ES2265153T3 - Metodos para una transferencia de adn mediada por virus potenciada usando moleculas con dominios de union a virus y celulas. - Google Patents

Metodos para una transferencia de adn mediada por virus potenciada usando moleculas con dominios de union a virus y celulas. Download PDF

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Abstract

SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA AUMENTAR LA EFICACIA DE LA TRANSDUCCION DE CELULAS HEMATOPOYETICAS Y OTRAS CELULAS MEDIANTE RETROVIRUS, QUE INCLUYE INFECTAR LAS CELULAS EN PRESENCIA DE FIBRONECTINA O DE FRAGMENTOS DE FIBRONECTINA. LA FIBRONECTINA Y LOS FRAGMENTOS DE FIBRONECTINA MEJORAN DE FORMA SIGNIFICATIVA LA TRANSFERENCIA DE GENES MEDIADA POR RETROVIRUS HACIA EL INTERIOR DE LAS CELULAS, EN PARTICULAR CELULAS HEMATOPOYETICAS QUE INCLUYEN PROGENITORES COMPROMETIDOS Y CELULAS PLURIPOTENCIALES HEMATOPOYETICAS PRIMITIVAS. LA INVENCION TAMBIEN DESCRIBE PROCEDIMIENTOS MEJORADOS PARA LA TERAPIA GENICA SOMATICA QUE SE APROVECHA DE LA TRANSFERENCIA DE GENES MEJORADA, POBLACIONES CELULARES HEMATOPOYETICAS, Y NUEVOS CONSTRUCTOS PARA MEJORAR LA TRANSFERENCIA DE ADN MEDIADA POR RETROVIRUS HACIA EL INTERIOR DE CELULAS Y SU USO.

Description

Métodos para una transferencia de ADN mediada por virus potenciada usando moléculas con dominios de unión a virus y células.
Campo de la invención
La presente invención se refiere generalmente a métodos para aumentar la eficacia de transducción de células mediante virus, y más particularmente a métodos para potenciar la transferencia génica mediada por virus en células utilizando moléculas, tales como polipéptidos, que contienen un área que se une al virus y un área que se une a las células.
Antecedentes de la invención
El progreso en la comprensión de la base molecular de muchas enfermedades humanas, así como la mejora en la tecnología de transferencia génica ha conducido a intentos recientes para desarrollar protocolos para la terapia génica somática para enfermedades genéticas graves. Actualmente, entre los candidatos de enfermedades prometedoras para terapia génica humana se incluyen aquellas en las que una enzima u otra proteína es defectuosa o está ausente, cuando el nivel de enzima o proteína no necesita regularse de manera exacta, especialmente aquellas que están reguladas de manera constitutiva, y aquellos defectos que se encuentran en la médula ósea del paciente.
Por ejemplo, un candidato de enfermedad para terapia génica es la deficiencia en adenosina desaminasa (ADA) que da como resultado una enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave (SCID). Los pacientes deficientes en ADA tienen muy poca o no tienen enzima detectable en las células de la médula ósea. Sin embargo, la deficiencia en ADA se ha curado mediante transplante de médula ósea compatible. Las células normales en ADA tienen una ventaja selectiva sobre las células deficientes en ADA y, normalmente, repoblarán la médula ósea del paciente.
Las células de la médula ósea son una buena diana para la terapia somática porque el tejido de médula ósea se manipula fácilmente in vitro y contiene células repobladoras. Alternativamente, la sangre del cordón umbilical ha demostrado previamente contener un gran número de células progenitoras primitivas. Una transferencia génica en células madres hematopoyéticas con éxito, las células repobladoras a largo plazo, puede conducir a curaciones de por vida para una variedad de enfermedades que se manifiestan en la progenie de estas células.
Se ha conseguido la transferencia génica en, y la expresión génica a largo plazo en, células madre repobladoras en modelos murinos por parte de diversos investigadores. Sin embargo, los experimentos in vivo en grandes animales, tales como perros y primates, se han encontrado con un éxito limitado, debido en gran parte a la baja eficacia de infección de las células madres hematopoyéticas primitivas. Las limitaciones de la tecnología de transferencia génica actual se han complicado adicionalmente cuando se han aplicado a protocolos humanos por diversos factores, incluyendo los bajos números de células embrionarias presentes en la médula ósea adulta (adult bone marrow-ABM), la falta de métodos adecuados para purificar estas células, y la baja fracción de tales células primitivas en el ciclo celular.
Tanto en experimentos murinos y en grandes animales que implican a células de médula ósea, se ha observado que los protocolos de más éxito utilizan el cocultivo de células diana con líneas celulares productoras de retrovirus. Además, la mayoría de ensayos de transferencia génica aprobados por la FDA en seres humanos se basan en vectores retrovirales recombinantes para la transducción génica. Los vectores retrovirales recombinantes son deseables para la terapia génica porque se transfieren de manera eficaz e integran de manera precisa y estable ADN exógeno en ADN celular. Estos vectores contienen ADN exógeno para transferencia génica y se modifican adicionalmente para eliminar la patogenicidad viral. Debido a estas modificaciones, la producción viral generalmente se lleva a cabo utilizando células de empaquetamiento de retrovirus. Sin embargo, para la terapia génica clínica, es más deseable la transducción libre de células debido a asuntos sobre control de bioseguridad y calidad. Desafortunadamente, generalmente no ha sido posible la transferencia génica eficaz en células hematopoyéticas tales como células madre sin el cocultivo de células productoras de virus.
Recientemente, se ha demostrado que la eficacia de la transferencia génica puede aumentarse exponiendo las células diana a células estromales durante la infección. Las células estromales son un componente principal del microambiente hematopoyético (hematopoietic microenvironment-HM). El HM consiste en una red organizada de macrófagos, células estromales, células endoteliales, adipositos y una matriz extracelular compleja (complex extracellular matriz-ECM) elaborada a partir de una variedad de moléculas de adhesión definidas. Moléculas de ECM tales como laminina, colágeno, trombospondina, proteoglucanos, glucosaminoglucanos y fibronectina proporcionan sitios de anclaje tanto para células hematopoyéticas, como para factores de crecimiento. El mecanismo subyacente a este efecto promotor del estroma sobre la infección retroviral no está claro, pero se ha sabido durante algún tiempo que la regulación fisiológica de la proliferación y diferenciación de las células hematopoyéticas se produce cuando estas células están en contacto directo con células del HM.
El documento WO 95/26200 describe un método para aumentar la eficacia de transducción de células hematopoyéticas y otras células por parte de retrovirus, incluyendo el la infección de las células en presencia de fibronectina o fragmentos de fibronectina.
La transferencia génica eficaz a largo plazo en células madre hematopoyéticas repobladoras y otras células sigue siendo problemática, inhibiendo, a día de hoy, la aplicación generalizada de protocolos de transferencia génica para terapias curativas de enfermedades hematopoyéticas y otras. Persiste la necesidad de métodos para una transferencia génica eficaz de material genético en células de mamífero sin los peligros y limitaciones de los métodos anteriores. El presente documento trata estas necesidades.
Sumario de la invención
En un método in vitro para obtener una población transducida de células viables por parte de un retrovirus comprende:
infección de las células con un retrovirus en presencia de una cantidad inmovilizada eficaz de material para aumentar la eficacia de transducción de las células por parte del retrovirus, incluyendo dicho material un ligando que se una a las células y un ligando que se una al retrovirus, para así co-localizar el retrovirus y las células, llevándose a cabo dicha infección en un medio libre de agente policatiónico que aumenta la eficacia de transducción de las células por parte del retrovirus en co-cultivo, pero agente que reduce la eficacia de transducción de las células por parte del retrovirus en presencia de dicho material.
Brevemente, una realización preferida de esta invención proporciona un método para aumentar la frecuencia de transducción de células hematopoyéticas por parte de un vector de retrovirus. El método incluye la infección células hematopoyéticas viables con un retrovirus recombinante defectuoso en replicación en presencia de fibronectina sustancialmente pura y/o fragmentos de fibronectina eficaces para aumentar la frecuencia de transducción celular por parte del retrovirus. La fibronectina y/o fragmentos de fibronectina pueden derivarse a partir de materiales que se dan de manera natural o pueden derivarse sintéticamente (por ejemplo, modificados genéticamente mediante técnicas de síntesis química o recombinante), o derivarse de una combinación de materiales que se dan de manera natural y materiales sintéticos. Además, se comprenderá que el polipéptido de fibronectina o polipéptidos utilizados en la invención pueden incluir mutaciones en la secuencia de aminoácidos de la fibronectina que se da manera natural que, no obstante, proporcionan polipéptidos funcionales que tiene las propiedades de adhesión necesarias para lograr una transducción potenciada según la invención.
Otra realización preferida de la invención proporciona un método para producir células hematopoyéticas transducidas que incluye la infección de células hematopoyéticas viables con un retrovirus recombinante defectuoso en replicación que lleva ADN exógeno en presencia de fibronectina inmovilizada, fragmentos de fibronectina inmovilizada, o una mezcla inmovilizada de los mismos en cantidades eficaces para aumentar la frecuencia de la transducción celular por parte del retrovirus.
Otra realización preferida de la presente invención proporciona un método para obtener células sanguíneas del cordón umbilical transducidas adecuadas para un procedimiento de injerto celular. El método incluye la infección de células hematopoyéticas a partir de sangre del cordón umbilical con un vector de retrovirus recombinante defectuoso en replicación en presencia de una cantidad eficaz de fibronectina y/o fragmentos de fibronectina inmovilizada para aumentar la frecuencia de transducción de las células hematopoyéticas por parte del vector de retrovirus. La invención también incluye poblaciones celulares transducidas viables de sangre del cordón umbilical que pueden obtenerse por un método de este tipo, y métodos de injerto celular que incluyen la introducción de poblaciones celulares transducidas en un animal como un injerto celular.
Según aspectos más específicos de las realizaciones de la invención anteriormente mencionadas, la fibronectina o el fragmento de fibronectina utilizado contendrá una primera secuencia de aminoácidos que proporciona la actividad de unión retroviral del dominio de unión a heparina II de la fibronectina, y una segunda secuencia de aminoácidos que proporciona la actividad de unión celular del dominio CS-1 de la fibronectina. El uso conjunto de estos dos dominios de unión de la fibronectina ha demostrado potenciar de manera significativa la eficacia de transducción de las células diana por parte del retrovirus.
Otra realización preferida de la invención proporciona un método para obtener una población transducida de células viables por parte de un retrovirus, que comprende la infección de las células con un retrovirus en presencia de una cantidad eficaz inmovilizada de un material tal como un polipéptido, cantidad de material inmovilizado que incluye un ligando que se une a las células y un ligando que se une al retrovirus, para colocalizar así el retrovirus y las células y aumentar la eficacia de transducción de las células. Además, se ha descubierto de manera sorprendente que tales procesos se llevan a cabo de manera más ventajosa en ausencia de o al menos en ausencia sustancial de un bromuro de hexadimetrina (también identificado como polimetobromuro de 1, 5-dimetil-1,5-diazaundecametileno), que hasta el momento se ha utilizado en protocolos de transferencia génica por el deseo de aumentar la eficacia de transducción. Sin embargo, de manera sorprendente, se ha descubierto que la presencia de bromuro de hexadimetrina reduce, más que aumenta, la eficacia de transducción en los procedimientos de transferencia génica mediados por co-localización de la invención. Así, los procedimiento más preferidos de la invención se llevan a cabo en ausencia de bromuro de hexadimetrina u otros agentes que aumentan la eficacia de transducción en protocolos similares llevados a cabo en ausencia del material para colocalización, por ejemplo en protocolos de co-cultivo correspondientes. Las poblaciones celulares mejoradas resultantes y los métodos de injerto celular también forman parte de la presente
invención.
Otra realización de la invención proporciona un método para obtener una población transducida de células viables por parte de un retrovirus, que incluye la etapa de infección de las células con un retrovirus en presencia de un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que se une a las células y una secuencia de aminoácidos del colágeno V o del factor de crecimiento de fibroblastos que se une al retrovirus.
Otra realización preferida de la invención proporciona un método para localizar un retrovirus, que incluye poner en contacto el retrovirus con una cantidad eficaz de un polipéptido aislado que tiene una secuencia de aminoácidos del colágeno V o del factor de crecimiento de fibroblastos que se une al retrovirus.
Es un objeto de esta invención proporcionar métodos para una infección retroviral eficaz de células de mamífe-
ro.
Es un objeto adicional de esta invención proporcionar métodos para la transferencia génica con vectores retrovirales que evitan la necesidad de cocultivo.
Es un objeto adicional de la invención proporcionar métodos mejorados y cultivos celulares para injerto celular autólogo y/o alogénico.
Estos y otros objetos, ventajas y características de la invención serán fácilmente evidentes para un experto en la técnica a partir de la siguiente descripción.
Descripción de las figuras
La figura 1 proporciona una representación esquemática de una molécula de fibronectina, que incluye fragmentos quimotrípticos.
la figura 2 muestra la eficacia de infección de células progenitoras humanas comprometidas en presencia de fragmentos de fibronectina utilizando el vector TKNEO, tal como se describe adicionalmente en el ejemplo de referencia 1 de a continuación.
la figura 3 compara la eficacia de infección de diversas células progenitoras hematopoyéticas humanas comprometidas en presencia de fragmentos de fibronectina de las mismas utilizando el vector TKNEO, tal como se describe adicionalmente en el ejemplo de referencia 1 de a continuación.
la figura 4 proporciona un diagrama esquemático que ilustra diversos fragmentos de fibronectina recombinantes utilizados en el ejemplo ilustrativo 1 de a continuación.
la figura 5 muestra un retrovirus uniéndose a diversos fragmentos de fibronectina, incluyendo a diversos fragmentos recombinantes, tal como se describe en el ejemplo ilustrativo 1 de a continuación.
la figura 6 demuestra que la heparina bloquea la unión de retrovirus a los fragmentos de fibronectina, tal como se describe en el ejemplo ilustrativo 1 de a continuación
la figura 7 muestra la estructura de una cadena \alpha de fibronectina y su relación con los fragmentos recombinantes utilizados en los ejemplos. Se indican las repeticiones de fibronectina de tipo I, II y III y las repeticiones de tipo III se numera de desde el 1 hasta el 14. Los tres sitios de unión para células se marcan como CÉLULA para el dominio de unión celular (CBD-cell binding domain), HEPARIN para el dominio de unión a la heparina (HBD-heparin binding domain), y CS1 para el sitio de unión de VLA-4 CS1 formado por los primeros 25 aminoácidos de la región IIICS cortada y empalmada de manera alternativa.
la figura 8 muestra la eficacia de la infección por retrovirus de células NIH/3T3 en presencia de diversos fragmentos de fibronectina, tal como se informa en el ejemplo ilustrativo 2 de a continuación.
la figura 9 muestra la eficacia de la infección por retrovirus de células HL60 no adherentes en presencia de diversos fragmentos de fibronectina, tal como se informa en el ejemplo ilustrativo 2 de a continuación.
la figura 10 muestra la influencia de la heparina de bajo y alto peso molecular en la unión del retrovirus a la fibronectina.
la figura 11 demuestra que la eficacia de la infección retroviral de las células NIH/3T3 se reduce con las concentraciones creciente de bromuro de hexadimetrina, tal como se trata en el ejemplo ilustrativo 3 de a continuación.
la figura 12 demuestra que la eficacia de la infección retroviral de células clonogénicas de médula ósea disminuye con las concentraciones crecientes de bromuro de hexadimetrina, tal como se trata en el ejemplo ilustrativo 3 de a continuación.
Descripción de realizaciones preferidas
Con el fin de favorecer la comprensión de los principios de la invención, ahora se hará referencia a ciertas realizaciones de la misma y se utilizará un lenguaje específico para describir las mismas. No obstante, se comprenderá que de este modo no se pretende una limitación del alcance de la invención, contemplando tales alteraciones, modificaciones adicionales y tales aplicaciones de los principios de la invención, tal como se ilustran en el presente documento, como las que se le ocurrirían de manera normal a un experto en la técnica a la que la invención se refiere.
Tal como se indica anteriormente, la presente invención proporciona métodos para aumentar la frecuencia de transducción de células viables por parte de un virus tal como un retrovirus. La invención también proporciona métodos para una transferencia génica eficaz en células viables utilizando vectores retrovirales recombinantes, métodos para obtener células transducidas, y métodos y materiales para lograr injertos antólogos u otros injertos celulares.
Una característica de la presente invención es el descubrimiento de que la fibronectina (FN), y los fragmentos de fibronectina que contienen el dominio de adhesión celular CS-1 de FN, potencian de manera significativa la transferencia génica mediada por retrovirus en células tales como células hematopoyéticas, por ejemplo, células progenitoras comprometidas y células madre hematopoyéticas primitivas o células de iniciación de cultivo a largo plazo (LTCIC-long term cultura initiating cells), que llevan una receptor de fibronectina y presentan así la capacidad para unirse a fibronectina o fragmentos de la misma. De manera ventajosa, esta mayor eficacia hace innecesario los cocultivos de células productoras de virus. Otras características de la invención sacan provecho del descubrimiento del dominio de unión viral de la fibronectina localizado dentro del domino de unión a heparina II. Este dominio de unión viral puede utilizarse para localizar partículas de virus en muchas aplicaciones, incluyendo, por ejemplo en una amplia gama de constructor para administrar el virus a una célula diana.
Vectores virales recombinantes según ciertos aspectos preferidos de la presente invención contienen ADN exógeno y son no-patógenos, es decir, defectuosos en replicación. Estos vectores se transfieren de eficazmente y integran de manera precisa y estable ADN exógeno en el ADN celular de las células huésped tales como células animales, particularmente células de mamífero. Por ejemplo, en la presente invención puede incorporarse una secuencia de nucleótidos que incluye una serie de bases de la secuencia codificante del gen de interés en un vector retroviral recombinante bajo el control de un promotor adecuado para dirigir el gen, normalmente un promotor exógeno. A este respecto, el ADN exógeno puede contener ADN que se ha producido o bien de manera natural o bien de manera artificial, y puede ser de partes derivadas de fuentes heterólogas, partes que pueden ser moléculas que se den de manera natural o se sinteticen químicamente, y puede ser de partes derivadas de fuentes heterólogas, partes que pueden ser moléculas que se den de manera natural o se sinteticen químicamente, y en el que las partes se han unido mediante ligamiento u otros medios conocidos en la técnica.
El ADN exógeno incorporado en el virus puede ser cualquier ADN de interés para la introducción en las células, Por ejemplo, el ADN exógeno puede codificar para una proteína tal como ADA que se asocia con un trastorno conocido, o un ARN antisentido, ribozima o cebador falso. (véase, por ejemplo, el documento WO 90/13641 publicado el 15 de noviembre de 1990), para un anticuerpo intracelular (véase, por ejemplo, el documento WO 94/02610 publicado el 3 de febrero de 1994), para un factor de crecimiento, o similares.
Tal como se indica, la secuencia de nucleótidos introducida estará bajo el control de un promotor y por tanto, estará generalmente hacia 3' del promotor. Dicho de otro modo, la secuencia de promotor estará generalmente hacia 5' (es decir, el extremo 5') de la secuencia codificante. En este sentido, es bien sabido que pueden haber o pueden no haber otros elementos reguladores (por ejemplo, secuencias potenciadoras) que cooperen con el promotor y un codon de iniciación transcripcional para lograr la transcripción de la secuencia codificante exógena. La frase "bajo el control de" contempla la presencia de tales otros elementos ya que son necesarios para lograr la transcripción del gen introducido. Además, el ADN recombinante incluirá preferiblemente una secuencia de terminación hacia 3' de la secuencia codificante introducida.
Pueden utilizarse vectores retrovirales que incluyan ADN exógeno que proporcione un marcador seleccionable u otra ventaja seleccionable. Por ejemplo, los vectores pueden contener uno o más genes exógenos que proporcionar resistencia frente a diversos agentes de selección incluyendo antibióticos tales como la neomicina. Los vectores representativos que pueden usarse en la invención incluyen, por ejemplo, el vector N_{2}/ZipTKNEO (TKNEO) (título: 1 x 10^{5} G418^{r} ufc/ml cobre células NIH 3T3), el vector ZipPGK-hADA, y el vector ZipPGK-mADA tal como indicaron anteriormente Moritz et al. (1993) J. Exp. Med. 178:529. En el vector TKNEO, se expresan secuencias de neo fosfotransferasa en la orientación de sentido (en relación a la repetición terminal larga-LTR de 5') a través del promotor de la timidín cinasa del herpes simplex. Este vector contiene un gen marcador seleccionable que proporciona resistencia a la neomicina para facilitar la identificación de células transducidas. En el vector ZipPGK-hADA, el ADN_{c} de ADA humano ("hADA") se expresa en la orientación de sentido en relación a la LTR de 5' a través del promotor la fosfoglicerato (PGK) cinasa humana. Sólo contiene una única secuencia genética expresable y carece de un marcador seleccionable dominante. El vector ZipPGKmADA (PGK-mADA) es idéntico al vector ZipPGK-
hADA excepto en que el ADN_{c} de ADA humano se ha sustituido con ADN de ADA murino ("mADA"). Estos y otros vectores virales y técnicas para su producción son bien conocidos y su implementación y uso en la presente invención estarán dentro de las habilidades de los expertos en la técnica dada de la que se da la descripción en el presente
documento.
Los vectores virales utilizados en la invención presentan la capacidad de unirse a una secuencia de aminoácidos del dominio de unión a heparin-II de fibronectina, incluyendo la de la fibronectina humana. Tal como se trata en los apartados que siguen, aunque la presente invención no se limita por ninguna teoría, se cree que la co-localización del virus y de la célula diana a través de la unión del virus y las células a los dominios funcionales respectivos facilita una potenciación de la transducción de la célula por parte del virus. A este respecto, puede determinarse fácilmente la capacidad de un virus para unirse a la secuencia de aminoácidos del dominio de unión a la heparina-II, y servir así de manera eficaz en la invención, utilizando procedimientos de rutina. En términos generales, estos ensayos determinan el grado hasta el cual las partículas de virus se unen a los polipéptidos inmovilizados que contienen el dominio de unión a la heparina-II, para resistir así el lavado de la matriz de polipéptido inmovilizado. Brevemente, por ejemplo, puede incubarse un sobrenadante que contiene virus en un pocillo que contiene polipéptido inmovilizado que incluye el dominio de unión a la heparina-II de la fibronectina. Entonces, se lava exhaustivamente el pocillo con tampón de solución salina fisiológica, tras lo cual se incuban células diana para el virus en un pocillo para determinar el nivel de actividad infecciosa que queda en el pocillo. Se valora la reducción en la actividad infecciosa, o el título, en relación al sobrenadante viral inicial y se compara con de una serie de control similar (por ejemplo, utilizando un pocillo recubierto con BSA). Un título significativamente más alto que quede en el pocillo que contiene el dominio de heparina-II en comparación con el pocillo de control significa que el virus sujeto es adecuado para su uso en aspectos de la invención. Para facilitar este procedimiento de detección, el vector viral puede contener un gen marcador seleccionable, tal como se trató anteriormente.
Los fragmentos de fibronectina para su uso en la invención pueden ser de origen natural o sintética, y puede prepararse en pureza sustancial a partir de materiales que se dan de manera natural, por ejemplo, tal como describieron anteriormente Ruoslahti et al. (1981) J. Biol. Chem. 256: 7277; Patel y Lodish (1986) J. Cell. Biol. 102:449; y Bernardi et al. (1987) J. Cell. Biol. 105:489. A este respecto, la referencia en el presente documento a fibronectina o fragmentos de fibronectina sustancialmente pura pretende significar que están esencialmente libres de otras proteínas con las que se da de manera natural la fibronectina. Fibronectina o fragmentos de fibronectina sustancialmente pura para usar en la invención también pueden producirse de manera recombinante, por ejemplo, tal como se describió generalmente en la patente de los EE.UU. nº 5.198.423 concedida el 30 de marzo de 1993 a Taguchi et al. y cedida a Takara Shuzo Co., Ltd., Kioto, Japón. En particular, en esta patente nº 5.198.423 se describen en detalle fragmentos recombinantes identificados en los ejemplos de a continuación como H-271, H-296, CH-271, CH-296 y C-CS1, y métodos para obtenerlos. El fragmento C274 utilizado en los ejemplos de a continuación se obtuvo tal como se describió en la patente de los EE.UU. nº 5.102.988. Estos fragmentos o fragmentos a partir de los cuales pueden derivarse de manera rutinaria están disponibles mediante el cultivo de E. coli depositado en el Instituto de Investigación sobre Fermentación de la Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial de Japón como FERM P-10721 (H-296), FERM BP-2799 (C-277 unido a H-271 a través de metionina), FERM BP-2800 (C-277 unido a H-296 a través de metionina), y FERM BP-2264 (H-271), tal como describió también en la patente de los EE.UU. nº 5.198.423. Además, puede encontrarse información valiosa con respecto a los fragmentos de fibronectina utilizables en el presente documento o con respecto a los materiales de partida para tales fragmentos en Kimizuka et al., J. Biochem. 110, 284-291 (1991), que informa adicionalmente con respecto a los fragmentos recombinantes anteriormente indicados; en EMBO J., 4, 1755-1759 (1985), que informa sobre la estructura del gen de fibronectina humano; y en Biochemistry, 25, 4936-4941 (1986), que informa sobre el dominio de unión a la heparina-II de la fibronectina humana. En los trabajos hechos hasta ahora se ha encontrado que fragmentos de fibronectina que contienen tanto el dominio de adhesión celular CS-1, como el dominio de unión a heparina-II, por ejemplo, como incluidos en aproximadamente un fragmento de 30 o 35 kd (FN 30/35) y en diversos fragmentos recombinantes tal como se informa en los ejemplos de a continuación, potencia de manera significativa la eficacia de transferencia génica en células hematopoyéticas, y se prefieren para el uso en la invención. Se comprenderá por tanto que, en términos generales, el polipéptido o polipéptidos relacionados con la fibronectina utilizados en la invención proporcionará una secuencia de aminoácidos que proporciona actividad de unión celular del dominio de adhesión celular CS-1 de la fibronectina, así como una secuencia de aminoácidos del dominio de unión a la heparina-II de la fibronectina que se une al virus. El experto en la técnica reconocerá que las actividades de unión a virus y celular necesarias pueden proporcionarse tanto mediante la secuencia de aminoácidos nativa de estos dominios fibronectina funcionales, como mediante la secuencia de aminoácidos que difieren de las secuencias nativas que todavía son suficientemente similares como para presentar las actividades de unión viral y de unión celular. Estas secuencias de aminoácidos similares presentarán una homología de secuencia sustancia con sus secuencias nativas correspondientes, y pueden incluir aquellas en las que se han delecionado, sustituido y/o modificado aminoácidos al tiempo que, no obstante, proporcionan una secuencia de aminoácidos con las características de unión viral y de unión celular deseadas.
A este respecto, las técnicas biotecnológicas pertinentes han avanzado hasta un punto en el que pueden llevarse a cabo de manera rutinaria la deleción, sustitución, adición u otra modificación de los aminoácidos en los dominios funcionales sujeto. Entonces pueden detectarse las secuencias de aminoácidos resultantes de manera rutinaria buscando la actividad de unión viral o de unión celular deseadas. Por ejemplo, puede detectarse de manera general una actividad de unión viral de formas modificadas o mutantes del dominio de unión a heparina-II de la fibronectina tal como se trató anteriormente, utilizando ensayos de incubación de virus, lavado, y título viral para determinar la retención de la infectividad en comparación con un control. Dadas las enseñanzas proporcionadas en el presente documentos, estos ensayos de unión sólo representarán experimentación de rutina para aquellos que trabajan en este campo.
La unión celular a formas mutantes o modificadas del dominio de adhesión celular CS-1 de la fibronectina, u otros polipéptidos de unión celular, puede someterse a ensayo de la misma manera utilizando procedimientos convencionales. Por ejemplo, tales procedimientos incluyen los descritos en Nature 352: 438-441 (1991). Brevemente, el polipéptido de unión celular se recubre sobre placas plásticas y se superpone la población celular que va a someterse a ensayo en un medio de durante 30 minutos a 2 horas. Tras este periodo de incubación, se recuperan las células no adherentes a la proteína, se cuentan y se someten a ensayo para determinar la viabilidad. También se recuperan las células adherentes al polipéptido utilizando tripsina o un tampón de disociación celular (por ejemplo, Gibco), se cuentan y someten a pruebas de viabilidad. En algunos casos, por ejemplo, para células formadoras de colonias hematopoyéticas, las células se cultivan adicionalmente durante 12-24 días adicionales para determinar las características de formación de colonias de las células. Entonces se calcula el porcentaje de células adherentes y se compara con respecto a un control estándar tal como albúmina sérica bovina (BSA-bovine serum albumin) recubierta sobre placas plásticas. La unión sustancial de las células diana al polipéptido sometido a ensayo proporciona una indicación de que la combinación polipéptido/células es adecuada para la invención, y el polipéptido puede acoplarse al fragmento de unión retroviral de la fibronectina para producir un constructo de la invención para potenciar la infección de las células diana por parte del vector viral.
Con arreglo a aspectos más específicos de la invención, el polipéptido de unión viral utilizado para potenciar la transducción por parte de los vectores retrovirales comprenderá (i) una primera secuencia de aminoácidos que corresponde con Ala^{1690}-Thr^{1960} del dominio de unión a la heparina-II de la fibronectina humana, que se represente mediante la fórmula (Seq. I.D. nº 1):
100
o una secuencia de aminoácidos lo suficientemente similar a la misma como para presentar la capacidad de unirse al retrovirus; y (ii) una segunda secuencia de aminoácidos que corresponde con una parte del dominio de unión IIICS de la fibronectina humana (el dominio de unión celular CS-1); que se representa mediante la fórmula (Seq. I.D. nº 2):
101
o una secuencia de aminoácidos lo suficientemente similar a la misma como para presente la capacidad de unirse a células hematopoyéticas tales como células (madre) repobladora a largo plazo y/o progenitoras primitivas.
Tal como se mencionó anteriormente, se comprenderá que ciertas modificaciones y/o mutaciones de estas secuencias nativas son posibles dentro de la puesta en práctica de la presente invención, siempre que la secuencia de aminoácidos resultante sea los suficientemente similar a la secuencia nativa como para presentar la capacidad de unirse al virus (en el caso del dominio de unión a la heparina-II) y la capacidad para unirse a las células diana (en el caso del dominio CS-1).
Por ejemplo, polipéptidos que tienen secuencias que se unen a la heparina y presentan una homología de secuencia sustancial con el domino de unión a la heparina-II de la fibronectina incluyen, por ejemplo, colágeno V y factor de crecimiento de fibroblastos. Tal como se demuestra en el ejemplo específico 16 de a continuación, pueden utilizarse los polipéptidos que incluyen estas secuencias unidas a las secuencias de unión celular tales como los sitios de unión para VLA-4 y/o VLA-5, para potenciar la transferencia de ADN mediada por retrovirus a células que se unen a las secuencias de unión celular.
Un aspecto de la invención proporciona un método de terapia génica somática que implica terapia celular in vitro celular y el posterior transplante de células diana en un huésped, también conocido como "injerto" del huésped con las células Diana transducidas. Pueden recogerse células hemotopoyéticas u otras, por ejemplo, células madre aisladas de médula ósea o sangre periférica, células madre embrionarias, o células caracterizadas de otro modo como CD34+ y/o C-kit+, a partir de una fuente humana o de otro animal mamífero utilizando protocolos convencionales. Por ejemplo, pueden recogerse células hematopoyéticas a partir de médula ósea o sangre periférica de un donante humano o partir de sangre de cordón umbilical fetal humano. Una vez recogidas, las células hematopoyéticas pueden tratarse opcionalmente mediante técnicas convencionales para enriquecerlas en células madre y/o células progenitoras primitivas. Entonces, las células hematopoyéticas pueden incubarse de manera adecuada, por ejemplo en placas de cultivo tisular. Opcionalmente durante este periodo, pueden estimularse previamente células mononucleares de baja densidad negativas a la adherencia ("adherent-negative") antes de la infección retroviral. La estimulación previa, tal como se conoce en la técnica y tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al procedimiento de exposición de las células a factores estimulantes del crecimiento antes de la exposición al retrovirus. Tal estimulación previa ha demostrado mejorar la transducción de células hematopoyéticas por parte de retrovirus.
Posterior a la estimulación previa, las células pueden recogerse e incubarse con fibronectina o fragmentos de la misma tal como se describe en el presente documento para potenciar la frecuencia de transducción celular por parte de retrovirus. Preferiblemente, las células se incuban con material purificado y/o insoluble, por ejemplo, fibronectina o fragmentos de fibronectina inmovilizada. Entonces, las células pueden infectarse con el virus recombinante, por ejemplo un retrovirus que contiene un gen para corregir en las células una deficiencia o anomalía en una enzima u otra proteína, en presencia de cantidad de la fibronectina o el fragmento de fibronectina eficaz para aumentar la frecuencia de transducción de las células por parte del virus. Entonces, las células hematopoyéticas transducidas resultantes pueden introducirse de manera convencional, por ejemplo, por vía intravenosa, en un receptor de injerto celular animal, preferiblemente un donante autólogo pero incluyendo también transplantes alogénicos, siendo los últimos en los que se utilizan para el injerto especialmente las células sanguíneas del cordón umbilical tal como se trata a continuación.
Los métodos de la invención pueden utilizarse en protocolos de marcación génica o terapia génica para una variedad de trastornos, incluyendo trastornos de la médula ósea, incluyendo, por ejemplo cánceres, leucemias, trastornos que implican deficiencias o anomalías de proteínas, y terapias para modificar células hematopoyéticas para mejorar la resistencia frente a otros protocolos terapéuticos tales como quimioterapia. Trastornos representativos con los que puede utilizarse la invención incluyen la deficiencia en ADA, por ejemplo, SCID deficiente en ADA, leucemia mielógena aguda pediátrica (AML-acute myelogenous leukemia), neuroblastoma, y AML adulta y leucemia linfocítica aguda (ALL-acute lymphocytic leukemia).
En una realización particularmente preferida de la invención, las células utilizadas para un infarto celular se obtienen a partir de sangre del cordón umbilical humano. Así, puede recogerse sangre del cordón umbilical humano y enriquecerse en células madre y/o progenitoras hematopoyéticas primitivas, por ejemplo obteniendo una población celular mononuclear, de baja densidad, negativa a la adherencia. Entonces, esta población se estimula previamente de manera opcional, y se incuba en presencia de un vector retroviral y fibronectina o fragmentos de fibronectina inmovilizada y/o purificada, para potenciar la eficacia de transducción de las células por parte del vector. A este respecto, se ha hallado que la transducción de las células madre y/o hematopoyéticas primitivas de la sangre de cordón umbilical se potencia en gran medida en presencia de la fibronectina o fragmentos de fibronectina, incluso aunque la fibronectina no constituya parte del ECM en la sangre del cordón umbilical e incluso aunque las células madre o progenitoras primitivas de la sangre de cordón umbilical se hayan caracterizado como diferentes de las de la médula ósea. En particular, la célula madre de la sangre del cordón umbilical se ha caracterizado como CD34^{+}, HLA-DR^{+}, mientras que la célula madre de la médula ósea se ha caracterizado como CD34^{+}, HLA-DR^{-}. El descubrimiento de que las células progenitoras primitivas de la sangre del cordón umbilical se transducen de manera eficaz de forma potenciada en presencia de la fibronectina o fragmentos de fibronectina permite el uso de una fuente enriquecida en células madre de manera conveniente y elevada de células hematopoyéticas. Además, las pruebas de un injerto con éxito en numerosos pacientes con transplantes alogénicos de sangre de cordón umbilical enriquecido en células madre y progenitoras primitivas, hace de la sangre del cordón umbilical una fuente de células hematopoyéticas muy preferida. Veáse, Kohli-Kummer et al., Brit. Heaematol. 85:419-422 (1993); Broxmeyer et al., Blood Cell 17:313-329 (1991); Gluckman et al., Br. J. Heaematol. 45:557 (1980); Heidelberg: Springer-Verlag págs. 60-68 (1989); Wagner et al., Blood 79:1874-1881 (1992); y Wagner et al., Blood 82-86a (resumen).
Si se desea, pueden someterse a prueba células hematopoyéticas transducidas recogidas u otras para determinar la eficacia de transducción y la expresión génica. Por ejemplo, las mejoras significativas en la transferencia génica mediada por retrovirus proporcionada por la invención se demuestran en los ejemplos específicos de a continuación, que describen diversas pruebas que demuestran una alta eficacia de la infección y la transferencia génica por parte del retrovirus en presencia de fibronectina o fragmentos de fibronectina eficaces. En particular, células hematopoyéticas murinas infectadas con el retrovirus PGK-hADA expresaron altos niveles de ADN_{c} de ADA transferido. De manera similar, colonias progenitoras humanas infectadas por el virus PGK-mADA individual expresaron niveles de ADA murina de hasta 10 veces superior a la proteína de ADA humana endógena. Por lo tanto, para analizar estrictamente la eficacia de transferencia, las colonias progenitoras sólo se consideraron transducidas si la expresión de la mADA transferida fue igual o superior a los niveles de ADA humana endógena. Se detectaron altos niveles de expresión de neo a partir del vector TKNEO mediante la resistencia al fármaco G418, como un ensayo para determinar la actividad de la neofosfotransferasa (el producto génico de neo).
Tal como se indicó anteriormente, los métodos de la presente invención se llevan a cabo de manera ventajosa sin la necesidad de cocultivo en presencia de células productoras de retrovirus. Así, según un aspecto de la invención, la transferencia génica mediada por retrovirus puede llevarse a cabo en ausencia sustancia de células distintas de las células hematopoyéticas diana u otras células. Por ejemplo, pueden cultivarse células productoras que contengan el plásmido del vector retroviral y recoger el sobrenadante. Entonces, puede utilizarse el sobrenadante que contiene el retrovirus para infectar las células hematopoyéticas en presencia de la fibronectina y/o fragmentos de fibronectina, que están preferiblemente en forma inmobilizada, por ejemplo, recubierta sobre una superficie en la que se lleva a cabo la infección o se pone en contacto de otro modo con el medio para la infección. A este respecto, se contemplan como adecuadas para su uso en la invención cualquier célula productora que produzca un título alto de retrovirus libre de auxiliar. Éstas incluyen, por ejemplo, células de empaquetamiento tales como Psi-2, C2, PA12, PA317, y GP+envAM12, así como muchas otras líneas celulares de empaquetamiento conocidas en la técni-
ca.
Según otras características de la invención, puede utilizarse la fuerte unión del virus a los aminoácidos dentro del dominio de unión a la heparina-II de la fibronectina para construir sistemas de administración para terapia viral en una amplia gama de tipos celulares. Para este fin, puede acoplarse de manera covalente un polipéptido que incluye el dominio de unión a retrovirus de la fibronectina a cualquier ligando que dé a este constructo especificidad por células diana. Este enfoque salvará la necesidad anterior de de construir líneas celulares de retrovirus específicas para cada célula diana (Kasahara, N., A. M. Dozy, y Y. W. Kan., Science, Vol. 266, págs. 1373-1376 (1994) y Valsesia-Wittmann, S., A. Drynda, G. Deleage, M. Aumailley, J. M. Heard, O. Danos, G. Verdier, y F. L. Cosset, J. Virol., Vol. 68, págs 4609-4619 (1994)). La especificidad del constructo de selección de diana puede proporcionarse empleando ligandos que incluyen, por ejemplo, 1) proteína adhesiva celular, 2) hormonas o citocinas, 3) anticuerpos monoclonales frente a las células diana, 4) hidratos de carbono que se unan a las células diana (G. Ashwell, et al., Annu. Rev. Biochem., Vol. 51, págs. 531-554 (1982)), 5) metabolitos para las células diana, o 6) polipéptidos funcionales que se unan a las células diana. La eficacia del constructo para la administración génica puede mejorarse incluyendo diversos dominios de unión de virus a heparina II y aumentar así la cantidad de partículas víricas administradas a las células diana. Por ejemplo, el dominio de unión celular de la fibronectina humana que corresponde a Pro^{1239}-Ser^{1515}, tal como se describió en la patente de los EE.UU. nº 5.198.423, ha demostrado unirse a células incluyendo células BHK y B16-F10 (Kimizuka et al., J. Biochem. Vol. 110, págs. 285-291 (1991)). Además el domino de heparina-II por sí mismo a demostrado unirse a fibroblastos, células endoteliales, y células tumorales. Estas secuencias de polipéptido pueden acoplarse al dominio de unión a retrovirus de la fibronectina para seleccionar como diana células predeterminadas para la infección por retrovirus.
Aplicaciones a modo de ejemplo en el sistema hematopoyético también incluyen un constructo de eritropoyetina o G-CSF acoplado al dominio de unión a retrovirus de la fibronectina para seleccionar como diana células eritroides o precursoras granulocíticas altamente específicas, respectivamente. Otra aplicación común según la presente invención será combinar el dominio o dominios de unión a retrovirus con un ligando que se una específica y predominantemente a células malignas. Por ejemplo, se ha demostrado que el crecimiento in vitro e incluso in vivo de células de carcinoma mamario puede verse influido por el empleo de sustancias que se unen a los receptores de las células diana tales como derivados de liberación de la hormona luteinizante, Emons, G. et al., Hum. Reprod. 9:1364-1379 (1994), estrógenos, Tolcher, A. W., Oncol. 8:39-43 (1994), o anti-estrógenos, Howell, A. et al., Lancet 345:29-30 (1995), progestágenos o anti-progestágenos, Klijn. F. G. et al, Hum. Reprod. 9 Suppl. 1:181-189 (1994); Griffiths, K. et al, Semin. Oncol. 21:672-687 (1994), todas las cuales sirven como ligandos en constructos de la invención que contienen uno o más dominios de unión a virus de la fibronectina. Como ejemplos adicionales, pueden seleccionarse como diana células tiroideas (cáncer) de manera muy específica utilizando constructos con Jodid, y pueden seleccionarse como diana células hepáticas (cáncer) mediante constructor que contienen HDL o partes de los mismos. Finalmente, constructos de anticuerpos monoclonales y el dominio de unión a retrovirus de la fibronectina permitirá la selección como diana de cualquier célula u órgano frente al que haya disponible un anticuerpo. Así pues, pueden seleccionarse como diana una amplia gama de tipos celulares mamíferos sacando provecho de la capacidad del dominio de unión a retrovirus de la fibronectina para unir y localizar vectores virales.
Según esto, otra realización preferida de la invención implica la preparación de un constructo que puede utilizarse para potenciar la transducción viral de una célula diana. La secuencia de aminoácidos de unión viral del dominio de unión a heparina II de la fibronectina se acopla a un ligando al que se une la célula diana. Tal como se trató anteriormente, el ligando puede ser, por ejemplo, un polipéptido de fibronectina o de otra proteína (incluyendo una proteína adhesiva celular, por ejemplo, laminina, colágeno, vitronectina, osteopontina o trombospondina), una hormona, un metabolito, un anticuerpo (incluyendo anticuerpos monoclonales), o cualquier otro ligando que presente la capacidad de unirse, preferiblemente con especificidad, a la célula diana. El constructo global resultante puede utilizarse en forma inmovilizada de una manera similar a la usada para los polipéptidos de fibronectina dados a modo de ejemplo específicamente en los ejemplos de a continuación.
Tales constructos y enfoques de selección de diana celular pueden utilizarse in vitro tal como se trató anteriormente, y también en la selección como diana in vivo de retrovirus, teniendo en cuenta diversos factores tales como la estabilidad y la especificidad del constructo y la interacción del constructo de retrovirus en condiciones fisiológicas. También puede mejorarse la especificidad modificando el sistema de administración para localizar la administración del constructo a las células diana, por ejemplo, la cateterización de la vena portal para seleccionar como diana células de hígado.
Otro aspecto de la invención se refiere al descubrimiento de que los procedimientos de transducción de la invención, que implican la colocalización del virus y las células, son más ventajosos cuando se llevan a cabo en ausencia o ausencia sustancial de bromuro de hexadimetrina. El bromuro de hexadimetrina (comercialmente disponible bajo el nombre de Polybrene®) es una sustancia policatiónica que se ha utilizado ampliamente en protocolos de transferencia génica mediada por retrovirus con el fin de mejorar la eficacia de transducción por parte del retrovirus. No obstante, se ha descubierto que la presencia de bromuro de hexadimetrina en protocolos de transferencia génica potenciados por colocalización tales como los descritos en el presente documento reduce de manera significativa la eficacia de transducción. Por tanto, se llevan a cabo procedimientos mejorados de la invención en un medio al menos sustancialmente libre de bromuro de hexadimetrina (es decir, que no contenga más de aproximadamente 1 \mug/ml bromuro de hexadimetrina) y más preferiblemente en ausencia de bromuro de hexadimetrina. Tales procedimientos proporcionan composiciones celulares preferidas de la invención, que incluyen poblaciones celulares viables sustancialmente transducidas por retrovirus que están sustancialmente libres de tanto células productoras de retrovirus, como de bromuro de hexadimetrina. A este respecto, poblaciones celulares viables sustancialmente transducidas tal como se utiliza en el presente documento pretende querer decir que al menos aproximadamente un 20% de las células en la población se ha transducido por parte de un retrovirus. Las poblaciones más preferidas tendrán al menos aproximadamente un 50% de células transducidas, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente un 75% de células transducidas. Las composiciones celulares según este aspecto de la invención incluirán células hematopoyéticas, y más preferiblemente poblaciones celulares hematopoyéticas que están enriquecidas en células madre y progenitoras primitivas. En términos generales, los procedimientos ventajosos de la invención pueden llevarse a cabo, por tanto, sin la presencia de agentes poliocatiónicos u otros que, en protocolos de infección retrovirales correspondientes (por ejemplo, cocultivo) sin el fragmento de fibronectina u otro material para la colocalización, que conduce a un aumento en la eficacia de transducción, pero agentes que reducen la eficacia de transducción en presencia del material para colocalización.
Se contempla que se llevará a cabo una transferencia de ADN mediada por retrovirus muy conveniente utilizando kits especialmente diseñados para la puesta en práctica de los métodos de la invención. Por consiguiente, otro aspecto de la invención proporciona kits que incluyen una cantidad de polipéptido o constructo sustancialmente puro tratado anteriormente que potencia la transducción de células diana por parte de retrovirus, junto con un sustrato artificial con el que puede llevarse a cabo la infección retroviral. El polipéptido u otro constructo pueden proporcionarse separadamente o recubierto con el sustrato artificial. En el caso de protocolos de infección para células hematopoyéticas humanas los kits también incluirán factores de crecimiento de células hematopoyéticas para la estimulación celular previa. Además, los kits pueden incluir los vectores de retrovirus recombinantes tal como se trataron anteriormente para la transducción. En términos generales, los kits incluirán un envase estéril que garantice la protección de estos diversos componentes del kit en una relación espaciada entre sí suficiente como para evitar la rotura de los componentes durante el manejo del kit. Por ejemplo, es una práctica común utilizar artículos de plástico moldeado que tengas compartimentos o áreas múltiples para mantener los componentes del kit en una relación espaciada.
Con el fin de favorecer una comprensión y apreciación adicional de la invención se proporcionan más ejemplos. El primer ejemplo es un ejemplo de referencia que la presente invención no abarca, pero proporciona detalles de los protocolos utilizados en los ejemplos ilustrativos posteriores. Se comprenderá que estos ejemplos no son de naturaleza limitante.
Ejemplo de referencia 1
Transferencia génica en células de médula ósea utilizando TKNEO 1.1 Preparación de sobrenadante de virus
Se cultivaron células productoras GP+EnvAM 12 (véase Markowitz et al. (1998) Virology 167:400) que contenían vector TKNEO de plásmido retroviral en medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM, Gibco, Gaithersburg, MD) que contenía un 10% de suero de ternero fetal (FCS, Hyclone, Logan, UT) y 100 unidades/ml de penicilina y 100 microgramos/ml de estreptomicina (P/E, ambos de Gibco). Se recogió sobrenadante que contenía virus añadiendo 10 ml de IMDM que contenía un 20% de FCS a placas confluentes durante la noche. Se filtró el medio recogido a través de filtros de 0,45 micras (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) y se almacenó a -80ºC hasta su uso.
1.2. Preparación de fragmentos de fibronectina
Se purificó FN a partir de plasma humano (Lifesource, Glenview, IL) tal como se describió previamente en Ruoslahti et al., Methods Enzymol. 82:803-831 (1982), excepto en que la columna de gelatina-agarosa se lavó con urea 1 M antes de la elución de FN con urea 4 M. Se dializó FN purificada de manera extensa a 4ºC frente a ácido 3-(ciclohexilamino)-1-propano-sulfónico 10 mM (CAPS), NaCl 150 mM, CaCl_{2} 2 mM pH 11,0 y se almacenó en alícuotas a -80ºC. Se purificaron el dominio de unión celular quimotríptico (CBS) (CS-1) y los fragmentos de unión a heparina-II de FN tal como se describió previamente (Ruoslahti et al. (1982), anteriormente, Patel y Lodish, J. Cell. Biol. 102, págs. 449-456 (1986), y Bernardi et al., J. Cell. Biol. 105, págs. 489-498 (1987). Se obtuvieron 3 fragmentos de unión a heparina principales (30 kD, 35 kD, y 42 kD) en el eluato de NaCl 1M a partir de la columna de heparina-agarosa. Para purificar adicionalmente estos fragmentos de unión a heparina, se dializó durante la noche el eluato de NaCl 1 M a 4ºC frente a Tris-HCl 10 mM, pH 7,0 y se hizo pasar sobre una columna de intercambio aniónico (2 ml de flujo rápido de DEAE-Sepharose. (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia)/mg de proteína) que se había equilibrado con Tris-HCl 10 mM pH 7,0. Se recogieron los fragmentos de 30/35 kD en la fracción sin unir, mientras que el fragmento de 42kD fragmento eluyó de la columna con NaCl 100 mM. A partir de 500 mg de FN, se obtuvieron aproximadamente 26 mg de los fragmentos de 30/35 kD y 4 mg del fragmento de 42 kD. El fragmento de 42 kD, pero no los fragmentos de 30/35 kD, se reconocieron mediante un anticuerpo contra el dominio de unión a fibrina tal como se determinó mediante una técnica de inmunotransferencia de tipo western. Además, el fragmento de 42 kD se une a la columna de afinidad fibrina-Sepharose.
Para su uso en el protocolo de infección, se inmovilizaron fragmentos de fibronectina sobre placas de Petri de 35 o 100 mm (Falcon, Lincoln Park, NJ) a una concentración de 75 pmol/cm^{2} tal como describieron Patel y Lodish (1986), anteriormente. Se recubrieron placas de control de manera análoga con un 2% de albúmina sérica bovina (libre de FN) (BSA, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania).
1.3. Protocolo de infección retroviral
Se recogieron muestras de médula ósea a partir de donantes adultos sanos en tubo que contenían sulfato de heparina sódica según los protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional (Institutional Review Board) de la Escuela Universitaria de Medicina de Indiana. Se prepararon células mononucleares de baja densidad mediante centrifugación en Ficoll-Hypaque (densidad 1,077 g/ml, Pharmacia, Piscataway, NJ) durante 45 minutos a 25ºC. Se retiraron las células adherentes al plástico de las células de médula ósea de baja densidad mediante una incubación adicional en placas de cultivo tisular durante de 4-16 horas a 37ºC en un 5% de CO_{2} en IMDM con un 2% de FCS.
Se estimularon previamente células mononucleares de baja densidad negativas a la adherencia antes de la infección retroviral tal como describieron previamente Luskey et al. (1992) Blood 80:396, durante 48 horas a 37ºC y un 5% de CO_{2} en IMDM que contenía un 20% de FCS, 100 U/ml de rhIL-6, 100 ng/ml de rhSCF (ambos de Amgen, Thousand Oaks, CA), y P/E a una densidad celular de 1 x 10^{6} células/ml en placas de Petri. Se recogieron las células estimuladas previamente pipeteando enérgicamente para retirar las células adherentes al plástico de manera laxa.
Se incubaron las células estimuladas previamente (5 x 10^{5} células/ml) durante 6 horas sobre placas recubiertas con BSA (placas de control) o fibronectina o fragmentos de la misma (sometidas a radiación UV para que las proteínas se adhirieran mejor a la placa de plástico) y a continuación se infectaron con el sobrenadante de virus en presencia de factores de crecimiento (tal como anteriormente) y 7,5 microgramos/ml de polibreno (Aldrich Chemical, Milwaukee, WI). Se sustituyó el sobrenadante de virus (incluyendo factores de crecimiento y 5,0 microgramo/ml de polibreno) tras 2 horas y las células se incubaron durante de 12 a 24 horas adicionales. Con cada cambio de medio no se volvieron a añadir células no adherentes.
Tras el protocolo de infección, de los cultivos se decantaron las células no adherentes y se recogieron células hematopoyéticas adherentes usando un tampón de disociación celular (Cell Dissociation Buffer-CDB) (libre de enzimas/basado en PBS, Gibco) según las instrucciones del fabricante. Se añadieron las células adherentes a la fracción no adherente, se lavaron dos veces y se contaron. Las células recogidas o bien se dispusieron en placa en ensayos clonogénicos de progenitoras con metilcelulosa o cultivos de médula ósea a largo plazo.
1.4. Cultivos de médula ósea a largo plazo
Se llevaron a cabo ensayos de LTC-IC (célula madre humana) según métodos previamente descritos con ligeras modificaciones. Sutherland et al. Blood 74:1563 (1989). Brevemente, se sembraron 0,5-1 x 10^{6} células infectadas en cultivos de médula ósea a largo plazo (LTMC) en fibroblastos de médula ósea (bone marrow fibroblasts-BMF) humanos alogénicos irradiados previamente (como anteriormente), confluentes en 5 ml de IMDM que contenía un 10% de FCS, un 10% de suero de caballo (Sigma) y P/E, hidrocortisona 1 x 10^{-5} M (Upjohn, Kalamazoo, MI), y 320 mOsmol de cloruro de sodio en placas de cultivo tisular de 6 pocillos (Costar, Cambridge, MA). Se incubaron LTMC a 33ºC en un 5% de CO_{2} y se alimentaron semanalmente mediante la retirada de un 50% del medio y de células no adherentes. Tras cinco semanas, se sacrificaron los cultivos de LTC-IC utilizando un CDB para retirar las células hematopoyéticas adherentes de los BMF. Tanto las células hematopoyéticas adherentes, como las no adherentes se combinaron y se dispusieron en placas en metilcelulosa para obtener colonias derivadas de LTC-IC.
1.5. Ensayos clonogénicos con metilcelulosa
Se llevaron a cabo ensayos con metilcelulosa tal como describieron previamente Toksoz et al. Proc. Natl. Acad Sci., USA, Vol. 89, pág. 7350 (1992), con modificaciones menores. Brevemente, se dispusieron en placa 2-5 x 10^{4} células de médula ósea adultas infectadas con 5 unidades/ml de eritropoyetina (Epo, Amgen), 100 ng/ml de rhSCF, 10 ng/ml de rhIL-3 (Genzyme, Cambridge, MA) en 1 ml de IMDM-metilcelulosa al 2,4% (Fluka, Ronkonkoma, NY) que contenía un 25% de FCS, un 10% de plasma humano, beta-mercaptoetanol 10^{-5} M (Sigma), y P/E. Se incubaron los cultivos a 37ºC en 5% de CO_{2}/95% de aire y las colonias (> 50 células) se puntuaron mediante visualización en un microscopio invertido en el día 13 como UFC-GM (que contienen granulocitos y macrófagos), UFC-Mezcla (que contienen elementos mieloides y eritroides), o UFB-E (que contienen sólo elementos eritroides).
1.6. Análisis de infección retroviral
Se analizó la eficacia de infección con el virus TKNEO mediante determinación del porcentaje de colonias en metilcelulosa resistentes a 1,5 mg/ml (polvo seco, Gibco) de G418 en el día 13. Se llevaron a cabo infecciones simuladas en cada experimento incubando médula ósea en la línea de empaquetamiento GP+EnvAM 12 que no produce virus recombinante. El cultivo de estas células infectadas de manera simulada con 1,5 mg/ml de G418 demostró de manera sistemática colonias de fondo (background colonies) < 1%.
1.7. Eficacia de transferencia génica en células progenitoras comprometidas
Se comparó la eficacia de transducción infectando células de médula ósea mientras se dispusieron en placas recubiertas con BSA o FN 30/35. No se observó diferencia entre estas condiciones en el número de colonias obtenidas tras la infección sin selección. La figura 2 demuestra el porcentaje de colonias G418^{r} tras la infección. Se observó un porcentaje más elevado de colonias G418^{r} sobre FN 30/35 de todos los tipos de progenitores, incluyendo los derivados de la estirpe restringida (UBF-E y UFC-GM) así como células progenitoras de estirpe múltiple (UFC-Mezcla). En todos los progenitores comprometidos la infección aumentó 9 veces sobre FN 30/35 frente a BSA.
1.8. Eficacia de transferencia génica en células de iniciación de cultivo a largo plazo
Se valoró la transferencia génica en LTC-IC utilizando el vector TKNEO. Sólo se detectó transferencia génica en colonias derivadas de LTC-IC tras la infección sobre FN 30/35 (un 16% de colonias G418' frente a un 0% de colonias G418^{r}, FN 30/35 frente a BSA).
1.9. Especificidad de los efectos de FN 30/35 sobre la eficacia de infección de células hematopoyéticas
Para determinar la especificidad de la mayor eficacia de transferencia génica observada sobre FN30/35, se llevó a cabo una infección con TKNEO sobre placas recubiertas con BSA, FN30/35, fibronectina intacta, un fragmento de FN de 115 kd que contiene el dominio de unión celular central (CBD), que contiene la secuencia de tetrapéptido RGDS, y un fragmento de FN C-terminal de 42 kd (FN 42) caracterizado por el domino de unión a heparina II pero que carece de la secuencia CS-1 (figura 1). La infección sobre BSA produjo un 3 \pm 1% de UFB-E G418^{r}, un 1 \pm 1% de UFC-GM G418^{r}, y un 0 \pm 0% de UFC-Mezcla G418^{r}. No se observó un aumento significativo en la proporción de colonias G418^{r} sobre CBD, mientras que sobre FN 42 se observó una infección ligeramente mayor de UFB-E (6,0 \pm -1%) (figura 3). Sin embargo, la FN intacta potenció un aumento de la transferencia génica en todos los progenitores comprometidos. El porcentaje de colonias G418^{r} tras la infección sobre FN intacta fue inferior que sobre FN 30/35 en todas las estirpes, incluyendo UFB-E (16 \pm -2 frente a un 24 \pm 4%), UFC-GM (5\pm 2 frente a un 20 \pm 4%) y UFC-Mezcla (6 \pm 1 frente a un 9\pm 1; FN intacta frente a FN 30/35, respectivamente.
Ejemplo ilustrativo 1
Unión de virus a fragmentos de fibronectina recombinante 1.1. Parte experimental
Kimizuka et al. han notificado previamente la expresión de secuencias de ADN de FN clonadas en E. coli (Kimizuka, F., Y. Taguchi, Y. Ohdate, Y. Kawase, T. Shimojo, D. Hashino, I. Kato, K. Sekiguchi, y K. Titani. J. Biochem., Vol. 110, págs. 284-291 (1991)). Los péptidos clonados y quiméricos incluyen una o una combinación de varias secuencias importantes en la fibronectina de la(s) que se sabe que participa(n) en la adhesión celular (incluyendo RGDS, CS-1 y sitio de unión a heparina), véase la figura 4. Para analizar si el retrovirus puede unirse a estos fragmentos de FN recombinante, se repitieron ensayos de formación de colonias de células 3T3 sobre placas recubiertas con los fragmentos recombinantes C-274, H-271, H-296, CH-271, CH-296, y C-CS1 así como FN 30/35 como control positivo, utilizando dos diluciones diferentes (1:10 y 1:100) de la reserva congelada de retrovirus TKNeo con 1 x 10^{4} partículas infecciosas/ml. Se utilizaron fragmentos de FN a una concentración de 120-130 pmol/cm^{2} (equivalente a 4 \mug/cm^{2} para C-274, H-271, H-296, C-CS1, FN 30/35 y 8 \mug/cm^{2} para CH-271 y CH-296). Brevemente, se recubrieron las placas, se añadió el virus, se lavaron extensamente las placas, se añadieron células NIH/3T3 durante 24 horas y, a continuación, se hicieron crecer en medio de selección durante 10 días, posteriormente, las colonias se tiñeron y se contaron.
1.2. Resultados
La figura 5 demuestra que el número de colonias resistentes a G418 (y por tanto a la adhesión del virus) aumentó en los fragmentos H-271, H-296, CH-271 y CH-296. Además, se muestra que la cantidad de virus unido fue aproximadamente comparable entre estos fragmentos recombinantes y FN 30/35, aunque en este trabajo el fragmento CH-271 presentó el mayor nivel de unión a virus. Comunes a estos 5 fragmentos de FN son las repeticiones 12-14 de tipo III que contienen el sitio de unión a heparina de alta afinidad (Ruoslahti, E., Ann. Rev. Biochem., Vol. 57, págs. 375-413 (1988) y Kimizuka, F., Y. Taguchi, Y. Ohdate, Y. Kawase, T. Shimojo, K. Hashino, I. Kato, K. Sekiguchi, y K. Titani, J. Biochem., Vol. 110, págs. 284-291. (1991)) probablemente localizado en la repetición 13 (Kimizuka, F., Y. Taguchi, Y. Ohdate, Y. Kawase, T. Shimojo, K. Hashino, I. Kato, K. Sekiguchi, y K. Titani, J. Biochem., Vol. 110, págs. 284-291 (1991)). Esto sugiere que la unión a virus se está produciendo a través de este sitio de adhesión conocido. Esto se demostró mediante la incubación previa de placas recubiertas con 4 \mug/cm^{2} de CH-271 con concentraciones crecientes (10-1000 \mug/ml) de sulfato de heparina, una molécula altamente cargada que se sabe que se une al sitio de unión a heparina. Tal como se observa en la figura 6, el número de colonias resistentes a G418 se reduce tras la incubación previa de CH-271 con concentraciones crecientes de sulfato de heparina. Estos datos sugieren que la unión de virus a FN está mediada a través del sitio de unión a heparina de alta afinidad localizado inmediatamente adyacente al sitio CS-1 en los dominios carboxi-terminales de FN.
Ejemplos ilustrativos 2
La fibronectina dirige la adhesión celular a través de al menos tres sitios (figura 7): el domino de unión celular (CBD) que contiene el tetrapéptido RGDS en la repetición 10 a través de la integrina VLA-5; el dominio de unión a heparina contenido dentro de las repeticiones 12-14 de tipo III (III_{12-14}) a través de moléculas de proteoglucano de superficie celular; y la secuencia CS1 con la región IIICS cortada y empalmada de manera alternativa a través de la integrina VLA-4. En estos estudios, se usaron seis fragmentos de FN recombinantes quiméricos mostrados en la figura 7 que contienen estos sitios de adhesión celular únicos solos o en combinaciones en el péptido.
Se incubaron placas bacterianas recubiertas con FN con 200 ufc en 2 ml de sobrenadante (SN) a partir de la línea celular de empaquetamiento anfotrópica TKNeo. Tras 30 minutos a 37ºC, las placas se lavaron tres veces con PBS y, a continuación, se añadieron células 2000 NIH/3T3 (fibroblastos) en 2 ml de DMEM complementado con un 10% de suero de ternero (calf serum-CS; Sigma, EE.UU.) y un 2% de P/E. Al día siguiente, las células se pusieron en medio de selección con 0,75 mg/ml de G418. 8-10 días después, las placas se tiñeron con tinción Stat (Volu-Sol, EE.UU.) y se contaron las colonias G418^{r}. Mediante este ensayo, el retrovirus no se une a placas recubiertas con BSA o sin recubrir. Tal como se muestra en la figura 8, la transferencia génica en células NIH/3T3 células sólo se produjo en fragmentos que contenían el dominio de unión a heparina II, también llamado en el presente documento como "III_{12-14}" (H-271, CH-271, H-296, CH-296). Estos datos demuestran que las partículas retrovirales se unen directamente a secuencias dentro de las repeticiones III_{12-14} de fibronectina. La infección de células NIH/3T3 fue significativamente mayor en los fragmentos FN que contenían tanto III_{12-14}, como CBD en comparación con III_{12-14} solo (compárese H-271 frente a CH-271). Sorprendentemente, se generaron hasta 80 colonias de NIH/3T3 G418^{r}/placa a partir de una entrada de sólo 200 ufc de NEO/placa. Por el contrario, la adición de CS1 no mostró ningún efecto sobre la transducción de NIH/3T3 (H-271 frente a H-296, CH-271 frente a CH-296).
Para demostrar que el mecanismo por el cual FN aumentó la transferencia génica mediada por retrovirus fue mediante la unión simultánea del retrovirus y las células diana al fragmento, se llevaron a cabo experimentos usando una línea celular no adherente (HL60-una línea celular de leucemia promielocítica conocida). Las células HL60 se tiñeron con anticuerpos monoclonales conjugados directamente con fluorocromo contra VLA-4 (FITC; Immunotech, EE.UU.) y VLA-5 (PE; Antigenix America, EE.UU.) o con los controles de isotipo para IgGI e IgG2a (Becton Dickinson). Se excluyeron las células muertas mediante tinción con yoduro de propidio. A continuación, se analizaron las células en un FACScan (Becton Dickinson). Para los estudios de transferencia génica, se suspendieron 10^{4} células HL60 con sobrenadante viral a partir de la línea celular de empaquetamiento anfotrópica DAG (obtenida del Hospital de Investigación Infantil San Judas, Memphis, TN, EE.UU.) que contiene el dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento nervioso (NGF-R) (título de 10^{5} ufc/ml) y, a continuación, se añadieron a placas bacterianas de 6 pocillos con los seis fragmentos de FN a una concentración de 2 \mug/cm^{2}. Tras 4 horas, se añadieron 2 ml de medio condicionado procedente de cultivos en curso de HL60. Se añadieron 4 ml de medio nuevo (RPMI (Gibco) con un 5% de FCS y un 2% de P/E) tras 4-5 días. Se dejaron crecer las células durante un total de 8 días y, a continuación, se tiñeron con el anticuerpo monoclonal 8211 contra NGF-R (Boehringer, EE.UU. de América) o con un control de isotipo de IgG1 (Dako, EE.UU.) y, a continuación, se hicieron reaccionar con suero de cabra anti-ratón conjugado con FITC secundario (Boehringer). Las muestras se incubaron con yoduro de propidio (propidium iodine-PI) para la exclusión de restos celulares y, posteriormente, se midieron en el FACScan. La transferencia génica se demostró tras seleccionar células vivas mediante análisis de la expresión del NGF-R. Todos los estudios de transferencia génica se llevaron a cabo sin polibreno o protamina. Tal como se muestra en la figure 9, las células HL60 expresan VLA-4 pero no VLA-5 en el análisis de citometría de flujo (A + B). En coherencia con los datos de expresión, las células HL60 se adhirieron sólo a las placas recubiertas con fragmentos que contenían CS (H-296, CH-296, C-CS1). Tal como se observa en la figure 9, la transducción genética de las células HL-60 sólo se produjo en fragmentos que contenían III_{12-14} en combinación con CS1 (H-296, CH-296). Aunque las células HL-60 se adhieren al fragmento C-CS1 a través de su integrina VLA-4, la ausencia de III_{12-14} en la que se produce la unión retroviral reduce drásticamente la transducción de células HL60.
En otra serie de experimentos, se disolvieron concentraciones crecientes de heparina de alto peso molecular (APM) (Sigma, EE.UU., PM de aproximadamente 7000-25000) en 2 ml de solución salina equilibrada de Hank complementada con un 2,5% (v/v) de Hepes 1 M (HBSS/Hepes; todo de Gibco) y se añadieron a placas bacterianas de 6 pocillos recubiertas con los diferentes fragmentos de FN a una concentración de 4 \mug/cm^{2}. A los 30 minutos se lavaron tres veces las placas con PBS y, a continuación, se añadieron 400 ufc/2 ml del vector TKNeo anfotrópico. Tras 30 minutos a 37ºC, las placas se lavaron de nuevo con PBS y, a continuación, se añadieron 2000 células NIH/3T3 en DMEM con un 10% de CS y un 2% de P/E. La selección se llevó a cabo como anteriormente y la eficacia de transferencia génica se enumeró como el número de colonias G418^{r} después de 8-10 días de cultivo. En una serie de experimentos similar, se disolvió heparina fraccionada de bajo peso molecular (BPM) (Sigma, EE.UU., PM de aproximadamente 3000) en 2 ml de HBSS/Hepes a concentraciones crecientes. El diseño experimental fue entonces tal como se describió anteriormente para la heparina de APM. La eficacia de transferencia génica se leyó como el número de colonias G418r tras 8-10 días. Todos estos estudios de transferencia génica se llevaron a cabo sin polibreno o protamina. Los resultados de estos experimentos se muestran en la figura 10. Tal como se muestra, puede competirse con la unión de virus a FN de una manera dependiente de dosis mediante una heparina de alto (10A), pero no de bajo peso molecular (10B). Estos resultados demuestran que las partículas retrovirales se unen a secuencias dentro de III_{12-14}.
Ejemplo ilustrativo 3
Transducción de células NIH/3T3 y BM clonogénicas usando concentraciones variables de polibreno
En esta serie de experimentos, se demostró que los métodos de transducción ventajosos de la invención se llevan a cabo en ausencia de bromuro de hexadimetrina. Se sometió a células NIH/3T3 (fibroblastos) y células clonogénicas de médula ósea a protocolos de infección con TKNEO generalmente tal como se describe en el ejemplo de referencia 1 y el ejemplo 2, respectivamente, excepto en que el vector, las células y concentraciones variables de polibreno se suspendieron en primer lugar y, a continuación, se aplicaron a un sustrato recubierto con el fragmento de FN CH-296 (8 \mug/ml). Los ensayos fueron tal como se describieron anteriormente para estos tipos celulares. Los resultados se facilitan en las figuras 11 y 12. Tal como se muestra en la figura 11, el número de colonias de NIH/3T3 resistentes a G418 se reduce drásticamente con concentraciones crecientes de polibreno, oscilando desde aproximadamente 14 cuando no se usó polibreno, hasta aproximadamente 4 cuando se usaron 12,5 \mug/ml de polibreno. De manera similar, la figura 12 refleja que se observaron aproximadamente 40 colonias cuando el protocolo se llevó a cabo en ausencia de polibreno, mientras que el valor correspondiente cuando se usaron 10 \mug/ml fue inferior a 15.

Claims (15)

1. Método in vitro para obtener una población transducida de células viables por parte de un retrovirus, que comprende:
infectar las células con un retrovirus en presencia de una cantidad inmovilizada eficaz de material para aumentar la eficacia de transducción de las células por parte del retrovirus, incluyendo dicho material un ligando que se une a las células y un ligando que se une al retrovirus, para así co-localizar el retrovirus y las células, llevándose a cabo dicha infección en un medio libre de agente policatiónico que aumenta la eficacia de transducción de las células por parte del retrovirus en un co-cultivo, pero agente que reduce la eficacia de transducción de las células por parte del retrovirus en presencia de dicho material.
2. Método según la reivindicación 1, en el que las células comprenden células madre hematopoyéticas.
3. Método según la reivindicación 1, en el que dichas células son células de mamífero.
4. Método según la reivindicación 2 ó 3, en el que dichas células son células humanas.
5. Método según cualquier reivindicación anterior, en el que la infección da como resultado una población de células viables transducidas con una eficacia mayor de la que se lograría en presencia de dicho agente policatiónico.
6. Método según la reivindicación 5, en el que el ligando que se une al retrovirus es un polipéptido que tiene una secuencia de: SEQ ID. No 1.
7. Método según la reivindicación 5, en el que las células son células hematopoyéticas humanas, y el material es un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos de: SEQ ID No 1.; y una secuencia de aminoácidos de: SEQ ID No 2.
8. Método según la reivindicación 5, en el que las células son células de mamífero, y la infección se lleva a cabo en un medio libre de células co-productoras de retrovirus.
9. Uso de células producidas mediante el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, células que están libres de dicho agente policatiónico y que contienen dicho material, en la fabricación de un medicamento para uso en el injerto de un mamífero con una población celular de mamífero viable.
10. Población celular viable producida mediante el método de la reivindicación 1, población que está libre de dicho agente policatiónico y contiene dicho material.
11. Composición celular, que comprende:
población de células viables transducidas sustancialmente in vitro por retrovirus, estando libre dicha composición tanto de células productoras de retrovirus, como de un agente policatiónico que aumenta la eficacia de transducción de las células por parte del retrovirus en co-cultivo, comprendiendo adicionalmente dicha composición un material que incluye un ligando que se une a las células y un ligando que se une al retrovirus.
12. Composición celular según la reivindicación 11, en la que dichas células viables comprenden células madre hematopoyéticas.
13. Uso de una composición celular según la reivindicaciones 11 ó 12, en la fabricación de un medicamento para su uso en el injerto celular.
14. Uso según la reivindicación 13, en el que la población celular es de la misma especie que el mamífero.
15. Uso según la reivindicación 14, en el que el mamífero es un ser humano y la población celular es una población celular humana.
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