JP2015537043A - 多機能タンパク質を含むがん細胞標的化ｍｈｃクラスｉを用いた循環性ウイルス特異的細胞傷害性ｔ細胞によるがん細胞の除去 - Google Patents

多機能タンパク質を含むがん細胞標的化ｍｈｃクラスｉを用いた循環性ウイルス特異的細胞傷害性ｔ細胞によるがん細胞の除去 Download PDF

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Abstract

本明細書において、厳密に一の抗原提示ドメイン、厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び少なくとも一の抗原結合部位を含むことを特徴とする多機能タンパク質であって、抗原提示ドメインは、ＮからＣ末端方向に、（ｉ）β２−ミクログロブリン、及び（ｉｉ）１％未満の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２及びα３、又は（ｉ）Ｔ細胞応答誘発性ペプチド、（ｉｉ）β２−ミクログロブリン、及び（ｉｉｉ）１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３を含み、抗原結合部位は、がん細胞表面抗原に結合する、多機能タンパク質が報告される。【選択図】図１

Description

本明細書において、抗体断片及びＭＨＣクラスＩ成分を含む多機能タンパク質及び循環性ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞の標的引力によるがん細胞の除去におけるその使用が報告される。
メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）は、メラノーマがんの大部分において発現される大きな膜貫通型プロテオグリカンである。ＭＣＳＰはまた、神経膠芽細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、ＡＬＬ及びＡＭＬの幾つかの型を含む他のがんで、並びに基底細胞癌で発現される。ここれは、初期の細胞表面メラノーマの進行のマーカーとして機能し、そして腫瘍細胞の増殖、転移、遊走、浸潤、及び血管新生の刺激に関与している。（例えば、Staub, E., et al., FEBS Lett. 527 (2002) 114-118; Campoli, M., et al., Crit. Rev. Immun. 24 (2004) 267-296; Vergilis, I. J., J. Invest. Dermatol. 125 (2005) 526-531; Yang, J., J. Chem. Biol. 165 (2004) 881-891; Luo, W., J. Immunol. 176 (2006) 6046-6054を参照）。
ＭＨＣクラスＩタンパク質は、α鎖（α−１から３及び膜貫通ドメイン）及びβ２−マイクログロブリンからなる。それは多遺伝子性（一倍体ゲノムにおけるＭＨＣクラスＩタンパク質で３つの遺伝子座）で、６つの異なるＭＨＣクラスＩタンパク質のα鎖を生じる（ヒトでは２つのＨＬＡ−Ａ、２つのＨＬＡ−Ｂ、２つのＨＬＡ−Ｃ）。ＭＨＣはさらに多形性である。ヒトＨＬＡ−対立遺伝子Ａ＊０２０１は、コーカサス人口の約３０％から５０％で優勢である（例えば、Player, M.A., et al., J Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19 (1996) 357-363）。
ヒトサイトメガロウイルスのｈｕＣＭＶ（＝ヒトヘルペスウイルス５、ＨＨＶ−５）は、最大のヒトウイルスの一つである。そそのゲノムは約２３００００ｂｐの線形二重鎖ＤＮＡを含み、１６０タンパク質以上をコードする（Davison, A.J., et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 17-28を参照）。
ＣＭＶはヒトゲノムの崇高な寄生生物になるために進化しており、それは強力な免疫原であり、そして免疫系の全てのアームから強い免疫応答を引き起こす。このウイルスは、ヒト免疫系に知られている最も免疫優性な抗原の一つのように見え、前例のない大きさのＣＤ８＋−Ｔ細胞応答を刺激する。
ＣＭＶ「潜伏期」は、ウイルス転写パターンの変化よりもＣＭＶウイルスの慢性的な免疫抑制に依存する（例えば、Moss & Khan, Human Immunology 65 (2004) 456-464を参照）。
ＣＤ８＋−Ｔ細胞免疫応答は、全てのＣＭＶタンパク質に対して均等に向けられてはおらず、集束される。ＣＭＶタンパク質のｐｐ６５及びＩＥ−１が優勢な標的である（McLaughlin-Taylor, E., et al., J. Med. Virol. 43 (1994) 103-110; Moss & Khan, Human Immunology 65 (2004) 456-464を参照）。
ＣＭＶ特異的Ｔ細胞の頻度は非常に高く、個々のペプチドに対する頻度は全ＣＤ８＋−Ｔ細胞レパートリーのうち最大１％から２％の程度である（Moss & Khan, Human Immunology supra; Wills, M.R., et al., J. Virol. 70 (1996) 7569-7579）。
ＣＭＶ特異的ＣＤ８＋−Ｔ細胞応答は年齢とともに著しく増加し、個々のＨＬＡ−ペプチド四量体は全ＣＤ８＋−Ｔ細胞プールの１０％超でしばしば染まる（例えば、Khan, N., et al., J. Immunol. 169 (2002) 1984-1992を参照）。
健康な高齢ドナーにおける全ＣＤ８＋−Ｔ細胞応答は、ＣＤ８＋−Ｔ細胞レパートリーの約５０％を占めることができる。
膨大なＣＤ８＋−Ｔ細胞の増殖は、しばしばクローン的に非常にで限定され、ＣＭＶは、加齢に伴って末梢血において見られるクローン性ＣＤ８＋−Ｔ細胞の増殖の少なくとも３０％の原因であると推定されている。全ＣＤ８＋−Ｔ細胞数は、ＣＭＶ血清反応陰性コホートと比較して、６０歳以上のＣＭＶ血清反応陽性ドナーにおいて２倍高い（Looney, R.J., et al., Clin. Immunol. 90 (1999) 213-219）。
可溶性ＨＬＡとβ２−ミクログロブリンの融合は、Mottez, E., et al., Eur. J. Immunol. 21 (1991) 467-471; Godeau, F., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 24223-24229及びMage, M.G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (1992) 10658-10662によって報告されている。可溶性ＨＬＡ及びβ２−ミクログロブリンとのウイルス由来ペプチドの融合は、Mottez, E., et al., J. Exp. Med. 181 (1995) 493-502によって報告されている。免疫グロブリン重鎖の可溶性ＨＬＡと共発現されたβ２−ミクログロブリンとの融合は、Dal Porto, J., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6671-6675によって報告されている。Ｆａｂに化学的結合したストレプトアビジンとのビオチン化ペプチド可溶性ＨＬＡ及びβ２−ミクログロブリンの四量体多機能タンパク質は、Robert, B., et al., Eur. J. Immun. 30 (2000) 3165-3170によって記述されている。可溶性ＨＬＡ及びβ２−ミクログロブリンとのウイルス由来ペプチドの融合と化学的に結合したＦａｂは、Robert, B., et al., Cancer Immunity 1 (2001) 2によって報告されている。可溶性ＨＬＡ及びβ２−ミクログロブリンとのウイルス由来ペプチドのマウスモノクローナル抗体の重鎖への融合は、Greten, T.F., et al., J. Immunol. Methods 271 (2002) 125-135によって報告されている。ペプチド、インビトロでのリフォールディング及びペプチド負荷を伴わないｓｃＦｖ融合体の大腸菌発現は、Lev, A., et al., J. Immunol. 169 (2002) 2988-2996; Lev, A., Proc. Natl. Acad. Sci. 101 (2004) 9051-9056、及びNovak, H., et al., Int. J. Cancer 120 (2007) 329-336により報告されている。ペプチドを負荷され、ストレプトアビジン融合Ｆａｂ又はｓｃＦｖ抗体に結合したビオチン化可溶性ＭＨＣの使用は、Mous, R., et al., Leukemia 20 (2006) 1096-1102により報告される。
国際公開第２００５／０９９３６１号において、ＭＨＣクラスＩ−ペプチド抗体は修飾されたβ２−ミクログロブリンにコンジュゲートすると報告されている。国際公開第２００５／０９９３６１号に報告される典型的なコンジュゲートは、ＭＨＣ多機能タンパク質（ＨＬＡ）のアルファ鎖のインビトロのコンジュゲーションによるか又は同じ細胞において別々の遺伝子からの共発現により得られる。
米国特許出願公開第２００４／００９１４８８号において、特定のキャリア分子を有する主要組織適合性多機能タンパク質クラスＩ抗原の抗原性コンストラクトが報告されている。これらの報告された融合ポリペプチドは、ヒンジ領域を欠失している。
国際公開第０２／１０２２９９号において、がんの治療に特に有用な免疫欺騙（immune deception）のための方法及び薬学的組成物が報告されている。共有結合したペプチドを含むヒト単鎖クラスＩ ＭＨＣの抗体媒介性標的化が、腫瘍又はウイルス特異的細胞傷害性Ｔリンパ球による腫瘍細胞の効率的な殺傷を誘導することは、Oved, K., et al. (Immunotherapy 54 (2005) 867-879)によって報告されている。Robert, B., et al. (Cancer Immun. 1 (2001) 1-13)は、抗体断片にコンジュゲートした単量体ＭＨＣクラス１−ウイルスペプチドの表面標的化による、がん細胞に対する抗ウイルスＣＴＬの再指向を報告している。活性な抗ウイルスＴリンパ球応答は、抗腫瘍抗体×ＭＨＣ／ウイルスペプチドコンジュゲートにより腫瘍細胞に対して再指向することができる（Cresson, V., et al., Clin. Cancer Res. 12 (2006) 7422-7430）。Robert, B., et al. (Eur. J. Immunol. 30 (2000) 3165-3170) は、抗体がコンジュゲートしたＭＨＣクラスＩ四量体は、Ｔリンパ球による特異的溶解についての腫瘍細胞を標的とすることができることを報告している。特異的キャリア分子を含む主要組織適合性複合体クラスＩ抗原の抗原性構築物は、その製造及び使用が、米国特許出願公開第２００４／００９１４８８号に報告されている。Bluemel, C., et al. (Cancer Immunol. 59 (2010) 1197-1209) は、標的細胞膜までのエピトープ距離と抗原の大きさが、大きなメラノーマ表面抗原に特異的なのＢｉＴＥ抗体によるＴ細胞媒介溶解の効力を決定することを報告している。患者由来のＴ細胞に係合するＭＣＳＰ／ＣＤ３−二重特異性ＢｉＴＥ抗体によるヒトメラノーマ細胞の再指向性溶解が、Torisu-Itakura, H., et al. (J. Immunother. 34 (2011) 597-605)によって報告されている。Greten, T., et al. (J. Immunol. Meth. 271 (2002) 125-135) は、ペプチド−β２−ミクログロブリン−ＭＨＣ融合分子は、抗原特異的Ｔ細胞に結合し、多価のＭＨＣ−Ｉｇ複合体のために使用することができることを報告している。ＣＤ２０標的性ＨＬＡ／ＣＭＶ複合体を介するＢ−ＣＬＬに対するＣＭＶ特異的ＣＴＬの再指向は、Mous, R., et al. (Leukemia 20 (2006) 1096-1102)により報告されている。国際公開第２０１２／１７５５０８号において、複合体を含むＭＨＣクラスＩを用いた、循環性ウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞による標的細胞の除去が報告されている。
本明細書において、第一の部分として厳密に一の抗原提示ドメイン、第二の部分として一の抗体Ｆｃ領域、及び第三の部分として、抗体に由来し、標的抗原に特異的に結合する少なくとも一の抗原結合部位を含む多機能タンパク質が報告される。
本明細書に報告される多機能タンパク質を用いて、既存のウイルス特異的循環性細胞傷害性Ｔ細胞（Ｔメモリー細胞及び／又はＴエフェクター細胞）は、多機能タンパク質の抗体由来の部分が特異的に結合する標的抗原を発現する細胞に指向されることができる。その後、ＭＨＣクラスＩ複合体によりこれらの細胞をまとう（dressing）することにより、ＭＨＣクラスＩタンパク質の多機能タンパク質に連結したウイルス由来のペプチドにより急性ウイルス感染が模倣され、標的細胞の除去をもたらす細胞傷害性細胞が誘引される。
本明細書に報告される一態様は多機能タンパク質であり、
− 厳密に一の抗原提示ドメイン、
− 厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− 少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とし、
抗原提示ドメインは、ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）β２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉ）１％未満の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
又は
（ｉ）１％未満の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、並びに
（ｉｉ）β２−ミクログロブリン、
又は
（ｉ）Ｔ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）β２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、
又は
（ｉ）Ｔ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、並びに
（ｉｉｉ）β２−ミクログロブリン
の何れかを含み、
抗原結合部位は、がん細胞表面抗原に結合する。
一実施態様において、多機能タンパク質はグリコシル化されている。
一実施態様において、抗原提示ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、記載された成分を含む融合ポリペプチドである。一実施態様において、抗原提示ドメインは、完全な分子として組換え的に産生される。
一実施態様において、抗体Ｆｃ領域は、第一及び第二のジスルフィド結合したＦｃ領域ポリペプチドを含み、これにより抗原結合部位は第一のＦｃ領域ポリペプチドを含む。
一実施態様において、抗原結合部位は、ｉ）抗体重鎖と抗体軽鎖との（同族）対を含み、これにより個々の鎖は、野生型鎖又は（置換され、変異され、若しくはドメイン交換された）改変された鎖とすることができ、又はｉｉ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、ｓｃＦｖ抗体断片及び抗体Ｆｃ領域ポリペプチドを含むｓｃＦｖ融合ポリペプチドを含み、又はｉｉｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、ｓｃＦａｂ及び抗体Ｆｃ領域ポリペプチドを含むｓｃＦａｂ融合ポリペプチドを含む。
一実施態様において、抗体軽鎖はその同族重鎖とのみ対合する（即ち、抗体軽鎖は共通軽鎖ではない）。
一実施態様において、ｉ）抗原提示ドメインは、抗原結合部位の重鎖のＮ末端又は軽鎖のＮ末端に連結されており、又はｉｉ）抗原提示ドメインは、抗原結合部位の重鎖のＣ末端に、又は軽鎖のＣ末端に連結されており、又はｉｉｉ）抗原提示ドメインは、ｓｃＦｖ融合ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に連結されており、又はｉｖ）抗原提示ドメインは、ｓｃＦａｂ融合ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に連結されており、又はｉｖ）抗原提示ドメインは、第二のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に連結されている。
一実施態様において、がん細胞表面抗原は、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）である。
一実施態様において、多機能タンパク質は共有結合性の多機能タンパク質である。
一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発性ペプチドは、ウイルス由来のペプチドである。
一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発性ペプチドはＣＤ８＋−Ｔ細胞応答誘発性ペプチドである。
一実施態様において、ウイルスは、アデノウイルス、ヒトヘルペスウイルス１、ヒトヘルペスウイルス２、ヒトヘルペスウイルス４（エプスタイン・バーウイルス）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス１６型、ヒトパピローマウイルス１８型、ヒトパピローマウイルス３１型、ヒトパピローマウイルス３３型、ヒトパピローマウイルス３５型、ヒトパピローマウイルス３９型、ヒトパピローマウイルス４５型、ヒトパピローマウイルス５１型、ヒトパピローマウイルス５２型、ヒトパピローマウイルス５６型、ヒトパピローマウイルス５８型、ヒトパピローマウイルス５９型、ヒトパピローマウイルス６８型、ヒトパピローマウイルス７３型、ヒトパピローマウイルス８２型、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型、ヒトインフルエンザＡ型ウイルス、ヒトインフルエンザＢ型ウイルス、ワクシニアウイルス、デング熱ウイルスから選択される。
一実施態様において、ウイルス由来ペプチドは、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号０１）、ＶＴＥＨＤＴＬＬＹ（配列番号０２）、ＮＴＤＦＲＶＬＥＬ（配列番号０３）、ＣＶＥＴＭＣＮＥＹ（配列番号０４）、ＶＬＥＥＴＳＶＭＬ（配列番号０５）、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号０６）、ＲＩＦＡＥＬＥＧＶ（配列番号０７）、ＩＩＹＴＲＮＨＥＶ（配列番号０８）、ＶＬＡＥＬＶＫＱＩ（配列番号０９）、ＡＶＧＧＡＶＡＳＶ（配列番号１０）、ＴＶＲＳＨＣＶＳＫ（配列番号１１）、ＩＭＲＥＦＮＳＹＫ（配列番号１２）、ＧＰＩＳＨＧＨＶＬＫ（配列番号１３）、ＡＴＶＱＧＱＮＬＫ（配列番号１４）、ＶＹＡＬＰＬＫＭＬ（配列番号１５）、ＡＹＡＱＫＩＦＫＩＬ（配列番号１６）、ＱＹＤＰＶＡＡＬＦ（配列番号１７）、ＹＶＫＶＹＬＥＳＦ（配列番号１８）、ＤＩＹＲＩＦＡＥＬ（配列番号１９）、ＶＦＥＴＳＧＧＬＶＶ（配列番号２０）、ＫＡＲＤＨＬＡＶＬ（配列番号２１）、ＱＡＲＬＴＶＳＧＬ（配列番号２２）、ＫＡＲＡＫＫＤＥＬ（配列番号２３）、ＱＩＫＶＲＶＤＭＶ（配列番号２４）、ＲＲＲＨＲＱＤＡＬ（配列番号２５）、ＡＲＶＹＥＩＫＣＲ（配列番号２６）、ＫＭＱＶＩＧＤＱＹ（配列番号２７）、ＮＶＲＲＳＷＥＥＬ（配列番号２８）、ＣＰＳＱＥＰＭＳＩＹＶＹ（配列番号２９）、ＫＰＧＫＩＳＨＩＭＬＤＶＡ（配列番号３０）、ＥＬＲＲＫＭＭＹＭ（配列番号３１）、ＩＰＳＩＮＶＨＨＹ（配列番号３２）、ＦＥＱＰＴＥＴＰＰ（配列番号３３）、ＹＡＹＩＹＴＴＹＬ（配列番号３４）、ＱＥＦＦＷＤＡＮＤＩＹ（配列番号３５）、ＹＥＱＨＫＩＴＳＹ（配列番号３６）、ＱＥＰＭＳＩＹＶＹ（配列番号３７）、ＳＥＨＰＴＦＴＳＱＹ（配列番号３８）、ＱＡＩＲＥＴＶＥＬ（配列番号３９）、ＴＲＡＴＫＭＱＶＩ（配列番号４０）、ＤＡＬＰＧＰＣＩ（配列番号４１）、ＣＥＤＶＰＳＧＫＬ（配列番号４２）、ＨＥＲＮＧＦＴＶＬ（配列番号４３）、ＰＴＦＴＳＱＹＲＩＱＧＫＬ（配列番号４４）、ＱＭＷＱＡＲＬＴＶ（配列番号４５）、ＨＥＬＬＶＬＶＫＫＡＱＬ（配列番号４６）、又はＤＤＹＳＮＴＨＳＴＲＹＶ（配列番号４７）、ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号４８）、ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号４９）、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号５０）、ＳＴＮＲＱＳＧＲＱ（配列番号５１）、ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ（配列番号５２）、ＦＡＥＧＦＶＲＡＬ（配列番号５３）、ＬＩＶＩＧＩＬＩＬ（配列番号５４）、又はＩＬＨＴＰＧＣＶ（配列番号５５）、ＷＹＡＱＩＱＰＨＷ（配列番号５６）、ＡＦＳＧＶＳＷＴＭ（配列番号５７）、ＩＬＩＧＶＶＩＴＷ（配列番号５８）、ＭＭＩＰＴＶＶＡＦ（配列番号５９）、ＰＦＰＱＳＮＡＰＩ（配列番号６０）、ＬＬＬＴＬＬＡＴＶ（配列番号６１）、ＩＶＬＥＨＧＳＣＶ（配列番号６２）、ＬＬＦＫＴＥＮＧＶ（配列番号６３）、ＰＬＮＥＡＩＭＡＶ（配列番号６４）、ＮＬＶＲＬＱＳＧＶ（配列番号６５）、ＬＶＩＳＧＬＦＰＶ（配列番号６６）、ＬＬＬＶＡＨＹＡＩ（配列番号６７）、ＬＡＬＬＡＡＦＫＶ（配列番号６８）、ＶＩＬＡＧＰＭＰＶ（配列番号６９）、ＨＶＬＧＲＬＩＴＶ（配列番号７０）、又は１から３アミノ酸の交換、付加、及び／又は欠失を含む．それらの変異体から選択される。
一実施態様において、ウイルス由来ペプチドは、ヒトサイトメガロウイルス由来のペプチドである。一実施態様において、ウイルス由来ペプチドは、配列番号０１から配列番号４７の群から選択されるアミノ酸配列を有する。一実施態様において、ウイルス由来ペプチドは、配列番号０１のアミノ酸配列を有する。
一実施態様において、１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子は、１０％以上の相対頻度を有する。
一実施態様において、１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、又はＨＬＡ−Ａ＊１１０１、又はＨＬＡ−Ａ＊２４０２、又はＨＬＡ−Ａ＊３４０１０１、又はＨＬＡ−Ｃ＊０３０４、又はＨＬＡ−Ｃ＊０４０１、又はＨＬＡ−Ｃ＊０７０２である。
一実施態様において、１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子は、多機能タンパク質が以下：
− ヨーロッパ起源の個体において、クラスＩのＭＨＣ分子は、ＨＬＡ−Ａ＊０１０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３０１、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２、ＨＬＡ−Ｂ＊０８０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０４０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０５０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０７０１、及びＨＬＡ−Ｃ＊０７０２を含む群から選択され、
− オーストラリア起源の個体において、クラスＩのＭＨＣ分子は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊３４０１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊１３０１、ＨＬＡ−Ｂ＊１５２１、ＨＬＡ−Ｂ＊５６０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５６０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０１０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０４０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０４０３、及びＨＬＡ−Ｃ＊１５０２を含む群から選択され、
− 北アメリカ起源の個体において、クラスＩのＭＨＣ分子は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０２０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０３０４、ＨＬＡ−Ｃ＊０４０１、及びＨＬＡ−Ｃ＊０７０２を含む群から選択され、及び
− 東南アジア起源の個体において、クラスＩのＭＨＣ分子は、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ｂ＊１５０４、ＨＬＡ−Ｃ＊０１０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０３０４、ＨＬＡ−Ｃ＊０７０２、及びＨＬＡ−Ｃ＊０８０１を含む群から選択される
のように投与される個体の地域に依存して選択される。
一実施態様において、１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子は、多機能タンパク質が以下：
− ヨーロッパ起源の個体において、クラスＩのＭＨＣ分子はＨＬＡ−Ａ＊０２０１であり、
− オーストラリア起源の個体において、クラスＩのＭＨＣ分子は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ｂ＊１３０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０１０２、及びＨＬＡ−Ｃ＊０４０１を含む群から選択され、
− 北アメリカ起源の個体において、クラスＩのＭＨＣ分子は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、及びＨＬＡ−Ｃ＊０３０４を含む群から選択され、そして
− 東南アジア起源の個体において、クラスＩのＭＨＣ分子はＨＬＡ−Ａ＊２４０２である
のように投与される個体の地域に依存して選択される。
一実施態様において、ＮからＣ末端方向に、β２−ミクログロブリン及び１％未満の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２及びα３を含む抗原提示ドメインは、そのＮ末端に、ＭＨＣペプチド結合の溝に結合するペプチドを更に含む。
一実施態様において、１％未満の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子は、ＨＬＡ−Ｂ＊４２０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５９０１、ＨＬＡ−Ｂ＊６７０１、及びＨＬＡ−Ｂ＊７８０２を含む群から選択される。
一実施態様において、抗原提示ドメインは、
（ｉ）ウイルス由来ペプチド、
（ｉｉ）β２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）可溶性ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子Ａ＊０２０１
を含む／からなる。
一実施態様において、β２−ミクログロブリンはヒトβ２−ミクログロブリンである。
一実施態様において、β２−ミクログロブリンは野生型ヒトβ２−ミクログロブリンである。
一実施態様において、β２−ミクログロブリンは配列番号７１のアミノ酸配列からなるか、又は１から１０のアミノ酸の交換、付加、及び／又は欠失を含むその機能性変異体である。
一実施態様において、β２−ミクログロブリンはヒトβ２−ミクログロブリンであり、１０％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子はヒトＨＬＡ−Ａ＊０２０１である。
一実施態様において、クラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメイン（α１、α２、及びα３）は、配列番号７２のアミノ酸配列からなるか又は１から１０のアミノ酸の交換、付加、及び／又は欠失を含むその機能性変異体である。
一実施態様において、抗原提示ドメインは、Ｎ末端からＣ末端の方向で、β２−ミクログロブリン、及び１％未満の出現の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２及びα３を含む。
一実施態様において、ウイルス由来ペプチドは第一リンカーペプチドを介してβ２−ミクログロブリンへ融合される。
一実施態様において、ウイルス由来ペプチドはβ２−ミクログロブリンのＮ末端へ融合される。
一実施態様において、β２−ミクログロブリンは第二リンカーペプチドを介してクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１へ融合される。
一実施態様において、クラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα３は第三のリンカーペプチドを介してジスルフィド結合ポリペプチドの一へ融合される。
一実施態様において、第一、第二、及び第三のリンカーペプチドは同一であるか又は異なる。
一実施態様において、第一リンカーペプチド、第二リンカーペプチド、及び第三リンカーペプチドはアミノ酸配列ＧＳ（配列番号７３）、ＧＧＳ（配列番号７４）、ＧＳＧ（配列番号１３６）、ＧＧＧＳ（配列番号７５）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７６）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７７）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７８）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７９）、ＧＧＧＧＳ（配列番号８０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８３）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）からお互いに独立して選択される。
全ての態様のうちの一実施態様において、第一リンカーペプチドは配列番号８２のアミノ酸配列を含む。
全ての態様のうちの一実施態様において、第二リンカーペプチドは配列番号８３のアミノ酸配列を含む。
全ての態様のうちの一実施態様において、第三リンカーペプチドは配列番号７３のアミノ酸配列を含む。
一実施態様において、抗原提示ドメインは、ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１から配列番号７０を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するウイルス由来ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７７、７８、７９、８２、８３、及び８４を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第一リンカーペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を有するβ２−ミクログロブリン、
（ｉｖ）配列番号７７、７８、７９、８、８３、及び８４を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第二リンカーペプチド、
（ｖ）配列番号７２のアミノ酸配列を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、及び
（ｖｉ）配列番号７３、７７、７８、７９、８２、８３、８４、及び１３６を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第三リンカーペプチド
を含む。
一実施態様において、
− 第一リンカーペプチドは配列番号８２のアミノ酸配列を有し、及び／又は
− 第二リンカーペプチドは配列番号８３のアミノ酸配列を有し、及び／又は
− 第三リンカーペプチドは配列番号１３６のアミノ酸配列を有する。
一実施態様において、多機能タンパク質は、抗原提示ドメインがＮからＣ末端の方向に
（ｉ）配列番号０１から配列番号７０を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するウイルス由来ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７７、７８、７９、８２、８３、及び８４を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第一リンカーペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を有する又は１から１０のアミノ酸の交換、付加、及び／又は欠失を含むその機能性変異体であるβ２−ミクログロブリン、
（ｉｖ）配列番号７７、７８、７９、８２、８３、及び８４を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第二リンカーペプチド、
（ｖ）配列番号７２のアミノ酸配列を有する又は１から１０のアミノ酸の交換、付加、及び／又は欠失を含むその機能性変異体であるクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、及び
（ｖｉ）配列番号７３、７７、７８、７９、８２、８３、８４、及び１３６を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第三リンカーペプチド
を含むことを特徴とする。
一実施態様において、抗体Ｆｃ領域は、クラスＩｇＧ又はクラスＩｇＥのヒト抗体の抗体Ｆｃ領域から選択される。
一実施態様において、抗体Ｆｃ領域は、サブクラスＩｇＧ１、又はＩｇＧ２、又はＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のヒト抗体の抗体Ｆｃ領域から選択される。
一実施態様において、抗体Ｆｃ領域は、サブクラスＩｇＧ１又はＩｇＧ２のヒト抗体のものであり、そしてＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ａ３３０、及び／又はＰ３３１において少なくとも一の変異を含む（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）。
一実施態様において、抗体Ｆｃ領域は、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、及び／又は変異Ｄ２６５Ａ及びＮ２９７Ａを有するサブクラスＩｇＧ２又はサブクラスＩｇＧ１のヒト抗体のものであり、及び／又はＰＶＡ２３６変異を含み、及び／又は変異Ｐ３２９Ｇを含む。
一実施態様において、抗体Ｆｃ領域は、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ及び／又はＰ３２９Ｇを有するサブクラスＩｇＧ１のヒト抗体のものである。
一実施態様において、抗体Ｆｃ領域は、Ｓ２２８Ｐ及び／又はＬ２３５Ｅを有するサブクラスＩｇＧ４のヒト抗体のものである。
一実施態様において、第一及び第二抗体のＦｃ領域ポリペプチドは、配列番号８７から１０１を含む群からお互いに独立して選択される。
一実施態様において、抗体Ｆｃ領域は、配列番号９４のアミノ酸配列を含む２つのＦｃ領域ポリペプチドを含む。
一実施態様において、抗体Ｆｃ領域は、配列番号１００のアミノ酸配列を含む２つのＦｃ領域ポリペプチドを含む。
一実施態様において、抗体Ｆｃ領域は、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む２つのＦｃ領域ポリペプチドを含む。
一実施態様において、抗体Ｆｃ領域は、配列番号８９のアミノ酸配列を含む第一のＦｃ領域ポリペプチド、及び配列番号９０のアミノ酸配列を含む第二のＦｃ領域ポリペプチドを含む。
一実施態様において、抗体Ｆｃ領域は、配列番号９７のアミノ酸配列を含む第一のＦｃ領域ポリペプチド、及び配列番号９８のアミノ酸配列を含む第二のＦｃ領域ポリペプチドを含む。
一実施態様において、抗体Ｆｃ領域は、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む第一のＦｃ領域ポリペプチド、及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含む第二のＦｃ領域ポリペプチドを含む。
本明細書に報告される一態様は多機能タンパク質であり、
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）β２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉ）１％未満の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
又は
（ｉ）１％未満の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、並びに
（ｉｉ）β２−ミクログロブリン、
又は
（ｉ）Ｔ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）β２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、
又は
（ｉ）Ｔ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、並びに
（ｉｉｉ）β２−ミクログロブリン
の何れかを含む、厳密に一の抗原提示ドメイン、
− 厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する、少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とする。
本明細書に報告される一態様は多機能タンパク質であり、
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）Ｔ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）β２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− 厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する、少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とする。
本明細書に報告される一態様は多機能タンパク質であり、
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− 厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する、少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とする。
本明細書に報告される一態様は多機能タンパク質であり、
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９７のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９８のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する、少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とする。
本明細書に報告される一態様は多機能タンパク質であり、
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０３のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する、少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とする。
本明細書に報告される一態様は多機能タンパク質であり、
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９７のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９８のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− 配列番号１０４から１０６の群からのアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメイン、及び配列番号１０８から１１０の群からのアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメインを含み、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する、少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とする。
本明細書に報告される一態様は多機能タンパク質であり、
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０３のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合し、配列番号１０４から１０６の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖、及び配列番号１０８から１１０の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含む、少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とする。
本明細書に報告される一態様は多機能タンパク質であり、
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９７のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９８のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する二つの抗原結合部位であって、各々が配列番号１０５から１０７の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖、及び配列番号１１０から１１２の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含む、二つの抗原結合部位
を含むことを特徴とする。
本明細書に報告される一態様は多機能タンパク質であり、
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０３のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する、少なくとも一の抗原結合部位であって、配列番号１０５から１０７の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖、及び配列番号１１０から１１２の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、それによって抗体重鎖のＦｃ領域は、ジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドの一つとなる、少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とする。
本明細書に報告される一態様は多機能タンパク質であり、
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９７のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９８のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する、少なくとも一の抗原結合部位であって、配列番号１０４から１０６の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖、及び配列番号１０８から１１０の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、それによって抗体重鎖のＦｃ領域は、ジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドの一つとなる、少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とし、
抗原提示ドメインは、可変ドメインの一つのＮ末端に連結している。
本明細書に報告される一態様は多機能タンパク質であり、
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０３のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する二つの抗原結合部位であって、各々が配列番号１０４から１０６の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖、及び配列番号１０８から１１０の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、それによって抗体重鎖のＦｃ領域は、ジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドとなる、二つの抗原結合部位
を含むことを特徴とし、
抗原提示ドメインは、可変ドメインの一つのＮ末端に連結している。
本明細書に報告される一態様は多機能タンパク質であり、
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９７のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９８のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する二つの抗原結合部位であって、各々が配列番号１０５から１０７の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖、及び配列番号１１２から１１２の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、それによって抗体重鎖のＦｃ領域は、ジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドとなる、二つの抗原結合部位
を含むことを特徴とし、
抗原提示ドメインは、重鎖可変ドメインの一つのＮ末端に連結している。
本明細書に報告される一態様は多機能タンパク質であり、
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０３のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する二つの抗原結合部位であって、各々が配列番号１０５から１０７の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖、及び配列番号１１２から１１２の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、それによって抗体重鎖のＦｃ領域は、ジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドとなる、二つの抗原結合部位
を含むことを特徴とし、
抗原提示ドメインは、重鎖可変ドメインの一つのＮ末端に連結している。
本明細書に報告される一態様は多機能タンパク質であり、
− 配列番号１１７の一ポリペプチド鎖、
− 配列番号１１８の一ポリペプチド鎖、
− 各々配列番号１１９の２つのポリペプチド鎖、
を含むことを特徴とする。
本明細書に報告される一態様は多機能タンパク質であり、
− 配列番号１３７の一ポリペプチド鎖、
− 配列番号１１７の一ポリペプチド鎖、
− 各々配列番号１１９の２つのポリペプチド鎖
を含むことを特徴とする。
一実施態様において、ＭＣＳＰ結合部位は、配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗体重鎖可変ドメインを含む。
一実施態様において、ＭＣＳＰ結合部位は、配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗体軽鎖可変ドメインを含む。
一実施態様において、ＭＣＳＰ結合部位は、配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン；及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗体軽鎖可変ドメインを含む。
一実施態様において、ＭＣＳＰ結合部位は、配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗体重鎖可変ドメインを含む。
一実施態様において、ＭＣＳＰ結合部位は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗体軽鎖可変ドメインを含む。
一実施態様において、ＭＣＳＰ結合部位は、配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン；及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗体軽鎖可変ドメインを含む。
一実施態様において、ＭＣＳＰ結合部位は、配列番号１１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン；及び配列番号１１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有する抗体軽鎖可変ドメインを含む。
一実施態様において、ＭＣＳＰ結合部位は、配列番号１１４の抗体重鎖可変ドメイン及び配列番号１１３の抗体軽鎖可変ドメインを含む。
一実施態様において、ＭＣＳＰ結合部位は、配列番号１１４及び配列番号１１３を含む。
一実施態様において、ＭＣＳＰ結合部位は、配列番号１１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン；及び配列番号１１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有する抗体軽鎖可変ドメインを含む。
一実施態様において、ＭＣＳＰ結合部位は、配列番号１１６の抗体重鎖可変ドメイン；及び配列番号１１５の抗体軽鎖可変ドメインを含む。
一実施態様において、ＭＣＳＰ結合部位は、配列番号１１６及び配列番号１１５を含む。
一態様において、本発明は、単離された抗体の結合特異性を含む多機能タンパク質、即ちＨＶＲ又は可変ドメインを提供する。特に、抗ＭＣＳＰ抗体結合特異性、即ち、本明細書において提供される多機能タンパク質に含まれる、ＨＶＲ又は可変ドメインは、ヒトＭＣＳＰの膜近傍エピトープに結合する。Staub, E., et al. (FEBS Lett. 527 (2002) 114-118)に議論されるように、ＭＣＳＰの膜近傍領域は、ＣＳＰＧリピートドメインとも呼ばれる複数の新規な繰り返しドメインから構成されている。
本明細書に報告される一態様は、本明細書に報告される多機能タンパク質をコードする核酸である。
一実施態様において、核酸は、異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする構造遺伝子を含む二から四の発現カセットを含む。
本明細書に報告される一態様は、本明細書に報告される核酸を含む宿主細胞である。
本明細書に報告される一態様は、多機能タンパク質が産生されるように本明細書に報告される宿主細胞を培養することを含む、本明細書に報告される多機能タンパク質を産生する方法である。
一実施態様において、多機能タンパク質は細胞又は培養培地から回収され、それにより多機能タンパク質が産生される。
本明細書に報告される一態様は、本明細書に報告される多機能タンパク質、及び任意で薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤である。
一実施態様において、薬学的製剤は追加の治療薬を更に含む。
本明細書に報告される一態様は、医薬として使用のための本明細書に報告される多機能タンパク質である。
本明細書に報告される一態様は、がんの治療における使用のための本明細書に報告される多機能タンパク質である。
本明細書に報告される一態様は、個体のウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞を標的に誘引することにおける使用のための本明細書に報告される多機能タンパク質である。
本明細書に報告される一態様は、がん細胞除去において使用のための本明細書に報告される多機能タンパク質である。
本明細書に報告される一態様は、医薬の製造における本明細書に報告される多機能タンパク質の使用である。
一実施態様において、本医薬はがんの治療のためである。
一実施態様において、本医薬は個体のウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞を標的に誘引するためである。
一実施態様において、本医薬はがん細胞除去のためである。
本明細書に報告される一態様は、本明細書に報告される多機能タンパク質の有効量を個体に投与することを含む、がんに罹患している個体を治療する方法である。
一実施態様において、本方法は個体に追加の治療薬を投与することを更に含む。
本明細書に報告される一態様は、個体のウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞を標的に誘引するために、本明細書に報告される多機能タンパク質の有効量を個体に投与することを含む、個体のウイルス特異的細胞障害性Ｔ細胞を個体における標的に誘引する方法である。
本明細書に報告される一態様は、がん細胞を除去／分解するために、本明細書に報告されるように多機能タンパク質の有効量を個体に投与することを含む、個体においてがん細胞を除去する方法である。
本明細書に報告される一態様は、真核細胞において、ｉ）多機能タンパク質をコードする一以上の核酸を含む真核細胞を培養し、及びｉｉ）細胞又は培養培地から多機能タンパク質を回収する工程を含む、ｉ）β２−ミクログロブリンとクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインα１、α２、及びα３の融合ポリペプチド、ｉｉ）抗体のヒンジ領域を各々含むジスルフィド結合ポリペプチドの対、及びｉｉｉ）抗体軽鎖可変ドメイン及び抗体重鎖可変ドメインの少なくとも一対を含んでなる多機能タンパク質の組換え生産の方法であり、該多機能タンパク質は、β２−ミクログロブリン及びクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３の厳密に一の融合ポリペプチドを含むことを特徴とする。
一実施態様において、多機能タンパク質は厳密に一のＭＨＣ由来ポリペプチド又はＭＨＣ由来分子を含む厳密に一の融合ポリペプチドを含んでなる。
一実施態様において、多機能タンパク質は培養培地中で１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で得られる。一実施態様において、多機能タンパク質は培養培地中で４ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で得られる。
一実施態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。一実施態様において、哺乳動物細胞は、ヒト胚性腎細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣細胞、又はベビーハムスター腎臓細胞、又はマウスの骨髄腫細胞である。
以下の実施態様は、本明細書で報告される態様の何れかと組み合わせることができる。また、本明細書で報告される任意の実施態様は、本明細書で報告される任意の他の実施態様と、又は実施態様の組合せと組み合わせることができる。
発明の詳細な説明
本明細書に報告される例示的な多機能タンパク質の注釈付きの図解。 本明細書に報告される多機能タンパク質に含まれる典型的なポリペプチド：融合ポリペプチドは、ポリペプチドを含む抗体軽鎖又は抗体重鎖のヒンジ領域の何れかに対してＮ末端が融合していた。 対応する発現プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清のＳＤＳポリアクリルアミドゲルのウエスタンブロット。染色は、ペルオキシダーゼ結合ポリクローナルウサギ抗ヒトκ軽鎖抗体及び西洋ワサビペルオキシダーゼにコンジュゲートしたポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体を用いて実施した。レーン：１：二腕のペプチド−β２−ミクログロブリン−ＨＬＡ−Ａ０２０１−ＩｇＧ−Ｆｃ；２：一腕のペプチド−β２−ミクログロブリン−ＨＬＡ−Ａ０２０１−ＩｇＧ−Ｆｃ＋ＩｇＧ−Ｆｃ；３：一腕のペプチド−β２−ミクログロブリン−ＨＬＡ−Ａ０２０１−ＩｇＧ−重鎖＋ＩｇＧ−軽鎖＋ＩｇＧ−Ｆｃ；４：一腕のペプチド−β２−ミクログロブリン−ＨＬＡ−Ａ０２０１−ＩｇＧ−重鎖＋ＩｇＧ−重鎖＋ＩｇＧ−軽鎖；５：二腕のβ２−ミクログロブリン−ＨＬＡ−Ａ０２０１−ＩｇＧ−軽鎖＋ＩｇＧ−重鎖；６：二腕のペプチド−β２−ミクログロブリン−ＨＬＡ−Ａ０２０１−ＩｇＧ−軽鎖＋ＩｇＧ−重鎖；７：二腕のペプチド−β２−ミクログロブリン−ＨＬＡ−Ａ０２０１−ＩｇＧ−重鎖＋ＩｇＧ−軽鎖；８：二腕のペプチド−β２−ミクログロブリン−ＨＬＡ−Ａ０２０１−ＩｇＧ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ；９：一腕のペプチド−β２−ミクログロブリン−ＨＬＡ−Ａ０２０１−ＩｇＧ−Ｆｃ＋一腕のＩｇＧ（重及び軽鎖）；１０：分子量マーカー；１１：参照の標準ＩｇＧ１抗体。 特異的ペプチドを用いたインビトロの刺激の前後で異なるドナー由来のＣＭＶ特異的細胞溶解性Ｔ細胞の数を決定するためのフローサイトメトリー分析：４人のヒトドナー由来末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の分析；Ｐｒｏ５ペンタマーＡＰＣ（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ、カタログ番号Ｆ００８−４Ａ−Ｅ）と組み合わされたＦＩＴＣ標識染色にコンジュゲートした抗ＣＤ８抗体（ＢＤ，カタログ番号３４５７７２）は、ＣＭＶ由来ペプチド（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ、配列番号０１）を負荷された、ＴＣＲを認識するＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１）を染色した；丸：ＣＭＶ−特異的ＣＤ８＋−Ｔ細胞；Ａ：ドナー１；Ｂ：ドナー３。 Ａ：クーマシー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル：レーン１：分子量の標準、レーン２：一腕のペプチド−β２−ミクログロブリン−ＨＬＡ−Ａ０２０１−ＩｇＧ−Ｆｃ＋一腕のＩｇＧ（重及び軽鎖）、非還元条件；レーン３：一腕のペプチド−β２−ミクログロブリン−ＨＬＡ−Ａ０２０１−ＩｇＧ−Ｆｃ＋一腕のＩｇＧ多機能タンパク質（重及び軽鎖）、還元条件Ｂ：サイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラム；１：高分子量型（０．７面積％）；２：単量体多機能タンパク質（９９．３面積％）。Ｃ：模式的分子。 Ａ：ａ）プロテインＡ ＨＰＬＣ及びＳＥＣ後のクーマシー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル：非還元条件；レーン１：分子量の標準、レーン２：ペプチド−β２−ミクログロブリン−ＨＬＡ−Ａ０２０１−ＨＣ＋ＬＣ＋ＩｇＧ−Ｆｃ、レーン３：ペプチド−β２−ミクログロブリン−ＨＬＡ−Ａ０２０１−ＨＣ＋ＬＣ＋一腕のＩｇＧ（重及び軽鎖）。ｂ）：プロテインＡ ＨＰＬＣ及びＳＥＣ後のクーマシー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル：還元条件；レーン１：分子量の標準、レーン２：ペプチド−β２−ミクログロブリンＨＬＡ−Ａ０２０１−ＨＣ＋ＬＣ＋ＩｇＧ−Ｆｃ、レーン３：ペプチド−β２−ミクログロブリン−ＨＬＡ−Ａ０２０１−ＨＣ＋ＬＣ＋一腕のＩｇＧ（重及び軽鎖）。Ｂ：ａ）ペプチド−β２−ミクログロブリン−ＨＬＡ−Ａ０２０１−ＨＣ＋ＬＣ＋ＩｇＧ−Ｆｃのサイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラム；１：高分子量型（１．９面積％）；２：単量体多機能タンパク質（９８．１面積％）。ｂ）ペプチド−β２−ミクログロブリン−ＨＬＡ−Ａ０２０１−ＨＣ＋ＬＣ＋一腕のＩｇＧ（重及び軽鎖）のサイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラム；１：高分子量型（２．１面積％）；２：単量体多機能タンパク質（９７．９面積％）。Ｃ：模式的分子 ２：ペプチド−β２−ミクログロブリ−ＨＬＡ−Ａ０２０１−ＨＣ＋ＬＣ＋ＩｇＧ−Ｆｃ、３：ペプチド−β２−ミクログロブリン−ＨＬＡ−Ａ０２０１−ＨＣ＋ＬＣ＋一腕のＩｇＧ。 ＭＣＳＰ＋標的細胞（Ｃｏｌｏ３８）における異なるＭＨＣ−Ｉ−多機能タンパク質の結合：Ｃｏｌｏ３８細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＰＡＡ、カタログ＃Ｌ１１−００７）と共に５分間インキュベートされ、単一細胞懸濁液を得た。バイアルあたり２×１０５細胞が、４℃で、４５分間、１００μｌのＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で１μｇ／ｍｌのＭＨＣ−Ｉ−多機能タンパク質と共にインキュベートされた。インキュベーション後に、細胞は１ｍｌの冷却ＰＢＳ／２％ＦＣＳで洗浄され、９１０ｒｐｍで７分間遠心分離された。細胞は二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ１抗体ＰＥコンジュゲート、Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ＃１０９−１１６−０８８）（２μｇ／ｍｌ）と共に１００μｌのＰＢＳ／２％ＦＣＳ中に再懸濁され、更に４℃で４５分間インキュベートされた。細胞は１ｍｌのＰＢＳ％２％ＦＣＳで２回洗浄され、ＢＤカントＩＩフローサイトメーターを用いて測定された。 細胞毒性アッセイ：本明細書で報告されるように、抗原結合多機能タンパク質は、ヒトＣＭＶ特異的Ｔ細胞を通じてＨ４６０Ｍ２腫瘍細胞の溶解を動作させる。ａ）（６時間）標的細胞：ＣＭＶ−特異的エフェクターＴ細胞 １：１．５；ｂ）（６時間）標的細胞：ＣＭＶ−特異的エフェクターＴ細胞１：０．７５；ｃ）（６時間）標的細胞：ＣＭＶ−特異的エフェクターＴ細胞 １：０．５；左の棒：本明細書で報告される多機能タンパク質；右の棒 ＭＡＢ ＩＧＦ−１Ｒ−アフコシル化型。 細胞毒性アッセイ：本明細書で報告されるように、抗原結合多機能タンパク質は、ヒトＣＭＶ特異的Ｔ細胞を通じてＩ２４ ３Ｔ３腫瘍細胞の溶解を動作させる。ａ）（９時間）標的細胞：ＣＭＶ−特異的エフェクターＴ細胞 １：１．５；ｂ）（９時間）標的細胞：ＣＭＶ−特異的エフェクターＴ細胞 １：０．７５；ｃ）（９時間）標的細胞：ＣＭＶ−特異的エフェクターＴ細胞 １：０．５；左の棒：本明細書で報告される多機能タンパク質；中央の棒：ＭＡＢ ＩＧＦ−１Ｒ−ａｆｕ；右の棒：ＭＡＢ ｅｄ；右の棒：抗ジゴキシゲニン抗体。 抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体及び本明細書に報告される多機能タンパク質の肺腺癌細胞株Ｈ４６０Ｍ２に対する結合のＦＡＣＳ分析；ａ）二次抗体のみ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，カタログ＃１０９−１１６−０８８））；ｂ）融合ポリペプチドが、可変ドメインのただ一つの対を含む抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の重鎖のＮ末端に融合されている本明細書に報告される多機能タンパク質；ｃ）抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体。 本明細書に報告される異なる多機能タンパク質のインビトロ有効性及び特異性（細胞毒性試験）；ａ）一価抗ＩＧＦ１Ｒ抗体及びＣＭＶ由来ペプチドを含む多機能タンパク質；ｂ）一価の抗ＩＧＦ１Ｒ抗体及びＥＢＶ由来ペプチド（対照）を含む多機能タンパク質；ｃ）二価の抗ＩＧＦ１Ｒ抗体及びＣＭＶ由来ペプチドを含む多機能タンパク質；ｄ）抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（対照）；ｅ）抗ジゴキシゲニン抗体（対照）。 融合ポリペプチドは、標的（Ｔ）対エフェクター（Ｅ）細胞の異なる比率で特定された完全な抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体の重鎖のＮ末端に融合されていることを特徴とする、本明細書に報告されるような多機能タンパク質のインビトロ有効性及び特異性（ＥＣ５０の値）。 ａ）一価の抗ＩＧＦ１Ｒ抗体とＣＭＶ由来ペプチドを含む融合ポリペプチドを含む多機能タンパク質及びｂ）抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体とともに、標的対エフェクター細胞の比率を１：１．５で、６時間インキュベートした後の標的細胞の溶解。 ＭＨＣ−Ｉ抗ＭＣＳＰ多機能タンパク質とインキュベートしたＣｏｌｏ３８細胞についての正規化された細胞指数の経過；１μｇ／ｍｌの多機能タンパク質の濃度（ＭＨＣＩ−０００８（１）、ＭＨＣＩ−００１０（２）、ＭＨＣＩ−００３０（３）、ＭＨＣＩ−００３１（４））、エフェクター対標的細胞の比は１０：１；ドナー３由来のＰＢＭＣ（２０００００細胞、ドナー３はＣＭＶ陽性であるがＥＢＶ陰性である）及びメラノーマ腫瘍細胞株Ｃｏｌｏ３８（２００００細胞）、９６ウェルあたり，データはｔｒｉｐｌｉｃａｔｅである。 Ａ：ＭＨＣ−Ｉ抗ＭＣＳＰ多機能タンパク質とインキュベートしたＣｏｌｏ３８細胞についての正規化された細胞指数の経過；１μｇ／ｍｌの多機能タンパク質の濃度（ＭＨＣＩ−０００８（１）、ＭＨＣＩ−００１０（２）、ＰＢＭＣのみ（３）、ＭＨＣＩ−００３１（３））、エフェクター対標的細胞の比は１０：１；ドナー３由来のＰＢＭＣ（２０００００細胞、ドナー３はＣＭＶ陽性であるがＥＢＶ陰性である）及びメラノーマ腫瘍細胞株Ｃｏｌｏ３８（２００００細胞）、９６ウェルあたり，データはｔｒｉｐｌｉｃａｔｅである。Ｂ：ＭＨＣ−Ｉ抗ＭＣＳＰ多機能タンパク質とインキュベートしたＷＭ２６６細胞についての正規化された細胞指数の経過；１μｇ／ｍｌの多機能タンパク質の濃度（ＭＨＣＩ−０００８（１）、ＭＨＣＩ−００１０（２）、ＭＨＣＩ−００３０（３）、ＭＨＣＩ−００３１（４）、標的細胞のみ（５）、標的細胞＋Ｔ細胞（６））、エフェクター対標的細胞の比は１０：１；ドナー３由来のＰＢＭＣ（２０００００細胞、ドナー３はＣＭＶ陽性であるがＥＢＶ陰性である）及びメラノーマ腫瘍細胞株ＷＭ２６６（２００００細胞）、９６ウェルあたり，データはｔｒｉｐｌｉｃａｔｅである。 多機能タンパク質ＭＨＣＩ−０００８（一価、ＣＭＶペプチド負荷型、１）、ＭＨＣＩ−００１０（一価、ＥＢＶペプチド負荷型対照、２）、ＭＨＣ−００２６（二価、ＣＭＶペプチド負荷型、非結合対照、３）、ＭＨＣＩ−００３０（一価、ＣＭＶペプチド負荷型、活性、４）及びＭＨＣＩ−００３１（二価、ＣＭＶペプチド負荷型、活性、５）によって、無刺激のＰＢＭＣの存在下での多機能タンパク質とのインキュベーションの４２時間後の標的細胞の溶解。 多機能タンパク質ＭＨＣＩ−０００８（一価、ＣＭＶペプチド負荷型、１）、ＭＨＣＩ−００１０（一価、ＥＢＶペプチド負荷型対照、２）、ＭＨＣ−００２６（二価、ＣＭＶペプチド負荷型、非結合対照、３）、ＭＨＣＩ−００３０（一価、ＣＭＶペプチド負荷型、活性、４）及びＭＨＣＩ−００３１（二価、ＣＭＶペプチド負荷型、活性、５）によって、無刺激のＰＢＭＣの存在下での多機能タンパク質とのインキュベーションの４８時間後のＬＤＨの放出。 Ａ：１μｇ／ｍｌの濃度での多機能タンパク質ＭＨＣＩ−０００８（一価、ＣＭＶペプチド負荷型、１）、ＭＨＣＩ−００１０（一価、ＥＢＶペプチド負荷型対照、２）、ＭＨＣ−００２６（二価、ＣＭＶペプチド負荷型、非結合対照、３）、ＭＨＣＩ−００３０（一価、ＣＭＶペプチド負荷型、活性、４）及びＭＨＣＩ−００３１（二価、ＣＭＶペプチド負荷型、活性、５）によって、刺激されたＰＢＭＣの存在下での多機能タンパク質とのインキュベーションの１０時間後のＣｏｌｏ３８細胞の溶解。Ｂ：１μｇ／ｍｌの濃度での多機能タンパク質ＭＨＣＩ−０００８（一価、ＣＭＶペプチド負荷型、１）、ＭＨＣＩ−００１０（一価、ＥＢＶペプチド負荷型対照、２）、ＭＨＣ−００２６（二価、ＣＭＶペプチド負荷型、非結合対照、３）、ＭＨＣＩ−００３０（一価、ＣＭＶペプチド負荷型、活性、４）及びＭＨＣＩ−００３１（二価、ＣＭＶペプチド負荷型、活性、５）によって、刺激されたＰＢＭＣの存在下での多機能タンパク質とのインキュベーションの１０時間後のＷＭ２６６細胞の溶解。 非ジスルフィド安定化多機能タンパク質（Ａ）及びジスルフィド安定化多機能タンパク質（Ｂ）の、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー後で分取サイズ排除クロマトグラフィーの前の分析用サイズ排除クロマトグラム。 １μｇ／ｍｌの濃度での、多機能タンパク質ＭＨＣＩ−００３１（二価、ＣＭＶペプチド負荷型、活性、非ジスルフィド結合型、１）及びＭＨＣＩ−００５４（二価、ＣＭＶペプチド負荷型、活性、ＭＨＣＩ−００３１のジスルフィド結合型バージョン、２）によって、刺激されたＰＢＭＣの存在下でのＣｏｌｏ３８細胞の溶解。
配列の簡単な説明
配列番号０１から４７ ヒトサイトメガロウイルス由来ペプチド。
配列番号４８ ヒト免疫不全ウイルス由来ペプチド。
配列番号４９ ヒトヘルペスウイルス４由来ペプチド。
配列番号５０ インフルエンザＡウイルス由来ペプチド。
配列番号５１ Ｂ型肝炎ウイルス由来ペプチド。
配列番号５２ ヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルス１型由来ペプチド。
配列番号５３ Ｖ−ｊｕｎ肉腫ウイルス１７がん遺伝子ホモログ１７（ＪＵＮ）由来ペプチド。
配列番号５４ ヒトアデノウイルスタイプ３由来ペプチド。
配列番号５５ Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド。
配列番号５６から７０ デング熱ウイルス由来ペプチド。
配列番号７１ ヒトβ２−ミクログロブリンのアミノ酸配列。
配列番号７２ ヒトＨＬＡ−Ａ＊０２０１ α１−α３鎖のアミノ酸配列。
配列番号７３−８４ リンカーペプチドのアミノ酸配列。
配列番号８５ ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列。
配列番号８６ ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列。
配列番号８７ ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のアミノ酸配列。
配列番号８８ ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体アミノ酸配列。
配列番号８９ ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異体アミノ酸配列。
配列番号９０ ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＴ３６６Ｗ変異体アミノ酸配列。
配列番号９１ ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異体アミノ酸配列。
配列番号９２ ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｔ３６６Ｗ変異体アミノ酸配列。
配列番号９３ ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＰ３２９Ｇ変異体アミノ酸配列。
配列番号９４ ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ変異体アミノ酸配列。
配列番号９５ ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＰ３２９Ｇ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異体アミノ酸配列。
配列番号９６ ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＰ３２９Ｇ、Ｔ３６６Ｗ変異体アミノ酸配列。
配列番号９７ ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異体アミノ酸配列。
配列番号９８ ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｔ３６６Ｗ変異体アミノ酸配列。
配列番号９９ ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のアミノ酸配列。
配列番号１００ ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ変異体アミノ酸配列。
配列番号１０１ ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ変異体アミノ酸配列。
配列番号１０２ ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異体アミノ酸配列。
配列番号１０３ ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域のＳ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ、Ｔ３６６Ｗ変異体アミノ酸配列。
配列番号１０４ ＨＶＲ−Ｌ１
配列番号１０５ ＨＶＲ−Ｌ２
配列番号１０６ ＨＶＲ−Ｌ３
配列番号１０７ ＨＶＲ−Ｌ１
配列番号１０８ ＨＶＲ−Ｈ１
配列番号１０９ ＨＶＲ−Ｈ２
配列番号１１０ ＨＶＲ−Ｈ３
配列番号１１１ ＨＶＲ−Ｈ１
配列番号１１２ ＨＶＲ−Ｈ２
配列番号１１３ ＶＬ
配列番号１１４ ＶＨ
配列番号１１５ ＶＬ
配列番号１１６ ＶＨ
配列番号１１７ ＭＨＣ−Ｉ−ＶＨ（ＭＣＳＰ）−ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異体アミノ酸配列。
配列番号１１８ ＶＨ（ＭＣＳＰ）−ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｔ３６６Ｗ変異体アミノ酸配列。
配列番号１１９ ＶＬ（ＭＣＳＰ）−ＣＬのアミノ酸配列。
配列番号１２０ ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒモノクローナル軽鎖抗体のアミノ酸配列（カッパ）。
配列番号１２１ ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒモノクローナル重鎖抗体のアミノ酸配列（ＩｇＧ１のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体）。
配列番号１２２ ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒモノクローナル重鎖抗体のアミノ酸配列（ＩｇＧ１のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体及びノブ変異体）。
配列番号１２３ ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒモノクローナル重鎖抗体のアミノ酸配列（ＩｇＧ１のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体及びホール変異体）。
配列番号１２４ ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域変異体ヒンジ領域及びＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体及びノブ変異体。
配列番号１２５ ヒト化抗ＩＧＦ−１Ｒモノクローナル抗体のジスルフィド安定化一本鎖Ｆｖ。
配列番号１２６ マウス抗ＭＣＳＰモノクローナル軽鎖抗体のアミノ酸配列（カッパ）。
配列番号１２７ ヒト化抗ＭＣＳＰモノクローナル軽鎖抗体のアミノ酸配列（カッパ）。
配列番号１２８ マウス抗ＭＣＳＰモノクローナル重鎖抗体のアミノ酸配列（ＩｇＧ１のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体）。
配列番号１２９ ヒト化抗ＭＣＳＰモノクローナル重鎖抗体のアミノ酸配列（ＩｇＧ１のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体）。
配列番号１３０ マウス抗ＭＣＳＰモノクローナル重鎖抗体のアミノ酸配列（ＩｇＧ１のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体及びノブ変異体）。
配列番号１３１ ヒト化抗ＭＣＳＰモノクローナル重鎖抗体のアミノ酸配列（ＩｇＧ１のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体及びノブ変異体）。
配列番号１３２ マウス抗ＭＣＳＰモノクローナル重鎖抗体のアミノ酸配列（ＩｇＧ１のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体及びホール変異体）。
配列番号１３３ ヒト化抗ＭＣＳＰモノクローナル重鎖抗体のアミノ酸配列（ＩｇＧ１のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体及びホール変異体）。
配列番号１３４ マウス抗ＭＣＳＰモノクローナル抗体のジスルフィド安定化一本鎖Ｆｖ。
配列番号１３５ ヒト化抗ＭＣＳＰモノクローナル抗体のジスルフィド安定化一本鎖Ｆｖ。
配列番号１３６ リンカーペプチド１３。
配列番号１３７ ジスルフィド安定化ＭＨＣ−Ｉ−ＶＨ（ＭＣＳＰ）−ＩｇＧ１ Ｆｃ領域のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ変異体アミノ酸配列。
配列番号１３８ ヒトＭＣＳＰのアミノ酸配列。
Ｉ．定義
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映している本質的な結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な例示であって典型的な実施態様は、以下で説明される。
この出願で用いられる用語「アミノ酸」は、カルボキシα−アミノ酸の基を表し、それは直接的に又は前駆体の形態で、核酸によってコードされ得る。個々のアミノ酸は、コドン又は塩基トリプレットと呼ばれる３つのヌクレオチドからなる核酸によってコードされる。各アミノ酸は、少なくとも一つのコドンによってコードされる。これは、「遺伝コードの縮重」として知られている。用語「アミノ酸」は、本出願で使用される場合、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に生じるカルボキシα−アミノ酸の群を示す。
用語「抗標的抗体」及び「標的に結合する抗体」は、抗体が、標的を標的とすることにおいて、診断薬剤及び／又は治療的薬剤として有用であるように、十分な親和性で標的に結合することができる抗体を指す。所定の実施態様において、標的へ結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）。
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
用語「抗原結合部位」は、標的に特異的に結合することができるタンパク質性部分を意味する。例示的な抗原結合部位は、ペプチド、抗体断片、ドメイン抗体、又は一本鎖抗体（例えば、ラクダ又はサメ抗体）の可変ドメインである。抗原結合部位は、天然に存在する抗原結合部位又は操作された抗原結合部位であることができる。例示的な操作された抗原結合部位は、ＤＡＲＰＩＮｓ、ドメイン交換抗体又はドメイン交換抗体断片、及び二重可変ドメイン抗体である。
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ，及びＩｇＭがあり、これらのうちの幾つかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２へとさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
用語「〜の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子」とは、個別のクラスＩのＭＨＣ分子が、ヒトの特定の集団において又は所与の相対頻度を持つ全てのヒトのなかで出現の頻度を有することを意味する。これが特定の集団、例えばヨーロッパ起源の全ヒトの２７．２％の全てのヒトのうち１０％以上に見いだすことができる１０％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子である。
本明細書で使用される用語「含む（comprising）」は、用語「成る（consisting）」を包含し、即ち、含むから成るへの変化は限定であると考えられる。
多機能タンパク質のそのコンジュゲーションパートナーへの「コンジュゲーション」は、異なる方法により、例えば化学結合、又は特定の結合対を介した結合により行うことができる。用語「コンジュゲーションパートナー」は、例えば、ポリペプチド、検出可能な標識、特異的結合対のメンバーを意味する。一実施態様において、コンジュゲーションパートナーへの多機能タンパク質のコンジュゲーションは、Ｎ末端基、及び／又はεアミノ基（リジン）、別のリジンのεアミノ基、多機能タンパク質の一部分のアミノ酸配列のカルボキシ−、スルフヒドリル−、ヒドロキシル−、及び／又はフェノール官能基、及び／又は多機能タンパク質の糖鎖構造の糖アルコール基を介する化学結合により行われる。一実施態様において、多機能タンパク質は特定の結合対を介してそのコンジュゲーションパートナーへコンジュゲートする。
本明細書で用いられる「細胞傷害性薬物」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞死若しくは破壊を生ずる物質を指す。細胞傷害性薬物は、限定されないが、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体）：化学療法剤又は薬物（例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤）；成長阻害剤、酵素及びその断片、例えば核酸分解酵素など；抗生物質；小分子毒素などの毒素、又は細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素（それらの断片及び／又はその変異体を含む）；及び様々な抗腫瘍剤又は抗がん剤を包含する。
色原体（蛍光性又は発光性の基及び色素）、酵素、ＮＭＲ活性基又は金属粒子、ハプテン、例えばジゴキシゲニンは、「検出可能な標識」の例である。検出可能な標識は、光活性化可能な架橋基、例えばアジド又はアジリン基などであってもよい。電気化学発光により検出できる金属キレートはまた、適切なシグナル放出基であり、ルテニウムキレート、例えばルテニウム（ビスピリジル）３ ２＋キレートに対して特に興味がある。適切なルテニウム標識基は、例えば、ＥＰ０５８０９７９、国際公開第９０／０５３０１号、国際公開第９０／１１５１１号、及び国際公開第９２／１４１３８号に記述されている。直接検出のため、標識基は、任意の公知の検出可能なマーカー基、例えば染料、例えばアクリジニウムエステル又はジオキセタンなど化学発光基などの発光標識基、又は蛍光染料、例えばフルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニンお及びその誘導体から選択することができる。標識基の他の例は、例えば、ルテニウム錯体又はユーロピウム錯体などの発光金属錯体、例えばＥＬＩＳＡ用又はＣＥＤＩＡ用（Ｃｌｏｎｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｄｏｎｏｒ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、例えば、ＥＰ−Ａ−００６１８８８）に使用される酵素、及び放射性同位元素である。
「エフェクター機能」とは、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体Ｆｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）；貪食；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞の活性化を含む。
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
用語「発現」は、本明細書で使用される場合、細胞内で生じる転写及び／又は翻訳及び分泌のプロセスを指す。細胞中の目的の核酸配列の転写レベルは、細胞内に存在する対応するｍＲＮＡの量に基づいて決定することができる。例えば、目的の配列から転写されるｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによって、又はノーザンハイブリダイゼーションによって定量することができる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照）。核酸によってコードされるポリペプチドは、例えばＥＬＩＳＡなど種々の方法によって、ポリペプチドの生物学的活性についてアッセイすることによって、又は、ポリペプチドを認識し結合する免疫グロブリンを使用するウェスタンブロッティング又はラジオイムノアッセイなど、そのような活性とは無関係であるアッセイを用いることにより定量することができる（Sambrook, et al., (1989）、前記を参照）。
「発現カセット」は、細胞中に少なくとも含有される核酸の発現のために、プロモーターやポリアデニル化部位など必要な調節エレメントが含まれるコンストラクトを意味する。
用語「発現機構」は、核酸又は遺伝子の転写工程（すなわち、「遺伝子発現機構」ともいう）から始まり、核酸によってコードされるポリペプチドの翻訳後修飾までの工程に関与している細胞の酵素、補因子などの総和を意味する。発現機構は、例えば、ＤＮＡのプレｍＲＮＡへの転写の工程、成熟ｍＲＮＡへのプレｍＲＮＡスプライシングの工程、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳工程、及びポリペプチドの翻訳後修飾工程を含む。
「発現プラスミド」は、宿主細胞中で構成される構造遺伝子の発現のための全ての必要な要素を提供する核酸である。典型的には、発現プラスミドは、例えば大腸菌用に、目的の構造遺伝子の発現のための、複製起点、及び選択可能なマーカー、真核生物の選択マーカー、及び、各々がプロモーター、構造遺伝子、及びポリアデニル化シグナルを含む転写ターミネーターを含む一又は複数の発現カセットを含む原核生物プラスミド増殖ユニットを含む。遺伝子発現は通常、プロモーターの制御下に置かれ、そのような構造遺伝子はプロモーターに「作動可能に連結された」と言われる。同様に、調節エレメントがコアプロモーターの活性を調節する場合、調節エレメント及びコアプロモーターは作動可能に連結されている。
用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する。Ｆｃ領域は、２つのジスルフィド結合した抗体の重鎖ポリペプチドを含む二量体分子である。Ｆｃ領域は、インタクトな（完全長）抗体のパパイン消化、又はＩｄｅＳ消化、又はトリプシン消化により生成することができるか、又は組換え的に産生することができる。
完全長抗体又は免疫グロブリンから得られるＦｃ領域は、全長重鎖のＣ末端に少なくとも残基２２６（Ｃｙｓ）を含み、従って、ヒンジ領域の一部、並びに２つ又は３つの定常ドメイン、即ち、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＩｇＥ及びＩｇＭクラスの抗体の場合には、付加的な／余分なＣＨ４ドメインを含む。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、 Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
二つの同一又は非同一の抗体の重鎖のＦｃ領域ポリペプチドを含む二量体Ｆｃ領域の形成は、含まれるＣＨ３ドメインの非共有結合性二量体化によって媒介される（関係するアミノ酸残基については、Dall'Acqua, W., Biochem. 37 (1998) 9266-9273を参照）。Ｆｃ領域は、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合の形成により共有結合的に安定化される（例えば、Huber, R., et al., Nature 264 (1976) 415-420; Thies, M.J., et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 67-79を参照）。
米国特許第５６４８２６０号及び米国特許第５６２４８２１号から、Ｆｃ領域における定義されたアミノ酸残基の修飾は表現型効果をもたらすことが知られている。
本明細書に報告される多機能タンパク質は、一実施態様にて、抗体重鎖ヒンジ領域ポリペプチドとして、ヒトＦｃ領域又はヒト起源由来のＦｃ領域を含み得る。更なる実施態様において、Ｆｃ領域は、サブクラスＩｇＧ４のヒト抗体Ｆｃ領域又はサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３のヒト抗体Ｆｃ領域のいずれかであって、Ｆｃγ受容体（例えばＦｃγＲＩＩＩａ）結合及び／又はＣ１ｑ結合を全く検出することができないように改変されている。一実施態様において、Ｆｃ領域は、ヒトＦｃ領域であり、特にヒトＩｇＧ４サブクラス由来又はヒトＩｇＧ１サブクラス由来の変異型Ｆｃ領域の何れかである。一実施態様において、Ｆｃ領域はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ並びにＰ３２９Ｇの変異を有するヒトＩｇＧ１サブクラスからのものである。ＩｇＧ４はＦｃγ受容体（ＦｃγＲＩＩＩａ）結合の減少を示すが、別のＩｇＧサブクラスの抗体は強い結合を示す。しかしながら、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７（Ｆｃ糖鎖の喪失）、Ｐｒｏ３２９、Ｌｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４、又は／及びＨｉｓ４３５は、変更される場合には、Ｆｃγ受容体結合の減少も与える残基である（Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324；ＥＰ０３０７４３４）。一実施態様において、本明細書に報告される多機能タンパク質は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｐ３２９及び／又はＤ２６５に変異を伴う、ＩｇＧ４サブクラス又はＩｇＧ１又はＩｇＧ２サブクラスのＦのＦｃγ受容体結合に関し、及び／又はＰＶＡ２３６変異を含む。一実施態様において、変異はＳ２２８Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、ＰＶＡ２３６であり（ＰＶＡ２３６とは、ＩｇＧ１のアミノ酸位置の２３３から２３６由来のアミノ酸配列ＥＬＬＧ（一文字アミノ酸コードで与えられる）又はＩｇＧ４のＥＦＬＧがＰＶＡで置換されることを意味する）及び／又はＰ３２９Ｇである。一実施態様において、変異はＩｇＧ４のＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ、並びにＩｇＧ１のＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇである。抗体Ｆｃ領域は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接関与している。Ｆｃγ受容体及び／又は補体因子Ｃ１ｑに結合しない多機能タンパク質は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘発しない。
ＩｇＧ１アイソタイプの野生型ヒトＦｃ領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号８７）。
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａの変異を含むＩｇＧ１アイソタイプの変異体ヒトＦｃ領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号８８）。
Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を含むＩｇＧ１アイソタイプの変異体ヒトＦｃ領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号８９）。
Ｔ３６６Ｗ変異を含むＩｇＧ１アイソタイプの変異体ヒトＦｃ領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９０）。
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を含むＩｇＧ１アイソタイプの変異体ヒトＦｃ領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９１）。
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＴ３６６Ｗ変異を含むＩｇＧ１アイソタイプの変異体ヒトＦｃ領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９２）。
Ｐ３２９Ｇ変異を含むＩｇＧ１アイソタイプの変異体ヒトＦｃ領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９３）。
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ変異を含むＩｇＧ１アイソタイプの変異体ヒトＦｃ領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９４）。
Ｐ２３９Ｇ及びＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を含むＩｇＧ１アイソタイプの変異体ヒトＦｃ領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９５）。
Ｐ３２９Ｇ及びＴ３６６Ｗ変異を含むＩｇＧ１アイソタイプの変異体ヒトＦｃ領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９６）。
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ及びＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を含むＩｇＧ１アイソタイプの変異体ヒトＦｃ領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９７）。
Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ及びＴ３６６Ｗ変異を含むＩｇＧ１アイソタイプの変異体ヒトＦｃ領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＣＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９８）。
ＩｇＧ４アイソタイプの野生型ヒトＦｃ領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号９９）。
Ｓ２２８Ｐ及びＬ２３５Ｅ変異を含むＩｇＧ４アイソタイプの変異体ヒトＦｃ領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１００）。
Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇ変異を含むＩｇＧ４アイソタイプの変異体ヒトＦｃ領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＧＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１０１）。
Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ及びＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖ変異を含むＩｇＧ４アイソタイプの変異体ヒトＦｃ領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＧＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１０２）。
Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ３２９Ｇ及びＴ３６６Ｗ変異を含むＩｇＧ４アイソタイプの変異体ヒトＦｃ領域のポリペプチド鎖は、以下のアミノ酸配列を有する：
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＥＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＧＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＷＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号１０３）。
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する初代形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は、親細胞と、核酸含有物において完全に同一ではなく、変異を含む場合もある。元来の形質転換細胞において、スクリーニング又は選択された場合に、同様の機能又は生物活性を有する変異子孫がここに含まれる。
用語「細胞」は、プラスミドの増殖のために使用される原核細胞及び核酸の発現のために使用される真核細胞の両方を含む。一実施態様において、真核細胞は哺乳動物細胞である。一実施態様において、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞（例えばＣＨＯ Ｋ１、ＣＨＯ ＤＧ４４）、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＨＥＫ ２９３ ＥＢＮＡ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞、及びＣＯＳ細胞を含む哺乳動物細胞の群から選択される。
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
「イムノコンジュゲート」は、１つ以上の異種分子にコンジュゲートした本明細書に報告される多機能タンパク質を意味し、限定されないが、細胞傷害性薬物を含む。
「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。ある実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
「単離された」多機能タンパク質は、その自然環境の成分から分離されたものである。幾つかの実施態様において、多機能タンパク質は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％又は９９％以上の純度にまで精製される。
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、しかし、その核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
特に断らない限り、本明細書で使用する用語「ＭＣＳＰ」は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意のＭＣＳＰ（メラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカン）を指す。その用語は、「完全長」、未処理のＭＣＳＰ並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＭＣＳＰを含む。その用語はまた、天然に存在するＭＣＳＰの変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。ＭＣＳＰはまた、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンＮＧ２、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、及びメラノーマコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしても知られる。典型的なヒトＭＣＳＰのアミノ酸配列は、配列番号１に示される。また、Pluschke, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 9710-9715, Staub, E., et al., FEBS Lett. 527 (2002) 114-118、及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１８８８を参照。
用語「一の抗原提示ドメイン」は、厳密に一の、即ち、定義される単一の抗原提示ドメインを意味し、更なる、即ち定義される第二の抗原提示ドメインの存在を除外する。用語「一」は「厳密に一」又は「単一」を意味する。
「作動可能に連結される」とは、２つ以上の構成要素の並置を意味し、そのように説明される構成要素は、それらの意図された様式で機能することを可能にする関係にある。例えば、プロモーター及び／又はエンハンサーは、連結された配列の転写を制御又は調節するためにそれがシスに作用した場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に、必ずしもそうではないが、「作動可能に連結」されているＤＮＡ配列は連続しており、ここで、分泌リーダー及びポリペプチドなどの２つのタンパク質コード領域を連結するために必要である場合、連続しており（読み取り）フレーム内にある。しかし、作動可能に連結されたプロモーターは一般にコード配列の上流に位置しているものの、それは必ずしもそれと連続していない。エンハンサーは連続している必要はない。エンハンサーがコード配列の転写を増加させる場合、エンハンサーは、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、内部又は下流に、プロモーターからかなりの距離に位置することができる。ポリアデニル化部位は、それがコード配列の下流端に位置する場合、コード配列に作動可能に連結され、転写がコード配列を通じてポリアデニル化配列へと進行する。翻訳終止コドンは、それがコード配列の下流端（３’末端）に位置する場合、エキソンの核酸配列へ作動可能に連結され、コード配列を介して翻訳が終止コドンまで進みそこで終了する。連結は、当技術分野で公知の組換え方法によって、例えば、ＰＣＲ方法論を使用して及び／又は都合のよい制限部位でのライゲーションにより達成される。都合のよい制限部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカー従来の慣例に従って使用される。
用語「パッケージ挿入物」は、効能、用法、用量、投与、併用療法、禁忌についての情報、及び／又はそのような治療用製品の使用に関する警告を含む、治療用製品の商用パッケージに慣習的に含まれている説明書を指すために使用される。
用語「ペプチドリンカー」は、天然及び／又は合成起源のアミノ酸配列を示す。それらは２０の天然アミノ酸は単量体構成要素であることを特徴とする直鎖アミノ酸鎖から構成される。ペプチドリンカーは、１から５０個のアミノ酸の長さを有し、一実施態様では１から２８個のアミノ酸、更なる実施態様では２から２５個のアミノ酸を有する。ペプチドリンカーは、反復アミノ酸配列又は天然に存在するポリペプチドの配列を含み得る。リンカーは、お互いにコンジュゲートしたポリペプチドが、該ポリペプチドが正しくフォールディングし適切に提示されることによりその生物学的活性を発揮することができることを確実にする機能を有する。一実施態様において、ペプチドリンカーは、グリシン、グルタミン、及び／又はセリン残基に富んでいる。これらの残基は、例えば最大５つのアミノ酸の小さな反復単位で、例えばＧＳ（配列番号７３）、ＧＧＳ（配列番号７４）、ＧＧＧＳ（配列番号７５）、及びＧＧＧＧＳ（配列番号８０）で配列されている。この小さな反復単位は、１から５回反復することができる。多量体単位のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端で、最大６つの付加的な任意の天然に存在するアミノ酸を加えることができる。他の合成ペプチドリンカーは、１０から２０回の間で反復される単一のアミノ酸で構成され、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端に、最大６つの付加的な任意の天然に存在するアミノ酸を含み得る。全てのペプチドリンカーは、核酸分子によってコードされることができ、よって組換えにより発現させることができる。リンカーは、ペプチド自体であるので、リンカーによって連結されたポリペプチドは、二つのアミノ酸の間に形成されるペプチド結合を介してリンカーに連結されている。
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の製剤処方中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
「ポリペプチド」は、天然又は合成で生成されるかによらず、ペプチド結合によって結合されるアミノ酸からなるポリマーである。約２５アミノ酸残基未満のポリペプチドは「ペプチド」と呼ばれても良く、一方二以上のポリペプチドからなる、又は１００アミノ酸残基を超える一のポリペプチドを含む分子は「タンパク質」と呼ぶことができる。ポリペプチドはまた、炭水化物基、金属イオン、又はカルボン酸エステルなどの非アミノ酸成分を含むことができる。非アミノ酸成分は、ポリペプチドが発現される細胞によって添加してもよく、細胞の種類によって異なり得る。ポリペプチドは、それらのアミノ酸骨格構造又はそれをコードする核酸の観点から本明細書において定義される。炭水化物基などの付加は、一般に特定されないが、それにもかかわらず存在することができる。
「構造遺伝子」は、シグナル配列、即ちコード領域を含まない遺伝子の領域を示す。
用語「Ｔ細胞応答誘発性ペプチド」は、クラスＩのＭＨＣ多機能タンパク質のペプチド結合溝に提示されるペプチドを意味し、循環性メモリー又はエフェクターＴ細胞によって認識される。ペプチドの認識により、このようなペプチド−ＭＨＣクラスＩ多機能タンパク質を提示する細胞の除去をもたらす免疫応答を生じる。
本明細書で用いられるように、「治療」（及び「治療する（treat）」又は「治療している（treating）」など文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然型抗体の可変重鎖ドメイン及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各ドメインを持ち、一般的に似たような構造を有する。（例えば、Kindt, T.J., et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007）、91頁を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的なＶＬ又はＶＨドメインのそれぞれのライブラリーをスクリーニングするために、抗原に特異的に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを用いて単離することができる。例えば、Portolano, S., et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T., et al., Nature 352 (1991) 624-628)を参照。
本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なように連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
ＩＩ．組成物及び方法
組換えによる産生の間に、共有結合ペプチドＭＨＣ−免疫グロブリンコンジュゲートは、通常の完全長抗体に匹敵するレベルで発現できない。これは、ある特定のフォーマットにおいてのみ可能である。完全長の抗体（ＩｇＧ）−ＭＨＣ融合体は、細菌中で発現させることはできない。更に、完全長抗体（ＩｇＧ）ペプチドＭＨＣ−融合体は有意なレベルで発現することはできない。これまでに、抗体断片（ヒンジ及びＦｃ領域を欠いたｓｃＦｖ及びＦａｂ）の融合体のみが、細菌で（好ましくは大腸菌で）ＭＨＣクラスＩ融合体として発現することができた。発現は、封入体、続いて特に大規模で技術的に困難なプロセスである複合体のリフォールディング過程を介してのみ成功した。
代替は、例えば完全長抗体又は抗体断片に融合されることの無い細菌中での可溶性ＭＨＣ複合体の組換え発現であって、その後に抗体への化学的コンジュゲーション又はビオチン−ストレプトアビジン媒介性非共有結合を伴う。化学的コンジュゲーションは、部位特異的ではなく、組換えにより産生された融合ポリペプチドと比較して、生成物の大きな不均一性をもたらす。
真核生物での発現は、発現量が全く無いか又は低いことに起因してこれまでに制限されていた。これまでは、哺乳動物細胞中での発現のみが、Greten, T.F. et al. (J. Immunol. Meth. 271 (2002) 125-135)に記載されている。しかしながら、得られた収率は非常に低く、技術的なプロセスに対しては実際に低すぎ、かつ通常の抗体よりもはるかに低い。
現在、ペプチドＭＨＣ複合体に融合した完全長抗体（ＩｇＧ）は、融合ポリペプチドが単一のＭＨＣ複合体のみを担持する場合、通常の抗体に匹敵して組換え的に高レベルで発現することができることが見出されている。
Ａ．例示的な多機能タンパク質
本明細書は、第一部分として標的抗原に特異的に結合する抗体由来部分、及び第二部分としてＭＨＣクラスＩタンパク質複合体に結合したウイルス由来ペプチドを含む抗原結合多機能タンパク質を組換え的に産生する方法を報告する。本明細書において報告されるような多機能タンパク質が、一以上の更なる抗原提示ドメインを含む場合、これらの更なる抗原提示ドメインは、ＭＨＣ分子を含まない。即ち本明細書において報告されるような多機能タンパク質は、ＭＨＣ分子を含む厳密に一の抗原提示ドメインを含む。
用語「ＭＨＣ分子」は、クラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３を含む融合ポリペプチドを意味する。一実施態様において、細胞外ドメインのα１、α２、及びα３は、ヒトクラスＩのＭＨＣ分子のものである。
本明細書に報告される多機能タンパク質によって、個体の既存のウイルス特異的循環性細胞障害性Ｔ細胞（Ｔメモリー細胞及び／又はＴエフェクター細胞）は、急性ウイルス感染を模倣するＭＨＣクラスＩ多機能タンパク質によりこれらの細胞をまとうことにより、多機能タンパク質の抗体由来部分が特異的に結合する標的抗原を発現する細胞に指向されることができる。
一態様において、本発明は、第一部分としてＭＨＣクラスＩタンパク質に結合したウイルス由来ペプチド及び第二部分として抗体に由来したジスルフィド結合分子を含んでなる本明細書において報告されている多機能タンパク質は、個体の既存のウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞を急性ウイルス感染を模倣する標的抗原を発現する細胞へと指向するために使用することができ、それにより標的抗原を発現する細胞の除去を開始することができるとする発見に一部基づいている。
ある実施態様において、（ｉ）ウイルス由来ペプチド、（ｉｉ）可溶性ＨＬＡ−対立遺伝子Ａ＊０２０１、及び（ｉｉｉ）β２−ミクログロブリンを含んでなる抗原提示ドメインを含む多機能タンパク質が与えられる。
本明細書において報告される多機能タンパク質は、例えば、がん又はウイルス感染など様々な疾患の診断又は治療のために有用である。
一態様において、本発明は（ｉ）細胞表面抗原及び（ｉｉ）細胞傷害性Ｔ細胞に結合する多機能タンパク質を提供する。
本明細書に報告される多機能タンパク質は、標的細胞、例えば腫瘍細胞又はウイルス感染細胞を除去／分解するために、天然に存在する、非常に効果的な抗ウイルス免疫応答を利用する。細胞の除去は、活性化のために任意の共刺激を必要としない個体自身の非常に強力な循環性Ｔ細胞を使用することにより達成される。更に、少数の治療用分子が作用機序のために細胞表面上に必要とされる（例えば、Mottez, E., et al., J. Exp. Med. 181 (1995) 493-502を参照）。
治療中に、多機能タンパク質は免疫化に類似して個体の抗ウイルス免疫応答を誘発することができる。これにより、複数の治療／適用は、治療の有効性を高めることができる。このように、前治療としての免疫感作は有効性を高めるために使用することができる。
また、集団におけるその頻度が非常に低く、一実施態様においては１％以下であるようなアロタイプを使用することができる。このようなアロタイプの使用は、アロタイプは異物として個体の免疫系によって認識され、免疫応答が開始されるであろうため、免疫感作の工程を陳腐化し得る。
標的とする抗原結合部位は、毒性及び副作用を制限するために高度に細胞又は抗原特異的である必要がある。
このように、本明細書に報告される多機能タンパク質を用いることにより
（ｉ）非常に特異的なＴ細胞集団のみがが活性化され（多機能タンパク質のＭＨＣ−Ｉタンパク質複合体に提示される単一のウイルス由来ペプチドに特異的なＣＤ８陽性エフェクター／メモリー細胞）、他の全てのＣＤ３＋細胞は影響されない（ＣＤ４＋−Ｔ細胞：ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ１７、調節Ｔ細胞）；
（ｉｉ）個体の免疫系の自然な応答が模倣され（ウイルス感染細胞の正常な除去）；及び
（ｉｉｉ）多機能タンパク質の／による適応／治療に対する応答は最初は低いであろうが治療期間中に追加免疫することができ（特異的Ｔ細胞が活性化され数が増える）、それとともに初期注入反応と初期のサイトカイン放出を減らすことができる。
一実施態様において、本方法は、選択されたウイルス由来ペプチド、例えばヒトサイトメガロウイルス（ｈｕＣＭＶ）由来ペプチドを適用することにより、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞を刺激する工程を含む。一実施態様において、ペプチドは、配列番号０１のアミノ酸配列を有する。
活性化されたＣＭＶ−ペプチド特異的Ｔ細胞は、インビトロで効果的な腫瘍細胞（インビトロでＣＭＶ由来ペプチドを負荷された腫瘍細胞）の除去を媒介することが示されている。
ウイルス感染細胞はそれらの細胞表面上にＭＨＣクラスＩタンパク質とともにウイルス由来ペプチドの複合体を提示する。これらは、ウイルス由来ペプチド提示細胞を枯渇／除去する特異的ＣＤ８＋−Ｔ細胞によって認識される。細胞溶解性（細胞傷害性）ＣＤ８＋−Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、その特異的なＴ細胞受容体により、ＭＨＣクラスＩタンパク質内のペプチドを認識する。ＣＴＬは、共刺激シグナルを必要とせずにウイルス感染細胞の除去を誘発する。
エフェクター細胞、例えば本明細書において報告されているように、融合ポリペプチドに含まれるＣＭＶ由来ペプチドで予め刺激することができる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又はＦＡＣＳ選別ＣＤ８＋−Ｔ細胞を使用することができる。
治療されるべき個体のＨＬＡ−アロタイプが認識されなければならない。
ＮＣＢＩによると、１０％以上の頻度を有するＨＬＡ−アロタイプは次の表に示されるように分布している。
Figure 2015537043
用語「頻度」は、特定のＨＬＡ−アロタイプが、全ヒト個体群内で発生する頻度を示している。従って、「１％以上の相対頻度を有する」という用語は、個別のＨＬＡ−アロタイプは、１％以上の全ヒト個体群内における発生を有することを意味する。全ての態様の一実施態様において、相対頻度は、ヒト個体群における相対的な頻度である。一実施態様において、相対頻度は、ヨーロッパ人個体群における相対的な頻度である。一実施態様において、相対頻度は、北米人個体群における相対的な頻度である。
それゆえ、本明細書に報告される一態様は抗原結合多機能タンパク質であり、
− 一の抗原提示ドメイン、
− 一の抗体Ｆｃ領域、及び
− 少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とし、
抗原提示ドメインは、ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）β２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉ）１％未満の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
又は
（ｉ）１％未満の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、並びに
（ｉｉ）β２−ミクログロブリン、
又は
（ｉ）Ｔ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）β２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、
又は
（ｉ）Ｔ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、並びに
（ｉｉｉ）β２−ミクログロブリン
の何れかを含み、
抗原結合部位は、がん細胞表面抗原に結合する。
一実施態様において、ＮからＣ末端方向に、β２−ミクログロブリン及び１％未満の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２及びα３を含む抗原提示ドメインは、そのＮ末端に、ＭＨＣペプチド結合の溝に結合するペプチドを更に含む。
一実施態様において、ペプチドは、Ｔ細胞応答を誘発するペプチドである。
一実施態様において、Ｔ細胞応答誘発性ペプチドは、ウイルス由来のペプチドである。一実施態様において、ウイルスは、アデノウイルス、ヒトヘルペスウイルス１、ヒトヘルペスウイルス２、ヒトヘルペスウイルス４（エプスタイン・バーウイルス）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス１６型、ヒトパピローマウイルス１８型、ヒトパピローマウイルス３１型、ヒトパピローマウイルス３３型、ヒトパピローマウイルス３５型、ヒトパピローマウイルス３９型、ヒトパピローマウイルス４５型、ヒトパピローマウイルス５１型、ヒトパピローマウイルス５２型、ヒトパピローマウイルス５６型、ヒトパピローマウイルス５８型、ヒトパピローマウイルス５９型、ヒトパピローマウイルス６８型、ヒトパピローマウイルス７３型、ヒトパピローマウイルス８２型、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型、ヒトインフルエンザＡ型ウイルス、ヒトインフルエンザＢ型ウイルス、ワクシニアウイルスから選択される。
一実施態様において、ウイルス由来ペプチドは、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号０１）、ＳＬＹＮＴＶＡＴＬ（配列番号４８）、ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ（配列番号４９）、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ（配列番号５０）、ＳＴＮＲＱＳＧＲＱ（配列番号５１）、ＬＬＦＧＹＰＶＹＶ（配列番号５２）、ＦＡＥＧＦＶＲＡＬ（配列番号５３）、ＬＩＶＩＧＩＬＩＬ（配列番号５４）、又はＩＬＨＴＰＧＣＶ（配列番号５５）から選択される。
一実施態様において、β２−ミクログロブリンはヒトβ２−ミクログロブリンである。一実施態様において、β２−ミクログロブリンは、配列番号７１のアミノ酸配列からなる。
一実施態様において、１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子はヒトＨＬＡ−Ａ＊０２０１である。一実施態様において、クラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３は配列番号７２のアミノ酸配列からなる。
一実施態様において、ウイルス由来ペプチドは第一リンカーペプチドを介してβ２−ミクログロブリンへ融合される。
一実施態様において、β２−ミクログロブリンは第二リンカーペプチドを介してクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１へ融合される。
一実施態様において、クラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα３は第三のリンカーペプチドを介して（ジスルフィド結合し又はジスルフィド結合していない何れかの）ポリペプチドへ融合される。
一実施態様において、第一、第二、及び第三のリンカーペプチドは同一であるか又は異なる。
一実施態様において、第一リンカーペプチド、第二リンカーペプチド、及び第三リンカーペプチドはアミノ酸配列ＧＳ（配列番号７３）、ＧＧＳ（配列番号７４）、ＧＧＧＳ（配列番号７５）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７６）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７７）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７８）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号７９）、ＧＧＧＧＳ（配列番号８０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８３）、及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８４）からお互いに独立して選択される。
一実施態様において、第一リンカーペプチドは配列番号８２のアミノ酸配列を含む。
一実施態様において、第二リンカーペプチドは配列番号８３のアミノ酸配列を含む。
一実施態様において、第三リンカーペプチドは配列番号７３のアミノ酸配列を含む。
一実施態様において、抗体Ｆｃ領域は、クラスＩｇＧ又はクラスＩｇＥのヒト抗体の抗体Ｆｃ領域から選択される。
一実施態様において、抗体Ｆｃ領域は、サブクラスＩｇＧ１、又はＩｇＧ２、又はＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のヒト抗体の抗体Ｆｃ領域から選択される。
一実施態様において、第一ジスルフィド結合ポリペプチド及び第二ジスルフィド結合ポリペプチドは、ヒト起源のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。一実施態様において、ヒト起源のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインはクラスＩｇＧ又はＩｇＥのヒト抗体のものである。一実施態様において、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインは、サブクラスＩｇＧ１、又はＩｇＧ２、又はＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のヒト抗体のものである。一実施態様において、ＣＨ２ドメインは配列番号８５のアミノ酸配列を含む。一実施態様において、ＣＨ２ドメインは、サブクラスＩｇＧ１又はＩｇＧ２のヒト抗体のものであり、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ａ３３０、及び／又はＰ３３１（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）の少なくとも一の変異を含む。一実施態様において、ＣＨ２ドメインは、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、及び／又は変異Ｄ２６５Ａ及びＮ２９７Ａを有するヒトサブクラスＩｇＧ２又はサブクラスＩｇＧ１のヒト抗体のものであり、及び／又はＰＶＡ２３６変異を含み、及び／又は変異Ｐ３２９Ｇを含む。一実施態様において、ＣＨ２ドメインは変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ及び／又はＰ３２９Ｇを有するサブクラスＩｇＧ１のヒト抗体のものである。一実施態様において、ＣＨ２ドメインはＳ２２８Ｐ及び／又はＬ２３５Ｅを有するサブクラスＩｇＧ４のヒト抗体のものである。
一実施態様において、第一ジスルフィド結合ポリペプチドは配列番号８９のアミノ酸配列を含み、第二ジスルフィド結合ポリペプチドは配列番号９０のアミノ酸配列を含む。
一実施態様において、第一及び第二ジスルフィド結合ポリペプチドは配列番号９４又は配列番号１０１のアミノ酸配列を含む。
一実施態様において、第一ジスルフィド結合ポリペプチド又は第二ジスルフィド結合ポリペプチドは配列番号９７又は配列番号９８のアミノ酸配列からなる。
一実施態様において、第一ジスルフィド結合ポリペプチドは配列番号１０２のアミノ酸配列を含み、第二ジスルフィド結合ポリペプチドは配列番号１０３のアミノ酸配列を含む。
一実施態様において、ジスルフィド結合ポリペプチドは、２つ、又は３つ、又は４つのジスルフィド結合により連結される。
一実施態様において、抗原提示ドメインは、それがＮからＣ末端の方向に
（ｉ）配列番号０１のアミノ酸配列を有するウイルス由来ペプチド、
（ｉｉ）配列番号８２のアミノ酸配列を有する第一リンカーペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を有するβ２−ミクログロブリン、
（ｉｖ）配列番号８３のアミノ酸配列を有する第二リンカーペプチド、
（ｖ）配列番号７２のアミノ酸配列を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、及び
（ｖｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を有する第三リンカーペプチド
を含むことを特徴とする。
図１０から、本明細書で報告されるような多機能タンパク質は、それが融合される抗体の結合特性を維持することが分かる（図１０ｂ）及びｃ））。
図１１と１３において、本明細書で報告されるような多機能タンパク質のインビトロでの有効性と特異性が示される。
細胞毒性試験はＣＭＶ特異的ＣＤ８＋−Ｔ細胞の存在下で行った。ＣＭＶ由来ウイルスペプチドを含む多機能タンパク質は、標的細胞の溶解／除去／分解を誘発することが分かる（一価抗体について、図１１ａ）、二価抗体について、図１１ｂ）を参照）。標的細胞の溶解は、ＥＢＶ由来ウイルスペプチド（図１１ｂ））と対照抗体（図１１ｄ）及びｅ））を含んでなる多機能タンパク質とのインキュベーションは広範な細胞溶解を生じないため（自然溶解は約３．５％である）、非常に特異的であることが更に分かる。
図１３に、ＩＧＦ−１Ｒ陽性肺腺癌細胞株Ｈ４６０Ｍ２の溶解が示されている。
ＣＭＶ由来ペプチド及び二価抗体を含む多機能タンパク質のＥＣ５０値は、約５０ｐＭに相当する約１０ｎｇ／ｍｌである。決定されたＥＣ５０の値は標的細胞対エフェクター細胞の比率とは無関係である（図１２を参照；標的細胞対エフェクター細胞の比率が１：３から１：１は１：０．４４から１：０．１４の実効比に対応する（エフェクター細胞の７６％がＣＤ８陽性であり、１９％がＣＭＶ特異的である））。
１：親和性
所定の実施態様において、本明細書において提供される多機能タンパク質は、抗体から派生する抗原結合部位、例えば、抗体可変ドメインの対、又は単一ドメイン抗体を含む。所定の実施態様において、抗原結合部位は、その抗原に関して、解離定数（Ｋｄ）が、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ未満、例えば、１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）を有する。
一実施態様において、Ｋｄは表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。
例えば、これはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００機器（ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて固定化抗原ＣＭ５チップにより〜１０応答単位（ＲＵ）で２５℃で行うことができる。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｃ．）を、提供者の指示書に従ってＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化した。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）に希釈し、結合したタンパク質の応答単位（ＲＵ）がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入する。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入する。動力学的な測定のために、Ｆａｂの２倍の段階希釈（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、２５℃で、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０ＴＭ）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳに注入する。会合センサーグラム及び解離センサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル（simple one-to-one Langmuir binding model）（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出する。例えば、Chen, Y., et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照。
２：発現
ＨＥＫ２９３及びＣＨＯ細胞における本明細書で報告される多機能タンパク質の特定の形態（異なるリンカー、ＨＬＡとβ２−ミクログロブリンの異なる組み合わせ）の発現は、仮にも検出可能な場合、小胞体内に多機能タンパク質の蓄積をもたらし、即ち多機能タンパク質の単離と分泌が強く損なわれた。
多機能タンパク質が以下の表に概説されるようなポリペプチドの一を含むことを意図したときには、培養培地への多機能タンパク質の分泌は検出できなかった。
Figure 2015537043
Figure 2015537043
ＭＨＣクラスＩタンパク質複合体に結合したウイルス由来ペプチドから形成された２つの抗原提示ドメイン、及び抗体の少なくとも一の可変ドメイン及び一の定常ドメインを含む多機能タンパク質の発現、及び特に分泌は真核細胞では不可能であることが分かっている。
更に、ＭＨＣクラスＩタンパク質の多機能タンパク質に結合したウイルス由来ペプチドから形成された２つの抗原提示ドメイン、少なくとも一の可変ドメイン、及び抗体ヒンジ領域を含む多機能タンパク質の発現、及び特に分泌は真核細胞では不可能であることが分かっている。
従って、本明細書において報告される多機能タンパク質において、真核細胞を用いた多機能タンパク質の産生及び分泌を可能にするために、ＭＨＣクラスＩタンパク質に結合したウイルス由来のペプチドを含む抗原提示ドメインは複数存在することはできず、少なくとも一の抗体可変ドメイン及び一の抗体定常ドメインが存在しなければならない。
従って、ＭＨＣクラスＩタンパク質に結合したウイルス由来ペプチドの厳密に一の抗原提示ドメイン、抗体重鎖ヒンジ領域、及び少なくとも一の抗体可変ドメイン及び一の抗体定常ドメインを含む多機能タンパク質は、真核細胞中で組換え産生され分泌させることができる。
従って、抗体重鎖ヒンジ領域、抗体可変ドメインの少なくとも一対、任意で抗体定常ドメイン、及びＭＨＣクラスＩタンパク質に結合したウイルス由来ペプチドの厳密に一の抗原提示ドメインを含む多機能タンパク質は、真核細胞で組換え的に産生され分泌させることができる。
様々な組合せが試験された。多機能タンパク質の分泌型発現は、例えば、ウイルス由来ペプチドがクラスＩのＭＨＣ分子にＮ−末端で融合される、免疫グロブリン由来のシグナルペプチドのＮ末端融合により達成することができる。クラスＩのＭＨＣ分子の重鎖（膜貫通及び細胞質ドメインを欠いているα１−α２−α３）及び軽鎖（β２ミクログロブリン）を順番に変えることができる。異なる抗原提示ドメインを、抗体軽鎖又はポリペプチドを含む抗体の重鎖のヒンジ領域のいずれかにＮ末端で融合させた。典型的な組み合わせを図２に示す。
以下の表に見ることができるように、ＭＨＣ−Ｉタンパク質複合体を含んでなる抗原提示ドメインを含む多機能タンパク質は、単一のウイルス由来ペプチド−ミクログロブリン−ＨＬＡ融合ポリペプチドが存在する場合には、可変抗体ドメイン、及び抗体ヒンジ領域由来ポリペプチドの存在下において発現できるのみである。
Figure 2015537043
Figure 2015537043
Figure 2015537043
Figure 2015537043
幾つかの実施態様において、本明細書に報告される多機能タンパク質はポリペプチドの異なる対合を含む。ポリペプチドの適切な対合を可能にするために、ノブ・イントゥ・ホール（knobs-into-holes）技術又はクロスｍＡｂの技術を、正しく会合していない多機能タンパク質の量を減らするために使用することができる。
ノブ修飾は抗体のＣＨ３ドメインの変異Ｔ３６６Ｗを意味する（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けられる）。
ホール修飾は抗体のＣＨ３ドメインの変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを意味する（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って番号付けられる）。
ノブ及びホール修飾に加えて、一方のＣＨ３ドメインの変異Ｓ３５４Ｃ及び他方のＣＨ３ドメインの変異Ｙ３４９Ｃが存在し得る。
クロスｍＡｂ技術は、例えば国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２、及び国際公開第２０１０／１４５７９３に報告されている。
３：変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される多機能タンパク質のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、多機能タンパク質の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。多機能タンパク質のアミノ酸配列変異体は、多機能タンパク質のポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、多機能タンパク質のポリペプチドのアミノ酸配列内における残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達させるために作成され得る。
ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
ある実施態様において、一以上のポリペプチド鎖に一以上のアミノ酸置換を有する多機能タンパク質変異体が提供される。例示的な改変が、以下の表の「例示的な置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。保存的置換は以下の表の「好ましい置換」の見出しの下に示されている。アミノ酸置換は、目的の多機能タンパク質に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
Figure 2015537043
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを伴うこととなる。
アミノ酸配列挿入は、一残基から百以上の残基を含有するポリペプチド長にわたるアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニン残基を有するポリペプチドを含む多機能タンパク質が含まれる。他の挿入変異体は、酵素への多機能タンパク質のポリペプチド鎖のＮ−又はＣ−末端への融合を含む。
ｂ）グリコシル化変異体
所定の実施態様において、本明細書で提供される多機能タンパク質の一以上のポリペプチドは、ポリペプチドがグリコシル化される程度を増加させるか又は減少させるように改変される。ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加又は欠失は、一以上のグリコシル化部位が作成又は削除されるようにアミノ酸配列を変えることによって簡便に達成することができる。
多機能タンパク質は抗体Ｆｃ領域を含み、それに付着する糖は改変され得る。哺乳動物細胞によって産生された天然型Ｆｃ領域は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ−結合により一般的に付着された分岐鎖、二分岐オリゴ糖を含んでいる。例えば、Wright, A., and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合した、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、並びにフコースを含み得る。幾つかの実施態様において、本明細書に報告される多機能タンパク質におけるオリゴ糖の改変は、一定の改善された特性を有する変異体を作成するためになされ得る。
一実施態様において、ポリペプチド変異体を含む多機能タンパク質は、Ｆｃ領域に（直接又は間接的に）付着されたフコースを欠いた糖鎖構造を有して提供される。例えば、このようなＦｃ領域のフコース量は、１％から８０％、１％から６５％、５％から６５％、又は２０％から４０％であり得る。フコースの量は、例えば、国際公開第２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって測定されるＡｓｎ２９７に付着しているすべての糖構造の合計（例えば、多機能タンパク質、ハイブリッド及び高マンノース構造）に対して、Ａｓｎ２９７の糖鎖中のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）でおよそ２９７の位置に位置するアスパラギン残基を指し、しかし、Ａｓｎ２９７もまた位置２９７の上流又は下流のおよそ±３アミノ酸に、すなわち抗体の軽微な配列変異に起因して、位置２９４と３００の間に配置され得る。このようなフコシル化変異体はＡＤＣＣ機能を改善させた可能性がある。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；米国特許第２００４／００９３６２１号を参照。「非フコシル化」又は「フコース欠損」抗体変異体に関連する出版物の例としては、米国特許出願公開第２００１／２９２４６号；国際公開第２００３／０１１５６１４号；国際公開第２００２／０１６４３２８号；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１４０号；米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号；米国特許出願公開第２００４／０１１０２８２号；米国特許出願公開第２００４／０１０９８６５号；米国特許出願公開第２００３／０８５１１９号；米国特許出願公開第２００３／０８４５７０号；国際公開第２００５／０３５５８６号；国際公開第２００５／０３５７７８号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号；国際公開第２００５／０５３７４２号；国際公開第２００２／０３１１４０号；Okazaki, A., et al., J. Mol. Biol. 336 (2004) 1239-1249; Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622が含まれる。非フコシル化抗体を産生する能力を有する細胞株の例としては、タンパク質フコシル化を欠損しているＬｅｃ１３ ＣＨＯ細胞（Ripka, J., et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533-545；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、アルファ−１、６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Yamane-Ohnuki, N., et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622; Kanda, Y., et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照）を含む。
Ｆｃ領域変異体を含む多機能タンパク質は、例えば、Ｆｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を更に備えている。このような変異体はフコシル化を減少させ、及び／又はＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。このような抗体変異体の例は、例えば国際公開第２００３／０１１８７８号；米国特許第６６０２６８４号；及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号に記述される。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つＦｃ領域変異体も提供される。このようなＦｃ領域変異体はＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。対応する抗体変異体は、例えば国際公開第９７／３００８７号；国際公開第９８／５８９６４号；及び国際公開第９９／２２７６４号に記述される。
ｃ）Ｆｃ領域変異体
所定の実施態様において、一以上のアミノ酸改変を、本明細書で提供される多機能タンパク質のＦｃ領域に導入することができ、それによってＦｃ領域変異体を生成する。Ｆｃ領域の変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置においてアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトＦｃ領域の配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域）を含んでもよい。
ある実施態様において、本発明は、インビボにおける多機能タンパク質の半減期が重要であるが、ある種のエフェクター機能（例えば補体及びＡＤＣＣなど）が不要又は有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有するＦｃ領域変異体を意図している。インビトロ及び／又はインビボでの細胞毒性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、多機能タンパク質がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、おそらくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣを媒介する初代細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ravetch, J.V., and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492の464頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５５００３６２号（例えばHellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063；及びHellstrom, I., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502を参照）；米国特許第５８２１３３７号（Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照）に説明される。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を参照。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は更に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656に開示されるように、インビボで、例えば動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro, H., et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052;及びCragg, M.S. and Glennie, M.J., Blood 103 (2004) 2738-2743を参照）。ＦｃＲｎ結合及びインビボでのクリアランス／半減期の測定は当該分野で公知の方法を用いても行うことができる（例えば、Petkova, S.B., et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769を参照）。
エフェクター機能が減少したＦｃ領域は、Ｆｃ領域の残基２３４、２３５、２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の一つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ領域変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ領域変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の二つ以上の置換を有するＦｃ領域変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
ＦｃＲへの結合を改善又は減少させた特定のＦｃ領域変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６７３７０５６号；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)を参照）。
所定の実施態様において、ポリペプチド変異体はＡＤＣＣを改善する一以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４における置換（ＥＵの残基番号付け）を有するＦｃ領域を含む。
幾つかの実施態様において、改変された（すなわち改善されたか減少した）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６１９４５５１号、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に説明される。
増加した半減期を有し、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Guyer, R.L., et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593及びKim, J.K., et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）が、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する一つ又は複数の置換をその中に有するＦｃ領域を含む。このようなＦｃ領域変異体は、Ｆｃ領域の残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の一以上の置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換が含まれる（米国特許第７３７１８２６号）。
Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第５６２４８２１号；及び、Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
Ｂ．組換え方法及び組成物
本明細書に報告される多機能タンパク質は、例えば米国特許第４８１６５６７号で説明したように、組換え方法及び組成物を用いて生成することができる。一実施態様において、本明細書に記載される多機能タンパク質のポリペプチドをコードする単離された核酸が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む一以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。一実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換される）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２／０細胞）である。一実施態様において、本明細書に報告されるように多機能タンパク質を作成する方法が提供され、その方法は、上記のように、ポリペプチドの発現及び多機能タンパク質の形成に適した条件下で、多機能タンパク質のポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を培養することを含み、かつ必要に応じて、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から多機能タンパク質を回収することを含む。
多機能タンパク質の組換えによる産生のために、例えば上述したように、多機能タンパク質のポリペプチドをコードする核酸が単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために一以上のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定することができる。
ベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、多機能タンパク質は細菌で産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体断片の発現を記述しているCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003)、245-254頁も参照）。発現後、多機能タンパク質は可溶化フラクションにおいて細菌細胞ペーストから単離され、更に精製することもできる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む、ポリペプチドをコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路が、「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414;及びLi, H., et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照。
グリコシル化多機能タンパク質の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から由来している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組合せて使用することができる。
植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適応されている哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（例えば、Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に記載される２９３又は２９３細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載されるＴＭ４細胞）；サル腎細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）；例えば、Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載されるＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ− ＣＨＯ細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004)、255-268頁を参照。
Ｃ．薬学的製剤
本明細書に記載の多機能タンパク質の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するその多機能タンパク質と任意の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA (1980)）とを、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、介在性薬物分散剤、例えば、水溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。所定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒｈｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８に開示されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ又は複数の追加のグルコサミノグリカンと組み合わされる。
典型的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性の抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものが含まれ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
本明細書の製剤はまた、治療を受けている特定の徴候のために必要な一以上の活性成分、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものが含まれる場合がある。このような活性成分は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合法によって、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）、コロイド薬物送達系で（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）又はマクロ・エマルジョンで調製されたマイクロカプセルに封入されてもよい。このような技術は、RemingtonのPharmaceutical Sciences、第１６版、Osol, A. (編) (1980)に開示される。
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形をしている。
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、達成することができる。
Ｄ．治療的方法及び組成物
本明細書で提供される多機能タンパク質のいずれかを、治療方法で使用することができる。
一態様では、医薬として使用するための本明細書に報告される多機能タンパク質が提供される。
更なる態様では、がんの治療における使用のための本明細書に報告される多機能タンパク質が提供される。
所定の実施態様において、治療の方法における使用のための本明細書に報告される多機能タンパク質が提供される。
所定の実施態様において、本発明は、個体に本明細書に報告される多機能タンパク質の有効量を投与することを含む、がんに罹患した個体を治療する方法における使用のための本明細書に報告される多機能タンパク質を提供する。一つのそのような実施態様において、本方法は、例えば後述するように、少なくとも一の追加の治療薬の有効量を個体に投与することを更に含む。
更なる実施態様において、本発明は、がん細胞の除去において使用のための本明細書に報告される多機能タンパク質を提供する。所定の実施態様において、本発明は、がん細胞を除去するために、本明細書に報告される多機能タンパク質の有効量を個体に投与することを含む、個体においてがん細胞を除去する方法に使用のための本明細書に報告される多機能タンパク質を提供する。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
更なる態様にて、本発明は、医薬の製造又は調製における本明細書に報告される多機能タンパク質の使用を提供する。一実施態様において、本医薬はがんの治療のためのものである。更なる実施態様において、本医薬は、がんを有する個体に、医薬の有効量を投与することを含む、がんを治療する方法で使用するためのものである。一つのそのような実施態様において、この方法は少なくとも一の更なる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。更なる実施態様において、本医薬は、がん細胞の除去のためのものである。更なる実施態様にて、本医薬は、がん細胞を除去するために本医薬の有効量を個体に投与することを含む、個体においてがん細胞を除去する方法で使用のためのものである。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
更なる態様にて、本発明は、がんを治療する方法を提供する。一実施態様において、本方法はそのようながんに罹患した個体に、本明細書に報告される多機能タンパク質の有効量を投与することを含む。一つのそのような実施態様において、この方法は少なくとも一の更なる治療剤の有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様の何れかに記載の「個体」は、ヒトであり得る。
更なる態様において、本発明は、個体におけるがん細胞の除去のための方法を提供する。一実施態様において、本方法は、がん細胞を除去するために、本明細書に報告される多機能タンパク質の有効量を投与することを含む。一実施態様において、「個体」はヒトである。
更なる態様において、本発明は、例えば、上記の治療法の何れかに使用のための、本明細書に報告される多機能タンパク質の何れかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で報告される多機能タンパク質の何れか及び薬学的に許容される担体を含む。別の実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で報告される多機能タンパク質の何れか、及び少なくとも一の更なる治療剤を含む。
本発明の多機能タンパク質は、治療において、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の多機能タンパク質は、少なくとも一つの追加の治療剤と共投与されうる。
上記のこうした併用療法は、併用投与（二以上の治療剤が、同一又は別々の製剤に含まれている）、及び、本発明の多機能タンパク質の投与が、付加的治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、同時、及び／又はその後に起きうる分離投与を包含する。本発明の多機能タンパク質はまた放射線治療と併用して用いることができる。
本発明の多機能タンパク質（及び任意の追加の治療剤）は、任意の適切な手段によって投与することができ、経口、肺内、及び鼻腔内、及び局所治療が所望される場合病巣内投与が含まれる。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定するものではないが、単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投与スケジュールがここで考えられる。
本発明の多機能タンパク質は、良好な医療行為に矛盾しない方式で、処方、服用、及び投与されるであろう。この文脈における考慮因子としては、治療すべき具体的な障害、治療すべき具体的な哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医師にとって既知の他の因子が挙げられる。多機能タンパク質は、必要ではないが任意で、問題となる障害の予防又は治療のために、現在使用中の一又は複数の薬剤ともに処方される。かかる他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する多機能タンパク質の量、疾患又は治療のタイプ、及び上で検討した他の因子に依存する。これらは一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の１％から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
疾患の予防又は治療のためには、本発明の多機能タンパク質の適切な用量（単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合）は治療すべき疾患の種類、多機能タンパク質の種類、疾患の重症度及び経過、二重特異性抗体を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、以前の治療、患者の臨床的履歴及び多機能タンパク質に対する応答性、及び担当医の判断に依存する。多機能タンパク質は、患者に対して、一回、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、多機能タンパク質の約１μｇ／ｋｇから１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．５ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ）が患者への投与のための初期候補用量となり得る。１つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の所望される抑制が起こるまで持続するであろう。１つの例示される抗体用量は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。従って、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの１つ以上の用量（又はこれらの何れかの組合せ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は３週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば抗体の約６投与量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷投与量の後に一以上の低投与量が投与され得る。しかしながら、他の投与レジメンも有益であり得る。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
上記の製剤又は治療方法のいずれかが、本明細書に報告される多機能タンパク質の代わりか又は多機能タンパク質に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて行うことができることが理解される。
本明細書に報告される一態様は、患者のがんを治療する方法において使用のための本明細書に報告される多機能タンパク質であり、本多機能タンパク質は多機能タンパク質に含まれるウイルス由来ペプチドによる患者の免疫感作の前、同時又は後で投与されるべきである。
本明細書に報告される一態様は、多機能タンパク質に含まれるウイルス由来ペプチドに対する免疫感作と併用してがんを治療するための医薬の製造のための本明細書に報告される多機能タンパク質の使用である。
第一段階において、多機能タンパク質に含有されるようなウイルス由来ペプチドが治療されるべき個体に最初に投与される。所定の期間の後、即ち４日と２８日の間で、本明細書に報告される多機能タンパク質が個体に投与される。
ウイルス由来ペプチドのこの連続かつ分離した適用により、本明細書で報告される多機能タンパク質の第一段階単独で及び第二段階において、ウイルス由来ペプチド特異的Ｔ細胞の数を増加させ、よって治療の有効性を増加させることができる。
ＩＩＩ．製造品
本発明の他の実施態様において、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベル又は容器上にある又は容器に付属するパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び／又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の多機能タンパク質である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択した症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、（ａ）本発明の二重特異性抗体を含有する組成物を中に収容する第一の容器と（ｂ）更なる細胞障害剤又は別の治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物を更に含んでいてもよい。別法として、又は加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器をさらに含んでもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの立場から望まれる他の物質のさらに含んでもよい。
上記の製造品のいずれかは、本明細書に報告される多機能タンパク質の代わりか又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解される。
ＩＶ．具体的な実施態様
１：
− （厳密に）一の抗原提示ドメイン、
− （厳密に）一の抗体Ｆｃ領域、及び
− 少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とする多機能タンパク質であって、
抗原提示ドメインは、ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）β２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉ）１％未満の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
又は
（ｉ）１％未満の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、並びに
（ｉｉ）β２−ミクログロブリン、
又は
（ｉ）Ｔ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）β２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、
又は
（ｉ）Ｔ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、並びに
（ｉｉｉ）β２−ミクログロブリン
の何れかを含み、
抗原結合部位は、がん細胞表面抗原に結合する、多機能タンパク質。
２：
抗体Ｆｃ領域は、第一及び第二のジスルフィド結合したＦｃ領域ポリペプチドを含み、これにより抗原結合部位は第一のＦｃ領域ポリペプチドを含むことを特徴とする、１項に記載の多機能タンパク質。
３：
抗原結合部位が、ｉ）抗体重鎖と抗体軽鎖との対、又はｉｉ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、ｓｃＦｖ抗体断片及び抗体Ｆｃ領域ポリペプチドを含むｓｃＦｖ融合ポリペプチド、又はｉｉｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、ｓｃＦａｂ及び抗体Ｆｃ領域ポリペプチドを含むｓｃＦａｂ融合ポリペプチドを含むことを特徴とする、１項から２項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
４：
ｉ）抗原提示ドメインは、抗原結合部位の重鎖のＮ末端に又は軽鎖のＮ末端に連結されており、又はｉｉ）抗原提示ドメインは、抗原結合部位の重鎖のＣ末端に、又は軽鎖のＣ末端に連結されており、又はｉｉｉ）抗原提示ドメインは、ｓｃＦｖ融合ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に連結されており、又はｉｖ）抗原提示ドメインは、ｓｃＦａｂ融合ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に連結されており、又はｉｖ）抗原提示ドメインは、第二のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に連結されていることを特徴とする、１項から３項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
５：
がん細胞表面抗原がメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）であることを特徴とする、１項から４項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
６：
Ｔ細胞応答誘発性ペプチドがウイルス由来ペプチドであることを特徴とする、１項から５項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
７：
Ｔ細胞応答誘発性ペプチドがＣＤ８＋−Ｔ細胞応答誘発性ペプチドであることを特徴とする、１項から６項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
８：
ウイルス由来ペプチドがヒトサイトメガロウイルス由来のペプチドであることを特徴とする、６項から７項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
９：
ウイルス由来ペプチドが配列番号０１から配列番号７０の群から選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、１項から８項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
１０：
ウイルス由来ペプチドが配列番号０１のアミノ酸配列を有することを特徴とする、１項から９項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
１１：
１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子が、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊３４０１０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０３０４、ＨＬＡ−Ｃ＊０４０１、及びＨＬＡ−Ｃ＊０７０２を含む群から選択されることを特徴とする、１項から１０項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
１２：
１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子は、多機能タンパク質が以下：
− ヨーロッパ起源の個体において、クラスＩのＭＨＣ分子は、ＨＬＡ−Ａ＊０１０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊０３０１、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２、ＨＬＡ−Ｂ＊０８０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０４０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０５０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０７０１、及びＨＬＡ−Ｃ＊０７０２を含む群から選択され、
− オーストラリア起源の個体において、クラスＩのＭＨＣ分子は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊３４０１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊１３０１、ＨＬＡ−Ｂ＊１５２１、ＨＬＡ−Ｂ＊５６０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５６０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０１０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０４０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０４０３、及びＨＬＡ−Ｃ＊１５０２を含む群から選択され、
− 北アメリカ起源の個体において、クラスＩのＭＨＣ分子は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０２０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０３０４、ＨＬＡ−Ｃ＊０４０１、及びＨＬＡ−Ｃ＊０７０２を含む群から選択され、及び
− 東南アジア起源の個体において、クラスＩのＭＨＣ分子は、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ｂ＊１５０４、ＨＬＡ−Ｃ＊０１０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０３０４、ＨＬＡ−Ｃ＊０７０２、及びＨＬＡ−Ｃ＊０８０１を含む群から選択される
のように投与される個体の地域に依存して選択されることを特徴とする、１項から１１項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
１３：
１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子は、多機能タンパク質が以下：
− ヨーロッパ起源の個体において、クラスＩのＭＨＣ分子はＨＬＡ−Ａ＊０２０１であり、
− オーストラリア起源の個体において、クラスＩのＭＨＣ分子は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ｂ＊１３０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０１０２、及びＨＬＡ−Ｃ＊０４０１を含む群から選択され、
− 北アメリカ起源の個体において、クラスＩのＭＨＣ分子は、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、及びＨＬＡ−Ｃ＊０３０４を含む群から選択され、そして
− 東南アジア起源の個体において、クラスＩのＭＨＣ分子はＨＬＡ−Ａ＊２４０２である
ように投与される個体の地域に依存して選択されることを特徴とする、１項から１２項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
１４：
１％未満の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子が、ＨＬＡ−Ｂ＊４２０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５９０１、ＨＬＡ−Ｂ＊６７０１、及びＨＬＡ−Ｂ＊７８０２を含む群から選択されることを特徴とする、１項から１３項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
１５：
β２−ミクログロブリンはヒトβ２−ミクログロブリンであり、１０％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子はヒトＨＬＡ−Ａ＊０２０１であることを特徴とする、１項から１４項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
１６：
抗原提示ドメインが、
（ｉ）ウイルス由来ペプチド、
（ｉｉ）β２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）可溶性ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子Ａ＊０２０１
又は
（ｉ）ウイルス由来ペプチド、
（ｉｉ）可溶性ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子Ａ＊０２０１
（ｉｉｉ）β２−ミクログロブリン
を含むことを特徴とする、１項から１５項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
１７：
β２−ミクログロブリンは配列番号７１のアミノ酸配列からなるか又は１から１０のアミノ酸の交換、付加、及び／又は欠失を含むその変異体であることを特徴とする、１項から１６項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
１８：
クラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３は、配列番号７２のアミノ酸配列からなるか又は１から１０のアミノ酸の交換、付加、及び／又は欠失を含むその変異体であることを特徴とする、１項から１７項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
１９：
抗原提示ドメインがＮからＣ末端の方向に
（ｉ）配列番号０１から配列番号７０を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するウイルス由来ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７７、７８、７９、８２、８３、及び８４を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第一リンカーペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を有するβ２−ミクログロブリン、
（ｉｖ）配列番号７７、７８、７９、８２、８３、及び８４を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第二リンカーペプチド、
（ｖ）配列番号７２のアミノ酸配列を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、及び
（ｖｉ）配列番号７３、７７、７８、７９、８２、８３、８４、及び１３６を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第三リンカーペプチド
を含むことを特徴とする、１項から１８項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
２０：
多機能タンパク質は、抗原提示ドメインがＮからＣ末端の方向に
（ｉ）配列番号０１から配列番号７０を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するウイルス由来ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７７、７８、７９、８２、８３、及び８４を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第一リンカーペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を有する又は１から１０のアミノ酸の交換、付加、及び／又は欠失を含むその変異体であるβ２−ミクログロブリン、
（ｉｖ）配列番号７７、７８、７９、８２、８３、及び８４を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第二リンカーペプチド、
（ｖ）配列番号７２のアミノ酸配列を有する又は１から１０のアミノ酸の交換、付加、及び／又は欠失を含むその変異体であるクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、及び
（ｖｉ）配列番号７３、７７、７８、７９、８２、８３、８４、１３６を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第三リンカーペプチド
を含むことを特徴とすることを特徴とする、１項から１９項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
２１：
− 第一リンカーペプチドは配列番号８２のアミノ酸配列を有し、及び／又は
− 第二リンカーペプチドは配列番号８３のアミノ酸配列を有し、及び／又は
− 第三リンカーペプチドは配列番号１３６のアミノ酸配列を有する
ことを特徴とする、２０項に記載の多機能タンパク質。
２２：
抗体Ｆｃ領域が、クラスＩｇＧ又はクラスＩｇＥのヒト抗体の抗体Ｆｃ領域から選択されることを特徴とする、１項から２１項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
２３：
抗体Ｆｃ領域が、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のヒト抗体の抗体Ｆｃ領域から選択されることを特徴とする、１項から２２項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
２４：
抗体Ｆｃ領域は、サブクラスＩｇＧ１又はＩｇＧ２のヒト抗体のものであり、そしてＥ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３６、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ａ３３０、及び／又はＰ３３１において少なくとも一の変異を含む（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従った番号付け）ことを特徴とする、１項から２３項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
２５：
抗体Ｆｃ領域は、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ、及び／又は変異Ｄ２６５Ａ及びＮ２９７Ａを有するヒトサブクラスＩｇＧ２又はサブクラスＩｇＧ１のヒト抗体のものであり、及び／又はＰＶＡ２３６変異を含み、及び／又は変異Ｐ３２９Ｇを含むことを特徴とする、１項から２４項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
２６：
抗体Ｆｃ領域が、変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ及び／又はＰ３２９Ｇを有するサブクラスＩｇＧ１のヒト抗体のものであることを特徴とする、１項から２５項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
２７：
抗体Ｆｃ領域が、変異Ｓ２２８Ｐ及び／又はＬ２３５Ｅを有するサブクラスＩｇＧ４のヒト抗体のものであることを特徴とする、１項から２５項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
２８：
第一及び第二抗体のＦｃ領域ポリペプチドは、配列番号８７から１０３を含む群からお互いに独立して選択されることを特徴とする、１項から２５項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
２９：
抗体Ｆｃ領域が、配列番号９４のアミノ酸配列を有する２つのＦｃ領域ポリペプチドを含むことを特徴とする、１項から２５項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
３０：
抗体Ｆｃ領域が、配列番号１００のアミノ酸配列を有する２つのＦｃ領域ポリペプチドを含むことを特徴とする、１項から２５項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
３１：
抗体Ｆｃ領域が、配列番号１０１のアミノ酸配列を有する２つのＦｃ領域ポリペプチドを含むことを特徴とする、１項から２５項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
３２：
抗体Ｆｃ領域が、配列番号８９のアミノ酸配列を有する第一のＦｃ領域ポリペプチド、及び配列番号９０のアミノ酸配列を有する第二のＦｃ領域ポリペプチドを含むことを特徴とする、１項から２５項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
３３：
抗体Ｆｃ領域が、配列番号９７のアミノ酸配列を有する第一のＦｃ領域ポリペプチド、及び配列番号９８のアミノ酸配列を有する第二のＦｃ領域ポリペプチドを含むことを特徴とする、１項から２５項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
３４：
抗体Ｆｃ領域が、配列番号１０２のアミノ酸配列を有する第一のＦｃ領域ポリペプチド、及び配列番号１０３のアミノ酸配列を有する第二のＦｃ領域ポリペプチドを含むことを特徴とする、１項から２５項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
３５：
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）β２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉ）１％未満の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
又は
（ｉ）１％未満の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、並びに
（ｉｉ）β２−ミクログロブリン、
又は
（ｉ）Ｔ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）β２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、
又は
（ｉ）Ｔ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、並びに
（ｉｉｉ）β２−ミクログロブリン
の何れかを含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− 厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する、少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とする多機能タンパク質。
３６：
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）Ｔ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）β２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− 厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する、少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とする多機能タンパク質。
３７：
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− 厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する、少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とする多機能タンパク質。
３８：
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９７のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９８のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する、少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とする多機能タンパク質。
３９：
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０３のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する、少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とする多機能タンパク質。
４０：
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９７のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９８のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− 配列番号１０４から１０６の群からのアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメイン、及び配列番号１０８から１１０の群からのアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメインを含み、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する、少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とする多機能タンパク質。
４１：
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０３のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合し、配列番号１０４から１０６の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖、及び配列番号１０８から１１０の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含む、少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とする多機能タンパク質。
４２：
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９７のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９８のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する二つの抗原結合部位であって、各々が配列番号１０５から１０７の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖、及び配列番号１１０から１１２の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含む、二つの抗原結合部位
を含むことを特徴とする多機能タンパク質。
４３：
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０３のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する、少なくとも一の抗原結合部位であって、配列番号１０５から１０７の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖、及び配列番号１１０から１１２の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、それによって抗体重鎖のＦｃ領域は、ジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドの一つとなる、少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とする多機能タンパク質。
４４：
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９７のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９８のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する、少なくとも一の抗原結合部位であって、配列番号１０４から１０６の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖、及び配列番号１０８から１１０の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、それによって抗体重鎖のＦｃ領域は、ジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドの一つとなる、少なくとも一の抗原結合部位
を含むことを特徴とする多機能タンパク質であって、
抗原提示ドメインは、可変ドメインの一つのＮ末端に連結している多機能タンパク質。
４５：
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０３のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する二つの抗原結合部位であって、各々が配列番号１０４から１０６の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖、及び配列番号１０８から１１０の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、それによって抗体重鎖のＦｃ領域は、ジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドとなる、二つの抗原結合部位
を含むことを特徴とする多機能タンパク質であって、
抗原提示ドメインは、可変ドメインの一つのＮ末端に連結している多機能タンパク質。
４６：
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９７のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号９８のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する二つの抗原結合部位であって、各々が配列番号１０５から１０７の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖、及び配列番号１１０から１１２の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、それによって抗体重鎖のＦｃ領域は、ジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドとなる、二つの抗原結合部位
を含むことを特徴とする多機能タンパク質であって、
抗原提示ドメインは、重鎖可変ドメインの一つのＮ末端に連結している多機能タンパク質。
４７：
− ＮからＣ末端方向に、
（ｉ）配列番号０１のＴ細胞応答誘発性ペプチド、
（ｉｉ）配列番号７１のβ２−ミクログロブリン、及び
（ｉｉｉ）配列番号７２のクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
を含む、厳密に一の抗原提示ドメイン
− ２つのジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドを含む、厳密に一の抗体Ｆｃ領域であって、そのうち、第一のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０２のアミノ酸配列を有し、第二のジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドは配列番号１０３のアミノ酸配列を有する厳密に一の抗体Ｆｃ領域、及び
− メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に特異的に結合する二つの抗原結合部位であって、各々が配列番号１０５から１０７の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体軽鎖、及び配列番号１１０から１１２の群からのアミノ酸配列を含む可変ドメインを有する抗体重鎖を含み、それによって抗体重鎖のＦｃ領域は、ジスルフィド結合Ｆｃ領域ポリペプチドとなる、二つの抗原結合部位
を含むことを特徴とする多機能タンパク質であって、
抗原提示ドメインは、重鎖可変ドメインの一つのＮ末端に連結している多機能タンパク質。
４８：
− 配列番号１１７又は１３７の一ポリペプチド鎖、
− 配列番号１１８の一ポリペプチド鎖、
− 各々配列番号１１９の２つのポリペプチド鎖
を含むことを特徴とする多機能タンパク質。
４９：
ＭＣＳＰ結合部位は、配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗体重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、１項から４８項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
５０：
ＭＣＳＰ結合部位は、配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗体重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、１項から４８項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
５１：
ＭＣＳＰ結合部位は、配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン；及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗体軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、１項から４８項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
５２：
ＭＣＳＰ結合部位は、配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗体重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、１項から４８項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
５３：
ＭＣＳＰ結合部位は、配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗体重鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、１項から４８項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
５４：
ＭＣＳＰ結合部位は、配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗体重鎖可変ドメイン；及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗体軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、１項から４８項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
５５：
ＭＣＳＰ結合部位が、配列番号１１４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン；及び配列番号１１３のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有する抗体軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、１項から４８項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
５６：
ＭＣＳＰ結合部位が、配列番号１１４の抗体重鎖可変ドメイン；及び配列番号１１３の抗体軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、１項から４８項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
５７：
ＭＣＳＰ結合部位が、配列番号１１４及び配列番号１１３を含むことを特徴とする、１項から４８項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
５８：
ＭＣＳＰ結合部位が、配列番号１１６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有する抗体重鎖可変ドメイン；及び配列番号１１５のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％配列同一性を有する抗体軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、１項から４８項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
５９：
ＭＣＳＰ結合部位が、配列番号１１６の抗体重鎖可変ドメイン；及び配列番号１１５の抗体軽鎖可変ドメインを含むことを特徴とする、１項から４８項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
６０：
ＭＣＳＰ結合部位が、配列番号１１６及び配列番号１１５を含むことを特徴とする、１項から４８項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
６１：
１項から６０項の何れか一項に記載の多機能タンパク質をコードする核酸。
６２：
６１項に記載の核酸を含む宿主細胞。
６３：
１項から６０項の何れか一項に記載の多機能タンパク質及び任意で薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤。
６４：
医薬として使用のための１項から６０項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
６５：
がんの治療における使用のための１項から６０項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
６６：
個体のウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞を標的に誘引することにおける使用のための１項から６０項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
６７：
がん細胞又はウイルス感染細胞の除去に使用のための１項から６０項の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
６８：
以下の工程：
− ６１項に記載の核酸を含む真核細胞を培養し、及び
− 細胞又は培養培地から多機能タンパク質を回収する
工程を含む、多機能タンパク質が、β２−ミクログロブリン及びクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３を含む厳密に一の抗原提示ドメインを含む、１項に記載の多機能タンパク質の組換え産生の方法。
６９：
医薬の製造における１項から６０項の何れか一項に記載の多機能タンパク質の使用。
７０：
医薬はがんの治療用である、６９項に記載の使用。
７１：
医薬は標的に対して個体のウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘引するためである、６９項に記載の使用。
７２：
医薬はがん細胞の除去のためである、６９項に記載の使用。
７３：
個体のウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞を標的に誘引するために、１項から６０項の何れか一項に記載の多機能タンパク質の有効量を個体に投与することを含む、個体のウイルス特異的細胞障害性Ｔ細胞を個体における標的に誘引する方法。
７４：
がん細胞を除去するために１項から６０項の何れか一項に記載の多機能タンパク質の有効量を個体に投与することを含む、個体においてがん細胞を除去する方法。
前述の発明は、明瞭な理解のために説明及び例として幾らか詳細に記載したが、説明及び実施例は、発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用した全ての特許及び科学文献の開示は、出典明記によってその全体を明瞭に引用する。
Ｖ．実施例
以下は本発明の方法及び組成物の例である。種々の他の実施態様は、上記に示す一般的な説明を前提として実施することができることが理解される。
実施例１
ヒトドナーからのＣＭＶ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の単離及び刺激のための手順
ＰＢＬ（複数）の単離
ＰＢＬは、ヒトのドナーの血液からフィコール勾配遠心分離により単離された（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ、カタログ番号２２７２９０）。ＰＢＬは５％のヒト血清（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ２５２０）、２ｍＭのＬグルタミン（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号Ｐ０４−８０１００）、１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１４００１１００）を補充されたＲＰＭＩ中で培養された。
ＰＢＬ（複数）の刺激
細胞（２×１０７細胞／ｍｌ）は、５０μｇ／ｍｌのＣＭＶ ｐｐ６５由来ペプチド（配列番号０１）を補充した細胞培養培地中で、細胞培養条件下で（３７℃、５％ＣＯ２、８０％湿度）２時間培養された。その後、細胞懸濁液を培養培地で２０倍希釈し、９６のウェル当たり２×１０５細胞の播種密度で平底９６ウェルプレート中で培養した。４から５日後、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１０１１４５６００１）、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００−０１）及び２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００−１５）が添加され、細胞は更に７〜８日間培養された。Ｔ細胞の刺激は、細胞クラスターとして顕微鏡下で目に見える。
ＰＢＬ（複数）の再刺激
Ｔ細胞は、ペプチドをパルスした同じドナーの自己の一次ＰＢＬ（新たに調製され又は凍結ストックから由来したのいずれか）である刺激細胞と共に培養された。刺激細胞は、上記のようにペプチドでパルスされた。ペプチドのインキュベーションの２時間後に、ＰＢＬを放射線照射し（４０００ラド；ＳＴＳ ＧｍｂＨ ＯＢ２９ Ｎｒ．９５１０−５）、ペプチドを含まない培養培地中で２回洗浄した。再刺激は、９６ウェルプレートの丸底プレート中で行われた。９６ウェルあたり、８×１０４から１×１０５の刺激細胞が使用された。初代培養からの細胞を培養培地で２回洗浄し、２００μｌの培養培地中に再懸濁し、８０μｌを刺激細胞の各ウェルに移した。３日後、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７及び２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５が添加された。細胞は増殖し、新鮮な培地を使用して新しいウェル中で２〜３日ごとに増殖された。
Ｔ細胞の分析
細胞は、ＣＤ８の発現（ＢＤ、カタログ番号３４５７７２）及びＣＭＶ特異的Ｔ細胞受容体（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ、カタログ番号Ｆ００８−４Ａ−Ｅ）について染色され、ＦＡＣＳで分析された。
細胞培養培地
ＲＰＭＩ１６４０（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ，カタログ番号Ｐ０４−１７５００）、５％のヒト血清（ＨＳ；Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｈ２５２０）、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号Ｐ０４−８０１００）、１００μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１４００１１００）。
結果
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）に由来する４人のヒトドナーのＦＡＣＳ分析が行われた。細胞は、ＡＰＣ結合Ｐｒｏ５五量体（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ、カタログ番号Ｆ００８−４Ａ−Ｅ）と組み合わされたＦＩＴＣ結合抗ＣＤ８抗体（ＢＤ、カタログ番号３４５７７２）で標識され、ＣＭＶ由来ペプチド（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号０１））を負荷されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を認識するＭＨＣ−クラスＩ（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１）を担持するＴ細胞を染色した。結果は図４を参照。第０日に、ドナー１と４は少数のＣＭＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を保有する（それぞれ０．０８％と０．１％）。ドナー２と３は、より多くのＣＭＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞を末梢血中に保有する（それぞれ０．２５％と３．１２％）。ＣＭＶ由来ペプチドでパルスした自己細胞による刺激の１４日後、ドナー２と３のみがＣＭＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の有意な増加を示し（それぞれ６．２％と７１．２％）、一方ドナー１と４はＣＭＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞数の増加を示していない（それぞれ０．０１％と０．０５％）。ＣＭＶ由来ペプチドでパルスした自己細胞による二次刺激の１４日後、ドナー２と３はＣＭＶ特異的ＣＤ８Ｔ細胞の更なる増加を示している（それぞれ１５．１％と９６．６％）。
実施例２
細胞毒性試験
急性リンパ芽球性白血病細胞ＭＮ６０は、Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−対立遺伝子を保有する。ＭＮ６０細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）は、５０μｇ／ｍｌのＣＭＶ ｐｐ６５ペプチド（配列番号０１）と共に細胞培養条件下で（３７℃、５％ＣＯ２、８０％湿度）４５分間インキュベートされた。インキュベーションによってＨＬＡ−Ａ＊０２０１ペプチド結合の溝においてペプチド交換を生じる。ペプチド交換したＭＮ６０細胞は遠心分離されＰＢＳ（ＰａｎＢｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号Ｐ０４−３６５００）で１×１０６細胞／ｍｌの密度へ希釈され、１μＭの細胞トレーサーカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３４５５４）で、室温（ＲＴ）で１５分間染色された。細胞はその後ＰＢＳで一回洗浄され、ＡＩＭ−Ｖ培地で１×１０５細胞／ｍｌに希釈された（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号０８７０１１２ＤＫ）。アッセイにおいて、ＭＮ６０細胞（標的細胞）は、９６ウェル丸底プレート中で、ＣＭＶ特異的ヒトドナー３由来のＣＤ８＋Ｔ細胞（エフェクター細胞、実施例１を参照のこと）と細胞培養条件下で４時間共培養された。標的細胞に対するエフェクター比は４：１であった。死滅細胞は、１μｌ／１００μｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ−４８６４）で染色され、ＦＡＣＳで分析された。
結果
ＣＭＶペプチドを負荷されたＭＮ６０腫瘍細胞の溶解を介する刺激されたＣＴＬの細胞溶解能力を分析するためにフローサイトメトリー分析が行われた。
ＣＭＶ由来ペプチドを負荷されていないＭＮ６０細胞の共培養が行われた。ＭＮ６０細胞は、ＦＩＴＣ陽性である。エフェクター細胞は、ＦＩＴＣ−陰性である。死滅細胞は、ＰＩ陽性であり、生細胞は、ＰＩ陰性である。ＣＭＶ由来ペプチドを負荷されていない場合、ＭＮ６０細胞の８５％以上が生存している（Ｑ２及びＱ４）。
ＣＭＶ由来ペプチドを負荷されたＭＮ６０細胞の共培養が行われた。ＭＮ６０細胞の８０％以上が死滅しており（Ｑ２及びＱ４）、一方生存エフェクター細胞と死滅エフェクター細胞の比率はＦＡＣＳ分析の間で有意に変化しておらず、ＣＭＶ−ペプチド負荷標的細胞の特異的溶解を示している。
エフェクター対標的細胞の比率に依存する、ＣＭＶペプチドを負荷されたＭＮ６０腫瘍細胞の溶解を介する刺激されたＣＴＬの細胞溶解能力を分析するためのフローサイトメトリー分析。
細胞毒性アッセイは上述のように実施した。エフェクター細胞と標的細胞の様々な比を、標的細胞あたり０．５エフェクター細胞から標的細胞あたり４エフェクター細胞の範囲で適用した。インキュベーション時間は４時間であった。ＣＭＶ由来ペプチドを負荷されなかったＭＮ６０細胞は、エフェクター対標的の比率が増加し、即ち、０．５：１から４：１の比率を伴い８％から１３％まで、死滅細胞の数の増加を示していない。
ＣＭＶ由来ペプチドを負荷されたＭＮ６０細胞のほぼ２０％は、４時間以内にエフェクターの標的に対する比率が０．５：１と低く、すでに死滅している。死滅した細胞の数は、エフェクター対標的の比率の増加に伴い急激に増加し、標的細胞あたりのエフェクター細胞の比率が４：１で最大８３％にまで達する。
実施例３
ＤＮＡの調製、トランスフェクション、発現、精製及び分析
ＤＮＡの調製
一晩の細菌ＬＢ培養液２５０ｍｌが回収され、プラスミドＤＮＡが、製造業者のプロトコールに従って抽出された（Ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ Ｍａｘｉ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１２６６３）。得られたプラスミドＤＮＡは１ｍｌのＴＥ緩衝液中に溶出され、ＤＮＡ濃度が分光光度測定により測定された（Ｅｐｏｃｈ、ＢｉｏＴｅｋ）。
最終的な発現ベクターは、以下の要素を含んでいた。
−エンドヌクレアーゼ制限部位 ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、
−ＣＭＶ−プロモーター、
−５’ＵＴＲ １（ヒトＣＭＶから由来）、
−イントロンＡ、
−５’ＵＴＲ ２、
−アンピシリン耐性遺伝子、
−ＢＧＨポリＡ部位（ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル）、
−ｐＵＣ Ｏｒｉ
Figure 2015537043
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トランスフェクション
ＨＥＫ２９３細胞は、トランスフェクションの前日に８×１０５細胞／ｍｌに希釈された。約１〜１．６×１０６細胞／ｍｌが、製造業者のプロトコールに従ってトランスフェクトされた。３０ｍｌの最終トランスフェクション容積に対して、３０μｇのＤＮＡがＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ 還元型血清培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号３１９８５０７０）により最終容量１ｍｌに希釈された。１μｇのＤＮＡあたり２μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２３４７０１９）が、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地で１ｍｌの最終容量に均等に希釈され、５分間インキュベートされた。インキュベーションの後、希釈されたＤＮＡは、希釈された２９３ｆｅｃｔｉｎＴＭ試薬に添加され、穏やかに混合され、更に２０〜３０分間インキュベートされ、その後ＨＥＫ２９３細胞の２８ｍｌに滴下ピペッティングされ、３０ｍｌの最終容量を得た。細胞は、１２５ｒｐｍで回転するオービタルシェーカーで細胞培養条件下（３７℃、８％ＣＯ２、８０％湿度）でインキュベートされ、７２時間後に回収された。回収物は、１０００ｒｐｍで１０分間、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離され、２２μｍの滅菌フィルターを通して濾過された（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＳＣＧＰＵ０５ＲＥ）。
ウェスタンブロッティング
細胞培養上清の５００μｌが、ポールナノセップオメガメンブレン３０ＫＤ遠心分離デバイス（Ｐａｌｌ、カタログ番号ＯＤ０３０Ｃ３３）を用いて５０μｌの容量にまで濃縮された。各濃度の１７．５μｌは、４×ＸＴサンプルバッファー（Ｂｉｏ Ｒａｄ、カタログ番号１６１−０７９１）及び２０×ＸＴ還元剤（ＢｉｏＲａｄ、カタログ番号１６１−０７９２）で最終容量２５μｌにまで希釈され、９６℃で８分間加熱され、４〜１２％のクライテリオンＸＴプレキャストゲル（カタログ番号３４５−０１２４）へ適用された。ブロッティングは、トランスブロットピュアニトロセルロース膜（０．４５μｍ）（ＢｉｏＲａｄ、カタログ番号１６２−０１１７）上で、２０Ｖで３０分間、トランスブロットＳＤセミドライトランスファーセル（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行われた。膜のブロッキングは、室温で１時間、１Ｘウエスタンブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１１９２１６８１００１）を用いて行われた。染色は、室温で１時間、ペルオキシダーゼ結合ポリクローナルウサギ抗ヒトκ軽鎖（ＤＡＫＯ、カタログ番号Ｐ０１２９、１：３０００に希釈）、及びポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体ＨＲＰコンジュゲート（ＤＡＫＯ、カタログ番号Ｐ０２１４、１：５０００に希釈）を用いて行われた。発光検出はＬＵＭＩ−イメージャＦ１（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行われた。
精製
細胞を遠心分離によって培地から取り出した。多機能タンパク質は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＡＫＴＡ−Ａｖａｎｔ上のＭａｂＳｅｌｅｃｔセファロース）により上清から精製された。溶出された多機能タンパク質は、アミコン遠心チューブを用いて３ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に濃縮された。アリコートを、サイズ排除クロマトグラフィーで分析した（ＨＰＬＣ ＴＳＫｇｅｌ ＧＦＣ３００ Ｓｙｓ８９）。凝集物を除去するために、スーパーデックス２００上で分取ＳＥＣが行われ、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０の中に融合タンパク質をバッファリングした。溶出された多機能タンパク質は、アミコン遠心管を用いて１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に濃縮され、滅菌濾過された（０．２μｍのポアサイズ）。
分析論
多機能タンパク質サンプルは、ＵＶ分光光度計を用いてＯＤ２８０により分析され、溶液中のタンパク質濃度を決定した。このために必要な吸光係数は、Pace, C.N., et al., Protein Science 4 (1995) 2411-2423に記載のアミノ酸配列から計算された。サンプル中において単量体で、凝集し、分解した種の含有量を決定するために、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）が、移動相として、０．２５ＭのＫＣｌ、ｐＨが７．０を含む０．２Ｍのリン酸カリウム緩衝液を用いて、ＴＳＫ−Ｇｅｌ３００ＳＷＸＬ又はスーパーデックス２００カラムで行われた。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（還元及び非還元）が、製品関連の分解生成物及び無関係な不純物に関して、多機能タンパク質製剤の純度を分析するために行われた。エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を、還元され（ＴＣＥＰ）、脱グリコシル化した（Ｎ−グリコシダーゼＦ）のサンプルを用いて行い、各鎖の正確な質量／同一性を確認し、化学的修飾を検出した。脱グリコシル化されたサンプルのＥＳＩ−ＭＳを行い、完全に構築されたタンパク質の性質と質を分析し、生成物に関連する潜在的な副生成物を検出するために行った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色の方法
デバイス：インビトロジェン ＸＣｅｌｌ Ｓｕｒｅ Ｌｏｃｋ Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ
ゲル：４−２０％のトリス−グリシンゲル、インビトロジェン ＥＣ６０２５ＢＯＸ
緩衝液：トリス−グリシンＳＤＳランニングバッファー（１０×）、インビトロジェン ＬＣ２６７５−５
サンプルバッファー：トリス−グリシンＳＤＳランニングバッファー（２×）、インビトロジェン ＬＣ２６７６
還元緩衝液：ＮｕＰＡＧＥ サンプル還元剤（１０×）、インビトロジェン ＮＰ０００４
分子量マーカー：マーク１２、分子量標準、インビトロジェン ＬＣ５６７７
タンパク質サンプル調製
サンプルは緩衝液により１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に調整された。サンプルの還元のために以下の手順が行われた：
− 還元緩衝液：４ｍｌのサンプルバッファー（２×）及び１ｍｌの還元緩衝液（１０×）、
− サンプルを１：１に還元緩衝液で希釈する、
− ７０℃で５分間インキュベートする。
ゲル電気泳動は、９０分間１２５Ｖで行った。ゲルはＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＬＣ６０６５）で染色された。
結果
Figure 2015537043
Figure 2015537043
Figure 2015537043
前の表による番号１、２Ａ及び３Ａに対応する構造を有する選択された多機能タンパク質のクーマシー染色によるＳＤＳゲル及び対応するＳＥＣクロマトグラムを図５と６に示す。定義された多機能タンパク質が得られることが分かる。
実施例４
ヒトＩＧＦ−１Ｒ陽性細胞株に対するＭＨＣ−Ｉ−抗ＩＧＦ−１Ｒの結合
Ｈ４６０Ｍ２細胞は、ＡＩＭ−Ｖ培地中で８×１０５細胞／ｍｌに希釈された（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号０８７０１１２ＤＫ）。細胞懸濁液５００μｌが、本明細書に報告されるように４℃又は３７℃の何れかで１時間、１０μｇのＭＨＣ−Ｉ−抗ＩＧＦ−１Ｒ多機能タンパク質を用いて染色された。その後、細胞は氷冷したＡＩＭ−Ｖ培地を用いて１回洗浄され、Ｒ−ＰＥにコンジュゲートしたヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体である（Ｄｉａｎｏｖａ、カタログ番号１０９−１１６−０８８、希釈１：５０）第二の抗体を用いて４℃で３０分間染色された。その後、細胞は氷冷ＡＩＭ−Ｖ培地を用いて１回洗浄され、蛍光は、生細胞をゲーティングしてＦＡＣＳカントＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を介して測定された。二重特異性抗体は、アイソタイプ対照として役割を果たし、抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体（例えば国際公開第２００４／０８７７５６号及び国際公開第２００７／１１５８１４号を参照）は陽性対照として役割を果たした。
結果
ＰＥ−蛍光測定のシフト（Ｘ軸）を考慮すると、本明細書で報告されるようにＭＨＣ−Ｉ−抗ＩＧＦ−１Ｒ多機能タンパク質は、対照抗体と比較してＨ４６０Ｍ２標的細胞への結合には目に見える違いを示さない。また、ＭＨＣ−Ｉ−抗ＩＧＦ−１Ｒ多機能タンパク質によるインキュベーションが４℃で又は３７℃で成し遂げられるかによらず違いは無かった。アイソタイプ対照との又は蛍光標識した二次抗体のみでのインキュベーションのどちらもＰＥの蛍光測定にいかなるシフトをも示さない。クラスＩのＭＨＣ分子の融合にも関わらず、本明細書のＭＨＣ−Ｉ−抗ＩＧＦ−１Ｒ多機能タンパク質の抗体可変ドメインはなおＨ４６０Ｍ２標的細胞へ結合する。
実施例５
抗原発現細胞のインビトロでの除去
Ｉ２４標的細胞（１×１０５細胞／ｍｌ）が、２４から４８時間かけてウィルコガラスボトムディッシュ（ＦＡ． ＷｉｌｌＣｏ Ｗｅｌｌｓ ＢＶ、ＲＥＦ ＧＷＳＴ−３５２２）上で細胞培養培地（２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、及び１０％（ｖ／ｗ）ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ １６４０）に播種された。ウィルコガラスボトムディッシュは、５０μｇ／ｍｌのポリ−Ｌ−リジン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ２６５８）で皿当たり３０分間予めコーティングされた。皿をコーティングした後に、徹底的に滅菌組織培養グレードの水でリンスし、２時間乾燥した。
培養後、細胞培養培地は除去され、一の［ＣＭＶ−ｐｐ６５−ペプチド］−［リンカー１］−［β２−ミクログロブリン］−［リンカー２］−［ＨＬＡ−Ａ−α１−α２−α３］−［リンカー３］−［ホール変異を有するＩｇＧ１−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体］融合ポリペプチド、一のＩｇＧ１−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体Ｆｃ領域ノブ変異体ジスルフィド結合ポリペプチド及び一のＩｇ軽鎖を含んでなるＩＧＦ−１Ｒ結合多機能タンパク質であって、本明細書に報告されるようにヒトＩＧＦ−１Ｒへ特異的に結合する多機能タンパク質（実施例３を参照）が、３ｍＭのＫ＋クレブスリンガーＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．３（０．５ｍＭのＤＬ−ジチオスレイトール、１ｍＭのアスコルビン酸、及び４ｍＭのグルタチオンを補充した）中で５μｇ／ｍｌの最終濃度になるよう添加された。
Ｔ細胞は標的細胞対エフェクター細胞比を１：１０で添加された。イメージングはツァイスのＡｘｉｏｖｅｒｔ１３５顕微鏡で４時間行われた。
結果
ＩＧＦ−１Ｒ結合多機能タンパク質は、ヒトＩＧＦ−１Ｒ発現Ｉ２４ ３Ｔ３細胞（大きな接着して増殖する細胞）の溶解を媒介した。溶解は、ヒトＭＶ特異的Ｔ細胞によって媒介される（各円形の小細胞、又はアメーバ状に移行する細胞）。Ｉ２４細胞は５μｇ／ｍｌの濃度での多機能タンパク質、及び（ＨＬＡ−Ａ０２０１＋／ＣＭＶペプチドパルス化ＡＰＣで予め活性化された）ヒトＣＭＶ特異的Ｔ細胞とインキュベートされた。５６分及び７６分でのＴ細胞とのＩ２４細胞の相互作用、及びその後１２５分後でのＩ２４細胞の崩壊に注意のこと。
本明細書に報告される抗原結合多機能タンパク質の欠如の下、ヒトＣＭＶ特異的Ｔ細胞（各円形の小細胞、又はアメーバ状に移行する細胞）によるＩ２４ ３Ｔ３細胞（大きく粘着性に増殖している細胞、白い矢印）の溶解の欠如を示す対照が行われた。Ｉ２４細胞は（ＨＬＡ−Ａ０２０１＋／ＣＭＶペプチドパルス化ＡＰＣで予め活性化された）特異的細胞傷害性Ｔ細胞とともにインキュベートされる。時間の経過は、それぞれの画像の下に表示される。
実施例６
細胞毒性試験
細胞培養培地（５０μｌ）を、バックグラウンド測定を行うためＸｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ９６ウェルＥ−プレート（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０５２３２３６８００１）の各ウェルにピペッティングした。
Ｉ２４細胞は、細胞培養培地中（ＲＰＭＩ １６４０、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭのＮＥＡＡ、１０％（ｗ／ｖ）のＦＣＳ）で１×１０６細胞／ｍｌに希釈され、５０μｌ（２×１０４細胞／ウェル）をＸｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ９６ウェルプレートの各ウェルに最終容量１００μｌにピペッティングし、２４時間培養した（３７℃、８％ＣＯ２、８０％湿度）。２４時間後、培地は除去され、細胞は２００μｌのＡＩＭ−Ｖ（無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）Ｔ細胞培地（カタログ番号）：１２０５５−０８３）培地で洗浄された。一の［ＣＭＶ−ｐｐ６５−ペプチド］−［リンカー１］−［β２−ミクログロブリン］−［リンカー２］−［ＨＬＡ−Ａ−α１−α２−α３］−［リンカー３］−［ホール変異を有するＩｇＧ１−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体］融合ポリペプチド、一のＩｇＧ１−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体Ｆｃ−領域ノブ変異体ジスルフィド結合ポリペプチド及び一のＩｇ軽鎖を含んでなるＩＧＦ−１Ｒ結合多機能タンパク質であって、ヒトＩＧＦ−１Ｒへ特異的に結合する多機能タンパク質が、洗浄された標的細胞に、ＡＩＭ−Ｖ培地中で最終濃度１μｇ／ｍｌになるよう添加された。エフェクター細胞がかなりの比率で１５０μｌの最終容量となるまでＡＩＭ−Ｖ培地に添加された。ヒトＩＧＦ−１Ｒに対して指向されるアフコシル化ＩｇＧ１モノクローナル抗体（抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体−アフコシル化）及び非結合ヒト抗ジゴキシゲニン抗体（抗ジゴキシゲニン抗体）はそれぞれ、アイソタイプ対照体及び特異的抗体対照体とした。測定はｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステム（Ｒｏｃｈｅ）によりそれぞれ６から９時間行った。
結果
ＩＧＦ−１Ｒ結合多機能タンパク質は、ヒトＣＭＶ特異的Ｔ細胞を介してＨ４６０Ｍ２の腫瘍細胞の溶解を引き起こす。
腫瘍細胞は、一の［ＣＭＶ−ｐｐ６５−ペプチド］−［リンカー１］−［β２−ミクログロブリン］−［リンカー２］−［ＨＬＡ−Ａ−α１−α２−α３］−［リンカー３］−［ホール変異を有するＩｇＧ１−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体］融合ポリペプチド、一のＩｇＧ１−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体Ｆｃ−領域ノブ変異体ジスルフィド結合ポリペプチド及び一のＩｇ軽鎖を含んでなる多機能タンパク質であって、ヒトＩＧＦ−１Ｒ、及び特異的Ｔ細胞へそれぞれの比率（１：１．５から１：０．５）で特異的に結合する多機能タンパク質の１μｇ／ｍｌとともに４時間インキュベートされた（図８を参照）。溶解のパーセンテージは、各棒の上に示されている。ヒトＩＧＦ−１Ｒ（ＭＡＢ ＩＧＦ−１Ｒ−ａｆｕ）に対して指向されるアフコシル化ＩｇＧ１モノクローナル抗体は有意な腫瘍細胞溶解を引き起こさなかった。
本明細書に報告される多機能タンパク質は、ヒトＣＭＶ特異的Ｔ細胞を介してＩ２４ ３Ｔ３腫瘍細胞の溶解を引き起こす。
標的細胞は、一の［ＣＭＶ−ｐｐ６５−ペプチド］−［リンカー１］−［β２−ミクログロブリン］−［リンカー２］−［ＨＬＡ−Ａ−α１−α２−α３］−［リンカー３］−［ホール変異を有するＩｇＧ１−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体］融合ポリペプチド、一のＩｇＧ１−Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異体Ｆｃ−領域ノブ変異体ジスルフィド結合ポリペプチド及び一のＩｇ軽鎖を含んでなる抗原結合多機能タンパク質であって、ヒトＩＧＦ−１Ｒ、及び特異的Ｔ細胞へそれぞれの比率（１：１．５から１：０．５）で特異的に結合する多機能タンパク質の１μｇ／ｍｌとともに４時間インキュベートされた（図９を参照）。溶解のパーセンテージは、各棒の上に示されている。ヒトＩＧＦ−１Ｒに対して指向されるアフコシル化ＩｇＧ１モノクローナル抗体（抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体−アフコシル化）及び非結合ヒト抗ジゴキシゲニン抗体（抗ジゴキシゲニン抗体）は標的細胞の著しい溶解を引き起こさなかった。
実施例７
インビトロの有効性
ＩＧＦ−１Ｒ陽性の肺腺癌細胞株Ｈ４６０Ｍ２は、ｈＣＭＶ由来ペプチド及び抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体及びヒトＣＭＶ−特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、エフェクター細胞対標的細胞の低比率（腫瘍細胞あたり１．５から０．５特異的Ｔ細胞）で含んでなる多機能タンパク質の１μｇ／ｍｌとインキュベートされた。対照抗体は、糖操作型抗ＩＧＦ−１Ｒ抗体であった。インキュベーション時間は６時間であった。多機能タンパク質とのインキュベーションは、Ｈ４６０Ｍ２腫瘍細胞の強力な除去をもたらした。
実施例８
異なるＭＨＣ−Ｉ−抗ＭＣＳＰ多機能タンパク質のＭＣＳＰ陽性標的細胞への結合
Ｃｏｌｏ３８細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＰＡＡ、カタログ＃Ｌ１１−００７）とともに５分間インキュベートされ、単一細胞懸濁液を得た。バイアルあたり２×１０５細胞が、４℃で、４５分間、１００μｌのＰＢＳ／２％ＦＣＳ中で１μｇ／ｍｌのＭＨＣ−Ｉ−抗ＭＣＳＰ多機能タンパク質と共にインキュベートされた。インキュベーション後に、細胞は１ｍｌの冷却ＰＢＳ／２％ＦＣＳで洗浄され、９１０ｒｐｍで７分間遠心分離された。細胞は二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ１抗体ＰＥコンジュゲート、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ．、カタログ＃１０９−１１６−０８８）を２μｇ／ｍｌと共に１００μｌのＰＢＳ／２％ＦＣＳ中に再懸濁され、更に４℃で４５分間インキュベートされた。細胞は１ｍｌのＰＢＳ％２％ＦＣＳで２回洗浄され、ＢＤカントＩＩフローサイトメーターを用いて測定された。結果を図７に示す。
実施例９
ＭＨＣ−Ｉ−抗ＭＣＳＰ多機能タンパク質とのＭＣＳＰ陽性細胞のインキュベーション
Ｃｏｌｏ３８細胞又はＷＭ２６６−４細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＰＡＡ、カタログ＃Ｌ１１−００７）とともに５分間インキュベートされ、単一細胞懸濁液を得た。ウェルあたり、Ｃｏｌｏ３８細胞株の２×１０４個の細胞又はＷＭ２６６−４細胞の１×１０４個の細胞が、１００μｌのそれぞれの細胞培養培地（Ｃｏｌｏ３８細胞株：２ｍＭグルタミン、１０％ＦＣＳを補充したＲＰＭＩ１６４０；ＷＭ−２６６−４細胞株：２ｍＭグルタミン、１０％ＦＫＳ、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＮＥＡＡを補充したＲＰＭＩ１６４０）を含むＥｐｌａｔｅｓ９６（Ｒｏｃｈｅ、カタログ＃０５２３２３６８００１）中で２４時間インキュベートされ、密着性（インピーダンス）はＡＣＥＡ技術を用いて１５分毎に測定された（Ｘｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ）。２４時間後（平静な増殖期）、細胞はＡＩＭＶ培地２００μｌで洗浄された（Ｇｉｂｃｏ、カタログ＃０８７０１１２ＤＫ）。ＭＨＣ−Ｉ−抗ＭＣＳＰ多機能タンパク質は、細胞に対して、ＡＩＭＶ培地中で１５０μｌの最終容量まで、異なる比率の刺激されたＴ細胞又はＰＢＭＣと共に、１μｇ／ｍｌの最終濃度になるよう添加された。インキュベーションは、５分おきに同時ＡＣＥＡ測定により更に４から４８時間続けられた。読み出しは、Ｅｐｌａｔｅ底から剥離された溶解又は崩壊した細胞を検出するインピーダンス測定に基づいている。細胞指数は、多機能タンパク質の添加後の最初の測定点で１に正規化されている。１μｇ／ｍｌの多機能タンパク質の濃度（ＭＨＣＩ−０００８（１）、ＭＨＣＩ−００１０（２）、ＭＨＣＩ−００３０（３）、ＭＨＣＩ−００３１（４））、エフェクター対標的細胞の比は１０：１；ドナー３由来のＰＢＭＣ（２０００００細胞、ドナー３はＣＭＶ陽性であるがＥＢＶ陰性である）及びメラノーマ腫瘍細胞株Ｃｏｌｏ３８（２００００細胞）、９６ウェルあたりで、データはｔｒｉｐｌｉｃａｔｅである結果が図１４に示される。１μｇ／ｍｌの多機能タンパク質の濃度（ＭＨＣＩ−０００８（１）、ＭＨＣＩ−００１０（２）、ＰＢＭＣのみ（３））、エフェクター対標的細胞の比は１０：１；ドナー３由来のＰＢＭＣ（２０００００細胞、ドナー３はＣＭＶ陽性であるがＥＢＶ陰性である）及びメラノーマ腫瘍細胞株Ｃｏｌｏ３８（２００００細胞）、９６ウェルあたりで、データはｔｒｉｐｌｉｃａｔｅである結果が図１５Ａ（Ｃｏｌｏ３８）及び１５Ｂ（ＷＭ２６６）に示される。
実施例１０
細胞毒性試験
細胞培養培地（５０μｌ）が、バックグラウンド測定を行うためＸｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ９６ウェルＥ−プレート（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号０５２３２３６８００１）の各ウェルにピペッティングされた。
Ｃｏｌｏ３８細胞は、細胞培養培地中（２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％のＦＣＳを補充したＲＰＭＩ１６４０）で１×１０６細胞／ｍｌに希釈され、５０μｌ（２×１０４細胞／ウェル）が、Ｘｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ９６ウェルプレートの各ウェルに最終容量１００μｌにピペッティングされ、２４時間培養された（３７℃、８％ＣＯ２、８０％湿度）。２４時間後、培地は除去され、細胞は２００μｌのＡＩＭ−Ｖ（無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）Ｔ細胞培地（カタログ番号）：１２０５５−０８３）培地で洗浄された。ＭＣＳＰ結合多機能タンパク質ＭＨＣＩ−０００８（一価、ＣＭＶペプチド負荷型）、ＭＨＣＩ−００１０（一価、ＥＢＶペプチド負荷型対照）、ＭＨＣ−００２６（二価、ＣＭＶペプチド負荷型、非結合対照）、ＭＨＣＩ−００３０（一価、ＣＭＶペプチド負荷型、活性）とＭＨＣＩ−００３１（二価、ＣＭＶペプチド負荷型、活性）が、洗浄された標的細胞に対して、ＡＩＭ−Ｖ培地中で１μｇ／ｍｌの最終濃度になるように別個に添加された。エフェクター細胞は、１０：１（Ｅ：Ｔ）のかなりの比率で１５０μｌの最終容量となるまでＡＩＭ−Ｖ培地に添加された。測定は、Ｘｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅシステム（Ｒｏｃｈｅ）により添加後４２時間行われた。
２００００個の付着性Ｃｏｌｏ３８細胞（９６ウェルプレートにｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）と共培養された、ドナー３から単離されたばかりの２０００００個のＰＢＭＣ（エフェクター細胞）に対して得られた結果が、図１６に示される（多機能タンパク質とのインキュベーションの４２時間後の細胞の溶解）。ＰＢＭＣの２５％がＣＤ８陽性Ｔ細胞であり、そのうち今度は３％がＣＭＶ−ｐｐ６５−ペプチド特異的であり、２００００個のＣｏｌｏ３８標的細胞当たり、およそ１５００個のＣＭＶ−ｐｐ６５−ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を生じる（実際のＥ：Ｔ（エフェクターと標的細胞の比率）＝１：１３）。
結果
ＭＣＳＰ結合多機能タンパク質は、ヒトＣＭＶ特異的Ｔ細胞を介してＣｏｌｏ３８腫瘍細胞の溶解を引き起こす。
実施例１１
サイトカイン放出アッセイ
ＡＣＥＡプレートは、９１０ｒｐｍで７分間遠心分離された。ＡＣＥＡ上清５０μｌが、別の９６ウェル平底プレートに移された（Ｃｏｓｔａｒ）。ＬＤＨ試薬（細胞毒性検出キット、Ｒｏｃｈｅ、カタログ＃１１６４４７９３００１）１及び２が、製造者の指示に従って希釈され、溶液の５０μｌが上清に添加された。吸収は、テカンリーダーサンライズ（Ｔｅｃａｎ）で５から２５分間のインキュベーション時間後に検出された。遠心分離の前に、全溶解は、標的細胞に対する１％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｔ−８７８７）の添加によって検出される。
２００００個の付着性Ｃｏｌｏ３８細胞（９６ウェルプレートにｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）と共培養された、ドナー３から単離されたばかりの２０００００個のＰＢＭＣ（エフェクター細胞）に対して得られた結果が、図１７に示される（多機能タンパク質とのインキュベーションの４８時間後のＬＤＨ放出）。ドナー３から単離されたばかりの２０００００個のＰＢＭＣが、２００００個の付着性Ｃｏｌｏ３８細胞と共に共培養された（９６ウェルプレートにｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）。ＰＢＭＣの２５％がＣＤ８陽性Ｔ細胞であり、そのうち今度は３％がＣＭＶ−ｐｐ６５−ペプチド特異的であり、２００００個のＣｏｌｏ３８標的細胞当たり、およそ１５００個のＣＭＶ−ｐｐ６５−ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を生じる（Ｅ：Ｔ（エフェクターと標的細胞の比率）＝１：１３）。
結果
ＭＣＳＰ結合多機能タンパク質は、ヒトＣＭＶ特異的Ｔ細胞を介してＣｏｌｏ３８腫瘍細胞の溶解を引き起こす。
実施例１２
細胞毒性試験
ＰＢＭＣは、フィコール遠心分離によって全血から得た。ｍｌあたり１×１０７のＰＢＭＣがＴ細胞培地（１０％のＨＳ、２ｍＭのグルタミンを補充したＲＰＭＩ １６４０）中で希釈され、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子上でのペプチド交換が、懸濁液への５０μｇ／ｍｌのＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドの添加により達成された。２〜３時間のインキュベーション後、ＰＢＭＣは１：１０に希釈され、９６ウェル丸底プレートに２００μｌが蒔かれた。３日目に、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７及びＩＬ−１５が添加された。１４日後、再刺激が行われた。
刺激されたＴ細胞は、９６ウェルプレート中で２回洗浄され、２００μｌのＴ細胞培地で希釈され、その中から８０μｌが新しい９６ウェル丸底プレートに移された。
ＰＢＭＣは上記のプロトコールに従って刺激された。刺激されたＰＢＭＣは、ペプチド交換後に４０００グレイで照射され、Ｔ細胞培地で２回洗浄され、１×１０５のＰＢＭＣが８０μｌのＴ細胞へピペッティングされた。３日目に、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７及びＩＬ−１５が添加された。Ｘｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ細胞毒性アッセイが、１１日目に再刺激されたＴ細胞を用いて実施された。
エフェクター細胞の６３％が、ＣＭＶ−ｐｐ６５ペプチド特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
標的細胞対エフェクター比は１：３．５であった。細胞溶解は、各多機能タンパク質の添加の１０時間後に測定された。多機能融合タンパク質が、１μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加された。
結果は、Ｃｏｌｏ３８細胞について図１８Ａに、ＷＭ２６６細胞について図１８Ｂに示される。
実施例１３
ジスルフィド安定化多機能タンパク質
本明細書に報告される多機能タンパク質における抗原提示ドメインの位置１１と２２７の間にジスルフィド架橋が導入されている。
ジスルフィド安定化抗原提示ドメインのアミノ酸配列は以下の通りである：
ＮＬＶＰＭＶＡＴＶＧＣＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＩＱＲＴＰＫＩＱＶＹＳＲＨＰＡＥＮＧＫＳＮＦＬＮＣＹＶＳＧＦＨＰＳＤＩＥＶＤＬＬＫＮＧＥＲＩＥＫＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫＤＷＳＦＹＬＬＹＹＴＥＦＴＰＴＥＫＤＥＹＡＣＲＶＮＨＶＴＬＳＱＰＫＩＶＫＷＤＲＤＭＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＨＳＭＲＹＦＦＴＳＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＡＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＳＤＡＡＳＱＲＭＥＰＲＡＰＷＩＥＱＥＧＰＥＹＷＤＧＥＴＲＫＶＫＡＨＳＱＴＨＲＶＤＬＧＴＬＲＧＣＹＮＱＳＥＡＧＳＨＴＶＱＲＭＹＧＣＤＶＧＳＤＷＲＦＬＲＧＹＨＱＹＡＹＤＧＫＤＹＩＡＬＫＥＤＬＲＳＷＴＡＡＤＭＡＡＱＴＴＫＨＫＷＥＡＡＨＶＡＥＱＬＲＡＹＬＥＧＴＣＶＥＷＬＲＲＹＬＥＮＧＫＥＴＬＱＲＴＤＡＰＫＴＨＭＴＨＨＡＶＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＳＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＲＤＧＥＤＱＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＱＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＫＰＬＴＬＲＷＧＳＧＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＧＳＩＴＳＧＹＹＷＮＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＴＹＤＧＳＮＮＹＮＰＳＬＫＳＲＶＴＩＳＲＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＤＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＧＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１３７）。
ジスルフィド安定化無しでは、プロテインＡアフィニティー精製後、１ｌの培養上清から６．４ｍｇの多機能タンパク質が得られる。凝集体を分離するためのサイズ排除クロマトグラフィー後の最終的な収量は２．２ｍｇであった。
ジスルフィド安定化を有する場合、プロテインＡアフィニティー精製後、１ｌの培養上清から１７．８ｍｇの多機能タンパク質を得ることができる。導入されたジスルフィド結合による熱安定性の増大に起因する凝集体の量の低下に起因して、サイズ排除クロマトグラフィー後の最終的な収量は１１．４ｍｇであった。
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー後で、分取サイズ排除クロマトグラフィーによる凝集体除去前の分析用サイズ排除クロマトグラムが図１９に示される。
ジスルフィド結合型多機能タンパク質は、非ジスルフィド結合型多機能タンパク質と同じ機能を示している。
ＰＢＭＣは、フィコール遠心分離によって全血から得た。１ｍｌあたり１×１０７のＰＢＭＣがＴ細胞培地（１０％のＨＳ、２ｍＭのグルタミンを補充したＲＰＭＩ １６４０）中で希釈され、ＨＬＡ−Ａ０２０１分子上でのペプチド交換が、懸濁液への５０μｇ／ｍｌのＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドの添加により達成された。２〜３時間のインキュベーション後、ＰＢＭＣは１：１０に希釈され、９６ウェル丸底プレートに２００μｌが蒔かれる。３日目に、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７及びＩＬ−１５が添加された。細胞は、一次刺激後１１日目で採取された；細胞の４５％は、ＣＭＶ特異的であった。標的細胞対エフェクター細胞の比が１：３についての結果が図２０に示される。

Claims (17)

  1. − 一の抗原提示ドメイン、
    − 一の抗体Ｆｃ領域、及び
    − 少なくとも一の抗原結合部位
    を含むことを特徴とする多機能タンパク質であって、
    抗原提示ドメインは、ＮからＣ末端方向に、
    （ｉ）β２−ミクログロブリン、及び
    （ｉｉ）１％未満の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３
    又は
    （ｉ）１％未満の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、並びに
    （ｉｉ）β２−ミクログロブリン、
    又は
    （ｉ）Ｔ細胞応答誘発性ペプチド、
    （ｉｉ）β２−ミクログロブリン、及び
    （ｉｉｉ）１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、
    又は
    （ｉ）Ｔ細胞応答誘発性ペプチド、
    （ｉｉ）１％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、並びに
    （ｉｉｉ）β２−ミクログロブリン
    の何れかを含み、
    抗原結合部位は、がん細胞表面抗原に結合する、多機能タンパク質。
  2. 抗体Ｆｃ領域が、第一及び第二のジスルフィド結合したＦｃ領域ポリペプチドを含み、これにより抗原結合部位は第一のＦｃ領域ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１に記載の多機能タンパク質。
  3. 抗原結合部位が、ｉ）抗体重鎖と抗体軽鎖との対、又はｉｉ）Ｎ末端からＣ末端の方向に、ｓｃＦｖ抗体断片及び抗体Ｆｃ領域ポリペプチドを含むｓｃＦｖ融合ポリペプチド、又はｉｉｉ）Ｎ末端からＣ末端方向に、ｓｃＦａｂ及び抗体Ｆｃ領域ポリペプチドを含むｓｃＦａｂ融合ポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の多機能タンパク質。
  4. ｉ）抗原提示ドメインは、抗原結合部位の重鎖のＮ末端又は軽鎖のＮ末端に連結されており、又は、ｉｉ）抗原提示ドメインは、抗原結合部位の重鎖のＣ末端に、又は軽鎖のＣ末端に連結されており、又はｉｉｉ）抗原提示ドメインは、ｓｃＦｖ融合ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に連結されており、又はｉｖ）抗原提示ドメインは、ｓｃＦａｂ融合ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に連結されており、又はｉｖ）抗原提示ドメインは、第二のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に連結されていることを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
  5. がん細胞表面抗原がメラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）であることを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
  6. Ｔ細胞応答誘発性ペプチドがウイルス由来ペプチドであることを特徴とする、請求項１から５の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
  7. ウイルス由来ペプチドがヒトサイトメガロウイルス由来のペプチドであることを特徴とする、請求項６に記載の多機能タンパク質。
  8. ウイルス由来ペプチドが配列番号０１のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１から７の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
  9. １％以上の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子が、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊１１０１、ＨＬＡ−Ａ＊２４０２、ＨＬＡ−Ａ＊３４０１０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０３０４、ＨＬＡ−Ｃ＊０４０１、及びＨＬＡ−Ｃ＊０７０２を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１から８の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
  10. １％未満の相対頻度を有するクラスＩのＭＨＣ分子が、ＨＬＡ−Ｂ＊４２０１、ＨＬＡ−Ｂ＊５９０１、ＨＬＡ−Ｂ＊６７０１、及びＨＬＡ−Ｂ＊７８０２を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１から９の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
  11. 抗原提示ドメインが、
    （ｉ）ウイルス由来ペプチド、
    （ｉｉ）β２−ミクログロブリン、及び
    （ｉｉｉ）可溶性ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子Ａ＊０２０１
    を含むことを特徴とする、請求項１から１０の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
  12. 抗原提示ドメインが、ＮからＣ末端の方向に
    （ｉ）配列番号０１から配列番号７０を含む群から選択されるアミノ酸配列を有するウイルス由来ペプチド、
    （ｉｉ）配列番号７７、７８、７９、８２、８３、及び８４を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第一リンカーペプチド、
    （ｉｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を有するβ２−ミクログロブリン、
    （ｉｖ）配列番号７７、７８、７９、８２、８３、及び８４を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第二リンカーペプチド、
    （ｖ）配列番号７２のアミノ酸配列を有するクラスＩのＭＨＣ分子の細胞外ドメインのα１、α２、及びα３、及び
    （ｖｉ）配列番号７３、７７、７８、７９、８２、８３、８４、及び１３６を含む群から選択されるアミノ酸配列を有する第三リンカーペプチド
    を含むことを特徴とする、請求項１から１１の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
  13. 請求項１から１２の何れか一項に記載の多機能タンパク質及び任意で薬学的に許容される担体を含む薬学的製剤。
  14. 医薬として使用のための請求項１から１２の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
  15. がんの治療における使用のための請求項１から１２の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
  16. 個体のウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞を標的に誘引することにおける使用のための請求項１から１２の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
  17. がん細胞又はウイルス感染細胞の除去における使用のための請求項１から１２の何れか一項に記載の多機能タンパク質。
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