KR101442209B1 - 융합 단백질, 이의 용도 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단백질의 아미노 말단에서 시작해서 (i) 사이토메갈로바이러스 인간 MHC-제한 펩타이드, (ii) 제1 펩타이드 링커, (iii) 인간 β-2 마이크로글로불린, (iv) 제2 펩타이드 링커, (v) 인간 MHC 클래스 I 분자의 HLA-A2 사슬, (vi) 제3 펩타이드 링커, (vii) 항체의 scFv 단편의 중사슬로부터의 가변 영역, 및 (viii) 상기 scFv 단편의 경사슬로부터의 가변 영역에 존재하는 연속적인 아미노산에 대응하는 연속적인 아미노산을 포함하는 융합 단백질을 제공하는데, 상기 (vii) 및 (viii)에 대응하는 연속적인 아미노산들은 펩타이드 결합에 의해 직접 결합되거나 제4 펩타이드 링커에 대응하는 연속적인 아미노산들에 의해 함께 결합되며, 상기 scFv 단편은 메소텔린과 특이적으로 결합하는 항체로부터 유래된 것이다. 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 구조물, 상기 융합 단백질의 제조방법, 조성물 및 이의 용도를 제공한다.
융합 단백질, 종양, 펩타이드, 메소텔린
Description
본 발명은 융합 단백질, 이의 용도 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 출원 전반에 걸쳐 특정 문헌들이 인용된다. 이들 문헌들의 전체 리스트는 청구의 범위 바로 전에 찾아볼 수 있다. 본 발명에 관한 기술의 상태를 보다 완전하게 설명하기 위하여 상기 공개된 문헌들을 본 출원에 참조로 포함하였다.
면역 감시이론에 따르면, 면역 시스템은 계속적으로 변형된 세포들을 찾아내고 이를 파괴한다. 그러나, 일부 세포들은 명백히 효과적인 면역 반응으로부터 피해 나가서 결국 종양이 된다(1-4). 면역 반응으로부터의 종양 회피는 다수의 연구에서 증명된 잘 정립된 현상이며, 다양하게 제안된 메커니즘들에 의해 일어난다(1-4). 이들 메커니즘들은 다음과 같은데, 면역억제 사이토카인의 생성, 면역우세 펩타이드의 소실, 세포 자살 메커니즘(apoptosis)에 대한 저항 및 MHC 클래스 I의 소실이다(1-4). 종양 진행과 강한 연관성을 갖는 것으로 증명된 회피 메커니즘들 중 하나는 MHC 클래스 I 분자들의 소실 또는 하향조절(down regulation)이다. 이러한 회피 메커니즘은 많은 종양에서 볼 수 있으며, 다수의 상이한 돌연변이로부터 기인할 수 있다. 많은 연구들을 통하여 MHC 클래스 I의 로딩(loading) 및 제시 경로에 다음과 같은 약점: 베타-2-마이크로글로불린의 소실, TAP1/TAP2 돌연변이, LMP 돌연변이, MHC 유전자 내의 이형접합 소실 및 특이적 MHC 대립 유전자의 하향조절을 포함하는 약점이 있음을 밝혔다.
현재의 암 면역요법 방법은 일반적으로 2 부문의 면역 시스템: 체액성 면역 시스템 및 세포성 면역 시스템을 이용한다. 첫째, 종양 관련 항원의 세포 표면으로 유도되는 높은 친화성을 갖는 단일클론 항체(mAb)의 체계적인 주입은 임상 시험에서 통계학적으로 유의미한 항-종양 활성을 나타내었다(5, 6). 또한, 사이토카인이나 독소와 같은 효과기들을 수반하는 항-종양 mAb들이 현재 임상 시험에서 평가되고 있다(7). 둘째로 특이적 암 면역요법에 대한 주요한 접근법은 면역 시스템의 세포 가지부(arm), 주로 CD8+ 세포독성 T-림프구를 이용한다. 2가지 주요 방법이 면역 시스템의 세포 가지부의 항-종양 효율성을 증가시키는데 현재 사용되고 있다: (i) T-림프구에 의해 인식된다고 알려진 펩타이드로 환자의 면역을 활성화하는 요법, 및 (ii) 개선된 항-종양 효능을 갖는 고 활성의 T-세포 소집단을 선별, 활성화 및 증식시킬 수 있는 입양 이입 요법. 상기 첫번째 접근법에서, 최근 확인된 종양 관련 항원(예를 들어, gp100, MAGE 군, NY-ESO-1)으로부터 유도된 MHC-제한 펩타이드들이 환자들의 백신 주사에 사용된다. 이들 종양 특이적 항원-유도된 펩타이드들은 특정 조직에서 이들이 유일하게 발현되기 때문에 매우 특이성이 높다(8-11). 두번째 방법인 입양 이입 요법은 최근 전이상태의 흑색종 환자에게 인상적인 결과를 보여주었는데, 여러가지의 과발현된 자기-유래의 분화 항원들에 대하여 고도로 선별된 종양-반응성 T-세포들을 단리하고, 체외에서 증가시켜 환자들에게 재주입하였 다. 상기 접근법에서, T-세포의 지속적인 클론 재증식, 체내 증식, 기능의 활성화 및 종양 부위로의 이동들이 증명되었다(12-14).
최근 제시된 신규의 면역치료 접근법은 2개의 잘 확립된 분야들을 이용한다: (i) 고도의 면역원성 MHC/펩타이드 복합체를 제시하는 세포들의 제거에서의 CD8+ 세포독성 T-림프구의 알려진 효율성, 및 (ii) 항체의 재조합 단편들, 주로 단일 사슬 Fv 단편들(scFvs)을 통한 종양-특이적 세포 표면 항원의 인식. 상기 접근법은 2개의 기능적으로 상이한 부분: (i) 고도의 면역원성 종양 또는 바이러스-유래의 펩타이드를 지니는 단일-사슬 MHC 클래스 I 분자 및 (ii) 종양-특이적이며, 친화성이 높은 scFv 단편으로 구성된 재조합 융합 단백질을 이용한다. 다수의 연구 그룹들이 스트렙트아비딘에 다량체로 결합된 비오틴화 MHC 펩타이드, 또는 화학적 컨쥬게이션을 통하여 종양-특이적 항체와 결합된 단량체 HLA-A2/인플루엔자(Flu) 매트릭스 펩타이드 복합체가 체외에서, 피복된 종양 세포들의 T-림프구 매개의 세포용해(lysis)를 유도할 수 있음을 보여주었다(16-20). 그러나, 이들 접근법들은 화학적 컨쥬게이션을 사용하며 전체 항체 또는 예를 들어, Fab 단편과 같은 보다 큰 단편들을 이용한다. 하지만, 이러한 분자들의 큰 크기로 인하여, 종양 투과 능력 뿐만 아니라 커플링 전략에 의한 생성 및 균질성에 한계가 있다. Lev 등은 단일 사슬 재조합 HLA-A2 및 종양 특이적 scFvs 사이에 형성된 유전자의 융합을 기술한다. 이들 융합은 체외 및 체내에서 기능을 하는 것으로 밝혀졌는데, 표적의 피복된 종양 세포들에 대하여 체외 및 체내에서 T-림프구 매개의 세포용해를 특이적으로 유도할 수 있었다(15). 새로운 혼성 분자의 안정성은 MHC 홈(groove) 내의 펩타이드의 존 재에 크게 의존한다. 따라서, 상기 혼성 분자의 scHLA-A2 도메인으로부터 펩타이드가 분리되면 분자의 안정성을 떨어뜨릴 수 있다. Oved 등은 상기 문제를 해결하기 위하여 새로운 혼성 분자를 설계하는데 초점을 맞추었는데, 짧은 링커를 통하여 상기 펩타이드를 scHLA-A2/scFv 구조물에 연결하였다. 이러한 신규 융합 단백질의 생화학적 및 생물학적 활성을 체외에서 실험하였다(21).
공유결합으로 연결된 HLA-A2-제한 펩타이드에 의해 그 특이성이 좌우되는 CD8+ T-세포의 모집을 통하여 강력하고 효과적이며 특이적인 세포독성을 매개할 뿐만 아니라, scFv 부분을 통하여 표적 종양 세포에 결합하는 이중 작용을 지속할 수 있는 신규 융합 단백질에 대한 필요성이 널리 인식되고 있다.
입양 면역 반응의 MHC 클래스 I-제한된 CD8+ 세포독성 T-세포(CTL) 효과기 가지부가 종양 세포를 외래의 것으로 인식하고 연쇄 반응을 개시하여 종양 사멸을 유도하는 것으로 가장 잘 인식되어 있다. 그러나, 종양들이 정교한 방법을 발전시켜 면역 효과기 메커니즘으로부터 벗어나고 있는데, 가장 잘 연구되어 있는 것이 CTL에 의해 인식되는 항원들을 제시하는 MHC 클래스 I의 하향조절이다.
종래 접근법의 한계를 극복하고 면역요법의 새로운 접근법을 개발하고자 재조합 분자를 설계하였는데, 암 특이적-재조합 항체 단편, 또는 종양 세포에 의해 발현되는 수용체들과 결합하는 리간드와의 융합을 통한 단일 사슬 MHC가 종양 세포들에 대하여 특이적으로 표적화된다.
본 발명의 요약
본 발명은 단백질의 아미노 말단에서 시작해서, (i) 사이토메갈로바이러스 인간 MHC-제한 펩타이드, (ii) 제1 펩타이드 링커, (iii) 인간 β-2 마이크로글로불린, (iv) 제2 펩타이드 링커, (v) 인간 MHC 클래스 I 분자의 HLA-A2 사슬, (vi) 제3 펩타이드 링커, (vii) 항체의 scFv 단편의 중사슬로부터의 가변 영역, 및 (viii) 상기 scFv 단편의 경사슬로부터의 가변 영역에 존재하는 연속적인 아미노산에 대응하는 연속적인 아미노산을 포함하는 융합 단백질을 제공하는데, 상기에서 (vii) 및 (viii)에 대응하는 연속적인 아미노산들은 펩타이드 결합에 의해 직접 결합되거나 제4 펩타이드 링커에 대응하는 연속적인 아미노산들에 의해 함께 결합되며, 상기 scFv 단편은 메소텔린(mesothelin)과 특이적으로 결합하는 항체로부터 유래된 것이다.
본 발명은 또한 상기 융합 단백질 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 단백질의 아미노 말단에서 시작해서 (i) 사이토메갈로바이러스 인간 MHC-제한 펩타이드, (ii) 제1 펩타이드 링커, (iii) 인간 β-2 마이크로글로불린, (iv) 제2 펩타이드 링커, (v) 인간 MHC 클래스 I 분자의 HLA-A2 사슬, (vi) 제3 펩타이드 링커, (vii) 항체의 scFv 단편의 중사슬로부터의 가변 영역, 및 (viii) 상기 scFv 단편의 경사슬로부터의 가변 영역에 존재하는 연속적인 아미노산에 대응하는 연속적인 아미노산을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 구조물을 제공하는데, 상기 (vii) 및 (viii)에 대응하는 연속적인 아미노산들은 펩타이드 결합에 의해 직접 결합되거나 제4 펩타이드 링커에 대응하는 연속적인 아미노산들에 의해 함께 결합되며, 상기 scFv 단편은 메소텔린과 특이적으로 결합하는 항체로부터 유래된 것이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 융합 단백질을 30중량% 이상 포함하는, 박테리아를 통하여 발현된 봉입체(inclusion body)의 분리된 조제물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 융합 단백질이 발현되도록 상기 융합 단백질을 포함하는 형질변환된 세포를 배양하는 단계; 및 발현된 상기 융합 단백질을 복구하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 종양 세포에 대하여 CTL-매개된 면역 반응을 개시시켜 이로써 종양 세포를 사멸시키기 위한 유효량으로 본 발명에 따른 융합 단백질을 상기 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, 종양 세포를 선택적으로 사멸시키는 방법을 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 또한 종양 세포에 대하여 CTL-매개된 면역 반응을 개시시켜 이로써 종양 세포를 치료하기 위한 유효량으로 본 발명에 따른 융합 단백질을 상기 종양 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, 표면에 메소텔린을 발현하는 종양 세포의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 전형적인 분자로서, 짧은 펩타이드 링커(15 아미노산)를 통하여 HLA-A2의 α1, α2 및 α3 영역과 융합된 β2 마이크로글로불린으로 구성된 단일-사슬 MHC 분자는 메소텔린을 표적으로 하는 scFv SS1과 결합되었다. 공유결합으로 연결된 펩타이드를 갖는 융합 단백질을 제조하기 위하여, CMV pp65 단백질로부터 유래된 9개의 아미노산 NLVPMVATV(서열번호 4)가, scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질의 N-말단에 20개의 아미노산 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 6)를 통하여 결합되었다. 상기 융합 단백질을 E.coli에 발현시키고, CMV/scHLA-A2/SS1(scFv)의 존재 하의 체외 조건에서 리폴딩(refolding)을 함으로써 기능을 갖춘 분자를 제조하였다. 유세포 분석(flow cytometry) 연구를 통하여, 항원-양성이며 HLA-A2-음성인 인간 종양 세포에 HLA-A2-펩타이드 복합체를 표적 항체 단편의 특이성에 전적으로 좌우되는 방식으로 첨가할 수 있음을 알 수 있었다. 가장 중요한 것은, 표적 종양 세포를 CMV/scHLA-A2/SS1(scFv) 매개로 피복을 하게되면 상기 세포들로 하여금 효과적이고 특이적이며, HLA-A2-제한적이고 CMV 펩타이드 특이적인 CTL-매개의 세포용해를 가능하게 한다는 점이다. 이들 결과들은 종양 세포에 대한 MHC-펩타이드 복합체의 항체-유도되고 종양 항원-특이적인 표적화가 CTL 사멸을 가능하게 하며 효능을 높일 수 있음을 보여준다. 이제 이러한 신규 접근법은 천연적인 동류의 MHC 리간드의 항체 표적화 및 CTL-기반의 세포독성 메커니즘에 기초한 새로운 면역치료 방법을 개발하는 길을 열고 있다.
본 발명과 관련하여, 표적 종양 세포에 의한 클래스 I MHC 발현양의 정도와는 무관하게 클래스 I MHC-펩타이드 복합체를 종양 세포 표면으로 재-표적화하는 신규 방법을 개발하였다. 이를 위해, 본 발명의 일 실시형태에서 2개의 가지부(arm)를 갖는 분자를 이용하였다. 표적화하는 부분인 하나의 가지부는 수년간 동위원소, 독소 또는 약물을 암세포로 표적화하는데 사용되어 온, 종양 또는 분화 항원들에 따른 항체들의 종양-특이적인 재조합 단편들을 포함한다. 나머지 다른 효과기 가지부는 HLA-A2 중사슬(24, 25, WO 01/72768)의 3개의 세포외 도메인들과 연결된 인간 β2-마이크로글로불린으로 구성된 단일-사슬 MHC 분자(scMHC)이다. 단일 재조합 유전자 내에 상기 2개의 가지부를 코딩하는 유전자들을 연결하고 이 유전자를 발현함으로써, 신규 분자가 E.coli에서 효과적으로 발현되며 예를 들어, HLA-A2-CMV 펩타이드의 존재 하에서의 체외 리폴딩으로 수득된다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 이러한 접근법은 표적 종양 세포로 하여금 그들의 MHC 발현양과는 무관하게 세포독성 T-세포에 의한 세포용해가 일어나도록 함으로써, CTL-매개의 항-종양 면역의 효능을 높이는 새로운 접근법으로 이용될 수 있다. 이러한 신규 접근법은 천연적인 동류의 MHC 리간드들 및 CTL-기반의 세포독성 메커니즘을 이용하여 종양 세포들을 선택적으로 사멸하고 제거할 수 있는 새로운 종류의 재조합 치료제들의 개발을 유도할 수 있다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 (i) 사이토메갈로바이러스 인간 MHC-제한 펩타이드, (ii) 제1 펩타이드 링커, (iii) 인간 β-2 마이크로글로불린, (iv) 제2 펩타이드 링커, (v) 인간 MHC 클래스 I 분자의 HLA-A2 사슬, (vi) 제3 펩타이드 링커, (vii) 항체의 scFv 단편의 중사슬로부터의 가변 영역, 및 (viii) 상기 scFv 단편의 경사슬로부터의 가변 영역에 존재하는 연속적인 아미노산에 대응하는 연속적인 아미노산을 포함하며, 단백질의 아미노 말단에서 시작하는 융합 단백질을 제공하는데, 상기에서 (vii) 및 (viii)에 대응하는 연속적인 아미노산들은 펩타이드 결합에 의해 직접 결합되거나 제4 펩타이드 링커에 대응하는 연속적인 아미노산들에 의해 함께 결합되며, 상기 scFv 단편은 메소텔린과 특이적으로 결합하는 항체로부터 유래된 것이다. 일 실시형태에서, 상기 제1 펩타이드 링커는 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 6)을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 제2 펩타이드 링커는 아미노산 서열 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 8)을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 제3 펩타이드 링커는 아미노산 서열 ASGG(서열번호 10)를 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 제4 펩타이드 링커는 아미노산 서열 GVGGSGGGGSGGGGS(서열번호 19)을 갖는다. 다른 실시형태에서, 상기 사이토메갈로바이러스 인간 MHC-제한 펩타이드는 아미노산 서열 NLVPMVATV(서열번호 4)를 갖는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "제1 펩타이드 링커", "제2 펩타이드 링커" 및 "제4 펩타이드 링커"는 아미노산 서열이 GXGGS(서열번호 20)인 단량체 펩타이드 또는 이의 다량체로 이루어진 펩타이드를 의미하는데, 상기 X는 임의의 아미노산 일 수 있다. 이들 펩타이드 링커들은 상기와 같은 단량체 펩타이드의 2 내지 10 다량체일 수 있다. 이러한 다량체에서, 각 단량체 펩타이드는 다량체 내의 다른 단량체 펩타이드와 동일하거나 아미노산 X가 무엇인지에 따라서 다를 수도 있다. 일 실시형태에서, 단량체 펩타이드 내의 X는 아미노산 발린(V)이다. 다른 실시형태에서, 단량체 펩타이드 내의 X는 아미노산 글라이신(G)이다. 본원의 바람직한 실시형태에서, 상기 펩타이드 링커는 3 내지 4개의 단량체 펩타이드들로 이루어진 다량체, 특히 가장 N-말단쪽에 있는 단량체 내의 X는 아미노산 V이며, 제2 및 제3의 X는 아미노산 G인 3개의 단량체 펩타이드들로 이루어진 다량체를 포함한다.
일 실시형태에서, (vii)에 대응하는 연속적인 아미노산 서열, 그 뒤의 제4 펩타이드 링커 서열 및 그 뒤의 (viii)에 대응되는 서열은 서열번호 12에 개시된 바와 같다.
다른 실시형태에서, 융합 단백질인 화합물 A의 연속적인 아미노산 서열은 서열번호 2에 개시된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 융합 단백질 및 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 융합 단백질은 조성물 내에 치료학적 유효량으로 존재하며, 상기 담체는 약제학적으로 허용가능한 담체이다.
본 발명은 또한 (i) 사이토메갈로바이러스 인간 MHC-제한 펩타이드, (ii) 제1 펩타이드 링커, (iii) 인간 β-2 마이크로글로불린, (iv) 제2 펩타이드 링커, (v) 인간 MHC 클래스 I 분자의 HLA-A2 사슬, (vi) 제3 펩타이드 링커, (vii) 항체의 scFv 단편의 중사슬로부터의 가변 영역, 및 (viii) 상기 scFv 단편의 경사슬로부터의 가변 영역에 존재하는 연속적인 아미노산에 대응하는 연속적인 아미노산을 포함하며, 단백질의 아미노 말단에서 시작하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산 구조물을 제공하는데, 상기에서 (vii) 및 (viii)에 대응하는 연속적인 아미노산들은 펩타이드 결합에 의해 직접 결합되거나 제4 펩타이드 링커에 대응하는 연속적인 아미노산들에 의해 함께 결합되며, 상기 scFv 단편은 메소텔린과 특이적으로 결합하는 항체로부터 유래된 것이다. 일 실시형태에서, 상기 핵산 구조물은 서열번호 1에 개시된 핵산 서열을 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 구조물을 포함하는 벡터(vector)를 제공한다. 이러한 벡터들의 예로는 플라스미드, 바이러스, 파지 등을 들 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 구조물 및 이에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 형질전환된 세포를 제공한다. 상기 형질전환된 세포는 진핵 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 세포 및 원생동물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 세포일 수 있다. 또한, 상기 형질전환된 세포는 박테리아 세포일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 융합 단백질을 30중량% 이상 포함하는, 박테리아를 통하여 발현된 봉입체의 분리된 조제물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 융합 단백질이 발현되도록 형질변환된 세포를 배양하는 단계, 및 발현된 상기 융합 단백질을 복구하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 융합 단백질의 복구는 상기 발현된 융합 단백질을 분자크기 배제 크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 융합 단백질은 봉입체로 발현된다. 일 실시형태에서, 상기 제조방법은 또한 상기 봉입체로부터 융합 단백질을 분리하고 리폴딩을 실시하여 상기 융합 단백질을 활성화 형태로 수득하기 위해 상기 봉입체를 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 봉입체로부터 융합 단백질을 분리하기 위하여 봉입체를 처리하는 단계는 상기 봉입체를 변성제에 접촉하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 융합 단백질의 "활성화 형태"는 메소텔린이 종양 세포의 표면상에 존재하는 경우 상기 융합 단백질로 하여금 메소텔린에 특이적으로 결합할 수 있도록 하는 상기 융합 단백질의 3차 구조를 의미한다.
본 발명은 또한 종양 세포에 대하여 CTL-매개된 면역 반응을 개시시켜 이로써 종양 세포를 사멸시키기 위한 유효량으로 본 발명의 융합 단백질을 상기 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, 종양 세포를 선택적으로 사멸시키는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 종양 세포는 환자 내에 있으며, 상기 접촉시키는 단계는 상기 융합 단백질을 상기 환자에 투여함으로 달성된다.
본 발명은 또한 종양 세포에 대하여 CTL-매개된 면역 반응을 개시시켜 이로써 종양 세포를 치료하기 위한 유효량으로 본 발명에 따른 융합 단백질을 상기 종양 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는, 그 표면에 메소텔린을 발현하는 종양 세포의 치료방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 상기 종양 세포는 고형의 종양 내에 존재한다. 다른 실시형태에서, 상기 고형의 종양은 난소암, 폐암, 췌장암 또는 두경부암, 또는 중피종(mesothelioma)이다.
본 발명은 (i) 신규 융합 단백질; (ii) 상기 융합 단백질의 제조방법; (iii) 상기 융합 단백질을 코딩하는 핵산 구조물; 및 (iv) 세포, 특히 암세포의 선택적 사멸을 위한 상기 융합 단백질의 이용방법을 제공한다.
본 발명의 원리 및 실시는 본 명세서에 개시된 도면 및 설명을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다.
본 발명은 그 적용이 본 명세서에 개시된 상세한 설명 또는 예시된 바에 국한되지 않음을 이해하여야 한다. 본 발명은 다른 실시형태들을 포함하며, 다양한 방법으로 실시되고 달성될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용된 표현 및 용어는 설명을 위함이지 본 발명을 제한하려는 의도가 아님을 이해하여야 한다.
종양 전이는 면역-억제 인자들의 분비 및/또는 항원 제시 기능을 하는 MHC 클래스 I의 하향조절과 종종 관련된다(2). 환자 체내에서 특이적 CTL 반응이 보이는 경우라고 하더라도, 항-종양 CTL 개체군의 밀도가 희박하고, 매우 부정기적이며 일부 경우에는 CTL이 기능하지 않거나 면역 저하 상태에 있기 때문에 상기 반응은 약하다(26). 또한, 특정 종양 관련 펩타이드를 제공하는, 종양 세포의 표면 상의 MHC-펩타이드 복합체의 수가 낮다는 것이 잘 알려져 있다(27). 종양에 대한 면역 반응을 자극할 수 있는 백신 개발로의 큰 진전은 특정 종양 타입과 관련된 단백질 항원의 식별을 의미해 왔으며, MHC 클래스 I 및 클래스 II 제한 결합 모티프에 대한 종양 항원의 에피토프 맵핑이 식별되었고 현재 다양한 백신 접종 프로그램에 사용 중이다(14, 11, 8). 적절한 펩타이드들을 제공하는 MHC 클래스 I 분자들은 CTL에 의한 인식 및 사멸을 위한 특이적 신호들을 제공할 필요가 있다. 그러나, 세포가 적절한 종양 항원을 발현할지라도, CTL 세포용해에 대하여 표적 세포가 무반응하도록 할 수 있는 HLA 특성의 소실, 하향조절 또는 변형이 종양 세포가 회피하는 주요 메커니즘이 된다.
본 발명은 상기 문제를 극복하는 새로운 접근법을 제공한다. 본 발명을 실시하도록 하는 동안, 종양 세포에 대한 클래스 I MHC-펩타이드 복합체의 종양 특이적 표적화는 HLA-A2 음성 세포들로 하여금 적절한 HLA-A2 제한 CTL에 의한 세포용해가 이루어지도록 하여 효과적이고 효율적인 방법임이 증명되었다. 종양 세포에 대해 CTL을 재유도하는 상기 신규 방법은 종양을 발현하는 악성 종양 세포에 대해 상대적으로 높은 특이성으로 위치를 찾아갈 수 있는 항-메소텔린 항체 단편 및 CMV 리간드를 이용한다.
상기 항-메소텔린 항체 표적 단편 및 CMV 리간드는, 효과적이며 기능성을 가지도록 폴딩될 수 있는 단일-사슬 HLA-A2 분자에 결합된다.
본 명세서에 제공된 결과들은 암-특이적 항체 또는 리간드 유도된 scMHC-펩타이드 복합체들의 표적화를 통하여 종양 세포 사멸을 위한 활성 CTL을 끌어 모으는데 본 발명의 접근법의 유용성이 있음을 명백히 증명한다. 이들 결과들은 종양 세포들에 대하여 재유도되는 자연적으로 발생하는 세포성 면역 반응에 기초한 신규 면역치료 접근법의 개발의 길을 열고 있다.
본 발명의 융합 단백질 또는 그의 일부는 고상 단백질 합성을 포함하는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있음을 이해할 것이다. 그러나, 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 적어도 상기 분자의 주요 부분, 예를 들어 scHLA-A2 도메인(CMV 펩타이드가 있거나 없는) 및 scFV 도메인은 상기 분자를 코딩하는 각각의 핵산 구조물 또는 구조물들의 해독에 의해 생성된다.
따라서, 해독을 통하여 도 1B의 분자를 합성하기 위해서는 1 내지 3개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 필요하다. 이들 오픈 리딩 프레임들은 하나, 둘 또는 세개의 핵산 분자들 상에 속할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 단일 핵산 구조물은 하나, 둘 또는 세개의 오픈 리딩 프레임 모두를 가질 수 있다. 1 내지 3개의 오픈 리딩 프레임의 발현을 조절하기 위하여 1 내지 3개의 시스-작용 조절 서열이 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 시스-작용 조절 서열은 시스트론과 같은 방식으로 하나, 둘 또는 세개의 오픈 리딩 프레임의 발현을 조절할 수 있다. 또한 다른 방법으로, 3개의 오픈 리딩 프레임의 발현을 조절하기 위하여 3개의 독립적인 시스-작용 조절 서열이 사용될 수 있다. 다른 조합들도 또한 생각해 볼 수 있다.
상기 오픈 리딩 프레임 및 상기 시스-작용 조절 서열은 1 내지 3개의 핵산 분자들에 의해 보유될 수 있다. 예를 들어, 각각의 오픈 리딩 프레임 및 그의 시스-작용 조절 서열들이 다른 핵산 분자에 의해 보유되거나, 모든 오픈 리딩 프레임들 및 그들과 관련된 시스-작용 조절 서열들이 하나의 핵산 분자에 의해 보유된다. 다른 조합들도 또한 생각해 볼 수 있다.
상기 융합 단백질의 발현은 형질전환/형질감염 벡터(예를 들어, 플라스미드, 파지, 파지미드 또는 바이러스)로 기능하는 핵산 분자들 중 하나를 갖는 단일 세포 또는 복수의 세포들의 형질전환/형질감염 및/또는 공동 형질전환/공동 형질감염에 의해 달성될 수 있다.
상기 융합 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2에 개시되며 N-말단 아미노산 메싸이오닌을 포함하는데, 이는 상기 융합 단백질이 박테리아 세포에서 발현되는 것을 의미한다고 이해할 것이다. 상기 융합 단백질을 발현하는데 사용되는 특정 박테리아 세포에 따라 N-말단 메싸이오닌이 절단되어 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 융합 단백질은 N-말단에 메싸이오닌을 가질 수도 있고 가지고 있지 않을 수도 있다고 사료된다. 일반적으로, 본 발명에 따른 융합 단백질이 진핵 세포에서 발현되는 경우, N-말단 메싸이오닌을 가지지 않는다. 따라서, 본 발명에 따라 발현된 융합 단백질의 아미노산 서열은 상기 단백질이 발현된 세포의 종류에 따라 이러한 N-말단 메싸이오닌을 포함하거나 포함하지 않을 수 있음을 이해하여야 한다.
언제 어디에서 사용되더라도, 본 발명의 링커 펩타이드는 원래부터 유연성이 좋은 아미노산 서열에서 선택되는데, 이는 상기 링커 펩타이드로 연결된 폴리펩타이드들이 발현 후에 독립적 및 천연적으로 폴딩을 이루도록 하여 기능적이거나 활성의 단일 사슬(sc) 인간 β2M/HLA 복합체, 항체 표적성이거나 인간 β2M/HLA -CMV 제한 항체 복합체의 형성을 가능하게 하도록 하기 위함이다.
본원에 기술된 임의의 핵산 구조물들은 그 내부의 코딩 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결된 적어도 하나의 시스-작용 조절 서열을 포함한다. 상기 시스-작용 조절 서열은 박테리아에서 기능하는 것이 바람직하다. 대안으로, 상기 시스-작용 조절 서열은 효모에서 기능한다. 다른 대안으로, 상기 시스-작용 조절 서열은 동물 세포에서 기능한다. 또 다른 대안으로, 상기 시스-작용 조절 서열은 식물 세포에서 기능한다.
상기 시스-작용 조절 서열은 프로모터 서열 및 추가적인 전사 또는 해독 인헨서 서열을 포함할 수 있는데, 이 모든 서열은 숙주 세포 내로 주입될 때 폴리뉴클레오티드의 발현을 도와주는 역할을 한다. 특정 프로모터들의 예들은 다양한 진핵 및 원핵 발현 시스템의 관점에서 하기에 기술되며, 뒤이은 실시예에서도 기술된다.
하나 또는 그 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 단일 전사물의 전사를 지시하는 핵산 구조물 내에 하나의 시스-작용 조절 서열이 이용될 수 있음을 이해할 것이다. 하나 이상의 오픈 리딩 프레임의 경우에 내부적으로 위치된 핵산 서열을 해독하도록 내부 리보좀 도입 부위(IRES)가 이용될 수 있다.
단일 세포 내에서 독립적인 폴리펩타이드의 공동 발현을 선택하게 되는 경우에는 언제든지 최종 산물을 최대한의 수율로 수득하기 위하여, 사용되는 핵산 구조물 또는 구조물들은 독립적인 폴리펩타이드들의 발현양이 최적화되도록 구성되어야 한다.
본 발명의 핵산 구조물(들)에 의해 이용되는 바람직한 프로모터(시스-작용 조절 서열의 일례가 되는)는 숙주 세포 형질전환 후에 폴리뉴클레오티드의 발현량이 높도록 하는 강력한 구조 프로모터이다.
또한, 복제 수가 큰 핵산 구조물(들)을 갖는 숙주 세포를 형질전환하거나, 수득된 전사물을 안정화시켜 상기 전사물의 분해 또는 "턴오버(turn-over)"를 감소시키는 시스-작용 서열을 이용함으로써 높은 발현량을 달성할 수 있음을 이해할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "형질전환된 세포"란 말은 세포 내부로 외래 핵산 서열이 도입되어 안정적으로 또는 일시적으로 숙주 세포가 유전적으로 변형된 세포를 말한다. 이는 당해 분야에 공지된 다양한 방법을 사용하여 자연적이거나 인공적인 조건 하에서 일어날 수 있으며, 이들 중 일부는 하기에 특정 숙주 세포들의 예를 들어 상세하게 기술된다.
상기 형질전환된 세포는 예를 들어, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 세포 및 원생동물 세포와 같은 진핵 세포일 수 있으며, 또는 대안적으로, 상기 세포는 박테리아 세포일 수 있다.
진핵 숙주 세포 발현에 사용되는 경우, 본 발명에 따른 핵산 구조물(들)은 E.coli에서도 증식될 수 있고(여기에서, 상기 구조물은 적절한 선택성 마커 및 복제 개시점을 포함한다) 진핵 세포에서의 발현에도 사용될 수 있는 셔틀 벡터일 수 있다. 본 발명에 따른 상기 핵산 구조물(들)은 예를 들어, 플라스미드, 박미드(bacmid), 파지미드, 코스미드, 파지, 바이러스 또는 인조 염색체일 수 있다.
적절한 포유동물 발현 시스템으로는 이에 제한되지는 않지만, 인비트로젠사(InvitrogenTM)(미국 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재)에서 시판하는 pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto 및 pCR3.1; 프로메가사(Promega(등록상표)(미국 위스콘신주의 매디슨시에 소재)에서 시판하는 pCI, 스트라타진(Stratagene(등록상표))(미국 캘리포니아주의 라 졸라시에 소재)에서 시판하는 pBK-RSV 및 pBK-CMV, 클론텍 러보레터리사(Clontech(등록상표) Laboratories, Inc.)(미국 캘리포니아주의 마운틴뷰시에 소재)에서 시판하는 pTRES 및 이들의 유사물을 포함한다.
또한, 본 발명의 핵산 서열을 발현하기 위하여 곤충 세포 배양이 이용될 수 있다. 적절한 곤충 발현 시스템으로는 이에 제한되지는 않지만, maxBacTM(미국 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 인비트로젠사), BacPakTM(미국 캘리포니아주의 마운틴뷰시에 소재한 클론텍 러보레터리사) 또는 Bac-to-BacTM(미국 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 인비트로젠사/깁코사)과 같은 많은 공급업자들로부터 상업적으로 입수 가능한 바큘로바이러스 발현 시스템 및 이의 유사물을 포함한다.
또한, 본 발명의 핵산 서열의 발현은 식물 세포에서 수행될 수도 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "식물 세포"란 말은 식물 원형질체, 식물 조직 배양 세포, 식물 유래 조직 세포 또는 전체 식물의 세포를 언급할 수 있다.
핵산 구조물을 식물 세포 내로 도입하는 다양한 방법이 있다. 이러한 방법들은 핵산 구조물 또는 그 일부가 식물 세포의 게놈 내로 안정적으로 삽입을 하는가 또는 이들 서열들이 식물 세포의 게놈 내로 안정적으로 삽입되지 않은 경우에 핵산 구조의 일부가 일시적으로 발현하느냐에 따라 좌우된다.
본 발명의 핵산 구조물 내에 포함된 것과 같은 외래 핵산 서열을 식물 세포 내로 안정적으로 게놈 통합하는 2가지 주요 방법이 있다:
(1) 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개의 유전자 전이: Klee 등 (1987) 식물 생리학 연감. 38:467-486; Klee 및 Rogers, 식물의 세포 배양 및 체세포 유전학, Vol. 6, 식물 핵 유전자의 분자 생물학, eds. Schell, J., 및 Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p.2-25; Gatenby, 식물 바이오 테크놀로지, eds. Kung, S. 및 Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p.93-112.
(ii) 직접적인 DNA 흡수: Paszkowski 등, 식물의 세포 배양 및 체세포 유전학, Vol. 6, 식물 핵 유전자의 분자 생물학, eds. Schell, J., 및 Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p.52-68; 원형질체 내로 DNA를 직접 흡수시키는 방법을 포함하는 직접 DNA 흡수, Toriyama, K. 등. (1988) 바이오/테크놀로지 6:1072-1074. 식물 세포의 짧은 전기 충격에 의해 유도된 DNA 흡수: Zhang 등. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm 등. 네이처(1986) 319:791-793. 입자 분사에 의한 식물 세포 또는 조직으로의 DNA 주입, Klein 등. 바이오/테크놀로지 (1988) 6:559-563; McCabe 등. 바이오/테크놀로지 (1988) 6:923-926; Sanford, 식물 생리학 (1990) 79:206-209; 마이크로피펫 시스템을 이용한 직접 DNA 흡수: Neuhaus 등, Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus 및 Spangenberg, 식물 생리학 (1990) 79:213-217; 또는 발아하는 꽃가루로 DNA를 직접 배양함에 의한 직접 DNA 흡수, Dewet 등. 배주(ovule) 조직의 실험 조작, eds. Chapman, G. P. 및 Mantell, S. H. 및 Daniels, W. Longman, London, (1985) p.197-209; 및 Ohta, 미국국립학술원 회보 (1986) 83:715-719.
아그로박테리움 시스템은 식물 게놈 DNA 내로 특정 DNA 세그먼트를 포함하는 플라스미드 벡터를 통합시키는 용도를 포함한다. 식물 조직의 접종 방법은 식물 종 및 아그로박테리움 전달 시스템에 따라 달라진다. 널리 이용되는 접근법은 잎 절편(leaf disc) 절차인데, 예를 들어 식물 분자 생물학 매뉴얼 A5(Horsch 등, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p.1-9)를 참조하라. 보충적인 접근법으로는 진공침윤법(vacuum infiltration)과 병행하는 아그로박테리움 전달 시스템을 이용한다. 상기 아그로박테리움 시스템은 안정적으로 형질전환된 쌍떡잎 식물의 제조에 특히 유용하다.
식물 세포 내로 DNA를 직접 전달하는 다양한 방법이 있다. 전기천공법(electroporation)에서, 원형질체는 강한 전기장에 짧게 노출된다. 마이크로주입법에서는, 매우 작은 마이크로피펫을 사용하여 세포 내로 DNA를 직접 물리적으로 주입한다. 마이크로입자 분사법에서는, DNA를 황산마그네슘 결정, 텅스텐 입자 또는 금 입자와 같은 마이크로발사체에 흡착시키고 상기 마이크로발사체를 세포 또는 식물 조직 내로 물리적으로 가속화시킨다. 일시적으로 식물 세포를 형질전환하기 위하여 직접 DNA 전달법도 또한 사용될 수 있다.
제1 및 제2 핵산 서열의 식물 세포 발현을 위하여 사용될 수 있는 적절한 식물 프로모터들로는 이에 제한되지는 않지만, CaMV 35S 프로모터, 유비퀴틴 프로모터 및 구조적 또는 조직 특이적인 방법으로 핵산 서열을 발현할 수 있는 다른 강력한 프로모터들을 포함한다.
또한, 식물 바이러스들도 형질전환 벡터로 사용될 수 있다. 식물 세포 숙주의 형질전환을 위하여 유용한 것으로 알려진 바이러스들은 CaV, TMV 및 BV를 포함한다. 식물 바이러스를 사용하는 식물 형질전환은 하기 문헌들에 기술되어 있다: 미국특허 제4,855,237호(BGV), EP-A 67, 553(TMV), 일본특허공개공보 제63-14693호(TMV), EPA 194,809(BV); 및 Gluzman, Y. 등., 분자 생물학 커뮤니케이션: 바이러스 벡터, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp.172-189 (1988). 식물을 포함하는 많은 숙주에 외래 DNA를 발현하는 용도로 사용되는 유사바이러스 입자는 WO 87/06261에 개시되어 있다.
비바이러스성 외래 핵산 서열을 식물에 도입하고 발현하기 위한 식물 RNA 바이러스의 구조물은 상기 참조문헌 및 하기 문헌에 예시되어 있다: Dawson, W. O. 등, 바이러스학 (1989) 172:285-292; Takamatsu 등. EMBO J. (1987) 6:307-311; French 등. 사이언스 (1986) 231:1294-1297; 및 Takamatsu 등. FEBS Letters (1990) 269:73-76.
바이러스가 DNA 바이러스인 경우, 상기 구조물은 바이러스 자체에 만들어질 수 있다. 대안적으로, 상술한 핵산 서열을 갖는 원하는 바이러스 벡터 설계를 용이하게 하기 위하여 상기 바이러스는 먼저 박테리아 플라스미드 내로 복제될 수 있다. 그후, 상기 바이러스는 플라스미드로부터 잘라내어질 수 있다. 만일 바이러스가 DNA 바이러스라면, 박테리아의 복제 개시점이 바이러스 DNA로 부착될 수 있고 그후 박테리아에 의해 복제가 이루어진다. 상기 DNA의 전사 및 해독은 상기 바이러스 DNA를 단백질 막으로 둘러싸는 피막 단백질을 산출할 것이다. 만일 바이러스가 RNA 바이러스라면, 상기 바이러스는 일반적으로 cDNA로서 복제되어 플라스미드에 삽입된다. 그후 상기 플라스미드는 모든 구조물을 제조하는데 사용된다. 그후 상기 플라스미드의 바이러스 서열을 전사하고 상기 바이러스 RNA를 단백질 막으로 둘러싸는 피막 단백질을 산출하는 바이러스 유전자의 해독에 의하여 RNA 바이러스가 제조된다.
본 발명의 구조물 내에 포함되는 것과 같은 비바이러스성 외래 핵산 서열을 식물에 도입하고 발현하기 위한 식물 RNA 바이러스의 구조물은 상기 참조문헌 및 미국특허 제5,316,931호에 예시되어 있다.
또한, 효모 세포도 본 발명에 의한 숙주 세포로 사용될 수 있다. 본 발명의 핵산 서열을 효모에서 발현하기 적당한 효모 발현 벡터의 수많은 예들은 당해 분야에 공지되어 있으며 상업적으로 구입가능하다. 상기 벡터들은 일반적으로 당해 분야에서 잘 알려진 화학적 또는 전기천공적 형질전환 방법들을 통하여 효모 숙주 세포에 도입된다. 상업적으로 구입가능한 시스템들은 예를 들어, pYESTM(미국 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 인비트로젠사) 또는 YEXTM(미국 캘리포니아주의 마운틴뷰시에 소재한 클론텍 러보레터리사) 발현 시스템들을 포함한다.
상술한 바와 같은 진핵 발현 시스템들에서 발현할 경우, 핵산 구조물은 제1 및 제2 핵산 서열로부터 생성된 폴리펩타이드들이 부속의 신호 펩타이드들을 통하여 분비 경로로 유도되게 하는 신호 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 포유동물, 곤충 및 효모 숙주 세포에서, 발현된 폴리펩타이드들은 성장 배지로 분비될 수 있는 한편, 식물 발현 시스템에서는, 상기 폴리펩타이드들이 아포플라스트(apoplast) 내로 분비되거나 세포내 기관으로 유도될 수 있다.
박테리아 숙주는 예를 들어, 화학적 형질전환(예, CaCl2) 또는 전기천공을 포함하는 당해 분야에 공지된 형질전환 방법들을 통하여 핵산 서열로 형질전환될 수 있다.
본 발명의 핵산 서열을 발현하는데 사용될 수 있는 박테리아 발현 시스템의 수많은 예들은 당해 분야에 공지된 것들이다. 상업적으로 구입가능한 박테리아 발현 시스템들로는 이에 제한되지는 않지만, pETTM 발현 시스템(노바젠사, EMB 바이오사이언스사; 미국 캘리포니아주의 샌디에이고시에 소재), pSETM 발현 시스템(미국 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 인비트로젠사) 또는 pGEXTM 발현 시스템(미국 뉴저지주의 피스카타웨이시에 소재한 아머샴 바이오사이언스사)을 포함한다.
하기의 실험적인 상세 부분에서 보다 기술되는 바와 같이, 박테리아 발현이 특히 장점이 많은데, 그 이유는 발현된 폴리펩타이드들이, 발현된 폴리펩타이드들을 복구 및 정제하는데 용이한 실질적으로 순수한 봉입체를 형성하기 때문이다.
따라서, 본 발명은 박테리아로 발현된 봉입체 조제물이, 본 발명의 융합 단백질 또는 융합 단백질들의 혼합물 30중량% 이상, 바람직하게는 50중량% 이상, 보다 바람직하게는 75중량% 이상, 가장 바람직하게는 90중량% 이상으로 구성되는 봉입체 조제물을 제공한다. 이러한 봉입체들의 분리 및 이들로부터 융합 단백질(들)을 정제하는 것은 하기의 실험의 상세한 설명 부분에서 자세히 기술된다. 융합 단백질(들)의 박테리아 발현은 많은 양의 순수하고 활성화된 형태의 융합 단백질들을 제공할 수 있다.
하기의 실험의 상세한 설명에서 보다 더 기술되는 바와 같이, 상기 발현된 융합 단백질들은 당해 분야에 공지된 분획(fractionation) 방법을 통하여 용이하게 분리되고, 가령, 변성-복원 단계들을 통하여 정제되는 실질적으로 순수한 봉입체들을 형성한다.
본 발명의 융합 단백질들은 MHC-제한 펩타이드의 존재 하에서 복원되고 리폴딩이 일어날 수 있는데, 상기 MHC-제한 펩타이드는 본 발명의 다른 폴리펩타이드들과 연결되었거나 함께 공동 발현되었거나 또는 함께 혼합되어 있으며 상기 융합 단백질들은 단일 사슬 MHC 클래스 I 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 실시예에서 보다 더 기술되는 바와 같이, 이는 분자크기 배제 크로마토그래피를 통하여 더 정제될 수 있는 실질적으로 순수한 MHC 클래스 I-항원성 펩타이드 복합체를 생성 가능하게 한다.
리폴딩을 위해 사용되는 CMV 펩타이드는 박테리아 내에서 MHC 클래스 I 분자의 scHLA-A2 사슬과 함께 (독립적인 펩타이드로서) 공동 발현되거나 scHLA-A2 사슬에 결합될 수 있다. 이런 경우에, 발현된 융합 단백질 및 펩타이드는, MHC 클래스 I-항원성 펩타이드 복합체 형성을 위하여 분리되고 이용될 수 있는 봉입체들을 공동으로 형성한다.
하기 부분에는 상술한 본 발명의 다양한 관점들 각각에 대한 특정 실시예들을 제공한다. 이들 실시예들은 본 발명을 제한하려는 것으로 간주되어서는 안되는데, 본 발명은 유사하거나 다소 상이한 방법으로 실시될 수 있기 때문이다. 단지, 이들 실시예들은 본 발명의 다양한 대안들 및 실시형태들을 실시하는 방법에 관하여 당해 분야의 통상적인 기술들 중 하나를 가르친다.
일반적으로, 본원에 사용되는 명명법 및 본 발명에 사용되는 실험에 관한 절차들은 분자적, 생화학적, 미생물학적 및 재조합 DNA 기술들을 포함한다. 이러한 기술들은 문헌들에 자세하게 설명되어 있다. 예를 들어, "분자 클로닝: 실험 매뉴얼" Sambrook 등., (1989); "분자 생물학의 최신 프로토콜" 1-3권, Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel 등, "분자 생물학의 최신 프로토콜", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "분자 클로닝에 대한 실제 가이드", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson 등., "재조합 DNA", Scientific American Books, New York; Birren 등. (eds) "게놈 분석: 실험 매뉴얼 시리즈", 1-4권, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국특허 제4,666,828호; 제4,683,202호; 제4,801,531호; 제5,192,659호 및 제5,272,057호에 개시된 바와 같은 방법론들; "세포 생물학: 실험 핸드북" 1-3권, Cellis, J. E., ed. (1994); "동물 세포의 배양 - 기본 기술 매뉴얼", Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), 3판; "면역학의 최신 프로토콜" 1-3권, Coligan J. E., ed. (1994); Stites 등., (eds), "기초 및 임상 면역학" (8판), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell 및 Shiigi (eds), "세포 면역학에서의 선택적 방법", W. H. Freeman and Co., New York (1980); 예를 들어, 하기 특허 및 과학 논문에 광범위하게 기술된 사용가능한 면역측정법: 미국특허 제3,791,932호; 제3,839,153호; 제3,850,752호; 제3,850,578호; 제3,853,987호; 제3,867,517호; 제3,879,262호; 제3,901,654호; 제3,935,074호; 제3,984,533호; 제3,996,345호; 제4,034,074호; 제4,098,876호; 제4,879,219호; 제5,011,771호 및 제5,281,521호; "올리고뉴클레오티드 합성" Gait, M. J., ed. (1984); "핵산 혼성화" Hames, B. D., 및 Higgins S. J., eds. (1985); "전사 및 해독" Hames, B. D., 및 Higgins S. J., eds. (1984); "동물 세포 배양" Freshney, R. I., ed. (1986); "고정화된 세포 및 효소" IRL Press, (1986); "분자 클로닝에 대한 실습 가이드" Perbal, B., (1984) 및 "효소학 내에서의 방법" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR 프로토콜: 방법 및 적용 가이드", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak 등., "단백질 정제 및 평가 방법 - 실습 코스 매뉴얼" CSHL Press (1996)을 포함하며, 이들 모두는 본원에 그 전체 개시된 내용이 참조로 포함되어 있다. 본 명세서 전반에 걸쳐 다른 일반적인 참조문헌들도 제공된다. 상기 문헌들의 절차들은 당해 분야에 공지되어 있는 것으로 확신하며 독자의 편이를 위해 제공된다. 상기 문헌들에 포함된 모든 정보들은 참조로 본원에 포함된다.
도 1A 내지 도 1B는 scHLA-A2/SS1(scFv) 및 pep(CMV)/scHLA-A2/SS1(scFv)(화합물 A)의 개념도로, 도 1A는 4개의 아미노산 링커를 통하여 SS1(scFv)의 N-말단에 결합된 scHLA-A2의 C-말단을 나타내고, 도 1B는 20개의 아미노산 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 6)를 통하여 scHLA-A2/SS1(scFv)의 N-말단에 CMV pp65 펩타이드, 즉, NLVPMVATV(서열번호 4)가 결합되어 있는 형태를 나타냄;
도 2는 화합물 A를 코딩하는 핵산 서열(서열번호 1)을 나타낸 도면;
도 3a 내지 도 3b는 화합물 A의 발현 및 정제를 나타낸 도면으로, 도 3a는 분리된 봉입체의 SDS/PAGE 분석 결과를 나타내고, 도 3B는 이온교환 크로마토그래피에 의한 정제 후 화합물 A의 SDS/PAGE 분석 결과를 나타냄;
도 4는 재조합 메소텔린에 화합물 A가 결합함을 나타내는 도면으로, 메소텔린을 면역 플레이트 상에 고정하고, 형태 민감성 mAb W6에 의해 화합물 A의 약량 의존적인 결합을 관찰한 것임(33, 34);
도 5a 내지 도 5d는 메소텔린을 발현하는 세포에 화합물 A가 결합함을 나타내는 도면으로, 도 5a 내지 도 5b는 메소텔린-양성이며 HLA-A2-음성인 A431K5 세포 및 메소텔린-음성이며 HLA-A2-음성인 A431 세포 각각에 화합물 A가 결합한 것의 유 세포 분석 결과를 나타내고, 도 5a는 K1 mAb(31, 32)가 A431K5 세포에 결합함을 나타내며, 도 5b는 K1 mAb가 A431 세포에 결합하지 않음을 나타내고, 도 5c는 화합물 A가 A431K5 세포에 결합함을 나타내며, 도 5d는 화합물 A가 A431 세포에 결합하지 않음을 보여준다. 상기 결합은 항-HLA-A2 특이 항체 BB7.2(35) 및 FITC-부착된 2차 항체를 사용하여 관찰됨;
도 6a 내지 도 6b는 화합물 A에 의한 HLA-A2 음성 종양 세포의 CTL 매개된 세포용해의 효능을 나타낸 도면으로, 도 6a에서, 메소텔린-주입된 A431K5 세포 및 모세포인 메소텔린 음성의 A431 세포를 화합물 A(10㎍) 및 CMV 특이적 CTL과 함께 배양하고, [S35]메싸이오닌 방출 시험을 하였으며, 도 6b는 메소텔린-주입된 A431K5 세포 및 모세포인 메소텔린 음성의 A431 세포를 여러가지 농도의 화합물 A 및 CMV 특이적 CTL과 함께 배양한 경우에 화합물 A의 약량 의존적인 활성을 [S35]메싸이오닌 방출 시험으로 분석한 결과를 나타냄;
도 7은 pep/scHLA-A2/SS1(scFv)(화합물 B)의 개념도로, 화합물 B에서는, 15개의 아미노산 링커 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 8)를 통하여 펩타이드 NLVPMVATV가 scHLA-A2/SS1(scFv)의 N-말단에 결합되어 있음;
도 8은 화합물 B를 코딩하는 핵산 서열(서열번호 22)을 나타낸 도면;
도 9A 내지 도 9B는 화합물 B의 발현 및 정제를 나타낸 도면으로, 도 9A는 분리된 봉입체의 SDS/PAGE 분석 결과를 나타내고, 도 9B는 이온교환 크로마토그래피에 의한 정제 후 화합물 B의 SDS/PAGE 분석 결과를 나타냄;
도 10a 내지 도 10f는 메소텔린을 발현하는 세포에 화합물 B가 결합함을 나타낸 도면으로, 도 10a 내지 도 10f는 메소텔린-양성이고 HLA-A2-음성인 A431K5 세포 및 메소텔린-음성이며 HLA-A2-음성인 A431 세포 각각에 화합물 B가 결합한 것의 유세포 분석 결과를 나타내고, 도 10a는 K1 mAb가 A431K5 세포에 결합함을 보여주며, 도 10b는 K1 mAb가 A431 세포에 결합하지 않음을 나타내며(B). 도 10c는 화합물 B가 A431K5 세포에 결합함을 나타내고, 도 10d는 화합물 B가 A431 세포에 결합하지 않음을 나타내며, 도 10e는 A431K5 세포에 결합된 화합물 A 및 화합물 B 사이의 비교를 나타내고, 도 10f는 A431 세포에 화합물 A 및 화합물 B가 결합하지 않음을 나타내며, 상기 결합은 항-HLA-A2 특이 항체 BB7.2 및 FITC-부착된 2차 항체를 사용하여 관찰됨;
도 11a 내지 도 11b는 화합물 B에 의한 HLA-A2 음성 종양 세포의 CTL 매개된 세포용해의 효능을 도시한 도면으로, 도 11a에서, 메소텔린-주입된 A431K5 세포 및 모세포인 메소텔린 음성의 A431 세포를 화합물 B(10㎍) 및 CMV 특이적 CTL과 함께 배양하고, [S35]메싸이오닌 방출 시험을 하였고, 도 11b는 메소텔린-주입된 A431K5 세포 및 모세포인 메소텔린 음성의 A431 세포를 여러가지 농도의 화합물 A 및 CMV 특이적 CTL과 함께 배양한 경우에 화합물 B의 약량 의존적인 활성을 [S35]메싸이오닌 방출 시험으로 분석한 결과를 나타냄;
도 12는 화합물 B 및 화합물 A에 의한 HLA-A2 음성 종양 세포의 CTL 매개된 세포용해의 효능을 도시한 도면으로, 메소텔린-주입된 A431K5 세포 및 모세포인 메 소텔린 음성의 A431 세포를 여러가지 농도의 화합물 B 또는 화합물 A 및 CMV 특이적 CTL과 함께 배양하면서 [S35]메싸이오닌 방출 시험을 하였고, 상기 도면은 화합물 A와 A431K5 세포의 배양 결과, 화합물 B와 A431K5 세포의 배양 결과, 화합물 A와 A431 세포의 배양 결과 및 화합물 B와 A431 세포의 배양 결과를 나타냄;
도 13a 내지 도 13b는 scHLA-A2/SS1(scFv) 및 M1cov/scHLA-A2/SS1(scFv)의 개념도로, 도 13a는 4개의 아미노산 링커를 통하여 scFv의 N-말단에 결합된 scHLA-A2의 C-말단을 도시한 도면이고, 도 13b는 15개의 아미노산 링커 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 8)를 통하여 scHLA-A2/SS1(scFv)의 N-말단에 M158-66 펩타이드가 결합되어 있음을 나타낸 도면;
도 14는 M1cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열(서열번호 23)을 나타낸 도면;
도 15A 내지 도 15B는 M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질의 발현 및 정제 결과를 나타낸 도면으로, 도 15A는 분리된 봉입체의 SDS/PAGE 분석 결과를 도시하고, 도 15B는 이온교환 크로마토그래피에 의한 정제 후 M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질의 SDS/PAGE 분석 결과를 도시한 도면;
도 16은 재조합 메소텔린에 M1cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질이 결합함을 나타내는 도면으로, 메소텔린을 면역 플레이트 상에 고정하고, 형태 민감성 mAb(W6)에 의해 M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv)의 약량 의존적인 결합이 관찰됨;
도 17a 내지 도 17d는 메소텔린을 발현하는 세포에 M1-cov/scHLA- A2/SS1(scFv) 융합 단백질이 결합함을 나타내는 도면으로, 도 17a 내지 도 17d는 메소텔린-양성이고 HLA-A2-음성인 A431K5 세포 및 메소텔린-음성이고 HLA-A2-음성인 A431 세포 각각에 M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv)이 결합한 것의 유세포 분석 결과를 도시하고, 도 17a는 K1 mAb가 A431K5 세포에 결합함을 나타내며, 도 17b는 K1 mAb가 A431 세포에 결합하지 않음을 나타내고, 도 17c는 A431K5 세포에 M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질이 결합함을 나타내며, 도 17d는 A431 세포에 M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질이 결합하지 않음을 나타내고, 상기 결합은 항-HLA-A2 특이 항체 BB7.2 및 FITC-부착된 2차 항체를 사용하여 관찰됨;
도 18은 M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질에 의한 HLA-A2 음성 종양 세포의 CTL 매개된 세포용해의 효능을 도시한 도면으로, 메소텔린-주입된 A431K5 세포 및 모세포인 메소텔린 음성의 A431 세포를 여러가지 농도의 M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 및 M1 특이적 HLA-A2-제한된 CTL과 함께 배양하면서 [S35]메싸이오닌 방출 시험을 하였음.
실험의 상세한 기술
재료 및 방법
화합물 A의 클로닝
scHLA-A2/SS1(scFv)를 상술한 바와 같이, scHLA-A2의 C-말단과 SS1 scFv의 N-말단을 짧은 링커 ASGG(서열번호 4)로 연결하여 제조하였다(15). MHC-제한 펩타 이드와 공유 결합된 scHLA-A2/SS1(scFv)을 제조하기 위하여, 상기 MHC-제한 펩타이드를 펩타이드 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 6)를 통하여 scHLA-A2/SS1(scFv) 분자의 N-말단에 결합하였는데, 이는 하기의 프라이머들을 이용한 PCR 오버랩 확장 반응에 의하여 수행되었다: 5'M1-5'GGAAGCGTTGGCGCATATGGGCATT CTGGGCTTCGTGTTTACCCTGGGCGGAGGAGGATCCGGTGGCGGAGGTTCAGGAGGCGGTGGATCGATCCAGCGTACTCCAAAG3'(서열목록13) 및 3'VLscSS1-5'GCAGTAAGGAATTCTCATTATTTTATTTCCAACTTTGT3' (서열번호 14). 5'M1 프라이머에서 링커 서열에 사일런스 뮤테이션이 삽입되었는데, 서열상의 이 변화로 인해 BamH1 제한 부위를 형성하게 되었다.
상기 PCR 산물을 TA 클로닝 벡터(pGEM-T Easy Vector, 미국 위스콘신주의 매디슨시에 소재한 프로메가사)로 서브클로닝하고, 그후 NdeI 및 EocRI 제한 부위를 사용하는 T7 프로모터 기반의 발현 벡터(PRB)로 서브클로닝하였다.
화합물 A를 생성하기 위하여, M1/scHLA-A2/SS1(scFv)이 dsDNA 프라이머를 이용한 라이게이션을 위하여 주형으로 사용되었다. 상기 M1/scHLA-A2/SS1(scFv)(PRB 플라스미드 내)를 NdeI 및 BamHI으로 처리하여 절단하고, 상기 플라스미드 분획물을 하기와 같은 CMV 펩타이드 서열 및 링커 서열의 확장을 포함하는 dsDNA 프라이머에 라이게이션하였다: 5'CMVcovLL(카세트):5'TATGAACCTGGTGCCGATGGTCGCGACCG TTGGAGGTGGCGGTTCTGGCGGAGGAG-3'(서열번호 15) 및 3'CMVcovLL(카세트):5'GATCCTCCT CCGCCAGAACCGCCACCTCCAACGGTCGCGACCATCGGCACCAGGTTCA3'(서열번호 16). 상기 프라이머들(5'CMVcovLL(카세트) 및 3'CMVcovLL(카세트))의 어닐링(annealing)은 상기 프라이머들을 2분간 95℃에 정치하고, 이어 실온에서 1시간 정치함으로써 수행되었 다. 플라스미드 증폭을 위하여 상기 라이게이션 산물을 E-coli DH5α로 형질전환하였다. 플라스미드를 QIAGEN(등록상표) 미니프렙 키트(미국 캘리포니아주의 발렌시아시에 소재한 큐아젠사)로 정제하고, 샘플들을 서열 분석하기 위해 준비하였다.
화합물 A의 발현, 리폴딩 및 정제
화합물 A를 E-coli LB21(λDE3) 세포(미국 위스콘신주의 매디슨시에 소재한 노바젠사)에서 봉입체로 발현하였다. 화합물 A 구조물을 열 충격으로 E-coli 세포에 형질전환하고, 세포들을 LBAMP 플레이트 상에 놓은 후, 37℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니들을 글루코스, MgSO4, AMP 및 염으로 보강된 영양 배지(super broth)로 옮겼다. 상기 세포들을 37℃에서 DO=2(600㎚)가 될 때까지 배양하고, IPTG(최종 농도 1mM)로 단백질 발현을 유도하였으며 추가로 37℃에서 3시간 배양하였다.
0.2mg/㎖의 라이소자임 및 이어서 2.5% 트라이톤(Triton(등록상표)) X-100(옥틸페놀폴리[에틸렌글리콜에테르]x, 독일 만하임시에 소재한 Roche Diagnostics GmbH, Roche Applied Science) 및 0.5M NaCl을 첨가하여 세포 분쇄를 함으로써 세포 펠릿으로부터 봉입체를 정제하였다. 상기 봉입체들의 펠릿을 원심 분리(13,000rpm, 4℃에서 60분간)하여 모으고, 이를 20mM EDTA가 첨가된 50mM Tris 완충액 pH 7.4로 3번 세척하였다. 분리되고 정제된 봉입체들을 6M 구아니딘 HCl pH 7.4에 용해시키고, 이어서 65mM DTE로 환원시켰다. 용해되고 환원된 봉입체들을 0.1M Tris, 0.001M EDTA, 0.5M 아르기닌 및 0.09mM 산화된 글루타치온 pH 9을 포함하는 산화환원-셔플링 완충액 내에서 1:100의 희석비율로 리폴딩을 하였으며, 10℃ 에서 24시간 동안 정치하였다. 리폴딩이 완료된 후, 단백질을 150mM 요소, 20mM Tris, pH 8에 대하여 투석하고, 이어서 Q 세파로즈(Sepharose(등록상표)) 컬럼(7.5mm I.D 60㎝)(미국 미조리주의 세인트 루이스시에 소재한 시그마-알드리치사)을 이용한 이온교환 크로마토그래피법으로 염(NaCl)의 농도를 구배하여 용해된 화합물 A를 정제하였다. 그후, 화합물 A를 포함하는 피크 분획을 PBS로 교환한 완충액으로 옮겼다.
화합물 B의 클로닝
scHLA-A2/SS1(scFv)를 상술한 바와 같이, scHLA-A2의 C-말단과 SS1 scFv의 N-말단을 짧은 링커 ASGG(서열번호 15)로 연결하여 제조하였다. MHC-제한 펩타이드와 공유 결합된 scHLA-A2/SS1(scFv)을 제조하기 위하여, 상기 MHC-제한 펩타이드를 펩타이드 링커 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 8)를 통하여 scHLA-A2/SS1(scFv) 분자의 N-말단에 결합하였는데, 이는 하기의 프라이머들을 이용한 PCR 오버랩 확장 반응에 의하여 수행되었다: 5'Nde-209B2M:5'GGAAGCGTTGGCGCATATGATCATGGACCAGGTTCCGTT CTCTGTTGGCGAGGAGGGTCCGGTGGCGGAGGTTCAGGAGGCGGTGGATCGATCCAGCGTACTCCAAAG3'(서열번호 17) 및 3'VLscSS1-5'GCAGTAAGGAATTCTCATTATTTTATTTCCAACTTTGT3'(서열번호 18). 화합물 B의 제조를 위하여, 209cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 분자를 주형으로 사용하였다. 상기 분자에 CMV 펩타이드 NLVPMVATV(서열번호 4)를 하기 프라이머들을 사용하는 PCR 반응에 의하여 209cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 서열 내로 도입하였다(209 펩타이드와 교환): 5'GGAAGCGTTGGCGCATATGGGCATTCTGGGCTTCGTGTTTACCCT GGGCGAGGAGGATCCGGTGGCGGAGGTTCAGGAGGCGGTGGATCGATCCAGCGTACTCCAAAG3'(서열번호 17) 및 3'VLscSS15'GCAGTAAGGAATTCTCATTATTTTATTTCCAACTTTGT3'(서열번호 18).
화합물 B의 발현 및 정제 프로토콜은 상기 화합물 A의 발현 및 정제 프로토콜과 동일하였다.
화합물 B의 생화학적 및 생물학적 특성을 분석하는데 사용되는 모든 방법들은 화합물 A의 활성을 분석하는데 사용된 방법들과 동일하였다.
M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv)의 제조
M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질을 제조하기 위하여, MI 58-66 펩타이드를 scHLA-A2/SS1(scFv)의 N-말단에 짧은 15개의 아미노산 링커를 통하여 결합하였는데, 이는 하기 프라이머들을 사용하는 오버랩 PCR 반응으로 수행하였다: 5'M1-링커 프라이머: 5'GGAAGCGTTGGCGCATATGGGCATTCTGGGCTTCGTGTTTACCCTGGGCGGAGG AGGATCCGGTGGCGGAGGTTCAGGAGGCGGTGGATCGATCCAGCGTACTCCAAAG3'(서열번호 13) 및 3'VLscSS1-5'GCAGTAAGGAATTCTCATTATTTTATTTCCAACTTTGT3'(서열번호 14). PRB 플라스미드가 scHLA-A2/SS1(scFv) 서열을 포함하는 주형으로 사용되었다. M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질의 발현 및 정제 프로토콜은 화합물 A의 발현 및 정제 프로토콜과 동일하였다. M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질의 생화학적 및 생물학적 특성을 분석하는 모든 방법들은 화합물 A의 활성을 분석하는데 사용된 방법들과 동일하였다.
유세포 분석
세포들을 화합물 A(4℃에서 60분, 100㎕의 양, 10㎍/㎖)와 함께 배양하고, 항-HLA-A2 MAb BB7.2(4℃에서 60분, 10㎕/㎖)로 세척 및 정치하였다. 상기 세포들 을 2차 항원으로 작용하는 항-마우스 FITC(4℃에서 60분, 10㎕/㎖)로 세척 및 정치하였다. 그후, 상기 세포들을 세척하고 FACS 칼리버 유세포 분석기(미국 캘리포니아주의 새너제이시에 소재한 벡톤-딕킨슨(Becton-Dickinson)사)로 분석하였다.
효소면역 검사(Enzyme linked immunosorbent assay)
면역 플레이트(Falcon(등록상표), 미국 뉴저지주의 프랭클린 레이크스시에 소재한 벡톤-딕킨슨 랩웨어사)를 10㎍/㎖의 정제되고 박테리아에 의해 수득된 재조합 메소텔린(4℃ 하룻밤 정치)으로 코팅하였다. 상기 플레이트를 2% 스킴 밀크를 포함하는 PBS로 차단한 후, 다양한 농도의 화합물 A(실온에서 60분)와 함께 정치하고 PBS로 3번 세척하였다. 항-HLA-형태 의존성 항체 W6/32(실온에서 60분, 1㎍/㎖)를 사용하여 결합을 검출하고, 플레이트를 PBS로 3번 세척한 후 항-마우스 IgG-페록시데이즈(실온에서 60분, 1㎍/㎖)와 함께 정치하였다. TMB(DAKO)를 사용하여 반응을 진행시키고, 50㎕ H2SO4 2N을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 항-메소텔린 항체(K1)가 양성 대조구로 사용되었다. 상기 면역 플레이트를 450nm 필터를 사용하는 ELISA 해독기(Anthos 2001(등록상표), 오스트리아 잘츠부르크시에 소재한 안토스 랩테크(Anthos Labtech)사)로 분석하였다.
세포독성 검사
세포독성은 S35-메싸이오닌 방출 검사로 판정하였다. 표적 세포들을 메싸이오닌이 없는 RPMI 10% FCS로 배양 플레이트에서 2시간 배양한 후, 15μCi/㎖의 S35메싸이오닌(NEN)으로 밤새 배양하였다. 상기 표적 세포들을 트립신 처리하여 수집 하고 40㎖ RPMI 10% FCS로 2번 세척하였다. 표적 세포들을 RMPI+10% FCS가 들어있는 96웰 플레이트(웰 당 5×103 세포수)에 분주하고, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 밤새 배양하였다. 표적 세포들을 여러가지 농도의 화합물 A 융합 단백질과 함께 2시간 동안 배양하고, 효과기 CTL 세포들을 다양한 비율의 표적세포:효과기로 첨가하였으며, 상기 플레이트들을 37℃, 5% CO2의 조건하에서 8 내지 12시간 배양하였다. 배양한 후, 표적 세포들로부터의 S35메싸이오닌 방출을 25㎕의 배양 상등액 샘플로 측정하였다. 모든 검사들은 3번 반복하여 실시되었고, 세포용해를 직접 계산하였다:([실험에서의 방출-자연적인 방출]/[최대 방출-자연적인 방출])×100. 자연적인 방출은 효과기 세포가 존재하지 않는 경우 표적 세포들로부터 방출된 S35메싸이오닌으로 측정하였으며, 최대 방출은 0.05M NaOH에 의해 용해된 표적 세포들로부터 방출된 S35-메싸이오닌으로 측정하였다.
세포주(Cell lines)
A431 및 A431K5 세포(유표피 암종)를 10% FCS, L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 배지에서 보존하였다. 상기 A431K5 세포주는 메소텔린이 안정적으로 주입된 인간 유표피 암종 A431 세포주이며, 상기 주입된 세포들은 700㎍/㎖의 G418(Gibco-BRL(등록상표), 미국 캘리포니아주의 칼스배드시에 소재한 인비트로젠사)로 보존되었다.
CMV pp65 에피토프(NLVPMVATV)에 대한 특이성을 갖는 CTL을 Ditmar Zehn(독 일 베를린의 차리티시에 소재) 박사의 호의로 제공받았다. 상기 CTL은, 건강한 HLA-A2 양성 기증자로부터의 PBMC를 펩타이드로 펄스하고 방사선조사(4000rad)하여 배양함으로써 그 수가 증가되었으며, 이를 AIMV 배지 + 8.9% FCS + 50㎕ μM-2-머캅토에탄올 + 페니실린/스트렙토마이신 1×105U/L에 보존하였다.
결과:
화합물 A의 제조
짧은 펩타이드 링커(15 아미노산)를 통하여 HLA-A2 유전자의 α1, α2 및 α3와 결합된 β2 마이크로글로불린 유전자로 구성된 단일-사슬 MHC 분자를 코딩하는 구조물이 메소텔린을 표적화하는 scFv SS1과 결합되었다(도 1A). 상기 구조물을 생화학적 및 생물학적 활성에 대하여 자세히 분석하여, 체내 및 체외에서 기능을 가짐을 확인하였다(15). 공유결합으로 연결된 펩타이드를 갖는 융합 단백질을 제조하기 위하여, CMV pp65 단백질 유래의 9개의 아미노산(NLVPMVATV)(서열번호 4)이 20개의 아미노산 링커 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 6)를 통하여 scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질의 N-말단에 결합되었다(도 1B). 화합물 A는 2단계로 제조되었다: 먼저, M1/scHLA-A2/SS1(scFv)이라는 공유 결합된 융합 단백질을 오버랩 확장 PCR로 제조하였다. 상기 구조물에서는, 인플루엔자 M158-66 펩타이드 GILGFVFTL(서열번호 21) 및 15개의 아미노산 링커가 scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질의 N-말단에 결합되었다. 상기 구조물에, 신규의 유일한 제한 부위(BamHI)가 사일런트 뮤테이션으로 상기 링커 서열에 삽입되었다. 두번째 단계에서, M1/scHLA- A2/SS1(scFv) 전체 서열을 포함하는 PRB 플라스미드가 NdeI 및 BamHI 제한 효소에 의하여 처리되었다. 상기 처리에 의하여 2개의 단편이 수득되었다. 하나의 단편은 펩타이드 및 링커 서열의 일부를 포함하며, 나머지 단편은 플라스미드, 링커의 일부 및 scHLA-A2/SS1(scFv) 서열을 포함한다. 그후, 플라스미드, 링커의 일부 및 scHLA-A2/SS1(scFv) 서열을 포함하는 단편을 CMV pp65 펩타이드 서열 및 링커 서열의 확장을 코딩하는 dsDNA 프라이머와 라이게이션 하였다(도 1B). 새로 수득한 플라스미드를 E-coli DH5α 세포에 형질전환시키고, 수득된 양성 콜로니들을 DNA 서열 분석하였다(도 2).
화합물 A의 발현 및 정제
화합물 A를 E.coli BL21 세포에서 발현하였는데, 아이소프로필 β-D-싸이오갈락토사이드로 인덕션을 하여 다량의 재조합 단백질이 세포내 봉입체로 축적되었다. 분리되고 정제된 봉입체의 SDS/PAGE 분석 결과, 정확한 분자량의 화합물 A가 전체 봉입체 질량의 80-90%를 구성함을 알 수 있었다(도 3A). 분리되고 용해된 봉입체를 환원시키고 체외에서 산화환원 셔플링 완충액으로 리폴딩을 하였다. 단량체의 가용성 융합 단백질(화합물 A)을 Q-세파로스(등록상표) 상에서 이온교환 크로마토그래피를 하여 정제하였다. 화합물 A의 SDS/PAGE 분석 결과, 예상된 72KDa의 분자량을 가진 고도로 정제된 단량체 분자임을 알 수 있었다(도 3B).
화합물 A의 생물학적 활성
ELISA
정제된 화합물 A의 표적 항원으로의 결합 능력을 시험하기 위하여, 재조합 메소텔린을 면역 플레이트 상에 고정하였다. 화합물 A의 결합을 형태 민감성 mAb W6/32를 사용하여 관찰하였으며, 상기 항체는 MHC 분자의 홈에 펩타이드를 가진 채 정확하게 폴딩을 이루는 MHC 분자를 인식한다. 도 4에 도시된 바와 같이, 재조합 메소텔린에 대한 화합물 A의 결합은 약량-의존적이었다. 이는 화합물 A의 2개의 기능 도메인, scFv(SS1) 도메인 및 펩타이드/scHLA-A2 도메인이 정확하게 폴딩을 이루고 있음을 암시한다. 또한, 상기 융합 단백질의 scFv(SS1) 도메인은 활성 형태로 있으며 메소텔린에 특이적으로 결합할 수 있다.
유세포 분석(FACS)
메소텔린을 발현하는 세포주에 대한 화합물 A의 결합 능력을 시험하기 위하여, FACS 분석을 수행하였다. 모델로서, HLA-A2 음성인 표적 세포들을 사용하였으며, 따라서, 그 표면에 메소텔린을 발현하는 세포들에 대한 화합물 A의 결합을 측정하는데 항-HLA-A2 항체의 반응성이 사용될 수 있다. 메소텔린-양성이며, HLA-A2-음성인 세포들의 이러한 모델은 종양 세포들이 HLA 발현을 소실한 극단적인 경우를 나타낸다. 따라서, FACS 분석을 위하여, HLA-A2 음성인 A431K5 세포들이 사용되었는데, 이들은 메소텔린이 안정적으로 주입된 인간 유표피 암종 A431 세포들이다. 메소텔린-음성이며 HLA-A2 음성인 모세포 A431 인간 유표피 암종 세포들은 음성 대조구로 사용되었다. 표적 세포들에 대한 화합물 A의 결합은 1차 항체인 항-HLA-A2 mAb BB7.2 및 FITC 부착된 2차 항체로 관찰되었다. 메소텔린 항-mAb K1은 메소텔린의 발현 수준을 측정하기 위하여 사용되었다. 도 5a에 도시된 바와 같이, A431K5 세포들은 높은 양의 메소텔린을 발현하는 반면, 모세포인 A431 세포들은 표적 항원 을 발현하지 않는다. 또한, HLA-A2 특이 항체(BB7.2)를 사용하여 HLA-A2의 발현에 대하여 세포주 A431 및 A431K5를 측정하였는데, 2개의 세포주 모두 HLA-A2 음성이었다. 그러나, A431K5 세포들을 화합물 A와 전배양한 경우, 이들은 HLA-A2 특이 항체 BB7.2에 의하여 양성으로 염색되었다(도 5b). 항원-음성 A413 세포들은 아무 영향이 없었다. 화합물 A가 A431 세포가 아닌 A431K5 세포에 특이적으로 결합한다는 사실은 상기 결합이 융합 단백질의 표적 scFv 도메인과 메소텔린의 상호작용에만 의존하며 상기 융합 단백질이 세포 표면 상에 자연적으로 발생된 그대로의 표적 항원과 결합할 수 있음을 또한 암시한다.
세포독성 분석
HLA-A2 제한 CMV pp65 NLVPMVATV(서열번호 4) 특이적 CTL에 의하여 HLA-A2-음성이며 메소텔린-양성인 세포들을 사멸시키는 것을 매개하는 화합물 A의 능력을 시험하기 위하여, HLA-A2-음성이며 메소텔린 주입된 A431K5 세포 및 HLA-A2-음성이며 메소텔린-음성인 A431 모세포를 사용하여 S35-메싸이오닌 방출 시험을 수행하였다. CMV 특이적 CTL의 세포 사멸 능력을 측정하기 위하여, MetS35로 방사성 동위원소 처리되고 CMV 펩타이드 NLVPMVATV가 주입된 HLA-A2-양성의 JY 세포들을 사용하여 세포독성 검사를 수행하였다. CMV 특이적 CTL에 의한 JY 세포들의 특이적 사멸 평균값은 47%였으며, E:T의 비율은 10:1이었다(데이터 표시 생략). 도 6a에 도시된 바와 같이, 화합물 A는 A431K5 세포들(메소텔린-양성이며 HLA-A2-음성인)의 사멸을 효과적으로 매개하였다. 특이적 사멸은 펩타이드-주입된 JY 세포들에 비하여 66%까 지 달성될 수 있었다. 따라서, 상기 융합 단백질을 이용한 사멸이, 최적 표적을 나타내는 펩타이드로 펄스된 항원 제시 세포들과 비교할 때 훨씬 더 효과적이었다. 그러나, 표적 A431K5 세포가 화합물 A와의 전배양없이 CMV 특이적 CTL과만 배양된 경우, 또는 표적 세포가 화합물 A와 전배양을 하든 하지 않았든 A431 메소텔린-음성 세포인 경우에는 어떠한 세포독성 활성도 관찰되지 않았다. 다음으로, 도 6b에 도시된 바와 같이, 화합물 A의 효능을 판정하기 위하여 적정(titration) 실험을 수행하였는데, 메소텔린-양성의 A431K5 세포들의 사멸은 약량 의존적이었으며, IC50값은 0.5-1㎍/㎖였다.
이들 결과들은 메소텔린-양성이며 HLA-A2-음성인 A431K5 세포의 사멸은 특이적이며, 화합물 A의 표적 도메인(scFv/SS1)에 의한 메소텔린의 인식 및 CMV CTL의 펩타이드/scHLA-A2 도메인에 대한 특이성에 의해 좌우됨을 암시한다.
화합물 B의 생물학적 활성
유세포 분석(FACS)
메소텔린을 발현하는 세포주에 대한 화합물 B의 결합 능력을 시험하기 위하여, 유세포 분석을 수행하였다. 모델로서, HLA-A2 음성인 표적 세포들을 사용하였으며, 따라서, 항-HLA-A2 mAb의 반응성은 세포 표면 항원에 대한 화합물 B의 결합을 암시할 것이다. 인간 유표피 암종 A431 세포에 메소텔린이 안정적으로 주입된 A431K5 세포는 HLA-A2 음성이다. 메소텔린-음성이며 HLA-A2 음성인 모세포 A431 인간 유표피 암종 세포들은 대조구로 사용되었다. 표적 세포들에 대한 화합물 B의 결 합은 1차 항체인 항-HLA-A2 mAb BB7.2 및 FITC 부착된 2차 항체로 관찰되었다. 양성 대조구로서의 메소텔린의 발현양을 측정하기 위하여, 상업적으로 시판되는 항-메소텔린 mAb K1을 사용하였다. 도 10a 내지 도 10b에 도시된 바와 같이, A431K5 세포들은 높은 양의 메소텔린을 발현하는 반면, 모세포인 A431 세포들은 메소텔린을 발현하지 않는다. 또한, HLA-A2 특이 항체(BB7.2)를 사용하여 HLA-A2의 발현에 대하여 세포주 A431 및 A431K5를 측정하였는데, 2개의 세포주 모두 HLA-A2 음성이었다. 그러나, A431K5 세포들을 화합물 B와 전배양한 경우, 이들은 HLA-A2 특이 항체 BB7.2에 의하여 양성으로 염색되었으며, 반면 대조구인 A431 세포들은 염색되지 않았다(도 10c 내지 도 10d). 화합물 B가 A431 세포가 아닌 A431K5 세포에 특이적으로 결합한다는 사실은 상기 결합이 표적 scFv 도메인과 메소텔린의 상호작용에만 의존함을 암시한다.
화합물 A 융합 단백질과 비교하여 화합물 B의 결합을 분석하기 위하여, 동일한 조건 및 농도에서의 양 분자들을 사용하여 FACS 분석을 수행하였다. 도 10e 내지 도 10f에 도시된 바와 같이, 2개의 융합 단백질들과 함께 전배양한 경우, 메소텔린-양성의 A431K5 세포들만이 HLA-A2-특이적 Ab에 의하여 양성으로 염색되었는데, 그러나, 화합물 A가 보다 나은 결합력을 보였다.
세포독성 분석
HLA-A2 제한 CMV NLVPMVATV(서열번호 4) 특이적 CTL에 의하여 HLA-A2-음성이며 메소텔린-양성인 세포들을 사멸시키는 것을 매개하는 화합물 B의 능력을 시험하기 위하여, HLA-A2-음성이며 메소텔린 주입된 A431K5 세포 및 HLA-A2-음성이며 메 소텔린-음성인 A431 모세포를 사용하여 S35-메싸이오닌 방출 시험을 수행하였다. CMV 특이적 CTL의 세포 사멸 능력을 측정하기 위하여, MetS35로 방사성 동위원소 처리되고 CMV 펩타이드 NLVPMVATV가 주입된 HLA-A2-양성의 JY 세포들을 사용하여 세포독성 검사를 수행하였다. CMV 특이적 CTL에 의한 JY 세포들의 특이적 사멸 평균값은 약 45-50%였으며, 사용된 E:T의 비율은 10:1이었다(데이터 표시 생략). 도 11a에 도시된 바와 같이, 화합물 B는 A431K5 세포들(메소텔린-양성이며 HLA-A2-음성인)의 사멸을 효과적으로 매개하였으며, 이러한 특이적 사멸은 펩타이드-주입된 JY 세포들에 비하여 66%였다(JY 세포와 비교하면 ~150%). 그러나, 표적 A431K5 세포가 화합물 B와의 전배양없이 CMV 특이적 CTL과만 배양된 경우, 또는 표적 세포가 화합물 B와 전배양을 하든 하지 않았든 메소텔린-음성 (A431 세포)인 경우에는 어떠한 세포독성 활성도 관찰되지 않았다. 도 11b에 도시된 바와 같이, 상기 융합 단백질의 효능을 측정한 적정 실험은 메소텔린-양성의 A431K5 세포들의 사멸이 약량 의존적이었음을 암시한다. β-2 마이크로글로불린에 항원성 펩타이드를 공유적으로 결합시키는데 사용된 펩타이드의 길이에서 서로 차이가 나는 화합물 B 및 화합물 A의 세포독성 활성을 비교하기 위하여, 2개의 융합 단백질에 대하여 동일한 조건으로 S35-메싸이오닌 활성 시험을 수행하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, 두 분자들 모두 A431K5 세포들의 사멸을 효과적으로 및 특이적으로 매개하였으나, A431 세포들의 경우는 그렇지 않았다. 상대적으로 높은 농도의 융합 단백질들(화합물 B 및 화합물 A)을 사용한 경우, 두 분자들의 사멸 활성은 유사하였다. 그러나, 낮은 농 도의 융합 단백질들이 사용된 경우에는 화합물 A의 세포독성 활성이 우수하였는데, 이는 아마도 링커의 길이가 더 길기 때문에 MHC 펩타이드-결합 홈 내의 CMV 펩타이드가 보다 안정적이며 보다 잘 배치되기 때문인 것 같다.
M1-COV/scHLA-A2/SS1
M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질을 오버랩 확장 PCR 반응으로 제조하였는데, 인플루엔자 M1 58-66 펩타이드 및 15개의 아미노산 링커 GGGGSGGGGSGGGGS가 scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질의 N-말단에 결합되었다(도 13). PCR 산물을 TA-클로닝 벡터(p-GEM, 프로메가사)에 라이게이션을 하고, E-coli DH5α 세포에 형질전환하였다. 양성 콜로니들을 선별하고, 삽입 유전자를 EcoRI 및 NdeI을 사용하여 분리하였다. 상기 삽입 유전자를 PRB 발현 벡터에 라이게이션을 하고, E-coli DH5α 세포에 형질전환하였다. 양성 콜로니들을 DNA 서열 분석하였다(도 14).
화합물 B의 발현 및 정제
M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질을 E.coli BL21 세포에서 발현하였는데, 아이소프로필 β-D-싸이오갈락토사이드로 인덕션을 하여 다량의 재조합 단백질이 세포내 봉입체로 축적되었다. 분리되고 정제된 봉입체의 SDS/PAGE 분석 결과, 정확한 분자량의 M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질이 전체 봉입체 질량의 80-90%를 구성함을 알 수 있었다(도 15A). 분리되고 용해된 봉입체를 환원시키고 체외에서 산화환원 셔플링 완충액으로 리폴딩을 하였다. 단량체의 가용성 융합 단백질(M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv))을 Q-세파로스(등록상표) 상에서 이온교환 크로마토그래피로 정제하였다. M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv)의 SDS/PAGE 분석 결과, 예상된 72KDa의 분자량을 가진 고도로 정제된 단량체 분자임을 알 수 있었다(도 15B).
ELISA
정제된 M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질의 표적 항원으로의 결합 능력을 시험하기 위하여, 재조합 메소텔린을 면역 플레이트 상에 고정하였다. M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질의 결합을 형태 민감성 mAb W6/32를 사용하여 관찰하였으며, 상기 항체는 MHC 분자의 홈에 펩타이드를 가진 채 정확하게 폴딩을 이루는 MHC 분자를 인식한다. 도 16에 도시된 바와 같이, 재조합 메소텔린에 대한 M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질의 결합은 약량-의존적이었다. 이는 M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질의 2개의 기능 도메인, scFv(SS1) 도메인 및 M1-cov/scHLA-A2 도메인이 정확하게 폴딩을 이루고 있음을 암시한다. 또한, 상기 융합 단백질의 scFv(SS1) 도메인은 활성 형태로 있으며 메소텔린에 특이적으로 결합할 수 있다.
유세포 분석(FACS)
메소텔린을 발현하는 세포주에 대한 M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질의 결합 능력을 시험하기 위하여, FACS 분석을 수행하였다. 모델로서, HLA-A2 음성인 표적 세포들을 사용하였으며, 세포 표면 항원에 대한 M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질의 결합을 관찰하기 위하여 항-HLA-A2 mAb가 사용될 수 있다. FACS 분석을 위하여, 메소텔린-주입된 A431K5 세포들이 사용되었다. 표적 세포들에 대한 M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질의 결합은 1차 항체인 항-HLA-A2 mAb BB7.2 및 FITC 부착된 2차 항체로 관찰되었다. 양성 대조구로서의 메소텔린 의 발현양을 측정하기 위하여, 상업적으로 시판되는 항-메소텔린 mAb K1을 사용하였다. 도 17a 내지 도 17b에 도시된 바와 같이, A431K5 세포들은 높은 양의 메소텔린을 발현하는 반면, 모세포인 A431 세포들은 메소텔린을 발현하지 않는다. 또한, HLA-A2 특이 항체(BB7.2)를 사용하여 HLA-A2의 발현에 대하여 세포주 A431 및 A431K5를 측정하였는데, 2개의 세포주 모두 HLA-A2 음성이었다. 그러나, A431K5 세포들을 M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질과 전배양한 경우, 이들은 HLA-A2 특이 항체 BB7.2에 의하여 양성으로 염색되었으며, 반면 대조구인 A431 세포들은 염색되지 않았다(도 17c 내지 도 17d). M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질이 A431 세포가 아닌 A431K5 세포에 특이적으로 결합한다는 사실은 상기 결합이 표적 도메인(scFv(SS1))과 메소텔린의 상호작용에만 의존함을 암시한다.
세포독성 분석
HLA-A2 제한 M158-66 특이적 CTL에 의하여 HLA-A2-음성이며 메소텔린-양성인 세포들을 사멸시키는 것을 매개하는 M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질의 능력을 시험하기 위하여, HLA-A2-음성이며 메소텔린 주입된 A431K5 세포를 사용하여 S35-메싸이오닌 방출 시험을 수행하였다. 도 18에 도시된 바와 같이, M1-cov/scHLA-A2/SS1(scFv) 융합 단백질은 A431K5 세포들(메소텔린-양성이며 HLA-A2-음성인)의 세포용해를 매개하지 못하였다. 그러나, 그 홈에 M158-66 펩타이드를 갖고 있는 scHLA-A2/SS1(scFv)은 HLA-A2-제한 M158-66 특이적 CTL에 의한 메소텔린 양성의 표적 세포의 사멸을 매개하였다.
고찰
:
본 연구는 공유 결합으로 연결된 펩타이드/scMHC/scFv 융합 단백질의, 종양 세포들을 표적화하는 능력이 HLA-A2-음성 세포들로 하여금 적절한 HLA-A2-제한 CTL에 의하여 세포용해가 이루어질 수 있도록 함을 예시한다. Lev 등의 문헌 및 Oved 등의 문헌(15, 21)에 의해 이전에 보여진 바와 같이, 이 방법은 2가지 주요한 장점들을 갖는다. 먼저, 본 방법은 형질전환된 표현형(성장 인자 수용체 및/또는 분화 항원과 같은)과 일반적으로 연관된 종양 마커를 발현하는 악성 종양 세포들의 위치를 상대적으로 높은 특이성으로 찾아낼 수 있는 재조합 Ab 단편들을 사용할 수 있다는 잇점을 갖는다. 둘째로, 본 방법은 표적화된 MHC-펩타이드 복합체 내에 존재하는 바이러스 특이적 T-세포 에피토프와 같은 미리 선택되고 고도의 항원성을 가진 펩타이드 에피토프에 대하여 특이적이고 매우 반응성이 큰 세포독성 T-세포들의 특별한 개체군을 모집하는 능력을 갖는다. 이러한 기본 접근법은 종양, 바이러스 또는 박테리아의 T-세포 에피토프로부터 유래된 단일하면서 미리 선택된, 매우 항원성이 큰 펩타이드들을 보유하는 많은 종류의 MHC-펩타이드 복합체들을 표적화하는 능력과 함께, 다양한 종양 특이적 항원들을 표적화하는 많은 종양-특이적 scFv 단편들을 갖는 복합 분자들을 생성한다. 본 실시예들은 짧은 링커(20AA)로 연결된 9개의 아미노산 펩타이드를 종래 보고된 scHLA-A2/scFv 융합 단백질(15AA)에 결합함으로써 한 단계 더 나아간 방법을 제공하는데, 이렇게 함으로써 MHC 홈 내에 있는 펩타이드를 안정화시키고 융합 단백질의 일반적인 안정성을 연장시킨다. 이러한 새로운 융합 단백질의 생성을 위한 모델로서, 본 발명은 CMV pp65 유래의 (NLVPMVATV)가 scHLA-A2/SS1(scFv) 분자의 N-말단에 결합된 융합 단백질의 제조 및 그의 생화학적 및 생물학적 특성을 기술한다. 신규 융합 단백질의 2개의 도메인들은 체외에서 리폴딩하여 정확한 폴딩 상태에 있는 분자 구조를 취할 수 있는데, HLA-A2 홈 내에 펩타이드를 가지며, 표적 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 활성 상태의 표적 도메인(scFv)을 가질 수 있다. 또한, 상기 융합 단백질은 HLA-A2-제한된 CTL에 의한, HLA-A2-음성이며 메소텔린-양성인 종양 세포들의 세포용해를 성공적으로 매개하였다.
종양 전이는 면역-억제 인자들의 분비 및/또는 항원 제시 기능을 하는 MHC 클래스 I의 하향조절과 종종 관련된다(2). 환자 체내에서 특이적 CTL 반응이 보이는 경우라고 하더라도, 항-종양 CTL 개체군의 밀도가 희박하고, 매우 부정기적이며 일부 경우에는 CTL이 기능하지 않거나 면역 저하 상태에 있기 때문에 상기 반응은 약하다(26). 또한, 특정 종양 관련 펩타이드를 제공하는, 종양 세포의 표면 상의 MHC-펩타이드 복합체의 수가 낮다는 것이 잘 알려져 있다(27). 본원에서 알 수 있듯이, 신규 방법은 이러한 문제들을 극복하였다. 먼저, 종양 세포들은 그들의 내인성 MHC 발현과는 독립적인 MHC-펩타이드 복합체들로 피복된다. 둘째, 일반적으로 종양 표현형(성장 인자 수용체 및 분화 항원 등)의 일부인 종양 특이적 항원들의 사용은 이들 항원들의 하향조절을 방지하고, 치료의 효율성을 높인다. 가장 중요한 셋째는, 융합 단백질의 효과기 도메인인 MHC-펩타이드 복합체는 MHC 홈에 있는 펩타이드에 의하여 특이적 CTL 개체군들을 모집할 수 있다.
명확성을 위하여 개별적인 실시형태들의 관점에서 기술된 본 발명의 특정 특 성들은 또한 단일 실시형태의 조합에도 제공될 수 있다고 이해된다. 역으로, 간결성을 위하여 단일 실시형태의 관점에서 기술된 본 발명의 다양한 특성들은 또한 개별적으로 또는 어떤 적절한 하부 조합에도 제공될 수 있다. 비록 본 발명이 특정의 실시형태와 관련하여 기술되었을지라도, 수많은 대안, 수정 및 변형물들이 당해 분야의 숙련자에게 명백할 것임은 자명하다. 따라서, 본 발명의 사상 및 청구항들의 광의의 범주 내에 대응되는 이러한 모든 대안, 수정 및 변형물들을 포함하고자 한다. 본 명세서에 언급된 모든 문헌, 특허 및 특허 출원들은 각 개별 문헌, 특허 또는 특허 출원이 구체적 및 개별적으로 본원에 참조로 포함된다고 명시된 바대로 본 명세서 내에 그 전체가 참조로 포함된다. 또한, 본 출원 내의 참조문헌 중의 어떤 인용이나 동일화가 그러한 참조문헌이 본 발명에 대한 종래 기술로 활용 가능함을 인정하는 것으로 유추되어서는 안된다.
인용된 참조문헌
<110> TEVA PHARMACEUTICAL INDUSTRIES, LTD.
TECHNION RESEARCH AND DEVELOPMENT FOUNDATION LTD.
<120> FUSION PROTEINS, USES THEREOF AND PROCESSES FOR PRODUCING SAME
<150> US60/801,798
<151> 2006-05-19
<160> 23
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1995
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Compound A fusion protein
<400> 1
atgaacctgg tgccgatggt cgcgaccgtt ggaggtggcg gttctggcgg aggaggatcc 60
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gcgtacgacg gcaaggatta catcgccctg aaagaggacc tgcgctcttg gaccgcggcg 840
gacatggcag ctcagaccac caagcacaag tgggaggcgg cccatgtagc ggagcagttg 900
agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccgca gatacctgga gaacgggaag 960
gagacgctgc agcgcacgga cgcccccaaa acgcacatga ctcaccacgc tgtctctgac 1020
catgaagcca ccctgaggtg ctgggccctg agcttctacc ctgcggagat cacactgacc 1080
tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacacggagc tcgtggagac aaggcctgca 1140
ggggatggaa ccttccagaa gtgggcggct gtggtggtgc cttctggaca ggagcagaga 1200
tacacctgcc atgtgcagca tgagggtttg cccaagcccc tcaccctgag atgggaggct 1260
tccggaggtc aggtacaact gcagcagtct gggcctgagc tggagaagcc tggcgcttca 1320
gtgaagatat cctgcaaggc ttctggttac tcattcactg gctacaccat gaactgggtg 1380
aagcagagcc atggaaagag ccttgagtgg attggactta ttactcctta caatggtgct 1440
tctagctaca accagaagtt caggggcaag gccacattaa ctgtagacaa gtcatccagc 1500
acagcctaca tggacctcct cagtctgaca tctgaagact ctgcagtcta tttctgtgca 1560
agggggggtt acgacgggag gggttttgac tactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 1620
tcctcaggtg taggcggttc aggcggcggt ggctctggcg gtggcggatc ggacatcgag 1680
ctcactcagt ctccagcaat catgtctgca tctccagggg agaaggtcac catgacctgc 1740
agtgccagct caagtgtaag ttacatgcac tggtaccagc agaagtcagg cacctccccc 1800
aaaagatgga tttatgacac atccaaactg gcttctggag tcccaggtcg cttcagtggc 1860
agtgggtctg gaaactctta ctctctcaca atcagcagcg tggaggctga agatgatgca 1920
acttattact gccagcagtg gagtaagcac cctctcacgt tcggtgctgg gacaaagttg 1980
gaaataaaat aatga 1995
<210> 2
<211> 663
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Compound A fusion protein
<400> 2
Met Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln
20 25 30
Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu Asn Gly
35 40 45
Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp
50 55 60
Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu
65 70 75 80
His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr
85 90 95
Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val
100 105 110
Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Asp
115 120 125
Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe Phe Thr Ser Val Ser Arg Pro Gly
145 150 155 160
Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala Val Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln
165 170 175
Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ala Ala Ser Gln Arg Met Glu Pro Arg
180 185 190
Ala Pro Trp Ile Glu Gln Glu Gly Pro Glu Tyr Trp Asp Gly Glu Thr
195 200 205
Arg Lys Val Lys Ala His Ser Gln Thr His Arg Val Asp Leu Gly Thr
210 215 220
Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly Ser His Thr Val Gln
225 230 235 240
Arg Met Tyr Gly Cys Asp Val Gly Ser Asp Trp Arg Phe Leu Arg Gly
245 250 255
Tyr His Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Ala Leu Lys Glu
260 265 270
Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala Asp Met Ala Ala Gln Thr Thr Lys
275 280 285
His Lys Trp Glu Ala Ala His Val Ala Glu Gln Leu Arg Ala Tyr Leu
290 295 300
Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu Arg Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Thr Leu Gln Arg Thr Asp Ala Pro Lys Thr His Met Thr His His
325 330 335
Ala Val Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Ser Phe
340 345 350
Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln
355 360 365
Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr
370 375 380
Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Gln Glu Gln Arg
385 390 395 400
Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu
405 410 415
Arg Trp Glu Ala Ser Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro
420 425 430
Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser
435 440 445
Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His
450 455 460
Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala
465 470 475 480
Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp
485 490 495
Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu
500 505 510
Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly
515 520 525
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Val
530 535 540
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu
545 550 555 560
Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val
565 570 575
Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr
580 585 590
Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser
595 600 605
Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
610 615 620
Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Asp Ala
625 630 635 640
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Lys His Pro Leu Thr Phe Gly Ala
645 650 655
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
660
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMV peptide
<400> 3
aacctggtgc cgatggtcgc gaccgtt 27
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMV peptide
<400> 4
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20-aa peptide linker
<400> 5
ggaggtggcg gttctggcgg aggaggatcc ggtggcggag gttcaggagg cggtggatcg 60
60
<210> 6
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 20-aa peptide linker
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 7
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 15-aa peptide linker
<400> 7
ggtggcggtg gaagcggcgg tggaggctct ggtggaggtg gcagc 45
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 15-aa peptide linker
<400> 8
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 9
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-aa peptide linker
<400> 9
gcttccggag gt 12
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 4-aa peptide linker
<400> 10
Ala Ser Gly Gly
1
<210> 11
<211> 726
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SS1
<400> 11
caggtacaac tgcagcagtc tgggcctgag ctggagaagc ctggcgcttc agtgaagata 60
tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacacca tgaactgggt gaagcagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggactt attactcctt acaatggtgc ttctagctac 180
aaccagaagt tcaggggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccag cacagcctac 240
atggacctcc tcagtctgac atctgaagac tctgcagtct atttctgtgc aagggggggt 300
tacgacggga ggggttttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 360
gtaggcggtt caggcggcgg tggctctggc ggtggcggat cggacatcga gctcactcag 420
tctccagcaa tcatgtctgc atctccaggg gagaaggtca ccatgacctg cagtgccagc 480
tcaagtgtaa gttacatgca ctggtaccag cagaagtcag gcacctcccc caaaagatgg 540
atttatgaca catccaaact ggcttctgga gtcccaggtc gcttcagtgg cagtgggtct 600
ggaaactctt actctctcac aatcagcagc gtggaggctg aagatgatgc aacttattac 660
tgccagcagt ggagtaagca ccctctcacg ttcggtgctg ggacaaagtt ggaaataaaa 720
taatga 726
<210> 12
<211> 240
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SS1
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
130 135 140
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
145 150 155 160
Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser
165 170 175
Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro
180 185 190
Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
195 200 205
Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
210 215 220
Ser Lys His Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235 240
<210> 13
<211> 109
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR Primer
<400> 13
ggaagcgttg gcgcatatgg gcattctggg cttcgtgttt accctgggcg gaggaggatc 60
cggtggcgga ggttcaggag gcggtggatc gatccagcgt actccaaag 109
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 14
gcagtaagga attctcatta ttttatttcc aactttgt 38
<210> 15
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 15
tatgaacctg gtgccgatgg tcgcgaccgt tggaggtggc ggttctggcg gaggag 56
<210> 16
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 16
gatcctcctc cgccagaacc gccacctcca acggtcgcga ccatcggcac caggttca 58
<210> 17
<211> 108
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 17
ggaagcgttg gcgcatatga tcatggacca ggttccgttc tctgttggcg aggagggtcc 60
ggtggcggag gttcaggagg cggtggatcg atccagcgta ctccaaag 108
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 18
gcagtaagga attctcatta ttttatttcc aactttgt 38
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide linker
<400> 19
Gly Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide linker monomer
<220>
<221> UNSURE
<222> (2)
<223> MISC_FEATURE; X = any amino acid
<220>
<221> UNSURE
<222> (2)
<223> misc_feature; Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 20
Gly Xaa Gly Gly Ser
1 5
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> peptide linker
<400> 21
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5
<210> 22
<211> 1980
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> compound B fusion protein
<400> 22
atgaacctgg tgccgatggt cgcgaccgtt ggcggaggag gatccggtgg cggaggttca 60
ggaggcggtg gatcgatcca gcgtactcca aagattcagg tttactcacg tcatccagca 120
gagaatggaa agtcaaattt cctgaattgc tatgtgtctg ggtttcatcc atccgacatt 180
gaagttgact tactgaagaa tggagagaga attgaaaaag tggagcattc agacttgtct 240
ttttcgaagg actggtcttt ctatctcttg tactacactg aattcacccc cactgaaaaa 300
gatgagtatg cctgccgtgt gaaccatgtg actttgtcac agcccaagat agttaagtgg 360
gatcgcgaca tgggtggcgg tggaagcggc ggtggaggct ctggtggagg tggcagcggc 420
tctcactcca tgaggtattt cttcacatcc gtgtcccggc ccggccgcgg ggagccccgc 480
ttcatcgcag tgggctacgt ggacgacacg cagttcgtgc ggttcgacag cgacgccgcg 540
agccagagga tggagccgcg ggcgccgtgg atagagcagg agggtccgga gtattgggac 600
ggggagacac ggaaagtgaa ggcccactca cagactcacc gagtggacct ggggaccctg 660
cgcggctact acaaccagag cgaggccggt tctcacaccg tccagaggat gtatggctgc 720
gacgtggggt cggactggcg cttcctccgc gggtaccacc agtacgcgta cgacggcaag 780
gattacatcg ccctgaaaga ggacctgcgc tcttggaccg cggcggacat ggcagctcag 840
accaccaagc acaagtggga ggcggcccat gtagcggagc agttgagagc ctacctggag 900
ggcacgtgcg tggagtggct ccgcagatac ctggagaacg ggaaggagac gctgcagcgc 960
acggacgccc ccaaaacgca catgactcac cacgctgtct ctgaccatga agccaccctg 1020
aggtgctggg ccctgagctt ctaccctgcg gagatcacac tgacctggca gcgggatggg 1080
gaggaccaga cccaggacac ggagctcgtg gagaccaggc ctgcagggga tggaaccttc 1140
cagaagtggg cggctgtggt ggtgccttct ggacaggagc agagatacac ctgccatgtg 1200
cagcatgagg gtttgcccaa gcccctcacc ctgagatggg aggcttccgg aggtcaggta 1260
caactgcagc agtctgggcc tgagctggag aagcctggcg cttcagtgaa gatatcctgc 1320
aaggcttctg gttactcatt cactggctac accatgaact gggtgaagca gagccatgga 1380
aagagccttg agtggattgg acttattact ccttacaatg gtgcttctag ctacaaccag 1440
aagttcaggg gcaaggccac attaactgta gacaagtcat ccagcacagc ctacatggac 1500
ctcctcagtc tgacatctga agactctgca gtctatttct gtgcaagggg gggttacgac 1560
gggaggggtt ttgactactg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc aggtgtaggc 1620
ggttcaggcg gcggtggctc tggcggtggc ggatcggaca tcgagctcac tcagtctcca 1680
gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt 1740
gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag tcaggcacct cccccaaaag atggatttat 1800
gacacatcca aactggcttc tggagtccca ggtcgcttca gtggcagtgg gtctggaaac 1860
tcttactctc tcacaatcag cagcgtggag gctgaagatg atgcaactta ttactgccag 1920
cagtggagta agcaccctct cacgttcggt gctgggacaa agttggaaat aaaataatga 1980
1980
<210> 23
<211> 1980
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M1cov/scHLA-A2/SS1 (scFv) fusion protein
<400> 23
atgggcattc tgggcttcgt gtttaccctg ggcggaggag gatccggtgg cggaggttca 60
ggaggcggtg gatcgatcca gcgtactcca aagattcagg tttactcacg tcatccagca 120
gagaatggaa agtcaaattt cctgaattgc tatgtgtctg ggtttcatcc atccgacatt 180
gaagttgact tactgaagaa tggagagaga attgaaaaag tggagcattc agacttgtct 240
ttttcgaagg actggtcttt ctatctcttg tactacactg aattcacccc cactgaaaaa 300
gatgagtatg cctgccgtgt gaaccatgtg actttgtcac agcccaagat agttaagtgg 360
gatcgcgaca tgggtggcgg tggaagcggc ggtggaggct ctggtggagg tggcagcggc 420
tctcactcca tgaggtattt cttcacatcc gtgtcccggc ccggccgcgg ggagccccgc 480
ttcatcgcag tgggctacgt ggacgacacg cagttcgtgc ggttcgacag cgacgccgcg 540
agccagagga tggagccgcg ggcgccgtgg atagagcagg agggtccgga gtattgggac 600
ggggagacac ggaaagtgaa ggcccactca cagactcacc gagtggacct ggggaccctg 660
cgcggctact acaaccagag cgaggccggt tctcacaccg tccagaggat gtatggctgc 720
gacgtggggt cggactggcg cttcctccgc gggtaccacc agtacgcgta cgacggcaag 780
gattacatcg ccctgaaaga ggacctgcgc tcttggaccg cggcggacat ggcagctcag 840
accaccaagc acaagtggga ggcggcccat gtagcggagc agttgagagc ctacctggag 900
ggcacgtgcg tggagtggct ccgcagatac ctggagaacg ggaaggagac gctgcagcgc 960
acggacgccc ccaaaacgca catgactcac cacgctgtct ctgaccatga agccaccctg 1020
aggtgctggg ccctgagctt ctaccctgcg gaaatcacac tgacctggca gcgggatggg 1080
gaggaccaga cccaggacac ggagctcgtg gagaccaggc ctgcagggga tggaaccttc 1140
cagaagtggg cggctgtggt ggtgccttct ggacaggagc agagatacac ctgccatgtg 1200
cagcatgagg gtttgcccaa gcccctcacc ctgagatggg aggcttccgg aggtcaggta 1260
caactgcagc agtctgggcc tgagctggag aagcctggcg cttcagtgaa gatatcctgc 1320
aaggcttctg gttactcatt cactggctac accatgaact gggtgaagca gagccatgga 1380
aagagccttg agtggattgg acttattact ccttacaatg gtgcttctag ctacaaccag 1440
aagttcaggg gcaaggccac attaactgta gacaagtcat ccagcacagc ctacatggac 1500
ctcctcagtc tgacatctga agactctgca gtctatttct gtgcaagggg gggttacgac 1560
gggaggggtt ttgactactg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc aggtgtaggc 1620
ggttcaggcg gcggtggctc tggcggtggc ggatcggaca tcgagctcac tcagtctcca 1680
gcaatcatgt ctgcatctcc aggggagaag gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt 1740
gtaagttaca tgcactggta ccagcagaag tcaggcacct cccccaaaag atggatttat 1800
gacacatcca aactggcttc tggagtccca ggtcgcttca gtggcagtgg gtctggaaac 1860
tcttactctc tcacaatcag cagcgtggag gctgaagatg atgcaactta ttactgccag 1920
cagtggagta agcaccctct cacgttcggt gctgggacaa agttggaaat aaaataatga 1980
1980
Claims (29)
- 단백질의 아미노 말단에서 시작해서, (i) 사이토메갈로바이러스 인간 MHC-제한 펩타이드, (ii) 제1 펩타이드 링커, (iii) 인간 β-2 마이크로글로불린, (iv) 제2 펩타이드 링커, (v) 인간 MHC 클래스 I 분자의 HLA-A2 사슬, (vi) 제3 펩타이드 링커, (vii) 항체의 scFv 단편의 중사슬로부터의 가변 영역, 및 (viii) 상기 scFv 단편의 경사슬로부터의 가변 영역을 포함하는 연속적인 아미노산을 포함하는, 융합 단백질로서, 상기 (vii) 및 (viii)에 대응하는 아미노산들은 펩타이드 결합에 의해 혹은 제4 펩타이드 링커에 의해 직접 함께 결합되며, 상기 scFv 단편은 메소텔린(mesothelin)과 특이적으로 결합하는 항체로부터 유래된 것이고, 상기 연속적인 아미노산은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것인, 융합 단백질.
- 제1항의 융합 단백질; 및 담체를 포함하며, 메소텔린을 발현하는 세포를 포함하는 종양을 치료하기 위한 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 융합 단백질은 치료상 유효량으로 상기 조성물 내에 존재하며, 상기 담체는 약제학적으로 허용가능한 담체인 것인 조성물.
- 제1항의 융합 단백질을 코딩하는, 서열번호 1의 핵산 구조물.
- 제4항의 핵산 구조물을 포함하는 벡터.
- 제4항의 핵산 구조물; 및 이에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 발현 벡터.
- 제6항의 벡터를 포함하는 세포.
- 제7항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 세포 및 원생동물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 진핵 세포인, 세포.
- 제7항에 있어서, 상기 세포는 박테리아 세포인, 세포.
- 제1항의 융합 단백질을 30중량% 이상 포함하는 분리된 봉입체.
- 제7항의 세포를 융합 단백질이 발현되도록 배양하는 단계 및 상기 발현된 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조방법.
- 제9항의 세포를 융합 단백질이 발현되도록 배양하는 단계 및 상기 발현된 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조방법.
- 제11항에 있어서, 상기 융합 단백질의 회수 단계는 상기 발현된 융합 단백질을 크기 배제 크로마토그래피로 분리하는 단계를 포함하는 것인 융합 단백질의 제조방법.
- 제12항에 있어서, 상기 융합 단백질은 봉입체로 발현되는 것인 융합 단백질의 제조방법.
- 메소텔린을 표면에 발현하는 세포를 포함하는 종양을 치료하기 위한 의약의 제조에 제1항의 융합 단백질을 사용하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 종양은 고형의 종양인, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 고형의 종양은 난소암, 폐암, 췌장암, 두경부암, 또는 중피종(mesothelioma)인, 방법.
- 삭제
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| PE20141212A1 (es) * | 2011-06-22 | 2014-09-19 | Hoffmann La Roche | Eliminacion de celulas diana por parte de celulas t citotoxicas especificas de virus utilizando complejos que comprenden mhc de clase 1 |
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| JP2015537043A (ja) * | 2012-11-30 | 2015-12-24 | ロシュ グリクアート アーゲー | 多機能タンパク質を含むがん細胞標的化ｍｈｃクラスｉを用いた循環性ウイルス特異的細胞傷害性ｔ細胞によるがん細胞の除去 |
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| SG11201504414UA (en) | 2012-12-21 | 2015-07-30 | Hoffmann La Roche | Disulfide-linked multivalent mhc class i comprising multi-function proteins |
| JP6875126B2 (ja) * | 2014-01-21 | 2021-05-19 | アルバート アインシュタイン カレッジ オブ メディシン | 迅速かつ包括的なｔ細胞免疫モニタリング用の細胞プラットフォーム |
| WO2015165480A1 (en) | 2014-04-30 | 2015-11-05 | Institute For Research In Biomedicine | Human cytomegalovirus vaccine compositions and method of producing the same |
| US10457716B2 (en) * | 2014-08-06 | 2019-10-29 | University Of Notre Dame Du Lac | Protein folding and methods of using same |
| US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
| US11339201B2 (en) | 2016-05-18 | 2022-05-24 | Albert Einstein College Of Medicine | Variant PD-L1 polypeptides, T-cell modulatory multimeric polypeptides, and methods of use thereof |
| WO2017201210A1 (en) | 2016-05-18 | 2017-11-23 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
| AU2017379900A1 (en) | 2016-12-22 | 2019-06-13 | Cue Biopharma, Inc. | T-cell modulatory multimeric polypeptides and methods of use thereof |
| CN107663239A (zh) * | 2016-12-28 | 2018-02-06 | 天津天锐生物科技有限公司 | 一种识别hla‑a2/nlvpmvatv的单域抗体 |
| EP3565829A4 (en) | 2017-01-09 | 2021-01-27 | Cue Biopharma, Inc. | MULTIMER POLYPEPTIDES T-LYMPHOCYTE MODULATORS AND THEIR METHODS OF USE |
| EP3596118B1 (en) | 2017-03-15 | 2024-08-21 | Cue Biopharma, Inc. | Combination of multimeric fusion polypeptides and immune checkpoint inhibitor for treating hpv-associated cancer |
| WO2019139896A1 (en) | 2018-01-09 | 2019-07-18 | Cue Biopharma, Inc. | Multimeric t-cell modulatory polypeptides and methods of use thereof |
| EP3755711A4 (en) * | 2018-02-20 | 2021-11-24 | Technion Research & Development Foundation Limited | IMMUNOTHERAPEUTIC COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF CANCER |
| US20230138095A1 (en) * | 2018-06-20 | 2023-05-04 | Danmarks Tekniske Universitet | Scaffolds with stabilized mhc molecules for immune-cell manipulation |
| US20220047710A1 (en) * | 2018-09-12 | 2022-02-17 | Washington University | Single chain constructs |
| EP3976084A4 (en) * | 2019-05-29 | 2023-06-21 | Cue Biopharma, Inc. | MULTIMERIC T-CELL-MODULATING POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE THEREOF |
| IL296209A (en) | 2020-05-12 | 2022-11-01 | Cue Biopharma Inc | Multimeric t-cell modulatory polypeptides and methods of using them |
| JP2023541366A (ja) | 2020-09-09 | 2023-10-02 | キュー バイオファーマ， インコーポレイテッド | １型真性糖尿病（ｔ１ｄ）を治療するためのｍｈｃクラスｉｉ ｔ細胞調節多量体ポリペプチド及びその使用方法 |
| WO2023126544A1 (en) * | 2022-01-03 | 2023-07-06 | Aarhus Universitet | Proteinaceous compound for generating specific cytotoxic t-cell effect |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999028471A2 (en) * | 1997-12-01 | 1999-06-10 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | ANTIBODIES, INCLUDING Fv MOLECULES, AND IMMUNOCONJUGATES HAVING HIGH BINDING AFFINITY FOR MESOTHELIN AND METHODS FOR THEIR USE |
| WO2002102840A2 (en) | 2001-06-20 | 2002-12-27 | Avidex Limited | Multiners of class i major histocompatibility complexes cantaining modified beta2-microglobulin proteins |
| US6843992B2 (en) * | 1996-11-12 | 2005-01-18 | City Of Hope | Immuno-reactive peptide CTL epitopes of human cytomegalovirus |
Family Cites Families (51)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL154600B (nl) * | 1971-02-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen. |
| NL154598B (nl) * | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
| NL154599B (nl) * | 1970-12-28 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking. |
| US3901654A (en) * | 1971-06-21 | 1975-08-26 | Biological Developments | Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors |
| US3853987A (en) * | 1971-09-01 | 1974-12-10 | W Dreyer | Immunological reagent and radioimmuno assay |
| US3867517A (en) * | 1971-12-21 | 1975-02-18 | Abbott Lab | Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies |
| NL171930C (nl) * | 1972-05-11 | 1983-06-01 | Akzo Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen. |
| US3850578A (en) * | 1973-03-12 | 1974-11-26 | H Mcconnell | Process for assaying for biologically active molecules |
| US6416738B1 (en) * | 1973-12-07 | 2002-07-09 | Neorx Corporation | Pretargeting methods and compounds |
| JPS6054684A (ja) | 1983-09-05 | 1985-03-29 | Teijin Ltd | 新規ｄνａ及びハイブリツドｄνａ |
| EP0243029A1 (en) | 1986-04-08 | 1987-10-28 | THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce | Recombinant vaccinia virus expressing human retrovirus gene |
| GB8608850D0 (en) | 1986-04-11 | 1986-05-14 | Diatech Ltd | Packaging system |
| US5591829A (en) * | 1987-05-29 | 1997-01-07 | Matsushita; Shuzo | Antibodies modified with toxic substance |
| US5468481A (en) | 1988-06-23 | 1995-11-21 | Amergen, Inc. | MHC class II-peptide conjugates useful in ameliorating autoimmunity |
| US5194425A (en) | 1988-06-23 | 1993-03-16 | Anergen, Inc. | Mhc-mediated toxic conjugates useful in ameliorating autoimmunity |
| US5260422A (en) | 1988-06-23 | 1993-11-09 | Anergen, Inc. | MHC conjugates useful in ameliorating autoimmunity |
| DE3825615A1 (de) | 1988-07-28 | 1990-02-01 | Behringwerke Ag | Antigenkonstrukte von "major histocompatibility complex" klasse i antigenen mit spezifischen traegermolekuelen, ihre herstellung und verwendung |
| US6291160B1 (en) * | 1989-05-16 | 2001-09-18 | Scripps Research Institute | Method for producing polymers having a preselected activity |
| WO1994004679A1 (en) * | 1991-06-14 | 1994-03-03 | Genentech, Inc. | Method for making humanized antibodies |
| US6011146A (en) | 1991-11-15 | 2000-01-04 | Institut Pasteur | Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and methods of using the determinant |
| US6153408A (en) | 1991-11-15 | 2000-11-28 | Institut Pasteur And Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale | Altered major histocompatibility complex (MHC) determinant and methods of using the determinant |
| US20030129191A1 (en) * | 1992-12-23 | 2003-07-10 | Neorx Corporation | Pretargeting methods and compounds |
| US5837477A (en) | 1993-01-15 | 1998-11-17 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | T cell receptor ligands and methods of using same |
| US5695928A (en) * | 1993-12-10 | 1997-12-09 | Novartis Corporation | Rapid immunoassay for detection of antibodies or antigens incorporating simultaneous sample extraction and immunogenic reaction |
| US5820866A (en) | 1994-03-04 | 1998-10-13 | National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine | Product and process for T cell regulation |
| DK0776339T4 (da) | 1994-07-29 | 2010-05-25 | Sunol Molecular Corp | MHC-komplekser og anvendelser deraf |
| GB9415492D0 (en) * | 1994-08-01 | 1994-09-21 | Celltech Ltd | Biological products |
| US5635363A (en) | 1995-02-28 | 1997-06-03 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Compositions and methods for the detection, quantitation and purification of antigen-specific T cells |
| EP0870040A2 (en) | 1995-12-29 | 1998-10-14 | Chiron Corporation | Gene delivery vehicle-targeting ligands |
| US5869270A (en) | 1996-01-31 | 1999-02-09 | Sunol Molecular Corporation | Single chain MHC complexes and uses thereof |
| US6140113A (en) | 1996-03-28 | 2000-10-31 | The Johns Hopkins University | Polynucleotides encoding molecular complexes which modify immune responses |
| EP0889964A1 (en) | 1996-03-28 | 1999-01-13 | The Johns Hopkins University | Soluble divalent and multivalent heterodimeric analogs of proteins |
| US6211342B1 (en) | 1996-07-18 | 2001-04-03 | Children's Hospital Medical Center | Multivalent MHC complex peptide fusion protein complex for stimulating specific T cell function |
| US6248564B1 (en) | 1997-08-29 | 2001-06-19 | Harvard University | Mutant MHC class I molecules |
| DE69840600D1 (de) | 1997-09-16 | 2009-04-09 | Univ Oregon Health & Science | Rekombinante mhc-moleküle welche nützlich sind für die manipulation von antigen-spezifischen t-zellen |
| US6232445B1 (en) | 1997-10-29 | 2001-05-15 | Sunol Molecular Corporation | Soluble MHC complexes and methods of use thereof |
| GB2339782A (en) | 1998-06-05 | 2000-02-09 | Philip Michael Savage | Chimeric protein complexes comprising HLA class I antigens |
| CA2372053C (en) * | 1999-04-28 | 2008-09-02 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf |
| US6680209B1 (en) * | 1999-12-06 | 2004-01-20 | Biosite, Incorporated | Human antibodies as diagnostic reagents |
| AU785493B2 (en) | 2000-03-27 | 2008-01-03 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Single chain class I major histo-compatibility complexes, constructs encoding same and methods of generating same |
| US20040191260A1 (en) * | 2003-03-26 | 2004-09-30 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Compositions capable of specifically binding particular human antigen presenting molecule/pathogen-derived antigen complexes and uses thereof |
| JP2003530836A (ja) | 2000-04-12 | 2003-10-21 | ユニバーシティー オブ ロチェスター | 標的化ワクチン送達システム |
| WO2001090198A1 (en) | 2000-05-24 | 2001-11-29 | Ludwig Institute For Cancer Research | Multicomponent conjugates which bind to target molecules and stimulate cell lysis |
| GB0026812D0 (en) | 2000-11-02 | 2000-12-20 | Isis Innovation | Cancer therapy |
| US20030017134A1 (en) | 2001-06-19 | 2003-01-23 | Technion Research And Development Foundation Ltd. | Methods and pharmaceutical compositions for immune deception, particularly useful in the treatment of cancer |
| US8022190B2 (en) * | 2001-06-19 | 2011-09-20 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Immuno-molecules containing viral proteins, compositions thereof and methods of using |
| US7362707B2 (en) | 2001-07-23 | 2008-04-22 | Acme Packet, Inc. | System and method for determining flow quality statistics for real-time transport protocol data flows |
| US6992176B2 (en) * | 2002-02-13 | 2006-01-31 | Technion Research & Development Foundation Ltd. | Antibody having a T-cell receptor-like specificity, yet higher affinity, and the use of same in the detection and treatment of cancer, viral infection and autoimmune disease |
| CA2476625A1 (en) * | 2002-02-20 | 2003-08-28 | Dyax Corp. | Mhc-peptide complex binding ligands |
| US7632866B2 (en) * | 2002-10-21 | 2009-12-15 | Ramot At Tel Aviv University | Derivatives of N-phenylanthranilic acid and 2-benzimidazolone as potassium channel and/or neuron activity modulators |
| ES2549128T3 (es) * | 2006-05-19 | 2015-10-23 | Technion Research And Development Foundation Ltd. | Proteínas de fusión, usos de las mismas y procesos para producir las mismas |
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Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| US6843992B2 (en) * | 1996-11-12 | 2005-01-18 | City Of Hope | Immuno-reactive peptide CTL epitopes of human cytomegalovirus |
| WO1999028471A2 (en) * | 1997-12-01 | 1999-06-10 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | ANTIBODIES, INCLUDING Fv MOLECULES, AND IMMUNOCONJUGATES HAVING HIGH BINDING AFFINITY FOR MESOTHELIN AND METHODS FOR THEIR USE |
| WO2002102840A2 (en) | 2001-06-20 | 2002-12-27 | Avidex Limited | Multiners of class i major histocompatibility complexes cantaining modified beta2-microglobulin proteins |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Cancer Immunol. Immunother. 54(9): 867-879(2005. 9) * |
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