CN109311985A - 抗pd-l1抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明的方面包括分离的抗PD‑L1抗体和包含此类抗体的组合物，以及用其治疗PD‑L1信号转导介导的疾病或病症的方法。

Description

抗PD-L1抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年5月9日提交的美国临时专利申请系列号62/333,643的优先权，其公开通过引用全文纳入本文。
发明领域
本发明涉及分离的抗PD-L1抗体及其制备和应用。
背景技术
程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)是一种属于免疫球蛋白超家族的细胞表面受体，该超家族包括涉及细胞识别、结合和附着过程的细胞表面和可溶性蛋白。该家族最早被发现的成员因其在加入单抗后能增强T细胞增殖的功效而被发现(Hutloff等，(1999)Nature397:263-266；Hansen等，(1980)Immunogenics 10:247-260)。已鉴定了PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体(称为PD-L1和PD-L2)，且已显示这些配体结合PD-1时能下调T细胞活化和细胞因子分泌(Freeman等，(2000)J Exp Med 192:1027-34；Latchman等，(2001)Nat Immunol2:261-8；Carter等，(2002)Eur J Immunol 32:634-43；Ohigashi等，(2005)Clin CancerRes 11:2947-53)。PD-L1和PD-L2均为B7同源物，它们结合PD-1，但不结合其他CD28家族成员(Blank等.(2004)。还显示了PD-L1在细胞表面的表达通过IFN-γ刺激被上调。
已在数种鼠和人类癌症，包括人肺癌、卵巢和结肠癌以及各种骨髓瘤中发现PD-L1表达(Iwai等.(2002)PNAS 99:12293-7；Ohigashi等.(2005)Clin Cancer Res 11:2947-53)。PD-L1还被认为在肿瘤免疫中通过增加抗原特异性T细胞克隆的凋亡起作用(Dong等.(2002)Nat Med 8:793-800)。由此，靶向PD-1和PD-L1之间的相互作用成为治疗干预中尤被感兴趣的领域。需要针对该途径中靶标的治疗组合物，例如抗PD-L1抗体。
发明内容
本发明的方面包括分离的抗PD-L1抗体和包含此类抗体的组合物，以及用其治疗PD-L1信号转导介导的疾病或病症的方法。
在一些实施方式中，分离的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含：(i)与序列GFSLTSYDIS(SEQ ID NO:4)具有至少约99％序列相同性的HVR-H1序列；(ii)与序列VIWTGVGTN(SEQ ID NO:5)具有至少约99％序列相同性的HVR-H2序列；以及(iii)与序列DPYYYGMDY(SEQ ID NO:6)具有至少约99％序列相同性的HVR-H3序列。在一些实施方式中，HVR-H1序列包含序列GFSLTSYDIS(SEQ ID NO:4)；HVR-H2序列包含序列VIWTGVGTN(SEQ ID NO:5)；且HVR-H3序列包含序列DPYYYGMDY(SEQ ID NO:6)。在一些实施方式中，分离的抗PD-L1抗体还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含至少一个选自下组的HVR序列：(i)与序列RASQDISIWLS(SEQ ID NO:1)具有至少约99％序列相同性的HVR-L1序列；(ii)与序列KASNLHT(SEQ ID NO:2)具有至少约99％序列相同性的HVR-L2序列；以及(iii)与序列LQSQSFPRT(SEQ ID NO:3)具有至少约99％序列相同性的HVR-L3序列。在某些实施方式中，轻链可变区包含全部所述的HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含：(i)HVR-L1，其包含序列RASQDISIWLS(SEQ ID NO:1)；(ii)HVR-L2，其包含序列KASNLHT(SEQ ID NO:2)；和(iii)HVR-L3，其包含序列LQSQSFPRT(SEQ ID NO:3)。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段包含：(i)HVR-L1，其包含序列RASQDISIWLS(SEQ ID NO:1)；(ii)HVR-L2，其包含序列KASNLHT(SEQ ID NO:2)；和(iii)HVR-L3，其包含序列LQSQSFPRT(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是单克隆抗体。在一些实施方式中，该抗体是嵌合、人源化或人抗体。在一些实施方式中，重链可变区包含框架序列。在一些实施方式中，框架序列的至少一部分包含人框架序列。在一些实施方式中，框架序列的至少一部分包含人共有框架序列。在一些实施方式中，框架序列包含选自下组的框架区1(FR1)序列：SEQ ID NO：7、8、9、10和11。在一些实施方式中，框架序列包含选自下组的框架区2(FR2)序列：SEQ ID NO:12、13、14、15和16。在一些实施方式中，框架序列包含选自下组的框架区3(FR3)序列：SEQ ID NO:17、18、19、20、21、22、23和24。在一些实施方式中，框架序列包含选自下组的框架区4(FR4)序列：SEQ ID NO:25和26。在一些实施方式中，框架序列包含选自下组的FR1序列：SEQ ID NO：7、8、9、10和11；选自下组的FR2序列：SEQ ID NO:12、13、14、15和16；选自下组的FR3序列：SEQ ID NO:17、18、19、20、21、22、23和24；和选自下组的FR4序列：SEQ ID NO:25和26。
在一些实施方式中，轻链可变区包含框架序列。在一些实施方式中，框架序列的至少一部分包含人框架序列。在一些实施方式中，框架序列的至少一部分包含人共有框架序列。在一些实施方式中，框架序列包含选自下组的框架区1(FR1)序列：SEQ ID NO:27、28和29。在一些实施方式中，框架序列包含选自下组的框架区2(FR2)序列：SEQ ID NO:30和31。在一些实施方式中，框架序列包含选自下组的框架区3(FR3)序列：SEQ ID NO:32和33。在一些实施方式中，框架序列包含选自下组的框架区4(FR4)序列：SEQ ID NO:34和35。在一些实施方式中，框架序列包含选自下组的FR1序列：SEQ ID NO：27、28和29；选自下组的FR2序列：SEQ ID NO:30和31；选自下组的FR3序列：SEQ ID NO:32和33；和选自下组的FR4序列：SEQID NO:34和35。
在一些实施方式中，分离的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含：与SEQ ID NO:45具有至少约90％序列相同性的重链可变域和/或与SEQ ID NO:46具有至少约90％序列相同性的轻链可变域。在一些实施方式中，分离的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含：含SEQID NO:45的重链可变域和/或含SEQ ID NO:46的轻链可变域。
在一些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，该抗体是嵌合、人源化或人抗体。
在一些实施方式中，分离的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含：与SEQ ID NO:36、37、38、39、40、41或42中任一种具有至少约90％序列相同性的重链可变域和/或与SEQID NO:43或44中任一种具有至少约90％序列相同性的轻链可变域。在一些实施方式中，分离的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段包含：含SEQ ID NO:36、37、38、39、40、41或42中任一种的重链可变域和/或含SEQ ID NO:43或44中任一种的轻链可变域。在一些实施方式中，抗体：(i)基本上结合于与包含SEQ ID NO:36、37、38、39、40、41或42中任一种的重链可变域和SEQ ID NO:43或44中任一种的轻链可变域的抗PD-L1抗体相同的表位；或(ii)与包含SEQID NO:36、37、38、39、40、41或42中任一种的重链可变域和SEQ ID NO:43或44中任一种的轻链可变域的抗PD-L1抗体竞争结合相同的表位。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体或其抗原结合片段通过如下过程制备：(a)培养表达抗体的细胞，所述抗体包含SEQ ID NO:36、37、38、39、40、41或42中任一种的重链可变域和SEQ ID NO:43或44中任一种的轻链可变域；和(b)从细胞或培养所述细胞的细胞培养基中分离所述抗体。在一些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，该抗体是嵌合、人源化或人抗体。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是单特异性的。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是双特异性的。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段结合PD-L1蛋白和细胞表面蛋白。在一些实施方式中，所述细胞表面蛋白选自下组：CD20、EGFR、HER2、CTLA-4、TIM3、LAG3、VISTA和TIGIT。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是多特异性的。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段结合PD-L1蛋白和一种或多种细胞表面蛋白。在一些实施方式中，所述细胞表面蛋白选自下组：CD20、EGFR、HER2、CTLA-4、TIM3、LAG3、VISTA和TIGIT。
在一些实施方式中，抗原结合片段选自下组：Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv、scFv和单结构域抗体。在一些实施方式中，抗体包含κ轻链或λ轻链。在一些实施方式中，抗体是IgG、IgM、IgA、IgD或IgE同种型。在一些实施方案中，抗体是IgG同种型，并且抗体是选自下组的亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在一些实施方案中，抗体是IgM同种型。在一些实施方案中，抗体包含J链。在一些实施方案中，抗体是IgA同种型，且其中该抗体是选自下组的亚类：IgA1和IgA2。在一些实施方案中，抗体包含J链。在一些实施方式中，抗体是包含J链的IgG/IgM或IgG/IgA杂交抗体。在一些实施方式中，J链是包含外来结合部分的修饰的J链。在一些实施方式中，外来结合部分选自下组：抗体、抗体的抗原结合片段、抗体-药物偶联物、抗体样分子、抗体样分子的抗原结合片段、可溶性和膜结合蛋白、配体和受体。在一些实施方式中，外来结合部分是抗体的抗原结合片段，且其选自下组：Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv、scFv和单结构域抗体。在一些实施方式中，抗原结合片段是scFv。
在一些实施方式中，外来结合部分影响T细胞信号转导途径。在一些实施方式中，外来结合部分拮抗T细胞抑制性信号转导途径。在一些实施方式中，外来结合部分结合选自下组的细胞表面蛋白：CTLA4、PD-1、TIM3、LAG3、BTLA、VISTA和TIGIT。在一些实施方式中，外来结合部分结合白蛋白或白蛋白的片段。在一些实施方式中，外来结合部分包含白蛋白结合肽。在一些实施方式中，外来结合部分包含白蛋白结合抗体片段。在一些实施方式中，白蛋白结合抗体片段选自下组：Fab、scFv、VHH、scFab和dAb。在一些实施方式中，外来结合部分包含FcRn结合肽。在一些实施方式中，外来结合部分包含FcRn结合抗体片段。在一些实施方式中，FcRn结合抗体片段选自下组：Fab、scFv、VHH、scFab和dAb。在一些实施方式中，外来结合部分包含Fc结构域。
本发明的方面包括IgM、IgA、IgG/IgM或IgG/IgA抗体或抗原结合片段，其包含具有外来结合部分的修饰的J链，其中所述抗体结合细胞表面蛋白，且其中所述外来结合部分包括抗PD-L1抗体或其抗原结合片段(如本文所述)。在一些实施方式中，细胞表面蛋白选自下组：CD20、EGFR、HER2、CTLA-4、PD-1、TIM3、LAG3、BTLA、VISTA和TIGIT。
在一些实施方式中，外来结合部分结合效应细胞。在一些实施方式中，效应细胞选自下组：T细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。在一些实施方式中，效应细胞是T细胞。在一些实施方式中，外来结合部分结合T细胞上的CD3蛋白(例如CD3ε蛋白)。在一些实施方式中，效应细胞是NK细胞。在一些实施方式中，外来结合部分结合NK细胞上选自下组的靶标：CD16、CD64和NKG2D。在一些实施方式中，效应细胞是巨噬细胞。在一些实施方式中，外来结合部分结合巨噬细胞上的CD14。在一些实施方式中，效应细胞是中性粒细胞。在一些实施方式中，外来结合部分结合中性粒细胞上的CD16b或CD177。
在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是PD-L1拮抗剂。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段拮抗PD-L1信号转导途径。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段拮抗PD-L1蛋白和PD-1蛋白之间的相互作用。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段抑制PD-L1蛋白和PD-1蛋白之间的相互作用。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段阻断PD-L1蛋白和PD-1蛋白之间的结合。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段结合PD-L1蛋白，并抑制PD-1蛋白的一种或多种功能。
本发明的方面包括编码本文所述抗体的重链和/或轻链的多核苷酸。本发明的方面包括包含本文所述多核苷酸的载体。本发明的方面包括包含本文所述载体的宿主细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是原核细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是真核细胞。
本发明的方面包括包含本文所述抗PD-L1抗体的试剂盒。
本发明的方面包括生产分离的抗PD-L1抗体的方法，所述方法包括：用包含编码本文所述抗PD-L1抗体的重链和/或轻链的多核苷酸的核酸转染宿主细胞；在适于生产所述抗PD-L1抗体的条件下培养所述宿主细胞；以及，分离所述抗PD-L1抗体。
本发明的方面包括抑制PD-1蛋白一种或多种功能的方法，所述方法包括：使PD-L1蛋白与本文所述的抗体接触。在一些实施方式中，该方法在体外进行。在一些实施方式中，该方法在哺乳动物对象体内进行。
本发明的方面包括抑制表达PD-L1的肿瘤生长的方法，所述方法包括：给予带有肿瘤细胞的对象本文所述的抗体，从而(i)抑制肿瘤细胞的生长或增殖；或(ii)诱导肿瘤细胞死亡。
本发明的方面包括含有本文所述抗体和药学上可接受运载体的药物组合物。
本发明的方面包括治疗癌症对象的方法，所述方法包括：给予所述患者有效量的本文所述的药物组合物。本发明的方面包括本文所述抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。在一些实施方式中，癌症是血液癌症或上皮癌症。在一些实施方式中，血液癌症是白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或骨髓增生异常综合征。在一些实施方式中，白血病是急性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性髓性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。在一些实施方式中，淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方式中，上皮癌症是非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、结直肠癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌或鼻咽癌。在一些实施方式中，乳腺癌是激素受体阴性或三阴性乳腺癌。在一些实施方式中，癌症是黑色素瘤。在一些实施方式中，癌症是成胶质细胞瘤。
在一些实施方式中，药物组合物或药物还包含有效量的第二治疗剂。
本发明的方面包括筛选样品以确定该样品中PD-L1多肽存在的方法，所述方法包括：使样品与本文所述的抗PD-L1抗体接触；确定所述抗PD-L1抗体是否结合样品中的PD-L1多肽，其中该结合的存在指示了所述样品中PD-L1多肽的存在。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体经可检测标记，且确定所述抗PD-L1抗体是否结合PD-L1多肽包括检测可检测标记物。
附图说明
图1是间接ELISA测试的示意图。
图2是用于测定抗人PD-L1抗体的反应性和特异性的流式细胞测试的示意图。
图3，分图A显示了三种杂交瘤上清液以及阳性和阴性对照抗体在间接ELISA中的活性。分图B显示了获自杂交瘤上清液以及阳性和阴性对照的FACS筛选的样品数据。
图4是PD-1/PD-L1阻断测试的示意图，该测试在基于Jurkat的报告细胞系上基于NFAT驱动的荧光素酶表达进行，所述报告细胞系过表达PD-1且在过表达PD-L1抗原的CHO细胞的存在下被抑制。
图5，分图A显示了获自在PD-1/PD-L1阻断测试中筛选的杂交瘤上清液的实例数据。分图B是杂交瘤筛选策略和结果示意图。
图6，分图A显示了来自3C5-2G12轻链的NGS衍生序列的分布柱状图。分图B显示了来自3C5-2G12重链的NGS衍生序列的分布柱状图。并非所有重链均以相同水平表达。
图7是采用抗J链抗体的考马斯染色混合胶(左)和Western印迹的图。这些图显示了完全组装的IgM五聚体的形成以及J链的掺入。
图8显示了获自3C5.2G12IgM、3C5.2G12IgM+J链以及3C5.2G12IgG抗体形式的PD-L1阻断数据。
图9，分图A显示了3C5.2G12与PD-L1的交叉反应性。分图B显示了3C5.2G12缺乏与小鼠PD-L1的交叉反应性。分图C显示了3C5.2G12缺乏与人PD-L2的交叉反应性。
图10显示了获自3C5.2G12IgM和3C5.2G12IgG形式抗体以及IgG h3C5-1、IgGh3C5-2、IgG h3C5-3和IgG h3C5-4抗体的PD-L1阻断数据。
图11显示了荧光标记的抗PD-L1抗体S70IgG(分图A)或荧光标记的抗PD-L1抗体3C5(分图B)与表达人PD-L1的重组CHO细胞的结合，其中所述细胞事先与未标记的S70(闭合方块)或3C5(闭合圆圈)的系列稀释液结合。结果证明了S70能阻断3C5的结合，3C5能阻断S70的结合。
发明详述
综合技术
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，它们均在本领域技术范围内。此类技术在文献中有详细的解释，《分子克隆实验室指南》(“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,第二版(Sambrook等，1989)；《寡核苷酸合成》(“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编，1984)；《单克隆抗体原理及实践》("Monoclonal Antibodies:Principles and Practice"(Goding,学术出版社(Academic Press),第三版，1996)；《抗体工程》(“AntibodyEngineering”(R.E.Kontermann&S.Dubel,2013))；《动物细胞培养》(“Animal CellCulture”(R.I.Freshney编,1987)；《酶学方法》(“Methods in Enzymology”(学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.))；《新编分子生物学实验指南》(“Current Protocols inMolecular Biology”(F.M.Ausubel等编，1987,及其定期更新)；《PCR：聚合酶连锁反应》(“PCR:The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis等编，1994))；《分子克隆实践指导》(“APractical Guide to Molecular Cloning”(Perbal Bernard V.,1988))；《噬菌体展示实验室指南》(“Phage Display:A Laboratory Manual”(Barbas等，2001))。
本领域普通技术人员应认识到许多方法和材料与本文所述的那些类似或等价，它们可用于本发明的实践中。事实上，本发明并未限制所描述的方法和材料。出于理解本发明的目的，定义以下术语。
定义
出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数使用的术语将包括复数，反之亦然。若所列任何定义与通过引用纳入本文的任何文献相悖，则以所列定义为准。
除非另有说明，术语“PD-L1”和“程序化细胞死亡蛋白1配体1”在本文中可互换使用，是指任何脊椎动物来源的任何PD-L1，包括哺乳动物，如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)来源。“人PD-L1”具体包括长度为290个氨基酸的SEQ ID NO:48的PD-L1人多肽(UniProtKB-Q9NZQ7)。
术语“PD-L1”包括“全长”未加工的PD-L1以及在细胞内加工所得的PD-L1任何形式。该术语还包括天然存在的PD-L1变体，例如剪切变体、等位基因变体以及同种型。本文所述的PD-L1多肽可分离自各种来源中的任何一种，例如分离自人组织类型或其他来源，或通过重组或合成方法制备。“天然序列PD-L1多肽”包括具有与天然产生的相应PD-L1多肽相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列PD-L1多肽可从自然分离或可通过重组或合成方式生产。术语“天然序列PD-L1多肽”具体包括天然存在的PD-L1截短或分泌形式(例如胞外结构域序列)、该多肽天然存在的变体形式(例如可变剪切形式)以及天然存在的等位基因变体。在本发明的某些实施方式中，本文所公开的天然序列PD-L1多肽是包括PD-L1全长氨基酸序列的成熟或全长天然序列多肽。术语“PD-L1”具体包括天然人PD-L1多肽，其包括但不限于：带有或不带有氨基酸1-18位的N末端信号肽的SEQ ID NO:48的人PD-L1多肽。
除非另有说明，术语“PD-1”和“程序化细胞死亡蛋白1”在本文中可互换使用，是指任何脊椎动物来源的任何PD-1，包括哺乳动物，如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)来源。“人PD-1”具体包括UniProtKB-Q15116所提供的长度为288个氨基酸的PD-1人多肽。
术语“PD-1”包括“全长”未加工的PD-1以及在细胞内加工所得的PD-1任何形式。该术语还包括天然存在的PD-1变体，例如剪切变体、等位基因变体以及同种型。本文所述的PD-1多肽可分离自各种来源中的任何一种，例如分离自人组织类型或其他来源，或通过重组或合成方法制备。“天然序列PD-1多肽”包括具有与天然产生的相应PD-1多肽相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列PD-1多肽可从自然分离或可通过重组或合成方式生产。术语“天然序列PD-1多肽”具体包括天然存在的PD-1截短或分泌形式(例如胞外结构域序列)、该多肽天然存在的变体形式(例如可变剪切形式)以及天然存在的等位基因变体。在本发明的某些实施方式中，本文所公开的天然序列PD-1多肽是包括PD-1全长氨基酸序列的成熟或全长天然序列多肽。术语“PD-1”具体包括天然人PD-1多肽，包括但不限于：带有或不带有N末端信号肽的UniProtKB-Q15116人PD-1多肽。
“表位”是抗原分子表面上结合单个抗体分子的位置。通常，抗原具有数个或许多不同的表位，并与许多不同的抗体反应。该术语具体包括线性表位和具有构象的表位。
“表位作图”是鉴别抗体在其目标抗原上结合位点或表位的过程。抗体表位可为线性表位或具有构象的表位。线性表位通过蛋白质中的连续序列形成。具有构象的表位则由蛋白质序列中不连续的氨基酸形成，这些不连续氨基酸通过蛋白质折叠为其三维结构而靠近。
如本文所用，“表位分类(epitope binning)”是基于抗体所识别的表位对抗体进行分组的过程。更具体而言，表位分类包括用于辨别不同抗体的表位识别特性的方法和系统，结合基于抗体的表位识别特性的抗体聚类以及识别具有特定结合特异性的抗体的计算过程。
当某种抗体与参比抗体识别相同或空间重叠的表位时，该抗体结合与参比抗体“基本上相同的表位”。确定两种表位是否结合相同或空间重叠表位的最常用且迅速的方法是竞争性测试，其可用标记的抗原或标记的抗体以各种不同形式配置。通常，抗原被固定在96孔板上，采用放射性标记或酶标记来测定未标记抗体阻断标记抗体结合的能力。优选地，该抗体结合与如下抗体所结合基本相同的PD-L1表位：所述抗体包含序列为GFSLTSYDIS的HVR-H1(SEQ ID NO:4)；序列为VIWTGVGTN的HVR-H2(SEQ ID NO:5)；和序列为DPYYYGMDY的HVR-H3(SEQ ID NO:6)。在一个实施方式中，该抗体将包含：与SEQ ID NO:4的序列具有至少约99％序列相同性的HVR-H1序列；与SEQ ID NO:5的序列具有至少约99％序列相同性的HVR-H2序列；与SEQ ID NO:6的序列具有至少约99％序列相同性的HVR-H3序列。全文中，“PD-L1”优选为带有或不带有其N末端信号肽的SEQ ID NO:48的人PD-L1多肽。
如本文所用，氨基酸残基/位置的“修饰”是指氨基酸一级序列与起始氨基酸序列相比的编号，其中该变化由涉及所述氨基酸残基/位置的序列改变所致。例如，典型的修饰包括用另一氨基酸取代该残基(或于所述位置)(例如保守或非保守取代)、在所述残基/位置邻接处插入一个或多个(通常少于5或3个)氨基酸、以及使得所述残基/位置缺失。“氨基酸取代”或其变化形式是指用不同的氨基酸残基替换预先确定的(起始)氨基酸序列中所存在的氨基酸残基。通常且优选地，与包含起始(或“野生型”)氨基酸序列的多肽相比，修饰使得变体多肽的至少一种物理或生物化学活性发生改变。例如，在抗体的情况下，所改变的物理或生物化学活性可为对目标分子的结合亲和力、结合能力和/或结合效力。
术语“抗体”包括单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、单链分子以及抗体片段(例如Fab、F(ab')2和Fv)。术语“免疫球蛋白(Ig)”与本文中的“抗体”可互换使用。基本的4链抗体单位是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成的异四聚体糖蛋白。除非另有说明，术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，并且具体包括抗体的所有同种型、亚类和形式，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE抗体及其片段，优选抗原结合片段。本文优选的抗体包括：IgG、IgM和IgA抗体及其抗原结合片段。在一些实施方式中，可修饰第一同种型(如IgM)的抗体以使其包括来自另一同种型(例如IgG)的序列从而产生杂合抗体，其非限制性的例子包括IgG/IgM和IgG/IgA杂合抗体。
除非另有说明，术语“抗体”具体包括天然人和非人IgG1、IgG2(IgG2a、IgG2b)、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgD和IgM抗体，包括天然存在的变体。因此，例如，人IgM序列可在GenBank登录号X14940.1下获得，而变体已被报道为GenBank CAB37838.1、CAC20458.1、AFM37312.1、X57331.1和J00260.1。
针对多肽(例如，抗体或J链)的术语“天然”在本文中用于指具有天然存在的序列的多肽，而不管其制备方式如何。因此，术语“天然”和“天然序列”在本文中可互换使用，并且明确地涵盖具有在自然界中发现的序列的重组多肽。
本文所用术语“单克隆抗体”指获自基本均一抗体群体的抗体，即除了少数中存在的可能天然发生的突变外，群体包含的单独抗体是相同的。单克隆抗体具有针对某一抗原性位点的高度特异性。而且，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相比，每一单克隆抗体针对抗原的单一决定簇。修饰语“单克隆”指示该抗体获自基本均质的抗体群这一特点，而不应被解释为需要通过任何特定的方法来产生抗体。例如，根据本发明所用的单克隆抗体可通过首先由Kohler等，Nature 256:495(1975)所述的杂交瘤方法，或通过重组DNA方法(参见例如美国专利号4,816,567)制备。也可通过例如Clackson等，Nature 352:624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222:581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。
本文所述单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种的抗体的相应序列相同或同源，而该链或这些链的其余部分与衍生自另一物种的抗体(以及此类抗体的片段)的相应序列相同或同源，只要它们具有所需生物学活性(美国专利号4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851-6855(1984))。
非人(如鼠)抗体的“人源化”形式是包含衍生自非人免疫球蛋白最小序列的抗体。人源化抗体的绝大部分是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者超变区的残基被来自非人物种(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)超变区(供者抗体)但具有所需特异性、亲和性和性能的残基取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基也被相应的非人残基所替换。而且，人源化抗体可包含在受者抗体或供者抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体包含至少一个且通常两个可变结构域的几乎全部，其中全部或基本上全部的超变环对应于非人免疫球蛋白的超变环，全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还任选包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般是人免疫球蛋白的Fc。其他详细内容参见，Jones等(1986)Nature 321:522-525；Riechmann等(1988)Nature 332:323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596。
本文中的“分离的”抗体是已从其重组宿主细胞中的天然环境组成中鉴定并分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染成分是会干扰抗体的诊断或治疗应用的材料，并可以包括酶、激素、和其他蛋白质或非蛋白质的溶质、以及不需要的生产副产物。在一个优选的实施方式中，本文中的分离抗体将被纯化(1)至大于95重量％，或大于98重量％，或大于99重量％，通过SDS-PAGE或SEC-HPLC方法测定，(2)至足以通过使用氨基酸测序仪获得N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至使用考马斯蓝或优选银染在还原性或非还原性条件下通过SDS-PAGE的均一化。通常，分离抗体的制备经历至少一个纯化步骤。
在IgG的情况下，4-链单元通常约为150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两条H链根据H链同种型通过一个或多个二硫键相互连接。各H链和L链也具有规则间隔的链内二硫桥。每条H链在N端具有可变结构域(VH)，随后是α和γ链各自的三个恒定结构域(CH)，以及μ和ε同种型的四个CH结构域。每条L链在N端具有可变结构域(VL)，在其另一端具有恒定结构域。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。据信某些特定氨基酸残基会形成轻链和重链可变域之间的界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。
IgM是形成聚合物的糖蛋白，其中多个免疫球蛋白通过二硫键共价连接在一起。IgM主要以五聚体形式存在，但也以六聚体形式存在，因此含有10或12个抗原结合位点。五聚体形式通常含有称为J链的额外多肽，但也可以在不存在J链的情况下制备。五聚体IgM分子的分子量约为970kDa。由于其多聚性，IgM具有高亲合力，并且在补体激活中特别有效。与IgG不同，IgM单体中的重链由一个可变结构域和四个恒定结构域组成。本文中将IgM恒定结构域称为CM1或Cμ1、CM2或Cμ2、CM3或Cμ3以及CM4或Cμ4，其中“CM”和“Cμ”名称可互换使用。
术语“IgM”在本文中以最广泛的含义使用，具体包括单特异性和多特异性(包括双特异性)IgM分子，例如PCT申请号PCT/US2014/054079(其全部公开内容明确地通过引用并入本文)中公开的多特异性IgM结合分子。
术语“IgM结合单元”或“IgM抗体结合单元”以最广泛的含义使用并且具体涵盖包含至少Cμ4恒定结构域的IgM抗体重链恒定区多肽，该多肽与结合靶标(例如，抗原)的可变结构域序列(VH)融合，其有或没有相关的抗体轻链可变域(VL)序列。
术语“双特异性IgM结合单元”或“双特异性IgM抗体结合单元”以最广泛的含义使用，并具体涵盖一对IgM抗体重链恒定区多肽，其包含至少一个Cμ4恒定结构域，与可变结构域序列(VH)融合，每个可变结构域序列结合不同的靶标，有或没有相关的抗体轻链可变域(VL)序列。在一个实施方式中，双特异性IgM抗体包含两个VHVL抗原结合区，各自能够结合一个抗原上的不同表位或两个不同抗原上的表位。双特异性IgM抗体结合单元可以是来自单个物种的全长，也可以是嵌合或人源化的。本发明的双特异性IgM抗体可具有包含五个或六个双特异性IgM结合单元的五或六聚环结构。
术语“多特异性IgM”在本文中以最广泛的含义用于指具有两种或更多种结合特异性的IgM抗体。因此，术语“多特异性”包括“双特异性”，例如，双特异性抗体或双特异性结合单元，包括IgM五聚体，其包含至少两个单特异性亚基，其中每个亚基与不同抗原(AA，BB)结合，或五或六个双特异性亚基，每个亚基结合两种不同的抗原(AB，AB)。因此，双特异性和多特异性IgM五聚体可以包括五个相同的双特异性结合单元，单特异性IgM结合单元，其中至少两个具有不同的结合特异性，或其任何组合。
“全长IgM抗体重链”是以N端向C端的方向由以下组成的多肽：抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CM1或Cμ1)、抗体重链恒定结构域2(CM2或Cμ2)、抗体重链恒定结构域3(CM3或Cμ3)，和抗体重链恒定结构域4(CM4或Cμ4)。如本文所定义的双特异性全长IgM抗体包含五个或六个单体(结合单元)，每个具有两个抗原结合位点，其特异性结合两个不同的结合靶标(表位)。全长抗体的重链或轻链的C端表示位于重链或轻链的C端的最后一个氨基酸。全长抗体的重链或轻链的N端表示位于重链或轻链的N端的第一个氨基酸。
天然IgA是包含两条相同轻链(κ或λ)和两条相同重链(α)的四聚体蛋白。在人体中，有两种IgA同种型，IgA1和IgA2。与IgG类似，IgA含有三个恒定结构域(CA1-CA3或Cα1-Cα3)，在Cα1和Cα2结构域之间具有铰链区，其中“CA”和“Cα”的名称可互换使用。所有IgA同种型都具有18个氨基酸的“尾片段”，其位于Cα3结构域的C端，这使得多聚Ig形成(参见例如Garcia-Pardo等，1981,J.Biol.Chem.256,11734-11738和Davis等，1988,Eur.J.Immunol.18,1001-1008)。血清IgA是一种单体，但也可以聚合。在其分泌形式中，IgA包含2-5个由J链连接的基本4-链单元，其可以包含尾片段，并且可以由分泌组分缔合。IgA抗体可以进一步分为IgA1和IgA2亚类。本文所用术语“IgA”抗体具体包括所有亚类，即IgA1和IgA2抗体，包括具有和不具有分泌组分的二聚体和多聚体形式，以及此类抗体的片段，优选抗原结合片段。为了本发明的目的，IgA抗体优选是二聚体，其中两个尾片段通过J链连接。
术语“IgA”在本文中以最广泛的含义使用，具体包括单特异性和多特异性IgA分子，例如PCT申请号PCT/US2015/015268(其全部公开内容明确地通过引用并入本文)中公开的多特异性IgA结合分子。
术语“多特异性IgA”在本文中以最广泛的含义用于指具有两种或更多种结合特异性的IgA抗体。因此，术语“多特异性”包括“双特异性”，例如，双特异性抗体或双特异性结合单元，包括如下IgA二聚体，其包含两个单特异性亚基，每个亚基结合不同抗原(AA，BB)，或两个双特异性亚基，每个亚基结合两种不同的抗原(AB，AB)。
在一个实施方式中，二聚体多特异性IgA分子由两个单特异性结合单元组成，每个结合单元对不同的结合靶标(AA，BB)具有结合特异性。在另一个实施方式中，在二聚体IgA分子中，两个结合单元中的至少一个具有两种不同的结合特异性(即，是双特异性的，例如AA，AB或AA，BC)。在另一个实施方式中，两个结合单元中的每一个具有两种特异性，这两种特异性可以是相同的(AB，AB)或不同的(例如，AC，CD或AB，AC)。
术语“双特异性IgA抗体结合单元”以最广泛的含义使用，并具体涵盖一对IgA抗体重链恒定区多肽，其包含至少CA3恒定结构域，与可变结构域序列(VH)融合，每个可变结构域序列结合不同的靶标，有或没有相关的抗体轻链可变结构域(VL)序列。在一个实施方式中，双特异性IgA抗体包含两个VHVL抗原结合区，各自能够结合一个抗原上的不同表位或两个不同抗原上的表位。双特异性IgA抗体结合单元可以是来自单个物种的全长，或可以是嵌合或人源化的。
“全长IgA抗体重链”是以N端向C端的方向由以下组成的多肽：抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CA1或Cα1)、抗体重链恒定结构域2(CA2或Cα2)，和抗体重链恒定结构域3(CA3或Cα3)。根据本发明的双特异性或多特异性全长IgA抗体包含两种单体(结合单元)，每种单体可以是单或双特异性的，有或没有分泌组分。因此，本发明的多特异性IgA抗体可包括单特异性和双特异性结合单元，条件是所得IgA抗体具有至少两种结合特异性。全长抗体的重链或轻链的C端表示位于重链或轻链的C端的最后一个氨基酸。全长抗体的重链或轻链的N端表示位于重链或轻链的N端的第一个氨基酸。
对于不同类别抗体的结构和性质的其他细节，参见例如《基础和临床免疫学》(Basic and Clinical Immunology)，第8版，Daniel P.Stites,Abba I.Terr和TristramG.Parslow(编)，Appleton&Lange出版社,康涅狄克州诺瓦克,1994，第71页和第6章。
如本文所用，术语“界面”用于指包含第一抗体重链恒定区中“接触”氨基酸残基(或其他非氨基酸基团，例如碳水化合物基团)的区域，这些“接触”氨基酸残基与第二抗体重链恒定区中的一个或多个“接触”氨基酸残基(或其他非氨基酸基团)相互作用。
术语“不对称界面”用于指两个抗体链，诸如第一和第二IgM重链恒定区之间形成的和/或IgM重链恒定区和其匹配轻链之间形成的界面(如上文所定义的)，其中第一链和第二链中的接触残基通过设计而不同，包含互补接触残基。可以通过节/孔(knobs/holes)相互作用和/或盐桥偶联(电荷交换)和/或本领域已知的其他技术(例如，通过用于将μ重链偶联到其匹配轻链的CrossMab方法)来产生不对称界面。
“空腔”或“孔”是指从第二多肽的界面凹陷的至少一个氨基酸侧链，并因此容纳第一多肽相邻界面上的相应突起(“节”)。空腔(孔)可以存在于原始界面中或可以合成引入(例如，通过改变编码界面的核酸)。通常，编码第二多肽的界面的核酸被改变以编码空腔。为了实现这一点，编码第二多肽界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸被编码至少一个“输入”氨基酸残基的DNA替代，所述“输入”氨基酸残基具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积。可以理解的是，可以存在超过一个的原始和相应输入残基。被替代原始残基的数量上限是第二多肽界面中残基的总数。用于形成空腔的优选输入残基通常是天然存在的氨基酸残基，并且优选选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)和甘氨酸(G)。最优选的氨基酸残基是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸，最优选丙氨酸。在优选的实施方式中，用于形成突起的原始残基具有大的侧链体积，例如酪氨酸(Y)、精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)或色氨酸(W)。
“原始”氨基酸残基是被“输入”残基取代的氨基酸残基，该输入残基可以具有比原始残基更小或更大的侧链体积。输入氨基酸残基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸残基，但优选前者。
“非天然存在的”氨基酸残基是指不由遗传密码编码但能够共价结合多肽链中相邻氨基酸残基的残基。非天然存在的氨基酸残基的示例是正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，例如Ellman等，Meth.Enzym.202:301-336(1991)中描述的那些。为了产生这种非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等，Science 244:182(1989)和Ellman等，同上的方法。简言之，这涉及化学活化具有非天然存在的氨基酸残基的抑制子tRNA，然后进行RNA的体外转录和翻译。在某些实施方式中，本发明的方法涉及替换IgM重链中的至少一个原始氨基酸残基，且可以替换超过一个原始残基。通常，不超过第一或第二多肽界面中的总残基将包含被替换的原始氨基酸残基。替换的优选原始残基是“被埋藏的”。“埋藏”是指残基基本上不能与溶剂接触。优选的输入残基不是半胱氨酸以防止可能的二硫键错配或氧化。
突起在空腔中是“可定位的”，这意味着分别在第一多肽和第二多肽的界面上的突起和空腔的空间位置以及突起和空腔的尺寸使得突起可以位于空腔中而不显著干扰界面处第一和第二多肽的正常缔合。由于诸如Tyr、Phe和Trp之类的突起通常不从界面的轴线垂直延伸并具有优选的构象，所以突起与对应空腔的对准依赖于基于三维结构对突起/空腔对进行建模，如通过X射线晶体学或核磁共振(NMR)所获得。这可以使用本领域中广泛接受的技术来实现，包括分子建模技术。
“原始核酸”是指编码感兴趣多肽的核酸，其可以被“改变”(即，基因工程改造或突变)以编码突起或空腔。原始核酸或起始核酸可以是天然存在的核酸，或者可以包含经历先前改变的核酸(例如，人源化抗体片段)。“改变”核酸是指原始核酸通过插入、缺失或取代至少一个编码感兴趣氨基酸残基的密码子而突变。通常，编码原始残基的密码子被编码输入残基的密码子取代。例如，已经在《诱变：实践方法》(Mutagenesis:a PracticalApproach),M.J.McPherson编，(英国牛津的IRL出版社)(1991)中综述了以这种方式遗传修饰DNA的技术，包括定点诱变、盒式诱变和聚合酶链式反应(PCR)诱变。
可以通过合成手段将突起或空腔“引入”第一或第二多肽的界面，例如通过重组技术、体外肽合成、用于引入先前描述的非天然存在的氨基酸残基的那些技术、通过肽的酶促或化学偶联或这些技术的一些组合。因此，“引入”的突起或空腔是“非天然存在的”或“非天然的”，这意味着它不存在于自然界或原始多肽中(例如，人源化单克隆抗体)。
优选用于形成突起的输入氨基酸残基具有较少数量的“旋转异构体”(例如约3-6)。“旋转异构体”是氨基酸侧链的能量有利构象。在Ponders和Richards，J.Mol.Biol.193:775-791(1987)中综述了各种氨基酸残基的旋转异构体数量。
本文所述术语“天然序列的J链”或“天然J链”指各种动物物种IgM或IgA抗体天然序列的J链，包括成熟人J链，其氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示。
本文所述术语“修饰的J链”指天然序列J链多肽的变体，其含被引入天然序列的外来结合部分。该引入可以通过各种方式实现，包括外来结合部分的直接或间接融合或通过化学接头的附连。术语“修饰的人J链”具体包括但不限于通过引入结合部分修饰的SEQ IDNO：47氨基酸序列的天然序列人J链。该术语具体包括但不限于SEQ ID NO：47氨基酸序列的天然序列人J链，其通过引入不干扰IgM或IgA的有效聚合(二聚化)以及这些聚合体(二聚体)与靶标结合的外来结合部分来修饰。
本文所用术语“结合部分”以最广泛的含义包括能够特异性结合靶标，如抗原的任何化学实体。结合部分的示例包括但不限于抗体、抗体的抗原结合片段、抗体-药物偶联物、抗体样分子、抗体样分子的抗原结合片段、配体和受体。优选的结合部分是多肽(包括肽)，优选具有生物功能。生物功能的示例是结合部分结合并活化或阻断信号转导途径的能力。
术语“多肽”在本文中以最广泛的含义使用，并且包括肽序列。术语“肽”通常描述含有由肽键共价连接的多达约60个，优选多达约30个氨基酸的氨基酸线性分子链。
针对“结合部分”的术语“外来”在本文中用于指在参比天然多肽序列中相同位置处并不存在于的结合部分。因此，外来多肽序列(包括肽序列)可以包含在相应的天然序列内但在不同的位置。在一个优选的实施方式中，“外来”序列不存在于相应天然序列中的任何位置。
术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”是指结合部分与结合靶标的结合，如抗体与靶抗原(例如特定多肽、肽或其他靶标(例如，糖蛋白靶标)上的表位)的结合，且表示不同于非特异性相互作用(例如，非特异性相互作用可为与牛血清白蛋白或酪蛋白的结合)的可测量的结合。例如，可以通过测定与结合至对照分子的结合相比的结合部分或抗体或通过引入结合部分修饰的抗体与靶分子的结合来测量特异性结合。例如，可通过与靶标相似的对照分子(例如过量的未标记的靶标)的竞争来确定特异性结合。在这种情况下，如果标记靶标与探针的结合被过量的未标记靶标竞争性抑制，则表明特异性结合。本文使用的术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位可以通过以下方式展示，例如具有针对靶标至少约200nM，或者至少约150nM，或者至少约100nM，或者至少约60nM，或者至少约50nM，或者至少约40nM，或者至少约30nM，或者至少约20nM，或者至少约10nM，或者至少约8nM，或者至少约6nM，或者至少约4nM，或者至少约2nM，或者至少约1nM或更大的Kd的分子。在某些情况下，术语“特异性结合”是指分子结合特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合的情况下的结合。
“结合亲和性”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，如本文所用，“结合亲和性”是指反映结合对成员(例如抗体和抗原)之间1:1相互作用的内在结合亲和性。分子X对其伴侣Y的亲和性通常可以由解离常数(Kd)表示。例如，Kd可以是约200nM，150nM，100nM，60nM，50nM，40nM，30nM，20nM，10nM，8nM，6nM，4nM，2nM，1nM，或更强。亲和性可以通过本领域已知的常用方法来测量，包括本文所述的那些方法。低亲和性抗体通常缓慢结合抗原并倾向于容易地解离，而高亲和性抗体通常更快地结合抗原并倾向于保持更长的结合。测量结合亲和性的多种方法在本领域中是已知的。
如本文所用，“Kd”或“Kd值”是指通过适用于抗体和靶标对的技术测量的解离常数，例如使用表面等离子共振测定法，例如，使用BIAcoreTM-2000或BIAcoreTM-3000(新泽西州皮斯卡特维的BIAcore公司(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.))在25℃下用约10个响应单位(RU)的固定化抗原CM5芯片进行。
术语“偶联物”、“偶联的”和“偶联”是指任何和所有形式的共价或非共价连接，并且包括但不限于直接的遗传或化学融合、通过接头或交联剂的偶联和非共价缔合。
术语“融合”在本文中用于指一条多肽链中不同来源氨基酸序列通过其编码核苷酸序列的框内组合的组合。术语“融合”明确地包括内部融合，即，除了融合到其一个末端之外，在多肽链内插入不同来源的序列。术语“融合”在本文中用于指不同来源的氨基酸序列的组合。
如本文所用，术语“价”表示抗体中存在特定数目的结合位点。如此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。因此，如果在根据本发明的双特异性IgA抗体中每个结合单位是二价的，则双特异性IgA抗体将具有4价。
术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何分子决定簇。在某些实施方式中，表位决定簇包括有化学活性的成组表面分子(例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基基团)，而在某些实施方式中，表位决定簇可具有特定的三维结构特点和/或特定的电荷特点。表位是由抗体结合的抗原的区域。“结合区”是由结合分子结合的结合靶标上的区域。
“多表位特异性”是指特异性结合相同或不同靶标上的两个或更多个不同表位的能力。“单特异性”指与唯一一种表位结合的能力。在一些实施方式中，抗体以至少10-7M或10-8M或更好的亲和性与各表位结合。
术语“靶标”或“结合靶标”以最广泛的含义使用，并且具体包括多肽，但不限于，核酸、碳水化合物、脂质、细胞和其它具有或不具有它们在自然界中存在的生物功能的分子。
术语“抗原”是指可以结合抗体或引发细胞免疫应答的实体或其片段。免疫原是指可以在有机体，特别是动物，更特别是包括人在内的哺乳动物中引发免疫应答的抗原。术语抗原包括如上所定义的已知为抗原决定簇或表位的区域。
如本文所用，术语“免疫原性”是指引发抗体产生和/或激活针对免疫原抗原的T细胞和/或其他反应性免疫细胞的物质。
本发明抗体的“抗原结合位点”或“抗原结合区”通常含有六个超变区(HVR)，它们对于结合位点对抗原的亲和性具有不同程度的贡献。术语“互补决定区”或“CDR”可与术语“超变区”或“HVR”互换使用。重链可变结构域HVR有三种(HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3)，轻链可变结构域HVR也有三种(HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3)。通过与氨基酸序列的编译数据库比较来确定HVR和框架区(FR)的程度，其中根据来自抗体/抗原复合物的序列/结构信息间的差异确定了这些区域。在本发明的范围内还包括由较少的HVR组成的功能性抗原结合位点(即，其中结合特异性由三个、四个或五个HVR确定)。少于一组完整的6个HVR可能足以结合一些结合靶标。因此，在一些情况下，单独的VH或VL结构域的HVR将是足够的。此外，某些抗体可能具有针对抗原的非HVR相关结合位点。这种结合位点具体包括在本定义中。
本申请中使用的术语“宿主细胞”表示可被工程改造以产生根据本发明的抗体的任何种类的细胞系统。在一个实施方式中，将中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用作宿主细胞。
本文所用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这样的名称包括子代。因此，词语“转化体”和“转化细胞”包括原代对象细胞和由其衍生的培养物，而不考虑传代的数量。还应理解，由于有意或偶然的突变，所有的后代的DNA内容可能不是精确相同的。包括功能或生物活性与在原始转化细胞中筛选的功能或生物活性相同的变体子代。
当将核酸置于与另一核酸序列的功能性关系中时，其是“可操作地连接”的。例如，如果前体序列或分泌前导体的DNA表达为参与多肽分泌的前体蛋白质，则其与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则该核酸体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情况下是连续的并且在阅读框中。但是，增强子不必是连续的。通过在方便的限制性位点进行连接来完成相连。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
术语“抗PD-L1抗体”、“PD-L1抗体”或“结合PD-L1的抗体”均是指能够以足够的亲和力结合PD-L1的抗体，由此该抗体可用作靶向PD-L1的诊断和/或治疗剂。在某些实施方式中，抗PD-L1抗体结合至在不同物种的PD-L1之间保守的PD-L1表位。
在一个实施方式中，“PD-L1抗体”在本文中用于具体指如下的抗PD-L1抗体：(i)包含如SEQ ID NO:36-42或45中任一项所述的重链可变域序列，和/或如SEQ ID NO:43、44或46中任一项所述的轻链可变域序列；或(ii)包含SEQ ID NO:1-6中所给出的HVR中的一种、两种、三种、四种、五种或六种。
“可变”是指可变区的某些区段在序列上在抗体间广泛变化的事实。“可变”或“V”结构域介导抗原结合并限定了具体抗体对其具体抗原的特异性。然而，可变性在可变结构域的110个氨基酸跨度中并不是均匀分布的。相反，V区由称为框架区(FR)的相对稳定的15-30个氨基酸的延伸部分和分布在框架区之间称为“超变区”的各自长9-12个氨基酸的可变短区域组成。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，主要采取β-片层构型，通过三个超变区连接，形成环连接β-片层结构，在一些情况下形成β-片层结构的一部分。各链中的超变区被FR聚集在一起，紧密相邻，与另一条链的超变区一起形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等，《免疫学感兴趣的蛋白质序列》(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，第5版，公共卫生服务，国立卫生研究院(National Institutes of Health)，美国马里兰州贝塞斯达(Bethesda,MD)(1991))。
“完整”抗体是指包含抗原结合位点以及轻链恒定域(CL)和至少具体抗体类型的重链恒定域。例如，完整IgG抗体包含抗原结合位点、轻链恒定域CL和至少重链恒定域CH1(Cγ1)、CH2(Cγ2)和CH3(Cγ3)。完整IgM抗体包含抗原结合位点、轻链恒定域CL和至少重链恒定域CM1(Cμ1)、CM2(Cμ2)、CM3(Cμ3)和CM4(Cμ4)。完整IgA抗体包含抗原结合位点、轻链恒定域CL和至少重链恒定域CA1(Cα1)、CA2(Cα2)和CA3(Cα3)。完整IgD抗体包含抗原结合位点、轻链恒定域CL和至少重链恒定域CD1(Cδ1)、CD2(Cδ2)和CD3(Cδ3)。完整IgE抗体包含抗原结合位点、轻链恒定域CL和至少重链恒定域CE1(Cε1)、CE2(Cε2)、CE3(Cε3)和CE4(Cε4)。恒定区可以是天然序列恒定域(例如，人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。完整抗体优选具有一个或多个效应子功能。
“抗体片段”包含完整抗体的部分，优选完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的非限制性示例包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双抗体；线形抗体(Zapata等(1995)Protein Eng.8(10):1057-1062)；单链抗体分子；形成自抗体片段的多特异性抗体。在一个实施方式中，抗体片段包括完整抗体的抗原结合位点，从而保持结合抗原的能力。本领域普通技术人员将理解抗体片段可由任何完整抗体产生，例如由IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，通过从抗体所余轻链和重链分离其至少抗原结合部分以产生抗原结合片段。在某些实施方式中，抗体片段可包含抗体的抗原结合区以及抗体轻链和/或重链的一个或多个额外结构域。例如，在一些实施方式中，抗体片段可包含抗原结合区，该抗原结合区可包含VH和VL结构域，轻链恒定域CL，以及一个或多个重链恒定区，例如CH1(Cγ1)结构域、CM1(Cμ1)结构域、CA1(Cα1)结构域、CD1(Cδ1)结构域或CE1(Cε1)结构域。
在IgG抗体片段的情况下，木瓜蛋白酶消化产生称为“Fab”片段的两段相同抗原结合片段，以及残余的“Fc”片段，该命名反映了其易于结晶的能力。Fab片段由完整L链与H链的可变区结构域(CH)以及一条重链的第一恒定结构域(CH1)组成。各Fab片段相对于抗原结合而言是单价的，即其具有单个抗原结合位点。用胃蛋白酶处理IgG抗体获得单个大F(ab')2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性且仍然能交联抗原的由两个二硫连接的Fab片段。Fab'片段与Fab片段的区别在于CH1结构域羧基末端处添加有数个额外残基，包括抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文对Fab'的命名，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离巯基。F(ab')2抗体片段最初生成为中间有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
IgG抗体的Fc片段包括通过二硫键聚拢的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应子功能通过Fc区中的序列确定，该区域也是在某些类型细胞上发现的Fc受体(FcF)识别的部分。
“Fv”是含有完整抗原识别与结合位点的最小抗体片段。该片段由一个重链可变域和一个轻链可变域以紧密非共价结合的二聚体组成。在单链Fv(scFv)物质中，一个重链和一个轻链可变域可通过柔性肽接头共价连接，从而轻链和重链可以类似于双链Fv物质中所见的"二聚"结构相联。由这两个结构域的折叠发散出6个超变环(从H和L链各发散出3个环)，它们提供了用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体抗原结合特异性。但是，即使单个可变结构域(或仅含3个抗原特异性HVR的半个Fv)仍具有识别并结合抗原的能力，尽管亲和性通常低于完整的结合位点。
“单链Fv”也可缩写为“sFv”或“scFv”，其为包含连接入单个多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。sFv多肽优选还包含位于VH和VL结构域之间的多肽接头，这使sFv形成抗原结合所需的结构。有关sFv的综述参见Pluckthun，《单克隆抗体药理学》(ThePharmacology of Monoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore编，纽约施普林格出版社(Springer-Verlag,New York)，第269-315页(1994)；Borrebaeck 1995，见下文。
如本文所用的术语“拮抗剂”是指与其不存在时的相同功能或活性相比，引起功能或活性降低的分子。因此，信号转导途径的“拮抗剂”是其存在引起信号转导途径的功能或活性降低的分子。如本文所用的术语“拮抗”是指引起功能或活性的降低。“阻断”抗体或“拮抗剂”或“拮抗性”抗体是抑制或降低其所结合抗原的生物活性的抗体。优选的阻断抗体或拮抗抗体能够基本上或完全抑制抗原的生物活性。
“结合”于感兴趣抗原(例如PD-L1表位抗原靶标)的抗体是以足够的亲和力结合该抗原从而使得该抗体可用作靶向表达该抗原的细胞或组织的治疗剂、且不与其他蛋白质发生明显交叉反应的抗体。就抗体与靶分子的结合而言，术语“特异性结合”或“特异性结合于”或“特异于”具体多肽或具体多肽靶标上的表位是指相对于非特异性相互作用而言具有可检测到的区别的结合。例如，特异性结合可通过测定某分子的结合并与对照分子的结合进行比较来测量，对照分子通常是结构上相似但没有结合活性的分子。例如，可通过与靶标相似的对照分子(例如过量的未标记的靶标)的竞争来确定特异性结合。在这种情况下，如果标记靶标与探针的结合被过量的未标记靶标竞争性抑制，则表明特异性结合。在某些情况下，术语“特异性结合”是指分子结合特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合的情况下的结合。
“抑制表达PD-L1表位的肿瘤细胞生长”的抗体或“生长抑制”抗体是指使得表达或过表达PD-L1表位的癌细胞发生可测的生长抑制的抗体。PD-L1表位可为癌细胞表面上表达的跨膜多肽，或可为由癌细胞产生或分泌的多肽。与适当的对照相比，优选的生长抑制性抗PD-L1抗体对表达PD-L1的肿瘤细胞生长的抑制大于20％，优选大约20％至约50％，更优选大于50％(例如从约50％至约100％)，所述对照通常为未被所测试抗体处理的肿瘤细胞。
“抑制表达PD-L1表位的肿瘤细胞生长”的抗体还可(i)抑制其所结合细胞的生长或增殖；(ii)诱导其所结合细胞的死亡；或(iii)抑制其所结合细胞的转移。
如本文所用的术语“激动剂”是指与该分子不存在时的相同功能或活性相比，引起功能或活性提高的分子。因此，信号转导途径的“激动剂”是其存在引起信号转导途径的功能或活性提高的分子。如本文所用的术语“激动”是指引起功能或活性的提高。
如本文所用的术语“T细胞抑制性信号转导途径”是指导致T细胞免疫应答的定性或定量降低、阻断或停止的T细胞信号转导途径。
如本文所用的术语“T细胞刺激性信号转导途径”是指导致T细胞免疫应答定性或定量提高或维持的T细胞信号转导途径。
术语“癌症”和“癌的”是指或描述典型特征为细胞生长失控的哺乳动物生理病症。“肿瘤”包含一种或多种癌细胞。癌症的示例包括但不限于：癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症更具体的例子包括：鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、皮肤癌、黑素瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌(“NSCLC”)、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌(例如胰腺导管腺癌)、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌(例如、高级别浆液性卵巢癌)、肝癌(例如肝细胞癌(HCC))、膀胱癌(例如尿路上皮膀胱癌)、睾丸(生殖细胞肿瘤)癌、肝癌、乳腺癌、脑癌(例如星形细胞瘤)、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌或肾脏癌(如肾细胞癌、肾母细胞瘤或Wilms肿瘤)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、以及头颈癌。癌症的其他例子包括但不限于：视网膜母细胞瘤、卵泡膜细胞瘤(thecomas)、男性细胞瘤(arrhenoblastomas)、肝癌、血液系统恶性肿瘤(包括非霍奇金淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤和急性血液系统恶性肿瘤)、子宫内膜癌或子宫癌、子宫内膜异位症、纤维肉瘤、绒毛膜癌、唾液腺癌、外阴癌、甲状腺癌、食道癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、鼻咽癌、喉癌、卡波西肉瘤、黑色素瘤、皮肤癌、神经鞘瘤(Schwannoma)、少突神经胶质瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、成骨肉瘤、平滑肌肉瘤和泌尿道癌。
术语“转移性癌症”是指癌症的某种状态，在该状态中来源组织的癌细胞通过血管或淋巴管从原始部位传递到身体中的一个或多个其他部位，以在来源组织以外的一个或多个器官中形成一个或多个继发性肿瘤。一个较为突出的例子是转移性乳腺癌。
如本文所用，“PD-L1相关癌症”是与PD-L1基因或基因产物表达或过表达相关的癌症，其可为具有如下细胞特征的任何癌症：相对于适当的对照细胞而言，表达正常或提高水平的一种或多种PD-L1基因产物的细胞。适当的对照细胞可为来自未受PD-L1表达或过表达癌症影响的个体，或可为来自有需要的对象的非癌细胞，或可为受PD-L1表达或过表达癌症影响的其他个体的非癌细胞。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”是指与一定程度的异常细胞增殖相关的病症。在一个实施方式中，细胞增殖性病症是癌症。
本文所用“肿瘤”是指所有的成瘤性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有的癌前和癌细胞和组织。
本文所用的术语“预测性”和“预后性”也可互换，意为预测或预后的方法允许实施该方法的人选择被认为更可能对抗癌剂(包括抗PD-L1抗体)的治疗有反应的患者(通常在治疗之前，但非必须)。
如本文所用，术语“治疗”、“处理”或“医治”是指治疗性处理和预防性措施的预防，其中对象被防止或延缓(缓解)目标病理状况或病症。需要治疗的对象包括已患有具体症状或病症的对象，以及易于罹患所述症状或病症的对象，对于这些对象需要进行病症预防。
抗PD-L1组合物
本发明的方面包括抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，具体包括但不限于：IgM、IgG和IgA抗体。在一个方面，本发明提供了如本文所述的结合，优选特异性结合PD-L1多肽的抗体。在一些实施方式中，抗体为单克隆抗体或其抗原结合片段，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、双抗体和单结构域抗体。在一些实施方式中，抗体为嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体或竞争性抑制抗PD-L1抗体与其相应抗原性表位结合的抗体。本发明的抗体可任选地在CHO细胞或细菌细胞中生产，且能够抑制PD-L1蛋白和其所结合的受体或配体之间的相互作用。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体能够诱导其所结合的细胞死亡。出于检测目的，本发明的抗体可被可检测标记、连接于固体支持物等。
在一个方面中，提供了抗PD-L1抗体，其中所述抗体具有一种或多种如下活性：(i)抑制PD-L1蛋白与PD-L1蛋白能够结合的受体或配体(例如PD-1蛋白)之间的相互作用；(ii)抑制体内肿瘤转移；(iii)抑制体内肿瘤生长；(iv)减小体内肿瘤尺寸；(v)在体内对表达PD-L1的肿瘤细胞展示细胞毒性活性；或(vi)在体内对表达PD-L1的肿瘤细胞展示细胞生长抑制活性。在一个方面中，抗PD-L1抗体是拮抗性抗体，其抑制PD-L1和PD-1之间的相互作用。在某些方面中，抗PD-L1抗体能够结合PD-L1蛋白，从而抑制PD-1蛋白的一种或多种功能(例如一种或多种免疫抑制功能)。
在一个方面中，提供了结合PD-L1的抗体，其中该抗体包含与SEQ ID NO:4、5和6中所提供序列具有至少约99％序列相同性的一条或多条重链HVR序列。在一些实施方式中，抗体包含SEQ ID NO:4、5和6所提供序列中全部3条重链HVR序列。在一些实施方式中，抗体还包含与SEQ ID NO:1、2和3中所提供序列具有至少约99％序列相同性的一条或多条轻链HVR序列。在一些实施方式中，抗体包含SEQ ID NO:1、2和3所提供序列中全部3条轻链HVR序列。在一些实施方式中，抗体包含：含有SEQ ID NO:4、5和6所提供序列中全部3条重链HVR序列的重链可变域；且包含：含有SEQ ID NO:1、2和3所提供序列中全部3条轻链HVR序列的轻链可变域。
本发明的方面包括重链和轻链序列中包含框架序列的抗PD-L1抗体。根据本发明实施方式中的框架序列包括例如：人蛋白质和DNA种系序列，以及衍生自任何数量人蛋白质和/或DNA种系序列的共有框架序列。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体轻链序列包含人框架序列或人共有框架序列。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体重链序列包含人框架序列或人共有框架序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链框架区1(FR1)序列，该序列与SEQ IDNO:7-11中任一所提供的重链FR1序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在某些实施方式中，抗体包含SEQ ID NO:7-11中任一所提供的重链FR1序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链框架区2(FR2)序列，该序列与SEQ IDNO:12-16中任一所提供的重链FR1序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在某些实施方式中，抗体包含SEQ ID NO:12-16中任一所提供的重链FR2序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链框架区3(FR3)序列，该序列与SEQ IDNO:17-24中任一所提供的重链FR3序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在某些实施方式中，抗体包含SEQ ID NO:17-24中任一所提供的重链FR3序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链框架区4(FR4)序列，该序列与SEQ IDNO:25-26中任一所提供的重链FR4序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在某些实施方式中，抗体包含SEQ ID NO:25-26中任一所提供的重链FR4序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含轻链框架区1(FR1)序列，该序列与SEQ IDNO:27-29中任一所提供的轻链FR1序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在某些实施方式中，抗体包含SEQ ID NO:27-29中任一所提供的轻链FR1序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含轻链框架区2(FR2)序列，该序列与SEQ IDNO:30-31中任一所提供的轻链FR2序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在某些实施方式中，抗体包含SEQ ID NO:30-31中任一所提供的轻链FR2序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含轻链框架区3(FR3)序列，该序列与SEQ IDNO:32-33中任一所提供的轻链FR3序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在某些实施方式中，抗体包含SEQ ID NO:32-33中任一所提供的轻链FR3序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含轻链框架区4(FR4)序列，该序列与SEQ IDNO:34-35中任一所提供的轻链FR4序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在某些实施方式中，抗体包含SEQ ID NO:34-35中任一所提供的轻链FR4序列。
在一个方面中，提供了结合PD-L1的抗体，其中该抗体包含的重链可变域序列与SEQ ID NO:36-42或45中任一所提供的重链可变域序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在一些实施方式中，抗体包含SEQ ID NO:36-42或45中任一所提供的重链可变域序列。
在一些实施方式中，抗体包含轻链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:43、44或46所提供的任一轻链可变域序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在一些实施方式中，抗体包含SEQ ID NO:43、44或46中任一所提供的重链可变域序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:45所提供的重链可变域序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同；且包含轻链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:46所提供的轻链可变域序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:45所提供的重链可变域序列以及SEQ ID NO:46所提供的轻链可变域序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:36所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同；且包含轻链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:43所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:36所提供的重链可变域序列，且包含SEQ ID NO:43所提供的轻链可变域序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:37所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同；且包含轻链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:43所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:37所提供的重链可变域序列，且包含SEQ ID NO:43所提供的轻链可变域序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:38所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同；且包含轻链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:43所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:38所提供的重链可变域序列，且包含SEQ ID NO:43所提供的轻链可变域序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:39所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同；且包含轻链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:43所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:39所提供的重链可变域序列，且包含SEQ ID NO:43所提供的轻链可变域序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:36所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同；且包含轻链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:44所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:36所提供的重链可变域序列，且包含SEQ ID NO:44所提供的轻链可变域序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:37所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同；且包含轻链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:44所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:37所提供的重链可变域序列，且包含SEQ ID NO:44所提供的轻链可变域序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:38所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同；且包含轻链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:44所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:38所提供的重链可变域序列，且包含SEQ ID NO:44所提供的轻链可变域序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:39所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同；且包含轻链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:44所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:39所提供的重链可变域序列，且包含SEQ ID NO:44所提供的轻链可变域序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:40所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同；且包含轻链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:43所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:40所提供的重链可变域序列，且包含SEQ ID NO:43所提供的轻链可变域序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:41所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同；且包含轻链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:43所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。.在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:41所提供的重链可变域序列，且包含SEQ ID NO:43所提供的轻链可变域序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:42所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同；且包含轻链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:43所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:42所提供的重链可变域序列，且包含SEQ ID NO:43所提供的轻链可变域序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:40所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同；且包含轻链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:44所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:40所提供的重链可变域序列，且包含SEQ ID NO:44所提供的轻链可变域序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:41所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同；且包含轻链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:44所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:41所提供的重链可变域序列，且包含SEQ ID NO:44所提供的轻链可变域序列。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含重链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:42所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同；且包含轻链可变域序列，该序列与SEQ ID NO:44所提供的序列至少约80％相同，如约85％、约90％、约95％或约99％相同。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:42所提供的重链可变域序列，且包含SEQ ID NO:44所提供的轻链可变域序列。
在一些实施方式中，包含本文中所述任何序列或任何序列组合的抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，抗PD-L1抗体是嵌合、人源化或人抗体。
在一些实施方式中，抗体包含人VH亚组III(VH3)重链框架共有序列。在一些实施方式中，抗体包含人VH亚组II(VH2)重链框架共有序列。在一些实施方式中，抗体包含人VH亚组I(VH1)重链框架共有序列。VH3重链FR1序列的实例提供于SEQ ID NO:10和11。VH3重链FR2序列的实例提供于SEQ ID NO:15和16。VH3重链FR3序列的实例提供于SEQ ID NO:22、23和24。
在一些实施方式中，抗体包含人κ轻链框架共有序列。在一些实施方式中，抗体包含人λ轻链框架共有序列。
如本领域中所知，且如本文中大量详细描述，划定抗体超变区的氨基酸位置/边界可根据上下文和各种本领域所知的定义(如下文所述)而变化。在可变域中的某些位置可被视为混合超变位置(hybrid hypervariable position)，这是因为这些位置在一组标准中可被视为位于超变区之内，而在另一组标准中则被视为位于超变区之外。这些位置中的一个或多个也可在延展超变区中发现(如下文进一步描述)。本发明提供在这些混合超变位置中包含修饰的抗体。在一个实施方式中，这些超变位置包括重链可变域中26-30、33-35B、47-49、57-65、93、94和101-102位中的一个或多个。在一个实施方式中，这些混合超变位置包括轻链可变域中24-29、35-36、46-49、56和97位中的一个或多个。
根据本发明方面的抗体具体包括抗体的所有同种型、亚类和形式，包括但不限于：IgG、IgM、IgA、IgD和IgE抗体及其片段，优选抗原结合片段。本文优选的抗体包括IgG、IgM和IgA抗体及其抗原结合片段，其可以被修饰以包括来自其他同种型(例如IgG)的序列以产生嵌合抗体。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体是IgG抗体。在某些实施方式中，IgG抗体是选自下组的亚类：IgG1、IgG2(IgG2a、IgG2b)、IgG3或IgG4。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体是IgM抗体。IgM抗体描述于公开的PCT申请PCT/US2014/054079中，其揭示的内容通过引用全部纳入本文。
在一些实施方式中，抗PD-L1抗体是IgA抗体。在某些实施方式中，IgA抗体是选自下组的亚类：IgA1或IgA2。IgA抗体描述于公开的PCT申请PCT/US2015/015268中，其揭示的内容通过引用全部纳入本文。
在某些实施方式中，抗PD-L1抗体是包含修饰的J链的IgM抗体。在某些实施方式中，抗PD-L1抗体是包含修饰的J链的IgA抗体。在某些实施方式中，抗PD-L1抗体是包含修饰的J链的IgG/IgM杂合抗体。在某些实施方式中，抗PD-L1抗体是包含修饰的J链的IgG/IgA杂合抗体。包含修饰的J链的IgM、IgA、IgG/IgM和IgG/IgA抗体描述于公开的PCT申请PCT/US2015/024149，其揭示的内容通过引用全部纳入本文。
根据本发明实施方式的抗体可为单特异性、双特异性或多特异性的。双特异性IgG抗体描述于例如美国专利公开No.2014/0120096，其揭示的内容通过引用全部纳入本文。
本发明的方面包括双特异性IgM抗体，其具有对两种不同结合区的结合特异性。双特异性IgM抗体描述于公开的PCT申请PCT/US2014/054079中，其揭示的内容通过引用全部纳入本文。
本发明的方面包括双特异性IgA抗体，其具有对两种不同结合区的结合特异性。双特异性IgA抗体描述于例如公开的PCT申请PCT/US2015/015268中，其揭示的内容通过引用全部纳入本文。
本发明的方面包括IgG/IgM和IgG/IgA杂合抗体。这些抗体描述于公开的PCT申请PCT/US2015/024149中，其揭示的内容通过引用全部纳入本文。
在一个具体实施方式中，全长抗PD-L1抗体是IgG抗体。
在一个具体实施方式中，全长抗PD-L1抗体是IgM抗体。在一个实施方式中，全长抗PD-L1IgM抗体包含修饰的J链，其包含外来结合部分。
在一个具体实施方式中，全长抗PD-L1抗体是IgA抗体。在一个实施方式中，全长抗PD-L1IgA抗体包含修饰的J链，其包含外来结合部分。
在一个具体实施方式中，全长抗PD-L1抗体是IgG/IgM杂合抗体。在一个实施方式中，全长抗PD-L1IgG/IgM杂合抗体包含修饰的J链，其包含外来结合部分。
在一个具体实施方式中，全长抗PD-L1抗体是IgG/IgA杂合抗体。在一个实施方式中，全长抗PD-L1IgG/IgA抗体包含修饰的J链，其包含外来结合部分。
本文所述的氨基酸序列如下表1中所示：
表1：氨基酸序列
本发明的方面包括包含J链的抗体，其包含拮抗T细胞抑制性信号转导途径而不干扰IgM、IgA、IgG/IgM或IgG/IgA抗体与其结合靶标(例如PD-L1)结合的能力的结合部分。例如，根据本发明实施方式的抗体可为IgM抗体、IgA抗体或IgG/IgM或IgG/IgA杂合抗体，其可以在IgG重链上含有IgM或IgA尾片段，并因此组合了IgG和IgM或IgA的性质，包括纳入且形成具有修饰的J链的聚合物的能力，所述修饰的J链的结合部分能拮抗T细胞抑制性信号转导途径。关于IgG/IgM和IgG/IgA杂合抗体的其他详细内容参见例如Koteswara等，ClinicalImmunology 2001,101(1):21-31。
T细胞抑制性信号转导途径是本领域已知的，并且包括但不限于Pardoll,Drew M.“癌症免疫治疗中的免疫检验点阻断(The blockade of immune checkpoints in cancerimmunotherapy)”Nature Reviews Cancer 12.4(2012):252-264中所述的那些，其全部内容通过引用纳入本文。下文进一步详细描述T细胞抑制性信号转导途径及其组成的非限制性示例。
程序化细胞死亡-1(PD-1)及其配体程序化细胞死亡配体-1(PD-L1)通常涉及到T细胞的免疫抑制活性。PD-1是免疫球蛋白超家族的抑制性细胞表面受体蛋白，表达于T细胞表面，并参与调节免疫和自身耐受中的T细胞功能。PD-L1与T细胞表面上的PD-1相互作用，并通过阻断细胞周期进程和细胞因子产生来抑制T细胞的增殖。同上。PD-1的免疫抑制功能的例子包括但不限于：使表达PD-1的T细胞耗竭、无效和静默。如前所述，在一些实施方式中，抗PD-L1抗体或其抗原结合片段能够结合PD-L1蛋白，从而抑制PD-1蛋白的一种或多种免疫抑制功能。
细胞毒性T淋巴细胞缔合蛋白4(CTLA4)是免疫球蛋白超家族成员，并且已经显示能向T细胞传送抑制性信号。CTLA4的膜结合同种型以由二硫键互连的同二聚体发挥功能，而可溶同种型以单体发挥功能。例如，Pardoll，255。
T细胞抑制性信号转导途径的另一个示例是涉及T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(TIM3)的信号转导途径。TIM3是一种在T细胞表面上表达的细胞表面糖蛋白，其功能是参与Th1细胞终止的抑制性分子。同上。
T细胞抑制性信号转导途径的另一个示例是涉及淋巴细胞激活基因3(LAG3)的信号转导途径。LAG3属于免疫球蛋白超家族，并作为T细胞的细胞增殖、活化和体内平衡的抑制剂起作用。同上。
T细胞抑制性信号转导途径的另一个示例是涉及B和T淋巴细胞衰减蛋白(BTLA)的信号转导途径。BTLA是通过与肿瘤坏死因子受体超家族成员的相互作用抑制T细胞而发挥功能的细胞表面蛋白。已知BTLA负调节T细胞免疫应答。同上。
T细胞抑制性信号转导途径的另一个示例是涉及T细胞活化的V-结构域Ig抑制物(VISTA)的信号转导途径。VISTA是T细胞功能的调节物，其在造血细胞和白细胞上表达，并通过抑制T-细胞活化来发挥作用。例如，Lines JL等，Cancer research.2014；74(7):1924-1932。
T细胞抑制性信号转导途径的另一个示例是涉及具有Ig和ITIM结构域的蛋白质T细胞免疫受体(TIGIT)的信号转导途径。TIGIT在数种类型的T细胞中表达，并且以高亲和性结合脊髓灰质炎病毒受体。TIGIT通过促进成熟免疫调节树突细胞的生成来抑制T细胞活化。例如，Yu X.等，Nat Immunol.2009年1月；10(1):48-57。
如上所述，根据本发明实施方式的抗体可包括在J链上的结合部分，其拮抗T细胞抑制性信号转导途径。在一些实施方式中，J链上的结合部分结合T细胞抑制性信号转导途径中的靶标，并由此阻断或消除通过该途径由T细胞接收的抑制性信号。结果，T细胞的免疫应答不被阻断、停止或减少，或至少对T细胞的免疫应答的抑制减小或消失。对象抗体J链上的结合部分可用于拮抗任何T细胞抑制性信号转导途径，包括但不限于涉及下表2中列出的蛋白质的抑制性信号转导途径。下表2中提供了对应于这些T细胞抑制性信号转导途径靶标的人类蛋白质序列的GenBank登录号。
表2：T细胞抑制性信号转导途径靶标的序列信息
T细胞抑制性信号转导途径成员: GenBank登录号
CTLA-4 AAL07473.1
TIM3 AAL65158.1
LAG3 AAH52589.1
BTLA AAI07092.1
VISTA NP_071436.1
TIGIT NP_776160.2
本发明的方面包括具有J链的抗PD-L1抗体，所述J链包含减少抗体从对象循环中清除的结合部分，从而增加了抗体在对象中的半衰期。本领域已知白蛋白结合作为改善蛋白质药代动力学的一般策略。例如，与白蛋白的非共价缔合已经显示延长了短寿命蛋白质的半衰期。例如，Dennis,Mark S.等，J.Biol.Chem.,2002,277:35035-35043，其公开内容通过引用整体并入本文。就此，将白蛋白(人血清白蛋白)、白蛋白样蛋白质或白蛋白结合肽用作对象中抗PD-L1抗体J链上的结合部分为操纵抗体药代动力学提供了有效的策略。另外，已知新生儿Fc受体(FcRn)提供再循环(recycling)途径，其为免疫球蛋白分子提供更长的循环半衰期。例如，Roopenian D.C.等，Nature Reviews Immunology 7,715-725(2007)。就此，采用FcRn结合蛋白、结合FcRn的Fc结构域或结合FcRn的抗体部分也为操纵抗体的药代动力学提供了有效的策略。
在一些实施方式中，对象抗PD-L1抗体J链上的结合部分包含白蛋白蛋白。白蛋白蛋白是血浆中常见的可溶性非糖基化蛋白。已知白蛋白蛋白与FcRn介导的再循环途径相互作用，并由此具有特别长的循环半衰期。
在某些实施方式中，对象抗PD-L1抗体J链上的结合部分结合白蛋白蛋白，由此将其与白蛋白蛋白连接，并利用FcRn介导的再循环途径的优势。就此，在一些实施方式中，对象抗PD-L1抗体J链上的结合部分包含白蛋白结合肽。美国专利公开号US20050287153中描述了白蛋白结合肽的非限制性示例，其公开内容通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，对象抗PD-L1抗体J链上的结合部分包含白蛋白结合抗体部分。结合白蛋白的抗体部分的非限制性例子包括：抗白蛋白Fab、抗白蛋白scFv、抗白蛋白VHH(例如骆驼样抗体分子)、抗白蛋白scFab和抗白蛋白dAb(例如人结构域抗体)。
在一些实施方式中，对象抗PD-L1抗体J链上的结合部分包含FcRn结合肽。在某些实施方式中，对象抗PD-L1抗体J链上的结合部分包含FcRn结合抗体部分。结合FcRn的抗体部分的非限制性示例包括：抗FcRn Fab、抗FcRn scFv、抗FcRn VHH、抗FcRn scFab和抗FcRndAb。
在一些实施方式中，对象抗PD-L1抗体J链上的结合部分包含由FcRn受体结合的免疫球蛋白分子Fc结构域。可包含在对象抗PD-L1抗体J链上以减少抗PD-L1抗体清除的结合部分包含但不限于下表3中所提供的结合部分。表3中还提供了可用于产生抗体部分的蛋白质的非限制性实例，所述抗体部分可用作对象抗PD-L1抗体J链上的结合部分。
表3：减少清除的结合部分的序列信息
减少清除的结合部分 氨基酸序列信息
白蛋白 GenBank登录号：NP_000468.1
白蛋白结合肽 DLCLRDWGCLW(SEQ ID NO:58)
白蛋白结合肽 DICLPRWGCLW(SEQ ID NO:59)
白蛋白结合肽 MEDICLPRWGCLWGD(SEQ ID NO:60)
白蛋白结合肽 QRLMEDICLPRWGCLWEDDE(SEQ ID NO:61)
白蛋白结合肽 QGLIGDICLPRWGCLWGRSV(SEQ ID NO:62)
白蛋白结合肽 QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK(SEQ ID NO:63)
白蛋白结合肽 EDICLPRWGCLWEDD(SEQ ID NO:64)
白蛋白结合肽 RLMEDICLPRWGCLWEDD(SEQ ID NO:65)
白蛋白结合肽 MEDICLPRWGCLWEDD(SEQ ID NO:66)
白蛋白结合肽 MEDICLPRWGCLWED(SEQ ID NO:67)
白蛋白结合肽 RLMEDICLARWGCLWEDD(SEQ ID NO:68)
白蛋白结合肽 EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG(SEQ ID NO:69)
白蛋白结合肽 RAPESFVCYWETICFERSEQ(SEQ ID NO:70)
白蛋白结合肽 EMCYFPGICWM(SEQ ID NO:71)
FcRn GenBank登录号：P55899.1
IgG1的Fc结构域 GenBank登录号：AAB24269.1
IgG2的Fc结构域 GenBank登录号：AAR26706.1
IgG3的Fc结构域 GenBank登录号：ACO54886.1
IgG4的Fc结构域 GenBank登录号：AAG00912.1
对象抗体J链上的结合部分可包括但不限于：抗体、抗体的抗原结合片段、抗体-药物偶联物、抗体-药物偶联物的抗原结合片段、抗体样分子、抗体样分子的抗原结合片段、可溶和膜结合蛋白、配体和受体。在一些实施方式中，抗体的抗原结合片段选自下组：Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、Fv、scFv和单结构域抗体。
在一个优选的实施方式中，J链上的结合部分是抗体或抗体的抗原结合片段(也称为“抗体片段”)，包括单特异性、双特异性和多特异性抗体和抗体片段，其作为T细胞抑制性信号转导途径的抑制剂发挥作用。在一个优选实施方式中，该抗体片段是单链Fv(scFv)。
本发明的方面包括：IgM、IgA、IgG/IgM或IgG/IgA抗体、或其抗原结合片段，其结合细胞表面蛋白(例如CD20、EGFR、HER2、CTLA-4、TIM3、LAG3、VISTA或TIGIT蛋白)，其中该IgM、IgA、IgG/IgM或IgG/IgA抗体、或抗原结合片段包含修饰的J链，所述修饰的J链包含外来结合部分，包括如本文所述的抗PD-L1抗体或抗原结合片段。
在一些方面中，本发明提供了载体，其包含编码本文所述任何抗PD-L1抗体的DNA。还提供了包含任何此类载体的宿主细胞。作为示例，宿主细胞可为CHO细胞、大肠杆菌细胞或酵母细胞。进一步提供了生产任何本文所述多肽的方法，其包括在适于所需多肽表达的条件下培养宿主细胞，并从细胞培养物中回收所需多肽。
根据本发明实施方式的抗体可用于任何已知的测试方法，例如ELISA、竞争性结合试验、直接和间接夹心试验和免疫沉淀试验(Zola,(1987)《单克隆抗体技术指南》(Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques),第147-158页,CRC出版公司(CRCPress,Inc.))。
可将检测标记物用于结合或识别事件的定位、可视化和定量。本发明标记的抗体可检测细胞表面受体。可检测标记的抗体的另一用途是基于微珠的免疫捕获方法，其包括将微珠与荧光标记的抗体偶联，并在与配体结合后检测荧光信号。类似的结合检测方法采用了表面等离子共振(SPR)效应来测定和检测抗体-抗原相互作用。
检测标记物，如荧光染料和化学发光染料(Briggs等(1997)，“功能化荧光染料的合成及其与胺和氨基酸的偶联”("Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes andTheir Coupling to Amines and Amino Acids,")J.Chem.Soc.,Perkin-Trans.1:1051-1058)提供了可检测信号，且通常可应用于标记抗体，优选具有如下性质：(i)标记的抗体应当产生极高信号和低背景，从而使得少量抗体能被灵敏地从无细胞和基于细胞的测试中检测出；以及(ii)标记的抗体应当光稳定，从而使得荧光信号可被观察、监测和记录而不发生明显的光脱色。对于涉及标记抗体与膜或细胞表面(尤其是活细胞)的细胞表面结合的应用，标记物优选(iii)具有良好的水溶性以获得有效偶联浓度和检测敏感度；以及(iv)对活细胞无毒从而不会破坏细胞的正常代谢过程或造成成熟前细胞死亡。
细胞荧光强度的直接定量和荧光标记事件的计数(例如肽-染料偶联物的细胞表面结合)可在对或细胞或微珠自动进行混合和读数、无放射性测试的系统(8100HTS系统,Applied Biosystems公司,福斯特城，加利福尼亚州)上进行(Miraglia,“采用荧光微量测定技术进行高通量筛选的基于细胞和微珠的均相测定”("Homogeneouscell-and bead-based assays for high throughput screening using fluorometricmicrovolume assay technology"),(1999)J.of Biomolecular Screening 4:193-204)。标记抗体的用途还包括细胞表面受体结合测试、免疫捕获测试、荧光连接没有吸附测试(FLISA)、胱冬酶裂解(Zheng,“胱冬酶-3控制体内与Fas介导的凋亡相关的胞质和核事件”("Caspase-3controls both cytoplasmic and nuclear events associated with Fas-mediated apoptosis in vivo"),(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:618-23；US6372907)、凋亡(Vermes,“凋亡测试新方法：采用荧光素标记的膜联蛋白V流式细胞检测早期凋亡细胞上磷脂酰丝氨酸的表达”("A novel assay for apoptosis.Flow cytometricdetection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells usingfluorescein labelled Annexin V")(1995)J.Immunol.Methods 184:39-51)、以及细胞毒性测试。荧光微量体积测定技术可用于鉴定靶向细胞表面的分子的上调或下调(Swartzman,“使用荧光微量体积测定技术进行高通量筛选的均相和多重免疫测定”("Ahomogeneous and multiplexed immunoassay for high-throughput screening usingfluorometric microvolume assay technology"),(1999)Anal.Biochem.271:143-51)。
本发明的标记抗体可通过生物医学和分子成像的各种方法和技术用作成像生物标记物和探针，例如：(i)MRI(磁共振成像)；(ii)MicroCT(计算机断层扫描)；(iii)SPECT(单光子发射计算机断层扫描)；(iv)PET(正电子发射断层扫描)(Chen等(2004)Bioconjugate Chem.15:41-49)；(v)生物发光；(vi)荧光；(vii)超声波。免疫闪烁法是一种成像方法，其中将放射性物质标记的抗体给予动物或人患者，并拍摄抗体所在身体位置的图片(US6528624)。可客观地测定和评估成像生物标记物来作为正常生物过程、致病过程或对治疗干预的药理学反应的指示。
肽标记方法是熟知的。参见Haugland,2003,《荧光探针和研究化学物的分子探针手册》(“Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals”,Molecular Probes公司；Brinkley,1992,Bioconjugate Chem.3:2；Garman,(1997)《非放射性标记实践方法》(Non-Radioactive Labelling:A Practical Approach),学术出版社，伦敦；Means(1990)Bioconjugate Chem.1:2；Glazer等，(1975)《蛋白质化学修饰。生化和分子生物学实验室技术》(“Chemical Modification of Proteins.LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology”)(T.S.Work和E.Work编)American Elsevier出版公司，纽约；Lundblad,R.L.和Noyes,C.M.(1984)《用于蛋白质修饰的化学试剂》(“Chemical Reagents for Protein Modification”,第I和II卷，CRC出版公司，纽约；Pfleiderer,G.(1985)《“蛋白质的化学修饰”蛋白质化学现代方法》(“ChemicalModification of Proteins”,Modern Methods in Protein Chemistry),H.Tschesche编，Walter DeGryter，柏林和纽约；以及Wong(1991)《蛋白质偶联和交联化学》(“Chemistry ofProtein Conjugation and Cross-linking,CRC出版社，博卡拉顿，佛罗里达州)；De Leon-Rodriguez等(2004)Chem.Eur.J.10:1149-1155；Lewis等(2001)Bioconjugate Chem.12:320-324；Li等(2002)Bioconjugate Chem.13:110-115；Mier等(2005)BioconjugateChem.16:240-237。
用足够靠近的两个部分，即荧光报告物和淬灭剂，标记的肽和蛋白质经历荧光共振能量转移(FRET)。报告物基团通常为荧光染料，其可被特定波长的光激发并以适当的斯托克斯位移将能量递送到接受体或猝灭剂以发射最大亮度。荧光染料包括具有延长芳香性结构的分子，例如荧光素和罗丹明及其衍生物。荧光报告物可被完整肽中的猝灭部分明显或部分猝灭。肽被肽酶或蛋白酶切割后，可测得荧光的可检测增强(Knight,C.(1995)“蛋白分解酶的荧光测试”(“Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes”,《酶学方法》(Methods in Enzymology),学术出版社(Academic Press),248:18-34))。
本发明标记抗体也可用作亲和纯化试剂。在该过程中，采用本领域中熟知的方法将标记抗体被固定在固相上，例如葡聚糖凝胶或滤纸上。固定化抗体与包含抗原的待纯化样品接触，然后用合适的溶剂洗涤支持物，该溶剂可基本上除去样品中除了结合于固定化多肽变体的待纯化抗原以外的所有物质。最后，用另一合适溶剂(如甘氨酸缓冲液，pH5.0)洗涤支持物，从多肽变体上释放该抗原。
在一些实施方式中，本发明提供了抗PD-L1抗体，其可用作为本文所述的治疗剂。示例性的抗体包括多克隆、单克隆、嵌合、人源化和人抗体。
多克隆抗体
优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关的抗原和佐剂在动物中产生多克隆抗体。将相关抗原(尤其是采用合成肽时)与在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白质偶联可能是有用的。例如，可将该抗原与匙孔血蓝蛋白(KLH)、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂偶联，该偶联采用双功能或衍生剂，例如，马来酰亚胺基苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester，通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R'N＝C＝NR，其中R和R'是不同的烷基。
如下针对抗原、免疫原性偶联物或其衍生物对动物进行免疫：混合例如100μg或5μg该蛋白质或偶联物(分别用于兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂，并将溶液皮内注射到多个部位。一个月后，用溶于弗氏完全佐剂的含约1/5～1/10初始量的肽或偶联物皮下注射多个部位以加强免疫动物。7～14天后，动物放血，检验血清的抗体效价。使动物加强免疫直至效价到达平台。还可在重组细胞培养中制备作为蛋白融合物的偶联物。聚集剂(如明矾)也适合用于增强免疫应答。
单克隆抗体
可采用本领域中已知的任何技术来制备针对感兴趣抗原的单克隆抗体(mAb)。这些包括但不限于：最早由Kohler和Milstein(1975,Nature 256:495-497)描述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983,Immunology Today 4:72)、EBV杂交瘤技术(Cole等，1985，《单克隆抗体和癌症治疗》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，ARL公司(Alan R.Liss,Inc.)，第77-96页)。选择的淋巴细胞抗体方法(SLAM)(Babcook，JS等，“用于从单个分离的淋巴细胞产生单克隆抗体的新策略，产生确定特异性的抗体”(A novelstrategy for generating monoclonal antibodies from single,isolatedlymphocytes producing antibodies of defined specificities.).Proc Natl AcadSci USA，1996.93(15)：p.7843-8。)和(McLean GR，Olsen OA，Watt IN，Rathanaswami P，Leslie KB，Babcook JS，Schrader J.“人类原代免疫球蛋白对人巨细胞病毒的识别确定了适应性免疫应答的先天基础”(Recognition of human cytomegalovirus by humanprimary immunoglobulins identifies an innate foundation to an adaptive immuneresponse).J Immunol.2005年4月15日；174(8)：4768-78)。这类抗体可属于任何免疫球蛋白类型，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亚类。生产本发明mAb的杂交瘤可在体外或体内培养。
可采用由Kohler等，Nature,256:495(1975)首次公开的杂交瘤方法或采偶用能够重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)来制备单克隆抗体。
在杂交瘤方法中，对小鼠或其它合适的宿主动物(如仓鼠)进行如上所述的免疫，以引发产生或能够产生特异性结合免疫所用蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，可体外免疫淋巴细胞。免疫后，分离淋巴细胞，并随后用合适的融合试剂(如聚乙二醇)使其与骨髓瘤细胞系融合，形成杂交瘤细胞(Goding，“单克隆抗体：原理和实践”(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)，第59-103页(学术出版社(Academic Press)，1986))。
将如此制备的杂交瘤细胞接种于合适的培养基并培养，所述培养基优选含有能抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞(也称为融合伴侣)生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的选择性培养基一般包含次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质能防止HGPRT缺陷细胞的生长。
优选的融合伴侣骨髓瘤细胞是能有效融合、支持所选抗体生产细胞稳定高水平产生抗体，且对选择性针对未融合亲代细胞的选择性培养基敏感的那些细胞。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，如衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系(获自美国加州圣地亚哥的索尔克研究所细胞销售中心(Salk Institute Cell Distribution Center，SanDiego,CA，USA))和SP-2及其衍生物，例如X63-Ag8-653细胞(获自美国弗吉尼亚州玛纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas,Va.,USA))。也已记载将人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于生产人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.，133:3001(1984)；Brodeur等，“单克隆抗体生产技术和应用”(MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications)，第51-63页(纽约MD公司(MarcelDekker,Inc.,New York),1987))。
检测培养杂交瘤细胞的培养基中是否产生针对抗原的单克隆抗体。优选用免疫沉淀或体外结合试验，例如放射免疫试验(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
可通过例如Munson等，Anal.Biochem.,107:220(1980)中描述的Scatchard分析法确定单克隆抗体的结合亲和力。
一旦鉴定到产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可通过有限稀释步骤和标准方法培养对该克隆进行亚克隆(Goding，《单克隆抗体：原理和实践》(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)，第59-103页，(学术出版社，1986))。适用于此目的的培养基包括例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水肿瘤生长，例如通过将该细胞腹腔注射入小鼠。
通过常规抗体纯化方法，例如亲和层析(例如采用蛋白A或蛋白G-琼脂糖)或离子交换层析、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析等，适当地由培养基、腹水或血清分离所述亚克隆分泌的单克隆抗体。
用常规方法(例如，利用能特异性结合编码鼠抗体重链和轻链基因的寡核苷酸探针)易于分离和测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞用作这类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染入宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不会产生抗体蛋白的骨髓瘤细胞，以实现重组宿主细胞中的单克隆抗体合成。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等，Curr.Opinion in Immunol.,5:256-262(1993)和Pliickthun，Immunol.Revs.130:151-188(1992)。
在其他实施方式中，可以从采用McCafferty等，Nature，348:552-554(1990)中所述技术产生的抗体噬菌体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等,Nature,352:624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222:581-597(1991)中分别记载了利用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续的出版物中描述了采用链改组产生高亲和(nM范围)人抗体(Marks等，Bio/Technology，10:779-783(1992))，以及将联合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的方案(Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，21:2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可选替代方案。
可修饰编码抗体的DNA以产生嵌合或融合抗体多肽，例如通过用同源鼠序列替换人重链和轻链恒定区(美国专利No.4,816,567；以及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白(异源多肽)的部分或全部编码序列融合。可用非免疫球蛋白多肽序列取代抗体的恒定域，或者取代抗体一个抗原结合位点的可变域，以产生包含对抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对另一抗原具有特异性的另一抗原结合位点的嵌合二价抗体。
嵌合、人源化和人抗体
在一些实施方式中，抗体PD-L1抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利No.4,816,567；和Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中。在一个示例中，嵌合抗体包含非人可变区(例如衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类(如猴)的可变区)和人恒定区。在另一个示例中，嵌合抗体是“类型转换”抗体，其中该抗体的类型或亚类相对于亲本抗体有所改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在一些实施方式中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，非人抗体经人源化以降低对人的免疫原性并同时保持对亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含：其中HVR(或其部分)衍生自非人抗体的一个或多个可变区，以及衍生自人抗体序列的FR(或其部分)。人源化抗体也能可任选地包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方式中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，HVR残基所衍生自的抗体)的相应残基取代，例如，为了恢复或改善抗体特异性或亲和性。
根据本发明实施方式的抗PD-L1抗体可为人源化或人抗体。非人(例如鼠或兔)抗体的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合型亚序列)，其包含最少的源自非人免疫球蛋白的序列。人源化抗体包括人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者HVR的残基被具有所需特异性、亲和性和性能的非人物种(供者抗体)如小鼠、大鼠或兔HVR的残基取代。在一些实例中，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基所替换。人源化抗体也可包含在受者抗体以及输入的HVR或构架序列中均未发现的残基。通常，人源化抗体将包含几乎所有的至少一个、通常两个可变区，其中全部或基本上全部的HVR对应于非人免疫球蛋白的HVR，且全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。优化的人源化抗体还会包含免疫球蛋白恒定区(如Fc区)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白恒定区的至少一部分(Jones等，Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature,332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596(1992))。
本领域熟知人源化非人抗体的方法。通常，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常被称为“输入”残基，它们一般取自“输入”可变区。例如，人源化过程可基本按照Winter及合作者所述方法进行(Jones等，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332:323-327(1988)；Verhoeyen等，Science 239:1534-1536(1988))，用啮齿动物HVR或HVR序列取代人抗体的相应序列。因此，这类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上少于完整的人可变区被来自非人物种的相应序列所取代。在实践中，人源化抗体一般是其中一些HVR残基以及可能的一些FR残基被啮齿动物抗体中相似位点的残基所取代的人抗体。
当要将抗体用于人治疗用途时，对于待用于制备人源化抗体的人可变域(轻链和重链)的选择对于降低抗原性和HAMA应答(人抗鼠抗体)至关重要。HAMA应答的降低或消除是临床开发适宜治疗剂的重要方面。参见例如，Khaxzaeli等，J.Natl.Cancer Inst.(1988),80:937；Jaffers等，Transplantation(1986),41:572；Shawler等，J.Immunol.(1985),135:1530；Sears等，J.Biol.Response Mod.(1984),3:138；Miller等，Blood(1983),62:988；Hakimi等，J.Immunol.(1991),147:1352；Reichmann等，Nature(1988),332:323；Junghans等，Cancer Res.(1990),50:1495。如本文所述，本发明提供了被人源化的抗体从而降低或消除了HAMA应答。这些抗体的变体还能采用本领域已知的常规方法获得，其中一些方法在下文中进一步描述。按照所谓的“最佳拟合”方法，针对整个已知的人可变区序列文库筛选啮齿动物抗体可变区的序列。鉴别最接近啮齿类V区序列的人V区序列，并将其中的人框架区(FR)接受为人源化抗体(Sims等，J.Immunol.，151:2296(1993)；Chothia等，J.Mol.Biol.，196:901(1987))。另一种方法采用特定的框架区，其衍生自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列。这种相同框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285(1992)；Presta等，J.Immunol.，151:2623(1993))。
例如，可将来自如本文所述抗体的氨基酸序列用作起始(亲本)序列来使得框架区和/或超变序列多样化。起始超变区所连接的所选框架序列在本文中被称为受者人框架。受者人框架可来自或衍生自人免疫球蛋白(其VL和/或VH区)，但优选受者人框架来自或衍生自人共有框架序列，因为已证明了这种框架对人患者的免疫原性最小或没有免疫原性。
虽然受者衍生自人免疫球蛋白，但也可任选地选择基于其与供者框架序列的同源性选择的人框架序列，这可如下进行：通过将供者框架序列与人框架序列集合中的各种人框架序列进行比对并选择与受者最具同源性的框架序列。
虽然受者可以在序列上与所选择的人框架序列相同，无论其来自人免疫球蛋白还是人共有框架，本发明都包括：受者序列可包含相对于人免疫球蛋白序列或人共有框架序列的预先存在的氨基酸取代。这些预先存在的取代优选最少；通常与人免疫球蛋白序列或共有框架序列相比，仅有4、3、2或1个氨基酸的差异。
在一些实施方式中，将非人抗体的超变区残基纳入VL和/或VH受者人框架。例如，可纳入对应于如下的残基：Kabat CDR残基、Chothia超变环残基、Abm残基和/或接触残基。可任选地，纳入如下的扩展超变区残基：24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)，26-35B(H1)、50-65、47-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。
本发明中讨论了超变区残基的“纳入”，但应理解这可通过不同方法实现，例如可通过小鼠可变区序列的编码核酸的突变产生所需氨基酸序列的编码核酸，从而使其框架残基改变为受者人框架残基，或者可通过人可变区序列的编码核酸的突变产生所需氨基酸序列的编码核酸，从而使超变区残基改变为非人残基，或者通过合成编码所需序列的核酸产生所需核酸等。
如本文所述，可通过对编码人受者序列的核酸的Kunkel诱变，对各超变区采用独立的寡核苷酸产生超变区接枝变体。Kunkel等，Methods Enzymol.154:367-382(1987)。采用常规技术在框架和/或超变区内引入合适的变化以纠正和重建适当的超变区-抗原相互作用。
噬菌(粒)展示(本文上下文中也称为噬菌体展示)可用作从通过序列随机化产生的文库中产生和筛选许多不同的潜在变体抗体的简便和快速方法。然而，制备和筛选改变抗体的其他方法是本领域技术人员可得的。
噬菌(粒)展示技术为产生和选择结合于配体(例如抗体)的新蛋白质提供了强有力的工具。采用噬菌(粒)展示技术产生了蛋白质变体的大文库，其可被快速分选以获得能以高亲和力结合目标分子的那些序列。编码变体多肽的核酸通常与编码病毒包衣蛋白(如基因III蛋白或基因VIII蛋白)融合。已开发了单价嗜菌粒系统，其中编码蛋白质或多肽的核酸序列与编码基因III蛋白一部分的核酸序列融合。(Bass,S.,Proteins,8:309(1990)；Lowman和Wells,“方法：酶学方法指南”(Methods:A Companion to Methods inEnzymology,3:205(1991))。在单价嗜菌粒展示系统中，以低水平表达基因融合，且也表达野生型基因III蛋白，从而保留了颗粒感染性。产生肽文库和筛选那些文库的方法已揭示于许多专利中(例如美国专利No.5,723,286、美国专利No.5,432,018、美国专利No.5,580,717、美国专利No.5,427,908和美国专利No.5,498,530)。已通过多种方法制备了抗体或抗原结合多肽文库，这些方法包括：通过插入随机DNA序列或通过克隆相关基因家族来改变单个基因。采用噬菌(粒)展示抗体或抗原结合片段的方法已描述于美国专利No.5,750,373、5,733,743、5,837,242、5,969,108、6,172,197、5,580,717和5,658,727。然后筛选文库中具有所需特征的抗体或抗原结合蛋白的表达。
将所选氨基酸取代入模板核酸的方法在本领域中已非常成熟，本文中将描述其中一些方法。例如，可用Kunkel方法取代超变区残基。参见例如，Kunkel等，MethodsEnzymol.154:367-382(1987)。
寡核苷酸的序列包含用于待改变超变区残基的一个或多个经设计的密码子组。密码子组是一组不同的核苷酸三联体序列，其用于编码所选变体氨基酸。可采用符号来代表密码子组，以指示如下所示的根据IUB代码的具体核苷酸或核苷酸的等摩尔混合物。
IUB代码：G鸟嘌呤；A腺嘌呤；T胸腺嘧啶；C胞嘧啶；R(A或G)；Y(C或T)；M(A或C)；K(G或T)；S(C或G)；W(A或T)；H(A或C或T)；B(C或G或T)；V(A或C或G)；D(A或G或T)H(A或C或T)；N(A或C或G或T)。
例如，在密码子组DVK中，D可为核苷酸A或G或T；V可为A或G或C；K可为G或T。该密码子组可代表18种不同密码子且能译码为氨基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly和Cys。
可采用标准方法合成寡核苷酸或引物组。例如，可采用固相合成法合成一组寡核苷酸，其含有代表由密码子组提供的核苷酸三联体的所有可能组合并且将编码所需氨基酸组的序列。在某些位置具有所选多核苷酸“简并”的寡核苷酸的合成是本领域熟知的。具有某些密码子组的此类核苷酸组可采用市售核酸合成仪(可购自例如应用生物系统公司(Applied Biosystems)，福斯特城，加利福尼亚州)合成，或可市售获得(例如购自生命技术公司(Life Technologies,Inc.)，马里兰州洛克维尔)。因此，所合成的具有特定密码子组的一组寡核苷酸通常会包含具有不同序列的多种寡核苷酸，这些差异由全序列中的该密码子组建立。如本发明所用的寡核苷酸具有能与可变区核酸模板杂交的序列，且还可包含用于克隆目的的限制性酶切位点。
在一种方法中，编码变体氨基酸的核酸序列可通过寡核苷酸介导的诱变产生。该技术在本领域中是熟知的，如Zoller等Nucleic Acids Res.10:6487-6504(1987)所描述。简而言之，编码变体氨基酸的核酸序列如下产生：使编码所需密码子组的寡核苷酸组与DNA模板杂交，其中该模板是包含可变区核酸模板序列的质粒的单链形式。杂交后，用DNA聚合酶合成模板的整条第二互补链，由此其将纳入寡核苷酸引物，并将包含由寡核苷酸组提供的密码子组。
通常，采用长度至少为25个核苷酸的寡核苷酸。优化的寡核苷酸将具有与模板在编码突变的核苷酸两侧完全互补的12-15个核苷酸。这确保了寡核苷酸与单链DNA模板分子的正确杂交。很容易采用本领域已知的技术合成寡核苷酸，例如Crea等，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,75:5765(1978)中所描述。
可由载体产生DNA模板，所述载体衍生自噬菌体M13载体(市售的M13mp 18和M13mp19载体均适合)或包含单链噬菌体复制起点(如Viera等，Meth.Enzymol.,153:3(1987)所述)。因此，待突变的DNA可被插入这些载体之一以产生单链模板。单链模板的生产描述于如前所述的Sambrook等的第4.21-4.41节。
为了改变天然DNA序列，使寡核苷酸与单链模板在适当的杂交条件下杂交。然后，加入DNA聚合酶(通常为T7DNA聚合酶或DNA聚合酶I的Klenow片段)以采用用作合成引物的寡核苷酸来合成模板的互补链。由此产生了异源双链分子，其中一条DNA链编码突变形式的基因1，而另一条链(原始模板)则编码天然、未改变的基因1序列。然后将该异源双链分子转化入合适的宿主细胞，通常为原核细胞，例如大肠杆菌JM101。细胞生长后，将其接种到琼脂糖平板上，并采用以32-磷酸放射性标记的寡核苷酸引物进行筛选以鉴别包含突变DNA的细菌克隆。
可对如上所述的方法进行改进以产生同源双链分子，其中质粒的两条链均包含突变。可做如下改进：单链寡核苷酸与单链模板退火，如前所述。将三种脱氧核糖核苷酸的混合物(脱氧核糖腺苷(dATP)、脱氧核糖尿苷(dGTP)和脱氧核糖胸苷(dTT))与修饰的硫代脱氧核糖胞苷(称为dCTP-(aS)，可获自Amersham公司)合并。将该混合物加入模板-寡核苷酸复合物。在该混合物中加入DNA聚合酶时，产生了除突变碱基以外与模板均相同的DNA链。此外，这一新DNA链将包含dCTP-(aS)而不是dCTP，这可防止其被限制性内切酶消化。双链异源核酸分子的模板链用合适的限制性内切酶切割后，模板链可用ExoIII核酸酶或其他合适的核酸酶消化过包含待诱变的位置的区域。然后停止反应得到部分单链的分子。然后采用DNA聚合酶在所有四种三磷酸脱氧核糖核苷酸、ATP和DNA连接酶的存在下，形成完整的双链DNA同源双链分子。然后，可将该同源双链分子转化入适当的宿主细胞。
如前所述，寡核苷酸组的序列具有足以与模板核酸杂交的长度，且还可(但非必须)包含限制性位点。可由载体产生DNA模板，所述载体衍生自噬菌体M13载体或包含单链噬菌体复制起点的载体(如Viera等，Meth.Enzymol.,153:3(1987)所述)。因此，待突变的DNA必须被插入这些载体之一以产生单链模板。单链模板的生产描述于如前所述的Sambrook等的第4.21-4.41节。
根据另一方法，在抗体人源化通过所选修复超变区期间可恢复抗原结合(参见申请系列号11/061,841，提交于2005年2月18日)。方法包括将非人超变区纳入受者框架并在一个或多个超变区进一步引入一个或多个氨基酸取代而不修饰受者框架序列。或者，一个或多个氨基酸取代的引入可伴随受者框架序列的修饰。
根据另一方法，可如下产生文库：提供上游和下游寡核苷酸组，各组包含具有不同序列的多个寡核苷酸，所述不同序列由寡核苷酸序列中提供的密码子组建立。可将上游和下游寡核苷酸组以及可变区模板核酸序列用于聚合酶链式反应中以产生PCR产物“文库”。PCR产物可称作“核酸盒(nucleic acid cassettes)”，这是因为它们可采用已有生物学技术与其他相关或不相关核酸序列(例如病毒包衣蛋白和二聚化区)融合。
PCR引物序列包含经设计用于溶剂接近和超变区中高变位置的一个或多个密码子组。如前所述，密码子组是一组不同的核苷酸三联体序列，其用于编码所需变体氨基酸。
可采用标准重组技术分离和克隆符合所需标准的抗体选择物(seletants)，其通过合适的筛选/选择步骤被选择。
更重要的是人源化抗体保留对抗原的高亲和性和其它有利的生物学特性。为了实现该目标，按照优选方法，利用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念人源化产物来制备人源化抗体。本领域技术人员通常可获得并且熟悉三维免疫球蛋白模型。也可利用计算机程序阐明和显示所选的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。检查这些展示能够分析所述残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中所起的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，可选择FR残基并从受者和输入序列中组合，从而获得所需抗体特征，例如对靶抗原的亲和性增加。通常，超变区残基直接或最实质性参与影响抗原结合。
包括了人源化抗PD-L1抗体的各种形式。例如，人源化抗体可以是抗体片段，例如Fab片段。或者，人源化抗体可以是完整的抗体，例如完整的IgG、IgM或IgA抗体。在一些实施方式中，完整抗体可为完整IgM抗体。
作为人源化的替代方案，可产生人抗体。例如，目前能够产生转基因动物(例如，小鼠)，其在免疫后能产生完全的人抗体库但不产生内源性免疫球蛋白。例如，已描述了嵌合型和种系突变型小鼠中抗体重链铰链区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移入这类种系突变型小鼠将导致在抗原刺激后产生人抗体。参见，例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362:255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immun.，7:33(1993)；美国专利No.5,545,806、5,569,825、5,591,669(均为GenPharm)；5,545,807；和WO 97/17852。
或者，可采用噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature，348:552-553(1990))，用未免疫供者的免疫球蛋白可变(V)区基因库在体外产生人抗体和抗体片段。按照该技术，将抗体V结构域基因框内克隆入丝状噬菌体(例如M13或fd)的主要或次要衣壳蛋白基因中，在噬菌体颗粒表面上展示为功能抗体片段。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体功能特性的选择还可选择显示那些特性的抗体编码基因。因此，噬菌体模拟了B细胞的一些特性。可用不同形式进行噬菌体展示，例如如Johnson,Kevin S和Chiswell,DavidJ.,Current Opinion in Structural Biology 3:564-571(1993)中所综述。数种来源的V-基因区段可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature,352:624-628(1991)从衍生自免疫小鼠脾脏的V基因随机合并小文库中分离了一系列不同的抗噁唑酮抗体。可构建来自未免疫人供者的V基因库，且可基本上可按照Marks等，J.Mol.Biol.，222:581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.，12:725-734(1993)分离一系列不同的抗原(包括自体抗原)。还可参见美国专利No.5,565,332和5,573,905。
如前所述，人抗体还可通过体外活化的B细胞产生(参见美国专利No.5,567,610和5,229,275)。
在一些实施方式中，本公开的抗体是人单克隆抗体。此类针对PD-L1的人单克隆抗体可采用携带部分人免疫系统而非小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生。这些转基因和转染色体小鼠包括本文中分别称为HuMAb小鼠TM和KM小鼠TM的小鼠，它们在本文中合称为“人Ig小鼠”。
HuMAb小鼠TM(Medarex公司)包含人免疫球蛋白基因迷你基因座，其编码未重排人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列，以及包含使得内源μ和κ链基因座失活的定点突变(参见例如，Lonberg等.(1994)Nature 368(6474):856-859)。因此，这些小鼠具有小鼠IgM或κ表达降低，且在应答免疫时，导入的人重链和轻链转基因发生类型转变和体细胞突变以产生高亲和力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg,N.等，(1994),同上；Lonberg,N.(1994)“实验药理学手册”(Handbook of Experimental Pharmacology)113:49-101中所综述；Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93，以及Harding,F.和Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。HuMAb小鼠TM的制备和使用以及由此类小鼠携带的基因组修饰在如下文献中有进一步描述：Taylor,L.等，(1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等，(1993)International Immunology 5:647-656；Tuaillon等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724；Choi等，(1993)Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等，(1993)EMBO J.12:821-830；Tuaillon等，(1994)J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.等，(1994)International Immunology 6:579-591；和Fishwild,D.等，(1996)Nature Biotechnology 14:845-851，以上文献的所有内容通过引用以其全文纳入本文。还可参见美国专利No.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；均授予Lonberg和Kay；美国专利No.5,545,807，授予Surani等；PCT公开No.WO 92/03918、WO 93/12227、WO 94/25585、WO97/13852、WO 98/24884和WO 99/45962，均由Lonberg和Kay申请；以及PCT公开No.WO 01/14424，Korman等。
在另一实施方式中，可使用携带转基因和转染色体上人免疫球蛋白序列的小鼠(例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠)产生根据本发明实施方式的人抗体。该小鼠在本文中被称为“KM小鼠TM”，其在Ishida等申请的PCT公开WO 02/43478中描述。
另外，在本领域中还可获得表达人免疫球蛋白基因的其他转基因动物系统，它们可用于产生本公开的抗PD-L1抗体。例如，可采用另一种被称为Xenomouse(Abgenix公司)的转基因系统；此类小鼠描述于例如授予Kucherlapati等的美国专利No.5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963。
另外，在本领域中还可获得表达人免疫球蛋白基因的其他转染色体动物系统，它们可用于产生本公开的抗PD-L1抗体。例如，可采用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠，其被称为“TC小鼠”；此类小鼠在Tomizuka等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:722-727中有所描述。此外，本领域中已描述了携带人重链和轻链转染色体的牛(例如，Kuroiwa等，(2002)Nature Biotechnology 20:889-894和PCT申请No.WO 2002/092812)，其可用于产生本公开的抗PD-L1抗体。
抗体片段
在某些情况下，采用抗体片段比采用完整抗体更具优势。片段的小尺寸使其能被快速清除，且可使其进入实体瘤得以改善。
已开发了产生抗体片段的各种技术。传统上，这些片段是通过蛋白酶水解消化完整抗体产生的(参见例如，Morimoto等，Journal of Biochemical and BiophysicalMethods，24:107-117(1992)和Brennan等，Science，229:81(1985))。然而，现在这些片段可以通过重组宿主细胞直接产生。Fab、Fv和scFv抗体片段均能在大肠杆菌内表达并从其分泌，因此能容易生成大量的这些片段。可从如上所述的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，Fab'-SH片段可由大肠杆菌直接回收，并经化学偶联形成F(ab')2片段(Carter等，Bio/Technology，10:163-167(1992))。按照另一种方法，F(ab')2片段可由重组宿主细胞培养物直接分离。包含补救受体结合表位残基且体内半衰期增加的Fab和F(ab')2片段描述于美国专利No.5,869,046。本领域技术人员明白产生抗体片段的其它技术。在其它实施方式中，所选抗体是单链Fv片段(scFv或sFv)。参见WO 93/16185；美国专利No.5,571,894和美国专利No.5,587,458。Fv和sFv是仅有的包含完整结合位点但缺乏恒定区的种类；因此，它们适用于在体内应用期间降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以使效应蛋白融合于sFv的氨基或羧基末端。参见例如Borrebaeck,同上。抗体片段还可为“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所描述。
双特异性和多特异性抗体
如前所综述，双特异性和多特异性抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。示例性的双特异性抗体可结合本文所述PD-L1蛋白的两种不同表位。其他此类抗体可同时具有PD-L1结合位点和对其他蛋白质的结合位点(例如细胞表面蛋白，如肿瘤抗原)。或者，可将抗PD-L1结合单元与结合白细胞上的引发分子(例如T细胞受体分子，如CD3)联合，或与IgG的Fc受体(FcγR，如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16))联合，从而将细胞防御机制集中于和定位于表达PD-L1的细胞。在某些实施方式中，双特异性抗体可包含结合PD-L1的结合单元以及结合其他结合靶标(例如细胞表面蛋白，如肿瘤抗原)的第二结合单元。可用作结合靶标的细胞表面蛋白的非限制性例子包括：CD20、EGFR、HER2、CTLA-4、TIM3、LAG3、VISTA和TIGIT。表2中示出了对应于CTLA-4、TIM3、LAG3、VISTA和TIGIT的Genbank登录号。人CD20的氨基酸序列以UniProtKB号P11836提供。人EGFR的氨基酸序列以UniProtKB号P00533提供。人HER2(人ERBB2)的氨基酸序列以UniProtKB号P04626提供。
也可利用双特异性抗体将细胞毒剂定位于表达PD-L1的细胞。这些抗体具有PD-L1结合单元和结合细胞毒剂(如皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤(metholaexate)或放射性同位素半抗原)的结合单元。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如，F(ab')2双特异性抗体)。
制备双特异性抗体的方法为本领域已知。全长双特异性抗体的传统生产方法是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条链具有不同特异性(Millstein等，Nature，305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤，quadromas)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。正确分子纯化(通常通过亲和层析步骤进行)颇为烦琐，且产率较低。WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J.，10:3655-3659(1991)公开了相似方法。
效应功能的工程化改造
可能需要对本发明抗体的效应功能进行修饰，以例如增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。可通过在抗体重链恒定区(即Fc区)中引入一个或多个氨基酸取代实现这一目的。或者或额外地，可将半胱氨酸残基引入Fc区，从而在该区域中形成链间二硫键。如此产生的同源二聚体抗体可具有改善的内化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.ExpMed.，176:1191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.，148:2918-2922(1992)。也可利用如Wolff等，Cancer Research，53:2560-2565(1993)所述的异源双功能交联剂制备抗肿瘤活性提高的同源二聚体抗体。或者，可对抗体进行工程化改造以使其具有增加的Fc区数(例如具有2个或多个Fc区的工程化改造IgG分子)，且可由此具有增强的补体裂解和ADCC能力。参见Stevenson等，Anti-Cancer Drug Design，3:219-230(1989)。为了提高抗体的血清半衰期，可将补救受体结合表位纳入该抗体(尤其是抗体片段)，例如如美国专利5,739,277中所述。如本文所用，术语“补救受体结合表位”是指IgG分子Fc区中负责增加包含该表位分子(例如IgG抗体)的体内血清半衰期的表位。
抗体变体
除了本文所述的抗PD-L1抗体以外，还包括可制备抗PD-L1抗体变体。可通过将合适的核苷酸变化引入编码DNA，和/或通过合成所需抗体或多肽来制备抗PD-L1抗体变体。本领域技术人员应理解氨基酸变化可改变抗PD-L1抗体的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数目或位置或改变膜锚定特性。本文所述抗PD-L1抗体中的变化可采用例如，用于保守和非保守突变的任何技术和指引(例如，如美国专利No.5,364,934中所述)来进行。改变可为编码抗体或多肽的一个或多个密码子的取代、缺失或插入，其使得氨基酸序列与天然抗体或多肽序列相比发生改变。可任选地，改变通过以任何其他氨基酸取代抗PD-L1抗体一个或多个结构域中的至少一个氨基酸发生。可如下获得确定哪个氨基酸残基可被插入、取代或缺失而不会对所需活性产生不利影响的指导：通过将抗PD-L1抗体的序列与同源已知蛋白质分子的序列进行比较，并使得高度同源结构域中进行的氨基酸序列改变数最少。氨基酸取代可由用具有类似结构和/或化学性质的另一氨基酸替换某一氨基酸所致，例如用丝氨酸替换亮氨酸，即保守氨基酸替换。插入或缺失可任选地为约1-5个氨基酸。可通过对在序列中的氨基酸进行系统化插入、缺失或取代并测试所得变体由全长或成熟天然序列所展示的活性来确定允许的改变。
本文提供了抗PD-L1抗体片段。与全长天然抗体或蛋白质相比，此类片段可例如：在N末端或C末端截短，或缺乏内部残基。某些片段可缺乏对于抗PD-L1抗体所需生物学活性而言非必需的氨基酸残基。
抗PD-L1抗体片段可通过多种常规技术中的任一种来制备。所需肽片段可化学合成。另一种方法涉及通过酶消化来产生抗体或多肽片段，例如通过用已知可在由特定氨基酸残基限定的位点处切割蛋白质的酶处理该蛋白质，或通过用合适的限制性酶消化DNA并分离所需片段。另一合适的技术涉及分离编码所需抗体或多肽片段的DNA片段，并通过聚合酶链式反应(PCR)对其进行扩增。限定DNA片段所需末端的寡核苷酸在PCR中用于5'和3'引物。优选抗PD-L1抗体片段与本文所述的全长抗PD-L1抗体均具有相同的至少一种生物和/或免疫活性。
在具体实施方式中，感兴趣的保守取代示于表4“优选取代”栏中。如果这些取代造成生物学活性变化，则引入表4中称为示例性取代的或如下文参考氨基酸类别进一步描述的更实质性变化，并筛选产物。
表4
通过选择残基产生抗PD-L1抗体功能或免疫特性上的实质改变，所选残基在维持以下方面的效果上差异显著：(a)取代区域中多肽骨架的结构，例如片层或螺旋构型，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或者(c)侧链体积。基于共同的侧链特性将天然产生的残基分组：
(1)疏水：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水：Cys、Ser、Thr；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；以及
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代将涉及这些类别之一的成员与另一类别交换。也可将此类取代的残基引入保守取代位点，或者更优选引入剩余(非保守)位点。
改变可采用本领域已知的方法进行，例如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描以及PCR诱变。定点诱变(Carter等，Nucl.Acids Res.,13:4331(1986)；Zoller等，Nucl.Acids Res.,10:6487(1987))、盒式诱变(Wells等，Gene,34:315(1985))、限制性选择诱变(Wells等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA,317:415(1986))或其他已知技术可在克隆的DNA上进行，以产生抗PD-L1抗体变体DNA。
扫描氨基酸分析也可用于鉴别沿连续序列的一个或多个氨基酸。在优选的扫描氨基酸中，其为相对较小的中性氨基酸。此类氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。在该组中，丙氨酸通常是优选的扫描氨基酸，这是由于其消除了β-碳上方的侧链且不易改变变体主链构象(Cunningham和Wells,Science,244:1081-1085(1989))。丙氨酸之所以通常优选的另一原因是其为最常见的氨基酸。此外，其在埋藏和暴露位置都频繁出现(Creighton,The Proteins,(W.H.Freeman&Co.,N.Y.)；Chothia,J.Mol.Biol.,150:1(1976))。如果丙氨酸取代不能获得适量的变体，可采用等排(isoteric)氨基酸。
也可对不涉及保持抗PD-L1抗体适当构象的任何半胱氨酸残基进行取代，通常用丝氨酸取代之，以改善分子的氧化稳定性并防止异常交联。相反，可将一个或多个半胱氨酸键加入抗PD-L1抗体以改善其稳定性(尤其是在抗体为抗体片段(如Fv片段)的情况下)。
一类尤为优选的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个超变区残基。通常，与产生变体的亲本抗体相比，选择用于进一步开发的所得变体具有改善的生物学性质。产生此类取代变体的一种常规方法涉及采用噬菌体展示的亲和成熟。简而言之，使数个超变区位点(如，6-7个位点)突变以在各位点上产生所有可能的氨基酸取代。如此产生的抗体变体以单价方式由丝状噬菌体颗粒展示为包装在各颗粒内的与M13基因III产物的融合物。然后，如本文所述筛选噬菌体展示变体的生物学活性(如结合亲和力)。为了鉴别用于修饰的候选超变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴别对抗原结合起到重要作用的超变区残基。可选地或补充地，抗原-抗体复合物的晶体结构分析可有利于鉴定抗体和PD-L1多肽之间的接触点。此类接触残基和相邻残基是根据本发明所提供技术进行取代的候选残基。一旦产生此类变体，如本文所述对变体组进行筛选，可选择出在一个或多个相关测试中显示优异性能的抗体用于进一步开发。
用多种本领域已知方法制备编码抗PD-L1抗体的氨基酸序列变体的核酸分子。这些方法包括但不限于：从天然来源(在天然氨基酸序列变体的情况下)分离，或通过寡核苷酸介导(或定点)诱变、PCR诱变和盒式诱变先前制备的变体或非变体形式抗PD-L1抗体来制备。
抗体修饰
抗PD-L1抗体的共价修饰包括在本发明范围内。一类共价修饰包括：使抗PD-L1抗体的靶标氨基酸残基与有机衍生剂反应，该有机衍生剂能够与抗PD-L1抗体的所选侧链或N末端或C末端残基反应。用双功能剂进行衍生可用于例如使抗PD-L1抗体与用于纯化抗PD-L1抗体的方法中的水不溶性支持基质或表面交联，或反之亦然。常用的交联剂包括，例如，1,1-二(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如与4-叠氮水杨酸的酯、同双功能亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺酯，如3,3′-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、和双功能马来酰亚胺，如双-N-马来酰亚胺-1,8-辛烷，以及诸如甲基-3-[(对-叠氮苯基)二硫]丙亚酰胺的试剂。
其它修饰包括：谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基脱酰胺为相应的谷氨酰和天冬酰胺残基，脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，《蛋白质：结构和分子特性》(Proteins:Structure and Molecular Properties)，圣弗朗西斯科的WHF公司(W.H.Freeman andCo.，San Francisco)，第79-86页(1983))，N末端胺的乙酰化和C-末端羧基的酰胺化。
包括在本发明范围内的另一类抗PD-L1抗体共价修饰包括改变该抗体或多肽的天然糖基化模式。“改变天然糖基化模式”就本文目的而言意在指缺失天然序列抗PD-L1抗体中存在的一种或多种碳水化合物部分(通过移除潜在的糖基化位点或通过用化学和/或酶方法去除糖基化)，和/或添加天然序列抗PD-L1抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。另外，该短语包括天然蛋白糖基化中的定性变化，涉及所存在的各种碳水化合物部分的性质和比例的变化。
抗体和其他多肽的糖基化通常为N-连接或O-连接。N-连接指碳水化合物部分附连至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X为脯氨酸以外的任意氨基酸，是酶促连接碳水化合物部分与天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中任意这些三肽序列的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附连到羟基氨基酸，最常见是丝氨酸或苏氨酸，虽然也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
添加糖基化位点到抗PD-L1抗体可很方便地通过改变氨基酸序列使其含有一个或多个上述三肽序列(用于N-连接糖基化位点)而实现。也可通过向起始抗PD-L1抗体序列添加、取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行改变(用于O-连接的糖基化位点)。可任选地通过DNA水平的变化来改变抗PD-L1抗体氨基酸序列，具体为通过在预选碱基处使编码抗PD-L1抗体的DNA突变来产生将翻译成所需氨基酸的密码子。
另一种增加抗PD-L1抗体上碳水化合物部分数量的方式是通过将糖苷化学或酶促偶联至多肽。这些方法描述于例如1987年9月11日公开的WO 87/05330以及Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，第259-306页(1981)。
可通过化学或酶法、或通过突变取代编码用作糖基化靶标的氨基酸残基的密码子来去除存在于抗PD-L1抗体上的碳水化合物部分。化学去糖基化技术是本领域已知的，且描述于例如Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.,259:52(1987)和Edge等，Anal.Biochem.,118:131(1981)。多肽上碳水化合物部分的酶促切割可采用各种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现，如Thotakura等，Meth.Enzymol.138:350(1987)所述。
免疫偶联物
本发明的方面包括免疫偶联物(也可互换称为“抗体-药物偶联物”或“ADC”)，所述免疫偶联物包含抗体(如本文所述)，其偶联于细胞毒剂，如化疗剂、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性偶联物)。毒素的非限制性例子包括WO 2014144871和美国专利No.8,466,260中所描述的那些，以上专利的公开内容通过引用以其全文纳入本文。根据本发明实施方式的免疫偶联物或“ADC”可为如下式I所示，其中抗体通过可任选的接头(L)偶联于(即共价附连于)一个或多个药物部分(D)ADC可包括硫代Mab药物偶联物(“TDC”)。
Ab-(L-D)p I
因此，抗体可直接或通过接头偶联于药物。在式I中，p是药物部分数量的平均数/个抗体，其范围可为例如从约1～约20个药物部分/个抗体，且在某些实施方式中，可为例如从1～约8个药物部分/个抗体。本发明的方面包括组合物，其包含式I所示抗体-药物化合物的混合物，其中每个抗体平均药物加载量为约2～约5，或约3～约4。
接头可包括一个或多个接头组分。示例性接头组分包括美国专利No.8,466,260中所描述的那些，其公开的内容通过引用全文纳入本文。接头组分包括延伸单元、间隔单元和氨基酸单元，可通过本领域中已知的方法合成接头组分，例如如美国申请2005/0238649 A1所述的那些方法，其公开的内容通过引用全文纳入本文。接头的其他非限制性例子包括WO2015095953中所公开的那些，其公开的内容通过引用全文纳入本文。
含有美登木素生物碱的免疫偶联物、其制备方法以及其治疗应用公开于例如Erickson等，(2006)Cancer Res.66(8):4426-4433；美国专利号5,208,020、5,416,064、美国申请2005/0276812 A1和欧洲专利号EP 0 425 235 B1，其公开内容通过引用明确纳入本文。
在一些实施方式中，免疫偶联物包含的抗体偶联于尾海兔素或尾海兔素肽类似物或衍生物，例如奥瑞他汀(美国专利No.5,635,483和5,780,588)，其公开的内容通过引用全文纳入本文。
在一些实施方式中，免疫偶联物包含偶联于一个或多个卡奇霉素分子的抗体。关于卡奇霉素家族偶联物的制备，参见美国专利No.5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001,5,877,296(都属于美国氰氨公司(AmericanCyanamid Company))，其公开的内容通过引用全文纳入本文。
可与抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括：BCNU、链脲霉素、长春新碱和5-氟尿嘧啶、统称为LL-E33288复合物的一类试剂(描述于美国专利No.5,053,394和5,770,710中)、以及埃斯波霉素(esperamicins，描述于美国专利No.5,877,296)，其公开的内容通过引用全文纳入本文。
药物制剂
本发明的抗PD-L1组合物(例如如本文所述的抗PD-L1抗体、抗PD-L1抗体的抗原结合片段或ADC)可通过适用于待治疗病症的任何途径给药。通常，给药在胃肠道外完成，即通过灌注、皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和/或硬膜外给药。
在一个实施方式中，组合物通过静脉注射给药。通过灌注给予的剂量为约1μg/m2～约10,000μg/m2每剂，通常每周1剂，共给药1、2、3或4剂。在一些实施方式中，剂量范围为约1μg/m2～约1,000μg/m2，约1μg/m2～约800μg/m2，约1μg/m2～约600μg/m2，约1μg/m2～约400μg/m2，约1μg/m2～约200μg/m2，或约1μg/m2～约100μg/m2。在一些实施方式中，剂量范围为约10μg/m2～约500μg/m2，约10μg/m2～约300μg/m2，或约10μg/m2～约200μg/m2。
在一些实施方式中，每天一次、每周一次、每周多次但频率不高于每天一次、每月多次但频率不高于每天一次、每月多次但频率不高于每周一次、每月一次、隔月一次、三个月一次、六个月一次、每年一次或间歇性地给予一剂以缓解或减轻疾病症状。可以任何所述间隔持续给药直至肿瘤或被治疗癌症的症状缓解。可在实现症状缓解或减轻后继续给药，其中通过该继续给药延长该缓解或减轻。
在一个方面中，本发明提供了药物制剂，其包含至少一种本发明的抗PD-L1组合物。在一个实施方式中，药物制剂包含：(1)本发明的抗PD-L1组合物，以及(2)药学上可接受的运载体。
按照本发明使用的包含抗PD-L1抗体的治疗性制剂通过如下方式制备保存：将具有所需纯度的抗体与可选的药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)第16版，Osol，A.编，(1980))混合，制成冻干制剂或水性溶液的形式。在所用剂量和浓度下，可接受的运载体、赋形剂或稳定剂对接受者无毒，包括：缓冲剂，如醋酸盐、Tris、磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸缓冲剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；等张剂，如海藻糖和氯化钠；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；表面活性剂，如聚山梨醇酯；形成盐的抗衡离子，如钠；金属络合物(如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂，如 或聚乙二醇(PEG)。用于体内给药的药物制剂一般为无菌的。这可通过无菌滤膜过滤容易地实现。
活性成分还可包入微胶囊中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或界面聚合制备，例如分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，或可包入胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或包入巨乳液(macroemulsion)。这类技术可参见《雷明顿药物科学》第16版，Osol,A.编(1980)。
可制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含有抗PD-L1组合物的固体疏水性聚合物的半渗透基质，该基质是成型制品形式，例如膜或微胶囊。缓释基质的例子包括：聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚丙交酯(美国专利号3,773,919)，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物释放分子的时间能够超过100天，某些水凝胶释放蛋白质的时间则较短。包裹的免疫球蛋白留存于体内的时间更长，但它们可能因在37℃接触水分而变性或聚集，导致生物学活性丧失以及免疫原型可能改变。取决于相关的机制，可设计合理方案实现稳定化。例如，如果发现聚集机制是通过硫代基(thio-)-二硫键互换形成的分子间S-S键，可以通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制水分含量、使用合适添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现稳定化。
抗PD-L1组合物可配制成适于递送到靶标细胞/组织的任何形式。例如，抗体可配制为免疫脂质体。“脂质体”是由不同类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊，它可用于向人递送药物。脂质体的组分通常排列成双层形式，类似于生物膜的脂质排列。可通过本领域已知方法制备含有抗体的脂质体，这些方法描述于例如Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82:3688(1985)；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77:4030(1980)；美国专利号4,485,045和4,544,545；以及公开于1997年10月的WO97/38731。美国专利号5,013,556中公开了循环时间延长的脂质体。
可通过反相蒸发方法，利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生特别有用的脂质体。使脂质体通过孔隙大小确定的滤器挤出，以得到具有所需直径的脂质体。可以如Martin等，J.Biol.Chem.,257:286-288(1982)所述，通过二硫互换反应将本发明抗体的Fab'片段偶联于脂质体。脂质体内可任选地包含化疗剂。参见Gabizon等，J.National Cancer Inst.,81(19)：1484(1989)。
用于体内给药的制剂必须是无菌的。这可通过无菌滤膜过滤容易地实现。
VI.制品和试剂盒
本发明的方面包括制品，其包含用于治疗、预防和/或诊断由PD-L1介导的疾病或病症(例如表达PD-L1的癌症)的物质。制品可包括容器和位于容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括例如，瓶、小瓶和注射器等。该容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。所述容器装载有效于治疗、预防和/或诊断所述疾病或病症的组合物，并且可具有无菌进入端口(例如，所述容器可以是具有皮下注射针可刺穿塞子的静脉输液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗PD-L1组合物。标签或包装插页指示该组合物用于治疗该疾病或病症。标签或包装插页还包含指导给予患者抗体组合物的说明书。此外，该制品还可包括第二容器，该容器中含有药学上可接受的缓冲剂，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格斯溶液和/或右旋糖溶液。其还可以包括从商业和用户的观点所需的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
还提供了用于各种目的的试剂盒，例如用于PD-L1表达细胞杀伤测试，或用于从细胞纯化或免疫沉淀PD-L1多肽。为了分离和纯化PD-L1多肽，试剂盒可包含与微珠(例如琼脂糖微珠)连接的抗PD-L1抗体。可提供包含抗体的试剂盒以用于PD-L1多肽的体外检测和定量，例如用于ELISA或Western印迹法中。与制品相同，试剂盒可包括容器和位于容器上或与容器相关的标签或包装插页。容器容纳包含至少一种本发明抗PD-L1抗体、或其抗原结合片段的组合物。也可包括其他容器以容纳例如稀释剂、缓冲剂和/或对照抗体。标签或包装插页可提供对于组合物的描述以及指导体外或检测应用的说明。
使用方法
本发明的方面包括方法，所述方法使用如本文所述的一种或多种抗PD-L1组合物(例如，抗PD-L1抗体、抗PD-L1抗体的抗原结合片段或ADC)来治疗、预防和/或诊断至少部分由PD-L1介导(例如通过PD-1和PD-L1间的相互作用)的疾病或病症，包括但不限于治疗各种癌症和免疫疾病。使用的非限制性例子在下文中进一步详述。
A.治疗方法
本发明的抗PD-L1组合物可用于例如体外、离体和体内治疗方法中。在一个方面中，本发明提供了抑制PD-L1蛋白和一种或多种受体或配体(例如PD-1蛋白)的相互作用的方法。在一个方面中，本发明提供了体内或体外抑制细胞生长或增殖的方法，所述方法包括在允许组合物中的抗PD-L1抗体、或其抗原结合片段与PD-L1结合的条件下，使细胞与抗PD-L1组合物接触。“抑制细胞生长或增殖”是指使细胞生长或增殖降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或高达100％，且包括诱导细胞死亡。在某些实施方式中，细胞是肿瘤细胞。根据本发明实施方式的抗PD-L1组合物可：(i)抑制PD-L1蛋白与PD-L1蛋白能够结合的受体或配体(例如PD-1蛋白)的相互作用；(ii)体内抑制肿瘤转移；(iii)体内抑制肿瘤生长；(iv)体内减小肿瘤尺寸；(v)显示对表达PD-L1的肿瘤细胞的体内细胞毒性活性；或(vi)显示对表达PD-L1的肿瘤细胞的体内细胞生长抑制活性。在某些方面中，抗PD-L1组合物能够结合PD-L1蛋白，从而抑制PD-1蛋白的一种或多种功能(例如抑制PD-L1蛋白的一种或多种免疫抑制功能)。因此，在一些方面中，该应用治疗方法涉及使PD-L1蛋白与本文所述的抗PD-L1抗体或抗原结合片段接触，从而抑制PD-1蛋白的一种或多种功能(例如一种或多种免疫抑制功能)。
本发明的方面包括通过使PD-L1蛋白与本文所述的抗PD-L1抗体接触来抑制PD-1蛋白与PD-L1蛋白间相互作用的方法。在一些实施方式中，该方法在体内通过给予需要治疗的对象有效量的抗PD-L1抗体进行，从而抑制该对象中PD-1蛋白与PD-L1蛋白间的相互作用。
在一个方面中，本发明的抗PD-L1组合物用于治疗或预防细胞增殖失调，例如癌症。癌症类型的示例包括但不限于：急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、胆道癌、乳腺癌(如三阴性乳腺癌、激素受体阴性乳腺癌)、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、结直肠癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头颈癌、鼻咽癌、霍奇金淋巴瘤、肺癌(如非小细胞肺癌)、甲状腺髓样癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肾癌、卵巢癌、胰腺癌、胶质瘤、黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、膀胱癌、黑色素瘤和胶质母细胞瘤。
在一些方面中，癌症是上皮癌。适合用本发明抗PD-L1组合物治疗的上皮癌症包括但不限于：非小细胞肺癌、尿道膀胱癌、肾癌、肝癌、结肠直肠癌、卵巢癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌(例如激素受体阴性乳腺癌或三阴性乳腺癌)和鼻咽癌。
在一些方面中，癌症是血液癌症。适合用本发明抗PD-L1组合物治疗的血液癌症包括但不限于：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、急性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。
在一些方面中，癌症是黑素瘤或成胶质细胞瘤。
在一个优选实施方式中，癌症是黑素瘤。在一个优选实施方式中，癌症是肾癌。在一个优选实施方式中，癌症是膀胱癌。在一个优选实施方式中，癌症是肺癌。在一个优选实施方式中，癌症是非小细胞肺癌。在一个优选实施方式中，癌症是小细胞肺癌。
在一个方面中，本发明提供了治疗细胞增殖异常的方法，包括给予个体有效量的抗PD-L1组合物。在一些实施方式中，可将抗PD-L1组合物给予表达所述抗体可交叉反应的PD-L1的非人哺乳动物(例如灵长类、猪、大鼠或小鼠)以用于兽医学目的或作为人疾病的动物模型。就后者而言，此类动物模型可用于评估本发明抗PD-L1组合物的疗效(例如测试给药剂量和时程)。
可通过任何合适的途径给予本发明的抗PD-L1组合物(以及任何其他治疗剂或佐剂)，这些途径包括：胃肠道外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内给药，以及如果需要局部治疗，病变内给药。胃肠道输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。此外，所述抗PD-L1组合物能通过脉冲输注、尤其是采用组合物的递减剂量来合适地给予。可通过任何合适的途径(例如注射，如静脉内或皮下注射)进行定量给药，这部分取决于给药是急促还是缓慢。
根据本发明实施方式的抗PD-L1组合物通常以符合良好药物实践的方式配制、定剂量和给药。这种情况下，考虑的因素包括治疗的具体病症、治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、所述病症的起因、试剂的递送位点、给药方法、给药安排，以及医学从业人员已知的其它因素。
筛选方法
本发明的方面包括确定怀疑含PD-L1多肽的样品中PD-L1多肽的存在的方法，其中所述方法包括使该样品与结合PD-L1多肽的抗体接触，并测定该抗体与样品中PD-L1多肽的结合，其中该结合的存在指示样品中PD-L1多肽的存在。可任选地，样品可包含怀疑表达PD-L1多肽的细胞(例如癌细胞)。用于该方法的抗体可任选地被可检测标记、附连到固体支持物等。
本发明的另一实施方式涉及诊断哺乳动物中存在肿瘤的方法，其中，所述方法包括：(a)使包含获自该哺乳动物的细胞的测试样品与结合PD-L1多肽的抗体接触，以及(b)检测该抗体与测试样品中PD-L1多肽间复合物的形成，其中形成该复合物指示该哺乳动物中存在表达PD-L1的肿瘤。可任选地，该抗体被可检测标记、附连到固体支持物等，和/或测试样品获自怀疑患有癌性肿瘤的个体。抗体检测可通过本文所述的不同技术完成，例如IHC和PET成像。
活性试验
根据本发明实施方式的抗PD-L1组合物可用于本领域已知的各种试验中。在一个方面，抗PD-L1组合物可用于生物学活性试验中。生物学活性试验可测定例如抗PD-L1组合物抑制细胞生长或增殖的能力(例如“细胞杀伤”活性)，或诱导细胞死亡(包括程序化细胞死亡(凋亡))的能力。
在某些实施方式中，抗PD-L1组合物可用于体外试验中以测定细胞生长或增殖抑制作用。细胞生长或增殖抑制试验是本领域中熟知的。某些对于细胞增殖的试验(例如本文所述的“细胞杀伤”试验)测定细胞活力。此类试验之一是CellTiter-GloTM发光细胞活力试验，可市售购自Promega公司(威斯康星州麦迪逊)。该试验基于对所存在ATP(指示代谢活性细胞)的定量来测定存活细胞数。参见Crouch等，(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88,美国专利No.6602677。该试验以96孔或384孔形式进行，使其适合于自动化高通量筛选(HTS)。参见Cree等，(1995)AntiCancer Drugs 6:398-404。试验过程涉及将单种试剂(试剂)直接加入培养的细胞。这导致细胞裂解并通过荧光素酶反应产生发光信号。该发光信号与存在的APT量成比例，而ATP量则与培养物中存在的存活细胞数直接成比例。数据可以通过光度计或CCD相机成像设备进行记录。发光输出表示为相对光单位(RLU)。
另一种测定细胞增殖的试验是“MTT”试验，其为测定3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑鎓通过线粒体还原酶氧化为甲的一种比色试验。与CellTiter-GloTM试验一样，该试验指示细胞培养物中存在的代谢活性细胞数。参见例如Mosmann(1983)J.Immunol.Meth.65:55-63和Zhang等，(2005)Cancer Res.65:3877-3882.
在一个方面中，抗PD-L1组合物可用于试验中以测定其体外诱导细胞死亡的能力。诱导细胞死亡的试验是本领域中熟知的。在一些实施方式中，此类试验测定例如由碘化丙啶(PI)、台盼蓝(参见Moore等.(1995)Cytotechnology,17:1-11)或7AAD摄入指示的膜完整性丧失。在示例性PI摄入试验中，细胞培养于补充有10％热灭活FBS(Hyclone公司)和2mML-谷氨酰胺的Dulbecco改良型伊格尔培养基(D-MEM):翰氏F-12(50:50)培养基中。由此，试验在在不存在补体和免疫效应细胞的情况下进行。以3×106个细胞每培养皿的密度将细胞接种在100×20mm的培养皿中，使其贴壁过夜。去除培养基，仅用新鲜培养基替换或用包含各种浓度抗PD-L1组合物的培养基替换。孵育细胞3天。处理后，用PBS洗涤单层，并用胰蛋白酶消化分离。然后，在4℃以1200rpm离心细胞5分钟，在3ml冷Ca2+结合缓冲液(10mM Hepes,pH 7.4,140mM NaCl,2.5mM CaCl2)中重悬沉淀，并等分入35mm滤网覆盖的12×75mm管中(1ml/管，3管/处理组)以去除细胞团块。然后在管中加入PI(10μg/ml)。用FACSCANTM流式细胞仪和FACSCONVERTTM CellQuest软件(Becton Dickinson公司)分析样品。由此通过PI摄入鉴定出诱导统计学上显著水平细胞死亡的抗PD-L1组合物。
在一个方面中，可测试抗PD-L1组合物体外诱导凋亡(程序化细胞死亡)的能力。抗体诱导凋亡的示例性试验是膜联蛋白结合试验。在一个示例性膜联蛋白结合试验中，培养细胞并将其接种在培养皿中(如前段落中所述)。去除培养基，并仅用新鲜培养基替换或用包含0.001～10μg/ml抗体的培养基替换。孵育3天后，用PBS洗涤单层，并用胰蛋白酶消化分离。然后离心细胞，在Ca2+结合缓冲剂中重悬，并等分入管中(如前段所述)。然后在管中加入标记的膜联蛋白(例如膜联蛋白V-FITC)(1μg/ml)。用FACSCANTM流式细胞仪和FACSCONVERTTM CellQuest软件(BD Biosciences公司)分析样品。由此，鉴定出相对于对照诱导统计学上显著水平膜联蛋白结合的抗体。抗体诱导凋亡的另一示例性试验是组蛋白DNA ELISA比色试验，其用于测试基因座DNA的核小体内降解。该试验可采用例如细胞死亡检测ELISA试剂盒(罗氏公司，加州帕洛阿尔托(Roche,Palo Alto,CA))。
用于任何上述体外试验的细胞包括天然表达PD-L1的细胞或细胞系或经工程化改造表达PD-L1的细胞或细胞系。此类细胞包括表达PD-L1或相对于同一组织来源中的正常细胞过表达PD-L1的肿瘤细胞。此类细胞还包括表达PD-L1的细胞系(包括肿瘤细胞系)以及正常不表达PD-L1但经编码PD-L1的核酸转染的细胞系。
在一个方面中，测试抗PD-L1组合物体内抑制细胞生长或增殖的能力。在某些实施方式中，测试抗PD-L1组合物体内抑制肿瘤细胞生长的能力。在此类测试中可采用体内模型系统，例如异种移植模型。在示例性的异种移植系统中，将人肿瘤细胞导入适当的免疫功能不全非人动物(例如SCID小鼠)中。将本发明的抗PD-L1组合物给予该动物。测定抗PD-L1组合物抑制或减少肿瘤生长的能力。在上述异种移植系统的某些实施方式中，人肿瘤细胞为来自人患者的肿瘤细胞。在某些实施方式中，通过皮下注射或通过抑制入适当部位(例如乳腺脂肪垫)，将人肿瘤细胞导入合适的免疫功能不全非人动物中。
结合试验和其他试验
本发明的方面包括通过使PD-L1蛋白与本文所述的抗PD-L1抗体接触来抑制PD-1蛋白与PD-L1蛋白间相互作用的方法。在一些实施方式中，该方法在体外进行。
在一个方面中，测试抗PD-L1抗体的抗原结合活性。例如，在某些实施方式中，测试抗PD-L1抗体与表达于细胞(例如肿瘤细胞)表面的PD-L1的结合能力。FACS试验可用于该测试。
在一个方面，竞争性试验可用于鉴别与本文所述单克隆抗体竞争性结合PD-L1的一种或多种抗体(例如，一种或多种单克隆抗体)。在某些实施方式中，该竞争性抗体所结合的表位(例如线性或构象表位)与本文所述单克隆抗体所结合的表位相同。示例性的竞争性试验包括但不限于：诸如Harlow和Lane(1988)，《抗体：实验室手册》(Antibodies:ALaboratory Manual，第14章(冷泉港实验室，冷泉港，NY)中所提供的那些常规试验。Morris(1996)《分子生物学方法》第66卷(Methods in Molecular Biology vol.66)中的“表位定位方法”(“Epitope Mapping Protocols”)(新泽西州托托瓦的胡马纳出版社，HumanaPress,Totowa,NJ)中提供了抗体所结合表位定位示例性方法的详细描述。如果两种抗体各自阻断对方的结合达到50％或以上，则认为这两种抗体结合相同的表位。
在一个示例性的竞争性试验中，将固定化的PD-L1孵育溶液中，所述溶液包含：结合PD-L1的第一标记抗体(例如本文所述的单克隆抗体)，以及待测试其与第一抗体竞争性结合PD-L1的能力的未标记第二抗体。第二抗体可存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化PD-L1孵育在包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中。在允许第一抗体与PD-L1结合的条件下孵育后，去除过量未结合抗体，并测定与固定化PD-L1相关的标记量。如果测试样品中固定化PD-L1相关的标记量相对于对照样品发生实质性的减少，则指示第二抗体与第一抗体竞争性结合PD-L1。在某些实施方式中，固定化PD-L1存在于细胞表面上或存在于膜制备物中，该膜制备物获自其表面上表达PD-L1的细胞。
在一个方面中，纯化的抗PD-L1抗体可通过一系列试验进一步表征，这些试验包括但不限于：N末端测序、氨基酸分析、非变性尺寸排阻高压液相色谱(HPOL)、质谱、离子交换色谱和木瓜蛋白酶消化。
提供以下实施例仅用于说明目的，并非旨在以任何方式限制本发明的范围。尽管在本公开中已经提供了若干实施方式，但应该理解，在不脱离本公开的精神或范围的情况下，所公开的系统和方法可以体现为许多其他特定形式。当前的实施例被认为是说明性的而不是限制性的，并且本发明的意图不限于这里给出的细节。本领域技术人员可以确定各种变化，替代和改变的例子，并且可以在不脱离本文公开的精神和范围的情况下做出变化，替代和改变。
本文所引用的所有文献通过引用明确纳入本文。
实施例
实施例1:鼠杂交瘤的产生和筛选
1.1免疫方案和计划
将包含i)和ii)的胞外部分的重组融合蛋白用作免疫方案中的抗原：i)带有HIS标签的人PD-L1(Sino Bio公司，目录#10084-H084)和ii)带有HIS标签的食蟹猴(Cynomolgus)PD-L1(Sino Bio公司，目录#90251-C08H)。为了产生抗PD-L1全长人单克隆抗体，免疫并筛选了三种不同种系的小鼠。在第1、7、14、21、28和35天用蛋白质(人和食蟹猴PD-L1)交替(with alternating proteins(human and cyno PDL1))免疫Balb/C(3)、C57/Black 6(3)和Swiss Webster(3)小鼠六次。第一次免疫的剂量为50ug蛋白质，后续免疫剂量为25ug。将抗原和佐剂MagicMouse以50uL/部位皮下给药至左侧和右侧腹股沟淋巴结、左侧和右侧臂部淋巴结以及左侧和右侧轴淋巴结。对于全部9只小鼠，在第0天第一次免疫前取血(预采血)，在第42天评估取血评估抗体应答的血清效价。用ELISA(如下所述)筛选血清，将具有足够抗人PD-L1免疫球蛋白效价的小鼠用于融合。在处死小鼠并取脾脏的3天前，对其静脉注射重组人PD-L1进行增强免疫。
生产针对PD-L1的人单克隆抗体的杂交瘤的产生
根据标准方案，将分离自Swiss Webster小鼠的鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后基于抗原特异性抗体的产生筛选所得骨髓瘤。
采用PEG，将来自经免疫Swiss Webster小鼠的脾细胞的单细胞悬液与Sp2/0细胞(一种非分泌型小鼠骨髓瘤细胞系)融合。将约1×105个/孔的细胞接种于平底96孔无菌微量滴定板中，然后用1×HAT的完全DMEM-F12、10％FBS、谷氨酰胺(Glutamax)、丙酮酸钠、HEPES、非必需氨基酸和青霉素/链霉素(Penn/Strep)溶液选择2周。2周后，将细胞培养在HAT选择被HT替代的培养基中。然后用ELISA(如下所述)筛选各个孔的抗人PD-L1单克隆IgG和IgM抗体。将分泌抗体的骨髓瘤再次接种，并再次筛选以检查它们是否仍然为抗人PD-L1IgG或IgM阳性。然后通过有限稀释将抗人PD-L1抗体亚克隆。将稳定的克隆从HT培养基中转移到DMEM-F12+10％FBS+谷氨酰胺(Glutamax)+青霉素链霉素(Pen Strep)，并培养以产生少量用于进一步表征的抗体。还可在10％DMSO 90％FBS中冷冻杂交瘤。
1.3上清液中鼠IgG特异性人PD-L1抗体的检测
间接捕获ELISA：
在第一轮筛选中，采用间接ELISA方案以及血清或杂交瘤上清液的单一稀释液进行抗体生产小鼠血清或杂交瘤的检测。后续筛选采用小鼠血清或杂交瘤上清液的稀释液。ELISA的形式如流程图1中所示。
在4℃，用50uL山羊抗人IgG Fc的PBS溶液(1ug/mL，Southern Biotech公司，目录#2014-01)包被96孔高度结合蛋白质板过夜。用PBS 0.05％Tween20洗涤板3次，然后在纸巾上轻敲数次干燥。在室温下，用200uL1％牛奶封闭板。重复如上所述的洗涤和干燥步骤，在室温下于50uL的200ng/mL重组人B7-H1(PD-L1)Fc嵌合蛋白的1％牛奶溶液(R&D公司，目录#156-87-1000)中孵育板1小时。为了筛选特异性，用重组食蟹猴PD-L1Fc嵌合体(SinoBiological公司，目录#90251-C02H)、重组小鼠PD-L1Fc嵌合体(Sino Biologicals公司，目录#50010-M02H)或重组人PD-L2Fc嵌合体蛋白(Sino Biological公司，目录#10292-H02H)替换人PD-L1Fc嵌合体。如前所述洗涤并干燥板后，将阳性对照抗体(小鼠抗人PD-L1，29E.2A3，BioLegend公司，目录#329702)及其同种型对照(小鼠IgG2b k，BioLegend公司，目录#400302)在1％牛奶中3倍系列稀释，起始于3ug/mL至0.1ng/mL，将50uL滴定的抗体加入到其在所有板上的相应孔中。杂交瘤上清液各自在1％牛奶中1:3稀释。将50μL上清液加入到相应的孔中。在室温下孵育板1小时。如前所述洗涤并干燥板，然后在室温下与50uL的1:5000山羊抗小鼠IgG Fc与辣根过氧化酶(HRP)的偶联物一起孵育1小时(Jackson ImmunoResearch公司，目录#115-035-071)。重复洗涤和干燥步骤后，用50uL TMB底物(BDOptiIEIA公司，目录#555214)使板显色20～30分钟。用50uL 2N H2SO4终止反应，在Spectramax Gemini分光光度计上读取450nm处的吸光度。图3分图A显示了系列稀释杂交瘤上清液的实施例数据。
1.4抗体与表达人PD-L1细胞结合的检测
通过流式细胞术检测结合反应性：
将在其表面表达人PD-L1的细胞系，如Granta(DSMZ ACC#342)或Promega 187103细胞(Promega公司，目录#187106)用于如图2所示的流式细胞术中以测定杂交瘤上清液中抗人PD-L1单克隆抗体的反应性和特异性。
在染色前一天，给细胞补充新鲜培养基。染色当天，用HyQtase酶(GE Health&LifeSciences公司，目录#SV30030.01)移出细胞。吸出所有培养基之后，使用10mL的不含钙和镁的PBS漂洗细胞。吸出PBS后，在37℃用5ml HyQtase酶孵育细胞5分钟。然后轻拍培养瓶移出细胞以产生单细胞悬液。通过加入等量的培养基中和HyQtase酶，用台盼蓝排除法在细胞计数器(伯乐公司(BioRad)TC20)上确定活细胞计数。将细胞密度调整到1.5×10e4个细胞/60μL FACS 2％FBS。
浓缩染色[3块(杂交瘤上清液板)至1块(PD-L1表达细胞板)]
将60μL的FACS 2％FBS缓冲液(BD法敏进公司(BD Pharmingen)，目录号554656)中的细胞以1.5×10^4/孔加入“V型”底96孔板。用12孔多通道移液器将10uL上清液从杂交瘤板的各孔中加入到对应孔的细胞中。用3块杂交瘤上清液板重复该操作，将3个杂交瘤孔中的上清液合并到各个含细胞的孔中。在细胞中以1ug/mL加入阳性对照29E.2A3(BioLegend公司，目录#329702)和IgG2b k同种型对照(BioLegend公司，目录#400302)，并与对照孔同样命名。在4℃，孵育该板30分钟。用150μL FACS 2％FBS缓冲液洗涤细胞后，将板以1200rpm离心(Sorvall Legend XIR离心机)5分钟，轻柔吸取上清液而不扰动细胞沉淀。通过在4℃用AF647山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch公司，目录#115-605-164)孵育细胞30分钟检测抗体结合。重复如上洗涤步骤，并且在60μL的包含1:100 7_AAD的FACS 2％FBS(BD法敏进公司，目录号68981E)中重悬细胞。在FACSCalibur(Becton Dickinson公司)上对各样品获得1000个样品事件，并且在流式细胞术平台上完成分析。将上清液中检测的结合与阳性和同种型对照相比较，标记阳性孔。
FACS阳性杂交瘤孔的反演(Deconvoluting)
将来自浓缩板/孔的各阳性孔去浓缩至个体板/孔，其中根据如上所述的方案，测试来从3块浓缩板的个体孔的杂交瘤上清液各自的Promega 187103细胞阳性染色。将该结合与同种型对照比较来识别产生抗PD-L1抗体的杂交瘤，将显示与PD-L1表达细胞高水平结合的ELISA阳性细胞用于下一轮筛选。图3分图B显示了杂交瘤上清液的FACS筛选实施例数据。
间接捕获ELISA：FACS阳性上清液的滴定
采用如前所述的间接ELISA方案进行第一轮杂交瘤阳性上清液的滴定，其中将上清液加入孔之前，用1％牛奶系列稀释上清液3倍。通过间接ELISA以已知浓度的市售29E.2A3抗体估算所选杂交瘤上清液中鼠抗体的浓度。然后测试阳性上清液在PD1/PD-L1阻断试验中的功能。
实施例2:在PD1/PD-L1阻断功能试验中测试FACS和ELISA阳性杂交瘤上清液
虽然如前所述的筛选试验能够鉴别可结合包被在板上或位于细胞表面作为抗原的PD-L1的克隆，我们想要开发的抗体还需要能够有效阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用。为了测试如前鉴定出的FACS和ELISA阳性抗体阻断该相互作用的能力，我们采用了市售PD-1/PD-L1阻断试验(Promega公司)和基于发光的读数(图4)。
简而言之，在37℃解冻表面表达PD-L1的冷冻CHO细胞(Promega CS187103)，重悬在补充有10％胎牛血清的DMEM中(Invitrogen公司)。将含有7500个细胞的培养基加入到384孔板的孔中，在37℃、5％CO2中培养16小时。用含抗体的10uL RPMI+2％FBS替换培养基。将含10,000个工程化改造Jurkat细胞(Promega CS187105)的另外10uL培养基加入孔中，在37℃、5％CO2中孵育5小时。然后，将细胞与包含荧光素(Promega公司，Cell Titer Glo)的20μL裂解缓冲液混合以测定荧光素酶报告物活性。光输出通过EnVision酶标仪检测。EC50采用Prism软件通过4参数曲线拟合来确定。
图5分图A中显示了阻断试验中筛选杂交瘤上清液的实施例数据。图5分图B中总结了杂交瘤筛选策略和结果。总共筛选了约3000个杂交瘤上清液，得到了121个ELISA阳性克隆。在这些克隆中，有9个是FACS阳性克隆，而只有一个(3C5)在生物测试中显示了功能活性。将该克隆进一步亚克隆，将其亚克隆之一3C5-2G12用于进行下一代测序以鉴别如下所述的VH和VL序列。
实施例3:用下一代测序(NGS)方案对杂交瘤测序
典型的杂交瘤具有表达的多个重链和轻链，其中的一个或多个可为负责功能试验中所观察到活性的序列。应用下一代测序(NGS)方法从ELISA、FACS和阻断试验中鉴定出的杂交瘤中鉴定序列。简而言之，从杂交瘤中提取RNA(1×106个细胞)，采用RACE-PCR方案产生单链DNA。为了扩增重链和轻链，采用了针对小鼠IgG和小鼠IgK区的简并引物。引物设计为覆盖可变区的FR1至FR4。给样品标记条形码，并用MiSEq NGS测序仪(Illumina公司)进行末端配对测序。采用在Panoply Bio公司(加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA))定制的软件分析所得Fastq文件。针对重叠配对末端比对序列，采用小鼠框架区识别CDR。基于各序列的频度组合数据。在该序列组装过程中会遇到许多截短，因此所选用于克隆和进一步测试的序列基于如下标准：
1)存在所有3个CDR
2)在序列家族中多次出现
3)CDR最高频率
4)在N末端无明显截短
在杂交瘤中，最主要的克隆貌似具有最高频率的序列。通常，也存在与靶标的结合同样良好或更佳或欠佳的其他克隆，但是它们的表达水平并不同样高或在培养物中的生长并不同样好。在获自轻链的序列家族中，基于上述标准有一条序列较所有其他序列脱颖而出。如图6分图A所示，有一条序列出现了24次，并如下所示。
3C5-2G12轻链序列：
然而，如图6分图B所示，获自重链测序的NGS数据显示多个序列具有高频率。因此，采用进一步筛选来确定哪些序列存在编码由该杂交瘤产生的活性抗体的最高可能性。例如，该组中最高频序列出现了47次，但具有大的N末端截短，且缺失了CDR1，因此不被考虑。相反，选择了具有所有三个CDR且在N末端没有截短的最高频序列用于测试。在该组序列中此序列出现19次，包含所有3个CDR，且似乎具有完整的N末端(类似于生殖细胞系)。
3C5-2G12重链序列：
实施例4:3C5-2G12IgG和IgM的生产和测试
1.生成具有设计的突变的DNA构建体
DNA构建体合成.所有具有设计的突变的DNA构建体均由商业供应商(金斯瑞(Genescript)，Lake Pharma公司)合成，两端具有相容的限制性位点，用于亚克隆到各自的表达载体中。
构建表达载体合成的DNA构建体以1μg/ml重悬于Tris-EDTA缓冲液中。对DNA(1μg)进行酶消化，并通过电泳将合成的基因与载体质粒DNA分离。通过标准分子生物学技术将消化的DNA连接到预消化的表达载体质粒DNA。将连接的DNA转化进入感受态细菌，并铺板于含有多重选择性抗生素的LB板上。挑取若干细菌集落，并通过标准分子生物学技术制备DNA制备物。通过测序验证制备的DNA。只有DNA序列与设计的DNA序列100％匹配的细菌克隆才被用于质粒DNA制备，随后用于细胞转染。
IgG和IgM重链和轻链背景下的3C5-2G12VH和VL序列如下所示。
3C5-2G12IgG1抗体HC：
3C5-2G12IgM抗体HC：
3C5-2G12IgG,IgM抗体LC：
3C5-2G12IgM+J抗体J-链序列：
合成对应于这些序列的DNA，并转染入HEK293细胞以产生蛋白质，然后采用特异于IgM的骆驼科抗体亲和基质纯化该蛋白质。如图7所示，J链能够纳入IgM，且具有相应J链的IgM五聚体形式明显不同于不具有J链的六聚体形式。
2.蛋白质表达、纯化和表征
a.转染将重链、轻链和J链DNA转染到CHO或HEK293细胞中。表达载体的DNA通常以1：1：1的比例与PEI混合，然后加入到CHO-S细胞中。根据已建立的技术用CHO-S细胞进行PEI转染(参见《生物技术和生物工程化》(Biotechnology and Bioengineering，第87卷，553-545页))。
b.免疫沉淀
i.捕获选择IgM(Capture Select IgM))(BAC，赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher))根据制造商的方案(GE生命科学公司(GE Life Sciences))，通过用CaptureSelect IgM亲和基质免疫沉淀来部分纯化来自转染的CHO细胞上清液的IgM蛋白。在室温下温育2小时后，通过离心将亲和基质与上清液分离。用PBS进一步洗涤基质3次，然后小心除去PBS。捕获的蛋白质通过与NuPage LDS蛋白质缓冲液(生命技术公司(Life Technology))一起孵育5分钟而从基质中洗脱下来。
c.凝胶电泳：
i非还原性SDS-PAGE：非还原性SDS PAGE根据大小分离天然IgM及其突变体形式。由同源二聚体重链和轻链组成的五聚体IgM产生约1,000,000分子量的蛋白质条带。在25℃下将NuPage LDS样品缓冲液(生命技术公司)加入到IgM蛋白样品中30分钟，然后加载到凝胶上。NativePage Novex 3-12％Bis-Tris凝胶(生命技术公司)与Novex Tris-乙酸盐SDS跑胶缓冲液(生命技术公司)一起使用。跑胶直至染料前沿到达凝胶底部。
ii.还原性SDS-PAGE：将NuPage LDS样品缓冲液(生命技术公司)和NuPage还原剂二硫苏糖醇(生命技术公司)加入到IgM蛋白样品中，加热至80℃持续10分钟，然后加载到NuPage Novex 4-12％Bis-Tris凝胶(生命技术公司)上。将NuPage MES SDS跑胶缓冲液(生命技术公司)用于凝胶电泳。跑胶直至染料前沿到达凝胶底部。电泳完成后，从设备中取出凝胶并用胶体蓝染色(生命技术公司)进行染色。
iii.Western印迹：在上述条件下跑丙烯酰胺凝胶，在20％乙醇溶液中洗涤10分钟，然后采用iBlot干印迹系统(英杰公司(Invitrogen))以20V进行10分钟将蛋白质转移至iBlot PVDF膜(英杰公司)。转膜后，PVDF膜采用2％牛血清白蛋白、0.05％吐温20封闭至少12小时。将Pierce J链抗体(赛默飞世尔科学公司)的1/500稀释物添加至该膜，孵育1小时，然后添加过氧化物酶-偶联的山羊抗兔IgG(杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoResearch))的1/5000稀释物，并使其避光孵育30分钟。最终，将Super Signal WestPico化学发光底物(赛默飞世尔科学公司)添加至印迹，并采用ChemiDoc-It HR410成像系统(UVP)或通过使该印迹在X光胶片上曝光来使所得信号可视化。
实施例5:3C5-2G12IgG和IgM的功能测试
如前所述，在37℃解冻表面表达PD-L1的冷冻CHO细胞(Promega CS187103)，重悬在补充有10％胎牛血清的DMEM中(Invitrogen公司)。将含有7,500个细胞的培养基加入到384孔板的孔中，在37℃、5％CO2中培养16小时。用含3C5-1G12或对照抗体的10uL RPMI+2％FBS替换培养基。将含10,000个工程化改造Jurkat细胞(Promega CS187105)的另外10uL培养基加入孔中，在37℃、5％CO2中孵育5小时。然后，将细胞与包含荧光素(Promega公司，Cell Titer Glo)的20μL裂解缓冲液混合以测定荧光素酶报告物活性。光输出通过EnVision酶标仪检测。EC50采用Prism软件通过4参数曲线拟合来确定。
图8示出了阻断试验中纯化的3C5-2G12抗体制剂测试的实施例数据。在该试验中，IgM和IgM+J形式显示高效力(61pM和96pM)，且高于IgG形式。
实施例6：3C5-2G12IgG和IgM的交叉反应性测试
通过在4℃孵育过夜，将重组人PD-L1Fc嵌合体(Sino Biological公司，目录#10084-H02H)、重组食蟹猴PD-L1Fc嵌合体(Sino Biological公司，目录#90251-C02H)、重组小鼠PD-L1Fc嵌合体(Sino Biologicals公司，目录#50010-M02H)和重组人PD-L2Fc嵌合体蛋白(Sino Biological公司，目录#10292-H02H)直接以1ug/mL包被到ELISA板上。用PBS0.05％Tween洗涤板3次，然后在纸巾上轻敲数次干燥。在室温下，用200uL1％牛奶封闭所有板1小时。如前所述洗涤和干燥板之后，3C5.2G12IgG、3C5.2G12IgM和3C5.2G12IgM+wtJ抗体各自以1:3稀释在1％牛奶中，起始于浓度3ug/mL，至0.1ng/mL。将50μL稀释的抗体加到所有板中对应的孔。将阳性对照抗体(小鼠抗人PD-L1，29E.2A3，BioLegend公司，目录#329702)及其同种型小鼠IgG2b k对照(BioLegend公司，目录#400302)在1％牛奶中3倍系列稀释，起始于3ug/mL至0.1ng/mL，将50uL滴定的抗体加入到其在相应板/孔。同样，如前所述滴定大鼠抗小鼠PD-L1(BioLegend公司，目录#124302)和大鼠IgG2b同种型(BioLegend公司，目录#400622)、抗人PD-L2(BioLegend公司，目录#345502)与小鼠IgG1同种型(BioLegend公司，目录#4011402)，并加入其相应的板/孔。在室温下孵育板1小时。如前所述洗涤并干燥板，然后在室温下将3C5.2G12与50uL的1:5000山羊抗人κ轻链抗体与辣根过氧化酶(HRP)的偶联物一起孵育1小时(Jackson Immuno Research公司，目录#115-035-071)。对于对照孔，如上所述稀释并孵育适当的二抗，即山羊抗小鼠HRP(Southern Biotech公司，目录#1033)和小鼠抗大鼠HRP(Southern Biotech公司，目录#3070-05)。重复洗涤和干燥步骤后，用50uL TMB底物(BD OptiIEIA公司，目录#555214)使板显色20～30分钟。用50uL 2N H2SO4终止反应，在Spectramax Gemini分光光度计上读取450nm处的吸光度。图9分图A、分图B和分图C示出系列稀释3C5.2G12的实施例数据。
实施例7：3C5-2G12IgG和IgM的人源化
以两种形式(IgG和IgM)进行3C5-2G12抗体的人源化。所产生用于测试的序列和组合如下所示。
h3C5H1-hIgG1：
h3C5H2-hIgG1：
h3C5H3-hIgG1：
h3C5H4-hIgG1：
h3C5L1-hκ：
h3C5L2-hκ：
采用如上所述的标准技术形成IgG形式的如下组合，并用蛋白A纯化。
h3C5H1-h3C5L1
h3C5H2-h3C5L2
h3C5H3-h3C5L2
h3C5H4-h3C5L2
在PD-L1阻断试验中对这些抗体各自的测试结果示于图10中。在人源化过程中的保守性改变均显示对于人源化抗体的阻断活性几乎没有影响。
实施例8：表位作图
肽表位作图如下进行：采用PEPSCANTM系统通过直接合成于固体支持物上，产生覆盖PD-L1(Q9NZQ7,SEQ ID NO:48)胞外域氨基酸19-132位的所有重叠15氨基酸线性肽的文库。
在PEPSCANTM系统中采用自动化ELISA型输出定量抗体的结合。对3C5抗体(IgG形式)和对照抗体YW243.55S70(本文中称为“S70”，一种结合PD-L1的参比抗体)测定与肽阵列的结合。S70重链和轻链序列揭示于美国专利No.8,217,149，其公开的内容通过引用全文纳入本文。结合S70抗体的hPD-L1表位清晰地定位到氨基酸序列QDAGVYRCMIS(SEQ ID NO:48的氨基酸107-117)。该表位包括计算出与hPD-1接触的hPD-L1的14个不连续残基中的三个氨基酸(R113、M115和S117)。参见Lin,D.Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:3011-3016(2008)，其公开的内容通过引用全文纳入本文。
采用低严谨结合条件(例如，抗体预处理和ELISA反应中采用的0.1×样品缓冲液)，仅能部分确定3C5表位。结合结果与3C5表位和S70表位部分重叠相一致。结合结果并未排除hPD-L1的其他区域也被3C5结合的可能性，例如作为不连续或构象表位。如以下实施例9所示，3C5和S70抗体交叉竞争与人PD-L1结合(参见下文实施例9)，这为两种抗体的表位重叠提供了进一步的支持。
实施例9：抗体交叉阻断
抗体交叉阻断分析通过如下方法进行。将表达人PD-L1的CHO细胞(每个反应20,000-30,000个)与3C5IgG、S70或无关同种型对照IgG抗体的未标记滴定稀释液在4℃孵育30分钟。洗涤细胞，然后与恒定浓度的Alexa647标记3C5或S70(1μg/mL)在4℃孵育30分钟。采用FACSCaliburTM系统测定荧光染色强度。以同样抗体的竞争作为阳性对照，并以缺乏竞争的无关抗体作为阴性对照。交叉阻断的结果如图11分图A和分图B所示。结果证明了3C5和S70对人PD-L1结合的相互交叉阻断。虽然出于阐明目的已经通过说明和举例的方式对本发明有所描述，但本领域普通技术人员根据本发明的教导不难了解，可以对本发明作出某些改变和修改而不背离所附权利要求书的构思和范围。
因此，前述内容只是说明本发明的原理。应理解，本领域技术人员能够设计各种安排，虽然本文没有明确描述或显示这些安排，但它们均体现本发明的原理并包含在本发明构思和范围内。而且，本文所述的所有实施例和条件语言主要旨在辅助读者理解本发明的原理和本发明对发展现有技术作出的贡献，且不对这些具体引用的实施例和条件构成限制。而且，本文有关本发明原理、方面、实施方式以及具体实施例的所有陈述都应包括其结构和功能等同物。此外，这些等同物应包括目前已知的等同物和将来开发的等同物，即新开发的具有相同功能的任何成员，无论其是何种结构。因此，本发明的范围不限于本文所示和所述的示例性实施方式。适当的是，本发明的范围和构思由所附权利要求书限定。

Claims (109)

1.一种分离的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区，所述重链可变区包含：
(i)HVR-H1序列，其与序列GFSLTSYDIS(SEQ ID NO:4)具有至少约99％的序列相同性；
(i)HVR-H2序列，其与序列VIWTGVGTN(SEQ ID NO:5)具有至少约99％的序列相同性；以及
(iii)HVR-H3序列，其与序列DPYYYGMDY(SEQ ID NO:6)具有至少约99％的序列相同性。
2.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其中：
(i)所述HVR-H1序列包含序列GFSLTSYDIS(SEQ ID NO:4)；
(ii)所述HVR-H2序列包含序列VIWTGVGTN(SEQ ID NO:5)；以及
(iii)所述HVR-H3序列包含序列DPYYYGMDY(SEQ ID NO:6)。
3.如权利要求1或2所述的抗体或抗原结合片段，其还包括轻链可变区，所述轻链可变区包含选自下组的至少一个HVR序列：
(i)HVR-L1，其与序列RASQDISIWLS(SEQ ID NO:1)具有至少99％序列相同性；
(ii)HVR-L2，其与序列KASNLHT(SEQ ID NO:2)具有至少99％序列相同性；
(iii)HVR-L3，其与序列LQSQSFPRT(SEQ ID NO:3)具有至少99％序列相同性。
4.如权利要求3所述的抗体或抗原结合片段，其中，轻链可变区包含所有所述HVR-L1、HVR-L2和HVR-L3序列。
5.如权利要求3所述的抗体或抗原结合片段，其中：
(i)HVR-L1包含序列RASQDISIWLS(SEQ ID NO:1)；
(ii)HVR-L2序列包含序列KASNLHT(SEQ ID NO:2)；以及
(iii)HVR-L3包含序列LQSQSFPRT(SEQ ID NO:3)。
6.如权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，其中：
(i)HVR-L1包含序列RASQDISIWLS(SEQ ID NO:1)；
(ii)HVR-L2序列包含序列KASNLHT(SEQ ID NO:2)；以及
(iii)HVR-L3包含序列LQSQSFPRT(SEQ ID NO:3)。
7.如权利要求1-6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体是单克隆抗体。
8.如权利要求7所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体是嵌合、人源化或人抗体。
9.如权利要求1-8中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述重链可变区包含框架序列。
10.如权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其中，框架区序列的至少一部分包含人框架序列。
11.如权利要求10所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述人框架序列是人共有框架序列。
12.如权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述框架序列包含选自下组的框架区1(FR1)序列：SEQ ID NO:7、8、9、10和11。
13.如权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述框架序列包含选自下组的框架区2(FR2)序列：SEQ ID NO:12、13、14、15和16。
14.如权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述框架序列包含选自下组的框架区3(FR3)序列：SEQ ID NO:17、18、19、20、21、22、23和24。
15.如权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述框架序列包含选自下组的框架区4(FR4)序列：SEQ ID NO:25和26。
16.如权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其中，框架序列包含：
选自下组的FR1序列：SEQ ID NO:7、8、9、10和11；
选自下组的FR2序列：SEQ ID NO:12、13、14、15和16；
选自下组的FR3序列：SEQ ID NO:17、18、19、20、21、22、23和24；以及
选自下组的FR4序列：SEQ ID NO:25和26。
17.如权利要求3-6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述轻链可变区包含框架序列。
18.如权利要求17所述的抗体或抗原结合片段，其中，框架区序列的至少一部分包含人框架序列。
19.如权利要求18所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述人框架序列是人共有框架序列。
20.如权利要求17所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述框架序列包含选自下组的框架区1(FR1)序列：SEQ ID NO:27、28和29。
21.如权利要求17所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述框架序列包含选自下组的框架区2(FR2)序列：SEQ ID NO:30和31。
22.如权利要求17所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述框架序列包含选自下组的框架区3(FR3)序列：SEQ ID NO:32和33。
23.如权利要求17所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述框架序列包含选自下组的框架区4(FR4)序列：SEQ ID NO:34和35。
24.如权利要求17所述的抗体或抗原结合片段，其中，框架序列包含：
选自下组的FR1序列：SEQ ID NO:27、28和29；
选自下组的FR2序列：SEQ ID NO:30和31；
选自下组的FR3序列：SEQ ID NO:32和33；以及
选自下组的FR4序列：SEQ ID NO:34和35。
25.一种分离的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其包含：与SEQ ID NO:45具有至少约90％序列相同性的重链可变区和/或与SEQ ID NO:46具有至少约90％序列相同性的轻链可变区。
26.一种分离的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其包含：含SEQ ID NO:45的重链可变域和/或含SEQ ID NO:46的轻链可变域。
27.如权利要求25或26所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体是单克隆抗体。
28.如权利要求27所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体是嵌合、人源化或人抗体。
29.一种分离的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其包含：与SEQ ID NO:36、37、38、39、40、41或42中任一具有至少约90％序列相同性的重链可变域和/或与SEQ ID NO:43或44中任一具有至少约90％序列相同性的轻链可变域。
30.一种分离的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其包含：含SEQ ID NO:36、37、38、39、40、41或42中任一种的重链可变域和/或含SEQ ID NO:43或44中任一种的轻链可变域。
31.一种分离的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体：
(i)与包含SEQ ID NO:36、37、38、39、40、41或42中任一种的重链可变域和包含SEQ IDNO:43或44中任一种的轻链可变域的抗PD-L1抗体基本上结合相同的表位；或
(ii)与包含SEQ ID NO:36、37、38、39、40、41或42中任一种的重链可变域和包含SEQ IDNO:43或44中任一种的轻链可变域的抗PD-L1抗体竞争结合相同的表位。
32.一种分离的抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其通过如下过程制备：
(a)培养表达抗体的细胞，所述抗体包含：SEQ ID NO:36、37、38、39、40、41或42中任一种的重链可变域和包含SEQ ID NO:43或44中任一种的轻链可变域；以及
(b)从所述细胞或从培养所述细胞的细胞培养基中分离所述抗体。
33.如权利要求29-32中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体是单克隆抗体。
34.如权利要求33所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体是嵌合、人源化或人抗体。
35.如权利要求1-34中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段是单特异性的。
36.如权利要求1-34中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段是双特异性的。
37.如权利要求36所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述双特异性抗体或抗原结合片段结合PD-L1蛋白和细胞表面蛋白。
38.如权利要求37所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述细胞表面蛋白选自下组：CD20、EGFR、HER2、CTLA-4、TIM3、LAG3、VISTA和TIGIT。
39.如权利要求1-34中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段是多特异性的。
40.如权利要求39所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述多特异性抗体或抗原结合片段结合PD-L1蛋白和一种或多种细胞表面蛋白。
41.如权利要求40所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述一种或多种细胞表面蛋白选自下组：CD20、EGFR、HER2、CTLA-4、TIM3、LAG3、VISTA和TIGIT。
42.如权利要求1-41中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段选自下组：Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv、scFv和单结构域抗体。
43.如权利要求1-42中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体包含κ轻链或λ轻链。
44.如权利要求1-43中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体是IgG、IgM、IgA、IgD或IgE同种型。
45.如权利要求44所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体是IgG同种型，且其中，所述抗体是选自下组的亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
46.如权利要求44所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体是IgM同种型。
47.如权利要求46所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体包含J链。
48.如权利要求44所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体是IgA同种型，且其中，所述抗体是选自下组的亚类：IgA1和IgA2。
49.如权利要求48所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体包含J链。
50.如权利要求1-43中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体是IgG/IgM或IgG/IgA杂合抗体，其包含J链。
51.如权利要求47、49或50中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述J链是包含外来结合部分的修饰J链。
52.如权利要求51所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述外来结合部分选自下组：抗体、抗体的抗原结合片段、抗体-药物偶联物、抗体样分子、抗体样分子的抗原结合片段、可溶和膜结合蛋白、配体和受体。
53.如权利要求52所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述外来结合部分是抗体的抗原结合片段且选自下组：Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv、scFv和单结构域抗体。
54.如权利要求53所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗原结合片段是scFv。
55.如权利要求51所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述外来结合部分影响T细胞信号转导途径。
56.如权利要求55所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述外来结合部分拮抗T细胞抑制性信号转导途径。
57.如权利要求56所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述外来结合部分结合选自下组的细胞表面蛋白：CTLA-4、TIM3、LAG3、BTLA、VISTA和TIGIT。
58.如权利要求51所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述外来结合部分包含白蛋白蛋白或白蛋白蛋白的片段。
59.如权利要求51所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述外来结合部分包含白蛋白结合肽。
60.如权利要求51所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述外来结合部分包含白蛋白结合抗体片段。
61.如权利要求60所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述白蛋白结合抗体片段选自下组：Fab、scFv、VHH、scFab和dAb。
62.如权利要求51所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述外来结合部分包含FcRn结合肽。
63.如权利要求51所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述外来结合部分包含FcRn结合抗体片段。
64.如权利要求63所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述FcRn结合抗体片段选自下组：Fab、scFv、VHH、scFab和dAb。
65.如权利要求51所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述外来结合部分包含Fc结构域。
66.一种IgM、IgA、IgG/IgM或IgG/IgA抗体或抗原结合片段，其包含：含外来结合部分的修饰J链，其中所述抗体或抗原结合片段结合细胞表面蛋白，且其中所述外来结合部分包含如权利要求1-34中任一项所述的抗PD-L1抗体或抗原结合片段。
67.如权利要求66所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述细胞表面蛋白选自下组：CD20、EGFR、HER2、CTLA-4、TIM3、LAG3、VISTA和TIGIT。
68.如权利要求51所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述外来结合部分结合效应细胞。
69.如权利要求68所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述效应细胞选自下组：T细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。
70.如权利要求69所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述效应细胞是T细胞。
71.如权利要求70所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述外来结合部分结合T细胞上的CD3。
72.如权利要求69所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述效应细胞是NK细胞。
73.如权利要求72所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述外来结合部分结合NK细胞上选自下组的靶标：CD16、CD64和NKG2D。
74.如权利要求69所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述效应细胞是巨噬细胞。
75.如权利要求74所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述外来结合部分结合巨噬细胞上的CD14。
76.如权利要求69所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述效应细胞是中性粒细胞。
77.如权利要求76所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述外来结合部分结合中性粒细胞上的CD16b或CD177。
78.如权利要求1-77中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段是PD-L1拮抗剂。
79.如权利要求1-78中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段拮抗PD-L1信号转导途径。
80.如权利要求78或79中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段拮抗PD-L1蛋白与PD-1蛋白之间的相互作用。
81.如权利要求78或79中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段抑制PD-L1蛋白与PD-1蛋白之间的结合。
82.如权利要求78或79中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段阻断PD-L1蛋白与PD-1蛋白之间的结合。
83.如权利要求1-82中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段结合PD-L1蛋白并抑制PD-L1蛋白的一种或多种功能。
84.一种多核苷酸，其编码如前述权利要求中任一项所述抗体的重链和/或轻链。
85.一种包含权利要求84所述的多核苷酸的载体。
86.一种重组宿主细胞，其包含权利要求84所述的多核苷酸或权利要求85所述的载体。
87.如权利要求86所述的宿主细胞，其为原核细胞。
88.如权利要求86所述的宿主细胞，其为真核细胞。
89.一种试剂盒，其包含如权利要求1-83中任一项所述的抗PD-L1抗体。
90.一种生产分离的抗PD-L1抗体的方法，所述方法包括：
用包含多核苷酸的核酸转染宿主细胞，所述多核苷酸编码如权利要求1-83中任一项所述的抗PD-L1抗体的重链和/或轻链；
在适于生产抗PD-L1抗体的条件下培养所述宿主细胞；以及
分离所述抗PD-L1抗体。
91.一种抑制PD-1蛋白的一种或多种功能的方法，所述方法包括使PD-L1蛋白与权利要求1-83中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触。
92.如权利要求91所述的方法，其中，所述方法在体外进行。
93.如权利要求91所述的方法，其中，所述方法在哺乳动物对象的体内进行。
94.一种抑制表达PD-L1的肿瘤生长的方法，所述方法包括：给予带有肿瘤细胞的对象如权利要求1-83中任一项所述的抗体，从而(i)抑制肿瘤细胞的生长或增殖，或(ii)诱导肿瘤细胞死亡。
95.一种药物组合物，其包含权利要求1-83中任一项所述的抗体和药学上可接受的载剂。
96.一种治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括给予所述对象有效量的如权利要求95所述的药物组合物。
97.权利要求1-83中任一项所述抗体在制备癌症治疗药物中的应用。
98.如权利要求1-83中任一项所述的分离的抗体，其用于治疗癌症。
99.如权利要求96-98中任一项所述的方法或应用，其中，所述癌症是血液癌症或上皮癌症。
100.如权利要求99所述的方法或应用，其中，所述血液癌症是白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或骨髓增生异常综合征。
101.如权利要求100所述的方法或应用，其中，所述白血病是急性骨髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、慢性髓性白血病或慢性淋巴细胞性白血病。
102.如权利要求100所述的方法和应用，其中，所述淋巴瘤是霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
103.如权利要求99所述的方法或应用，其中，所述上皮癌症是非小细胞肺癌、膀胱癌、肾癌、肝癌、结直肠癌、卵巢癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌或鼻咽癌。
104.如权利要求103所述的方法或应用，其中，所述乳腺癌是激素受体阴性乳腺癌或三阴性乳腺癌。
105.如权利要求96-98中任一项所述的方法或应用，其中，所述癌症是黑素瘤。
106.如权利要求96-98中任一项所述的方法或应用，其中，所述癌症是成胶质细胞瘤。
107.如权利要求96-106中任一项所述的方法或应用，其中，所述药物组合物或药物还包含有效量的第二治疗剂。
108.一种筛选样品以确定所述样品中PD-L1多肽的存在的方法，所述方法包括：
使所述样品与如权利要求1-83中任一项所述的抗PD-L1抗体接触；以及
确定所述抗PD-L1抗体是否结合样品中的PD-L1多肽，其中该结合的存在指示了所述样品中PD-L1多肽的存在。
109.如权利要求108所述的方法，其中，所述抗PD-L1抗体是可检测标记的，且确定所述抗PD-L1抗体是否结合PD-L1多肽包括检测所述可检测标记物。
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