JP2019530640A - 多量体ｏｘ４０結合分子及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本開示は、二量体、五量体、及び六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子ならびに抗腫瘍免疫を誘導するためにそのような結合分子を使用する方法を提供する。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、その全体で参照によって本明細書に組み込まれる２０１６年７月２０日出願の米国特許仮出願６２／３６４，７６３号の利益を主張する。
本出願は、その全体で参照によって本明細書に組み込まれる２０１６年７月２０日出願の米国特許仮出願６２／３６４，７６３号の利益を主張する。
背景
腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体（ＴＮＦＳＦＲ）タンパク質は、腫瘍免疫治療薬のための重要な標的である。例えば、ＴＮＦＳＦＲ標的、例えば、多くのなかでも、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、及びＯＸ４０を指向するアゴニストモノクローナル抗体は現在、無数のがん適応症について治験中である。
腫瘍壊死因子スーパーファミリー受容体（ＴＮＦＳＦＲ）タンパク質は、腫瘍免疫治療薬のための重要な標的である。例えば、ＴＮＦＳＦＲ標的、例えば、多くのなかでも、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ１３７、及びＯＸ４０を指向するアゴニストモノクローナル抗体は現在、無数のがん適応症について治験中である。
多くの事例において、ＴＮＦＳＦＲ標的の活性化は、その受容体を発現する細胞の表面上で少なくとも３つの非相互作用性受容体モノマーが架橋して、安定な受容体三量体を形成し、細胞膜を通過するシグナル伝達が生じることを必要とする。ＴＮＦＳＦＲタンパク質三量体がクラスター化して三量体の「ラフト」になると、シグナル伝達カスケードのより有効な活性化が生じる（Ｖａｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７（２５）：２１２６５−２１２７８，２０１２（非特許文献1）を参照されたい）。典型的には、細胞の表面上でのＴＮＦＳＦＲのクラスター化は、多量体、例えば、三量体リガンドによる会合を介して達成され得る。最近の研究によって、ＴＮＦＳＦＲ ＤＲ５を指向する多量体アゴニストＩｇＭ抗体は、二次架橋の非存在下で、かつ同一の結合ドメインを有するＩｇＧ分子を上回る細胞傷害性の上昇を伴って、細胞の表面上で多数のＤＲ５受容体モノマーに効果的に結合し得ることが実証されている。その全体で参照によって本明細書に組み込まれる２０１６年１月２０日出願のＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１６／１４１５３（特許文献1）を参照されたい。
ＣＤ１３４またはＴＮＦＲＳＦ４としても公知のＯＸ４０は、活性化Ｔ細胞上に発現されるＴＮＦＳＦＲである。ＯＸ４０は、活性化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の上に発現されるが、休止ナイーブＴ細胞または多くの休止メモリーＴ細胞では見い出されず、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、ＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞、及び好中球上にも発現される（Ｃｒｏｆｔ，Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２２９：１７３−１９１（２００９）（非特許文献2））。ＯＸ４０発現は、マウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ上で構成的であるが、活性化ヒトＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇでのみ発現される（Ｃｒｏｆｔ，Ｍ．Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８：５７−７８（２０１０）（非特許文献3））。活性化させると、エフェクターＴ細胞及びＴｒｅｇは両方とも、動態の遅延を伴って、ＯＸ４０発現を上方制御する（同書）。活性化抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）上に発現されるその三量体リガンド（ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦＳＦ４）との相互作用は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋エフェクターＴ細胞において共刺激増殖、生存、及びエフェクター機能の増強をもたらす（同書、Ｓｔｕｅｂｅｒ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２：５０７−２１（１９９５）（非特許文献4））。適正なサイトカイン環境を与えられると、ＯＸ４０シグナル伝達はまた、Ｔｒｅｇの免疫抑制能を遮断することができ、それによって、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）機能を増強する（Ｌｉｎｃｈ，ＳＮ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．５：ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｏｎｃ．２０１５．０００３４（２０１５）（非特許文献5））。ＯＸ４０アゴニストｍＡｂは、ＣＴＬのエフェクター機能及び増殖を増強することができ、かつ腫瘍内ＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞による免疫抑制を遮断することができる（Ｐｉｃｏｎｅｓｅ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０５：８２５−８３９（２００８）（非特許文献6））。ＯＸ４０を指向するアゴニストモノクローナル抗体は、前臨床モデルにおいて治療活性を示している（例えば、Ｌｉｎｃｈ，ＳＮ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．５：ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｏｎｃ．２０１５．０００３４（２０１５）（非特許文献5）における引用を参照されたい）。さらに、これに限定されないが、９Ｂ１２（マウス抗ＯＸ４０ｍＡｂ、Ｃｕｒｔｉ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７３：７１８９−９８（２０１３）（非特許文献7））；ＫＨＫ４０８３（完全ヒト抗ＯＸ４０ｍＡｂ、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＃ ＮＣＴ０２６４７８６６）；Ｍｅｄｉ０５６２（ヒト化抗ＯＸ４０ｍＡｂ、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＃ ＮＣＴ０２７０５４８２）；ＰＦ−０４５１８６００（完全ヒト抗ＯＸ４０ｍＡｂ、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＃ ＮＣＴ０２３１５０６６）；及びＧＳＫ３１７４９９８（ヒト化抗ＯＸ４０ ｍＡｂ、ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ ＃ ＮＣＴ０２５２８３５７）を包含する、いくつかのＯＸ４０ＩｇＧアゴニストｍＡｂが、単独で、または他の治療法との組合せでヒト治験において調査中である。しかしながら、典型的な二価ＩｇＧアゴニスト抗体は、細胞の表面上でＴＮＦＳＦＲを十分に会合させてシグナル伝達を開始させるために、架橋を必要とする。
がん免疫療法において使用するために、より効力のある、したがって、より有効なＯＸ４０アゴニスト抗体を開発する必要が依然としてある。
Ｖａｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８７（２５）：２１２６５−２１２７８，２０１２
Ｃｒｏｆｔ，Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２２９：１７３−１９１（２００９）
Ｃｒｏｆｔ，Ｍ．Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８：５７−７８（２０１０）
Ｓｔｕｅｂｅｒ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２：５０７−２１（１９９５）
Ｌｉｎｃｈ，ＳＮ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｏｎｃｏｌ．５：ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｏｎｃ．２０１５．０００３４（２０１５）
Ｐｉｃｏｎｅｓｅ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０５：８２５−８３９（２００８）
Ｃｕｒｔｉ ＢＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７３：７１８９−９８（２０１３）
概要
本開示は、多量体、例えば、２、５、または６個の二価結合ユニットまたはそのバリアントもしくは断片を含む二量体、五量体、または六量体結合分子であって、各結合ユニットが、抗原結合ドメインとそれぞれ結合している２つのＩｇＡもしくはＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片を含み、結合分子の抗原結合ドメインのうちの少なくとも３個が、活性化Ｔ細胞、例えば、ＣＴＬの表面上に、または休止または活性化Ｔｒｅｇ上に発現されるＯＸ４０に特異的に、かつアゴニスティックに結合し、結合分子が、二次架橋部分の非存在下で、Ｔｒｅｇまたは活性化ＣＴＬ上に発現される多数の、例えば、３個以上のＯＸ４０モノマーに結合し、それによって、抗腫瘍免疫応答を誘発することができる多量体結合分子を提供する。
本開示は、多量体、例えば、２、５、または６個の二価結合ユニットまたはそのバリアントもしくは断片を含む二量体、五量体、または六量体結合分子であって、各結合ユニットが、抗原結合ドメインとそれぞれ結合している２つのＩｇＡもしくはＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片を含み、結合分子の抗原結合ドメインのうちの少なくとも３個が、活性化Ｔ細胞、例えば、ＣＴＬの表面上に、または休止または活性化Ｔｒｅｇ上に発現されるＯＸ４０に特異的に、かつアゴニスティックに結合し、結合分子が、二次架橋部分の非存在下で、Ｔｒｅｇまたは活性化ＣＴＬ上に発現される多数の、例えば、３個以上のＯＸ４０モノマーに結合し、それによって、抗腫瘍免疫応答を誘発することができる多量体結合分子を提供する。
本開示は、２、５、または６個の二価結合ユニットまたはそのバリアントもしくは断片を含む多量体結合分子であって、各結合ユニットが、抗原結合ドメインとそれぞれ結合している２つのＩｇＡまたはＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片を含み、結合分子の抗原結合ドメインのうちの少なくとも３個が、ＯＸ４０を発現する細胞上のＯＸ４０モノマーに特異的に、かつアゴニスティックに結合することができ、結合分子が、二次架橋部分の非存在下で、細胞においてＯＸ４０媒介性シグナル伝達を誘導することができる多量体結合分子を提供する。ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの多量体結合分子は、二次架橋部分の非存在下で、細胞の表面上に発現される３個以上のＯＸ４０モノマーに結合し、かつそれらを会合させることができる。ある種の態様では、ＯＸ４０を発現する細胞は、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ調節性（Ｔｒｅｇ）細胞である。ある種の態様では、細胞におけるＯＸ４０媒介性シグナル伝達は、ＯＸ４０の表面発現を増加させることができる、ＣＴＬ増殖を増加させることができる、炎症性サイトカインの産生を増加させることができる、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の阻害作用に対する抵抗性を増加させることができる、腫瘍細胞の死滅を増加もしくは増強させることができる、またはそれらの組合せを可能にする。ある種の態様では、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３ Ｔｒｅｇ細胞におけるＯＸ４０媒介性シグナル伝達は、腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫を抑制する細胞の能力を妨害することができる。ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの多量体結合分子は、２個の同等のＯＸ４０抗原結合ドメインを含む等量の二価ＩｇＧ抗体またはその断片よりも高い効力で、ＯＸ４０を発現する細胞においてＯＸ４０媒介性Ｔ細胞活性化を誘導することができる。
ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの多量体結合分子は、細胞の表面上に発現されるＯＸ４０モノマーに特異的に、かつアゴニスティックに結合する少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または１２個の抗原結合ドメインを含み、それによって、細胞においてＯＸ４０媒介性シグナル伝達を活性化させる。ある種の態様では、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の抗原結合ドメインは、同じ細胞外ＯＸ４０エピトープに結合する。ある種の態様では、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の抗原結合ドメインはそれぞれ、２つ以上の異なる細胞外ＯＸ４０エピトープの群のうちの１つに特異的に結合する。
ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの多量体結合分子の２、５、または６個の結合ユニットは、ヒト、ヒト化、またはキメラ免疫グロブリン結合ユニットである。
ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの多量体結合分子の少なくとも３個の抗原結合ドメインは、ＯＸ４０アゴニスト結合ドメインであり、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または１２個の抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、そのＶＨ及びＶＬはまとめて、それぞれ配列番号９及び配列番号１０；配列番号１１及び配列番号１２；配列番号１３及び配列番号１４；配列番号１５及び配列番号１６；配列番号１７及び配列番号１８；配列番号１９及び配列番号２０；配列番号２１及び配列番号２２；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２５及び配列番号２６；配列番号２５及び配列番号２８；配列番号２７及び配列番号２６；配列番号２７及び配列番号２８；配列番号２９及び配列番号２６；配列番号２９及び配列番号２８；配列番号３０及び配列番号３１；配列番号３０及び配列番号３３；配列番号３２及び配列番号３１；配列番号３２及び配列番号３３；配列番号３４及び配列番号３１；配列番号３４及び配列番号３３；配列番号３５及び配列番号３６；配列番号３７及び配列番号３８；配列番号３９及び配列番号４０；配列番号４１及び配列番号４２；配列番号４３及び配列番号４４；配列番号４５及び配列番号４６；配列番号４７及び配列番号４８；配列番号４９及び配列番号５０；もしくは配列番号５１及び配列番号５２を含むかもしくはそれらの中に含まれるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む抗体の６つの免疫グロブリン相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、またはＣＤＲのうちの１つもしくは複数における１つもしくは２つのアミノ酸置換を除いて、それぞれ配列番号９及び配列番号１０；配列番号１１及び配列番号１２；配列番号１３及び配列番号１４；配列番号１５及び配列番号１６；配列番号１７及び配列番号１８；配列番号１９及び配列番号２０；配列番号２１及び配列番号２２；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２５及び配列番号２６；配列番号２５及び配列番号２８；配列番号２７及び配列番号２６；配列番号２７及び配列番号２８；配列番号２９及び配列番号２６；配列番号２９及び配列番号２８；配列番号３０及び配列番号３１；配列番号３０及び配列番号３３；配列番号３２及び配列番号３１；配列番号３２及び配列番号３３；配列番号３４及び配列番号３１；配列番号３４及び配列番号３３；配列番号３５及び配列番号３６；配列番号３７及び配列番号３８；配列番号３９及び配列番号４０；配列番号４１及び配列番号４２；配列番号４３及び配列番号４４；配列番号４５及び配列番号４６；配列番号４７及び配列番号４８；配列番号４９及び配列番号５０；もしくは配列番号５１及び配列番号５２を含むかもしくはそれらの中に含まれるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む抗体のＣＤＲを有する。
ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの多量体結合分子の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または１２個の抗原結合ドメインは、抗体ＶＨ及びＶＬを含み、そのＶＨ及びＶＬは、それぞれ配列番号９及び配列番号１０；配列番号１１及び配列番号１２；配列番号１３及び配列番号１４；配列番号１５及び配列番号１６；配列番号１７及び配列番号１８；配列番号１９及び配列番号２０；配列番号２１及び配列番号２２；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２５及び配列番号２６；配列番号２５及び配列番号２８；配列番号２７及び配列番号２６；配列番号２７及び配列番号２８；配列番号２９及び配列番号２６；配列番号２９及び配列番号２８；配列番号３０及び配列番号３１；配列番号３０及び配列番号３３；配列番号３２及び配列番号３１；配列番号３２及び配列番号３３；配列番号３４及び配列番号３１；配列番号３４及び配列番号３３；配列番号３５及び配列番号３６；配列番号３７及び配列番号３８；配列番号３９及び配列番号４０；配列番号４１及び配列番号４２；配列番号４３及び配列番号４４；配列番号４５及び配列番号４６；配列番号４７及び配列番号４８；配列番号４９及び配列番号５０；または配列番号５１及び配列番号５２を含むかまたはそれらの中に含まれる成熟ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一なアミノ酸配列を有する。
ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの多量体結合分子は、２個の二価ＩｇＡ結合ユニットまたはその断片とＪ鎖またはその断片もしくはバリアントとを含む二量体結合分子であり、その際、各結合ユニットは、それぞれ抗原結合ドメインと結合した２つのＩｇＡ重鎖定常領域またはその断片を有する。ある種の態様では、この多量体結合分子はさらに、分泌成分またはその断片もしくはバリアントを含む。ある種の態様では、ＩｇＡ重鎖定常領域またはその断片はそれぞれ、Ｃα２ドメインまたはＣα３−ｔｐドメインを含み、さらにＣα１ドメインを含むことができる。ある種の態様では、ＩｇＡ重鎖定常領域は、ヒトＩｇＡ定常領域である。ある種の態様では、この多量体結合分子の各結合ユニットは、ＩｇＡ定常領域またはその断片のアミノ末端側に位置するＶＨをそれぞれ有する２本のＩｇＡ重鎖、及び免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端側に位置するＶＬをそれぞれ有する２本の免疫グロブリン軽鎖を含むことができる。
ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの多量体結合分子は、５または６個の二価ＩｇＭ結合ユニットをそれぞれ含む五量体または六量体結合分子であり、その際、各結合ユニットは、抗原結合ドメインとそれぞれ結合している２つのＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片を含む。ある種の態様では、この多量体結合分子のＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片はそれぞれ、Ｃμ３ドメイン及びＣμ４−ｔｐドメインまたはその断片もしくはバリアントを含み、さらに、Ｃμ２ドメイン、Ｃμ１ドメイン、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。結合分子が五量体である態様では、これはさらに、Ｊ鎖、またはその断片、もしくはそのバリアントを含むことができる。ある種の態様では、ＩｇＭ重鎖定常領域は、ヒトＩｇＭ定常領域である。ある種の態様では、この多量体結合分子の各結合ユニットは、ＩｇＭ定常領域またはその断片のアミノ末端側に位置するＶＨをそれぞれ含む２本のＩｇＭ重鎖、及び免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端側に位置するＶＬをそれぞれ含む２本の免疫グロブリン軽鎖を含む。
ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの多量体結合分子の各結合ユニットは、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含み、その重鎖及び軽鎖は、それぞれ配列番号９及び配列番号１０；配列番号１１及び配列番号１２；配列番号１３及び配列番号１４；配列番号１５及び配列番号１６；配列番号１７及び配列番号１８；配列番号１９及び配列番号２０；配列番号２１及び配列番号２２；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２５及び配列番号２６；配列番号２５及び配列番号２８；配列番号２７及び配列番号２６；配列番号２７及び配列番号２８；配列番号２９及び配列番号２６；配列番号２９及び配列番号２８；配列番号３０及び配列番号３１；配列番号３０及び配列番号３３；配列番号３２及び配列番号３１；配列番号３２及び配列番号３３；配列番号３４及び配列番号３１；配列番号３４及び配列番号３３；配列番号３５及び配列番号３６；配列番号３７及び配列番号３８；配列番号３９及び配列番号４０；配列番号４１及び配列番号４２；配列番号４３及び配列番号４４；配列番号４５及び配列番号４６；配列番号４７及び配列番号４８；配列番号４９及び配列番号５０；または配列番号５１及び配列番号５２を含むかまたはそれらの中に含まれる成熟ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一なＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む。
本明細書で提供するとおりの多量体結合分子が五量体ＩｇＭ分子である態様では、これはさらに、Ｊ鎖またはそのバリアントを含み得る。
本開示はさらに、本明細書で提供するとおりの多量体結合分子を含む組成物を提供する。
本開示はさらに、本明細書で提供するとおりの多量体結合分子のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。
ある種の態様では、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドサブユニットは、ＩｇＭ重鎖定常領域と、多量体結合分子の抗原結合ドメインの少なくとも抗体ＶＨ部分とを含む。ある種の態様では、ポリペプチドサブユニットは、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、もしくは配列番号５１を含むかもしくはその中に含まれるＶＨアミノ酸配列に含有されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３領域；またはＨＣＤＲの１つもしくは複数における１つもしくは２つの単一アミノ酸置換を伴う、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、もしくは配列番号５１を含むかもしくはその中に含まれるＶＨアミノ酸配列に含有されるＣＤＲを含むＶＨのＣ末端に融合された、ヒトＩｇＭ定常領域またはその断片を含むか、またはポリペプチドサブユニットは、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、もしくは配列番号５１を含むかもしくはその中に含まれる成熟ＶＨアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含むＶＨのＣ末端に融合された、ヒトＩｇＭ定常領域またはその断片を含む。
ある種の態様では、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドサブユニットは、軽鎖定常領域と、多量体結合分子の抗原結合ドメインの抗体ＶＬ部分とを含む。ある種の態様では、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドサブユニットは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、もしくは配列番号５２を含むかもしくはその中に含まれるＶＬアミノ酸配列に含有されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３領域、またはＬＣＤＲの１つもしくは複数における１つもしくは２つの単一アミノ酸置換を伴う、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、もしくは配列番号５２を含むかもしくはその中に含まれるＶＬアミノ酸配列に含有されるＣＤＲを含むＶＬのＣ末端に融合された、ヒトカッパもしくはラムダ軽鎖定常領域またはその断片を含むか；またはポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドサブユニットは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、もしくは配列番号５２を含むかもしくはその中に含まれる成熟ＶＬアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは１００％同一なＶＬアミノ酸配列のＣ末端に融合された、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常領域またはその断片を含む。
本開示はさらに、ＶＨをコードするポリヌクレオチド及びＶＬをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。ある種の態様では、ポリヌクレオチドは、別々のベクター上にある。ある種の態様では、ポリヌクレオチドは、単一のベクター上にある。ある種の態様では、組成物はさらに、ＶＨ及び／またはＶＬと同じか、または別々のベクター上にあってよい、Ｊ鎖、またはその断片、またはそのバリアントをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む。このベクターまたはこれらのベクターも提供する。
本開示はさらに、提供するポリヌクレオチド、提供する組成物、及び／または提供する１つもしくは複数のベクターの１つまたは複数を含む宿主細胞を提供する。ある種の態様では、提供する宿主細胞は、本明細書で提供する多量体結合分子を発現することができる。本開示はさらに、本明細書で提供する多量体結合分子を生成する方法であって、提供する宿主細胞を培養すること、及び結合分子を回収することを含む方法を提供する。
本開示はさらに、ＯＸ４０発現細胞においてＯＸ４０の移動及びクラスター化を誘導する方法であって、ＯＸ４０発現細胞を、本明細書で提供するとおりの多量体結合分子と接触させることを含む方法を提供する。
本開示はさらに、処置を必要とする対象に、本明細書で提供する多量体結合分子の有効量を投与することを含む、がんを処置する方法であって、その多量体結合分子は、ＯＸ４０発現エフェクターＴ細胞を活性化させることができ、それによって、殺腫瘍性ＣＴＬ応答を開始させる、方法を提供する。ある種の態様では、対象は、ヒトである。別の態様では、本開示は、がんを処置するための医薬の調製における、本明細書で提供する多量体結合分子の使用であって、その多量体結合分子は、ＯＸ４０発現エフェクターＴ細胞を活性化させることができ、それによって、殺腫瘍性ＣＴＬ応答を開始させる、使用を提供する。別の態様では、本開示は、がんの処置において使用するための、本明細書で提供する多量体結合分子を提供する。
詳細な説明
定義
「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という用語を付された物は、その物の１つまたは複数を指すことに留意されたい；例えば、「１個の結合分子（ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、１個または複数の結合分子を表すと理解される。したがって、「１つの（ａ）」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。
定義
「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」という用語を付された物は、その物の１つまたは複数を指すことに留意されたい；例えば、「１個の結合分子（ａ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、１個または複数の結合分子を表すと理解される。したがって、「１つの（ａ）」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。
さらに、「及び／または」は、本明細書において使用する場合、他方を伴うか、または伴わない、２つの指定された特徴または成分のそれぞれの具体的な開示とみなされるべきである。したがって、本明細書において「Ａ及び／またはＢ」などの語句で使用されるとおりの「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図されている。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの語句において使用されるとおりの「及び／または」という用語は、次の実施形態のそれぞれを包含することが意図されている：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）。
別段に定義されていない限り、本明細書において使用する技術用語及び科学用語は、本開示が関連する分野の当業者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；及びｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓが、当業者に、本開示において使用される用語の多くの一般的な辞書を提供している。
単位、接頭辞、及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で認められた形態で示されている。数値範囲は、その範囲を定義する数値を包括する。別段に示さない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で、左から右へ記載されている。本明細書で提供する見出しは、様々な態様または本開示の態様の限定ではなく、本明細書を全体として参照することによって備えることができる。したがって、この直後に定義する用語は、明細書をその全体で参照することによって、より十分に定義される。
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」、さらには複数の「ポリペプチド」を包含することが意図されており、アミド結合（ペプチド結合としても公知）によって直線状に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。「ポリペプチド」という用語は、２個以上のアミノ酸の任意の１つまたは複数の鎖を指し、産物の具体的な長さを指すものではない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２個以上のアミノ酸の１本または複数の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義の範囲内に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のいずれかの代わりに、またはそれらと互換的に使用され得る。「ポリペプチド」という用語はまた、限定ではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、及び既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性切断、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含む、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことが意図されている。ポリペプチドは、生物源に由来しても、または組換え技術によって生成されていてもよいが、必ずしも、指定の核酸配列から翻訳されるものではない。これは、化学合成による手法を含む、任意の手法で生成することができる。
本明細書に開示のとおりのポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、または２，０００以上のアミノ酸のサイズであってよい。ポリペプチドは、規定の三次元構造を有し得るが、それらは、必ずしもそのような構造を有するものではない。規定の三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれている、と称され、規定の三次元構造を有さないが、むしろ、多数の異なる立体配置を採ることができるポリペプチドは、折り畳まれていない、と称される。本明細書で使用する場合、糖タンパク質という用語は、アミノ酸、例えば、セリンまたはアスパラギンの酸素含有または窒素含有側鎖を介してタンパク質に結合している少なくとも１つの炭水化物部分にカップリングしているタンパク質を指す。
「単離」ポリペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体では、その天然環境にはないポリペプチドが意図されている。特定の精製レベルは必要ない。例えば、単離ポリペプチドを、その天然または自然環境から取り出すことができる。組換え生成されたポリペプチド及び宿主細胞で発現されたタンパク質は、任意の適切な技術によって分離されている、画分されている、または部分的に、もしくは実質的に精製されている天然または組換えポリペプチドであるので、本明細書に開示のとおり、単離と判断される。
本明細書で使用する場合、「天然に存在しないポリペプチド」という用語またはその任意の文法的な変異形は、審査官によって、または行政機関もしくは司法機関によって「天然に存在する」と決定または解釈されるか、決定または解釈されるであろうポリペプチドの形態を明確に排除するが、排除するに過ぎない条件付き定義である。
本明細書において開示する他のポリペプチドは、上述のポリペプチドの断片、誘導体、類似体、またはバリアント、及びそれらの任意の組合せである。本明細書に開示のとおりの「断片」、「バリアント」、「誘導体」及び「類似体」という用語は、対応する天然の抗体またはポリペプチドの特性（例えば、抗原への特異的結合）の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドを含む。ポリペプチドの断片には、本明細書の他の箇所で論述する特異的抗体断片に加えて、例えば、タンパク質分解性断片、さらには、欠失断片が含まれる。例えば、ポリペプチドのバリアントには、上記のとおりの断片、及び他にも、アミノ酸置換、欠失、または挿入によって変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。ある種の態様では、バリアントは、天然に存在しなくてよい。天然に存在しないバリアントを、当分野で公知の変異誘発技術を使用して生成することができる。バリアントポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を含むことができる。誘導体は、元のポリペプチドでは見い出されない追加の特徴を示すように変更されているポリペプチドである。例には、融合タンパク質が含まれる。バリアントポリペプチドは、本明細書では「ポリペプチド類似体」とも称され得る。本明細書で使用する場合、ポリペプチドの「誘導体」は、官能性側基の反応によって化学的に誘導体化された１個または複数のアミノ酸を有する本ポリペプチドも指し得る。２０種の標準アミノ酸の１つまたは複数の誘導体を含有するペプチドも、「誘導体」として含まれる。例えば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンの代わりに用いることができ；５−ヒドロキシリシンをリシンの代わりに用いることができ；３−メチルヒスチジンをヒスチジンの代わりに用いることができ；ホモセリンをセリンの代わりに用いることができ；オルニチンをリシンの代わりに用いることができる。
「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸が、同様の側鎖を有する別のアミノ酸に置き換えられる置換である。塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、同様の側鎖を有するアミノ酸のファミリーは、当技術分野で定義されている。例えば、チロシンでのフェニルアラニンの置換は、保存的置換である。ある種の実施形態では、本開示のポリペプチド及び抗体の配列における保存的置換は、結合分子が結合する抗原への、そのアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体の結合を排除するものではない。抗原結合性を消去しないヌクレオチド及びアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１ １８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；ａｎｄ Ｂｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：．４１２−４１７（１９９７）を参照されたい）。
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸、さらには、複数の核酸を包含することが意図されており、単離核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、従来型のホスホジエステル結合または非従来型の結合（例えば、アミド結合、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）において見い出されるものなど）を含むことができる。「核酸」または「核酸配列」という用語は、ポリヌクレオチド中に存在するいずれか１つまたは複数の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。
「単離」核酸またはポリヌクレオチドでは、その天然環境から分離された核酸またはポリヌクレオチドの任意の形態が意図されている。例えば、ゲル精製されたポリヌクレオチド、またはベクター中に含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、「単離」と考えられるであろう。また、クローニングのために制限部位を有するように操作されているポリヌクレオチドセグメント、例えば、ＰＣＲ産物は、「単離」と考えられる。単離ポリヌクレオチドのさらなる例には、異種の宿主細胞において維持される組換えポリヌクレオチド、または緩衝液または生理食塩水などの非天然溶液中で（部分的に、または実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離ＲＮＡ分子には、ポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写物が含まれ、その際、その転写物は、天然に見い出されるものではない。単離ポリヌクレオチドまたは核酸にはさらに、合成で生成されたそのような分子が含まれる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、調節エレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターであり得るか、またはそれらを含み得る。
本明細書で使用する場合、「天然に存在しないポリヌクレオチド」という用語またはその任意の文法的変異形は、審査官によって、または行政機関または司法機関によって「天然に存在する」と決定または解釈されるか、解釈されるであろう核酸またはポリヌクレオチドの形態を明確に排除するが、排除するに過ぎない条件付き定義である。
本明細書で使用する場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないとはいえ、これは、コード領域の一部と考慮することができるが、ただし、いずれのフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域は、単一のポリヌクレオチド構築物に、例えば、単一のベクター上に、または別々のポリヌクレオチド構築物に、例えば、別々の（異なる）ベクター上に存在し得る。さらに、任意のベクターが、単一のコード領域を含有することができるか、または２つ以上のコード領域を含むことができ、例えば、単一のベクターが、免疫グロブリン重鎖可変領域及び免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードすることができる。加えて、ベクター、ポリヌクレオチド、または核酸が、別のコード領域に融合された、または融合されていない異種のコード領域を含むことができる。異種のコード領域には、限定ではないが、特殊エレメントまたはモチーフをコードするもの、例えば、分泌シグナルペプチドまたは異種機能ドメインが含まれる。
ある種の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは通常、１つまたは複数のコード領域と作動可能に結合しているプロモーター及び／または他の転写または翻訳制御エレメントを含み得る。作動可能な結合とは、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドのためのコード領域が、制御配列（複数可）の影響または制御下で遺伝子産物を発現するような様式で、１つまたは複数の制御配列と結合していることである。プロモーター機能の誘導が、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び２個のＤＮＡ断片間の連結の性質が、伝子産物の発現を指示する発現制御配列の能力を妨害しない場合、または転写されるＤＮＡテンプレートの能力を妨害しない場合、２個のＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域と、それと結合しているプロモーター）は、「作動可能に結合して」いる。したがって、プロモーターが、ポリペプチドをコードする核酸の転写を行うことができるならば、プロモーター領域は、その核酸と作動可能に結合しているであろう。プロモーターは、所定の細胞においてＤＮＡの実質的な転写を指示する細胞特異的なプロモーターであり得る。プロモーター以外の他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー及び転写停止シグナルは、細胞特異的転写を指示するために、ポリヌクレオチドと作動可能に結合していてよい。
様々な転写制御領域が、当業者に公知である。これらには、限定ではないが、脊椎動物の細胞で機能する転写制御領域、例えば、これに限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（イントロン−Ａと併せて前初期プロモーター）、サルウイルス４０（初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）が含まれる。他の転写制御領域には、脊椎動物の遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ−グロビン、さらには、真核細胞中の遺伝子発現を制御することができる他の配列が含まれる。追加の適切な転写制御領域には、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、さらには、リンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導されるプロモーター）が含まれる。
同様に、様々な翻訳制御エレメントが、当業者に公知である。これらには、これに限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始コドン及び停止コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、配列内リボソーム進入部位、またはＩＲＥＳは、ＣＩＴＥ配列とも称される）。
他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、またはリボソームＲＮＡの形態のＲＮＡであってよい。
ポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌ペプチドまたはシグナルペプチドをコードし、本明細書に開示のとおりのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する追加のコード領域と結合していてもよい。シグナルの仮説によれば、粗面小胞体全体で成長するタンパク質鎖の外への輸送が開始されると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質は、成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、ポリペプチドのＮ末端に融合するシグナルペプチドを有し得て、このペプチドが、完全または「全長」ポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌形態または「成熟」形態を産生することに気づいている。ある種の実施形態では、天然のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖のシグナルペプチドを使用するか、またはこれに作動可能に結合したポリペプチドの分泌を指示する能力を保持する、この配列の機能性誘導体を使用する。別法では、異種哺乳類のシグナルペプチド、またはその機能性誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列を、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列と置き換えることができる。
本明細書で使用する場合、「ＴＮＦスーパーファミリー受容体タンパク質」、「ＴＮＦＳＦＲ」、「ＴＮＦ受容体ファミリー」、「ＴＮＦ受容体」という用語またはそのような語句の任意の組合せは、様々な細胞及び組織の表面上に発現される腫瘍壊死因子膜貫通受容体タンパク質のファミリーを指す。このスーパーファミリーのファミリーメンバーには、リガンド結合またはアゴニスト抗体結合による活性化時に、受容体タンパク質が発現される細胞において、活性化、炎症応答、アポトーシス（またはアポトーシスの阻害）、増殖、及び／または形態形成を開始させることができるものが含まれる。ＴＮＦＳＦＲには、これに限定されないが、ＴＮＦＲ１（ＤＲ１）、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦＲ１／２、ＣＤ４０（ｐ５０）、Ｆａｓ（ＣＤ９５、Ａｐｏ１、ＤＲ２）、ＣＤ３０、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＩＬＡ）、ＴＲＡＩＬＲ１（ＤＲ４、Ａｐｏ２）、ＴＲＡＩＬＲ２（ＤＲ５）、ＴＲＡＩＬＲ３（ＤｃＲ１）、ＴＲＡＩＬＲ４（ＤｃＲ２）、ＯＰＧ（ＯＣＩＦ）、ＴＷＥＡＫＲ（ＦＮ１４）、ＬＩＧＨＴＲ（ＨＶＥＭ）、ＤｃＲ３、ＤＲ３、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＬＴ−βＲ、ＧＩＴＲ（ＡＩＴＲ）、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＣＤ２７、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＲＡＮＫ（ＴＲＡＮＣＥＲ）、ＲＥＬＴ、及びＢＡＦＦ−Ｒが含まれる。例えば、Ｗａｊａｎｔ，Ｈ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２２：１７２７−１７４１（２０１５）を参照されたい。
ＴＮＦＳＦＲ ＯＸ４０にアゴニスティックに結合し、それによって、例えば、ＯＸ４０を発現する活性化ＣＴＬにおいて増殖及びそのエフェクター機能の増強、ならびに例えば、腫瘍周囲の微小環境においてＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇによる免疫抑制の低減を誘発し、したがって、抗腫瘍免疫を促進することができる、ある種の結合分子、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体を本明細書において開示する。フルサイズ抗体に具体的に言及していない限り、「結合分子」という用語は、フルサイズ抗体、さらには、そのような抗体の抗原結合サブユニット、断片、バリアント、類似体、または誘導体、例えば、抗体分子と同様の手法で抗原に結合するが、異なるスキャフォールドを使用する、操作された抗体分子または断片を包含する。
ヒトＯＸ４０のアイソフォーム１の前駆体型は、アミノ酸配列の配列番号７（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ４３４８９．１）を含む。成熟タンパク質は、配列番号７のアミノ酸２９〜２７７を含み、その際、アミノ酸１〜２８は、シグナルペプチドを含む。ヒトＯＸ４０の細胞外ドメインは、配列番号７のアミノ酸２９〜２１４を含む。ヒトＯＸ４０の膜貫通ドメインは、配列番号７のアミノ酸２１５〜２３５を含む。ヒトＯＸ４０の細胞質ドメインは、配列番号７のアミノ酸２３６〜２７７を含む。
配列番号７
配列番号７
マウスＯＸ４０の前駆体型は、アミノ酸配列の配列番号８（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＰ＿０３５７８９．１）を含む。成熟タンパク質は、配列番号８のアミノ酸２０〜２７２を含み、その際、アミノ酸１〜１９は、シグナルペプチドを含む。マウスＯＸ４０の細胞外ドメインは、配列番号８のアミノ酸２０〜２１１を含む。マウスＯＸ４０の膜貫通ドメインは、配列番号８のアミノ酸２１２〜２３６を含む。マウスＯＸ４０の細胞質ドメインは、配列番号８のアミノ酸２３７〜２７２を含む。
配列番号８
配列番号８
本明細書で使用する場合、「結合分子」という用語は、その最も広い意味では、受容体、例えばエピトープまたは抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。本明細書においてさらに記載するとおり、結合分子は、本明細書に記載の複数の「抗原結合ドメイン」のうちの１つを含み得る。結合分子の非限定的例は、抗体、または抗原特異的結合を保持するその断片である。
本明細書で使用する場合、「結合ドメイン」または「抗原結合ドメイン」という用語は、エピトープに特異的に結合するために必要かつ十分である結合分子の領域を指す。例えば、「Ｆｖ」、例えば、２つの別々のポリペプチドサブユニットとして、または一本鎖としてのいずれかの、抗体の可変重鎖及び可変軽鎖は、「結合ドメイン」であると見なされる。他の結合ドメインには、限定ではないが、ラクダ科種に由来する抗体の可変重鎖（ＶＨＨ）、またはフィブロネクチンスキャフォールドにおいて発現される６つの免疫グロブリン相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。本明細書に記載のとおりの「結合分子」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の「抗原結合ドメイン」を含み得る。
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。抗体（または本明細書に開示のとおりのその断片、バリアント、もしくは誘導体）は、少なくとも重鎖の可変ドメイン（ラクダ種に関して）または少なくとも重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は、比較的よく理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）を参照されたい。別段に述べない限り、「抗体」という用語は、抗体の小さな抗原結合断片からフルサイズ抗体に至るまでのあらゆるもの、例えば、２本の完全な重鎖及び２本の完全な軽鎖を含むＩｇＧ抗体、４本の完全な重鎖及び４本の完全な軽鎖を含み、任意選択でＪ鎖及び／または分泌成分を含むＩｇＡ抗体、または１０本もしくは１２本の完全な重鎖及び１０本もしくは１２本の完全な軽鎖を含み、任意選択でＪ鎖を含むＩｇＭ抗体を包含する。
以下でより詳細に論述するとおり、「免疫グロブリン」という用語は、生化学的に区別され得る様々な幅広いクラスのポリペプチドを含む。当業者は、重鎖がガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、それらの中にいくつかのサブクラス（例えば、γ１〜γ４またはα１〜α２）があることを認識するであろう。この鎖の性質が、抗体の「アイソタイプ」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして決定する。免疫グロブリンサブクラス（サブタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２などは、十分に特徴づけられており、機能的特殊化を付与することが知られている。これらの免疫グロブリンのそれぞれの修飾型は、本開示を考慮すれば当業者には容易に識別可能であり、したがって、それらは本開示の範囲内である。
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかに結合し得る。一般的に、軽鎖及び重鎖は共有結合で相互に結合しており、免疫グロブリンが例えばハイブリドーマ、Ｂ細胞、または遺伝子操作された宿主細胞によって発現されるときに、２本の重鎖の「尾」部分は、ジスルフィド共有結合または非共有結合によって相互に結合される。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ構造の分岐末端にあるＮ末端から始まり、それぞれの鎖の底部にあるＣ末端まで続く。ある種の抗体、例えば、ＩｇＧ抗体の基本構造は、ジスルフィド結合による共有結合によって接続して、本明細書において「Ｈ２Ｌ２」構造、または「結合ユニット」とも称される「Ｙ」構造を形成している２本の重鎖サブユニット及び２本の軽鎖サブユニットを含む。
「結合ユニット」という用語は、標準的な「Ｈ２Ｌ２」免疫グロブリン構造、すなわち、２本の重鎖またはその断片及び２本の軽鎖またはその断片に対応する結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片の部分を指すために本明細書において使用される。ある種の態様では、例えば、結合分子が二価ＩｇＧ抗体またはその抗原結合断片である場合、「結合分子」及び「結合ユニット」という用語は、同等である。他の態様では、例えば、結合分子がＩｇＡ二量体、ＩｇＭ五量体、またはＩｇＭ六量体である場合、結合分子は、２個以上の「結合ユニット」を含む。ＩｇＡ二量体の場合には、２個であり、またはＩｇＭ五量体もしくは六量体の場合にはそれぞれ、５個もしくは６個である。結合ユニットは、全長抗体重鎖及び軽鎖を必要としないが、典型的には、二価であり、すなわち、上記で定義したとおりの２つの「結合ドメイン」を含む。本明細書で使用する場合、本開示で提供するある種の結合分子は、「二量体」であり、ＩｇＡ定常領域またはその断片を含む２個の二価結合ユニットを含む。本開示で提供するある種の結合分子は、「五量体」または「六量体」であり、ＩｇＭ定常領域またはその断片を含む５または６個の二価結合ユニットを含む。２個以上、例えば、２、５、または６個の結合ユニットを含む結合分子は本明細書において、「多量体」と称される。
「結合価」、「二価」、「多価」という用語及び文法的等価物は、所与の結合分子または結合ユニットにおける結合ドメインの数を指す。したがって、所与の結合分子、例えばＩｇＭ抗体またはその断片に関する、「二価」、「四価」、及び「六価」という用語は、それぞれ２つの結合ドメイン、４つの結合ドメイン、及び６つの結合ドメインの存在を示す。各結合ユニットが二価である典型的なＩｇＭ由来結合分子では、結合分子自体は１０または１２の結合価を有し得る。二価または多価結合分子は、単一特異性であってもよい、すなわち、結合ドメインのすべてが同じであってもよいし、または二重特異性もしくは多重特異性であってもよく、例えば、その際、２つ以上の結合ドメインが異なり、例えば同じ抗原上の異なるエピトープに結合するか、もしくは完全に異なる抗原に結合する。
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができる任意の分子決定基を含む。ある種の態様では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの、分子の化学的に活性な表面基を含み得、ある種の態様では、三次元構造特性及びまたは特異的電荷特性を有し得る。エピトープは、抗体が結合する標的の領域である。
「標的」という用語は、その最も広い意味で使用され、結合分子が結合し得る物質を含む。標的は、例えば、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、または他の分子であってよい。さらに、「標的」は、例えば、結合分子が結合し得るエピトープを含む細胞、器官、または生物であってよい。
軽鎖及び重鎖は両方とも、構造的及び機能的相同性の領域に分割される。「定常」及び「可変」という用語は、機能的に用いられる。これに関して、可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖部分の両方の可変ドメインは、抗原認識及び特異性を決定することは分かるであろう。逆に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の定常ドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、またはＣＨ３）は、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの生物学的特性を付与する。慣例では、定常領域ドメインの番号付けは、それらが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠ざかるにつれて増加する。Ｎ末端部分は可変領域であり、Ｃ末端部分は定常領域である；ＣＨ３（またはＩｇＭの場合にはＣＨ４）ドメイン及びＣＬドメインは実際に、それぞれ重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端を含む。
「全長ＩｇＭ抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖定常ドメイン１（ＣＭ１またはＣμ１）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＭ２またはＣμ２）、抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＭ３またはＣμ３）、及び尾片を含み得る抗体重鎖定常ドメイン４（ＣＭ４またはＣμ４）を含むポリペプチドである。
「全長ＩｇＡ抗体重鎖」は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖定常ドメイン１（ＣＡ１またはＣα１）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＡ２またはＣα２）、及び尾片を含み得る抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＡ３またはＣα３）を含むポリペプチドである。
上に示したとおり、可変領域（複数可）は、結合分子が抗原上のエピトープを選択的に認識し、それに特異的に結合することを可能にする。すなわち、結合分子、例えば、抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、抗原結合ドメインを形成する。より具体的には、抗原結合ドメインは、ＶＨ鎖及びＶＬ鎖のそれぞれにある３つのＣＤＲによって規定され得る。ある種の抗体は、より大きな構造を形成する。例えば、ＩｇＡは、２個のＨ２Ｌ２結合ユニット及びジスルフィド結合によって共有結合しているＪ鎖を含む分子を形成することができ、これは分泌成分とさらに結合させることができ、ＩｇＭは、５または６個のＨ２Ｌ２結合ユニット及び任意選択でジスルフィド結合によって共有結合しているＪ鎖を含む五量体または六量体分子を形成することができる。
抗体の抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、抗体が水性環境においてその三次元配置をとる場合に、結合ドメインを形成するように特異的に配置されている、アミノ酸の短い非連続的な配列である。「フレームワーク」領域と称される、結合ドメイン中のアミノ酸の残りの部分は、より小さな分子間変動性を示す。フレームワーク領域は主にβシート高次構造をとり、ＣＤＲは、βシート構造を連結し、場合によってはβシート構造の一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合相互作用によってＣＤＲを正しい方向に配置することを提供するスキャフォールドを形成するように働く。配置されたＣＤＲによって形成される結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープと相補的な表面を規定する。この相補的な表面は、抗体のその同族エピトープに対する非共有結合を促進する。それぞれＣＤＲ及びフレームワーク領域を構成するアミノ酸は、様々な異なる方法で定義されているため、当業者によって任意の所与の重鎖または軽鎖可変領域について容易に同定され得る（その全体で参照によって本明細書に組み込まれる”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）；及びＣｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照されたい）。
当技術分野において使用される、及び／または許容される用語の定義が２つ以上存在する場合、本明細書で使用されるとおりの用語の定義は、反対のことが明記されていない限り、すべてのそのような意味を含むことが意図される。具体的な例は、重鎖及び軽鎖の両方のポリペプチドの可変領域内に見出される非連続的な抗原結合部位を説明するための「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）という用語の使用である。これらの特定の領域は、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって記載されており、これらは、参照によって本明細書に組み込まれる。Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの定義は、相互に比較した場合のアミノ酸の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはそのバリアントのＣＤＲを指すためのいずれの定義（または当業者に公知の他の定義）の適用も、別段に示さない限り、本明細書で定義及び使用されるとおりの用語の範囲内であることが意図される。上記の引用参考文献のそれぞれによって定義されるとおりのＣＤＲを包含する適切なアミノ酸を、比較として以下の表１に記載する。特定のＣＤＲを包含する正確なアミノ酸番号は、ＣＤＲの配列及びサイズに応じて変動する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられると、どのアミノ酸が特定のＣＤＲを構成するかをルーチン的に決定することができる。
（表１）ＣＤＲ定義＊
＊表１におけるすべてのＣＤＲ定義の番号付けは、Ｋａｂａｔらによって記載された番号付けの規則に従う（以下を参照されたい）。
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能である可変ドメイン配列の番号付けシステムを定義した。当業者は、配列自体以外のいかなる実験データにも頼ることなく、任意の可変ドメイン配列に「Ｋａｂａｔ番号付け」のこのシステムを一義的に割り当てることができる。本明細書で使用する場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって記載される番号付けシステムを指す。しかしながら、Ｋａｂａｔ番号付けシステムの使用が明記されていない限り、本開示では、連続した番号付けがすべてのアミノ酸配列について使用される。
結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体には、これに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、一本鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生される断片が含まれる。ＳｃＦｖ分子は当技術分野で公知であり、例えば米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。
「特異的に結合する」とは、一般的に、結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体が、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、及びその結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間で多少の相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、結合分子は、それが無作為の無関係なエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介してそのエピトープに結合する場合に、エピトープに「特異的に結合する」と言われる。「特異性」という用語は、ある種の結合分子がある種のエピトープに結合する際の相対的親和性を表すために、本明細書において使用される。例えば、結合分子「Ａ」は、所与のエピトープについて結合分子「Ｂ」よりも高い特異性を有すると見なすことができるか、または結合分子「Ａ」は、関連エピトープ「Ｄ」について有する特異性よりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われ得る。
本明細書において開示する結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×１０−３秒−１、１０−３秒−１、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、もしくは１０−５秒−１、５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１、または１０−７秒−１以下のオフ速度（ｋ（ｏｆｆ））で標的抗原に結合すると言われ得る。
本明細書において開示する結合分子、例えば、抗体、または抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１、５×１０４Ｍ−１秒−１、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、もしくは５×１０６Ｍ−１秒−１、または１０７Ｍ−１秒−１以上のオン速度（ｋ（ｏｎ））で標的抗原に結合すると言われ得る。
結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、所与のエピトープに対する参照抗体または抗原結合断片の結合をある程度遮断する程度まで、そのエピトープに優先的に結合するのであれば、そのエピトープに対する参照抗体または抗原結合断片の結合を競合阻害すると言われる。競合阻害は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイによって決定することができる。結合分子は、所与のエピトープに対する参照抗体または抗原結合断片の結合を、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％競合阻害すると言われ得る。
本明細書で使用する場合、「親和性」という用語は、個々のエピトープと、例えば、免疫グロブリン分子の１つまたは複数の結合ドメインとの結合の強さの尺度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）の２７〜２８ページを参照されたい。本明細書で使用する場合、「結合活性」という用語は、結合ドメインの集団と抗原との複合体の全体的な安定性を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの２９〜３４ページを参照されたい。結合活性は、集団中の個々の結合ドメインと特定のエピトープとの親和性、ならびにまた免疫グロブリン及び抗原の結合価の両方に関係する。例えば、２価モノクローナル抗体と、重合体などの高度反復エピトープ構造を有する抗原との相互作用は、高い結合活性の１つである。２価モノクローナル抗体と、細胞表面上に高密度で存在する受容体との相互作用もまた、高い結合活性のものである。
本明細書に開示のとおりの結合分子、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体はまた、それらの交差反応性に関して説明または特定され得る。本明細書で使用する場合、「交差反応性」という用語は、ある抗原に特異的な結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体が第２の抗原と反応する能力；２つの異なる抗原物質間の関連性の尺度を指す。したがって、結合分子が、その形成を誘導したエピトープ以外のエピトープに結合するのであれば、その結合分子は交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般的に、誘導エピトープと同じ相補的構造的特徴の多くを含有しており、場合によっては、元のエピトープよりも実際には良好に適合し得る。
結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体はまた、抗原に対するそれらの結合親和性に関して説明または特定され得る。例えば、結合分子は、５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ以下の解離定数またはＫＤで抗原に結合し得る。
一本鎖抗体または他の結合ドメインを含む抗体断片は、単独で、または以下：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、もしくはＣＨ４ドメイン、Ｊ鎖、または分泌成分のうちの１つまたは複数との組み合わせで存在し得る。可変領域（複数可）と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、もしくはＣＨ４ドメイン、Ｊ鎖、または分泌成分のうちの１つまたは複数との任意の組み合わせを含み得る抗原結合断片も含まれる。結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片は、鳥類及び哺乳類を含む任意の動物起源に由来し得る。抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ラマ、ウマ、またはニワトリ抗体であってよい。別の実施形態では、可変領域は軟骨魚類（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）起源（例えば、サメ由来）であってもよい。本明細書で使用する場合、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ならびにヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、または以下に記載の、及び例えばＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，９３９，５９８号に記載のとおりの、１つもしくは複数のヒト免疫グロブリンに関してトランスジェニックであり、場合によっては内因性免疫グロブリンを発現することができ、場合によってはできない動物から単離された抗体が含まれる。
本明細書で使用する場合、「重鎖サブユニット」という用語は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含み、重鎖サブユニットを含む結合分子、例えば、抗体は、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中間、及び／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、またはそのバリアントもしくは断片のうちの少なくとも１つを含み得る。例えば、結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、限定ではないが、ＶＨドメインに加えて、ＣＨ１ドメイン；ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、及びＣＨ２ドメイン；ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン；ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、及びＣＨ３ドメイン；またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含み得る。ある種の態様では、結合分子、例えば、抗体、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、ＶＨドメインに加えて、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン；またはＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、及びＪ鎖を含み得る。さらに、本開示において使用するための結合分子は、一定の定常領域部分、例えば、ＣＨ２ドメインのすべてまたは一部を欠いていてもよい。これらのドメイン（例えば、重鎖サブユニット）が、元の免疫グロブリン分子とアミノ酸配列が異なるように修飾され得ることは、当業者によって理解されるであろう。
本明細書で使用する場合、「軽鎖サブユニット」という用語は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。軽鎖サブユニットは、少なくともＶＬを含み、ＣＬ（例えば、ＣκまたはＣλ）ドメインをさらに含み得る。
結合分子、例えば、抗体、またはその抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体は、それらが認識するか、または特異的に結合する抗原のエピトープ（複数可）または部分（複数可）に関して説明または特定され得る。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的抗原の部分が、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的抗原は、単一のエピトープまたは少なくとも２つのエピトープを含み得、抗原のサイズ、高次構造、及び種類に応じて、任意の数のエピトープを含み得る。
すでに示したとおり、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造及び三次元配置は周知である。本明細書で使用する場合、「ＶＨドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖のアミノ末端の可変ドメインを含み、「ＣＨ１ドメイン」という用語は、免疫グロブリン重鎖の最初の（最もアミノ末端側の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接しており、典型的なＩｇＧ重鎖分子のヒンジ領域のアミノ末端側にある。
本明細書で使用する場合、「ＣＨ２ドメイン」という用語は、例えば、従来の番号付けスキームを用いて、ＩｇＧ抗体の例えば、アミノ酸のおよそ２４４位からアミノ酸のおよそ３６０位に及ぶ重鎖分子の部分を含む（アミノ酸２４４〜３６０、Ｋａｂａｔ番号付けシステム；及びアミノ酸２３１〜３４０、ＥＵ番号付けシステム；ＫａｂａｔＥＡ ｅｔ ａｌ．、前掲書を参照されたい）。ＣＨ３ドメインは、ＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端に及び、およそ１０８アミノ酸を含む。特定の免疫グロブリンクラス、例えばＩｇＭはさらに、ＣＨ４領域を含む。
本明細書で使用する場合、「ヒンジ領域」という用語は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＤ重鎖においてＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域はおよそ２５アミノ酸を含み、可動性であり、したがって、２つのＮ末端の抗原結合領域は独立して動くことが可能である。
本明細書で使用する場合、「ジスルフィド結合」という用語は、２つの硫黄原子間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、第２のチオール基とジスルフィド結合または架橋を形成し得るチオール基を含む。
本明細書で使用する場合、「キメラ抗体」という用語は、免疫反応領域または部位が第１の種から得られているか、またはそれに由来し、かつ定常領域（インタクト、部分的、または修飾型であってよい）が第２の種から得られている抗体を指す。一部の実施形態では、標的結合領域または部位は非ヒト供給源（例えば、マウスまたは霊長類）に由来し、定常領域はヒトである。
「多重特異性抗体」または「二重特異性抗体」という用語は、単一の抗体分子内に、２つ以上の異なるエピトープに対する結合ドメインを有する抗体を指す。標準的な抗体構造に加えて、２つの結合特異性を有する他の結合分子を構築することができる。二重特異性または多重特異性抗体によるエピトープ結合は、同時または逐次的であってよい。トリオーマ及びハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性抗体を分泌し得る細胞系の２つの例である。二重特異性抗体はまた、組換え手段によって構築することもできる（Ｓｔｒｏｈｌｅｉｎ ａｎｄ Ｈｅｉｓｓ，Ｆｕｔｕｒｅ Ｏｎｃｏｌ．６：１３８７−９４（２０１０）；Ｍａｂｒｙ ａｎｄ Ｓｎａｖｅｌｙ，ＩＤｒｕｇｓ．１３：５４３−９（２０１０））。二重特異性抗体はまた、ダイアボディであってもよい。
本明細書で使用する場合、「操作された抗体」という用語は、重鎖及び軽鎖のいずれか一方またはその両方の可変ドメインが、ＣＤＲまたはフレームワーク領域のいずれかにおいて１個または複数のアミノ酸の少なくとも部分置換によって改変されている抗体を指す。ある種の態様では、公知の特異性の抗体に由来するＣＤＲ全体を、異種抗体のフレームワーク領域にグラフトすることができる。代替ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはさらにはサブクラスの抗体に由来してよいが、ＣＤＲはまた、異なるクラスの抗体、例えば異なる種からの抗体に由来してもよい。公知の特異性の非ヒト抗体からの１つまたは複数の「ドナー」ＣＤＲがヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域にグラフトされた、操作された抗体は、本明細書において「ヒト化抗体」と称される。ある種の態様では、ＣＤＲのすべてが、ドナー可変領域由来の完全なＣＤＲで置き換えられるわけではないが、それでも、ドナーの抗原結合能をレシピエント可変ドメインに移行させることができる。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６１号、同第５，６９３，７６２号、及び同第６，１８０，３７０号に記載された説明を考慮すると、ルーチン的な実験の実行または試行錯誤の試験のいずれかによって、機能的な操作された抗体またはヒト化抗体を得ることは、十分に当業者の能力の範囲内である。
本明細書で使用する場合、「操作された」という用語は、合成手段による（例えば、組換え技法、インビトロペプチド合成、ペプチドの酵素的もしくは化学的カップリング、またはこれらの技法のいくつかの組み合わせによる）核酸またはポリペプチド分子の操作を含む。
本明細書で使用する場合、「連結された」、「融合された」、もしくは「融合」という用語、または他の文法的等価物は、互換的に使用され得る。これらの用語は、化学的結合または組換え手段を含むどのような手段であれ、２つ以上の要素または成分を共に連結することを指す。「インフレーム融合」は、元のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳リーディングフレームを維持する様式で、２つ以上のポリヌクレオチドＯＲＦを連結して、連続したより長いＯＲＦを形成することを指す。したがって、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポリペプチドに対応する２つ以上のセグメントを含有する単一のタンパク質である（これらのセグメントは通常、天然ではそのように連結されていない）。リーディングフレームはこのように融合セグメント全体にわたって連続しているが、これらのセグメントは、例えばインフレームのリンカー配列によって、物理的または空間的に分離されていてもよい。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、インフレームで融合させることができるが、「融合された」ＣＤＲが連続ポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域またはさらなるＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって分離されていてもよい。
本明細書で使用する場合、「架橋された」という用語は、２個以上の分子を第３の分子によって共に連結することを指す。例えば、同じ抗原に特異的に結合する２つの結合ドメインを有する二価抗体は、例えばその抗原の２コピーが細胞上に発現されている場合に、それらを「架橋」し得る。ＴＮＦＳＦＲを介してのシグナル伝達は典型的には、３つ以上の受容体モノマーが細胞の表面上で近接することを必要とする。これは天然では、ホモ三量体リガンドを介しての受容体モノマーの会合によって達成される。典型的な二価ＩｇＧ抗体は、細胞の表面上で、２個のＴＮＦＳＦＲモノマーを会合させることしかできず、したがって、そのような二価抗体は、受容体を効果的に活性化させるためには、それ自体が架橋されることを必要とする。そのような架橋は、例えば、二価抗体のＦｃ領域に結合する二次抗体で、またはＦｃガンマ受容体によって達成され得る。「二次架橋部分」は、本明細書で使用する場合、結合分子、例えば、ＴＮＦＳＦＲについて特異的な結合分子を架橋することができる任意の物質であってよい。本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子は、単一の共有結合分子中に最高４、１０、または１２個の同一の抗原結合ドメインを含む。各抗原結合ドメインは、ＴＮＦＳＦＲモノマーに会合して、モノマーを近接させてクラスター化することができる。したがって、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子は例えば、同時に少なくとも３、例えば、４、１０、または１２個のＴＮＦＳＦＲに特異的に結合し、それらを架橋し、それによって、二次架橋部分の非存在下でシグナル伝達を活性化させることができる。
ポリペプチドとの関連で、「線状配列」または「配列」は、ポリペプチドにおけるアミノ末端からカルボキシル末端方向へのアミノ酸の順序であり、配列内で相互に隣接するアミノ酸は、ポリペプチドの一次構造において連続している。ポリペプチドの別の部分に対して「アミノ末端側」または「Ｎ末端側」にあるポリペプチドの部分は、連続的なポリペプチド鎖において先に来る部分である。同様に、ポリペプチドの別の部分に対して「カルボキシル末端側」または「Ｃ末端側」にあるポリペプチドの部分は、連続的なポリペプチド鎖において後に来る部分である。例えば、定型抗体において、可変ドメインは定常領域の「Ｎ末端側」にあり、定常領域は可変ドメインの「Ｃ末端側」にある。
「発現」という用語は、本明細書で使用する場合、遺伝子が生化学物質、例えば、ポリペプチドを産生するプロセスを指す。このプロセスは、限定ではないが、遺伝子ノックダウン、さらには、一過性発現及び安定発現の両方を含む、細胞内での遺伝子の機能的存在の任意の顕在化を含む。これには、限定ではないが、遺伝子のＲＮＡ、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、及びそのようなｍＲＮＡのポリペプチド（複数可）への翻訳が含まれる。所望の最終産物が生化学物質である場合、発現は、その生化学物質及び任意の前駆体の作出を含む。遺伝子の発現によって、「遺伝子産物」が生成される。本明細書で使用する場合、遺伝子産物は、核酸、例えば遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであってよい。本明細書に記載の遺伝子産物にはさらに、転写後修飾、例えばポリアデニル化を受けた核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の添加、他のタンパク質サブユニットとの結合、タンパク質分解性切断などを受けたポリペプチドが含まれる。
「処置すること」または「処置」または「処置するため」または「緩和すること」または「緩和するため」などの用語は、既存の診断された病理学的状態または障害を治癒する、減速させる、その症状を減少させる、及び／またはその進行を停止させるか、もしくは遅らせる治療的手段を指す。「予防する」、「予防」、「回避する」、「抑止」などの用語は、未診断の、標的とする病理学的状態または障害の発生を防ぐ予防的または防止的手段を指す。したがって、「処置を必要とするもの」には、その障害を既に有するもの；その障害を有する傾向があるもの；及びその障害が予防されるべきものが含まれ得る。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳類」は、診断、予後診断、または治療が望まれる任意の対象、特に哺乳類対象を意味する。哺乳類対象には、ヒト、家庭用動物、家畜、牧場動物、及び動物園、運動競技、または愛玩用の動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、ウシ、クマなどが含まれる。
本明細書で使用する場合、「治療から恩恵を受ける対象」及び「処置を必要とする動物」などの語句は、すべての予期される対象のなかから、１つまたは複数の抗原結合ドメインを含む、所与の治療薬、例えば、結合分子、例えば抗体の投与から恩恵を受けるであろう対象のサブセットを指す。例えば、疾患の診断手順及び／または処置もしくは予防のために、そのような結合分子、例えば抗体を使用することができる。
ＩｇＭ結合分子
ＩｇＭは、抗原による刺激に応答してＢ細胞によって産生される最初の免疫グロブリンであり、５日の半減期で血清中におよそ１．５ｍｇ／ｍｌで存在する。ＩｇＭは五量体または六量体分子である。ＩｇＭ結合ユニットは、２本の軽鎖及び２本の重鎖を含む。ＩｇＧが３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を含有する一方で、ＩｇＭの重（μ）鎖は追加で、Ｃ末端の「尾片」を含む第４の定常ドメイン（ＣＨ４）を含有する。ヒトＩｇＭ定常領域は典型的に、アミノ酸配列の配列番号１を含む。ヒトＣμ１領域は、配列番号１のアミノ酸のおよそ５位からアミノ酸のおよそ１０２位までの範囲であり；ヒトＣμ２領域は、配列番号１のアミノ酸のおよそ１１４位からアミノ酸のおよそ２０５位までの範囲であり、ヒトＣμ３領域は、配列番号１のアミノ酸のおよそ２２４位からアミノ酸のおよそ３１９位までの範囲であり、Ｃμ４領域は、配列番号１のアミノ酸のおよそ３２９位からアミノ酸のおよそ４３０位までの範囲であり、かつ尾片は、配列番号１のアミノ酸のおよそ４３１位からアミノ酸のおよそ４５３位までの範囲である。配列番号１を下に示す。
ＩｇＭは、抗原による刺激に応答してＢ細胞によって産生される最初の免疫グロブリンであり、５日の半減期で血清中におよそ１．５ｍｇ／ｍｌで存在する。ＩｇＭは五量体または六量体分子である。ＩｇＭ結合ユニットは、２本の軽鎖及び２本の重鎖を含む。ＩｇＧが３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を含有する一方で、ＩｇＭの重（μ）鎖は追加で、Ｃ末端の「尾片」を含む第４の定常ドメイン（ＣＨ４）を含有する。ヒトＩｇＭ定常領域は典型的に、アミノ酸配列の配列番号１を含む。ヒトＣμ１領域は、配列番号１のアミノ酸のおよそ５位からアミノ酸のおよそ１０２位までの範囲であり；ヒトＣμ２領域は、配列番号１のアミノ酸のおよそ１１４位からアミノ酸のおよそ２０５位までの範囲であり、ヒトＣμ３領域は、配列番号１のアミノ酸のおよそ２２４位からアミノ酸のおよそ３１９位までの範囲であり、Ｃμ４領域は、配列番号１のアミノ酸のおよそ３２９位からアミノ酸のおよそ４３０位までの範囲であり、かつ尾片は、配列番号１のアミノ酸のおよそ４３１位からアミノ酸のおよそ４５３位までの範囲である。配列番号１を下に示す。
５つのＩｇＭ結合ユニットは、追加の小さいポリペプチド鎖（Ｊ鎖）と複合体を形成して、ＩｇＭ抗体を形成し得る。ヒトＪ鎖は、アミノ酸配列の配列番号２を含む。Ｊ鎖がなければ、ＩｇＭ結合ユニットは典型的に、集合して六量体になる。理論によって縛られることは望まないが、ＩｇＭ結合ユニットの五量体または六量体結合分子への構築には、Ｃμ３及びＣμ４ドメインが関与すると考えられている。したがって、本開示で提供する五量体または六量体結合分子は典型的に、少なくともＣμ３及びＣμ４ドメインを含むＩｇＭ定常領域を含む。配列番号２を下に示す。
ＩｇＭ重鎖定常領域は追加で、Ｃμ２ドメインもしくはその断片、Ｃμ１ドメインもしくはその断片、及び／または他のＩｇＭ重鎖ドメインを含み得る。ある種の態様では、本明細書で提供する結合分子は、完全なＩｇＭ重（μ）鎖定常ドメイン、例えば配列番号１、またはそのバリアント、誘導体、もしくは類似体を含み得る。
アゴニスト五量体または六量体ＯＸ４０結合分子
本開示は、３個以上、例えば、４個以上、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のＯＸ４０モノマー、例えば、マウス及び／またはヒトＯＸ４０モノマーに特異的に結合し得る五量体または六量体結合分子、すなわち本明細書で定義するとおりの５または６個の「結合ユニット」を有する結合分子を提供する。ある種の態様では、ＯＸ４０が、細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、Ｔｒｅｇまたは活性化エフェクターＣＴＬ上に発現される場合、本明細書で提供するとおりの五量体または六量体結合分子は、その細胞上の多数の、例えば、３個以上のＯＸ４０モノマーを十分に会合させて、二次架橋部分の非存在下でシグナル伝達経路を開始させ、それによって、抗腫瘍免疫を誘導することができる。本明細書で提供するとおりの結合分子は、単一の結合ユニットから構成される結合分子、例えば二価ＩｇＧ抗体と比較して、改善された結合特性または生物活性を有し得る。例えば、五量体または六量体結合分子は、細胞の表面上の多数の、３個以上のＯＸ４０受容体をより効率的に架橋することができ、及び／または、例えば、これに限定されないが、ＦｃγＲなどの二次架橋部分の非存在下で細胞の表面上の多数の、例えば、３個以上のＯＸ４０受容体を効果的に架橋することができ、それによって、抗腫瘍免疫を促進することができる。
本開示は、３個以上、例えば、４個以上、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個のＯＸ４０モノマー、例えば、マウス及び／またはヒトＯＸ４０モノマーに特異的に結合し得る五量体または六量体結合分子、すなわち本明細書で定義するとおりの５または６個の「結合ユニット」を有する結合分子を提供する。ある種の態様では、ＯＸ４０が、細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、Ｔｒｅｇまたは活性化エフェクターＣＴＬ上に発現される場合、本明細書で提供するとおりの五量体または六量体結合分子は、その細胞上の多数の、例えば、３個以上のＯＸ４０モノマーを十分に会合させて、二次架橋部分の非存在下でシグナル伝達経路を開始させ、それによって、抗腫瘍免疫を誘導することができる。本明細書で提供するとおりの結合分子は、単一の結合ユニットから構成される結合分子、例えば二価ＩｇＧ抗体と比較して、改善された結合特性または生物活性を有し得る。例えば、五量体または六量体結合分子は、細胞の表面上の多数の、３個以上のＯＸ４０受容体をより効率的に架橋することができ、及び／または、例えば、これに限定されないが、ＦｃγＲなどの二次架橋部分の非存在下で細胞の表面上の多数の、例えば、３個以上のＯＸ４０受容体を効果的に架橋することができ、それによって、抗腫瘍免疫を促進することができる。
本明細書で提供するとおりの結合分子は、同様に、合成またはキメラ構造から構成される多価結合分子と比較して、特有の特徴を有し得る。例えば、ヒトＩｇＭ定常領域の使用は、キメラ定常領域または合成構造を含有する結合分子と比べて、免疫原性の低下、したがって安全性の増加を提供し得る。さらに、ＩｇＭベースの結合分子は一貫して、六量体または五量体オリゴマーを形成し、より均一な発現産物をもたらし得る。優れた補体結合も、ＩｇＭベースの結合分子の有利なエフェクター機能であり得る。
ある種の態様では、本開示は、それぞれ５または６個の二価結合ユニットを含む五量体または六量体結合分子であって、各結合ユニットが２つのＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片を含む、五量体または六量体結合分子を提供する。ある種の態様では、２つのＩｇＭ重鎖定常領域はヒト重鎖定常領域である。
本明細書で提供する結合分子が五量体である場合、その結合分子はさらに、Ｊ鎖またはその断片もしくはそのバリアントを含み得る。ある種の態様では、Ｊ鎖は、本明細書の他の箇所で論述するとおり、修飾されていてもよい。
ＩｇＭ重鎖定常領域は、この定常領域が、結合分子において所望の機能を果たし得る、例えば、第２のＩｇＭ定常領域と結合して結合ドメインを形成し得る、または他の結合ユニットと結合して六量体もしくは五量体を形成し得る限り、Ｃμ１ドメインまたはその断片もしくはバリアント、Ｃμ２ドメインまたはその断片もしくはバリアント、Ｃμ３ドメインまたはその断片もしくはバリアント、及び／またはＣμ４ドメインまたはその断片もしくはバリアントのうちの１つまたは複数を含み得る。ある種の態様では、個々の結合ユニット内の２つのＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片もしくはバリアントはそれぞれ、Ｃμ３ドメインまたはその断片もしくはバリアント、Ｃμ４ドメインまたはその断片もしくはバリアント、尾片（ＴＰ）またはその断片もしくはバリアント、あるいはＣμ３ドメイン、Ｃμドメイン、及びＴＰ、またはその断片もしくはバリアントの任意の組み合わせを含む。ある種の態様では、個々の結合ユニット内の２本のＩｇＭ重鎖定量領域またはその断片もしくはバリアントはそれぞれさらに、Ｃμ２ドメインまたはその断片もしくはバリアント、Ｃμ１ドメインまたはその断片もしくはバリアント、あるいはＣμ１ドメインまたはその断片もしくはバリアント及びＣμ２ドメインまたはその断片もしくはバリアントを含む。
ある種の態様では、所与の結合ユニット中の２つのＩｇＭ重鎖定常領域のそれぞれは、抗原結合ドメイン、例えば、抗体のＦｖ部分、例えばヒトまたはマウス抗体のＶＨ及びＶＬと結合しており、その際、ＶＬは軽鎖定常領域と結合していてよい。本明細書で提供する結合分子において、結合分子の少なくとも３個の抗原結合ドメインは、ＯＸ４０、例えば、ヒト及び／またはマウスＯＸ４０に特異的に、かつアゴニスティックに結合し得るＯＸ４０結合ドメインである。
ＩｇＡ結合分子
ＩｇＡは、粘膜免疫において重要な役割を果たし、産生される全免疫グロブリンの約１５％を占める。ＩｇＡは、単量体または二量体分子である。ＩｇＡ結合ユニットは、２本の軽鎖及び２本の重鎖を含む。ＩｇＡは、３つの重鎖定常ドメイン（Ｃα１、Ｃα２、及びＣα３）を含有し、Ｃ末端の「尾片」を含む。ヒトＩｇＡには、２つのサブタイプ、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２がある。ヒトＩｇＡ１定常領域は典型的に、アミノ酸配列の配列番号３を含む。ヒトＣα１領域は、配列番号３のアミノ酸のおよそ６位からアミノ酸のおよそ９８位までの範囲であり；ヒトＣα２領域は、配列番号３のアミノ酸のおよそ１２５位からアミノ酸のおよそ２２０位までの範囲であり、ヒトＣα３領域は、配列番号３のアミノ酸のおよそ２２８位からアミノ酸のおよそ３３０位までの範囲であり、かつ尾片は、配列番号３のアミノ酸のおよそ３３１位からアミノ酸のおよそ３５２位までの範囲である。ヒトＩｇＡ２定常領域は典型的に、アミノ酸配列の配列番号４を含む。ヒトＣα１領域は、配列番号４のアミノ酸のおよそ６位からアミノ酸のおよそ９８位までの範囲であり；ヒトＣα２領域は、配列番号４のアミノ酸のおよそ１１２位からアミノ酸のおよそ２０７位までの範囲であり、ヒトＣα３領域は、配列番号４のアミノ酸のおよそ２１５位からアミノ酸のおよそ３１７位までの範囲であり、かつ尾片は、配列番号４のアミノ酸のおよそ３１８位からアミノ酸のおよそ３４０位までの範囲である。配列番号３及び４を下に示す。
配列番号３
配列番号４
ＩｇＡは、粘膜免疫において重要な役割を果たし、産生される全免疫グロブリンの約１５％を占める。ＩｇＡは、単量体または二量体分子である。ＩｇＡ結合ユニットは、２本の軽鎖及び２本の重鎖を含む。ＩｇＡは、３つの重鎖定常ドメイン（Ｃα１、Ｃα２、及びＣα３）を含有し、Ｃ末端の「尾片」を含む。ヒトＩｇＡには、２つのサブタイプ、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２がある。ヒトＩｇＡ１定常領域は典型的に、アミノ酸配列の配列番号３を含む。ヒトＣα１領域は、配列番号３のアミノ酸のおよそ６位からアミノ酸のおよそ９８位までの範囲であり；ヒトＣα２領域は、配列番号３のアミノ酸のおよそ１２５位からアミノ酸のおよそ２２０位までの範囲であり、ヒトＣα３領域は、配列番号３のアミノ酸のおよそ２２８位からアミノ酸のおよそ３３０位までの範囲であり、かつ尾片は、配列番号３のアミノ酸のおよそ３３１位からアミノ酸のおよそ３５２位までの範囲である。ヒトＩｇＡ２定常領域は典型的に、アミノ酸配列の配列番号４を含む。ヒトＣα１領域は、配列番号４のアミノ酸のおよそ６位からアミノ酸のおよそ９８位までの範囲であり；ヒトＣα２領域は、配列番号４のアミノ酸のおよそ１１２位からアミノ酸のおよそ２０７位までの範囲であり、ヒトＣα３領域は、配列番号４のアミノ酸のおよそ２１５位からアミノ酸のおよそ３１７位までの範囲であり、かつ尾片は、配列番号４のアミノ酸のおよそ３１８位からアミノ酸のおよそ３４０位までの範囲である。配列番号３及び４を下に示す。
配列番号３
配列番号４
２個のＩｇＡ結合ユニットは、２本の追加のポリペプチド鎖、Ｊ鎖（配列番号２）及び分泌成分（前駆体、配列番号５、成熟体、配列番号６）と複合体を形成して、分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）抗体を形成し得る。理論によって縛られることは望まないが、ＩｇＡ結合ユニットの二量体ｓＩｇＡ結合分子への構築には、Ｃα３及び尾片ドメインが関与すると考えられている。したがって、本開示で提供する二量体ｓＩｇＡ結合分子は典型的に、少なくともＣα３及び尾片ドメインを含むＩｇＡ定常領域を含む。配列番号５及び配列番号６を下に示す。
配列番号５
配列番号６
配列番号５
配列番号６
ＩｇＡ重鎖定常領域は追加で、Ｃα２ドメインもしくはその断片、Ｃα１ドメインもしくはその断片、及び／または他のＩｇＡ重鎖ドメインを含み得る。ある種の態様では、本明細書で提供する結合分子は、完全なＩｇＡ重（α）鎖定常ドメイン（例えば、配列番号３または配列番号４）、またはそのバリアント、誘導体、もしくは類似体を含み得る。
アゴニスト二量体ＯＸ４０結合分子
本開示は、３個以上または最高４個のＯＸ４０モノマー、例えば、ヒトまたはマウスＯＸ４０モノマーに特異的に結合し得る二量体結合分子、例えば本明細書で定義するとおりの２個のＩｇＡ「結合ユニット」を有する結合分子を提供する。ある種の態様では、ＯＸ４０が細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、Ｔｒｅｇまたは活性化エフェクターＣＴＬ上に発現される場合、その細胞上の多数のＯＸ４０受容体と、本明細書で提供するとおりの結合分子との接触は、二次架橋部分の非存在下でシグナル伝達経路を開始させ、それによって、抗腫瘍免疫を誘導することができる。本明細書で提供するとおりの二量体結合分子は、単一の結合ユニットから構成される結合分子、例えば、二価ＩｇＧ抗体と比較して、改善された結合特性または生物活性を有し得る。例えば、ＩｇＡ結合分子は、細胞の表面上の多数の、例えば、３個以上のＯＸ４０受容体をより効率的に架橋することができ、及び／または二次架橋部分、例えば、これに限定されないが、ＦｃγＲの非存在下で細胞の表面上の多数の、例えば、３個以上のＯＸ４０受容体を効率的に架橋し、それによって、抗腫瘍免疫を促進することができる。さらに、ＩｇＡ結合分子は、粘膜部位に到達し、本明細書で提供する結合分子のより多大な組織分布を提供し得る。ＩｇＡベースの結合分子の使用は、例えば、本明細書で提供する結合分子のより多大な組織分布を可能にし得る。粘膜分布は、ある種のがん、例えば、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、または扁平上皮癌の腫瘍微小環境に達するために有益であり得る。同様に、本明細書で提供するとおりの二量体結合分子は、５または６個の結合ユニットを含む結合分子、例えば六量体または五量体ＩｇＭ抗体と区別され得る結合特性または生物活性を有し得る。例えば、二量体結合分子はより小さく、例えば、固形腫瘍においてより良好な組織浸透を達成し得る。
本開示は、３個以上または最高４個のＯＸ４０モノマー、例えば、ヒトまたはマウスＯＸ４０モノマーに特異的に結合し得る二量体結合分子、例えば本明細書で定義するとおりの２個のＩｇＡ「結合ユニット」を有する結合分子を提供する。ある種の態様では、ＯＸ４０が細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、Ｔｒｅｇまたは活性化エフェクターＣＴＬ上に発現される場合、その細胞上の多数のＯＸ４０受容体と、本明細書で提供するとおりの結合分子との接触は、二次架橋部分の非存在下でシグナル伝達経路を開始させ、それによって、抗腫瘍免疫を誘導することができる。本明細書で提供するとおりの二量体結合分子は、単一の結合ユニットから構成される結合分子、例えば、二価ＩｇＧ抗体と比較して、改善された結合特性または生物活性を有し得る。例えば、ＩｇＡ結合分子は、細胞の表面上の多数の、例えば、３個以上のＯＸ４０受容体をより効率的に架橋することができ、及び／または二次架橋部分、例えば、これに限定されないが、ＦｃγＲの非存在下で細胞の表面上の多数の、例えば、３個以上のＯＸ４０受容体を効率的に架橋し、それによって、抗腫瘍免疫を促進することができる。さらに、ＩｇＡ結合分子は、粘膜部位に到達し、本明細書で提供する結合分子のより多大な組織分布を提供し得る。ＩｇＡベースの結合分子の使用は、例えば、本明細書で提供する結合分子のより多大な組織分布を可能にし得る。粘膜分布は、ある種のがん、例えば、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、または扁平上皮癌の腫瘍微小環境に達するために有益であり得る。同様に、本明細書で提供するとおりの二量体結合分子は、５または６個の結合ユニットを含む結合分子、例えば六量体または五量体ＩｇＭ抗体と区別され得る結合特性または生物活性を有し得る。例えば、二量体結合分子はより小さく、例えば、固形腫瘍においてより良好な組織浸透を達成し得る。
ある種の態様では、本開示は、２個の二価結合ユニットを含む二量体結合分子であって、各結合ユニットが２つのＩｇＡ重鎖定常領域またはその断片もしくはバリアントを含む二量体結合分子を提供する。ある種の態様では、２つのＩｇＡ重鎖定常領域はヒト重鎖定常領域である。
本明細書で提供するとおりの二量体ＩｇＡ結合分子はさらに、Ｊ鎖またはその断片もしくはそのバリアント、例えば、本明細書の他の箇所において開示するとおりの修飾Ｊ鎖を含み得る。本明細書で提供するとおりの二量体ＩｇＡ結合分子はさらに、分泌成分またはその断片もしくはそのバリアントを含み得る。
ＩｇＡ重鎖定常領域は、この定常領域が、結合分子において所望の機能を果たし得る、例えば、軽鎖定常領域と結合して抗原結合ドメインの形成を促進し得る、または別のＩｇＡ結合ユニットと結合して二量体結合分子を形成し得る限り、Ｃα１ドメイン、Ｃα２ドメイン、及び／またはＣα３ドメインのうちの１つまたは複数を含み得る。ある種の態様では、個々の結合ユニット内の２つのＩｇＡ重鎖定常領域またはその断片もしくはバリアントはそれぞれ、Ｃα３ドメインまたはその断片もしくはバリアント、尾片（ＴＰ）またはその断片もしくはバリアント、あるいはＣα３ドメイン、ＴＰ、またはそれらの断片もしくはバリアントの任意の組み合わせを含む。ある種の態様では、個々の結合ユニット内の２つのＩｇＡ重鎖定量領域またはその断片はそれぞれさらに、Ｃα２ドメインまたはその断片もしくはバリアント、Ｃα１ドメインまたはその断片もしくはバリアント、あるいはＣα１ドメインまたはその断片もしくはバリアント及びＣα２ドメインまたはその断片もしくはバリアントを含む。
ある種の態様では、所与の結合ユニット中の２つのＩｇＡ重鎖定常領域のそれぞれは、抗原結合ドメイン、例えば、抗体のＦｖ部分、例えばヒトまたはマウス抗体のＶＨ及びＶＬと結合しており、この場合、ＶＬは軽鎖定常領域と結合していてよい。本明細書で提供するとおりの結合分子において、結合分子の少なくとも３個の抗原結合ドメインは、ＯＸ４０、例えば、ヒト及び／またはマウスＯＸ４０に特異的に、かつアゴニスティックに結合する。
多重特異性二量体、五量体または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子
本明細書で提供するとおりの多重特異性、例えば、二重特異性二量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子は、ＩｇＡ抗体の二量体型に基づくことができ、その際、結合した軽鎖配列を伴って、または伴わずに、２対のＩｇＡ重鎖配列が存在し得る。例えば、本明細書で提供するとおりの二重特異性二量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子は、Ｊ鎖、例えば、本明細書の他の箇所で提供するとおりの修飾Ｊ鎖を含む、２つのＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）二量体から構成されてよい。
本明細書で提供するとおりの多重特異性、例えば、二重特異性二量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子は、ＩｇＡ抗体の二量体型に基づくことができ、その際、結合した軽鎖配列を伴って、または伴わずに、２対のＩｇＡ重鎖配列が存在し得る。例えば、本明細書で提供するとおりの二重特異性二量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子は、Ｊ鎖、例えば、本明細書の他の箇所で提供するとおりの修飾Ｊ鎖を含む、２つのＩｇＡ（ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）二量体から構成されてよい。
本明細書で提供するとおりの多重特異性、例えば、二重特異性二量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子は、その分子が全体として、少なくとも２つの結合特異性を、例えば、少なくとも２つの同一でない抗原結合ドメイン、例えば、ＯＸ４０の異なるエピトープ、他のＴＮＦＳＦＲ分子、または異種の抗原からのエピトープを含む限り、単一及び二重特異性結合ユニットを含むことができる。
したがって、一実施形態では、本明細書で提供するとおりの多重特異性、例えば、二重特異性二量体結合分子は、異なる結合標的に対して二価結合特異性をそれぞれ有する２個の単一特異性結合ユニット（ＡＡ、ＢＢ）を含むことができる。別の実施形態では、本明細書で提供するとおりの多重特異性、例えば、二重特異性二量体結合分子は、各結合ユニットが同じ２つの結合標的に結合する２個の二重特異性結合ユニット（ＡＢ、ＡＢ）を含んで、二重特異性二量体結合分子を形成することができる。さらなる一実施形態では、本明細書で提供するとおりの多重特異性二量体結合分子に存在する１個の結合ユニットは、単一特異性（ＡＡ）である一方で、他の結合ユニットは、二重特異性（ＢＣ）であり、３つの（Ａ、Ｂ、Ｃ）結合特異性を有する多重特異性結合分子が生じている。さらなる一実施形態では、各結合ユニットは、二重特異性であるが、１つの特異性が重複していて（例えば、ＡＢ、ＡＣ）、３つの（Ａ、Ｂ、Ｃ）結合特異性を有する多重特異性結合分子が生じている。例えば、４つの同一でない抗原結合ドメイン（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）を有する他の組合せも、本開示に基づき容易に作製することができる。
本明細書で提供するとおりの多重特異性、例えば、二重特異性五量体または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子は、ＩｇＭ抗体の五量体型または六量体型に基づくことができ、その際、結合した軽鎖配列を伴って、または伴わずに、５対または６対のＩｇＭ重鎖配列が存在し得る。例えば、本明細書で提供するとおりの二重特異性６量体または五量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子は、Ｊ鎖、例えば、本明細書の他の箇所で提供するとおりの修飾Ｊ鎖を含む、５つのＩｇＭ二量体、または６つのＩｇＭ二量体から構成されてよい。
本明細書で提供するとおりの多重特異性、例えば、二重特異性五量体または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子は、その分子が全体として、少なくとも２つの結合特異性を、例えば、少なくとも２つの同一でない抗原結合ドメイン、例えば、ＯＸ４０の異なるエピトープ、他のＴＮＦＳＦＲ分子、または異種の抗原からのエピトープを含む限り、単一及び二重特異性結合ユニットを含むことができる。
多重特異性二量体結合分子について上記で論述したとおり、５または６個の結合ユニットのそれぞれは独立に、単一特異性または二重特異性（例えば、ＡＡ、ＢＢ、ＣＣなど）であってもよいし、または１個または複数の結合ユニットは、二重特異性（例えば、ＡＢ、ＡＢ、ＡＣ、ＣＤなど）であってもよい。したがって、本明細書で提供するとおりの多重特異性、例えば、二重特異性五量体または六量体結合分子は、少なくとも２つの独立した抗原結合ドメイン、及び最高１２個の異なる独立した抗原結合ドメインを含むことができる。
修飾Ｊ鎖
ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの二量体または五量体結合分子のＪ鎖は、その結合標的（複数可）と会合及び結合するＩｇＭまたはＩｇＡ結合分子の能力を妨害することなく、例えば、異種部分、または２つ以上の異種部分の導入によって修飾されていてよい。それぞれ、その全体で参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２４１４９（公報ＷＯ２０１５／１５３９１２）、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５５０５３（公報ＷＯ２０１７／０５９３８７）、及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５５０４１（公報ＷＯ２０１７／０５９３８０）を参照されたい。したがって、本明細書の他の箇所で記載するとおりの多重特異性二量体または五量体結合分子を含む、本明細書で提供するとおりの二量体または五量体結合分子は、Ｊ鎖またはその断片に導入された異種部分を含む修飾Ｊ鎖またはその機能性断片を含むことができる。ある種の態様では、異種部分は、フレームでＪ鎖に融合している、またはＪ鎖に化学的にコンジュゲートしているペプチドまたはポリペプチド配列であってよい。ある種の態様では、異種部分は、Ｊ鎖にコンジュゲートしている化学的部分であってよい。Ｊ鎖に結合される異種部分には、限定ではないが、結合部分、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片、例えば、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子、二量体もしくは五量体結合分子の半減期を増大させ得る安定化ペプチド、または化学的部分、例えば、ポリマーもしくは細胞毒素が含まれ得る。
ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの二量体または五量体結合分子のＪ鎖は、その結合標的（複数可）と会合及び結合するＩｇＭまたはＩｇＡ結合分子の能力を妨害することなく、例えば、異種部分、または２つ以上の異種部分の導入によって修飾されていてよい。それぞれ、その全体で参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２４１４９（公報ＷＯ２０１５／１５３９１２）、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５５０５３（公報ＷＯ２０１７／０５９３８７）、及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５５０４１（公報ＷＯ２０１７／０５９３８０）を参照されたい。したがって、本明細書の他の箇所で記載するとおりの多重特異性二量体または五量体結合分子を含む、本明細書で提供するとおりの二量体または五量体結合分子は、Ｊ鎖またはその断片に導入された異種部分を含む修飾Ｊ鎖またはその機能性断片を含むことができる。ある種の態様では、異種部分は、フレームでＪ鎖に融合している、またはＪ鎖に化学的にコンジュゲートしているペプチドまたはポリペプチド配列であってよい。ある種の態様では、異種部分は、Ｊ鎖にコンジュゲートしている化学的部分であってよい。Ｊ鎖に結合される異種部分には、限定ではないが、結合部分、例えば、抗体もしくはその抗原結合断片、例えば、一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）分子、二量体もしくは五量体結合分子の半減期を増大させ得る安定化ペプチド、または化学的部分、例えば、ポリマーもしくは細胞毒素が含まれ得る。
一部の実施形態では、修飾Ｊ鎖は、限定ではないが、標的抗原に特異的に結合することができるポリペプチド（低分子ペプチドを含む）を含むことができる抗原結合ドメインを含むことができる。ある種の態様では、修飾Ｊ鎖と結合している抗原結合ドメインは、本明細書の他の箇所で記載するとおりの抗体またはその抗原結合断片であってよい。ある種の態様では、抗原結合ドメインは、例えば、ラクダ科または軟骨魚類抗体に由来するｓｃＦｖ結合ドメインまたは一本鎖結合ドメインであってよい。抗原結合ドメインは、Ｊ鎖の機能、または結合しているＩｇＭもしくはＩｇＡ抗体の機能を妨害することなく、抗原結合ドメインがその結合標的に結合することを可能にする任意の位置で、Ｊ鎖に導入することができる。挿入位置には、これに限定されないが：Ｃ末端もしくはその付近、Ｎ末端もしくはその付近、またはＪ鎖の三次元構造に基づきアクセス可能である内部位置が含まれる。ある種の態様では、抗原結合ドメインを、配列番号２のヒトＪ鎖に、配列番号２のシステイン残基９２から１０１の間で導入することができる。さらなる一態様では、抗原結合ドメインは、配列番号２のヒトＪ鎖に、グリコシル化部位またはその付近で導入することができる。さらなる一態様では、抗原結合ドメインを、配列番号２のヒトＪ鎖に、Ｃ末端から約１０のアミノ酸残基内で導入することができる。
ＯＸ４０結合ドメイン
本明細書で提供するとおりのＯＸ４０アゴニスト結合分子は、それぞれ２、５、または６個の二価結合ユニットを含む二量体、五量体、または六量体であってよい。結合ユニットは、全長またはその、結合機能を保持しているバリアントもしくは断片であってよい。
本明細書で提供するとおりのＯＸ４０アゴニスト結合分子は、それぞれ２、５、または６個の二価結合ユニットを含む二量体、五量体、または六量体であってよい。結合ユニットは、全長またはその、結合機能を保持しているバリアントもしくは断片であってよい。
各結合ユニットは、抗原結合ドメインとそれぞれ結合している２つのＩｇＡまたはＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片を含む。上述のとおり、抗原結合ドメインは、エピトープに特異的に結合するために必要で、かつ十分である結合分子の領域である。本明細書に記載のとおりの「結合分子」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個以上の「抗原結合ドメイン」を含むことができる。
本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子は、ＯＸ４０、例えば、ヒト及び／またはマウスＯＸ４０に特異的に、かつアゴニスティックに結合する少なくとも３個の抗原結合ドメインを含むことができる。上述のとおり、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子は、多数の、例えば、３個以上のＯＸ４０モノマーに特異的に結合し、かつそれらを会合させることができる。ある種の態様では、ＯＸ４０が細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、Ｔｒｅｇまたは活性化エフェクターＣＴＬ上に発現される場合、細胞上の多数の、例えば、３個以上のＯＸ４０受容体と本明細書で提供するとおりの結合分子との接触は、シグナル伝達経路を開始させ、それによって、抗腫瘍免疫を誘導することができる。シグナルが細胞膜を通過してＯＸ４０発現細胞のサイトゾルへと伝達されるように、複数の受容体タンパク質が一緒に結合して受容体分子の架橋をもたらすと、シグナル伝達経路は開始され得る。
本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子は、細胞の表面上に発現される少なくとも３個のＯＸ４０モノマーを架橋することができる。その二量体、五量体、または六量体の性質によって、本明細書で提供するとおりのＯＸ４０アゴニスト結合分子は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個もの多くのＯＸ４０モノマーを架橋することができる。ＯＸ４０モノマーは、必然的に空間的に相互に近接して、多くの場合に、脂質ラフトになり、この脂質ラフトが、それらの架橋に寄与し、活性化をさらに増強することができる。本明細書で提供するとおりの五量体または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子の５個すべて、または６個すべての二価結合ユニットが、単一の細胞上の最大１０または１２個のＯＸ４０モノマーに結合する場合に、受容体の架橋及び活性化が高い効率で起こり得る。
結合ユニットのそれぞれは二価であるので、各結合分子は、１０個（五量体結合分子で）または１２個（六量体結合分子で）もの多くのＯＸ４０モノマーに結合し得る。
本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子の結合による受容体の活性化時に、細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、Ｔｒｅｇまたは活性化エフェクターＣＴＬは、活性化され、それによって、例えば、ＣＴＬ活性化（増殖、腫瘍細胞死滅）またはＴｒｅｇ免疫抑制の妨害を介して、抗腫瘍免疫を誘導することができる。
ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子は、同じＯＸ４０エピトープに同じく特異的に結合し、それをアゴナイズさせる等量の二価ＩｇＧ抗体またはその断片よりも高い効力で、ＯＸ４０発現細胞においてシグナル伝達を誘導することができる。理論によって縛られることは望まないが、提供する結合分子は二量体、五量体、または六量体であるので、及び各結合ユニットは二価であるので、そのような結合分子は、同等のＩｇＧ結合ユニットなどの任意の単独の単一結合ユニットよりも高い効力で、ＯＸ４０について以前に特徴づけられた受容体媒介性機能を誘導することができる。ＩｇＧ結合ユニットは、２つの結合部位を含有して二価であるが、以前の臨床試験が示したとおり、２個のＯＸ４０モノマーと単一ＩｇＧ分子との結合は、クロスリンカーなどの他の成分の添加がなければ無効であり得る。
「効力」または「改善された結合特性」とは、所与のアッセイ、例えば、Ｔ細胞シグナル伝達アッセイ、Ｔ細胞増殖アッセイ、Ｔ細胞活性化及びサイトカイン分泌アッセイ、細胞傷害性アッセイ、または以下の実施例において提供するとおりの他のアッセイにおいて、所与の生物学的結果、例えば、ＯＸ４０シグナル伝達活性の２０％、５０％、または９０％の活性化を達成するために必要な、所与の結合分子の最少量を意味する。
本明細書で提供するとおりの結合分子は二量体、五量体、または六量体であるので、それはそれぞれ４、１０、または１２もの多くのＯＸ４０特異的抗原結合ドメインを含有し得る。抗原結合ドメインのそれぞれは、ＯＸ４０モノマーに特異的に結合し、モノマーを一緒に寄せ集めて、アゴニスト活性をもたらし得る。さらに、異なる抗原結合ドメインは、２つ以上の特定のＯＸ４０エピトープについて特異的であり得る。
したがって、単一の二量体、五量体、または六量体結合分子は、ａ）多くのＯＸ４０モノマー上の単一のエピトープと同時に結合し得るか、またはｂ）単一のＯＸ４０モノマー上の異なるエピトープに結合し得るか、またはｃ）ＯＸ４０に加えて、異なるＴＮＦＳＦＲタンパク質上の異なるエピトープに結合し得る。実施形態ａ）では、本明細書で提供するとおりのＯＸ４０アゴニスト結合分子は、多数のＯＸ４０モノマーに結合して、それによって、単一の位置においてそのようなモノマーのラフトを形成し、その受容体が活性化される可能性を増大させることができる。他の実施形態、例えば、実施形態ｃ）では、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子は、ＯＸ４０、さらには、他のＴＮＦＳＦＲタンパク質、例えば、ＧＩＴＲ及び／またはＣＤ１３７／４−１ＢＢと接触し、それによって、様々な標的受容体を通じて１つよりも多い経路を活性化させて、細胞において所望の生物学的応答を達成するために使用することができる。これらの実施形態では、本明細書で提供するとおりのＯＸ４０アゴニスト結合分子は、すべて１つの単一細胞上にあるか、または複数の細胞にわたる、そのような受容体と接触し、それらをアゴナイズすることができる。
したがって、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子は、１個または複数の細胞の表面上に発現されるＯＸ４０、及び任意選択で１個または複数の追加のＴＮＦＳＦＲタンパク質に特異的に、かつアゴニスティックに結合する、３、４、５、６、７、８、９、１０個の、または六量体結合分子の場合には１１もしくは１２個もの多くの抗原結合ドメインを含むことができ、それによって、その細胞（複数可）において意図された、または所望の生物学的応答を誘導することができる。
本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子の結合ユニットは、ヒト、ヒト化、またはキメラ免疫グロブリン結合ユニットであってよい。免疫グロブリン配列をヒト化する方法は、当技術分野で周知である。したがって、二量体、五量体、または六量体結合分子ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、直接ヒト配列に由来してよいか、またはヒト化され得るか、もしくはキメラであってよく、すなわち、複数の異なる種に由来する配列によってコードされてよい。
ＯＸ４０を発現する細胞は、任意の動物細胞であってよい。例えば、一実施形態では、細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒトＴ細胞、例えば、ヒトＣＴＬである。例えば、細胞は、霊長類、げっ歯類、イヌ、ウマなどの細胞の任意の１つまたは複数であってよい。
本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子は、その抗原結合ドメインが、ＯＸ４０、例えば、ヒト及び／またはマウスＯＸ４０に特異的に結合することが公知である配列によってコードされるように、遺伝子操作され得る。特徴づけられていて、ＯＸ４０に特異的に結合することが公知である、大部分がＩｇＧアイソタイプであるモノクローナル抗体の可変領域の配列を、多くのグループが公表している。ＯＸ４０に特異的に結合することが公知である非限定的な免疫グロブリン可変ドメイン配列を、表２に提供する。ＯＸ４０について特異的な他のモノクローナル抗体配列も公表されている。当業者は、これらの公表された配列を操作して、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ構造などの免疫グロブリン構造、またはその生物学的活性断片もしくは機能的断片（上記で論述したとおりのｓｃＦｖ断片など）にすることができる。クローニングされた可変領域を遺伝子操作して免疫グロブリンドメインにする方法、及びそのような構築物を発現させ精製する方法は、公表されており、当業者の能力の範囲内である。
したがって、ある種の態様では、本明細書で提供するとおりのＯＸ４０結合ドメインは、それぞれ配列番号９及び配列番号１０；配列番号１１及び配列番号１２；配列番号１３及び配列番号１４；配列番号１５及び配列番号１６；配列番号１７及び配列番号１８；配列番号１９及び配列番号２０；配列番号２１及び配列番号２２；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２５及び配列番号２６；配列番号２５及び配列番号２８；配列番号２７及び配列番号２６；配列番号２７及び配列番号２８；配列番号２９及び配列番号２６；配列番号２９及び配列番号２８；配列番号３０及び配列番号３１；配列番号３０及び配列番号３３；配列番号３２及び配列番号３１；配列番号３２及び配列番号３３；配列番号３４及び配列番号３１；配列番号３４及び配列番号３３；配列番号３５及び配列番号３６；配列番号３７及び配列番号３８；配列番号３９及び配列番号４０；配列番号４１及び配列番号４２；配列番号４３及び配列番号４４；配列番号４５及び配列番号４６；配列番号４７及び配列番号４８；配列番号４９及び配列番号５０；または配列番号５１及び配列番号５２を含むかまたはそれらの中に含まれる成熟ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む抗ＯＸ４０ｍＡｂの６つの免疫グロブリン相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３、またはそのＣＤＲの１つもしくは複数において１、２、３、４、もしくは５つの単一アミノ酸置換を有する６つの免疫グロブリン相補性決定領域を含む。
（表２）抗ＯＸ４０アゴニスト抗体ＶＨ及びＶＬ配列
ある種の態様では、ＶＨは、それぞれ配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、または配列番号５１を含むかまたはその中に含まれる成熟ＶＨアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。
ある種の態様では、ＶＬは、それぞれ配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、または配列番号５２を含むかまたはその中に含まれる成熟ＶＬアミノ酸配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。
ある種の態様では、ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列は、それぞれ配列番号９及び配列番号１０；配列番号１１及び配列番号１２；配列番号１３及び配列番号１４；配列番号１５及び配列番号１６；配列番号１７及び配列番号１８；配列番号１９及び配列番号２０；配列番号２１及び配列番号２２；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２５及び配列番号２６；配列番号２５及び配列番号２８；配列番号２７及び配列番号２６；配列番号２７及び配列番号２８；配列番号２９及び配列番号２６；配列番号２９及び配列番号２８；配列番号３０及び配列番号３１；配列番号３０及び配列番号３３；配列番号３２及び配列番号３１；配列番号３２及び配列番号３３；配列番号３４及び配列番号３１；配列番号３４及び配列番号３３；配列番号３５及び配列番号３６；配列番号３７及び配列番号３８；配列番号３９及び配列番号４０；配列番号４１及び配列番号４２；配列番号４３及び配列番号４４；配列番号４５及び配列番号４６；配列番号４７及び配列番号４８；配列番号４９及び配列番号５０；または配列番号５１及び配列番号５２を含むかまたはそれらの中に含まれる成熟ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列と少なくとも少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一なアミノ酸配列を含み得る。
ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの二量体、六量体、または五量体結合分子のＯＸ４０抗原結合ドメインは、それぞれ配列番号９及び配列番号１０；配列番号１１及び配列番号１２；配列番号１３及び配列番号１４；配列番号１５及び配列番号１６；配列番号１７及び配列番号１８；配列番号１９及び配列番号２０；配列番号２１及び配列番号２２；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２５及び配列番号２６；配列番号２５及び配列番号２８；配列番号２７及び配列番号２６；配列番号２７及び配列番号２８；配列番号２９及び配列番号２６；配列番号２９及び配列番号２８；配列番号３０及び配列番号３１；配列番号３０及び配列番号３３；配列番号３２及び配列番号３１；配列番号３２及び配列番号３３；配列番号３４及び配列番号３１；配列番号３４及び配列番号３３；配列番号３５及び配列番号３６；配列番号３７及び配列番号３８；配列番号３９及び配列番号４０；配列番号４１及び配列番号４２；配列番号４３及び配列番号４４；配列番号４５及び配列番号４６；配列番号４７及び配列番号４８；配列番号４９及び配列番号５０；もしくは配列番号５１及び配列番号５２を含むかもしくはそれらの中に含まれる成熟ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３領域、または１つもしくは２つの単一アミノ酸置換を含有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３領域、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３領域、または１つもしくは２つの単一アミノ酸置換を含有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。
ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの二量体、六量体、または五量体結合分子のＯＸ４０抗原結合ドメインは、アミノ酸配列の配列番号４９を含むＶＨ、及びアミノ酸配列の配列番号５０を含むＶＬを含む（「抗ＯＸ４０＃１」）。
ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの二量体、六量体、または五量体結合分子のＯＸ４０抗原結合ドメインは、アミノ酸配列の配列番号５１を含むＶＨ、及びアミノ酸配列の配列番号５２を含むＶＬを含む（「抗ＯＸ４０＃２」）。
「成熟ＶＨアミノ酸配列」または「成熟ＶＬアミノ酸配列」とは、分泌シグナルペプチドが切断された後に残るＶＨまたはＶＬアミノ酸配列を意味する。
様々な異なる二量体、五量体、及び六量体結合分子が、本開示に基づいて当業者によって企図され得、したがって本開示に含まれる一方で、ある種の態様では、各結合ユニットが、ＩｇＡもしくはＩｇＭ定常領域またはその断片のアミノ末端側に位置するＶＨをそれぞれ含む２本のＩｇＡまたはＩｇＭ重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端側に位置するＶＬをそれぞれ含む２本の免疫グロブリン軽鎖とを含む、上記のとおりの結合分子を提供する。
さらにある種の態様では、結合分子の少なくとも１個の結合ユニット、または結合分子の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、もしくは少なくとも６個の結合ユニットは、上記のとおりのＯＸ４０結合ドメインを２つ含む。ある種の態様では、結合分子の少なくとも１個の結合ユニット、または結合分子の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、もしくは少なくとも６個の結合ユニットにおける２つのＯＸ４０結合ドメインは、相互に異なってもよいし、またはそれらは同一であってもよい。
ある種の態様では、結合分子の少なくとも１個の結合ユニット、または結合分子の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、もしくは少なくとも６個の結合ユニット内の２本のＩｇＡまたはＩｇＭ重鎖は、同一である。ある種の態様では、結合分子の少なくとも１個の結合ユニット内の、または少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、もしくは少なくとも６個の結合ユニット内の２本の同一のＩｇＡまたはＩｇＭ重鎖は、表２に開示のとおりの重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
ある種の態様では、結合分子の少なくとも１個の結合ユニット、または結合分子の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、もしくは少なくとも６個の結合ユニット内の２本の軽鎖は、同一である。ある種の態様では、結合分子の少なくとも１個の結合ユニット内の、または少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、もしくは少なくとも６個の結合ユニット内の２本の同一の軽鎖は、カッパ軽鎖、例えば、ヒトカッパ軽鎖、またはラムダ軽鎖、例えばヒトラムダ軽鎖である。ある種の態様では、結合分子の少なくとも１個の結合ユニット内の、または少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、もしくは少なくとも６個の結合ユニット内の２本の同一の軽鎖はそれぞれ、表２に開示のとおりの軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む。
ある種の態様では、本開示が提供する二量体、五量体、または六量体結合分子の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６個の結合ユニットは、表２に開示のとおりの同一の重鎖可変ドメインアミノ酸配列をそれぞれ含む２つの同一のＩｇＡまたはＩｇＭ重鎖定常領域、ならびに表２に開示のとおりの同一の重鎖可変ドメインアミノ酸配列をそれぞれ含む２本の同一の軽鎖を含むか、またはそれぞれが含む。この態様によれば、結合分子の少なくとも１個の結合ユニット、または結合分子の少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、もしくは少なくとも６個の結合ユニット中のＯＸ４０結合ドメインは、同一であってよい。さらにこの態様によれば、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子は、上記のとおりのＯＸ４０結合ドメインを少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または少なくとも１２コピー含み得る。ある種の態様では、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、または少なくとも６個の結合ユニットは同一であってよく、ある種の態様では、結合ユニットは同一の結合ドメインを含んでよく、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、または少なくとも１２個のＯＸ４０結合ドメインは同一であってよい。
ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子は、同じ抗原結合ドメインを有する対応する二価結合分子と比較して、有利な構造的または機能的特性を有し得る。ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子は、同じ結合ドメインを含む等量の単一特異性二価ＩｇＧ抗体またはその断片よりも高い効力で、ＯＸ４０発現細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、Ｔｒｅｇまたは活性化エフェクターＣＴＬの活性化を開始させ得る。ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子は、細胞の表面上の複数の、例えば、３個以上のＯＸ４０受容体をより効率的に架橋させることができ、及び／または二次架橋部分、例えば、これに限定されないが、ＦｃγＲの非存在下で、細胞の表面上の複数の、例えば、３個以上のＯＸ４０受容体を効果的に架橋させることができ、それによって、抗腫瘍免疫を促進することができる。本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子の結合によって受容体が活性化されると、細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、Ｔｒｅｇまたは活性化エフェクターＣＴＬは、同じ抗原結合ドメインを含む等量の単一特異性二価ＩｇＧ抗体またはその断片（この場合、この抗体は、表２に示されている抗体と同じＶＨ及びＶＬ領域を含むか、またはこの抗体は、例えば、９Ｂ１２、ＫＨＫ４０８３、Ｍｅｄｉ０５６２、ＰＦ−０４５１８６００、及び／またはＧＳＫ３１７４９９８である）よりも、より効果的に活性化され得、次いで、改善された抗腫瘍免疫を誘導することができる。
ポリヌクレオチド、ベクター、及び宿主細胞
本開示はさらに、上記のとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、例えば、単離された、組換え、及び／または天然に存在しないポリヌクレオチドをさらに提供する。「ポリペプチドサブユニット」とは、独立して翻訳され得る、結合分子、結合ユニット、または抗原結合ドメインの部分を意味する。例には、限定ではないが、抗体可変ドメイン、例えば、ＶＨまたはＶＬ、Ｊ鎖、分泌成分、一本鎖Ｆｖ、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖定常領域、抗体軽鎖定常領域、及び／またはその任意の断片、バリアント、もしくは誘導体が含まれる。
本開示はさらに、上記のとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、例えば、単離された、組換え、及び／または天然に存在しないポリヌクレオチドをさらに提供する。「ポリペプチドサブユニット」とは、独立して翻訳され得る、結合分子、結合ユニット、または抗原結合ドメインの部分を意味する。例には、限定ではないが、抗体可変ドメイン、例えば、ＶＨまたはＶＬ、Ｊ鎖、分泌成分、一本鎖Ｆｖ、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖定常領域、抗体軽鎖定常領域、及び／またはその任意の断片、バリアント、もしくは誘導体が含まれる。
ある種の態様では、ポリペプチドサブユニットは、ＩｇＭもしくはＩｇＡ重鎖定常領域またはその断片、及びＯＸ４０抗原結合ドメインのＶＨ部分を含むことができる。ある種の態様では、ポリヌクレオチドは、ＶＨのＣ末端に融合されたヒトＩｇＭもしくはＩｇＡ定常領域またはその断片を含むポリペプチドサブユニットをコードすることができ、その際、ＶＨは、アミノ酸配列の配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、または配列番号５１を含むかまたはその中に含まれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３領域、またはＶＨの１つもしくは２つの単一アミノ酸置換を含有するＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３領域を含む。
ある種の態様では、ポリペプチドサブユニットは、上記のとおりのＯＸ４０抗原結合ドメインの抗体ＶＬ部分を含むことができる。ある種の態様では、ポリペプチドサブユニットは、ＶＬのＣ末端に融合されたヒト抗体軽鎖定常領域またはその断片を含むことができ、その際、ＶＬは、アミノ酸配列の配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、または配列番号５２を含むかまたはその中に含まれるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３領域、またはＶＬの１つまたは２つの単一アミノ酸置換を含有するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３領域を含む。
ある種の態様では、ポリヌクレオチドは、ＶＨのＣ末端に融合されたヒトＩｇＭもしくはＩｇＡ定常領域またはその断片を含むポリペプチドサブユニットをコードすることができ、その際、ＶＨは、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、または配列番号５１を含むかまたはその中に含まれる成熟ＶＨアミノ酸配列のいずれか１つまたは複数と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。
ある種の態様では、ポリヌクレオチドは、ＶＬのＣ末端に融合されたヒト軽鎖定常領域またはその断片を含むポリペプチドサブユニットをコードすることができ、その際、ＶＬは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、または配列番号５２を含むかまたはその中に含まれる成熟ＶＬアミノ酸配列のいずれか１つまたは複数と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一なアミノ酸配列を含む。
したがって、抗原結合ドメインを形成するために、ＯＸ４０に特異的に結合する抗体の可変領域を、ＩｇＭ及び／またはＩｇＡ構造のための発現ベクターテンプレートに挿入し、それによって、少なくとも２個の二価結合ユニットを有する多量体結合分子を作製することができる。簡略には、重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列をコードする核酸配列を既存の分子から合成または増幅させ、適性な方向で、かつ発現すると、ベクターが全長重鎖または軽鎖をもたらすであろうインフレームで、ベクターに挿入することができる。これらの目的のために有用なベクターは、当技術分野で公知である。そのようなベクターはまた、所望の鎖の発現を達成するために必要なエンハンサー及び他の配列を含むことができる。多数のベクターまたは単一のベクターを使用することができる。これらのベクターを宿主細胞に遺伝子導入し、次いで、鎖を発現させ、精製する。文献において報告されてきたとおり、発現すると、鎖は十分に機能性の多量体結合分子を形成する。次いで、完全に組み立てられた多量体結合分子を標準的な方法によって精製することができる。発現及び精製プロセスを、必要ならば、商業規模で行うことができる。
本開示はさらに、２つ以上のポリヌクレオチドを含む組成物であって、その２つ以上のポリヌクレオチドが上記のとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子をまとめてコードし得る組成物を提供する。ある種の態様では、組成物は、ＯＸ４０抗原結合ドメインの少なくともＶＨを含むＩｇＭ及び／もしくはＩｇＡ重鎖またはその断片、例えば、上記のとおりのヒトＩｇＭ重鎖をコードするポリヌクレオチド、及びＯＸ４０抗原結合ドメインの少なくともＶＬを含む軽鎖またはその断片、例えば、ヒトカッパまたはラムダ軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含み得る。提供するとおりのポリヌクレオチド組成物はさらに、Ｊ鎖、例えばヒトＪ鎖、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含み得る。ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの組成物を構成するポリヌクレオチドは、２つ、３つ以上の別々のベクター、例えば、発現ベクター上に位置し得る。そのようなベクターは本開示によって提供される。ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの組成物を構成するポリヌクレオチドの２つ以上は、単一のベクター、例えば、発現ベクター上に位置し得る。そのようなベクターは本開示によって提供される。
本開示はさらに、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、もしくは六量体のＯＸ４０アゴニスト結合分子またはその任意のサブユニットをコードする１つのポリヌクレオチドまたは２つ以上のポリヌクレオチド、本明細書で提供するとおりのポリヌクレオチド組成物、あるいは本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、もしくは六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子またはその任意のサブユニットをまとめてコードする１つのベクターまたは２つ、３つ以上のベクターを含む宿主細胞、例えば原核または真核宿主細胞を提供する。ある種の態様では、本開示によって提供される宿主細胞は、本開示が提供するとおりの二量体、五量体、もしくは六量体のＯＸ４０アゴニスト結合分子、またはそのサブユニットを発現し得る。
関連態様では、本開示は、本開示が提供するとおりの二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子を生成する方法であって、上記のとおりの宿主細胞を培養すること、及び結合分子を回収することを含む方法を提供する。
使用の方法
本開示は、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体ＩｇＡまたはＩｇＭベースのＯＸ４０アゴニスト結合分子を使用して、ＯＸ４０を発現する細胞においてシグナル伝達を活性化させるための改善された方法を提供する。下記の方法は、限定ではないが、表２に示されている抗体、またはそのバリアント、誘導体、もしくは類似体を含む任意の既存のＯＸ４０抗体に由来するＯＸ４０結合ドメインを含む結合分子を利用することができ、その際、二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子は、同等の二価抗体、断片、バリアント、誘導体、または類似体と比較して、ＯＸ４０発現細胞において、改善された活性を提供し得る。例えば、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子が３つ以上の受容体モノマーに結合することによって受容体が活性化すると、細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、Ｔｒｅｇまたは活性化エフェクターＣＴＬは、細胞においてシグナル伝達経路を開始させることができ、それによって、抗腫瘍免疫を誘導することができる。ある種の態様では、二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子の使用は、同等の単一結合ユニット分子よりも、効力のあるＴ細胞活性化をもたらすことができ、次いで、腫瘍微小環境において、例えば、サイトカイン放出、ＣＴＬ増殖、腫瘍細胞の死滅、及び／またはＴｒｅｇ細胞の抑制作用の中断によって、より効力のある抗腫瘍免疫を誘導することができる。本開示に基づいて、目的の任意のＯＸ４０結合ドメインを含む、二量体、五量体、または六量体ＩｇＡまたはＩｇＭベースのＯＸ４０アゴニスト結合分子の構築は、十分に当業者の能力の範囲内である。活性の改善により、例えば、使用される用量の低減を可能にすることができるか、以前は治療不可能なままであったがんを処置することができるか、またはより有効か、もしくは長期持続する抗腫瘍免疫をもたらすことができる。
本開示は、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体ＩｇＡまたはＩｇＭベースのＯＸ４０アゴニスト結合分子を使用して、ＯＸ４０を発現する細胞においてシグナル伝達を活性化させるための改善された方法を提供する。下記の方法は、限定ではないが、表２に示されている抗体、またはそのバリアント、誘導体、もしくは類似体を含む任意の既存のＯＸ４０抗体に由来するＯＸ４０結合ドメインを含む結合分子を利用することができ、その際、二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子は、同等の二価抗体、断片、バリアント、誘導体、または類似体と比較して、ＯＸ４０発現細胞において、改善された活性を提供し得る。例えば、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体結合分子が３つ以上の受容体モノマーに結合することによって受容体が活性化すると、細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、Ｔｒｅｇまたは活性化エフェクターＣＴＬは、細胞においてシグナル伝達経路を開始させることができ、それによって、抗腫瘍免疫を誘導することができる。ある種の態様では、二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子の使用は、同等の単一結合ユニット分子よりも、効力のあるＴ細胞活性化をもたらすことができ、次いで、腫瘍微小環境において、例えば、サイトカイン放出、ＣＴＬ増殖、腫瘍細胞の死滅、及び／またはＴｒｅｇ細胞の抑制作用の中断によって、より効力のある抗腫瘍免疫を誘導することができる。本開示に基づいて、目的の任意のＯＸ４０結合ドメインを含む、二量体、五量体、または六量体ＩｇＡまたはＩｇＭベースのＯＸ４０アゴニスト結合分子の構築は、十分に当業者の能力の範囲内である。活性の改善により、例えば、使用される用量の低減を可能にすることができるか、以前は治療不可能なままであったがんを処置することができるか、またはより有効か、もしくは長期持続する抗腫瘍免疫をもたらすことができる。
ある種の態様では、本開示は、ＯＸ４０を発現する細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、Ｔｒｅｇまたは活性化エフェクターＣＴＬを活性化させる方法であって、ＯＸ４０発現細胞を、本明細書に記載のとおりの二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子と接触させることを含み、その際、結合分子が、ＯＸ４０発現細胞の活性化、または活性化の増強を開始させ得る方法を提供する。細胞がＣＴＬである場合、「活性化」には、限定ではないが、ＯＸ４０の表面発現、増殖、炎症性サイトカインの産生、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の阻害作用に対する抵抗性の増加、及び／または腫瘍細胞の死滅の増強が含まれ得る。細胞がＴｒｅｇである場合、「活性化」には、限定ではないが、腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫を抑制する細胞の能力の妨害が含まれ得る。ある種の態様では、ＯＸ４０発現細胞と、本明細書に記載のとおりの二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子との接触は、ＯＸ４０発現の増加、及び細胞表面上でのＯＸ４０の多量体化、及び細胞表面の脂質ラフトへのＯＸ４０モノマーの移動（Ｃｒｏｆｔ，Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．２２９：１７３−１９１（２００９））を誘導し得る。ある種の態様では、本明細書に記載のとおりの二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子と、ＯＸ４０発現細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＯＸ４０を発現するＴｒｅｇまたは活性化エフェクターＣＴＬとの接触は、同じか、または同等のＯＸ４０結合ドメインを含む等量の単一特異性二価ＩｇＧ抗体またはその断片よりも高い効力で、細胞の活性化をもたらし得る。ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子と、ＯＸ４０発現細胞、例えば、Ｔ細胞、例えば、ＯＸ４０を発現するＴｒｅｇまたは活性化エフェクターＣＴＬとの接触は、例えば、ＦｃγＲによる二次架橋を必要とせずに、細胞の活性化をもたらし得、その際、同等のＯＸ４０結合ドメインを含む等量の単一特異性二価ＩｇＧ抗体またはその断片は、二次架橋を必要とするであろう。
また別の態様では、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子は、がん処置を必要とする対象に有効用量として投与された場合に、例えば、腫瘍成長を遅らせる、腫瘍成長を失速させる、または既存腫瘍のサイズを減少させることによって、がん処置を促進し得る。本開示は、処置を必要とする対象に、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子の有効用量を投与することを含む、がんを処置する方法を提供する。
「がん」、「腫瘍」、「がん性」、及び「悪性」という用語は、典型的に未制御の細胞成長によって特徴付けられる哺乳類における生理的状態を指すか、または説明する。がんの例には、これに限定されないが、腺癌を含む癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、及び白血病が含まれる。そのようながんのより詳細な例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、膠腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝細胞癌及び肝細胞種などの肝癌、膀胱癌、乳癌（ホルモン媒介性乳癌を含む、例えばＩｎｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９４：１０５７−１０６５を参照されたい）、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、骨髄腫（多発性骨髄腫など）、唾液腺癌、腎細胞癌及びウィルムス腫瘍などの腎臓癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、睾丸癌、食道癌、これに限定されないが扁平上皮細胞癌を含む様々な型の頭頸部癌、ならびに粘液性卵巣癌、胆管癌（肝臓）、及び乳頭状腎癌などの粘液起源の癌が含まれる。
本開示はさらに、それを必要とする対象においてがんを予防または処置する方法であって、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子またはその多量体抗原結合断片、その結合分子、または本明細書に記載のとおりのポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞を含む組成物または製剤の有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。
「治療上有効な用量または量」または「有効量」では、投与された場合に、がん患者の処置に関して、プラスの免疫治療反応をもたらす二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子の量が意図されている。
がんを処置するための組成物の有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるかまたは動物であるか、投与されている他の薬物、及び処置が予防的であるかまたは治療的であるかを含む、多くの異なる因子に応じて変動する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳類を含む非ヒト哺乳類を処置することもできる。安全性及び有効性を最適化するために、当業者に公知のルーチン的な方法を用いて、処置投薬量を用量設定することができる。
処置されるべき対象は、処置を必要とする任意の動物、例えば哺乳類であってよく、ある種の態様では、対象はヒト対象である。
その最も簡単な形態では、対象に投与されるべき調製物は、従来の剤形で投与される、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、もしくは六量体結合分子、またはその多量体抗原結合断片であり、これは本明細書の他の箇所で記載するとおりの医薬賦形剤、担体、または希釈剤と組み合わせることができる。
ある種の態様では、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、もしくは六量体結合分子を、これに限定されないが、化学療法、放射線療法、または他の免疫調節療法、例えば、がんワクチン、免疫チェックポイント遮断阻害薬、免疫刺激薬、またはＣＡＲ−Ｔ細胞などの養子細胞移植を包含する、他のがん療法と組み合わせて投与してもよい。
本開示の組成物は、任意の適切な方法によって、例えば、非経口で、脳室内で、経口で、吸入スプレーによって、局所で、直腸内で、経鼻で、頬側で、膣内で、または埋め込み式レザバーを介して投与することができる。「非経口」という用語は、本明細書で使用する場合、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝臓内、病変内、及び頭蓋内への注射または注入技法を含む。ある種の態様では、本明細書で提供するとおりのＯＸ４０アゴニスト結合分子またはその多量体抗原結合断片を局所で、腫瘍内に、または腫瘍細胞の近傍に、例えば、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内に導入することができる。
上述のとおり、限定ではないが、乳房、肺、膵臓、卵巣、腎臓、結腸、及び膀胱の癌、さらには黒色腫、肉腫、及びリンパ腫を含む、すべての型の腫瘍が、潜在的にこのアプローチによる処置に適している。粘膜分布は、ある種のがん、例えば、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、または扁平上皮癌に対して有益であり得る。本明細書で提供するとおりのＯＸ４０アゴニスト結合分子またはその多量体抗原結合断片は、有効となるためにがん細胞または腫瘍自体と接触する必要はなく、本明細書で提供する処置方法が、ＯＸ４０を発現するがん細胞で有効であり得るとおり、ＯＸ４０を発現しないがん細胞にも有効であり得ることに留意することが重要である。
本明細書で提供する方法において使用するための二量体、五量体、または六量体結合分子は、ＯＸ４０、例えば、ヒト及び／またはマウスＯＸ４０に特異的に結合し得る、本明細書で定義するとおりの２、５、または６個の「結合ユニット」を有する結合分子である。ある種の態様では、本明細書で提供する方法において使用するための二量体、五量体、または六量体結合分子は、それぞれ２、５、または６個の二価結合ユニットを含み、その際、各結合ユニットは２つのＩｇＡもしくはＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片を含む。ある種の態様では、２つのＩｇＡまたはＩｇＭ重鎖定常領域は、ヒト重鎖定常領域である。
本明細書で提供する方法において使用するための結合分子が二量体のＩｇＡベースの結合分子である場合、結合分子は、Ｊ鎖またはその断片もしくはそのバリアントをさらに含み得、かつ分泌成分またはその断片もしくはそのバリアントをさらに含み得る。
本明細書で提供する方法において使用するための結合分子が五量体のＩｇＭベースの結合分子である場合、結合分子は、Ｊ鎖またはその断片もしくはそのバリアントをさらに含み得る。
本明細書で提供する方法において使用するための結合分子のＩｇＡ重鎖定常領域は、その定常領域が、結合分子において所望の機能を果たし得る、例えば、軽鎖定常領域と結合して結合ドメインの形成を促進し得る、または別の結合ユニットと結合して二量体を形成し得る限り、Ｃα１ドメイン、Ｃα２ドメイン、及び／またはＣα３ドメインのうちの１つまたは複数を含み得る。ある種の態様では、個々の結合ユニット内の２つのＩｇＡ重鎖定常領域またはその断片はそれぞれ、Ｃα３ドメインもしくはその断片、尾片（ＴＰ）もしくはその断片、またはＣα３ドメイン及びＴＰもしくはそれらの断片の任意の組み合わせを含む。ある種の態様では、個々の結合ユニット内の２つのＩｇＡ重鎖定常領域またはその断片はそれぞれ、Ｃα２ドメインもしくはその断片、Ｃα１ドメインもしくはその断片、またはＣα１ドメインもしくはその断片及びＣα２ドメインもしくはその断片をさらに含む。
本明細書で提供する方法において使用するための結合分子のＩｇＭ重鎖定常領域は、その定常領域が、結合分子において所望の機能を果たし得る、例えば、軽鎖定常領域と結合して結合ドメインの形成を促進し得る、または他の結合ユニットと結合して六量体もしくは五量体を形成し得る限り、Ｃμ１ドメイン、Ｃμ２ドメイン、Ｃμ３ドメイン、及び／またはＣμ４ドメインのうちの１つまたは複数を含み得る。ある種の態様では、個々の結合ユニット内の２つのＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片はそれぞれ、Ｃμ３ドメインもしくはその断片、Ｃμ４ドメインもしくはその断片、尾片（ＴＰ）もしくはその断片、またはＣμ３ドメイン、Ｃμ４ドメイン、及びＴＰ、もしくはそれらの断片の任意の組み合わせを含む。ある種の態様では、個々の結合ユニット内の２本のＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片はそれぞれ、Ｃμ２ドメインもしくはその断片、Ｃμ１ドメインもしくはその断片、またはＣμ１ドメインもしくはその断片及びＣμ２ドメインもしくはその断片をさらに含む。
本明細書で提供する方法において使用するための様々な異なる二量体、五量体、及び六量体結合分子が、本開示に基づいて当業者によって企図され得、したがって本開示に含まれる一方で、ある種の態様では、各結合ユニットが、ＩｇＡもしくはＩｇＭ定常領域またはその断片のアミノ末端側に位置するＶＨをそれぞれ含む２本のＩｇＡまたはＩｇＭ重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端側に位置するＶＬをそれぞれ含む２本の免疫グロブリン軽鎖とを含む、本明細書で提供する方法において使用するための結合分子を提供する。
さらにある種の態様では、本明細書で提供する方法において使用するための結合分子の少なくとも２個の結合ユニット、または本明細書で提供する方法において使用するための結合分子の少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、もしくは少なくとも６個の結合ユニットは、上記のとおりのＯＸ４０結合ドメインを２つ含む。ある種の態様では、本明細書で提供する方法において使用するために、本明細書で提供する方法において使用するための結合分子の少なくとも２個の結合ユニット、または少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、もしくは少なくとも６個の結合ユニットにおける２つのＯＸ４０結合ドメインは、相互に異なってよく、またはそれらは同一であってもよい。
ある種の態様では、本明細書で提供する方法において使用するための結合分子の少なくとも２個の結合ユニット、または結合分子の少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、もしくは少なくとも６個の結合ユニット内の２本のＩｇＡまたはＩｇＭ重鎖は、同一である。
ある種の態様では、本明細書で提供する方法において使用するための結合分子の少なくとも２個の結合ユニット、または結合分子の少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、もしくは少なくとも６個の結合ユニット内の２本の軽鎖は、同一である。ある種の態様では、本明細書で提供する方法において使用するための結合分子の少なくとも２個の結合ユニット内の、または少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、もしくは少なくとも６個の結合ユニット内の２本の同一の軽鎖は、カッパ軽鎖、例えばヒトカッパ軽鎖、またはラムダ軽鎖、例えばヒトラムダ軽鎖である。
本明細書で提供する方法において使用するための二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子は、他の結合分子と比較して、有利な構造的または機能的特性を有し得る。例えば、本明細書で提供する方法において使用するための二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子は、本明細書の他の箇所で記載するとおりの対応するＩｇＧ結合分子よりも、インビトロまたはインビボのいずれかでのバイオアッセイにおいて、改善された活性を有し得る。
医薬組成物及び投与方法
本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子を調製する方法、及びそれを必要とする対象に投与する方法は、当業者に周知であるか、または本開示を考慮して当業者によって容易に決定される。ＴＮＦ受容体結合分子の投与経路は、例えば、腫瘍内で、経口で、非経口で、吸入による、または局所であってよい。非経口という用語は、本明細書で使用する場合、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸内、または膣内投与を含む。これらの投与形態が適切な形態として企図される一方で、投与形態の別の例は、注射用の、特に、腫瘍内、静脈内または動脈内の注射または点滴用の液剤である。適切な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸、またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意選択で安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含み得る。
本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子を調製する方法、及びそれを必要とする対象に投与する方法は、当業者に周知であるか、または本開示を考慮して当業者によって容易に決定される。ＴＮＦ受容体結合分子の投与経路は、例えば、腫瘍内で、経口で、非経口で、吸入による、または局所であってよい。非経口という用語は、本明細書で使用する場合、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸内、または膣内投与を含む。これらの投与形態が適切な形態として企図される一方で、投与形態の別の例は、注射用の、特に、腫瘍内、静脈内または動脈内の注射または点滴用の液剤である。適切な医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸、またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意選択で安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含み得る。
本明細書において論述するとおり、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子は、がんのインビボ免疫治療処置のために薬学的有効量で投与することができる。これに関して、開示の結合分子は、投与を容易にするように、及び活性薬剤の安定性を促進するように製剤化できることは分かるであろう。したがって、医薬組成物は、生理食塩水、非毒性緩衝液、防腐剤などの、薬学的に許容される非毒性の滅菌担体を含み得る。本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体ＴＮＦ受容体結合分子の薬学的有効量は、標的への効率的な結合を達成するために、及び治療効果を達成するために十分な量を意味する。適切な製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）１６ｔｈ ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
本明細書で提供するある種の医薬組成物は、例えば、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、または液剤を含む、許容される剤形で経口投与することができる。ある種の医薬組成物はまた、経鼻エアロゾルまたは吸入によって投与することもできる。そのような組成物は、ベンジルアルコールもしくは他の適切な防腐剤、生物学的利用能を高めるための吸収促進剤、及び／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製することができる。
単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる、二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子の量は、例えば処置される対象及び特定の投与様式に応じて変動する。組成物は、単回用量として、複数回用量として、または確立された期間にわたり注入で投与することができる。投薬計画をまた、最適な所望の応答（例えば、治療応答または予防応答）を提供するように調整することもできる。
本開示の範囲と一致して、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子を、治療効果をもたらすのに十分な量で、治療を必要とする対象に投与することができる。本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子を、公知の技法に従って、本開示の抗体、またはその多量体抗原結合断片、バリアント、もしくは誘導体を従来の薬学的に許容される担体または希釈剤と組み合わせることによって調製された従来の剤形において、対象に投与することができる。薬学的に許容される担体または希釈剤の形態及び特徴は、それと組み合わされるべき活性成分の量、投与経路、及び他の周知の変数によって規定され得る。
本開示はまた、がんを処置する、予防する、または管理するための医薬の製造における、本明細書で提供するとおりの二量体、五量体、または六量体ＯＸ４０アゴニスト結合分子の使用を提供する。
本開示は、別段に示さない限り、当技術分野の技能の範囲内にある、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来技法を用いる。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９９２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ）；Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，（１９８５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ；Ｇａｉｔ，ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９８７）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）（１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５；Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．）を参照されたい。
抗体工学の一般的原理は、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）に明記されている。タンパク質工学の一般的原理は、Ｒｉｃｋｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．）に明記されている。抗体及び抗体−ハプテン結合の一般的原理は、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ（１９８４）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．；Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．）；及びＳｔｅｗａｒｄ（１９８４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）に明記されている。加えて、当技術分野において公知であり、かつ具体的に記載されていない免疫学における標準的方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９４）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ ｅｄ；Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．）、及びＭｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ）（１９８０）Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ＮＹ）においてのとおり従い得る。
免疫学の一般的原理を明記している標準的な参考図書には、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ（１９８２）Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ）；Ｋｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９８０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ（１９８４）”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ” ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｂｕｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｇｏｌｄｓｂｙ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（２０００）Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（４ｔｈ ｅｄ．；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ＮＹ）；Ｒｏｉｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（６ｔｈ ｅｄ．；Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ）；Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（５ｔｈ ｅｄ．；Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ（２００１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）；Ｌｅｗｉｎ（２００３）Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩＩ（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ，２００３）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ（２００３）ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）が含まれる。
上記で引用した参考文献のすべて、さらには本明細書において引用したすべての参考文献は、その全体で参照によって本明細書に組み込まれる。
以下の実施例は、実例として提供するものであり、限定として提供するものではない。
実施例１：抗体生成及び精製
抗ＯＸ４０ＩｇＭ及び抗ＯＸ４０ＩｇＧ＃１及び＃２
標準的なクローニングプロトコルに従って、例示的な構築物として、表２からの２つの抗ＯＸ４０抗体のＶＨ及びＶＬ領域をＩｇＭ（野生型Ｊ鎖を含む）及びＩｇＧ型に組み込んだ。抗ＯＸ４０＃１は、それぞれＶＨ及びＶＬアミノ酸配列の配列番号４９及び配列番号５０を含み、抗ＯＸ４０＃２は、それぞれＶＨ及びＶＬアミノ酸配列の配列番号５１及び配列番号５２を含む。これらの抗体構築物を発現させ、下記のとおりに精製した。ＩｇＭ（Ｊ鎖を含む）分子を、次のとおり、還元型及び非還元型ゲル上で分割した。精製抗ＯＸ４０ＩｇＭ抗体を還元及び非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。図１Ａは、ＩｇＭ重鎖及び軽鎖を示すための還元型ゲルを示しており、図１Ｃは、高分子量ＩｇＭを分割するための非還元型ゲルを示している。非還元型ゲルサンプルをＮｕＰａｇｅ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＮＰ０００７）と混合し、ＮａｔｉｖｅＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ ３〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＢＮ１００３）に装填した。Ｎｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＬＡ００４１）をゲル電気泳動のために使用し、ゲルをＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＬＣ６０２５）で染色した。還元型ゲルでは、サンプルをサンプル緩衝液及びＮｕＰａｇｅ還元剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＮＰ０００４）と混合し、１０分間にわたって８０℃に加熱し、ＮｕＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＮＰ０３２２）に装填した。ＮｕＰａｇｅ ＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＮＰ０００２）をゲル電気泳動のために使用し、ゲルをＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅで染色した。結果は、抗ＯＸ４０ＩｇＭ五量体が均一に集合して、ＩｇＭ重鎖及び軽鎖を示すことを実証している。
抗ＯＸ４０ＩｇＭ及び抗ＯＸ４０ＩｇＧ＃１及び＃２
標準的なクローニングプロトコルに従って、例示的な構築物として、表２からの２つの抗ＯＸ４０抗体のＶＨ及びＶＬ領域をＩｇＭ（野生型Ｊ鎖を含む）及びＩｇＧ型に組み込んだ。抗ＯＸ４０＃１は、それぞれＶＨ及びＶＬアミノ酸配列の配列番号４９及び配列番号５０を含み、抗ＯＸ４０＃２は、それぞれＶＨ及びＶＬアミノ酸配列の配列番号５１及び配列番号５２を含む。これらの抗体構築物を発現させ、下記のとおりに精製した。ＩｇＭ（Ｊ鎖を含む）分子を、次のとおり、還元型及び非還元型ゲル上で分割した。精製抗ＯＸ４０ＩｇＭ抗体を還元及び非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。図１Ａは、ＩｇＭ重鎖及び軽鎖を示すための還元型ゲルを示しており、図１Ｃは、高分子量ＩｇＭを分割するための非還元型ゲルを示している。非還元型ゲルサンプルをＮｕＰａｇｅ ＬＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＮＰ０００７）と混合し、ＮａｔｉｖｅＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ ３〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＢＮ１００３）に装填した。Ｎｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＬＡ００４１）をゲル電気泳動のために使用し、ゲルをＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＬＣ６０２５）で染色した。還元型ゲルでは、サンプルをサンプル緩衝液及びＮｕＰａｇｅ還元剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＮＰ０００４）と混合し、１０分間にわたって８０℃に加熱し、ＮｕＰａｇｅ Ｎｏｖｅｘ ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＮＰ０３２２）に装填した。ＮｕＰａｇｅ ＭＥＳ ＳＤＳ Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＃ＮＰ０００２）をゲル電気泳動のために使用し、ゲルをＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅで染色した。結果は、抗ＯＸ４０ＩｇＭ五量体が均一に集合して、ＩｇＭ重鎖及び軽鎖を示すことを実証している。
ＩｇＭ五量体におけるＪ鎖の存在を確認するために、抗Ｊ鎖ウエスタンブロットを行った（図１Ｂ）。ウエスタンブロット法では、タンパク質を、製造者指示に従ってｉＢｌｏｔ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して膜に移動させた。膜を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中２％ＢＳＡでブロックし、次いで、ｉＢｉｎｄ ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、抗Ｊ鎖抗体（Ｔｈｅｒｍｏ＃ＭＡ５−１６４１９）と共に、続いて、ＨＲＰコンジュゲートした二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１１１−０３５−１４４）と共にインキュベートした。結果は、Ｊ鎖が精製抗ＯＸ４０ＩｇＭ抗体に存在したことを実証している。
追加の抗ＯＸ４０ＩｇＭ及びＩｇＧ構築物
ＯＸ８６は、それぞれＶＨ及びＶＬアミノ酸配列の配列番号９及び配列番号１０を含むＩｇＧ１アイソタイプのラット抗マウスＯＸ４０モノクローナル抗体（例えば、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能）である。標準的なクローニングプロトコルに従って、ＶＨ及びＶＬを、ラット、マウス、またはヒトＩｇＭ及びＩｇＧ型に組み込む。標準的なクローニングプロトコルに従って、選択されたＶＨ及びＶＬ配列、例えば、表２に列挙されているものをヒトＩｇＭ及びＩｇＧ型に組み込むことによって、抗ヒトＯＸ４０ＩｇＭを生成する。加えて、ヒトＯＸ４０に対する新たな抗体を生成し、例えば、ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ相互作用を妨害する、及び／またはＴ細胞シグナル伝達の成熟、Ｔ細胞増殖、及び／またはサイトカイン分泌を可能にするそれらの能力に基づき選択する。選択された抗体結合ドメインを、従来どおりＩｇＭ結合分子として再フォーマットする。
ＯＸ８６は、それぞれＶＨ及びＶＬアミノ酸配列の配列番号９及び配列番号１０を含むＩｇＧ１アイソタイプのラット抗マウスＯＸ４０モノクローナル抗体（例えば、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能）である。標準的なクローニングプロトコルに従って、ＶＨ及びＶＬを、ラット、マウス、またはヒトＩｇＭ及びＩｇＧ型に組み込む。標準的なクローニングプロトコルに従って、選択されたＶＨ及びＶＬ配列、例えば、表２に列挙されているものをヒトＩｇＭ及びＩｇＧ型に組み込むことによって、抗ヒトＯＸ４０ＩｇＭを生成する。加えて、ヒトＯＸ４０に対する新たな抗体を生成し、例えば、ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ相互作用を妨害する、及び／またはＴ細胞シグナル伝達の成熟、Ｔ細胞増殖、及び／またはサイトカイン分泌を可能にするそれらの能力に基づき選択する。選択された抗体結合ドメインを、従来どおりＩｇＭ結合分子として再フォーマットする。
タンパク質の発現、精製及び特徴づけ
遺伝子導入。重鎖、軽鎖、及び修飾または未修飾Ｊ鎖ＤＮＡ（ＩｇＭ五量体構築物で）を、例えば、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入する。発現ベクターのためのＤＮＡをポリエチルアミン（ＰＥＩ）試薬と混合し、次いで、細胞に添加する。確立された技法に従って、ＣＨＯ−Ｓ細胞でのＰＥＩ遺伝子導入を行う（「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．８７，５５３−５４５」を参照されたい）。
遺伝子導入。重鎖、軽鎖、及び修飾または未修飾Ｊ鎖ＤＮＡ（ＩｇＭ五量体構築物で）を、例えば、ＣＨＯ細胞またはＨＥＫ２９３細胞に遺伝子導入する。発現ベクターのためのＤＮＡをポリエチルアミン（ＰＥＩ）試薬と混合し、次いで、細胞に添加する。確立された技法に従って、ＣＨＯ−Ｓ細胞でのＰＥＩ遺伝子導入を行う（「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．８７，５５３−５４５」を参照されたい）。
例えば、製造者の推奨に従ってＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｔａｌｏｇ＃１７−５４３８−０１）を使用して、ＩｇＧ発現産物を精製する。
例えば、製造者の推奨に従って、Ｃａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ ＩｇＭ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｔｒｉｘ（ＢＡＣ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔａｌｏｇ＃２８９０．０５）を使用して、Ｊ鎖を含むか、または含まないＩｇＭ発現産物を精製する。
実施例２：抗体の特徴づけ
ＥＬＩＳＡによる抗体特異性の測定
ヒトＯＸ４０についての、抗ＯＸ４０＃１及び抗ＯＸ４０＃２のＩｇＧ及びＩｇＭバージョンの特異性を次のとおり、２つの異なる抗原密度で、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した。ＥＬＩＳＡプレートを１００ｍＭ炭酸水素ナトリウムｐＨ９．５中で希釈された０．４または１．６ｎｇ／ｍＬのＯＸ４０−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）で終夜コーティングした。すべての後続の洗浄液はＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎを使用し、すべてのインキュベーションステップをブロック緩衝液（ＰＢＳ中２％ＢＳＡ）中で行った。プレートを３回洗浄し、１時間にわたってブロックし、次いで、再度洗浄した。次いで、プレートを抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＧ、抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＭ、抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＧ、及び抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＭの４倍希釈曲線で、１時間にわたってインキュベートした。洗浄後に、プレートを１：６０００のマウス抗ヒトカッパ軽鎖−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に１時間にわたってインキュベートした。プレートを５回洗浄し、ＥＬＩＳＡを、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４停止溶液を用いるＴＭＢ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して展開した。プレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを使用してＯＤ４５０で読み取った。１つの代表的実験からの技術的反復の平均±ＳＥＭが示されている。３つの独立した実験を行った。次いで、各コーティング密度で、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおいて、Ｈｉｌｌ勾配で１サイト特異的結合を使用して、Ｂｍａｘを計算した。ＩｇＭ量が抗原感受性を上昇させることを実証するために、ＩｇＭに対するＩｇＧの比として、変化倍率を計算した。
ＥＬＩＳＡによる抗体特異性の測定
ヒトＯＸ４０についての、抗ＯＸ４０＃１及び抗ＯＸ４０＃２のＩｇＧ及びＩｇＭバージョンの特異性を次のとおり、２つの異なる抗原密度で、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した。ＥＬＩＳＡプレートを１００ｍＭ炭酸水素ナトリウムｐＨ９．５中で希釈された０．４または１．６ｎｇ／ｍＬのＯＸ４０−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ）で終夜コーティングした。すべての後続の洗浄液はＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎを使用し、すべてのインキュベーションステップをブロック緩衝液（ＰＢＳ中２％ＢＳＡ）中で行った。プレートを３回洗浄し、１時間にわたってブロックし、次いで、再度洗浄した。次いで、プレートを抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＧ、抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＭ、抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＧ、及び抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＭの４倍希釈曲線で、１時間にわたってインキュベートした。洗浄後に、プレートを１：６０００のマウス抗ヒトカッパ軽鎖−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に１時間にわたってインキュベートした。プレートを５回洗浄し、ＥＬＩＳＡを、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４停止溶液を用いるＴＭＢ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して展開した。プレートをＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏソフトウェアを使用してＯＤ４５０で読み取った。１つの代表的実験からの技術的反復の平均±ＳＥＭが示されている。３つの独立した実験を行った。次いで、各コーティング密度で、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおいて、Ｈｉｌｌ勾配で１サイト特異的結合を使用して、Ｂｍａｘを計算した。ＩｇＭ量が抗原感受性を上昇させることを実証するために、ＩｇＭに対するＩｇＧの比として、変化倍率を計算した。
結果を図２Ａ及び図２Ｂ（抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＧ及び抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＭ、それぞれ０．４ｎｇ／ｍＬ及び１．６ｎｇ／ｍＬ抗原密度）、及び図２Ｃ及び図２Ｄ（抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＧ及び抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＭ、それぞれ０．４ｎｇ／ｍＬ及び１．６ｎｇ／ｍＬ抗原密度）に示す。抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＭでは、抗体は、０．４ｎｇ／ｍＬ抗原密度では抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＧよりも約２８倍良好に、かつ１．６ｎｇ／ｍＬ抗原密度では１．２倍良好に結合した。抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＭは、低いほうの密度では抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＧよりも４倍良好に、かつ高いほうの密度では約３倍良好に結合した。すべての構築物が、ヒトＯＸ４０に特異的に結合した。結果は、特に低い抗原密度で、ＩｇＭ構築物が、ＩｇＧよりもかなり強い結合活性でＯＸ４０に結合することを示している。
ＯＸ８６のキメラＩｇＧ及びＩｇＭバージョンの特異性を、例えば、次のとおりに、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定する。ヒトまたはマウスＯＸ４０の細胞外ドメインは、ｈｉｓタグタンパク質として利用可能である（例えば、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍａｒｔ製、Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）。抗体の多量体型が、低い抗原密度への結合について利点を有するかどうかを決定するために、抗原をプレート上に一連の漸減濃度でコーティングする。この方法では、９６ウェル白色ポリスチレンＥＬＩＳＡプレート（Ｐｉｅｒｃｅ １５０４２）を１ウェル当たり、１０μｇ／ｍＬまたは０．３μｇ／ｍＬのｈｉｓタグマウスＯＸ４０細胞外ドメイン１００μＬで終夜、４℃でコーティングする。次いで、プレートを０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、２％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロックする。ブロッキングの後に、ＯＸ８６−ＩｇＭ、ＯＸ８６−ＩｇＧ（または上記のとおりの他の抗ヒト抗体）、標準、及び対照の系列希釈液１００μＬをウェルに添加し、室温で２時間にわたってインキュベートする。次いで、プレートを洗浄し、ＨＲＰコンジュゲートしたマウス抗ヒトカッパ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、９２３０−０５。２％ＢＳＡ−ＰＢＳ中で１：６０００希釈）と共に３０分間にわたってインキュベートする。０．０５％ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを使用する１０回の最終洗浄の後に、プレートを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、３７０７０）を使用して読み取る。発光データをＥｎＶｉｓｉｏｎ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）に収集し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで４−パラメーターロジスティックモデルを使用して解析する。
ＥＬＩＳＡプレートに添付されているｈｉｓタグヒトＯＸ４０細胞外ドメインを使用することにより、他の抗ヒトＯＸ４０抗体を使用して同様の実験を実施する。
抗原親和性及び選択性の測定
ヒトまたはマウスＯＸ４０−Ｉｇ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）、及び対照タンパク質をＭａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、ＶＷＲ）上に、炭酸水素緩衝液中で０．２〜２．０μｇ／ｍｌの濃度でプレーティングし、終夜、４℃でインキュベートする。使用前に、プレートを解凍し、一度洗浄し、次いで、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）中０．５％ＢＳＡでブロックする。様々な濃度の、実施例１に記載のとおりに生成した抗ＯＸ４０ＭＡｂまたは対照抗ＫＬＨ抗体を添加し、サンプルを１時間にわたって室温でインキュベートし、３回洗浄し、ブロッキング緩衝液中のビオチン化抗ヒトカッパ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）の１：７，０００希釈液と共に１時間にわたってインキュベートする。次いで、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）をＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）と共に添加し、光学密度をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒで６５０ｎｍで読み取る。ＯＸ４０に対する正味シグナルと他の標的に対する正味シグナルとの比として、選択性を計算する。
ヒトまたはマウスＯＸ４０−Ｉｇ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）、及び対照タンパク質をＭａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ、ＶＷＲ）上に、炭酸水素緩衝液中で０．２〜２．０μｇ／ｍｌの濃度でプレーティングし、終夜、４℃でインキュベートする。使用前に、プレートを解凍し、一度洗浄し、次いで、洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）中０．５％ＢＳＡでブロックする。様々な濃度の、実施例１に記載のとおりに生成した抗ＯＸ４０ＭＡｂまたは対照抗ＫＬＨ抗体を添加し、サンプルを１時間にわたって室温でインキュベートし、３回洗浄し、ブロッキング緩衝液中のビオチン化抗ヒトカッパ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）の１：７，０００希釈液と共に１時間にわたってインキュベートする。次いで、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）をＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）と共に添加し、光学密度をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒで６５０ｎｍで読み取る。ＯＸ４０に対する正味シグナルと他の標的に対する正味シグナルとの比として、選択性を計算する。
Ｆｏｒｔｅ Ｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ機器を使用し、Ｂｉｏｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）を使用し、固定化マウスまたはヒトＯＸ４０−Ｉｇを使用して、さらなる親和性測定を実施する。市販の抗ヒトＯＸ４０抗体、例えば、Ｂｅｒ−ＡＣＴ３５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）または４４３３１８（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、さらには、ＯＸ４０リガンド（ＴＮＦＳＦ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから入手可能）に対して、エピトープマッピングを評価する。
ＯＸ４０発現の試験
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、実施例１に記載のとおりに生成した抗ＯＸ４０Ｍａｂで３０分間にわたって４℃で染色する。細胞を洗浄し、抗カッパ−Ａ６４７検出抗体で１５分間にわたって４℃で染色し、再び洗浄する。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋エフェクターＴ細胞及びＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞への結合をフローサイトメトリーによって評価する。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、実施例１に記載のとおりに生成した抗ＯＸ４０Ｍａｂで３０分間にわたって４℃で染色する。細胞を洗浄し、抗カッパ−Ａ６４７検出抗体で１５分間にわたって４℃で染色し、再び洗浄する。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋エフェクターＴ細胞及びＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋調節性Ｔ細胞への結合をフローサイトメトリーによって評価する。
Ｔ細胞結合アッセイ
活性化Ｔ細胞上のＯＸ４０に結合する抗ＯＸ４０＃１及び抗ＯＸ４０＃２のＩｇＧ及びＩｇＭバージョンの能力を評価するために、結合アッセイを行った。ＣＤ８＋Ｔ細胞で低レベルのＯＸ４０（図３Ａ、３Ｃ）またはＣＤ４＋Ｔ細胞で高レベルのＯＸ４０（図３Ｂ、３Ｄ）を誘導するためにＨｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）で３日間にわたって活性化させたＰＢＭＣで、Ａｂ結合を試験した。０．５×１０５細胞／条件を抗ＯＸ４０＃１及び抗ＯＸ４０＃２のＩｇＧ及びＩｇＭバージョンの３倍希釈、続いて、２０μｇ／ｍＬ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗ヒトＩｇ軽鎖κ抗体ＭＨＫ−４９で染色した。ＰＢＭＣでは、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ４−ＣＤ３＋ＣＤ８Ｔ細胞でゲートするために、抗ＣＤ３−Ａ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−ＣＹ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）も含まれた。ＦＡＣＳデータをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で解析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでプロットした。代表的な実験の１つをＣＤ８Ｔ細胞（ｎ＝３ドナー）及びＣＤ４Ｔ細胞（ｎ＝５ドナー）について示した。各抗体で、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおいて、Ｈｉｌｌ勾配で１サイト特異的結合を使用して、Ｋｄを計算した。ＩｇＭ量が抗原感受性を上昇させることを実証するために、ＩｇＭに対するＩｇＧの比として、変化倍率を計算した。
活性化Ｔ細胞上のＯＸ４０に結合する抗ＯＸ４０＃１及び抗ＯＸ４０＃２のＩｇＧ及びＩｇＭバージョンの能力を評価するために、結合アッセイを行った。ＣＤ８＋Ｔ細胞で低レベルのＯＸ４０（図３Ａ、３Ｃ）またはＣＤ４＋Ｔ細胞で高レベルのＯＸ４０（図３Ｂ、３Ｄ）を誘導するためにＨｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）で３日間にわたって活性化させたＰＢＭＣで、Ａｂ結合を試験した。０．５×１０５細胞／条件を抗ＯＸ４０＃１及び抗ＯＸ４０＃２のＩｇＧ及びＩｇＭバージョンの３倍希釈、続いて、２０μｇ／ｍＬ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗ヒトＩｇ軽鎖κ抗体ＭＨＫ−４９で染色した。ＰＢＭＣでは、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４Ｔ細胞及びＣＤ４−ＣＤ３＋ＣＤ８Ｔ細胞でゲートするために、抗ＣＤ３−Ａ６４７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−ＣＹ５．５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）も含まれた。ＦＡＣＳデータをＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で解析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでプロットした。代表的な実験の１つをＣＤ８Ｔ細胞（ｎ＝３ドナー）及びＣＤ４Ｔ細胞（ｎ＝５ドナー）について示した。各抗体で、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアにおいて、Ｈｉｌｌ勾配で１サイト特異的結合を使用して、Ｋｄを計算した。ＩｇＭ量が抗原感受性を上昇させることを実証するために、ＩｇＭに対するＩｇＧの比として、変化倍率を計算した。
図３Ａ〜Ｄに示す結果は、抗ＯＸ４０ＩｇＭ抗体が抗ＯＸ４０ＩｇＧ抗体と比較してＴ細胞への結合の増強を示すことを実証している。図３Ａ及び３Ｃは、それぞれ、低ＯＸ４０発現ＣＤ８＋Ｔ細胞を抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＭ及び抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＧで、または抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＭ及び抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＧで染色した場合のＦＡＣＳ結果を示している。図３Ｂ及び３Ｄは、高ＯＸ４０発現ＣＤ４＋Ｔ細胞をそれぞれ抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＭ及び抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＧ、または抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＭ、または抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＧで染色した場合のＦＡＣＳ結果を示している。抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＭでは、抗体は、低ＯＸ４０発現ＣＤ８＋Ｔ細胞では抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＧよりも約２５倍良好に、及び高ＯＸ４０発現ＣＤ４＋Ｔ細胞では抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＧよりも６倍良好に結合した。抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＭは、ＣＤ８＋Ｔ細胞では抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＧよりも２４倍良好に、及びＣＤ４＋Ｔ細胞では抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＧよりも約１１倍良好に結合した。これらの結果は、ＩｇＭがＴ細胞への結合の増加を示すことを実証している。
実施例１に記載のとおり生成した抗ＯＸ４０ＭＡｂも同様に細胞結合について、例えば、次のとおりに評価することができる。抗体を、刺激された（＋抗ＣＤ３）または休止（抗ＣＤ３なし）Ｔ細胞と共に３０分間にわたって４℃でインキュベートする。洗浄した後に、細胞を抗カッパＡ６４７検出抗体で１５分間にわたって４℃で染色する。細胞を再び洗浄し、次いで、フローサイトメトリーによってアッセイする。
Ｔ細胞シグナル伝達アッセイ
市販のＯＸ４０ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ ＮＦ−κＢリポーターアッセイ（ＤｉｓｏｖｅｒＸ）を使用して、抗体のアゴニスト活性を決定する。製造者プロトコルに従って、アッセイを行った。抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＧ及び抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＭまたは抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＧ及び抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＭの２倍希釈液を単独で、または他にも１０μｇ／ｍＬのプレート結合抗ヒトＩｇＧ Ｆｃクロスリンカー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０９３０２）と共に、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ Ｕ２０Ｓ ＯＸ４０ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ（ＤｉｓｏｖｅｒＸ）で１６時間にわたって、続いて、ＰＫ／ＰＬ基質と共に１時間にわたってインキュベートした。細胞を溶解し、ルミノメータで読み取った。抗体の最高濃度からのＲＬＵを使用して、ＩｇＧと比較して、ＩｇＭによるシグナル伝達の強度（変化倍率）の上昇を計算した。
市販のＯＸ４０ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ ＮＦ−κＢリポーターアッセイ（ＤｉｓｏｖｅｒＸ）を使用して、抗体のアゴニスト活性を決定する。製造者プロトコルに従って、アッセイを行った。抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＧ及び抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＭまたは抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＧ及び抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＭの２倍希釈液を単独で、または他にも１０μｇ／ｍＬのプレート結合抗ヒトＩｇＧ Ｆｃクロスリンカー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ＃４０９３０２）と共に、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ Ｕ２０Ｓ ＯＸ４０ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ａｓｓａｙ（ＤｉｓｏｖｅｒＸ）で１６時間にわたって、続いて、ＰＫ／ＰＬ基質と共に１時間にわたってインキュベートした。細胞を溶解し、ルミノメータで読み取った。抗体の最高濃度からのＲＬＵを使用して、ＩｇＧと比較して、ＩｇＭによるシグナル伝達の強度（変化倍率）の上昇を計算した。
図４に示されている結果は、抗ＯＸ４０ＩｇＭ抗体が、架橋及び非架橋抗ＯＸ４０ＩｇＧ抗体の両方と比較して、ＮＦ−κＢ経路の活性の上昇を示すことを実証している。抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＭでは、抗体は、非架橋抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＧと比較すると、ＮＦ−κＢ活性の２３倍の上昇、及び架橋抗ＯＸ４０＃１−ＩｇＧ抗体と比較すると、シグナル伝達活性の１３倍の上昇を示した（図４Ａ）。抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＭでは、抗体は、非架橋抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＧと比較すると、ＮＦ−ｋＢ活性化の４倍の増加、及び架橋抗ＯＸ４０＃２−ＩｇＧ抗体ではシグナル伝達活性化の２倍の増加を示した（図４Ｂ）。これらの結果は、スーパーアゴニストとして作用するＩｇＭ構築物の能力を実証している。
別法では、市販のＯＸ４０発現ＮＦ−ｋＢリポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、抗体のアゴニスト活性を実証する。実施例１に記載のとおりに生成された抗ＯＸ４０ＭＡｂをプレート上に、抗ＣＤ３Ｍａｂを伴って、または伴わずに１時間にわたってコーティングし、次いで、プレートをレポーター細胞と共に４時間にわたって３７℃でインキュベートする。次いで、細胞を溶解し、ルミノメータ―で読み取る。
Ｔ細胞増殖アッセイ
実施例１において記載したとおりに生成された抗ＯＸ４０Ｍａｂをプレート上に、抗ＣＤ３ Ｍａｂを伴って、または伴わずに１時間にわたってコーティングし、次いで、ナイーブＴ細胞をプレーティングする。１５時間後に、Ｔ細胞増殖を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定する。調節性Ｔ細胞の存在下でのエフェクターＴ細胞増殖を評価するために、エフェクターＴ細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）色素で標識し、調節性Ｔ細胞と１：１の比で混合し、次いで、抗ＣＤ３を伴うか、または伴わずに抗ＯＸ４０Ｍａｂで事前コーティングされたプレートに添加する。エフェクターＴ細胞増殖をフローサイトメトリーによってモニターする。
実施例１において記載したとおりに生成された抗ＯＸ４０Ｍａｂをプレート上に、抗ＣＤ３ Ｍａｂを伴って、または伴わずに１時間にわたってコーティングし、次いで、ナイーブＴ細胞をプレーティングする。１５時間後に、Ｔ細胞増殖を、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定する。調節性Ｔ細胞の存在下でのエフェクターＴ細胞増殖を評価するために、エフェクターＴ細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）色素で標識し、調節性Ｔ細胞と１：１の比で混合し、次いで、抗ＣＤ３を伴うか、または伴わずに抗ＯＸ４０Ｍａｂで事前コーティングされたプレートに添加する。エフェクターＴ細胞増殖をフローサイトメトリーによってモニターする。
Ｔ細胞活性化及びサイトカイン分泌
Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体の存在下または非存在下で、実施例１において記載したとおりに生成された抗ＯＸ４０Ｍａｂで刺激する。２４時間後に、ＩＦＮγ＋及びＴＮＦα＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって解析する。加えて、上清に分泌されたサイトカインＩＬ−２及びＩＦＮγを、標準的なＥＬＩＳＡキットを使用して測定する。
Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体の存在下または非存在下で、実施例１において記載したとおりに生成された抗ＯＸ４０Ｍａｂで刺激する。２４時間後に、ＩＦＮγ＋及びＴＮＦα＋Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって解析する。加えて、上清に分泌されたサイトカインＩＬ−２及びＩＦＮγを、標準的なＥＬＩＳＡキットを使用して測定する。
Ｔ細胞媒介性細胞傷害性
エフェクターＴ細胞を、腫瘍細胞特異的ペプチドで７日間にわたって刺激する。マウスＣＴ２６結腸腫瘍細胞またはＡ２０Ｂ細胞リンパ腫細胞をＣＦＳＥ色素で標識し、次いで、活性化Ｔ細胞及び実施例１において記載したとおりに生成された抗ＯＸ４０ＭＡｂと混合する。２４時間後に、腫瘍細胞細胞傷害性をフローサイトメトリーによって測定する。
エフェクターＴ細胞を、腫瘍細胞特異的ペプチドで７日間にわたって刺激する。マウスＣＴ２６結腸腫瘍細胞またはＡ２０Ｂ細胞リンパ腫細胞をＣＦＳＥ色素で標識し、次いで、活性化Ｔ細胞及び実施例１において記載したとおりに生成された抗ＯＸ４０ＭＡｂと混合する。２４時間後に、腫瘍細胞細胞傷害性をフローサイトメトリーによって測定する。
インビボ活性
ＯＸ８６ＩｇＭ及びＯＸ８６ＩｇＧ抗体では、同系マウスモデルを使用する。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＣＴ２６またはＡ２０腫瘍細胞を皮下移植し、次いで、マウスを腫瘍サイズに従って無作為化する。次いで、動物にＯＸ８６ＩｇＧ、ＯＸ８６ＩｇＭ、またはビヒクル対照を投与し、腫瘍体積を測定する。
ＯＸ８６ＩｇＭ及びＯＸ８６ＩｇＧ抗体では、同系マウスモデルを使用する。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＣＴ２６またはＡ２０腫瘍細胞を皮下移植し、次いで、マウスを腫瘍サイズに従って無作為化する。次いで、動物にＯＸ８６ＩｇＧ、ＯＸ８６ＩｇＭ、またはビヒクル対照を投与し、腫瘍体積を測定する。
実施例１において記載したとおりに生成された抗ヒトＯＸ４０Ｍａｂでは、ＯＸ４０ノックインＨｕＧＥＭＭマウスモデルを使用する（Ｃｒｏｗｎ Ｂｉｏ）。マウスモデルでは、マウスＯＸ４０をノックアウトし、ヒトＯＸ４０に置き換える。ＣＴ２６またはＡ２０腫瘍を皮下移植し、マウスに、抗ＯＸ４０ＩｇＧまたはＩｇＭまたはビヒクルを投与し、腫瘍体積を測定する。
Claims (46)
- ２個、５個、または６個の二価結合ユニットまたはそのバリアントもしくは断片を含む多量体結合分子であって、
各結合ユニットが、抗原結合ドメインとそれぞれ結合している２つのＩｇＡまたはＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片を含み、
前記結合分子の抗原結合ドメインのうちの少なくとも３個が、ＯＸ４０を発現する細胞上のＯＸ４０モノマーに特異的に、かつアゴニスティックに結合し、かつ
前記結合分子が、二次架橋部分の非存在下で、前記細胞においてＯＸ４０媒介性シグナル伝達を誘導することができる、
前記多量体結合分子。 - 二次架橋部分の非存在下で、前記細胞の表面上に発現される３個以上のＯＸ４０モノマーに結合し、かつそれらを会合させることができる、請求項１に記載の多量体結合分子。
- ＯＸ４０を発現する前記細胞がＴ細胞である、請求項１または請求項２に記載の多量体結合分子。
- 前記Ｔ細胞が細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である、請求項３に記載の多量体結合分子。
- 前記細胞におけるＯＸ４０媒介性シグナル伝達が、ＯＸ４０の表面発現を増加させることができる、ＣＴＬ増殖を増加させることができる、炎症性サイトカインの産生を増加させることができる、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の阻害作用に対する抵抗性を増加させることができる、腫瘍細胞の死滅を増加もしくは増強させることができる、またはそれらの組合せを可能にする、請求項３または請求項４に記載の多量体結合分子。
- 前記Ｔ細胞が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞である、請求項３に記載の多量体結合分子。
- 前記細胞におけるＯＸ４０媒介性シグナル伝達が、腫瘍微小環境において抗腫瘍免疫を抑制する前記細胞の能力を妨害することができる、請求項３または請求項６に記載の多量体結合分子。
- ２個の同等のＯＸ４０抗原結合ドメインを含む等量の二価ＩｇＧ抗体またはその断片よりも高い効力で、ＯＸ４０を発現する前記細胞においてＯＸ４０媒介性シグナル伝達を誘導することができる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の多量体結合分子。
- 前記細胞の表面上に発現されるＯＸ４０モノマーに特異的に、かつアゴニスティックに結合する少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または１２個の抗原結合ドメインを含み、それによって、前記細胞においてＯＸ４０媒介性シグナル伝達を活性化させる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の多量体結合分子。
- 前記少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または１２個の抗原結合ドメインが、同じ細胞外ＯＸ４０エピトープに結合する、請求項９に記載の多量体結合分子。
- 少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または１２個の抗原結合ドメインがそれぞれ、２つ以上の異なる細胞外ＯＸ４０エピトープの群のうちの１つに特異的に結合する、請求項９に記載の多量体結合分子。
- 前記２個、５個、または６個の結合ユニットが、ヒト、ヒト化、またはキメラ免疫グロブリン結合ユニットである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の多量体結合分子。
- 前記結合分子の少なくとも３個の抗原結合ドメインが、ＯＸ４０アゴニスト結合ドメインであり、かつ少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または１２個の抗原結合ドメインが重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記ＶＨ及びＶＬが、６つの免疫グロブリン相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３が、
それぞれ配列番号９及び配列番号１０；配列番号１１及び配列番号１２；配列番号１３及び配列番号１４；配列番号１５及び配列番号１６；配列番号１７及び配列番号１８；配列番号１９及び配列番号２０；配列番号２１及び配列番号２２；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２５及び配列番号２６；配列番号２５及び配列番号２８；配列番号２７及び配列番号２６；配列番号２７及び配列番号２８；配列番号２９及び配列番号２６；配列番号２９及び配列番号２８；配列番号３０及び配列番号３１；配列番号３０及び配列番号３３；配列番号３２及び配列番号３１；配列番号３２及び配列番号３３；配列番号３４及び配列番号３１；配列番号３４及び配列番号３３；配列番号３５及び配列番号３６；配列番号３７及び配列番号３８；配列番号３９及び配列番号４０；配列番号４１及び配列番号４２；配列番号４３及び配列番号４４；配列番号４５及び配列番号４６；配列番号４７及び配列番号４８；配列番号４９及び配列番号５０；もしくは配列番号５１及び配列番号５２を含むかもしくはそれらの中に含まれるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む抗体のＣＤＲ、または
ＣＤＲの１つもしくは複数における１つもしくは２つのアミノ酸置換を除いて、それぞれ配列番号９及び配列番号１０；配列番号１１及び配列番号１２；配列番号１３及び配列番号１４；配列番号１５及び配列番号１６；配列番号１７及び配列番号１８；配列番号１９及び配列番号２０；配列番号２１及び配列番号２２；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２５及び配列番号２６；配列番号２５及び配列番号２８；配列番号２７及び配列番号２６；配列番号２７及び配列番号２８；配列番号２９及び配列番号２６；配列番号２９及び配列番号２８；配列番号３０及び配列番号３１；配列番号３０及び配列番号３３；配列番号３２及び配列番号３１；配列番号３２及び配列番号３３；配列番号３４及び配列番号３１；配列番号３４及び配列番号３３；配列番号３５及び配列番号３６；配列番号３７及び配列番号３８；配列番号３９及び配列番号４０；配列番号４１及び配列番号４２；配列番号４３及び配列番号４４；配列番号４５及び配列番号４６；配列番号４７及び配列番号４８；配列番号４９及び配列番号５０；もしくは配列番号５１及び配列番号５２を含むかもしくはそれらの中に含まれるＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む抗体のＣＤＲ
を含む、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の多量体結合分子。 - 少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、または１２個の抗原結合ドメインが抗体ＶＨ及びＶＬを含み、前記ＶＨ及びＶＬが、それぞれ配列番号９及び配列番号１０；配列番号１１及び配列番号１２；配列番号１３及び配列番号１４；配列番号１５及び配列番号１６；配列番号１７及び配列番号１８；配列番号１９及び配列番号２０；配列番号２１及び配列番号２２；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２５及び配列番号２６；配列番号２５及び配列番号２８；配列番号２７及び配列番号２６；配列番号２７及び配列番号２８；配列番号２９及び配列番号２６；配列番号２９及び配列番号２８；配列番号３０及び配列番号３１；配列番号３０及び配列番号３３；配列番号３２及び配列番号３１；配列番号３２及び配列番号３３；配列番号３４及び配列番号３１；配列番号３４及び配列番号３３；配列番号３５及び配列番号３６；配列番号３７及び配列番号３８；配列番号３９及び配列番号４０；配列番号４１及び配列番号４２；配列番号４３及び配列番号４４；配列番号４５及び配列番号４６；配列番号４７及び配列番号４８；配列番号４９及び配列番号５０；または配列番号５１及び配列番号５２を含むかまたはそれらの中に含まれる成熟ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の多量体結合分子。
- ２個の二価ＩｇＡ結合ユニットまたはその断片とＪ鎖またはその断片もしくはバリアントとを含む二量体結合分子である多量体結合分子であって、ここで、各結合ユニットが、抗原結合ドメインとそれぞれ結合している２つのＩｇＡ重鎖定常領域またはその断片を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の多量体結合分子。
- 分泌成分またはその断片もしくはバリアントをさらに含む、請求項１５に記載の多量体結合分子。
- 前記ＩｇＡ重鎖定常領域またはその断片がそれぞれ、Ｃα２ドメインまたはＣα３−ｔｐドメインを含む、請求項１５または請求項１６に記載の多量体結合分子。
- １つまたは複数のＩｇＡ重鎖定常領域またはその断片が、Ｃα１ドメインをさらに含む、請求項１７に記載の多量体結合分子。
- 前記ＩｇＡ重鎖定常領域がヒトＩｇＡ定常領域である、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の多量体結合分子。
- 各結合ユニットが、前記ＩｇＡ定常領域またはその断片のアミノ末端側に位置するＶＨをそれぞれ含む２本のＩｇＡ重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端側に位置するＶＬをそれぞれ含む２本の免疫グロブリン軽鎖とを含む、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の多量体結合分子。
- ５または６個の二価ＩｇＭ結合ユニットをそれぞれ含む五量体または六量体結合分子である多量体結合分子であって、ここで、各結合ユニットが、抗原結合ドメインとそれぞれ結合している２つのＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の多量体結合分子。
- 前記ＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片がそれぞれ、Ｃμ３ドメインまたはその断片もしくはバリアント及びＣμ４−ｔｐドメインまたはその断片もしくはバリアントを含む、請求項２１に記載の多量体結合分子。
- １つまたは複数のＩｇＭ重鎖定常領域またはその断片が、Ｃμ２ドメイン、Ｃμ１ドメイン、またはそれらの任意の組合せをさらに含む、請求項２１または請求項２２に記載の多量体結合分子。
- 五量体であり、かつＪ鎖、またはその断片、またはそのバリアントをさらに含む、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の多量体結合分子。
- 前記ＩｇＭ重鎖定常領域がヒトＩｇＭ定常領域である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の多量体結合分子。
- 各結合ユニットが、前記ＩｇＭ定常領域またはその断片のアミノ末端側に位置するＶＨをそれぞれ含む２本のＩｇＭ重鎖と、免疫グロブリン軽鎖定常領域のアミノ末端側に位置するＶＬをそれぞれ含む２本の免疫グロブリン軽鎖とを含む、請求項２１〜２５のいずれか1項に記載の多量体結合分子。
- 各結合ユニットが２本の重鎖及び２本の軽鎖を含み、前記重鎖及び軽鎖が、それぞれ配列番号９及び配列番号１０；配列番号１１及び配列番号１２；配列番号１３及び配列番号１４；配列番号１５及び配列番号１６；配列番号１７及び配列番号１８；配列番号１９及び配列番号２０；配列番号２１及び配列番号２２；配列番号２３及び配列番号２４；配列番号２５及び配列番号２６；配列番号２５及び配列番号２８；配列番号２７及び配列番号２６；配列番号２７及び配列番号２８；配列番号２９及び配列番号２６；配列番号２９及び配列番号２８；配列番号３０及び配列番号３１；配列番号３０及び配列番号３３；配列番号３２及び配列番号３１；配列番号３２及び配列番号３３；配列番号３４及び配列番号３１；配列番号３４及び配列番号３３；配列番号３５及び配列番号３６；配列番号３７及び配列番号３８；配列番号３９及び配列番号４０；配列番号４１及び配列番号４２；配列番号４３及び配列番号４４；配列番号４５及び配列番号４６；配列番号４７及び配列番号４８；配列番号４９及び配列番号５０；または配列番号５１及び配列番号５２を含むかまたはそれらの中に含まれる成熟ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一なＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含む、請求項１〜２６のいずれか1項に記載の多量体結合分子。
- 五量体ＩｇＭ分子であり、Ｊ鎖またはその断片もしくはバリアントをさらに含む、請求項１〜１４または２１〜２７のいずれか1項に記載の多量体結合分子。
- 請求項１〜２８のいずれか１項に記載の多量体結合分子を含む、組成物。
- 請求項１〜２８のいずれか１項に記載の結合分子のポリペプチドサブユニットをコードする核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
- 前記ポリペプチドサブユニットが、ＩｇＭ重鎖定常領域と、前記多量体結合分子の前記抗原結合ドメインの少なくとも抗体ＶＨ部分とを含む、請求項３０に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリペプチドサブユニットが、
（ａ）配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、もしくは配列番号５１を含むかもしくはその中に含まれるＶＨアミノ酸配列に含まれるＣＤＲを含む、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３領域；または、ＨＣＤＲの１つもしくは複数において１つもしくは２つの単一アミノ酸置換を有する、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、もしくは配列番号５１を含むかもしくはその中に含まれるＶＨアミノ酸配列に含まれるＣＤＲを含む、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３領域；あるいは
（ｂ）配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、または配列番号５１を含むかまたはその中に含まれる成熟ＶＨアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一なアミノ酸配列
を含むＶＨ
のＣ末端に融合されたヒトＩｇＭ定常領域またはその断片
を含む、
請求項３１に記載のポリヌクレオチド。 - 前記ポリペプチドサブユニットが、軽鎖定常領域と、前記多量体結合分子の前記抗原結合ドメインの抗体ＶＬ部分とを含む、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリペプチドサブユニットが、
（ａ）配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、もしくは配列番号５２を含むかもしくはその中に含まれるＶＬアミノ酸配列に含まれるＣＤＲを含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３領域；または、ＬＣＤＲの１つもしくは複数において１つもしくは２つの単一アミノ酸置換を有する、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、もしくは配列番号５２を含むかもしくはその中に含まれるＶＬアミノ酸配列に含まれるＣＤＲを含む、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３領域；あるいは
（ｂ）配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、または配列番号５２を含むかまたはその中に含まれる成熟ＶＬアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％同一なアミノ酸配列
を含むＶＬ
のＣ末端に融合されたヒトカッパまたはラムダ軽鎖定常領域またはその断片
を含む、
請求項３３に記載のポリヌクレオチド。 - 請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、及び請求項３０、３３、または３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、組成物。
- 前記ポリヌクレオチドが別々のベクター上にある、請求項３５に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチドが単一のベクター上にある、請求項３５に記載の組成物。
- Ｊ鎖、またはその断片、またはそのバリアントをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
- 請求項３７に記載のベクター。
- 請求項３６に記載のベクター。
- 請求項３０〜３４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の組成物、または請求項３９または４０のいずれか１項に記載のベクターを含み、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の結合分子またはそのサブユニットを発現することができる、宿主細胞。
- 請求項１〜２８のいずれか１項に記載の結合分子を生成する方法であって、請求項４１に記載の宿主細胞を培養すること、及び前記結合分子を回収することを含む、前記方法。
- ＯＸ４０発現細胞においてＯＸ４０媒介性活性化を誘導する方法であって、前記ＯＸ４０発現細胞を、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の多量体結合分子と接触させることを含む、前記方法。
- ＯＸ４０発現Ｔ細胞においてＯＸ４０の移動及びクラスター化を誘導する方法であって、ＯＸ４０発現Ｔ細胞を、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の多量体結合分子と接触させることを含む、前記方法。
- 処置を必要とする対象に、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の多量体結合分子の有効量を投与することを含む、がんを処置する方法であって、前記多量体結合分子は、ＯＸ４０発現エフェクターＴ細胞を活性化させることができ、それによって、殺腫瘍性ＣＴＬ応答を開始させる、前記方法。
- 前記対象がヒトである、請求項４５に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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