CN111808818A - 表达hla-g2异构体标准蛋白的细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了表达HLA‑G2异构体标准蛋白的细胞株，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202012。其能够稳定表达HLA‑G2异构体标准蛋白，能在人类白细胞抗原‑G异构体分子HLA‑G2流式细胞术、免疫印迹、组织及细胞免疫组化、HLA‑G异构体功能研究及特异性抗体开发筛选作为标准参照物等应用。

Description

表达HLA-G2异构体标准蛋白的细胞株及其应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，特别涉及已知7种人类白细胞抗原-G(HLA-G)异构体分子 (HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7)表达载体构建及稳定表达的细胞株，可作为特定HLA-G异构体分子(HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7)流式细胞术、免疫印迹、组织及细胞免疫组化、HLA-G异构体功能研究及特异性抗体开发筛选作为标准参照物等应用。
背景技术
人类白细胞抗原-G(human leukocyte antigen-G,HLA-G)基因，全长6.0kb，位于人类第 6号染色体短臂远侧6p21.3。在蛋白质翻译过程中，HLA-G mRNA第1外显子编码信号肽，第2、3和第4外显子分别编码细胞外区的α1、α2和α3结构域，第5位外显子编码跨膜区；第6外显子编码仅含6个氨基酸残基的HLA-G分子胞内段；由于外显子6内含有终止密码子，第7外显子不被转录；第8外显子对应于HLA-G基因的3′UTR。
HLA-G初始转录产物经选择性剪接，可产生7种成熟mRNA，分别编码7种不同分子量的异构体分子(HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7)。HLA-G1是由全长HLA-G mRNA编码，结构上类似于HLA Ia抗原分子。HLA-G2缺乏α2结构域；HLA-G3缺乏α2 和α3结构域；HLA-G4缺乏α3结构域；HLA-G5及HLA-G6胞外区结构域分别与HLA-G1 及HLA-G2相同，但它们由含有内含子4的HLA-G mRNA编码，因内含子4中含有终止密码子，所编码的蛋白分子缺乏由外显子5所编码的跨膜区，形成可溶性HLA-G分子。编码 HLA-G7的mRNA由于内含子2中含有终止密码子，胞外区仅含α1结构域及由内含子2所编码的2个氨基酸残基相连(图1)。HLA-G1～-G7异构体分子的分子量分别为39kD、31kD、 23kD、30kD、37kD、27kD及16kD。
生理情况下，HLA-G分子仅表达在母胎界面的绒毛外滋养层细胞，在维持母胎免疫耐受中起重要作用。病理情况下，HLA-G分子能在多种肿瘤细胞及病毒感染等组织细胞中诱导性表达，与疾病的发生及进展密切相关。目前已广泛认同HLA-G分子是体内一个重要的免疫致耐分子，其免疫抑制功能主要通过结合免疫抑制性受体免疫球蛋白样转录物-2(immunoglobulin-like transcript-2,ILT2/LILRB1/CD85j)、免疫球蛋白样转录物-4(ILT4/LILRB2/CD85d),传递抑制信号，诱导免疫耐受。具体作用机制有：①与表达在T 细胞、NK细胞和B细胞上的ILT2结合，抑制T细胞和NK细胞免疫杀伤活性，及B细胞增殖和抗体分泌等功能。②与树突状细胞(DC)上的ILT2、ILT4结合，抑制DC细胞的成熟和分化，诱导产生耐受性DC细胞。③与骨髓来源抑制性细胞(MDSC)和巨噬细胞(Mφ) 上的ILT2、ILT4结合，诱导促炎抗肿瘤的M1向免疫致耐性M2细胞分化。因此，HLA-G分子是机体内一个重要的免疫耐受分子。
此外，HLA-G与受体ILT2、ILT4结合，具有分子结构特异性。受体ILT2、ILT4与HLA-G结合的位点HLA-G胞外区α3结构域。ILT2仅结合HLA-G/β2m复合物，而ILT4不仅可以与 HLA-G/β2m结合，同时可以与不含β2m的游离HLA-G分子结合。由于HLA-G1、-G2、-G3、 -G4、-G5、-G6及HLA-G7在表达机制及分子结构上存在差异，如HLA-G3、-G4、及HLA-G7 不含α3结构域，不能与ILT2和ILT4结合。因此，不同HLA-G异构体分子可在病理生理过程中发挥特定的免疫学效应。
在不同病理状态下，尤其在肿瘤组织细胞中，HLA-G异构体表达存在广泛的异质性，不同HLA-G分子异构体的表达具有特定的临床意义。分析特定HLA-G异构体分子表达及不同 HLA-G异构体分子表达谱，对于阐述特定HLA-G异构体分子的生物学功能及其临床意义具有重要意义。
但目前尚无用于检测特定HLA-G异构体分子的抗体。目前已广泛应用，通过免疫组化或免疫印迹检测HLA-G分子表达的抗体4H84，其识别位点位于7种HLA-G异构体分子均具有的胞外区α1结构域，特异性上能够检测含有α1结构域的7种HLA-G异构体分子，在免疫组化中不能区分具体特定HLA-G异构体分子的表达。同时，HLA-G1～-G7异构体分子的分子量分别为39kD、31kD、23kD、30kD、37kD、27kD及16kD，分子量相近的HLA-G异构体分子如HLA-G1(39kD)和HLA-G5(37kD)、HLA-G2(31kD)和HLA-G4(30kD)、HLA-G3 (23kD)和HLA-G6(27kD)，以及分子量较小的HLA-G7(16kD)等，由于缺乏特定HLA-G异构体分子的标准参照，在免疫印迹检测中不容易区分特定HLA-G异构体分子的表达。更重要的是，在针对HLA-G异构体抗体研发过程中，HLA-G异构体抗原参照物是特异性抗体筛选的必要条件。
因此，建立分别稳定表达7种HLA-G(HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7) 异构体分子的细胞系，作为HLA-G分子检测及特异性抗体筛选的标准参照物，在HLA-G相关基础、临床研究及抗体研发过程中具有重要应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供7种HLA-G异构体分子(HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6 及HLA-G7)稳定表达的肿瘤细胞株，细胞株命名：表达HLA-G1标准蛋白的K562细胞株 (K562-HLA-G1)，表达HLA-G2标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G2)、表达HLA-G3 标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G3)、表达HLA-G4标准蛋白的K562细胞株 (K562-HLA-G4)、表达HLA-G5标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G5)、表达HLA-G6 标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G6)及表达HLA-G7标准蛋白的K562细胞株(K562- HLA-G7)。其保藏信息分别为：
表达HLA-G1标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G1)，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202004，保藏时间为2020年1月9日。核苷酸序列为序列表中Seq No.1.HLA-G1核苷酸序列，氨基酸序列为序列表中Seq No.2.HLA-G1氨基酸序列。
表达HLA-G2标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G2)，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202012，保藏时间为2020年1月9日。核苷酸序列为序列表中Seq No.3.HLA-G2核苷酸序列，氨基酸序列为序列表中Seq No.4.HLA-G2氨基酸序列。
表达HLA-G3标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G3)，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202013，保藏时间为2020年1月9日。核苷酸序列为序列表中Seq No.5.HLA-G3核苷酸序列，氨基酸序列为序列表中Seq No.6.HLA-G3氨基酸序列。
表达HLA-G4标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G4)，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202014，保藏时间为2020年1月9日。核苷酸序列为序列表中Seq No.7.HLA-G4核苷酸序列，氨基酸序列为序列表中Seq No.8.HLA-G4氨基酸序列。
表达HLA-G5标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G5)，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202015，保藏时间为2020年1月9日。核苷酸序列为序列表中Seq No.9.HLA-G5核苷酸序列，氨基酸序列为序列表中Seq No.10.HLA-G5氨基酸序列。
表达HLA-G6标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G6)，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202016，保藏时间为2020年1月9日。核苷酸序列为序列表中Seq No.11.HLA-G6核苷酸序列，氨基酸序列为序列表中Seq No.12.HLA-G6氨基酸序列。
表达HLA-G7标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G7)，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202017，保藏时间为2020年1月9日。核苷酸序列为序列表中Seq No.13.HLA-G7核苷酸序列，氨基酸序列为序列表中Seq No.14.HLA-G7氨基酸序列。
中国典型培养物保藏中心的地址是中国湖北省武汉市武汉大学，邮编430072。
由K562-HLA-G1、K562-HLA-G2、K562-HLA-G3、K562-HLA-G4、K562-HLA-G5、 K562-HLA-G6及K562-HLA-G7细胞株生产的HLA-G异构体分子重链量分别为39kD、31kD、 23kD、30kD、37kD、27kD及16kD；轻链即β2微球蛋白(β2m)，分子量12kDa，由人类第15号染色体编码。稳定表达的HLA-G异构体分子(HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6 及HLA-G7)可作为流式细胞术、免疫印迹、细胞及组织免疫组化、HLA-G异构体功能研究及特异性抗体开发筛选作为标准参照物等应用。
本发明肿瘤细胞株的建株方法如下：采用分子生物学方法分离来源于人绒癌细胞株JEG-3 的HLA-G1～HLA-G7异构体编码基因与真核细胞表达质粒载体pVITRO2-mcs重组，并将其转染至HLA表达阴性的白血病细胞系K562中进行表达，通过多种分子生物学方法鉴定转染细胞系HLA-G1～HLA-G7异构体分子的表达，完成首轮初筛。初筛后的细胞株，通过有限稀释法进行肿瘤细胞株的克隆化培养，复筛以确定HLA-G1～HLA-G7蛋白的表达量高低，挑选表达量最高的细胞株，命名为K562-HLA-G1，K562-HLA-G2、K562-HLA-G3、K562-HLA-G4、K562-HLA-G5、K562-HLA-G6及K562-HLA-G7，-196℃液氮保存，每1-2月复苏一管细胞检验其细胞活力。
采用传统的细胞株鉴定与分子生物学鉴定相结合的方式对筛选得到的细胞株进行鉴定。本发明采用RT-PCR(图2-1、图2-2、图2-3、图2-4、图2-5、图2-6、图2-7)、免疫细胞化学法(图3)、Western blot(图4)及流式细胞术(图5)等技术方法对目的基因及蛋白表达进行鉴定，整个发明过程具有操作简单，设计完整等特点。结果证明表达的HLA-G1、-G2、 -G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7异构体分子量完全符合文献报道。
本发明建立稳定表达HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7的K562细胞系，可应用于HLA-G异构体分子(HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7)流式细胞术、免疫印迹、组织及细胞免疫组化、HLA-G异构体功能研究及特异性抗体开发筛选作为标准参照物等，具有重要应用价值。
在本说明书上下文中，除非特别指明，否则所引用的任何技术术语具有本领域普通技术人员在本领域中通常理解的含义，而未注明的实验方法是按照常规实验方法进行或按照供应商所建议的操作说明进行。
附图说明
图1是HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7异构体的分子结构模式图。
图2-1、图2-2、图2-3、图2-4、图2-5、图2-6、图2-7分别是HLA-G1、-G2、-G3、-G4、 -G5、-G6及HLA-G7构建成功基因序列测序结果图。
图3是RT-PCR技术鉴定稳定表达HLA-G异构体分子HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、 -G6及HLA-G7 mRNA表达电泳图，其中泳道1：核酸Marker；泳道2～8：HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7 mRNA。
图4是流式细胞术鉴定转染细胞中HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7表达。
图5是Western blot技术鉴定转染细胞中HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7异构体蛋白分子量，其中泳道1：K562-pv细胞；泳道2～8：分别稳定表达HLA-G1、-G2、-G3、 -G4、-G5、-G6及HLA-G7异构体的K562细胞系。
图6是HLA-G异构体在抗体研发筛选中作为标准蛋白，以HLA-G5和HLA-G6为例。
图7是稳定表达HLA-G1及HLA-G5异构体对NK细胞功能的影响。
具体实施方式
以下实施例提供了实现本发明的优选实施方案。本领域技术人员可以理解的是，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。下面的实施例中所公开的技术表示由本发明人所发现的技术，这些技术能有效实施本发明。不过，本领域技术人员可以理解，在不超出本发明的构思的前提下，可以对这些具体实施方案进行多种改变，仍然能获得相似的结果。
实施例1：HLA-G1～-G7异构体基因克隆和pVITRO2-mcs-HLA-G重组质粒构建
分别编码含酶切位点的HLA-G1～-G7异构体基因序列的RT-PCR扩增，以人绒癌细胞株 JEG-3基因为模板，按照以下条件进行HLA-G1～-G7异构体mRNA扩增。引物序列及扩增产物长度如表1：
表1 HLA-G1～-G7 RT-PCR扩增引物序列
Figure RE-GDA0002671820640000051
注:大写字母序列为核酸内切酶EcoR I and Xho I序列.
PCR反应体系：
H2O 50μL；Buffer(10×)5μL；Mg2+(25mmol/L)2μL；3′-Primer(25μmol/L)2μL； 5′-Primer(25μmol/L)2μL；dNTP(20mmol/L)1μL；Template(10ng/μL)1μL；Taq Polymerase(5U/μL)1μL。
PCR程序：
1. 95℃预变性5min
2. 94℃变性60s，60℃退火60s，72℃延伸2min
3.依步骤2循环35次
4. 72℃延伸10min
含编码HLA-G1～-G7异构体基因序列的pGEM-T重组质粒的构建：将PCR扩增所得的HLA-G1～-G7基因分别克隆入pGEM-T质粒，转化至大肠杆菌DH5α中扩增。提取该重组质粒，经酶切鉴定后送样测序，获得HLA-G基因序列与http://www.anthonynolan.org.uk基因序列比对，HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7编码基因序列与HLA-G*01:01:03 序列一致。HLA-G1～-G7异构体基因测序结果(图2-1、图2-2、图2-3、图2-4、图2-5、图2-6、图2-7)。
HLA-G1～-G7异构体编码基因pVITRO2-mcs重组表达质粒的构建：用EcoR I和XhoI 分别酶切上述步骤中得到的含内切酶位点的编码HLA-G1～-G7异构体基因片段和pVITRO2-mcs质粒。分别回收酶切后的含酶切位点的编码HLA-G基因片段以及pVITRO2-mcs质粒酶切产物片段，并将两者连接，分别构建HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7 重组表达质粒pVITRO2-mcs-HLA-G。将该重组质粒转入大肠杆菌DH5α扩增并提取质粒，经过EcoRI和Xho I酶切鉴定，结果表明目的基因片段已插入载体质粒。重组质粒酶切电泳结果见图3。HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7目的基因在pVITRO2-mcs-HLA-G 质粒上的详细序列见本发明的序列表。
核苷酸序列为序列表中Seq No.1.HLA-G1核苷酸序列，氨基酸序列为序列表中SeqNo.2. HLA-G1氨基酸序列。核苷酸序列为序列表中Seq No.3.HLA-G2核苷酸序列，氨基酸序列为序列表中Seq No.4.HLA-G2氨基酸序列。核苷酸序列为序列表中Seq No.5.HLA-G3核苷酸序列，氨基酸序列为序列表中Seq No.6.HLA-G3氨基酸序列。核苷酸序列为序列表中SeqNo.7. HLA-G4核苷酸序列，氨基酸序列为序列表中Seq No.8.HLA-G4氨基酸序列。核苷酸序列为序列表中Seq No.9.HLA-G5核苷酸序列，氨基酸序列为序列表中Seq No.10.HLA-G5氨基酸序列。核苷酸序列为序列表中Seq No.11.HLA-G6核苷酸序列，氨基酸序列为序列表中Seq No.12.HLA-G6氨基酸序列。核苷酸序列为序列表中Seq No.13.HLA-G7核苷酸序列，氨基酸序列为序列表中Seq No.14.HLA-G7氨基酸序列。
实施例2：稳定表达HLA-G1～-G7异构体的K562细胞系鉴定
采用RT-PCR鉴定转染细胞中HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7异构体的mRNA表达：Trizol试剂分别提取各转染细胞株总mRNA后，经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定未见降解，A260/280比值为2.0019。取2μl总mRNA，逆转录合成cDNA第一条链。 PCR反应参数为：94℃预变性4min；94℃1min,60℃1min，72℃2min，共35个循环；最后72℃延伸10min。取5μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。RT-PCR扩增所得HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7特异性条带均符合预期目的片段长度。结果说明HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7异构体分子在K562细胞稳定表达 (图3)。
采用Western blot法鉴定转染细胞中HLA-G蛋白的分子量：取出10μl细胞裂解物行 SDS-PAGE。电转膜后，用5％去脂奶粉室温封闭4h，0.2％TBS(Teween-20 PBS)洗涤。加入HLA-G单抗4H84(该抗体识别位点位于HLA-G分子α1结构域，可检测所有7种HLA-G异构体分子)，4℃孵育过夜，洗涤；加入HRP标记兔抗鼠IgG抗体,室温孵育30min，洗涤后，用DakoREALTM EnVisionTM检测系统(DAKO)孵育1～3min。研究结果显示：结果说明 HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7异构体分子在K562细胞成功稳定表达，HLA-G1～ -G7异构体分子的分子量分别为39kD,31kD,23kD,30kD,37kD,27kD及16kD，分子量大小符合预期(图4)。表达HLA-G1标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G1)，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202004，保藏时间为2020年1月9日。表达HLA-G2 标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G2)，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202012，保藏时间为2020年1月9日。表达HLA-G3标准蛋白的K562细胞株 (K562-HLA-G3)，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202013，保藏时间为2020年1月9日。表达HLA-G4标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G4)，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202014，保藏时间为2020年1月9日。表达HLA-G5标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G5)，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202015，保藏时间为2020年1月9日。表达HLA-G6标准蛋白的K562细胞株(K562-HLA-G6)，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202016，保藏时间为2020年1月9日。表达HLA-G7标准蛋白的K562细胞株(K562- HLA-G7)，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202017，保藏时间为2020年1月9日。
采用流式细胞术鉴定转染细胞中HLA-G的蛋白表达：细胞培养至对数生长期，收集细胞， PBS洗涤后，采用MEM-G/9抗体标记(该抗体的特异性可以检测膜结合型HLA-G1及可溶性 HLA-G5异构体)，结果显示，以：K562-HLA-G1及HLA-G5细胞株为例(图5)。
实施例3：HLA-G异构体在抗体研发筛选中作为标准蛋白(图6)
新抗体1研发(图6中的A分图)：将HLA-G5及HLA-G6标准蛋白电转膜后，用5％去脂奶粉室温封闭4h，0.2％TBS(Teween-20 PBS)洗涤。加入新抗体1，检测其识别特异性，4℃孵育过夜，洗涤；加入HRP标记兔抗鼠IgG抗体,室温孵育30min，洗涤后，用Dako REALTMEnVisionTM检测系统(DAKO)孵育1～3min。结果显示：结果说明新抗体1能特异性识别 HLA-G5及HLA-G6标准蛋白。
新抗体2研发(图6中的B分图)：将HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6及HLA-G7标准蛋白电转膜后，用5％去脂奶粉室温封闭4h，0.2％TBS(Teween-20 PBS)洗涤。加入新抗体2，检测其识别特异性，4℃孵育过夜，洗涤；加入HRP标记兔抗鼠IgG抗体,室温孵育30min，洗涤后，用Dako REALTM EnVisionTM检测系统(DAKO)孵育1～3min。结果显示：结果说明新抗体2能特异性识别HLA-G5及HLA-G6标准蛋白。
新抗体3研发(图6中的C分图)：将HLA-G5标准蛋白电转膜后，用5％去脂奶粉室温封闭 4h，0.2％TBS(Teween-20 PBS)洗涤。加入免疫小鼠血清，检测其识别特异性，4℃孵育过夜，洗涤；加入HRP标记兔抗鼠IgG抗体,室温孵育30min，洗涤后，用Dako REALTMEnVisionTM检测系统(DAKO)孵育1～3min。结果显示：结果说明新抗体3小鼠血清#1，#4号已产生能够特异性识别HLA-G标准蛋白的抗血清，其他小鼠血清为非特异性血清，为判断免疫小鼠是否产生特异性抗体提供判断基础。
实施例4：稳定表达HLA-G1及HLA-G5异构体对NK细胞功能的影响
将NK-92细胞分别和稳定表达HLA-G1和HLA-G5蛋白的K562细胞按1:1共培养4小时后，收集细胞培养上清液，磁珠法流式细胞仪检测细胞培养上清液中NK细胞释放的白细胞介素-2 (IL-2)，IL-6，IL-10和干扰素-γ(IFN-γ)的浓度。结果显示，HLA-G1和HLA-G5蛋白对NK 细胞细胞因子的释放具有不同的效应(图7)。
Figure RE-GDA0002671820640000091
Figure RE-GDA0002671820640000101
Figure RE-GDA0002671820640000111
Figure RE-GDA0002671820640000121
Figure RE-GDA0002671820640000131
Figure RE-GDA0002671820640000141
Figure RE-GDA0002671820640000151
Figure RE-GDA0002671820640000161
Figure RE-GDA0002671820640000171
序列表
<110> 台州恩泽医疗中心（集团）
<120> 表达HLA-G2异构体标准蛋白的细胞株及其应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1017
<212> DNA
<213> K562-HLA-G1
<400> 1
atggtggtca tggcgccccg aaccctcttc ctgctactct cgggggccct gaccctgacc 60
gagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttcagcg ccgccgtgtc ccggcccggc 120
cgcggggagc cccgcttcat cgccatgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180
gacagcgact cggcgtgtcc gaggatggag ccgcgggcgc cgtgggtgga gcaggagggg 240
ccagagtatt gggaagagga gacacggaac accaaggccc acgcacagac tgacagaatg 300
aacctgcaga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccagttctca caccctccag 360
tggatgattg gctgcgacct ggggtccgac ggtcgcctcc tccgcgggta tgaacagtat 420
gcctacgatg gcaaggatta cctcgccctg aacgaggacc tgcgctcctg gaccgcagcg 480
gacactgcgg ctcagatctc caagcgcaag tgtgaggcgg ccaatgtggc tgaacaaagg 540
agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccaca gatacctgga gaacgggaag 600
gagatgctgc agcgcgcgga cccccccaag acacacgtga cccaccaccc tgtctttgac 660
tatgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat catactgacc 720
tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacgtggagc tcgtggagac caggcctgca 780
ggggatggaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtgc cttctggaga ggagcagaga 840
tacacgtgcc atgtgcagca tgaggggctg ccggagcccc tcatgctgag atggaagcag 900
tcttccctgc ccaccatccc catcatgggt atcgttgctg gcctggttgt ccttgcagct 960
gtagtcactg gagctgcggt cgctgctgtg ctgtggagga agaagagctc agattga 1017
<210> 2
<211> 338
<212> PRT
<213> K562-HLA-G1
<400> 2
Met Val Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe
20 25 30
Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala
35 40 45
Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser
50 55 60
Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly
65 70 75 80
Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln
85 90 95
Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser
100 105 110
Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly
115 120 125
Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly
130 135 140
Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala
145 150 155 160
Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val
165 170 175
Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu
180 185 190
His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro
195 200 205
Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr
210 215 220
Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr
225 230 235 240
Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu
245 250 255
Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val
260 265 270
Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu
275 280 285
Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Trp Lys Gln Ser Ser Leu Pro
290 295 300
Thr Ile Pro Ile Met Gly Ile Val Ala Gly Leu Val Val Leu Ala Ala
305 310 315 320
Val Val Thr Gly Ala Ala Val Ala Ala Val Leu Trp Arg Lys Lys Ser
325 330 335
Ser Asp
<210> 3
<211> 741
<212> DNA
<213> K562-HLA-G2
<400> 3
atggtggtca tggcgccccg aaccctcttc ctgctactct cgggggccct gaccctgacc 60
gagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttcagcg ccgccgtgtc ccggcccggc 120
cgcggggagc cccgcttcat cgccatgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180
gacagcgact cggcgtgtcc gaggatggag ccgcgggcgc cgtgggtgga gcaggagggg 240
ccagagtatt gggaagagga gacacggaac accaaggccc acgcacagac tgacagaatg 300
aacctgcaga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccaacccccc caagacacac 360
gtgacccacc accctgtctt tgactatgag gccaccctga ggtgctgggc cctgggcttc 420
taccctgcgg agatcatact gacctggcag cgggatgggg aggaccagac ccaggacgtg 480
gagctcgtgg agaccaggcc tgcaggggat ggaaccttcc agaagtgggc agctgtggtg 540
gtgccttctg gagaggagca gagatacacg tgccatgtgc agcatgaggg gctgccggag 600
cccctcatgc tgagatggaa gcagtcttcc ctgcccacca tccccatcat gggtatcgtt 660
gctggcctgg ttgtccttgc agctgtagtc actggagctg cggtcgctgc tgtgctgtgg 720
aggaagaaga gctcagattg a 741
<210> 4
<211> 246
<212> PRT
<213> K562-HLA-G2
<400> 4
Met Val Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe
20 25 30
Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala
35 40 45
Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser
50 55 60
Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly
65 70 75 80
Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln
85 90 95
Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser
100 105 110
Glu Ala Asn Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Val Phe Asp
115 120 125
Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu
130 135 140
Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Val
145 150 155 160
Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp
165 170 175
Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His
180 185 190
Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Trp Lys Gln
195 200 205
Ser Ser Leu Pro Thr Ile Pro Ile Met Gly Ile Val Ala Gly Leu Val
210 215 220
Val Leu Ala Ala Val Val Thr Gly Ala Ala Val Ala Ala Val Leu Trp
225 230 235 240
Arg Lys Lys Ser Ser Asp
245
<210> 5
<211> 465
<212> DNA
<213> K562-HLA-G3
<400> 5
atggtggtca tggcgccccg aaccctcttc ctgctactct cgggggccct gaccctgacc 60
gagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttcagcg ccgccgtgtc ccggcccggc 120
cgcggggagc cccgcttcat cgccatgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180
gacagcgact cggcgtgtcc gaggatggag ccgcgggcgc cgtgggtgga gcaggagggg 240
ccagagtatt gggaagagga gacacggaac accaaggccc acgcacagac tgacagaatg 300
aacctgcaga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccaagcagtc ttccctgccc 360
accatcccca tcatgggtat cgttgctggc ctggttgtcc ttgcagctgt agtcactgga 420
gctgcggtcg ctgctgtgct gtggaggaag aagagctcag attga 465
<210> 6
<211> 154
<212> PRT
<213> K562-HLA-G3
<400> 6
Met Val Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe
20 25 30
Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala
35 40 45
Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser
50 55 60
Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly
65 70 75 80
Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln
85 90 95
Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser
100 105 110
Glu Ala Lys Gln Ser Ser Leu Pro Thr Ile Pro Ile Met Gly Ile Val
115 120 125
Ala Gly Leu Val Val Leu Ala Ala Val Val Thr Gly Ala Ala Val Ala
130 135 140
Ala Val Leu Trp Arg Lys Lys Ser Ser Asp
145 150
<210> 7
<211> 741
<212> DNA
<213> K562-HLA-G4
<400> 7
atggtggtca tggcgccccg aaccctcttc ctgctactct cgggggccct gaccctgacc 60
gagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttcagcg ccgccgtgtc ccggcccggc 120
cgcggggagc cccgcttcat cgccatgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180
gacagcgact cggcgtgtcc gaggatggag ccgcgggcgc cgtgggtgga gcaggagggg 240
ccagagtatt gggaagagga gacacggaac accaaggccc acgcacagac tgacagaatg 300
aacctgcaga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccagttctca caccctccag 360
tggatgattg gctgcgacct ggggtccgac ggtcgcctcc tccgcgggta tgaacagtat 420
gcctacgatg gcaaggatta cctcgccctg aacgaggacc tgcgctcctg gaccgcagcg 480
gacactgcgg ctcagatctc caagcgcaag tgtgaggcgg ccaatgtggc tgaacaaagg 540
agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccaca gatacctgga gaacgggaag 600
gagatgctgc agcgcgcgga gcagtcttcc ctgcccacca tccccatcat gggtatcgtt 660
gctggcctgg ttgtccttgc agctgtagtc actggagctg cggtcgctgc tgtgctgtgg 720
aggaagaaga gctcagattg a 741
<210> 8
<211> 246
<212> PRT
<213> K562-HLA-G4
<400> 8
Met Val Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe
20 25 30
Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala
35 40 45
Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser
50 55 60
Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly
65 70 75 80
Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln
85 90 95
Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser
100 105 110
Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly
115 120 125
Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly
130 135 140
Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala
145 150 155 160
Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val
165 170 175
Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu
180 185 190
His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Met Leu Gln Arg Ala Glu Gln
195 200 205
Ser Ser Leu Pro Thr Ile Pro Ile Met Gly Ile Val Ala Gly Leu Val
210 215 220
Val Leu Ala Ala Val Val Thr Gly Ala Ala Val Ala Ala Val Leu Trp
225 230 235 240
Arg Lys Lys Ser Ser Asp
245
<210> 9
<211> 960
<212> DNA
<213> K562-HLA-G5
<400> 9
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gagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttcagcg ccgccgtgtc ccggcccggc 120
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gacagcgact cggcgtgtcc gaggatggag ccgcgggcgc cgtgggtgga gcaggagggg 240
ccagagtatt gggaagagga gacacggaac accaaggccc acgcacagac tgacagaatg 300
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tggatgattg gctgcgacct ggggtccgac ggtcgcctcc tccgcgggta tgaacagtat 420
gcctacgatg gcaaggatta cctcgccctg aacgaggacc tgcgctcctg gaccgcagcg 480
gacactgcgg ctcagatctc caagcgcaag tgtgaggcgg ccaatgtggc tgaacaaagg 540
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gagatgctgc agcgcgcgga cccccccaag acacacgtga cccaccaccc tgtctttgac 660
tatgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat catactgacc 720
tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacgtggagc tcgtggagac caggcctgca 780
ggggatggaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtgc cttctggaga ggagcagaga 840
tacacgtgcc atgtgcagca tgaggggctg ccggagcccc tcatgctgag atggagtaag 900
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<210> 10
<211> 319
<212> PRT
<213> K562-HLA-G5
<400> 10
Met Val Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe
20 25 30
Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala
35 40 45
Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser
50 55 60
Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly
65 70 75 80
Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln
85 90 95
Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser
100 105 110
Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly
115 120 125
Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly
130 135 140
Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala
145 150 155 160
Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val
165 170 175
Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu
180 185 190
His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro
195 200 205
Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr
210 215 220
Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr
225 230 235 240
Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu
245 250 255
Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val
260 265 270
Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu
275 280 285
Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Trp Ser Lys Glu Gly Asp Gly
290 295 300
Gly Ile Met Ser Val Arg Glu Ser Arg Ser Leu Ser Glu Asp Leu
305 310 315
<210> 11
<211> 684
<212> DNA
<213> K562-HLA-G6
<400> 11
atggtggtca tggcgccccg aaccctcttc ctgctactct cgggggccct gaccctgacc 60
gagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttcagcg ccgccgtgtc ccggcccggc 120
cgcggggagc cccgcttcat cgccatgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180
gacagcgact cggcgtgtcc gaggatggag ccgcgggcgc cgtgggtgga gcaggagggg 240
ccagagtatt gggaagagga gacacggaac accaaggccc acgcacagac tgacagaatg 300
aacctgcaga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccaacccccc caagacacac 360
gtgacccacc accctgtctt tgactatgag gccaccctga ggtgctgggc cctgggcttc 420
taccctgcgg agatcatact gacctggcag cgggatgggg aggaccagac ccaggacgtg 480
gagctcgtgg agaccaggcc tgcaggggat ggaaccttcc agaagtgggc agctgtggtg 540
gtgccttctg gagaggagca gagatacacg tgccatgtgc agcatgaggg gctgccggag 600
cccctcatgc tgagatggag taaggaggga gatggaggca tcatgtctgt tagggaaagc 660
aggagcctct ctgaagacct ttaa 684
<210> 12
<211> 227
<212> PRT
<213> K562-HLA-G6
<400> 12
Met Val Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe
20 25 30
Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala
35 40 45
Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser
50 55 60
Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly
65 70 75 80
Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln
85 90 95
Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser
100 105 110
Glu Ala Asn Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Val Phe Asp
115 120 125
Tyr Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu
130 135 140
Ile Ile Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Val
145 150 155 160
Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp
165 170 175
Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His
180 185 190
Val Gln His Glu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Trp Ser Lys
195 200 205
Glu Gly Asp Gly Gly Ile Met Ser Val Arg Glu Ser Arg Ser Leu Ser
210 215 220
Glu Asp Leu
225
<210> 13
<211> 363
<212> DNA
<213> K562-HLA-G7
<400> 13
atggtggtca tggcgccccg aaccctcttc ctgctactct cgggggccct gaccctgacc 60
gagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttcagcg ccgccgtgtc ccggcccggc 120
cgcggggagc cccgcttcat cgccatgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180
gacagcgact cggcgtgtcc gaggatggag ccgcgggcgc cgtgggtgga gcaggagggg 240
ccagagtatt gggaagagga gacacggaac accaaggccc acgcacagac tgacagaatg 300
aacctgcaga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccagtgagta actccggccc 360
agg 363
<210> 14
<211> 116
<212> PRT
<213> K562-HLA-G7
<400> 14
Met Val Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe
20 25 30
Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala
35 40 45
Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser
50 55 60
Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly
65 70 75 80
Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln
85 90 95
Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser
100 105 110
Glu Ala Ser Glu
115
<210> 15
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcgagaattc atggtggtca tggcgccccg aa 32
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcgactcgag tcaatctgag ctcttctt 28
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcgagaattc atggtggtca tggcgccccg aa 32
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcgactcgag ccaccgaccc tgtta 25
<210> 19
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tcgagaattc atggtggtca tggcgccccg aa 32
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcgactcgag cctgggccgg agtta 25

Claims (3)

1.表达HLA-G2异构体标准蛋白的细胞株，保藏机构为：中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:C202012。
2.权利要求1所述的表达HLA-G2异构体标准蛋白的细胞株，作为表达HLA-G2异构体标准蛋白，将所表达的HLA-G2异构体标准蛋白作为标准参照物的应用。
3.权利要求1所述的表达HLA-G2异构体标准蛋白的细胞株，作为表达HLA-G2异构体标准蛋白，将所表达的HLA-G2异构体标准蛋白在人类白细胞抗原-G异构体分子HLA-G2流式细胞术、免疫印迹、组织及细胞免疫组化、HLA-G异构体功能研究及特异性抗体开发筛选作为标准参照物的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115894687A (zh) * 2022-03-31 2023-04-04 台州恩泽医疗中心(集团) 一种抗hla-g1，-g2，-g5及hla-g6异构体分子的单克隆抗体及其用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103333861A (zh) * 2013-06-03 2013-10-02 浙江省台州医院 特异性表达hla-g1抗原的细胞株k562

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103333861A (zh) * 2013-06-03 2013-10-02 浙江省台州医院 特异性表达hla-g1抗原的细胞株k562

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI: "GenBank:M90684.1", 《NCBI GENBANK》 *
R. MARCHAL等: "Expresslon of HLA-Gl and HLA-G2 lsoforms on the K552 transfected cells", 《IMMUNOLOGY LETTERS》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115894687A (zh) * 2022-03-31 2023-04-04 台州恩泽医疗中心(集团) 一种抗hla-g1，-g2，-g5及hla-g6异构体分子的单克隆抗体及其用途
WO2023184734A1 (zh) * 2022-03-31 2023-10-05 台州恩泽医疗中心(集团) 一种抗hla-g1，-g2，-g5及hla-g6异构体分子的单克隆抗体及其用途
CN115894687B (zh) * 2022-03-31 2024-06-07 台州恩泽医疗中心(集团) 一种抗hla-g1，-g2，-g5及hla-g6异构体分子的单克隆抗体及其用途

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