CN115485299A - Pd-1激动剂多聚结合分子 - Google Patents

Abstract

本公开提供多聚结合分子，所述多聚结合分子特异性地并且激动性地与程序性细胞死亡蛋白1(PD‑1)结合。本公开还提供包含所述多聚结合分子的组合物、编码所述多聚结合分子的多核苷酸和可产生所述结合分子的宿主细胞。此外，本公开提供使用所述多聚结合分子的方法，包括治疗自身免疫病症和预防移植排斥反应的方法。

Description

PD-1激动剂多聚结合分子

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年4月22日提交的美国临时专利申请序列号63/014,023；2020年7月10日提交的63/050,413；和2021年2月2日提交的63/144,708的权益，其各自以引用的方式整体并入本文中。

序列表

本申请含有序列表，所述序列表以ASCII格式以电子方式提交并特此以引用方式整体并入。ASCII副本创建于2021年4月20日，名为031WO1-Sequence-Listing，且大小为69,796字节。

背景技术

可多聚的抗体和抗体样分子，例如IgA和IgM抗体已成为例如免疫肿瘤学和传染病的领域中有前景的药物候选物，从而改善特异性、改善亲合力并且能够与多个结合靶标结合。参见例如美国专利第9,951,134号、第9,938,347号、第10,351,631号和第10,400,038号，美国专利申请公开案第US 2019-0100597号、第US 2018-0009897号、第US 2019-0330374号、第US 2019-0330360号、第US 2019-0338040号、第US 2019-0338041号、第US2019-0185570号、第US 2018-0265596号、第US 2018-0118816号、第US 2018-0118814号和第US 2019-0002566号，以及PCT公开案第WO 2018/187702号、第WO 2019/165340号和第WO2019/169314号，其内容以引用的方式整体并入本文中。

程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)是一种属于免疫球蛋白超家族的细胞表面受体，所述超家族包括参与细胞识别、结合和粘附过程的细胞表面和可溶性蛋白。此家族的最初成员是由于它们在添加单克隆抗体后对增强T细胞增殖的功能作用而被发现的(Hutloff等人(1999)Nature 397:263-266；Hansen等人(1980)Immunogenics 10:247-260)。已鉴定PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体，称为PD-L1和PD-L2，并已显示在与PD-1结合后下调T细胞激活和细胞因子分泌(Freeman等人(2000)J Exp Med 192:1027-34；Latchman等人(2001)NatImmunol 2:261-8；Carter等人(2002)Eur J Immunol 32:634-43；Ohigashi等人(2005)Clin Cancer Res 11:2947-53)。PD-1途径与许多自身免疫疾病有关(Francisco等人,(2010)Immunol Rev 236:219-42)。

仍需要治疗剂来治疗自身免疫疾病，例如由PD-1途径破坏引起的自身免疫疾病。

发明内容

本文提供了包含两个、五个或六个二价结合单元或其变体或片段的多聚结合分子，其中每个结合单元包含两个各自与结合域缔合的IgA或IgM重链恒定区或其多聚化片段或变体，其中三至十二个结合域是程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)结合域，其特异性地并且激动性地与PD-1结合，其中结合分子可激活细胞中的PD-1介导的信号转导，其效力高于等量的包含两个相同PD-1结合域的二价IgG抗体或其片段，所述抗体或其片段也特异性地与PD-1结合并刺激PD-1。在一些实施方案中，两个、五个或六个结合单元是人、人源化或嵌合免疫球蛋白结合单元。

在一些实施方案中，三个至十二个PD-1结合域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH和VL包含六个免疫球蛋白互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3构成包含以下的抗体的CDR：分别地，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50的VH和VL，或SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22中的任一者的VL，或包含以下的抗体的CDR：分别地，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SE Q ID NO:11和SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SE Q ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，在HCDR或LCDR中的一者或多者中具有一个或两个单一氨基酸取代，或SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20和SEQ ID NO:22中的任一者的VL，在HCDR或LCDR中的一者或多者中具有一个或两个单一氨基酸取代。

在一些实施方案中，三个至十二个PD-1结合域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：(a)VH和VL包含六个免疫球蛋白互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3构成分别包含以下的抗体的CDR：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50的VH和VL，在HCDR或LCDR中的一者或多者中具有零个、一个或两个单一氨基酸取代；(b)VH和VL包含六个免疫球蛋白互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3构成包含以下的抗体的CDR：SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:23或SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22中的任一者的VL，在HCDR或LCDR中的一者或多者中具有零个、一个或两个单一氨基酸取代；(c)VH和VL包含分别与以下者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的氨基酸序列：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50；或(d)VH包含与SEQID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的氨基酸序列，且VL包含与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的氨基酸序列。

在一些实施方案中，VH和VL包含六个免疫球蛋白互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3构成分别包含以下的抗体的CDR：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13和SEQID NO:14以及SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的VH和VL，或分别包含以下的抗体的CDR：SEQID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14以及SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26，在HCDR或LCDR中的一者或多者中具有一个或两个单一氨基酸取代。

在一些实施方案中，结合分子的三个至十二个PD-1结合域包含抗体VH和VL，其中VH和VL包含与以下各者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的氨基酸序列：分别地，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，或SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22中的任一者的VL。在一些实施方案中，结合分子的三个至十二个PD-1结合域包含抗体VH和VL，其中VH和VL包含分别与SEQ ID NO:1和SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14以及SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的氨基酸序列。

在一些实施方案中，三个至十二个PD-1结合域包含抗体VH和VL区，其分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，或包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22中的任一者的VL。在一些实施方案中，三个至十二个PD-1结合域包含抗体VH和VL区，其分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、AEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:25和SEQ IDNO:26。

在一些实施方案中，每个结合单元包含两条重链和两条轻链，其中重链和轻链包含与以下各者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的VH和VL氨基酸序列：分别地，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，或SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQ ID NO:16、SEQID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22中的任一者的VL。在一些实施方案中，每个结合单元包含两条重链和两条轻链，其中重链和轻链包含分别与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的VH和VL氨基酸序列。

在一些实施方案中，重链和轻链分别包含VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34或SEQ IDNO:49和SEQ ID NO:50，或包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:20或SEQ ID NO:22中的任一者的VL。在一些实施方案中，重链和轻链分别包含抗体VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、AEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。

在一些实施方案中，多聚结合分子是包含两个二价IgA或IgA样结合单元和J链或其功能片段或变体的二聚结合分子，其中每个结合单元包含两个各自包含IgA Cα3域和IgA尾段域的IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体。在一些实施方案中，每个IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体还包含Cα1域、Cα2域、IgA铰链区或其任何组合。在一些实施方案中，IgA重链恒定区或其多聚化片段是人IgA恒定区。在一些实施方案中，每个结合单元包含两条IgA重链，所述IgA重链各自包含位于IgA恒定区或其多聚化片段的氨基端的VH；以及两条免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链各自包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基端的VL。

在一些实施方案中，多聚结合分子是分别包含五个或六个二价IgM结合单元的五聚或六聚结合分子，其中每个结合单元包含两个各自与PD-1结合域缔合的IgM重链恒定区或其多聚化片段，其中每个IgM重链恒定区包含IgM Cμ4和IgM尾段域。在一些实施方案中，IgM重链恒定区或其片段或变体各自还包含Cμ1域、Cμ2域、Cμ3域或其任何组合。在一些实施方案中，IgM重链恒定区是人IgM恒定区。

在一些实施方案中，每个结合单元包含两条IgM重链，所述IgM重链各自包含位于IgM恒定区或其片段的氨基端的VH；以及两条免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链各自包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基端的VL。

在一些实施方案中，多聚结合分子包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36或其多聚化片段。在一些实施方案中，IgM恒定区相对于野生型人IgM恒定区在SEQ ID NO:35或SEQ IDNO:36的位置310、311、313和/或315处包含取代。在一些实施方案中，IgM恒定区相对于野生型人IgM恒定区在SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的位置46、209、272或440处包含两个或更多个取代。

在一些实施方案中，多聚结合分子是五聚的，并且还包含J链或其功能片段或变体。

在一些实施方案中，J链或其功能片段或变体是相对于野生型J链包含一个或多个可影响多聚结合分子的血清半衰期的单一氨基酸取代、缺失或插入的变体J链；且其中相对于除了一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入之外相同，并以相同方式施用于相同动物物种的参考多聚结合分子，包含变体J链的多聚结合分子在施用于动物时表现出增加的血清半衰期。

在一些实施方案中，J链或其功能片段在对应于成熟野生型人J链(SEQ ID NO:41)的氨基酸Y102的氨基酸位置处包含氨基酸取代。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:41的Y102的氨基酸被丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或精氨酸(R)取代。在一些实施方案中，对应于SEQID NO:41的Y102的氨基酸被丙氨酸(A)取代。

在一些实施方案中，J链是变体人J链并且包含氨基酸序列SEQ ID NO:42。在一些实施方案中，J链或其功能片段在对应于成熟人J链(SEQ ID NO:41)的氨基酸N49、氨基酸S51或N49和S51两者的氨基酸位置处包含氨基酸取代，其中对应于SEQ ID NO:41的位置S51的单一氨基酸取代不是苏氨酸(T)取代。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:41的N49的位置被丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)或天冬氨酸(D)取代。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的N49的位置被丙氨酸(A)取代。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的S51的位置被丙氨酸(A)或甘氨酸(G)取代。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的S51的位置被丙氨酸(A)取代。

在一些实施方案中，J链或其功能片段或变体还包含异源多肽，其中异源多肽直接或间接与J链或其功能片段或变体融合。

在一些实施方案中，异源多肽通过肽接头与J链或其片段融合。在一些实施方案中，肽接头包含至少5个氨基酸，但不超过25个氨基酸。在一些实施方案中，J链或其功能片段或变体还包含异源多肽，其中异源多肽通过包含至少5个氨基酸，但不超过25个氨基酸的肽接头与J链或其功能片段或变体融合。在一些实施方案中，肽接头由GGGGS(SEQ ID NO:43)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:44)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:45)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:46)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:47)组成。在一些实施方案中，异源多肽与J链或其片段或变体的N端、J链或其片段或变体的C端或J链或其片段或变体的N端和C端两者融合。

在一些实施方案中，异源多肽可影响多聚结合分子的吸收、分布、代谢和/或排泄(ADME)。

在一些实施方案中，异源多肽包含抗原结合域。在一些实施方案中，异源多肽的抗原结合域为抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合片段包含Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)片段或其任何组合。在一些实施方案中，抗原结合片段为scFv片段。在一些实施方案中，抗原结合域结合ICOS配体(ICOSLG)、ICOS(CD278)、白细胞介素6(IL6)、CD28、CD3、CD80、CD86、肿瘤坏死因子α(TNFa)或成纤维细胞激活蛋白(FAP)。

本文还提供了包含本文公开的多聚结合分子的组合物。在一些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂。

本文还提供了包含编码本文公开的结合分子的多肽亚基的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，多肽亚基包含多聚结合分子的IgM重链恒定区和PD-1结合域的至少抗体VH部分。

在一些实施方案中，多肽亚基包含与VH的C末端融合的人IgM恒定区或其片段，所述VH包含：(a)HCDR1、HCDR2和HCDR3区，其包含VH氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:49中所含的CDR，或VH氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:49中所含的CDR，在一个或多个HCDR中具有一个或两个单一氨基酸取代；或(b)与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:49至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的氨基酸序列。

在一些实施方案中，多肽亚基包含多聚结合分子的轻链恒定区和PD-1结合域的抗体VL部分。在一些实施方案中，多肽亚基包含与VL的C末端融合的人κ或λ轻链恒定区或其片段，所述VL包含：(a)LCDR1、LCDR2和LCDR3区，其包含VL氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:50中所含的CDR，或VH氨基酸序列SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:50中所含的CDR，在一个或多个LCDR中具有一个或两个单一氨基酸取代；或(b)与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQID NO:32、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:50至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的氨基酸序列。

本文还提供了包含本文提供的多核苷酸的组合物。在一些实施方案中，组合物含有包含编码本文提供的多聚结合分子的IgM重链恒定区和PD-1结合域的至少抗体VH部分的核酸序列的多核苷酸，以及包含编码本文提供的多聚结合分子的轻链恒定区和PD-1结合域的抗体VL部分的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸位于单独的载体上。在一些实施方案中，多核苷酸位于单一载体上。在一些实施方案中，组合物还含有包含编码J链或其功能片段或其功能变体的核酸序列的多核苷酸。

本文还提供了本文公开的一种或多种载体。

本文还提供了包含本文提供的多核苷酸、本文提供的组合物或本文提供的一种或多种载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞可表达本文提供的结合分子或其亚基。

本文还提供了产生本文提供的结合分子的方法，所述方法包括培养本文提供的宿主细胞，以及回收结合分子。

本文还提供了治疗需要治疗的受试者的自身免疫病症、炎症性病症或其组合的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文提供的多聚结合分子，其中所述多聚结合分子表现出比与相同结合搭配物结合的等量的单体或二聚结合分子更大的效力。在一些实施方案中，受试者是人。

本文还提供了预防受试者的移植排斥反应的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文提供的多聚结合分子，其中所述多聚结合分子表现出比与相同结合搭配物结合的等量的单体或二聚结合分子更大的效力，且其中所述受试者是移植接受者。在一些实施方案中，受试者是人。

附图说明

图1显示在ELISA分析中抗PD-1IgG#1、抗PD-1IgM#1、抗PD-1IgG#2和抗PD-1IgM#2与人PD-1的结合。

图2显示在基于细胞的分析中抗PD-1IgG#1、抗PD-1IgM#1、抗PD-1IgG#2和抗PD-1IgM#2与人PD-1的结合。

图3A-3B显示抗PD-1IgG或IgM#1(图3A)或抗PD-1IgG或IgM#2(图3B)对PD-1信号传导的激活。

图4A-4B显示抗PD-1IgG、IgG+交联剂或IgM#1(图4A)或抗PD-1IgG、IgG+交联剂或IgM#2(图4B)对PD-1信号传导的激活。

图5A-5D显示抗PD-1IgG、IgG+交联剂或IgM#1(图5A)或抗PD-1IgG、IgG+交联剂或IgM#2(图5B)或抗PD-1IgG、IgG+交联剂或IgM#3(图5C)或抗PD-1IgG、IgG+交联剂或IgM#4(图5D)对PD-1信号传导的激活。

图6A-6D显示抗PD-1IgG、IgG+交联剂、五聚IgM或六聚IgHM#1(图6A)或抗PD-1IgG、IgG+交联剂、五聚IgM或六聚IgHM#2(图6B)或抗PD-1IgG、IgG+交联剂、五聚IgM或六聚IgHM#3(图6C)或抗PD-1IgG、IgG+交联剂、五聚IgM或六聚IgHM#5(图6D)对PD-1信号传导的激活。

具体实施方式

定义

如本文所用，术语“一个(a)”或“一种(an)”实体是指该实体中的一者或多者；例如，“结合分子”被理解为表示一种或多种结合分子。因此，术语“一个(a)”(或“一种(an)”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。

此外，当在本文使用时，“和/或”应当视为具有或不具有另一者的两种特定特征或组分中的每一者的具体公开。因此，本文在短语中使用的术语“和/或”例如“A和/或B”旨在包括：“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、和“B”(单独)。同样地，如例如“A、B和/或C”的短语中所用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一者：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本公开相关领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；The Dictionary of Celland Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；和the Oxford Dictionary ofBiochemistry and Molecular Biology,修订版,2000,Oxford University Press为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用字典。

单位、前缀和符号以其Système International de Unites(SI)可接受的形式表示。数值范围将限定范围的数包括在内。除非另有说明，否则氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。本文提供的标题不限制各种实施方案或本公开的实施方案，其可通过整体参考本说明书而得。因此，紧接下文定义的术语通过整体参考本说明书被更详细地定义。

如本文所用，术语“多肽”旨在涵盖单数“多肽”以及复数“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，而不是指产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指代两个或更多个氨基酸的一条或多条链的任何其它术语包括在“多肽”的定义内，并且可使用术语“多肽”来代替这些术语中的任一者。术语“多肽”也旨在指代多肽的表达后修饰产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、以及通过已知保护/封闭基团、蛋白水解切割或通过非天然存在的氨基酸进行修饰的衍生化。多肽可衍生自生物来源或通过重组技术产生，但不必需由指定的核酸序列翻译。它可以任何方式产生，包括通过化学合成。

如本文所公开的多肽的大小可为约3或更多、5或更多、10或更多、20或更多、25或更多、50或更多、75或更多、100或更多、200或更多、500或更多更多、1,000或更多、或2,000或更多个氨基酸。多肽可具有确定的三维结构，尽管它们不必需具有这样的结构。具有确定的三维结构的多肽称为折叠的，并且不具有确定的三维结构但可采用许多不同构象的多肽称为未折叠的。如本文所用，术语糖蛋白是指与至少一个碳水化合物部分偶联的蛋白质，所述碳水化合物部分通过氨基酸，例如丝氨酸或天冬酰胺的含氧或含氮侧链与蛋白质附接。在本公开的别处更详细地描述了天冬酰胺(N)连接的聚糖。

“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意指不在其自然环境中的多肽。不需要特定的纯化水平。例如，分离的多肽可从其天然或自然环境中去除。如本文所公开，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的，已经通过任何合适的技术分离、分级分离或者部分或基本上纯化的天然或重组多肽也是如此。

如本文所用，术语“非天然存在的多肽”或其任何语法变体是明确排除但仅排除是或可能是由法官或行政或司法机构确定或解释为是“天然存在的”的那些多肽形式的条件定义。

本文公开的其它多肽为上述多肽的片段、衍生物、类似物或变体以及其任何组合。如本文所公开的术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保留对应天然抗体或多肽的至少一些特性，例如与抗原特异性结合的任何多肽。除了本文别处论述的特异性抗体片段之外，多肽的片段包括例如蛋白水解片段以及缺失片段。例如，多肽的变体包括如上所述的片段，并且还包括由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，变体可为非天然存在的。非天然存在的变体可使用本领域已知的诱变技术产生。变体多肽可包含保守或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。衍生物是经过改变以表现出原始多肽上没有的附加特征的多肽。实例包括融合蛋白。如本文所用，多肽的“衍生物”还可指代具有一个或多个通过官能性侧基的反应来在化学上衍生的氨基酸的对象多肽。还包括作为“衍生物”的是那些含有二十种标准氨基酸的一种或多种衍生物的多肽。例如，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；以及鸟氨酸可取代赖氨酸。

“保守的氨基酸取代”是其中一种氨基酸被具有类似侧链的另一种氨基酸替代。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，用苯丙氨酸取代酪氨酸为保守取代。在某些实施方案中，本公开的多肽、结合分子和抗体的序列中的保守取代不取消含有氨基酸序列的多肽、结合分子或抗体与抗体结合抗原的结合。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法在本领域中是众所周知的(参见例如Brummell等人,Biochem.32:1180-1 187(1993)；Kobayashi等人,Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:.412-417(1997))。

术语“多核苷酸”旨在涵盖单个核酸以及多个核酸并且指代分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、cDNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如，例如见于肽核酸(PNA)中的酰胺键)。术语“核酸”或“核酸序列”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA或RNA片段。

“分离的”核酸或多核苷酸意指从其天然环境中分离的任何形式的核酸或多核苷酸。例如，凝胶纯化的多核苷酸或编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸将被认为是“分离的”。此外，经工程改造以具有用于克隆的限制性位点的多核苷酸区段例如PCR产物被认为是“分离的”。分离的多核苷酸的其它实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或在非天然溶液例如缓冲液或盐水中的纯化(部分或基本上)的多核苷酸。分离的RNA分子包括多核苷酸的体内或体外RNA转录物，其中所述转录物在自然界中不可见。分离的多核苷酸或核酸还包括此类以合成方式产生的分子。另外，多核苷酸或核酸可为或可包括调节元件，例如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。

如本文所用，术语“非天然存在的多核苷酸”或其任何语法变体是明确排除但仅排除是或可能是由法官或行政或司法机构确定或解释为是“天然存在的”的那些核酸或多核苷酸形式的条件定义。

如本文所用，“编码区”是核酸的一部分，所述核酸由可翻译成氨基酸的密码子组成。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但它可被认为是编码区的一部分，但任何侧翼序列例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中，例如在单一载体上，或存在于单独的多核苷酸构建体中，例如在单独的(不同的)载体上。此外，任何载体可含有单个编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如单个载体可单独编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，载体、多核苷酸或核酸可包含与或未与另一个编码区融合的异源编码区。异源编码区包括但不限于编码特殊元件或基序的那些，例如分泌信号肽或异源功能域。

在某些实施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可包含启动子和/或与一个或多个编码区可操作地缔合的其它转录或翻译控制元件。可操作的缔合是当基因产物(例如多肽)的编码区与一个或多个调控序列以这样的方式缔合时，使得基因产物的表达处于调控序列的影响或控制之下。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调控序列指导基因产物表达的能力或干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(例如多肽编码区和与其缔合的启动子)是“可操作地缔合的”。因此，如果启动子能够影响该核酸的转录，则启动子区将与编码多肽的核酸可操作地缔合。启动子可为指导DNA在预定细胞中大量转录的细胞特异性启动子。除了启动子之外的其它转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏子和转录终止信号可与多核苷酸可操作地缔合以指导细胞特异性转录。

本领域技术人员已知多种转录控制区。这些控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，例如但不限于来自巨细胞病毒(立即早期启动子，与内含子A结合)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(例如劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus))的启动子和增强子区段。其它转录控制区包括源自脊椎动物基因的转录控制区，例如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-珠蛋白，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。其它合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子-诱导型启动子(例如，干扰素或白介素诱导型启动子)。

类似地，本领域普通技术人员已知多种翻译控制元件。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及源自小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点(或IRES)，也称为CITE序列)。

在其它实施方案中，多核苷酸可为例如信使RNA(mRNA)、转移RNA或核糖体RNA形式的RNA。

多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌肽或信号肽的额外的编码区缔合，所述分泌肽或信号肽指导由如本文公开的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦开始将生长的蛋白质链输出穿过粗面内质网，所述信号肽或分泌前导序列就会被从成熟蛋白质上切割下来。本领域普通技术人员知道，脊椎动物细胞分泌的多肽可具有融合到多肽N端的信号肽，所述信号肽被从完整或“全长”多肽上切割下来，产生分泌的或“成熟的”多肽形式。在某些实施方案中，使用天然信号肽例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或所述序列的功能衍生物，其保留指导与其可操作地缔合的多肽的分泌的能力。或者，可使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可被人组织纤溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列取代。

如本文所用，术语“结合分子”在其最广泛的意义上是指特异性结合受体或靶标(例如，表位或抗原决定簇)的分子。如本文进一步描述的，结合分子可包含本文所述的多个“结合域”，例如“抗原结合域”之一。结合分子的非限制性实例为保留抗原特异性结合的如本文详细描述的抗体或抗体样分子。在某些实施方案中，“结合分子”包含如本文详细描述的抗体或抗体样或抗体衍生的分子。

如本文所用，术语“结合域”或“抗原结合域”(可互换使用)是指结合分子(例如，抗体或抗体样或抗体衍生的分子)区域，其对于特异性结合靶标(例如，表位、多肽、细胞或器官)是必要且充分的。例如，作为两个单独的多肽亚基或作为单链的“Fv”，例如抗体的重链可变区和轻链可变区被认为是“结合域”。其它抗原结合域包括但不限于衍生自骆驼科物种的抗体的单个域重链可变区(VHH)、或在纤连蛋白支架中表达的六个免疫球蛋白互补决定区(CDR)。如本文所述的“结合分子”，例如“抗体”可包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个或更多个“抗原结合域”。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。抗体(或如本文公开的其片段、变体或衍生物，例如IgM样抗体)至少包括重链可变域(例如，来自骆驼科物种)或至少包括重链可变域和轻链可变域。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构被相对较好地理解。参见例如Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring HarborLaboratory Press,第2版,1988)。除非另有说明，否则术语“抗体”涵盖从抗体的小抗原结合片段到全尺寸抗体的任何事物，例如，包含两条完整重链和两条完整轻链的IgG抗体、包含四条完整重链和四条完整轻链并且包含J链和/或分泌组分的IgA抗体、或包含十条或十二条完整重链和十条或十二条完整轻链并且任选地包含J链或其功能片段或变体的IgM衍生的结合分子，例如IgM抗体或IgM样抗体。

术语“免疫球蛋白”包含可在生化上区分的各种广泛的多肽类别。本领域技术人员将理解，重链分类为伽马(gamma)、缪(mu)、阿尔法(alpha)、德尔塔(delta)或伊普西龙(epsilon)(γ、μ、α、δ、ε)，其中有一些亚类别(例如，γ1至γ4或α1至α2))。此链的性质决定了抗体的“同种型”分别为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白亚类别(亚型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等已被很好地表征，并且已知赋予功能专一性。这些免疫球蛋白中的每一种的修饰版本鉴于本公开内容对于本领域技术人员来说是容易辨别的，并且因此在本公开内容的范围内。

轻链分类为卡帕(kappa)或兰姆达(lambda)(κ、λ)。每种重链类别都可与卡帕或兰姆达轻链结合。通常，轻链和重链彼此共价键合，并且当免疫球蛋白表达时，两条重链的“尾”部分通过共价二硫键联或非共价键联彼此键合，例如通过杂交瘤、B细胞或遗传工程改造的宿主细胞。在重链中，氨基酸序列从Y构型叉形末端的N端延伸到每条链底部的C端。某些抗体(例如，IgG抗体)的基本结构包含通过二硫键共价连接的两个重链亚基和两个轻链亚基，以形成“Y”结构(在本文中也称为“H2L2”结构)或“结合单元”。

术语“结合单元”在本文中用于指代结合分子例如抗体、抗体样分子、或抗体衍生的分子、其抗原结合片段或其多聚片段的一部分，所述部分对应于标准的“H2L2”免疫球蛋白结构，即，两条重链或其片段和两条轻链或其片段。在例如其中结合分子为二价IgG抗体或其抗原结合片段的某些实施方案中，术语“结合分子”和“结合单元”是等效的。在其它实施方案中，例如其中结合分子是“多聚结合分子”，例如二聚IgA抗体、二聚IgA样抗体、二聚IgA衍生的结合分子、五聚或六聚IgM抗体、五聚或六聚IgM样抗体、或五聚或六聚IgM衍生的结合分子或其任何衍生物，所述结合分子包含两个或更多个“结合单元”。分别地，在IgA二聚体的情况下为两个，或在IgM五聚体或六聚体的情况下为五个或六个。结合单元不需要包含全长抗体重链和轻链，但典型地将是二价的，即，将包含两个如上文所定义的“抗原结合域”。如本文所用，本公开中提供的某些结合分子为“二聚体”，并且包含两个二价结合单元，所述结合单元包含IgA恒定区或其多聚片段。本公开中提供的某些结合分子为“五聚体”或“六聚体”，并且包含五个或六个二价结合单元，所述结合单元包含IgM恒定区或其多聚片段或变体。包含两个或更多个例如两个、五个或六个结合单元的结合分子例如抗体或抗体样分子或抗体衍生的结合分子在本文中称为“多聚体”。

如本文所用，术语“J链”是指任何动物物种的IgM或IgA抗体的J链、其任何功能片段、其衍生物和/或其变体，包括成熟人J链，成熟人J链的氨基酸序列呈现为SEQ ID NO:41。本文公开了各种J链变体和经修饰的J链衍生物。如本领域普通技术人员将认识到的，“功能片段”或“功能变体”包括可与IgM重链恒定区缔合以形成五聚IgM抗体的那些片段和变体。

术语“修饰的J链”在本文中用于指代J链多肽的衍生物，其包含异源部分，例如异源多肽，例如引入或附接至J链序列的外来结合域或功能域。可通过任何方式实现引入，所述方式包括异源多肽或其它部分的直接或间接融合或通过经由肽或化学接头的附接。术语“修饰的人J链”涵盖但不限于包含通过引入异源部分，例如异源多肽，例如外来结合域修饰的SEQ ID NO:41的氨基酸序列的天然序列人J链或其功能片段或其功能变体。在某些实施方案中，异源部分不干扰IgM有效聚合成五聚体或IgA有效聚合成二聚体，以及此类聚合物与靶标的结合。示例性修饰的J链可见于例如以下各者中：美国专利第9,951,134号和第10,400,038号以及美国专利申请公开案第US-2019-0185570号和第US-2018-0265596号，所述专利中的每一者都以引用的方式整体并入本文中。

如本文所用，术语“IgM衍生的结合分子”总体地是指天然IgM抗体、IgM样抗体、以及包含非抗体结合和/或功能域而不是抗体抗原结合域或其亚基的其它IgM衍生的结合分子，以及任何片段，例如其多聚化片段、变体或衍生物。

如本文所用，术语“IgM样抗体”通常是指仍保留形成例如与J链缔合的六聚体或五聚体的能力的变体抗体或抗体衍生的结合分子。IgM样抗体或其它IgM衍生的结合分子典型地至少包括IgM恒定区的Cμ4-tp域，但可包括来自源于同一物种或源于不同物种的其它抗体同种型(例如，IgG)的重链恒定区域。IgM样抗体或其它IgM衍生的结合分子同样可为其中一个或多个恒定区缺失的抗体片段，只要IgM样抗体能够形成六聚体和/或五聚体。因此，IgM样抗体或其它IgM衍生的结合分子可为例如杂合IgM/IgG抗体、或可为IgM抗体的“多聚片段”。

术语“价”、“二价”、“多价”和语法等效物是指给定结合分子(例如，抗体、抗体衍生的或抗体样分子)中或给定结合单元中结合域例如抗原结合域的数量。因此，关于给定结合分子例如IgM抗体、IgM样抗体、其它IgM衍生的结合分子或其多聚片段，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示存在两个抗原结合域、四个抗原结合域和六个抗原结合域。在每个结合单元为二价的情况下，典型的IgM抗体、IgM样抗体或其它IgM衍生的结合分子可具有10或12个价。二价或多价结合分子例如抗体或抗体衍生的分子可为单特异性的(即，所有抗原结合域是相同的)或可为双特异性或多特异性的，例如，其中两个或更多个抗原结合域是不同的，例如，结合同一抗原上的不同表位、或结合完全不同的抗原。

术语“表位”包括能够特异性结合抗体、抗体样或抗体衍生的分子的抗原结合域的任何分子决定簇。在某些实施方案中，表位可包括分子的化学活性表面基团例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中可具有三维结构特性和或比电荷特性。表位是由抗体的抗原结合域结合的靶区域。

术语“靶标”在最广泛的意义上用于包括可由结合分子例如抗体、抗体样或抗体衍生的分子结合的物质。靶标可为例如多肽、核酸、碳水化合物、脂质或其它分子、或此类分子上的最小表位。此外，“靶标”可为例如，细胞、器官或生物体(例如，动物、植物、细菌或病毒)，其包含可由结合分子例如抗体、抗体样或抗体衍生的分子结合的表位。

抗体、抗体样或抗体衍生的分子的轻链和重链两者分为结构同源和功能同源的区域。术语“恒定”和“可变”在功能上使用。在这方面，应理解，可变轻链(VL)和可变重链(VH)部分两者的可变域决定抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链的恒定区域(例如，CH1、CH2、CH3或CH4)赋予生物学特性，例如分泌、经胎盘移动性、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区域的编号随其离抗体的抗原结合位点或氨基端越来越远而增加。N端部分是可变区，并且C端部分是恒定区；CH3(或例如在IgM的情况下为CH4)和CL域实际上分别包含重链和轻链的羧基端。

“全长IgM抗体重链”是多肽，所述多肽在N端至C端方向上包含可包含尾段的抗体重链可变域(VH)、抗体重链恒定域1(CM1或Cμ1)、抗体重链恒定域2(CM2或Cμ2)、抗体重链恒定域3(CM3或Cμ3)和抗体重链恒定域4(CM4或Cμ4)。

如上所指出的那样，可变区允许结合分子例如抗体、抗体样或抗体衍生的分子选择性地识别并特异性结合抗原上的表位。即，结合分子(例如，抗体、抗体样或抗体衍生的分子)的VL域和VH域或互补决定区(CDR)的子集组合以形成抗原结合域。更具体地，抗原结合域可由每个VH和VL链上的三个CDR定义。某些抗体形成较大的结构。例如，IgA可形成分子，所述分子包括通过二硫键共价连接的两个H2L2结合单元和J链，所述J链还可与分泌组分缔合，并且IgM可形成五聚或六聚分子，所述五聚或六聚分子包括任选地通过二硫键共价连接的五个或六个H2L2结合单元和J链。

抗体抗原结合域中存在的六个“互补决定区”或“CDR”是短的非连续氨基酸序列，当抗体假定其在水性环境中呈三维构型时，所述氨基酸序列被特异性定位以形成抗原结合域。抗原结合域中的其余氨基酸称为“框架”区，其示出较小的分子间变异性。框架区主要采用β-片层构象，并且CDR形成环，所述环连接β-片层结构且在一些情形下形成其一部分。因此，框架区起形成支架的作用，所述支架提供通过链间非共价相互作用将CDR定位在正确的方向上。由定位的CDR形成的抗原结合域限定与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。此互补表面促进抗体与其同源表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员可容易地确定分别构成CDR和框架区的氨基酸，因为它们已经以各种不同的方式定义(参见"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"Kabat,E.等人,U.S.Department of Health and Human Services,(1983)；以及Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)，所述文献以引用的方式整体并入本文中)。

在本领域内使用和/或接受的术语有两个或多个定义的情况下，本文使用的术语的定义旨在包括所有这些含义，除非明确说明相反。具体的实例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原组合位点。已例如由Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences of Proteins ofImmunological Interest"(1983)以及由Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)描述了这些特定区域，所述文献通过引用并入本文。当相互比较时，Kabat定义和Chothia定义包括氨基酸重叠或子集。然而，除非另有说明，否则应用任一定义(或本领域普通技术人员已知的其它定义)来指代抗体或其变体的CDR旨在落入如本文所定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上述引用的参考文献中每一者定义的CDR的适当的氨基酸列于下表1中作为比较。涵盖特定CDR的确切氨基酸数将根据CDR的序列和大小而变化。给定抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可惯例地确定哪些氨基酸包含特定CDR。

表1 CDR定义^*

^*表1中所有CDR定义的编号都是根据Kabat等人列出的编号约定(参见下文)。

例如，也可使用IMGT信息系统(imgt_dot_cines_dot_fr/)(IMGT

/V-Quest)对抗体可变域进行分析，以识别可变区区段，包括CDR。(参见例如Brochet等人,Nucl.AcidsRes.36:W503-508,2008)。

Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变域序列的编号系统。本领域普通技术人员可明确地将此“Kabat编号”系统分配给任何可变域序列，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由以下提出的编号系统：Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest"(1983)。然而，除非明确指出使用Kabat编号系统，否则本公开中所有氨基酸序列使用连续编号。

用于人IgM恒定域的Kabat编号系统可发现于Kabat等人,“Tabulation andAnalysis of Amino acid and nucleic acid Sequences of Precursors,V-Regions,C-Regions,J-Chain,T-Cell Receptors for Antigen,T-Cell Surface Antigens,β-2Microglobulins,Major Histocompatibility Antigens,Thy-1,Complement,C-ReactiveProtein,Thymopoietin,Integrins,Post-gamma Globulin,α-2Macroglobulins,andOther Related Proteins,”U.S.Dept.of Health and Human Services(1991)中。IgM恒定区可顺序地编号(即，氨基酸#1从恒定区的第一个氨基酸开始)、或通过使用Kabat编号方案编号。下文列出了人IgM恒定区的两个等位基因顺序地编号(在本文中表示为SEQ ID NO:35(等位基因IGHM*03)和SEQ ID NO:36(等位基因IGHM*04))与通过Kabat系统编号的比较。加下划线的氨基酸残基不包括在Kabat系统中(“X”(以下双下划线)可为丝氨酸(S)(SEQ IDNO:35)或甘氨酸(G)(SEQ ID NO:36))：

IgM重链的顺序(SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36)/KABAT编号键

结合分子例如抗体、抗体样或抗体衍生的分子、其抗原结合片段、变体或衍生物、和/或其多聚片段包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含VL或VH域的片段、由Fab表达文库产生的片段。ScFv分子在本领域中已知并且描述于例如美国专利5,892,019中。

“特异性结合”通常意指结合分子(例如，抗体或其片段、变体或衍生物)通过其抗原结合域结合表位，并且意指结合需要抗原结合域与表位之间的某种互补性。根据此定义，当与随机的无关表位结合相比，结合分子例如抗体、抗体样或抗体衍生的分子通过其抗原结合域更容易地结合一个表位时，可将其判定为“特异性结合”该表位。本文中使用术语“特异性”以限定某个结合分子与某个表位结合的相对亲和力。例如，可认为对于给定的表位，结合分子“A”比结合分子“B”具有更高的特异性，或可将结合分子“A”判定为与表位“C”结合的特异性比与相关表位“D”结合的特异性更高。

可将本文公开的结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物判定为以小于或等于以下的解离率(k(off))与靶抗原结合：5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1、10-3sec-1、5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×10-5sec-1、或10-5sec-1、5×10-6sec-1、10-6sec-1、5×10-7sec-1或10-7sec-1。

可将本文公开的结合分子例如抗体或抗原结合片段、变体或衍生物判定为以大于或等于以下的缔合率(k(on))与靶抗原结合：103M-1sec-1、5×103M-1sec-1、104M-1sec-1、5×104M-1sec-1、105M-1sec-1、5×105M-1sec-1、106M-1sec-1、或5×106M-1sec-1或107M-1sec-1。

如果结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物优先结合到给定表位至其(在某种程度上)阻断参考抗体或抗原结合片段与所述表位的结合的程度，则据说所述结合分子竞争性地抑制参考抗体或抗原结合片段与所述表位的结合。竞争性抑制可通过本领域已知的任何方法例如竞争ELISA测定来确定。可将结合分子判定为竞争性地抑制参考抗体或抗原结合片段与给定表位的结合达至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。

如本文所用，术语“亲和力”是指单个表位与例如免疫球蛋白分子的一个或多个抗原结合域结合的强度的量度。参见例如Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988)，第27-28页。如本文所用，术语“亲合力”是指抗原结合域群体与抗原之间的复合物的总体稳定性。参见例如Harlow，第29-34页。亲和力不仅与群体中单个抗原结合域与特定表位的亲和力有关，并且还与免疫球蛋白和抗原的价有关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构例如聚合物的抗原之间的相互作用将是高亲合力的相互作用。二价单克隆抗体与在细胞表面上以高密度存在的受体之间的相互作用也将具有高亲合力。

如本文所公开的结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物也可根据其交叉反应性来描述或指定。如本文所用，术语“交叉反应性”是指对一种抗原具有特异性的结合分子例如抗体或其片段、变体或衍生物与第二抗原反应的能力；两种不同抗原物质之间相关性的量度。因此，如果结合分子与同诱导其形成的表位不同的表位结合，则结合分子是交叉反应的。交叉反应表位通常含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下可实际上比原始表位更适合。

结合分子，例如抗体或其片段、变体或衍生物也可根据它们对抗原的结合亲和力来描述或指定。例如，结合分子可以不大于以下的解离常数或KD与抗原结合：5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M。

包括单链抗体或其它抗原结合域的“抗原结合抗体片段”可单独存在或与以下中的一种或多种组合存在：铰链区、CH1、CH2、CH3或CH4域、J链或分泌组分。还包括抗原结合片段，所述抗原结合片段可包括一个或多个可变区与以下中的一个或多个的任何组合：铰链区、CH1、CH2、CH3或CH4域、J链或分泌组分。结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段，可来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。抗体可为人、鼠科动物、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡的抗体。在另一个实施方案中，可变区可为软骨鱼(condricthoid)来源的(例如，来自鲨鱼)。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从一种或多种人免疫球蛋白转基因的动物中分离的抗体，并且在一些情况下可表达内源性免疫球蛋白而在一些情况下不表达，如在下文以及例如在Kucherlapati等人的美国专利第5,939,598号中所述。根据本公开的实施方案，本文提供的IgM抗体、IgM样抗体或其它IgM衍生的结合分子可包括抗体的抗原结合片段，例如scFv片段，只要IgM抗体、IgM样抗体或其它IgM衍生的结合分子能够形成多聚体，例如六聚体或五聚体，并且本文提供的IgA抗体、IgA样抗体或其它IgA衍生的结合分子可包括抗体的抗原结合片段，例如scFv片段，只要IgA抗体、IgA样抗体或其它IgA衍生的结合分子能够形成多聚体，例如二聚体。如本文所用，这样的片段包括“多聚化片段”。

如本文所用，术语“重链亚基”包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列，包含重链亚基的结合分子(例如，抗体、抗体样或抗体衍生的分子)可包括以下中的至少一个：VH域、CH1域、铰链(例如，上、中和/或下铰链区)域、CH2域、CH3域、CH4域或其变体或片段。例如，结合分子(例如，抗体、抗体样或抗体衍生的分子)或其片段(例如，多聚片段)、变体或衍生物可包括但不限于：除了VH域之外，CH1域；CH1域、铰链和CH2域；CH1域和CH3域；CH1域、铰链和CH3域；或CH1域、铰链域、CH2域和CH3域。在某些实施方案中，结合分子(例如，抗体、抗体样或抗体衍生的分子)或其片段(例如，多聚片段)、变体或衍生物可包括除了VH域之外，CH3域和CH4域；或CH3域、CH4域和J链。此外，用于本公开的结合分子例如抗体或抗体样或抗体衍生的分子可缺乏某些恒定区部分，例如CH2域的全部或部分。本领域普通技术人员将理解，可修饰这些域(例如，重链亚基)，使得其在氨基酸序列上与原始免疫球蛋白分子不同。根据本公开的实施方案，如本文提供的IgM抗体、IgM样抗体或其它IgM衍生的结合分子包含IgM重链恒定区的足够部分，以允许IgM抗体、IgM样抗体或其它IgM衍生的结合分子形成多聚体例如六聚体或五聚体。如本文所用，这样的片段包括“多聚化片段”。

如本文所用，术语“轻链亚基”包括衍生自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。轻链亚基至少包括VL，并且还可包括CL(例如，Cκ或Cλ)域。

结合分子(例如，抗体、抗体样分子、抗体衍生的分子、其抗原结合片段、变体或衍生物)可根据其识别或特异性结合的靶标例如靶抗原的一个或多个表位或部分来描述或指定。与抗体的抗原结合域特异性相互作用的靶抗原的部分为“表位”或“抗原决定簇”。靶抗原可包含单个表位或至少两个表位，并且可包括任意数量的表位，其取决于抗原的大小、构象和类型。

如本文所用，术语“二硫键”包括例如在多肽的半胱氨酸残基中两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可与第二硫醇基形成二硫键或桥的硫醇基。二硫键可为“链内的”，即连接单个多肽或多肽亚基中的半胱氨酸残基，或可为“链间的”，即连接两个单独的多肽亚基，例如抗体重链和抗体轻链、两条抗体重链、或IgM或IgA抗体重链恒定区和J链。

如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中免疫反应性区域或位点获自或来源于第一物种并且恒定区(其可为完整的、部分的或修饰的)获自第二物种的抗体。在一些实施方案中，靶结合区或位点将来自非人来源(例如，小鼠或灵长类动物)并且恒定区是人的。

术语“多特异性抗体”或“双特异性抗体”是指在单个抗体分子内具有针对两个或更多个不同表位的抗原结合域的抗体、抗体样或抗体衍生的分子。除标准抗体结构外，其它结合分子也可以两种结合特异性构建。双特异性或多特异性抗体的表位结合可为同时的或顺序的。Triomas和杂合杂交瘤是可分泌双特异性抗体的细胞系的两个实例。双特异性抗体还可通过重组方式构建。(

和Heiss,Future Oncol.6:1387-94(2010)；Mabry和Snavely,IDrugs.13:543-9(2010))。双特异性抗体还可为双体抗体。

如本文所用，术语“工程化抗体”是指其中可变域、恒定区和/或J链通过一个或多个氨基酸的至少部分替代而改变的抗体。在某些实施方案中，可将来自已知特异性抗体的完整CDR移植到异源抗体的框架区中。尽管替代的CDR可衍生自与衍生框架区的抗体相同类别或甚至亚类别的抗体，但CDR也可衍生自不同类别的抗体例如衍生自来自不同物种的抗体。其中将来自已知特异性的非人抗体的一个或多个“供体”CDR移植到人重链或轻链框架区中的工程化抗体在本文中称为“人源化抗体”。在某些实施方案中，并不是所有的CDR都被来自供体可变区的完整CDR替代，但是供体的抗原结合能力仍然可转移到受体可变域。根据在例如美国专利第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,762号和第6,180,370号中所阐述的解释，通过进行常规实验或通过反复测试来获得功能性工程化抗体或人源化抗体将完全在本领域技术人员的能力范围内。

如本文所用，术语“工程化”包括通过合成方式(例如通过重组技术、体外肽合成、通过肽、核酸或聚糖的酶促或化学偶联、或这些技术的某种组合)对核酸或多肽分子进行操纵。

如本文所用，术语“连接”、“融合”或其它语法等效物可互换使用。这些术语是指通过包括化学缀合或重组方式在内的任何方式将两个或更多个元件或组分连接在一起。“框内融合”是指以维持原始ORF的翻译阅读框的方式连接两个或更多个多核苷酸开放阅读框(ORF)以形成连续较长的ORF。因此，重组融合蛋白是含有两个或更多个对应于由原始ORF编码的多肽的区段的单一蛋白质(所述区段在自然界中通常不会如此连接)。尽管因此使阅读框在整个融合区段中是连续的，但区段可通过例如框内接头序列在物理上或空间上分离。例如，编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸可在框内融合，但是被编码至少一个免疫球蛋白框架区或额外的CDR区的多核苷酸分离，只要“融合”CDR作为连续多肽的一部分共同翻译。

在多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”是氨基酸在多肽中从氨基端到羧基端方向的顺序，其中序列中彼此紧邻的氨基酸在多肽的初级结构中是连续的。对于多肽的一部分是“氨基端”或“N端”的多肽的另一部分是在顺序多肽链中较早出现的部分。类似地，对于多肽的一部分是“羧基端”或“C端”的多肽的另一部分是在顺序多肽链中较晚出现的部分。例如，在典型的抗体中，可变域在恒定区的“N端”，且恒定区在可变域的“C端”。

如本文所用，术语“表达”是指基因产生生物化学物质例如多肽的过程。该过程包括细胞内基因功能性存在的任何表现，包括但不限于基因敲低以及瞬时表达和稳定表达两者。该过程包括但不限于将基因转录成RNA例如信使RNA(mRNA)，以及将这种mRNA翻译成多肽。如果最终所需产物是生物化学物质，则表达包括所述生物化学物质和任何前体的产生。基因的表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可为核酸，例如通过基因转录产生的信使RNA，或从转录物翻译的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰(例如，聚腺苷酸化)的核酸，或具有翻译后修饰(例如，甲基化、糖基化、脂质的添加、与其它蛋白质亚基的缔合、蛋白水解裂解等)的多肽。

例如“治疗”或“缓解”的术语是指治愈、减缓、减轻现有诊断出的病理疾患或病症的症状和/或停止或减慢现有诊断出的病理疾患或病症的进展的治疗措施。术语例如“防止(prevent)”、“防止(prevention)”、“避免(avoid)”、“阻遏(deterrence)”等是指防止未诊断出的靶向的病理病状或病症的发展的预防或防止措施。因此，“需要治疗的那些”可包括已经患有病症的那些和/或易患病症的那些。

如本文所用，术语“血清半衰期”或“血浆半衰期”是指施用后使药物(例如，结合分子例如抗体、抗体样或抗体衍生的分子或片段例如其多聚化片段)的血清或血浆浓度降低50％所需的时间(例如，以分钟、小时或天为单位)。可描述两个半衰期：α半衰期、α半衰期或t1/2α，其是由于药物从中央室(例如，在静脉内递送情况下的血液)到外周室(例如，组织或器官)的重新分配过程引起的血浆浓度下降速率，以及β半衰期、β半衰期或t1/2β，其是由于排泄或代谢过程引起的下降速率。

如本文所用，术语“血浆药物浓度-时间曲线下面积”或“AUC”反映了在施用一剂药物之后身体对药物的实际暴露，并表示为mg*h/L。此曲线下面积可被测量(例如从时间0(t0)到无穷大(∞))并且取决于药物从体内消除的速率和施用的剂量。

如本文所用，术语“平均停留时间”或“MRT”是指药物留在体内的平均时间长度。

“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指任何受试者。在某些实施方案中，受试者是需要诊断、预后或治疗的哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜、农场动物以及动物园动物、运动动物或宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、牛、熊等。

如本文所用，如术语“将从治疗中受益的受试者”是指所有预期受试者中将受益于施用给定的治疗剂的受试者的子集，所述治疗剂例如，结合分子例如包含一个或多个抗原结合域的抗体。此类结合分子例如抗体可例如用于诊断程序和/或用于治疗或预防疾病。

PD-1结合分子

本文提供了包含两个、五个或六个二价结合单元或其变体或片段的多聚结合分子，其中每个结合单元包含两个各自与结合域缔合的IgA或IgM重链恒定区或其多聚化片段或变体，其中三至十二个结合域是程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)结合域，其特异性地并且激动性地与PD-1结合。在某些实施方案中，结合分子可激活细胞中的PD-1介导的信号转导，其效力高于等量的包含两个相同PD-1结合域的二价IgG抗体或其片段，所述抗体或其片段也特异性地与PD-1结合并刺激PD-1。在一些实施方案中，两个、五个或六个结合单元是人、人源化或嵌合免疫球蛋白结合单元。所提供的结合分子可用作治疗剂或诊断剂，例如用于治疗自身免疫病症。

在一些实施方案中，多聚结合分子是二聚的并且包含两个二价结合单元或其变体或片段。在一些实施方案中，多聚结合分子是二聚的，包含两个二价结合单元或其变体或片段，并且还包含如本文所述的J链或其功能片段或变体。在一些实施方案中，多聚结合分子是二聚的，包含两个二价结合单元或其变体或片段，并且还包含如本文所述的J链或其功能片段或变体，其中每个结合单元包含两个IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体。

在一些实施方案中，多聚结合分子是五聚的并且包含五个二价结合单元或其变体或片段。在一些实施方案中，多聚结合分子是五聚的并且包含五个二价结合单元或其变体或片段，并且还包含如本文所述的J链或其功能片段或变体。在一些实施方案中，多聚结合分子是五聚的并且包含五个二价结合单元或其变体或片段，并且还包含如本文所述的J链或其功能片段或变体，其中每个结合单元包含两个IgM重链恒定区或其多聚化片段或变体。

在一些实施方案中，多聚结合分子是六聚的并且包含六个二价结合单元或其变体或片段。在一些实施方案中，多聚结合分子是六聚的并且包含六个二价结合单元或其变体或片段，并且其中每个结合单元包含两个IgM重链恒定区或其多聚化片段或变体。

在某些实施方案中，所提供的结合分子中的重链恒定区各自与结合域，例如抗体抗原结合域，例如抗体抗原结合域的scFv、VHH或VH亚基缔合。本文公开的多聚结合分子可包含三至十二个结合域，它们是程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)结合域，其特异性地并且激动性地与PD-1结合。在一些实施方案中，多聚结合分子，例如IgA抗体、IgA样抗体或IgA衍生的结合分子包含三个或四个特异性地并且激动性地与PD-1结合的结合域。在一些实施方案中，多聚结合分子，例如IgA抗体、IgA样抗体或IgA衍生的结合分子包含四个特异性地并且激动性地与PD-1结合的结合域。在一些实施方案中，多聚结合分子，例如IgM抗体、IgM样抗体或IgM衍生的结合分子包含十个或十二个特异性地并且激动性地与PD-1结合的结合域。

在某些实施方案中，所提供的多聚结合分子是多特异性的，例如双特异性、三特异性或四特异性的，其中与结合分子的重链恒定区缔合的两个或更多个结合域特异性结合不同的靶标。在某些实施方案中，多聚结合分子的结合域均与PD-1特异性结合。在某些实施方案中，多聚结合分子的结合域是相同的。在这种情况下，如果例如具有不同特异性的结合域是如本文别处所述的修饰的J链的一部分，则多聚结合分子仍可为双特异性的。在某些实施方案中，结合域是抗体衍生的抗原结合域，例如与重链恒定区缔合的scFv或与重链恒定区缔合的抗体结合域的VH亚基。

在某些实施方案中，每个结合单元包含两条重链，其各自包含位于重链恒定区的氨基端的VH，和两条免疫球蛋白轻链，其各自包含位于免疫球蛋白轻链恒定区，例如κ或λ恒定区的氨基端的轻链可变域(VL)。所提供的VH和VL结合形成与靶标特异性结合的抗原结合域。在某些实施方案中，每个结合分子的每个抗原结合域与相同的靶标，即PD-1结合。在某些实施方案中，每个结合分子的每个抗原结合域是相同的。

在某些实施方案中，多聚结合分子的三个至十二个PD-1结合域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH和VL包含六个免疫球蛋白互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3构成包含以下的抗体的CDR：分别地，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33和SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50的VH和VL，或SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22中的任一者的VL，或包含以下的抗体的CDR：分别地，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQID NO:33和SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，在HCDR或LCDR中的一者或多者中具有一个或两个单一氨基酸取代，或SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22中的任一者的VL，在HCDR或LCDR中的一者或多者中具有一个或两个单一氨基酸取代，例如分别包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14以及SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的VH和VL的抗体的CDR，或分别包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14以及SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的VH和VL的抗体的CDR，在HCDR或LCDR中的一者或多者中具有一个或两个单一氨基酸取代。

在某些实施方案中，多聚结合分子的三个至十二个PD-1结合域包含抗体VH和VL，其中VH和VL包含与以下各者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的氨基酸序列：分别地，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33和SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，或SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22中的任一者的VL，例如分别与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14以及SEQ IDNO:25和SEQ ID NO:26至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的氨基酸序列。

在某些实施方案中，三个至十二个PD-1结合域包含抗体VH和VL区，其分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ IDNO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，或包含SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:17、SEQID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22中的任一者的VL，例如分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的VH和VL区。

在某些实施方案中，多聚结合分子的每个结合单元包含两条重链和两条轻链，其中重链和轻链包含与以下各者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的VH和VL氨基酸序列：分别地，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，或SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22中的任一者的VL，例如分别与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:14或SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的VH和VL氨基酸序列。

在某些实施方案中，多聚结合分子的重链和轻链分别包含VH和VL氨基酸序列SEQID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、SEQID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，或包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22中的任一者的VL，例如分别包含VH和VL氨基酸序列SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:25和SEQ ID NO:26。

IgM抗体、IgM样抗体、其它IgM衍生的结合分子

IgM是B细胞响应抗原刺激而产生的第一免疫球蛋白。天然存在的IgM天然存在于在血清中，1.5mg/ml左右，半衰期约为5天。IgM是五聚或六聚分子，并且因此包含五个或六个结合单元。IgM结合单元典型地包括两条轻链和两条重链。尽管IgG重链恒定区含有三个重链恒定域(CH1、CH2和CH3)，但是IgM的重(μ)恒定区另外含有第四恒定域(CH4)并且包括C端“尾段”。人IgM恒定区典型地包含氨基酸序列SEQ ID NO:35(等同于例如GenBank登录号pir||S37768、CAA47708.1和CAA47714.1，等位基因IGHM*03)或SEQ ID NO:36(等同于例如GenBank登录号sp|P01871.4，等位基因IGHM*04)。人Cμ1区在SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的约氨基酸5至约氨基酸102范围内；人Cμ2区在SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的约氨基酸114至约氨基酸205范围内、人Cμ3区在SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的约氨基酸224至约氨基酸319范围内、Cμ4区在SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的约氨基酸329至约氨基酸430范围内，并且尾段在SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的约氨基酸431至约氨基酸453范围内。

存在具有微小序列变化的人IgM恒定区的其它形式和等位基因，包括但不限于GenBank登录号CAB37838.1和pir||MHHU。在对应于本公开别处描述和要求保护的SEQ IDNO:35或SEQ ID NO:36的位置处的氨基酸取代、插入和/或缺失同样可并入替代的人IgM序列中，以及并入其它物种的IgM恒定区氨基酸序列中。

每个IgM重链恒定区可与结合域例如抗原结合域(例如，scFv或VHH)或抗原结合域的亚基(例如，VH区)缔合。示例性的抗原结合域，例如特异性地并且激动性地与PD-1结合的结合域在本文别处描述。在某些实施方案中，结合域可为非抗体结合域，例如，受体胞外域、配体或其受体结合片段、细胞因子或其受体结合片段、生长因子或其受体结合片段、神经递质或其受体结合片段、肽或蛋白质激素或其受体结合片段、免疫检查点调节剂配体或其受体结合片段、或细胞外基质蛋白的受体结合片段。参见例如PCT申请第PCT US2019/057702号，其以引用的方式整体并入本文中。

五个IgM结合单元可与另一小多肽链(J链)、或其功能片段、变体或衍生物形成复合物，以形成五聚IgM抗体或IgM样抗体，如本文别处所论述。人J链的前体形式呈现为SEQID NO:40。信号肽从SEQ ID NO:40的氨基酸1延伸至约氨基酸22，并且成熟人J链从SEQ IDNO:40的约氨基酸23延伸至氨基酸159。成熟人J链包括氨基酸序列SEQ ID NO:41。

示例性变体和修饰的J链在本文别处提供。在没有J链的情况下，IgM抗体或IgM样抗体典型地组装成六聚体，其包含多至十二个抗原结合域。在有J链的情况下，IgM抗体或IgM样抗体典型地组装成五聚体，其包含多至十个抗原结合域，或如果所述J链是含有包含额外的抗原结合域的一个或多个异源多肽的修饰的J链时，则包含更多个抗原结合域。五个或六个IgM结合单元组装成五聚或六聚IgM抗体或IgM样抗体被认为涉及Cμ4和尾段域。参见例如Braathen,R.等人,J.Biol.Chem.277:42755-42762(2002)。因此，本公开中提供的五聚或六聚IgM抗体典型地包括至少Cμ4和尾段域(在本文中也统称为Cμ4-tp)。因此，IgM重链恒定区的“多聚化片段”至少包含Cμ4-tp域。IgM重链恒定区还可包括Cμ3域或其片段、Cμ2域或其片段、Cμ1域或其片段、和/或其它IgM重链域。在某些实施方案中，如本文提供的IgM衍生的结合分子，例如IgM抗体、IgM样抗体或其它IgM衍生的结合分子可包括例如如本文提供的完整的IgM重(μ)链恒定域，例如SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36、或其变体、衍生物或类似物。

在某些实施方案中，本公开提供了多聚结合分子，例如五聚或六聚结合分子，其中所述结合分子包括十个或十二个IgM衍生的重链，并且其中IgM衍生的重链包含IgM重链恒定区，所述恒定区各自与特异性结合靶标的结合域缔合。在某些实施方案中，本公开提供了包括五个或六个二价结合单元的IgM抗体、IgM样抗体或IgM衍生的结合分子，其中每个结合单元包括两个各自与抗原结合域或其亚基缔合的IgM或IgM样重链恒定区或其多聚化片段或变体。在某些实施方案中，包括于每个结合单元中的两个IgM重链恒定区为人重链恒定区。在一些实施方案中，重链是糖基化的。在一些实施方案中，重链可被突变以影响糖基化。

当本公开提供的IgM抗体、IgM样抗体或其它IgM衍生的结合分子为五聚体时，IgM抗体、IgM样抗体或其它IgM衍生的结合分子典型地还包括J链或其功能片段或变体。在某些实施方案中，J链为修饰的J链或其变体，其还包含一个或多个与J链附接的异源部分，如本文别处所述。在某些实施方案中，可使J链突变以影响(例如，增强)本文提供的IgM抗体、IgM样抗体或其它IgM衍生的结合分子的血清半衰期，如本公开别处所论述。在某些实施方案中，J链可发生突变以影响糖基化，如本公开别处所论述。

IgM重链恒定区可包含一个或多个Cμ1域或其片段或变体、Cμ2域或其片段或变体、Cμ3域或其片段或变体、和/或Cμ4域或其片段或变体，条件是恒定区可在IgM抗体、IgM样抗体或其它IgM衍生的结合分子中发挥所需功能，例如与第二IgM恒定区缔合以形成具有一个、两个或更多个抗原结合域的结合单元，和/或与其它结合单元(并且在五聚体的情况下，J链)缔合以形成六聚体或五聚体。在某些实施方案中，在单个结合单元内的两个IgM重链恒定区或其片段或变体各自包含Cμ4域或其片段或变体、尾段(tp)或其片段或变体、或Cμ4域与TP或其片段或变体的组合。在某些实施方案中，在单个结合单元内的两个IgM重链恒定区或其片段或变体各自还包含Cμ3域或其片段或变体、Cμ2域或其片段或变体、Cμ1域或其片段或变体、或其任何组合。

在一些实施方案中，IgM抗体、IgM样抗体或其它IgM衍生的结合分子的结合单元包含两条轻链。在一些实施方案中，IgM抗体、IgM样抗体或其它IgM衍生的结合分子的结合单元包含两条片段轻链。在一些实施方案中，轻链是κ轻链。在一些实施方案中，轻链是λ轻链。在一些实施方案中，每个结合单元包含两条免疫球蛋白轻链，每条轻链包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基端的VL。

IgA抗体、IgA样抗体、其它IgA衍生的结合分子

IgA在粘膜免疫中起关键作用，并且占产生的总免疫球蛋白的约15％。IgA为单体或二聚体分子。IgA结合单元包括两条轻链和两条重链。IgA含有三个重链恒定域(Cα1、Cα2和Cα3)，并且包括C端“尾段”。人IgA具有两个亚型，IgA1和IgA2。人IgA1恒定区典型地包括氨基酸序列SEQ ID NO:37。人Cα1域从SEQ ID NO:37的约氨基酸6延伸至约氨基酸98；人IgA1铰链区从SEQ ID NO:37的约氨基酸102延伸至约氨基酸124；人Cα3域从SEQ ID NO:37的约氨基酸228延伸至约氨基酸330；并且尾段从SEQ ID NO:37的约氨基酸331延伸至约氨基酸352。人IgA2恒定区可包括氨基酸序列SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:48或本领域技术人员已知的其它相关同种型。人Cα1域从SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:48的约氨基酸6延伸至约氨基酸98；人IgA2铰链区从SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:48的约氨基酸102延伸至约氨基酸111；人Cα2域从SEQ ID NO:38的约氨基酸113延伸至约氨基酸206或SEQ ID NO:48；人Cα3域从SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:48的约氨基酸215延伸至约氨基酸317；并且尾段从SEQ IDNO:38或SEQ ID NO:48的约氨基酸318延伸至约氨基酸340。SEQ ID NOS:37和38如下所示：

两个IgA结合单元可与两条额外的多肽链，即J链(例如SEQ IDNO:41或SEQ ID NO:42)和分泌组分(前体，SEQ ID NO:39，成熟：SEQ ID NO:39的氨基酸19至603)形成复合物，以形成分泌型IgA(sIgA)抗体。IgA结合单元组装成二聚sIgA抗体被认为涉及Cα3和尾段域(在本文中也统称为Cα3-tp域)。因此，本公开中提供的二聚sIgA抗体典型地包括至少包括Cα3和尾段域的IgA恒定区。SEQ ID NO:39如下所示：

IgA重链恒定区还可包括Cα2域或其片段、IgA铰链区、Cα1域或其片段、和/或其它IgA重链域。在某些方面，本文提供的IgA抗体或IgA样结合分子可包括完整的IgA重(α)链恒定域(例如，SEQ IDNO:37或SEQ ID NO:38)或其变体、衍生物或类似物。在一些实施方案中，IgA重链恒定区或其多聚化片段是人IgA恒定区。

在一些实施方案中，IgA抗体、IgA样抗体或其它IgA衍生的结合分子的结合单元包含两条轻链。在一些实施方案中，IgA抗体、IgA样抗体或其它IgA衍生的结合分子的结合单元包含两条片段轻链。在一些实施方案中，轻链是κ轻链。在一些实施方案中，轻链是λ轻链。在一些实施方案中，每个结合单元包含两条免疫球蛋白轻链，每条轻链包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基端的VL。

J链和其功能片段或变体

在某些实施方案中，本文提供的多聚结合分子包含J链或其功能片段或变体。在某些实施方案中，本文提供的多聚结合分子是五聚的并且包含J链或其功能片段或变体。在某些实施方案中，本文提供的多聚结合分子是二聚的并且包含J链或其功能片段或变体。在一些实施方案中，多聚结合分子可包含天然存在的J链序列，例如成熟的人J链序列(例如，SEQID NO:41)。或者，在一些实施方案中，多聚结合分子可包含变体J链序列，例如本文所述的变体序列，其具有降低的糖基化或降低的与多聚Ig受体(例如，pIgR)的结合。在一些实施方案中，多聚结合分子可包含天然存在的或变体J链的功能片段。如本领域普通技术人员将认识到的，本文中的“功能片段”或“功能变体”包括可与结合单元，例如IgM或IgA重链恒定区缔合以形成五聚IgM抗体、IgM样抗体或IgM衍生的结合分子或二聚IgA抗体、IgA样抗体或IgA衍生的结合分子，和/或可与某些免疫球蛋白受体，例如pIgR缔合的那些片段或变体。

在某些实施方案中，J链可例如通过引入异源部分，或两个或更多个异源部分，例如多肽来修饰，而不干扰结合分子组装和结合其结合靶标的能力。参见美国专利第9,951,134号和第10,400,038号，以及美国专利申请公开案第US-2019-0185570号和第US-2018-0265596号，其各自以引用的方式整体并入本文中。

因此，本公开提供的结合分子，包括如本文别处所述的多特异性IgA、IgA样、IgM或IgM样抗体可包含修饰的J链或其功能片段或变体，其包含被引入(例如，融合或化学缀合)至J链或其片段或变体中的异源部分，例如异源多肽。在某些实施方案中，异源多肽可与J链或其功能片段或变体的N端、J链或其功能片段或变体的C端或J链或其功能片段或变体的N端和C端两者融合。在某些实施方案中，异源多肽可在J链或其功能片段或变体内部融合。在一些实施方案中，异源多肽可在糖基化位点处或附近被引入J链中。在一些实施方案中，异源多肽可在距C端约10个氨基酸残基内或距N端约10个氨基酸内被引入J链中。在某些实施方案中，异源多肽可在SEQ ID NO:41的半胱氨酸残基92与101之间，或J链序列，例如J链变体或J链的功能片段中的等效位置被引入SEQ ID NO:41的成熟人J链中。在另一实施方案中，异源多肽可在糖基化位点处或其附近被引入SEQ IDNO:41的成熟人J链中。在另一实施方案中，异源多肽可在距C端约10个氨基酸残基内或距N端约10个氨基酸内被引入SEQ IDNO:41的成熟人J链中。

在某些实施方案中，异源部分可为与J链框内融合或与J链或其片段或变体化学缀合的肽或多肽序列。在某些实施方案中，异源多肽通过肽接头与J链或其功能片段融合。可使用任何合适的接头，例如肽接头可包括至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30个氨基酸或更多等。在某些实施方案中，肽接头包括至少5个氨基酸，但不超过25个氨基酸。在某些实施方案中，肽接头可由5个氨基酸、10个氨基酸、15个氨基酸、20个氨基酸或25个氨基酸组成。在某些实施方案中，肽接头由GGGGS(SEQ ID NO:43)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:44)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:45)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:46)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:47)组成。

在某些实施方案中，异源部分可为与J链缀合的化学部分。与J链附接的异源部分可包括但不限于结合部分，例如抗体或其抗原结合片段，例如单链Fv(scFv)分子；细胞因子，例如IL-2或IL-15(参见例如PCT申请第PCT US2019/057702号，所述申请以引用的方式整体并入本文中)；可增加结合分子的半衰期的稳定肽，例如人血清白蛋白(HSA)或HSA结合分子；或异源化学部分，例如聚合物。

在一些实施方案中，修饰的J链可包含抗原结合域，所述抗原结合域可包括但不限于能够特异性结合靶抗原的多肽。在某些实施方案中，与修饰的J链缔合的抗原结合域可为抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，抗原结合域可为例如衍生自骆驼科或软骨鱼抗体的scFv抗原结合域或单链抗原结合域。在某些实施方案中，靶标是靶表位、靶抗原、靶细胞或靶器官。靶标可包括但不限于自身免疫靶标、免疫检查点抑制剂、涉及血脑屏障转运的靶标抗原、涉及神经退行性疾病和神经炎症性疾病的靶标抗原、以及它们的任何组合。在某些实施方案中，例如scFv片段的结合域可与例如T细胞或NK细胞的效应细胞结合。在某些实施方案中，例如scFv片段的结合域可与细胞毒性T细胞上的CD3，例如与CD3ε特异性结合。在一些实施方案中，抗原结合域结合ICOS配体(ICOSLG)，例如UniProtKB-O75144；ICOS(CD278)，例如UniProtKB-Q9Y6W8；白细胞介素6(IL6)，例如UniProtKB-P05231；CD28，例如UniProtKB-P10747；CD3，例如CD3ε或UniProtKB-P07766；CD80，例如UniProtKB-P33681；CD86，例如UniProtKB-P42081；肿瘤坏死因子α(TNFa)，例如UniProtKB-P01375；或成纤维细胞激活蛋白(FAP)，例如UniProtKB-Q12884。

可在允许抗原结合域与其结合靶标结合的任何位置将抗原结合域引入J链中，而不干扰J链功能或相关多聚结合分子，例如五聚IgM或二聚IgA抗体的功能。插入位置包括但不限于在C端处或其附近、在N端处或其附近、或者在基于J链的三维结构可接近的内部位置处。

增加血清半衰期的变体J链

在某些实施方案中，J链为功能变体J链，其包括相对于除了一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入之外与变体J链相同的参考J链的一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入。例如，某些氨基酸取代、缺失或插入可导致IgM衍生的结合分子在施用于受试者动物时后显示出相对于参考IgM衍生的结合分子增加的血清半衰期，所述参考IgM衍生的结合分子除了变体J链中的一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入之外是相同的且使用相同的方法施用于相同的动物物种。在某些实施方案中，变体J链相对于参考J链可包括一个、两个、三个或四个单一氨基酸取代、缺失或插入。

在某些实施方案中，J链，例如修饰的J链在对应于成熟野生型人J链(SEQ ID NO:41)的氨基酸Y102的氨基酸位置处包含氨基酸取代。“对应于成熟野生型人J链的氨基酸Y102的氨基酸”意指与人J链中的Y102同源的J链的序列中的氨基酸。例如，参见PCT公开案第WO 2019/169314号，其以引用的方式整体并入本文中。与SEQ ID NO:41中的Y102对应的位置在至少43个其它物种的J链氨基酸序列中是保守的。参见美国专利第9,951,134号的图4，其以引用的方式并入本文中。在对应于SEQ ID NO:41的Y102的位置处的某些突变可抑制某些免疫球蛋白受体，例如人或鼠科动物Fcαμ受体、鼠科动物Fcμ受体、和/或人或鼠科动物聚合物Ig受体(pIgR)与包含变体J链的IgM五聚体的结合。

相比于除取代之外都相同并且以相同方式向相同物种施用的对应多聚结合分子，包含对应于SEQ ID NO:41的Y102的氨基酸处的突变的多聚结合分子在向动物施用时具有改善的血清半衰期。在某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:41的Y102的氨基酸可被任何氨基酸取代。在某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:41的Y102的氨基酸可被丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或精氨酸(R)取代。在一个具体实施方案中，对应于SEQ ID NO:41的Y102的氨基酸可被丙氨酸取代。在一个具体实施方案中，J链或其功能片段或变体为在本文中称为“J*”的变体人J链，并且包含氨基酸序列SEQ ID NO:42。

野生型J链典型地包括一个N连接的糖基化位点。在某些实施方案中，如本文提供的多聚结合分子的变体J链或其功能片段包含例如从对应于成熟人J链(SEQ ID NO:41)或J*(SEQ ID NO:42)的氨基酸49(基序N6)的氨基酸位置开始的天冬酰胺(N)连接的糖基化基序N-X1-S/T内的突变，其中N是天冬酰胺，X1是除脯氨酸之外的任何氨基酸，并且S/T是丝氨酸或苏氨酸，并且其中所述突变阻止了在所述基序处的糖基化。如PCT公开案第WO 2019/169314号中所展示的，阻止此位点处的糖基化的突变可导致相对于除了变体J链中阻止糖基化的一个或多个突变之外都相同并且以相同方式向相同动物物种施用的参考多聚结合分子，如本文所提供的多聚结合分子在向受试动物施用时表现出增加的血清半衰期。

例如，在某些实施方案中，如本文所提供的五聚IgM衍生的或二聚IgA衍生的结合分子的变体J链或其功能片段可包括对应于SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的氨基酸N49或氨基酸S51的氨基酸位置处的氨基酸取代，条件是对应于S51的氨基酸不被苏氨酸(T)取代，或者其中变体J链包含对应于SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的氨基酸N49和氨基酸S51两者的氨基酸位置处的氨基酸取代。在某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的N49的位置被任何氨基酸取代，例如丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)或天冬氨酸(D)。在一个具体实施方案中，对应于SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的N49的位置可被丙氨酸(A)取代。在另一具体实施方案中，对应于SEQ ID NO:41或SEQ ID NO:42的N49的位置可被天冬氨酸(D)取代。

变体IgM恒定区

如本文所提供的多聚结合分子的IgM重链恒定区可被工程化以赋予本文所提供的多聚结合分子某些所需特性。例如，在某些实施方案中，IgM重链恒定区可被工程化以赋予本文提供的多聚结合分子增加的血清半衰期。可增加IgM衍生的结合分子的血清半衰期的示例性IgM重链恒定区突变在PCT公开案第WO 2019/169314号中公开，所述公开案以引用的方式整体并入本文中。例如，如本文提供的IgM抗体、IgM样抗体或IgM衍生的结合分子的变体IgM重链恒定区可包含在对应于野生型人IgM恒定区(例如，SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36)的氨基酸S401、E402、E403、R344和/或E345的位置处的氨基酸取代。“对应于野生型人IgM恒定区的氨基酸S401、E402、E403、R344和/或E345的氨基酸”意指与人IgM恒定区中S401、E402、E403、R344和/或E345同源的任何物种的IgM恒定区序列中的氨基酸。在某些实施方案中，对应于SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的S401、E402、E403、R344和/或E345的氨基酸可被任何氨基酸，例如丙氨酸取代。

在某些实施方案中，IgM抗体、IgM样抗体或其它IgM衍生的结合分子的单克隆群体可经工程化以在补体存在下相对于具有对应的除了赋予降低的CDC活性的突变外相同的参考人IgM恒定区的参考IgM抗体、IgM样抗体或其它IgM衍生的结合分子对细胞表现出降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。这些CDC突变可与如本文提供的赋予增加的血清半衰期的任何突变组合。“对应的参考人IgM恒定区”意指人IgM恒定区，其除了影响CDC活性的恒定区中的一个或多个修饰外与变体IgM恒定区相同。在某些实施方案中，相对于描述于例如PCT申请第WO/2018/187702号中的野生型人IgM恒定区，变体人IgM恒定区包含例如Cμ3域中的一个或多个氨基酸取代，所述申请以引用的方式整体并入本文中。用于测量CDC的分析是本领域普通技术人员众所周知的，并且示例性分析描述于例如PCT申请第WO/2018/187702号中。

在某些实施方案中，赋予降低的CDC活性的变体人IgM恒定区包括对应于SEQ IDNO:35(人IgM恒定区等位基因IGHM*03)或SEQ ID NO:36(人IgM恒定区等位基因IGHM*04)的L310、P311、P313和/或K315位置处的野生型人IgM恒定区的氨基酸取代。在某些实施方案中，赋予降低的CDC活性的变体人IgM恒定区包含对应于在SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的P311位置处的野生型人IgM恒定区的氨基酸取代。在其它实施方案中，本文提供的变体人IgM恒定区含有对应于SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的位置P313处的野生型人IgM恒定区的氨基酸取代。在其它实施方案中，本文提供的变体人IgM恒定区含有对应于SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的位置P311和SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的位置P313处的野生型人IgM恒定区的取代的组合。这些脯氨酸残基可独立地被任何氨基酸取代，例如被丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸取代。

人以及某些非人灵长类动物IgM恒定区典型地包括五(5)个天然存在的天冬酰胺(N)连接的糖基化基序或位点。如本文所用，“N连接的糖基化基序”包含氨基酸序列N-X1-S/T或由其组成，其中N是天冬酰胺，X1是除脯氨酸(P)之外的任何氨基酸，并且S/T是丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。聚糖与天冬酰胺残基的氮原子附接。参见例如Drickamer K,Taylor ME(2006),Introduction to Glycobiology(第2版).Oxford University Press,USA。N连接的糖基化基序出现在SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的人IgM重链恒定区中，从位置46(“N1”)、209(“N2”)、272(“N3”)、279(“N4”)和440(“N5”)开始。这五个基序在非人灵长类动物IgM重链恒定区中是保守的，而五个中的四个在小鼠IgM重链恒定区中是保守的。因此，在一些实施方案中，本文提供的多聚结合分子的IgM重链恒定区包含5个N连接的糖基化基序：N1、N2、N3、N4和N5。在一些实施方案中，每个IgM重链恒定区上的至少三个N连接的糖基化基序(例如，N1、N2和N3)由复合聚糖占据。

在某些实施方案中，至少一个、至少两个、至少三个或至少四个N-X1-S/T基序可包括阻止所述基序处的糖基化的氨基酸插入、缺失或取代。在某些实施方案中，IgM衍生的多聚结合分子可包括N1基序、N2基序、N3基序、N5基序或N1、N2、N3或N5基序中的两个或更多个、三个或更多个或全部四个的任何组合处的氨基酸插入、缺失或取代，其中氨基酸插入、缺失或取代阻止所述基序处的糖基化。在一些实施方案中，IgM恒定区相对于野生型人IgM恒定区在SEQ ID NO:35(人IgM恒定区等位基因IGHM*03)或SEQ ID NO:36(人IgM恒定区等位基因IGHM*04)的位置46、209、272或440处包含两个或更多个取代。参见例如美国临时申请第62/891,263号，其以引用的方式整体并入本文中。

多核苷酸和载体

在某些实施方案中，本公开提供了包含编码本文所述的多聚结合分子的多肽亚基的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸编码多肽亚基，所述多肽亚基包含多聚结合分子的重链恒定区和PD-1结合域的至少抗体VH部分。在一些实施方案中，多核苷酸编码包含多聚结合分子的重链的多肽亚基。

在一些实施方案中，多核苷酸编码多肽亚基，所述多肽亚基包含多聚结合分子的轻链恒定区和PD-1结合域的抗体VL部分。在一些实施方案中，多核苷酸编码包含多聚结合分子的轻链的多肽亚基。

在某些实施方案中，本公开提供了包含本文所述的一种或多种多核苷酸的载体。在一些实施方案中，载体还含有包含编码J链或其功能片段或变体的核酸序列的多核苷酸。

在某些实施方案中，本公开提供了包含第一载体和第二载体的组合物，其中：a)第一载体含有包含编码多聚结合分子的重链的核酸序列的多核苷酸，且第二载体含有包含编码多聚结合分子的轻链的核酸序列的多核苷酸，b)第一载体含有包含编码多聚结合分子的重链的核酸序列的多核苷酸和包含编码多聚结合分子的轻链的核酸序列的多核苷酸，且第二载体含有包含编码J链或其功能片段或变体的核酸序列的多核苷酸，c)第一载体含有包含编码多聚结合分子的重链的核酸序列的多核苷酸和包含编码J链或其功能片段或变体的核酸序列的多核苷酸，且第二载体含有包含编码多聚结合分子的轻链的核酸序列的多核苷酸，或d)第一载体含有包含编码多聚结合分子的轻链的核酸序列的多核苷酸和包含编码J链或其功能片段或变体的核酸序列的多核苷酸，且第二载体含有包含编码多聚结合分子的重链的核酸序列的多核苷酸。在某些实施方案中，本公开提供了包含第一载体、第二载体和第三载体的组合物，其中第一载体含有包含编码多聚结合分子的重链的核酸序列的多核苷酸，第二载体含有包含编码多聚结合分子的轻链的核酸序列的多核苷酸，且第三载体含有包含编码J链或其功能片段或变体的核酸序列的多核苷酸。

宿主细胞

在某些实施方案中，本公开提供了能够产生如本文提供的多聚结合分子的宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞包含一种或多种载体、包含多种载体的组合物或本文公开的多核苷酸。本公开还提供了产生如本文提供的多聚结合分子的方法，其中所述方法包括培养所提供的宿主细胞以及回收多聚结合分子。

使用方法

本公开还提供一种治疗需要治疗的受试者的疾病或病症的方法，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的如本文提供的多聚结合分子。“治疗有效剂量或量”或“有效量”意指多聚结合分子在施用时对于受试者治疗产生积极的免疫治疗反应的量。

用于治疗疾病或病症的组合物的有效剂量的变化取决于许多不同因素，包括施用方式、靶位点、受试者的生理状态、受试者是人还是动物、所施用的其它药物以及治疗是预防性还是治疗性的。通常，受试者是人，但也可治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。可使用本领域的技术人员已知的常规方法来滴定治疗剂量，以优化安全性和功效。

在某些实施方案中，本公开提供一种治疗需要治疗的受试者的自身免疫病症、炎症性病症或其组合的方法，其中所述方法包括向受试者施用有效量的如本文提供的多聚结合分子。在某些实施方案中，与施用等量的与相同结合搭配物结合的单体或二聚结合分子相比，将本文提供的多聚结合分子施用于受试者产生更高的效力。在某些实施方案中，单体或二聚结合分子包括与本文提供的多聚结合分子相同的结合多肽。“等量”意指例如通过分子量测量的量，例如以总毫克计，或者意指摩尔当量，例如在施用等量分子的情况下。

在某些实施方案中，自身免疫疾病可为例如关节炎，例如类风湿性关节炎、骨关节炎或强直性脊柱炎；多发性硬化症(MS)；炎症性肠病(IBD)，例如克罗恩氏病(Crohn'sdisease)或溃疡性结肠炎；或全身性红斑狼疮(SLE)。在某些实施方案中，炎症性疾病或病症可为例如关节炎，例如类风湿性关节炎或骨关节炎或银屑病关节炎、莱姆病(Lymedisease)、SLE、MS、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、哮喘、炎症性肠病、局部缺血、动脉粥样硬化或中风。

在其它实施方案中，本公开提供一种预防移植接受者的移植排斥反应的方法，其中所述方法包括向受试者施用有效量的本文提供的多聚结合分子。在某些实施方案中，与施用等量的与相同结合搭配物结合的单体或二聚结合多肽相比，将本文提供的多聚结合分子施用于受试者产生更高的效力。在某些实施方案中，单体或二聚结合分子包括与本文提供的多聚结合分子相同的结合多肽。“等量”意指例如通过分子量测量的量，例如以总毫克计，或者意指摩尔当量，例如在施用等量分子的情况下。

待治疗的受试者可为任何需要治疗的动物(例如，哺乳动物)，在某些实施方案中，受试者是人受试者。

以其最简单的形式，待向受试者施用的制剂是以常规剂型施用的如本文所提供的多聚结合分子，其可与本文别处所述的药物赋形剂、载体或稀释剂组合。

可通过任何合适的方法来施用本公开的多聚结合分子，例如胃肠外、心室内、经口、通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或通过植入式贮存器施用。如本文中所用的术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内以及颅内注射或输注技术。

药物组合物和施用方法

鉴于本公开，本领域技术人员熟知或容易地确定制备本文提供的多聚结合分子并将其施用于有需要的受试者的方法。施用途径可为例如经口、肠胃外、通过吸入或局部。如本文所用的术语肠胃外包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、经直肠或经阴道施用。尽管这些施用形式被认为是合适的形式，但是施用形式的另一实例是注射用溶液，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。合适的药物组合物可包括缓冲剂(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯)、任选地稳定剂(例如，人白蛋白)等。

如本文所论述的，本文提供的多聚结合分子可以药学有效量施用以治疗有需要的受试者。就此而言，应理解，可配制所公开的多聚结合分子，以便于施用和促进活性剂的稳定性。因此，药物组合物可包括药学上可接受、无毒、无菌的载体(例如生理盐水)、无毒缓冲剂、防腐剂等。如本文所提供的多聚结合分子的药学有效量意指足够实现与靶标的有效结合并实现治疗益处的量。合适的配制物描述于Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co.)第16版,(1980)中。

本文提供的某些药物组合物可以可接受的剂型口服施用，所述剂型包括例如胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。某些药物组合物也可通过鼻气雾剂或吸入施用。采用苄醇或其它合适的防腐剂、增强生物利用率的吸收促进剂、和/或其它常规稳定剂或分散剂，可将此类组合物制备成盐水中的溶液。

可与载体材料组合以产生单一剂型的多聚结合分子的量将根据例如所治疗的受试者和特定施用模式而改变。组合物可作为单剂量、多剂量或以输注的形式在确定的时间段内施用。还可调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应或预防反应)。

在本公开的范围内，本文提供的多聚结合分子可以足以产生治疗效果的量施用于需要治疗的受试者。本文提供的多聚结合分子可以常规剂型施用于受试者，所述常规剂型通过根据已知的技术将本公开的多聚结合分子与常规药学上可接受的载体或稀释剂组合来制备。药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特征可由与其组合的活性成分的量、施用途径和其它众所周知的变量来决定。

本公开还提供了本文提供的多聚结合分子在制造用于治疗、预防或控制疾病或病症，例如自身免疫疾病、炎症性疾病或用于预防移植排斥反应的药剂中的用途。

除非另外指示，否则本公开采用本领域技术范围内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。文献中充分解释了此类技术。参见例如Green和Sambrook编(2012)Molecular Cloning A Laboratory Manual(第4版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人编(1992)MolecularCloning:A Laboratory Manual,(Cold Springs Harbor Labo ratory,NY)；D.N.Glover和B.D.Hames编,(1995)DNA Cloning第2版(IRL Press),第1-4卷；Gait编(1990)Oligonucleotide Synthesis(IRL Press)；Mullis等人,美国专利第4,683,195号；Hames和Higgins编(1985)Nucleic Acid Hybridization(IRL Press)；Hames和Higgins编(1984)Transcription And Translation(IRL Press)；Freshney(2016)Culture Of AnimalCells,第7版(Wiley-Blackwell)；Woodward,J.,Immobilized Cells And Enzymes(IRLPress)(1985)；Perbal(1988)A Practical Guide To Molecular Cloning；第2版(Wiley-Interscience)；Miller和Calos编(1987)Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells,(Cold Spring Harbor Laboratory)；S.C.Makrides(2003)Gene Transfer andExpression in Mammalian Cells(Elsevier Science)；Methods in Enzymology,第151-155卷(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Mayer和Walker编(1987)Immunochemical Methodsin Cell and Molecular Biology(Academic Press,London)；Weir和Blackwell编；以及Ausubel等人,(1995)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley andSons)。

抗体工程的一般原理提出于例如Strohl、W.R.和L.M.Strohl(2012),TherapeuticAntibody Engineering(Woodhead Publishing)中。蛋白质工程的一般原理提出于例如Park和Cochran编(2009),Protein Engineering and Design(CDC Press)中。免疫学的一般原理提出于例如：Abbas和Lichtman(2017)Cellular and Molecular Immunology第9版(Elsevier)中。此外，可遵循本领域已知的免疫学标准方法，例如Current Protocols inImmunology(Wiley Online Library)；Wild,D.(2013),The Immunoassay Handbook第4版(Elsevier Science)；Greenfield编(2013),Antibodies,a Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Press)；和Ossipow和Fischer编(2014),Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Humana Press)中的方法。

以上引用的所有参考文献以及本文引用的所有参考文献均以引用的方式整体并入本文中。

示例性实施方案

所提供的实施方案包括：

实施方案1.一种包含两个、五个或六个二价结合单元或其变体或片段的多聚结合分子，

其中每个结合单元包含两个各自与结合域缔合的IgA或IgM重链恒定区或其多聚化片段或变体，

其中三至十二个所述结合域是程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)结合域，其特异性地并且激动性地与PD-1结合，

其中所述结合分子可激活细胞中的PD-1介导的信号转导，其效力高于等量的包含两个相同PD-1结合域的二价IgG抗体或其片段，所述抗体或其片段也特异性地与PD-1结合并刺激PD-1。

实施方案2.如实施方案1所述的多聚结合分子，其中两个、五个或六个结合单元是人、人源化或嵌合免疫球蛋白结合单元。

实施方案3.如实施方案1或实施方案2所述的多聚结合分子，其中三个至十二个PD-1结合域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH和VL包含六个免疫球蛋白互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3构成包含以下的抗体的CDR：分别地，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50的VH和VL，或SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ IDNO:22中的任一者的VL，或包含以下的抗体的CDR：分别地，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ IDNO:50，在HCDR或LCDR中的一者或多者中具有一个或两个单一氨基酸取代，或SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22中的任一者的VL，在HCDR或LCDR中的一者或多者中具有一个或两个单一氨基酸取代。

实施方案4.如实施方案3所述的多聚结合分子，其中VH和VL包含六个免疫球蛋白互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3构成分别包含以下的抗体的CDR：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14以及SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的VH和VL，或分别包含以下的抗体的CDR：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14以及SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26，在HCDR或LCDR中的一者或多者中具有一个或两个单一氨基酸取代。

实施方案5.如实施方案1至3中任一项所述的多聚结合分子，其中结合分子的三个至十二个PD-1结合域包含抗体VH和VL，其中VH和VL包含与以下各者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的氨基酸序列：分别地，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ IDNO:50，或SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQID NO:24中的任一者的VH和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22中的任一者的VL。

实施方案6.如实施方案5所述的多聚结合分子，其中结合分子的三个至十二个PD-1结合域包含抗体VH和VL，其中VH和VL包含分别与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14以及SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的氨基酸序列。

实施方案7.如实施方案5所述的多聚结合分子，其中三个至十二个PD-1结合域包含抗体VH和VL区，其分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ IDNO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，或包含SEQID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22中的任一者的VL。

实施方案8.如实施方案7所述的多聚结合分子，其中三个至十二个PD-1结合域包含抗体VH和VL区，其分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQID NO:4、AEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。

实施方案9.如实施方案1至3、5或7中任一项所述的多聚结合分子，其中每个结合单元包含两条重链和两条轻链，其中重链和轻链包含与以下各者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的VH和VL氨基酸序列：分别地，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，或SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQID NO:22中的任一者的VL。

实施方案10.如实施方案9所述的多聚结合分子，其中每个结合单元包含两条重链和两条轻链，其中重链和轻链包含分别与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQID NO:4、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的VH和VL氨基酸序列。

实施方案11.如实施方案8所述的多聚结合分子，其中重链和轻链分别包含VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50，或包含SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22中的任一者的VL。

实施方案12.如实施方案11所述的多聚结合分子，其中重链和轻链分别包含抗体VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、AEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。

实施方案13.如实施方案1至10中任一项所述的多聚结合分子，所述多聚结合分子是包含两个二价IgA或IgA样结合单元和J链或其功能片段或变体的二聚结合分子，其中每个结合单元包含两个各自包含IgA Cα3域和IgA尾段域的IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体。

实施方案14.如实施方案13所述的多聚结合分子，其中每个IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体还包含Cα1域、Cα2域、IgA铰链区或其任何组合。

实施方案15.如实施方案13或实施方案14所述的多聚结合分子，其中IgA重链恒定区或其多聚化片段是人IgA恒定区。

实施方案16.如实施方案13至15中任一项所述的多聚结合分子，其中每个结合单元包含两条IgA重链，所述IgA重链各自包含位于IgA恒定区或其多聚化片段的氨基端的VH；以及两条免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链各自包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基端的VL。

实施方案17.如实施方案1至12中任一项所述的多聚结合分子，所述多聚结合分子是分别包含五个或六个二价IgM结合单元的五聚或六聚结合分子，其中每个结合单元包含两个各自与PD-1结合域缔合的IgM重链恒定区或其多聚化片段，其中每个IgM重链恒定区包含IgM Cμ4和IgM尾段域。

实施方案18.如实施方案17所述的多聚结合分子，其中IgM重链恒定区或其片段或变体各自还包含Cμ1域、Cμ2域、Cμ3域或其任何组合。

实施方案19.如实施方案18所述的多聚结合分子，其中IgM重链恒定区是人IgM恒定区。

实施方案20.如实施方案17至19中任一项所述的多聚结合分子，其中每个结合单元包含两条IgM重链，所述IgM重链各自包含位于IgM恒定区或其片段的氨基端的VH；以及两条免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链各自包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基端的VL。

实施方案21.如实施方案17至20中任一项所述的多聚结合分子，所述多聚结合分子包含SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36或其多聚化片段。

实施方案22.如实施方案17至20中任一项所述的多聚结合分子，其中IgM恒定区相对于野生型人IgM恒定区在SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的位置310、311、313和/或315处包含取代。

实施方案23.如实施方案17至20中任一项所述的多聚结合分子，其中IgM恒定区相对于野生型人IgM恒定区在SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的位置46、209、272或440处包含两个或更多个取代。

实施方案24.如实施方案17至22中任一项所述的多聚结合分子，所述多聚结合分子是五聚的，并且还包含J链或其功能片段或变体。

实施方案25.如实施方案24所述的多聚结合分子，其中J链或其功能片段或变体是相对于野生型J链包含一个或多个可影响多聚结合分子的血清半衰期的单一氨基酸取代、缺失或插入的变体J链；且其中相对于除了一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入之外相同，并以相同方式施用于相同动物物种的参考多聚结合分子，包含变体J链的多聚结合分子在施用于动物时表现出增加的血清半衰期。

实施方案26.如实施方案25所述的多聚结合分子，其中J链或其功能片段在对应于成熟野生型人J链(SEQ ID NO:41)的氨基酸Y102的氨基酸位置处包含氨基酸取代。

实施方案27.如实施方案26所述的多聚结合分子，其中对应于SEQ ID NO:41的Y102的氨基酸被丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或精氨酸(R)取代。

实施方案28.如实施方案27所述的多聚结合分子，其中对应于SEQ ID NO:41的Y102的氨基酸被丙氨酸(A)取代。

实施方案29.如实施方案28所述的多聚结合分子，其中J链是变体人J链并且包含氨基酸序列SEQ ID NO:42。

实施方案30.如实施方案25至29中任一项所述的多聚结合分子，其中J链或其功能片段在对应于成熟人J链(SEQ ID NO:41)的氨基酸N49、氨基酸S51或N49和S51两者的氨基酸位置处包含氨基酸取代，其中对应于SEQ ID NO:41的位置S51的单一氨基酸取代不是苏氨酸(T)取代。

实施方案31.如实施方案30所述的多聚结合分子，其中对应于SEQ ID NO:41的N49的位置被丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)或天冬氨酸(D)取代。

实施方案32.如实施方案31所述的多聚结合分子，其中对应于SEQ ID NO:41或SEQID NO:42的N49的位置被丙氨酸(A)取代。

实施方案33.如实施方案30至32中任一项所述的多聚结合分子，其中对应于SEQID NO:41或SEQ ID NO:42的S51的位置被丙氨酸(A)或甘氨酸(G)取代。

实施方案34.如实施方案33所述的多聚结合分子，其中对应于SEQ ID NO:41或SEQID NO:42的S51的位置被丙氨酸(A)取代。

实施方案35.如实施方案13至16或24至34中任一项所述的多聚结合分子，其中J链或其功能片段或变体还包含异源多肽，其中异源多肽直接或间接与J链或其功能片段或变体融合。

实施方案36.如实施方案35所述的多聚结合分子，其中异源多肽通过肽接头与J链或其片段融合。

实施方案37.如实施方案36所述的多聚结合分子，其中肽接头包含至少5个氨基酸，但不超过25个氨基酸。

实施方案38.如实施方案36或37所述的多聚结合分子，其中肽接头由GGGGS(SEQID NO:43)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:44)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:45)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:46)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:47)组成。

实施方案39.如实施方案35至38中任一项所述的多聚结合分子，其中异源多肽与J链或其片段或变体的N端、J链或其片段或变体的C端或J链或其片段或变体的N端和C端两者融合。

实施方案40.如实施方案35至39中任一项所述的多聚结合分子，其中异源多肽可影响多聚结合分子的吸收、分布、代谢和/或排泄(ADME)。

实施方案41.如实施方案35至39中任一项所述的多聚结合分子，其中所述异源多肽包含抗原结合域。

实施方案42.如实施方案41所述的多聚结合分子，其中所述异源多肽的抗原结合域是抗体或其抗原结合片段。

实施方案43.如实施方案42所述的多聚结合分子，其中抗原结合片段包含Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)片段或其任何组合。

实施方案44.如实施方案42或实施方案43所述的多聚结合分子，其中所述抗原结合片段是scFv片段。

实施方案45.如实施方案41至44中任一项所述的多聚结合分子，其中抗原结合域结合ICOS配体(ICOSLG)、ICOS(CD278)、白细胞介素6(IL6)、CD28、CD3、CD80、CD86、肿瘤坏死因子α(TNFa)或成纤维细胞激活蛋白(FAP)。

实施方案46.一种组合物，所述组合物包含如实施方案1至45中任一项所述的多聚结合分子。

实施方案47.一种多核苷酸，其包含编码如实施方案1至45中任一项所述的结合分子的多肽亚基的核酸序列。

实施方案48.如实施方案47所述的多核苷酸，其中多肽亚基包含多聚结合分子的IgM重链恒定区和PD-1结合域的至少抗体VH部分。

实施方案49.如实施方案48所述的多核苷酸，其中所述多肽亚基包含与VH的C末端融合的人IgM恒定区或其片段，所述VH包含：

(a)HCDR1、HCDR2和HCDR3区，其包含VH氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:49中所含的CDR，或VH氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:33或SEQ ID NO:49中所含的CDR，在一个或多个HCDR中具有一个或两个单一氨基酸取代；或

(b)与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQID NO:33或SEQ ID NO:49至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的氨基酸序列。

实施方案50.如实施方案47至49中任一项所述的多核苷酸，其中所述多肽亚基包含多聚结合分子的轻链恒定区和PD-1结合域的抗体VL部分。

实施方案51.如实施方案50所述的多核苷酸，其中所述多肽亚基包含与VL的C末端融合的人κ或λ轻链恒定区或其片段，所述VL包含：

(a)LCDR1、LCDR2和LCDR3区，其包含VL氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQID NO:32、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:50中所含的CDR，或VH氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:50中所含的CDR，在一个或多个LCDR中具有一个或两个单一氨基酸取代；或

(b)与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:50至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的氨基酸序列。

实施方案52.一种组合物，其包含如实施方案47至49中任一项所述的多核苷酸，以及如实施方案47、50或51中任一项所述的多核苷酸。

实施方案53.如实施方案52所述的组合物，其中所述多核苷酸位于单独的载体上。

实施方案54.如实施方案52所述的组合物，其中所述多核苷酸位于单一载体上。

实施方案55.如实施方案52至54中任一项所述的组合物，所述组合物还含有包含编码J链或其功能片段或其功能变体的核酸序列的多核苷酸。

实施方案56.如实施方案54所述的载体。

实施方案57.如实施方案53所述的载体。

实施方案58.一种宿主细胞，其包含如实施方案47至51中任一项所述的多核苷酸、如实施方案52至55中任一项所述的组合物或如实施方案56或57中任一项所述的载体，其中所述宿主细胞可表达如实施方案1至45中任一项所述的结合分子或其亚基。

实施方案59.一种产生如实施方案1至44中任一项所述的结合分子的方法，所述方法包括培养如实施方案58所述的宿主细胞，以及回收所述结合分子。

实施方案60.一种治疗需要治疗的受试者的自身免疫病症、炎症性病症或其组合的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如实施方案1至45中任一项所述的多聚结合分子，其中所述多聚结合分子表现出比与相同结合搭配物结合的等量的单体或二聚结合分子更大的效力。

实施方案61.一种预防受试者的移植排斥反应的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的如实施方案1至45中任一项所述的多聚结合分子，其中所述多聚结合分子表现出比与相同结合搭配物结合的等量的单体或二聚结合分子更大的效力，且其中所述受试者是移植接受者。

实施方案62.如实施方案60或实施方案61所述的方法，其中所述受试者是人。

通过示例性而非通过限制性的方式提供以下实施例。

实施例

实施例1：材料和方法

PathHunter Checkpoint Signaling Assay(Eurofins DiscoverX)用于确定抗体或重组蛋白诱导的PD-1信号传导的相对水平。此分析利用通过酶片段互补方法进行修饰的Jurkat细胞，其中部分β-半乳糖苷酶被分裂并共价连接至细胞内PD-1信号传导域或SHP-1细胞内信号传导介质，后者在信号传导事件期间自然地与PD-1缔合。在存在底物的情况下，PD-1信号传导诱导化学发光信号。

根据标准细胞培养程序解冻和扩增PD-1报告基因Jurkat细胞。在96孔板中以每孔45μL接种细胞，并添加10×最终浓度的抗体，并在37℃下培育30分钟。添加45μL体积的PD-L1+配体呈递细胞或其它培养基，并且再培育2-8小时。添加10μL Bioassay Reagent 2，并且在室温下避光培育细胞15分钟。将40μL Bioassay Reagent 2和细胞在室温下避光再培育1小时。在Molecular Devices SpectraMax Paradigm上测量化学发光信号，并在GraphPad Prism中分析数据。

实施例2：抗体产生和纯化

抗PD-1IgM#1和#2以及抗PD-1IgG#1和#2

作为示例性构建体，根据标准克隆方案，将两种抗PD-1抗体的VH和VL区并入IgM(具有示例性J链，SEQ ID NO:41)和IgG形式中。抗PD-1#1构建体分别包括VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，并且抗PD-1#2构建体分别包括VH和VL氨基酸序列SEQ IDNO:25和SEQ ID NO:26。这些抗体构建体根据WO2017196867中描述的方法进行表达和纯化。IgM抗体组装成具有J链的五聚体(数据未示出)。

实施例3：根据ELISA的PD-1结合

进行酶联免疫吸附分析(ELISA)以评估抗PD-1抗体与人、食蟹猴或小鼠PD-1的结合。通过在4℃下过夜培育，使用含有PD-1细胞外域以及免疫球蛋白Fc区或His标签的重组蛋白涂布标准96孔ELISA板的孔。去除未结合的重组蛋白，添加Pierce SUPERBLOCKTM T20，并且将板在室温下摇动培育10分钟。用磷酸盐缓冲盐水-TWEEN-20(PBST)洗涤板，并将抗PD-1抗体添加至含有1％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并在室温下摇动培育一小时。接着将板在PBST中洗涤，并与针对人IgG或人IgM的F(ab')2中的辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗一起培育。一小时后，再次用PBST洗涤板，用SUPERSIGNAL^TMELISA Pico底物产生信号，并使用

光度计(PerkinElmer)记录信号。使用GRAPHPAD

分析数据。人PD-1的结果显示于图1中。每种抗体和形式的计算半最大有效浓度(EC50)显示于表2中。所有抗体也结合食蟹猴PD-1，但不结合小鼠PD-1。

表2：ELISA EC₅₀

抗体	IgG EC<sub>50</sub>(nM)	IgM EC<sub>50</sub>(nM)
			#1	1.5	0.087
#2	0.60	0.35

实施例4：基于PD-1细胞的结合分析

HEK293细胞被修饰为过表达人或小鼠PD-1。细胞在含嘌呤霉素的培养基中扩增以保持选择，并等分至96孔V型底板中用于抗体染色和流式细胞术分析。将抗PD-1抗体添加至含有胎牛血清的BD染色缓冲液(BD Biosciences，目录号554656)中的细胞中，并在冰上培育20分钟。接着洗涤细胞，且接着添加R-藻红蛋白(PE)标记的抗人IgG或抗人IgM二抗并再培育20分钟。在Beckman Coulter

细胞仪上收集数据并在FLOWJOTM中进行分析。人PD-1的结果显示于图2中。每种抗体和形式的计算EC50显示于表3中。抗体不结合小鼠PD-1。

表3：细胞结合EC₅₀

抗体	IgG EC<sub>50</sub>(nM)	IgM EC<sub>50</sub>(nM)
			#1	59	0.20
#2	2.9	n/a

实施例5：PD-1信号传导分析

Checkpoint Signaling Assay(Eurofins DiscoverX)用于确定抗体诱导的PD-1信号传导的相对水平。此分析利用酶片段互补方法，其中部分β-半乳糖苷酶被分裂并共价连接至细胞内PD-1信号传导域或SHP-1细胞内信号传导介质。当SHP-1在信号传导事件期间与PD-1缔合时，会产生化学发光信号。

根据制造商的说明书解冻和扩增PD-1报告基因Jurkat细胞。在96孔板中以每孔40μL接种细胞过夜，并添加10×最终浓度的抗体，并在37℃下培育1小时。接着添加40μL体积的PD-L1+配体呈递细胞或其它培养基，并在室温下再培育1小时。添加10μL BioassayReagent 1(Eurofins Discover X目录号93-1104719-001117的组分)，并在室温下避光培育细胞15分钟。添加40μL Bioassay Reagent 2，并将细胞在室温下避光再培育3小时。在PerkinElmer的

多标签读板器上测量化学发光信号，并使用GRAPHPAD

进行数据分析。抗体#1和抗体#2的结果分别显示于图3A和图3B中。每种抗体和形式的计算的EC50显示于表4中。IgM形式的抗体显示出比IgG形式的抗体更高的效力。

表4：PD-1信号传导EC₅₀

抗体	IgG EC<sub>50</sub>(nM)	IgM EC<sub>50</sub>(nM)
			#1	65	0.014
#2	ND	0.72

实施例6：PD-1信号传导分析

重复实施例5中描述的PD-1信号分析，以确定交联IgG抗体#1和#2诱导的PD-1信号的相对水平。使用“交联抗体”(AffiniPure F(ab')2Fragment Goat Anti-Human IgG,F(ab')2Fragment Specific(Jackson ImmunoResearch,P/N 109-006-097))交联IgG抗体。将交联抗体稀释并以每孔10μL添加，最终交联抗体与PD-1激动剂抗体的比率为1:1。

与实施例5的结果相比的抗体#1和抗体#2的所得PD-1信号传导分别显示于图4A和4B中。与实施例5形式的结果相比的每种抗体的计算的EC50显示于表5中。IgM形式的抗体显示出比IgG形式的抗体更高的效力。交联的IgG抗体具有中间效应。

表5：PD-1信号传导EC₅₀

实施例7：额外抗体的产生和纯化

作为额外的示例性构建体，根据标准克隆方案，将两种抗PD-1抗体的VH和VL区并入IgM(具有示例性J链，SEQ ID NO:41)和IgG形式中。抗PD-1#3构建体分别包括VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，并且抗PD-1#4构建体分别包括VH和VL氨基酸序列SEQID NO:3和SEQ ID NO:4。这些抗体构建体根据WO2017196867中描述的方法进行表达和纯化。IgM抗体组装成具有J链的五聚体(数据未示出)。

实施例8：PD-1信号传导分析

PD-1信号传导分析根据实施例5和6中的方法进行，具有以下修改：在所有条件下在4℃下进行添加额外培养基后的第二次1小时培育。抗体#1-抗体#4的结果分别显示于图5A-5D中。每种抗体和形式的计算的EC50显示于表6中。IgM形式的抗体显示出比IgG形式的抗体更高的效力。交联的IgG抗体具有中间效应。

表6：PD-1信号传导EC₅₀

实施例9：抗体产生和纯化

抗PD-1IgG和五聚IgM#5

作为额外的示例性构建体，根据标准克隆方案，将抗PD-1抗体的VH和VL区并入IgM(具有示例性J链，SEQ ID NO:41)和IgG形式中。抗PD-1#5构建体分别包括VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50。这些抗体构建体根据WO2017196867中描述的方法进行表达和纯化。IgM抗体组装成具有J链的五聚体(数据未示出)。

抗PD-1六聚IgM(IgHM)#1、#2、#3和#5

作为示例性构建体，根据标准克隆方案，将三种抗PD-1抗体的VH和VL区并入无J链的IgM中。抗PD-1#1IgHM构建体分别包括VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，抗PD-1#2IgHM构建体分别包括VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:25和SEQ IDNO:26，抗PD-1#3IgHM构建体分别包括VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，抗PD-1#5IgHM构建体分别包括VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50。这些抗体构建体根据WO2017196867中描述的方法进行表达和纯化。IgM抗体组装成无J链的六聚体(数据未示出)。

实施例10：PD-1信号传导分析

根据实施例8中的方法用IgG、交联IgG、五聚IgM和六聚IgM(IgHM)形式的抗体#1-#3和#5进行PD-1信号传导分析。抗体#1-抗体#3和抗体#5的结果分别显示于图6A-6D中。每种抗体和形式的计算的EC50显示于表7中。IgM形式的抗体显示出比IgG形式的抗体更高的效力。交联的IgG抗体具有中间效应。

表7：PD-1信号传导EC₅₀

序列表

<110> IGM生物科学公司(IGM BIOSCIENCES, INC.)

<120> PD-1激动剂多聚结合分子

<130> 005-031WO1

<140>

<141>

<150> 63/144,708

<151> 2021-02-02

<150> 63/050,413

<151> 2020-07-10

<150> 63/014,023

<151> 2020-04-22

<160> 50

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Ser Leu Ser Lys Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Tyr Thr Ser Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

50 55 60

Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Thr Gly Asn Pro Tyr Tyr Thr Asn Gly Phe Asn Ser Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Ser Pro Asn Asn Leu

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asp Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Asn Tyr Tyr Val Gly Pro

85 90 95

Val Ser Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Ile Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Thr Tyr Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Leu Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 5

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Leu Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Val Arg Lys Gly Tyr Tyr Asp Tyr Gly Tyr Val Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 6

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Leu Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn

85 90 95

Leu Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys

100 105 110

<210> 7

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 7

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Phe Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Met Arg Gln Leu Gly Arg Phe Val Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr

20 25 30

Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Asn Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 9

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 9

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Val Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Phe His Trp Val Lys Gln Arg Pro Asp Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Val Ser Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Leu

50 55 60

Gln Asp Lys Ala Thr Ile Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Leu Ile Tyr Tyr Gly Phe Glu Glu Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Val Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Asn Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Phe Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 11

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Asn Glu Gly Gly Ile Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Asp Tyr Tyr Asp Tyr Gly Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 13

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Asn Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Ile Gly Ser Ser Ala Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 14

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Gly Gln Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Phe Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 15

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Pro Ile Glu Trp Met Arg Gln Ala His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Phe His Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Thr Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Asn Tyr Gly Ser His Gly Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115

<210> 16

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 16

Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ile Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Lys Ala Pro Lys Leu Trp

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Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro

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Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

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<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Pro Ile Glu Trp Met Arg Gln Ala His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Phe His Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Asn Tyr Gly Ser His Gly Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115

<210> 18

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 18

Glu Asn Val Met Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ile Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Lys Ala Pro Lys Leu Phe

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Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 19

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Pro Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Phe His Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Asn Tyr Gly Ser His Gly Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115

<210> 20

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 20

Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ile Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Trp

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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

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<210> 21

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Pro Ile Glu Trp Met Arg Gln Ala His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Phe His Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

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65 70 75 80

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Ala Arg Glu Asn Tyr Gly Ser His Gly Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115

<210> 22

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 22

Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Phe Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ile Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Ala Lys Ala Pro Lys Leu Phe

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Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 23

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Pro Ile Glu Trp Met Arg Gln Ala His Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Phe His Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Asn Tyr Gly Ser His Gly Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115

<210> 24

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Pro Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asn Phe His Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Asn Tyr Gly Ser His Gly Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115

<210> 25

<211> 128

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 25

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Val Val Lys Pro Ser Gly

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Gly Ser Ile Gly Ser Gly

20 25 30

Gly Ser Ile Arg Ser Thr Arg Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro

35 40 45

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr

50 55 60

Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Lys

65 70 75 80

Ser Arg Asn His Phe Ser Leu Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Asp Tyr Gly Asp Ser Gly Asp

100 105 110

Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Lys Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 26

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 26

Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn

20 25 30

Ser Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val

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Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

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Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly

65 70 75 80

Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ser Asp Ser

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Ser Ala Val Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 27

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

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Gly Trp Ile Ser Ala Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Asp Tyr Ser Ser Gly Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 28

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 28

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Gln Tyr Ala

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Met Val Ile Tyr

35 40 45

Lys Asp Thr Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Lys Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Asn Ser Ile Thr Tyr

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Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu

100 105

<210> 29

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Arg Gly Ala Thr Ile Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Ala Gly Ile Tyr Gly Phe Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Arg Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 30

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln His His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Ile Ile Tyr Asp Val Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Leu Ala Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ile Val

85 90 95

Thr Asn Phe Glu Val Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

100 105 110

<210> 31

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 31

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Ala Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Arg Ser Leu Val Thr Ile Ser Val Asp Ala Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ala Ser Asp Tyr Val Trp Gly Gly Tyr Arg Tyr Met Asp

100 105 110

Ala Phe Asp Ile Trp Gly Arg Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 32

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 32

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asn Ser Asn Ile Gly Ser Asn

20 25 30

Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln

65 70 75 80

Ser Glu Asn Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Asn Gly Pro Val Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Glu

100 105 110

<210> 33

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 33

Gly Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val

1 5 10 15

Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

20 25 30

Phe Ser Ser Tyr Trp Cys Asp Arg Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro

35 40 45

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser

50 55 60

Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

65 70 75 80

Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

85 90 95

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Asn Trp Gly Ser Tyr Phe

100 105 110

Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 34

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 34

Gly Val His Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser

1 5 10 15

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly

20 25 30

Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro

35 40 45

Lys Val Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr

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Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 35

<211> 453

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 35

Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn

1 5 10 15

Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp

20 25 30

Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser

35 40 45

Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln

65 70 75 80

Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn

85 90 95

Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys

100 105 110

Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg

115 120 125

Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile

130 135 140

Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr

145 150 155 160

Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr

165 170 175

Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln

180 185 190

Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln

195 200 205

Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val

210 215 220

Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr

225 230 235 240

Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr

245 250 255

Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn

260 265 270

Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala

275 280 285

Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr

290 295 300

Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg

305 310 315 320

Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro

325 330 335

Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu

340 345 350

Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg

355 360 365

Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro

370 375 380

Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val

385 390 395 400

Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala

405 410 415

His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser

420 425 430

Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr

435 440 445

Ala Gly Thr Cys Tyr

450

<210> 36

<211> 453

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 36

Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn

1 5 10 15

Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp

20 25 30

Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser

35 40 45

Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln

65 70 75 80

Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn

85 90 95

Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys

100 105 110

Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg

115 120 125

Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile

130 135 140

Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr

145 150 155 160

Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr

165 170 175

Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Gly Gln

180 185 190

Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln

195 200 205

Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val

210 215 220

Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr

225 230 235 240

Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr

245 250 255

Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn

260 265 270

Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala

275 280 285

Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr

290 295 300

Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg

305 310 315 320

Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro

325 330 335

Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu

340 345 350

Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg

355 360 365

Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro

370 375 380

Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val

385 390 395 400

Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala

405 410 415

His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser

420 425 430

Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr

435 440 445

Ala Gly Thr Cys Tyr

450

<210> 37

<211> 353

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 37

Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr

1 5 10 15

Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe

20 25 30

Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val

35 40 45

Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr

50 55 60

Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly

65 70 75 80

Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp

85 90 95

Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro

100 105 110

Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser

115 120 125

Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn

130 135 140

Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe

145 150 155 160

Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu

165 170 175

Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys

180 185 190

Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr

195 200 205

Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn

210 215 220

Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu

225 230 235 240

Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser

245 250 255

Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro

260 265 270

Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly

275 280 285

Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp

290 295 300

Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu

305 310 315 320

Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro

325 330 335

Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys

340 345 350

Tyr

<210> 38

<211> 340

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 38

Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr

1 5 10 15

Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe

20 25 30

Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val

35 40 45

Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr

50 55 60

Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly

65 70 75 80

Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp

85 90 95

Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro

100 105 110

Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser

115 120 125

Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly

130 135 140

Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly

145 150 155 160

Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu

165 170 175

Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr

180 185 190

Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn Ile Thr Lys

195 200 205

Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser

210 215 220

Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg

225 230 235 240

Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln

245 250 255

Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro

260 265 270

Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala

275 280 285

Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His

290 295 300

Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Met Ala

305 310 315 320

Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp

325 330 335

Gly Thr Cys Tyr

340

<210> 39

<211> 764

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 39

Met Leu Leu Phe Val Leu Thr Cys Leu Leu Ala Val Phe Pro Ala Ile

1 5 10 15

Ser Thr Lys Ser Pro Ile Phe Gly Pro Glu Glu Val Asn Ser Val Glu

20 25 30

Gly Asn Ser Val Ser Ile Thr Cys Tyr Tyr Pro Pro Thr Ser Val Asn

35 40 45

Arg His Thr Arg Lys Tyr Trp Cys Arg Gln Gly Ala Arg Gly Gly Cys

50 55 60

Ile Thr Leu Ile Ser Ser Glu Gly Tyr Val Ser Ser Lys Tyr Ala Gly

65 70 75 80

Arg Ala Asn Leu Thr Asn Phe Pro Glu Asn Gly Thr Phe Val Val Asn

85 90 95

Ile Ala Gln Leu Ser Gln Asp Asp Ser Gly Arg Tyr Lys Cys Gly Leu

100 105 110

Gly Ile Asn Ser Arg Gly Leu Ser Phe Asp Val Ser Leu Glu Val Ser

115 120 125

Gln Gly Pro Gly Leu Leu Asn Asp Thr Lys Val Tyr Thr Val Asp Leu

130 135 140

Gly Arg Thr Val Thr Ile Asn Cys Pro Phe Lys Thr Glu Asn Ala Gln

145 150 155 160

Lys Arg Lys Ser Leu Tyr Lys Gln Ile Gly Leu Tyr Pro Val Leu Val

165 170 175

Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Val Asn Pro Asn Tyr Thr Gly Arg Ile Arg

180 185 190

Leu Asp Ile Gln Gly Thr Gly Gln Leu Leu Phe Ser Val Val Ile Asn

195 200 205

Gln Leu Arg Leu Ser Asp Ala Gly Gln Tyr Leu Cys Gln Ala Gly Asp

210 215 220

Asp Ser Asn Ser Asn Lys Lys Asn Ala Asp Leu Gln Val Leu Lys Pro

225 230 235 240

Glu Pro Glu Leu Val Tyr Glu Asp Leu Arg Gly Ser Val Thr Phe His

245 250 255

Cys Ala Leu Gly Pro Glu Val Ala Asn Val Ala Lys Phe Leu Cys Arg

260 265 270

Gln Ser Ser Gly Glu Asn Cys Asp Val Val Val Asn Thr Leu Gly Lys

275 280 285

Arg Ala Pro Ala Phe Glu Gly Arg Ile Leu Leu Asn Pro Gln Asp Lys

290 295 300

Asp Gly Ser Phe Ser Val Val Ile Thr Gly Leu Arg Lys Glu Asp Ala

305 310 315 320

Gly Arg Tyr Leu Cys Gly Ala His Ser Asp Gly Gln Leu Gln Glu Gly

325 330 335

Ser Pro Ile Gln Ala Trp Gln Leu Phe Val Asn Glu Glu Ser Thr Ile

340 345 350

Pro Arg Ser Pro Thr Val Val Lys Gly Val Ala Gly Gly Ser Val Ala

355 360 365

Val Leu Cys Pro Tyr Asn Arg Lys Glu Ser Lys Ser Ile Lys Tyr Trp

370 375 380

Cys Leu Trp Glu Gly Ala Gln Asn Gly Arg Cys Pro Leu Leu Val Asp

385 390 395 400

Ser Glu Gly Trp Val Lys Ala Gln Tyr Glu Gly Arg Leu Ser Leu Leu

405 410 415

Glu Glu Pro Gly Asn Gly Thr Phe Thr Val Ile Leu Asn Gln Leu Thr

420 425 430

Ser Arg Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Leu Thr Asn Gly Asp Thr Leu

435 440 445

Trp Arg Thr Thr Val Glu Ile Lys Ile Ile Glu Gly Glu Pro Asn Leu

450 455 460

Lys Val Pro Gly Asn Val Thr Ala Val Leu Gly Glu Thr Leu Lys Val

465 470 475 480

Pro Cys His Phe Pro Cys Lys Phe Ser Ser Tyr Glu Lys Tyr Trp Cys

485 490 495

Lys Trp Asn Asn Thr Gly Cys Gln Ala Leu Pro Ser Gln Asp Glu Gly

500 505 510

Pro Ser Lys Ala Phe Val Asn Cys Asp Glu Asn Ser Arg Leu Val Ser

515 520 525

Leu Thr Leu Asn Leu Val Thr Arg Ala Asp Glu Gly Trp Tyr Trp Cys

530 535 540

Gly Val Lys Gln Gly His Phe Tyr Gly Glu Thr Ala Ala Val Tyr Val

545 550 555 560

Ala Val Glu Glu Arg Lys Ala Ala Gly Ser Arg Asp Val Ser Leu Ala

565 570 575

Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Glu Lys Val Leu Asp Ser Gly Phe Arg

580 585 590

Glu Ile Glu Asn Lys Ala Ile Gln Asp Pro Arg Leu Phe Ala Glu Glu

595 600 605

Lys Ala Val Ala Asp Thr Arg Asp Gln Ala Asp Gly Ser Arg Ala Ser

610 615 620

Val Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Gln Gly Gly Ser Ser Arg Ala Leu

625 630 635 640

Val Ser Thr Leu Val Pro Leu Gly Leu Val Leu Ala Val Gly Ala Val

645 650 655

Ala Val Gly Val Ala Arg Ala Arg His Arg Lys Asn Val Asp Arg Val

660 665 670

Ser Ile Arg Ser Tyr Arg Thr Asp Ile Ser Met Ser Asp Phe Glu Asn

675 680 685

Ser Arg Glu Phe Gly Ala Asn Asp Asn Met Gly Ala Ser Ser Ile Thr

690 695 700

Gln Glu Thr Ser Leu Gly Gly Lys Glu Glu Phe Val Ala Thr Thr Glu

705 710 715 720

Ser Thr Thr Glu Thr Lys Glu Pro Lys Lys Ala Lys Arg Ser Ser Lys

725 730 735

Glu Glu Ala Glu Met Ala Tyr Lys Asp Phe Leu Leu Gln Ser Ser Thr

740 745 750

Val Ala Ala Glu Ala Gln Asp Gly Pro Gln Glu Ala

755 760

<210> 40

<211> 159

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 40

Met Lys Asn His Leu Leu Phe Trp Gly Val Leu Ala Val Phe Ile Lys

1 5 10 15

Ala Val His Val Lys Ala Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp

20 25 30

Asn Lys Cys Lys Cys Ala Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser

35 40 45

Glu Asp Pro Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val

50 55 60

Pro Leu Asn Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg

65 70 75 80

Thr Arg Phe Val Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro

85 90 95

Thr Glu Val Glu Leu Asp Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn

100 105 110

Ile Cys Asp Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg

115 120 125

Asn Lys Cys Tyr Thr Ala Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr

130 135 140

Lys Met Val Glu Thr Ala Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp

145 150 155

<210> 41

<211> 137

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 41

Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp Asn Lys Cys Lys Cys Ala

1 5 10 15

Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser Glu Asp Pro Asn Glu Asp

20 25 30

Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val Pro Leu Asn Asn Arg Glu

35 40 45

Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr Arg Phe Val Tyr His

50 55 60

Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro Thr Glu Val Glu Leu Asp

65 70 75 80

Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn Ile Cys Asp Glu Asp Ser

85 90 95

Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg Asn Lys Cys Tyr Thr Ala

100 105 110

Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr Lys Met Val Glu Thr Ala

115 120 125

Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp

130 135

<210> 42

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 42

Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp Asn Lys Cys Lys Cys Ala

1 5 10 15

Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser Glu Asp Pro Asn Glu Asp

20 25 30

Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val Pro Leu Asn Asn Arg Glu

35 40 45

Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr Arg Phe Val Tyr His

50 55 60

Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro Thr Glu Val Glu Leu Asp

65 70 75 80

Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln Ser Asn Ile Cys Asp Glu Asp Ser

85 90 95

Ala Thr Glu Thr Cys Ala Thr Tyr Asp Arg Asn Lys Cys Tyr Thr Ala

100 105 110

Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly Glu Thr Lys Met Val Glu Thr Ala

115 120 125

Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro Asp

130 135

<210> 43

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 43

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 44

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 44

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 45

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 46

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 46

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 47

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 47

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

<210> 48

<211> 340

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 48

Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr

1 5 10 15

Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe

20 25 30

Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val

35 40 45

Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr

50 55 60

Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly

65 70 75 80

Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Ser Ser Gln Asp

85 90 95

Val Thr Val Pro Cys Arg Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro

100 105 110

Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser

115 120 125

Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly

130 135 140

Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly

145 150 155 160

Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu

165 170 175

Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr

180 185 190

Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn Ile Thr Lys

195 200 205

Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser

210 215 220

Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg

225 230 235 240

Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln

245 250 255

Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro

260 265 270

Ser Gln Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala

275 280 285

Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Glu Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His

290 295 300

Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Met Ala

305 310 315 320

Gly Lys Pro Thr His Ile Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Ala Asp

325 330 335

Gly Thr Cys Tyr

340

<210> 49

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 49

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 50

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 50

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

Claims (25)

1.一种包含两个、五个或六个二价结合单元或其变体或片段的多聚结合分子，

其中每个结合单元包含两个各自与结合域缔合的IgA或IgM重链恒定区或其多聚化片段或变体，

其中三至十二个所述结合域是程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)结合域，其特异性地并且激动性地与PD-1结合，

其中所述结合分子能够激活细胞中的PD-1介导的信号转导，其效力高于等量的包含两个相同PD-1结合域的二价IgG抗体或其片段，所述抗体或其片段也特异性地与PD-1结合并刺激PD-1。

2.如权利要求1所述的多聚结合分子，其中所述三个至十二个PD-1结合域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中：

(a)所述VH和VL包含六个免疫球蛋白互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3构成分别包含以下的抗体的CDR：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50的VH和VL，在所述HCDR或LCDR中的一者或多者中具有零个、一个或两个单一氨基酸取代；

(b)所述VH和VL包含六个免疫球蛋白互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3构成包含以下的抗体的CDR：SEQID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中的任一者的VH和SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22中的任一者的VL，在所述HCDR或LCDR中的一者或多者中具有零个、一个或两个单一氨基酸取代；

(c)所述VH和VL包含分别与以下序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的氨基酸序列：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27和SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32、SEQID NO:33和SEQ ID NO:34或SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50；或

(d)所述VH包含与SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:23或SEQ ID NO:24中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的氨基酸序列，且所述VL包含与SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22中的任一者至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％同一的氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的多聚结合分子，其中所述VH和VL包含六个免疫球蛋白互补决定区HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3构成分别包含以下的抗体的CDR：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQID NO:4、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14以及SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26的VH和VL，在所述HCDR或LCDR中的一者或多者中具有零个、一个或两个单一氨基酸取代。

4.如权利要求1所述的多聚结合分子，所述多聚结合分子是包含两个二价IgA或IgA样结合单元和J链或其功能片段或变体的二聚结合分子，其中每个结合单元包含两个各自包含IgACα3域和IgA尾段域的IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体。

5.如权利要求4所述的多聚结合分子，其中：

(a)每个IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体还包含Cα1域、Cα2域、IgA铰链区或其任何组合；

(b)所述IgA重链恒定区或其多聚化片段是人IgA恒定区；和/或

(c)每个结合单元包含两条IgA重链，所述IgA重链各自包含位于所述IgA恒定区或其多聚化片段的氨基端的VH；以及两条免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链各自包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基端的VL。

6.如权利要求1所述的多聚结合分子，所述多聚结合分子是分别包含五个或六个二价IgM结合单元的五聚或六聚结合分子，其中每个结合单元包含两个各自与PD-1结合域缔合的IgM重链恒定区或其多聚化片段，其中每个IgM重链恒定区包含IgM Cμ4和IgM尾段域。

7.如权利要求6所述的多聚结合分子，其中：

(a)所述IgM重链恒定区或其片段或变体各自还包含Cμ1域、Cμ2域、Cμ3域或其任何组合；

(b)所述IgM重链恒定区是人IgM恒定区；

(c)每个结合单元包含两条IgM重链，所述IgM重链各自包含位于所述IgM恒定区或其片段的氨基端的VH；以及两条免疫球蛋白轻链，所述免疫球蛋白轻链各自包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基端的VL。

8.如权利要求6所述的多聚结合分子，其中所述IgM恒定区包含：

(a)SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36或其多聚化片段；

(b)相对于野生型人IgM恒定区在SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的位置310、311、313和/或315处的取代；或

(c)相对于野生型人IgM恒定区在SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的位置46、209、272或440处的两个或更多个取代。

9.如权利要求6所述的多聚结合分子，所述多聚结合分子是五聚的，并且还包含J链或其功能片段或变体。

10.如权利要求9所述的多聚结合分子，其中所述J链或其功能片段或变体是相对于野生型J链包含一个或多个能够影响所述多聚结合分子的血清半衰期的单一氨基酸取代、缺失或插入的变体J链；且其中相对于除了所述一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入之外相同，并以相同方式施用于相同动物物种的参考多聚结合分子，包含所述变体J链的所述多聚结合分子在施用于动物时表现出增加的血清半衰期。

11.如权利要求9所述的多聚结合分子，其中所述J链或其功能片段包含：

(a)在对应于成熟野生型人J链(SEQ ID NO:41)的氨基酸Y102的氨基酸位置处的氨基酸取代；

(b)在对应于成熟野生型人J链(SEQ ID NO:41)的氨基酸Y102的氨基酸位置处的氨基酸取代，其中对应于SEQ ID NO:41的Y102的所述氨基酸被丙氨酸(A)取代；

(c)在对应于成熟野生型人J链(SEQ ID NO:41)的氨基酸Y102的氨基酸位置处的氨基酸取代，其中所述J链是变体人J链并且包含氨基酸序列SEQ ID NO:42；或

(d)在对应于成熟人J链(SEQ ID NO:41)的氨基酸N49、氨基酸S51或N49和S51两者的氨基酸位置处的氨基酸取代，其中对应于SEQ ID NO:41的位置S51的单一氨基酸取代不是苏氨酸(T)取代。

12.如权利要求9所述的多聚结合分子，其中所述J链或其功能片段或变体还包含异源多肽，其中所述异源多肽通过包含至少5个氨基酸，但不超过25个氨基酸的肽接头与所述J链或其功能片段或变体融合。

13.如权利要求12所述的多聚结合分子，其中所述异源多肽与所述J链或其片段或变体的N端、所述J链或其片段或变体的C端或所述J链或其片段或变体的N端和C端两者融合。

14.如权利要求12所述的多聚结合分子，其中所述异源多肽包含抗原结合域，且其中：

(a)所述异源多肽的所述抗原结合域是抗体或其抗原结合片段；

(b)所述异源多肽的所述抗原结合域是抗体的抗原结合片段，并且所述抗原结合片段包含Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、单链Fv(scFv)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)片段或其任何组合；

(c)所述异源多肽的所述抗原结合域是抗体的抗原结合片段，并且所述抗原结合片段是scFv片段；和/或

(d)所述异源多肽的所述抗原结合域是抗体的抗原结合片段，并且所述抗原结合域结合ICOS配体(ICOSLG)、ICOS(CD278)、白细胞介素6(IL6)、CD28、CD3、CD80、CD86、肿瘤坏死因子α(TNFa)或成纤维细胞激活蛋白(FAP)。

15.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1至14中任一项所述的多聚结合分子。

16.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码如权利要求1至14中任一项所述的结合分子的多肽亚基的核酸序列。

17.如权利要求16所述的多核苷酸，其中所述多肽亚基包含所述多聚结合分子的IgM重链恒定区和所述PD-1结合域的至少抗体VH部分；或包含所述多聚结合分子的轻链恒定区和所述PD-1结合域的抗体VL部分。

18.一种组合物，所述组合物含有包含编码如权利要求1至14中任一项所述的多聚结合分子的IgM重链恒定区和所述PD-1结合域的至少抗体VH部分的核酸序列的多核苷酸，以及包含编码如权利要求1至14中任一项所述的多聚结合分子的轻链恒定区和所述PD-1结合域的抗体VL部分的核酸序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸在单独的载体上或在单一载体上。

19.如权利要求18所述的组合物，所述组合物还含有包含编码J链或其功能片段或其功能变体的核酸序列的多核苷酸。

20.一种或多种如权利要求19所述的载体。

21.一种包含如权利要求18所述的组合物的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够表达所述结合分子或其亚基。

22.一种产生结合分子的方法，所述方法包括培养如权利要求21所述的宿主细胞，以及回收所述结合分子。

23.一种治疗需要治疗的受试者的自身免疫病症、炎症性病症或其组合的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1至14中任一项所述的多聚结合分子，其中所述多聚结合分子表现出比与相同结合搭配物结合的等量的单体或二聚结合分子更大的效力。

24.一种预防受试者的移植排斥反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求1至14中任一项所述的多聚结合分子，其中所述多聚结合分子表现出比与相同结合搭配物结合的等量的单体或二聚结合分子更大的效力，且其中所述受试者是移植接受者。

25.如权利要求23所述的方法，其中所述受试者是人。

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