CN103038258B - 用于治疗低密度脂蛋白相关蛋白质6(lrp6)的抗体的组合物及使用方法 - Google Patents

用于治疗低密度脂蛋白相关蛋白质6(lrp6)的抗体的组合物及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及靶向LRP6的抗体和组合物及其使用方法。

Description

用于治疗低密度脂蛋白相关蛋白质6(LRP6)的抗体的组合物 及使用方法
相关申请
本申请要求2010年5月6日提交的美国临时申请系列号61/331,985的优先权，所述临时申请的内容在此处以其整体引入本文作为参考。
发明领域
本发明涉及与LRP6特异性结合的抗体。本发明更特别地涉及LRP6拮抗剂的特异性抗体。
发明背景
Wnt/β-联蛋白通路通过调节β-联蛋白的蛋白质稳定性，在发育和组织内稳态期间调节多种生物学过程(Clevers等人，(2006)Cell 127：469-480；和Logan等人，(2004)Annu.Rev Cell Dev.Biol 20：781-810)。在不存在Wnt信号的情况下，胞质β-联蛋白与β-联蛋白破坏复合物结合，所述β-联蛋白破坏复合物包含多种蛋白质，包括腺瘤性结肠息肉(adenomatous polyposis coli)(APC)、Axin和糖原合酶激酶3(GSK3)。在该复合物中，β-联蛋白被GSK3组成性磷酸化，并通过蛋白酶通路降解。Wnt信号通过两种不同的受体，蛇根碱受体Frizzled和单次跨膜蛋白质LRP5或LRP6跨质膜转导。Wnt蛋白促进Frizzled-LRP5/6信号复合物的组装，并诱导LRP5/6的胞质PPPSPxS基序被GSK3和酪蛋白激酶I磷酸化。磷酸化的LRP5/6与Axin结合并失活β-联蛋白降解复合物。稳定的β-联蛋白进入细胞核，与TCF家族转录因子结合，并启动转录。
LRP5/6的巨大胞外结构域含有4个YWTD型β-螺旋桨区(每一个YWTD型β-螺旋桨区的后面是EGF样结构域)，以及LDLR结构域。每一螺旋桨区含有形成6叶片β-螺旋桨结构的6个YWTD基序。生物化学研究提示，Wnt蛋白质与Frizzled和LRP6二者物理结合，并诱导Frizzled-LRP6信号复合物的形成(Semenov等人，(2001)Curr.Biol 11，951-961；和Tamai，等人(2000)Nature 407，530-535)。除Wnt蛋白质外，LRP5/6的巨大胞外结构域与多种分泌性Wnt调节物结合，包括Wnt拮抗剂DKK1和Sclerostin(SOST)，以及Wnt激动剂R-Spondins。
Wnt信号通路的失调与许多人类疾病相关。Wnt/LRP5/6信号通路在组织内稳态和再生中发挥着重要作用。Wnt信号通过增加成骨细胞的生长和分化，促进骨形成(Baron等人，(2006)Curr.Top.Dev.Biol 76：103-127)。LRP5的功能获得突变(Boyden等人，(2002)N.Engl.J Med346：1513-1521；Little等人，(2002)Am.J Hum.Genet.70：11-19；VanWesenbeeck等人，(2003)Am.J Hum.Genet.72：763-71)和Wnt拮抗剂SOST的功能丢失突变(Balemans等人，(2001)Hum.Mol Genet.10：537-543；Brunkow等人，(2001)Am.JHum.Genet.68：577-589)二者都导致高骨量病(high bone mass disease)。Wnt信号通过维持肠隐窝中干细胞的增殖状态，对肠上皮细胞的内稳态也是关键的(Pinto等人，(2005)Biol Cell 97：185-196)。Wnt信号对肾修复和再生也是关键的(Lin SL PNAS 107：4194，2010)。此外，通路组分例如APC和β-联蛋白的突变与人类癌症相关。最近的研究表明，过表达Wnt蛋白和/或沉默Wnt拮抗剂例如DKK1、WISP和sFRP促进癌症的发展和进程(Akiri等人，(2009)Oncogene 28：2163-2172；Bafico等人，(2004)Cancer Cell 6：497-506；Suzuki等人，(2004)Nat Genet.36：417-422；Taniguchi等人，(2005)Oncogene.24：7946-7952；Veeck等人，(2006)Oncogene.25：3479-3488；Zeng等人，(2007)Hum.Pathol.38：120-133)。此外，Wnt信号还涉及肿瘤干细胞的维持(Jamieson等人，(2004)Cancer Cell 6：531-533和Zhao等人，(2007)Cancer Cell 12：528-541)。
因此，存在在胞外水平拮抗Wnt信号的试剂的需求，作为用于与异常的经典(canonical)Wnt信号相关疾病的疗法。
发明概述
本发明提供了抑制或者增强经典Wnt信号通路的LRP6抗体(例如，单价、二价LRP6抗体)和制备LRP6抗体的方法。本发明LRP6抗体与不同的LRP6β-螺旋桨区结合。螺旋桨1抗体与β-螺旋桨1结构域结合，并阻断螺旋桨1依赖的Wnt，例如Wnt1、Wnt2、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt9、Wnt10A、Wnt10B。螺旋桨3抗体与β-螺旋桨3结构域结合，并阻断螺旋桨3依赖的Wnt，例如Wnt3a和Wnt3。本发明基于LRP6抗体可以将螺旋桨1和螺旋桨3配体区分成两种不同的种类，并与靶LRP6的不同表位结合的意外发现。另一意外发现是，将LRP6抗体的片段(例如，Fab)转变成全长IgG抗体产生了在另一蛋白质例如Wnt1或Wnt3配体存在的情况下能加强(增强)Wnt信号的抗体。除Wnt配体外，LRP6螺旋桨1抗体预期会抑制与其他螺旋桨1结合配体(例如Sclerostin、Dkk1)的相互作用。类似地，螺旋桨3抗体预期会抑制与其他螺旋桨3结合配体(例如Dkk1)的相互作用。此外，螺旋桨1和3结合抗体预期可能会影响其他Wnt信号调节物(例如R-spondins)的活性。
因此，在一个方面，本发明涉及分离的针对低密度脂蛋白相关蛋白质6(LRP6)的二价抗体或其二价片段，在未封闭的LRP6结合蛋白质存在的情况下，所述二价抗体或其二价片段通过成簇一个或多个LRP6受体来增强Wnt信号。在一个实施方案中，抗体通过与选自螺旋桨1和螺旋桨3的螺旋桨区结合来成簇一个或多个LRP6。在一个实施方案中，LRP6结合蛋白质是选自Wnt 1、Wnt 3和Wnt 3a的Wnt结合蛋白质。
在另一方面，本发明涉及分离的针对低密度脂蛋白相关蛋白质6(LRP6)的二价抗体或其二价片段，在未封闭的LRP6结合蛋白质存在的情况下，所述二价抗体或其二价片段通过成簇一个或多个LRP6受体来避免Wnt信号的加强。
在另一方面，本发明涉及分离的针对低密度脂蛋白相关蛋白质6(LRP6)的单价抗体或其单价片段，在未封闭的LRP6结合蛋白质存在的情况下，所述单价抗体或其单价片段通过成簇一个或多个LRP6受体来避免Wnt信号的加强。
在一个方面，本发明涉及分离的针对低密度脂蛋白相关蛋白质6(LRP6)的抗体或其片段，所述抗体或其片段具有至少1×107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1或1011M-1、1012M-1、1013M-1的解离(KD)，其中抗体或其片段是单价的或者二价的。在一个实施方案中，如通过溶液平衡滴定测定(Solution Equilibrium Titration assay)中与人LRP6的体外结合所测量，所述抗体或其片段以0.001nM-1μM的KD抑制经典Wnt通路，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在另一方面，本发明涉及分离的针对低密度脂蛋白相关蛋白质6(LRP6)的抗体或其片段，如通过溶液平衡滴定(SET)测定中与人LRP6的体外结合所测量，所述抗体或其片段以低于或等于300μM(0.3pM)的EC50抑制经典Wnt通路，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在另一方面，本发明涉及分离的针对低密度脂蛋白相关蛋白质6(LRP6)的二价抗体或其二价片段，在未封闭的LRP6结合蛋白质存在的情况下，所述二价抗体或其二价片段通过成簇一个或多个LRP6受体来增强Wnt信号。抗体通过与选自螺旋桨1和螺旋桨3的LRP6分子的螺旋桨区结合来成簇一个或多个LRP6。在一个实施方案中，LRP6结合蛋白质是选自Wnt 1、Wnt 3和Wnt 3a的Wnt结合蛋白质。
在另一方面，本发明涉及针对LRP6蛋白的抗体或其片段，所述抗体或其片段与表1中所述的抗体交叉竞争，其中抗体或其片段是单价的或者二价的；抗体或其片段与和表1中所述抗体相同的表位相互作用(例如，通过结合、立体阻碍、稳定化/去稳定化、空间分布)。在一个实施方案中，抗体或其片段是单克隆抗体。在另一个实施方案中，抗体或其片段是人抗体或人源化抗体。在另一个实施方案中，抗体或其片段是嵌合抗体。在一个实施方案中，抗体或其片段包含人重链恒定区和人轻链恒定区。在一个实施方案中，抗体或其片段是单链抗体。在另一个实施方案中，抗体或其片段是Fab片段。又在另一个实施方案中，抗体或其片段是scFv。在一个实施方案中，抗体或其片段与人LRP6和食蟹猴LRP6二者结合。在一个实施方案中，抗体或其片段是IgG同种型。在另一个实施方案中，抗体或其片段包含这样的框架，其中已经将氨基酸取代成来自分别的人VH或VL种系序列的抗体框架。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，其包含表1中任一抗体的1、2、3、4、5或6个CDR，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本文中所公开的LRP6抗体与LRP6的螺旋桨1区结合。因此，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，其包含选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:25、SEQ和SEQ IDNO:43的重链CDR3，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，其包含选自SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:62的重链CDR1和选自SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:61的VL，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，其中所述抗体包含含SEQ ID NO:14的VH和含SEQ ID NO:13的VL，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，其中所述抗体包含含SEQ ID NO:34的VH和含SEQ ID NO:33的VL，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，其中所述抗体包含含SEQ ID NO:36的VH和含SEQ ID NO:35的VL，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，其中所述抗体包含含SEQ ID NO:44的VH和含SEQ ID NO:43的VL，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，其中所述抗体包含含SEQ ID NO:36的VH和含SEQ ID NO:35的VL，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，其中所述抗体包含含SEQ ID NO:60的VH和含SEQ ID NO:59的VL，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，其中所述抗体包含含SEQ ID NO:61的VH和含SEQ ID NO:62的VL，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的抗体或其片段，其包含与SEQ ID NO:1、2、3、21、22、23、47、48和49相同的至少一个重链CDR序列，其中所述抗体与人LRP6蛋白结合，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的抗体或其片段，其包含与SEQ ID NO:4、5、6、24、25、26 50、51和52相同的至少一个轻链CDR序列，其中所述抗体与人LRP6蛋白结合，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的抗体或其片段，其包含与SEQ ID NO:1、2、3、21、22、23、47、48和49具有至少95％序列同一性的至少一个重链CDR序列，其中所述抗体与人LRP6蛋白结合，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的抗体或其片段，其包含与SEQ ID NO:4、5、6、24、25、26 50、51和52具有至少95％序列同一性的至少一个轻链CDR序列，其中所述抗体与人LRP6蛋白结合，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的抗体或其片段，其包含SEQ ID NO:1的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:2的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:3的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:4的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:5的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:6的轻链可变区CDR3，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的抗体或其片段，其包含SEQ ID NO:21的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:22的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:23的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:24的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:25的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:26的轻链可变区CDR3，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的抗体或其片段，其包含SEQ ID NO:47的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:48的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:49的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:50的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:51的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:52的轻链可变区CDR3，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个实施方案中，与LRP6结合的抗体片段选自Fab、F(ab2)’、F(ab)2’、scFv、VHH、VH、VL、dAb，其中所述片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含抗体或其片段和可药用载体，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。在一个方面，本发明涉及包含编码含与SEQ ID NO:14、34、36、44、60和62相同的重链可变区的多肽的核苷酸序列的核酸；包含编码含与SEQ IDNO:13、33、35、43、59和61相同的轻链可变区的多肽的核苷酸序列的核酸；包含编码含与SEQID NO:14、34、36、44、60和62具有至少98％序列同一性的重链可变区的多肽的核苷酸序列的核酸；包含编码含与SEQ ID NO:13、33、35、43、59和61具有至少98％序列同一性的轻链可变区的多肽的核苷酸序列的核酸。
在一个方面，本文中所公开的LRP6抗体与LRP6的螺旋桨3区结合。因此，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，其包含选自SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:93和SEQ IDNO:115的CDR3，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，其包含选自SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:115的重链CDR1；选自SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:94和SEQ ID NO:116的CDR2；和选自SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:95和SEQ ID NO:117的CDR3，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，其包含选自SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:118的轻链CDR1；选自SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:97和SEQ ID NO:119的CDR2；和选自SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:98和SEQ ID NO:120的CDR3，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，其包含选自SEQ IDNO:82、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:130和SEQ ID NO:138的VH；选自SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129和SEQ ID NO:137的VL，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，所述抗体包含SEQ IDNO:82和包含SEQ ID NO:81的VL，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，所述抗体含有包含SEQID NO:90的VH和包含SEQ ID NO:89的VL，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，所述抗体含有包含SEQID NO:106的VH和包含SEQ ID NO:105的VL，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，所述抗体含有包含SEQID NO:108的VH和包含SEQ ID NO:107的VL，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，所述抗体含有包含SEQID NO:128的VH和包含SEQ ID NO:127的VL，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，所述抗体含有包含SEQID NO:128的VH和包含SEQ ID NO:127的VL，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，所述抗体含有包含SEQID NO:130的VH和包含SEQ ID NO:129的VL，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的针对LRP6的抗体或其片段，所述抗体含有包含SEQID NO:138的VH和包含SEQ ID NO:137的VL，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的抗体或其片段，其包含与SEQ ID NO:69、70、71、93、94、95、115、116和117相同的至少一个重链CDR序列，其中所述抗体与人LRP6蛋白结合，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其片段，其包含与SEQ ID NO:72、73、74、96、97、98、118、119和120相同的至少一个轻链CDR序列，其中所述抗体与人LRP6蛋白结合，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其片段，其包含与SEQ ID NO:70、71、93、94、95、115、116和117具有至少95％序列同一性的至少一个重链CDR序列，其中所述抗体与人LRP6蛋白结合，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其片段，其包含与SEQ ID NO:72、73、74、96、97、98、118、119和120具有至少95％序列同一性的至少一个轻链CDR序列，其中所述抗体与人LRP6蛋白结合，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其片段，其包含SEQ ID NO:69的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:70的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:71的重链可变区CDR3；SEQ IDNO:72的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:73的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:74的轻链可变区CDR3，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其片段，其包含SEQ ID NO:93的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:94的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:95的重链可变区CDR3；SEQ IDNO:96的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:97的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:98的轻链可变区CDR3，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及分离的单克隆抗体或其片段，其包含SEQ ID NO:115的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:116的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:117的重链可变区CDR3；SEQID NO:118的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:119的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:120的轻链可变区CDR3，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及与LRP6的β-螺旋桨1结构域结合的单克隆抗体和与LRP6的β-螺旋桨3结构域结合的单克隆抗体的组合，其中所述抗体或其片段是单价的。
在一个方面，本发明涉及与LRP6的β-螺旋桨1结构域结合的单克隆抗体和与LRP6的β-螺旋桨3结构域结合的单克隆抗体的组合，其中所述抗体或其片段是二价的。
在一个实施方案中，与LRP6结合的抗体片段选自Fab、F(ab2)’、F(ab)2’、scFv、VHH、VH、VL、dAb，其中所述片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含抗体或其片段和可药用载体，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。在一个方面，本发明涉及包含编码多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽包含选自SEQ ID NO:82、89、106、108、128、130和138的重链可变区。在一个方面，本发明涉及包含编码多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽包含选自SEQ ID NO:81、90、105、107、127、129和137的轻链可变区。在一个方面，本发明涉及包含编码多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO:82、89、106、108、128、130和138具有至少98％序列同一性的重链可变区。在一个方面，本发明涉及包含编码多肽的核苷酸序列的核酸，所述多肽包含与SEQ ID NO:81、90、105、107、127、129和137具有至少98％序列同一性的轻链可变区。
在一个方面，本发明涉及包含核酸的载体；以及分离的宿主细胞，所述分离的宿主细胞包含(1)编码抗体的重链的重组DNA片段和(2)编码抗体的轻链的第二重组DNA片段。DNA片段与启动子有效连接，并能在所述宿主细胞中表达。抗体是人单克隆抗体；并且宿主细胞是非人哺乳动物细胞系。
在一个方面，本发明涉及治疗癌症的方法，包括选择具有LRP6表达的癌症的个体，给个体施用有效量的包含LRP6抗体(例如，单价或二价LRP6抗体或其片段)的组合物。在一个方面，本发明涉及使用针对LRP6的抗体或其片段治疗由经典Wnt信号通路介导的疾病的方法，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。在一个方面，本发明涉及治疗由经典Wnt信号通路介导的癌症的方法，包括选择具有LRP6表达的癌症的个体，并施用有效量的包含抗体或其片段的组合物，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的，并且其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌和黑素瘤。在一个实施方案中，所述癌症是乳腺癌。在一个实施方案中，所述个体是人类。
在一个方面，本发明涉及治疗癌症的方法，包括选择具有LRP6表达的癌症的个体，给所述个体施用有效量的组合物，所述组合物包含与LRP6的螺旋桨1区结合的抗体或其抗体片段，以及与LRP6的螺旋桨3区结合的抗体或其抗体片段，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及治疗癌症的方法，包括选择具有LRP6表达的癌症的个体，给所述个体施用有效量的组合物，所述组合物包含与LRP6结合的并通过LRP6抑制Wnt信号的抗体或其片段，以及与LRP6结合并通过LRP6抑制Wnt3信号的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及用于产生抗体或其片段的方法，包括培养宿主细胞，并分离抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在另一方面，本发明涉及抗体或其片段在生产用于治疗由经典Wnt信号通路介导的癌症的药物中的用途，所述癌症选自乳腺癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌和黑素瘤，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
在一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:14的VH和SEQ ID NO:13的VL的抗体，用于治疗由经典Wnt信号通路介导的癌症，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:34的VH和SEQ ID NO:36的VL的抗体，用于治疗由经典Wnt信号通路介导的癌症，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:36的VH和SEQ ID NO:35的VL的抗体，用于治疗由经典Wnt信号通路介导的癌症，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:44的VH和SEQ ID NO:43的VL的抗体，用于治疗由经典Wnt信号通路介导的癌症，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQID NO:60的VH和SEQ ID NO:59的VL的抗体，用于治疗由经典Wnt信号通路介导的癌症，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:62的VH和SEQ ID NO:61的VL的抗体，用于治疗由经典Wnt信号通路介导的癌症，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:82的VH和SEQ ID NO:81的VL的抗体，用于治疗由经典Wnt信号通路介导的癌症，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:90的VH和SEQ ID NO:89的VL的抗体，用于治疗由经典Wnt信号通路介导的癌症，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:106的VH和SEQ ID NO:105的VL的抗体，用于治疗由经典Wnt信号通路介导的癌症，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:108的VH和SEQ ID NO:107的VL的抗体，用于治疗由经典Wnt信号通路介导的癌症，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:128的VH和SEQ ID NO:127的VL的抗体，用于治疗由经典Wnt信号通路介导的癌症，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:130的VH和SEQ ID NO:129的VL的抗体，用于治疗由经典Wnt信号通路介导的癌症，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:138的VH和SEQ ID NO:137的VL的抗体，用于治疗由经典Wnt信号通路介导的癌症，其中所述抗体是单价的或者二价的。
在一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:14的VH和SEQ ID NO:13的VL的抗体，用于用作为药物，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:34的VH和SEQ ID NO:33的VL的抗体，用于用作为药物，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:36的VH和SEQ ID NO:35的VL的抗体，用于用作为药物，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:44的VH和SEQ ID NO:43的VL的抗体，用于用作为药物，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:62的VH和SEQ ID NO:61的VL的抗体，用于用作为药物，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:82的VH和SEQ ID NO:81的VL的抗体，用于用作为药物，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ IDNO:90的VH和SEQ ID NO:89的VL的抗体，用于用作为药物，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:106的VH和SEQ ID NO:105的VL的抗体，用于用作为药物，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:108的VH和SEQ ID NO:107的VL的抗体，用于用作为药物，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:128的VH和SEQ IDNO:127的VL的抗体，用于用作为药物，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:130的VH和SEQ ID NO:129的VL的抗体，用于用作为药物，其中所述抗体是单价的或者二价的。在另一个实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO:138的VH和SEQ ID NO:137的VL的抗体，用于用作为药物，其中所述抗体是单价的或者二价的。
在一个方面，本发明涉及用作为药物的本发明抗体或其片段。在一个方面，本发明涉及用作为治疗表达LRP6癌症的药物的本发明抗体或其片段。在一个方面，本发明涉及用作为治疗表达LRP6的癌症的药物的本发明抗体或其片段，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌和黑素瘤。
附图简述
图1是显示在PA1细胞、U266细胞和Daudi细胞上所选择的Fab的FACS EC50测定，以及相应的mRNA表达数据(A)和通过shRNA击倒LRP6的FACS EC50测定及相应的mRNA表达数据B的图；
图2A-B是显示表达Wnt1或Wnt3A配体的HEK293T/17STF细胞(基因报告测定)中抗LRP6Fab片段活性的图。数据显示，抗LRP6Fab选择性阻断Wnt1和Wnt3信号；
图3显示抗LRP6β螺旋桨1和β螺旋桨3抗体对人、小鼠和食蟹猴的交叉反应值；
图4是显示在HEK293T/17STF细胞(基因报告测定)中瞬时表达多种WNT配体并用抗LRP6抗体处理的图，其显示，基于抗体与LRP6的特定β螺旋桨区的结合/阻断，特定WNT的活性抑制；
图5是显示Fab转变成IgG导致来自未阻断的Wnt配体的信号的增强的柱状图；
图6是显示在细胞系统中选择性靶向抑制LRP6的蛋白质印迹；
图7是显示在啮齿类动物中，单次静脉内给药与β螺旋桨1区结合的LRP6抗体的图；
图8A是显示MMTV-Wnt1肿瘤中相对于t＝0对照上调＞2倍的基因的表(调整的P值＜0.01)和图8B是显示将单剂量的MOR08168(5mg/kg)施用给携带MMTV-Wnt1肿瘤的小鼠后8小时，相对于t＝0对照下调＞2倍的基因的表(调整的P值＜0.01)；
图9A是显示在MMTV-Wnt1模型中，螺旋桨1，而不是螺旋桨3mAb在体内引起肿瘤消退的图。图9B是显示不同剂量的螺旋桨1mAb对MMTV-Wnt1肿瘤模型生长的影响的图；
图10是显示在MMTV-Wnt3模型中，螺旋桨3，而不是螺旋桨1mAb引起肿瘤生长抑制的图；
图11是显示在PA-1细胞中，螺旋桨3，而不是螺旋桨1mAb在体内引起Wnt3A诱导的Super Top Flash活性的抑制的图；
图12是显示通过HDx MS测定的被MOR06475溶剂保护的LRP6PD3-4的区域(A)和导致结合scFv MOR06475丧失的特定残基突变的图(B)；
图13是显示LRP6的β螺旋桨区的简图；
图14是显示从大肠杆菌中成功表达并纯化的全部scFv分子的SDS-PAGE凝胶的图；
图15A-D是多价抗体的示意性实例。(15A)与完全IgG的羧基端连接的scFv scFv(15B)与Fc的氨基端连接的scFv scFv(15C)与Fc的羧基端连接的scFv scFv(15D)与Fc的氨基端和羧基端连接的scFv scFv；
图16是显示在非还原(泳道1)和还原(泳道2)条件下纯化的双旁原位(biparatopic)抗LRP6IgG scFv的SDS-PAGE凝胶的图；
图17显示双旁原位抗体和单独的各个组分部分在STF测定中的活性；
图18显示scFv分子中，接头长度比较在STF测定中的活性；
图19是显示双旁原位抗体的结合活性的表；
图20显示了双旁原位抗体和Prop3抗体，而不是Prop1抗体在PA-1/Wnt3a L细胞共培养模型中的活性；
图21是显示在啮齿类动物中，对比5mg/kg单次静脉内给药Prop1LRP6抗体和Prop1/3双旁原位抗体的图；
图22是显示在MMTV-Wnt1模型中螺旋桨1和双旁原位螺旋桨1/3抗体二者在体内引起肿瘤消退的图；
图23是显示在MMTV-Wnt1模型中，Prop1/3结合双旁原位抗体的剂量应答关系的图；
图24显示鼠MMTV-Wnt1乳房肿瘤的分化受拮抗性LRP6抗体诱导。A-B)将MMTV-Wnt1肿瘤的碎片皮下移植到裸鼠中。用单剂量的PBS(对照)或5mg/kg MOR08168IgG1LALA6475scfv处理荷瘤小鼠。A)Oil Red O染色脂质的代表性图像。B)Oil Red O染色的定量。图标表示为平均值±SEM值。在72小时组中n＝4，在24小时组中n＝3，在5天组中n＝2，并且对于PBS(对照)n＝1；
图25是显示在E-钙粘着蛋白阴性的MDA-MB231异种移植模型中，Prop1/3结合双旁原位抗体的活性的图；
图26显示MOR08168、MOR06475和MOR08168IgG1LALA 6475scfv与重组LRP6PD1/2和PD3/4的亲和性和结合动力学。A)如通过Biacore分析测定，亲和性和开/关速率的总结表。B)抗LRP6分子与相应的LRP6受体结构域，PD1/2和PD3/4的代表性结合曲线。C)LRP6PD1/2和PD3/4与MOR08168IgG1LALA 6475scfv的顺次结合；
图27显示基于IgG的双旁原位抗体的示意图；
图28是显示优化大肠杆菌中抗LRP6scFv表达的SDS-PAGE凝胶的图；
图29是显示MOR06475scFv中单突变对Tm的影响的表。
图30是显示MOR08168scFv中单突变对Tm的影响的表；
图31是显示在细菌和哺乳动物系统二者中表达的物质中，在MOR08168scFv中双突变对Tm的影响的表；
图32是总结在ELISA、Proteon亲和性和STF报告基因测定中，野生型和MOR06475和MOR08168scFvs的单/双突变形式的结合和功能活性的表；
图33是设计的突变的所选择的实例的图解。在全部图例中，蛋白质骨架以带状图表示，而所选择的侧链表示为棒状。(a)：在scFv6475的同源性模型中，VH:I37与两个芳香族残基(VL:F98和VH:W103)邻近。(b)在scFv6475的VH:I37F突变体中，VH:F37和VH:W103可以形成垂直的pi-pi垛叠相互作用，而VH:F37和VL:F98可以形成另一垂直的pi-pi垛叠相互作用。(c)在scFv8168的同源性模型中，疏水残基VH:V33与极性残基VH:N100a邻近。(d)在scFv8168的VH:V33N突变体中，通过同源性建模提示，VH:N33侧链可以与VH:N100a形成氢键。两个残基之间的氢键通过键表示。(e)：在scFv8168的同源性模型中，带电荷残基VH:K43并不与疏水残基VH:V85形成盐桥。(f)：由于scFv8168上的VH:V85E突变，VH:K43和VH:E85的两个带电荷的侧链可以形成盐桥。两个带电荷基团之间的距离可以为和
图34是显示双旁原位抗体的热稳定性测量的表。
发明详述
定义
为了可以更容易地理解本发明，首先定义了某些术语。其他定义在详细说明中给出。
如本文中所用，术语“免疫应答”指例如，淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞，以及由上述细胞或者肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致了从人体选择性损伤、破坏或者清除侵入病原体、受病原体感染的细胞或组织、癌细胞，或者在自身免疫或者病理炎症情况下，正常的人类细胞或组织。
如本文中所用，术语“信号转导通路”或“信号活性”指通常由蛋白质-蛋白质相互作用(例如生长因子与受体的结合)引发的生物化学因果关系，导致信号从细胞的一个部分传递到细胞的另一部分。对于LRP6，传递涉及引起信号转导的一系列反应中一个或多个蛋白质上一个或多个酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的特定磷酸化。次末端的过程通常包括导致基因表达改变的核事件。
如本文中所用，术语“Wnt信号通路”指经典Wnt通路，其中分泌的蛋白质配体的Wnt家族成员结合LRP和Frizzled(FZD)的受体复合体，允许β-联蛋白转移到核中，与LEF/TCF转录因子相互作用，并激活靶基因表达。如本文中所述，可以使用Wnt报告基因测定或者Wnt指导的信号(directed signaling)转导(例如，LRP6磷酸化、β-联蛋白稳定性和核易位、细胞增殖/存活)的其他测量方法来测量Wnt信号通路。
术语“Wnt 1信号通路”指通过LRP6与Wnt1配体和Wnt1结合配体种类(例如Wnt2、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt9a、Wnt10a或Wnt10b)相互作用激活的经典Wnt通路。
术语“Wnt 3信号通路”指通过LRP6与Wnt3或者Wnt3a配体相互作用激活的经典Wnt通路。
术语“LRP6”指如在登录号NP002327中所定义的人类LRP6。
如本文中所用，术语“抗体”指与LRP6表位相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)并抑制信号转导的完全抗体。天然存在的“抗体”是包含通过二硫键相互连接的至少两个重链(H)和两个轻链(L)的糖蛋白。每一重链由重链可变区(在本文中简称为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域，CH1、CH2和CH3组成。每一轻链由轻链可变区(在本文中简称为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域，CL组成。VH和VL区可以进一步细分成高变区(称为互补决定区(CDR))，其散布于更保守的区域(称为框架区(FR))中。每一VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的多种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)的结合。术语“抗体”包括例如，单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段和抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，本发明抗体的抗Id抗体)，以及上述任一的表位结合片段。抗体可以是任一同种型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
可以将轻链和重链二者分成结构和功能同源性区域。术语“恒定”和“可变”被功能性地使用。在这点上，应当理解轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)部分二者决定了抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)的恒定区和重链的恒定区(CH1、CH2或CH3)赋予重要的生物学特性，例如分泌、经胎盘的移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域离抗体的抗原结合位点或者氨基端越远，恒定区结构域的编号越大。氨基端是可变区，并且羧基端是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。
如本文中所用，术语“抗体片段”指抗体的一个或多个片段，其保留了与LRP6表位特异性相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力，并抑制信号转导。结合片段的实例包括但不限于，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段(单价片段)；F(ab)2片段，其是包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)；以及分离的互补决定区(CDR)。
此外，尽管Fv片段的两个结构域(VL和VH)通过分别的基因编码，但是可以通过能使它们制备为单一蛋白质链的合成的接头，使用重组方法连接它们，其中VL和VH区配对，以形成单价分子(已知为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人，(1988)Science 242：423-426；和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：5879-5883)。还意图将此类单链抗体包括在术语“抗体片段”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并筛选以与完整抗体相同的方式应用的片段。
还可以将抗体片段掺入到单结构域抗体、大型抗体、小型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv中(参见，例如，Hollinger和Hudson，(2005)Nature Biotechnology23：1126-1136)。还可以将抗体片段嫁接到基于多肽(例如III型纤连蛋白(Fn3))的支架中(参见美国专利号6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽单体(monobody))。
还可以将抗体片段掺入到包含串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)对的单链分子中，其与互补性轻链多肽一起形成了抗原结合区对(Zapata等人，(1995)Protein Eng.8：1057-1062；和美国专利号5,641,870)。
术语“多价抗体”指具有一价以上效价的单结合分子，其中“效价”描述为每一分子的抗体构建体所呈现的抗原结合部分的数目。因此，单结合分子可以与靶受体上一个以上的结合位点结合。多价抗体的实例包括但不限于二价抗体、三价抗体、四价抗体、五价抗体等，以及双特异性抗体和双旁原位抗体。例如，对于LRP6受体，多价抗体(例如，LRP6双旁原位抗体)分别具有LRP6的β-螺旋桨1结构域结合位点的结合部分和β-螺旋桨3结构域结合位点的结合部分。
术语“多价抗体”还指对于两个分离的靶受体具有一个以上抗原结合部分的单结合分子。例如，与LRP6靶受体和并非LRP6的第二靶受体(例如ErbB、cmet、IGFR1、Smoothened、Notch受体)二者结合的抗体。在一个实施方案中，多价抗体是具有4个受体结合结构域的四价抗体。四价分子可以是对靶受体上的每一结合位点双特异性的和双价的。
多价抗体介导生物学效应，例如，其调节细胞活化(例如，通过与细胞表面受体结合，并导致传递或者抑制活化或者抑制信号)、其导致细胞死亡(例如，通过细胞信号诱导通路)或者其通过介导或促进细胞杀伤或者通过调节生物可利用的底物的量，在个体中调节疾病或者病症。
如本文中所用，术语“单价抗体”指与靶受体例如LRP6上的单一表位结合的抗体。
如本文中所用，术语“二价抗体”指与至少两个相同靶受体(例如，与两个LRP6受体的β-螺旋桨1结构域结合的抗体或者与两个LRP6受体的β-螺旋桨3结构域结合的抗体)上的两个表位结合的抗体。二价抗体还可以将靶受体与另一个靶受体交联。“二价抗体”还指与至少两个相同靶受体上的两个不同表位结合的抗体。
如本文中所用，术语“双旁原位抗体”指与相同靶受体上的两个不同表位结合的抗体，例如与单个LRP6受体的β-螺旋桨1结构域和β-螺旋桨3结构域结合的抗体。该术语还包括这样的抗体，其与至少两个LRP6受体的β-螺旋桨1和β-螺旋桨3结构域二者结合。
如本文中所用，术语“双特异性抗体”指与至少两个不同靶受体(例如，LRP6受体和不是LRP6受体的受体)上的两个或两个以上不同表位结合的抗体。
如本文中所用，短语“分离的抗体”指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合LRP6的分离抗体基本上不含特异性结合非LRP6抗原的抗体)。此外，分离的抗体可以基本上没有其他细胞物质和/或化学物质。然而，特异性结合LRP6的分离的抗体可以与其他抗原，例如来自其他物种的LRP6分子具有交叉反应。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
如本文中所用，短语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指基本上具有相同的氨基酸序列或者来源于相同的遗传来源的多肽，包括抗体、抗体片段、双特异性抗体等。该术语还包括单分子组合物的抗体分子的制备物。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单结合特异性和亲和性。
如本文中所用，短语“人抗体”包括这样的抗体，其具有其中框架区和CDR区二者都衍生自人类来源的序列的可变区。此外，如果抗体含有恒定区，那么恒定区也衍生自该人类序列，例如人类种系序列或者人类种系序列的突变形式或者含有衍生自人类框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如，如Knappik，等人(2000.J Mol Biol 296，57-86)所述。可以使用熟知的编码制，例如Kabat编码制、Chothia编码制或者Kabat和Chothia的组合(参见，例如Sequences of Proteins of Immunological Interest，U.S.Department of Healthand Human Services(1991)编著，Kabat等人；Al Lazikani等人，(1997)J.Mol.Bio.273：927948；Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH公布号91-3242U.S.Department of Health and Human Services；Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，(1989)Nature 342：877-883；和Al-Lazikani等人，(1997)J.Mol.Biol.273：927-948)定义免疫球蛋白可变结构域(例如CDR)的结构和位置。
本发明的人抗体可以包括并不通过人类序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或者位点特异性诱变或者通过体内体细胞突变引入突变，或者保守取代以促进稳定性或者产生)。然而，如本文中所用，术语“人抗体”并不旨在包括这样的抗体，其中已经将衍生自另一哺乳动物物种的种系(例如小鼠)的CDR序列移植到人类框架序列上。
如本文中所用，短语“人单克隆抗体”指表现出单一结合特异性的抗体，其具有可变区，其中框架区和CDR区二者都衍生自人序列。在一个实施方案中，人单克隆抗体通过杂交瘤产生，所述杂交瘤包含与永生化细胞融合的获自转基因非人动物(例如转基因小鼠)的B细胞，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文中所用，短语“重组的人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或者分离的全部人抗体，例如分离自人类免疫球蛋白基因的转基因或者转染色体动物(例如，小鼠)或者其制备的杂交瘤的抗体、分离自经转化的表达人抗体的宿主细胞(例如转染瘤)的抗体、分离自重组的、组合的人抗体文库的抗体，以及通过涉及将人类免疫球蛋白基因、序列的全部或者一部分剪接至其他DNA序列的任一其他方法制备、表达、产生或者分离的抗体。此类重组的人抗体具有这样的可变区，其中框架区和CDR区衍生自人类种系免疫球蛋白序列。在某些实施方案中，然而，可以将此类重组的人抗体进行体外诱变(或者，当使用转基因了人类Ig序列的动物时，体内体细胞诱变)，并因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列可以不是体内人抗体种系库内天然存在的序列，尽管其衍生自人类种系VH和VL序列并与人类种系VH和VL序列相关。
如本文中所用，术语“接头”指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽接头，用于将scFv与IgG连接。甘氨酸/丝氨酸接头的实例包括氨基酸序列(Gly-Gly-Ser)2，即(Gly2Ser)n，其中n是等于或者大于1的正整数。例如n＝1、n＝2、n＝3、n＝4、n＝5和n＝6、n＝7、n＝8、n＝9和n＝10。在一个实施方案中，接头包括但不限于，(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)3。在另一个实施方案中，为了更好的可溶性，将接头的接谷氨酸和赖氨酸残基散布于甘氨酸-丝氨酸接头内。在另一个实施方案中，接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)的多个重复。在另一个实施方案中，接头包括(Gly3Ser)+(Gly4Ser)+(GlySer)的组合和并联。在另一个实施方案中，丝氨酸可以用丙氨酸取代，例如(Gly4Ala)或(Gly3Ala)。在另一个实施方案中，接头包含甘氨酸、丝氨酸和脯氨酸的任一组合。又在另一个实施方案中，接头包含基序(GluAlaAlaAlaLys)n，其中n是等于或者大于1的正整数。
如本文中所用，术语“Fc区”指包含抗体的CH3、CH2和恒定区的铰链区的至少一部分的多肽。任选地，Fc区可以包括在一些抗体种类中存在的CH4结构域。Fc区可以包含抗体恒定区的整个铰链区。在一个实施方案中，本发明包含抗体的Fc区和CH1区。在一个实施方案中，本发明包含抗体的Fc区CH3区。在另一个实施方案中，本发明包含抗体恒定区的Fc区、CH1区和Cκ/λ区。在一个实施方案中，本发明的结合分子包含恒定区，例如重链恒定区。在一个实施方案中，与野生型恒定区比较，该恒定区是经修饰的。即，本文中所公开的本发明多肽可以包含对三个重链恒定区(CH1、CH2或CH3)的一个或多个和/或对轻链恒定区(CL)的改变或修饰。示例性修饰包括在一个或多个结构域中添加、缺失或取代一个或多个氨基酸。可以包括此类改变，以优化效应功能、半衰期等。
如本文中所用，术语“结合位点”包含靶受体上被抗体或抗原结合片段选择性结合的区域。例如，LRP6上的结合位点包括β-螺旋桨1结合结构域、β-螺旋桨2结合结构域、β-螺旋桨3结合结构域和β-螺旋桨4结合结构域。
如本文中所用，术语“表位”指能以高亲和性与免疫球蛋白结合的任一决定簇。表位是特异性靶向抗原的抗体结合的抗原的区域，并且当抗原是蛋白质时，所述表位包括直接接触抗体的特定氨基酸。大多数情况下，表位存在于蛋白质上，但在一些情况中，其可以存在于其他类型的分子，例如核酸上。表位决定簇可以包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或者磺酰基，并且可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。
通常，对特定靶抗原特异的抗体将与蛋白质和/或大分子的复杂混合物中的靶抗原上的表位结合。
可以使用本领域熟知的许多表位作图技术鉴定包括表位的给定多肽的区域。参见，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris编著，1996)Humana Press，Totowa，New Jersey。例如，可以通过例如，在固相支持物上同时合成大量肽，所述肽对应于蛋白质分子的一部分，并使肽与抗体反应(而肽仍与支持物连接)来确定线性表位。此类技术是本领域已知的，并且描述于例如，美国专利号4,708,871；Geysen等人，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8：3998-4002；Geysen等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：78-182；Geysen等人，(1986)Mol.Immunol.23：709-715中。相似地，例如通过如X射线结晶学和二维核磁共振确定氨基酸的空间构象，可以很容易地鉴定构象表位。参见，例如Epitope Mapping Protocols，同上。还可以使用标准抗原性和亲水性图，例如使用例如可获自Oxford Molecular Group的Omiga版本1.0软件程序计算的那些标准抗原性和亲水性图来鉴定蛋白质的抗原区。该计算机程序使用Hopp/Woods方法，Hopp等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci USA 78：3824-3828；来测定抗原性谱，且使用Kyte-Doolittle技术，Kyte等人，(1982)J.MoI.Biol.157：105-132；来进行亲水性作图。
术语两个实体之间“特异性结合”指的是具有这样的平衡常数(KA)(kon/koff)的结合：至少102M-1、至少5×102M-1、至少103M-1、至少5×103M-1、至少104M-1、至少5×104M-1、至少105M-1、至少5×105M-1、至少106M-1、至少5×106M-1、至少107M-1、至少5×107M-1、至少108M-1、至少5×108M-1、至少109M-1、至少5×109M-1、至少1010M-1、至少5×1010M-1、至少1011M-1、至少5×1011M-1、至少1012M-1、至少5×1012M-1、至少1013M-1、至少5×1013M-1、至少1014M-1、至少5×1014M-1、至少1015M-1或者至少5×1015M-1。
术语与抗体(例如，LRP6抗体)“特异地(或选择性地)结合”指决定相关抗原(例如，人类LRP6)在蛋白质和其他生物制品的异源群体中存在的结合反应。除上述平衡常数(KA)外，本发明LRP6抗体通常还具有这样的解离速率常数(KD)(koff/kon)：小于5×10-2M、小于10-2M、小于5×10-3M、小于10-3M、小于5×10-4M、小于10-4M、小于5×10-5M、小于10-5M、小于5×10-6M、小于10-6M、小于5×10-7M、小于10-7M、小于5×10-8M、小于10-8M、小于5×10-9M、小于10-9M、小于5×10-10M、小于10-10M、小于5×10-11M、小于10-11M、小于5×10-12M、小于10-12M、小于5×10-13M、小于10-13M、小于5×10-14M、小于10-14M、小于5×10-15M、或小于10-15M或者更低，并且所述抗体以比其与非特异性抗原(例如，HSA)至少大两倍的亲和性与LRP6结合。在一个实施方案中，如使用本文中所述的或者本领域技术人员已知的方法(例如，BIAcore测定法、ELISA、FACS、SET)(Biacore International AB，Uppsala，瑞典)评估的，LRP6抗体具有小于3000pM、小于2500pM、小于2000pM、小于1500pM、小于1000pM、小于750pM、小于500pM、小于250pM、小于200pM、小于150pM、小于100pM、小于75pM、小于10pM、小于1pM的解离常数(Kd)。
如本文中所用，术语“Kassoc”或“Ka”指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，然而如本文中所用，术语“Kdis”或“Kd”指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。如本文中所用，术语“KD”指解离常数，其获自Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)，并且表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域成熟的方法测定。用于测定抗体的KD的方法是使用表面等离振子共振或者使用生物传感器系统，例如系统。
如本文中所用，术语“亲和性”指抗体和抗原之间在单个抗原性位点相互作用的强度。在每一抗原性位点内，抗体“臂”的可变区通过弱的非共价力在多个位点与抗原相互作用；相互作用越多，亲和性越强。
如本文中所用，术语“亲合力”(avidity)指抗体-抗原复合体的整体稳定性或强度的信息性量度。亲合力受三个主要因素控制：抗体表位亲和性；抗原和抗体二者的效价；以及相互作用部分的结构排列。最终，这些因素限定了抗体的特异性，即特定抗体与精确的抗原表位结合的可能性。
如本文中所用，短语“拮抗剂抗体”指与LRP6结合并抑制经典Wnt信号的生物学活性的抗体，例如在Wnt报告基因测定或者磷酸LRP6测定中降低、减少和/或抑制LRP6诱导的信号活性。在下文实施例中详细描述了测定法的实例。在一些实施方案中，如在Wnt报告基因测定中所测量，抗体以10nM或小于10nM、1nM或小于1nM或者100pM或小于100pM、10pM、1pM、0.5pM、0.1pM的IC50降低、减少或者抑制LRP6诱导的活性。在一些实施方案中，可以使用SET、ELISA、FACS、Scatchard，通过以10nM或小于10nM、1nM或小于1nM、0.5pM或者100pM或小于100pM的IC50与LRP6的结合，来测量抗体的活性。在一个实施方案中，IC50小于300μM(0.3pM)。在另一个实施方案中，IC50等于300μM(0.3pM)。又在另一个实施方案中，IgG增强LRP6Wnt的活性。
如本文中所用，术语“Wnt1”指Wnt1、Wnt2、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt9a、Wnt10a或Wnt10b。
如本文中所用，术语“Wnt 3a”指Wnt3a和Wnt3。
如本文中所用，术语“增强”指这样的过程，其中在Wnt配体存在的情况下，通过将抗体的片段转变成全长IgG LRP6抗体来活化和增强Wnt信号。
术语“未显著增强”或者“避免增强”指与结合相同表位的对照抗体或其片段比较，Wnt信号没有被激活或者增强。未显著增强可以是比对照抗体或其片段低至少10％，比对照抗体或其片段低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。
如本文中所用，术语“簇”指将LRP6受体聚集或者集合在一起并增强Wnt信号转导的任一蛋白质。此类蛋白质的实例包括但不限于，Wnt1配体、Wnt3a配体和Wnt3配体。这些蛋白质可以引起多聚化，例如，两个内源LRP6受体的二聚化。由于增加了LRP6的相互作用，这种二聚化可以导致亲合力的增加，所述二聚化在Wnt配体存在的情况下可以增强Wnt信号。
短语“分离的抗体”指基本上没有具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合LRP6的分离抗体基本上没有特异性结合非LRP6抗原的抗体)。然而，特异性结合LRP6的分离抗体可以与其他抗原具有交叉反应。此外，分离的抗体可以基本上没有其他细胞物质和/或化学物质。
术语“保守修饰的变体”应用于氨基酸和核酸序列二者。关于特定的核酸序列，保守修饰的变体指编码相同的或者基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或者当核酸并不编码氨基酸序列时，指基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量在功能上相同的核酸编码任一给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全都编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定为丙氨酸的每一位置处，在不改变所编码的多肽的情况下，可以将密码子改变成任一所描述的相应密码子。此类核酸变异为“沉默变异”，其是保守修饰的变异的一个种类。在本文中编码多肽的每一核酸序列还描述了核酸的每一可能的沉默变异。技术人员应当意识到，可以修饰核酸中的每一密码子(除AUG外，其通常仅编码甲硫氨酸，以及TGG，其通常仅编码色氨酸)，以产生在功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每一沉默变异都包含于每一所述的序列中。
对于多肽序列，“保守修饰的变体”包括对多肽序列的个别取代、缺失或添加，其导致用在化学上相似的氨基酸取代氨基酸。提供在功能上相似的氨基酸的保守取代表是本领域熟知的。此类保守修饰的变体有且不排除多态变体、种间同源物，以及本发明的等位基因。以下八组含有相互保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见，例如，Creighton，Proteins(1984))。在一些实施方案中，术语“保守序列修饰”用于指没有显著影响或者改变含有此氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。
术语“交叉阻断(cross-block)”和“交叉阻断的(cross-blocked)”在本文中可互换使用，意为在标准竞争结合测定法中，抗体或其他结合剂干扰其他抗体或者结合剂与LRP6结合的能力。
可以使用标准竞争结合测定法，测定抗体或其他结合剂能干扰另一抗体或结合分子与LRP6结合的能力或程度，并因此确定是否可将其称为根据本发明的交叉阻断。一种合适的测定法涉及使用Biacore技术(例如，通过使用BIAcore 3000仪器(Biacore，Uppsala，瑞典))，其使用表面等离振子共振技术测量相互作用的程度。用于测量交叉阻断的另一测定法使用基于ELISA的方法。
如本文中所用，术语“经优化的”核苷酸序列指已经将核苷酸序列的密码子改变成使用在生产细胞或生物中优选的密码子而编码氨基酸序列的核苷酸序列，所述生产细胞或生物通常是真核细胞，例如毕赤酵母属(Pichia)的细胞、木霉属(Trichoderma)的细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或者人类细胞。经优化的核苷酸序列是经改造的，以完全地或者尽可能地保留由起始核苷酸序列(其也称为“亲本”序列)原始编码的氨基酸序列。
评价抗体与多种物种的LRP6的结合能力的标准测定法是本领域已知的，包括例如，ELISA、蛋白质印迹和RIA。合适的测定法详细描述于实施例中。还可以通过本领域已知的标准测定法，例如通过Biacore分析或者FACS相对亲和性(Scatchard)来评估抗体的结合动力学(例如，结合亲和性)。评价抗体对LRP6的功能性质的影响的测定法(例如，受体结合测定法、调节Wnt通路)进一步详细描述于实施例中。
因此，应当理解，如根据本领域已知的和本文中所述的方法学测定的“抑制”一种或多种这些LRP6功能性质(例如，生物化学、免疫化学、细胞、生理学或其他生物学活性等)的抗体与相对于在抗体不存在的情况下(例如，或者当无关的特异性对照抗体存在时)观察到的特定活性的统计学显著降低有关。抑制LRP6活性的抗体引起测量参数在统计学上显著降低至少10％，降低至少50％、80％或90％，并且在某些实施方案中，本发明抗体可以抑制LRP6功能活性的95％、98％或99％以上。
在两个或两个以上核酸或多肽序列的情况下，术语“相同百分比”或“同一性百分比”指相同的两个或两个以上序列或子序列。当在比较窗口上比较并比对最大一致性，或者如使用以下序列比较算法之一或者通过人工比对和目视检查测量指定区域时，如果两个序列具有相同的氨基酸残基或核苷酸的特定百分比(即，在指定区域上，或者当没有指定时，在整个序列上具有60％的同一性，任选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的同一性)，那么这两个序列是“基本上同一的”。任选地，在至少约50个核苷酸(或10个氨基酸)长度的区域上，或者更优选地在100-500个或者1000个或者更多核苷酸(或者20、50、200个或更多氨基酸)长度区域上存在同一性。
对于序列比较，通常将一个序列作为参照序列与测试序列比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入到计算机中，根据需要指定子序列坐标(subsequencecoordinate)，并指定序列算法程序参数。可以使用默认程序参数，或者指定备选的参数。然后，基于程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参照序列的序列百分比同一性。
如本文中所用，“比较窗口”包括提及选自20至600，通常约50至约200，更通常地约100至约150个连续位置数的任意之一的区段，其中在最佳地比对该序列与相同数目连续位置的参照序列后，可以比较这两个序列。比对用于比较的序列的方法是本领域熟知的。例如通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算法、通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性算法、通过Pearson和Lipman，(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444的检索相似性的方法、通过这些算法的计算机化实现(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，出自Wisconsin遗传软件包，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)或者通过人工比对和目视检查(参见，例如，Brent等人，(2003)Current Protocols in Molecular Biology),可以进行用于比较的序列的最佳比对。
适合于测定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的两个实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人，(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402；和Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。用于进行BLAST分析的软件是可从国家生物技术信息中心(National Centre for Biotechnology Information)公开得到的。该算法涉及通过在查询序列中鉴定W长度的短字来首先鉴定高得分的序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字比对时，所述序列对匹配或者满足了一些正值阈值得分(positive-valued threshold score)T。T称为邻近字得分阈值(Altschul等人，上述)。将这些最初的邻近字命中作为启动检索的种子以寻找含有它们的更长HSP。字命中沿着每一序列的两个方向延伸，只要积累的比对得分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(匹配残基对的奖励得分；总是大于0)和N(错配残基的罚分；总是小于0)计算积累得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算积累得分。在以下情况下，中止在每一方向上的字命中延伸：积累比对得分从其最大达到值减少了X值；由于一个或多个负得分残基比对的积累，积累得分变成了0或者更低；或者到达了任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望(E)10、M＝5、N＝-4作为默认值，并比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用3的字长、10的期望(E)，以及BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)、50的比对(B)、10的期望(E)、M＝5、N＝-4作为默认值，并比较两条链。
BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计学分析(参见，例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。BLAST算法提供的相似性的一种测量方法是最小和概率(smallest sum probability)(P(N))，其提供了两个核苷酸序列或者氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参照核酸的比较中，最小和概率低于约0.2，更优选地低于约0.01，以及最优选地低于约0.001，那么认为核酸与参照序列相似。
还可以使用已经整合到ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller算法(Comput.Appl.Biosci.4：11-17(1988))，使用PAM120权重残基表(weight residuetable)、12的空位长度罚分和4的空位罚分确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。此外，可以使用已经整合到GCG软件包(可在www.gcg.com得到)中的GAP程序的Needleman和Wunsch(J.Mol,Biol.48：444-453(1970))算法，使用Blossom 62矩阵或者PAM250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的空位权重和1、2、3、4、5或6的长度权重确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比。
除上文提到的序列同一性百分比外，如下所述，两个核酸序列或多肽是基本上相同的另一个指标是由第一核酸编码的多肽与针对由第二核酸编码的多肽产生的抗体在免疫学上交叉反应。因此，该多肽通常基本上与第二多肽相同，例如，其中两种肽仅是保守性取代的不同。如下所述，两个核酸序列是基本上相同的另一种指标是，在严格条件下两个分子或其互补核酸序列相互杂交。两种核酸序列是基本上相同的的又一个指标是，可以将相同的引物用于扩增序列。
如本文中所用，术语“核酸”可与术语“多核苷酸”互换，并指单链形式或者双链形式的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸及其多聚体。该术语包括含有已知核苷酸类似物或者经修饰的骨架残基或者连接的核酸，其可以是合成的、天然存在的和非天然存在的，且具有与参照核酸类似的结合特性，并且其以与参照核苷酸类似的方式代谢。此类类似物的实例包括但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNA)。
除非另外指出，特定的核酸序列还可以包括其经保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指定的序列。具体而言，如下文所详述的，简并密码子取代可以通过产生序列实现，在所述序列中用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代一个或多个选择的(或者全部)密码子的第三位(Batzer等人，(1991)Nucleic Acid Res.19：5081；Ohtsuka等人，(1985)J.Biol.Chem.260：2605-2608；和Rossolini等人，(1994)Mol.Cell.Probes 8：91-98)。
术语“有效连接”指两个或两个以上多核苷酸(例如，DNA)区段之间的功能性关系。通常，有效连接指转录调节序列与转录的序列的功能性关系。例如，如果启动子或增强子序列在合适的宿主细胞或者其他表达系统中刺激或者调节编码序列的转录，那么其与编码序列有效连接。通常，与转录序列有效连接的启动子转录调节序列是与被转录的序列在物理上邻近的，即，它们是顺式作用的。然而，一些转录调节序列，例如增强子，不需要与它们增强转录的编码序列在物理上邻近或者与它们增强转录的编码序列非常接近。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，指氨基酸残基的多聚体。该术语可以应用于这样的氨基酸多聚体，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物，以及天然存在的氨基酸多聚物和非天然存在的氨基酸多聚物。除非另外指出，特定的多肽序列还可以包括其经保守修饰的变体。
术语“个体”包括人类和非人类动物。非人类动物包括全部脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非指出，术语“患者”或“个体”在本文中可互换使用。
术语“抗癌剂”指的是可以用于治疗细胞增殖疾病(例如癌症)的任一试剂，其包括细胞毒性剂、化疗剂、放疗和放疗剂、靶向抗癌剂，以及免疫治疗剂。
“肿瘤”指赘生性细胞生长和增殖(无论恶性还是良性)，以及全部癌前期的和癌性的细胞及组织。
术语“抗肿瘤活性”意为肿瘤细胞增殖的速率、存活力或者转移活性的降低。显示抗肿瘤活性的一种可能的方式是显示在治疗期间产生的异常细胞的生长速率的降低或者肿瘤大小的稳定或者减小。该活性可以使用已接受的体外或体内肿瘤模型评估，包括但不限于异种移植模型、同种异体移植模型、MMTV模型和本领域已知的用于研究抗肿瘤活性的其他已知模型。
术语“恶性肿瘤”指非良性的肿瘤或者癌症。如本文中所用，术语“癌症”包括以失调的或者不受控制的细胞生长为特征的恶性肿瘤。示例性癌症包括：癌、肉瘤、白血病和淋巴瘤。术语“癌症”包括原发性恶性肿瘤(例如，那样的恶性肿瘤,其细胞在个体身体中并不迁移到除原初肿瘤位点之外的位点)和继发性恶性肿瘤(例如，转移引起的那些恶性肿瘤，肿瘤细胞迁移到不同于原初肿瘤位点的第二位点)。
在以下章节和分段中进一步描述了本发明的多个方面。
LRP6和Wnt信号通路
本发明涉及LRP6抗体及其用途。通过针对LRP6的分子抑制Wnt信号导致了经典Wnt信号的丧失。因此，用抗体拮抗LRP6受体功能将抑制Wnt信号转导，并帮助与经典Wnt信号相关的疾病，例如癌症。具体而言，在不同的疾病背景下，LRP6抗体可以特异性增加或者降低由Wnt1或Wnt3a类蛋白质介导的信号转导。
Wnt/β-联蛋白信号通路的错误调节与多种人类疾病例如癌症和骨疾病相关。在这些疾病中恢复Wnt信号平衡的分子可能具有治疗潜能。使用基于噬菌体的淘选，已经鉴定，LRP6抗体可以抑制或者增强Wnt信号。显著地，已经鉴定了两种类型的LRP6拮抗抗体。一种类型的抗体特异性抑制由Wnt1代表的Wnt蛋白质，而第二种类型特异性抑制由Wnt3a代表的Wnt蛋白质。表位作图实验显示，Wnt1-特异性和Wnt3a特异性LRP6抗体分别与LRP6的第一螺旋桨和第三螺旋桨结合，表明Wnt1和Wnt3a蛋白质与LRP6的不同螺旋桨结合(参见2008年10月31日提交的国际申请系列号PCT/EP2008/064821，所述文献的内容以其整体引入作为参考)。
LRP6的螺旋桨3结构域的其他特征鉴定了该结构域中负责与抗体相互作用的残基。使用氢-氘交换(HDx)质谱(MS)鉴定了螺旋桨3的YWTD-EGF区内的抗体结合位点，并且其对应于螺旋桨3结构域的叶片1和叶片6之间的凹面。
Wnt信号通路在胚胎发育和出生后组织维持中非常重要。其通过指导控制细胞生长、运动和细胞存活的时间和空间调节的一组特定基因实现(综述于Barker和Clevers(2006)Nature Rev.5：997中)。对于维持组织稳态，该通路的正确调节非常重要。该通路的长期活化会促进不受控制的细胞生长和存活，并可以最终促使细胞增殖疾病(例如癌症)的发展。或者，该通路的异常抑制可能导致许多疾病状态，例如，例如骨量丢失和其他骨疾病。Wnt蛋白质通过与Frizzled受体和两种细胞表面受体之一相互作用引发下游信号，所述细胞表面受体为低密度脂蛋白受体(LDLR)相关蛋白质(LRP)的成员：LRP5和LRP6)(综述于He等人，(2004)Development 31：1663-1677中)。
LRP6在经典Wnt信号通路中的作用通过遗传研究发现。缺少LRP6的突变小鼠表现出与几种个别的Wnt基因突变相似的组合表型(Pinson等人，(2000)Nature 407：535-538)。在非洲爪蟾属(Xenopus)胚胎中，显性阴性的LRP6阻断了由几种Wnt蛋白质发出的信号，然而过表达LRP6活化了Wnt/β-联蛋白信号通路(Tamai等人，(2000)Nature 407：530-535)。此外，已经显示，LRP6或LRP5的表达对于细胞应答经典Wnt信号是必需的(综述于He等人，上述，2004)。
LRP5和LRP6是高度同源的，并且在它们的胞外和胞内结构域中分别具有73％和64％的同一性。它们在胚胎发生期间和在成年组织中广泛地共表达，并共有一些功能性冗余。
LRP5和LRP6的胞外结构域包含三个基本结构域：1)YWTD(酪氨酸、色氨酸、苏氨酸、天冬氨酸)-型β-螺旋桨区，2)EGF(表皮生长因子)样结构域，和3)LDLR型A(LA)结构域。
YWTD型β-螺旋桨区含有6个每个43-50个氨基酸残基的YWTD重复，并且形成6-叶片的β-螺旋桨结构。在LRP5和LRP6中，存在4个YWTD型β-螺旋桨区，每一个YWTD型β-螺旋桨区之后是EGF样结构域，其包含具有保守的半胱氨酸残基的约40个氨基酸残基，其后面依次是3个LA结构域(Springer等人，(1998)J.MoI.Biol.283：837-862；Jeon等人，(2001)Nat.Struct.Biol.8：499-504)。β-螺旋桨EGF样结构域可以结合胞外配体。LRP6的胞外结构域通过氨基酸残基19-1246定义，并在氨基酸残基43-324、352-627、654-929和957-1250处含有4个β-螺旋桨结构域，其分别对应于β-螺旋桨区1、2、3和4。螺旋桨结构域1-2包含氨基酸19-629，并且螺旋桨结构域3-4包含氨基酸631-1246。
LRP6抗体
本发明提供与LRP6(例如，人LRP6、食蟹猴(cynomologus)LRP6、小鼠LRP6和大鼠LRP6)特异性结合的抗体。本发明基于以下意外发现，如在2008年10月31日提交的国际申请系列号PCT/EP2008/064821中所述，可以将能活化β-联蛋白信号通路的Wnt蛋白质分成两种，并且它们需要LRP6的不同β-螺旋桨区用于信号通路，所述文献的内容在此处以其整体引用作为参考。此外，二聚/二价LRP6抗体(例如，IgG)使细胞对Wnt信号强烈敏感，例如通过二聚化内源的LRP6。这些结果显示，Wnt1和Wnt3的信号活化差别地需要β-螺旋桨1和β-螺旋桨3。这些发现提供了Wnt诱导的LRP6活化的新视角，并为开发在不同疾病中调节Wnt信号通路的LRP6抗体铺平了道路。将LRP6抗体的片段(例如，Fab)转变成IgG格式导致了使LRP6受体成簇的抗体，并且在配体蛋白质存在的情况下可以增强Wnt信号。
在一个实施方案中，抗体增强Wnt信号。在该实施方案中，Wnt信号基于在Wnt配体存在的情况下抗体片段转变成全长IgG LRP6抗体而活化并增强。例如，Wnt 1Fab与LRP6受体的β-螺旋桨1区结合，并在Wnt配体(例如Wnt3)不存在的情况下阻断Wnt 1通路。在Wnt配体(例如Wnt3)存在的情况下，Wnt 1Fab通过Wnt 1通路阻断信号，但是信号活化可以通过Wnt 3通路发生，从而产生信号。当将Wnt 1Fab转变成全长Wnt 1IgG时，Wnt 1IgG与两个LRP6受体的螺旋桨1区结合，并阻断Wnt 1通路，然而，在Wnt配体(例如Wnt 3)存在的情况下，信号活化通过Wnt 3通路发生并且同时增强。尽管并不需要提供作用的理论，但是一种可能的机制是IgG通过与每一LRP6受体的螺旋桨1区结合，将两个或者两个以上LRP6受体成簇，其在Wnt 3配体存在的情况下通过Wnt 3通路产生更强的信号。LRP6受体的二聚化可能通过增加涉及LRP6的多种相互作用的亲和力来促进Wnt信号。
用与LRP6受体的螺旋桨3区结合的Wnt 3Fab获得了相反的结果，并且阻断了Wnt 3通路。在Wnt 1配体存在的情况下，Wnt 3Fab阻断了Wnt 3通路，但活化Wnt 1通路来产生信号。当将Wnt 3Fab转变成全长Wnt 3IgG时，Wnt 3IgG与两个LRP6受体的螺旋桨3区结合，并且在Wnt 1配体存在的情况下，通过Wnt 1通路抑制信号。在另一个实施方案中，抗体避免增强Wnt信号。在一些实施方案中，本发明提供了与人类和食蟹猴LRP6二者特异性结合的抗体。在一个实施方案中，LRP6抗体是拮抗性抗体。在另一个实施方案中，LRP6抗体是激动性抗体。
由于不同的Wnt蛋白质需要LRP6的不同螺旋桨用于信号转导，并且由于LRP6的成簇或者二聚化增强了Wnt信号，所以可以使用抗体的不同组合，调节使用LRP6抗体的疗法。
在一个实施方案中，将LRP6抗体用作单体抗体或者其片段例如单链抗体、单抗体(unibody)等。在一个实施方案中，将与LRP6的螺旋桨1区结合的单体LRP6抗体和与LRP6的螺旋桨3区结合的单体LRP6抗体组合使用。在另一个实施方案中，将LRP6抗体用作为多聚体抗体或者其片段例如双特异性LRP6抗体、双旁原位LRP6抗体。
除Wnt配体外，LRP6螺旋桨1抗体预期可以抑制与其他螺旋桨1结合配体(例如，Sclerostin、Dkk1)的相互作用。类似地，螺旋桨3抗体预期可以抑制与其他螺旋桨3结合受体(例如Dkk1)的相互作用。此外，螺旋桨1和3结合抗体预期可以影响其他Wnt信号调节物(例如R-spondins)的活化。
本发明还提供了与LRP6蛋白(例如，人类和/或食蟹猴LRP6)特异性结合的抗体，该抗体包含具有在下文表1中所列VH CDR的任意之一的氨基酸序列的VH CDR。具体而言，本发明提供了与LRP6蛋白(例如，人类和/或食蟹猴LRP6)特异性结合的抗体，该抗体包含具有在下文表1中所列的任意VH CDR的氨基酸序列的1个、2个、3个、4个或更多VH CDR，或者备选地由所述VH CDR组成。
本发明提供了与LRP6蛋白(例如，人类和/或食蟹猴LRP6)特异性结合的抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO:14、34、36、44、60和62的氨基酸序列的VH结构域。本发明提供了与LRP6蛋白(例如，人类和/或食蟹猴LRP6)特异性结合的抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO:13、33、35、43、59和61的氨基酸序列的VL结构域。
本发明提供了与LRP6蛋白(例如，人类和/或食蟹猴LRP6)特异性结合的抗体，该抗体包含具有SEQ ID NO:82、89、106、108、128、130和138的氨基酸序列的VH结构域。本发明提供了与LRP6蛋白(例如，人类和/或食蟹猴LRP6)特异性结合的抗体，该抗体包含具有SEQ IDNO:81、90、105、107、127和129的氨基酸序列的VL结构域。
本发明的其他抗体包括已经突变的氨基酸，在CDR区中其仍具有与在表1中所述的序列中所描述的CDR区至少60％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性。在一些实施方案中，所述抗体包括突变的氨基酸序列，其中当与在表1中所述的序列中所描述的CDR区比较时，所述抗体在CDR区已经突变了不多于1、2、3、4或5个氨基酸，但仍维持它们对原始抗体表位的特异性。
本发明的其他抗体包括已经突变的氨基酸，其在框架区中仍具有与在表1中所述的序列中所描述的框架区至少60％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性。在一些实施方案中，所述抗体包括突变的氨基酸序列，其中当与在表1中所述的序列中所描述的框架区比较时，所述抗体在框架区已经突变了不多于1、2、3、4、5、6或7个的氨基酸，但仍维持其对原始抗体的表位的特异性。
本发明还提供了与LRP6蛋白(例如，人和/或食蟹猴LRP6)特异性结合的抗体的VH、VL、全长重链和全长轻链的编码核酸序列。可以优化此类核酸序列用于在哺乳动物细胞中表达(例如，表1用于β-螺旋桨1抗体的MOR08168、MOR08545和MOR06706，以及用于β-螺旋桨3抗体的MOR06475、MOR08193和MOR08473)。
本发明的LRP6抗体与不同LRP6β-螺旋桨区结合。螺旋桨1抗体与β螺旋桨1结构域结合，并阻断螺旋桨1依赖的Wnt，例如Wnt1、Wnt2、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt9、Wnt10A、Wnt10B。螺旋桨3抗体与β螺旋桨3结构域结合，并阻断螺旋桨3依赖的Wnt，例如Wnt3a和Wnt3。
表1：本发明LRP6抗体的实例
表1：本发明LRP6抗体的实例
本发明的其他抗体包括这样的抗体，其中已经突变了氨基酸或者编码氨基酸的核酸，但所述抗体仍具有与表1中所述的序列至少60％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性。在一些实施方案中，所述抗体包括突变的氨基酸序列，其中当与表1中所述的序列中所描述的可变区比较时，所述抗体在可变区中已经突变了不超过1、2、3、4或5个氨基酸，但仍保留了基本上相同的治疗活性。
因为这些抗体的每一个都可以与LRP6结合，所以可以“混合并匹配”VH、VL、全长轻链和全长重链序列(氨基酸序列和编码该氨基酸序列的核苷酸序列)，以产生本发明的其他LRP6抗体。可以使用本领域已知的结合测定法(例如，ELISA，以及在实施例部分中所述的其他测定法)测试此类“经混合并匹配的”LRP6抗体。当混合并匹配这些链时，应当用结构上类似的VH序列替换来自特定VH/VL对的VH序列。同样地，应当用结构上类似的全长重链序列替换来自特定全长重链/全长轻链对的全长重链序列。同样地，应当用结构上类似的VL序列替换来自特定VH/VL对的VL序列。同样地，应当用结构上类似的全长轻链序列替换来自特定全长重链/全长轻链对的全长轻链序列。因此，在一个方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或者它的片段，其具有：包含选自SEQ ID NO:14、34、36、44、60和62的氨基酸序列的重链可变区；和包含选自SEQ ID NO:13、33、35、43、59和61的氨基酸序列的轻链可变区；选自SEQID NO:82、106、108、128、130和138的重链；和包含选自SEQ ID NO:81和90、105、107、127、129和137的氨基酸序列的轻链可变区；其中该抗体与LRP6(例如，人和/或食蟹猴LRP6)特异性结合。
在另一方面，本发明提供了与LRP6的β螺旋桨1结构域结合的LRP6抗体，其包含如在表1中所述的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或者它们的组合。抗体的VH CDR1的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:1、21和47中。抗体的VH CDR2的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:2、22和48中。抗体的VH CDR3的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:3、23和49。抗体的VL CDR1的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:4、24和50中。抗体的VL CDR2的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:5、25和51中。抗体的VL CDR3的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:6、26和52中。使用Kabat系统描述CDR区(Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公布号91-3242；Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，(1989)Nature 342：877-883；和Al-Lazikani等人，(1997)J.Mol.Biol.273，927-948)。
在另一方面，本发明提供了与LRP6的β螺旋桨3结构域结合的LRP6抗体，其包含如在表1中所述的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或者它们的组合。抗体的VH CDR1的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:69、93和115中。抗体的VH CDR2的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:70、94和116中。抗体的VH CDR3的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:71、95和117。抗体的VL CDR1的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:72、96和118中。抗体的VL CDR2的氨基酸序列显示于SEQ IDNO:73、97和119中。抗体的VL CDR3的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:74、98和120中。使用Kabat系统描述CDR区(Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH公布号91-3242；Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，(1989)Nature 342：877-883；和Al-Lazikani等人，(1997)J.Mol.Biol.273，927-948)。
鉴于这些抗体的每一个都可以与LRP6结合，并且主要通过CDR1、2和3区提供结合抗原的特异性，那么可以“混合并匹配”VH CDR1、2和3序列以及VL CDR1、2和3序列(即，可以混合并匹配来自不同抗体的CDR，尽管每一抗体必须含有VH CDR1、2和3以及VL CDR1、2和3，以产生本发明的其他LRP6结合分子)。可以使用本领域已知的结合测定法以及那些在实施例中所述的测定法(例如，ELISA)测试此类“混合并匹配的”LRP6抗体。当混合并匹配VH CDR序列时，应当用结构上类似的CDR序列替换来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。同样地，当混合并匹配VL CDR序列时，应当用结构上类似的CDR序列替换来自特定的VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列。普通技术人员将很容易理解，可以通过用来自本文中所示的用于本发明单克隆抗体的结构上类似的CDR序列取代一个或多个VH和/或VL CDR区序列来产生新的VH和VL序列。
因此，本发明提供了分离的LRP6β-螺旋桨1单克隆抗体或它的片段，其包含：包含选自SEQ ID NO:1、21和47的氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含选自SEQ ID NO:2、22和48的氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含选自SEQ ID NO:3、23和49的氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含选自SEQ ID NO:4、24和50的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含选自SEQ IDNO:5、25和51的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及包含选自SEQ ID NO:6、26和52的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；其中所述抗体结合LRP6。
因此，本发明提供了分离的LRP6β-螺旋桨3单克隆抗体或它的片段，其包含：包含选自SEQ ID NO:69、93和115的氨基酸序列的重链可变区CDR1；包含选自SEQ ID NO:70、94和116的氨基酸序列的重链可变区CDR2；包含选自SEQ ID NO:71、95和117的氨基酸序列的重链可变区CDR3；包含选自SEQ ID NO:72、96和118的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；包含选自SEQ ID NO:73、97和119的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；以及包含选自SEQ ID NO:74、98和120的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；其中所述抗体结合LRP6。
在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:1的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:2的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:3的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:4的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:5的轻链可变区CDR2；以及SEQ ID NO:6的轻链可变区CDR3。
在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:21的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:22的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:23的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:24的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:25的轻链可变区CDR2；以及SEQ ID NO:26的轻链可变区CDR3。
在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:47的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:48的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:49的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:50的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:51的轻链可变区CDR2；以及SEQ ID NO:52的轻链可变区CDR3。
在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:69的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:70的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:71的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:72的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:73的轻链可变区CDR2；以及SEQ ID NO:74的轻链可变区CDR3。
在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:93的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:94的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:95的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:96的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:97的轻链可变区CDR2；以及SEQ ID NO:98的轻链可变区CDR3。
在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:115的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:116的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:117的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:118的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:119的轻链可变区CDR2；以及SEQ ID NO:120的轻链可变区CDR3。
在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:14的VH和SEQ ID NO:13的VL。在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:34的VH和SEQ ID NO:33的VL。在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:35的VH和SEQ ID NO:36的VL。在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:43的VH和SEQ ID NO:44的VL。在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:60的VH和SEQ ID NO:59的VL。在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:62的VH和SEQ ID NO:61的VL。在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:82的VH和SEQ ID NO:81的VL。在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:90的VH和SEQ ID NO:89的VL。在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:106的VH和SEQ ID NO:105的VL。在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:108的VH和SEQ ID NO:107的VL。在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:128的VH和SEQ ID NO:127的VL。在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:130的VH和SEQ ID NO:129的VL。在特定的实施方案中，与LRP6结合的抗体包含SEQ ID NO:138的VH和SEQ ID NO:137的VL。
在一个实施方案中，LRP6抗体是拮抗性抗体。在一个实施方案中，LRP6抗体是激动性抗体。在某些实施方案中，与LRP6结合的抗体是表1中所述的抗体。
如本文中所用，如果抗体的可变区或者全长链获自使用人种系免疫球蛋白基因的系统，那么人抗体包含“产生自”或者“衍生自”特定种系序列的重链或轻链可变区或者全长重链或轻链。此类系统包括用目的抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠或者用目的抗原筛选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。可以以下述方式鉴定“产生自”或者“衍生自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体，例如通过将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列比较，并选择在序列上与人抗体的序列最接近(即，最大百分比同一性)的人种系免疫球蛋白。由于例如天然存在的体细胞突变或者定点突变的故意引入，与种系序列相比较，“产生自”或者“衍生自”特定的人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以含有氨基酸差异。然而，在VH或VL框架区中，选择的人抗体在氨基酸序列中通常与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有至少90％的同一性，并且当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，小鼠种系序列)比较时，含有鉴定人抗体为人类的抗体的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体可以在氨基酸序列中具有与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％或者至少95％或者甚至至少96％、97％、98％或99％的同一性。通常，重组的人抗体在VH和VL框架区中展示出与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于10个氨基酸的差异。在某些情况下，人抗体可以展示出与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于5个或者甚至不多于4、3、2或1个氨基酸差异。
本文中所公开的抗体可以是单链抗体、双抗体、结构域抗体、纳米抗体和单抗体的衍生物。“单链抗体”(scFv)由包含与V结构域连接的VL结构域的单个多肽链组成，其中VL结构域和VH结构域配对以形成单价分子。单链抗体可以根据本领域已知的方法(参见，例如，Bird等人，(1988)Science 242：423-426和Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879-5883)制备。“disbud”由两个链组成，每一链包含在通过短肽接头连接的相同多肽链上与轻链可变区连接的重链可变区，其中在同一链上的两个区域并不相互配对，但与另一链上的互补结构域配对，以形成双特异性抗体。制备双抗体的方法是本领域已知的(参见，例如，Holliger等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448，和Poljak等人，(1994)Structure 2：1121-1123)。结构域抗体(dAb)是抗体的小功能性结合单位，相应于抗体的重链或者轻链的可变区。结构域抗体可以很好地在细菌、酵母和哺乳动物细胞系统中表达。结构域抗体的其他细节及其产生的方法是本领域已知的(参见，例如，美国专利号6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；6,696,245；欧洲专利0368684&0616640；WO05/035572、WO04/101790、WO04/081026、WO04/058821、WO04/003019和WO03/002609)。纳米抗体衍生自抗体的重链。纳米抗体通常包含单个可变结构域和两个恒定结构域(CH2和CH3)，并保留原始抗体的抗原结合能力。可以通过本领域已知的方法制备纳米抗体(参见，例如，美国专利号6,765,087、美国专利号6,838,254、WO 06/079372)。单抗体由IgG4抗体的一个轻链和一个重链组成。单抗体可以通过去除IgG4抗体的铰链区制备。单抗体的其他细节以及制备它们的方法可见于WO2007/059782中。
除Wnt配体外，预期LRP6螺旋桨1抗体可以抑制与其他螺旋桨1结合配体(例如，Sclerostin、Dkk1)的相互作用。类似地，预期螺旋桨3抗体可以抑制与其他螺旋桨3结合配体(例如Dkk1)的相互作用。此外，预期螺旋桨1和3结合抗体可以影响其他Wnt信号调节物，例如R-spondins的活性。
同源抗体
在另一个实施方案中，本发明提供了包含与表1中所述的序列同源的氨基酸序列的抗体或其片段，并且该抗体与LRP6蛋白(例如，人和/或食蟹猴LRP6)结合，并保留表1中所述那些抗体的所希望的功能性特性。
例如，本发明提供了包含重链可变区和轻链可变区的分离的单克隆抗体(或其功能性片段)，其中重链可变区包含具有与选自SEQ ID NO:14、34、36、44、60和62的氨基酸序列至少80％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列；轻链可变区包含具有与选自SEQID NO:13、33、37、43、59和61的氨基酸序列至少80％、至少90％或至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列；抗体与LRP6(例如，人和/或食蟹猴LRP6)的β-螺旋桨1结合，并抑制β-螺旋桨1依赖的Wnt蛋白质的信号活性，所述信号活性可以如本文中所述在Wnt报告基因测定或者Wnt指导的信号转导(例如，LRP6磷酸化、β-联蛋白稳定性和核易位、细胞增殖/存活)的其他测量法中测量。在具体的实例中，当使用条件培养基或者转染的细胞时，此类抗体在Wnt1测定法中具有小于10nM的EC50值。
例如，本发明提供了包含重链可变区和轻链可变区的分离的单克隆抗体(或其功能性片段)，其中重链可变区包含具有与选自SEQ ID NO:82、89、106、108、128、130和138的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列；轻链可变区包含具有与选自SEQ ID NO:81、90、105、107、127、129和137的氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的氨基酸序列；抗体与LRP6(例如，人和/或食蟹猴LRP6)的β-螺旋桨3结合，并抑制β-螺旋桨3依赖的Wnt蛋白质的信号活性，所述信号活性可以如本文中所述在Wnt报告基因测定法或者Wnt指导的信号(例如，LRP6磷酸化、β-联蛋白稳定性和核易位、细胞增殖/存活)的其他测量法中测量。在具体的实例中，当使用条件培养基或者转染的细胞时，此类抗体在Wnt 3测定法中具有小于10nM的EC50值。
此外，对于螺旋桨1抗体，可变重链亲本核苷酸序列显示于SEQ ID NO:16、38和64中。可变轻链亲本核苷酸序列显示于SEQ ID NO:15、37和63中。为在哺乳动物细胞中表达而优化的全长重链序列显示于SEQ ID NO:20、42和68中。为在哺乳动物细胞中表达而优化的全长轻链序列显示于SEQ ID NO:19、41和67中。本发明的其他抗体包括已经突变，但仍具有与上述序列至少60％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性的氨基酸或者核酸。在一些实施方案中，所述抗体包含这样的突变氨基酸序列，其中当与上述序列中所描述的可变区比较时，已经通过氨基酸缺失、插入或取代在可变区突变了不多于1、2、3、4或5个氨基酸。
此外，对于螺旋桨3抗体，可变重链亲本核苷酸序列显示于SEQ ID NO:84、110和132中。可变轻链亲本核苷酸序列显示于SEQ ID NO:83、109和131中。为在哺乳动物细胞中表达而优化的全长重链序列显示于SEQ ID NO:88、91、114、136和140中。为在哺乳动物细胞中表达而优化的全长轻链核苷酸序列显示于SEQ ID NO:87、92、113、135和139中。本发明的其他抗体包括已经突变的氨基酸或者核酸，并与上述序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％或98％的同一性。在一些实施方案中，所述抗体包含这样的突变氨基酸序列，其中当与上述序列中所描述的可变区比较时，已经通过氨基酸缺失、插入或取代在可变区突变了不多于1、2、3、4或5个氨基酸。
在其他实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以具有与表1中给出的序列50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在其他实施方案中，除不超过1、2、3、4或5个氨基酸位置的氨基酸取代外，VH和/或VL氨基酸序列可以是相同的。可以通过分别诱变(例如，定点诱变或PCR介导的诱变)编码SEQ ID NO:14、34、60、13、33和59的核酸分子，之后使用本文中所述的功能性测定法检测编码的改变的抗体的保留功能来获得具有与表1中所述的那些螺旋桨1抗体的VH和VL区高(即，80％或更高)同一性的VH和VL区的抗体。
可以通过分别诱变(例如，定点诱变或PCR介导的诱变)编码SEQ ID NO:82、106、128、81、105和127的核酸分子，之后使用本文中所述的功能性测定法检测编码的改变的抗体的保留功能来获得具有与表1中所述的那些螺旋桨3抗体的VH和VL区高(即，80％或更高)同一性的VH和VL区的抗体。
在其他实施方案中，重链和/或轻链的可变区核苷酸序列可以具有与上述序列60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
如本文中所用，两个序列之间的“百分比同一性”是序列共有的相同位置数的函数(即，百分比同一性等于相同位置数/位置总数×100)，其考虑为了两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数目和每一空位的长度。如在下文的非限制性实施例中所述，可以使用数学算法实现两个序列之间的序列比较和百分比同一性的确定。
额外地或备选地，还可以将本发明的蛋白质序列用作“查询序列”，以进行针对公共数据的检索，例如来鉴定相关序列。例如，可以使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的BLAST程序(2.0版)进行此类检索。
具有保守修饰的抗体
在某些实施方案中，本发明抗体具有包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中，这些CDR序列的一个或多个具有基于本文中所述的抗体或其保守修饰的特定的氨基酸序列，并且其中所述抗体保留了本发明LRP6抗体所希望的功能性特性。
因此，本发明提供了分离的螺旋桨1单克隆抗体或者它的功能性片段，其由包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区组成，其中：重链可变区CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO:1、21和47及其保守修饰；重链可变区CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NO:2、22和48及其保守修饰；重链可变区CDR3氨基酸序列选自SEQID NO:3、23和49及其保守修饰；轻链可变区CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO:4、24和50及其保守修饰；轻链可变区CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NO:5、25和51及其保守修饰；轻链可变区CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NO:6、26和52及其保守修饰；抗体或其片段与LRP6特异性结合，并通过抑制Wnt信号通路抑制LRP6活性，所述活性可以如本文中所述在Wnt报告基因测定法或者Wnt指导的信号(例如，LRP6磷酸化、β-联蛋白稳定性和核易位、细胞增殖/存活)的其他测量法中测量。
因此，本发明提供了分离的螺旋桨3单克隆抗体或者它的功能性片段，其由包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区组成，其中：重链可变区CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO:69、93和115及其保守修饰；重链可变区CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NO:70、94和116及其保守修饰；重链可变区CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NO:71、95和117及其保守修饰；轻链可变区CDR1氨基酸序列选自SEQ ID NO:72、96和118及其保守修饰；轻链可变区CDR2氨基酸序列选自SEQ ID NO:73、97和119及其保守修饰；轻链可变区CDR3氨基酸序列选自SEQ ID NO:74、98和120及其保守修饰；抗体或其片段与LRP6特异性结合，并抑制螺旋桨3－依赖的Wnt蛋白质的活性，所述活性可以如本文中所述在Wnt报告基因测定法或者Wnt指导的信号转导(例如，LRP6磷酸化、β-联蛋白稳定性和核易位、细胞增殖/存活)的其他测量法中测量。
与相同表位结合的抗体
本发明提供了这样的抗体，其结合的表位与表1中所述的LRP6抗体所结合的表位相同。因此，可以基于额外抗体与本发明的其他抗体在LRP6结合测定法中交叉竞争(例如，以统计学显著的方式竞争性抑制结合)的能力来鉴定所述额外抗体。测试抗体抑制本发明抗体与LRP6蛋白(例如，人和/或食蟹猴LRP6)结合的能力表明，测试抗体可以与该抗体竞争结合LRP6；根据非限制性理论，该抗体可以与其竞争的抗体结合LRP6蛋白上相同的或者相关的(例如，结构上类似的或者空间上接近的)表位。在一个实施方案中，与本发明抗体结合LRP6上相同的表位的抗体是人单克隆抗体。可以如本文中所述制备并分离此类人单克隆抗体。
改造和修饰抗体
本发明的抗体还可以如下制备：使用具有本文中所示的一个或多个VH和/或VL序列的抗体作为原料以改造得到经修饰的抗体，其中经修饰的抗体可以具有从起始抗体改变的性质。通过修饰在一个或两个可变区(即VH和/或VL)内的一个或多个残基可以改造抗体，例如修饰在一个或多个CDR区内和/或在一个或多个框架区内的一个或多个残基。额外地或者备选地，通过修饰恒定区内的残基可以改造抗体，例如以改变抗体的效应功能。
可以进行的可变区改造的一种类型是CDR移植。抗体主要通过定位于6个重链和轻链互补决定区(CDR)的氨基酸残基与靶抗原相互作用。因此，在各个抗体之间的CDR内的氨基酸序列比CDR之外的序列更多种多样。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，所以有可能通过构建表达载体表达模拟特定的天然存在的抗体的性质的重组抗体，所述表达载体包含来自特定的天然存在的抗体的CDR序列，该CDR序列被移植到来自具有不同特性的不同抗体的框架序列上(参见，例如，Riechmann等人，(1998)Nature 332：323-327；Jones等人，(1986)Nature 321：522-525；Queen等人，(1989)Proc.Natl.Acad.，美国86：10029-10033；Winter的美国专利号5,225,539和Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
因此，本发明的另一个实施方案涉及分离的螺旋桨1单克隆抗体或它的片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区分别包含具有选自SEQ ID NO:1、21和47的氨基酸序列的CDR1序列；具有选自SEQ ID NO:2、22和48的氨基酸序列的CDR2序列；具有选自SEQ ID NO:3、23和49的氨基酸序列的CDR3序列；所述轻链可变区分别包含具有选自SEQ ID NO:4、24和50的氨基酸序列的CDR1序列；具有选自SEQ ID NO:5、25和51的氨基酸序列的CDR2序列；以及由选自SEQ ID NO:6、26和52的氨基酸序列组成的CDR3序列。因此，此类抗体含有单克隆抗体的VH和VL CDR序列，还可以含有来自这些抗体的不同框架序列。
因此，本发明的另一个实施方案涉及分离的螺旋桨3单克隆抗体或它的片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中所述重链可变区分别包含具有选自SEQ ID NO:69、93和115的氨基酸序列的CDR1序列；具有选自SEQ ID NO:70、100和116的氨基酸序列的CDR2序列；具有选自SEQ ID NO:71、95和117的氨基酸序列的CDR3序列；所述轻链可变区分别包含具有选自SEQ ID NO:72、96和118的氨基酸序列的CDR1序列；具有选自SEQ ID NO:73、97和119的氨基酸序列的CDR2序列；以及由选自SEQ ID NO:74、98和120的氨基酸序列组成的CDR3序列。因此，此类抗体含有单克隆抗体的VH和VL CDR序列，还可以含有来自这些抗体的不同框架序列。
可以从包含种系抗体基因序列的公共DNA数据库或者发表的参考文献中获得此类框架序列。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于“Vase”人类种系序列数据库(可在互联网www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase上得到)中，以及Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH公布号91-3242；Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，(1989)Nature 342：877-883；和Al-Lazikani等人，(1997)J.Mol.Biol.273：927-948；Tomlinson等人，(1992)J.fol.Biol.227：776-798；和Cox等人，(1994)Eur.J Immunol.24：827-836中；将所述每一文献的内容明确并入本文作为参考。
用于本发明抗体的框架序列的实例是与本发明选择的抗体的框架序列结构上相似的那些框架序列，例如本发明的单克隆抗体所使用的共有序列和/或框架序列。可以将VHCDR1、2和3序列，以及VL CDR1、2和3序列移植到框架区上，所述框架区具有与在衍生该框架序列的种系免疫球蛋白基因中所发现的序列相同的序列，或者可以将CDR序列移植到与种系序列比较，含有一个或多个突变的框架区上。例如，已经发现，在某些情况下，在框架区内突变残基以维持或者增强抗体的抗原结合能力是有益的(参见例如，Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
可变区修饰的另一种类型是在VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内突变氨基酸残基，从而改进目的抗体的一个或多个结合性质(例如，亲和性)，称作“亲和性成熟”。可以进行定点诱变或者PCR介导的诱变以引入突变，并且可以如本文中所述以及实施例中所提供，在体外或体内测定法中评价对抗体结合或者其他功能性目的特性的影响。可以引入保守修饰(如上所述)。突变可以是氨基酸取代、添加或缺失。此外，通常改变CDR区内不超过1、2、3、4或5个残基。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供由重链可变区和轻链可变区组成的分离的螺旋桨1单克隆抗体或其片段，所述重链可变区具有：VH CDR1区，其由选自SEQ ID NO:1、21和47的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:1、21和47比较，具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或者添加的氨基酸序列组成；VH CDR2区，其具有选自SEQ ID NO:2、22和48的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2、22和48比较，具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或者添加的氨基酸序列；VH CDR3区，其具有选自SEQ ID NO:3、23和49的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:3、23和49比较，具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或者添加的氨基酸序列；所述轻链可变区具有：VL CDR1区，其具有选自SEQ ID NO:4、24和50的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4、24和50比较，具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或者添加的氨基酸序列；VL CDR2区，其具有选自SEQ ID NO:5、25和51的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:5、25和51比较，具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或者添加的氨基酸序列；和VL CDR3区，其具有选自SEQ ID NO:6、26和52的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:6、26和52比较，具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或者添加的氨基酸序列。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供由重链可变区和轻链可变区组成的分离的螺旋桨3单克隆抗体或其片段，所述重链可变区具有：VH CDR1区，其由选自SEQ ID NO:69、93和115的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:69、93和115比较，具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或者添加的氨基酸序列组成；VH CDR2区，其具有选自SEQ ID NO:70、94和116的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:70、94和116比较，具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或者添加的氨基酸序列；VH CDR3区，其具有选自SEQ ID NO:71、95和117的氨基酸序列或者与SEQID NO:71、95和117比较，具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或者添加的氨基酸序列；所述轻链可变区具有：VL CDR1区，其具有选自SEQ ID NO:72、96和118的氨基酸序列或者与SEQID NO:72、96和118比较，具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或者添加的氨基酸序列；VLCDR2区，其具有选自SEQ ID NO:73、97和119的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:73、97和119比较，具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或者添加的氨基酸序列；和VL CDR3区，其具有选自SEQ ID NO:74、98和120的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:74、98和120比较，具有1、2、3、4或5个氨基酸取代、缺失或者添加的氨基酸序列。
将抗体片段移植到备选的框架或支架中
可以使用多种抗体/免疫球蛋白框架或支架，只要得到的多肽包括与LRP6特异性结合的至少一个结合区。此类框架或者支架包括人类免疫球蛋白的5种主要独特型或者其片段，并包括其他动物种类的免疫球蛋白，优选地具有人源化方面的免疫球蛋白。本领域技术人员不断发现并开发了新的框架、支架和片段。
在一个方面，本发明涉及使用非免疫球蛋白支架(可以将本发明CDR移植到该支架上)，产生基于非免疫球蛋白的抗体。可以使用已知的或者未来可知的非免疫球蛋白框架和支架，只要它们包含对靶LRP6蛋白(例如，人和/或食蟹猴LRP6)特异的结合区。已知的非免疫球蛋白框架或者支架包括但不限于，纤连蛋白(Compound Therapeutics，Inc.，Waltham，MA)、ankyrin(Molecular Partners AG，Zurich，瑞士)、结构域抗体(Domantis，Ltd.，Cambridge，MA和Ablynx nv，Zwijnaarde，Belgium)、脂质运载蛋白(Pieris Proteolab AG，Freising，德国)、小模块的免疫药物(Trubion Pharmaceuticals Inc.，Seattle，WA)、maxybodies(Avidia，Inc.，Mountain View，CA)、A蛋白(Affibody AG，瑞典)，以及affilin(γ-晶体蛋白或泛素)(Scil Proteins GmbH，Halle，德国)。
纤连蛋白支架基于纤连蛋白III型结构域(如纤连蛋白III型的第十个组件(10Fn3结构域))。纤连蛋白III型结构域具有分布于两个β片层之间的7个或8个β链，(所述β片层自身相互包装以形成蛋白质的核心)，并还含有将β链相互连接并暴露于溶剂的环(类似于CDR)。在β片层夹心的每一边缘存在至少3个此类环，其中所述边缘是垂直于β链方向的蛋白质的边界(参见，US 6,818,418)。虽然总体的折叠与最小的功能抗体片段(即重链的可变区，其包含骆驼(camel)IgG和美洲驼(llama)IgG中的整个抗原识别单位)的折叠密切相关，但是这些基于纤连蛋白的支架不是免疫球蛋白。因为这种结构，非免疫球蛋白抗体模拟抗原结合特性，所述特性在本质上和亲和性上与抗体的类似。这些支架可用于与体内的抗体亲和性成熟过程相似的体外环随机化和改组策略。这些基于纤连蛋白的分子可用作支架，其中使用标准的克隆技术可用本发明的CDR替换分子的环区。
这种ankyrin技术是基于使用具有ankyrin衍生的重复组件的蛋白质，所述重复组件作为用于携带可变区的支架，所述可变区可用于结合不同靶标。Ankyrin重复组件是33个氨基酸多肽，由两个反平行α-螺旋和一个β-转角组成。可变区的结合通过使用核糖体展示来最优化。
Avimers衍生自天然的含有A-结构域的蛋白质如LRP6。这些结构域天然地用于蛋白质-蛋白质相互作用，并且在人中，超过250种蛋白质结构上是基于A-结构域的。Avimers由通过氨基酸接头连接的许多不同“A-结构域”单体(2-10)组成。使用描述于如美国专利申请公开号20040175756；20050053973；20050048512和20060008844中的方法，可产生能与靶抗原结合的Avimers。
Affibody亲和配体是小的简单蛋白质，由基于A蛋白的IgG结合结构域之一的支架的三螺旋束组成。A蛋白是来自细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的表面蛋白质。这种支架结构域由58个氨基酸组成，其中将13个氨基酸随机化以产生具有大量配体变体的Affibody文库(参见例如US 5,831,012)。Affibody分子模仿抗体，与150kDa的抗体分子量比较，它们具有6kDa的分子量。尽管它的体积很小，但是Affibody分子的结合位点与抗体的结合位点相似。
Anticalins是由Pieris ProteoLab AG公司开发的产品。它们衍生自脂质运载蛋白，其是通常涉及生理转运或化学敏感的或者不溶化合物的存储的一类广泛分布的小且坚固的蛋白质。几种天然的脂质运载蛋白存在于人组织或体液中。蛋白质结构表明脂质运载蛋白像免疫球蛋白，在刚性框架顶部具有高变环。然而，与抗体或其重组片段相反，脂质运载蛋白由具有160个至180个氨基酸残基的单一多肽链组成，这仅比单一的免疫球蛋白结构域略大。构成结合袋的4个环组显示出显著的结构可塑性并耐受多种侧链。因此，为了以高亲和性和高特异性识别不同形状的指定目标分子，结合部位可用专有的方法进行重塑。通过诱变处理4个环的组，已将脂质运载蛋白家族的一种蛋白质，即Pieris Brassicae的后胆色素结合蛋白(BBP)用于开发anticalins。描述anticalins的专利申请的一个实例是PCT公开号WO 199916873。
Affilin分子是经设计的对蛋白质和小分子具有特异亲和性的小的非免疫球蛋白蛋白质。新Affilin分子可非常快地选自两个文库，其中每一个文库基于不同的从人衍生的支架蛋白质。Affilin分子不显示出与免疫球蛋白蛋白质的任何结构同源性。目前，使用两种Affilin支架，其中一种Affilin支架是γ晶体蛋白(人结构性眼晶状体蛋白)和另一种是“泛素”超家族蛋白。两种人支架都非常小，且显示出高温稳定性并且几乎对pH变化和变性剂有抗性。这种高稳定性主要是由于蛋白质的展开的β片层结构。γ晶体蛋白衍生的蛋白质的例子描述于WO200104144中，且“泛素样”蛋白的实例描述于WO2004106368中。
蛋白质表位模拟物(PEM)是模拟蛋白质的β发夹二级结构的中等大小的环状肽样分子(MW 1-2kDa)，所述β发夹二级结构是蛋白质-蛋白质相互作用中涉及的主要的二级结构。
在一些实施方案中，通过改变Fc区，将Fab转变成沉默IgG1形式。例如，可以通过添加以下的氨基酸序列并且用CS(如果轻链是λ)或者C(如果轻链是κ)取代轻链，将表1中的抗体MOR08168、MOR08545、MOR06706、MOR06475、MOR08193和MOR08473转变成IgG1形式：
CDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK(SEQ ID NO：209)。
如本文中所用“沉默IgG1”是IgG1Fc序列，其中已经改变了氨基酸序列，以降低Fc介导的效应功能(例如ADCC和/或CDC)。此种抗体将通常具有与Fc受体减弱的结合。在一些其他实施方案中，将Fab转变成IgG2形式。例如，通过用以下的IgG2的重链的恒定序列取代恒定序列，可以将表1中的抗体MOR08168、MOR08545、MOR06706、MOR06475、MOR08193和MOR08473转变成IgG2形式：
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：210)。
人抗体或者人源化抗体
本发明提供与LRP6蛋白(例如，人和/或食蟹猴LRP6)特异地结合的全长人抗体。与嵌合的或者人源化的抗体比较，当施用给人类个体时，本发明的人LRP6抗体具有进一步降低的抗原性。
可以使用本领域已知的方法产生人LRP6抗体。例如，可以将人源改造技术(humaneering technology)用于将非人抗体转变成改造的人抗体。美国专利公开号20050008625描述了这样的体内方法：用抗体中的人可变区替换非人抗体可变区，同时相对于非人抗体，维持相同的或者提供更好的结合特征。该方法依赖于用完整人抗体表位指导地替换非人参照抗体的可变区。得到的人抗体通常与参照非人抗体在结构上不相关，但是与参照抗体结合相同的抗原上的相同表位。简言之，在应答测试抗体与抗原的结合的报告系统存在的情况下，通过设定细胞中“竞争者”与不同的杂种参照抗体(“测试抗体”)文库之间对结合有限量的抗原的竞争，能够进行连续的表位指导的互补性替换方法。竞争者可以是参照抗体或其衍生物，例如单链Fv片段。竞争者还可以是抗原的天然或人工配体，其与参照抗体结合相同的表位。竞争者的唯一要求是其与参照抗体结合相同的表位，并且其与参照抗体竞争抗原结合。测试抗体具有来自非人参照抗体的共有的一个抗原结合V区，并且其他V区随机选自不同的来源，例如人抗体的所有组成成分文库。将来自参照抗体的共有V区用作为向导，将测试抗体定位在抗原上的相同表位和相同的方向上，以使选择偏向于对参照抗体最高的抗原结合保真性。
可以将许多类型的报告系统用于检测测试抗体与抗原之间所希望的相互作用。例如，可以将互补报告片段分别与抗原和测试抗体连接，以使当测试抗体与抗原结合时才发生由于片段互补导致的报告子激活。当测试抗体报告片段融合物和抗原报告片段融合物与竞争者共表达时，报告子的激活变得取决于测试抗体与竞争者竞争的能力，其与测试抗体对抗原的亲和性成比例。可以使用的其他报告系统包括美国专利申请系列号10/208,730(公开号20030198971)中所公开的自动抑制的报告子再活化系统的反应器(reactivatorof an auto-inhibited reporter reactivation system)(RAIR)或者美国专利申请序列号10/076,845(公开号20030157579)中所公开的竞争激活系统(competitive activationsystem)。
使用连续表位指导的互补替换系统进行选择，以鉴定表达单一测试抗体，以及竞争者、抗原和报告子组分的细胞。在这些细胞中，每一测试抗体一对一地与竞争者竞争结合有限量的抗原。报告子的活性与测试抗体结合的抗原的量成比例，所述量又与测试抗体对抗原的亲和性和测试抗体的稳定性成比例。当表达为测试抗体时，最初基于测试抗体相对于参照抗体的活性来选择测试抗体。第一轮选择的结果是一组“杂合”抗体，每一种抗体都包含来自参照抗体的相同非人V区和来自文库的人V区，并且每一种抗体都与参照抗体结合抗原上的相同表位。在第一轮中选择的多个杂合抗体之一将具有与参照抗体相当的或者比参照抗体更高的对抗原的亲和性。
在第二个V区替换步骤中，将第一步中所选择的人V区用作用相关的人V区的不同文库替换剩余的非人参照抗体的V区的一组人替换的指导者。还可以将第一轮中所选择的杂合抗体用作第二轮选择的竞争者。第二轮选择的结果是一组完全人抗体，其在结构上与参照抗体不同，但是与参照抗体竞争结合相同的抗原。一些选择的人抗体与参照抗体结合相同的抗原上的相同表位。在这些选择的人抗体中，一种或多种人抗体以与参照抗体相当的或者比参照抗体更高的亲和性与相同的表位结合。
使用上述小鼠或嵌合LRP6抗体之一作为参照抗体，可以容易地利用该方法以产生以相同的结合特异性和相同的或者更高的亲和性与人LRP6结合的人抗体。此外，此类人LRP6抗体还可以从通常生产人抗体的公司，例如KaloBios,Inc.(Mountain View，CA)在商业上获得。
骆驼抗体
已经对获自骆驼和单峰驼(西亚骆驼(Camelus bactrianus)和Calelusdromaderius)家族成员包括新世界成员如骆马物种(Lama paccos、马驼(Lama glama)和小羊驼(Lama vicugna))的抗体蛋白的大小、结构复杂性和对人个体的抗原性进行了表征。发现来自该哺乳动物家族的一些IgG抗体天然缺失轻链，从而在结构上不同于来自其他动物的抗体的具有两个重链和两个轻链的典型四链四级结构。见PCT/EP93/02214(1994年3月3日公布的WO 94/04678)。
通过基因改造可以获得鉴定为VHH的小的单个可变区的骆驼抗体的一个区域，以产生具有对靶标高亲和性的小蛋白质，其导致了称为“骆驼纳米抗体”的低分子量抗体衍生蛋白质。见1998年6月2日发行的美国专利申请号5,759,808；也见Stijlemans，B.等人，(2004)J Biol Chem 279：1256-1261；Dumoulin，M.等人，(2003)Nature 424：783-788；Pleschberger，M.等人(2003)Bioconjugate Chem 14：440-448；Cortez-Retamozo，V.等人(2002)Int J Cancer 89：456-62；和Lauwereys等人(1998)EMBO J 17：3512-3520。骆驼抗体和抗体片段的改造文库可通过商业途径得到的，例如从Ablynx，Ghent，比利时(Ablynx,Ghent,Belgium)获得。与其他非人来源的抗体一样，也可以重组改变骆驼抗体的氨基酸序列以获得更近似人序列的序列，即可以“人源化”纳米抗体。因此，可以进一步降低骆驼抗体对人的天然低抗原性。
骆驼纳米抗体具有人IgG分子大约十分之一的分子量，并且该蛋白质仅具有几纳米的物理直径。小尺寸的一个结果是，骆驼纳米抗体能与对较大的抗体蛋白功能性不可见的抗原位点结合，即可以将骆驼纳米抗体用作为检测抗原的试剂并作为可能的治疗试剂，所述抗原否则是使用经典免疫学技术是不能检测的。因此，小尺寸的又一结果是，由于骆驼纳米抗体可以与靶蛋白的沟或窄裂缝中的特定位点结合而抑制靶蛋白，因此所述骆驼纳米抗体可以发挥比典型抗体更类似于典型的低分子量药物的功能的能力。
低分子量和紧凑的尺寸进一步导致了极端热稳定的、对极端pH和对蛋白水解消化稳定的、和低抗原性的骆驼纳米抗体。另一结果是，骆驼纳米抗体可以容易地从循环系统移动到组织中，甚至可以穿过血脑屏障，并且可以治疗影响神经组织的疾病。纳米抗体还促进了药物跨过血脑屏障的运输。参见2004年8月19号公开的美国专利申请20040161738。这些特点与对人的低抗原性组合，表明了极大的治疗潜能。此外，这些分子可以在原核细胞例如大肠杆菌中完全表达，并且可以与噬菌体一起表达为融合蛋白且是有功能的。
因此，本发明的特点是具有对LRP6高亲和性的骆驼抗体或纳米抗体。在本文中的一些实施方案中，骆驼抗体或纳米抗体是在骆驼动物中天然产生的，即通过使用本文中所述的用于其他抗体的技术用LRP6或其肽片段免疫骆驼后产生的。备选地，抗LRP6骆驼纳米抗体是经改造的，即选择产生的，如在本文实施例中所述，使用淘选法，以LRP6作为靶标，从展示合适的经诱变处理的骆驼纳米抗体的噬菌体文库中选择产生的。通过基因改造可以进一步定制经改造的纳米抗体，以在受体个体中具有45分钟至两周的半衰期。在特定的实施方案中，通过将本发明的人抗体的重链或轻链的CDR序列移植到纳米抗体或单结构域抗体框架序列中，获得骆驼抗体或纳米抗体，例如，如在PCT/EP93/02214中所述。
多价抗体
本发明描述了多价抗体(例如，双旁原位抗体、双特异性抗体)，其包含针对一个或多个靶受体的两个不同结合位点的至少两个受体结合结构域。临床益处可以通过在一个抗体内两种或多种特异性的结合来提供(Morrison等人，(1997)Nature Biotech.15：159-163；Alt等人(1999)FEBS Letters 454：90-94；Zuo等人，(2000)Protein Engineering 13：361-367；Lu等人，(2004)JBC 279：2856-2865；Lu等人，(2005)JBC280：19665-19672；Marvin等人，(2005)Acta Pharmacologica Sinica 26：649-658；Marvin等人，(2006)Curr OpinDrug Disc Develop 9：184-193；Shen等人，(2007)J Immun Methods 218：65-74；Wu等人(2007)Nat Biotechnol.11：1290-1297；Dimasi等人，(2009)J.Mol Biol.393：672-692；和Michaelson等人，(2009)mAbs 1：128-141)。
本发明基于这样的发现：多价抗体(例如，单个LRP6双旁原位或者双特异性抗体)具有抑制螺旋桨1(例如Wnt1)和螺旋桨3(例如Wnt3)配体介导的信号转导的能力。此外，意料之外地，多价抗体(例如，单个LRP6双旁原位或者双特异性抗体)没有展示出Wnt信号显著的增强。多价抗体与不同的LRP6β-螺旋桨区结合。螺旋桨1抗体与β-螺旋桨1结构域结合并阻断螺旋桨1依赖的Wnt，例如Wnt1、Wnt2、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt9、Wnt10A、Wnt10B以及抑制Wnt1信号转导通路。螺旋桨3抗体与β-螺旋桨3结构域结合并阻断螺旋桨3依赖的Wnt，例如Wnt3a和Wnt3以及抑制Wnt3信号转导通路。LRP6抗体将螺旋桨1和螺旋桨3配体区分成两种单独的种类，并与LRP6靶受体的不同表位结合。在另一蛋白质例如Wnt1或Wnt3配体存在的情况下，将LRP6抗体的片段(例如，Fab)转变成全长IgG抗体导致了增强Wnt信号的抗体。
多价抗体提供了优于常规抗体的优势，例如扩大了靶库的范围、具有新的结合特异性、效价增加，以及无信号增强。单个LRP6多价抗体可以与同一细胞上单个LRP6靶受体上的多个螺旋桨区结合，并抑制Wnt信号转导。在一个实施方案中，多价抗体与选自螺旋桨1、螺旋桨2、螺旋桨3和螺旋桨4的β-螺旋桨区的任一组合结合。在一个实施方案中，多价抗体与LRP6的螺旋桨1和螺旋桨3结构域结合。因此，通过与多个β-螺旋桨区结合，单个LRP6多价抗体具有增加的作用功效，并抑制由每一结构域介导的Wnt信号转导。例如，单个LRP6多价抗体通过分别与螺旋桨1和螺旋桨3结构域结合而抑制螺旋桨1和螺旋桨3介导的Wnt信号转导。增加的作用功效可能归因于LRP6多价抗体提高的亲合力或者更好的结合。
在一个实施方案中，多价抗体通过将scFv与IgG抗体连接来产生。用于制备scFv的VH和VL结构域可以衍生自相同的或者不同的抗体。scFv包含至少1、2、3、4、5或6个CDR。
IgG抗体的Fc区和scFv片段可以以多种不同的方向连接在一起。在一个实施方案中，scFv与Fc区的羧基端连接。在其他实施方案中，scFv与Fc区的氨基端连接。在其他实施方案中，scFv与Fc区的氨基端和羧基端都连接。在另一个实施方案中，scFv可以与抗体的轻链连接。本发明多价抗体可以同时结合靶受体的多个结合位点。本发明多价抗体的受体结合结构域可以结合至少1、2、3、4、5、6、7、8或者更多的结合位点。每一受体结合结构域可以是对相同的结合位点特异的。本发明多价抗体包含对相同靶受体上的不同表位(例如LRP6的β-螺旋桨1结构域或β-螺旋桨3结构域)特异的一个或多个受体结合结构域。备选地，本发明多价抗体包含对不同靶受体(例如LRP6和非LRP6的受体例如Erb、cmet、IGFR1、Smoothened和Notch受体)上的表位特异的一个或多个受体结合结构域。
与常规抗体比较，本发明多价抗体内的每一受体结合结构域还可以具有对抗原的不同(即更高或更低)的亲和性。
在一个实施方案中，本发明的多价抗体是双旁原位抗体，其包含针对LRP6靶受体上的第一表位的至少一个受体结合结构域和针对同一LRP6靶受体上的第二个表位的第二个受体结合结构域。
本发明的多价抗体包含抗体的至少一个CDR、给定抗体的至少两个CDR或者给定抗体的至少3个CDR、给定抗体的至少4个CDR、给定抗体的至少5个CDR或者给定抗体的至少6个CDR。本发明多价抗体包含抗体的至少1个VH结构域、给定抗体的至少一个VL结构域或者抗体的至少1个VH结构域和一个VL结构域。可以以VH-接头-VL方向或者VL-接头-VL方向构建scFv分子。
可以参考常规对照scFv分子或全长抗体的生物物理学性质(例如，热稳定性)评价本发明scFv分子或者包含其的融合蛋白的稳定性。在一个实施方案中，本发明多价抗体具有这样的热稳定性，其比对照结合分子(例如常规scFv分子)高约0.1、约0.25、约0.5、约0.75、约1、约1.25、约1.5、约1.75、约2、约2.5、约3、约3.5、约4、约4.5、约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10、约11、约12、约13、约14或者约15摄氏度。
scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的scFv接头。与常规抗体比较，优选的本发明scFv接头提高了本发明多价抗体的热稳定性至少约2℃或3℃。在一个实施方案中，与常规抗体比较，本发明多价抗体具有提高1℃的热稳定性。在另一个实施方案中，与常规抗体比较，本发明多价抗体具有提高2℃的热稳定性。在另一个实施方案中，与常规抗体比较，本发明多价抗体具有提高4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15℃的热稳定性。例如，可以在本发明scFv分子和使用现有技术方法制备的scFv分子之间或者在scFv分子和衍生scFv VH和VL的抗体的Fab片段之间进行比较。可以使用本领域已知的方法测量热稳定性。例如，在一个实施方案中，可以测量Tm。测量Tm的方法和测定蛋白质稳定性的其他方法详细描述于下文。
在一个实施方案中，scFv接头由氨基酸序列(Gly4Ser)3组成或者包含(Gly4Ser)4序列。其他示例性接头包含或者由(Gly4Ser)5和(Gly4Ser)6序列组成。本发明scFv接头可以具有不同的长度。在一个实施方案中，本发明scFv接头为约5个至约50个氨基酸的长度。在另一个实施方案中，本发明scFv接头为约10个至约40个氨基酸的长度。在另一个实施方案中，本发明scFv接头具有约15个至约30个氨基酸的长度。在另一个实施方案中，本发明scFv接头具有约15个至约20个氨基酸的长度。接头长度的变化可以保留或者增强活性，导致在活性研究中更高的效力。使用本领域已知的技术，可以将scFv接头引入到多肽序列中。例如，可以使用PCR诱变。可以通过DNA序列分析确认修饰。为了所生产的多肽的稳定产生，可以使用质粒DNA来转化宿主细胞。
在一个实施方案中，本发明scFv分子包含插入到VH结构域和VL结构域之间的具有(Gly4Ser)3或(Gly4Ser)4的氨基酸序列的scFv接头，其中所述VH和VL结构域通过二硫键连接。
本发明的scFv分子还可以包含连接VL结构域中的氨基酸和VH结构域中的氨基酸的至少一个二硫键。半胱氨酸残基对于提供二硫键是必需的。本发明的scFv分子中可以包括二硫键，例如，以连接VL的FR4和VH的FR2或者连接VL的FR2和VH的FR4。二硫键的示例性位置包括VH的43、44、45、46、47、103、104、105和106以及VL的42、43、44、45、46、98、99、100和101(Kabat编号)。可以使用本领域已知的技术，例如定点诱变来实现编码VH和VL结构域的基因的修饰。
scFv中的突变改变了scFv的稳定性，并且与不具有在scFv中突变的多价抗体比较，所述突变提高了包含突变的scFv的多价抗体的整体稳定性。对scFv的突变可以如实施例中所示产生。使用如实施例中所述的测量，例如Tm、温度变性和温度聚集，将突变的scFv的稳定性与未突变的scFv进行比较。可以使用测定法例如ELISA测定突变scFv的结合能力。
在一个实施方案中，本发明多价抗体包含scFv中的至少一个突变，以致突变的scFv赋予多价抗体提高的稳定性。在另一个实施方案中，本发明多价抗体在scFv中包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个突变，以致突变的scFv赋予多价抗体提高的稳定性。在另一个实施方案中，本发明多价抗体在scFv中包含突变的组合，以致突变的scFv赋予多价抗体提高的稳定性。
本文中公开了多价抗体，如本发明的双旁原位抗体。这些双旁原位抗体与LRP6的一个或多个表位结合。使用接头如GlySer接头，例如在铰链区将scFv与Fc区连接。在一个实施方案中，本发明涉及与LRP6的β-螺旋桨1结构域结合的抗体或者抗原结合片段，所述抗体或者抗原结合片段使用(GlyGlySer)2接头与结合LRP6的β-螺旋桨3结构域的scFv连接，所述(GlyGlySer)2接头顺着Fc的CH3区排列。在一个实施方案中，将与LPR6β-螺旋桨1结构域结合的全长IgG抗体用于连接与LRP6β-螺旋桨3结构域结合的抗体的scFv片段。
可以使用表2中所示的重链序列和轻链序列的任一组合，构建多价抗体，如本发明的双旁原位抗体。
表2：本发明的双旁原位构建体
因此，本发明涉及使用螺旋桨1IgG抗体和螺旋桨3scFv构建的双旁原位抗体。在一个实施方案中，使用选自SEQ ID NO:166、171、173、175、195、201和207的任一重链序列和选自SEQ ID NO:170、193、199和205的任一轻链序列构建双旁原位抗体。在一个实施方案中，双旁原位抗体包含选自SEQ ID NO:166/170、171/170、173/170、175/170、201/199、207/205和195/193的重链和轻链序列。
在一个实施方案中，双旁原位抗体包含重链SEQ ID NO:166和轻链SEQ ID NO:170。在一个实施方案中，双旁原位抗体包含重链SEQ ID NO:171和轻链SEQ ID NO:170。在一个实施方案中，双旁原位抗体包含重链SEQ ID NO:173和轻链SEQ ID NO:170。在一个实施方案中，双旁原位抗体包含重链SEQ ID NO:175和轻链SEQ ID NO:170。在一个实施方案中，双旁原位抗体包含重链SEQ ID NO:201和轻链SEQ ID NO:199。在一个实施方案中，双旁原位抗体包含重链SEQ ID NO:207和轻链SEQ ID NO:205。在一个实施方案中，双旁原位抗体包含重链SEQ ID NO:195和轻链SEQ ID NO:193。
在另一个实施方案中，双旁原位抗体是“备选的双旁原位抗体”，其中scFv与IgG的轻链连接。在一个实施方案中，双旁原位抗体包含重链SEQ ID NO:177和轻链SEQ ID NO:181。
在另一个实施方案中，将与LPR6β-螺旋桨3结构域结合的全长IgG抗体用于连接与LRP6β-螺旋桨1结构域结合的抗体的scFv片段，称为“反向双旁原位”。在一个实施方案中，使用螺旋桨3IgG抗体和螺旋桨1scFv构建本发明的反向双旁原位抗体。在一个实施方案中，使用选自SEQ ID NO:187和189的任一重链和SEQ ID NO:185的轻链序列构建反向双旁原位抗体。在一个实施方案中，反向双旁原位抗体包含重链SEQ ID NO:187和轻链SEQ ID NO:185。在一个实施方案中，反向双旁原位抗体包含重链SEQ ID NO:189和轻链SEQ ID NO:185。
本发明还涉及双旁原位抗体，其具有这样的重链可变区和轻链可变区：所述重链可变区分别包含具有选自1、21和47的氨基酸序列的CDR1序列、具有选自2、22和48的氨基酸序列的CDR2序列、具有选自3、23和49的氨基酸序列的CDR3序列；所述轻链可变区包含具有选自4、24和50的氨基酸序列的CDR1序列、具有选自5、25和51的氨基酸序列的CDR2序列、具有选自6、26和52的氨基酸序列的CDR3序列，和以下的重链可变区和轻链可变区的组合：所述重链可变区分别包含具有选自69、93和115的氨基酸序列的CDR1序列、具有选自70、94和116的氨基酸序列的CDR2序列、具有选自71、95和117的氨基酸序列的CDR3序列；所述轻链可变区包含具有选自72、96和118的氨基酸序列的CDR1序列、具有选自73、97和119的氨基酸序列的CDR2序列、具有选自74、98和120的氨基酸序列的CDR3序列；抗体与LRP6(例如，人和/或食蟹猴LRP6)结合，并抑制LRP6生物学活性，所述活性可以如本文中所述在Wnt报告基因测定或者Wnt指导的信号转导(例如，LRP6磷酸化、β-联蛋白稳定性和核易位、细胞增殖/存活)的任一其他测量法中测量。
可以在本发明的多价抗体中使用的抗体是人单克隆抗体、小鼠单克隆抗体、嵌合的单克隆抗体和人源化的单克隆抗体。
可以使用本领域已知的方法，通过缀合组成型受体结合结构域制备本发明的多价抗体。例如，可以单独地产生多价抗体的每一受体结合结构域，然后相互缀合。当受体结合结构域是蛋白质或肽时，可以将多种偶联剂或者交联剂用于共价缀合。交联剂的实例包括A蛋白、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-二硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基二马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和硫代琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-l-甲酸酯(硫代-SMCC)(参见例如，Karpovsky等人，(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括在Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.第78期：118-132；Brennan等人，(1985)Science 229：81-83)和Glennie等人，(1987)J.Immunol.139：2367-2375)中所述的那些方法。缀合剂是SATA和硫代-SMCC，二者都可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)得到。
当受体结合结构域是抗体时，它们可以通过巯基键合两个重链的羧基端铰链区来缀合。在特定的实施方案中，在缀合前，修饰铰链区以含有奇数个巯基残基，例如1个巯基残基。
备选地，可以在同一载体中编码受体结合结构域，并在同一宿主细胞中表达和组装受体结合结构域。在多价抗体是mAb x mAb、mAb x Fab、Fab x F(ab')2或者配体x Fab融合蛋白的情况下，该方法特别有用。用于制备双特异分子的方法描述于例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498和美国专利号5,482,858中。
多价抗体与其靶标的结合可以通过这样的方法确认，例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(REA)、FACS分析、生物测定(例如，生长抑制)或者蛋白质印迹测定。这些测定法的每一种一般都通过使用对目的复合体特异的经标记的试剂(例如，抗体)检测特定目的蛋白质-抗体复合体的存在。
在另一方面，本发明提供多价抗体，其包含与LRP6结合的本发明抗体的至少两个不同受体结合结构域。受体结合结构域可以通过蛋白质融合或者共价键或非共价键连接在一起。可以例如通过用与本发明抗体的恒定区，例如Fc或铰链区结合的抗体交联本发明的抗体来获得四价抗体。
多价抗体定向
本发明涉及具有多个受体结合结构域(“RBD”)的多价抗体，其包括例如，抗体可变区、抗体片段(例如，Fab)、scFv、单链双抗体或IgG抗体。RBD的实例是Fab片段的组分，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段、包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)；以及分离的互补决定区(CDR)。RBD还可以是单结构域抗体、大型抗体(maxibody)、单抗体、小型抗体(minibody)、双抗体、三抗体、四抗体、v-NAR和双-scFv的组分(参见，例如，Hollinger和Hudson，(2005)Nature Biotechnology 23：1126-1136)。
使用至少一个受体结合结构域(例如，scFv、单链双抗体、抗体可变区)，以任一方向产生本发明的多价抗体，只要得到的抗体保留功能活性(例如，抑制Wnt信号转导)。应当理解，可以将任意数目的受体结合结构域加入到Fc的羧基端和/或氨基端，只要得到的多价抗体保留功能性活性(例如，抑制Wnt信号转导)。在一个实施方案中，将1个、2个、3个或更多的受体结合结构域与Fc区的羧基端连接。在其他实施方案中，1个、2个、3个或更多的受体结合结构域与Fc区的氨基端连接。在其他实施方案中，1个、2个、3个或更多的受体结合结构域与Fc区的氨基端和羧基端均连接。例如，本发明多价抗体可以包含与Fc区的羧基端和/或氨基端连接的相同类型的一个以上受体结合结构域，例如，scFv-scFv-Fc-IgG。备选地，本发明多价抗体可以包含与Fc区的羧基端和/或氨基端连接的不同类型的一个以上受体结合结构域，例如，scFv-双抗体-Fc-IgG。在另一个实施方案中，1个、2个、3个或更多的受体结合结构域(例如，scFv)与IgG的羧基端连接。在另一个实施方案中，1个、2个、3个或更多的受体结合结构域(例如，scFv)与IgG的氨基端连接。在另一个实施方案中，1个、2个、3个或更多的受体结合结构域(例如，scFv)与IgG的氨基端和羧基端连接。
在其他实施方案中，使用与羧基端连接的不同类型的一个以上受体结合结构域产生本发明的多价抗体，例如scFv-双抗体-Fc-IgG；双抗体-scFv-Fc-IgG；scFv-scFv-双抗体-Fc-IgG；scFv-双抗体-scFv-Fc-IgG；双抗体-scFv-scFv-Fc-IgG；抗体可变区-scFv-双抗体-Fc-IgG等。可以产生具有任意数目的受体结合结构域排列的多价抗体。可以使用本文中所述的方法和测定法测试这些多价抗体的功能。
在其他实施方案中，使用与氨基端连接的不同类型的一个以上受体结合结构域产生本发明的多价抗体，例如IgG-Fc-scFv-双抗体；IgG-Fc-双抗体-scFv；IgG-Fc-scFv-scFv-双抗体；IgG-Fc-scFv-双抗体-scFv；IgG-Fc-双抗体-scFv-scFv；IgG-Fc-抗体可变区-scFv-双抗体等。
在其他实施方案中，使用与Fc区的羧基端和氨基端连接的单个受体结合结构域(例如，scFv、单链双抗体、抗体可变区)产生本发明的多价抗体。在另一个实施方案中，多个受体结合结构域与Fc区的氨基端连接，例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8或者更多的受体结合结构域与Fc区的羧基端和氨基端连接。例如，本发明的多价抗体可以包含与Fc区的羧基端和氨基端连接的一个或多个scFv，例如，scFv-Fc-scFv-scFv；-scFv-scFv-Fc-scFv-scFv等。在其他实施方案中，使用与氨基端连接的不同类型的一个以上受体结合结构域，产生本发明的多价抗体，例如scFv-Fc-scFv-双抗体；scFv-Fc-双抗体-scFv；scFv-Fc-scFv-scFv-双抗体；scFv-Fc-scFv-双抗体-scFv；scFv-Fc-双抗体-scFv-scFv；scFv-Fc-抗体可变区-scFv-双抗体等。可以产生具有任一数目的受体结合结构域排列的多价抗体。可以使用本文中所述的方法和测定法检测多价抗体的功能。
接头长度
已知接头长度可以极大地影响scFv的可变区怎样折叠和相互作用。事实上，如果使用短接头(例如，5-10个氨基酸之间；5-20个氨基酸之间)，那么防止了链内折叠，并且需要链间折叠以使两个可变区靠拢，以形成功能表位结合位点。对于接头方向和大小的实例，参见，例如，Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448、美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794和PCT公开号WO2006/020258和WO2007/024715，将所述文献并入本文作为参考。
也应当理解，可以通过多种长度的接头来分离受体结合结构域。可以通过接头序列，将受体结合结构域彼此分离、或与Cκ/λ、CH1、铰链、CH2、CH3或整个Fc区分离。此类接头序列可以包含随机分配的氨基酸或者限定集合的氨基酸。此类接头序列可以是柔性的或者刚性的。
本发明多价抗体在它的一个或多个其受体结合结构域、Cκ/λ结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域或Fc区之间，包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75个或者更多氨基酸残基的接头序列。接头序列可以包含任一天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，接头序列内的氨基酸包含甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施方案中，接头区方向包含多组甘氨酸重复(Gly4Ser)n，其中n是等于或者大于1的正整数。
在一个实施方案中，接头包括但不限于，(Gly4Ser)4或(Gly4Ser)3。在另一个实施方案中，为了更好的可溶性，可以将接头谷氨酸和赖氨酸残基散布在甘氨酸-丝氨酸接头内。在另一个实施方案中，接头包括(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)的多个重复。在另一个实施方案中，接头包括(Gly3Ser)+(Gly4Ser)+(GlySer)的组合和倍数。在另一个实施方案中，可以用丙氨酸替换丝氨酸，例如(Gly4Ala)或(Gly3Ala)。在另一个实施方案中，接头包含基序(GluAlaAlaAlaLys)n，其中n是等于或者大于1的正整数。
铰链区
本发明多价抗体可以包含抗体铰链区的全部或者至少一部分。铰链区或其部分可以直接与受体结合结构域、CH1、Cκ/λ、CH2或CH3连接。在一个实施方案中，铰链区或其部分可以通过可变长度的接头区与受体结合结构域、CH1、Cκ/λ、CH2或CH3连接。
本发明多价抗体可以包含1、2、3、4、5、6或更多铰链区或其部分。铰链区或其部分可以是相同的或者是不同的。在一个实施方案中，本发明多价抗体包含来自人IgG1分子的铰链区或其部分。在另外的实施方案中，可以改造铰链区或其部分，以去除天然存在的半胱氨酸残基，引入非天然存在的半胱氨酸残基，或者将天然存在的残基取代为非天然存在的半胱氨酸残基。在一个实施方案中，本发明的多价抗体含有包含以下氨基酸序列的至少一个铰链区或其部分，所述氨基酸序列包含：EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:211)或EPKSC(SEQID NO:212)。在一些实施方案中，改造至少一个铰链区或其部分，以用另一个氨基酸残基取代至少一个天然存在的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，用丝氨酸取代至少一个天然存在的半胱氨酸残基。
可以将用于位点特异性缀合的非天然存在的半胱氨酸残基工程化到本发明的多价抗体中。此类方法、组合物和方法示例于2008年1月18日提交的名称为“CysteineEngineered Antibodies for Site-Specific Conjugation”的美国临时专利申请系列号61/022,073和2005年9月22日提交的美国专利公开号20070092940中，将所述文献的每一个为了所有目的以其整体并入本文作为参考。
评价蛋白质稳定性的方法
为了评估多价抗体的稳定性，使用本发明方法和下文所述的那些方法预测多结构域蛋白质的最不稳定结构域的稳定性。
此类方法允许测定多个热解折叠过渡态(transition)，其中最不稳定结构域或者最先解折叠或者限制协同解折叠的多结构域单位的整体稳定性阈值(即显示出单一解折叠过渡态的多结构域蛋白质)。可以用许多其他的方法鉴定最不稳定结构域。可以进行诱变，以探查限制了整体稳定性的结构域。此外，可以在如下条件下进行多结构域蛋白质的蛋白酶抗性，在所述条件下通过DSC或者其他光谱法知道最不稳定结构域本质上是解折叠的(Fontana等人，(1997)Fold.Des.，2：R17-26；Dimasi等人(2009)J.Mol.Biol.393：672-692)。一旦鉴定最不稳定结构域，那么可以将编码该结构域的序列(或其部分)用作为本发明方法中的测试序列。
a)热稳定性
可以使用本领域已知的许多非限制性生物物理或生物化学技术来分析本发明组合物的热稳定性。在某些实施方案中，通过分析光谱学评价热稳定性。
示例性分析光谱法是差示扫描量热法(DSC)。DSC使用对热吸收灵敏的量热计，所述热吸收伴随着大多数蛋白质或蛋白质结构域的解折叠(参见，例如Sanchez-Ruiz等人，Biochemistry，27：1648-52,1988)。为了测定蛋白质的热稳定性，将蛋白质样品插入到量热计中，并升高温度直到Fab或scFv解折叠。蛋白质解折叠时的温度指示了整体蛋白质稳定性。
另一示例性分析光谱法是圆二色性(CD)光谱法。CD光谱法将组合物的旋光性测量为升高温度的函数。圆二色性(CD)光谱法测量由于结构不对称性出现的左旋偏振光对右旋偏振光的吸收差异。无序或者解折叠结构导致CD光谱与有序或者折叠结构的CD光谱差异很大。CD光谱反映了蛋白质对升高温度的变性作用的敏感性，并因此指示了蛋白质的热稳定性(参见van Mierlo和Steemsma，J.Biotechnol.，79(3)：281-98，2000)。
用于测量热稳定性的另一示例性分析光谱法是荧光发射光谱法(参见van Mierlo和Steemsma，上述)。用于测量热稳定性的另一示例性分析光谱法是核磁共振(NMR)光谱法(参见，例如van Mierlo和Steemsma，上述)。
可以通过生物化学方法测量本发明组合物的热稳定性。用于评估热稳定性的示例性生物化学方法是热攻击测定法(thermal challenge assay)。在“热攻击测定法”中，可以使本发明组合物在一系列评价温度中保持设定的一段时间。例如，在一个实施方案中，使测试scFv分子或包含scFv分子的分子在一系列的升高的温度中，例如保持1-1.5小时。然后通过相关的生物化学测定法测定蛋白质的活性。例如，如果蛋白质是结合蛋白(例如，scFv或者含scFv的本发明多肽)，那么可以通过功能或者定量ELISA测定结合蛋白的结合活性。
此类测定法可以以高通量形式进行，并且那些测定法公开于使用大肠杆菌和高通量筛选的实施例中。可以使用本领域已知的方法产生scFv变体的文库。可以诱导scFv表达，并且可以将scFv进行热攻击。可以测定经攻击的测试样品的结合，并且可以放大那些稳定的scFv并进一步将其表征。
通过使用任一上述技术(例如分析光谱技术)测量本发明组合物的熔解温度(Tm)评价了热稳定性。熔解温度是热过渡曲线的中点时的温度，其中50％的组合物分子处在折叠状态(参见例如，Dimasi等人(2009)J.Mol Biol.393：672-692)。在一个实施方案中，scFv的Tm值为约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。在一个实施方案中，IgG的Tm值为约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。在一个实施方案中，多价抗体的Tm值为约40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃。
还可以通过使用分析量热技术(例如DSC)，测量本发明组合物的比热或者热容(Cp)来评价热稳定性。组合物的比热是1摩尔水升高1℃的温度所需要的能量(例如，以千卡/摩尔计)。同样地，大Cp是变性或者失活蛋白质组合物的标志。在组合物的热转化之前和之后，通过测定组合物的比热来测量组合物的热容的改变(ΔCp)。可以通过测量或者测定热力学稳定性的其他参数，包括解折叠的吉布斯自由能(ΔG)、解折叠的焓(ΔH)或者解折叠的熵(ΔS)来评价热稳定性。
将一种或多种上述生物化学测定法(例如热攻击测定法)用于测定50％的组合物保留其活性(例如结合活性)时的温度(即Tc值)。
此外，与未突变的scFv比较，对scFv的突变改变了scFv的热稳定性。当将突变的scFv整合到多价抗体中时，突变的scFv赋予整个多价抗体的热稳定性。在一个实施方案中，scFv包含赋予scFv热稳定性的单个突变。在另一个实施方案中，scFv包含赋予scFv热稳定性的多个突变。在一个实施方案中，scFv中的多个突变对scFv的热稳定性具有加性效应。
b)聚集百分比
可以通过测量本发明组合物聚集的倾向来测定本发明组合物的稳定性。可以通过许多非限制性的生物化学或生物物理技术来测量聚集。例如，可以使用层析，例如大小排阻层析(SEC)评价本发明组合物的聚集。SEC基于大小分离分子。用聚合凝胶的半固体珠子填充柱子，所述凝胶将允许离子和小分子进入其内部，但不允许大分子进入其内部。当蛋白质组合物被施加于柱子的顶部时，致密折叠的蛋白质(即非聚集的蛋白质)与大蛋白质聚集物相比分布在更大体积的溶剂中。因此，大聚集物更快地移动穿过柱子，并且以该方法，可以将混合物分离或者分级分离成其组分。当每一级分从凝胶中洗脱时，可以对每一级分分别定量(例如通过光散射)。因此，可以通过将级分的浓度施加于凝胶的蛋白质的总浓度比较来测定本发明组合物的聚集百分比。稳定组合物从柱子中洗脱为基本上单一的级分，并且在洗脱谱或层析图中显现为基本上单一的峰。
c)结合亲和性
可以通过测定本发明组合物的靶标结合亲和性来评估本发明组合物的稳定性。用于测定结合亲和性的多种方法是本领域已知的。用于测定结合亲和性的示例性方法是应用表面等离振子共振。表面等离振子共振是光学现象，其通过(例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，N.J.))检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的改变允许分析实时的生物特异性相互作用。对于进一步的描述，参见Jonsson，U.，等人(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；Jonsson，U.，i(1991)Biotechniques11：620-627；Johnsson，B.，等人(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131；和Johnnson，B.，等人(1991)Anal.Biochem.198：268-277。
具有延长的半衰期的抗体
本发明提供了与LRP6蛋白质特异性结合的具有延长的体内半衰期的抗体。许多因素都可以影响蛋白质的体内半衰期。例如，肾的过滤、肝中代谢、蛋白水解酶(蛋白酶)降解和免疫原应答(例如，蛋白质的抗体中和和巨噬细胞和树突细胞的摄取)。可以将多种策略用于延长本发明抗体的半衰期。例如，通过与聚乙二醇(PEG)、reCODE PEG、抗体支架、多唾液酸(PSA)、羟乙基淀粉(HES)、白蛋白结合配体，以及糖类屏障化学键合；通过与结合血清蛋白质的蛋白质，例如白蛋白、IgG、FcRn，以及运铁蛋白基因融合；通过与结合血清蛋白质的其他结合部分，例如纳米抗体、Fab、DARPin、avimer、affibody、anticalin偶联(在基因上或者在化学上)；通过与rPEG、白蛋白、白蛋白的结构域、白蛋白结合蛋白，以及Fc基因融合；或者通过整合到纳米载体、缓释制剂或医学装置中。
为了延长抗体在体内的血清循环，可以通过PEG与抗体的氨基端或羧基端的位点特异性缀合或者通过赖氨酸残基上的ε氨基，用或者不用多功能接头，将惰性聚合分子例如高分子量PEG与抗体或其片段连接。为了进行聚乙二醇化，通常在一个或多个PEG基团与抗体或抗体片段连接的条件下，将抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)，例如PEG的活性酯或醛衍生物反应。可以用活性PEG分子(或者类似的活性水溶性聚合物)，通过酰化反应或者烷化反应进行聚乙二醇化。如本文中所用，术语“聚乙二醇”意在包括已经用于衍生其他蛋白质的任一形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或者芳氧基-聚乙二醇或者聚乙二醇马来酰亚胺。在某些实施方案中，待进行聚乙二醇化的抗体是脱糖基化的抗体。将使用导致生物学活性最少损失的线性或者分支的聚合物衍生化。可以通过SDS-PAGE和质谱密切监测缀合的程度，以确保PEG分子与抗体的正确缀合。可以通过大小排阻层析或者通过离子交换层析，从抗体-PEG缀合物中分离未反应的PEG。可以使用本领域技术人员熟知的方法(例如通过本文中所述的免疫测定法)测试PEG衍生的抗体的结合活性以及体内效力。用于使蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可用于本发明抗体。参见例如，Nishimura等人的EP 0154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。
其他改进的聚乙二醇化技术包括化学重构正交定向工程技术(reconstitutingchemically orthogonal directed engineering technology)(ReCODE PEG)，其通过包括tRNA合成酶和tRNA的重构系统将指定的侧链通过化学方法掺入到生物合成的蛋白质中。该技术能将30个以上的新氨基酸掺入到大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中的生物合成蛋白质中。tRNA将非天然氨基酸掺入到琥珀密码子被定位的任一位置，将琥珀密码子从终止密码子转变成标志掺入了化学上指定的氨基酸的密码子。
还可以将重组聚乙二醇化技术(rPEG)用于血清半衰期延长。该技术涉及将300-600个氨基酸的非结构蛋白质尾与现存的药物蛋白融合。由于该非结构蛋白质链的表观分子量比其实际分子量大约15倍，所以极大地增加了蛋白质的血清半衰期。与需要化学缀合和再纯化的常规PEG化相反，该生产方法被极大地简化并且产物是均一的。
多唾液酸化是另一技术，其使用天然聚合物多唾液酸(PSA)延长了治疗肽和蛋白质的有效寿命并提高了其稳定性。PSA是唾液酸(一种糖)的聚合物。当用于蛋白质和治疗肽药物递送时，多唾液酸为缀合物提供了保护性微环境。这增加了治疗蛋白质在循环中的有效寿命，并防止其被免疫系统识别。PSA聚合物是在人体中天然发现的。PSA聚合物被进化了上百万年的某些细菌采用，以用包被它们的细胞壁。然后，借助分子拟态，这些天然的多唾液酸化细菌能阻止身体的防御系统。PSA(自然的终极隐形技术(nature's ultimatestealth technology))可以容易地大量产生自此类细菌，并且具有预定的物理特征。甚至当与蛋白质偶联时，细菌PSA是完全非免疫原性的，因为其与人体中的PSA在化学上是相同的。
另一技术包括与抗体连接的羟乙基淀粉(“HES”)衍生物的用途。HES是来自蜡质玉米淀粉的经修饰的天然聚合物，并且可以通过身体的酶代谢。通常施用HES溶液，以取代缺少的血液体积并改进血液的流变性质。抗体的羟乙基淀粉化能通过增加分子的稳定性，以及通过降低肾清除来延长循环半衰期，导致增加的生物学活性。通过改变不同的参数，例如HES的分子量，可以定制多种HES抗体缀合物。
具有增加的体内半衰期的抗体还可以通过将一个或多个氨基酸修饰(即，取代、插入或缺失)引入到IgG恒定结构域或者其FcRn结合片段(优选地Fc或者铰链Fc结构域片段)中产生。参见，例如，国际公开号WO 98/23289；国际公开号WO 97/34631；和美国专利号6,277,375。
此外，可以将抗体与白蛋白缀合，以使抗体或抗体片段在体内更稳定或者在体内具有更长的半衰期。该技术是本领域熟知的，参见，例如，国际公开号WO 93/15199、WO 93/15200和WO 01/77137；和欧洲专利号EP 413,622。
还可以将LRP6抗体或其片段与一个或多个人血清白蛋白(HSA)多肽或其部分融合。HSA(其成熟形式为585个氨基酸的蛋白质)负责血清渗透压的重要均衡，并还用作为外源或内源配体的运载体。白蛋白作为运载体分子的作用及其惰性性质对于用作为多肽体内的运载体和转运蛋白都是有利的特性。在WO 93/15199、WO 93/15200和EP 413 622中已经显示了白蛋白作为白蛋白融合蛋白质的组分作为多种蛋白质的运载体的用途。还提出了将HAS的氨基端片段用于与多肽融合的用途(EP 399666)。因此，通过将抗体或其片段与白蛋白遗传学地或者化学地融合或者缀合，可以在体外和/或体内，稳定或者延长分子的贮存期，和/或在溶液中在延长的时间中保留分子的活性。
可以通过遗传操作，将白蛋白与另一蛋白质融合，以使编码HSA或其片段的DNA与编码蛋白质的DNA连接。然后用融合的核苷酸序列转化或者转染合适的宿主，融合的核苷酸序列如此排列在合适的质粒上以表达融合多肽。可以在体外，例如从原核或者真核细胞中，或者在体内例如，从转基因生物中实现表达。涉及HSA融合的其他方法可见于，例如WO2001077137和WO 200306007中，所述专利在此处引入作为参考。在特定的实施方案中，在哺乳动物细胞系，例如CHO细胞系中进行融合蛋白质的表达。
抗体缀合物
本发明提供了与LRP6蛋白特异结合的抗体和其片段，其与异源蛋白质或多肽(或它的片段，优选地与至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或者至少100个氨基酸的多肽)重组融合或者化学缀合(包括共价缀合和非共价缀合)，以产生融合蛋白。特别地，本发明提供了包含本文中所述的抗体片段(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VH CDR、VL结构域或者VL CDR)和异源蛋白质、多肽或肽的融合蛋白。将蛋白质、多肽或者肽与抗体或者抗体片段融合或缀合的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851和5,112,946；欧洲专利号EP 307,434和EP 367,166；国际公开号WO 96/04388and WO 91/06570；Ashkenazi等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539；Zheng等人，(1995)J.Immunol.154：5590-5600；和Vil等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11337-11341。
可以通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(共同称为“DNA改组”)技术产生其他融合蛋白。可以利用DNA改组来改变本发明抗体或其片段(例如具有更高亲和性和更低解离速率的抗体或其片段)的活性。通常，参见，美国专利号5,605,793；5,811,238；5,830,721；5,834,252和5,837,458；Patten等人，(1997)Curr.OpinionBiotechnol.8：724-33；Harayama，(1998)Trends Biotechnol.16(2)：76-82；Hansson等人，(1999)J.Mol.Biol.287：265-76；和Lorenzo和Blasco，(1998)Biotechniques 24(2)：308-313(将每一所述专利和出版物以其整体并入本文作为参考)。重组前，通过易错PCR、随机核苷酸插入或者其他方法进行随机诱变可以改变抗体或其片段或者编码的抗体或其片段。可以将编码与LRP6蛋白特异结合的抗体或其片段的多核苷酸与一种或多种异源分子的一个或多个组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。
此外，可以将抗体或其片段与标记序列，例如肽融合，以便于纯化。在一个实施方案中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽，例如在pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatsworth，CA，91311)中提供的标签，其中，许多六组氨酸肽是可从商业途径得到的。例如，如在Gentz等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824中所述，六组氨酸提供了融合蛋白的方便的纯化。用于纯化的其他肽标签包括但不限于，对应于来自流感血凝素蛋白的表位的血凝素(“HA”)标签(Wilson等人，(1984)Cell 37：767)和“flag”标签。
在其他实施方案中，本发明抗体及其片段与诊断剂或检测剂缀合。可以将此类抗体作为临床测试方法的一部分，用于监测或者预测疾病或病症的发病、发展、进程和/或严重性，例如确定特定疗法的有效性。可以通过将抗体与可检测物质偶联，来实现此类诊断和检测，所述可检测物质包括但不限于，多种酶，例如但不限于，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；辅基，例如但不限于，链酶亲和素/生物素和亲和素/生物素；荧光物质，例如但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质，例如但不限于，鲁米诺；生物荧光物质，例如但不限于，萤光素酶、萤光素和水母蛋白；放射性物质，例如但不限于，碘(131I、125I、123I和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In和111In)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga、67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn和117Tin；以及使用多种正电子发射断层扫描的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。
本发明进一步包括与治疗部分缀合的抗体或其片段的用途。可以将抗体或其片段与治疗部分如细胞毒素，例如细胞抑制剂或杀细胞剂、治疗剂或放射性金属离子，例如α发射体缀合。细胞毒素或者细胞毒性剂包括对细胞有害的任一试剂。
此外，可以将抗体或其片段与修饰给定生物学应答的治疗部分或药物部分缀合。理解治疗部分或药物部分不限于典型的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所希望的生物学活性的蛋白质、肽或多肽。此类蛋白质可以包括，例如，毒素例如相思豆毒蛋白、篦麻毒素A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质例如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、凋亡剂、抗血管生成剂；或生物应答调节剂例如，如淋巴因子。在一个实施方案中，抗LRP6抗体或其片段与治疗部分，例如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素缀合。在本文中将此类缀合物称为“免疫连接物”。将包含一种或多种细胞毒素的免疫缀合物称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害(例如，杀死细胞)的任一试剂。实例包括taxon、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、道诺红菌素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌呤霉素以及它们的类似物或同系物。治疗剂还包括，例如抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)、烧蚀剂(例如，氮芥、噻替哌、chloraxnbucil、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、cyclothosphamide、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)、顺铂、蒽环霉素(例如，道诺红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC)，以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。参见例如Seattle GeneticsUS20090304721。
可以与本发明抗体缀合的治疗性细胞毒素的其他实例包括多卡米星、加利车霉素、美登素和auristatin以及它们的衍生物。加利车霉素抗体缀合物的实例是可从商业途径得到的(MylotargTm；Wyeth-Ayerst)。
可以使用本领域可得到的接头技术，将细胞毒素与本发明抗体缀合。已经用于将细胞毒素与抗体缀合的接头类型的实例包括但不限于，腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽接头。可以选择对溶酶体区室内的低pH切割敏感的或者对蛋白酶，例如在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶如组织蛋白酶(例如，组织蛋白酶B、C、D)切割敏感的接头。
对于用于将治疗剂与抗体缀合的方法、细胞毒素的类型、接头的进一步讨论，还参见Saito等人，(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail等人，(2003)CancerImmunol.Immunother.52：328-337；Payne，(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan和Kreitman，(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter和Springer，(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。
还可以将本发明抗体与放射性同位素缀合，以产生细胞毒性放射性药物，也称为放射性免疫连接物。可以与抗体缀合用于诊断或治疗的放射性同位素的实例包括但不限于，碘l31、铟111、钇90和镏177。本领域已经建立了制备放射性免疫连接物的方法。放射性免疫连接物的实例是可从商业途径得到的，包括ZevalinTM(DEC Pharmaceuticals)和BexxarTM(Corixa Pharmaceuticals)，并且可以将类似的方法用于使用本发明抗体制备放射性免疫连接物。在某些实施方案中，大环螯合剂是可以通过接头分子与抗体连接的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸(DOTA)。此类接头分子在本领域是众所周知的，并且描述于Denardo等人，(1998)Clin Cancer Res.4(10)：2483-90；Peterson等人，(1999)Bioconjug.Chem.10(4)：553-7；和Zimmerman等人，(1999)Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50中，所述每一文献以其整体并入本文作为参考。
将治疗部分与抗体缀合的技术是熟知的，参见，例如，Arnon等人，“MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”，在MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(编著)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)中；Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery”，在Controlled DrugDelivery(第二版)，Robinson等人(编著),第623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)中；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review”，在Monoclonal Antibodies 84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(编著)，第475-506页(1985)中；“Analysis，Results，And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，在MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy,Baldwin等人(编著)，第303-16页(Academic Press1985)中，以及Thorpe等人，(1982)Immunol.Rev.62：119-58。
还可以将抗体与尤其用于靶抗原的免疫测定或纯化的固相支持体连接。此类固相支持体包括但不限于，玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
产生本发明抗体的方法
(i)编码抗体的核酸
本发明提供了基本上纯化的核酸分子，其编码包含上述LRP6抗体链的区段或结构域的多肽。本发明的一些核酸包含编码SEQ ID NO:14、34和60中所示的螺旋桨1抗体重链可变区的核苷酸序列和/或编码SEQ ID NO:13、33和59所示的轻链可变区的核苷酸序列。在特定的实施方案中，核酸分子是那些在表1中鉴定的核酸分子。本发明的一些核酸包含编码SEQ ID NO:82、106和128所示的螺旋桨3抗体重链可变区的核苷酸序列和/或编码SEQ IDNO:81、105和127所示的轻链可变区的核苷酸序列。本发明的一些其他核酸分子包含与在表1中鉴定的那些核酸分子的核苷酸序列基本上相同的(例如，至少65％、80％、95％或99％)核苷酸序列。当从合适的表达载体中表达时，由这些多核苷酸编码的多肽能表现出LRP6抗原结合能力。
本发明还提供了多核苷酸，其编码来自上述LRP6抗体的重链或轻链的至少1个CDR区和通常地全部3个CDR区。一些其他多核苷酸编码上述LRP6抗体的重链和/或轻链的全部或者基本上全部可变区序列。由于密码子的简并性，多种核酸序列编码每种免疫球蛋白氨基酸序列。
本发明核酸分子可以编码抗体的可变区和恒定区二者。本发明的一些核酸分子包含编码成熟重链可变区序列的核苷酸，所述成熟重链可变区序列与SEQ ID NO:14、34和60中所述的螺旋桨1抗体的成熟重链可变区序列基本上相同(例如，至少80％、90％或99％)。一些其他核酸序列包含编码成熟轻链可变区序列的核苷酸，所述成熟轻链可变区序列与SEQ ID NO:13、33和59中所述的螺旋桨1抗体的成熟轻链可变区序列基本上相同(例如，至少80％、90％或99％)。
本发明核酸分子可以编码抗体的可变区和恒定区二者。本发明的一些核酸分子包含编码成熟重链可变区序列的核苷酸，所述成熟重链可变区序列与SEQ ID NO:82、106和128中所述的螺旋桨3抗体的成熟重链可变区序列基本上相同(例如，至少80％、90％或99％)。一些其他核酸序列包含编码成熟轻链可变区序列的核苷酸，所述成熟轻链可变区序列与SEQ ID NO:81、105和127中所述的螺旋桨3抗体的成熟轻链可变区序列基本上相同(例如，至少80％、90％或99％)。
多核苷酸序列可以通过从头固相DNA合成或者通过编码LRP6抗体或其结合片段的现存序列(例如，如在下文实施例中所述的序列)的PCR诱变产生。核酸的直接化学合成可以通过本领域已知的方法实现，例如Narang等人，(1979)Meth.Enzymol.68：90的磷酸三酯法；Brown等人，(1979)Meth.Enzymol.68：109的磷酸二酯法；Beaucage等人，(1981)Tetra.Lett.,22：1859的二乙基亚磷酰胺法，以及美国专利号4,458,066的固相支持体法。可以如在例如，PCR Technology：Principles and Applications for DNAAmplification，H.A.Erlich(编著)，Freeman Press，NY，NY，1992；PCR Protocols：A Guideto Methods and Applications，Innis等人(编著)，Academic Press，San Diego，CA，1990；Mattila等人，(1991)Nucleic Acids Res.19：967；和Eckert等人，(1991)PCR Methods andApplications 1：17中所述通过PCR将突变引入到多核苷酸序列中。
本发明还提供了用于产生上述LRP6抗体的表达载体和宿主细胞。可以使用多种表达载体，以表达编码LRP6抗体或结合片段的多核苷酸。可以将基于病毒的和非病毒的表达载体二者用于在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括，质粒、附加体载体，通常具有用于表达蛋白质或RNA的表达盒，以及人类人工染色体(参见，例如，Harrington等人，(1997)Nat Genet 15：345)。例如，用于在哺乳动物(例如，人类)细胞中表达LRP6多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A、B&C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A、B&C(Invitrogen，San Diego，CA)、MPSV载体，以及本领域已知的用于表达其他蛋白质的许多其他载体。有用的病毒载体包括基于反转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体、基于SV40、乳头状瘤病毒、HBPEB病毒、痘苗病毒载体和西门利克森林病毒的载体。参见，Brent等人，(1995)上述；Smith，Annu.Rev.Microbiol.49：807；和Rosenfeld等人，(1992)Cell 68：143。
表达载体的选择取决于待表达载体的预期宿主细胞。通常，表达载体含有与编码LRP6抗体链或片段的多核苷酸有效连接的启动子和其他调节序列(例如，增强子)。在一些实施方案中，将诱导型启动子用于防止除诱导条件下之外的插入序列的表达。诱导型启动子包括，例如，阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热休克启动子。可以在非诱导条件下扩大经转化的生物的培养物，而不会使群体偏向于宿主细胞更耐受其表达产物的编码序列。除启动子外，对于LRP6抗体链或片段的有效表达，还需要或者要求其他调节元件。这些元件通常包括ATG起始密码子和邻近的核糖体结合位点或者其他序列。此外，还可以通过包含对所使用的细胞系统合适的增强子来增强表达的效率(参见，例如，Scharf等人，(1994)Results Probl.Cell Differ.20:125；和Bittner等人，(1987)Meth.Enzymol.,153:516)。例如，可以将SV40增强子或者CMV增强子用于在哺乳动物宿主细胞中增加表达。
表达载体还可以提供分泌信号序列位置，以与由插入的LRP6抗体序列编码的多肽形成融合蛋白质。更通常地，在包含于载体之前将插入的LRP6抗体序列与信号序列连接。用于接收编码LRP6抗体轻链和重链可变区结构域的序列的载体有时还编码恒定区或者其部分。此类载体允许可变区与恒定区表达为融合蛋白质，从而导致完整抗体或其片段的产生。通常，此类恒定区是人类的恒定区。
含有和表达抗体的宿主细胞可以是原核的或者真核的。大肠杆菌是用于克隆和表达本发明多核苷酸的一种原核宿主。适合使用的其他微生物宿主包括芽孢杆菌(bacilli)，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和其他肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，例如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)，以及多种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，还可以制备表达载体，其通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如，复制起点)。此外，将存在任意数量的多种熟知启动子，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或者来自λ噬菌体的启动子系统。启动子通常任选地与操纵基因序列一起控制表达，并且具有用于起始和完成转录和翻译的核糖体结合位点序列等。还可以将其他微生物，例如酵母用于表达本发明的LRP6多肽。还可以使用昆虫细胞与杆状病毒载体的组合。
在一些优选的实施方案中，将哺乳动物宿主细胞用于表达和产生本发明抗体。例如，宿主细胞可以是表达内源免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系(例如，实施例中所述的1D6.C9骨髓瘤杂交瘤克隆)或者含有外源表达载体的哺乳动物细胞系(例如，下文示例的SP2/0骨髓瘤细胞)。这些宿主细胞包括任一正常的非永生或者正常的或者异常的永生动物或人类细胞。例如，已经开发了能分泌完整免疫球蛋白的许多合适的宿主细胞系，包括CHO细胞系、多种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、经转化的B细胞和杂交瘤。在例如，Winnacker，FROM GENES TO CLONES，VCH Publishers，N.Y.，N.Y.，1987中概括地讨论了使用哺乳动物组织细胞培养物来表达多肽。用于哺乳动物宿主细胞的表达载体可以包括表达控制序列，例如复制起点、启动子和增强子(参见，例如，Queen等人，(1986)Immunol.Rev.89：49-68)，以及必需的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点和转录终止序列。这些表达载体通常含有来源于哺乳动物基因或者来自哺乳动物病毒的启动子。合适的启动子可以是组成型的、细胞类型特异的、时期特异的和/或可调节或者可调控的启动子。有用的启动子包括但不限于，本领域已知的金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松可诱导的MMTV启动子、SV40启动子、MRPpolIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素可诱导的CMV启动子(例如人类即时早期CMV启动子)、组成型CMV启动子，以及本领域已知的启动子-增强子组合。
用于引入含有目的多核苷酸序列的表达载体的方法取决于细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主。(通常参见Sambrook，等人，上述)。其他方法包括，例如，电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和显微注射、射弹法、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子：核酸缀合物、裸露DNA、人工病毒体、与疱疹病毒结构蛋白VP22融合(Elliot and O'Hare,(1997)Cell 88:223)、DNA的试剂增强的摄取，以及离体转导。为了重组蛋白质的长期、高产率产生，通常希望稳定表达。例如，可以使用本发明表达载体制备稳定表达LRP6抗体链或结合片段的细胞系，所述表达载体含有病毒复制起点或内源表达元件以及选择标记基因。引入载体后，允许细胞在滋养培养基中生长1-2天，然后将细胞转入选择性培养基。选择标记的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功表达引入序列的细胞在选择性培养基中生长。可以使用适合细胞类型的组织培养技术使有抗性的、稳定转染的细胞增殖。
(ii)单克隆抗体的产生
可以通过多种技术，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein，(1975)Nature 256：495的标准体细胞杂交技术来产生单克隆抗体。可以使用产生单克隆抗体的许多技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌性转化。
用于制备杂交瘤的动物系统是鼠类系统。小鼠中的杂交瘤产生是已经成熟建立的方法。免疫方案和分离用于融合的经免疫的脾细胞的技术是本领域已知的。融合配偶体(例如，小鼠骨髓瘤细胞)和融合方法也是已知的。
可以基于如上所述制备的小鼠单克隆抗体的序列来制备本发明的嵌合或人源化抗体。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以获自目的小鼠杂交瘤，并使用标准的分子生物学技术将所述DNA改造成含有非小鼠(例如，人类)的免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法，将小鼠可变区与人恒定区连接(参见例如，Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法，将小鼠CDR区插入到人框架区中。参见例如，Winter的美国专利号5225539和Queen的美国专利号5530101；5585089；5693762和6180370。
在某些实施方案中，本发明抗体是人单克隆抗体。可以使用携带一部分人免疫系统，而不是小鼠系统的转基因或者转染色体小鼠产生针对LRP6的此类人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括分别在本文中称为HuMAb小鼠和KM小鼠的小鼠，并且在本文中共同称为“人Ig小鼠”。
HuMAb(Medarex，Inc.)含有人免疫球蛋白基因微型基因座，其编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列，以及使内源性μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见，例如，Lonberg，等人，(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，该小鼠显示出小鼠IgM或κ的表达的降低，并且应答免疫中，引入的人重链和轻链转基因经历了类别转换和体细胞突变，以产生高亲和性的人IgGκ单克隆抗体(Lonberg等人，(1994)上述；综述于Lonberg，(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg和Huszar，(1995)Intern.Rev.Immunol.13：65-93，以及Harding和Lonberg，(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764：536-546中)。HuMAb小鼠的制备和用途，以及通过此类小鼠的基因组修饰进一步描述于Taylor等人，(1992)Nucleic Acids Research20：6287-6295；Chen等人，(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：3720-3724；Choi等人，(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen等人，(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等人，(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor等人，(1994)International Immunology 579-591；和Fishwild等人，(1996)NatureBiotechnology 14：845-851中，尤其将所述全部文献的内容以其整体并入本文作为参考。还参见，Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299和5,770,429；Surani等人的美国专利号5,545,807；Lonberg和Kay的PCT公开号WO 92103918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO97113852、WO 98/24884和WO 99/45962；以及Korman等人的PCT公开号WO 01/14424。
在另一个实施方案中，可以使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠(例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠)产生本发明的人抗体。此类小鼠，在本文中称为“KM小鼠”详述于Ishida等人的PCT Publication WO 02/43478中。
此外，表达人免疫球蛋白基因的备选转基因动物系统是本领域可得到的，并且可用于产生本发明的LRP6抗体。例如，可以使用称为Xenomouse(Abgenix，Inc.)的备选转基因系统。此类小鼠描述于，例如Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中。
此外，表达人免疫球蛋白基因的备选转染色体动物系统是本领域可得到的，并且可用于产生本发明的LRP6抗体。例如，可以使用称为“TC小鼠”的携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠；此类小鼠描述于Tomizuka等人，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：722-727中。此外，本领域已经描述了携带人重链和轻链转染色体的奶牛(Kuroiwa等人，(2002)Nature Biotechnology 20：889-894)，并且其可以用于产生本发明的LRP6抗体。
还可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法制备本发明的人单克隆抗体。本领域已经建立了或者在下文实施例中描述了用于分离人抗体的此类噬菌体展示方法。参见例如：Ladner等人的美国专利号5,223,409；5,403,484和5,571,698；Dower等人的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；以及Griffiths等人的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
还可以使用SCID小鼠制备本发明的人单克隆抗体，在所述SCID小鼠中已经重构了人免疫细胞，以致在免疫时可以产生人抗体应答。此类小鼠描述于，例如Wilson等人的美国专利号5,476,996和5,698,767中。
(iii)框架或Fc改造
本发明的改造抗体包括已经对VH和/或VL内的框架残基进行了修饰的那些抗体，例如以改进抗体的性质。通常，进行此类框架修饰，以降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个框架残基“回复突变”成相应的种系序列。更具体地，经历了体细胞突变的抗体可以含有与抗体来源的种系序列不同的框架残基。可以通过将抗体框架序列与抗体来源的种系序列比较来鉴定此类残基。为了将框架区序列回复成其种系构型，可以通过例如定向诱变，将体细胞突变“回复突变”成种系序列。本发明还期望包括此类“回复突变的”抗体。
框架修饰的另一类型涉及在框架区内或者甚至在一个或多个CDR区内突变一个或多个残基，以去除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。该方法也被称为“去免疫化(deimmunization)”，并且进一步详述于Carr的美国专利公开号20030153043中。
除在框架区或CDR区内进行修饰外或者作为在框架区或CDR区内进行修饰的备选，改造本发明抗体还可以包括Fc区内的修饰，通常以改变抗体的一种或多种功能性质，例如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖的细胞毒性。此外，可以化学修饰(将一个或多个化学部分与抗体连接)本发明抗体或者修饰本发明抗体以改变其糖基化，以再次改变抗体的一个或多个功能性质。这些实施方案的每一个都进一步详述于下文。Fc区中残基的编号是Kabat编号(上述)。
在一个实施方案中，可以修饰CH1的铰链区，以改变(例如，增加或减少)铰链区中半胱氨酸残基的数目。该方法进一步描述于Bodmer等人的美国专利号5,677,425中。改变CH1的铰链区中半胱氨酸残基的数目，以例如，便于轻链和重链的组装或者增加或降低抗体的稳定性。
在另一个实施方案中，可以突变抗体的Fc铰链区，以降低抗体的生物学半衰期。更具体地，可以将一个或多个氨基酸突变引入到Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区，以使抗体相对于天然Fc铰链结构域的Staphylococcyl蛋白质A(SpA)结合而言，具有削弱的SpA结合。该方法进一步详述于Ward等人的美国专利号6,165,745中。
又在其他实施方案中，通过用不同的氨基酸残基取代至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸，以使抗体具有对效应子配体改变的亲和性，但保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和性改变的效应子配体可以例如是Fc受体或者补体的C1组分。该方法进一步详述于Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260二者中。
在另一个实施方案中，可以用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸，以使抗体具有改变的C1q结合和/或降低的或者消除的补体依赖的细胞毒性(CDC)。该方法进一步详述于Idusogie等人的美国专利号6,194,551中。
在另一个实施方案中，可以改变一个或多个氨基酸残基，以改变抗体固定补体的能力。该方法进一步描述于Bodmer等人的PCT公开WO94/29351中。
又在另一个实施方案中，可以修饰Fc区，以增加抗体介导抗体依赖的细胞毒性(ADCC)的能力和/或通过修饰一个或多个氨基酸增加抗体对Fcγ受体的亲和性。该方法进一步描述于Presta的PCT公开WO 00/42072中。此外，已经绘制了人IgG1上针对FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且描述了具有改进的结合的变体(参见Shields等人，(2001)J.Biol.Chen.276：6591-6604)。
仍在另一个实施方案中，可以修饰抗体的糖基化。例如，可以制备去糖基化抗体(即，缺少糖基化的抗体)。可以改变糖基化，例如以增加抗体对“抗原”的亲和性。可以通过例如，改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现此类糖类修饰。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代导致一个或多个可变区框架糖基化位点的消除，从而消除该位点的糖基化。此类去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和性。该方法进一步详述于Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中。
另外地或备选地，可以制备具有改变类型的糖基化的抗体，例如具有减少量的岩藻糖残基的低岩藻糖基化(hypofucosylated)抗体或者具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。此类改变的糖基化模式已经显示出增加了抗体的ADCC能力。可以通过例如，在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现此类糖类修饰。本领域已经描述了具有改变的糖基化机制的细胞，并且可以将其用作表达本发明重组抗体的宿主细胞，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有在功能上被破坏的FUT8基因(其编码岩藻糖转移酶)的细胞系，以致该细胞系中表达的抗体显示出低岩藻糖基化。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了具有岩藻糖与Asn(297)-连接的糖类连接的能力降低的变体CHO细胞系Lecl3细胞，并且也导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(还参见Shields等人，(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO99/54342描述了经改造而表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如β-(1,4)-N乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII))的细胞系，以致在经改造的细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，其导致抗体的ADCC活性的增强(还参见Umana等人，(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。
在另一个实施方案中，可以修饰抗体以增加其生物学半衰期。多种方法都是可以的。例如，如在Ward的美国专利号6,277,375中所述，可以引入一种或多种以下突变：T252L、T254S、T256F。备选地，为了增加生物学半衰期，如在Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述，可以在CH1或CL区内改变抗体，以含有取自IgG的Fc区CH2结构域的两个环的补救受体结合表位。
(iv)改造经改变的抗体的方法
如上所述，通过修饰全长重链和/或轻链序列、VH和/或VL序列或者其所连接的恒定区，可以将本文中所示的具有VH和VL序列或全长重链和轻链序列的LRP6抗体用于产生新的LRP6抗体。因此，在本发明的另一方面中，可以将本发明LRP6抗体的结构特性用于产生结构上相关的LRP6抗体，所述抗体保留了本发明抗体的至少一种功能性特性，例如与人LRP6结合，并且还抑制LRP6的一种或多种功能性特性。例如，如上所述，可以将本发明抗体的一个或多个CDR区或其突变体与已知的框架区和/或其他CDR重组地组合，以产生其他的、经重组改造的本发明LRP6抗体。其他类型的修饰包括那些在前面的章节中所述的修饰。用于改造方法的起始材料是本文中所提供的一个或多个VH和/或VL序列或者其一个或多个CDR区。为了产生经改造的抗体，并不需要实际上制备(即，表达为蛋白质)具有本文中所提供的一个或多个VH和/或VL序列或者其一个或多个CDR区的抗体。相反，将序列中所含有的信息用作为起始材料，以产生衍生自原始序列的“第二代”序列，并然后制备“第二代”序列并表达为蛋白质。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备螺旋桨1LRP6抗体的方法，所述螺旋桨1LRP6抗体由下述内容组成：具有选自SEQ ID NO:1、21和47的CDR1序列、选自SEQID NO:2、22和48的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO:3、23和49的CDR3序列的重链可变区抗体序列；和具有选自SEQ ID NO:4、24和50的CDR1序列、选自SEQ ID NO:5、25和51的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO:6、26和52的CDR3序列的轻链可变区抗体序列；在重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内改变至少一个氨基酸残基，以产生至少一个经改变的抗体序列；并将经改变的抗体序列表达为蛋白质。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备螺旋桨3LRP6抗体的方法，所述螺旋桨3LRP6抗体由下述内容组成：具有选自SEQ ID NO:69、93和115的CDR1序列、选自SEQ ID NO:70、94和116的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO:71、95和117的CDR3序列的重链可变区抗体序列；和具有选自SEQ ID NO:91、107和118的CDR1序列、选自SEQ ID NO:73、97和121的CDR2序列和/或选自SEQ ID NO:74、98和120的CDR3序列的轻链可变区抗体序列；在重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内改变至少一个氨基酸残基，以产生至少一个经改变的抗体序列；并将经改变的抗体序列表达为蛋白质。
还可以通过筛选抗体文库来制备经改变的抗体序列，所述抗体文库具有固定的CDR3序列或者如在US20050255552中所述的最小基本结合决定簇，以及CDR1和CDR2序列上的多样性。可以根据适合从抗体文库中筛选抗体的任一筛选技术，例如噬菌体展示技术来进行筛选。
可以使用标准的分子生物学技术来制备并表达经改变的抗体序列。经改变的抗体序列编码的抗体是这样的抗体，其保留了本文中所述的LRP6抗体的一种、一些或者全部功能性质，所述功能性质包括但不限于，与人和/或食蟹猴LRP6特异地结合；抗体与LRP6结合，并在Wnt基因测定法中，通过抑制经典Wnt信号活性来抑制LRP6生物学活性。
可以使用本领域可得到的和/或本文中所述的标准测定法，例如那些在实施例中给出的那些测定法(例如，ELISA)来评估经改变的抗体的功能性质。
在改造本发明的抗体的方法的某些实施方案中，可以沿着全部或者部分LRP6抗体编码序列随机地或者选择性地引入突变，并且可以筛选得到的经修饰的LRP6抗体的结合活性和/或如本文所述的其他功能性质。本领域已经描述了突变方法。例如，Short的PCT公开WO 02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接组装(synthetic ligation assembly)或者其组合来产生和筛选抗体突变的方法。备选地，Lazar等人的PCT公开WO 03/074679描述了使用计算机筛选方法来优化抗体的生理化学性质的方法。
本发明抗体的表征
可以通过多种功能测定来表征本发明抗体。例如，可以在如本文中所述的Wnt基因测定法中通过其通过抑制经典Wnt信号转导抑制生物学活性的能力、其与LRP6蛋白(例如，人和/或食蟹猴LRP6)的亲和性、表位结合、其对蛋白水解的抗性，以及其阻断Wnt通路的能力来表征它们。此外，可以通过在存在Wnt配体的情况下增强Wnt信号转导的能力来表征抗体。可以将多种方法用于测量LRP6介导的Wnt信号转导。例如，可以通过(i)测量β-联蛋白的丰度和定位；和(ii)测量LRP6或其他下游Wnt信号蛋白质(例如DVL)的磷酸化，以及(iii)测量特异的基因标记或基因靶点(例如c-myc、Cyclin-D、Axin2)来监测Wnt信号通路。
可以通过直接标记目的抗体来检测抗体与LRP6结合的能力，或者抗体可以是未标记的，并且可以使用本领域已知的多种夹心测定法格式来间接检测结合。
在一些实施方案中，本发明LRP6抗体阻断参照LRP6抗体与LRP6多肽的结合或者与参照LRP6抗体竞争与LRP6多肽结合。它们可以是上述的完全人LRP6抗体。它们也可以是其他与参照抗体结合相同表位的小鼠LRP6抗体、嵌合LRP6抗体或者人源化LRP6抗体。阻断参照抗体或者与参照抗体竞争的能力显示，测试中的LRP6抗体与参照抗体所定义的相同或者类似表位结合或者与参照LRP6抗体所结合的表位足够接近的表位结合。此类抗体极有可能共有与参照抗体相同的有利特性。可以通过例如，竞争结合测定法来测定阻断参照抗体或者与参照抗体竞争的能力。使用竞争结合测定法，检测所测试抗体抑制参照抗体与共同抗原，例如LRP6多肽特异结合的能力。如果过量的测试抗体基本上抑制了参照抗体的结合，那么测试抗体与参照抗体竞争对抗原的特异结合。基本上抑制指的是测试抗体通常将参照抗体的特异结合降低至少10％、25％、50％、75％或90％。
有许多可以用于评估LRP6抗体与参照LRP6抗体竞争结合LRP6蛋白的已知的竞争结合测定法。所述方法包括，例如固相直接或间接放射免疫测定法(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定法(EIA)、夹心竞争测定法(参见Stahli等人，(1983)Methods in Enzymology9：242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见Kirkland等人，(1986)J.Immunol.137：3614-3619)；固相直接标记测定法、固相直接标记夹心测定法(参见Harlow&Lane，上述)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等人，(1988)Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等人，(1990)Virology 176：546-552)；以及直接标记RIA(Moldenhauer等人，(1990)Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常，此类测定法涉及使用与固相表面结合的纯化抗原或者携带未标记的测试LRP6抗体或标记的参照抗体的细胞。通过在测试抗体存在的情况下，测定与固相表面或者细胞结合的标记的量来测量竞争性抑制。通常，测试抗体是过量存在的。通过竞争测定法(竞争抗体)鉴定的抗体包括与参照抗体结合相同表位的抗体和因为存在空间位阻，结合足够接近参照抗体所结合的表位的邻近表位的抗体。
为了测定所所选择的的LRP6单克隆抗体是否与唯一的表位结合，使用商业可得到的试剂(例如，来自Pierce、Rockford、IL的试剂)生物素化每一抗体。可以使用LRP6多肽包被的ELISA板进行使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争研究。可以使用链霉素-亲和素-碱性磷酸酶探针来检测生物素化的MAb结合。为了测定纯化LRP6抗体的同种型，进行同种型ELISA。例如，可以在4℃，用1μg/ml的抗人IgG过夜包被微量滴定板的孔。用1％BSA封闭后，在环境温度，将平板与1μg/ml或者更少的单克隆LRP6抗体或者纯化的同种型对照反应1-2小时。然后，将孔与人IgGl或者人IgM特异性碱性磷酸酶缀合的探针反应。然后显影并分析平板，从而测定纯化抗体的同种型。
为了说明单克隆LRP6抗体与表达LRP6多肽的活细胞的结合，可以使用流式细胞仪。简言之，可以在含有0.1％BSA和10％胎牛血清的PBS中，将(在标准生长条件下培养的)表达LRP6的细胞系与多种浓度的LRP6抗体混合，并在37℃温育1小时。洗涤后，在与一级抗体染色相同的条件下，将细胞与荧光素标记的抗人IgG抗体反应。通过FACScan仪器分析样品，使用光散射和侧向散射性质门控单个细胞。除了或者代替流式细胞术测定法，可以使用应用荧光显微术的备选测定法。细胞可以如上所述被精确地染色，并通过荧光显微术检查。该方法允许显示单个细胞，但取决于抗原的密度，可能具有降低的灵敏度。
还可以通过蛋白质印迹来测试本发明LRP6抗体与LRP6多肽或抗原性片段的反应性。简言之，可以制备纯化的LRP6多肽或者融合蛋白质或者来自表达LRP6的细胞的细胞提取物，并进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用10％胎牛血清封闭，并用待测试的单克隆抗体探测。可以使用抗人IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合，并用BCIP/NBT底物片剂(Sigma Chem.Co.，St.Louis，MO)显影。在以下的实施例部分还描述了功能性测定法的其他实例。
预防性和治疗性用途
本发明通过给有需要的个体施用有效量的本发明抗体，提供了治疗与LRP6Wnt信号通路相关的疾病和病症的方法。在特定的实施方案中，本发明通过给有需要的个体施用有效量的本发明抗体，提供了治疗或者预防癌症的方法，例如，乳腺癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌和黑素瘤。在一个实施方案中，本发明通过给有需要的个体施用有效量的本发明抗体，提供了治疗或者预防与Wnt信号通路相关的癌症的方法。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗与Wnt信号通路相关的癌症的方法，所述癌症包括但不限于，乳腺癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌和黑素瘤。
还可以将LRP6抗体用于治疗或预防与Wnt信号转导异常或者缺损相关的其他疾病，包括但不限于，骨质疏松症、骨关节炎、多囊肾病、糖尿病、精神分裂症、血管疾病、心脏病、非致癌的增生性疾病、纤维变性，以及神经变性疾病例如阿尔茨海默病。Wnt信号通路在组织修复和再生中发挥着关键作用。可以将使细胞对Wnt信号转导敏感的试剂用于促进许多疾病的组织再生，例如骨疾病、粘膜炎、急性和慢性肾损伤等等。
可以与LRP6抗体组合治疗的合适试剂包括本领域已知的能调节经典Wnt信号通路的活性的标准治疗剂(care agent)(例如，PI3激酶剂)。
诊断性用途
在一个方面，本发明包括用于在生物样品(例如，血液、血清、细胞、组织)或来自受癌症折磨或者处于患癌症的风险的个体的生物样品的背景下，测定LRP6蛋白和/或核酸表达以及LRP6蛋白功能的诊断性测定法。
诊断性测定法，例如竞争性测定法依赖于标记的类似物(“示踪物”)与测试样品分析物对共有结合配偶体上的有限数量的结合位点竞争的能力。在竞争之前或之后结合配偶体通常是不溶的，然后将与结合配偶体结合的示踪物和分析物与未结合的示踪物和分析物分离。通过倾析(其中结合配偶体是事先不溶的(preinsolubilized))或者通过离心(其中结合配偶体在竞争反应之后是沉淀的)实现这种分离。如通过标记物质的量测量的，测试样品分析物的量是与结合的示踪物的量成反比的。用已知量的分析物制备剂量反应曲线，并与测试结果比较，以定量测定测试样品中存在的分析物的量。当将酶用作可检测标记物时，这些测定法称为ELISA系统。在该形式的测定法中，抗体和LRP6抗体之间的竞争性结合导致了结合的LRP6蛋白(优选本发明的LRP6表位)是血清样品中抗体(最特别地，血清样品中抑制性抗体)的量度。
该测定法的显著优势是直接对抑制性抗体(即，干扰LRP6蛋白，特别地，干扰表位的结合的那些抗体)进行测量。已经考虑将该测定法，特别地以ELISA测试形式应用于临床环境和常规血液筛查。
本发明还提供了用于确定个体是否处于患与补体途径活性失调相关的病症风险的预后(或者预测)测定法。例如，可以测定在生物样品中LRP6基因的突变。可以将此类测定法用于预后或者预测目的，从而在病症发作之前预防性治疗个体，所述病症以LRP6蛋白、核酸表达或活性为特征或者与LRP6蛋白、核酸表达或活性相关。
本发明的另一方面提供了用于在个体中测定LRP6核酸表达或LRP6蛋白活性的方法，从而为该个体选择合适的治疗或预防剂(在本文中称为“药物基因组学”)。药物基因组学允许基于个体的基因型选择用于个体的治疗性或者预防性治疗的试剂(例如，药物)，例如，检查个体的基因型，以测定个体应答特定试剂的能力。
本发明的再一方面涉及在临床试验中监测试剂(例如，药物)对LRP6蛋白的表达或活性的影响。
药物组合物
为了制备包含LRP6抗体(完整的LRP6抗体或者结合片段)的药物或者无菌组合物，将LRP6抗体(完整的LRP6抗体或者结合片段)与可药用运载体或赋形剂混合。该组合物可额外含有适合于治疗或预防癌症(乳腺癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌和黑素瘤)的一种或多种其他治疗剂。
可以通过与生理上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂混合以例如，冻干的粉剂、膏剂、水溶液、洗剂或混悬剂的形式制备治疗剂和诊断剂的制剂(参见，例如，Hardman，等人(2001)Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics，McGraw-Hill，New York，N.Y.；Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice ofPharmacy，Lippincott，Williams和Wilkins，New York，N.Y.；Avis，等人(编著)(1993)Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications，Marcel Dekker，NY；Lieberman，等人(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets，Marcel Dekker，NY；Lieberman，等人(编著)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems，Marcel Dekker，NY；Weiner和Kotkoskie(2000)Excipient Toxicity and Safety，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.)。
用于治疗剂的施用方案的选择取决于若干因素，包括本体的血清或组织更新率、症状水平、本体的免疫原性，以及生物基质中靶细胞的可及性。在某些实施方案中，在与副作用的可接受水平一致的情况下，施用方案最大化递送给患者的治疗剂的量。因此，生物剂递送的量部分取决于特定的本体和所治疗的疾病的严重性。合适剂量的抗体、细胞因子和小分子的选择准则是可得到的(参见，例如，Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy，BiosScientific Pub.Ltd，Oxfordshire，UK；Kresina(编著)(1991)Monoclonal Antibodies，Cytokines and Arthritis，Marcel Dekker，New York，N.Y.；Bach(编著)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases，MarcelDekker，New York，N.Y.；Baert等人，(2003)New Engl.J.Med.348：601-608；Milgrom等人，(1999)New Engl.J.Med.341：1966-1973；Slamon等人，(2001)New Engl.J.Med.344：783-792；Beniaminovitz等人，(2000)New Engl.J.Med.342：613-619；Ghosh等人，(2003)NewEngl.J.Med.348：24-32；Lipsky等人，(2000)New Engl.J.Med.343：1594-1602)。
合适剂量的确定通过临床医师，例如使用本领域已知或者推测的影响治疗或者预测影响治疗的参数或因素进行。通常，剂量以稍微小于最佳剂量的量开始，然后少量增加，直到相对于任意负面副作用取得了所希望的或者最佳的效果。重要的诊断性测量包括那些例如炎症症状或者所产生的炎性细胞因子水平的诊断性测量。
可以改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得有效实现对特定患者、组合物和施用方式所希望的治疗反应的活性成分的实际剂量水平，而不会对患者有毒性。选择的剂量水平将取决于多种药物动力学因素，包括本发明使用的特定组合物或者其酯、盐或酰胺的活性、施用的途径、施用的时间、所使用的特定化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所使用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或物质、所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和既往病史，以及医学领域中已知的类似因素。
可以通过连续灌输或者通过例如1天、1周的时间间隔或者每周1-7次给药来提供包含本发明抗体或其片段的组合物。可以静脉内地、皮下地、局部地、经口地、经鼻地、经直肠地、肌肉内地、脑内地或者通过吸入来提供剂量。特定的剂量方案是涉及避免显著的不期望副作用的最大剂量或剂量频率的剂量方案。总的每周剂量可以是至少0.05μg/kg体重、至少0.2μg/kg、至少0.5μg/kg、至少1μg/kg、至少10μg/kg、至少100μg/kg、至少0.2mg/kg、至少1.0mg/kg、至少2.0mg/kg、至少10mg/kg、至少25mg/kg或者至少50mg/kg体重(参见，例如，Yang等人，(2003)New Engl.J.Med.349：427-434；Herold等人，(2002)NewEngl.J.Med.346：1692-1698；Liu等人，(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67：451-456；Portielji等人，(2003)Cancer Immunol.Immunother.52：133-144)。抗体或其片段的期望剂量是大约与抗体或多肽相同的剂量(基于摩尔/kg体重)。抗体或其片段的期望血浆浓度是大约基于摩尔/kg体重的。剂量可以是至少15μg、至少20μg、至少25μg、至少30μg、至少35μg、至少40μg、至少45μg、至少50μg、至少55μg、至少60μg、至少65μg、至少70μg、至少75μg、至少80μg、至少85μg、至少90μg、至少95μg或者至少100μg。施用给个体的剂量可以总计至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次或者12次以上。
对于本发明抗体或其片段，施用给患者的剂量可以为0.0001mg/kg患者体重至100mg/kg患者体重。剂量可以为0.0001mg/kg患者体重至20mg/kg患者体重、0.0001mg/kg至10mg/kg、0.0001mg/kg至5mg/kg、0.0001至2mg/kg、0.0001至1mg/kg、0.0001mg/kg至0.75mg/kg、0.0001mg/kg至0.5mg/kg、0.0001mg/kg至0.25mg/kg、0.0001至0.15mg/kg、0.0001至0.10mg/kg、0.001至0.5mg/kg、0.01至0.25mg/kg或者0.01至0.10mg/kg患者体重。
可以使用患者体重(以公斤(kg)计)乘以待施用的剂量(以mg/kg计)来计算本发明抗体或其片段的剂量。本发明抗体或其片段的剂量可以为150μg/kg患者体重或以下、125μg/kg或以下、100μg/kg或以下、95μg/kg或以下、或以下、85μg/kg或以下、80μg/kg或以下、75μg/kg或以下、70μg/kg或以下、65μg/kg或以下、60μg/kg或以下、55μg/kg或以下、50μg/kg或以下、45μg/kg或以下、40μg/kg或以下、35μg/kg或以下、30μg/kg或以下、25μg/kg或以下、20μg/kg或以下、15μg/kg或以下、10μg/kg或以下、5μg/kg或以下、2.5μg/kg或以下、2μg/kg或以下、1.5μg/kg或以下、1μg/kg或以下、0.5μg/kg或以下或者0.5μg/kg或以下。
本发明抗体或其片段的单位剂量可以为0.1mg至20mg、0.1mg至15mg、0.1mg至12mg、0.1mg至10mg、0.1mg至8mg、0.1mg至7mg、0.1mg至5mg、0.1至2.5mg、0.25mg至20mg、0.25至15mg、0.25至12mg、0.25至10mg、0.25至8mg、0.25mg至7m g、0.25mg至5mg、0.5mg至2.5mg、1mg至20mg、1mg至15mg、1mg至12mg、1mg至10mg、1mg至8mg、1mg至7mg、1mg至5mg或者1mg至2.5mg。
本发明抗体或其片段的剂量在个体中可以达到至少0.1μg/ml、至少0.5μg/ml、至少1μg/ml、至少2μg/ml、至少5μg/ml、至少6μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少125μg/ml、至少150μg/ml、至少175μg/ml、至少200μg/ml、至少225μg/ml、至少250μg/ml、至少275μg/ml、至少300μg/ml、至少325μg/ml、至少350μg/ml、至少375μg/ml或者至少400μg/ml的血清滴度。备选地，本发明抗体或其片段的剂量可以在个体中达到至少0.1μg/ml、至少0.5μg/ml、至少1μg/ml,at least,2μg/ml、至少5μg/ml、至少6μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20.mu.g/ml、至少25μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少125μg/ml、至少150μg/ml、至少175μg/ml、至少200μg/ml、至少225μg/ml、至少250μg/ml、至少275μg/ml、至少300μg/ml、至少325μg/ml、至少350μg/ml、至少375μg/ml或者至少400μg/ml的血清滴度。
可以重复本发明抗体或其片段的剂量，并且施用可以间隔至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2个月、75天、3个月或者至少6个月。
可以依据因素，例如所治疗的疾病、患者的整体健康、施用的方法途径和剂量以及副作用的严重性来改变针对特定患者的有效量(参见，例如，Maynard，等人(1996)AHandbook of SOPs for Good Clinical Practice，Interpharm Press，Boca Raton，Fla.；Dent(2001)Good Laboratory and Good Clinical Practice，Urch Publ.，London，UK)。
施用途径可以是，例如通过皮肤应用、通过静脉内、腹膜内、大脑内、肌肉内、眼内、动脉内、脑脊髓内、病灶内注射或者灌输或者通过持续释放系统或者植入(参见，例如，Sidman等人，(1983)Biopolymers 22：547-556；Langer等人，(1981)J.Biomed.Mater.Res.15：167-277；Langer,(1982)Chem.Tech.12：98-105；Epstein等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688-3692；Hwang等人，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4030-4034；美国专利号6,350,466和6,316,024)。根据需要，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因，以在注射位点减轻疼痛。此外，还可以使用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及具有气雾剂的制剂。参见，例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；和PCT公开号WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346,和WO 99/66903，所述每一专利在此处以其整体引入作为参考。
还可以使用本领域已知的一种或多种若干方法，通过一种或多种施用途径施用本发明组合物。本领域技术人员应当理解，施用途径和/或模式可以依据期望的结果来改变。施用本发明抗体或其片段的所选择的途径包括静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、脊椎或者其他肠胃外施用途径，例如通过注射或者灌输。肠胃外施用可以表示除肠内和局部施用以外的施用模式，通常通过注射，并且包括但不限于，静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和灌输。或者，可以通过非注射用(non-parenteral)途径施用本发明的组合物，例如局部、表皮或者粘膜的施用途径，例如鼻内、经口地、阴道内、经直肠地、舌下地或局部地施用。在一个实施方案中，通过灌输施用本发明抗体或其片段。在另一个实施方案中，皮下施用本发明多特异表位结合的蛋白质。
如果在控释系统或者持续释放系统中施用本发明抗体或其片段，那么可以使用泵来实现控释或者持续释放(参见，Langer，上述；Sefton，(1987)CRC Crit.RefBiomed.Eng.14：20；Buchwald等人，(1980)Surgery 88：507；Saudek等人，(1989)N.Engl.J.Med.321：574)。可以使用聚合材料来实现本发明治疗剂的控释或持续释放(参见，例如，Medical Applications of Controlled Release，Langer and Wise(编著)，CRCPres.，Boca Raton，Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug ProductDesign and Performance，Smolen and Ball(编著)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；还参见Levy等人，1985，Science 228：190；During等人，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等人，1989，J.Neurosurg.71：105；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154；和PCT公开号WO 99/20253)。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括但不限于，聚(2-羟基甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共聚乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯共聚乙醇酸交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一个实施方案中，用于持续释放制剂的聚合物是惰性的、无可滤取杂质的、可稳定储存的、无菌的和生物可降解的。可以将控释系统或者持续释放系统置于预防性靶标或者治疗性靶标的附近，因此仅需要全身剂量的一小部分(参见，例如，Goodson，在Medical Applications of Controlled Release，上述，第2卷，第115-138页(1984))。
在Langer((1990)，Science 249：1527-1533)的综述中讨论了控释系统。可以将本领域技术人员已知的任一技术用于产生包含本发明的一种或多种抗体或其片段的持续释放制剂。参见，例如，美国专利号4,526,938、PCT公开WO 91/05548、PCT公开WO 96/20698、Ning等人，(1996)“Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon CancerXenograft Using a Sustained-Release Gel，”Radiotherapy&Oncology 39：179-189，Song等人，(1995)，“Antibody Mediated Lung Targeting of Long-CirculatingEmulsions，”PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology 50：372-397，Cleek等人，(1997)，“Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody forCardiovascular Application，”Pro.Int'l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854，和Lam等人，(1997)，“Microencapsulation of Recombinant Humanized MonoclonalAntibody for Local Delivery，”Proc.Int'l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，将所述每一文献以其整体并入本文作为参考。
如果局部施用本发明抗体或其片段，可以以软膏、乳膏、透皮贴剂、洗剂、凝胶剂、香波、喷雾剂、气溶胶、溶液剂、乳剂形式或者本领域技术人员熟知的其他形式配制本发明抗体。参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction toPharmaceutical Dosage Forms，第19版，Mack Pub.Co.，Easton，Pa.(1995)。对于非喷雾的局部剂型，通常使用粘稠的至半固体形式或者固体形式，其包含与局部应用相容的并且具有动态粘度(在一些实例中，大于水的动态粘度)的载体或者一种或多种赋形剂。合适的制剂包括但不限于，溶液剂、混悬剂、乳剂、乳膏、软膏、粉剂、搽剂、油膏等，根据需要，其可以是无菌的或者与辅助剂(例如，防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓冲剂或盐)混合的，以影响多种性质，例如渗透压。其他合适的局部剂型包括可喷雾的气溶胶制备物，其中在一些实例中，将活性成分与固体或液体惰性载体组合包装到具有加压挥发物(例如，气体推进剂，如氟利昂)的混合物中或者塑料挤瓶中。根据需要，还可以将增湿剂或湿润剂加入到药物组合物和剂型中。此类额外的成分的实例是本领域熟知的。
如果经鼻内施用包含抗体或其片段的组合物，可以以气溶胶形式、喷雾剂、合剂或者以滴剂形式配制包含抗体或其片段的组合物。
与第二治疗剂例如，细胞因子、类固醇、化疗剂、抗生素或辐射共同施用或治疗的方法是本领域已知的(参见，例如，Hardman等人，(编著)(2001)Goodman and Gilman's ThePharmacological Basis of Therapeutics，10.sup.th ed.，McGraw-Hill，New York，N.Y.；Poole和Peterson(编著)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:APractical Approach，Lippincott，Williams&Wilkins，Phila.，Pa.；Chabner and Longo(编著)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott，Williams&Wilkins，Phila.，Pa.)。治疗剂的有效量可以将症状减轻至少10％；至少20％；至少约30％；至少40％或至少50％。
可以与本发明抗体或其片段组合施用的其他疗法(例如，预防剂或治疗剂)的施用与本发明抗体或其片段可以间隔5分钟以下、30分钟以下、1小时、约1小时、约1至2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约5小时、约5小时至约6小时、约6小时至约7小时、约7小时至约8小时、约8小时至约9小时、约9小时至约10小时、约10小时至约11小时、约11小时至约12小时、约12小时至18小时、18小时至24小时、24小时至36小时、36小时至48小时、48小时至52小时、52小时至60小时、60小时至72小时、72小时至84小时、84小时至96小时或者96小时至120小时。可以在同一患者就诊中施用两种或两种以上疗法。
可以循环施用本发明抗体或其片段和其他疗法。循环疗法包括施用第一种疗法(例如，第一种预防剂或治疗剂)一段时间，之后施用第二种疗法(例如，第二种预防剂或治疗剂)一段时间，任选地，之后施用第三种疗法(例如，预防剂或治疗剂)一段时间等等，并且重复这种顺次施用，即该循环是为了减少产生对一种疗法的抗性，避免或者降低一种疗法的副作用，和/或改善治疗的功效。
在某些实施方案中，可以配制本发明的抗体或其片段，以确保体内的正确分布。例如，血脑屏障(BBB)排除了许多高亲水性化合物。为了确保本发明的治疗化合物穿过BBB(根据需要)，可以例如在脂质体中配制它们。对于产生脂质体的方法，参见，例如，美国专利号4,522,811；5,374,548和5,399,331。脂质体可以包含选择性运输到特定细胞或器官，从而增强靶向药物递送的一个或多个部分(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等人(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等人，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等人，(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p 120(Schreier等人，(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；还参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273)。
本发明提供了将包含本发明抗体或其片段的药物组合物单独或者与其他疗法组合施用给需要其的受试者的方法。可以将本发明组合治疗的疗法(例如，预防剂或治疗剂)相伴地或者顺序地施用给受试者。还可以循环施用本发明组合治疗的疗法(例如，预防剂或治疗剂)。循环疗法包括施用第一种疗法(例如，第一种预防剂或治疗剂)一段时间，之后施用第二种疗法(例如，第二种预防剂或治疗剂)一段时间，并且重复这种顺次施用，即该循环是为了减少产生的对一种疗法(例如，试剂)的抗性，以避免或者降低一种疗法(例如，试剂)的副作用，和/或改善疗法的功效。
可以将本发明组合疗法的疗法(例如，预防剂或治疗剂)同时施用给个体。术语“同时”并不限于在完全相同的时间施用疗法(例如，预防剂或治疗剂)，而指的是将包含本发明抗体或其片段的药物组合物以一定顺序和在一定的时间间隔内施用给个体，以便本发明抗体可以与其他疗法一起作用，来提供比以其他方式施用它们更多的益处。例如，可以在相同时间点将每一疗法施用给个体或者以任一顺序顺次地在不同时间点施用给个体；然而，如果不是同时施用，应当在时间上足够接近地施用它们，以提供所希望的治疗或者预防效果。可以将每一疗法以任一合适的形式并通过合适的途径，单独地施用给个体。在多个实施方案中，施用给个体的疗法(例如，预防剂或治疗剂)可以间隔15分钟以下、30分钟以下、1小时以下、约1小时、约1小时至2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约5小时、约5小时至约6小时、约6小时至约7小时、约7小时至约8小时、约8小时至约9小时、约9小时至约10小时、约10小时至约11小时、约11小时至约12小时、24小时、48小时、72小时或者1周。在其他实施方案中，可以在同一患者就诊中施用两种或两种以上疗法(例如，预防剂或治疗剂)。
可以在同一药物组合物中，将组合疗法的预防剂或治疗剂施用给个体。备选地，可以在分别的药物组合物中，将组合疗法的预防剂或治疗剂同时施用给个体。可以通过相同的或者不同的施用途径将预防剂或治疗剂施用于个体。
本发明已经充分描述，并通过以下实施例和权利要求进一步阐述，所述实施例和权利要求是说明性的，并不意在进一步限制。
实施例
材料和方法
1:淘选、抗体鉴定和表征
(a)淘选
(i)HuCAL淘选
为了选择识别人LRP6的抗体，应用了几种淘选策略。使用可通过商业途径得到的噬菌体展示文库，MorphoSys HuCAL文库作为抗体变体蛋白质的来源，通过选择具有高结合亲和性的克隆来产生针对人LRP6蛋白的治疗性抗体。
噬菌粒文库基于概念(Knappik等人，(2000)J Mol Biol 296：57-86)并使用在噬菌体表面上展示Fab的CysDisplayTM技术(Lohning的WO01/05950)。
详细地，用于本项目的HuCAL文库描述于(Rothe等人，(2007)J MolBiol)中。将用辅助噬菌体VCSM13产生的噬菌粒或者用Hyperphage产生的噬菌粒(Rondot等人，(2001)Nat Biotechnol 19：75-78)用于选择抗LRP6抗体。
(ii)针对LRP6的全细胞淘选
对于全细胞淘选，使用表达与eGFP融合的LRP6的氨基端片段(氨基酸1-1482)的细胞系HEK293-hLRP6ΔC-eGFP。特异性HuCAL抗体噬菌粒与LRP6表达细胞系孵育后吸附于HEK293-LRP5/6-shRNA细胞，然后被洗脱。将得到的含HuCAL噬菌体的上清液滴定到大肠杆菌TG1细胞上，并在感染大肠杆菌TG1细胞后用辅助噬菌体复苏。再次滴定多克隆扩增的噬菌体输出结果，并用于连续选择步骤。
(iii)针对LRP6的Fc捕获淘选
对于Fc捕获淘选，用Fc-捕获的LRP6-Fc孵育封闭的噬菌体，并在不同时间，使用不同浓度的PBST和PBS洗去非特异性噬菌体。
洗脱剩余的噬菌体，并立即用于感染大肠杆菌TG1细菌。如在针对LRP6的全细胞淘选中所述，进行扩增、噬菌体产生和输出结果滴度测定。
(iv)针对LRP6的差别全细胞淘选
如上文对全细胞淘选和Fc捕获淘选所述，使用抗体在HEK293-hLRP6ΔC-eGFP细胞上的选择和在重组人LRP6-Fc上的选择进行差示全细胞淘选。
选择过程期间，在不同时间，使用不同浓度的PBS和PBST去除非特异性噬菌体。
如上文在针对LRP6的全细胞淘选所述的，进行大肠杆菌TG1的噬菌体感染、扩增、噬菌体产生和输出结果滴度测定。
(v)针对LRP6的半溶液淘选
对于半溶液淘选，将重组人LRP6-Fc和BSA与甲苯磺酰基活化的M-280-Dynabead共价连接。
在旋转器上将预清洁的噬菌体与LRP6包被的珠子孵育。然后使用磁力分离器收集珠子并用PBST和PBS洗涤。洗脱结合珠子的噬菌体，并立即用于大肠杆菌TG1细菌的感染。如上在针对LRP6的全细胞淘选所述的，进行噬菌体感染、扩增、噬菌体产生和输出结果滴度测定。
(b)选择的Fab片段的亚克隆和微表达
为了便于可溶性Fab的快速表达，将所选择的HuCAL噬菌体的编码Fab的插入片段亚克隆到表达载体X9_FH或X9_FS中。转化TG1-F后，如前所述(Rauchenberger等人，(2003))进行单个克隆表达和含片段的周质提取物的制备。
2:筛选
(i)HEK293-hLRP6ΔC-eGFP细胞的FACS筛选
通过流式细胞术，在用于反筛选的HEK293-hLRP6ΔC-eGFP细胞和HEK293-LRP5/6-shRNA细胞上筛选由淘选策略(全细胞淘选、差示全细胞淘选和半溶液淘选)选择的克隆。也通过流式细胞术测试如上所述Fc捕获淘选策略的初级命中。
70-80％汇合时收获细胞，将其重悬于FACS缓冲液中，并在96孔U-底微量滴定板中用细菌细胞裂解物染色。用flurochrome缀合的检测抗体显示抗体结合。洗涤染色细胞两次，使用FACSArray仪器(BectonDickinson)测量并分析平均荧光强度。
(ii)在重组人LRP6-Fc上的Fc捕获筛选
在Fc-捕获-ELISA装置中筛选Fc捕获淘选中选择的克隆。用山羊抗人IgG、Fc片段特异的抗体包被Maxisorp(Nunc，Rochester，NY，美国)384孔板。用PBST洗涤并封闭孔后，加入重组人LRP6-Fc。洗涤经包被的平板后，加入细胞裂解物，并使用AP缀合的山羊IgG抗人IgG F(ab’)2与底物AttoPhos检测结合的Fab片段。使用Tecan平板读数器在535nm处读取荧光。
3:抗体在大肠杆菌中的表达和纯化
在TG-1细胞中通过添加IPTG诱导由X9_Fab_FH或编码的Fab片段的表达。使用溶菌酶使细胞破裂，并通过Ni-NTA层析(Bio-Rad，德国)分离Fab片段。通过UV分光光度法测定蛋白质浓度。在变性、还原状态使用SDS-PAGE分析Fab片段的纯度，并且在天然状态下通过HP-SEC分析Fab片段的纯度。
4:亲和性测定
(i)表面等离振子共振测量
为了测定KD值，应用表面等离振子共振技术。将抗人Fc捕获CM5芯片(Biacore，瑞典)用于捕获LRP6-Fc-融合物，之后注射不同浓度的配体(Fab)。
(ii)使用Sector Imager 6000(MSD)进行用于KD测定的溶液平衡滴定法(SET)
对于通过溶液平衡滴定法(SET)进行的KD测定，使用抗体蛋白质的单体部分(至少90％单体含量，通过分析SEC来分析；分别将Superdex75(Amersham Pharmacia)用于Fab或者将Tosoh G3000SWXL(Tosoh Bioscience)用于IgG)。
基本上如文献(Friguet等人，(1985)J Immunol Methods 77：305-319)中所述进行溶液中的亲和性测定。为了提高SET方法的灵敏性和准确性，将其从经典ELISA转移到基于ECL的技术(Haenel等人，(2005)Anal Biochem.339：182-184)。
应用定制的拟合模型，用XLfit(IDBS)软件评价数据。对于Fab分子的KD测定，使用根据Abraham等人(1996)Journal of Molecular Recognition 9：456-461修改的拟合模型(根据Haenel等人，同上)。
[Fab]t：应用的总Fab浓度
X：应用的总可溶性抗原浓度(结合位点)
Bmax：没有抗原的Fab的最大信号
KD：亲和性。
5:亲和性成熟后的筛选
在HEK293T/17细胞上进行的EC50测定
在FACS测量中，在亲本HEK293T/17细胞上测定EC50值。典型的抗体滴定曲线含有10至12个不同的抗体稀释度，并且在大约150-200μg/mL(终浓度)的浓度时开始滴定。使用Accutase收获细胞，将其重悬于FACS缓冲液中，分配到96孔板的孔中，并用抗体稀释物染色。使用非线性回归分析，用程序GraphPad Prism测定EC50值。
6：转变成IgG
为了表达全长IgG，将重链(VH)和轻链(VL)的可变结构域片段从Fab表达载体亚克隆到用于人IgG2、人IgG4、人IgG4_Pro和人IgG1f LALA的合适载体中。
7：人IgG的瞬时表达和纯化
用等量的IgG重链和轻链表达载体(pMORPH2)或者编码IgG的重链和轻链的表达载体DNA(pMORPH4)转染真核HKB11细胞。无菌过滤后，将溶液进行标准的A蛋白亲和层析(MabSelect SURE，GE Healthcare)。通过UV分光光度法测定蛋白质浓度。在变性、还原和非还原条件下，在SDS-PAGE中或者通过使用Agilent BioAnalyzer分析IgG纯度，并且在天然状态下通过HP-SEC分析IgG纯度。
8：Wnt报告基因测定
在Wnt1和Wnt3a应答的荧光素酶报告基因测定中测试抗LRP6抗体抑制Wnt信号转导的能力。用Wnt3a条件培养基或者通过共转染Wnt 1、Wnt3a或者其他Wnt表达质粒刺激细胞。
(i)使用条件培养基进行的Wnt3a报告基因测定
将104HEK293-STF细胞/孔接种在96孔组织培养板中，并在37℃/5％CO2，在100μL培养基中将细胞培养过夜。
第二天，制备纯的或者稀释于Wnt3a条件培养基中的多种抗LRP6抗体稀释液和DKK1稀释液(阳性对照)。从96孔组织培养板中除去60μL/孔的上清液，并替换为60μL/孔的条件培养基/抗体稀释液。
在37℃/5％CO2孵育16-24小时后，加入100μL BrightGlo荧光素酶试剂(Promega)，并将平板孵育10分钟。为了进行发光读出(Tecan平板读取仪)，将细胞裂解物转移到96孔微量滴定板(Costar，货号3917)中。
还可以使用共培养的Wnt3或Wnt3a过表达细胞(例如CHO-K1、TM3,L或HEK293细胞)进行类似的测定。
(ii)使用瞬时转染的细胞进行Wnt1/Wnt3a报告基因测定
如在表3中所述，将3×104HEK293T/17细胞/孔接种在96孔组织培养板(Costar)中，并在37℃/5％CO2，在100μL培养基中培养细胞。12-16小时后，用空载体Wnt表达质粒1ng/孔；pTA-Luc-10xSTF(荧火虫荧光素酶构建体)50ng/孔；或者phRL-SV40(海肾萤光酶构建体)0.5ng/孔转染细胞。
制备含有上文列出的质粒和0.2μL FuGene6/孔(Roche)的转染预混合液(10μL/孔)。在室温孵育转染预混合液15分钟，然后分配到孔中。将平板在常温以400转/分钟摇动2分钟，然后在37℃/5％CO2孵育4小时。同时，将抗体稀释在培养基中，并加入到转染的细胞中(75μL/孔)。
18-24小时后，加入75μL/孔DualGlo荧光素酶试剂(Promega)，并在读取萤火虫荧光素酶活性前摇动平板10分钟，用于细胞裂解。发光读出后，加入75μL/孔DualGlo Stop&Glow试剂(Promega)并再次测量发光，以测定海肾荧光素酶活性。
为了分析，计算萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比率。为了确定抗LRP6抗体的IC50，使用GraphPad Prism分析相对荧光素酶值。
还可以使用共培养的Wnt1或其他Wnt1类配体过表达细胞(例如CHO-K1、TM3,L或HEK293细胞)进行类似的测定。
9：FACS交叉反应研究
通过FACS分析，在细胞上测定对小鼠和食蟹猴LRP6的交叉物种反应性。FACS染色基本上如上所述进行。将人U266细胞(不表达LRP6)用作阴性对照。
在小鼠NIH-3T3细胞上测试与小鼠LRP6的交叉反应。在食蟹猴细胞系Cynom-K1上和瞬时转染的HEK293T/17细胞上测试与食蟹猴LRP6的交叉反应。
为了在人细胞系HEK293T/17上测试食蟹猴交叉反应，根据制造商的说明，使用Lipofectamine(Invitrogen)瞬时转染细胞。用人LRP6表达质粒pCMV6_XL4_LRP6和编码伴侣蛋白的质粒pcDNA3.1-flag_MESD的混合物或者用pcDNA3.1-nV5-DEST_cynoLRP6和pcDNA3.1-flag_MESD(过表达食蟹猴LRP6)的混合物转染细胞。每一T175烧瓶使用50μgLRP6表达质粒和20μg MESD表达质粒。24小时后，分离细胞并将其用山羊抗人LRP6对照抗体(R&D Systems)和用抗LRP6HuCAL抗体染色。将模拟物转染的HEK293T/17细胞用于阴性对照染色(低内源LRP6表达)。
10：结合优化
亲和性成熟文库的产生
为了增加所选择的抗体片段的亲和性和生物学活性，使用三核苷酸定向诱变，通过盒式诱变平行优化L-CDR3和HCDR2区，而保持框架区不变。
通过标准的克隆方法，并将不同的克隆转化进电感受态大肠杆菌TOP10F(Invitrogen)中产生不同的亲和性成熟文库。随机挑选的克隆的测序显示出100％的多样性。在挑选的克隆之间没有发现亲本结合者。最后，单独制备了全部文库的噬菌体。
11：MMTV-Wnt1异种移植物
在移植到裸鼠的乳房脂肪垫之前，将来自MMTV-Wnt1转基因小鼠的肿瘤以肿瘤碎片在FVB小鼠的乳房脂肪垫中传代5代。移植后第11天，当肿瘤达到大约110mm3的平均体积时，将小鼠随机分成3组(每组8只小鼠)，并每三天给药一次(DeAlmeida等人(2007)；CancerRes.67：5371-9)。
12：生物化学测定法中的抑制
在37℃5％CO2，使HEK293细胞生长于补充了10％胎牛血清的D-MEM中。将细胞以3×104/孔接种入96孔组织培养板(Costar)中，并用与0.2μL/孔FuGene6(Roche)混合的0.1ng/孔Wnt表达质粒、50ng/孔STF报告子和0.5ng/ml phRL-SV40(Promega)转染细胞。转染后4小时，将抗体稀释于PBS中，并加入到转染的细胞中。培养18小时后，使用DualGlo荧光素酶试剂(Promega)测量萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性。海肾荧光素酶用于归一化转染效率。
所测试的全部IgG形式都有效地且完全抑制Wnt1(2、6、7A、7B、9、10A、10B)产生的经典信号。在Wnt3/3A产生的信号存在的情况下，全部都产生了钟形增强曲线。
13：基于FACS的竞争测定
对于基于FACS的竞争测定，根据制造商说明，使用ECL蛋白质生物素化组件(GEHealthcare)使抗LRP6Fab和阴性对照Fab MOR03207生物素化。将生物素化的Fab以恒定的Fab浓度(20nM终浓度)用于HEK293-hLRP6ΔC-eGFP细胞上的FACS染色，并与100倍摩尔过量的未标记Fab竞争。在4℃，在平板震荡器上，用Fab稀释液孵育细胞1小时。用FACS缓冲液洗涤细胞一次后，在4℃，在平板震荡器上，用PE缀合的链亲和素(Dianova)避光孵育1小时。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并使用FACS Array(BD)测量荧光。类似地，非生物素化的抗LRP6Fab与100倍摩尔过量的LRP6蛋白SOST竞争，并通过PE缀合的抗人IgG抗体(Dianova)监测Fab与细胞的结合。
14：免疫印迹测定
在RIPA缓冲液(pH 7.4的50mM Tris-HCl、150mM NaCl、1％NP-40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、1mM EDTA)中制备总细胞裂解物。归一化裂解物的蛋白质浓度，通过SDS-PAGE分辨裂解物，将其转移到硝酸纤维素膜上并用指定的抗体探测。pT1479LRP6抗体需要产生膜提取物，以取得满意的结果。为了产生膜提取物，通过进行4次冻融循环，将细胞裂解于低渗缓冲液(10mM Tris-HCl pH7.5、10mM KCl)中，并使用RIPA缓冲液溶解不溶性膜部分。将蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)和1×磷酸酶抑制剂混合物(Upstate)加入到裂解缓冲液中。用于蛋白质印迹测定的商业抗体包括兔抗LRP6、兔抗pT1479LRP6和兔抗pS1490LRP6抗体(Cell Signaling Technology)。
实施例1：通过FACS测定抗LRP6抗体与内源性LRP6的特异性结合
使用抗LRP6抗体和FACS分析在许多肿瘤细胞上检查了LRP6的内源细胞表面表达的检测。如在图1A中所示，PA1细胞表达LRP5和LRP6mRNA，而U266和Daudi细胞并不表达LRP6mRNA。PA1细胞，而不是U266和Daudi细胞显示出被螺旋桨1抗LRP6IgG显著地染色。更重要地，U266细胞并不被抗LRP6抗体染色，尽管它们表达LRP6，表明抗LRP6抗体的特异性。此外，当使用LRP6shRNA消耗了内源性LRP6时，显著降低了抗LRP6抗体对PA1细胞的染色，进一步表明LRP6抗体的特异性。
在其他研究中，在PA1细胞中通过shRNA击倒LRP6进一步证实，Prop1和Prop3抗体对LRP6的特异性(参见图1B)。通过用编码针对LRP6的短发夹RNA的慢病毒感染细胞实现了击倒，并选择感染细胞的稳定库。用于本研究的shRNA感染方法描述于Wiederschain等人2009Cell Cycle 8：498-504。2009年2月25日电子发布。
实施例2：通过螺旋桨1和螺旋桨3抗LRP6Fab差别抑制Wnt1和Wnt3a报告基因测定
在体外Wnt报告基因测定中测试了不同的抗LRP6Fab。在HEK293T/17STF细胞中瞬时表达Wnt1或Wnt3A配体(报告基因测定)，并将其用不同浓度的抗LRP6Fab片段处理。使用由Huang等人(2009)，Nature；461：614-20(2009年9月16日电子发布)所述的方法进行STF测定。如在图2A中所见，螺旋桨1抗LRP6Fab(MOR08168、MOR08545、MOR06706)特异性降低了Wnt1依赖的信号转导，对Wnt3A依赖的信号转导没有很大影响。相反地，如在图2B中所示，螺旋桨3抗LRP6Fab(MOR06475、MOR08193、MOR08473)特异性降低了Wnt3依赖的信号转导，对Wnt1依赖的信号转导没有显著影响。结果表明，Wnt1和Wnt3A活性通过不同的LRP6Fab片段(表位)分别阻断。
实施例3：抗LRP6抗体与不同物种的LRP6的结合
为了显示交叉反应性，如上所述，处理表达人(HEK293T/17)和小鼠来源(NIH 3T3)的内源LRP6的细胞或者表达食蟹猴LRP6的瞬时转染的HEK293/T17细胞，并将其进行流式细胞术。图3总结了发现的结果，并显示全部的抗LRP6抗体都与人、小鼠和食蟹猴LRP6结合。
实施例4：基于对螺旋桨1和螺旋桨3抗LRP6抗体的敏感性的Wnt分类
为了基于Wnt对螺旋桨1和螺旋桨3抗LRP6抗体的敏感性来评价Wnt，将多种Wnt配体瞬时表达到HEK293T/17STF细胞中(报告基因测定)，并用螺旋桨1或螺旋桨3抗LRP6抗体处理。使用由Huang等人(2009)，Nature；461：614-20(2009年9月16日电子发布)所述的方法进行STF测定。结果显示于图4中，其基于抗体对LRP6的特定螺旋桨区的结合/阻断，描述了特定Wnt的活性抑制。图4显示，螺旋桨1抗LRP6Fab可以特异地抑制由Wnt1、Wnt2、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt9、Wnt10A、Wnt10B诱导的信号转导，而螺旋桨3抗LRP6Fab可以特异地抑制由Wnt3和Wnt3A诱导的信号转导。
实施例5：LRP6抗体从Fab片段至IgG的转变增强了由其他种类的Wnt诱导的Wnt信号转导
在一个相对出乎意料的观察研究中，LRP6抗体从Fab片段至IgG的转变增强了WNT信号转导。在293T/17STF报告子测定中，螺旋桨1抗LRP6IgG抑制Wnt1依赖的信号转导，并增强Wnt3A依赖的信号转导。类似地，如在图5中所示，螺旋桨3抗LRP6IgG抑制Wnt3A依赖的信号转导，并增强Wnt1依赖的信号转导。该发现提示，使用螺旋桨1和螺旋桨3抗体可以修饰或者“细调”Wnt信号通路。在其他细胞背景(例如MDA-MB231、MDA-MB435、PA-1、TM3和3t3细胞-数据未显示)下，在STF报告子测定中也观察到了类似的作用。
实施例6：螺旋桨1或螺旋桨3抗LRP6Fab特异地抑制Wnt1或Wnt3A诱导的LRP6磷酸化
用Wnt1或Wnt3A表达质粒瞬时转染HEK293T/17细胞，并将所述细胞用螺旋桨1或螺旋桨3抗LRP6Fab处理。如图6中可见，螺旋桨1抗LRP6Fab特异地抑制Wnt 1诱导的LRP6磷酸化，例如在T1479和S1490位点的磷酸化，而螺旋桨3抗体没有这种抑制。相反，螺旋桨3抗LRP6特异地抑制Wnt 3A诱导的LRP6的磷酸化，而螺旋桨1抗体没有这种抑制。这些结果证实抗体与LRP6的不同螺旋桨结构域结合，并且阻断特异的Wnt配体。
实施例7：使用螺旋桨1抗LRP6IgG在MMTV-Wnt1肿瘤异种移植模型中抑制Wnt靶基因的表达
在称作MMTV-Wnt1的本领域认可的遗传改造小鼠模型中，在体内进一步表征了LRP6抗体。进行实验，以测定IgG形式的抗LRP6抗体是否能在体内抑制Wnt信号转导和肿瘤生长。来源于MMTV-Wnt1转基因小鼠的乳房瘤是Wnt1依赖的；使用四环素调节系统(Gunther等人(2003)，上述)关闭Wnt1表达或者使用Fz8CRDFc(DeAlmeida等人(2007)CancerResearch 67：5371-5379)阻断Wnt活性以抑制体内肿瘤生长。为了测量抗LRP6抗体对MMTV-Wnt1肿瘤中Wnt信号转导的作用，用单剂量5mg/kg Wnt1种类特异的拮抗性抗LRP6抗体对移植了MMTV-Wnt1肿瘤的小鼠静脉内给药。在两周期间，分析抗体的血清浓度，以及β-联蛋白靶基因Axin2的mRNA表达。LRP6抗体的最终β相半衰期(terminalβ-phase half-life)为约108小时。对应于抗体注射，在肿瘤中观察到了Axin2mRNA表达的显著降低，并且在抗体注射后一周，当血清中的抗体水平降低时，Axin2表达逐渐恢复。这些结果提示，Wnt1种类特异性抗LRP6抗体在MMTV-Wnt1异种移植物中抑制了Wnt信号转导，并且这种抑制与血清中LRP6抗体的浓度相关。为了测试抗LRP6抗体对肿瘤生长的影响，用螺旋桨1特异的抗LRP6抗体、螺旋桨3特异的抗LRP6抗体或者同种型匹配的对照抗体对小鼠给药。用20mg/kg的初始剂量，然后每三天用10mg/kg对小鼠静脉内给药。在该实验中，螺旋桨1特异的抗LRP6抗体，而不是螺旋桨3特异的抗LRP6抗体引起了肿瘤消退。总之，这些结果表明，螺旋桨1特异的抗LRP6抗体诱导了MMTV-Wnt1异种移植物的消退。
在1小时至14天的不同时间点，用MOR08168(螺旋桨1抗LRP6IgG)处理裸鼠中的MMTV-Wnt1肿瘤异种移植物。图7显示，抗体的PK血清浓度和Wnt靶基因Axin2的mRNA表达的逆相关。用MOR08168处理抑制了肿瘤中Axin2基因表达水平，并且随着抗体从血清中清除而恢复。
除Axin2外，还评价了MOR08168对其他基因表达的影响。将Affymetrix Mouse4302.0Array用于进行加或者不加单剂量的MOR08168(5mg/kg)的MMTV-Wnt1同种异体移植肿瘤的时程实验。总共有6个时间点(0、1、3、8、24、336小时)并且每个时间点有3次重复。基于表明用抗体处理时的Axin的最大抑制的数据，将8小时选择为最佳代表性时间点，以确定推定应答Wnt途径抑制的差异表达基因。使用R/Bioconductor框架且利用Limma包以确定0小时时间点和8小时时间点之间差异表达的基因。将.05的调整P值用作确定差异表达基因集合的阈值。基于该截断，有映射到(mapped to)972个基因的称为差异表达的1270个探针集合。图8A是显示了上调＞2倍(具有＜0.01的调整P值)的基因的表格，并且图8B是显示下调＞2倍(具有＜0.01的调整P值)的基因的表格。
实施例8：螺旋桨1和螺旋桨3抗LRP6抗体在MMTV-Wnt1同种异体移植模型中的抗肿瘤活性
在MMTV-Wnt1同种异体移植模型中评价了LRP6螺旋桨1和3抗体的抗肿瘤活性。将MMTV-Wnt1肿瘤片段皮下(s.c.)移植到雌性裸鼠中。移植后11天，用载体IgG(10mg/kg，静脉内(i.v.))(每三天一次(q3d))、LRP6-螺旋桨1Ab MOR08168(10mg/kg，静脉内，每三天一次)或者LRP6-螺旋桨3Ab MOR06475(10mg/kg，静脉内，每三天一次)处理携带MMTV-Wnt1肿瘤(n＝8，平均121mm3；范围100-147mm3)的小鼠，并每三天一次用卡尺测量肿瘤。LRP6-螺旋桨1MOR08168Ab剂量依赖地诱导了肿瘤的消退(-55％，p＜0.05)(参见图9)。
实施例9：螺旋桨1和螺旋桨3抗LRP6抗体在MMTV-Wnt3同种异体移植模型中的抗肿瘤活性
在MMTV-Wnt3同种异体移植模型中评价了LRP6螺旋桨1和3抗体的抗肿瘤活性。将MMTV-Wnt3肿瘤片段皮下(s.c.)移植到雌性裸鼠中。移植后15天，用载体IgG(10mg/kg，静脉内，每周两次(2qw))、MOR08168LRP6-螺旋桨1Ab(3mg/kg，静脉内，每周一次)或者MOR06475LRP6-螺旋桨3Ab(10mg/kg，静脉内，每周两次)处理携带MMTV-Wnt3肿瘤(n＝6，平均209mm3；范围113-337mm3)的小鼠，并每周两次用卡尺测量肿瘤。MOR06475LRP6-螺旋桨3Ab表现出抗肿瘤活性(T/C＝34％，p＜0.05)(参见图10)。
实施例10：评价螺旋桨1和3抗LRP6抗体体内抑制Wnt3A的能力
在由与Wnt3A分泌L细胞共移植的PA1-STF报告细胞组成的共移植系统中体内测试LRP6-螺旋桨1和3抗体抑制Wnt3类Wnt信号转导的能力。用10×10e6PA1-STF细胞和0.5×10e6L-Wnt3A细胞皮下移植雌性裸鼠，并将其随机分成5组。24小时后，使小鼠接受单次静脉内剂量的载体、MOR08168LRP6-螺旋桨1Ab(10mg/kg)或MOR06475LRP6-螺旋桨3Ab(10mg/kg)，并在6小时、24小时、48小时、72小时和168小时后通过Xenogen成像。MOR06475能抑制Wnt3a诱导的信号转导至少72小时，而Mor08168增强Wnt3A诱导的信号转导(图11)。
实施例11：通过HDx MS对LRP6PD3/4及其抗体复合体的表位作图
为了鉴定螺旋桨3的YWTD-EGF区内的抗体结合位点，使用氢氘交换(HDx)质谱(MS)。LRP6螺旋桨结构域3-4(PD3/4)具有12个半胱氨酸和4个N-连接的糖基化位点。全部4个N-连接的糖基化位点都位于螺旋桨3结构域(631-932)。通过HDx MS，接近100％的覆盖度(可以得到结构信息的蛋白质的量)作图于螺旋桨4结构域上，并且大约70％的覆盖度作图于螺旋桨3结构域上。并没有检测紧邻4个糖基化位点周围的区域(图12A)。在Fab 06745存在的情况下，在螺旋桨3中发现了两个弱溶剂保护肽(Phe636-Leu647,Tyr 844-Glu856；图12A)。这提示，负责表位的残基或残基的部分在受保护的肽上或者在空间上与其邻近。基于LRP6PD34的晶体结构，溶剂保护区对应于Prop 3的叶片1和叶片6之间的凹面。
破坏ScFv06475与LRP6PD34相互作用的突变
为了证实叶片1和叶片6的边缘负责抗体介导的Wnt3a信号转导的抑制，构建了一系列的LRP6表面突变(R638A、W767A、Y706A/E708A、W850A/S851A、R852/R853A和D874A/Y875A)，所述突变也大约覆盖了通过HDx鉴定的涉及结合的区域。为了确保突变蛋白质是正确折叠的，进行了差异静态光散射(DSLS)热熔解测定。温度变性实验显示，野生型和突变蛋白质的聚集温度，Tagg(50％蛋白质变性的温度)是类似的。因此，突变并不影响蛋白质的折叠或者稳定性。
通过ELISA测定突变LRP6与scFv MOR06475的结合能力。定位于在HDx MS实验中显示出溶剂保护的肽上的残基(R638、W850/S851和R852/R853)的突变也显示出抗体结合的显著降低(参见图12B)。定位于在HDx中不显示出溶剂保护的肽上的残基(Y706/E708)的突变也不显示出抗体结合能力的改变(图12B)。因此，结合测定数据与通过HDx MS作图得到的结合界面很好地一致，提示残基R638、W850、S851、R852和R853直接参与表位。
总而言之，这些结果显示，不同的Wnt蛋白质需要LRP6的不同的螺旋桨区以用于信号转导。Wnt蛋白质的Wnt1类型(Wnt1、1、2、6、7A、7B、9、10A、10B)需要LRP6的螺旋桨1用于Wnt1信号转导，并且它们可以受螺旋桨1特异的抗LRP6抗体抑制。Wnt蛋白质的Wnt3A类型(Wnt3和Wnt3a)需要LRP6的螺旋桨3以用于Wnt3信号转导，并且它们可以受螺旋桨3特异的抗LRP6抗体抑制(图13)。另一意料之外的发现是，在Wnt配体存在的情况下，二价IgG形式的抗体的Wnt增强活性。在STF Luc报告基因测定法中，所测试的IgG形式的全部抗体都增强了Wnt1或者Wnt3A信号转导。有趣地，抑制Wnt1并且在Wnt3A测定中无活性的大多数Fab作为IgG仍抑制Wnt1，但增强Wnt3A信号转导，并且反之亦然。抑制Wnt3A的大多数Fab作为IgG增强Wnt1活性。该作用独立于IgG形式，因为测试了几种形式(IgG1LALA、IgG2、IgG4、IgG4_Pro)。这些数据显示，不同的Wnt蛋白与LRP6的不同螺旋桨结合以用于信号转导。使用二价LRP6抗体使LRP6二聚化，其自身并不足以刺激Wnt信号转导，但能增强通过其他类型的Wnt蛋白质引发的Wnt信号转导。这些发现阐明，不同的标准Wnt配体使用LRP6上不同的结合位点，并且在非阻断的Wnt Fab(单链抗体、单抗体)存在的情况下，全部二价抗体都以IgG形式增强Wnt活性。任一类型的单价结构作为最终形式都阻止了Wnt的增强。备选地，具有Wnt1和Wnt3A两种抑制活性的双特异性IgG或IgG样分子的构建都阻止了增强。因此，可以设计LRP6抗体构建体以控制和“细调”Wnt途径。
实施例12：产生双旁原位LRP6抗体
该实施例描述了双旁原位抗LRP6IgG-scFv抗体的产生和表征。首先表达、纯化和表征了含有不同结构域方向(例如VH-VL或VL-VH)和不同接头长度(例如(Gly4Ser)3或(Gly4Ser)4)的多种抗LRP6scFv。基于scFv研究的结果，制备并进一步评价了不同的双旁原位抗LRP6IgG-scFv。可以将scFv置于IgG内的多个位置，包括CH3或CL的羧基端和VH或VL的氨基端。此外，可以将多种接头用于scFv与IgG的连接，包括Gly4Ser和(GlyGlySer)2。
(a)材料和方法
(i)抗LRP6scFv的产生
通过Geneart合成编码全部scFv变体的基因。将编码两个方向(VH-VL和VL-VH，通过两个不同的接头：(Gly4Ser)3和(Gly4Ser)4分离，具有氨基端信号序列和羧基端6×组氨酸标签)的scFv的DNA片段通过NdeI/XbaI直接从Geneart载体克隆到载体pFAB15-FkpA中，得到的构建体称为：pFab15-MOR06475-VH-(Gly4Ser)3-VL，pFab15-MOR06475-VH-(Gly4Ser)4-VL，pFab15-MOR06475-VL-(Gly4Ser)3-VH，pFab15-MOR06475-VL-(Gly4Ser)4-VH，pFab15-MOR08168-VH-(Gly4Ser)3-VI.，pFab15-MOR08168-VH-(Gly4Ser)4-VL，pFab15-MOR08168-VL-(Gly4Ser)3-VH，pFab15-MOR08168-VL-(Gly4Ser)4-VH，pFab15-MOR08545-VH-(Gly4Ser)3-VL，pFab15-MOR08545-VH-(Gly4Ser)4-VL，pFab15-MOR08545-VL-(Gly4Ser)3-VH和pFab15-MOR08545-VL-(Gly4Ser)4-VH。
(ii)双旁原位抗LRP6IgG-scFv的产生
抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scFv
将含密码子优化的VH序列(通过Geneart合成)的载体pRS5a MOR08168hIgG1LALA用作产生双旁原位构建体的来源。首先，在编码hIgG1LALA的序列的3’端，通过QuickChange定点诱变(Stratagene)引入AfeI位点(引物号1：agcgtgatgcacgaagcgctgcacaaccactac-3’(SEQ ID NO：213)和引物号2：5，-gtagtggttgtgcagcgcttcgtgcatcacgctg-3’(SEQ ID NO；214))。通过Geneart合成编码MOR06475scFv的基因(VL-VH方向，通过(Gly4Ser)4接头分离)。将含AfeI位点的5’引物和编码(GlyGlySer)2接头序列，以及含AscI位点的3’引物用于扩增整个MOR06475-scFv基因(引物号3：5’-tgatgcacgaagcgctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtcccccggcaagggcggctccggcggaagcgatatc-3’(SEQ ID NO：215)和引物号4：5’-gagcggccgcccggcgcgcctcatcagctggacactgtcaccaggg-3’(SEQ ID NO：216))。然后将PCR产物通过AfeI/AscI克隆到载体pRS5a MOR08168hIgG1LALA中，得到最终构建体pRS5a MOR08168hIgG1LALA-6475sc-fv。通过Geneart合成编码MOR08168的密码子优化的VL的基因。将含AgeI位点的5’引物和含HindIII位点的3’引物用于扩增整个MOR08168-VL基因(引物号5：(5’-gcttccggacaccaccggt gacatcgagctgacccagcc-3’SEQ ID NO：217)和引物号6：5’-cagcacggtaagctt ggtgcctccgccgaacaccag-3’(SEQ ID NO：218))。然后将PCR产物通过AgeI/HindIII克隆到载体pRS5a-hlambda中，得到最终构建体pRS5a MOR08168hlambda。
没有赖氨酸(K)的抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scFv
将载体pRS5a MOR08168hIgG1LALA-6475scFv(SEQ ID NO：165)用作模板DNA来去除CH3的羧基端赖氨酸。将Quick Change XL定点诱变试剂盒(Stratagene)与以下引物组合使用：
5’-ctgtcccccggcggcggctccggc-3’(SEQ ID NO：219)
5’-gccggagccgccgccgggggacag-3’(SEQ ID NO：220)
根据Stratagene方法进行定点诱变；产生了称为pRS5a hIgG1LALA MOR08168opt6475scFv K的新构建体。
在没有任何修饰的情况下，将含密码子优化的VL序列(通过Geneart合成)的载体pRS5a MOR08168hlambda(其产生为抗LRP6_MOR08168hIgGlLALA_6475scFv所描述)用于表达LC。
抗LRP6MOR08168hIgGlLALA 6475scFv AspPro至AspAla(DP至DA)
将载体pRS5a MOR08168hIgG1LALA-6475scFv(SEQ ID NO：165)用作将scFv的VH中的DP取代成DA的模板DNA。将Quick Change XL定点诱变试剂盒(Stratagene)与以下引物组合使用：
5’-ccatgaccaacatggacgccgtggacaccgccacc-3’(SEQ ID NO：221)
5’-ggtggcggtgtccacggcgtccatgttggtcatgg-3’(SEQ ID NO：222)
根据Stratagene方法进行定点诱变；产生了称为pRS5a hIgG1LALA MOR08168opt6475scFv DP至DA的新构建体。
在没有任何修饰的情况下，将含密码子优化的VL序列(通过Geneart合成)的载体pRS5a MOR08168hlambda(其为抗LRP6_MOR08168hIgG1LALA_6475scFv描述)用于表达LC。
抗LRP6MOR08168hIgGlLALA 6475scFv AspPro至ThrAla(DP至TA)
将载体pRS5a MOR08168hIgG1LALA-6475scFv(SEQ ID NO：165)用作将scFv的VH中的DP取代成TA的模板DNA。将Quick Change XL定点诱变试剂盒(Stratagene)与以下引物组合使用：
5’-caccatgaccaacatgaccgccgtggacaccgccacc-3’(SEQ ID NO：223)
5’-ggtggcggtgtccacggcggtcatgttggtcatggtg-3’(SEQ ID NO：224)
根据Stratagene方法进行定点诱变；产生了称为pRS5a hIgG1LALA MOR081680pt6475scFv DP至TA的新构建体。
在没有任何修饰的情况下，将含密码子优化的VL序列(通过Geneart合成)的载体pRS5a MOR08168hlambda(其产生描述为抗LRP6_MOR08168hIgGlLALA_6475scFv)用于表达LC。
抗LRP6MOR08168hIgG1LALA6475scFv at ValLeu(VL )
在没有任何修饰的情况下，将含密码子优化的VH序列(通过Geneart合成)的载体pRS5a MOR08168hIgG1LALA用于表达HC。通过DNA2.0合成编码密码子优化的MOR06475scFv和MOR08168-VL的基因，并将其通过AgeI/HindIII克隆到载体pRS5a hlambda MOR08168中。得到的载体称为pRS5a hlambda MOR081686475scFv at VL。
抗LRP6MOR06475hIgG1 LALA 8168scfv(VH -3-VL )，其中3表示VH 和VL 链之间的 (Gly 4 Ser) 3 氨基酸接头。
使用以下引物：
5’-gttcctggtcgcgatcctggaaggggtgcactgccaggtgcaattgaaagaaagcg-3’(SEQ IDNO：225)
5’-cttggtggaggctgagctaac-3’(SEQ ID NO：226)
从载体pM2hIgG1LALA MOR06475中扩增MOR06475-VH，将PCR产物通过NruI/BlpI克隆到载体pRS5a hIgG1LALA MOR081686475scFv中，得到的载体称为pRS5a hIgG1LALAMOR06475 6475scFv。
使用以下引物：
5’-gcacgaagcgctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtcccccggcaagggcggctccggcggaagccaggttcaattggttgaaagc-3’(SEQ ID NO：227)
5’-gggccctctagagcggccgcccggcgcgcctcatcacagaacggtaagcttggtgcc-3’(SEQID NO：228)
从载体pRS5a MOR08168scFv(VH-3-VL)中扩增MOR08168scFv。将PCR产物通过AfeI/XbaI克隆到载体pRS5a hIgGlLALA MOR06475 6475scFv中，得到的最终载体称为pRS5ahIgGlLALA MOR06475 8168scFv(VH-3-VL)。
使用以下引物：
5’-gacaccaccggtgatatcgtgctgacccagagc-3’(SEQ ID NO：229)
5’-gcagccaccgtacgtttaatttcaac-3’(SEQ ID NO：210)
从载体pM2hkappa MOR06475中扩增MOR06475-VL，将PCR产物通过AgeI/BsiWI克隆到载体pRS5a hkappa MOR06654中，得到的载体称为pRS5a hkappa MOR06475。
抗LRP6MOR06475hIgG1 LALA 8168scfv(VH -4-VL )，其中4表示VH 和VL 链之间的 (Gly 4 Ser) 4 氨基酸接头。
使用以下引物：
5’-gttcctggtcgcgatcctggaaggggtgcactgccaggtgcaattgaaagaaagcg-3’(SEQ IDNO：211)
5’-cttggtggaggctgagctaac-3’(SEQ ID NO：212)
从载体pM2hIgG1LALA MOR06475中扩增MOR06475-VH，将PCR产物通过NruI/BlpI克隆到载体pRS5a hIgG1LALA MOR08168 6475scFv中，得到的载体称为pRS5a hIgG1LALAMOR06475 6475scFv。
使用以下引物：
5’-gcacgaagcgctgcacaaccactacacccagaagagcctgagcctgtcccccggcaagggcggctccggcggaagccaggttcaattggttgaaagc-3’(SEQ ID NO：213)
5’-gggccctctagagcggccgcccggcgcgcctcatcacagaacggtaagcttggtgcc-3’(SEQID NO：214)
从载体pRS5a MOR08168scFv(VH-4-VL)中扩增MOR08168scFv，使用以下引物：
5’-gacaccaccggtgatatcgtgctgacccagagc-3’(SEQ ID NO：215)
5’-gcagccaccgtacgtttaatttcaac-3’(SEQ ID NO：216)
从载体pM2hkappa MOR06475中扩增MOR06475-VL。
将PCR产物通过AgeI/BsiWI克隆到载体pRS5a hkappa MOR06654中，得到的载体称为pRS5a hkappa MOR06475。
(iii)抗LRP6-scFv的表达
用质粒DNA转化电感受态大肠杆菌菌株W3110。用单个菌落接种预培养物(500ml烧瓶中，含12.5μg四环素/ml和0.4％葡萄糖的150ml LB培养基)，并在37℃/230转/分钟培养过夜。用预培养物接种表达培养基(2l烧瓶中，含12.5μg四环素/ml的6×500ml SB培养基)至0.1的O.D600，并在25℃/230转/分钟培养至大约0.6的O.D600。然后，加入IPTG(Roche)至0.4mM的终浓度，并在25℃/230转/分钟培养过夜。通过离心(4℃，在4600转/分钟20分钟)收获细胞，并将细胞沉淀冰冻于-20℃。
(iv)抗LRP6-scFv的纯化
将来自3l表达的沉淀悬浮在50ml裂解缓冲液(pH 7.4的20mM NaH2PO4、20mM咪唑、500mM NaCl；每50ml缓冲液1片无EDTA的Complete，Roche#11836170001，10mM MgSO4和Benzonase)中。通过French Press处理细胞悬浮液(2×1000巴)，并在4℃，在16000×g离心30分钟。用10ml裂解缓冲液平衡1ml HisTrap HP柱子(GE Helthcare)。通过StericupFilter(Millipore)过滤上清液，并将其装载到已平衡的柱子中(1ml/分钟)。用裂解缓冲液(20ml)洗涤柱子，并用3ml洗脱缓冲液(除250mM咪唑外，与裂解缓冲液一样)洗脱结合的蛋白质。将洗脱物直接装载到用130ml PBS平衡的Superdex75柱子(HiLoad16/60，GE-Healthcare)上(1ml/分钟)。用1ml/分钟的PBS进行运行，将洗脱物收集成1.5ml级分，并将其在10％Bis-Tris凝胶(NuPage，Invitrogen)上分析。合并足够的级分，将其通过0.2μm滤器过滤，并储存于4℃。通过LC-MS(用氧化和还原的样品)并通过SEC-MALS(聚集分析)分析全部纯化的蛋白质。
(v)双旁原位抗LRP6IgG-scFv的瞬时表达
在BioWave20中，以10rpm，角度7°摇动、通气25L/小时、O2 25％、CO2 6％，在M11V3培养基：批号D07668B中培养3.2L HEK293-6E细胞至2E6个活细胞/mL的密度。用1.8L DNA:PEI-MIX(质粒：pRS5a MOR08168hIgG1LALA-6475sc-Fv 5mg+pRS5a MOR08168hlambda 5mg+20mg PEI)瞬时转染细胞。转染后6小时，将5L具有Yeastolate的进料培养基(Feedingmedia)(Novartis)：批号09-021加入到培养物中。然后，以24rpm、角度7°摇动、通气25L/小时、O2 25％、CO2 6％进一步培养细胞。转染后7天，通过使用Fresenius滤器0.2μm进行的横向流过滤去除细胞。然后，使用来自Fresenius的10kDa截断滤器，通过横向流过滤将无细胞物质浓缩至1.75L。浓缩后，通过杯式滤器(0.22μm)无菌过滤浓缩物。将无菌上清液储存于4℃。以类似的方式表达全部所述的双旁原位抗LRP6-scFv变体。
(vi)双旁原位抗LRP6IgG-scFv的纯化
使用具有25ml自包装的MabSelect SuRe树脂的新鲜消毒的(0.2M NaOH/30％异丙醇)XK16/20柱，在冷藏柜中6℃下，在100explorer Air层析系统上进行双旁原位IgG的纯化(所有试剂都来自GE Healthcare)。除加样外，所有流速都是3.5ml/分钟，压力限制为5巴。用3CV的PBS(制备自10×，Gibco)平衡柱子，然后以2.0ml/分钟过夜(o/n)装载浓缩的且无菌过滤的发酵上清液(1.35L)。用8CV的PBS洗涤柱子。然后，用pH梯度(从pH 4.5的50mM柠檬酸、70mM NaCl开始，在12CV中线性下降至pH 2.5的50mM柠檬酸、70mM NaCl，之后是2CV恒定步骤的相同pH 2.5缓冲液)洗脱IgG。在pH 3.8附近的单对称峰中的梯度期间洗脱双旁原位IgG，并收集成4ml级分。将级分合并成3个库，左坡、主峰和右坡。使用pH 9.0的2M Tris，在搅拌下立即将库缓慢滴定至pH 7.0。无菌过滤(Millipore Steriflip，0.22μm)库，在Lambda 35分光仪(Perkin Elmer)中测量OD 280nm，并基于序列数据计算蛋白质浓度。分别测试库的聚集(SEC-MALS)和纯度(SDS-PAGE和MS)，并且基于这些结果，仅进一步使用中间的库(35ml，2.55mg/ml蛋白质)。以类似的方式纯化全部所述的双旁原位抗LRP6-scFv变体。
(vii)通过蛋白质微阵列的交叉反应分析
微阵列是由Protagen AG(AV-VAR-EP)生产的定制高密度蛋白质芯片，并且含有以一式四份印刷在硝酸纤维素包被的载玻片上的384个预定且纯化的人蛋白质。基于基因本体论将这些蛋白质分类为胞外蛋白质或分泌蛋白质，并且使用大肠杆菌将所述蛋白质表达为氨基端组氨酸标签融合的蛋白质，并使用固定化金属离子亲和层析(IMAC)纯化。使用由Protagen AG开发的方法编程的TECAN Hybridization StationHS400Pro进行抗体的杂交。以5μg/ml的终浓度测试一级抗体。以7.5μg/ml的终浓度使用标记二级抗体(Cy5缀合的AffiniPure山羊抗hsIgG F(ab’)2，片段特异的)(JacksonImmunoresearch，代码号109-175-097)。使用装备了红色激光(635nm)的GenePixProfessional 4200A荧光微阵列扫描仪(Axon Instruments，CA)进行微阵列图像采集。使用GenePix Pro v6.0软件进行图像分析。使用Protagen数据分析工具v1.8进行数据分析。为了测定源自二级抗体与被印刷抗原的直接结合的非特异的交叉反应性，在没有使用一级抗体的情况下，也在上孵育二级抗体。为了测定归一化至相应抗原的交叉反应性水平，将饱和浓度(20fmol/点)时的荧光信号强度设定为100％。认为大于4％的抗原信号的给定的蛋白质的全部信号强度为阳性命中，条件是在仅具有经标记的二级抗体的各个对照中也没有发现所述信号强度。
(viii)通过差示扫描量热法(DSC)测量的构象稳定性
使用装备了深孔板自动取样器的来自Microcal的毛细管细胞微量热计VP-DSC测量DSC。用软件Origin 7.5分析数据。将样品(400μl)加入到来自NuncTm的2ml深孔板中。分析pH 7.0的PBS中的1mg/ml的样品。参照样品含有400μl与分析物相同的缓冲液，通常为PBS。在20℃至100℃之间(加热速率为每分钟3.3℃)测量与热变性相关的热交换。表观融解温度(Tm)对应于热转化中点，其中50％的分析物是解折叠的。
(ix)血清稳定性研究
将纯化的蛋白质溶解在35μl大鼠血清或者小鼠血清(Gene Tex)中，得到了0.3mg/ml的终浓度。在37℃，在平板培养箱中孵育样品。在不同时间点获取4μl的每一样品，加入10μl样品缓冲液(4×，NuPage，Invitrogen)和26μl水，并将样品冻存于-20℃。将12μl的每一样品装载到12％Bis-Tris-凝胶(NuPage，Invitrogen)中，在200V进行电泳35分钟。在30V，在硼酸盐缓冲液(50mM Borate，50mM Tris)中进行蛋白质至PVDF膜(Invitrogen)的转移1小时。在TBST(10mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，0.1％Tween80)中快速地洗涤膜，然后在含5％奶粉的TBST中室温/摇动器孵育2小时。在TBST中快速地洗涤膜，然后在含1:10.000稀释的POD缀合的山羊抗人IgG(Fab片段特异的)(Dianova)或者1:500稀释的抗组氨酸POD(Roche)的TBST中室温/摇动器孵育1小时。在TBST中室温/摇动器洗涤膜三次，每次5分钟。使用BM Blue POD底物(Roche)或者ECL/ECL Plus(GE-Healthcare)进行信号检测。
(b)结果
(i)抗LRP6-scFv的表达、纯化和表征
在大肠杆菌W3110中成功表达了全部scFv，并将其通过亲和层析之后通过大小排阻层析纯化。对于全部纯化的样品，通过LC-MS分析(用还原的或者氧化的样品进行)和通过SDS PAGE确认了预期大小(MOR06475(Gly4Ser)3/(Gly4Ser)4：分别为26.74和27.06kDa、MOR08168(Gly4Ser)3/(Gly4Ser)4：分别为26.5和26.85kDa、MOR08545(Gly4Ser)3/(Gly4Ser)4：分别为25.99和26.31kDa)。获得了＞95％的纯度。图14显示了SDS-PAGE分析的结果，其中将1.5μg的每一纯化蛋白质装载到10％Bis-Tris凝胶(NuPage，Invitrogen)中，M：标记物，参见Blue Plus2(Invitrogen)；(1)：MOR06475-VH-(Gly4Ser)4-VL；(2)MOR06475-VL-(Gly4Ser)4-VH；(3)MOR08168-VH-(Gly4Ser)4-VL；(4)MOR08168-VL-(Gly4Ser)4-VH；(5)MOR08545-VH-(Gly4Ser)4-VL；(6)MOR08545-VL-(Gly4Ser)4-VH(7)MOR06475-VH-(Gly4Ser)3-VL；(8)MOR06475-VL-(Gly4Ser)3-VH(9)MOR08168-VH-(Gly4Ser)3-VL；(10)MOR08168-VL-(Gly4Scr)3-VH；(11)MOR08545-VH-(Gly4Ser)3-VL；(12)MOR08545-VL-(Gly4Ser)3-VH。
通过DSC比较了全部ScFv的热稳定性。对于MOR06475变体，融解温度(Tm)显著更高。对于MOR06475-VL-(Gly4Ser)4-VH，观察到了最高的Tm(64.7℃)，因此认为该分子可能比产生的其他构建体更稳定。
在HEK293STF测定中评估了MOR06475、MOR08168和MOR08545scFv和Fab构建体，以及几种双旁原位形式的活性(图17和18)。总之，数据显示，在STF测定中，螺旋桨1IgG(MOR08168)抑制螺旋桨1配体，例如Wnt1，但增强螺旋桨3配体，例如Wnt3。螺旋桨3scFv6475抑制螺旋桨3配体，例如Wnt3，但对螺旋桨1配体例如Wnt1没有活性。此外，MOR08168/6475双旁原位抗体具有针对螺旋桨1和螺旋桨3两种配体的活性，并且在HEK293Wnt STF测定中应用的任一浓度都没有增强活性。
(ii)双旁原位抗LRP6IgG-scFv的表达、纯化和表征
图15显示了本研究中所产生的双旁原位抗LRP6Ig-scFv形式的图示。图15A表示与IgG的羧基端连接的scFv scFv；15B表示与Fc的氨基端连接的scFv scFv；15C表示与Fc的羧基端连接的scFv scFv；并且15D表示与Fc的氨基端和羧基端连接的scFv scFv。
本实验中的双旁原位抗体是具有与hIgG1 LALA CH3的羧基端融合的scFv的双旁原位完整IgG。在该特定研究中，通过(GlyGlySer)2-接头将scFv与完整IgG分离。scFv由具有(Gly4Ser)4接头的VL-VH方向组成。
在HEK293-6E细胞中瞬时表达双旁原位抗LRP6IgG-scFv，并将其通过亲和层析使用pH4.5-2.5梯度洗脱进行纯化。通过LC-MS分析和SDS-PAGE测定了197.4kDa的预期大小，具有大于97％的纯度。通过SEC MALS测定的聚集小于5％。图16是纯化的双旁原位抗LRPIgG-scfV的SDS-Page分析。将样品装载在12％Bis-Tris凝胶(NuPage，Invitrogen)中。标记物：Invitrogen Mark12；(1)：未还原的；(2)：还原的。
如通过Biacore测定的，在pH 6.0，双旁原位抗LRP6IgG scFv和亲本抗LRP6IgG分别以0.021和0.023μM的Kd与人FcRn结合。在pH 7.4，两种形式都表现出与人FcRn低水平的结合，因此预期该BpAb在体内表现为标准的IgG(PK特征与IgG1类似)(参见图19)。
在多达336个小时的测试期间，在37℃下，双旁原位抗LRP6IgG scFv在小鼠和大鼠血清中都是稳定的(数据未显示)，并且当在含384个纯化的胞外或分泌蛋白质的定制Protagen Unichip上评价时，没有显示大于4％的结合(数据未显示)。
(c)讨论
首先表征了多种抗LRP6scFv，以能优化最终的双旁原位抗体。在大肠杆菌中以两种方向表达了具有两种不同的接头长度的scFv。将抗LRP6MOR06475、8168和8545表达为具有(Gly4Ser)3和(Gly4Ser)4接头的VH-VL和VL-VH scFv。成功表达并纯化了具有低水平(＜5％)聚集的全部MOR06475和MOR08168变体。获得了具有预期大小的正确加工的蛋白质。热稳定性数据显示，最稳定的scFv形式为具有64.7℃的Tm的MOR06475-VL-(Gly4Ser)4–VH。全部测试的MOR08168scFv形式显示出具有50-52℃的Tm的显著降低的热稳定性。
从细胞培养物中成功表达并纯化了具有低水平(＜5％)聚集的在CH3和VL具有scFv的双旁原位抗LRP6IgG，以及修饰的变体(在CH3没有羧基端赖氨酸(K)、在scFv的VH中具有天冬氨酸脯氨酸(DP)至天冬氨酸丙氨酸(DA)和天冬氨酸脯氨酸(DP)至苏氨酸丙氨酸(TA)的取代)。测定了大约197-198kDa的预期大小。构建体抗LRP6MOR08168hIgG1LALA6475scFv和抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scFv at VL，以及突变的构建体(在CH3缺失羧基端赖氨酸(K)，并且具有天冬氨酸脯氨酸(DP)至天冬氨酸丙氨酸(DA)和天冬氨酸脯氨酸(DP)至苏氨酸丙氨酸(TA)的取代)由具有VL-VH方向的scFv组成，并且通过(Gly4Ser)4接头分离。将(GlyGlySer)2接头分别用于scFv与hIgG1LALA的CH3结构域以及与hlambda的VL的连接。然而，如前所述，scFv还可以由通过备选接头分离的VH-VL组成，此外，还可以使用备选接头将scFv与IgG内的其他位置包括CL的羧基端和VH的氨基端连接。具有MOR08168scFv的构建体由具有VH-VL方向的scFv组成，并通过(Gly4Ser)3和(Gly4Ser)4接头分离。(GlyGlySer)2接头用于scFv与hIgG1LALA的CH3结构域的连接。
双旁原位抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scFv在血清中是稳定的(测试了多达336个小时)。如预期的，在pH6.0，双旁原位抗体与人FcRn结合，在pH7.4可见低水平结合。亲本抗体的结合具有类似的动力学。
实施例13：双旁原位抗体抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv的体内评价
在由与Wnt3A分泌L细胞共移植的PA1-STF报告细胞组成的共移植系统中测试了双旁原位抗体抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv体内抑制Wnt3类Wnt信号转导的能力。用10×10e6PA1-STF细胞和0.5×10e6L-Wnt3A细胞皮下移植雌性裸鼠，并随机分成5组。24小时后，小鼠接收单次静脉内剂量的载体、MOR08168LRP6-螺旋桨1Ab(10mg/kg)、MOR06475LRP6-螺旋桨3Ab(10mg/kg)或者双旁原位抗体抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv(1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg)，然后通过Xenogen在6小时、24小时、48小时、72小时和168小时后成像。双旁原位抗体抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv显示出Wnt3A诱导的信号转导的剂量相关抑制(1mg/kg的抗体在24小时显示出最大的抑制，在48小时回到基线，并且3mg/kg和10mg/kg的抗体显示出持续抑制至少72个小时)。以10mg/kg施用的MOR06475LRP6-螺旋桨3Ab能抑制Wnt3A诱导的信号转导至少72个小时，而以10mg/kg施用的MOR08168LRP6-螺旋桨1Ab增强Wnt3A诱导的信号转导(图20)。
为了测量在MMTV-Wnt1肿瘤中相对于MOR08168LRP6-螺旋桨1Ab而言，双旁原位抗体抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv对Wnt信号转导的影响，用5mg/kg单次剂量的双旁原位抗体抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv或者5mg/kg单次剂量的MOR08168LRP6-螺旋桨1抗体对MMTV-Wnt1肿瘤移植的小鼠静脉内给药。在两周期间，分析双旁原位抗体和螺旋桨1抗体的血清浓度，以及β-联蛋白靶基因Axin2的mRNA表达。双旁原位抗体的最终β相半衰期为约48个小时，而LRP6抗体的最终β相半衰期为约72个小时。在获自用双旁原位抗体或螺旋桨1抗体给药的小鼠的肿瘤中观察到了Axin2mRNA表达的显著降低，并且Axin2表达逐渐恢复，在双旁原位抗体抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv和MOR08168LRP6-螺旋桨1抗体之间没有观察到显著差异(图21)。
在MMTV-Wnt1同种异体移植模型中评价了双旁原位抗体抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv的抗肿瘤活性。将MMTV-Wnt1肿瘤片段皮下(s.c.)移植到雌性裸鼠中。移植后7天，用载体IgG、MOR08168LRP6-螺旋桨1Ab(3mg/kg，i.v.，qw)或者双旁原位抗体抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv(3mg/kg，i.v.，2qw)处理携带MMTV-Wnt1肿瘤的小鼠(n＝8，平均137mm3；范围：81-272mm3)，并每周两次用卡尺测量肿瘤。MOR08168LRP6-螺旋桨1Ab和双旁原位抗体抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv抗体都诱导了肿瘤消退(分别为-93％，p＜0.05和-91％，p＜0.05)(参见图22)。评价了双旁原位抗体抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv的剂量依赖性，并描述于图23中。
通过β-联蛋白siRNA或者显性失活的TCF-4抑制结直肠癌细胞中Wnt信号转导引起了快速的细胞周期停滞并诱导了肠分化程序(van der Wetering等人(2002)，Cell，111，241-250；van der Wetering等人(2003)，EMBO Reports，4，609-615)。为了测定通过拮抗性LRP6抗体抑制Wnt信号转导是否在小鼠MMTV-Wnt1乳房瘤中具有类似的结果，通过油红O对脂质(乳的主要组分)染色检查了分泌性分化。用单次剂量的PBS(对照)或者5mg/kg抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv处理具有MMTV-Wnt1肿瘤的小鼠24小时、72小时或者5天，处理后，将冰冻的鼠肿瘤同种异体移植物切片切割成5μm厚。在室温将切片风干30-60分钟，然后在冰预冷的10％福尔马林中固定5-10分钟。立即在dH2O中漂洗切片3次。使用油红O染色试剂盒(Poly Scientific R&D，货号k043)进行油红O染色。用ScanScope CS/GL扫描仪(Aperio Technologies)扫描切片，并用ImageScope v10.2.1.2315软件(AperioTechnologies)，使用具有阳性像素计数(positive-pixel count)的IHC颜色解卷积算法分析组织切片。图24A中显示了油红O染色的代表性图像，并在图24B中定量。图表示平均值±SEM值。72小时组中n＝4，24小时组中n＝3，5天组中n＝2，对于PBS(对照)n＝1，并且表明在实验时程中油红O染色的增加。总之，这些结果提示，在乳房瘤细胞中抑制Wnt信号转导可以导致细胞周期停滞，并且诱导分泌性分化程序。
在MDA-MB-231乳房异种移植模型中进一步评价了双旁原位抗体抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv的抗肿瘤活性。将50％基质胶中的5×10e6个MDA-MB-231细胞皮下移植到雌性裸鼠中。移植后31天，用载体或双旁原位抗体抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv(3mg/kg，i.v.，qw)处理携带MDA-MB-231肿瘤的小鼠(n＝7，平均165mm3；范围99-238mm3)，并每周两次用卡尺测量肿瘤。以每周3mg/kg给药双旁原位抗体抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv显著延迟了肿瘤生长(T/C＝23％，p＜0.05)(参见图25)。
实施例14：在MMTV-Wnt1模型中其他双旁原位抗体的体内评价
如在实施例10中所述，产生的其他抗LRP6反向双旁原位抗体由螺旋桨3抗体MOR06475和螺旋桨1MOR08168scfv结构域组成。在MMTV-Wnt1模型中测定了相对于MOR08168hIgG1LALA 6475scfv，这些双旁原位抗体(MOR06475hIgG1LALA_8168scfv_(VH-3-VL)和MOR06475hIgG1LALA_8168scfv_(VH-4-VL))在体内抑制Wnt1信号转导的能力。用5mg/kg单剂量的上述每一抗体对用MMTV-Wnt1肿瘤移植的小鼠静脉内给药。在5天中(评价时间点为0、2、7、24、72和120小时)，分析每一抗体(MOR08168hIgG1LALA 6475scfv、MOR06475hIgG1LALA_8168scfv_(VH-3-VL)和MOR06475hIgG1LALA_8168scfv_(VH-4-VL))的血清浓度，以及β-联蛋白靶基因Axin2的mRNA表达。两种反向双旁原位抗体都显示出axin2mRNA表达的显著降低(降低与MOR08168hIgG1LALA 6475scfv相同的最大程度)。然而，axin2mRNA表达降低的持续时间比用MOR08168hIgG1LALA 6475scfv观察到的持续时间短，对于两种反向双旁原位分子，在24小时时间点信号都恢复到了基线。这与这些分子减少的暴露一致，在24小时时所述分子的血清水平下降到5μg/ml以下，相比较，MOR08168hIgG1LALA 6475scfv需要120小时。
实施例15：双旁原位抗体与重组LRP6PD1/2和PD 3/4的结合亲和性
使用Biacore T-100(GE Healthcare)，通过表面等离振子共振(SPR)评价了抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv、MOR08168和MOR6475与LRP6的螺旋桨结构域1-2(PD1/2，登录号NP002327的氨基酸残基19-629)和LRP6的螺旋桨结构域3-4(PD3/4，登录号NP002327的氨基酸631-1246)的结合亲和性。为了测定亲和性，将抗人IgG Fcγ特异性抗体(#109-005-098，Jackson Immunology)稀释在10mM乙酸钠(pH5.0)缓冲液中，然后使用标准胺偶联化学，将所述抗体固定于CM4芯片(GE Healthcare，BR-1005-34)上，使全部4个流动池都达到～2000RU的密度。用7分钟注射1:1比率的0.4M EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)和0.1M NHS(N-羟基丁二酰亚胺)活化羧甲基葡聚糖表面。然后用1M乙醇胺封闭过量的活性酯。在HBS-EP缓冲液(GE Healthcare)中制备10μg/ml的抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv，并以10μl/分钟的流速，捕获在CM4芯片的单独流动池上至～70RU的密度。将PD1/2和PD3/4从50nM开始，制备成2倍浓度系列，并以30μl/分钟注射1分钟。这允许抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv-捕获的表面和没有被捕获配体的对照表面上40分钟的解离相。然后用10mM甘氨酸(pH 2.2)使表面再生两次。为了进行抗LRP6MOR08168hIgG1LALA6475scfv与PD1/2和PD3/4的双重结合分析，在固定了抗人IgG Fcγ特异性抗体的CM4芯片上捕获抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475scfv。然后100nM饱和浓度的PD3/4以30μl/分钟的流速流过该表面30分钟。在PD3/4之后，立即注射100nM饱和浓度的PD1/2。使用BIA评价软件(GE Healthcare)，从减去基线的校正结合曲线计算解离常数(KD)、缔合速率(kon)和解离速率(koff)。
将抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475 scfv(双旁原位抗体)与PD1/2和PD3/4的结合与MOR08168(螺旋桨1抗体)和MOR6475(螺旋桨3抗体)与PD1/2和PD3/4的结合比较。图26A显示了分子与对应的LRP6受体结构域PD1/2和PD3/4的亲和性。所测定的抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475 scfv对PD1/2和PD3/4的KD分别与MOR08168对PD1/2和MOR6475对PD3/4的KD相似。图26B显示了抗LRP6 MOR08168hIgG1LALA 6475 scfv与每一蛋白质的缔合相(association phase)和解离相(dissociation phase)。抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475 scfv与PD1/2结合的解离率(off-rate)低于与PD3/4的解离率。进一步的研究表明，如所预期，将PD1/2和PD3/4顺次注射表明抗LRP6MOR08168hIgG1LALA 6475 scfv能与两种螺旋桨结构域构建体都结合(图26C)。
实施例16：提高scFv08168和scFv06475的热稳定性的scFv突变
该实施例描述了在螺旋桨1和螺旋桨3抗体的scFv中进行的突变，以及如通过热稳定性测定的，各个突变和突变的组合对scFv的稳定性的影响。scFv稳定性的提高可以翻译成包含该突变的scFv的抗体构建体的整体稳定性。
材料和方法
构建体
对于基于IgG的双旁原位分子，通过GlyGlySer接头，将scFv06475与MOR08168IgG1的羧基端融合，以制备图27中命名为“901”的双旁原位抗体(MOR08168IgG1LALA6475scfv)，或者通过GGS接头将scFv08168与MOR06475IgG1的羧基端融合，以制备图27中命名为“902”的双旁原位抗体。对于详细信息，请参考本专利申请的其他部分。
合理设计scFv06475和scFv08168的焦点文库(focused library)
将两种方法用于点突变的选择，以稳定scFv06475和scFv08168：使用分子运行环境(Molecular Operating Environment)(MOE)中同源性建模的序列共有区分析和基于结构的突变设计。
对于序列共有区分析，针对NCBI的非冗余蛋白质序列数据库用scFv06475的VH和VL结构域以及scFv08168的VH和VL结构域的氨基酸序列进行BLAST检索。每一BLAST运行后，通过clustalW程序比对查询序列和前250个同源序列。将内部的计算机程序用于计数比对序列之间每一残基位置处最常见氨基酸。在每一与比对序列库中最常见氨基酸不同的查询序列氨基酸的位置处，设计突变以将该残基从其野生型氨基酸突变成最常见的氨基酸。
在MOE中构建scFv06475的同源性模型和scFv08168的同源性模型。首先将序列读入到MOE的“序列编辑器”模块中。在MOE的“抗体模型(antibody modeler)”中检索具有同源序列的现有X射线结构。分别将通过MOE鉴定的X射线结构3L5X和1W72作为合适的模板，以构建scFv06475和scFv08168的同源性模型。然后通过MOE构建同源性模型，使用CHARMM27力场使能量最小化。
然后将通过MOE产生的模型进行5个阶段的能量最小化和NAMD中的MD模拟。在第一至第三阶段中，将整个模型进行5000个步骤的能量最小化，并将30kcal/mol/A2的限制应用于不同组的原子。在第一个阶段，将限制应用于除CDR中的侧链原子之外的全部原子。在第二个阶段，将限制应用于除CDR中的残基之外的全部原子。在第三个阶段，仅将限制应用于骨架原子。然后在第四阶段中，在50K在真空中模拟模型100皮秒，并将30kcal/mol/A2的限制应用于骨架原子。在最后并且是第五阶段，将模型进行5000个步骤的能量最小化，并将30kcal/mol/A2的限制应用于骨架原子。将进行了五个阶段的最小化和MD模拟后的模型作为用于基于结构突变设计的同源性模型。
基于野生型同源模型构建突变模型。将VMD的“psfgen”模块的“突变”指令用于将残基突变成设计的氨基酸(William Humphrey等人(1996)J.Molecular Graphics，14：33-38)。然后在六个阶段中将突变模型进行能量最小化和模拟。在第一至第四阶段进行5000步的能量最小化。第一阶段中将30kcal/mol/A2的限制应用于除突变的残基的侧链之外的全部原子。第二阶段中将相同强度的限制应用于除突变的残基之外的全部原子。在第三阶段中，去除距突变残基内的残基的侧链原子上的限制。并且在第四阶段，释放距突变残基内的残基的骨架原子上的限制。在应用与第四阶段中的那些限制相同的限制的情况下，将突变模型在50K在真空中模拟100皮秒。然后使用与第四阶段中的那些限制相同的限制，将模拟轨道的最后一次快照再次进行5000步的能量最小化。将这些最小化模型作为突变体的同源性模型。
在大肠杆菌系统中进行基于平板的文库构建、表达和纯化
使用QuikChange XL定点诱变试剂盒(Stratagene)进行高通量诱变。根据引物设计软件Mutaprimer设计引物，并以具有归一化的浓度的96孔形式从IDT订购。将突变链合成反应体积从50μl按比例缩小成25μl。在96孔PCR板中实施反应。循环后，将0.5μl DpnI酶加入到每一扩增反应中，并在37℃孵育2小时，以消化亲本dsDNA。通过在96孔PCR板中，将2μlDpnI消化的诱变反应物加入到20μl Acella化学感受态细胞中进行转化。
从每一转化板中挑选3个单独克隆用于表达和纯化。使用自诱导培养基，在两个96孔深孔平板中进行表达。将等分的细菌培养物保存为甘油原种，并送去测序分析。将合并自每一单独菌落的两个平板的细菌沉淀裂解，并用来自Promega的MagneHis蛋白质纯化系统纯化。装备了KingFisher仪器用于高通量纯化。将1M NaCl加入到裂解和洗涤缓冲液中，以提高蛋白质纯度。用100μl PBS中的300mM咪唑洗脱蛋白质。用Coomasie plus(Thermo)简略检测蛋白质的量，以测定用于差示扫描荧光测定法(Differential ScanningFluorimetry)(DSF)的蛋白质的最佳量。
通过DSF和差示扫描量热法(DSC)筛选热稳定突变
取决于为每一样品纯化的蛋白质的量，通常将10-20μl的洗脱物用于DSF分析。具体而言，在总体积为25μl的PBS中，将10-20μl样品与最终以1:1000稀释的Sypro Orange(Invitrogen)混合。通过BioRad CF×1000运行样品(25℃2分钟，然后以30秒内0.5℃的增量，从25℃至95℃)。将命中定义为Tm高于野生型scFv 2℃以上。通过单点ELISA(one-pointELISA)测定scFv结合活性。
哺乳动物细胞中的蛋白质产生
将突变引入到哺乳动物构建体pRS5a中，所述构建体具有带组氨酸标签的scFv06475或scFv08168。在50ml 293T悬浮细胞中瞬时表达构建体。简言之，为了最佳的转染效率，以1:3将PEI与50μgDNA混合。将1.4e6个/ml的细胞用于转染。被转染的细胞在CO2箱中80rpm摇动下在250ml的滤纸烧瓶中培养6天后被收集。为了最佳的蛋白质回收，将上清液浓缩至约1ml。根据来自制造商的说明，通过MagneHis试剂盒手工纯化蛋白质。在改变缓冲液的情况下，在PBS中过夜透析纯化的蛋白质。将透析之前或之后的蛋白质样品用于DSF分析。
scFvs的亲和性测量
通过ELISA测量scFvs对LRP6蛋白的结合EC50。在4℃，用3μg/ml的LRP6-Fc(R&DSysytems，货号1505-LR)过夜包被Maxisorp板。用50μl的2％BSA封闭平板1小时，并用洗涤溶液洗涤5次。相应地，用1％BSA稀释样品。室温孵育平板1小时，并洗涤3次。通过加入1:2000稀释于1％BSA的50μl pentaHis-HRP(Qiagen Mat.号1014992)，室温孵育1小时并洗涤3次进行检测。加入50μl的底物试剂A加B(R&D systems)，然后根据颜色孵育5-20分钟。通过加入25μl的终止溶液终止反应，然后在450nm处对平板读数。
使用BioRad’s Proteon XPR36生物传感器进行动力学实验。使用作为运行缓冲液的PBST(具有0.05％Tween-20的磷酸缓冲盐水)，在室温进行全部实验。使用新鲜制备的EDC(400mM)和sNHS(100mM)混合物，以30μl/分钟的流速活化GLM芯片上的全部6个垂直通道5分钟。在PH 5.0的10mM乙酸钠中，将抗组氨酸小鼠IgG1(R&D systems，货号：MAB050)稀释成20μg/ml，并以30μl/分钟的流速沿各个垂直通道与芯片偶联5分钟。然后以30μl/min注射1M乙醇胺5分钟，以使未反应的sNHS基团失活。然后以100μl/分钟，将2μg/ml MOR08168scFv野生型或2μg/ml MOR08168D1突变体固定在不同的垂直通道上15秒，之后在水平方向以30μl/分钟注射运行缓冲液两次，每次1分钟。将第六个垂直通道用作通道参照，并且在该通道上没有固定配体。制备300、100、33、11和3.7nM终浓度的360KD同源二聚体抗原LRP6-Fc(R&Dsystems，货号：1505-LR)的稀释系列，并以30μl/分钟沿每一水平通道注射。监测缔合5分钟，并监测解离20分钟。在第六个通道注射缓冲液，以用作用于实时基线漂移校正的行参照。通过在水平方向以100μl/分钟应用0.85％磷酸18s，之后在垂直方向使用相同的运行条件来再生芯片表面。在Proteon上在Proteon Manager v.2.1.1中进行动力学分析。将每一相互作用点数据减去通道参照以及行参照，以校正实时基线漂移。将处理的数据总体拟合到二价分析物模型。
结果
在大肠杆菌中进行的基于平板的诱变、表达和纯化允许从焦点文库中更有效筛选
为了实现高产率，以方便下游分析，测试了前导序列对表达的影响。如图28A中所示，在所测试的7个前导序列中，具有pelB的前导序列产生了最高量的纯化蛋白质。测试了几种细菌菌株，包括BL21(DE3)、XL-1Blue和W3110的用IPTG诱导的表达。如图28B所示，scFv06475的表达水平在BL21(DE3)中比在XL-1Blue中更高，并且比在W3110中稍高。为了便于诱变克隆、转化和表达，将Acella(BL21的衍生物)用于全部随后的实验，因为可以在同一菌株中高效地进行克隆和表达。使用MagneHis试剂盒，通过KingFisher从细胞裂解物中纯化蛋白质。scFv08168的估计的产率为来自深孔培养板中组合的孔的每一样品约10μg，其中将2μg用于DSF热稳定性分析。基于平板的HTP筛选将引物至具有提高的热稳定性的命中的时间显著缩短至大约1周。
通过从焦点文库中单点突变提高scFv的热稳定性
提高热稳定性的命中定义为Tm一直高于野生型至少1℃的提高。在总共51个确认序列的scFv06475变体中有9个命中，并且在总共83个确认序列的scFv08168变体中有15个命中。图28显示了scFv06475的所选择的命中，并且图29显示了scFv08168的所选择的命中。
将两种方法用于选择点突变，以稳定scFv06475和scFv08168：序列共有区分析和基于结构的突变设计。在与scFv06475的VH结构域同源的前250个序列中，VH:34位置通常由甲硫氨酸(45％)或缬氨酸(48％)占据(文中全部编号系统都来自Kabat系统)。在scFv06475的野生型序列中，该位置是甘氨酸残基。在该位置设计两个突变体，VH:G34M和VH:G34V，将野生型氨基酸突变成更通用的氨基酸。如图28中所列，当通过两种不同方案表达和纯化时，VH:G34V突变体一直显示出比野生型scFv06475更高的稳定性。VH:G34M突变体在细菌中表达不好，可能归因于PCR方法中的错误造成的错误序列。
基于相同的序列共有区分析，设计了VH:I34M、VH:G50S、VH:W52aG和VH:H58Y突变，以将scFv08168中的残基突变成它的前250个同源性序列中共有的氨基酸。如在图30中所示，这些突变分别将scFv08168的Tm提高7.5℃、3.0℃、7.0℃和3.5℃。
在基于结构的方法中，首先用MOE构建scFv06475的同源性模型和scFv08168的同源性模型，然后将其用NAMD能量最小化。然后目测检查这些模型，以发现增强局部相互作用的潜在突变。基于蛋白质稳定性的5种生物物理学理解，设计了scFv06475和scFv08168的多个残基上的突变。
第一种方法是增加蛋白质核心中侧链的大小，以改进堆积(packing)。将朝向蛋白质核心的一些具有侧链的疏水残基突变成较大的侧链，以改进这些残基周围的堆积。筛选后，发现通过该方法设计的三个突变提高了scFv08168的稳定性。如在图30中所列，VH:I34F、VL:V47L和VL:G64V突变分别将scFv08168的融解温度提高4.0℃、2.5℃和2.0℃。
第二种方法是将疏水残基突变成芳香族残基，以形成pi-pi垛叠相互作用。在野生型scFv06475同源性模型中，如在图33a中所示，VH:I37残基的侧链与VH:W103和VL:F98的两个芳香族残基紧密邻近。VH:I37的任一非氢侧链原子与VH:W103的任一非氢侧链原子之间的最近距离为3.82A。VH:I37与VL:F98之间的对应距离为如在图33b中所示，当通过VH:I37F突变，将苯丙氨酸残基引入到该局部区域时，形成了两个垂直的pi-pi垛叠相互作用：一个是VH:F37和VH:W103之间的相互作用，并且另一个是VH:F37和VL:F98之间之间的相互作用。在该局部区域中新形成的pi-pi垛叠相互作用必须比原始的疏水相互作用更强，因为通过该突变将scFv6475的融解温度从61℃提高至64.5℃(图28)。通过形成具有VH:W50和VH:F100的pi-pi垛叠相互作用，VH:M95F突变还提高了scFv06475的稳定性(图29)。Tm从61℃提高至64.5℃。
第三种方法是将不带电荷的残基突变成带电荷的残基，以形成盐桥。在同源性模型中，scFv6475的VH:K43残基并不与邻近残基形成盐桥。因为在scFv06475的同源性模型中VH:V85侧链直接朝向VH:K43(图33e)，所以将其突变成负电荷，以形成具有VH:K43的盐桥。如图33f中所述，突变的VH:E85侧链非氢原子与VH:K43侧链非氢原子之间的距离可以短至提示可以在两个残基之间建立盐桥。图29中所列的VH:V85E的突变提高scFv6475的稳定性的确支持了在该位置的设计理论。
第四种方法是将疏水残基突变成极性残基，以建立氢键。如图33c中所示，在scFv08168的同源性模型中，疏水VH:V33残基与极性残基VH:N100a邻近。当通过VH:V33N突变将极性残基插入到该区域时，在VH:N33和VH:N100a之间可以形成额外的氢键。如图33d中所示，同源性建模提示，VH:N33的ND2原子与VH:N100a的一个OD原子之间的距离可以短至所述距离在氢键的范围内。如图29中所示，该VH:V33N突变将scFv08168的稳定性提高了2.0℃。同样地，scFv06475上VL:D93N突变的稳定性增强(参见图29)有助于改进具有VL:Q27和VL:Q90的氢键几何学。
基于在scFv08168的同源性模型中令人惊奇的发现：VL:T78和VH S49的两个极性残基都完全被疏水侧链包围，利用第五种方法将否则疏水环境中的两个极性残基突变成非极性残基。VL:T78和VH:S49的两个极性残基都完全被疏水侧链包围。如图29中所列，VL:T78V和VH:S49A突变分别使scFv08168的融解温度增加了2.5℃和5.5℃。
实施单点ELISA，以评价结合活性。由于降低或者丢失了对LRP6的结合活性，所以去除了某些命中。例如，scFv08168的突变VH W052aG使Tm提高7℃，但与野生型scFv08168比较，所述突变显示出结合活性的极大降低。因此，并没有选择其用于进一步的分析。
如在scFv06475中所观察，洗脱缓冲液中300mM咪唑的存在有时会造成通过DSF测量的Tm的整体漂移。但该作用并不影响Tm的排名。如在图28中所示，对于scFv06475，在大肠杆菌中相比在哺乳动物细胞中产生的蛋白质也存在差异。相反，如在图30和图31中所示，咪唑的存在对scFv8168的Tm具有最小的影响。此外，如在图31中所示，对于scFv08168，产生自大肠杆菌或者产生自哺乳动物的蛋白质的Tm值保持不变。无论是否存在Tm漂移，Tm排名仍保持一致。
为了证实在哺乳动物细胞中产生的蛋白质的热稳定性作用，将这些突变引入到用于哺乳动物表达载体的构建体中，并在293T悬浮细胞中表达。通过MagneHis珠子纯化它们。对于scFv08168，如在图31中所示，检查Tm，并在哺乳动物细胞中表达的蛋白质中确认命中具有提高的热稳定性。对于scFv08168，具有最高热稳定性提高的单点突变为提高7.5℃的VH:I34M。
进一步提高热稳定性的突变的组合
为了进一步提高热稳定性，组合了提高scFv的热稳定性的单突变，以制备scFv08168的双突变体。如图31中所示，大多数双突变体，包括D1都观察到了加性效应，通过组合VH:I34M和VH:S49A两个突变，其显示出了12.5℃的提高，而单突变分别导致Tm分别增加7.5和5.5℃。
表征了结合和功能性活性的热稳定突变体
对scFv08168和scFv06475野生型和变体都进行亲和性分析ELISA EC50。如图32中所示，对于scFv08168，命中主要显示与野生型scFv08168相当的EC50，只有几个突变体似乎比野生型的活性稍高，包括双突变体D1。如图32所示，用Proteon亲和性测量和(如本申请中前述所进行的)基于STF细胞的测定活性(材料和方法，第8部分)进行了证实。通过Octet对scFv08168变体的亲和性排名显示，它们与野生型相当(数据未显示)。在Proteon动力学分析中，D1的KD为2.55nM，而野生型的KD为3.82nM(图32)。
对于scFv06475，如通过ELISA和Proteon动力学分析所测定，存在两种影响活性的突变。具体而言，在ELISA中，与野生型0.76nM的EC50比较，VH:G34V和VH:I37F分别显示出27nM和4.3nM的EC50。在Proteon分析中，VH:G34V和VH:I39F显示出解离率的显著下降(数据未显示)。
双旁原位分子的提高的热稳定性
对于基于IgG的融合分子902和突变形式902T，第一Tm峰从47℃漂移至62℃。该峰对应于scFv08168解折叠。第二峰从72℃漂移至76℃。如图34中所示，该峰对应于Fab06475。
讨论
基于序列分析和同源性建模的合理设计已经产生了scFv的热稳定突变。在本实施例中，对于scFv08168和scFv06475，命中率为约18％。在scFv08168中，通过单点突变VH:I34M，最显著的提高为比野生型Tm增加7.5℃。在序列前景方面，该位置对甲硫氨酸是高度保守的。在结构上，该位置处更大的疏水侧链可以改进该残基周围的堆积。scFv08168变体中的另一点突变VH:S49A使Tm升高了5℃。该突变通过同源建模挑选。尽管该位置对丝氨酸比对丙氨酸更保守，但在结构上，可能丙氨酸更合适，因为该残基周围缺少极性侧链。
为了使用同源性建模进行基于结构的突变设计，使用机制的组合。在scFv06475和scFv08168中，通过5种生物物理学的考虑之一：装填改进、更多的Pi-pi垛叠、更多的氢键、更多的盐桥和去除掩藏的极性基团来发现阳性命中。如在图29和30中所列，通过这种机制的组合，已经鉴定了总共10个稳定的突变。
经鉴定提高热稳定性(“有益的突变”)的突变的组合进一步提高了热稳定性(如果它们定位于不同的区域)。这以scFv08168为实例进行了阐明。当组合有益突变VH:I34M和VH:S49A时，Tm进一步增加至62.5℃，相比野生型的Tm为49℃。这比野生型增加了13.5℃，其中各个突变VH I34M和VH:S49A各自分别增加了Tm 7.5℃和5℃。这是加性效应的明确指标。
I34M与scFv08168的CDR1-H非常接近，但通过许多测定法所证实，突变并没有影响结合亲和性。CDR在整个scFv或完全抗体稳定性中起作用。通过使用公开的方法，改造与CDR区域临近的残基实现显著的改进，只要该突变不会影响结合亲和性和特异性。
大多数稳定化突变定位于VH上。在图29和30中所列的15种稳定化突变中，11种为VH结构域上的突变，而仅4种在VL结构域上。
当整合到IgG或其他形式(例如，血清白蛋白融合物)中时，稳定化的VH和VL导致该分子热稳定性的极大提高。对于IgG融合物，47℃的较低Tm对应于scFv08168的Tm，而72.5℃的更高峰值对应于CH2和Fab06475的Tm。掺入两种突变VH:I34M和VH:S49A将scFv08168的Tm从47℃提高至62℃，而在6475中掺入VH:M95F进一步将Fab的Tm从72.5℃提高至76℃。该提高并不仅显示于scFv自身，还显示于Fab，归因于VH和VL的提高的稳定性。这可以提供用于提高整个抗体稳定性的更一般策略。
合理设计加上在大肠杆菌系统中的HTP筛选提供了非常快的周转时间和高命中率。用来自大肠杆菌的材料测量的Tm与用来自哺乳动物的材料测量Tm相关，或者分级保持相同。这极大地简化了在大肠杆菌中实施为HTP的筛选方法。基于平板的诱变、转化、表达和纯化已经缩短时间至少于1周。使用本文中所公开的方法，可以制备scFv或者其他抗原结合片段中的许多突变，并筛选热稳定性。然后，可以将这些突变的scFv或者抗原结合片段用作更大的抗体构建体，例如双旁原位抗体的组分，以将这样的稳定性赋予较大的抗体构建体。

Claims (23)

1.低密度脂蛋白相关蛋白质6(LRP6)的分离的二价抗体或其二价片段，所述低密度脂蛋白相关蛋白质6(LRP6)的分离的二价抗体或其二价片段在未封闭的LRP6结合蛋白质存在的情况下，通过成簇一种或多种LRP6受体来增强Wnt信号，其中所述二价片段选自F(ab’)2、双-scFv，其中所述分离的二价抗体或其二价片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区CDR1；SEQID NO:2的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:3的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:4的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:5的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:6的轻链可变区CDR3。
2.权利要求1的分离的二价抗体或其二价片段，其中所述抗体或其片段包含序列为SEQID NO:14的重链可变区。
3.权利要求1的分离的二价抗体或其二价片段，其中所述抗体或其片段包含序列为SEQID NO:13的轻链可变区。
4.权利要求1的分离的二价抗体或其二价片段，其中所述抗体或其片段包含序列为SEQID NO:14的重链可变区和序列为SEQ ID NO:13的轻链可变区。
5.权利要求1-4中任一项的分离的二价抗体或其二价片段，其中所述抗体通过与选自螺旋桨1和螺旋桨3的螺旋桨区结合来成簇一种或多种LRP6受体，其中所述二价片段选自F(ab’)2、双-scFv。
6.权利要求5的分离的二价抗体或其二价片段，其中所述LRP6结合蛋白质是选自Wnt1、Wnt 3和Wnt 3a的Wnt结合蛋白质。
7.低密度脂蛋白相关蛋白质6(LRP6)的分离的单价抗体或其单价片段，所述低密度脂蛋白相关蛋白质6(LRP6)的分离的单价抗体或其单价片段在未封闭的LRP6结合蛋白质存在的情况下，通过成簇一种或多种LRP6受体来避免Wnt信号的增强，并且其中所述单价片段选自Fab或scFv，其中所述分离的单价抗体或其单价片段包含SEQ ID NO:1的重链可变区CDR1；SEQ ID NO:2的重链可变区CDR2；SEQ ID NO:3的重链可变区CDR3；SEQ ID NO:4的轻链可变区CDR1；SEQ ID NO:5的轻链可变区CDR2；和SEQ ID NO:6的轻链可变区CDR3。
8.权利要求1或7的低密度脂蛋白相关蛋白质6(LRP6)蛋白质的分离的抗体或其片段，所述低密度脂蛋白相关蛋白质6(LRP6)蛋白质的分离的抗体或其片段具有至少1×107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1、1013M-1的解离(KD)，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的，并且其中所述片段选自Fab、F(ab’)2、双-scFv或scFv。
9.权利要求8的分离的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段通过在溶液平衡滴定测定中与人LRP6体外结合所测量的以0.001nM-1μM的KD抑制经典Wnt通路，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的。
10.权利要求1或7的低密度脂蛋白相关蛋白质6(LRP6)蛋白质的分离的抗体或其片段，所述低密度脂蛋白相关蛋白质6(LRP6)蛋白质的分离的抗体或其片段抑制通过Wnt配体诱导的磷酸化测定评估的LRP6的磷酸化，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的，并且其中所述片段选自Fab、F(ab’)2、双-scFv或scFv。
11.权利要求1或7的低密度脂蛋白相关蛋白质6(LRP6)蛋白质的分离的抗体或其片段，所述低密度脂蛋白相关蛋白质6(LRP6)蛋白质的分离的抗体或其片段通过在溶液平衡滴定测定(SET)中与人LRP6体外结合所测量的以低于或等于300μM的EC50抑制经典Wnt通路，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的，并且其中所述片段选自Fab、F(ab’)2、双-scFv或scFv。
12.权利要求1或7的抗体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
13.权利要求12的抗体，其中所述抗体是嵌合抗体。
14.权利要求12的抗体，其中所述抗体包含人重链恒定区和人轻链恒定区。
15.权利要求12的抗体，其中所述抗体是单链抗体。
16.权利要求12的抗体，其中所述抗体是Fab片段。
17.权利要求12的抗体，所述抗体与人LRP6和食蟹猴LRP6二者结合。
18.权利要求12的抗体，所述抗体是IgG同种型。
19.权利要求12的抗体，其中所述抗体包含这样的框架，其中已经将氨基酸取代成来自各个人VH或VL种系序列的抗体框架。
20.药物组合物，其包含选自权利要求1-19的抗体或其片段和药用载体，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的，并且其中所述片段选自Fab、F(ab’)2、双-scFv或scFv。
21.核酸，其包含编码权利要求1-19的抗体或其片段的核苷酸序列。
22.载体，其包含权利要求21所述的核酸。
23.权利要求1-19任一项的抗体或其片段在生产用于治疗由经典Wnt信号通路介导的癌症的药物中的用途，所述癌症选自乳腺癌、肺癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、急性髓样白血病、慢性髓样白血病、骨肉瘤、鳞状细胞癌和黑素瘤，其中所述抗体或其片段是单价的或者二价的，并且其中所述片段选自Fab、F(ab’)2、双-scFv或scFv。
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