CN111024863A - 一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法 - Google Patents

一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法。所述测试方法包括如下步骤：在液相环境中用蛋白变性液和二硫键还原剂对雷莫芦单抗样品进行变性还原处理；加入烷基化试剂，进行烷基化反应，用二巯基苏糖醇终止反应；进行脱盐，然后加入胰蛋白酶进行酶解，用有机酸终止酶解反应并酸化肽段；用超高效液相色谱进行检测，得到所述雷莫芦单抗的肽图。本发明提供的测试方法简单易行，90min即可完成测试，得到的肽图的各峰的分离度高，准确度高，方法的重复性好，稳定可行。

Description

一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法
技术领域
本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法。
背景技术
雷莫芦单抗是一种完全人源化IgG1单克隆抗体，分子式为C6376H9886N1702O1996S46，分子量约147kDa，它是由两条重链和两条轻链组成的多肽。两条重链分别由446个氨基酸组成，两条轻链分别由214个氨基酸组成。
雷莫芦单抗能特异性的与血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)结合，阻断VEGFR-2与其配体VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D的结合。雷莫芦单抗与VEGFR-2的结合力大约是VEGFR-2与其配体VEGF-A结合力的8倍，因此能抑制VEGF刺激内皮细胞的增殖和迁移，最终抑制肿瘤血管的生成。雷莫芦单抗目前被获批适用于晚期胃癌、食管胃交界腺癌、结肠癌及非小细胞肺癌的二线治疗。
肽谱图分析(Peptide Mapping)是根据蛋白质分子量大小以及一级结构氨基酸组成特点，使用专一性较强的胞内蛋白水解酶作用于特殊的肽链位点将蛋白裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成的特征性指纹图谱。
通过肽图可以对蛋白质或多肽类药物的多肽结构进行研究，而多肽结构又与药物的生物医药特性和功效息息相关。因此开发适宜的方法，对雷莫芦单抗的肽图进行测试具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法。该测试方法简单易行，得到的肽图的各峰的分离度高，准确度高，方法的重复性好，稳定可行。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法，所述测试方法包括如下步骤：
(1)在液相环境中用蛋白变性液和二硫键还原剂对雷莫芦单抗样品进行变性还原处理；
(2)在步骤(1)得到的溶液中加入烷基化试剂，进行烷基化反应，用二巯基苏糖醇终止反应；
(3)对步骤(2)得到的溶液进行脱盐，然后加入胰蛋白酶进行酶解，用有机酸终止酶解反应并酸化肽段；
(4)用超高效液相色谱对步骤(3)处理后的样品进行检测，得到所述雷莫芦单抗的肽图。
本发明采用胰蛋白酶对雷莫芦单抗进行酶解处理，结合超高效液相色谱实现了对雷莫芦单抗肽图的测试。该测试方法简单易行，得到的肽图的各峰的分离度高，准确度高，方法的重复性好。
作为本发明的优选技术方案，步骤(1)中所述蛋白变性液中含有盐酸胍；
优选地，步骤(1)所述液相环境中盐酸胍的浓度为5.5-6.5M，例如可以是5.5M、5.6M、5.7M、5.8M、5.9M、6M、6.1M、6.2M、6.3M、6.4M或6.5M等；进一步优选为6M。
如无特殊说明，则本发明中单位“M”为mol/L，单位“mM”为mmol/L。
优选地，步骤(1)中所述二硫键还原剂为二巯基苏糖醇。
优选地，步骤(1)所述液相环境中二巯基苏糖醇的浓度为40-60mM，例如可以是40mM、42mM、43mM、45mM、46mM、48mM、50mM、52mM、53mM、55mM、56mM、58mM或60mM等；进一步优选为50mM。
作为本发明的优选技术方案，步骤(1)中所述变性还原处理的温度为35-40℃，例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃或40℃等；进一步优选为37℃。
优选地，步骤(1)中所述变性还原处理的时间为1-3h，例如可以是1h、1.2h、1.5h、1.8h、2h、2.2h、2.5h、2.8h或3h等；进一步优选为1h。
作为本发明的优选技术方案，步骤(2)中所述烷基化试剂为碘乙酸。
优选地，步骤(2)中所述烷基化试剂的添加量为100-140mM，例如可以是100mM、102mM、105mM、108mM、110mM、112mM、115mM、118mM、120mM、122mM、125mM、128mM、130mM、132mM、135mM、138mM或140mM等；进一步优选为120mM。
需要说明的是，本发明中所述“添加量”是指试剂添加到溶液后的该试剂的终浓度。如“烷基化试剂的添加量为100-140mM”即是指添加烷基化试剂后，其在溶液中的终浓度为100-140mM。
优选地，步骤(2)中所述烷基化反应是在避光条件下进行。
优选地，步骤(2)中所述烷基化反应的温度为18-25℃，例如可以是18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃等；进一步优选为22℃。
优选地，步骤(2)中所述烷基化反应的时间为40-60min，例如可以是40min、42min、43min、45min、46min、48min、50min、52min、53min、55min、56min、58min或60min等；进一步优选为45min。
优选地，步骤(2)中所述二巯基苏糖醇的添加量为30-50mM，例如可以是30mM、32mM、33mM、35mM、36mM、38mM、40mM、42mM、43mM、45mM、46mM、48mM或50mM等；进一步优选为40mM。
作为本发明的优选技术方案，步骤(3)中所述脱盐的方法为超滤管离心脱盐或脱盐柱脱盐。
优选地，在步骤(3)中所述脱盐之后，还进行如下操作：用微量紫外分光光度计检测脱盐后的溶液中的雷莫芦单抗浓度。
优选地，步骤(3)中所述胰蛋白酶与脱盐后的溶液中的雷莫芦单抗的质量比为1:(12.5-50)，例如可以是1:12.5、1:14、1:15、1:18、1:20、1:22、1:25、1:28、1:30、1:32、1:35、1:38、1:40、1:42、1:45、1:48或1:50等；进一步优选为1:25。
作为本发明的优选技术方案，步骤(3)中所述酶解的温度为35-40℃，例如可以是35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃或40℃等；进一步优选为37℃。
优选地，步骤(3)中所述酶解的时间为1-4h，例如可以是1h、1.2h、1.5h、1.8h、2h、2.2h、2.5h、2.8h、3h、3.2h、3.5h、3.8h或4h等；进一步优选为2h。
优选地，步骤(3)中所述有机酸为甲酸。
优选地，步骤(3)中所述有机酸的添加量为0.1-0.2Vol％，例如可以是0.1Vol％、0.11Vol％、0.12Vol％、0.13Vol％、0.14Vol％、0.15Vol％、0.16Vol％、0.17Vol％、0.18Vol％、0.19Vol％或0.2Vol％等；进一步优选为0.1Vol％。
作为本发明的优选技术方案，步骤(4)中所述超高效液相色谱采用的色谱柱的固定相为C18
优选地，所述超高效液相色谱采用的色谱柱的温度为47-53℃，例如可以是47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃或53℃等；进一步优选为50℃。
优选地，所述超高效液相色谱的检测波长为210-220nm，例如可以是210nm、211nm、212nm、213nm、214nm、215nm、216nm、217nm、218nm、219nm或220nm等；进一步优选为214nm。
作为本发明的优选技术方案，所述超高效液相色谱采用的流动相为含有三氟乙酸和甲酸的水-乙腈混合溶液。
优选地，所述流动相的流速为0.25-0.35mL/min，例如可以是0.25mL/min、0.26mL/min、0.27mL/min、0.28mL/min、0.29mL/min、0.3mL/min、0.31mL/min、0.32mL/min、0.33mL/min、0.34mL/min或0.35mL/min等；进一步优选为0.3mL/min。
作为本发明的优选技术方案，所述超高效液相色谱采用流动相进行梯度洗脱。
优选地，所述梯度洗脱使用的流动相中乙腈的浓度随洗脱时间先增大后增减小。
优选地，所述梯度洗脱使用的流动相由如下体积百分比的流动相A和流动相B组成：0-5min：97-99％流动相A和1-3％流动相B；5-65min：93-95％流动相A和5-7％流动相B；65-70min：60-68％流动相A和32-40％流动相B；70-78min：35-45％流动相A和55-65％流动相B；78-80min：17-23％流动相A和77-83％流动相B；80-90min：97-99％流动相A和1-3％流动相B；所述流动相A为包括0.02Vol％三氟乙酸和0.08Vol％甲酸的水溶液；所述流动相B为包括0.02Vol％三氟乙酸和0.08Vol％甲酸的乙腈溶液。
优选地，所述梯度洗脱使用的流动相由如下体积百分比的流动相A和流动相B组成：0-5min：98％流动相A和2％流动相B；5-65min：94％流动相A和6％流动相B；65-70min：64％流动相A和36％流动相B；70-78min：40％流动相A和60％流动相B；78-80min：20％流动相A和80％流动相B；80-90min：98％流动相A和2％流动相B；所述流动相A为包括0.02Vol％三氟乙酸和0.08Vol％甲酸的水溶液；所述流动相B为包括0.02Vol％三氟乙酸和0.08Vol％甲酸的乙腈溶液。
作为本发明的优选技术方案，所述超高效液相色谱的进样体积为8-15μL，例如可以是8μL、9μL、10μL、11μL、12μL、13μL、14μL或15μL等；进一步优选为10μL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的测试方法简单易行，90min即可完成测试，得到的肽图的各峰的分离度高，准确度高，方法的重复性好，稳定可行。
附图说明
图1为实施例1中各试样的肽图图谱。
图2为实施例2中各试样的肽图图谱。
图3为实施例3中各试样的肽图图谱。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
本发明实施例中使用的样品、试剂及仪器信息如下表1-3所示：
表1 样品信息
Figure BDA0002353070330000061
Figure BDA0002353070330000071
表2 试剂信息
Figure BDA0002353070330000072
表3 仪器设备信息
Figure BDA0002353070330000073
Figure BDA0002353070330000081
实施例1
本实施例提供一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法，包括如下步骤：
(1)取样品500μg(取原研药Cyramza 50μL；平行取3份阳离子洗脱收集液1，每份36.4μL)，加入225μL蛋白变性液和15μL,1M的DTT溶液，用0.05M的Tris-HCl溶液(pH 8.0)补足至总体系为300μL，使盐酸胍浓度为6M，DTT浓度为50mM，混匀，37℃恒温孵育1h。
(2)加入12.5μL,3M的碘乙酸(IAA)溶液，使碘乙酸浓度为120mM，混匀，室温避光孵育45min；样品孵育完后，加入13μL,1M的DTT溶液，混匀，使该步DTT加入浓度为40mM，终止烷基化反应。
(3)将终止烷基化的样品转移到Millipore超滤管(10KD)中，用0.05M的Tris-HCl溶液(pH 8.0)补至0.5mL，混匀，12000G,8℃条件下离心12min进行脱盐，重复3次，然后收集截留液，用微量紫外分光光度计检测脱盐后的单抗蛋白浓度。
(4)取脱盐后的样品，用0.05M的Tris-HCl溶液(pH 8.0)进行稀释，取稀释后的样品各1份，按酶:样品＝1:25(w/w)加入胰蛋白酶酶解抗体蛋白，37℃孵育2h，酶解完后加入10％FA溶液使其终浓度为0.1％，以终止酶解反应，同时酸化肽段；
再取2份阳离子洗脱收集液1的脱盐后的样品各40μL，分别按酶:单抗蛋白＝1:12.5(w/w)和酶:单抗蛋白＝1:50(w/w)加入胰蛋白酶6μL、1.5μL酶解抗体蛋白，37℃孵育2h，酶解完后各加入0.4μL 10％FA使其终浓度为0.1％，以终止酶解反应，同时酸化肽段。
上述脱盐后的单抗蛋白浓度及稀释过程如下表4所示：
表4
Figure BDA0002353070330000091
(5)用超高效液相色谱对步骤(4)处理后的样品进行检测，色谱条件如下表5所示：
表5
Figure BDA0002353070330000092
Figure BDA0002353070330000101
本实施例得到的肽图图谱如图1所示，其中从下往上依次是Cyramza(原研药)、阳离子洗脱收集液1(酶:单抗蛋白＝1:25)的3个平行试样、阳离子洗脱收集液1(酶:单抗蛋白＝1:12.5)、阳离子洗脱收集液1(酶:单抗蛋白＝1:50)的肽图。由图1可以看出，各试样的峰型基本一致，只有圈出的几处略有差别，表明本发明提供的测试方法准确可靠，具有良好的重复性。
实施例2
本实施例提供一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法，与实施例1的区别在于，使用的样品为MV缓冲液和阳离子洗脱收集液1，阳离子洗脱收集液1的酶解时间为1h、2h(3个平行样)、4h、21h。其中，脱盐后的单抗蛋白浓度及稀释过程如下表6所示：
表6
Figure BDA0002353070330000102
本实施例得到的肽图图谱如图2所示。其中，从下往上依次是MV缓冲液、阳离子洗脱收集液1(酶解2h)的3个平行试样、阳离子洗脱收集液1(酶解1h)、阳离子洗脱收集液1(酶解4h)、阳离子洗脱收集液1(酶解21h)的肽图。由图2可以看出，阳离子洗脱收集液1(除酶解21h的试样外)的峰型基本一致，只有圈出的几处略有差别。缓冲液在样品主峰的出峰时间没有响应峰出现。表明本发明提供的测试方法具有良好的重复性，酶解适宜的时间为1-4h。
实施例3
本实施例提供一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法，与实施例1的区别在于，使用的样品为原研药Cyramza和阳离子洗脱收集液2，设置5组实验：
其中，1份原研药Cyramza和1份阳离子洗脱收集液2按照与实施例1相同的方法进行测试；
3份平行的阳离子洗脱收集液2的处理方法与实施例1的区别在于步骤(3)中用G-25脱盐柱脱盐，具体为：将G-25脱盐柱用5mL,0.05M的Tris-HCl溶液平衡，不再往下滴液体后，再重复平衡2次，加300μL终止烷基化的样品，不再往下滴液体后，加900μL,0.05M的Tris-HCl溶液洗柱，不再往下滴液体后，加150μL,0.05M的Tris-HCl溶液洗柱，收集洗脱液(3个平行样分别记为1-1、2-1、3-1)，再加150μL,0.05M的Tris-HCl溶液洗柱，收集洗脱液(3个平行样分别记为1-2、2-2、3-2)，再加150μL,0.05M的Tris-HCl溶液洗柱，收集洗脱液(3个平行样分别记为1-3、2-3、3-3)；
取其中的柱脱盐洗脱液1-2、2-2、3-2进行后续的酶解和测试，柱脱盐洗脱液1-2、2-2酶解时间为2h，柱脱盐洗脱液3-2的酶解时间为4h。
本实施例中，脱盐后的单抗蛋白浓度及稀释过程如下表7所示：
表7
Figure BDA0002353070330000111
Figure BDA0002353070330000121
本实施例得到的肽图图谱如图3所示。其中，从下往上依次是原研药Cyramza(Millipore超滤管脱盐，酶解2h)、阳离子洗脱收集液2(Millipore超滤管脱盐，酶解2h)、阳离子洗脱收集液2(G-25脱盐柱脱盐洗脱液1-2，酶解2h)、阳离子洗脱收集液2(G-25脱盐柱脱盐洗脱液2-2，酶解2h)、阳离子洗脱收集液2(G-25脱盐柱脱盐洗脱液3-2，酶解4h)。
由图3可以看出，各试样肽图的峰型基本一致，只有圈出的几处略有差别，表明本发明提供的测试方法准确可靠，具有良好的重复性。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种雷莫芦单抗的肽图的测试方法，其特征在于，所述测试方法包括如下步骤：
(1)在液相环境中用蛋白变性液和二硫键还原剂对雷莫芦单抗样品进行变性还原处理；
(2)在步骤(1)得到的溶液中加入烷基化试剂，进行烷基化反应，用二巯基苏糖醇终止反应；
(3)对步骤(2)得到的溶液进行脱盐，然后加入胰蛋白酶进行酶解，用有机酸终止酶解反应并酸化肽段；
(4)用超高效液相色谱对步骤(3)处理后的样品进行检测，得到所述雷莫芦单抗的肽图。
2.根据权利要求1所述的测试方法，其特征在于，步骤(1)中所述蛋白变性液中含有盐酸胍；
优选地，步骤(1)所述液相环境中盐酸胍的浓度为5.5-6.5M，进一步优选为6M；
优选地，步骤(1)中所述二硫键还原剂为二巯基苏糖醇；
优选地，步骤(1)所述液相环境中二巯基苏糖醇的浓度为40-60mM，进一步优选为50mM。
3.根据权利要求1或2所述的测试方法，其特征在于，步骤(1)中所述变性还原处理的温度为35-40℃，进一步优选为37℃；
优选地，步骤(1)中所述变性还原处理的时间为1-3h，进一步优选为1h。
4.根据权利要求1-3任一项所述的测试方法，其特征在于，步骤(2)中所述烷基化试剂为碘乙酸；
优选地，步骤(2)中所述烷基化试剂的添加量为100-140mM，进一步优选为120mM；
优选地，步骤(2)中所述烷基化反应是在避光条件下进行；
优选地，步骤(2)中所述烷基化反应的温度为18-25℃，进一步优选为22℃；
优选地，步骤(2)中所述烷基化反应的时间为40-60min，进一步优选为45min；
优选地，步骤(2)中所述二巯基苏糖醇的添加量为30-50mM，进一步优选为40mM。
5.根据权利要求1-4任一项所述的测试方法，其特征在于，步骤(3)中所述脱盐的方法为超滤管离心脱盐或脱盐柱脱盐；
优选地，在步骤(3)中所述脱盐之后，还进行如下操作：用微量紫外分光光度计检测脱盐后的溶液中的雷莫芦单抗浓度；
优选地，步骤(3)中所述胰蛋白酶与脱盐后的溶液中的雷莫芦单抗的质量比为1:(12.5-50)，进一步优选为1:25。
6.根据权利要求1-5任一项所述的测试方法，其特征在于，步骤(3)中所述酶解的温度为35-40℃，进一步优选为37℃；
优选地，步骤(3)中所述酶解的时间为1-4h，进一步优选为2h；
优选地，步骤(3)中所述有机酸为甲酸；
优选地，步骤(3)中所述有机酸的添加量为0.1-0.2Vol％，进一步优选为0.1Vol％。
7.根据权利要求1-6任一项所述的测试方法，其特征在于，步骤(4)中所述超高效液相色谱采用的色谱柱的固定相为C18；
优选地，所述超高效液相色谱采用的色谱柱的温度为47-53℃，进一步优选为50℃；
优选地，所述超高效液相色谱的检测波长为210-220nm，进一步优选为214nm。
8.根据权利要求1-7任一项所述的测试方法，其特征在于，所述超高效液相色谱采用的流动相为含有三氟乙酸和甲酸的水-乙腈混合溶液；
优选地，所述流动相的流速为0.25-0.35mL/min，进一步优选为0.3mL/min。
9.根据权利要求1-8任一项所述的测试方法，其特征在于，所述超高效液相色谱采用流动相进行梯度洗脱；
优选地，所述梯度洗脱使用的流动相中乙腈的浓度随洗脱时间先增大后增减小；
优选地，所述梯度洗脱使用的流动相由如下体积百分比的流动相A和流动相B组成：0-5min：97-99％流动相A和1-3％流动相B；5-65min：93-95％流动相A和5-7％流动相B；65-70min：60-68％流动相A和32-40％流动相B；70-78min：35-45％流动相A和55-65％流动相B；78-80min：17-23％流动相A和77-83％流动相B；80-90min：97-99％流动相A和1-3％流动相B；所述流动相A为包括0.02Vol％三氟乙酸和0.08Vol％甲酸的水溶液；所述流动相B为包括0.02Vol％三氟乙酸和0.08Vol％甲酸的乙腈溶液；
优选地，所述梯度洗脱使用的流动相由如下体积百分比的流动相A和流动相B组成：0-5min：98％流动相A和2％流动相B；5-65min：94％流动相A和6％流动相B；65-70min：64％流动相A和36％流动相B；70-78min：40％流动相A和60％流动相B；78-80min：20％流动相A和80％流动相B；80-90min：98％流动相A和2％流动相B；所述流动相A为包括0.02Vol％三氟乙酸和0.08Vol％甲酸的水溶液；所述流动相B为包括0.02Vol％三氟乙酸和0.08Vol％甲酸的乙腈溶液。
10.根据权利要求1-9任一项所述的测试方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的进样体积为8-15μL，进一步优选为10μL。
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