　Ｇ２Ｎ１は、構 成ベクターを各々別個に、近時入手可能なアンフオトロビヅク　バッケジング　 ラインＰＡ１２　［５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：　６３０（１，９８４＋］および ＰＡ３１７　［Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　６：　２８９５　（１９８ ６１）を含有するレトロヴイールス　ベクター　バッケジング　ライン、　およ びエコトロピック　ラインＰｓｉ２　［Ｃｅ１１３３・１５３（ｔ９ａ３）　］ に導入して調製した。これらのラインは、ヘルパーヴイールスを含有しないレト ロヴイールスのベクター顆粒を生成させるために調製した。

大動脈内皮細胞は、ニューシーラント白兎（２−５ｋｇｌから、Ｒｙａ、ｎらが 仔牛の肺動脈より内皮細胞を採取した方法［Ｕ、Ｓ。

Ｒｙａｎ、Ｍ、１４ｏｒｔａｒａ、Ｃ，Ｗｈｉｔａｋｅｒ、Ｔｉ５ｓｕｅ　＆　 Ｃｅ１ｌ　１２，６１９ｆ１．９８０＋］用いて、取得した。この兎を麻酔（１ ｍｌのペントバービタルナトリウム）し、大動脈を分離し、次いで抗生物質３Ｘ を含有するＨａｎｋｓの緩衝化生理食塩水に浸漬した。この器官を縦に切り開き 、その口径表面を、各領域を一回だけ掻き取るよう注意を払い、スカルベル＃１ １を用いて掻き取った。この分離組織をＲｙａｎ　Ｒｅｄ　培地［Ｒｙａｎ　ｅ ｔ　ａｌ、　Ｊ、　Ｔｉ５ｓｕｅ　（：ｕｌｔ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ。

１．０：３　Ｆ１９８６］　］中で増殖させ、内皮’ｉｓ１．ａｒ＋ｄｓ″を選 ぶことによって精製し、かつ、ゴム製ポリスマンを用いてプライマリ７２５ｃｍ ″フラスコに移して培養した。

組織培養皿（１００ｍｍ径、Ｃｏ５ｔａｒ社製）に培養した組織をスカルベルを 用い集めた。５ｍｌ容ピペット中で１０〜２０回組織を攪はん崩壊した後、Ｒｙ ａｎ　Ｒｅｄ培地　８ｍｌを容れた組織培養皿（２ｍ＠　Ｘ　１００ｍｍ　ｌに 移した。−晩インキユベートした後、培養物を取分けて得たレトロヴイールスベ クターを含む上澄液５ｍｌに、ポリブレンを最終濃度８　ｕ　ｇ／ｍ　１になる ように添加した。２時間インキュベートした後、培養皿中にＲｙａｎ　Ｒｅｄ培 地培地５奢ｌ充した。この細胞を一晩インキユベートした後、培地を新しいＲｙ ａｎ　Ｒｅｄ培地８　ｍ　ｌに代えた。更に一晩インキヱベートした後、Ｇ４１ ８を最終濃度２００μｇ　／　ｍ　１になるように添加した。この細胞に対して 、３−４日毎に６４１８を２００ｕｇ／　ｍ　１濃度溶解したＲｙａｎ　Ｒｅｄ 培地を補充した。この様にして得た培養細胞を、最後に、Ｇ４１８を含まないＲ ｙａｎ　Ｒｅｄ培地中に保持した。

０４１８含有細胞培養液から抽出した６２Ｎ導入ＲＡＥＣを、ゴム製ポリスマン を用いて２本のＴ７５フラスコ中の培養液から取得し、かつ５ｍｌのＲｙａｎ　 Ｒｅｄ培地中に懸濁した。この懸濁細胞を、＃２３ニードルを着けた６ｃｃ容シ リンジで６−７回崩壊した。この細胞をベレットとして分離し、１．２５ｍ１の Ｒｙａｎ　Ｒｅｄ培地に再懸濁した。−個の血管クランプを、１０ｃｍＸ　２ｍ ｍ（内径）のシリコーンで被覆されたポリウレタン製グラフトであるコーヴイタ 　グラフト（（：ｏｒｖｉｔａ　（：ａｒｐ、、　Ｍｉａａ＋ｉ、　ＦＬ社製） の一つに取り付けた。この細胞懸濁液をよく撹はんし＃２０ニードルを着けた３ ｃｃ容シリンジを用いて一端が開放されたグラフト中に移した。このグラフトの 開放された一端を一個の血管クランプで塞いだ後、それをＲｙａｌ　Ｒｅｄ培地 で満たされた５０ｍ１容のコニカルチューブに移した。この両端を密閉したクラ フトをバラフィルムで包み、回転瓶中に移した。この回転瓶を５％Ｃ０２で平衡 化した、３７℃雰囲気をゆうするインキュベータ中に入れた。このインキュベー タ中で、向こう９日間、定期的に回転させて保持した。しかる後、このグラフト を７７５フラスコ中に入れ、向こう４週間に亘り、新鮮な培地を供給し、定期的 にサンプリングしてラット成長ホルモン生産量を測定した。

その結果、ラット成長ホルモンは、グラフト移行後、少なくとも４週間に亘り、 培地中に約１１０００ｎ／１０＠ｃｅｌｌｓ／ｄａｙの速度で分泌され続けたこ とが、下記した様に明らかにされた。

グラフト上の細胞数　ラット成長ホルモン生産量６　Ｘ　１０’（ｃｅｌｌｓ／ ｃｍ”ｊ　ｎｇ／　１．０’　ｃｅｌｌｓ　／２４　ｈｏｕｒｓ１３　日目　９ ３０ ３２　日目　１０６０ Ｂ、前述の方法を用いて、　ＳＡＸベクターが導入された兎肉皮細胞を作成した 。この細胞は、人間のＡＤＡを生産する形質を有した。

Ｃ，プラスミツドｐＴ４Ｂ　（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ　 ａｎｄ　ＳｕｒｇｅｏｎｓＣｏｌｕｌｌｂｉａ　Ｕｎｊ、−ｖｅｒｓｉｔｙ、　 Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎｅｗ　ＹｏｒｋのＲｉｃｈａｒｄ　Ａｘｅ１氏より贈ら れた）を含有するＣＤ４を、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＢａ＋ｉ　 ＨＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　Ｂｅｖｅｒｌｙ　ＭＡ社 製）切断することによりＣＤ−４遺伝子を遊離させた後、該遺伝子をアガロース ゲル電気泳動で分離し、かつガラスピーズ（ジエネクリーンＢｉｏ　１０１．　 Ｌａ　Ｊｏｌｌａ　ＣＡ社製）に対する吸着／脱着を繰り返して精製した。この ＣＤ４フラグメントを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼＮｅｗ　Ｅｎ−ｇｌａｎｄ　Ｂｉ ｏｌａｂｓ社製）を用いて、Ｅｃｏ　ＲＩ　＋Ｂａｍ　ＨＩカットブルースクリ プト　クローニング　ベクターＳｔｒａｔａｇｅｎｅＣａ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ　 ＣＡ社製）中に接合した。この接合物を、ＤＨ５αバクテリア（Ｂｅｔｈｅｓｄ ａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ　ＭＤ社製）中 へ形質転換し、その白色コロニーを分離し、プラスミツドｐ（：ＤＷの挿入に適 切な大きさを有するものを選択した。　ＣＤ４遺伝子に対する形質発現ベクター を含む適切なプラスミツドを作成するために、プラスミツド５Ｖ２ｎｅｏ　（Ａ ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋ ｖｉｌｌｅ　ＭＤより入手）をＨｉｎｄ　３　ｐｌｕｓ　Ｈｐａ　Ｉで切断し、 かつ、ｐＵｃ−１３ベクタ−ｔＰｈａｒａ＋ｍ１ｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａ ｙ　ＮＪ）から得た合成ポリリンカー塩基配列を、Ｔ４　ＤＮＡ　リガーゼを用 いて、ｐｓＶＺｎｅｏ中のｎｅｏ遺伝子の場所へ挿入した。この接合物を、　Ｄ Ｈ５バクテリア（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ社製）へ形質転 換し、ベクターｐＳＶＰＬを生産する前記ポリリンカーにのみ係わる制限酵素作 用位置を有するコロニーをスクリーニングした。

Ｘｈｏ　ｌ１ｎｋｅｒ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を、 ｐＳＶＰＬＸを生産するＳＶ４０　ｅａｒｌｙ　ｒｅｇｉｏｎプロモーターの５ °側上のＰｖｕ　ＩＩ位置へ挿入することによって、上記のｐｓｖｐｔ、発現ベ クターを更に修飾した。

このプラスミツドｐｃｎｗ及びｐＳＶＰＬＸを、）Ｉｉｎｄ　３　＋　Ｘｂａ　 Ｉ　（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて切断し、それらの プラスミツドのＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動分離およびジェネクリーン精 製により分離した。このＣＤ−４フラグメントをｐＳＶＰＬＸベクター中へ接合 し、　ＳＶ４０　ヴイールスｅａｒｌｙ　ｒｅｇｉｏｎプロモーターを作用させ てＣＤ−４遺伝子生産物の発現を完全に行わせた状態で、ｐｓＶｃＩＩＷを生産 するコロニーをスクリーニングした。次ぎの段階は、ＣＤ−４遺伝子を、細胞外 生産物として細胞から分泌させることであった。

水溶性のＣＤ−４を調製するために、ＣＩ］−４遺伝子の変異型を生成する、特 別にデザインされたオリゴヌクレオタイドアダプターを用いた。このアダプター は、それがＣＤ−４遺伝子のＮｈｅ　Ｉ位置に挿入されると、Ｎｈｅ　Ｉ位置を 再生成し及び新しいＨｐａ　１位置を創出しながら、ＣＤ−４のアミノ酸結合配 列指令を途中で中止するというユニークな性質を有する。このオリゴヌクレオタ イドアダプター（Ｍｉｄｌａｎｄ　ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ　ｒｅａｇｅｎｔ　（： ｏ、により合成された）は、２個の燐酸化オリゴヌクレオタイドを接合、即ち５ °ＣＴＡＧＣＩ丁ＧＡＧＴＧＡＧＩＴ３　’およびＡＡＣＴ（：ＡＣＴＣＡＡＧ をｐｓＶｃＤＷの位置に接合することにより調製された。この接合反応生成物を Ｈｐａ　Ｉにより切断した後、Ｘｈｏリンカ−（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉ ｏｌａｂｓ社製）を添加した。このリンカ−反応を、６５℃で１５分間加熱する ことにより停止した後、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏ　ｒ　（ＮｅｗＥｎｇｌ ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で切断した。反応生成物をアガロースゲル電気泳 動にかけ５Ｖ４０−（：Ｄ４　アダプターを分離し、ジェネクリーンで精製した 。このレトロヴイールスのベクターＮ２は、Ｘｈｏ　Ｉによる切断および仔牛の 腸起源のフォスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、　Ｉｎ ｄｉａｎ−ｐｏｌｉｓ　ＩＮ社製）による処理により、５Ｖ４０−ＣＤ４−ａｄ ａｐｔｏｒフラグメントを受け取るために調製された。ＣＤ−４遺伝子に対する 形質発現因子の接合は、ベクター比率５：１で行い、次いでＤＨ５バクテリア（ Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｓ社製）へ形質転換した。制限エン ドヌクレアーゼ切断による分析を行って、形質転換ＤＮＡが適切位置に挿入され ている構築物をスクリーニングし、それを大規模培養した。ＳＶ４０ヴイールス 　プロモーターがヴイールス起源ＬＴＲと同じ位置にある構築物は、ＳＳＣと称 され、反対にヴイールス起源ＬＴＲがＳＶ４０　ｖｉｒｕｓ　ｐｒｏ＠ｏｔｅｒ の位置にある構築物は、　５ｃｓｃと称される。

このＳＳＣベクターを、Ｍｉｌｌｅｒらが前に報告している様に、ＰＡ３１．７ セル　ライン中に挿入することにより水溶性ＣＤ−４タンパク質を生成すること ができるＰＡ３１７細胞を得た。

このＳＳＣベクターが挿入されたＰＡ３１７細胞を、前述の様に家兎内皮細胞へ の形質導入に使用した。

この形質導入された内皮細胞は、水溶性ＣＤ−４の形質を発現した。

Ｄ、　１（ＢＧＦ−４を含むコラーゲンのスポンジを、ラット腹腔内、肝臓の近 くに移植した［５ｃｉｅｎｃｅ　２４１．１３４９　ｆ１９８８１］。

移植後７−１０日目に、スポンジを外科手術により取り出し、組織培養用インキ ュベータ（５％ＣＯ２雰囲気）中にて、コラゲナーゼを１．　ｍ　ｇ　／　ｍ　 １濃度含有する燐酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ　）中、３７℃、３０−６０分間 、酵素分解した。放出された細胞を、遠心分離（１０ｗｉｎ、、　１１０００Ｒ Ｐ、　２０℃）により集め、細胞をＰＢＳ　１回洗い、遠心分離してベレットを 得た。細胞を下記組成の培地３０ｍ１に再懸濁し：Ｍ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ社 製） ＥＣＧＦ　（脳組織粗エキストラクト）　７．２ｍｇヘパリン（Ｕｐｊｏｈｎ社 製）　７５０　ｕｎｉｔｓ２ｏ％−仔牛の大動脈あるいは人間のヘソ静脈内皮細 胞の４８時間培養物の上澄液 １０％−仔牛脂児の血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）３０００ユニット−ペニシリン Ｇ　（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ社製）３０００ユニット−ストレプトマイシン硫酸塩 （Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ社製） それを１人間のフィブロネクチンをｌｕｇ／ｃｍ’濃度被覆した１００ｍｍ径の 組織培養ディスク上に、１６時間、靜置した。

靜置した細胞をＰＢＳで３回洗い、上記の培地１５ｍ１を与えた。この工程の期 間中、２日毎に、新鮮な培地に交換した。

下記の工程により、Ｎ−７，ＳＡＸ、　ＧＮ２およびＳＳＣベクターの形質が導 入されたラット内皮細胞を調製した：１、、２　Ｘ　１０’ミクロ内皮細胞（ｍ ｏｎｏｌａｙｅｒ　８０％ｃｏｎｆｌｕ−ｅｎｔ） ２．２Ｘ１０’ヴイールスの上澄液 ３、ポリブレン（８μｇ／ｌ１ｌｌｌ −全量が５ｍｌになるように、１，２，３．を合わせ３７℃（５％Ｃｏ、）下、 ２−３時間、インキュベートする。

−３７℃（５％Ｃｏ、＞下、１６時間のインキュベートにおいて新鮮な組織培養 培地２０ｍ１を補充する。

−ヴイールスを含む培地を吸引除去し、新鮮な培養培地を補充する。

−４８−９６時間後に、６４１８　ｆ８００μｇ／■ｌ）を添加し、かつ、培養 培地を補充する。

−１−２週の間、２日毎に交換する培地を選択する。

ＮＪを形質導入した細胞は、ｎｅｏｍｙｃｉｎの生産を発現した。ＳＡＸ形質導 入した細胞は、ＡＤＡの生産を発現した。ＧＩＮを形質導入した細胞は、ラット 成長ホルモンの生産を発現した。　ＳＳＣを形質導入した細胞は、５ＣＤ−４の 生産を発現した。

Ｇ２Ｎを形質導入したラット内皮細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、以下の様なラッ ト成長ホルモン生産能を発現した：１０６個の細胞が、２４時間後３．０μｇ； 　４８時間後６．０μｇ；　７２時間後９．０ｕｇ、のラット成長ホルモンを生 産した。

実施例２ Ａ、成長した羊の頚静脈、頚動脈、および大腿静脈の切片から、Ｊａｆｆｅｅら の方法［Ｊａｆｆｅｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、。

５２：２７４５−２７５６　ｆ１９７３）　］を用いて内皮細胞を採取した。３ 匹の羊から得た計４個の血管を使用した。採取した内皮細胞の同定は、道路に敷 き詰められた丸い小石に似た細胞構造の確認、および蛍光発色剤Ｄｉｒ−Ａｃｅ ｔｙｌ−ＬＤＬ　（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ。

Ｓｔｏｕｇｈｔｏｎ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｅｓ社製）との錯塩形成（Ｊ 、　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、　９９：２０３４−２０４０　（１９８４）］の確認によった。細 胞は、フィブロネクチン（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　 Ｂｅｄｆｏｒｄ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｅｓ社製）を被覆（濃度１．０　ＬＬｇ／ｃ＋ｏ”　 ）　Ｌ、かつ、仔牛脂児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　 Ｌｏｇａｎ、　Ｕｔａｈ社製）を２０％、ペニシリンを１ｏＯＵ／ｍｌ、ストレ プトマイシンを１００μｇ／ｍｌ、およびアンフォテリシンＢ　（Ｂｉｏｆｌｕ ｉｄｓ社製）を０．２５ｉｚｇ／ｍｌを含有するプラスチック製培養皿培地（Ｍ −１９９Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ社製） 上で培養した。細胞に、ｔ、ｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ　（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ社 製）酵素分解を施した。羊から血管を取り出す方法は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈｅ ａｒｔ、　Ｌｕｎｇ。

ａｎｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅのａｎｉｍａｌ　ｕｓｅ　ｃｏｍｍｉ ｔｔｅｅが承認した方法によった。

Ｂ、β−ガラクトシダーゼ含有″ＢＡＧ”ベクターを形質転移することができる 家屋生体組繊細胞［Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、、　８４：１５６−１６０　（１９８７１］は、Ｃｏｎ５ｔａｎｃｅ　 Ｃｅｐｋｏ［ＨａｒｖａｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍ ａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｅｓｌがら入手した。このβ−ガラクトシダーゼ含有″ ＢＡＧ″ベクターを形質転移することができる家屋の細胞培養物の上澄液を、ア ンフォトロビックバッケージング　ラインを、ＰＡ−３１７から生成せしめるた めに使用した。人間のｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡ　（ｉｎ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＰＡ３ ４’ｆｌ　［Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅ＋ｓ、　２６０　ｔ＋１１２２３−１１２３０　ｆ１９８５）　］　は、 ５ａｎｄｒａ　Ｄｅｇａｎ氏ｆｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃ１ｎｃｉｎｎ −ａｔｉ、　Ｃ１ｎｃｉｎｎａｔｉ、　０ｈｉｏｌ　より入手した。

このｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡは、付随のクローニングを施した後、ＳＡＸベクターの 構築に於けるＢ２Ｎ５ｔの類似物である、ｔ−ＰＡ含有レしロヴイールスのベク ターを構築するために使用した。このプラスミツドは、Ｂ２プラスミツド［５ｃ ｉｅｎｃｅ、　３４３：２２０−２２２ｆ１９８９）］に基づき、ＧＰＥ−８６ 細胞［Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、　６２：１１２０−１１２４　ｆ１９８８１　］に導 入され、かつ、これらの細胞の培養物の上澄液は、ｔ−ＰＡ遺伝子を形質転移す ることができるアンフォトロビック　パッケージング　コロニーを生成した。内 皮細胞は、レトロヴイールスのベクターを包含するヴイリオンを含む上澄液と一 緒に２時間インキュベートし、かつ、８μｇ／ｍｌのＧ−４１８と１６日間イン キュベートすることにより形質導入された。２本ペアで培養した各血管起源の内 皮細胞中に、同時に、ｔ−ＰＡ含有レしロヴイールスのベクターあるいはβ−ガ ラクトシダーゼ含有レしロヴイールスのベクターのいずれがをを形質導入した後 、前述と同じ工程で培養し、トリプシン処理し、選択した。この様にして、　ｔ −ＰＡ形質導入細胞およびβ−ガラクトシダーゼ形質導入細胞は、β−ガラクト シダーゼ活性あるいはｔ−ＰＡ分泌のいずれがを測定する実験において、お互い に一方に対する対照となった。

Ｃ８管状状のスロットを有するステンレス製ステント（直径１、６ｍｍ）　［Ｃ １ｒｃｕｌａｔｉｏｎ、　７６：ＩＶ−２７（１９８７１１（Ｊｏｈｎｓｏｎａ ｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｓｔｅｍ、　Ｗａｒ ｒｅｎ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ社製）を、関節部で切断し、各半分に、Ｖａｎ 　ｄｅｒ　Ｇｅ１ｓｓｅｎらの方法［Ｊ、　Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ、　Ｃａｒｄｉ ｏｌ、、　１：１０９−１２０　（１９８８１１を改変した方法を用いて内皮細 胞を接種した。計、１０本のステントに接種した。内皮細胞は、むき出しの金属 上には生長しなかった。

従って、細胞接種の前に、細胞が生長可能な材料をステント内に塗布する必要が あった。Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏにおいてステントへの内皮細胞の固着を可能にするた めに、フィブロネクチンによる被覆を採用した。ステントを、人間のフィブロネ クチン１００μｇ／ｍｌ溶液中に、３７℃で、１５分間浸漬した後、１０’個の 内皮細胞を！！濁した０、８ｍｌの培地を含有するポリウレタンチューブへ移し た。このチューブを、５％ｃｏ、を満たした３７℃のインキュベータに置き、２ 時間、１０分毎に１８００回転させて培養した後、ステントおよび細胞懸濁物を 、プラスチック製組織培養皿中へ移し、培地を補充した。ステント表面上に生長 した細胞は、位相差顕微鏡を用い、およびＤｉＩ−Ａｃｅｔｙｌ−ＬＤＬを含有 する培地中で４時間インキュベートした後、蛍光顕微鏡用いて経時的に観察した 。

Ｄ、　β−ガラクトシダーゼ遺伝子の生産物は、組織培養皿あるいはステント上 そのままの細胞を、５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ− β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ　（Ｘ−Ｇａｌ）　［ＥトＢＯＪ 、。

５・３１３３−３１４２　ｆｌ、９８６＋　］で染色して測定した。人間のｔ− ＰＡ濃度は、組織培養物の上澄液について、市販のキット［丁ｈｒｏｎ＋ｂ。

Ｒｅｓ、、　４１：５２７−５３５　（１９８６１］　（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄ ｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、　ＮｅｗＹｏｒｋ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ社製）を用いた ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｒ＋ｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ　（Ｅ ＬＩＳＡＩ法により測定した。分析に供した組織培養上澄液は、２　ｍ　ｌの新 鮮な培地を補充し４８時間培養後の時点において、径３５ｍｍの培養皿中の細胞 層を集めて、調製した。細胞を接種したステントからのｔ−ＰＡの分泌量の定量 は、このステントを新鮮な培地を含む新しい培養液に移した後、決められた時間 毎に培養液を集めて行った。採取した培養上澄液を、１５．０００ｇで、１５分 間、遠心分離して細胞残物を除去し、Ｔｗｅｅｎ−８０を０．０１％になるよう に添加し、分析にかける迄　−７０℃で凍結した。

ｔ−ＰＡ分泌速度（ｎａｎｏｇｒａｍｓ／　１０６ｃｅｌｌｓ／　２４　ｈｏｕ ｒｓ　）は、細胞密度（３ＸＩＯ’個／組綱培養皿１ｃｍ”）を用いて計算した （データは示さなかった）。

Ｅ、　細胞を接種したステントを、膨張する前に、　Ｄｉｒ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌ ＤＬ含有培地中で４時間インキュベートした。このステントは、その上に生長し た内皮細胞が蛍光顕微鏡で観察可能となり、次いで、マニュアル通りに、膨らま せていない３．０ｍｍ径の冠状血管形成術用風船カテーテル（Ｓｃｉｗｅｄ　１ ．、ｉｆｅ　Ｓｙｓｔｅｍ。

Ｍａｐｌｅ　Ｇｒｏｖｅ、　ＭＩｎｎｅｓｏｔ、ａ社製）上へ移した。風船を内 圧４−６気圧になるように膨らますことによりステントを完全に膨張させた後、 この風船のガスを抜き、ステントをカテーテルから取り出して、蛍光顕微鏡によ り再検鏡した。

Ｆ、　形質誘導された羊の内皮細胞は、小石を敷き詰めた様な構造、および蛍光 発色剤Ｄｉｌ−Ａｃｅｔｙｌ−ＬＤＬとの結合能を保持していた。また、β−ガ ラクトシダーゼ産生ベクターが形質導入された細胞と、ｔ−ＰＡ産生ベクターが 形質導入された細胞間には構造の相違は何ら認められなかった。

Ｇ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が形質導入された培養細胞のみが、Ｘ−Ｇａ１ による染色で、深青色に染まった細胞質を示した。　Ｇ−４１８分泌後でも、β −ガラクトシダーゼ遺伝子が形質導入された培養細胞の殆どが、Ｘ−Ｇａ１によ り深青色に染まった。

Ｈ，４個の血管全てについて、採取した内皮細胞は、ｔ−ＰＡベクターが導入さ れた後、免疫活性のあるｔ−ＰＡを分泌した。ｔ−ＰＡ分泌速度（２本ペアの組 織培養液の平均中標準偏差、ｎｇ／　１０’ｃｅｌｌｓ／　２４　ｈｏｕｒｓで 表現される）は、大腿静脈で３７０±８；頚動脈で６６０±２４０：頚静脈で１ ．２３０±６；頚静脈で２．２００±１８であった。β−ガラクトシダーゼが形 質導入された細胞のｔ−ＰＡ生産能は、試験した全ての培養上澄液について、分 析限界値以下（即ち、５　ｎｇ／　１０’　ｃｅｌｌｓ　／　２４　ｈｏｕｒｓ ）であった。

工、　蛍光顕微鏡観察により、細胞を接種した６個のステントの表面が、生長し た細胞で覆われていることが確認された。

β−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した内皮細胞あるいはｔ−ＰＡ遺伝子を導入 した内皮細胞のどちらかが接種された８個のステントを、Ｘ−Ｇａ１で染色した ところ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を導入した細胞で覆われたステントは、全 て青色を呈し、一方ｔ−ＰＡ分泌細胞で覆われたステントは、染色されなかった 。ステントを浸した細胞培養培地について人間のｔ−ＰＡ濃度を測定することに より、ｔ−ＰＡ遺伝子が導入された内皮細胞だけが、ｔ−ＰＡを分泌することを 確認した。ｔ−ＰＡ遺伝子が導入された内皮細胞を接種した３個のステントは、 ｔ−ＰＡを、２４時間の培養で、各々６．３，４．８．および２．６ｎｇ分泌し ていた。３個のステント上に生長したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が導入された 細胞のｔ−ＰＡ分泌量は、すべて分析限界値以下であった。

この分析結果の信頼度をチェックするために、形質導入された細胞の３個の培養 物の各々について、ステント上への細胞接種前および培養後のｔ−ＰＡ分泌量を 測定することにより、ステントの表面積を計算した。この計算は、細胞がステン ト上に存在する時、細胞密度および細胞のｔ−ＰＡ分泌速度は変化しないという 前提に基づいた。その結果１個のＦＩｔｅｎｔの表面積値（平均中標準偏差）は 、４８±１９ｍｍ”と計算されたが、この値は、メーカーの数値（ｐｅｒｓｏｎ ａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ、　Ｊｏｈｒ＋ｓｏｎ　＆　、Ｊｏｈｎｓｏ ｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｗａｒｒｅｎ、　Ｎｅｗ　 Ｊｅｒｓｅｙ　）である４２ｍｍ”対し有意差がなかった。

Ｊ、Ｄｉｌ−Ａｃｅｔｙｌ−ＬＤＬで染色された内皮細胞で覆われた４個のステ ントを、風船カテーテルを用いて膨張させ、かつ、速やかに蛍光顕微鏡で検鏡し た。その結果、４個のステント全てについて、その外部表面上に細胞がほぼ完全 に保持されていることが確認された。Ｘ−Ｇａ１で染まったステントについてし らべた結果、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が導入された細胞も、また、風船のガ スを抜いた後で、全ステント表面に保持されていることが確認された。即ち、解 剖顕微鏡による検鏡で、全ステント表面に細胞が保持されていることが確認され た。Ｘ−Ｇａ１染色したところ、計８個の膨張したステントのうちの４個が、β −ガラクトシダーゼ遺伝子が導入された細胞で覆われていた。多（のステントの 内部管腔表面は、風船のガスを抜いた後において、細胞で覆われていなかったが 、外部表面に生長した細胞層およびステント支柱側面表面に生長した細胞層は無 傷であった。

この発明は、いかなる学説理論にも基づかないが、血管内に移植された。上述の ごと（して内皮細胞を接種したステントは、血液中で局所的凝血破壊作用を与え るものと考える。血餅の近くでの高濃度のｔ−ＰＡ分泌は、ｔ−ＰＡのフィブリ ンへの高結合力によって、その箇所に濃縮されると考えられる［Ｔｈｏｒｓｅ口 。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｈｒｏｍｂ　Ｄ、　Ｈａｅｍｏｒｒｈ、、　２８：６５−７ ４　（１９７２１１、この様にして、フィブリン破壊活性は、ステント表面上、 あるいは、それから離れて形成される微小な凝血に直接作用して、閉塞性凝血の 生成を防止する。Ｈｅｒｇｒｅｕｔｅｒら［Ｐｌａｓｔ、　Ｒｅｃｏｎｓｔｒ、 　Ｓｕｒｇ。

、　８１：４１８−４２４　ｆ１９８８１　］は、家兎の血管モデルを用いて１ 局所に移植されたｔ−ＰＡが、トロンビンを高濃度生成するように逆転した動脈 中における凝血を防止するという知見が報告されている。血管内に移植されたス テントは、逆転した血管よりもトロンビンを生成しない。従って、ナノグラム量 のｔ−ＰＡを局所に与えることは、ステント移植が原因の凝血を防止するのに十 分なトロンビン破壊を結果としてもたらす。

ステント表面上に接種された遺伝工学的に修飾された内皮細胞を移植することは 、動脈内膜の肥厚を防止するものと考える。というのは、移植された内皮細胞が 、直接、動脈内膜に接触し、動脈内膜の成長を防止するタンパク質を分泌するよ うに、内皮細胞を遺伝工学的に修飾し得るからである。

上述した説明から、この発明の改良法および変法が多数考案されるであろう。そ れ故に、次に示すこの発明の特許請求の範囲については、そこに明記した事項以 外の工程により、この発明の目的が達成される可能性を含んでいる。

国際調査報告

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１種の異型のタンパク質の生産を指令する少なくとも１個の遺伝 子で遺伝工学により修飾された内皮細胞から成ることを特徴とする調製物。
2. ２．細胞が、人間の内皮細胞であることを特徴とする請求項１記載の調製物。
3. ３．内皮細胞が、毛細血管の内皮細胞であることを特徴とする請求項１記載の調 製物。
4. ４．内皮細胞が、長大血管の内皮細胞であることを特徴とする請求項１記載の調 製物。
5. ５．内皮細胞が、異型のタンパク質の生産を指令する遺伝子を含有するレトロヴ ィールスのベクターで遺伝工学により修節された内皮細胞であることを特徴とす る請求項１記載の調製物。
6. ６．異型のタンパク質が、治療薬であることを特徴とする請求項５記載の調製物 。
7. ７．内皮細胞が、哺乳動物の内皮細胞であることを特徴とする請求項１記載の調 製物。
8. ８．異型のタンパク質が、細胞分泌物であることを特徴とする請求項１記載の調 製物。
9. ９．固体状支持体であって、該固体状支持体が、少なくとも１種の異型のタンパ ク質の生産を指令する少なくとも１個の遺伝子で遺伝工学により修飾された内皮 細胞を含有することから成る調製物。
10. １０．固体状支持体が、血液親和柱であることを特徴とする請求項９記載の調製 物。
11. １１．固体状支持体が、血管グラフト（植接用片）であることを特徴とする請求 項１０記載の調製物。
12. １２．固体状支持体が、合成グラフトであることを特徴とする請求項１１記載の 調製物。
13. １３．固体状支持体が、管状スロットを設けたステンレス製の血管中に移植用ス テント（植皮固定鋳型）であって、該ステントが、内皮細胞のステントヘの固着 を可能とする基質で被覆されていることを特徴とする請求項１０記載の調製物。
14. １４．細胞が、人間の内皮細胞であることを特徴とする請求項１１記載の調製物 。
15. １５．内皮細胞が、毛細血管の内皮細胞であることを特徴とする請求項１１記載 の調製物。
16. １６．内皮細胞が、長大血管の内皮細胞であることを特徴とする請求項１１記載 の調製物。
17. １７．内皮細胞が、異型のタンパク質の生産を指令する遺伝子を含有するレトロ ヴィールスのベクターで遺伝工学により修節された内皮細胞であることを特徴と する請求項１１記載の調製物。
18. １８．異型のタンパク質が、治療薬であることを特徴とする請求項１２記載の調 製物。
19. １９．異型のタンパク質が、細胞分泌物であることを特徴とする請求項１８記載 の調製物。
20. ２０．宿主の血管中に、該宿主の内皮細胞であって、それが、該宿主の治療薬で ある少なくとも１種の異型のタンパク質の生産を指令する少なくとも１個の遺伝 子で遺伝工学により修飾された細胞を移植することから成ることを特徴とする遺 伝子治療（ｇｅｎｅ　ｔｈｅｒａｐｙ）方法。
21. ２１．遺伝工学により修節された内皮細胞が、生体親和性固体状支持体に固着さ れて宿主の血管中へ移植されることを特徴とする請求項２０記載の治療方法。
22. ２２．宿主が人間であり、かつ、遺伝工学により修飾された内皮細胞が人間の内 皮細胞であることを特徴とする請求項２１記載の治療方法。
23. ２３．内皮細胞が、治療薬の生産を指令する遺伝子を含有するレトロヴィールス のベクターで遺伝工学により修飾されていることを特徴とする請求項２２記載の 治療方法。
24. ２４．宿主が人間である患者であって、かつ、内皮細胞が同型の内皮細胞である ことを特徴とする請求項２１記載の治療方法。
25. ２５．固体状支持体が、血管クラフトであること特徴とする請求項２４記載の治 療方法。
26. ２６．内皮細胞が、治療薬の生産を指令する遺伝子を含有するレトロヴィールス のベクターで遺伝工学により修飾されていることを特徴とする請求項２５記載の 治療方法。
27. ２７．治療薬が、細胞分泌性であること特徴とする請求項２６記載の治療方法。
28. ２８．内皮細胞が、第一の治療薬の生産を発現する遺伝子で遺伝工学により修節 された第一の内皮細胞と、第二の治療薬の生産を発現する遺伝子で遺伝工学によ り修飾された第二の内皮細胞の混合物から成ることを特徴とする請求項２０記載 の治療方法。
29. ２９．遺伝子が、可溶性ＣＤ−４の生産をコードしていること特徴とする請求項 ７記載の調製物。
30. ３０．遺伝子が、ＡＤＡ（アデノシンデアミナーゼ）の生産をコードしているこ と特徴とする請求項７記載の調製物。
31. ３１．ＴＰＡの生産をコードしていること特徴とする請求項７記載の調製物。
32. ３２．遺伝子が、ＣＤ−４，ファクターＶＩＩＩ，ファクタ−ＩＸ，フォンウィ ルプランド因子、ＴＰＡ，ウロキナーゼ，ヒルデイ，インターフェロン，腫瘍破 死因子，インターロイキン，造血細胞成長因子，免疫抗体，グルコセレブロシダ ーゼ，ＡＤＡ，フェニールアラニンヒドロキシラーゼ，人間成長ホルモン，イン シュリン，およびエリスロポエチンから成るグループから選ばれる成分の生産を コードしていること特徴とする請求項１０記載の調製物。
33. ３３．遺伝子が、ＣＤ−４，ファクタ−ＶＩＩＩ，ファクタ−ＩＸ，フォンウィ ルブランド因子、ＴＰＡ，ウロキナーゼ，ヒルデイ，インターフェロン，腫瘍破 死因子，インターロイキン，造血細胞成長因子，免疫抗体，グルコセレブロシダ ーゼ，ＡＤＡ，フェニールアラニンヒドロキシラーゼ，人間成長ホルモン，イン シュリン，およびエリスロポエチンから成るグループから選ばれる成分の生産を コードしていること特徴とする請求項２４記載の治療方法。
34. ３４．遺伝子が、可溶性ＣＤ−４の生産をコードしていることを特徴とする請求 項１０記載の調製物。
35. ３５．遺伝子が、ＡＤＡの生産をコードしていることを特徴とする請求項１０記 載の調製物。
36. ３６．遺伝子が、ＴＰＡの生産をコードしていることを特徴とする請求項１０記 載の調製物。
37. ３７．遺伝子が、可溶性ＣＤ−４の生産をコードしていることを特徴とする請求 項３３記載の治療方法。
38. ３８．遺伝子が、ＡＤＡの生産をコードしていることを特徴とする請求項３３記 載の治療方法。
39. ３９．遺伝子が、ＴＰＡの生産をコードしていることを特徴とする請求項３３記 載の治療方法。