KR100395420B1 - 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키는 방법에 있어서, 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 유효량의 기능성 물질과 표적 세포 결합 부위를 갖는 유효량의 다른 기능성 물질과의 혼합물의 존재하, 또는 그것들의 결합 부위를 동일 분자 중에 갖는 유효량의 기능성 물질의 존재하에서, 표적 세포를 레트로바이러스로 감염시킨다. 기능성 물질은 고정화되지 않거나 또는 비드 상에 고정화시켜 사용해도 좋으며, 이 방법은, 예를 들자면 유전자 치료에 유용하다.
Description
[기술분야]
본 발명은, 의학, 세포공학, 유전자공학, 발생공학 등의 분야에 있어서 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키고, 표적 세포의 형질전환을 양호한 효율로 행하는 것을 가능하게 하는 방법 및 그것에 관련된 일련의 기술에 관한 것이다.
[배경기술]
다수의 인간 질병에 대해서 그 기구가 해명되었으며, 또한, 재조합 DNA 기술 및 세포내로의 유전자 도입 기술이 급속하게 진보함에 따라서, 근년, 심각한 유전병을 치료하기 위해서 체세포 유전자 치료법의 프로토콜의 개발이 진전되고 있다.또한, 최근에는 유전병 뿐만아니라, AIDS와 같은 바이러스 감염병이나 암의 치료에도 유전자 치료를 적용하려고 하는 시도가 행해지고 있다.
지금까지 미국 식품의약품국(FDA)이 승인한 인간에서의 유전자 도입 시험의 대부분은 재조합 레트로바이러스 벡터를 사용하여 세포내로의 유전자 도입을 행하는 것이다. 레트로바이러스 벡터는 목적하는 외래 유전자를 세포내에 효율적으로 도입시켜, 그 염색체 DNA속에 안정되게 통합시키기 때문에, 특히 장기간에 걸친 유전자 발현이 요구되는 유전자 치료에 대한 바람직한 유전자 도입 수단이다. 상기 벡터는 유전자 도입된 생물에 악영향을 끼치지 않게 하기 위하여 다양한 방식으로 설계되고 있다. 예를 들면, 벡터의 복제 기능을 결손시켜 세포내로의 유전자 도입에 사용되는 벡터의 자가 증식에 기인한 무제한적인 감염(유전자 도입)을 반복을 피하는 것이다. 그러한 벡터(복제능력 결손 레트로바이러스 벡터)는 자가 복제가 불가능하기 때문에, 일반적으로는 레트로바이러스 생산 세포(포장 세포)를 사용하여 바이러스 입자 중에 포장된 레트로바이러스 벡터를 제조한다.
한편, 골수세포는 시험관내 (in vitro)에서 취급이 가능하고 또 자기복제능력을 갖는 조혈 간세포를 함유하고 있는 것이므로, 체세포 유전자 치료법의 양호한 표적 세포이다. 또한 제대(臍帶) 혈액도 조혈 간세포를 포함한 다수의 원시 전구세포를 포함하고 있는 것이 지금까지 증명되어 있다. 이들의 표적 세포에 유전자를 도입시켜 생체에 이식하는 유전자 치료를 행함으로써, 도입된 유전자가 혈액세포 중에서 장기에 걸쳐 발현되어 질병을 일생에 걸쳐 치유할 수 있다.
그러나, 다수의 그룹에 의해 연구가 진전되고 있음에도 불구하고 조혈 간세포는 고효율의 유전자 도입이 어려운 세포 중의 하나이다. 지금까지 쥐나 그 밖의 동물의 조혈 간세포에 관해서 가장 효율이 좋은 유전자 도입의 프로토콜은 조혈 간세포를 레트로바이러스 생산 세포와 함께 공배양한다는 방법이었으나, 안전성에 있어서 불안감으로 인해 인간에 있어서의 임상적인 유전자 치료법에는, 레트로바이러스 생산 세포의 혼입 위험성이 낮은 무세포계에서의 유전자 도입이 기대되고 있다. 유감스럽게도, 레트로바이러스 생산 세포와의 공배양을 행하지 않고 조혈 간세포에 효율적으로 유전자를 도입하는 것은 쉽지가 않다.
최근, 세포외 매트릭스 성분인 피브로넥틴이나, 그 프라그먼트가, 단독으로 레트로바이러스를 사용한 세포내로의 유전자 도입의 효율을 향상시키는 것이 보고되어 있다(J. Clin. Invest., 제93권, 제1452~1457항페이지, 1994년, Blood, 제88권, 제855~862페이지, 1996년). 또한, 유전자 공학적으로 생산된 피브로넥틴프라그먼트도 동일한 성질을 갖고 있어, 이것을 이용하여 조혈 간세포에 효율좋은 외래유전자를 도입시키는 것이 가능하다는 것도 나타냈다(WO95/26200호). 이렇게 한 피브로넥틴에 의한 유전자 도입 효율의 향상에는, 피브로넥틴중의 헤파린결합 영역과, 레트로바이러스와의 결합이 관여하고 있는 것이 시사되어 있다. 이들의 피브로넥틴이나, 피브로넥틴 프라그먼트를 이용한 방법은, 모두 피브로넥틴이나, 그 프라그먼트를 고정화한 플레이트 중에서 세포에 레트로바이러스벡터를 감염시키는 것이다.
상기의 피브로넥틴이나, 피브로넥틴 프라그먼트를 이용한 유전자 도입법은, 레트로바이러스 결합 부위와 표적 세포부위를 동일한 분자상에 갖는 피브로넥틴 또는 그 프라그먼트 분자에 의해서 달성된다고 판단되어 있다(Nature Medicine, 제2권, 제876~872페이지, 1996년). 따라서, 상기의 방법을 응용해서 갖가지 표적 세포에 효율이 좋게 유전자를 도입하기 위해서는, 세포에 맞게 하나의 분자상에 바이러스와 세포의 결합 부위를 갖는 기능성 물질을 만들 필요가 있고, 보편적인 유전자 도입법으로서 이용하기 위해서는 여전히 문제점을 갖고 있다.
또한, 상기의 방법은, 레트로바이러스 감염시에 표적 세포의 배양에 사용하는 플레이트의 표면에 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 프라그먼트를 고정화함에 따라서 달성되고 있지만, 플레이트에의 고정화는 번잡한 조작을 필요로 하여, 간편한 유전자 도입법이라고는 말할 수 없다.
더욱이, 상기의 방법에 사용되는 기능성 물질은, 레트로바이러스 결합 부위로서 피브로넥틴 유래의 헤파린결합 영역을 포함하는 것에 한정되어 있다. 이 때문에, 이 상의 레트로바이러스 결합물질을 발견함에 따라서, 보다 우수한 유전자 도입방법을 개발할 가능성이 있다.
본 발명은, 이러한 문제를 해결하고, 보다 간편하고도 효율이 좋은 유전자 도입법을 제공하기 위해 행해진 것이다.
도 1은 섬유아세포 증식 인자, 섬유아세포 증식 인자를 함유하는 기능성 물질, 및 섬유 아세포 증식 인자와 피브로넥틴의 세포 접착 부위 폴리펩티드의 혼합물에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 섬유아세포 증식 인자, 섬유아세포 증식 인자와 피브로넥틴의 세포접착부위 폴리펩티드의 혼합물, 및 피브로넥틴의 세포 접착 부위 폴리펩티드에 의한 표적세로에의 유전자 도입 효율을 나타내는 그래프이다.
도 3은 콜라겐 프라그먼트, 피브로넥틴의 세포접착부위 폴리펩티드와 콜라겐 프라그먼트의 혼합물, 콜라겐 프라그먼트를 함유하는 기능성 물질, 및 피브로넥틴의 세포 접착 부위 폴리펩티드에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 나타내는 그래프이다.
도 4는 피브로넥틴 프라그먼트, 및 피브로넥틴 프라그먼트와 피브로넥틴의 세포 접착 부위 폴리펩티드의 혼합물에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 나타내는 그래프이다.
도 5는 피브로넥틴의 세포 접착 부위 폴리펩티드, 폴리라이신, 폴리라이신과 피브로넥틴의 세포 접착 부위 폴리펩티드의 혼합물, 피브로넥틴 프라그먼트, 및 피브로넥틴 프라그먼트와 피브로넥틴의 세포 접착 부위 폴리펩티드의 혼합물에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 나타내는 그래프이다.
도 6은 에리스로포이에틴 유도체, 폴리라이신, 및 에리스로포이에틴 유도체와 폴리라이신의 혼합물에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 나타내는 그래프이다.
도 7은 에리스로포이에틴유도체, 피브로넥틴 프라그먼트중합체, 및 에리스로포이에틴 유도체와 피브로넥틴 프라그먼트 중합체의 혼합물에 의한 표적 세포에의 유전자 도입 효율을 나타내는 그래프이다.
도 8은 피브로넥틴 프라그먼트고정화비드, 피브로넥틴의 세포접착부위 폴리펩티드고정화비드, 및 피브로넥틴 프라그먼트와 피브로넥틴의 세포접착부위 폴리펩티드의 혼합물을 고정화한 비드에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 나타내는 그래프이다.
도 9는 섬유아 세포 증식 인자, 및 섬유아세포 증식 인자를 함유하는 기능성 물질에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입을 나타내는 그래프이다.
도 10은 섬유아 세포 증식 인자를 함유하는 기능성 물질의 사용량과, 표적 세포내로의 유전자 도입의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 11은 섬유아세포 증식 인자를 함유하는 기능성 물질에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입을 나타내는 그래프이다.
도 12는 섬유아세포 증식 인자를 함유하는 기능성 물질에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 나타내는 다른 하나의 그래프이다.
도 13은 콜라겐 플라그먼트를 함유하는 기능성 물질의 사용량과, 표적 세포내로의 유전자 도입의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 14는 폴리라이신에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 나타내는 그래프이다.
도 15는 피브로넥틴 프라그먼트 및 피브로넥틴 프라그먼트 중합체에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 나타내는 그래프이다.
도 16은 피브로넥틴 프라그먼트 및 피브로넥틴 프라그먼트 중합체에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 나타내는 다른 하나의 그래프이다.
도 17은 피브로넥틴 프라그먼트 및 피브로넥틴 프라그먼트 중합체에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 나타내는 또 다른 하나의 그래프이다.
도 18은 섬유아 세포 증식 인자를 함유하는 기능성 물질, 콜라겐 프라그먼트, 및 콜라겐 프라그먼트를 함유하는 기능성 물질에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 나타내는 그래프이다.
도 19는 피브로넥틴 프라그먼트에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 나타내는 그래프이다.
도 20은 피브로넥틴 프라그먼트 및 섬유아세포 증식 인자를 함유하는 기능성 물질에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 나타내는 그래프이다.
도 21은 섬유아세포 증식 인자를 함유하는 기능성 물질 및 피브로넥틴 프라그먼트에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 나타내는 그래프이다.
도 22는 피브로넥틴 프라그먼트 고정화 비드에 의한 표적 세포내로의 유전자도입 효율을 나타내는 그래프이다.
도 23은 피브로넥틴 프라그먼트 사용량과, 표적 세포내로의 유전자 도입의 관계를 나타내는 그래프이다.
도 24는 섬유아세포 증식 인자를 함유하는 기능성 물질 및 피브로넥틴 프라그먼트에 의한 표적 세포 도입을 나타내는 그래프이다.
도 25는 섬유아세포 증식 인자를 함유하는 기능성 물질 및 피브로넥틴 프라그먼트에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입을 나타내는 다른 하나의 그래프이다.
도 26은 콜라겐 프라그먼트를 함유하는 기능성 물질에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입을 나타내는 그래프이다.
본 발명자들은, 피브로넥틴 또는 그 프라그먼트로 대표되는 기능성 물질에 의한 레트로바이러스 감염 촉진 작용이, 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 영역과, 세포 결합 부위를 갖는 영역이 동일 분자상에 존재하지 않는 경우에 있어서도 관찰됨을 발견하였다. 즉, 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 유효량의 기능성 물질과,유전자 도입의 표적 세포내로의 결합 부위를 갖는 기능성 물질을 혼합하여 사용함에 따라서, 표적 세포내로의 레트로바이러스를 사용한 유전자 도입 효율을 향상시키는 것이 가능함을 발견하였다.
또한, 본 발명자들은, 기능성 물질에 의한 레트로바이러스 감염 촉진 작용이, 기능성 물질을 플레이트의 표면에 고정화하지 않는 상태이더라도 인정되는 것도 발견하였다. 또, 기능성 물질을 고정화한 비드의 존재하에 레트로바이러스를 표적 세포에 접촉시킨 경우에도, 표적 세포내로의 유전자 도입 효율이 향상되는 것을 발견하였다.
본 발명자들은, 또한, 피브로넥틴 유래의 헤파린결합 영역을 포함하지 않는 레트로바이러스 결합물질을 발견하고, 상기 물질 및 그것들의 유도체가 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입에 유용하는 것도 발견하였다. 더욱이, 본 발명자들은, 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입에 유용한 기능성 물질을 제조하는데 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 제1의 일면은 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 레트로바이러스를 사용한 표적 세포 내로의 유전자 도입에 있어서, 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 유효량의 기능성 물질과, 표적 세포 결합 부위를 갖는 유효량의 다른 기능성 물질과의 혼합물의 존재하에서, 표적 세포를 레트로바이러스로 감염시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제1의 일면인 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질은 특별한 제한은 없으며, 예를 들면, 피브로넥틴의 헤파린-II 결합 영역, 섬유아세포 증식인자, 콜라겐, 폴리라이신 또는 이들의 기능적인 동등물로부터 선택되는 기능성 물질이다. 또한, 표적 세포 결합 부위를 갖는 기능성 물질이란, 표적 세포에 결합하는 리간드를 함유하는 물질이면 된다. 상기 리간드로서는 세포 접착성 단백질, 호르몬, 사이토카인, 항체, 당쇄(糖鎖), 탄수화물 또는 표적 세포의 대사물 등이 있고, 세포 접착성의 단백질로서는, 예를 들면, 피브로넥틴의 세포 결합 영역 폴리펩티드가 있다. 상기 피브로넥틴의 세포 결합 영역으로서는, VLA-5 및(또는) VLA-4에 대한 결합 영역 폴리펩티드가 있다. 또한, 다른 리간드로서는 에리스로포이에틴이 예가 된다.
본 발명의 제1의 일면에 사용되는 기능성 물질은 비고정화되거나 또는 고정화되어 있어도 사용가능하며, 특히 비드에 고정화에 의해서, 간편하게 사용할 수 있다. 또한, 표적 세포에 대한 결합 부위를 갖는 기능성 물질로서, 표적 세포에 특이적인 리간드를 선택함으로써, 본 발명의 제1의 일면에 따라, 간편하게 표적 세포내로의 유전자 도입의 표적화(targeting)가 가능하게 된다.
상기와 같이, 종래의 WO95/26200호나, Nature Medicine에 개시된 방법에 있어서는, 레트로바이러스와 표적 세포가, 레트로바이러스 결합 부위와 표적 세포 결합 부위를 동일 분자상에 갖는 기능성 물질상에서 공배치하는 것이, 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키는 기구에 있어서 필수가 되어 있다. 그러나, 본 발명에 의해서, 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 유효량의 기능성 물질과, 표적 세포 결합 부위를 갖는 유효량의 다른 기능성 물질과의혼합물의 존재하에서 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입을 행하면, 유전자 도입 효율이 향상된다.
본 발명의 제2의 일면은 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 유효량의 기능성 물질과, 표적 세포 결합 부위를 갖는 유효량의 다른 기능성 물질과의 혼합물을 함유하는 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입에 사용하기 위한 표적 세포용 배양 배지에 관한 것이다.
본원 발명의 제2의 일면에 따른 배지를 사용함으로써, 본원 발명의 제1의 일면에 따른 실시태양을 간편하게 실시할 수 있다.
본 발명의 제3의 일면은 레트로바이러스의 배치 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 유효량의 기능성 물질과, 표적 세포 결합 부위를 갖는 유효량의 다른 기능성 물질과의 혼합물과 접촉된 레트로바이러스를 함유하는 배지를 인큐베이션시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제4의 일면은 표적 세포내에의 레트로바이러스 개재 유전자 도입의 실시에 사용하기 위한 키트(kit)에 관한 것으로, 이 키트는
(a) 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 유효량의 기능성 물질 및(또는) 표적 세포 결합 부위를 갖는 유효량의 다른 기능성 물질,
(b) 레트로바이러스와 접촉된 표적 세포를 인큐베이션하기 위해서 인공기질, 및
(c) 상기 표적 세포를 예비 자극하기 위한 표적 세포 증식 인자
를 포함하여 이루어진 것을 특징으로 한다.
본원 발명의 제4의 일면의 키트를 사용함에 의해서, 본 발명의 제1 및 제3의 일면을 여러 가지 간편하게 행할 수 있다.
본 발명의 제5의 일면은 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은
표적 세포 결합 부위와, 섬유아세포 증식인자, 콜라겐 또는 폴리라이신 유래의 레트로바이러스 결합 부위 또는 이들의 기능적인 동등물과를 동일 분자상에 갖는 유효량의 기능성 물질의 존재하에서, 표적 세포를 레트로바이러스로 감염시키는 것을 특징으로 한다.
상기의 WO95/26200호 공보 및 Nature Medicine에 기재된 종래의 방법에 있어서는, 가장 좋은 효율로, 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입을 향상시키는 방법에 사용가능한 물질로서, 피브로넥틴의 프라그먼트가 개시되어 있다. 그러나, 피브로넥틴 프라그먼트 이외의 기능성 물질로 어떠한 기능성 물질이 좋은 효율로 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입을 향상시키는 방법에 사용가능한지에 대해서는 구체적인 개시는 없다. 특히, 이 종래의 방법에 있어서는, 레트로바이러스 결합 부위란, 피브로넥틴의 리피트(repeat, 반복부) 12-14가 개시되어 있을 뿐이다.
본 발명자들은, 이 피브로넥틴의 리피트 12-14란 구조적 상관이 전혀 없고, 섬유아세포 증식인자, 콜라겐, 폴리라이신 등이 의외로 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입을 향상시키는 방법에 있어서 유효하게 사용가능함을 발견하였다. 따라서, 이들의 물질과 기능적인 동등물, 즉, 이들의 물질과 기능적으로 동등한 레트로바이러스 결합 부위를 갖고, 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키는 능력을 갖는 물질은 모두 다 본발명의 제5의 일면에 있어서 사용할 수가 있다.
본 발명의 제5의 일면에 있어서, 표적 세포 결합 부위로서 표적 세포에 결합되는 리간드를 함유하는 물질을 사용할 수 있으며, 이것은 레트로바이러스 결합 부위와 결합한다.
상기 리간드로서는, 예를 들면, 세포 접착성의 단백질, 호르몬, 사이토카인, 항체, 당쇄, 탄수화물 또는 표적 세포의 대사물 등을 들 수 있다. 세포 접착성 단백질의 일례로서는, 피브로넥틴의 세포 결합 영역 폴리펩티드를 들 수 있고, 가령, VLA-5 및(또는) VLA-4에 대한 결합 영역 폴리펩티드가 사용가능하다. 다른 리간드로서는, 에리스로포이에틴을 들 수 있다.
본원 발명의 제5의 일면에 있어서, 레트로바이러스 결합 부위로서 제공되는 섬유아세포 증식 인자로서는, 예를 들면, 서열표의 서열번호 3으로 표기되는 섬유아세포 증식인자, 상기 인자의 기능적 동등물이나, 상기 인자 또는 상기 인자의 기능적 동등물을 함유하는 폴리펩티드로부터 선택되는 섬유아세포 증식 인자가 있다.
이들의 기능성 물질로서는, 예를 들면, 서열표의 서열번호 4 또는 5로 표기되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다.
본원 발명의 제5의 일면에 있어서, 레트로바이러스 결합 부위로서 제공되는 콜라겐으로는, 예를 들면, V형 콜라겐 유래의 인슐린 결합 부위를 함유하는 프라그먼트, 상기 프라그먼트의 기능적 동등물이나, 상기 프라그먼트 또는 상기 프라그먼트의 기능적 동등물을 함유하는 폴리펩티드로부터 선택되는 콜라겐이 있다. 또한, 상기 프라그먼트로서는, 예를 들어, 서열표의 서열번호 6로 표기되는 아미노산 서열을 함유하는 프라그먼트를 들 수 있다.
이들의 기능성 물질로서는, 서열표의 서열번호 7 또는 8로 표기되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다.
제5의 발명에 있어서, 레트로바이러스 결합 부위로서 제공되는 폴리라이신(polylysine)이라는 L-라이신(lysine)의 중합체이고, 예를 들면, 시판되는 폴리라이신 보다 적당한 중합도의 폴리라이신을 선택하여 사용할 수 있다.
섬유아세포 증식 인자, 콜라겐, 또는 폴리라이신 유래의 레트로바이러스 결합 부위가 동시에 표적 세포 결합 부위를 갖는 경우에 있어서는, 그 섬유아세포 증식 인자, 콜라겐 또는 폴리라이신 유래의 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 유효량의 기능성 물질의 존재하에서, 표적 세포를 레트로바이러스로 감염시킴으로써, 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키는 것이 가능하다. 또한, 표적 세포가 접착성 세포인 경우에는, 상기 기능성 물질에 레트로바이러스와 표적 세포가 각각 결합, 접착하여, 이 섬유아세포 증식 인자, 콜라겐 또는 폴리라이신 유래의 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 유효량의 기능성 물질의 존재하에서, 표적 세포를 레트로바이러스로 감염시킴에 의해서, 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효과를 향상시킬 수 있다.
또한, 서열표의 서열번호 1로 표기되는 폴리펩티드(이하, H-271이라 칭한다)이 동시에 표적 세포 결합 부위를 갖는 경우, 즉, 표적 세포가 상기 폴리펩티드,H-271에 결합성을 갖는 경우에 있어서도, 유효량의 이 폴리펩티드의 존재하에서, 표적 세포를 레트로바이러스로 감염시킴에 따라, 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시킬 수 있는 것도 발견하였다.
즉, 상기 Nature Medicine에 의하면, 피브로넥틴의 리피트 12-14가 레트로바이러스 결합 부위와 개시되어 있지만, 본 발명자들은, 의외로 이 H-271이 표적 세포의 종류에 따라서는, 표적 세포 결합 부위로서, 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율의 향상에 유효하게 기능하는 것을 발견하였다. 또, 표적 세포가 접착성 세포의 경우에도, 이 폴리펩티드에 레트로바이러스, 표적 세포가 각각 결합, 접촉하여, 유효량의 이 폴리펩티드의 존재하에서, 표적 세포를 레트로바이러스로 감염시킴에 의해서, 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시킬 수 있는 것도 발견하였다.
본원 발명의 제5의 일면에 있어서 상기 기능성 물질은 고정화되거나 또는 고정화되어 있지 않아도 사용가능하지만, 표적 세포가 접착성 세포인 경우는, 고정화시켜 사용하는 것이 효율 좋은 방법이다.
본 발명의 제6의 일면은 표적 세포 결합 부위와, 섬유아세포 증식 인자, 콜라겐 또는 폴리라이신 유래의 레트로바이러스 결합 부위 또는 이들의 기능적인 동등물을 동일 분자상에 갖는 유효량의 기능성 물질을 함유하는 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입에 사용하기 위한 표적 세포용 배양 배지에 관한 것이다.
본 발명의 제7의 일면은 상기한 섬유아세포 증식 인자, 콜라겐 또는 폴리라이신 유래의 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 유효량의 기능성 물질과 접촉된 레트로바이러스를 함유하는 배지를 인큐베이션시키는 레트로바이러스의 배치 방법에 관한 것이다. 이들의 기능성 물질은 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입을 향상시키는 방법에 있어서, 레트로바이러스의 배치에 유효하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 레트로바이러스의 배치 방법으로는, 표적 세포 결합 부위와 섬유아세포 증식 인자, 콜라겐 또는 폴리라이신 유래의 레트로바이러스 결합 부위 또는 이들의 기능적인 동등물을 동일 분자상에 갖는 유효량의 기능성 물질과 접촉된 레트로바이러스를 함유하는 배지를 인큐베이션시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 제8의 일면은 표적 세포내의 레트로바이러스 개재 유전자 도입에 사용하기 위한 키트에 관한 것으로, 이 키트는
(a) 표적 세포 결합 부위와, 섬유아세포 증식 인자, 콜라겐 또는 폴리라이신 유래의 레트로바이러스 결합 부위 또는 이들의 기능적인 동등물을 동일 분자상에 갖는 유효량의 기능성 물질,
(b) 레트로바이러스와 접촉된 표적 세포를 인큐베이션하기 위한 인공 기질, 및
(c) 상기 표적 세포의 예비자극하기 위한 표적 세포증식 인자,
를 포함한다.
이들 제1 및 제5의 일면의 방법, 제2 및 제6의 일면의 배지, 제3 및 제7의 일면의 방법 그리고 제4 및 제8의 일면의 키트 어느 것에 있어서도, 기능성 물질의비드고정화물이 바람직하게 사용가능하다.
본 발명의 제9의 일면은 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키는 방법에 관한 것으로서, 이 방법은 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입에 있어서, 실질적인 순수한 피브로넥틴, 실질적인 순수한 피브로넥틴 프라그먼트 및 그것들의 혼합물로부터 선택되는 유효량의 비드에 고정화된 기능성 물질의 존재하에서, 표적 세포의 레트로바이러스로 감염시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제10의 일면도 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입에 있어서, 실질적인 순수한 피브로넥틴, 실질적인 순수한 피브로넥틴 프라그먼트 및 그것들의 혼합물로부터 선택되는 유효량의 고정되어 있지않은 기능성 물질의 존재하에서, 표적 세포를 레트로바이러스로 감염시키는 것을 특징으로 한다.
상기의 WO95/26200호 및 Nature Medicine의 방법에 있어서는, 레트로바이러스와 표적 세포가, 레트로바이러스 결합 부위와 표적 세포 결합 부위를 동일 분자상에 갖는 기능성 물질상에 공배치하는 것이, 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키는 기구에 있어서 필수이다. 이 방법에 있어서는, 레트로바이러스와 표적 세포를, 레트로바이러스 결합 부위와 표적 세포 결합 부위를 동일 분자상에 갖는 기능성 물질상에 공배치시키려면, 레트로바이러스 결합 부위와 표적 세포 결합 부위를 동일 분자상에 갖는 기능성 물질을 배양기질에 고정화시킴으로써 처음에는 가능하게 된다.
그러나, 본 발명에 의하면, 이것들이 실직적인 순수한 피브로넥틴, 실질적인 순수한 피브로넥틴 프라그먼트 및 이들의 혼합물을 이용하는 경우에 있어서도, 의외로, 상기 레트로바이러스 결합 부위와 표적 세포 결합 부위를 동일 분자상에 갖는 기능성 물질상이 배양 기질에 고정화된 상태가 아니어도, 양호한 효율로, 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율이 향상된다.
본 발명의 제1, 제5, 제9 및 제10의 일면에 있어서, 표적 세포로서는, 예를 들어, 간세포(stem cells), 조혈세포, 비접착성 저밀도 단핵세포, 접착성세포, 골수세포, 조혈 간세포, 말초혈 간세포, 제대혈액세포, 태아성조혈 간세포, 배형성간세포, 배세포, 원시배세포(primordial germ cell), 난모세포, 난원세포, 난자, 정모세포, 정자, CD34+세포, C-kit+세포, 다능성 조혈전구세포, 단능성조혈전구세포, 적혈구계전구세포, 림프구모세포, 성숙혈구, 림프구, B세포, T세포, 섬유아세포, 신경아세포, 신경세포, 내피세포, 혈관내피세포, 간세포, 근아세포, 골격근세포, 평활근세포, 암세포, 골수종세포 및 백혈병 세포로부터 선택되는 세포가 사용가능하다.
본 발명의 제1, 제3, 제5, 제7, 제9 및 제10의 일면에 있어서, 레트로바이러스로서는, 외래 유전자를 함유하는 레트로바이러스를 사용하는 것이 가능하고, 또한, 레트로바이러스로서는, 예를 들면, 재조합 레트로바이러스벡터가 사용가능하다. 더욱이, 레트로바이러스로서는, 예를 들어, 복제능력이 결손된 재조합 레트로바이러스벡터를 사용할 수 있다.
본 발명의 제11의 일면은 상기의 본 발명의 제1, 제5, 제9 및 제10의 일면에서 얻어진 유전자 도입 세포에 관한 것이다.
본 발명의 제12의 일면은 제11의 일면의 유전자 도입 세포를 척추 동물에 이식하는 세포 이식 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제13의 일면은 서열표의 서열 번호 13로 표기되는 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키는 폴리펩티드 또는 그 기능적 동등물에 관한 것이다.
본 발명의 제14의 일면은 제13의 일면의 폴리펩티드를 코드하는 유전자에 관한 것이다. 이러한 유전자의 예로서는, 서열표의 서열번호 17로 표기되는 유전자 또는 긴축 조건하에서 상기 유전자에 하이브리다이즈되며, 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 들 수 있다.
상기 WO95/26200호 및 Nature Medicine의 방법에 있어서, 가장 효율 좋은 유전자 도입에 사용가능한 것은 CH-296이다. 한편, 본 발명자들은, VLA-5 결합 부위, VLA-4 결합 부위를 갖지 않는 상기 폴리펩티드가, 의외로 본 발명에 사용가능함을 발견하였다.
본 발명의 제15의 일면은 서열표의 서열번호 30로 표기되는 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키는 폴리펩티드 또는 그 기능적 동등물에 관한 것이다.
본 발명의 제16의 일면은 제15의 발명의 폴리펩티드를 코드하는 유전자에 관한 것이다. 이러한 유전자의 예로서는, 서열표의 서열번호 33로 표기되는 유전자 또는 긴축 조건하에서 상기 유전자에 하이브리다이즈되며, 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키는 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 들 수 있다.
본 발명의 제17의 일면은 서열표의 서열번호 5로 표기되는 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키는 폴리펩티드 또는 그 기능적 동등물에 관한 것이다.
본 발명의 제18의 일면은 본 발명의 제17의 일면의 폴리펩티드를 코드하는 유전자에 관한 것이다. 이러한 유전자의 예로서는, 서열표의 서열번호 26로 표기되는 유전자 또는 긴축 조건하에서 상기 유전자에 하이브리다이즈되며, 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키는 폴리펩티드를 코드하는 유전자가 있다.
본 발명의 유전자 도입 방법에는, 통상, 재조합 레트로바이러스 벡터가 사용되며, 특히, 복제 능력 결손 재조합 레트로바이러스벡터가 바람직하다. 상기 벡터는 감염된 세포중에서 자기복제가 불가능하도록 복제능력을 결손시켜 놓는 비병원성이다. 이들의 벡터는 척추 동물 세포, 특히, 포유 동물 세포와 같은 숙주 세포에 침입하여, 그 염색체 DNA중의 벡터에 삽입된 외래유전자를 안정하게 통합시키는 것이 가능하다.
본 발명에서는, 세포에 도입하려는 외래 유전자와 적당한 프로모터, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터 중에 존재하는 LTR의 프로모터나 외래 프로모터의 제어하에, 재조합 레트로바이러스 내에 삽입하여 사용하는 것이 가능하다. 또한, 외래 유전자의 전사를 달성하기 위해서는 프로모터 및 전사 개시 부위와 협력하는 다른 조절요소, 예를 들면, 인헨서(enhancer) 서열이 벡터내에 존재할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 도입된 유전자는 그 하류에 터미네이터 서열을 함유하는 것이 가능하다. 도입된 외래 유전자는 천연의 것이거나, 또는 인공적으로 제작된 것이라도 좋고, 혹은 기원을 달리하는 DNA 분자가, 라이게이션이나 상기 기술 분야에서 공지된 다른 수단에 의해서 결합된 것이어도 좋다.
레트로바이러스 벡터에 삽입된 외래 유전자는, 세포중에 도입하는 것이 기대되는 임의의 유전자를 선택할 수가 있다. 예를 들면, 외래 유전자는, 치료의 대상이 되는 환자에 관련되는 효소나, 단백질, 안티센스핵산 혹은 리보자임 또는 폴스(false) 프라이머(예를 들면, WO90/13641호 참조), 세포내항체(예를 들면, WO94/02610호 참조), 증식 인자 등을 코드하는 것을 사용할 수가 있다.
본 발명에서 사용되는 레트로바이러스 벡터는 유전자 도입된 세포의 선택을 가능하게 하기 위하여 마커 유전자를 함유한다. 적당한 마커 유전자로서는, 예를 들면, 세포에 항생물질에 대한 내성을 부여하는 약제내성 유전자나, 효소 활성의 검출에 의해 유전자 도입된 세포를 분별할 수 있는 리포터(reporter) 유전자가 이용가능하다.
사용되는 벡터에는, 예를 들면, 공지의 MFG벡터(ATCC No. 68754)나, α-SGC (ATCC No. 68755)등의 레트로바이러스 벡터가 있다. 또한, 본원 명세서의 하기의 실시예에 있어서 사용된 N2/ZipTKNEO 벡터(TKNEO, Blood, 제78권, 제310~317페이지, 1991년) 및 PM5neo 벡터(Exp. Hamatol., 제2권, 제630~638페이지, 1995년)는, 모두 마커 유전자로서 네오마이신 내성 유전자(네오마이신 포스포트랜스페라제 유전자)를 함유하고 있다. 따라서, 이들 벡터에 의해서 유전자 도입된 세포는 상기 유전자 산물에 의해 불활성화되는 항생물질(네오마이신, G418 등)에 대한 내성을 갖는 세포로서 확인하는 것이 가능하다. 또한, 이들의 벡터는 공지의 포장 세포주, 예를 들면, 공지의 PG13(ATCC DRL-10686), PG13/LNc8(ATCC CRL-10685), PM317(ATCC CRL-9078)이나, 미국특허 제5,278,056호에 기재된 세포주, GP+E-86(ATCC CRL 9642)이나 GP+envAm-12(ATCC CRL9641) 등의 세포주를 사용함으로써 상기 벡터가 포장된 바이러스 입자로서 조제할 수가 있다.
본 명세서에 있어서, 기능성 물질의 유효량이란, 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입에 의해, 표적 세포의 형질전환이 발생하는데 유효한 양이며, 사용하는 기능성 물질, 레트로바이러스 및 표적 세포의 종류에 의해, 본 명세서 기재의 방법에 의해 선정할 수가 있다. 또한, 유전자 도입 효과란, 형질전환효과를 의미한다.
레트로바이러스와 결합하고, 그 결과, 본 발명에서 유효하게 쓸모있는 기능성 물질의 능력은, 하기 실시예에 기재한 것과 같이, 통상의 방법을 사용하여 확인할 수 있다.
이들 분석 평가는, 레트로바이러스입자가 매트릭스 상에 고정화된 본 발명에 사용가능한 기능성 물질과 결합되고, 그 결과, 레트로바이러스가 매트릭스로부터의 세척에 저항하는 정도를 측정한다. 간단히 말하자면, 예를 들면, 바이러스 함유 상층액을, 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질의 고정물을 함유하는 웰공간에서 인큐베이션시킨다. 이어서, 이 웰을 생리 식염 완충액으로 철저하게 세정하고, 그 후에 표적 세포를 웰내에서 인큐베이션시켜 웰내에 잔존하고 있는 바이러스의 감염 활성치를 측정한다. 최초로 웰에 첨가된 바이러스 상층액액과 비교하여, 감염활성 또는 역가(力價)의 감소를 평가하고, 유사한 대조군의 것 (예를 들면, BSA 고정화 웰을 사용해서)와 비교한다. 대조 웰과 비교하여, 본 발명의 기능성 물질을 고정화한 웰내의 잔재 역가가 현저하게 높은 것은, 상기 물질이 본 발명의 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질로서 이용될 수 있음을 의미한다.
이 스크리닝 방법을 촉진하기 위해서, 바이러스 벡터는 선택가능한 마커 유전자를 함유할 수 있다.
이 방법에 따라서, 본 발명에서 사용하는 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질의 스크리닝을 행할 수 있다.
이러한 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질로서는, 피브로넥틴의 헤파린 II결합 영역, 섬유아세포 증식 인자, 콜라겐 또는 폴리라이신 유래의 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 기능성 물질의 세포 결합 부위, 즉, 표적 세포 결합성의 리간드를 함유하는 물질과, 세포와의 결합은 관용의 방법을 사용하여 동일하게 분석평가할 수 있다. 예를 들면, 이러한 방법에는, Nature 352:438~411(1991년)에 기재된 방법이 포함된다.
간단히 말하자면, 세포 결합 부위를 갖는 기능성 물질을 배양 플레이트 상에고정화시키고, 분석 평가해야 할 세포 집단은 배지에 겹치게 쌓아 30분 내지 2시간 인큐베이션시킨다. 이 인큐베션 기간 후에, 기능성 물질에 접착하지 않는 세포를 회수하고, 계수하여, 생존성에 대해서 분석평가한다. 기능성 물질과 접착된 세포도 트립신 또는 세포 해리 완충액(예를 들면, Gibco)을 사용하여 회수하고, 계수하여, 생존성을 시험한다. 일부 경우에 예를 들면, 조혈 콜로니 형성 세포에서는, 세포를 추가로 12~14 일간 배양하여 세포 콜로니 형성 특성을 확인하다. 계속해서, 접착 세포의 비율을 계산하여 소(牛) 혈청 알부민(BSA)을 고정화시킨 배양 플레이트와 같은 표준 내지 표준 대조군과 비교한다. 표적 세포와 분석평가한 기능성 물질의 실질적인 결합에 의해서, 기능성 물질/세포의 조합이 본 발명에 적당하고, 이 표적 세포 결합 부위를 갖는 기능성 물질을, 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질과 결합 또는 공존시켜서, 바이러스 벡터에 의한 표적 세포의 감염을 측정함으로써 본 발명에 사용되는 기능성 물질을 구축할 수 있다.
본 발명에 사용되는 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질로서는, 상기와 같이, 섬유아세포 증식 인자, 콜라겐 또는 폴리라이신 유래의 레트로바이러스 결합 부위가 선택가능하지만, 이들의 물질과 동등의 레트로바이러스 결합 부위를 가지며, 표적 세포 결합 부위를 갖는 리간드와의 결합 또는 공존에 있어서, 레트로바이러스를 사용한 표적 세포의 유전자 도입 효율을 향상시키는 물질은 모두, 섬유아세포 증식 인자, 콜라겐 또는 폴리라이신 유래의 레트로바이러스 결합 부위와 기능적인 동등물에 포함된다.
상기 방법에 의해, 선정된 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질과,표적 세포 결합 부위를 갖는 기능성 물질과의 결합 또는 공존하에 있어서, 본 발명은 유전자 도입방법에 사용하는 표적 세포, 레트로바이러스를 사용한, 그 유전자 도입 효율의 향상성을 측정함에 의해서 본 발명에 사용하는 기능성 물질의 유효량이 결정가능하다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일면은 레트로바이러스 벡터에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 높이는 방법이다. 이 방법은 레트로바이러스 벡터를 사용한 세포내로의 유전자 도입 효율을 높이기에 유효한, 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질과, 표적 세포 결합 부위를 갖는 다른 기능성 물질과의 혼합물의 공존하에, 레트로바이러스 벡터를 생존가능한 표적 세포에 감염시키는 것을 특징으로 한다.
이 방법은, 레트로바이러스 벡터를 사용하여 유전자 도입된 유전자 도입 세포를 얻는 방법으로서 사용가능하고, 상기 세포를 생물 단체에 이식함에 의해서 생물 단체로의 유전자 도입을 가능하게 한다.
이용되는 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질로서는, 특별한 제한은 없으며, 예를 들면, 피브로넥틴의 헤파린 II결합 영역, 섬유아세포 증식 인자, 콜라겐, 폴리라이신 등이 있으며, 또 이들의 기능성 물질과 기능적으로 동등한 물질, 예를 들면, 헤파린 결합성 부위를 갖는 기능성 물질도 사용할 수가 있다. 또한, 상기 기능성 물질의 혼합물, 상기 기능성 물질을 함유하는 폴리펩티드, 상기 기능성 물질의 중합체, 상기 기능성 물질의 유도체 등을 사용할 수가 있다. 이들의 기능성 물질은, 천연 기원의 물질로부터 얻을 수 있고, 또, 인위적으로 만드는(예를 들면, 유전자 재조합 기술이나 화학 합성 기술에 따라서 만든다)것이 가능하고, 더욱이, 천연 기원의 물질과 인위적으로 만들어진 물질과의 조합에 의해서 만드는 것도 가능하다.
또한, 이용하는 기능성 물질은, 본 명세서 중에 나타낸 고효율로 유전자 도입의 달성이 가능한 레트로바이러스 결합 부위 및(또는) 표적 세포 결합 부위를 갖고 있는 범위에 있어서는, 천연 기원의 폴리펩티드의 아미노산 서열에 변이가 발생한 것이라도 좋다. 본 명세서에 있어서는 천연 기원의 폴리펩티드의 아미노산 서열중의 1 혹은, 예를 들면, 수개까지의 복수의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및(또는) 부가되어 있어도, 목적하는 레트로바이러스 결합 부위 및(또는) 표적 세포 결합 부위를 갖는 한, 그 폴리펩티드를 천연 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 기능적 동등물이라 부른다. 이들의 기능적 동등물은, 상기 기능적 동등물을 코드하는 유전자를 만들고, 사용하는 상기 기능적 동등물을 만들고 나서, 그 생물 활성을 확인함에 의해 얻을 수 있다.
이 점에 관해서, 관련 생물공학 기술은, 대상의 기능적 영역 중의 아미노산의 결실, 치환, 부가 또는 다른 수식을 정형적으로 실시할 수 있는 상태에까지 진보하고 있다. 다음으로, 얻어진 아미노산 서열은, 목적하는 결합 부위 활성 또는 바이러스 결합 활성에 대해서 정형적으로 스크리닝할 수 있다.
또한, 상기 기능성 동등물을 코드하는 유전자는, 상기의 기능성 물질을 코드하는 유전자에 하이브리다이즈되는 유전자를 검색함으로써 얻을 수 있다.
즉, 상기의 기능성 물질을 코드하는 유전자 또는 그 염기 서열의 일부를 하이브리다이제이션의 프로브 또는 PCR 등의 유전자 증폭법의 프라이머로 이용함으로써 기능성 물질에 유사한 활성을 갖는 단백질을 코드하는 유전자를 스크리닝할 수 있다. 또한 상기 방법으로는 목적하는 유전자의 일부만을 포함한 DNA 조각이 얻어지는 일도 있으나, 그 때에는, 얻어진 DNA 조각의 염기 서열을 조사해서 그것이 목적 유전자의 일부인지를 확인한 후, 상기 DNA 조각 또는 그 일부의 프로브로 하여 하이브리다이제이션을 행하던지, 또는 상기 DNA 조각의 염기 서열에 근거하여 합성된 프라이머를 이용하여 PCR을 행함으로써 목적하는 유전자 전체를 취득할 수가 있다.
상기의 하이브리다이제이션은, 예를 들어, 이하의 조건에서 행할 수가 있다.
즉, DNA를 고정한 멤브레인(membrane)을 0.5% SDS, 0.1% 소혈청알부민(BSA), 0.1% 폴리비닐필로리돈, 0.1% 피콜400, 0.01% 변성연어정자 DNA를 포함하는 6×SSC (1×SSC는 0.15M NaCl, 0.015M 구연산나트륨, pH 7.0을 나타낸다)중에서, 50℃에서 12 ~ 20 시간,프로브와 함께 인큐베이션시킨다. 인큐베이션종료 후, 멤브레인을 먼저 0.5% SDS를 포함하는 2×SSC 중, 37℃에서, 이어서 SSC 농도를 0.1× SSC 까지의 범위로, 온도는 50℃까지의 범위로 변화시켜, 고정화된 DNA 유래의 시그널이 백그라운드와 구별 가능하게 될 때까지 세정한다.
또한, 이렇게 하여 얻어진 새로운 유전자에 대해서, 이것에 코드되어 있는 단백질이 갖는 활성을, 상기와 동일한 방법에 따라서 조사하므로서, 얻어진 유전자가 목적하는 것인지의 여부를 확인할 수가 있다.
상기 WO95/26200호에 기재된 바와 같이, 피브로넥틴의 헤파린 II 결합 영역은 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 폴리펩티드이다. 섬유아세포 증식 인자, 콜라겐, 폴리라이신은 피브로넥틴의 헤파린II 결합 영역과의 사이에 구조적인 유사성(예를 들면, 아미노산 서열상의 유사성)이 보여지는 물질은 아니지만, 본 발명자들은, 이들의 물질이 레트로바이러스 결합 부위를 갖고 있음을 발견하였다.
본 발명에 사용되는 표적 세포 결합 부위를 갖는 기능성 물질도, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 표적 세포에 결합하는 리간드를 갖는 물질이며, 상기 리간드로서는 세포 접착성의 단백질, 호르몬이나 사이토카인, 세포 표면의 항원에 대한 항체, 다당류나 당단백, 당지질중의 당쇄, 혹은 표적 세포의 대사물 등을 예로 들 수 있다. 또한 상기 기능성 물질을 함유하는 폴리펩티드, 상기 기능성 물질의 중합체, 상기 기능성 물질의 유도체, 상기 기능성 물질의 기능적 동등물 등을 사용할 수도 있다. 이들의 기능성 물질은 천연 기원의 물질로부터 얻을수 있고, 또한 인위적으로 만드는(예를 들면, 유전자 재조합 기술이나 화학 합성 기술에 의해서 만든다)것이 가능하며, 더욱이, 천연 기원의 물질과 인위적으로 만들어진 물질과의 조합에 의해 만들 수도 있다.
사용되는 세포 접착 단백질로서는, 피브로넥틴이나 그 프라그먼트가 있다. 예를 들면, 미국특허제 5,198,423호 기재의, Pro1239-Ser1515에 대응하는 인간피브로넥틴의 세포 결합 도메인은, 본 명세서 기재의 폴리펩티드 C-274와 동등한 기능을 갖고 있고, BHK 및 B16-F10 세포 등과 결합하는 것으로 개시되어 있다(J. Biochem. 제110권, 제285~291페이지, 1991년). 이들의 폴리펩티드 중에 존재하는 RGDS의 4 아미노산으로부터 이루어지는 서열은 VLA-5 리셉터의 리간드이다. VLA-5리셉터의 발현은 광범위한 세포에 있어서 보여지지만, 분화한 세포보다도 미분화한 것에서 자주 발현되고 있다. 또한, 피브로넥틴 중의 CS-1영역은 VLA-4 리셉터의 리간드로서 알려져 있어, 상기 리셉터를 발현하고 있는 세포(T세포, B세포, 단구, NK세포, 호산구, 호염기구, 흉선세포, 골수단구계세포, 적아구계 전구세포, 림프구계전구세포, 멜라노마, 근세포 등)에 결합한다. 특개평3-284700호 기재의 폴리펩티드에서, 서열표의 서열번호 19에서 표기된 폴리펩티드(이하 C277-CS1이라 칭한다)는 상기의 VLA-5, 및 VLA-4 리셉터의 리간드의 양쪽에 함유하는 폴리펩티드이고, 본 발명의 방법에 있어서, 이들의 리셉터를 갖는 세포내로의 유전자 도입에 사용할 수가 있다. 더욱이, 헤파린 II 영역은 섬유아세포, 내피세포 및 종양 세포와 결합하는 것이 개시되어 있다. 헤파린 II 영역의 세포 결합 부위 폴리펩티드 서열은 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질의 폴리펩티드의 존재하에서, 레트로바이러스벡터의 감염을 미리 표적 세포내로 향하게 하는데 유용하다.
세포 특이적인 작용을 갖는 호르몬이나 사이토카인류는 본 발명의 방법에 사용되는 세포 결합 부위를 갖는 기능성 물질로서 적합하다. 예를 들면, 조혈계의 사이토카인인 에리스로포이에틴을 사용함에 의해서, 적혈구계의 세포내로의 유전자 도입을 행할 수 있다. 에리스로포이에틴은 공지의 방법으로 만들어, 사용할 수가 있다. 또한, 상기 에리스로포이에틴의 기능적 동등물 및 에리스로포이에틴 또는 상기 에리스로포이에틴의 기능적 동등물을 함유하는 폴리펩티드도 사용할 수 있다.
하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질(예를 들면, H-271이나 섬유아세포 증식 인자)을 피브로넥틴 유래의 세포 결합부 활성을 갖는 폴리펩티드 C-274등과의 혼합물로 사용한 경우에는 높은 유전자도입 효율을 얻을 수 있다. 이들의 실험에 이용한 NIH/3T3세포는 C-274와 결합가능한 VLA-5 리셉터를 발현하고 있고, 이 양자의 상호작용이 유전자 도입 효율의 향상에 기여하고 있다.
더욱이, 동일한 현상은 에리스로포이에틴 리셉터를 발현하는 TF-1세포(Blood, 제73권, 제375~380페이지, 1989년)에의 유전자 도입에 에리스로포이에틴유도체를 공존시키는 경우에도 관찰된다. 게다가, 이 효과는 에리스로포이에틴 리셉터를 갖지 않는 세포에서는 인지되지 않는다.
이들의 결과로부터, 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질과 세포 결합 부위를 갖는 다른 기능성 물질과의 공존에 의한 세포 특이적인 유전자 도입 효율의 상승이 일어나는 것이 분명하게 되었다.
본 발명의 이 태양에 있어서는, 레트로바이러스 결합 부위를 가즌 기능성 물질을, 다른 표적 세포와의 결합 부위를 갖는 기능성 물질과의 혼합물로서 사용한다. 이것에 의해, 상기 기능성 물질에 친화성을 갖는 표적 세포내로의 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입의 효율을 현저하게 높이는 것이 가능하다. 이렇게 하여, 유전자 도입 효율이 향상됨에 따라, 바이러스 생산 세포와의 공배양의 회피가 가능하게 된 것은, 본 발명의 하나의 이점이다.
목적으로 하는 세포에 선택적으로 유전자를 도입하는 수단은 이용가치가 높고, 지금까지도 여러한 방법이 연구되어 있고, 예를 들면, 목적 세포의 표면에 존재하는 리셉터에 결합하는 물질과 DNA 결합성 물질을 결합시킨 비바이러스벡터(molecular conjugation vector)가 있다. 상기 벡터를 이용한 유전자 도입의 예로서는, 아시아로 당단백질을 이용한 간암세포내로의 도입(J. Biol. Chem.,제262권, 제4429~4432페이지, 1987년), 트랜스페린을 이용한 림프아구 세포내로의 도입(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제89권, 제6099~6103페이지, 1992년), 항EGF 리셉터 항체를 이용한 암세포내로의 도입(FEBS Letters, 제338권, 제167~169항, 1994년)등이 알려져 있다. 이러한 비바이러스 벡터를 이용한 유전자 도입법은, 도입된 유전자가 세포의 염색체 DNA상에 통합되지 않기 때문에, 도입된 유전자의 장기에 걸친 발현이 기대되는 경우에는 바람직한 방법이 아니다. 염색체상에의 유전자 통합이 가능한 벡터로서 빈번히 이용되는 레트로바이러스 벡터를 이용하여, 이것을 특정의 세포에 감염시키려고 하는 시도도 행해지고 있고, 예를 들면, 레트로바이러스 입자를 직접화학 수식하여 락토스를 결합시킴으로서 간세포내로의 유전자 도입(J. Biol. Chem.,제266권, 제14143~14146페이지, 1991년), 에리스로포이에틴과의 융합 단백질으로 한 엔벨로프 단백질을 갖는 재조합 바이러스 입자를 이용한 에리스로포이에틴 리셉터 발현 세포내로의 유전자 도입(Science, 제266권, 제1373~1376페이지, 1994년) 등이 개발되어 있다. 그러나, 이 목적을 위해서는 표적 세포에 걸맞게 특별한 바이러스 입자의 조제를 필요로 한다. 더욱이, 바이러스 입자의 화학 수식은 번잡한 조작을 필요로 할 뿐만아니라, 바이러스의 불활화를 부를 우려가 있고, 또한, 유전자 공학적으로 개변한 바이러스 엔벨로프에 대해서는, 반드시 필요한 기능(표적 세포내로의 결합, 및 바이러스 입자의 구축)을 갖는 것이 꼭 얻어진다고는 할 수 없다.
상기 WO95/26200호에는, 세포 결합 활성을 갖는 적당한 리간드를 공유결합시킨 피브로넥틴의 프라그먼트 공존하에 있어서는, 특별한 수식을 하고 있지 않는 레트로바이러스 벡터를 목적으로 하는 세포에 도입하는 것이 가능하다는 것이 시사되어 있다. 그러나, 상기 방법에서는 바이러스 결합 활성과 세포내로의 결합 활성의 양쪽을 갖는 기능성 분자를 이용하기 때문에, 표적 세포마다 별개의 기능성 물질을 만들지 않으면 안된다. 또한 만들어진 기능성 물질에 모두의 활성이 유지되는지는 불명확하다.
본 발명에 의한 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질과, 표적 세포와의 결합 부위를 갖는 다른 기능성 물질과의 조합은, 광범위한 세포종에 대해서 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자의 전달계를 제공할 수 있다. 이 목적을 위해서는, 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질과, 표적 세포와의 결합 부위를 갖는 기능성 물질이 공유 결합에 의해서 결합되어 있을 필요는 없다. 따라서, 표적이 되는 세포마다, 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질과, 표적 세포와의 결합 부위를 갖는 기능성 물질이 공유결합에 의해 결합된, 특정의 기능성 물질을 만들 필요가 없고, 목적의 세포내로의 유전자 도입을 간편하고도 양호한 효율로 행할 수가 있다.
본 발명의 방법을 이용한 표적 세포내로의 유전자 도입의 예로서는, 조혈계의 세포내로의 유전자 도입을 들 수 있다. 상기의 피브로넥틴의 CS-1 세포 접착 영역은 조혈 간세포내로의 유전자 도입에 유용한 것이 알려져 있다. 또한, 조혈계의 세포의 분화에는 상기의 에리스로포이에틴 외에도 다수의 세포 특이적인 사이토카인이 관여하도 있는 것이 알려져 있고, 이것들을 이용함에 따라서 목적으로 하는 세포(세포계)에 특이적으로 유전자를 도입할 수 있다. 예를 들면, G-CSF를 이용한 경우에는 거아구, 및 과립구 전구세포를 표적으로 하는 것이 가능하다.
세포 결합 부위를 갖는 기능성 물질로서, 악성 세포와, 특이적인 또는 우선적으로 결합하는 물질을 이용함으로써 이들의 세포를 표적내로의 유전자 도입을 행하는 것이 가능하다.
예를 들면, 어떠한 종의 폐암 세포에 있어서는 HER-2, HER-4라고 하는 리셉터가 과잉 발현하고 있는 것이 알려져 있다(Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 제92권, 제9747~9751페이지, 1995년). 따라서, 상기 리셉터에 대한 리간드의 헤리굴린(heregulin)을 레트로바이러스 결합 부위를 함유하는 기능성 물질과 조합시킴으로서 페암 세포의 증식을 억제하는 것이 가능하다.
또한, 예를 들어, 갑상선(암)세포에 대해서는 요오드를 갖는 기능성 물질을, 또, 폐장(암)세포는 고밀도 리포단백질 또는 이들의 일부를 함유하는 기능성 물질을 사용함으로서 유전자 도입의 표적으로 하는 것이 가능하다.
더욱이, 표적 세포의 표면에 존재하는 항원에 대한 항체, 바람직하게는 모노크로날항체를, 세포 결합 활성을 갖는 기능성 물질로서 사용함으로써 항체가 입수가능한 임의의 세포를 표적으로 하는 것이 가능하게 된다. 이렇게 하여, 본 발명에 의해 개시된 레트로바이러스 벡터와 표적 세포와의 배치 방법을 사용함에 따라서, 광범위한 종류의 세포를 표적으로 하는 것이 가능하다.
특히, 바람직한 일면에 있어서 레트로바이러스 벡터에 의한 표적 세포내로의유전자 도입 효율을 높이는 방법에 있어서, 신규한 기능성 물질을 이용하여 유전자 도입을 행한다.
이제까지 레트로바이러스를 사용한 세포내로의 유전자 도입에 유용한 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질은 피브로넥틴의 헤파린 II 영역 뿐이다.
상기한 바와 같이 상기 영역은, 그것 자체 특정의 세포에 대해서 결합 부위를 갖고 있고, 표적 세포에 따라서는 이 활성이 바람직하지 못한 경우가 있다. 이러한 경우에는, 이 결합 부위를 다른 표적 세포 결합 부위로 치환함으로써 목적을 달성하는 것이 가능하게 된다. 이렇게, 성질이 다른 복수의 기능성 물질이 사용가능한 것은, 본 발명에 의한 유전자 치료의 적용 범위를 넓히는 것으로 연결되어, 목적의 표적 세포내로의 표적화도 용이하게 행할 수가 있다.
본 발명에 의해 제공되는, 신규한 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질로서는, 섬유아세포 증식 인자, 상기 인자를 함유하는 폴리펩티드, 콜라겐의 프라그먼트, 상기 프라그먼트의 혼합물, 상기 프라그먼트를 함유하는 폴리펩티드,상기 기능성 물질의 중합체 등을 예로 들 수 있다. 또한, 폴리라이신도 본 발명의 목적에 사용할 수가 있다. 이들의 기능성 물질은, 천연 기원의 물질로부터 얻을 수 있으며, 또한 인위적으로 만드는(예를 들면, 유전자 재조합 기술 또는 화학 합성기술에 의해서 만든다)것이 가능하고, 더욱이, 천연 기원의 물질과 화학적으로 합성된 물질과의 조합에 의해 만드는 것도 가능하다. 상기 기능성 물질은, 본 발명의 제1의 일면에 따른 유전자 도입 방법에도 사용가능하며, 상기 기능성 물질과 세포 결합 활성을 갖는 기능성 물질과의 키메라 분자도 세포내로의 유전자 도입에 유용하다.
상기의 신규의 기능성 물질은 모두 레트로바이러스 결합 활성을 갖고 있다. 그러나, 이들의 물질은 상기 WO95/26200호 기재의, 인간 피브로넥틴의 헤파린II결합 영역 또는 그것에 유사한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 함유하는 것은 아니다.
본 발명에 사용되는 섬유아세포 증식 인자로서는, 실질적으로 둔화된 천연물을 사용하여도 좋고, 또한, 유전자 공학적으로 만들어진 것을 사용하여도 좋다. 본 발명에는, 서열표의 서열번호 3로 표기되는 섬유아세포 증식 인자를 사용할 수 있고, 더욱이, 그것들의 폴리펩티드의 기능을 손실하는 일없이 개변된 유도체도 사용할 수 있다. 섬유아세포 증식 인자유도체의 예로서는, 서열표의 서열번호 4로 표기되는 폴리펩티드(이하, C-FGF·A로 칭한다)가 있다. 이것은 서열번호 3로 표기되는 섬유아세포 증식 인자의 N말단에 피브로넥틴의 세포 접착 부위 폴리펩티드가 결합한 폴리펩티드이며, 미국특허제5,302,701호 기재의 방법에 의해서 유전자 공학적으로 제조하는 것이 가능하다. 상기 폴리펩티드는 상기 미국 특허에 FERM P-12637로서 기재되어, 현재는 부다페스트 조약하, FERM BP-5278의 수탁번호로 이바라키현 쯔꾸바시 아즈마 1쪼메 1반 3고의 통산성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 (NIBH)에 기탁되어 있는 대장균(원기탁일:1991년12월9일)을 사용함에 의해서 얻을 수 있다.
또한, 서열번호 5로 표기되는, 피브로넥틴 유래의 CS-1 세포 접착 영역을 갖는 상기의 C-FGF·A의 유도체 폴리펩티드(이하, C-FGF-CS1이라 칭하다)는, 상기의이바라키현 쯔꾸바시 아즈마 1쪼메 1반 3고의 통산성 공업기술원 생명공학공업기술연구소)에, 부다페스트 조약하, FERM BP-5654의 가탁번호로 기탁되어 있는 대장균(원기탁일:1996년9월6일)을 사용하여, 본원명세서에 기재의 방법으로 얻을 수가 있다. 이 C-FGF-CS1은 CS-1결합성을 갖는 표적 세포, 특히 조혈 간세포내로의 유전자 도입에 있어서 특히 유용하다.
콜라겐의 프라그먼트로서는, 천연형의 콜라겐을 효소학적, 화학적으로 분해하여, 실질적으로 둔화한 프라그먼트를 사용하여도 좋고, 또한, 유전자공학적으로 만들어진 것을 사용하여도 좋다. 더욱이, 이들의 프라그먼트의 기능을 손실하는 일없이 개변된 것도 사용할 수가 있다. 콜라겐중에서, 인간 V형 콜라겐은 강한 인슐린 결합 활성을 갖고(특개평2-209899호), 인슐린 결합 부위를 함유하는 폴리펩티드로서는 서열표의 서열번호 28로 표기되는 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드가 있고(특개평5-97698호), 그 외로서는, 서열표의 서열번호 6로 표기되는 폴리펩티드(이하, Co1V라 칭한다)를 예로 들 수 있다. Co1V는 본원 명세서 실시예에 개시의 방법으로 만들 수가 있다. Co1V를 함유하는 폴리펩티드이며, 서열번호 7로 표기되는 폴리펩티드(이하, C277-Co1V로 칭한다)는, Co1V의 N말단에 피브로넥틴의 세포접착 부위 폴리펩티드가 결합한 폴리펩티드이고, 상기 특원평5-97698호에 기재되어 있는 바와 같이 유전자 공학적으로 제조할 수가 있다. C277-Co1V는 상기 공개 공보에 FERM P-12560으로 기재되어, 현재는 부다페스트 조약하, FERM BP-5277의 수탁번호로 이바라키현 쯔꾸바시 아즈마 1쪼메 1반 3고의 통산성 공업기술원 생명공학공업기술연구소)에 기탁되어 있는 대장균(원기탁일:1991년10월7일)을 사용함에 따라서 얻을 수 있다.
서열번호 8로 표기되는, 피브로넥틴 유래의 CS-1 세포 접착 영역을 갖는 상기의 C277-Co1V의 유도체 폴리펩티드(이하, C-Co1V-CS1이라 칭한다)는 이하에 표시하는 방법에 의해서 만들 수 있다. 부다페스트 조약하, FERM BP-2800의 수탁번호로 이바라키현 쯔꾸바시 아즈마 1쪼메 1반 3고의 통산성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 기탁되어 있는 대장균 (원기탁일: 1989년5월12일)에서 조제되는 플라스미드 pCH102를 주형으로 하여, 프라이머CS1-S(서열표의 서열번호 9에 그 염기 서열을 표시한다) 및 M4를 이용한 PCR반응에 의해 증폭되는 DNA 조각을 제한효소 NheI, Sall로 분해한 후에 단리한다.
한편, 상기 C277-Co1V를 코드하는 유전자를 포함하여, 상기 대장균 FERM BP-5277에서 조제되는 플라스미드 pTF7520Co1V를 주형으로 하여, 프라이머 CF, 및 CNR을 이용한 PCR반응에 의해 증폭되는 DNA조각을 제한효소 AccIII, NheI로 분해한 후에 단리한다. 서열표의 서열번호10 및 12에 CF 및 CNR의 각각의 염기 서열을 표시한다. 상기의 2개의 DNA조각을, 플라스미드 pTF7520Co1V를 제한효소 AccIII, Sall로 절단하여 얻어진 약 4.4kb의 DNA조각과 혼합한다. 얻어지는 재조합 프라스미드는 C277-Co1V의 CS-1 세포 접착 영역을 가지며, Co1V의 말단에서 2번째의 글루탐산이 알라닌으로, C말단의 트레오닌이 세린으로 각각 치환된 폴리펩티드, C-Co1V-CS1을 코드하고 있다. 이 플라스미드에서 형질전환된 대장균을 배양한 후, 배양물로부터 목적하는 폴리펩티드를 취득할 수가 있다. 이 C-Co1V-CS1은 CS-1 결합성을 갖는 표적 세포, 특히 간세포내로의 유전자 도입에 있어서 특히 유용하다.
폴리라이신으로서는, 상기와 같이, 시판되는 폴리라이신으로부터 적당한 중합도의 폴리라이신을 선택하여, 사용할 수가 있다.
본 발명에서 사용하는 기능성 물질로서는, 상기의 기능성 물질의 유도체도 사용할 수 있다. 그 예로는 상기의 C-FGF-CS1 또는 그 기능적 동등물, C-Co1V-CS1 또는 그 기능적 동등물을 들 수 있다. 또한, 이들의 기능성 동동물의 복수의 분자들을 중합시킨 중합체나, 기능성 물질을 공지 방법에 의해 수식한 것(당쇄의 부가 등)도 본 발명에 사용하는 것이 가능하다. 이들의 유도체 및 상기 유도체의 기능적 동등물은, 상기 유도체를 코드하는 유전자 및 상기 유도체의 기능적 동등물을 코드하는 유전자를 이용하여 유전자 공학적으로 제조하는 것도 가능하다. 더욱이, 기능성 물질의 중합체를 만들기에 유용한 시스테인 부가 기능성 물질을 이들의 기능성 물질의 아미노산 서열중에 시스테인을 부가, 삽입, 치환함으로써 제조할 수 있다. 또한, 시스테인 부가 기능성 물질이고, 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 분자와, 시스테인 부가 기능성 물질이고 표적 세포 결합 부위를 갖는 다른 분자를 결합시키는 것도 용이하다. 더욱이, 시스테인 부가 기능성 물질의 시스테인 잔기의 반응성을 이용하여 다른 기능성 물질과의 결합체를 만드는 것이 가능하다.
다른 바람직한 태양으로는, 레트로바이러스 벡터에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 높이는 피브로넥틴의 레트로바이러스 결합 부위 폴리펩티드의 중합체를 이용하여 유전자 도입을 행한다.
상기 기능성 물질은 상기 WO95/26200호 기재의, 인간 피브로넥틴의 헤파린 II결합 영역을 1분자 내에 복수개 갖는 폴리펩티드, 및 상기 폴리펩티드의 유도체이다. 또한, 본 발명에 사용하는 기능성 물질로서는, 상기 기능성 물질과 동등한 활성을 갖는 범위내에서, 천연 기원의 폴리펩티드와는 그 아미노산 서열이 일부 상이한 기능적 동등물을 포함할 수 있다.
사용되는 기능성 물질의 중합체로서는 상기의 피브로넥틴 유래의 폴리펩티드를 효소학적 또는 화학적으로 중합시킨 것이나, 유전자공학으로 만들어진 것도 좋다. 피브로넥틴의 헤파린 II 결합 영역을 1분자 내에 2개 갖는 폴리펩티드로서는 서열표의 서열번호13에 아미노산 서열이 표시된 폴리펩티드(이하, H2-547이라 칭한다)를 예로 들 수 있다. H2-547은 부다페스트 조약하, FERM BP-5656의 수탁번호로 이바라키현 쯔꾸바시 아즈마 1쪼메 1반 3고의 통산성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 기탁되어 있는 대장균(원기탁일:1996년9월6일)을 사용하여, 본 명세서 기재의 방법에 따라서 취득할 수가 있다. 또한, 서열표의 서열번호14에 아미노산 서열을 표시하는 폴리펩티드는, H2-547의 N말단에 피브로넥틴의 세포 접착 부위 폴리펩티드가 결합한 유도체 폴리펩티드(이하, CH2-826이라 칭한다)이다. 상기 폴리펩티드는 본 명세서 기재의 방법에 따라서 취득할 수가 있다. 더욱이, 서열표의 서열번호 30에 아미노산 서열을 표시하는 폴리펩티드는, H2-547의 C말단에 피브로넥틴의 CS-1 세포 접착 영역을 결합한 유도체 폴리펩티드(이하, H2S-573이라 칭한다)이다. 상기 폴리펩티드는 부다페스트 조약하, FERM BP-5655의 수탁번호로 이바라키현 쯔꾸바시 아즈마 1쪼메 1반 3고의 통산성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 기탁되어 있는 대장균(원기탁일: 1996년9월6일)을 사용하고, 본 명세서 기재의 방법에 의해서 취득할 수가 있다. CS-1 세포 접착 영역을 갖는 H2S-573은 조혈 간세포내로의 유전자 도입에 유용하다.
또한, 다른 바람직한 태양에 있어서는, 레트로바이러스 벡터에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입에 있어서, 레트로바이러스 벡터에 의한 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키는데에 유효한, 비드에 고정화된 기능성 물질과의 공존하에 복제능력 결손 재조합 레트로바이러스 벡터를 생존 가능한 표적 세포로 감염시킨다.
종래의, 상기의 WO95/26200호 및 Nature Medicine 기재의 기능성 물질을 이용하여 레트로바이러스 벡터에 의한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율을 향상시키는 방법은, 이제까지는 바이러스를 세포에 감염시킬 때에 사용하는 용기(세포배양플레이트)의 표면에 상기 기능성 물질을 고정화시킴으로써 실시되어 왔다. 이 방법으로는, 플레이트를 기능성 물질을 함유하는 용액으로 처리한 후, 여분의 기능성 물질을 세류하는 등, 번잡한 조작을 필요로 한다.
이러한, 기능성 물질이 고정화된 플레이트를 사용하는 유전자 도입 방법은 간편한 방법이라고는 말하기 힘들다. 이것에 대해서, 기능성 물질을 비드상에 고정시켜 사용하는 방법은 다음과 같은 이점을 갖고 있다.
기능성 물질을 비드에 고정시키는 조작은 플레이트의 경우에 비해서 작은 공간에서 행할 수가 있고, 또한 비드을 밀폐가능한 용기 중에서 취급할 수가 있다. 기능성 물질이 고정화된 플레이트는 그 표면에 공기를 접하기 때문에, 안정성이 낮은 기능성 물질의 경우에는 보존중의 건조에 의한 기능성 물질의 변질 등에 신경을 써야할 필요가 있지만, 비드는 용액중에 현탁해서 보존할 수가 있기 때문에, 건조의 위험은 없다. 더욱이 비드의 사용은 기능성 물질이 존재하는 표면적을 크게하는 것 때문에, 플레이트 사용에 비해서 높은 유전자 도입 효율을 얻는 것도 가능하게 된다.
기능성 물질의 고정화는 통상의 방법에 의해 행하면 좋고, 예를 들면, 표적 세포 배양 용기에 고정화하여도 되며, 예를 들어, 세포 배양용의 비드에 고정화하여도 좋다. 비드의 소재, 재질 등은 사용하는 목적에 따라서 선택할 수가 있다. 비드로서는, 예를 들면, 중심이 둥근, 또는 구상의 핵을 갖고, 핵의 표면은 중합체로 피복되어 있어도 괜찮다. 이 핵이나 폴리머의 소재로서는, 예를 들어, 일본 특허 공개 제8-501092호 기재의 것을 예로 들 수 있다. 예를 들면, 생분해성 비드를 사용하여, 이들의 기능성 물질이 고정화된 비드를 생체내에 투여하는 것도 가능하다. 또한, 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 분자가 고정화된 비드와, 표적 세포 결합 부위를 갖는 다른 분자가 고정화된 비드를 혼합하여 사용하는 것은 효율이 좋은 방법이다.
이들의 기능성 물질을 고정화하지 않고 사용하는 경우는, 예를 들어, 표적 세포 배양 용기를, 미리, 상기 기능성 물질의 흡착을 방지하는 물질, 예로, 소혈청알부민(BSA)으로 전처리하여, 이들의 기능성 물질의 비특이적 흡착을 방지하여 사용하면 된다.
본 발명에 의하면, 이러한 비고정계에 있어서도, 본 발명에 사용하는 기능성 물질에 의해, 유전자 도입이 양호한 효율로 달성된다.
또한, 차후에 설명하는, 본 발명의 방법의 실시용으로 설계된 키트는, 세포내로의 유전자 도입을 지극히 간편하게 실시하는 것을 가능하게 한다.
상기와 같이, 본 발명의 방법에 의해서 유전자를 도입된 세포는 생체에 이식하는 것이 가능하며, 이것에 의해서 생체내에서 외래 유전자를 발현시키는 유전자치료를 생하는 것도 가능하다.
예를 들면, 조혈 간세포를 표적 세포로 한 유전자 치료는 이하와 같은 조작에 의해서 실시할 수가 있다. 우선, 도너에서 조혈 간세포를 포함하는 재료, 예를 들면, 골수조직, 말초혈액, 제대혈액 등을 채취한다. 이들의 재료는 그대로 유전자 도입조작으로 이용하는 것도 가능하지만, 통상은, 밀도구배 원심분리등의 방법에 의해서 조혈 간세포가 포함된 단핵세포 분획을조제하든지, CD34 및(또는) C-kit라고 하는 세포 표면의 마커 분자를 이용한 조혈 간세포의 정제를 행한다. 이들의 조혈 간세포를 함유하는 재료에 대해서, 필요에 따라서 적당한 세포증식 인자 등을 이용한 예비자극을 행한 후, 본 발명의 방법, 그 중에서도, 조혈 간세포내로의 결합 활성를 갖는 기능성 물질의 존재하에, 목적으로 하는 유전자를 삽입된 재조합 레트로바이러스 벡터를 감염시킨다. 이렇게 하여 얻어진 유전자 도입된 세포는, 예를 들면, 정맥 투여에 의해서 수여자에게 이식할 수 있다. 수여자는 바람직하게는 도너 자신이지만, 동종이계 이식을 행하는 것도 가능하고, 예를 들면, 제대혈액을 재료로 한 경우에는 동종이계 이식이 행해진다.
조혈 간세포를 표적으로 한 유전자 치료로서는, 환자에 있어서 결손하여 있든지, 이상이 보이는 유전자를 보완하는 것이 있고, 예를 들어, ADA 결손증이나, 고쉐병(Gaucher's disease)의 유전자 치료가 이에 해당한다. 이밖에, 예를 들면,암이나, 백혈병의 치료에 사용되는 화학 요법제 의한 조혈 세포의 장해를 완화하기 위해서, 조혈 간세포내로의 약제내성 유전자의 도입이 행해지는 것도 있다.
조혈 간세포는 VLA-4 리셉터를 발현하는 것이 알려져 있고, 본 발명에 의해 개시된 CS-1 세포 접착 영역을 갖는 기능성 물질을 이용하여 양호한 효율로 유전자 도입을 행하는 것이 가능하다. 또한, 조혈 간세포 표면에는 상기와 같이 CD34, C-kit라고 하는 분자도 발현되고 있고, 이들의 분자에 대한 항체나 C-kit의 리간드인 간세포인자(stem cell factor)를 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질과 조합시킴에 의해서도, 유전자 도입 효율을 향상시키는 것이 가능하다.
또한, 암의 유전자 치료법으로서는, 암세포에 사이토카인류의 유전자를 도입한 후에 그 증식 능력을 빼앗고 환자의 체내로 돌려서, 종양 면역을 증강시키는 종양 백신 치료법이 연구되고 있다(Human Gene Therapy, 제5권, 제153~164페이지, 1994년). 암세포에 높은 친화성을 갖는 기능성 물질을 이용하여 본 발명의 방법을 적용함에 의해서, 이러한 유전자 치료도, 보다 효과가 높은 것이 된다.
또한, AIDS를 유전자 치료법에 의해 치료하려고 하는 시도도 행해지고 있다. 이경우에는, AIDS의 원인인 HIV(인간면역부전바이러스)의 감염하는 T세포에, HIV의 복제나 유전자 발현을 방해하는 것 같은 핵산분자(안티센스핵산이나 리보자임 등)을 코드하는 유전자를 도입하는 것이 생각되고 있다(예를 들면, J. Virol., 제69권, 제4045~4052페이지, 1995년). T세포내로의 유전자 도입은, T세포 표면에 존재하는 분자에 결합하는 기능성 물질, 예를 들면 항CD4 항체 등을 이용하여, 본 발명의 방법에 의해 달성할 수가 있다.
이렇게, 유전자 도입된 표적 세포로서는, 상기한 본 발명의 태양에 따라서,상기 표적 세포 결합 부위를 갖는 기능성 물질이 입수, 또는 만들 수 있는 범위의 임의의 세포를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 표적 세포를 레트로바이러스 생산 세포의 존재하에서 공배양할 필요가 없는 것, 및 인간에 있어서는 임상에서의 사용에 문제가 있는 헥사디메트린·브로미드를 사용하는 않는 것 등의 점에서, 임상에 있어서 유전자치료의 프로토콜로서도 적합한 것이라고도 말할 수 있다.
더욱이, 유전자 치료 이외의 분야에의 본 발명의 적용으로서, 예를 들면, 표적 세포로서 배형성간세포, 원시배세포(primordial germ cell), 난모세포, 난원세포, 난자, 정모세포, 정자 등을 사용한, 트랜스제닉(transgenic) 척추동물의 간편한 작성을 들 수가 있다.
즉, 본 발명은, 그 하나의 태양으로서, 본 발명의 방법으로 얻어지는 형질전환세포를 척수동물에 이식하는 세포 이식 방법도 제공한다. 형질전환 세포가 이식되는 척추동물로서는, 포유류(예: 쥐, 랫(rat), 토끼, 염소, 돼지, 소, 말, 개, 원숭이, 침팬지, 인간 등), 조류(예: 닭, 칠면조, 메추리, 거위, 오리 등), 파충류(예:뱀, 악어, 거북이 등), 양서류(예: 개구리, 도룡뇽, 도마뱀 등), 어류(예: 전갱이, 고등어, 농어, 도미, 이면수, 방어, 참치, 연어, 송어, 잉어, 은어, 뱀장어, 넙치, 상어, 가오리, 용상어 등)가 예가 된다.
이리하여, 본 발명의 이 태양에 의하면, 실질적으로 순수한 피브로넥틴, 실질적으로 순수한 피브로넥틴 프라그먼트 또는 그것들의 혼합물과 동일하게, 본 발명에 사용하는 기능성 물질의 레트로바이러스를 사용한 유전자 도입이 양호한 효율로 행해진다. 그것에 따라, 종래의 방법의 한계를 갖고 있는 않는, 유전자 재료의 척추동물 세포내로의 효율적인 도입가능한 기술을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 있어서는, 레트로바이러스 결합 부위와, 표적 세포 결합 부위를 동일분자 중에 갖는다. 실질적으로 순수한 피브로넥틴, 실질적으로 순수한 피브로넥틴 프라그먼트 또는 그것들의 혼합물과 동등한 기능을 갖는 물질의 유효량을 기능성 물질로서 사용한다.
이러한 기능성 물질로서는, 피브로넥틴, 피브로넥틴 프라그먼트 또는 그것들의 혼합물과 동등한 효율로 유전자 도입을 행하는 물질이며, 전형적으로는, 상기한 본 발명에 의한 신규인 레트로바이러스 결합 부위와 표적 세포 결합 부위를 동일 분자중에 갖는 기능성 물질을 예로 들 수 있다. 이들의 기능성 물질을 사용하는 경우는, 적어도 1이상의 기능성 물질에 레트로바이러스와 표적 세포가 결합한다고 생각되어 진다.
상기한 레트로바이러스 결합 부위와, 표적 세포 결합 부위를 동일 분자중에 갖는 기능성 물질은, 예를 들면, 서열표의 서열번호 21 및 22로 표기되는 폴리펩티드(이하, 각각, CHV-181 및 CHV-179라고 칭한다)가 포함된다.
이들의 펩티드는 H-271 중에 포함되는 III형 유사 서열(III-12, III-13, III-14)를 포함하는 것이며, CHV-181은 III-12, III-13서열이, 또한, CHV-179는 III-13, III-14 서열이 각각 피브로넥틴의 세포 접착 폴리펩티드(Pro1239-Ser1515)의 C말단에 메티오닌을 사이에 두고 부가된 것이다.
폴리펩티드 CHV-181을 발현하기 위한 플라스미드는, 예를 들면, 이하에 표시하는 방법에 의해 구축할 수 있다.
먼저, 피브로넥틴의 헤파린 결합 폴리펩티드(H-271)을 코드하는 DNA조각을 함유하는 플라스미드 pHD101을 대장균 (Escherichia coli) HB101/pHD101 (FERM BP-2264)에서 조제한다. 이 플라스미드상의 III-13서열의 C말단을 코드하는 영역에 부위특이적 변이 도입 방법에 따라서 HindIII 부위를 도입한 후, 이것을 NcoI, HindIII로 분해하여, III-12, III-13 서열을 코드하는 DNA 조각을 얻는다. 한편, 플라스미드벡터 pINIII-ompA1을 HindIII, SalI로 분해하여 리포프로테인 터미네이터 영역을 코드하는 DNA조각을 얻는다.
다음으로, 피브로넥틴의 세포 접착 폴리펩티드(C-279)를 코드하는 DNA 조각을 함유하는 플라스미드 pHTF7021을 대장균 JM109/pTF7021 (FERM BP-1941)로부터 제조하여, 이 플라스미드상의 C-279의 정지 코돈(codon)의 직전에 부위특이적 변이 도입 방법에 의해서 NcoI 부위를 도입한 플라스미드pTF7520을 만든다. 이 플라스미드상의 NcoI,SalI로 분해한 후, 상기의 III-12, III-13 서열을 코드하는 DNA 조각과 혼합하여 라이게이션을 행함으로써 폴리펩티드CHV-181을 발현하기 위한 플라스미드 pCHV181을 얻을 수 있다. 서열표의 서열번호 27에 플라스미드 pCHV181 상의 폴리펩티드 CHV-181을 코드하는 영역의 염기 서열을 표시한다.
또한, 폴리펩티드 CHV-179를 발현하기 위해서 플라스미드는, 예를 들어, 이하에 표기하는 방법에 의해 구축할 수 있다.
우선, 상기의 플라스미드 pHD101 상의 III-13 서열의 N 말단을 코드하는 영역에 부위특이적 변이 도입법에 의해 NcoI 부윌를 도입한 후, 이것을 NcoI, HindIII으로 분해하여, III-13, III-14서열을 코드하는 DNA 조각을 얻는다. 이것과, 상기의 리포프로테인 터미네이터 영역을 코드하는 DNA조각과, NcoI 및 SalI로 분해한 플라스미드pTF7520을 혼합하여 라이게이션을 행함으로서 폴리펩티드 CHV-179를 발현하기 위한 플라스미드 pCHV-179를 얻을 수 있다.
CHV-181 및 CHV-179는 각각 상기의 플라스미드로 형질변환된 대장균을 배양한 후, 얻어진 배양물로부터 정제를 행하여 얻을 수가 있다.
이들의 기능성 물질도, 비고정이라도, 상기와 동일하게. 예를 들면, 비드에 고정하여도 사용할 수 있다.
더욱이 다른 태양으로는, 본 발명은, (1) 상기의 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 유효량의 기능성 물질과, 표적 세포 결합 부위를 갖는 유효량의 다른 기능성 물질의 혼합물 또는 (2) 상기의 본 발명의 신규인 레트로바이러스 결합 부위 및 표적 세포 결합 부위의 유효량을 동일 분자중에 갖는 기능성 물질을 함유하는 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입에 사용하는 표적 세포의 배양 배지를 제공하는 것으로, 기능성 물질은 비고정이라도, 고정화되어 있어도 좋다.
본 발명의 배양 배지의 다른 성분은, 표적 세포의 배양에 사용가능한 것이라면 특히 제한은 없고, 시판중인 세포 배양 배지를 사용하여도 좋다. 또한 본 발명의 배지는, 혈청이나 표적 세포의 생육에 픽요한 세포증식 인자, 미생물 등에 의한 오염을 막기위해 항생 물질 등을 포함할 수가 있다. 예를 들면, NIH/3T3 세포의 경우에는, 10% 소태아혈청 (기브코사 제품)과, 50단위/ml의 페니실린, 50㎍/ml의 스트렙트마이신(역시 기브코사 제품)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, JRH 바이오사이언스사 제품)를 배양배지에 이용할 수가 있다.
그리고 다른 태양으로서는, 본 발명은, (1) 상기한 레트로바이러스의 결합 부위를 갖는 분자와, 표적 세포 결합 부위를 갖는 다른 분자와의 혼합물, (2) 상기한 본 발명에 의한 신규인 레트로바이러스 결합 부위와, 표적 세포 결합 부위를 동일분자 중에 갖는 기능성 물질, 또는 (3) 상기한 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 기능성 물질과 접촉된 레트로바이러스를 함유하는 배지를 인큐베이션시키는 것을 특징으로 하는 레트로바이러스의 배치 방법을 제공한다.
당해 기능성 물질은, 비고정화되어도, 상기한 바와 같이 같이, 고정화되어 있어도 좋다. 인큐베이션은 통상의 방법에 따라서 행하는 것이 가능하며, 예를 들어, 37℃, CO2농도5%, 습도 99.5%의 조건에서 행할 수 있다. 이 조건은 사용하는 표적 세포에 따라서 적절히 조정하여, 또한 배양 시간도 세포나 목적에 따라서 변경할 수가 있다.
본 발명의 방법을 사용하면, 예를 들어, 표적 세포에 바이러스를 송달하는 광범위한 구축물 중에 바이러스 입자를 배치시키는 것이 가능하다.
본 발명의 다른 태양으로는, 표적 세포내에의 레트로바이러스 개재 유전자 도입의 실시에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는
(a) 유효량의, (1) 상기 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 분자와, 표적 세포 결합 부위를 갖는 다른 분자와의 혼합물 또는 (2) 상기한 본 발명에 의한 신규인 레트로바이러스 결합 부위와, 표적 세포 결합 부위를 동일 분자중에 갖는 기능성 물질,
(b) 표적 세포와 접촉된 레트로바이러스를 인큐베이션시키기 위한 인공기질, 및
(c) 상기 표적 세포를 예비자극시키기 위한 표적 세포 증식 인자,
를 포함하여 이루어지며, (a)의 기능성 물질은, 비고정화되어도, 고정화되어 있어도 무방하며, 이 키트는 또 유전자 도입에 사용하는 재조합 레트로바이러스 벡터나, 필요한 완충제 등을 포함하고 있어도 좋다.
인공 기질로서는, 세포 배양용의 플레이트, 페트리접시, 플라스크 등을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 폴리스틸렌제의 것도 사용 가능하다.
표적 세포가 G0기의 세포인 경우에는, 레트로바이러스가 감염되지 않기 때문에, 예비자극에 따른 세포 주기에 유도하는 것이 바람직하고, 이 목적으로, 레트로바이러스의 감염보다 먼저, 표적 세포를 적당한 표적 세포증식 인자의 존재하에서 배양한다. 예를 들면, 골수 세포나 조혈 간세포에 유전자 도입을 행하는 경우의 예비자극에는, 인터로이킨 6 및 간세포 인자와 같은 표적 세포증식 인자가 사용된다.
키트의 각 구성 성분은, 각각, 자체 공지의 방법에 따라, 수용액 외에 동결건조물, 과립, 정제등의 제형으로 하는 것이 가능하며,
본 발명의 키트를 사용함에 따라서, 예를 들면, 형질전환된 생존가능한 표적 세포 배양물을 얻을 수 있고, 표적 세포내에의 레트로바이러스 개재의 유전자 도입을 간편하게 실시할 수가 있다.
본 발명은 또한, 실질적으로 순수한 피브로넥틴, 실적으로 순수한 피브로넥틴 프라그먼트 및 그것들의 혼합물에서 선택되는 기능성 물질 또는 그 중합체의 유효량의 비고정화물 또는 비드 고정화물을 사용한, 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입도 포함한다.
본 발명은, 상기의 CH2-826 및 그 기능적 동등물을 함유한다. 또한 본 발명은 CH2-826을 코드하는 유전자를 제공하며, 서열표의 서열번호 20으로 표기되는 유전자가 그 일례이다. 본 발명은 그것들의 유전자의 기능적 동등물도 포함한다.
더욱이, 본 발명은 상기의 CHV-181을 제공하며, 본 발명은 그 기능적 동등물을 포함한다. 또 CHV-181을 코드하는 유전자를 제공하며, 서열표의 서열번호 27로 표기되는 유전자가 그 일례이다. 본 발명은 그 유전자의 기능적 동등물을 포함한다.
본 발명은 또한, 레트로바이러스 결합 부위의 중합체 및(또는) 표적 세포 결합 부위의 중합체를 함유하는 중합체를 제공할 수 있다. 중합체의 구체예로서는 섬유아세포 증식 인자의 중합체, V형 콜라겐 유래의 인슐린결합 부위를 갖는 폴리펩티드의 중합체가 예시된다. 이들의 중합체를 코드하는 유전자도 제공한다.
이하에 고찰하는 바와 같이, 본 발명은 특정의 이론에 의해 한정되는 것은 아니지만, 레트로바이러스와 세포를 각각의 기능 영역 부위에 결합시킴에 의해서, 레트로바이러스를 사용한 세포내로의 유전자 도입, 즉 형질전환이 촉진된다.
레트로바이러스와 결합하여, 그 결과, 본 발명에서 유효하게 쓸모가 있는 기능성 물질로서는, 실질적으로 순수한 피브로넥틴, 실질적으로 순수한 피브로넥틴 프라그먼트 또는 그것들의 혼합물이 있으나, 본 발명자들은, 상기한 바와 같이, 이것들과 실질적으로 동등한 기능을 갖는 본 발명의 기능성 물질이 표적 세포의 레트로바이러스를 사용한 유전자 도입 효율, 즉 형질전환 효율을 향상시키는 것을 발견했다.
본 명세서중에 기재된 피브로넥틴의 프라그먼트는 천연 또는 합성기원인 것이 가능하며, 예를 들면, 루오슬라치(Ruoslahti) 등 (1981년), J. Biol. Chem. 256:7277; 파텔(Patel) 및 로디쉬(Lodish)(1986년), J. Cell. Biol. 102:449; 및 베르나르디(Bernardi) 등 (1987년), J. Cell. Biol. 105:489에 의해서 이미 기재된 바와 같이, 천연 기원의 물질로부터 실질적으로 순수한 형태로 제조할 수가 있다. 이 점에 관해서, 본 명세서에서 실질적으로 순수한 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 프라그먼트라 칭하고 있는 것은, 이것들이 천연에 있어서 피브로넥틴과 함께 존재하는 다른 단백질을 본질적으로 함유하고 있지 않는 것을 의미한다.
본 명세서 중에 기재된 실질적으로 순수한 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 프라그먼트는, 예를 들어, 미국특허제5,198,423호에 일반적으로 기재되어 있는 것과 같이, 유전자 재조합체로부터 제조할 수가 있다. 특히, 하기 실시예에서 H-271, H-296, CH-271(서열번호 23) 및 CH-296(서열번호 24)로서 동일하게 정해진 재조합 프라그먼트 및 그것들을 취득하는 방법은 그 특허에 상세하게 기재되어 있다. 하기 실시예에서 사용한 C-274 프라그먼트는 미국특허 제5,102,988호에 기재된 바와 같이 실시하여 얻었다. 이것들 프라그먼트 또는 이것들 프라그먼트로부터 정형적으로 유도가능한 프라그먼트는, 미국특허 제5,198,423호에도 기재되어 있는 바와 같이, 부다페스트조약하, 이바라키현 쯔꾸바시 아즈마 1쪼메 1반 3고의 통산성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 FERM P-10721 (H-296) (원기탁일: 1989년 5월 12일), FERM BP-2799(메티오닌을 사이에 두고 H-271과 결합한 C-277, 즉, CH-271) (원기탁일: 1989년 5월 12일), FERM BP-2800 (메티오닌을 사이에 두고 H-296과 결합한 C-277, 즉, CH-296) (원기탁일: 1989년 5월 12일) 및 FERM BP-2264 (H-271) (원기탁일: 1989년 1월 30일)의 수탁번호를 근거로 기탁된 대장균을 배양함에 의해서 입수할 수가 있다.
더욱이, 본 명세서에서 사용가능한 피브로넥틴 플라그먼트 또는 이러한 프라그먼트의 출발 물질에 관하는 유용한 정보는, 키미즈카(Kimizuka) 등, J. Biochem. 110, 284~291(1991년)(이것은 상기한 재조합 프라그먼트에 관해서 보고하고 있다);EMBO J., 4, 1755~1759(1985년)(이것은 인간피브로넥틴 유전자의 구조를 보고하고 있다); 및 Biochemistry, 25, 4936~4941(1986년) (이것은 인간 피브로넥틴의 헤파린 II 결합 영역에 대해서 보고하고 있다) 중에 볼 수가 있다. 예를 들면, 하기 실시예에 보고되고 있는 것과 같은 각종의 재조합 프라그먼트 중에 포함되는 것같은 CS-1 세포 접착 영역과 헤파린 II 결합 영역과의 양쪽을 갖는 피브로넥틴 프라그먼트는, 이제까지의 연구로 조혈 세포내에의 유전자 도입 효율을 현저하게 높이는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 명세서 중에 기재의 피브로넥틴 관련 폴리펩티드는, 피브로넥틴의 CS-1 세포 접착 영역의 세포 결합 활성을 제공하는 아미노산 서열 및 바이러스와 결합하는 피브로넥틴의 헤파린 II 결합 영역의 아미노산 서열을 제공한다.
또한, 상기 WO95/26200호 기재의, 레트로바이러스 벡터에 의한 형질 전환을높이기 위해서 사용되는 바이러스 결합 폴리펩티드는 (i) 인간피브로넥틴의 헤파린 II 결합 영역의 Ala 1690 - Thr 1960에 상당하는, 하기 식(서열 번호 1)로 표기되는 제1의 아미노산 서열:
Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro
Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr
Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met
Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser
Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu
Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr
Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala
Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr
Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr
Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile
Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr
Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser
Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr
Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile
Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg
Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile
Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala
Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys
Thr,
또는 레트로바이러스와 결합하는 능력을 갖고, 상기의 서열에 충분히 유사한 아미노산 서열 및 (ii) 인간 피브로넥틴의 IIICS 결합 도메인의 1 부분에 상당하는, 하기 식 (서열번호 2)로 표기되는 제2의 아미노산 서열(CS-1):
Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His
Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr;
또는 원시 전구 세포 및(또는) 장기 재정주(간)세포와 같은 조혈 세포와 결합하는 능력을 갖고, 상기의 서열에 충분히 유사한 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 상기의 서열표의 서열번호 1로 표기되는 폴리펩티드(H-271)의 레트로바이러스 결합 활성은 농도 의존성을 표시하고, 실시예 8에 표시되는 것과 같이 고농도하에 있어서는, CH-271과 실질적으로 동등한 활성을 표시한다. 즉, 고농도의 유효량의 H-271의 존재하에서 처음으로 레트로바이러스와 표적 세포는, 적어도 1분자 이상의 H-271에 결합하는 것이 본 발명에 의해 발견되었다.
본 발명에서 사용하는 기능성 물질중의 레트로바이러스 결합 부위와 레트로바이러스와의 강력한 결합은, 광범위한 세포종에 있어서 바이러스를 이용한 치료법을 위한 전달계를 구축하기 위해서 사용하는 것이 가능하다. 이 목적을 위해서, 본 발명에서 사용하는 기능성 물질의 레트로바이러스 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드는, 구축물로서 표적 세포 특이성을 주는 임의의 세포 결합 부위를 포함하는 물질과 결합시키는 경우도 있고, 또한 그 세포 접착 부위를 포함하는 물질과 공존시키는 경우도 있다. 즉, 레트로바이러스 결합 부위를 가지는 기능성 물질성과, 세포 결합 부위를 가지는 기능성 물질은 결합하여도 좋고, 또 다른 분자로서 공존하고 있어도 좋다.
이 방법은, 각 표적 세포용에 특별한 레트로바이러스 세포주를 구축하는 지금까지의 필요성을 회피하는 것이 가능하고, 목적의 표적 세포의 종류에 따라, 최적의 표적 세포 결합 부위를 가지는 기능성 물질의 선택이 용이하게 된다. 따라서, 본 발명의 기능성 물질을 사용함에 따라서, 사용하는 표적 세포에 특이적인 표적화가 용이하게 실시되며, 특히 레트로바이러스 결합 부위를 가지는 기능성 물질과, 세포 결합 부위를 가지는 기능성 물질의 혼합물을 사용하는 본 발명의 방법은, 목적의 표적 세포내로의 목적의 유전자 도입 효율의 향상에 지극히 유용하다. 또한 본 발명이 제공하는 신규 기능성 물질은 레트로바이러스를 사용한 표적 세포내로의 유전자 도입 효율의 향상시키는 방법 및 관련 기술에 있어서 지극히 유용하다.
이하에 실시예를 들어, 더욱 자세하게 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예의 범위에만 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
<실시예 1>
(1) 바이러스 상층액의 조제
레트로바이러스 플라스미드, PM5neo벡터(Exp. Hematol., 제23권, 제630~638페이지, 1995년)를 함유하는 GP+E-86세포 (ATCC CRL-9642)는 10% 소태아혈청(FCS, 기브코사제품) 및 50 단위/ml의 페니실린 및 50㎍/ml의 스트렙트마이신(역시 기브코사 제품)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, JGH 바이오사이언스사 제품)중에서 배양한다. 또한, 이후의 조작에 사용한 DMEM은 모두 50단위/ml의 페니실린 및 50㎍/ml의 스트렙트마이신을 포함한 것이다. PM5neo 바이러스 함유 상층액은 상기 생산 세포를 반융합성 (semi-confluent)까지 생육시킨 플레이트 (지름10㎝의 젤라틴 피복 세포 배양용 접시, 이와시로유리사 제품)에 10%FCS를 함유하는 4ml의 DMEM을 첨가하여, 하룻밤 배양한 후에 채집하여 조제했다. 채집한 배지 상층액을 0.45 미크론의 필터(밀리포어사 제품)으로 여과하여 바이러스 상층액 원액으로 하여, 사용하기 까지 -80℃로 보존했다.
별도로, 레트로바이러스 플라스미드, TKNEO 벡터 (Blood, 제78권, 제310~317페이지, 1991년)에 대해서는 GP+envAm-12세포 (ATCC CRL-9641)을 사용하여, 상기의 동일한 조작을 행하여 TKNEO 바이러스 상층액을 조제하였다.
(2) 상층액의 바이러스 역가의 측정
상층액의 바이러스 역가는 NIH/3T3 세포를 사용하여 표준 방법(J. Virol., 제62권, 제1120~1124페이지, 1988년)에 따라서 측정했다. 즉, 6웰의 조직배양 플레이트의 1웰당 2000개의 NIH/3T3 세포 (ATCC CRL-1658)를 포함하는 DMEM을 첨가하여, 하룻밤 배양한 후, 연속 희석한 바이러스 상층액과 최종 농도 7.5 ㎍/ml의 헥사디메트린·브로미드 (폴리브렌: 알드리히사 제품)을 각 웰에 가했다. 이것을 37℃로 24시간 인큐베이션한 후, 배지를 최종 농도0.75㎎/ml의 G418(기브코사 제품)을 함유하는 것과 교환하여 한층 인큐베이션를 계속하였다. 10~12일 후에 생육한 G418 내성 (G418r) 콜로니를 크리스탈 바이오레트로 염색하여 그 수를 기록하였다.웰당 콜로니 수에 바이러스 상층액의 희석배율을 곱한 치보다. 상층액 1ml당 포함되는 감염성 입자수(cfu/ml)를 산출하여, 이것을 상층액의 역가로서 이후의 실험에 있어서의 바이러스 상층액의 첨가량을 결정하였다.
실시예2
(1) 피브로넥틴 유래의 폴리펩티드의 조제
인간 피브로넥틴 유래의 폴리펩티드, H-271(서열표의 서열번호 1에 그 아미노산 서열을 표시한다)은 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 포함하는 재조합 플라스미드, pHD101을 함유하는 대장균 HB101/pHD101 (FERM BP-2264)로부터 미국특허 제5,198,423호 공보 기재의 방법에 의해서 조제하였다.
또한, 폴리펩티드CH-271(서열표의 서열 번호 23에 그 아미노산 서열을 표시한다)은 이하에 표시하는 방법에 의해서 조제하였다. 즉, 대장균 HB101/pCH101(FERM BP-2799)을 이용하여, 이것을 상기의 공보 기재의 방법으로 배양하여, 상기 배양물로부터 CH-271을 얻었다.
또, 폴리펩티드 CH-296(서열표의 서열번호 24에 그 아미노산 서열을 표시한다)은 이하에 표시하는 방법에 따라 조제한다. 즉, 대장균 HB101/pCH102(FERM BP-2800)을 이용하여, 이것을 상기의 공보 기재의 방법으로 배양하여, 상기 배양물로부터 CH-296을 얻었다.
폴리펩티드C-274(서열표의 서열번호25에 그 아미노산 서열을 표시한다)는 이하에 표시하는 방법에 따라 조제한다. 즉, 대장균 JM109/pTF7221(FERM BP-1915)을 이용하여, 이것을 미국특허 제5,102,988호 공보 기재의 방법으로 배양하여, 상기배양물로부터 C-274를 얻었다.
더욱이, 폴리펩티드 C277-CS1((서열표의 서열 번호 29에 그 아미노산 서열을 표시한다)는 이하에 표시하는 방법에 따라 조제한다. 즉, 일본 특허공개 평3-284700호 공보에 FERM P-11339로서 기재되어, 현재는 부다페스트 조약하, 상기의 이바라키현 쯔꾸바시 아즈마 1쪼메 1반 3고의 통산성 공업기술원 생명공학공업기술연구소에 수탁번호 FERM BP-5723으로서 기탁되어 있는 대장균 HB101/pCS25(원기탁일: 1990년3월5일)을 이용하여, 이것을 상기 공보 기재의 방법으로 배양하여,상기배양물로부터 C277-CS1을 얻었다.
(2) C-FGF·A의 조제
폴리펩티드C-FGF·A(서열표의 서열 번호 4에 그 아미노산 서열을 표시한다)는 이하에 표시하는 방법에 따라서 조제한다. 즉, 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 함유하는 재조합 플라스미드, pYMH-CF·A를 포함하는 대장균 JM109/pYMH-CF·A(FERM BP-5278)을 100㎍/ml의 앰피실린을 포함하는 5ml의 LB 배지 중, 37℃로 8시간 배양했다. 이 전 배양액은 100㎍/ml의 앰피실린, 1mM의 IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)를 함유하는 LB배지 500ml에 접종하여, 37℃로 하룻밤 배양한 후, 집균하였다. 얻어진 균체를 1mM, PMSF(페닐메탄설포늄플로리드), 0.05% 노니티드P-40을 함유하는 10ml의 PBS(인산완충 생리식 염수)에 현탁하여, 초음파처리를 행하여 균체를 파쇄한 후, 원심분리를 행하여 상층액을 얻었다. 이 상층액 260 ml에 있어서의 흡광도를 측정하여, 이것에 상처의 액량 (ml)을 곱한 치를 산출하여, 이 치 4000에 대하여 1ml의 비율로 5% 폴리에틸렌이민을 가한 후,원리분리하여 상층액을 얻었다. 이 상층액을 미리 PBS로 평형화한 HiTrap-헤파린 컬럼 (파마시아사 제품)에 걸쳐, PBS로 비흡착의 분획을 세정한 후, 0.5M부터 2M의 NaCl 농도 구배를 갖는 PBS로 흡착 분획의 용출을 행하였다. 용출액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 분석하면 약 47kd의 폴리펩티드를 포함한 2개의 분획이 존재하고 있지만, 이 중의 고 NaCl 농도에서 용출된 쪽의 분획을 모아 1.5M NaCl을 포함하는 PBS로 평형화한 세파로스 6컬럼(파마시아사 제품)에 걸쳤다. 용출액을 SDS-PAGE에 의해 분석하고, 약 47kd의 폴리펩티드를 포함하는 분획을 모아 정제C-FGF·A를 조제하여, 이하의 조작에 사용하였다.
(3) C-FGF-CS1의 조제
먼저, 폴리펩티드C-FGF-CS1(서열표의 서열 번호 5에 그 아미노산 서열을 표시한다)를 대장균을 숙주로서 발현시키기 위해 플라스미드를 구축하였다.
대장균 HB101/pCH102(FERM BP-2800)을 배양하여, 얻어진 균체로부터 알카리SDS법에 의해서 플라스미드 pCH102를 조제하였다. 이 플라스미드를 주형으로 하여, 프라이머M4 (타카라 슈조사 제품) 및 서열표의 서열 번호 9에 염기서열을 표시하는 프라이머 CS1-S를 이용한 PCR 반응을 행한 후, 에탄올 침전에 의해서 반응액 중의 증폭 DNA조각을 회수하였다. 얻어진 DNA조각을 NheI, SalI(모두 타카라 슈조사 제품)으로 분해한 후, 아가로스 겔 전기영동을 행하여 약 970bp의 DNA 조각을 겔로부터 회수하였다.
다음으로 대장균 JM109/pYMH-CF·A(FERM BP-5278)을 배양하여, 얻어진 균체로부터 알카리 SDS법에 의해서 플라스미드 pYMH-CF·A를 조제하였다. 이 프라스미드를 주형으로 하여, 서열번호 10에 염기 서열을 표시하는 프라이머 CF 및 서열표의 서열 번호 11에 염기 서열을 표시한 프라이머 FNR을 이용한 PCR 반응을 행한 후, 에탄올 침전에 의해 반응액 중의 증폭 DNA 조각을 회수하였다. 얻어진 DNA 조각을 Eco521 (타카라 슈조사 제품), NheI으로 분해한 후, 아가로스겔 전기 영동을 행하여 약 320bp의 DNA조각을 겔로부터 회수하였다.
상기 플라스미드 pYMH-CF·A를 Eco521, SalI로 분해한 후에 아가로스 겔 전기영동을 행하여 단리된 약 4.1kb의 DNA 조각을 상기의 약 970bp의 DNA 조각 및 약 320bp의 DNA 조각과 혼합하여, 라이게이션을 행하여 얻어진 재조합 플라스미드를 대장균 JM109에 도입하였다. 얻어진 형질전환체로부터 플라스미드를 조제하여, 상기의 3개의 DNA 조각이 1분자씩 포함되는 것을 선택하여 플라스미드 pCFS100이라고 명명하였다. 또한, 플라스미드 pCFS100으로 형질전환된 대장균 JM109를 대장균 JM109/pCFS100이라고 명명하였다. 플라스미드 pCFS100은 C-FGF·A의 C 말단에 피브로넥틴 유래의 CS-1 세포 접착 영역을 갖고, FGF·A의 C말단으로부터 2번째의 라이신이 알라닌으로 치환된 폴리펩티드, C-FGF-CS1을 코드하고 있다.
폴리펩티드 C-FGF-CS1은 이하에 표시하는 방법에 따라서 조제하였다.
즉, 상기의 대장균 JM109/pCFS100㎍/ml의 앰피실린을 함유하는 5ml의 LB배지 중, 37℃로 8시간 동안 배양하였다. 이 전 배양액을 100㎍/ml의 앰피실린, 1mM의 IPTG를 함유하는 LB배지 500ml에 접종하여, 37℃로 하룻밤 배양한 후에 집균하였다. 얻어진 균체를 0.5M NaCl, 1mM PMSF, 0.05% 노니테트(Nonidet) P-40을 포함하는 10ml의 PBS (인산 완충 생리 식염수)에 현탁하여, 초음파 처리를 행하여 균체를파쇄한 후, 원심분리를 행하여 상층액을 얻었다. 이 상층액을 미리 0.5M NaCl을 포함하는 PBS로 평형화한 HiTrap-헤파린 컬럼에 걸쳐, 0.5M NaCl을 포함하는 PBS로 비흡착의 분획을 세정한 후, 0.5M로부터 2M의 NaCl농도구배를 갖는 PBS로 흡착분획의 용출을 행하였다. 용출액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석하고, 약 50kd의 폴리펩티드를 포함한 분획을 모아 정제C-FGF-CS1을 조제하여, 이하의 조작에 사용하였다.
이렇게하여 얻어진 정제 C-FGF-CS1의 N말단으로부터 5 번째까지의 아미노산 서열을 조사한 결과, 서열표의 서열번호 5에 표시된 아미노산 서열의 것과 일치하였다. 또, 질량 분석법에 의하여 측량된 정제 C-FGF-CS1의 분자량도 상기의 아미노산 서열로부터 예상되는 것과 일치하였다.
(4) C277-ColV의 조제
폴리펩티드 C277-ColV(서열표의 서열번호 6에 그 아미노산 서열을 표시한다)는 이하에 표시하는 조작에 따라서 조제한다. 즉, 상기 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 함유하는 재조합 플라스미드, pTF7520ColV를 포함하는 대장균 JM109/pTF7520ColV (FERM BP-5277)를 100㎍/ml의 앰피실린을 포함하는 5ml의 LB 배지중, 37℃로 6.6 시간 배양했다. 이 전 배양액은 100㎍/ml의 앰피실린을 포함하는 LB배지 500ml에 접종하여, 37℃로 배양하였다. 660nm에 있어서의 흡광도가 0.6에 달한 시점에서 IPTG를 최종 농도 1mM가 되도록 첨가하여 하룻밤 배양한 후에 집균하였다. 얻어진 균체를 1mM, EDTA, 0.05% 노니데트 P-40, 2mM PMSF를 함유하는 10ml의 PBS에 현탁하여, 초음파처리를 10분간 행하여 균체를 파쇄하였다. 이 균체파쇄액을 원심분리를 하여 얻은 상층액을 PBS로 평형화한 리소스(Resource) Q컬럼(파마시아사 제품)에 걸쳐, 목적하는 폴리펩티드를 함유하는 비흡착 분획을 얻었다. 이 분획을 PBS로 평형화한 Hitrap-헤파린 컬럼에 걸쳐, PBS로 비흡착의 분획을 세정한 후, 0M부터 0.5M의 NaCl농도구배를 갖는 PBS로 흡착분획의 용출을 행하였다. 용출액을 SDS-PAGE에 의해 분석하여 48kd의 폴리펩티드를 포함한 2개의 분획을 모아 정제C277-ColV를 조제하여, 이하의 조작에 사용하였다.
(5) ColV의 조제
먼저, 폴리펩티드 ColV(서열표의 서열번호 6에 그 아미노산 서열을 표시한다)를 대장균을 숙주로서 발현시키기 위해 플라스미드를 구축하였다.
대장균 HB101/pTF7520ColV(FERM BP-5277)을 배양하여, 얻어진 균체로부터 알카리 SDS법에 의해서 플라스미드 pTF7520ColV를 조제하였다. 이 플라스미드를 NcoI, BamHI(모두 타카라주소사 제품)으로 분해후, 아가로스겔 전기영동을 행하여 약 0.5kb의 DNA조각을 겔로부터 회수하였다. 이것을 미리 NcoI과 BamHI로 분해해 둔 플라스미드벡터 pET8C(노바젠사 제품)과 혼합하여 라이게이션을 행하였다. 얻어진 재조합 플라스미드를 대장균 BL21에 도입하여 얻어진 형질전환체로부터 플라스미드를 제조하여, 상기의 약 0.55kb의 DNA 조각 1분자 만이 포함된 것을 선택하여, 이것을 플라스미드 pETColV라고 명명하였다.
상기의 플라스미드 pETColV로 형질전환된 대장균 BL21, 대장균 BL-21/pETColV를 50㎍/ml의 앰피실린을 포함하는 10ml의 LB배지중, 37℃로 하룻밤 배양하였다. 이 전 배양액은 0.2ml를 50㎎/ml의 앰피실린을 포함하는 LB배지 100ml에접종하여, 37℃로 배양하였다. 660nm에 있어서의 흡광도가 0.4에 달한 시점에서 IPTG를 최종 농도 1mM가 되도록 첨가하여 하룻밤 배양한 후에 집균하였다. 얻어진 균체를 1mM, EDTA, 0.05% 노니데트 P-40, 10㎎/ml 아프로티닌 (aprotinin), 10㎎/ml 류펩틴(leupeptin), 2mM PMSF를 함유하는 5ml의 PBS(인산 완충 생리 식염수)에 현탁하여, 초음파 처리를 행하여 균체를 파쇄한 후, 원심분리를 행하여 상층액을 얻었다. 이 상층액을 PBS로 평형화한 HiTrap-헤파린컬럼에 걸쳐, PBS로 비흡착의 분획을 세정한 후, 0.5M의 NaCl을 포함하는 PBS로 흡착 분획의 용출을 행하였다. 용출액을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동에 의해 분석한 결과, 거의 단일한 약 18kd의 폴리펩티드가 확인되었다. 이렇게하여 얻어진 정제 ColV를 이하의 조작에 사용하였다.
(6) H2-547의 조제
폴리펩티드H2-547(서열표의 서열 번호 13에 그 아미노산 서열을 표시한다)을 발현시키기 위한 플라스미드는 이하에 표시하는 조작에 따라서 구축하였다. 대장균HB101/pCH102(FERM BP-2800)을 배양하여, 얻어진 균체로부터 알카리 SDS법에 의해서 플라스미드 pCH102를 조제하였다. 이 플라스미드를 주형으로 하여, 서열표의 서열번호 15에 염기 서열을 표시하는 프라이머 12S와 서열표의 서열 번호 16에 염기서열을 표시한 프라이머 14A를 이용한 PCR 반응후, 아가로스겔 전기영동을 행하여, 피브로넥틴의 헤파린 결합 폴리펩티드를 코드하는 약 0.8kb의 DNA 조각을 겔로부터 회수하였다. 얻어진 DNA조각을 NcoI, BamHI(모두 타카라 슈조사 제품)으로 분해한 후, NcoI, BamHI로 분해한 pTV118N(타카라 슈조사 제품)과 혼합하여 라이게이션을 행하여, 대장균 JM109에 도입하였다. 얻어진 형질전환체로부터 플라스미드를 조제하여, 상기의 DNA 조각을 포함하는 플라스미드를 선택하여 이것을 플라스미드 pRH1으로 하였다.
플라스미드 벡터 pINⅢ-ompA1(The EMBO Journal, 제3권, 제2437~2442페이지, 1984년)을 BamHI와 HincⅡ(타카란주조사 제품)로 분해하여, 리포프로테인 터미네이터 영역을 포함하는 0.9kb의 DNA 조각을 회수하였다. 이것을 BamHI와 HincⅡ로 분해한 상기의 플라스미드 pRH1과 혼합하여 라이게이션을 행하여, lac 프로모터, 헤파린 결합 폴리펩티드를 코드하는 DNA조각 및 폴리프로테인 터미네이터를 순서대로 포함하는 플라스미드pRH1-T를 얻었다.
플라스미드 pRH1-T를 NheI와 ScaI(모두 타카라 슈조사 제품)으로 분해하여 얻어진 약 3.1kb의 DNA 조각과, SpeI (타카라 슈조사 제품)과 ScaI로 분해하여 얻어진 약 2.5kb의 DNA조각을 각각 조제하여, 이 2개를 라이게이션시킴에 의해 1ac 프로모터, 헤파린 결합 폴리펩티드가 2개 탠덤(tandum)에 연결된 폴리펩티드를 코드하는 개방 해독 프레임, 및 리포프로테인 터미네이터를 순서대로 포함하는 플라스미드 pRH2-T를 얻었다. 상기의 개방 해독 프레임의 염기 서열을 서열표의 서열번호 17에 표시하였다.
폴리펩티드 H2-547은 이하의 방법에 의해 조제하였다. 100㎍/ml의 앰피실린을 포함하는 120ml의 LB배지를 넣은 500ml 배플 (baffle)이 달린 삼각 플라스크를 4개 준비하여, 이것에 상기의 프리스미드 pRH2-T로 형질전환된 대장균 HB101/pRH2-T를 접종하여 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 배양액으로부터 원심분리에 의해 균체를 모아, 40ml의 파쇄용 완충액(50mM 트리스-HC1, 1mM EDTA, 150mM NcCl, 1mM DTT, 1mM PMSF, pH7.5)에 현탁하여, 초음파 처리를 행하여 균체를 파쇄하였다. 원심분리를 행하여 얻어진 상층액을 정제용 완충액(50mM 트리스-HC1,pH7.5)로 평형화된 하이트랩 헤파린 컬럼(파마시아사 제품)에 걸었다. 동 완충액으로 칼럼내의 비흡착분획을 세정한 후, 0 ~ 1 M NcCl 농도 구배를 갖는 정제용 완충액으로 용출을 행하였다. 용출액을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동으로 분석하여, 분자량 약 6만의 폴리펩티드를 포함하는 분획을 모아 정제 H2-547 표준품을 얻었다. 얻어진 표품의 단백량을 비씨에이 프로테인 분석 시약(BCA PROTEIN ASSAY REAGENT) (피어스사 제품)에 의해, 소혈청 알부민을 표준으로서 측정한 결과, 약 10 ㎎의 H2-547이 얻어져 있었다.
이렇게 하여 얻어진 정제 H2-547의 N말단으로부터 5 잔기까지의 아미노산 서열을 조사한 결과, 서열표의 서열번호 17로 표시되는 염기 서열로부터 예상되는 H2-547의 아미노산 서열로부터 N말단의 메티오닌이 제거된 것(서열표의 서열 번호 13에 그 서열을 표시한다)와 일치하였다. 또한, 질량 분석법에 의해 측정된 정제H2-547의 분자량은 서열표의 서열 번호 13에 표시된 아미노산 서열로부터 예상된 것과 일치하였다.
(7) CH2-826의 조제
폴리펩티드CH2-826 (서열표의 서열 번호 14에 그 아미노산 서열을 표시한다)을 발현시키기 위한 플라스미드는 이하에 표시하는 조작에 따라서 구축한다. 상기의 플라스미드 pCH102를 주형으로 하여, 서열표의 서열번호 18에 염기 서열을 표시하는 프라이머 CLA를 이용한 PCR 반응 후, 아가로스겔 전기영동을 행하여, 피브로넥틴의 세포 접착 폴리펩티드를 코드하는 약 0.8kb의 DNA조각을 겔로부터 회수하였다. 얻어진 DNA조각을 NcoI, Bg1Ⅱ(타카라 슈조사 제품)으로 분해한 후, NcoI, BamHI로 분해한 pTV118N과 혼합하여 라이게이션을 행하고, 대장균 JM109에 도입하였다. 얻어진 형질전환체로부터 플라스미드를 조제하여, 상기의 DNA 조각을 포함하는 플라스미드를 선택하여 이것을 플라스미드 pRC1이라 하였다. 이 플라스미드pRC1을 SpeI와 ScaI로 분해하여 얻어진 약 2.5kb의 DNA 조각과, 상기의 플라스미드pRH2-T를 NheI와 ScaI로 분해하여 얻어진 약 3.9kb의 DNA 조각을 혼합하여 라이게이션을 행하고, 세포 접착 폴리펩티드의 C말단에 헤파린 결합 폴리펩티드가 2개 탠덤에 결합된 폴리펩티드를 코드하는 플라스미드 pRCH2-T을 얻었다. 이 폴리펩티드를 코드하는 플라스미드 pRCH2-T상의 개방 해독 프레임의 염기 서열을 서열표의 서열번호 20에 표시한다.
폴리펩티드 CH2-826은 실시예2-(6) 기재의 폴리펩티드 H2-547에 대해서 이용된 것과 동일한 방법에 따라서 조제하였다. HiTrap-헤파린 컬럼의 용출액 중, 분자량 약 9만의 폴리펩티드를 포함하는 분획을 모아 정제 CH2-826표품을 얻었다.
(8) H2S-537의 조제
폴리펩티드 H2S-537(서열표의 서열번호 30에 그 아미노산 서열을 표시한다)을 발현시키기 위해서 플라스미드는 이하에 표시되는 조작에 따라서 구축하였다. 상기의 염기 서열을 표시하는 플라스미드 pCH102를 주형으로 하여, 서열표의 서열번호31에 염기 서열을 표시하는 프라이머 CS1S와, 서열표의 서열번호 32에 염기 서열을 표시하는 프라이머CS1A를 이용한 PCR 반응후, 아가로스겔 전기영동을 행하여 피브로텍틴의 CS-1 세포 접착 영역을 코드하는 약 0.1kb의 DNA 조각을 겔로부터 회수하였다. 얻어진 DNA조각을 NcoI, BamHI로 분해한 후, NcoI, BamHI로 분해한 플라스미드 벡터 pTV118N과 혼합하여 라이게이션을 행하여, 대장균 JM109에 도입하였다. 얻어진 형질전환체로부터 플라스미드를 조제하여, 상기의 DNA 조각을 포함하는 플라스미드를 선택하여 이것을 플라스미드 pRS1이라 하였다.
플라스미드 벡터 pINIII-ompA1을 BamHI와 HincII로 분해하여, 리포프로테인 터미네이터 영역을 포함하는 약 0.9kb의 DNA 조각을 회수하였다. 이것을 BamHI와 HincII로 분해한 상기의 플라스미드 pRS1과 혼합하여 라이게이션을 행하여, 1ac 프로모터, CS-1영역 폴리펩티드를 코드하는 DNA 조각 및 리포프로테인 터미네이터를 순서대로 포함하는 플라스미드 pRS1-T를 얻었다.
플라스미드 pRS1-T를 NheI와 ScaI로 분해하여 얻어진 약 2.4kb의 DNA 조각과, 플라스미드 pRH2-T를 SpeI, ScaI, PstI(타카라 슈조사 제품)로 분해하여 얻어진 약 3.3kb의 DNA조각을 각각 조제하여, 이 2개를 라이게이션시킴으로서 1ac 프로모터, 탠덤에 늘어선 2개의 헤파린 결합 폴리펩티드의 C말단측에 CS-1 영역이 연결된 구조의 폴리펩티드를 코드하는 개방 해독 프레임, 및 리포프로테인 터미네이터를 순서대로 포함하는 플라스미드 pRH2S-T를 얻었다. 상기의 개방 해독 프레임의 염기서열을 서열표의 서열 번호 32에 표시한다.
폴리펩티드 H2S-573은 실시예2-(6) 기재의 폴리펩티드 H2-547에 대해서 이용된 것과 동일의 방법으로부터 조제하였다. 하이트랩 헤파린 컬럼의 용출액 중, 분자량 약 6 만의 폴리펩티드를 포함하는 분획을 모아 정제 H2S-573 표준품을 얻었다.
(9) 기능성 물질의 플레이트 상에의 고정화
기능성 물질은 고정화된 플레이트(6-웰 조직배양 플레이트, 파르콘사 제품)을 레트로바이러스의 세포내로의 감염 실험에 사용하는 경우에는, 이하에 나타낸 조작에 따라서 고정화 조작을 행하였다. 즉, 상기의 실시예 기재의 각종 기능성 물질을 적당한 농도가 되도록 PBS에 용해한 용액을 한 웰 (저부 면적 9.6㎠)당 2 ml를 첨가하여, 자외선의 조사(照射)하에 플레이트의 뚜껑을 열어 1 시간, 그리고 뚜껑을 덮고 1 시간, 실온에서 인큐베이션시켰다. 다음으로 기능성 물질 용액을 2%의 소혈청 알부민(BSA, 베링거·만하임사 제품)을 포함하는 PBS 2ml로 교환하여 30분간 더 실온에서 인큐베이션한 후, 25mM HEPES를 포함하는 PBS로 플레이트를 세정하였다. BSA를 고정화한 대조 플레이트는 상기의 조작 중 폴리펩티드 용액과의 인큐베이션을 생략하고 만들었다.
또한, 이후에 표시하는 실시예에서의 유전자 도입(바이러스 감염) 실험에 있어서는, 특별히 언급하지 않는한, 상기의 6 웰의 조직 배양 플레이트를 사용하고, 플레이트상에의 고정화에 사용된 기능성 물질의 농도를 표시하는 경우에는, 웰의 단위 바닥 면적당 기능성 물질량을 pmol/㎠(및 ㎍/㎠)을 단위로 하여 기재한다. 예를 들면, 상기의 플레이트 (바닥 면적 9.6㎠)에 대해서 48㎍/ml의 H-271 용액 2ml을 이용하여 고정화를 행한 경우에는, 「333 pmol/㎠(10 ㎍/㎠)의 H-271을 이용하여 고정화하였다」라고 기재한다. 또한, 유전자 도입후의 부유 세포 (TF-1, HL-60)을 배양할 때에 이용하는 CH-296을 고정화한 플레이트는, 48 pmol/㎠(3㎍/㎠)의 CH-296 용액을 이용하여, 상기의 조작에 따라서 고정화를 행한 것이다. 후속 실시예에 있어서, 표적 세포내로의 바이러스 감염은 모두 폴리브랜을 함유하지 않는 배지 중에서 행하였다. 또한, 사용하는 바이러스, 세포, 배지 등의 양을 표시하는 경우에는 특별히 사전에 아무런 얘기가 없는 한, 1 웰당 량을 기재한다.
실시예 3
(1) 기능성 물질의 혼합물을 이용한 유전자 도입
세포에 결합하는 물질과, 레트로바이러스에 결합하는 물질을 혼합하여 플레이트에 고정화한 경우의 유전자 도입 효율에의 영향을 조사하기 위해서 이하에 표시하는 실험을 행하였다. 우선, 실시예 2-(9) 기재의 방법에 따라서 32 pmol/㎠(1.5㎍/㎠)의 C-FGF·A, 32 pmol/㎠(1㎍/㎠)의 C-274와 32 pmol/㎠(0.5㎍/㎠)의 FGF(벡톤·디킨슨사 제품)의 각각을 이용하여, 각 폴리펩티드를 플레이트에 고정화하였다. 이들의 플레이트 및 BSA를 고정화한 대조 플레이트의 각각에 1000 cfu의 PM5neo 바이러스를 포함하는 2ml의 바이러스 상층액을 가하여 37℃, 30 분간 예비 인큐베이션한 후, PBS를 이용하여 플레이트를 철저하게 세정하였다. 이 플레이트에 2000개의 NIH/3T3 세포를 포함하는 2ml의 DMEM 배지를 가하고, 폴리브랜의 부재하에 37℃, 2시간 인큐베이션한 후, 비부착 세포는 경사에 의해, 또 플레이트에 부착한 세포는 트립신 처리 후에 플레이트로부터 분리시킴으로써 각각 채취하여, 그것들을 합하였다. 얻어진 세포 현탁액을 2등분하여 한쪽은 DMEM, 다른 한쪽은 최종농도0.75 ㎎/ml의 G418을 포함하는 DMEM과 함께 37℃로 10일간 배양하여,출현한 콜로니수를 계수하였다. G418을 포함하지 않는 배지에서 얻어진 콜로니수에 대해서 G418 내성 콜로니 수의 비율을 유전자 도입 효율로 하여, 그 결과를 도1에 표시하였다. 도면 중, 횡축은 사용한 기능성 물질, 종축은 유전자 도입 효율을 각각 표시한다.
도 1에 표시되어 있는 바와 같이, 레트로바이러스의 감염 시간을 2 시간으로 한 경우에는 FGF 단독으로는 C-FGF·A에 비하여 낮은 유전자 도입 효율밖에 얻지못하지만, C-274와 FGF의 혼합물을 고정화한 플레이트를 이용한 경우에는, 이 2개의 폴리펩티드가 공유결합된 C-FGF·A을 이용한 경우와 동일한 효과로 G418 내성 콜로니가 얻어졌다.
상세한 검토를 행하기 위해, C-274 단독, 및 FGF 단독을 고정화한 경우와 그것들의 혼합물을 고정화한 경우와의 비교를 행하였다. 즉 32pmol/㎠(1㎍/㎠)의 C-274, 32pmol/㎠(0.5㎍/㎠)의 FGF 및 32pmol/㎠의 C-274와 32pmol/㎠의 FGF와의 혼합물의 각각을 이용하여 실시예 2-(9) 기재의 방법에 의해서 플레이트 상에의 고정화를 행하여, 이들의 플레이트를 이용하여 상기와 동일한 조작으로 레트로바이러스 감염의 효과를 조사하였다. 얻어진 결과를 도 2에 표시한다. 도면 중, 횡축은 사용한 기능성 물질, 종축은 유전자 도입 효율을 각각 표시한다.
도 2에 표시되어 있는 바와 같이, C-274와 FGF와의 혼합물을 고정화한 플레이트를 이용한 경우에는 FGF 단독을 고정화한 것에 비해서 높은 유전자 도입 효율을 보였다. 또한 레트로바이러스 결합 부위를 갖지 않는 C-274 단독을 고정화한 플레이트에서는 G418 내성 콜로니는 얻어지지 않았다. 이상의 실험 결과로부터, 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 FGF에 세포 결합 부위를 갖는 C-274를 조합시킴으로써 FGF 단독을 사용한 경우에 비해서 높은 감염효율이 얻어지는 것, 및 이러한 폴리펩티드의 조합에 의한 효과의 발현에는 반드시 폴리펩티드쇄가 공유 결합에 의해 연결되어 있을 필요가 없는 것으로 나타났다.
(2) 기능성 물질의 혼합물을 이용한 유전자 도입
레트로바이러스 결합 부위를 갖는 폴리펩티드를 ColV로 치환하여, 실시예3-(1)과 동일하게 실험을 행하였다. 본 실험에 있어서는 C-274와 ColV를 갖가지 몰(mol)비로 혼합한 경우를 비교하였다. 즉, 330pmol/㎠(6㎍/㎠)의 ColV, 330pmol/㎠(10㎍/㎠)의 C-274와 330pmol/㎠의 ColV와의 혼합물(C-274와 ColV의 몰비는 10:10), 100pmol/㎠(3㎍/㎠)의 C-274와 330pmol/㎠의 ColV와의 혼합물(3:10), 33pmol/㎠(1㎍/㎠)의 C-274와 330pmol/㎠의 ColV와의 혼합물(1:10), 330pmol/㎠(16㎍/㎠)의 C277-ColV, 및 330pmol/㎠(10㎍/㎠)의 C-274의 각각을 이용하여 실시예2-(9) 기재의 방법에 따라서 플레이트에의 고정화를 행하여, 만들어진 플레이트를 이용하여 상기와 동일한 조작에 의해 레트로바이러스 감염의 효과를 조사하였다. 얻어진 결과를 도 3에 표시한다. 도면 중, 횡축은 사용한 기능성 물질, 종축은 유전자 도입 효율을 각각 나타낸다.
도 3에 표시되는 바와 같이, 감염 시간을 2 시간으로 한 경우에는 ColV를 고정화시킨 플레이트 상에서 감염 효율은 C277-ColV 고정화 플레이트의 1/2이하였으나, ColV와 그 1/10의 양(분자수로서)의 C274의 혼합물을 고정화시킨 플레이트를 이용한 경우에는 C277-ColV와 동등한 감염 효과가 얻어졌으며, FGF의 경우도 동일하게 C-274 분자의 레트로바이러스 감염의 촉진 효과가 확인되었다. 또한, ColV분자에 대한 C-274 분자의 비율이 상승한 경우에는 이 효과는 오히려 저하하고, 동량의 ColV, C-274를 포함하는 혼합물을 고정화한 경우에는 ColV 단독을 고정화한 경우와 거의 차이를 보이지 않았다.
(3) 기능성 물질의 혼합물을 이용한 유전자 도입
세포 결합 부위를 갖는 물질과, 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 물질을 혼합하여 플레이트에의 고정화를 행한 경우의 유전자 도입 효율의 영향을 조사하기 위해서 이하에 나타내는 실험을 행하였다. 우선, 실시예 2-(9) 기재의 방법에 따라서, 32pmol/㎠(1㎍/㎠)의 C-274, 333pmol/㎠(10㎍/㎠)의 H-271, 및 32pmol/㎠(1㎍/㎠)의 C-274와 333pmol/㎠(10㎍/㎠)의 H-271의 혼합물 각각을 이용하여 플레이트 상에의 고정화를 행하였다. 이들의 플레이트 각각에 1000 cfu의 PM5neo 바이러스를 포함하는 2ml의 바이러스 상층액을 가하여, 37℃, 30분간 예비 인큐베이션한 후, PBS를 이용하여 플레이트를 철저하게 세정하였다. 이 플레이트에 2000개의 NIH/3T3세포를 포함하는 2ml의 DMEM배지를 가하여 37℃, 2 시간 인큐베이션한 후, 비부착세포는 경사에 의해서, 또한 플레이트에 부착한 세포는 트립신 처리 후에 플레이트로부터 분리시켜 각각 채취하여, 이것들을 합하였다. 얻어진 세포 현탁액을 2등분하여 한쪽은 DMEM, 다른 한쪽은 최종농도 0.75㎎/ml의 G418을 포함하는 DMEM과 함께 37℃로 10일간 배양하여, 출현한 콜로니(colony) 수를 계수하였다. G418을 포함하지 않는 배지에서 얻어진 콜로니 수에 대한 G418 내성 콜로니 수의 비율을 유전자 도입 효율로 하여, 그 결과를 도 4에 표시한다. 도면 중, 횡축은 사용한 기능성물질, 종축은 유전자 도입 효율을 각각 나타낸다.
도 4에 표시되는 바와 같이, C-274와 H-271,의 혼합물(몰비 1:10)을 고정화한 플레이트을 이용한 경우에는 H-271 단독을 고정화한 것에 비하여 감염 효율이 크게 상승하였다. 또한, C-274 단독을 고정화한 플레이트에서는 유전자 도입은 나타나지 않았다.
(4) C277-CS1을 이용한 유전자 도입
세포 결합 부위를 갖는 물질로서 C277-CS1을 이용하여, 이것을 레트로바이러스에 결합 부위를 갖는 물질을 혼합하여 플레이트 상에의 고정화를 행한 경우의 유전자 도입 효율에의 영향을 조사하기 위해서 이하에 표시되는 실험을 행하였다. 레트로바이러스에 결합하는 물질로서는 폴리라이신[(Lys)n, 폴리-L-라이신브롬화수소산염, 분자량 5만~10만, 와꼬 퓨어 케미칼 제품], 및 H-271의 2 종을 이용하고, 또한 세포에는 부유세포인 TF-1세포(ATCC CRL-2003)을 이용하였다. 우선, 실시예2-(9) 기재의 방법에 따라서, 이하에 표시되는 용액으로 플레이트 상에의 고정화를 행하였다. 33pmol/㎠(1.1㎍/㎠)의 C277-CS1, 133pmol/㎠(10㎍/㎠)의 폴리라이신, 33pmol/㎠의 C277-CS1과 133pmol/㎠의 폴리라이신의 혼합물, 333pmol/㎠(10㎍/㎠)의 H-271, 33pmol/㎠의 C277-CS1과 333pmol/㎠의 H-271의 혼합물, 및 33pmol/㎠(2.1㎍/㎠)의 CH-296. 이들의 플레이트 각각에 1×104cfu/의 TKNEO 바이러스, 1×104개의 TF-1세포를 포함하는 RPMI 1640 배지[5ng/ml GM-CFS (페트로텍크사 제품), 50단위/ml 페니실린, 50㎍/ml 스트렙트마이신을 포함함]을 가하여 37℃로24시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 종료 후, 비부착 세포는 경사에 의해서, 또한 플레이트에 부착된 세포는 트립신 처리를 행하여 각각 채취하여, 이것을 합하였다. 얻어진 세포 현탁액중, 1/5 씩을 CH-296을 고정화한 플레이트 2장에 옮겨서 24시간 인큐베이션한 후, 배지를 한쪽은 상기의 배지, 다른 한쪽은 최종농도 0.75㎎/ml의 G418을 포함하는 상기의 배지로 교환하여 37℃로 8일간 배양하여, 출현한 콜로니수를 세었다. G418의 존재하, 부재하에 출현한 콜로니수로부터 G418 내성 콜로니의 출현율(유전자 도입 효율)을 산출하였다.
도 5에 얻어진 결과를 표시한다. 그림중, 횡축은 사용한 기능성 물질, 종축은 유전자 도입 효율을 각각 나타낸다. 또한 도5의 (a)는 레트로바이러스 결합성 물질로서 폴리라이신을 이용한 경우, (b)는 H-271을 이용한 경우이다. 세포로 결합 부위를 갖는 C277-CS1을 폴리라이신, 또는 H-271과 병용함으로서, 유전자 도입 효율은 이들의 레트로바이러스 결합성 물질만을 고정화한 플레이트에 비하여 현저하게 상승하는 것이 나타났다.
(5) 에리스로포이에틴 유도 폴리펩티드의 조제
에리스로포이에틴에 대한 리셉터를 갖는 세포내로의 유전자 도입에 사용하기 위해, 에리스로포이에틴을 글루타치온-S-트랜스페라제와의 융합 폴리펩티드로 한 유도체 폴리펩티드, GST-Epo를 조제하였다. 서열표의 서열번호 34에 GST-Epo의 아미노산 서열을 표시한다. 상기 서열 중 233번째~398번째의 아미노산 서열이 에리스로포이에틴에 상당한다.
우선, GST-Epo를 발현시키기 위한 플라스미드를 이하에 표시되는 조작에 따라 구축하였다. 인간태아간 유래의 cDNA라이브러리(클론테크사 제품)를 주형으로 하여, 프라이머 EPF1, EPR1(서열표의 서열번호 35, 36에 각각 프라이머 EPF1, EPR1의 염기 서열을 표시한다)을 이용한 PCR을 행하였다. 이 반응액의 일부를 뽑아 이것을 주형으로 하여, 프라이머 EPF2, EPR2(서열표의 서열번호 37, 38에 각각 프라이머 EPF2, EPR2의 염기서열을 표시한다)을 이용하여 재차 PCR을 행하였다. 이 반응액으로부터 증폭 DNA 조각을 회수하여, 이것을 EcoRI, BamHI(모두 타카라 슈조사제품)으로 분해한 후, 아가로스 겔 전기영동을 행하여 에리스로포이에틴을 코드하는 영역을 포함하는 약 520bp의 DNA 조각을 회수하였다. 얻어진 조각을 EcoRI(타카라 슈조사제품), BamHI로 분해한 플라스미드 벡터 pTV118N(타카라 슈조사 제품)과 혼합하여 라이게이션을 행한 후, 대장균 JM118에 도입하였다. 얻어진 형질전환체로부터 상기의 DNA조각을 포함하는 플라스미드를 보유하는 것을 선택하여, 플라스미드를 조제하여 이것을 플라스미드 pEPO라고 명명하였다. 다음으로, 이렇게 하여 얻어진 플라스미드 pEPO를 EcoRI, SalI(타카라 슈조사 제품)으로 분해한 후, 아가로스겔 전기영동을 행하여 약 0.5kb의 DNA 조각을 회수하였다. 이 조각을 EcoRI, SalI로 분해한 플라스미드벡터 pGEX5X-3(파마시아사제품)과 혼합하여 라이게이션을 행한 후, 대장균 JM109에 도입하였다. 얻어진 형질전환체로부터 상기의 DNA 조각을 포함하는 플라스미드를 보유하는 것을 선택하여, 이 플라스미드를 조제하여 이것을 플라스미드 pGSTEPO라고 명명하였다. 상기 플라스미드에는 벡터 유래의 글루타치온-S-트랜스페라제의 C말단부분에 에리스로포이에틴의 아미노산 서열이 삽입된 융합폴리펩티드, GST-Epo가 코드되어 있다. 플라스미드 pGSTEPO 상의 GST-EPO를 코드하는 염기서열을 서열표의 서열번호 39에 표시한다.
폴리펩티드GST-Epo는 이하에 표시되는 조작에 의해서 조제한다. 100㎍/ml의 앰피실린을 함유하는 5ml의 LB배지를 7개 준비하여, 각각에 상기의 플라스미드pGSTEPO로 형질전환된 대장균 JM109/pGSTEPO를 접종하여 37℃로 하룻밤 배양하였다. 다음으로, 동일한 배지 500ml씩을 넣은 2 리터용 삼각 플라스크를 7개 준비하여, 이것에 상기의 배양액 5ml씩을 접종하여 37℃로 배양하였다. 배양 개시로부터 3.5 시간 후에 최종농도 1mM가 되도록 IPTG를 첨가하여, 3.5시간 더 배양하였다. 배양종료후, 원심분리를 행하여 배양액으로부터 균체를 회수하여, 이것을 1mM PMSF 및 1mM EDTA를 포함하는 100ml의 PBS에 현탁하여, 초음파 처리를 행하여 균체를 파쇄하였다. 얻어진 파쇄액에 1mM PMSF, 1mM EDTA 및 2%의 트리톤 X-100을 포함하는 100ml의 PBS를 가하여, 얼음 상에 30분간 방치한 후에 원심 분리를 행하여 상층액을 모았다. 얻어진 상층액을 0.45㎛의 필터(밀리포어사 제품)로 여과한 후, PBS로 평형화한 글루타치온-세파로스 4B 컬럼(파마시아사제 품, 3ml)에 가하였다. 칼럼을 PBS로 세정후, 10mM 글루타치온을 포함하는 50mM 트리스-HCl, pH8.0을 이용하여 용출을 행하였다. 용출액을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하여, 분자량 4.4만의 폴리펩티드를 포함하는 분획을 모아 이것을 PBS에 대해서 투석하였다. 투석후의 시료를 PBS로 평형화한 Resource Q 컬럼(파마시아사제품, 6ml)에 가하고, 칼럼을 PBS로 세정후, 0~0.6M NaCl농도구배를 갖는 PBS에 의해 용출을 행하였다. 상기와 동일하게 글루타치온을 포함하는 50mM 트리스-HCI, pH8.0을 이용하여 용출을 행하였다. 분자량 약 4.4만의 폴리펩티드를 포함하는 분획을 모아, 이것을 센트리콘10(아미콘사제품)을 이용한 한외(한계)여과에 의해 50㎕까지 농축하여, 울트라프리C3GVSTRL(밀리포아사제품)을 이용하여 여과한 후, 여액을 슈퍼텍스200컬럼(파마시아사 제품, PBS로 평형화)을 이용한 겔 여과 크로마트그라피에 가하였다. 분자량 약 4.4만의 폴리펩티드를 포함하는 용출 분획을 모아, 이것을 GST-Epo 폴리펩티드 용액으로서 이후의 실험에 사용하였다. 이 GST-Epo 용출액 중에는 총단백의 약 50%의 GST-Epo가 포함되어 있었다.
(6) 에리스로포이에틴 리셉터 발현 세포내로의 유전자 도입
세포 결합 활성을 갖는 기능성 물질로서 에리스로포이에틴을 사용한 경우의 유전자 도입에의 효과를, 에리스로포이에틴의 리셉터를 발현하는 TF-1, 및 에리스로포이에틴의 리셉터를 발현하지 않는 HL-60(ATCC CCL-240)의 2종의 세포를 이용하여 조사하였다. 또한, 에리스로포이에틴으로서는 상기의 에리스로포이에틴 유도체 폴리펩티드 (GST-Epo)을, 또한, 레트로바이러스에 결합하는 물질로서 폴리라이신을 각각 사용하였다. 우선, 실시예2-(9) 기재의 방법에 따라서, 34pmol/㎠(1.5㎍/㎠)상당의 GST-Epo, 133pmol/㎠(10㎍/㎠)의 폴리라이신 및 34pmol/㎠의 GST-Epo와 133pmol/㎠의 폴리라이신의 혼합물의 각각을 이용하여 플레이트에의 고정화를 행하였다. 이들의 플레이트를 각각에 1×104cfu/의 TKNEO바이러스, 및 1×104개의 TF-1세포를 포함하는 배지를 가하여 37℃로 24시간 인큐베이션하였다. 또한 배지로서는, TF-1에 대해서는 RPMI 1640배지(5ng/ml GM-CFS, 50단위/ml페니실린, 50㎍/ml스트렙트마이신을 첨가한 것), HL-60에는 RPMI배지(닛스이사 제품, 10% FCS, 50단위/ml 페니실린, 50㎍/ml 스트렙트마이신을 첨가한 것)을 각각 사용하였다. 인큐베이션종료후, 비부착 세포는 경사에 의해서, 또한 플레이트에 부착한 세포는 트립신처리를 행하여 각각 채취하여, 이것을 합하였다. 각 플레이트로부터 얻어진 세포 현탁액 중, 1/5 씩을 CH-296을 고정화한 플레이트 2장에 옮겨서 24시간 인큐베이션한 후, 배지를 한쪽은 상기의 배지, 다른 한쪽은 최종 농도 0.75㎎/ml의 G418을 포함하는 상기의 배지로 교환하여 37℃로 8일간 배양하여, 출현한 콜로니 수를 세었다. G418의 존재하, 부재하에 출현한 콜로니 수로부터 G418 내성 콜로니의 출현율(유전자 도입 효율)을 산출하였다.
도 6에 얻어진 결과를 표시한다. 그림중, 횡축은 사용한 기능성 물질, 종축은 유전자 도입 효율을 각각 나타낸다. 또한 도6의 (a)에 표시한 TF-1세포의 경우, 폴리라이신만을 고정화한 플레이트에 있어서도 어느 정도의 유전자 도입이 일어나고 있지만, GST-Epo가 공존하는 경우에는 이것보다도 높은 유전자 도입 효율이 얻어졌다. 한편, 도6 (b)에 나타낸 HL-60 세포에서는, GST-Epo의 공존에 의한 유전자 도입 효율의 상승은 볼 수 없었다. 이상의 결과로부터, 에리스로포이에틴을 이용함으로서, 표적으로 하는 세포에 특이적인 유전자 도입이 가능한 것으로 나타났다.
더욱이, 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 물질을 H2-527을 대신하여 TF-1세포내로의 유전자 도입실험을 행하였다. 실시예2-(9) 기재의 방법에 따라서, 333pmol/㎠(20㎍/㎠)의 H2-547, 34pmol/㎠(1.5㎍/㎠)상당의 GST-Epo, 및 34pmol/㎠의 GST-Epo와 333pmol/㎠(20㎍/㎠)의 H2-547의 혼합물의 각각을 이용하여 플레이트에의 고정화를 행하였다. 동시에 BSA를 고정화한 플레이트를 사용한 대조 실험도 행하였다. 도 7에 얻어진 결과를 나타낸다. 도면 중, 횡축은 플레이트에 고정화된기능성 물질, 횡축은 유전자 도입 효율을 각각 나타낸다. 그림에 나타나는 바와 같이 H2-547을 사용한 경우에도 GST-Epo의 공존에 의한 TF-1 세포내로의 유전자 도입 효율이 향상된 것으로 나타났다.
(7) 기능성 물질의 혼합물을 고정화한 비드을 이용한 유전자 도입
세포 결합 부위를 갖는 물질과 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 물질의 양자를 고정화한 비드를 이용하여, 레트로바이러스 감염 효율을 높이는 것이 가능한지를 조사하였다.
폴리펩티드를 고정화한 비드는 이하에 나타나는 방법에 의해 조제하였다. 비드에는 입자 지름 1.14㎛의 폴리스티렌 비드(폴리비드 폴리스티렌 마이크로스페아, 폴리사이언스사 제품)을 이용하였다. 상기 비드의 2.5% 현탁액 20㎕에 에탄올 80㎕, 및 각종 폴리펩티드의 PBS용액 2ml를 가하여 4℃로 하룻밤 방치한 후, BSA 및 PBS를 가하여 4ml의 1% BSA/PBS 현탁액으로 하였다. 이 현탁액으로부터 원심 분리에 의해 회수한 비드를 재차 5 ml의 1% BSA/PBS에 현탁하여, 실온에서 1시간 방치하고 폴리펩티드 고정화 비드의 현탁액을 얻었다. 폴리펩티드 용액으로서는 100㎍/mlC-274, 100㎍/mlH-271, 100㎍/mlCH-271, 100㎍/mlCH-296, 및 100㎍/mlH-271과 10㎍/mlC-274의 혼합물을 이용하고, 또 대조로서 2% BSA 용액을 사용하여 고정화를 행한 비드도 동일하게 조제하였다.
조제된 폴리펩티드 고정화 비드 중, 1/10의 양을 상기의 현탁액으로부터 회수하여, 각각을 2000개의 TF-1세포, 1000 cfu의 TKNEO 바이러스 상층액과 함께 37℃로 하룻밤 배양하였다. 세포를 회수하여, 0.3% Bacto Agar(디프코사 제품)을 포함하는 RPMI배지[10%FCS, 5ng/ml GM-CFS(페트로테크사 제품), 50 단위/ml 페니실린, 50 ㎍/ml 스트렙트마이신을 첨가한 것]에 현탁하여, 이것을 미리 0.5% Bacto Agar를 포함하는 상기의 RPMI배지로 만든 35㎜ 플레이트상에 감았다. 또한, 배지는 0.75㎎/ml G418을포함한 것, 포함하지 않은 것의 2 가지를 사용하였다. 플레이트를 5% CO2중, 37℃로 14일간 인큐베이션한 후, G418의 존재하, 부재하에 출현한 콜로니를 계수하여, G418 내성 콜로니의 출현율(유전자 도입 효율)을 산출하였다.
도 8에 결과를 표시한다. 그림중, 횡축은 비드에 고정화된 기능성 물질, 종축은 유전자 도입 효율을 각각 나타낸다. H-271과 C-274의 혼합물을 고정화한 비드을 사용한 경우에는, H-271만이 고정화된 비드, 동일 분자중에 레트로바이러스 결합 부위와 세포 결합 부위의 양쪽을 갖는 CH-271이나 CH-296이 각각 고정화된 비드을 이용한 경우에 비하여 높은 유전도입 효율이 얻어졌다.
실시예4
(1) FGF, C-FGF·A를 이용한 유전자 도입
FGF(벡톤·디킨슨사 제품), 및 서열표의 서열 번호 4에 나타난 폴리펩티드(C-FGF·A)의 레트로바이러스 감염에 대한 영향을 NIH/3T3세포 콜로니 형성 분석에 의해 조사하였다. 즉, 실시예 2-(9) 기재의 방법에 의해 132 pmol/㎠(2.25㎍/㎠)의 FGF, 및 133pmol/㎠(6.3㎍/㎠)의 C-FGF·A의 각각을 이용하여 고정화를 행한 플레이트, 및 BSA를 고정화한 대조 플레이트의 각각에 1000cfu의 PM5neo 바이러스를 포함하는 2ml의 바이러스 상층액을 가하여 37℃, 30분간 예비 인큐베이션한 후, PBS를 이용하여 플레이트를 철저하게 세정하였다. 이 플레이트에2000개의 NIH/3T3 세포를 포함하는 2ml의 DMEM배지를 가하여 37℃, 24시간 인큐베이션하고, 그 후 0.75㎎/ml의 G418을 포함하는 선택 배지 중에서 10일간 증식시키고, 그것에 계속해서 콜로니를 염색하여, 계수하였다. 도 9에 얻어진 결과를 나타낸다. 도면 중, 횡축은 플레이트에 고정화된 기능성 물질, 종축은 출현한 G418 내성 콜로니수를 각각 나타낸다.
도 9에 나타내는 바와 같이, 대조군으로 사용한 BSA 고정화 플레이트에서는 콜로니가 출현하지 않았는데 비하여, FGF, 및 C-FGF·A를 고정화한 플레이트를 이용한 경우에는 G418 내성 콜로니의 출현이 확인되었다. 이 결과로부터 FGF, C-FGF·A가 레트로바이러스 결합 부위를 갖고 있는 것, 및 피브로넥틴의 세포 결합 부위 폴리펩티드가 부가된 C-FGF·A는 유전자 도입에 있어서 FGF보다 우수한 효과를 갖는 것이 나타났다.
(2) 플레이트에의 고정화에 사용한 C-FGF·A농도와 유전자 도입 효율과의 관계
갖가지 농도의 C-FGF·A로 고정화를 행한 플레이트에서의 유전자 도입 효율의 비교를 행하였다. 즉 실시예 2-(9) 기재의 방법에 따라서, 0.521 pmol/㎠(0.0247㎍/㎠)~5.21pmol/㎠(0.247㎍/㎠)의 C-FGF·A를 이용하여 고정화를 행한 플레이트, 및 BSA 고정화 플레이트(대조 플레이트)를 이용하여, 실시예4-(1)과 동일한 조작으로 레트로바이러스의 감염을 행하였다. 바이러스 감염 처리후, 비부착세포는 경사에 의해, 또한 플레이트에 부착한 세포는 트립신 처리에 의해 플레이트로부터 분리시킴으로써 각각 채취하여, 양자를 합하였다. 얻어진 세포 현탁액을 2등분하여 한쪽을 DMEM, 다른 한쪽을 최종농도 0.75㎎/ml의 G418을 포함하는 DMEM과 함께 37℃로 10일간 배양한 후, 출현한 콜로니수를 계수하여, G418을 포함하지 않는 배지에서 얻어진 콜로니 수에 대한 G418 내성 콜로니수의 비율을 유전자 도입 효율로 하였다.
얻어진 결과를 도10에 나타낸다. 도면 중, 횡축은 플레이트의 고정화 조작에 사용된 C-FGF·A의 농도, 횡축은 유전자 도입 효율을 각각 나타낸다. 또한, 대조플레이트에서의 실험 결과는 폴리펩티드 농도 0μmol/㎠로서 플로트(plot)하였다. 도10에 나타난 바와 같이, 고정화에 사용한 C-FGF·A의 농도 의존적으로 유전자 도입 효율의 상승을 볼 수 있었다.
(3) HL-60세포내로의 유전자 도입
부유세포인 HL-60세포(ATCC CCL-240)에의 레트로바이러스의 감염에 관하여, 각종 폴리펩티드의 존재의 효과를 이하에 나타내는 조작에 의해서 조사하였다. 즉, 100pmol/㎠의 C-FGF·A(4.8㎍/㎠), 및 C-FGF-CS1(5.1㎍/㎠)을 이용하여 실시예2-(9) 기재의 방법으로 고정화를 행한 플레이트, 및 BSA를 고정화한 대조 플레이트의 각각에 1×104cfu/의 TKNEO 바이러스, 2000개의 HL-60 세포를 포함하는 2ml의 RPMI 배지(10%FCS, 50단위/ml 페니실린, 50㎍/ml 스트렙트마이신을 첨가하여 사용)를 첨가하여 37℃로 24시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 종료 후, 비부착 세포는 경사에 의해, 또한 플레이트에 부착한 세포는 피페팅에 의해 각각 채취하여, 이것들을 합하였다. 얻어진 세포 현탁액 중 1/2 씩을 CH-296 고정화 플레이트로 옮겨서 24시간 인큐베이션한 후, 배지를 최종농도 0.75㎎/ml의 G418을 포함하는 상기의 RPMI배지로 교환하고, 37℃로 12일간 배양하여, 출현한 콜로니 수를 세었다. 각 폴리펩티드를 사용하여 얻어진 G418 내성 콜로니 수를 도 11에 나타낸다. 도면 중, 횡축은 플레이트에 고정화된 기능성 물질, 횡축은 출현한 G418 내성 콜로니 수를 각각 나타낸다.
도 11에 나타내는 바와 같이, BSA 고정화 플레이트를 비교하여 C-FGF·A 및 C-FGF-CS1을 고정화한 플레이트에서는 G418 내성 콜로니 수가 현저하게 상승하고 있고, 이들의 폴리펩티드가 HL-60 세포 내로의 레트로바이러스의 감염을 촉진하고 있는 것으로 나타났다.
(4) 쥐골수 세포내로의 유전자 도입
골수 세포내로의 레트로바이러스 감염에 대한 FGF, C-FGF·A 및 C-FGF-CS1의 효과를 조사하기 위해, 이하의 나타낸 실험을 행하였다.
6 ~ 8 주령의 쥐(C3H/HeJ)에 150 ㎎/㎏의 5-풀오로우라실(5-FU, 암레스코사 제품)을 복강내 투여하여, 2 일후에 대퇴골 및 경골을 적출하여 골수를 채취하였다. 얻어진 골수를 피콜바이팩(밀도 1.0875g/ml, 파마시아사 제품)을 이용한 밀도구배 원심분리를 행하여, 저밀도 단핵 세포 분획을 조제하여 이것을 쥐골수 세포로 하였다.
쥐골수 세포는 루스키(Luskey)등의 방법 (Blood, 제80권, 제396~402페이지, 1992년)에 따라서, 레트로바이러스 감염전에 예비자극을 행하였다. 즉, 20%FCS, 100단위/ml 재조합 인간 인터류킨-6(rhIL-6, 암젠사 제품), 100ng/ml 재조합 쥐간세포 인자(rmSCF, 암젠사 제품), 50 단위/ml의 페니실린 및 50㎍/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 α-MEM(기브코사 제품)중에 1×106cells/ml의 세포 밀도로 상기의 쥐골수 세포를 첨가하여, 5% CO2중, 37℃로 48시간 인큐베이션하였다. 예비자극한 세포는 용기에 부착한 것을 포함하여, 피펫을 이용하여 흡인, 채집하였다.
실시예 2-(9) 기재의 방법에 따라서, 236 μmol/㎠(4㎍/㎠)의 FGF, 169 pmol/㎠(8㎍/㎠)의 FGF·A, 혹은 159 μmol/㎠(8㎍/㎠)의 C-FGF-CS1을 이용하여 고정화를 행한 플레이트, 및 BSA 고정화 플레이트 (대조 플레이트)에 1×106개의 예비자극한 세포와 1×104cfu의 PM5neo 바이러스를 포함하는 상기의 예비자극에 이용되는 배지 2ml를 첨가하여 37℃로 인큐베이션하였다. 2 시간 후에 동량의 바이러스를 포함하는 동일한 배지(2ml)를 새롭게 플레이트에 추가하여, 22 시간 더 인큐베이션를 계속하였다. 인큐베이션 종료후, 비접착 세포는 경사에 의해, 또한 플레이트에 접착한 세포는 세포해리 완충액(CDB, 효소를 포함하지 않는 것, 기브코사 제품)을 사용하여 각각 채집하여, 이것들을 합쳐서 동 완충액으로 2회 세정한 후, 세포수를 계수하였다. 채집한 세포는 HPP-CFC(High Proliferative Potential-Colony Forming Cells, 고증식 능력 콜로니 형성 세포) 분석 평가에 제공하였다.
HPP-CFC 분석 평가는 브래들리(Bradley) 등의 방법(Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 제44권, 제287~293페이지, 1966년)에 따라서 행하였다. 배지에는 1%/0.66% 중층 연한천(重層軟寒天) 배지를 사용하여, 최종농도 1.5㎎/ml의 G418을 포함하는 것, 및 포함하지 않는 것의 2 가지를 이용하였다. 1 웰 당 1×104개의 감염 세포를 첨가하여, 10% CO2중, 37℃로 13일간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 종료후, 출현한 콜로니를 도립 현미경으로 관찰하여, HPP-CFC유래의 고밀도 콜로니 (지름 0.5㎜이상)을 계수하여 G418 내성 콜로니의 출현율(유전자 도입 효율)을 계산하였다. 얻어진 결과를 도12에 나타낸다. 도면 중, 횡축은 사용한 기능성 물질, 횡축은 유전자 도입 효율을 나타낸다.
도 12에 나타내는 바와 같이, 대조로서 사용한 BSA 고정화 플레이트에서는 G418 내성 콜로니는 출현하지 않았음에 비하여, 상기의 각 폴리펩티드를 고정화한 플레이트를 사용한 경우에는 G418 내성 콜로니가 얻어졌다. 또한 유전자 도입 효율은 FGF, C-FGF·A, C-FGF-CS1의 순으로 높았으며, 세포내로의 결합 활성을 갖는 피브로넥틴 유래의 세포 결합 부위 폴리펩티드, 및 CS-1 폴리펩티드 부분의 존재가 골수 세포내로의 레트로바이러스의 감염 효율을 상승시켰다.
(5)플레이트의 고정화에 사용하는 C277-ColV 농도와 유전자 도입 효율과의 관계
여러 가지 농도의 C277-ColV를 이용하여 고정화를 행한 플레이트에서의 유전자 도입 효율의 비교를 이하에 나타내는 조작에 의해 행하였다. 0.1 pmol/㎠(0.1㎍/㎠) ~ 416 pmol/㎠(20㎍/㎠)의 C277-CS1을 이용하여 실시예 2-(9) 기재의 방법에 의해 플레이트에의 고정화를 행하였다. 이들의 플레이트의 각각에 1000 cfu의 PM5neo 바이러스를 포함하는 2ml의 바이러스 상층액을 가하여 37℃, 30분간 예비 인큐베이션한 후, PBS를 이용하여 플레이트를 철저하게 세정하였다. 이 플레이트에 2000 개의 NIH/3T3 세포를 포함하는 2ml의 DMEM 배지를 가하여 37℃,24 시간 인큐베이션한 후, 비부착세포는 경사에 의해, 또한 플레이트에 부착한 세포는 트립신처리후에 플레이트로부터 분리시킴으로서 각각 채취하고, 이것들을 합하였다. 얻어진 세포 현탁액을 2 등분하여, 한쪽은 DMEM, 다른 한쪽에는 최종농도 0.75 ㎎/ml의 G418을 포함하는 DMEM을 가하여 37℃로 10일간 배양하여, 출현한 콜로니 수를 계수하였다. G418을 포함하지 않는 배지에서 얻어진 콜로니 수에 대한 G418 내성 콜로니수의 비율을 유전자 도입 효율로 하여, 그 결과를 도 13에 나타낸다. 도면 중, 횡축은 사용한 기능성 물질, 종축은 유전자 도입 효율을 나타낸다.
도 13에 나타낸 바와 같이 C277-ColV를 고정화한 플레이트를 이용한 경우, 고정화에 사용한 C277-ColV의 농도 의존적으로 유전자 도입 효율이 상승하였다.
(6) 폴리라이신을 이용한 유전자 도입
폴리라이신[(Lys)n]과 레트로바이러스와의 결합을 이하에 나타내는 조작에 의해 조사하였다. 폴리라이신으로서는 폴리-L-라이신 브롬화수소산염(분자량 5만~10만, 와꼬 퓨어 케미컬 제품)을 사용하였다. 우선, 133 pmol/㎠(10㎍/㎠)의 PBS용액으로 한 폴리라이신을 이용하여, 실시예2-(9) 기재의 방법에 의해서 플레이트에의 고정화를 행하였다. 이 플레이트 및 BSA를 고정화한 대조 플레이트의 각각에 대해서 실시예 4-(2) 기재의 방법으로 유전자 도입 효율을 평가하였다. 그 결과를 도 14에 나타낸다. 도면 중, 횡축은 사용한 기능성 물질, 종축은 유전자 도입 효율을 나타낸다.
도 14에 나타나는 바와 같이 BSA를 이용한 대조 플레이트에서는 콜로니를 볼 수 없었음에 대하여, 폴리라이신을 고정화한 플레이트에서는 G418 내성 콜로니의출현이 확인되었다. 이 것은 레트로바이러스가 플레이트에 고정화된 폴리라이신에 결합하기 위해, 세정후의 플레이트 상에 레트로바이러스가 잔존하고 있는 것을 나타내고 있다.
실시예 5
(1) 폴리펩티드의 중합체를 이용한 유전자 도입
폴리펩티드의 중합체를 이용한 유전자 도입은, 각 폴리펩티드를 플레이트상에 고정되지 않는 상태에서 사용하여 실시하였다. 실시예 2-(9) 기재의 방법으로 미리 BSA를 고정화시킨 플레이트에 1000 pfu의 PM5neo 바이러스, 2000 개의 NIH/3T3 세포, 및 최종농도 0.63 nmol/ml의 각 폴리펩티드(H-271, CH-271, H2-547, CH2-826)을 포함하는 2ml의 DMEM 배지를 가하여 37℃, 25 시간 인큐베이션한 후, 비부착 세포는 경사에 의해, 또한 플레이트에 부착한 세포는 트립신 처리에 의해 플레이트로부터 분리함으로써 각각 채취하여, 양자를 합하였다. 또한 대조로서 폴리펩티드를 첨가하지 않은 것에 대해서도 동일한 조작으로 도입 실험을 행하였다. 얻어진 세포 현탁액을 2등분하여 한쪽은 DMEM, 다른 한쪽을 최종농도 0.75㎎/ml의 G418을 포함하는 DMEM과 함께 37℃로 10일간 배양하여, 출현한 콜로니 수를 세었다. G418을 포함하지 않은 배지에서 얻어진 콜로니 수에 대한 G418 내성 콜로니수의 비율을 유전자 도입 효율로 하여, 그 결과를 도 15에 나타낸다. 도면 중, 횡축은 사용한 기능성 물질, 종축은 유전자 도입 효율을 나타낸다.
도 15에 나타내는 바와 같이, H2-547 존재하에서의 유전자 도입 효율은 CH-271 존재하에 비하여 현저하게 높고, 또한 CH2-826에서도 CH-271과 동등 혹은 그이상의 유전자 도입 효율이 얻어졌다.
더욱 자세하게 검토하였다. 폴리펩티드로서 CH-271, CH-296, H2-547을 사용하여, 각각 플레이트당 0.126nmol(최종농도 0.063 nmol/ml), 1.26nmol(최종농도 0.63 nmol/ml)의 2가지의 양으로 이용한 것을 제외하고는 상기와 동일하게 조작하였다. 도 16에 얻어진 결과를 나타낸다. 도면 중, 횡축은 기능성 물질과 그 양, 횡축은 유전자 도입 효율을 나타낸다.
도 16에 나타내는 바와 같이 H2-547을 이용한 경우에는, 이용한 2가지의 폴리펩티드량 모두 다 CH-271, CH-296에 비하여 유의성 있게 높은 유전자 도입 효율이 얻어졌다.
(2) H2S-573을 이용한 쥐골수 세포내로의 유전자 도입
골수 세포내로의 레트로바이러스 감염에 대한 H2S-573의 효과를 조사하기 위해, 실시예 4-(4) 기재의 방법으로 쥐골수 세포 내로의 유전자 도입을 실험하였다.
쥐골수 세포는 상기 실시예 기재의 방법에 따라서 조제하여, 예비 자극을 행하였다. 또한, 레트로바이러스 감염시의 플레이트에는 H2S-573 [160pmol/㎠(10㎍/㎠)]을 고정화한 것외에, CH-296 [132pmol/㎠(8.3㎍/㎠)]을 고정화한 것, 및 대조로서 BSA를 고정화한 것을 이용하였다. HPP-CFC 분석평가에 의해 얻어진 결과를 도 17에 나타낸다. 도면 중, 횡축은 기능성 물질, 종축은 유전자 도입 효율을 나타낸다.
도 17에 나타내는 바와 같이, 대조로서 사용한 BSA 고정화 플레이트에서는 G418 내성의 고밀도 콜로니의 출현은 보이지 않았다. CH-296 고정화 플레이트에서는 약 50%의 유전자 도입 효율이 얻어졌으나, H2S-573 고정화 플레이트를 이용한 경우에는 이것보다도 높은 효율로 G418 내성의 고밀도 콜로니가 얻어졌다.
실시예 6
(1) 비고정의 기능성 물질을 이용한 유전자 도입
폴리펩티드가 플레이트 상에 고정되지 않은 상태에서 공존하는 경우에 레트로바이러스의 감염 효율에 미치는 효과에 대해서 이하와 같이 조사하였다. 즉, 실시예 2-(9) 기재의 방법에 의해 미리 BSA를 고정화하여 둔 플레이트에 100cfu의 PM5neo 바이러스, 2000 개의 NIH/3T3 세포, 및 최종농도 10, 40, 250 ㎍/ml(각각 0.158, 0.632, 3.950 nmol/ml에 상당)의 CH-296을 포함하는 2ml의 DMEM 배지를 가하여 24시간 인큐베이션한 후, 비부착 세포는 경사에 의해, 또한 플레이트에 부착한 세포는 트립신 처리후에 플레이트로부터 분리시킴으로서 각각 채취하여, 양자를 합하였다. 얻어진 세포 현탁액을 10㎝ 세포배양 플레이트에 옮겨 24시간 동안 인큐베이션한 후, 배지를 최종농도 0.75 ㎎/ml의 G418을 포함하는 DMEM으로 교환하여 10일간 더 배양하였다. 또한 대조로서 CH-296을 첨가하지 않은 것, 및 32 pmol/㎠(2㎍/㎠), 127 pmol/㎠(8㎍/㎠)의 CH-296을 고정화한 플레이트를 이용하여 이것에 바이러스 상층액과 세포를 가한 것에 대해서 상기와 동일하게 조작하였다. 이렇게 하여 얻어진 G418 내성 콜로니의 수를 세어, 결과를 표 1에 정리하였다.
| 플레이트 | CH-296 | G418r콜로니수 |
| BSABSABSABSACH-296(32pmol/㎠)CH-296(127pmol/㎠) | -10㎍/ml40㎍/ml250㎍/ml-- | 54166925547 |
표 1에 나타나는 바와 같이 용액중에 세포, 바이러스, CH-296이 공존하는 경우에는 CH-296 비공존하에 비하여 G418 내성 콜로니 수가 대폭적으로 증가하였다. 또한, 그 수는 CH-296을 고정화한 플레이트를 이용한 경우와 동등하든지, 그렇지 않으면 그것보다도 많았다. 또한, BSA 고정화 플레이트에 상기 각 농도의 CH-296 용액을 첨가하여 잠깐동안 방치한 후에 플레이트를 세정하여 바이러스 감염 실험에 이용한 경우에는, 상기의 CH-296을 첨가하지 않은 경우와 같은 정도의 G418 내성 콜로니 밖에 얻어지지 않은 것으로부터 BSA 고정화 플레이트에는 CH-296이 결합하지 않음을 알 수 있다. 따라서 상기의 CH-296에 의한 레트로바이러스 감염 촉진 효과는 인큐베이션 중에 용액중의 CH-296이 플레이트에 결합하여 초래된 것은 아니라고 생각되어진다.
(2) 비고정의 기능성 물질을 이용한 유전자 도입
폴리펩티드가 플레이트상에 고정되지않은 상태에서 공존하는 경우에 레트로바이러스의 감염 효율에 미치는 효과에 대해서 다음과 같이하여 조사하였다. 즉, 실시예 2-(9) 기재의 방법에 따라서 미리 BSA를 고정화하여 둔 플레이트에 1000 cfu의 PM5neo 바이러스, 2000개의 NIH/3T3세포, 및 최종농도 1.67 nmol/ml의 C-FGF·A, ColV, C277-ColV를 각각 포함하는 2ml의 DMEM 배지를 가하여 37℃, 24 시간인큐베이션한 후, 비부착 세포는 경사에 의해, 또한 플레이트에 부착한 세포는 트립신 처리후에 플레이트로부터 분리시킴으로써 각각 채취하여, 양자를 합하였다. 얻어진 세포 현탁액을 이등분하여 한쪽은 DMEM, 다른 한쪽은 최종농도 0.75 ㎎/ml의 G418을 포함하는 DMEM과 함께 37℃로 10일간 배양하여, 출현한 콜로니 수를 세었다. G418을 포함하지 않는 배지에서 얻어진 콜로니 수에 대한 G418 내성 콜로니수의 비율을 유전자 도입 효율로 하여, 그 결과를 도18에 나타낸다. 도면 중, 횡축은 사용한 기능성 물질, 종축은 유전자 도입 효율을 나타낸다.
도 18에 나타내는 바와 같이, 각 폴리펩티드가 바이러스 감염시에 공존하는 경우에는 높은 유전자 도입 효율이 얻어지고 있고, 이들의 폴리펩티드가 플레이트상에 고정되지않은 상태에서도 레트로바이러스 감염의 촉진 효과를 갖는 것이 분명해 졌다.
(3) 비고정 기능성 물질을 이용한 부유세포내로의 유전자 도입
비고정의 폴리펩티드가 부유 세포내로의 유전자 도입 효율에 미치는 효과에 대하여 다음과 같이 조사하였다. 즉, 실시예 2-(9) 기재의 방법에 따라서 333 pmol/㎠(10㎍/㎠)의 H-271을 고정화한 플레이트 및 BSA를 고정화한 플레이트의 각각에 1×104cfu/의 TKNEO 바이러스, 1×104개의 TF-1 세포를 2ml의 RPMI1640 배지[5ng/ml GM-CFS, 50단위/ml 페니실린, 50㎍/ml 스트립트마이신을 포함하는 것]을 가하여, BSA를 고정화한 플레이트에는 최종농도 50 ㎍/ml(1.67nmol/ml)의 H-271을 가하여 37℃로 24시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 종료후, 비부착 세포는 경사에 의해, 또한 플레이트에 부착한 세포는 트립신 처리를 행하여 각각 채취하여,이것들을 합하였다. 얻어진 세포 현탁액중, 1/5 씩을 CH-296을 고정화한 플레이트 2장에 옮겨서 24시간 인큐베이션한 후, 배지를 한쪽은 상기의 배지, 다른 한쪽은 최종 농도 0.75㎎/ml의 G418을 포함하는 상기의 배지에 교환하여 37℃로 8 일간 배양하여, 출현한 콜로니 수를 세었다. G418의 존재하 및 부재하에 출현한 콜로니 수보다 G418 내성 콜로니의 출현율(유전자 도입 효율)을 산출하였다. 얻어진 결과를 도 19에 나타낸다. 도면 중, 횡축은 사용한 기능성 물질과 그 사용태양, 종축은 유전자 도입 효율을 나타낸다.
도 19 에 나타내는 바와 같이, 비고정의 H-271을 사용한 경우에는 H-271을 고정화한 플레이트 보다도 높은 유전자 도입 효율이 얻어지고 있고, TF-1 세포내로의 유전자 도입에 H-271을 사용할 때에는, 비고정의 상태의 쪽이 바람직하는 것으로 나타났다.
(4) 폴리펩티드에 의한 레트로바이러스 감염 촉진의 기구의 해명
상기 실시예에 나타난, 비고정의 폴리펩티드에 의한 세포내로의 레트로바이러스 감염의 촉진이 세포와 폴리펩티드와의 결합, 및 폴리펩티드와 레트로바이러스와의 결합을 사이에 두고 일어나고 있는 것을 확인하기 위해서 이하에 나타내는 바와 같이 실험을 행하였다. 우선, 실시예 2-(9) 기재의 방법으로 조제한 BSA 고정화 플레이트에 1000개의 NIH/3T3 세포를 포함하는 2ml의 DMEM을 가하여, 37℃로 24시간 생육시켰다. 이 플레이트로부터 배지를 제외하고, 각각 2ml의 1.67 nmol/ml의 H-271, CH-271, C-FGF·A 및 대조로서 PBS를 가하여 37℃, 2.5 시간 동안 인큐베이션한 후, 25mM HEPES를 포함하는 행크스(Hank's) 평형 염류 용액(HBSS, 기브코사제품)으로 플레이트를 세정하였다. 다음으로 1000 cfu의 PM5neo 바이러스를 포함하는 2ml이 바이러스 상층액을 플레이트에 가하여 37℃, 30분간 인큐베이션한 후, PBS로 플레이트를 세정하였다. 이 플레이트에 2ml의 DMEM을 가하여 37℃, 24시간 인큐베이션한 후에 비부착 세포는 경사에 의해, 또한 플레이트에 부착한 세포는 트립신 처리후에 플레이트로부터 분리시킴으로써 각각 채취하여, 양자를 합하였다. 얻어진 세포 현탁액을 2 등분하여 한쪽은 DMEM, 다른 한쪽은 최종농도 0.75 ㎎/ml의 G418을 포함하는 DMEM과 함께 37℃로 10일간 배양하여, 출현한 콜로니 수를 세었다. G418을 포함하지 않은 배지에서 얻어진 콜로니수에 대한 G418 내성 콜로니수의 비율을 유전자 도입 효율로 하여, 그 결과를 도 20에 나타낸다. 도면 중, 횡축은 사용한 기능성 물질, 종축은 유전자 도입 효율을 나타낸다.
도 20에 나타내는 바와 같이 플레이트 상의 세포를 상기의 폴리펩티드 용액으로 처리한 후에 바이러스 감염을 행한 경우에는 현저한 감염 효율의 상승이 보였다. 이 것은 세포에 폴리펩티드가 결합하여, 세포상의 폴리펩티드에 레트로바이러스가 결합함에 따라서 레트로바이러스의 감염효율의 상승이 일어나는 것을 시사하고 있다.
더욱이, 첨가하는 폴리펩티드를, 0.29 nmol/ml의 C-FGF·A, 및 0.79 nmol/ml의 CH-296으로 변경하여, 상기와 동일한 실험을 행하였다. 도 21에 그 결과를 나타낸다. 도면 중, 횡축은 사용한 기능성 물질, 종축은 유전자 도입 효율을 나타낸다. 도 21에 나타내는 바와 같이 C-FGF·A, 및 CH-296을 첨가한 경우에는 유전자 도입 효율의 상승이 보이고 있고, C-FGF·A에 대해서 상기의 활성이 확인됨과 함께, CH-296도 같은 기구로 레트로바이러스의 감염을 촉진하는 활성을 가지는 것이 나타났다.
실시예7
(1) 기능성 물질을 고정화한 비드을 이용한 유전자 도입
기능성 물질을 고정화한 비드을 이용하여 레트로바이러스 감염 효율을 개선시키는 것이 가능한지를 아래에 나타내는 조작에 의해서 조사하였다. 비드에는 입자지름 1.14㎛의 폴리스티렌비드(폴리비드 폴리스티렌 마이크로스페아, 폴리사이언스사 제품)을 이용하였다. 상기 비드 2.5% 현탁액 20㎕에 에탄올 80 ㎕, 및 40 ㎍/ml의 CH-296 용액 2ml를 가하여 4℃로 하룻밤 방치한 후, BSA 및 PBS를 가하여 4ml의 1% BSA/PBS현탁액으로 하였다. 이 현탁액으로부터 원심분리에 의해 회수한 비드를 재차 5ml의 1% BSA/PBS에 현탁하여, 실온으로 1시간 놓아두고 CH-296 고정화 비드의 현탁액을 얻었다. 또한 대조로서 CH-296 용액을 대신해서 2% BSA를 사용하여 고정화 조작을 행한 비드도 동일하게 조제하였다.
상기 비드 혼탁액중, 1/10의 양(0.5 ml)을 뽑아, 이것으로부터 원심 분리에 의해 비드를 회수한 후, 이것에 1000 cfu의 PM5neo 바이러스를 포함하는 DMEM을 가하여 37℃, 30 분간 인큐베이션하였다. 비드를 1% BSA/PBS로 2회 세정후, 2 ml의 DMEM에 현탁하여 1ml를 플레이트로 옮겨, 3×105개의 NIH/3T3 세포를 포함하는 1ml의 DMEM을 가하여, CO2인큐베이터 중, 37℃로 24시간 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 최종 농도 0.75 ㎎/ml의 G418을 포함하는 DMEM으로 교환하여, 10일간 더 배양하여, 출현한 콜로니를 염색, 계수하였다. 표2에 그 결과를 나타낸다.
| 플레이트 | G418내성콜로니수 |
| BSA고정화(대조) | 0 |
| CH-296고정화 | 296 |
(2) 기능성 물질을 고정화한 비드를 이용한 쥐골수 세포내로의 유전자 도입
기능성 물질을 고정화한 비드를 이용한 쥐골수 세포내로의 레트로바이러스 감염 효율을 개선시키는 것이 가능한지의 여부를 아래에 나타내는 조작에 의해서 조사했다.
쥐골수세포는 실시예 4-(4) 기재의 방법에 따라서 조제하여, 예비 자극을 행하였다.
실시예 2-(9) 기재의 방법에 따라서 BSA를 고정화한 플레이트, 이것에 실시예 7-(1) 기재의 방법으로 조제한 CH-296 고정화 비드중, 1/10의 양을 첨가한 것의 각각에 1×104cfu의 PM5neo 바이러스를 포함하는 상기의 예비 자극에 이용된 배지 2ml를 첨가하여 37℃로 인큐베이션하였다. 2시간후에 동량의 바이러스를 포함하는 동일한 배지 (2ml)를 새로이 플레이트에 추가하여, 22 시간 더 인큐베이션를 계속하였다. 인큐베이션 종료후, 비접착 세포는 경사에 의해, 또한 플레이트에 접착한 세포는 세포 해리 완충액(CDB, 효소를 포함하지 않음, 기브코사 제품)을 사용하여 각각 채집하여, 이것들을 합하여 동 완충액으로 2회 세정한 후, 세포수를 계수하였다. 채집한 세포는 실시예 4-(4) 기재의 방법에 따라서 HPP-CFC분석평가에 제공하였다.
결과를 도 22에 나타낸다. 도면 중, 횡축은 사용된 기능성 물질과 그 사용형태, 횡축은 유전자 도입 효율을 나타낸다. 이 결과로부터, CH-296 고정화 비드를 이용한 경우에서도 쥐골수 세포내로의 레트로바이러스 감염 효율을 개선시키는 것으로 이해된다.
실시예8
(1) H-271, 및 CH-271을 이용한 유전자 도입
H-271의 레트로바이러스 감염에 대한 영향을, H-271, 및 레트로바이러스 감염의 촉진을 나타내는 것이 알려져 있는 CH-271을 고정화한 플레이트 중에서 바이러스 상층액을 인큐베이션한 후, 플레이트를 철저하게 세정하고, 거기에 잔존하는 바이러스의 양을 NIH/3T3 세포 콜로니 형성 분석평가로 측정하여, 양자의 결과를 비교함으로서 평가하였다. 즉, 실시예 2-(9) 기재의 방법에 따라서 갖가지 농도의 H-271 [67 pmol/㎠(4㎍/㎠) ~ 333 pmol/㎠(10㎍/㎠)] 및 CH-271 [67 pmol/㎠(4㎍/㎠)~ 333 pmol/㎠ (20㎍/㎠)]을 이용하여 고정화 조작을 행한 플레이트의 각각에 1000 cfu의 PM5neo 바이러스를 포함하는 2ml의 바이러스 상층액을 가하여 37℃, 30분간 인큐베이션한 후, PBS를 이용하여 플레이트를 철저하게 세정하였다. 이 플레이트에 2000개의 NIH/3T3 세포를 포함하는 2ml의 DMEM 배지를 가하여 37℃, 24시간 동안 인큐베이션하고, 그 후 0.75 ㎎/ml의 G418을 포함하는 선택 배지 중에서 10일간 증식시켜, 그것에 계속해서 콜로니를 염색하고, 계수하였다. 그 결과를 도 23에 나타낸다. 도 23은 기능성 물질과 유전자 도입 효율의 관계를 나타내는 도면으로, 횡축은 폴리펩티드의 사용량, 종축은 G418 내성 콜로니수를 나타낸다.
도 23에 나타내는 바와 같이, CH-271을 이용한 경우에는 고정화 조작에 이용한 폴리펩티드 농도에 관계없이 거의 같은 정도의 G418 내성 콜로니가 출현하였다. 이에 대하여, H-271에서는 고정화때의 폴리펩티드 농도를 올림으로서 농도 의존적으로 출현 콜로니 수가 증가하였으며, 333 pmol/㎠로 고정화를 행한 것에서는 CH-271과 같은 정도의 G418 내성 콜로니가 얻어졌다. 이 것은 충분한 양의 H-271을 이용하여 플레이트의 고정화를 행함으로서, CH-271과 실질상 동등한 바이러스 감염효율이 얻어짐을 나타낸다.
(2) C-FGF·A을 이용한 유전자 도입
C-FGF·A폴리펩티드의 레트로바이러스 감염에 대한 영향을 NIH/3T3 세포콜로니 형성 분석평가에 의해서 조사하였다. 즉, 실시예 2-(9) 기재의 방법에 의해 127 pmol/㎠(6㎍/㎠)의 C-FGF·A로 고정화를 행한 플레이트, 127 pmol/㎠(7.6㎍/㎠)의 CH-271로 고정화를 행한 플레이트, 127 pmol/㎠(80㎍/㎠)의 CH-296으로 고정화를 행한 플레이트, 및 BSA를 고정화한 대조 플레이트를 사용한 외에는 실시예 8-(1)과 완전히 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과를 도 24에 나타낸다. 도 24는 기능성 물질과 유전자 도입 효율의 관계를 나타내는 그림이며, 횡축에 사용한 기능성 물질 및 BSA를 , 횡축에 G418 내성 콜로니 수를 나타낸다.
도 24에 나타내는 바와 같이, 대조로서 사용한 BSA를 고정화한 플레이트에서는 콜로니가 출현하지 않았다. 한편, C-FGF·A를 고정화한 플레이트를 이용한 경우에는 G418 내성 콜로니의 출현이 확인되었고, 그 수는 CH-271, 및 CH-296을 이용한 것과 같은 정도였다. 이것은 FGF 분자상에 CH-271, 및 CH-296과 실질적으로 동등한기능을 가지는 레트로바이러스 결합 부위가 존재하고 있는 것을 나타내고 있다.
(3) C-FGF-CS1을 이용한 유전자 도입
C-FGF-CS1 폴리펩티드의 레트로바이러스 감염에 대한 영향을 이하에 나타내는 조작에 의해 조사하였다. 즉, 각각 133 pmol/㎠의 C-FGF-CS1(6.7㎍/㎠), C-FGF·A(6.3㎍/㎠), CH-271(8㎍/㎠), CH-296(8.4㎍/㎠)을 사용하여 실시예 2-(9) 기재의 방법으로 플레이트 고정화를 행하여, 이것을 이용하여 실시예 8-(1)과 동일한 NIH/3T3 세포 콜로니 형성 분석평가를 행하였다. 그 결과를 도 25에 나타낸다. 도 25는 기능성 물질과 유전자 도입 효율의 관계를 나타내는 그림으로, 횡축에 사용한 기능성 물질을, 종축에 G418 내성 콜로니 수를 나타낸다.
도 25에 나타내는 바와 같이, 이것들 4 종의 폴리펩티드를 고정화한 플레이트에서 거의 같은 수의 G418 내성 콜로니가 출현하고 있고, C-FGF-CS1 분자도 다른 폴리펩티드와 실질적으로 동등한 레트로바이러스 결합 활성을 갖고 있음을 나타낸다.
(4) C277-ColV를 이용한 유전자 도입
C277-ColV 폴리펩티드의 레트로바이러스 감염에 대한 영향을, 124 pmol/㎠(6.4㎍/㎠)의 C277-ColV로 고정화를 행한 플레이트, 및 BSA를 고정화한 대조플레이트를 이용한 실시예 8-(1)과 동일한 방법으로 평가하였다. 그 결과를 도 26에 나타낸다. 도 26은 기능성 물질과 유전자 도입 효율의 관계를 나타내는 그림으로, 횡축에 사용한 기능성 물질 및 BSA를, 종축에 G418 내성 콜로니수를 나타낸다.
도 26에 나타내는 바와 같이 BSA를 이용한 대조 플레이트에서는 콜로니가 보이지 않았음에 대해서, C277-ColV를 고정화한 플레이트에서는 G418 내성 콜로니의 출현이 확인되었다. 이것은 ColV 분자상에 레트로바이러스 결합 부위가 존재하고 있기 때문에 세정후의 플레이트 상에 레트로바이러스가 잔존하고 있는 것을 나타내고 있다.
이상의 기재한 바와 같이, 본 발명에 의해, 레트로바이러스를 이용하여 표적 세포에 양호한 효율로 유전자 도입하는 방법이 제공된다. 목적으로 하는 표적 세포에 적합한 세포 결합성의 물질을 선택하여 본 발명의 방법을 실시하므로서, 특수한 레트로바이러스 벡터를 필요로 하지않고, 간편하고도 고효율로 유전자 도입된 표적 세포를 취득할 수가 있다. 유전자 도입된 세포의 척수 동물에의 이식에 따라서, 형질전환 동물이 간편하게 만들어지고, 본 발명의 방법은 의료 분야, 세포공학분야, 유전자공학 분야, 발생공학 분야 등에 있어서 유용하다. 또한 본 발명의 기능성 물질, 및 그 혼합물을 함유하는 배지, 표적 세포내로의 레트로바이러스 개재 유전자 도입을 행하지 위해서 키트도 제공되고, 이들의 배지, 키트를 이용하므로서, 레트로바이러스의배치, 표적 세포내로의 외래 유전자의 도입 등을 간편하게 양호한 효율로 행하는 것이 가능하다.
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- 피브로넥틴의 헤파린-II 결합 영역, 섬유아세포 증식 인자, 콜라겐 또는 폴리라이신으로부터 선택되는 레트로바이러스 결합 부위를 갖는 유효량의 기능성 물질과, 표적 세포에 특이적으로 결합하는 리간드인 표적 세포 결합 부위를 갖는 유효량의 다른 기능성 물질의 혼합물과 접촉된 레트로바이러스를 함유하는 배양 배지를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 레트로바이러스를 표적 세포로 송달하기 위한 기능성 물질에 레트로바이러스를 결합시키는 방법.
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- 제17항에 있어서, 리간드가 세포 접착성 단백질, 호르몬, 사이토카인, 항체, 당쇄, 탄수화물 또는 표적 세포의 대사물 중에서 선택되는 결합 방법.
- 제20항에 있어서, 세포 접착성 단백질이 피브로넥틴의 세포 결합 영역 폴리펩티드인 결합 방법.
- 제21항에 있어서, 피브로넥틴의 세포 결합 영역 폴리펩티드가 VLA-5 및(또는) VLA-4에 대한 결합 영역 폴리펩티드인 결합 방법.
- 제20항에 있어서, 리간드가 에리스로포이에틴인 결합 방법.
- 제17항 및 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 물질이 고정화된 것인 결합 방법.
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- 섬유아세포 증식 인자, 콜라겐 또는 폴리라이신 유래의 레트로바이러스 결합부위를 갖는 유효량의 기능성 물질과 접촉된 레트로바이러스를 함유하는 배양 배지를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 레트로바이러스를 표적 세포로 송달하기 위한 기능성 물질에 레트로바이러스를 결합시키는 방법.
- 제33항에 있어서, 기능성 물질이 고정화된 것인 결합 방법.
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- 표적 세포에 특이적으로 결합하는 리간드인 표적 세포 결합 부위와, 섬유아세포 증식 인자, 콜라겐 또는 폴리라이신 유래의 레트로바이러스 결합 부위를 동일 분자상에 갖는 유효량의 기능성 물질과 접촉된 레트로바이러스를 함유하는 배양 배지를 인큐베이션시키는 단계를 포함하는 레트로바이러스를 표적 세포로 송달하기 위한 기능성 물질에 레트로바이러스를 결합시키는 방법.
- 제55항에 있어서, 섬유아세포 증식 인자가 서열표의 서열번호 3으로 표기되는 섬유아세포 증식 인자 또는 상기 인자를 함유하는 폴리펩티드로부터 선택되는 것인 결합 방법.
- 제56항에 있어서, 기능성 물질이 서열표의 서열번호 4 또는 5로 표기되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 결합 방법.
- 제55항에 있어서, 콜라겐이 V형 콜라겐 유래의 인슐린 결합 부위를 함유하는 프라그먼트 또는 상기 프라그먼트를 함유하는 폴리펩티드로부터 선택되는 것인 결합 방법.
- 제58항에 있어서, V형 콜라겐 유래의 인슐린 결합 부위를 함유하는 프라그먼트가 서열표의 서열번호 6으로 표기되는 아미노산 서열을 함유하는 프라그먼트인 결합 방법.
- 제59항에 있어서, 기능성 물질이 서열표의 서열번호 7 또는 8로 표기되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 결합 방법.
- 제55항 내지 60항 중 어느 한 항에 있어서, 기능성 물질이 고정화된 결합 방법.
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- 제17항, 제33항 및 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 레트로바이러스가 외래 유전자를 함유하는 것인 결합 방법.
- 제76항에 있어서, 레트로바이러스가 재조합 레트로바이러스 벡터인 결합 방법.
- 제77항에 있어서, 레트로바이러스가 복제 능력이 결손된 재조합 레트로바이러스 벡터인 결합 방법.
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- 제24항에 있어서, 기능성 물질이 비드상에 고정화된 결합 방법.
- 제34항에 있어서, 기능성 물질이 비드상에 고정화된 결합 방법.
- 제61항에 있어서, 기능성 물질이 비드상에 고정화된 결합 방법.
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