CN114965839A - 人碱性成纤维细胞生长因子的肽图分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种人碱性成纤维细胞生长因子的肽图分析方法。本发明首次提供了适用于人碱性成纤维细胞生长因子供试品质量控制的稳定的HPLC肽图分析方法，该方法可以使人碱性成纤维细胞生长因子的酶解更稳定，肽图重复率更高，稳定性更好，对人碱性成纤维细胞生长因子的质量控制具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体涉及人碱性成纤维细胞生长因子的肽图分析方法。
背景技术
肽图分析(Peptide Mapping)是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶作用于特殊的肽链位点，将多肽裂解成小的片段，通过一定的分离检测手段形成的特征性指纹图谱。
肽图能够提供丰富的结构信息，对多肽结构研究和特性鉴别具有重要意义，因此，肽图分析已经逐渐成为抗体、蛋白或多肽类药物的指标。
目前，按照药典公开的方法对人碱性成纤维细胞生长因子相关多肽进行肽图分析时，存在结果不稳定、酶解特征峰重复率不高、特征峰之间分离度不够等问题。
发明内容
本发明目的在于提供一种人碱性成纤维细胞生长因子的肽图分析方法。
为了实现上述发明目的，本发明一方面提供了一种人碱性成纤维细胞生长因子的肽图分析方法，其包括：将人碱性成纤维细胞生长因子样品进行变性还原处理、烷基化处理和酶解处理后，对所得产物进行反相高效液相色谱检测；
其中，所述反相高效液相色谱检测的条件为：
色谱柱：反相辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱或反相十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相A：三氟乙酸-水溶液；
流动相B：三氟乙酸-乙腈溶液；
检测波长：210-220nm；
柱温：30-56℃；
流速：0.5-1.05mL/min；
梯度洗脱。
在一些实施方案中，所述梯度洗脱的程序为：
在一些实施方案中，所述人碱性成纤维细胞生长因子的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一些实施方案中，所述肽图分析方法选取了10个特征峰，所述特征峰的出峰顺序以及对应的序列为：
| 特征峰编号 | 肽段标记 | 序列 |
| 1 | T24 | TGPGQK |
| 2 | T22 | TGQYK |
| 3 | T6 | IHPDGR |
| 4 | T7 | VDGVR |
| 5 | T4& | LYCK |
| 6 | T17 | LESNNYNTYR |
| 7 | T5 | NGGFFLR |
| 8 | T19-20 | KYTSWYVALK |
| 9 | T16& | CVTDECFFFER |
| 10 | T25 | AILFLPMSAK |
另一方面，本发明提供了所述肽图分析方法在检测和/或鉴定人碱性成纤维细胞生长因子中的用途。
重组人碱性成纤维细胞生长因子作为一类新药，目前尚无专门适用于人碱性成纤维细胞生长因子的肽图分析方法。采用药典中的现有方法对人碱性成纤维细胞生长因子进行肽图分析时，存在结果不稳定、酶解特征峰重复率不高、特征峰之间分离度不够等问题。本发明首次提供了专门适用于人碱性成纤维细胞生长因子供试品质量控制的稳定的HPLC肽图分析方法，该方法可以使人碱性成纤维细胞生长因子的酶解更稳定，所选取的10个特征峰重复率高，特征肽段理论塔板数大于2000，特征肽段与相邻峰之间的分离度大于1.2，且色谱图基线平稳，对人碱性成纤维细胞生长因子的质量控制具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1中标准品重组人碱性成纤维细胞生长因子原液(批号：C202111036)的Trypsin酶解产物UV图谱；
图2-4为实施例1中供试品重组人碱性成纤维细胞生长因子原液(批号依次为：C202111032、C202111033、C202111037)的Trypsin酶解产物UV图谱；
图5为实施例1中供试品重组人碱性成纤维细胞生长因子原液(从上往下依次为批号： C202111032、C202111033、C202111036、C202111037)HPLC肽图的肽段覆盖分析图谱；
图6为实施例1中供试品重组人碱性成纤维细胞生长因子原液(批号：C202111036)的Trypsin酶解产物UV图谱；
图7为实验例1中盐酸胍变性后不同酶解缓冲液中Trypsin反应24h酶解产物液相检测 UV图谱(上：25mMABC缓冲液，下：2M UA缓冲液)；
图8为实验例1中盐酸胍变性后不同酶解缓冲液中GluC反应24h酶解产物液相检测UV图谱(上：25mMABC缓冲液，下：2M UA缓冲液)；
图9为实验例1中UA变性后不同酶解缓冲液中Trypsin反应24h酶解产物液相检测UV图谱(上：25mMABC缓冲液，下：2M UA缓冲液)；
图10为实验例1中UA变性后不同酶解缓冲液中GluC反应24h酶解产物液相检测UV图谱(上：25mMABC缓冲液，下：2M UA缓冲液)；
图11为实验例2中盐酸胍变性后2M UA缓冲液中不同酶解比例Trypsin反应24h后酶解产物液相检测UV图谱(上：10:1，中：20:1，下：50:1)；
图12为实验例2中UA变性后2M UA缓冲液中不同酶解比例Trypsin反应24h后酶解产物液相检测UV图谱(上：10:1，中：20:1，下：50:1)；
图13为实验例2中盐酸胍变性后2M UA缓冲液中不同酶解比例GluC反应24h后酶解产物液相检测UV图谱(上：10:1，中：20:1，下：50:1)；
图14为实验例2中UA变性后2M UA缓冲液中不同酶解比例GluC反应24h后酶解产物液相检测UV图谱(上：10:1，中：20:1，下：50:1)；
图15为实验例2中2M UA缓冲液酶解比例(10:1)不同反应时间后酶解产物液相检测UV图谱(上：酶解16h，下：酶解24h)；
图16为实验例2中2M UA缓冲液相同酶解比例(20:1)酶解不同反应时间后酶解产物液相检测UV图谱(上：酶解16h，下：酶解24h)；
图17为实验例3中2M UA缓冲液相同酶解比例(20:1)酶解16h后酶解产物在不同C18色谱柱中液相检测UV图谱(上：Kromasil 100-5-C18(M05CLA25)，下：ZORBAX E clipseXDB-C18)；
图18为实验例4中不同色谱梯度的UV图谱肽段覆盖比较(从上往下依次为梯度二、三、四)；
图19为实验例4中不同柱温的UV图谱肽段覆盖比较(从上往下柱温依次为30℃、40℃、55℃)；
图20为实验例4中不同流速的UV图谱肽段覆盖比较(从上往下柱温依次为0.5mL/min、 0.8mL/min、1mL/min)；
图21为实验例4中不同仪器的UV图谱肽段覆盖比较(上：ACQUITYUPLC H-Class，下：ACQUITYArc)；
图22为实验例4中不同色谱梯度的UV图谱肽段覆盖比较(从上往下依次为梯度三、五)；
图23为实验例5中不同批次样品的UV图谱肽段覆盖比较(从上往下依次为批号：C202111032、C202111033、C202111036、C202111037)；
图24为实验例6中供试品(批号：C202111037)在HPLC高效液相色谱(LC-20A) 的UV图谱肽段覆盖比较；
图25为实验例7中供试品(批号：C202111032、C202111033、C202111036、C202111037) 液质检测紫外色谱标注图谱；
图26为实验例7中供试品(批号：C202111032)特征峰(T24)一级和二级质谱图；
图27为实验例7中供试品(批号：C202111032)特征峰(T22)一级和二级质谱图；
图28为实验例7中供试品(批号：C202111032)特征峰(T6)一级和二级质谱图；
图29为实验例7中供试品(批号：C202111032)特征峰(T7)一级和二级质谱图；
图30为实验例7中供试品(批号：C202111032)特征峰(T4&)一级和二级质谱图；
图31为实验例7中供试品(批号：C202111032)特征峰(T17)一级和二级质谱图；
图32为实验例7中供试品(批号：C202111032)特征峰(T5)一级和二级质谱图；
图33为实验例7中供试品(批号：C202111032)特征峰(T19-20)一级和二级质谱图；
图34为实验例7中供试品(批号：C202111032)特征峰(T16&)一级和二级质谱图；
图35为实验例7中供试品(批号：C202111032)特征峰(T25)一级和二级质谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种人碱性成纤维细胞生长因子的肽图分析方法，其包括：将人碱性成纤维细胞生长因子样品进行变性还原处理、烷基化处理和酶解处理后，对所得产物进行反相高效液相色谱检测；
其中，所述反相高效液相色谱检测的条件为：
色谱柱：反相辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱或反相十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相A：三氟乙酸-水溶液；
流动相B：三氟乙酸-乙腈溶液；
检测波长：210-220nm；
柱温：30-56℃；
流速：0.5-1.05mL/min；
梯度洗脱。
本发明提供的肽图分析方法是采用蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法，以蛋白质与多肽分析用辛烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，当供试品通过高压泵被流动相带入色谱柱时，通过梯度洗脱，将供试品不同肽段组分分开后进入紫外检测器，然后记录色谱图。
具体地，所述人碱性成纤维细胞生长因子的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示(NCBI参照序列编号:NP_001348594.1)。
重组人碱性成纤维细胞生长因子(SEQ ID NO:1)：
MAAGSITTLPALPEDGGSGAFPPGHFKDPKRLYCKNGGFFLRIHPDGRVDGVREKSDPHI KLQLQAEERGVVSIKGVCANRYLAMKEDGRLLASKCVTDECFFFERLESNNYNTYRSRK YTSWYVALKRTGQYKLGSKTGPGQKAILFLPMSAKS
在一些实施方案中，在对所述人碱性成纤维细胞生长因子样品进行变性还原处理之前，先用缓冲液对所述样品进行超滤换液处理以浓缩样品。在一些具体实施例中，所述超滤换液处理是将所述样品置于超滤管中，加入磷酸缓冲液进行离心，收集离心后的滤液，当OD280大于等于1.31时，处理完毕。
通过对所述人碱性成纤维细胞生长因子样品进行变性还原处理和烷基化处理，可以消除其高级结构对酶解的阻碍作用，将人碱性成纤维细胞生长因子的二硫键断裂并还原为巯基，同时为了防止自由巯基再次形成二硫键，通过烷基化处理将巯基进行封闭处理，最终使人碱性成纤维细胞生长因子在溶液中成为游离的伸展肽链，有利于后续的酶解。
在一些实施方案中，用于进行变性还原处理和烷基化处理的样品的浓度≥1.35mg/mL。
在一些实施方案中，所述变性还原处理中所用的变性试剂为盐酸胍或尿素(UA)。优选地，所述变性试剂的浓度为6-8mol/L。
在一些实施方案中，所述变性还原处理中所用的还原试剂为二硫苏糖醇(DDT)。优选地，所述二硫苏糖醇的浓度为1mol/L。
在一些实施方案中，所述变性还原处理的温度为37-60℃。
在一个或多个具体实施例中，所述变性还原处理是将人碱性成纤维细胞生长因子样品与6mol/L盐酸胍缓冲液(pH7.8)或8mol/L尿素缓冲液(pH7.8)混合，得到盐酸胍变性样品或尿素变性样品；然后将盐酸胍变性样品与1mol/L二硫苏糖醇在56℃下孵育30分钟，或将尿素变性样品与1mol/L二硫苏糖醇在37℃下孵育60分钟，得到变性还原样品。
在一些实施方案中，所述烷基化处理中所用的烷基化试剂为碘乙酰胺(IAM)。优选地，所述碘乙酰胺的浓度为1mol/L。
在一个或多个具体实施例中，所述烷基化处理是将变性还原样品与1mol/L碘乙酰胺混合，避光室温孵育30分钟，得到烷基化样品。
在一些实施方案中，在烷基化处理之后、酶解处理之前，对烷基化样品中的缓冲液置换为用于酶解处理的缓冲液。通过该置换步骤，可以使酶解反应更加高效、稳定，有利于获得重复率高且稳定的肽图分析结果。
在一个或多个具体实施例中，所述置换步骤是将脱盐离心柱(Zeba SpinDesalting Column)离心、去滤液，然后加入尿素缓冲液或碳酸氢铵(ABC)缓冲液进行离心、去滤液，重复2次；再加入烷基化样品进行离心，收集滤液，直至OD280大于等于0.5。
本发明酶解处理通过将还原烷基化样品与酶和缓冲液进行混合孵育，可以使人碱性成纤维细胞生长因子裂解形成肽段用于后续分析。酶解处理条件对结果的稳定性、酶解特征峰的重复率至关重要。
在一些实施方案中，所述酶选自胰蛋白酶(Trypsin)、蛋白内切酶GluC(金黄色葡萄菌v8蛋白酶)中的至少一种，优选胰蛋白酶。
在一些实施方案中，所述缓冲液选自尿素缓冲液、ABC缓冲液中的至少一种，优选尿素缓冲液。
在一些优选实施方案中，所述尿素缓冲液的浓度为2mol/L。
在一些实施方案中，所述还原烷基化样品与所述酶的质量比为(10-50):1。
在一些优选实施方案中，所述还原烷基化样品与胰蛋白酶的质量比为20:1。
在一些实施方案中，所述混合孵育的时间(即酶解时间)为16-24h，优选16h。
反相高效液相色谱检测及其参数对肽图分析结果的稳定性、特征峰之间的分离度具有显著影响。在一些实施方案中，所述反相高效液相色谱的梯度洗脱程序如下，具有更好的色谱峰分离度。
在一些实施方案中，所述色谱柱为ZORBAX E clipse XDB-C18或Kromasil 100-5-C18 (M05CLA25)，优选ZORBAX E clipse XDB-C18。采用ZORBAX E clipse XDB-C18具有更好的色谱峰分离度。
在一些实施方案中，所述三氟乙酸-水溶液中三氟乙酸(TFA)的体积分数为0.1％。
在一些实施方案中，所述三氟乙酸-乙腈溶液中三氟乙酸的体积分数为0.1％。
在一些实施方案中，所述检测波长为214nm。
在一些实施方案中，所述柱温为54-56℃，优选55℃，该温度下具有更好的色谱峰分离度。
在一些实施方案中，所述流速为0.95-1.05mL/min，优选1mL/min，该流速下具有更好的色谱峰分离度。
在一些实施方案中，进样量为50μL。优选地，在进样之前用初始流动相平衡至少30分钟，直至基线平稳。
本发明提供的上述方法及条件同样适用于超高效液相色谱。
检测结果的数据分析可采用本领域常用的数据分析方法。在一些实施方案中，当采用Empower软件处理数据时，可参考的积分参数为：
采用本发明提供的上述肽图分析方法选取了10个特征峰，所述特征峰的出峰顺序、对应的肽段序列以及相对保留时间和峰面积百分比为：
为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例人碱性成纤维细胞生长因子的肽图分析方法的进步性能显著的体现，以下通过多个实施例来举例说明上述技术方案。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实验仪器：
1)高分辨质谱仪：Xevo-G2-XS-Qtof，Waters；
2)超高效液相色谱仪：ACQUITYUPLC I-Class，Waters；
3)超高效液相色谱仪：ACQUITYUPLC H-Class，Waters；
4)高效液相色谱仪：ACQUITYArc，Waters；
5)高效液相色谱仪：LC-20A，Shimadzu
6)软件：Empower，Waters。
材料和试剂：
1)水：实验用水，现取现用。
2)20mM PB缓冲液(pH7.8)：称取十二水合磷酸氢二钠(国药，10020318)7.16g，加水溶解并定容至100mL，配成0.2M磷酸氢二钠溶液；称取二水合磷酸二氢钠(国药，20040718)3.12g，加水溶解并定容至100mL，配成0.2M磷酸二氢钠溶液。量取45.75mL 0.2M磷酸氢二钠溶液，加入4.25mL 0.2M磷酸二氢钠溶液，混匀，4℃保存，有效期1个月。
3)离心超滤管，10kD，0.4mL(Sartorius，VN01H02)。
4)150mM Tris-HCl缓冲液(pH7.8)：称取Tris(BIO-RAD，1610719)1.82g，加适量水溶解后，用HCl(国药，10011008)调节pH值至7.8，加水定容至100mL，4℃保存有效期1个月。
5)6M盐酸胍缓冲液(pH7.8)：称取Guanidine HCl(Sigma，50950)57.32g，Tris(BIO-RAD，1610719)1.82g，加适量水溶解后，用HCl(国药，10011018)调节pH值至 7.8，加水定容至100mL，4℃避光保存有效期6个月。
6)1M DTT：称取DTT(Sigma，D9163)15.7mg，加100μL水溶解，-20℃保存，有效期1月。
7)1M IAM：称取IAM(Sigma，V900335)18.49mg，加100μL水溶解，室温避光保存，有效期1天。
8)Zeba Spin Desalting Columns,7KMWCO，0.5mL(Thermo，89883)。
9)25mMABC缓冲液：称取0.1975g碳酸氢铵(Sigma，A6141)，加水定容至100mL， 4℃保存，有效期3个月。
10)8M UA缓冲液(pH7.8)：称取48g尿素(BIO-RAD，1610731)，1.82g Tris(BIO-RAD， 1610719)，加入适量水溶解后，用HCl(国药，10011008)调pH至7.8，加水定容至100mL，分装为2mL每管，放入81孔盒中，注明配制日期，保存于-20℃，有效期1个月。
11)2M UA尿素缓冲液：取1mL 8M UA缓冲液，加入3mL水混匀，现用现配。
12)0.1％TFA-水溶液：量取1000mL纯水，加入1mL三氟乙酸(Sigma，T6508)，混匀，室温保存，有效期1周。
13)0.1％TFA-乙腈溶液：量取1000mL乙腈(Fisher,212213)，加入1mL三氟乙酸(Sigma， T6508)，混匀，室温保存，有效期1个月。
14)10％FA水溶液：量取900μL纯水，加入100μL甲酸(TCI，F0654)，混匀，室温保存，有效期1个月。
15)Trypsin(Promega)：购买后存于-80℃，直接使用，浓度约为0.4μg/μL。
16)GluC(Wako)：购买后存于-80℃，使用前加入100μL水，浓度约为0.5μg/μL。
17)反相色谱柱：ZORBAX E clipse XDB-C18(Angilent，4.6x150mm，5μm，80A，993967-902)、Kromasil 100-5-C18(4.6x250mm，5μm，100A，M05CLA25)。
质谱分析：供试品酶解产物经高效液相色谱脱盐及分离后采用高分辨质谱仪进行检测扫描质谱分析。分析时长：65min，检测方式：正离子(MSE)，母离子扫描范围：300-2000m/z。
数据分析：质谱数据采用UNIFI控制程序(1.8.2，Waters)，选择供试品理论序列为数据库，然后进行数据库匹配检索，主要参数如下：
实施例1
供试品信息如下：
供试品理论序列如SEQ ID NO:1所示。
肽图分析步骤如下：
1)超滤换液：取400μL原始供试品加入预润洗的10kD超滤管(加入200μL 20mM PB缓冲液，10℃，12000g离心5分钟)，10℃，12000g离心20分钟，去滤液。再加入400μL 原始供试品，10℃，12000g离心20分钟，去滤液。加入400μL 20mM PB缓冲液，10℃， 12000g离心20分钟，去滤液，重复4次。倒置超滤管至新接收管，10℃，10000g离心15 分钟，收集滤液。以20mM PB缓冲液为空白对照，取2μL上述样品测定OD280值，OD280 应不低于1.31，-80℃冻存。
2)样品准备：
保证超滤换液后样品浓度≥1.35mg/mL，200μg供试品于EP管中，加入150mM Tris-HCl pH 7.8补足150μL。
样品体积＝200μg/样品浓度。
3)还原烷基化：
a)取200μg供试品于EP管中，加入150mM Tris-HCl补足150μL。
b)向上述EP管中加入150μL 6M盐酸胍缓冲液(pH7.8)，混匀。
c)向上述EP管中加入6μL 1M DDT混匀，放入电热恒温水槽56℃孵育30分钟，冷却至室温。
d)向上述EP管中加入24μL 1M IAM，混匀，避光室温孵育30分钟。
4)置换缓冲液：
a)取3个Zeba Spin Desalting Columns(7K MWCO，0.5mL)，去底部管塞，套入空EP管，标记离心朝向位置，对准离心朝向位置放入高速离心机，25℃，1500g离心1分钟，去滤液。
b)向上述Zeba Spin Desalting Columns中加入300μL 2M UA缓冲液，对准离心朝向位置放入高速离心机，25℃，1500g离心1分钟，去滤液，重复2次。
c)将上述Zeba Spin Desalting Columns套入新EP管中，分别加入110μL还原烷基化样品，对准离心朝向位置放入高速离心机，25℃，1500g离心2分钟，收集滤液。
d)以2M UA缓冲液为空白对照，取2μL上述样品测定OD280值，OD280应不低于 0.5。
5)酶解：
a)酶：底物比例：取100μg还原烷基化样品于新EP管中，加入2M UA缓冲液补足体积至200μL，稀释成终浓度为0.5μg/μL，1：20加入Trypsin酶液(12.5μL)，混匀。
b)孵育时间：将上述加入Trypsin后溶液样品置于37℃分别孵育16小时，将酶解后样品加入5μL 10％FA终止反应，上机测试。
6)色谱分析：
供试品酶解产物采用超高效液相色谱进行分离。流动相A液：0.1％TFA水溶液，B液为0.1％TFA乙腈溶液。柱温55℃，样品室温度4℃，流速1mL/min，紫外检测波长214nm，进样量50μL。洗脱梯度见表1。
表1液相色谱洗脱梯度
进样序列：进样之前用初始流动相平衡至少30分钟，直至基线平稳。
7)数据分析：
色谱数据采用Empower分析，积分参数设置见表2。
表2色谱积分参数
实验结果和分析：
1)标准品的肽图分析：
标准品重组人碱性成纤维细胞生长因子原液(批号：C202111036)经蛋白酶水解后，通过高效液相色谱进行肽图分析，所得的测试图谱见图1，供试品色谱峰信息见表3。
表3标准品重组人碱性成纤维细胞生长因子原液(批号：C202111036)的HPLC肽图色谱峰表
2)供试品的肽图分析：
供试品经蛋白酶水解后，通过高效液相色谱进行肽图分析，所得的测试图谱见图2-4，各批次肽段覆盖图谱见图5，供试品色谱峰信息见表4-6。
表4供试品重组人碱性成纤维细胞生长因子原液(批号：C202111032)的HPLC肽图色谱峰表
表5供试品重组人碱性成纤维细胞生长因子原液(批号：C202111033)的HPLC肽图色谱峰表
表6供试品重组人碱性成纤维细胞生长因子原液(批号：C202111037)的HPLC肽图色谱峰表
通过图1-5和表3-6可以看出，标准品重组人碱性成纤维细胞生长因子(批号：C202011036)与各批次供试品重组人碱性成纤维细胞生长因子(批号：C202011032、C202011033、C202011037)经Trypsin酶解及质量肽图检测分析，各批次供试品检测结果基本一致，并参考色谱峰的质谱鉴定结果，确定了10条分离度较好且信号较高的肽段作为特征峰，HPLC高效液相色谱的紫外图谱见图6。
所选取的10个特征峰的出峰顺序、对应的肽段序列以及相对保留时间和峰面积百分比为：
对实施例1提供的肽图分析方法进行专属性验证、系统适用性验证、中间精密度验证、以及耐用性验证，验证结果如下：
1)空白样品在出峰位置无可见的干扰峰；
2)样品重复进样的色谱图无明显差别；
3)样品的特征肽段理论塔板数>2000，特征肽段与相邻峰分离度>1.2；
4)样品的10个特征峰的相对保留时间的RSD小于5％；10个特征峰的峰面积百分比的RSD小于10％。
实验例1
本实验例研究了酶解缓冲液对分析结果的影响。
实验步骤与实施例1基本相同，不同之处在于将供试品(C202011032)经盐酸胍或UA 变性还原烷基化后分别置换至2M UA或25mMABC缓冲液中，按照蛋白质：酶w/w＝20:1 比例加入Trypsin进行酶解，分别酶解反应24h，酶解产物进行液相检测(H-Class)，UV214 图谱见图7-10。其中，UA变性还原时，在实施例1的还原烷基化步骤b)中，用150μL 8M UA缓冲液(pH7.8)替代150μL 6M盐酸胍缓冲液；步骤c)中，将尿素变性的样品置于 37℃孵育1h，冷却至室温。
通过本实验发现，将供试品还原烷基化后置换至25mMABC缓冲液中进行酶解反应会产生沉淀，且紫外检测信号强度低，后续不考虑用25mMABC缓冲液中进行酶解。
实验例2
本实验例研究了酶、蛋白质与酶的比例以及酶解反应时间对分析结果的影响。
实验步骤与实施例1基本相同，不同之处在于酶解步骤中，取100μg还原烷基化样品于新EP管中，按下表7加入Trypsin或GluC，并用2M UA缓冲液或25mMABC缓冲液补足体积至200μL，混匀；将上述加入Trypsin或GluC后溶液样品置于37℃分别孵育24小时，将酶解后样品加入5μL 10％FA终止反应，进行液相检测，UV214图谱见图11-14。
表7酶解体系配制
由图11-14可知，供试品(C202011032)经GluC酶解的肽段较少，不利于选择特征峰，因此后续不再对GluC的酶解条件进行优化。由图11与图12可知，供试品经盐酸胍或UA变性的Trypsin酶解结果无明显差异，可选择盐酸胍或UA其中之一使供试品变性，还原烷基化后置换至2M UA缓冲液中。由图11可知，酶解比例为50：1时，28min的色谱峰为漏切肽段，增加酶量，肽段鉴定中的漏切比例下降，因此选择蛋白质：酶w/w＝10：1、20： 1的酶解比例，尝试更短的酶解时间(16h)，酶解产物进行液相检测，UV214图谱见图15-16。
通过图15-16可以看出，供试品经不同条件酶解后，酶切16h或24h无明显差别；酶解比例蛋白质：酶w/w＝10：1与20：1相比未产生明显差别，为节约实验成本，确定最终酶解条件为在2M UA缓冲液中，加入酶解比例蛋白质：酶w/w＝20：1的Trypsin，酶解16h。
实验例3
本实验例研究了不同型号色谱柱对分析结果的影响。
实验步骤与实施例1基本相同，不同之处在于分别采用色谱柱ZORBAX E clipseXDB-C18和Kromasil 100-5-C18(M05CLA25)进行分析，色谱梯度如表8，UV214图谱见图17。选择Kromasil 100-5-C18(M05CLA25)进行分析时，21.2min色谱峰和34.4min 色谱峰比ZORBAX E clipse XDB-C18的17.7min色谱峰和29.9min色谱峰分离度差，其他色谱峰分离度无明显差异，因此选择继续使用ZORBAX E clipse XDB-C18色谱柱进行后续实验。
表8液相色谱洗脱梯度(梯度一)
实验例4
本实验例研究了色谱参数对分析结果的影响。
参考表8梯度一色谱检测结果，肽段主要在B相5％～45％时洗脱，当前有效梯度过长，没有冲洗时间，设置3个梯度对色谱进行优化，梯度见表9-11。紫外图谱见图18，梯度二的17.2min和30.9min色谱峰比梯度三的13.8min和35.1min色谱峰分离度差；梯度四的10.8min、12.9min和31.8min色谱峰比梯度三的10.5min、13.8min和35.1min色谱峰分离度差，其他色谱峰分离度无明显差异，因此选择梯度三进行后续实验。
表9液相色谱洗脱梯度(梯度二)
表10液相色谱洗脱梯度(梯度三)
表11液相色谱洗脱梯度(梯度四)
参考梯度三色谱检测结果，调整柱温(30℃、40℃、55℃)和流速(0.5mL/min、0.8mL/min、 1mL/min)对色谱进行优化。紫外图谱见图19-20，结果表明流速为1mL/min时，柱温为 30℃的19.7min、42.7min和43.2min色谱峰比55℃的13.8min、40.4min和41.9min色谱峰分离度差；柱温为40℃的14.6min、42min和42.4min色谱峰比55℃的13.8min、40.4min和41.9min色谱峰分离度差。柱温为55℃时，流速为0.5mL/min的24.9min、27.7min和44.4min色谱峰比1mL/min的14.1min、17.7min和35.6min色谱峰分离度更差；流速为0.8mL/min的17.3min和37.7min色谱峰比1mL/min的14.1min和35.6min色谱峰分离度更差。其他色谱峰的分离度无明显差异，因此选择柱温55℃，流速1mL/min，进行后续实验。
将优化后超高效液相色谱(ACQUITY UPLC H-Class)的色谱条件(梯度三、柱温为55℃、流速为1mL/min)转移至HPLC高效液相色谱(ACQUITYArc)，紫外图谱见图21，结果表明，同一酶解样品在HPLC高效液相色谱上的色谱峰和分离度与超高效液相色谱基本一致，优化后的色谱条件适用于HPLC高效液相色谱。
参考85min梯度色谱检测结果，肽段主要在B相5％～35％时洗脱，当前梯度时间过长，中间有大段不出峰的空白位置，设置1个梯度对色谱进行优化，梯度见表12。紫外图谱见图22，色谱峰峰形、分离度与85min梯度色谱结果基本一致，因此选择梯度五，即65min 梯度进行后续实验。
表11液相色谱洗脱梯度(梯度五)
实验例5
本实验例研究了不同批次供试品对分析结果的影响。
按照优化后的酶解条件，对不同批次样品进行测定，UV图谱肽段覆盖比较见图23。结果表明各批次供试品及标准品酶解后进行上机检测，UV图谱基本一致。
实验例6
将优化后HPLC高效液相色谱(ACQUITYArc)的色谱条件(65min梯度五、柱温为 55℃、流速为1mL/min)转移至普通HPLC高效液相色谱(LC-20A，Shimadzu)，紫外图谱见图24，结果表明，供试品在LC-20A上的色谱峰和分离度与ACQUITYArc基本一致，优化后的色谱条件适用于普通HPLC高效液相色谱。
实验例7
按照实验例1-6最终得到优化后的条件，采用超高效液相色谱质谱(UPLC/Q-TOF)对各色谱峰进行质谱鉴定分析，肽段鉴定信息列表见表12-15，各批次样品的肽图测定结果一致。综合不同仪器检测结果，选择出峰稳定，峰强度高，前后无分离度小于1.2的杂峰的肽段作为特征峰，UV标注图谱如图25所示。特征峰的肽段鉴定结果如表16-19所示，特征肽段一级和二级质谱图见图26-35。
表12供试品(批号：C202011032)Trypsin酶解产物匹配肽段列表
表13供试品(批号：C202011033)Trypsin酶解产物匹配肽段列表
表14供试品(批号：C202011036)Trypsin酶解产物匹配肽段列表
表15供试品(批号：C202011037)Trypsin酶解产物匹配肽段列表
表16供试品(批号：C202111032)特征峰的肽段鉴定结果
表17供试品(批号：C202111033)特征峰的肽段鉴定结果
表18供试品(批号：C202111036)特征峰的肽段鉴定结果
表19供试品(批号：C202111037)特征峰的肽段鉴定结果
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 朗肽生物制药股份有限公司
<120> 人碱性成纤维细胞生长因子的肽图分析方法
<130> DSP1F222934JW
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 155
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu
20 25 30
Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg
35 40 45
Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu
50 55 60
Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn
65 70 75 80
Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys
85 90 95
Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr
100 105 110
Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys
115 120 125
Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys
130 135 140
Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser
145 150 155
Claims (10)
1.一种人碱性成纤维细胞生长因子的肽图分析方法，其特征在于，所述方法包括：将人碱性成纤维细胞生长因子样品进行变性还原处理、烷基化处理和酶解处理后，对所得产物进行反相高效液相色谱检测；
其中，所述反相高效液相色谱检测的条件为：
色谱柱：反相辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱或反相十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相A：三氟乙酸-水溶液；
流动相B：三氟乙酸-乙腈溶液；
检测波长：210-220nm；
柱温：30-56℃；
流速：0.5-1.05mL/min；
梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的肽图分析方法，其特征在于，所述梯度洗脱的程序为：
3.根据权利要求2所述的肽图分析方法，其特征在于，所述色谱柱为ZORBAX E clipseXDB-C18；和/或
所述三氟乙酸-水溶液中三氟乙酸的体积分数为0.1％；和/或
所述三氟乙酸-乙腈溶液中三氟乙酸的体积分数为0.1％；和/或
所述检测波长为214nm；和/或
所述柱温为54-56℃；和/或
所述流速为0.95-1.05mL/min。
4.根据权利要求1所述的肽图分析方法，其特征在于，所述酶解处理是将还原烷基化样品与酶和缓冲液进行混合孵育。
5.根据权利要求4所述的肽图分析方法，其特征在于，所述酶选自胰蛋白酶、蛋白内切酶GluC中的至少一种；和/或
所述缓冲液选自尿素缓冲液、碳酸氢铵缓冲液中的至少一种；优选地，所述缓冲液的浓度为2mol/L；和/或
所述还原烷基化样品与所述酶的质量比为(10-50):1，优选为10:1，更优选为20:1；和/或
所述混合孵育的时间为16-24h。
6.根据权利要求1所述的肽图分析方法，其特征在于，所述变性还原处理中所用的变性试剂为盐酸胍或尿素；优选地，所述变性试剂的浓度为6-8mol/L；和/或
所述变性还原处理中所用的还原试剂为二硫苏糖醇；优选地，所述二硫苏糖醇的浓度为1mol/L；和/或
所述变性还原处理的温度为37-60℃，时间为30-60min。
7.根据权利要求1所述的肽图分析方法，其特征在于，所述烷基化处理中所用的烷基化试剂为碘乙酰胺；优选地，所述碘乙酰胺的浓度为1mol/L；和/或
所述烷基化处理的时间为30min。
8.根据权利要求1-7任一项所述的肽图分析方法，其特征在于，在进行变性还原处理之前，所述人碱性成纤维细胞生长因子样品经过超滤换液处理。
9.根据权利要求1-7任一项所述的肽图分析方法，其特征在于，所述人碱性成纤维细胞生长因子的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
10.权利要求1-9任一项所述的肽图分析方法在检测和/或鉴定人碱性成纤维细胞生长因子中的用途。
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Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1058597A (zh) * | 1990-08-02 | 1992-02-12 | 法米塔利亚·卡洛·埃巴有限责任公司 | 酶促制备成纤维细胞生长因子的方法 |
| CN1160721A (zh) * | 1996-12-27 | 1997-10-01 | 暨南大学生物工程研究所 | 成纤维细胞生长因子-2结构类似物，其生产方法及应用 |
| CN1207774A (zh) * | 1995-11-13 | 1999-02-10 | 宝酒造株式会社 | 用逆转录病毒将基因转入靶细胞的方法 |
| CN109293745A (zh) * | 2018-09-04 | 2019-02-01 | 暨南大学 | 一种运载蛋白、重组表达载体、外泌体及制备方法与应用 |
| CN110554121A (zh) * | 2019-10-17 | 2019-12-10 | 东莞太力生物工程有限公司 | 一种重组蛋白肽图分析方法 |
| CN110618229A (zh) * | 2018-06-20 | 2019-12-27 | 成都康弘生物科技有限公司 | 一种蛋白的非还原肽图分析方法 |
| CN110988244A (zh) * | 2019-12-23 | 2020-04-10 | 上海景峰制药有限公司 | 一种奈西立肽的肽图分析方法及其应用 |
| CN111024863A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-17 | 上海博威生物医药有限公司 | 一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法 |
| CN111868531A (zh) * | 2018-03-13 | 2020-10-30 | 安进公司 | 用于质谱分析的多肽的依序消化 |
| CN113075330A (zh) * | 2021-04-02 | 2021-07-06 | 杭州奕安济世生物药业有限公司 | 基于肽图的单抗糖型检测方法 |
-
2022
- 2022-05-11 CN CN202210513656.8A patent/CN114965839A/zh active Pending
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1058597A (zh) * | 1990-08-02 | 1992-02-12 | 法米塔利亚·卡洛·埃巴有限责任公司 | 酶促制备成纤维细胞生长因子的方法 |
| CN1207774A (zh) * | 1995-11-13 | 1999-02-10 | 宝酒造株式会社 | 用逆转录病毒将基因转入靶细胞的方法 |
| CN1160721A (zh) * | 1996-12-27 | 1997-10-01 | 暨南大学生物工程研究所 | 成纤维细胞生长因子-2结构类似物，其生产方法及应用 |
| CN111868531A (zh) * | 2018-03-13 | 2020-10-30 | 安进公司 | 用于质谱分析的多肽的依序消化 |
| US20210255075A1 (en) * | 2018-03-13 | 2021-08-19 | Amgen Inc. | Sequential digestion of polypeptides for mass spectrometric analysis |
| CN110618229A (zh) * | 2018-06-20 | 2019-12-27 | 成都康弘生物科技有限公司 | 一种蛋白的非还原肽图分析方法 |
| CN109293745A (zh) * | 2018-09-04 | 2019-02-01 | 暨南大学 | 一种运载蛋白、重组表达载体、外泌体及制备方法与应用 |
| CN110554121A (zh) * | 2019-10-17 | 2019-12-10 | 东莞太力生物工程有限公司 | 一种重组蛋白肽图分析方法 |
| CN110988244A (zh) * | 2019-12-23 | 2020-04-10 | 上海景峰制药有限公司 | 一种奈西立肽的肽图分析方法及其应用 |
| CN111024863A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-17 | 上海博威生物医药有限公司 | 一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法 |
| CN113075330A (zh) * | 2021-04-02 | 2021-07-06 | 杭州奕安济世生物药业有限公司 | 基于肽图的单抗糖型检测方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 吴宏斌;邱文娜;李磊;熊吉滨;: "重组艾塞那肽RP-HPLC法肽图分析", 中国医药科学, no. 07, 15 April 2016 (2016-04-15) * |
| 富岩;韩国;富俞淞;杨小楠;邢静;于在林;: "具长效性重组人血清白蛋白/粒细胞刺激因子融合蛋白的理化特性研究", 中国医药生物技术, no. 03, 10 June 2011 (2011-06-10) * |
| 李健等: "封闭负压引流技术联合重组人碱性成纤维细胞生长因子在慢性难愈合创面中的临床应用", 现代实用医学, vol. 35, no. 4, 30 April 2023 (2023-04-30) * |
| 王敏力;杨鹏云;沈琦;: "重组人促红细胞生成素的HPLC与UPLC肽图谱分析", 中国预防医学杂志, no. 05 * |
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