CN116964081A - 抗cd123结合分子及其用途 - Google Patents

Abstract

本公开提供特异性结合CD123的抗体或其抗原结合片段或衍生物。还提供编码所述抗体或其抗原结合片段或衍生物的多核苷酸和包含所述多核苷酸的载体和宿主细胞。本公开还提供用于产生和/或使用特异性结合CD123的抗体或其抗原结合片段或衍生物的方法。

Description

抗CD123结合分子及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年2月17日提交的美国临时专利申请序列号63/150,488和2021年9月28日提交的美国临时专利申请序列号63/249,455的权益，所述临时专利申请都以引用的方式各自整体并入本文。

序列表

本申请含有已以电子方式以ASCII格式提交并以引用的方式整体并入本文的序列表。创建于2022年2月17日的ASCII拷贝命名为038WO1-Sequence-Listing.txt，并且大小为84,588字节。

背景技术

急性髓系白血病(AML)是美国白血病死亡的主要原因，每年有超过20,000名新患者，5年存活率低于30％，超过60岁的患者的存活率下降至10％(National CancerInstitute Surveillance,Epidemiology and End-Result Program(SEER)data；Oran和Weisdorf 2012,Haematologica 97(12)1916)。在过去的40年里，AML患者的治疗进展甚微，并且目前的治疗选择主要包括强化疗和干细胞移植(Luppi等人2018,Cancers 10,429)。已经采用若干方法来靶向AML细胞上的细胞表面分子，以引导T细胞接合并杀伤AML细胞。一种这样的表面分子是CD123(也称为IL-3受体α链或IL-3Rα)，其在超过90％的AML患者的白血病细胞以及白血病干细胞上表达，白血病干细胞是通常导致治疗后疾病复发的细胞类型(Kovtun等人2018,Blood Advances 2(8)848；Xie等人2017,Blood Cancer Journal 7,e567)。此外，CD123在具有与极差预后相关的基因突变诸如FLT3的患者中高度表达(Xie等人2017,Blood Cancer Journal 7,e567)。CD123的两种人同工型的氨基酸序列呈现为SEQID NO:14(同工型1，成熟蛋白质：SEQ ID NO:14的大约氨基酸23至378)和SEQ ID NO:15(同工型2，成熟蛋白质：SEQ ID NO:15的大约氨基酸23至300)，食蟹猕猴CD123氨基酸序列呈现为SEQ ID NO:16(与人同工型1约87％相同；成熟蛋白质：SEQ ID NO:16的大约氨基酸23至378)，并且小鼠CD123氨基酸序列呈现为SEQ ID NO:17(与人同工型1约30％相同；成熟蛋白：SEQ ID NO:17的大约氨基酸17至396)。

CD123是一些血液恶性肿瘤的临床验证靶标，作为FDA批准重组IL-3细胞因子与白喉毒素缀合用于治疗母细胞性浆细胞样树突状细胞赘瘤的证据(Pemmaraju等人2019,NEJM380:1628)。这种和其他CD123靶向剂正在临床前和临床试验中进行测试。Xencor(XmAb14045-基于IgG)、Macrogenics(氟替珠单抗(flotetuzumab)-DART)和Jansen(JNJ-63709178-duobody)已使用CD123 x CD3双特异性抗体进行了早期1期临床研究。尽管已在这些患者的一些中报告了临床功效的早期迹象，但使用此类双特异性药物也已观察到了严重的细胞因子释放综合征和一些患者死亡(Ravandi等人2018Blood 132:763；Jacobs等人2018,Blood 132:2738；Uy等人2018,Blood 132:764)。细胞因子释放综合征(或CRS)的特征是发热、低血压、凝血异常和毛细血管渗漏，这可能会危及生命，并且此类发现也与其他T细胞接合方法相关，包括CAR-T和BiTE(Teachley等人2016,Cancer Discovery 6(6)664；Hay等人2017,Blood 130(21)2295)。这些与细胞因子释放相关的不良安全事件往往构成基于IgG的CD3接合双特异性抗体的剂量限制性毒性，并且表现为对此类剂的安全、高效和耐受施用的挑战，并由于因此产生的给药限制，可能表现为对优化这些治疗剂功效的能力的挑战。

可以多聚化的抗体和抗体样分子，诸如IgA和IgM抗体，已成为例如免疫肿瘤学和传染病领域中有希望的候选药物，从而允许改善的特异性、改善的亲合力以及结合多个结合靶标的能力。参见例如美国专利号9,951,134、9,938,347、10,570,191、10,604,559、10,618,978、10,787,520和10,899,835以及美国专利申请公开号US2019-0185570、US2019-0330374、US2019-0338041、US2019-0330360和US 2019-0338040，其内容以引用的方式整体并入本文。

仍然需要靶向表达CD123的AML细胞并诱导T细胞介导的这些细胞的杀伤，同时最大限度地减少CRS。已经评估了使用CD3双特异性IgM技术靶向CD123是否将不仅有效地靶向表达CD123的AML肿瘤细胞以获得T细胞介导的细胞毒性，还产生针对使用基于IgG的CD123x CD3双特异性抗体治疗的患者有时很严重的细胞因子释放综合征具有良好安全性的反应。此外，与基于IgG的双特异性抗体相比，IgM抗体的高亲合力结合可以允许CD123 x CD3双特异性IgM靶向表达细胞表面表达水平相对较低的CD123的肿瘤细胞。

发明内容

本文提供一种抗体或其抗原结合片段或衍生物，其包含特异性结合CD123的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH和VL分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:81和SEQ IDNO:83或SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83。在一些实施方案中，所述VH和VL分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:79。

在一些实施方案中，抗体或其片段或衍生物是Fv片段、单链Fv片段(scFv)或二硫键连接的Fv片段(sdFv)。

在一些实施方案中，所述抗体或其片段或衍生物是多聚体抗体，其包含五个、六个或两个二价结合单元和十个、十二个或四个抗原结合结构域，其中至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个抗原结合结构域特异性结合CD123；其中每个结合单元包含两条重链，每条重链包含IgM或IgA恒定区或其多聚化片段或变体，并且其中所述多聚体抗体的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个重链恒定区与所述VH的拷贝缔合。在一些实施方案中，所述抗体或其片段或衍生物包含有包含两个抗原结合结构域的二价结合单元，其中至少一个抗原结合结构域特异性结合CD123，其中所述结合单元包含两条重链，每条重链包含重链恒定区或其片段或变体，并且其中所述结合单元的至少一个重链恒定区或其片段或变体与所述VH的拷贝融合。

在一些实施方案中，所述抗体或其片段或衍生物包含有包含两个抗原结合结构域的单个二价结合单元，其中至少一个抗原结合结构域特异性结合CD123，其中所述结合单元包含两条重链，每条重链包含重链恒定区或其片段或变体，并且其中所述结合单元的至少一个重链恒定区或其片段或变体与所述VH的拷贝缔合。在一些实施方案中，重链包含IgG重链恒定区或其片段或变体。

在一些实施方案中，所述抗体或其片段或衍生物是多聚体抗体，其包含两个、五个或六个二价结合单元和四个、十个或十二个抗原结合结构域，其中至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个抗原结合结构域特异性结合CD123；其中每个结合单元包含两条重链，每条重链包含IgA或IgM恒定区或其多聚化片段或变体，并且其中所述多聚体抗体的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个重链恒定区与所述VH的拷贝融合。在一些实施方案中，所述抗体或其片段或衍生物是多聚体抗体，其包含两个、五个或六个二价结合单元和四个、十个或十二个抗原结合结构域，其中至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个抗原结合结构域特异性结合CD123；其中每个结合单元包含两条重链，每条重链包含IgA或IgM恒定区或其多聚化片段或变体，并且其中所述多聚体抗体的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个重链恒定区与所述VH的拷贝融合。在一些实施方案中，每个重链恒定区或其多聚化片段或变体与所述VH的拷贝缔合。在一些实施方案中，每个重链恒定区或其片段或变体与所述VH的拷贝融合。

在一些实施方案中，每个结合单元还包含两条轻链，每条轻链包含轻链恒定区或其片段或变体，并且其中至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个轻链恒定区或其片段或变体与所述VL的拷贝缔合。在一些实施方案中，每个结合单元还包含两条轻链，每条轻链包含轻链恒定区或其片段或变体，并且其中至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个轻链恒定区或其片段或变体与所述VL的拷贝融合。在一些实施方案中，每个轻链恒定区或其片段或变体与所述VL的拷贝缔合。在一些实施方案中，每个轻链恒定区或其片段或变体与所述VL的拷贝融合。

在一些实施方案中，抗体或其片段或衍生物包含完整抗体、Fab片段、Fab'片段或F(ab')₂片段。

在一些实施方案中，所述抗体或其片段或衍生物是二聚体并且包含两个二价IgA结合单元以及J链或其片段或变体，其中每个结合单元包含Cα3结构域和α-尾片(αtp)结构域。在一些实施方案中，所述IgA重链恒定区或其片段或变体各自还包含Cα1结构域、Cα2结构域、IgA铰链区或其任何组合。

在一些实施方案中，所述抗体或其片段或衍生物是六聚体或五聚体并且包含五个或六个二价IgM结合单元，其中每个结合单元包含Cμ4结构域和μ-尾片(μtp)结构域或其片段或变体。在一些实施方案中，所述IgM重链恒定区或其多聚化片段或变体各自还包含Cμ1结构域、Cμ2结构域、Cμ3结构域或其任何组合。在一些实施方案中，IgA重链恒定区或其片段或变体是IgA1重链恒定区或其片段或变体。在一些实施方案中，IgA重链恒定区或其片段或变体包含SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，IgA重链恒定区或其片段或变体是IgA2重链或其片段或变体。在一些实施方案中，IgA重链恒定区或其片段或变体包含SEQ ID NO:4。

在一些实施方案中，每个IgM重链恒定区是人IgM恒定区或其多聚化变体或片段，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或其变体或片段。在一些实施方案中，抗体或其片段或衍生物包含变体人IgM恒定区，其中抗体或其片段或衍生物相对于包含有包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的IgM重链恒定区的抗体或其抗原结合片段或衍生物具有降低的CDC活性。在一些实施方案中，每个变体人IgM恒定区包含与SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的位置P311相对应的氨基酸取代、与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置P313相对应的氨基酸取代，或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置P311和P313相对应的氨基酸取代。

在一些实施方案中，每个IgM重链恒定区或其多聚化变体或片段是变体人IgM恒定区，其具有相对于与变体IgM重链恒定区除一个或多个改变半衰期的单一氨基酸取代、缺失或插入之外都相同的参考IgM重链恒定区的一个或多个改变半衰期的单一氨基酸取代、缺失或插入；其中在施用于受试动物时，抗体或其片段或衍生物相对于包含参考IgM重链恒定区的以相同方式施用于相同动物物种的抗体或其抗原结合片段或衍生物表现出增加的血清半衰期。在一些实施方案中，变体IgM重链恒定区包含在与野生型人IgM恒定区SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸E345A、S401A、E402A或E403A相对应的一个或多个氨基酸位置处的氨基酸的改变半衰期的取代。

在一些实施方案中，IgM重链恒定区或其多聚化变体或片段各自包含与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的N46、N209、N272或N440相对应的一个或多个糖基化取代，其中所述一个或多个糖基化取代阻止了天冬酰胺(N)-连接的糖基化。

在一些实施方案中，抗体或其片段或衍生物是五聚体，并且还包含J链或其片段或其变体。

在一些实施方案中，所述J链或其片段或变体是包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或其片段或其变体的成熟人J链。在一些实施方案中，所述抗体或其片段或衍生物包含变体J链或其片段，其中所述变体J链在与SEQ ID NO:7的野生型成熟人J链的氨基酸Y102相对应的氨基酸位置处包含氨基酸取代，并且其中在施用于动物时，包含所述变体J链的IgM抗体相对于除所述J链中的一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入之外都相同的并以相同方式施用于相同动物物种的参考IgM抗体表现出增加的血清半衰期。在一些实施方案中，与SEQID NO:7的Y102相对应的氨基酸可以被丙氨酸(A)取代。在一些实施方案中，J链包含氨基酸序列SEQ ID NO:8。

在一些实施方案中，所述J链或其片段或变体是修饰的J链，其还包含异源部分，其中所述异源部分与所述J链或其片段或变体融合或缀合。在一些实施方案中，所述异源部分是与所述J链或其片段或变体融合的多肽。在一些实施方案中，异源多肽经由肽接头与J链或其片段或变体融合，所述肽接头包含至少5个氨基酸但不超过25个氨基酸。在一些实施方案中，异源多肽与J链或其片段或变体的N末端融合、与J链或其片段或变体的C末端融合，或与J链或其片段或变体的N末端和C末端两者融合，其中与N末端和C末端两者融合的异源多肽可以是相同的或不同的。在一些实施方案中，与J链或其片段或变体融合的多肽是抗体抗原结合结构域或其亚基。在一些实施方案中，抗体抗原结合结构域包含scFv片段。

在一些实施方案中，异源多肽结合CD3。在一些实施方案中，抗体或其片段或衍生物可以结合CD3。在一些实施方案中，抗体或其片段或衍生物包含本文公开的结合CD3的VH和VL序列。在一些实施方案中，抗体抗原结合结构域结合CD3并包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含VH互补决定区VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，并且VL包含VL互补决定区VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48和SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQID NO:56和SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65；或SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:71、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73。在一些实施方案中，VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。在一些实施方案中，抗体抗原结合结构域分别包含与SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:58和SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:70至少80％、85％、90％、95％或100％相同的VH和VL氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体抗原结合结构域分别包含VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34和SEQID NO:38、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:70。在一些实施方案中，抗体抗原结合结构域分别包含VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:30。

在一些实施方案中，抗体或其片段或衍生物还包含分泌性组分或其片段或变体。

在一些实施方案中，抗体或其片段或衍生物是多特异性的。在一些实施方案中，抗体或其片段或衍生物是双特异性的。

在一些实施方案中，抗体或其片段或衍生物可以特异性结合人CD123。在一些实施方案中，抗体或其片段或衍生物以特征为解离常数KD不超过500nM、100nM、50.0nM、40.0nM、30.0nM、20.0nM、10.0nM、9.0nM、8.0nM、7.0nM、6.0nM、5.0nM、4.0nM、3.0nM、2.0nM、1.0nM、0.50nM、0.10nM、0.050nM、0.01nM、0.005nM或0.001nM的亲和力特异性结合人CD123。

本文还提供了一种组合物，其包含本文公开的抗体或其片段或衍生物。本文还提供了一种多核苷酸，其包含编码本文公开的所述抗体或其片段或衍生物或其亚基的核酸序列。本文还提供了一种载体，其包含本文公开的多核苷酸。本文还提供了一种宿主细胞，其包含本文公开的载体。

本文还提供了一种产生本文公开的抗体或其片段或衍生物的方法，其包括培养本文公开的宿主细胞和回收所述抗体或其片段或衍生物。

本文还提供了一种治疗癌症的方法，其包括向需要治疗的受试者施用有效量的本文公开的抗体或其片段或衍生物。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述癌症是血液癌症。在一些实施方案中，所述血液癌症是急性髓系白血病(AML)。

附图说明

图1A至图1D示出了基于4D9Q(图1A、图1B)或4NWT(图1C、图1D)框架的亲本和人源化抗CD123 VH(图1A、图1C)和VL(图1B、图1D)序列的比较。32716-VH:SEQ ID NO:74、h32716-VL:SEQ IDNO:75、h32716-VH1:SEQ ID NO:76、h32716-VH2:SEQ ID NO:77、h32716-VH3:SEQ ID NO:78、h32716-VL1:SEQ ID NO:79、h32716-VH4:SEQ ID NO:80、h32716-VH5:SEQ ID NO:81、h32716-VH6:SEQ ID NO:82和h32716-VL2:SEQ ID NO:83。

图2A至图2G示出了32716IgG(图2A)、h32716-1-1IgG(图2B)、h32716-2-1IgG(图2C)、h32716-3-1IgG(图2D)、h32716-4-2IgG(图2E)、h32716-5-2IgG(图2F)和h32716-6-2IgG(图2G)的缔合和解离的Octet测量。垂直线表示所述过程的解离阶段的开始。

图3示出了通过流式细胞术测量的不同浓度的抗CD123 IgG抗体与MV411细胞上的人CD123的结合。

图4A至图4C示出了32716IgM(图4A)、h32716-1-1IgM(图4B)和h32716-4-2IgM(图4C)的缔合和解离的Octet测量。垂直线表示所述过程的解离阶段的开始。

图5A至图5B示出了通过ELISA测量的不同浓度的抗CD123xCD3 IgM抗体与人CD123(图5A)或人CD3ε(图5B)的结合。

图6示出了通过流式细胞术测量的不同浓度的抗CD123xCD3IgM抗体与MV411细胞上的人CD123的结合。

图7A至图7B示出了用抗CD123xCD3 IgM抗体治疗后72小时后对KG1a细胞(图7A)和MV411细胞(图7B)进行的泛T细胞依赖性细胞毒性(TDCC)测定中的肿瘤活力。

图8示出了在各种条件下h32716-1-1IgM、h32716-4-2IgM和32716IgM抗体的溶液中高分子量聚集体的百分比(％HMW)。

图9A示出了75天中随时间推移的用媒介物、抗CD123XCD3 IgG#1治疗、5mg/kgh32716-1-1IgM抗体和15mg/kg h32716-1-1IgM抗体治疗的小鼠的平均肿瘤体积。图9B示出了第75天，用媒介物、抗CD123XCD3 IgG#1治疗、5mg/kg h32716-1-1IgM抗体和15mg/kgh32716-1-1IgM抗体治疗的小鼠的个体肿瘤体积。

图10A至图10D示出了75天中随时间推移的对于媒介物(图10A)、抗CD123XCD3IgG#1(图10B)、5mg/kg h32716-1-1IgM抗体(图10C)和15mg/kg h32716-1-1IgM抗体(图10D)的个体肿瘤体积。

图11示出了在用h32716-1-1IgM抗体治疗后，来自四个不同供体的AML细胞的体外集落形成。将计算归一化为溶剂对照。

图12示出了在小鼠模型中，在一次剂量为5mg/kg的h32716、h32716-4-2或h32716-1-1后随时间变化的抗体的血清浓度。

图13A示出了使用CD123xCD3 IgG#1或h32716-1-1进行48小时TDCC后活肿瘤细胞的数量。图13B至图13D示出了使用CD123xCD3 IgG#1或h32716-1-1进行48小时TDCC后在培养基中检测到的IFNγ(图13B)、IL-6(图13C)和IL-10(图13D)的量。

图14A示出了使用CD123xCD3 IgG#1或h32716-1-1进行72小时TDCC后活肿瘤细胞的数量。图14B至图14D示出了使用CD123xCD3 IgG#1或h32716-1-1进行72小时TDCC后在培养基中检测到的IFNγ(图14B)、IL-6(图14C)和IL-10(图14D)的量。

具体实施方式

定义

应注意，术语“一种/个(a)”或“一种/个(an)”实体是指一个或多个所述实体；例如，“结合分子”应理解为代表一个或多个结合分子。因此，术语“一种/个(a)”(或“一种/个(an)”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文可以互换使用。

此外，在本文中使用时将“和/或”视为对两个指定特征或组分中的每一个在存在或不存在另一者的情况下的具体公开。因此，本文如在短语诸如“A和/或B”中所用的术语“和/或”意图包括：“A和B”；“A或B”；“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如在短语诸如“A、B和/或C”中所用的术语“和/或”意图涵盖以下实施方案中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

除非另有定义，否则本文使用的技术和科技术语具有与本公开相关领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。例如，Concise Dictionary of Biomedicine andMolecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；The Dictionary of Celland Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；以及Oxford Dictionary ofBiochemistry and Molecular Biology,修订版,2000,Oxford University Press向技术人员提供本公开中使用的许多术语的一般词典。

单位、前缀和符号均以其国际单位制(Système International de Unites(SI))可接受的形式表示。数值范围包括限定范围的数字。除非另外指明，否则氨基酸序列是以氨基至羧基取向自左至右书写。本文提供的标题不是对本公开的各个实施方案或实施方案的限制，这些实施方案可以通过参考整个说明书来获得。因此，即将在下文定义的术语通过参考说明书全文而得到更充分地定义。

如本文所用，术语“多肽”意图涵盖单个“多肽”以及多个“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也被称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不涉及产物的特定长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸”或用于指代具有两个或更多个氨基酸的一条或多条链的任何其他术语包括在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替任何这些术语使用或与任何这些术语互换使用。术语“多肽”还意图指代多肽的表达后修饰的产物，所述表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酰化、酰胺化和通过已知保护/阻断基团、蛋白水解性裂解或被非自然存在的氨基酸修饰而进行的衍生化。多肽可以来源于生物来源或通过重组技术产生，但不必从指定的核酸序列翻译。多肽可以以任何方式生成，包括通过化学合成。

如本文所公开的多肽的尺寸可以是约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1000个或更多个或2000个或更多个的氨基酸。多肽可以具有定义的三维结构，尽管其不一定具有此种结构。具有定义的三维结构的多肽称为折叠的，并且不具有定义的三维结构但可以采用许多不同构象的多肽称为未折叠的。如本文所用，术语糖蛋白是指与至少一个碳水化合物部分偶联的蛋白质，所述至少一个碳水化合物部分经由氨基酸(例如，丝氨酸或天冬酰胺)的含氧或含氮侧链附接到蛋白质。

“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意指不在它的自然环境中的多肽。不要求特定的纯化水平。例如，分离的多肽可以是从其天然或自然环境中移出的。如本文所公开，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质被认为是分离的，通过任何合适的技术分离、分级分离或部分或基本上纯化的天然或重组多肽也被认为是分离的。

如本文所用，术语“非自然存在的多肽”或其任何语法变体是附带条件的定义，所述附带条件的定义明确排除但仅排除由或可能由法官或行政或司法机构确定或解释为“自然存在”的那些形式的多肽。

本文所公开的其他多肽为上述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任何组合。本文所公开的术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保留对应的天然抗体或多肽的至少一些特性(例如，特异性结合抗原)的任何多肽。除了本文别处讨论的特异性抗体片段以外，多肽的片段包括例如蛋白水解片段以及缺失片段。例如，多肽的变体包括如上所述的片段和由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，变体可以是非自然存在的。可以使用本领域已知的诱变技术来产生非自然存在的变体。变体多肽可以包含保守或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。衍生物是已被改变以表现出原始多肽上未发现的另外特征的多肽。实例包括融合蛋白。变体多肽在本文中也可以称为“多肽类似物”。如本文所用，多肽的“衍生物”还可以指具有一个或多个通过官能性侧基的反应化学衍生的氨基酸的主题多肽。“衍生物”还包括含有二十种标准氨基酸的一个或多个衍生物的那些肽。例如，4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；并且鸟氨酸可以取代赖氨酸。

“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸被具有类似侧链的另一个氨基酸替代的一种取代。在本领域中已定义具有类似侧链的氨基酸的家族，所述侧链包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸取代酪氨酸是保守取代。在某些实施方案中，本公开的多肽和抗体的序列中的保守取代不消除含有氨基酸序列的多肽或抗体与多肽或抗体结合的抗原的结合。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域熟知的(参见，例如，Brummell等人,Biochem.32:1180-1 187(1993)；Kobayashi等人,Protein Eng.12(10):879-884(1999)；以及Burks等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:.412-417(1997))。

术语“多核苷酸”意图涵盖单个核酸以及多个核酸，并且是指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)、cDNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如，酰胺键，诸如在肽核酸(PNA)中发现的)。术语“核酸”或“核酸序列”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如，DNA或RNA片段。

“分离的”核酸或多核苷酸意指从其天然环境分离的任何形式的核酸或多核苷酸。例如，凝胶纯化的多核苷酸或包含在载体中的编码多肽的重组多核苷酸将被认为是“分离的”。此外，已被工程化以具有用于克隆的酶切位点的多核苷酸区段(例如，PCR产物)被认为是“分离的”。分离的多核苷酸的其他实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸，或在非天然溶液诸如缓冲液或盐水中的纯化(部分或基本上)多核苷酸。分离的RNA分子包括多核苷酸的体内或体外RNA转录物，其中转录物不是在自然中发现的转录物。分离的多核苷酸或核酸还包括由合成方式产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是调控元件或可以包含调控元件，诸如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。

如本文所用，术语“非自然存在的多核苷酸”或其任何语法变体是附带条件的定义，所述附带条件的定义明确排除但仅排除由或可能由法官或行政或司法机构确定或解释为“自然存在”的那些形式的核酸或多核苷酸。

如本文所用，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸的一部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不被翻译成氨基酸，但它可以被认为是编码区的一部分，但任何侧接序列例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单个多核苷酸构建体中，例如，在单个载体上，或存在于单独的多核苷酸构建体中，例如，在单独的(不同的)载体上。此外，任何载体可以含有单个编码区，或可以包含两个或更多个编码区，例如，单个载体可以单独编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，载体、多核苷酸或核酸可以包含与另一编码区融合或未融合的异源编码区。异源编码区包括但不限于编码特殊元件或基序(诸如分泌信号肽或异源功能结构域)的那些。

在某些实施方案中，多核苷酸或核酸为DNA。在DNA的情况下，包含正常编码多肽的核酸的多核苷酸可以包含与一个或多个编码区可操作地缔合的启动子和/或其他转录或翻译控制元件。可操作的缔合是基因产物(例如，多肽)的编码区与一个或多个调控序列缔合，从而将基因产物的表达置于一个或多个调控序列的影响或控制之下。如果诱导启动子功能会导致编码所期望基因产物的mRNA的转录，以及如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调控序列引导基因产物的表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，那么两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其缔合的启动子)是“可操作地缔合”。因此，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，那么启动子区域将与所述核酸可操作地缔合。启动子可以是在预先确定的细胞中引导DNA实质性转录的细胞特异性启动子。除启动子外，其他转录控制元件例如增强子、操纵子、阻遏子和转录终止信号可以与多核苷酸可操作地缔合以引导细胞特异性转录。

多个转录控制区是本领域技术人员已知的。它们包括但不限于转录控制区，其在脊椎动物细胞中起作用，诸如但不限于来自巨细胞病毒(立即早期启动子，与内含子-A联合)、猿猴病毒40(早期启动子)以及逆转录病毒(诸如劳斯肉瘤病毒(Rous sarcomavirus))的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括来源于脊椎动物基因的那些，诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β球蛋白，以及能够在真核细胞中控制基因表达的其他序列。另外的合适转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导型启动子(例如，可由干扰素或白介素诱导的启动子)。

类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及来源于微小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，其也被称为CITE序列)。

在其他实施方案中，多核苷酸可以是RNA，例如呈信使RNA(mRNA)、转运RNA或核糖体RNA的形式。

多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的另外的编码区缔合，分泌肽或信号肽引导由如本文所公开的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长中的蛋白质链跨粗面内质网的输出被起始，那么所述序列就从成熟蛋白质裂解。本领域普通技术人员应了解由脊椎动物细胞分泌的多肽可以具有与多肽的N末端融合的信号肽，其从完整或“全长”多肽裂解以产生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施方案中，使用天然信号肽(例如，免疫球蛋白重链或轻链信号肽)，或所述序列的保留引导与其可操作地缔合的多肽的分泌的能力的功能衍生物。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可被人组织纤溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列取代。

如本文所用，术语“结合分子”在其最广泛的意义上是指特异性结合结合靶标(例如，表位或抗原决定簇)的分子。如本文还描述的，结合分子可包含一个或多个本文所述的“抗原结合结构域”。结合分子的非限制性实例是保留抗原特异性结合的抗体或抗体样分子或如本文详述的保留抗原特异性结合的抗体样分子或其片段。在某些实施方案中，“结合分子”包含如本文详述的抗体或抗体样分子。

如本文所用，术语“结合结构域”或“抗原结合结构域”(可互换使用)是指结合分子(例如，抗体或抗体样分子)的区域或片段，其对于特异性结合结合靶标(例如，表位)是必要且充分的。例如，“Fv”，例如抗体的重链可变区和轻链可变区，作为两个单独的多肽亚基或作为单个链，被认为是“结合结构域”。其他抗原结合结构域包括但不限于来源于骆驼科物种的抗体的重链可变区(VHH)或在支架(例如，纤连蛋白支架)中表达的六个免疫球蛋白互补决定区(CDR)。如本文所述的“结合分子”，例如抗体或抗体样分子可以包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个或甚至更多个“抗原结合结构域”。如本文所用，“与结合单元缔合的抗原结合结构域”是指为抗体重链和/或抗体轻链的一部分的抗原结合结构域。术语“与J链缔合的抗原结合结构域”是指与如本文所述的经修饰的J链缔合的抗原结合结构域，例如与野生型人J链或其功能片段或变体融合的scFv。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。如本公开提供的抗体必须特异性结合抗原，即，所述抗体至少包含重链的可变结构域(对于骆驼科物种)或至少包含重链和轻链的可变结构域。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构被相对充分地理解。参见，例如，Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,第2版1988)。除非另外指出，否则术语“抗体”涵盖从抗体的小抗原结合片段到全尺寸的抗体的任何事物，例如，包含两条IgG重链或其片段和两条完整轻链的IgG抗体；包含两条、四条或八条重链或其多聚化片段和两条、四条或八条轻链并任选地包含J链和/或分泌组分的IgA抗体；或包含十条或十二条完整重链和十条或十二条完整轻链并任选地包含J链或其功能片段或变体的IgM抗体。

术语“免疫球蛋白”包括可以被生物化学区别的各种广泛类别的多肽。本领域技术人员将理解，重链分类为伽马(gamma)、缪(mu)、阿尔法(alpha)、德尔塔(delta)或伊普西龙(epsilon)(γ、μ、α、δ、ε)，它们之中有一些亚类(例如，γ1至γ4或α1至α2)。此链的本质决定了抗体的“同种型”分别为IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。免疫球蛋白亚类(亚型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等被充分地表征，并且已知其赋予功能特异化。鉴于本公开，这些免疫球蛋白中的每种的修饰型式对于本领域技术人员是容易辨别的并因此处于本公开的范围内。

轻链分类为卡帕(kappa)或兰布达(lambda)(κ、λ)。每个重链类别可与卡帕(kappa)或兰布达(lambda)轻链缔合。通常，轻链和重链经由二硫键彼此共价键合，并且当例如，通过杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞来表达免疫球蛋白时，两条重链的“尾”部分通过共价二硫键联或非共价键联彼此结合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的叉端处的N末端到每条链底部的C末端。某些抗体(例如，IgG抗体)的基本结构包括两个重链亚基和两个轻链亚基，亚基经由二硫键共价连接以形成“Y”结构，在本文中也称为“H2L2”结构，或“结合单元”。

术语“结合单元”在本文中用于指代结合分子，例如与标准“H2L2”免疫球蛋白结构(例如，两条重链或其片段和两条轻链或其片段)相对应的抗体或抗体样分子的部分。在某些实施方案中，结合单元可以与两条重链(例如，骆驼科抗体中)相对应。在某些实施方案中，例如在结合分子是二价IgG抗体或抗体样分子的情况下，术语“结合分子”和“结合单元”是等同的。在其他实施方案中，例如在结合分子是多聚体(例如，二聚体或四聚体IgA抗体或IgA样抗体、五聚体IgM抗体或IgM样抗体或六聚体IgM抗体或IgM样抗体)的情况下，结合分子包含两个或更多个“结合单元”。在IgA二聚体或四聚体的情况下分别包含两个或四个结合单元，或在IgM五聚体或六聚体的情况下分别包含五个或六个结合单元。结合单元不需要包含全长抗体的重链和轻链，但通常将是二价的，即，将包括两个如上所定义的“抗原结合结构域”。如本文所用，本公开中提供的某些结合分子是“二聚体”或“四聚体”，并且包含两个或四个包含IgA重链恒定区或其多聚化片段的二价结合单元。本公开中提供的某些结合分子是“五聚体”或“六聚体”，并且包含五个或六个包含IgM重链恒定区或其多聚化片段的二价结合单元。包含两个或更多个(例如，两个、四个、五个或六个)结合单元的结合分子(例如，抗体或抗体样分子)在本文中称为“多聚体”。

如本文所用的术语“J链”是指任何动物物种的与五聚体IgM或二聚体或四聚体IgA抗体缔合的J链、其任何功能片段、其衍生物和/或其变体，包括成熟人J链，所述成熟人J链的氨基酸序列呈现为SEQ ID NO:7。本文公开了各种J链变体和经修饰的J链衍生物。如本领域的普通技术人员将认识到的，“功能片段”或“功能变体”包括能够与IgM重链恒定区缔合以形成五聚体IgM抗体(或另选地能够与IgA重链恒定区缔合以形成二聚体或四聚体IgA抗体)的那些片段和变体。

术语“经修饰的J链”在本文中用于指代天然序列J链多肽的衍生物，其包含异源部分，例如异源多肽，例如，引入到天然序列中的外部结合结构域。可以通过任何方式实现引入，包括异源多肽或其他部分的直接或间接融合，或通过肽接头或化学接头进行附接。术语“经修饰的人J链”涵盖但不限于通过引入异源部分(例如，异源多肽，例如，外部结合结构域)进行修饰的包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的人J链或其功能片段或其功能变体。在某些实施方案中，异源部分不干扰IgM高效地聚合为五聚体或IgA高效地聚合为二聚体或四聚体，并且不干扰此类聚合物与靶标的结合。示例性经修饰的J链可见于例如美国专利号9,951,134、10,975,147、10,400,038和10,618,978和美国专利申请公开号US-2019-0185570，其各自以引用的方式整体并入本文。

如本文所用，术语“IgM衍生的结合分子”、“IgM样抗体”、“IgM样结合单元”或“IgM样重链恒定区”是指仍保留IgM重链的结构部分的变体抗体衍生的结合分子、抗体、结合单元或重链恒定区，所述IgM重链的结构部分对于赋予结合抗原和形成多聚体(即，六聚体或与J链缔合形成五聚体)的能力是必要的。IgM样抗体或IgM衍生的结合分子通常至少包含IgM恒定区的Cμ4和μ尾片(μtp)结构域及其抗原结合结构域或亚基，但可以包含来自相同物种或不同物种的其他抗体同种型(例如，IgG)的重链恒定区结构域。IgM样抗体或IgM衍生的结合分子同样可以是其中一个或多个恒定区缺失的抗体片段，只要IgM样抗体能够结合抗原和形成六聚体和/或五聚体。因此，IgM样抗体或IgM衍生的结合分子可以是例如杂合IgM/IgG抗体，或可以是IgM抗体的“多聚化片段”。

如本文所用，术语“IgA衍生的结合分子”、“IgA样抗体”、“IgA样结合单元”或“IgA样重链恒定区”是指仍保留IgA重链的结构部分的变体抗体衍生的结合分子、抗体、结合单元或重链恒定区，所述IgA重链的结构部分对于结合抗原和赋予与J链缔合形成多聚体(即，二聚体或四聚体)的能力是必要的。IgA样抗体或IgA衍生的结合分子通常至少包含IgA恒定区的Cα3和α尾片(αtp)结构域及其抗原结合结构域或亚基，但可以包含来自相同物种或不同物种的其他抗体同种型(例如，IgG)的重链恒定区结构域。IgA样抗体或IgA衍生的结合分子同样可以是其中一个或多个恒定区缺失的抗体片段，只要IgA样抗体能够结合抗原和与J链缔合形成二聚体。因此，IgA样抗体或IgA衍生的结合分子可以是例如杂合IgA/IgG抗体，或可以是IgA抗体的“多聚化片段”。

术语“价”、“一价”、“二价”、“多价”和语法等同物是指给定结合分子(例如，抗体或抗体样分子)中或给定结合单元中抗原结合结构域的数量。因此，参考给定结合分子(例如，IgM抗体、IgM样抗体或其多聚化片段)，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示存在两个抗原结合结构域、四个抗原结合结构域和六个抗原结合结构域。在每个结合单元为二价的情况下，典型的IgM抗体或IgM样抗体或IgM衍生的结合分子可以具有10价或12价。二价或多价结合分子，例如，抗体或抗体样分子，可以是单特异性的，即，所有抗原结合结构域是相同的，或可以是双特异性或多特异性的，例如，其中两个或更多个抗原结合结构域是不同的，例如，结合相同抗原上的不同表位或结合完全不同的抗原。

术语“表位”包括能够特异性结合抗体或抗体样分子的抗原结合结构域的任何分子决定簇。在某些实施方案中，表位可以包括诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的分子的化学活性表面集群，并且在某些实施方案中，可以具有三维结构特征和或特定电荷特征。表位是靶标中由抗体的抗原结合结构域结合的区域。

术语“靶标”在最广泛的意义上使用，以包括可以由结合分子(例如，抗体或抗体样分子)结合的物质。靶标可以是例如，多肽、核酸、碳水化合物、脂质或其他分子。此外，“靶标”可以是例如，细胞、器官或生物体，其包含可以由结合分子(例如，抗体或抗体样分子)结合的表位。

抗体或抗体样分子的轻链和重链均分成结构同源性和功能同源性的区域。术语“恒定”和“可变”在功能方面使用，但是指分子的特定结构。轻链的可变区(VL)和重链的可变区(VH)两者决定抗原识别和特异性。相反，轻链的恒定结构域(CL)和重链的恒定结构域(例如，CH1、CH2、CH3或CH4)赋予生物学特性，诸如多聚化的能力、分泌、经胎盘移动性、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随其离抗体的抗原结合区或氨基末端更远而增加。N末端部分是可变区并且C末端部分是恒定区；CH3(或在IgM的情况下是CH4)结构域和CL结构域实际上分别包含重链和轻链的羧基末端。

“全长IgM抗体重链”是在N末端向C末端方向上包含抗体重链可变结构域(VH)、可以包含尾片的抗体重链恒定结构域1(CM1或Cμ1)、抗体重链恒定结构域2(CM2或Cμ2)、抗体重链恒定结构域3(CM3或Cμ3)和抗体重链恒定结构域4(CM4或Cμ4)的多肽。

如上所指明，来自抗体或抗体样分子的抗原结合结构域的一个或多个可变区允许其选择性识别并特异性结合抗原上的表位。即，结合分子(例如，抗体或抗体样分子)的VL结构域和VH结构域或互补决定区(CDR)的抗原结合子集组合以形成抗原结合结构域。更具体地，抗原结合结构域可以由每条VH和VL链上的三个CDR限定。某些抗体或抗体样分子形成更大的结构。例如，IgA重链可以形成包含经由二硫键共价连接的两个或四个H2L2结合单元和J链的分子，所述分子还可以与分泌组分缔合，并且IgM重链可以形成包含经由二硫键共价连接的五个或六个H2L2结合单元和任选地J链的五聚体或六聚体分子。

抗体抗原结合结构域中存在的六个“互补决定区”或“CDR”是短的非连续氨基酸序列，当抗体在水性环境中呈现其三维构型时，所述氨基酸序列被特别定位以形成抗原结合结构域。抗原结合结构域中的其余氨基酸被称为“框架”区，其显示较小的分子间变异性。框架区主要采用β-片层构象，并且CDR形成环，所述环连接β-片层结构并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。因此，框架区起形成支架的作用，所述支架提供用于通过链间非共价相互作用将CDR定位在正确的取向上。由经定位的CDR形成的抗原结合结构域限定与靶抗原上的表位互补的表面。此互补表面促进抗体与其同源表位的非共价结合。对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域普通技术人员可以容易地鉴定分别构成CDR和框架区的氨基酸，因为它们已经以各种不同的方式被定义(参见，"Sequences of Proteins ofImmunological Interest,"Kabat,E.等人,U.S.Department of Health and HumanServices,(1983)；以及Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)，其以引用的方式整体并入本文)。

在本领域内使用和/或公认的术语存在两个或更多个定义的情况下，除非明确地相反说明，否则本文所用的术语的定义意图包括所有此类含义。具体的实例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重链和轻链多肽两者的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定区域已例如由Kabat等人,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences of Proteins of Immunological Interest"(1983)以及由Chothia等人,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)描述，其以引用的方式并入本文。Kabat和Chothia定义包括相互比较时氨基酸的重叠或子集。然而，除非另有指明，否则提及抗体或其变体的CDR的任一定义(或本领域普通技术人员已知的其他定义)的应用意图落入本文定义和使用的术语的范围内。涵盖由以上引用的每个参考文献中的所定义的CDR的适当氨基酸在下表1中列出，作为比较。涵盖特定CDR的确切氨基酸数将根据CDR的序列和尺寸而变化。给定抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规地确定哪些氨基酸构成特定的CDR。

表1CDR定义^*

	Kabat	Chothia
			VH CDR1	31-35	26-32
VH CDR2	50-65	52-58
			VH CDR3	95-102	95-102
VL CDR1	24-34	26-32
			VL CDR2	50-56	50-52
VL CDR3	89-97	91-96

^*表1中所有CDR定义的编号根据Kabat等人提出的编号惯例(见下文)。

例如，也可以使用IMGT信息系统(imgt_dot_cines_dot_fr/)(/V-Quest)对抗体可变结构域进行分析，以鉴定可变区区段，包括CDR。(参见例如，Brochet等人,Nucl.Acids Res.,36:W503-508,2008)。

Kabat等人还定义了适用于任何抗体的可变区和恒定区序列的编号系统。本领域的普通技术人员可以明确地对任何可变区序列分配这种“Kabat编号”系统，而不依赖于序列本身以外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”是指由Kabat等人，U.S.Dept.ofHealth and Human Services,"Sequence of Proteins ofImmunological Interest"(1983)提出的编号系统。然而，除非明确指出使用Kabat编号系统，否则本公开中所有氨基酸序列使用连续编号。

用于人IgM恒定结构域的Kabat编号系统可见于Kabat等人“Tabulation andAnalysis of Amino acid and nucleic acid Sequences of Precursors,V-Regions,C-Regions,J-Chain,T-Cell Receptors for Antigen,T-Cell Surface Antigens,β-2Microglobulins,Major Histocompatibility Antigens,Thy-1,Complement,C-ReactiveProtein,Thymopoietin,Integrins,Post-gamma Globulin,α-2Macroglobulins,andOther Related Proteins,”U.S.Dept.of Health and Human Services(1991)。IgM恒定区可以顺序地编号(即，氨基酸#1从恒定区的第一个氨基酸开始)或通过使用Kabat编号方案编号。下文列出了人IgM恒定区的两个等位基因顺序地编号(在本文中呈现为SEQ ID NO:1(等位基因IGHM*03)和SEQ ID NO:2(等位基因IGHM*04))和通过Kabat系统编号的比较。带下划线的氨基酸残基不考虑在Kabat系统中(下文带双下划线的“X”可以是丝氨酸(S)(SEQID NO:1)或甘氨酸(G)(SEQ ID NO:2))：

IgM重链的顺序(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)/KABAT编号图例

结合分子(例如，抗体、抗体样分子)、其抗原结合片段、变体或衍生物，和/或其多聚化片段包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如，Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段。ScFv分子描述于例如美国专利5,892,019中。

“特异性结合”一般意指结合分子(例如，抗体或抗体样分子)经由其抗原结合结构域与表位结合，并且所述结合需要抗原结合结构域与表位之间的一定互补性。根据此定义，当与结合分子(例如，抗体或抗体样分子)将与随机的、不相关的表位结合相比，结合分子更易于经由其抗原结合结构域与一表位结合时，称结合分子与所述表位“特异性结合”。本文中使用术语“特异性”来形容某个结合分子与某个表位结合的相对亲和力。例如，可以认为，结合分子“A”比结合分子“B”对于给定的表位具有更高的特异性，或可以称，结合分子“A”以比对于相关表位“D”更高的特异性与表位“C”结合。

可以称，本文所公开的结合分子(例如，抗体或抗体样分子)以小于或等于5X 10^{- 2}sec^-1、10^-2sec^-1、5X 10^-3sec^-1、10^-3sec^-1、5X 10^-4sec^-1、10^-4sec^-1、5X 10^-5sec^-1、10^-5sec^-1、5X 10^-6sec^-1、10^-6sec^-1、5X 10^-7sec^-1或10^-7sec^-1的解离速率(k(off))与靶抗原结合。

可以称，本文所公开的结合分子(例如，抗体或抗体样分子)以大于或等于10³M^{- 1}sec^-1、5X 10³M^-1sec^-1、10⁴M^-1sec^-1、5X 10⁴M^-1sec^-1、10⁵M^-1sec^-1、5X 10⁵M^-1sec^-1、10⁶M^-1sec^-1、5X 10⁶M^-1sec^-1或10⁷M^-1sec^-1的结合速率(k(on))与靶抗原结合。

如果结合分子(例如，抗体或抗体样分子)优先结合给定表位的程度使得它在一定程度上阻断参考抗体或抗原结合片段与所述表位的结合，则称结合分子竞争性抑制参考抗体或抗体样分子与所述表位的结合。竞争性抑制可以通过本领域已知的任何方法，例如竞争ELISA测定或OCTET测定来确定。可以称，结合分子竞争性抑制参考抗体或抗体样分子与给定表位的结合至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％。

如本文所用，术语“亲和力”是指单个表位与例如抗体或抗体样分子的一个或多个抗原结合结构域结合强度的量度。参见，例如，Harlow等人,Antibodies:A LaboratoryManual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第2版,1988)，第27至28页。如本文所用，术语“亲合力”是指抗原结合结构域群与抗原之间的复合物的整体稳定性。参见，例如，Harlow，第29至34页。亲合力与群中单个抗原结合结构域与特定表位的亲和力有关，并且与免疫球蛋白的价和抗原有关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复的表位结构的抗原(诸如聚合物)之间的相互作用将是高亲合力的一种相互作用。同样，具有四价、八价、十价或十二价的多聚体抗体与特定表位群之间的相互作用将是高亲合力的一种相互作用。二价单克隆抗体与在细胞表面上以高密度存在的受体之间的相互作用也将具有高亲合力。

如本文所公开的结合分子(例如，抗体或其片段、变体或衍生物)也可以根据其交叉反应性来描述或指定。如本文所用，术语“交叉反应性”是指对一种抗原具有特异性的结合分子(例如，抗体或其片段、变体或衍生物)与第二抗原反应的能力；两种不同抗原物质之间相关性的量度。因此，如果结合分子与诱导其形成的表位以外的表位结合，则其是交叉反应的。交叉反应表位通常含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下，可以实际上比原始表位更适合。

结合分子(例如，抗体或其片段、变体或衍生物)也可以根据其与抗原的结合亲和力来描述或指定。例如，结合分子可以不大于5x 10^-2M、10^-2M、5x 10^-3M、10^-3M、5x 10^-4M、10^{- 4}M、5x 10^-5M、10^-5M、5x 10^-6M、10^-6M、5x 10^-7M、10^-7M、5x 10^-8M、10^-8M、5x 10^-9M、10^-9M、5x 10^-10M、10^-10M、5x 10^-11M、10^-11M、5x 10^-12M、10^-12M、5x 10^-13M、10^-13M、5x 10^-14M、10^-14M、5x 10^{- 15}M或10^-15M的解离常数或KD与抗原结合。

包括单链抗体或其他抗原结合结构域的如本文提供的结合分子或抗体的抗原结合片段可以单独存在或与以下中的一种或多种组合存在：铰链区、CH1、CH2、CH3或CH4结构域、J链或分泌组分。还包括抗原结合片段，其可以包括足以结合抗原的一个或多个可变区与铰链区、CH1、CH2、CH3或CH4结构域、J链或分泌组分中的一种或多种的任何组合。结合分子(例如，抗体或或抗体样分子)可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。抗体可以是例如人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡的抗体。在另一个实施方案中，可变区可以是软骨鱼(condricthoid)来源(例如，来自鲨鱼)。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人免疫球蛋白文库或从一种或多种人免疫球蛋白的转基因动物中分离出的抗体，所述转基因动物可以在一些情况下表达内源性免疫球蛋白而在一些情况下不表达，如在下文并且例如在Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598中描述。根据本公开的实施方案，如本文所提供的IgM或IgM样抗体或IgM衍生的结合分子可以包含抗体的抗原结合片段(例如，scFv)，只要IgM或IgM样抗体能够形成多聚体，例如六聚体或五聚体。

如本文所用，术语“重链亚基”包含衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链亚基的结合分子(例如，抗体或抗体样分子)可以包含VH结构域以及CH1结构域、铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、μ尾片(μtp)或其变体或片段中的一种或多种。例如，除VH结构域之外，结合分子(例如，抗体、抗体样分子或其片段、变体或衍生物)还可以包含但不限于一种或多种抗体同种型和/或物种的CH1结构域、铰链、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或μ尾片(μtp)的任何组合。在某些实施方案中，除了VH结构域之外，结合分子(例如抗体、抗体样分子或其片段、变体或衍生物)还可以包含以下中的一种或多种：CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域、μ-尾片(μtp)结构域和J链(在IgM的情况下)，或以下中的一种或多种：CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域、α-尾片(αtp)结构域和J链(在IgA的情况下)。此外，提供于本公开中的结合分子(例如，抗体或抗体样分子)可以缺乏某些恒定区部分，例如CH1结构域、铰链、CH2结构域或CH3结构域的全部或部分。可以修饰这些结构域(例如，重链亚基)，使得其在氨基酸序列上与原始免疫球蛋白分子不同。根据本公开的实施方案，如本文所提供的IgM或IgM样抗体包括IgM重链恒定区的足够部分，以允许IgM或IgM样抗体形成多聚体(例如六聚体或五聚体)，例如IgM重链恒定区包括IgM重链恒定区的“多聚化片段”。

如本文所用，术语“轻链亚基”包括衍生自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。轻链亚基至少包含VL，并且还可以包含CL(例如，Cκ或Cλ)结构域。

结合分子(例如，抗体、抗体样分子、其抗原结合片段、变体或衍生物或其多聚化片段)可以根据其识别或特异性结合的抗原的一个或多个表位或部分来描述或指定。与抗体的抗原结合结构域特异性相互作用的靶抗原的部分是“表位”或“抗原决定簇”。靶抗原可以包含单个表位或两个或更多个表位，并且可以包含任何数量的表位，取决于抗原的尺寸、构象和类型。

如本文所用，术语“铰链区”包括在IgG、IgA和IgD重链中连接CH1结构域与CH2结构域的重链分子的部分。此铰链区包含大约25个氨基酸并且是柔性的，从而允许两个N末端抗原结合区独立地移动。

如本文所用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可以与第二巯基形成二硫键或与第二巯基桥联的巯基。

如本文所用，术语“嵌合抗体”是指其中免疫反应性区或位点获得自或来源于第一物种而恒定区(其可以是完整的、部分的或修饰的)获得自第二物种的抗体。在一些实施方案中，靶结合区或位点将来自非人来源(例如，小鼠或灵长类)并且恒定区是人的。

术语“多特异性抗体”或“双特异性抗体”是指在单个抗体分子内具有针对两种或更多种不同表位的抗原结合结构域的抗体或抗体样分子。除典型抗体结构之外，其他结合分子可以以两种结合特异性构建。

如本文所用，术语“工程化抗体”是指其中重链或轻链或两者中的可变结构域通过CDR或框架区中的一个或多个氨基酸的至少部分替代而改变的抗体。在某些实施方案中，可以将来自已知特异性的抗体的整个CDR移植到异源抗体的框架区中。尽管替代的CDR可以来源于与框架区所来源的抗体相同类别或甚至亚类的抗体，但是CDR也可以来源于不同类别的抗体，例如，来源于不同物种的抗体。其中将来自已知特异性的非人抗体的一个或多个“供体”CDR移植到人重链或轻链框架区中的工程化抗体在本文中称为“人源化抗体”。在某些实施方案中，并不是所有CDR都被来自供体可变区的完整CDR替代，但是供体的抗原结合能力仍然可以转移到受体可变结构域。人源化的示例性方法描述于美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370。

如本文所用，术语“工程化”包括通过合成方式(例如，通过重组技术、体外肽合成、通过肽、核酸或聚糖的酶促或化学偶联或这些技术的一些组合)对核酸或多肽分子进行操纵。

如本文所用，术语“连接的”、“融合的”或“融合”或其他语法等同物可以互换使用。这些术语是指通过无论什么方式(包括化学缀合或重组方式)将两种或更多种元件或组分连接在一起。“框内融合”是指以维持原始开放阅读框(ORF)的翻译阅读框的方式连接两个或更多个多核苷酸ORF以形成连续的更长ORF。因此，重组融合蛋白是含有两个或更多个区段的单一蛋白质，所述区段对应于原始ORF编码的多肽(所述区段在自然界中通常不会如此连接)。尽管阅读框因此在整个融合区段中是连续的，但区段可以通过例如框内接头序列在物理上或空间上分开。例如，编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸可以在框内融合，但是可以被编码至少一个免疫球蛋白框架区或另外的CDR区的多核苷酸分离，只要“融合的”CDR作为连续多肽的一部分被共翻译。术语“缔合”和语法等价物是指两个或更多个元件一起起作用，可以连接或融合，但也可以接近的相互作用，例如，在没有以任何特定方式连接的情况下进行反式相互作用。

在多肽的情境下，“线性序列”或“序列”是多肽中从氨基末端至羧基末端方向上的顺序的氨基酸，其中序列中彼此相邻的氨基酸在多肽的一级结构中是连续的。处在多肽另一部分的“氨基末端”或“N末端”的多肽部分是在顺序多肽链中出现较早的那部分。类似地，处在多肽另一部分的“羧基末端”或“C末端”的多肽部分是在顺序多肽链中出现较迟的那部分。例如，在典型的抗体中，可变结构域处在恒定区的“N末端”，并且恒定区处在可变结构域的“C末端”。

如本文所用，术语“表达”是指基因产生生化物质例如多肽的过程。所述过程包括基因在细胞内的功能存在的任何表现，包括但不限于基因敲除以及瞬时表达与稳定表达。其包括但不限于将基因转录成RNA，例如，信使RNA(mRNA)，以及将此种mRNA翻译成一个或多个多肽。如果最终期望产物是生化物质，则表达包括产生所述生化物质和任何前体。基因的表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可以是核酸(例如，由基因转录产生的信使RNA)或从转录物翻译的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰(例如，聚腺苷酸化)的核酸，或具有翻译后修饰(例如，甲基化、糖基化、脂质的添加、与其他蛋白质亚基的缔合、蛋白水解裂解等)的多肽。

诸如“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“治疗(to treat)”或“缓和(alleviating)”或“缓和(to alleviate)”的术语是指治愈、减缓、减轻现有诊断出的疾病、病理状况或病症的症状，和/或停止或减慢现有诊断出的疾病、病理状况或病症的进展。诸如“预防(prevent)”、“预防(prevention)”、“避免(avoid)”、“阻止(deterrence)”等的术语是指预防未诊断的目标疾病、病理状况或病症的发展的预防性(prophylactic)措施或预防性(preventative)措施。因此，“需要治疗的受试者”可以包括那些已经患有疾病、病理状况的受试者。术语“需要预防的受试者”可以包括那些容易患有疾病、病理状况或病症的受试者；以及那些要预防疾病、病理状况或病症的受试者。

如本文所用，术语“血清半衰期”或“血浆半衰期”是指施用后蛋白质或药物(例如，如本文所述的结合分子，诸如抗体或抗体样分子)的血清或血浆浓度降低50％所用的时间(例如，以分钟、小时或天为单位)。可以描述两个半衰期：阿尔法半衰期、α半衰期或t_1/2α，其是由于药物从中央室(例如，在静脉内递送情况下的血液)到外周室(例如，组织或器官)的重新分配过程引起的血浆浓度下降速率；和贝塔半衰期、β半衰期或t_1/2β，其是由于排泄或新陈代谢过程引起的下降速率。

如本文所用，术语“血浆药物浓度-时间曲线下面积”或“AUC”反映了在施用一定剂量的药物之后身体对药物的实际暴露并且以mg*h/L表示。此曲线下面积从时间0(t₀)至无穷大(∞)测量并且取决于药物从体内的消除速率和施用的剂量。

如本文所用，术语“平均停留时间”或“MRT”是指药物保留在体内的平均时间长度。

“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指期望进行诊断、预后或治疗的任何哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜、农场动物以及动物园、运动或宠物动物，诸如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、牛、熊等。

抗CD123抗原结合结构域

本文提供一种抗体或其抗原结合片段或衍生物，其包含特异性结合CD123的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH和VL分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:81和SEQ IDNO:83或SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83。

在某些实施方案中，如上文所提供的抗原结合结构域是Fv片段，例如，单链Fv片段(scFv)或二硫键连接的Fv片段(sdFv)。在某些实施方案中，如上文所提供的抗原结合结构域是scFv。

在某些实施方案中，如上文所提供的抗原结合结构域包含在如本文别处所述的抗体或抗体样分子中。在一些实施方案中，如上文所提供的抗原结合结构域包含在抗体或抗体样分子中，其中抗体或抗体样分子是多特异性的，例如，双特异性、三特异性或四特异性。在一些实施方案中，如本文所提供的多特异性抗体或抗体样分子特异性结合CD123和效应细胞上的靶标，例如，CD16或CD3。

在某些实施方案中，抗体或抗体样分子包含有包含两个抗原结合结构域的二价结合单元，其中至少一个抗原结合结构域特异性结合CD123。根据此实施方案，结合单元包含两条重链，每条重链包含重链恒定区或其片段或变体，并且其中结合单元的至少一个重链恒定区或其片段或变体与抗原结合结构域的提供的VH的拷贝缔合，例如，融合。在某些实施方案中，结合单元的重链恒定区或其片段或变体均与抗原结合结构域的提供的VH的拷贝缔合，例如，融合。在某些实施方案中，重链包含IgG重链恒定区或其片段或变体。各种IgG重链恒定区及其片段或变体是已知的，诸如描述于以下中的那些：Kang等人,2019,Experimental&Molecular Medicine,51:1-9；Brezski等人,2016,Current Opinion inImmunology,40:62-69；Okazaki等人,2004,Journal of Molecular Biology,336(5):1239-1249；Kang等人,2019,Front.Immunol.,10(562):1-11，以及Saxena等人,2016,Front.Immunol.,7(580):1-11。在某些实施方案中，二价结合单元还包含两条轻链，每条轻链包含轻链恒定区或其片段或变体。在某些实施方案中，至少一个轻链恒定区与抗原结合结构域的提供的VL的拷贝融合。在某些实施方案中，二价结合单元包含完整抗体，例如，完整的IgG抗体或F(ab')2片段。在某些实施方案中，结合单元的轻链恒定区或其片段或变体均与抗原结合结构域的提供的VL的拷贝融合。在某些实施方案中，二价结合单元包含完整抗体，例如，完整的IgG抗体或F(ab')2片段。在某些实施方案中，二价结合单元包含完整抗体，例如，完整的IgG重链恒定区。在某些实施方案中，二价结合单元是人IgG抗体、其片段或衍生物。

在某些实施方案中，所提供的抗原结合结构域包含在包含两个、五个或六个二价结合单元的多聚体抗体或抗体样分子中，其中抗体包含四个、八个、十个或十二个抗原结合结构域。在某些实施方案中，至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个抗原结合结构域特异性结合CD123。如本文所提供的，至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个抗原结合结构域包含如本文所提供的VH和VL氨基酸序列。根据这些实施方案，每个结合单元包含两条重链，每条重链包含IgA或IgM恒定区或其多聚化片段或变体，并且结合单元的至少一个重链恒定区与所提供的抗原结合结构域的提供的VH的拷贝缔合，例如，融合。在某些实施方案中，多聚体抗体或抗体样分子是人抗体。

在某些实施方案中，所提供的多聚体抗体或抗体样分子是二聚体或四聚体并且包含两个二价IgA结合单元以及J链或其功能片段或变体，其中每个结合单元包含两个IgA重链恒定区，例如，IgA1或IgA2重链恒定区，或其多聚化片段或变体。在某些实施方案中，二聚体或四聚体抗体或抗体样分子还可以包含分泌性组分或其片段或变体。在某些实施方案中，IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体各自包含Cα3结构域和α-尾片(αtp)结构域，并且还可以包含Cα1结构域、Cα2结构域、IgA铰链区或其任何组合。

在某些实施方案中，所提供的多聚体抗体或抗体样分子是六聚体或五聚体并且包含五个或六个二价IgM结合单元，其中每个结合单元包含两个IgM重链恒定区或其多聚化片段或变体。在某些实施方案中，IgM重链恒定区或其多聚化片段或变体各自包含Cμ4结构域和μ-尾片(μtp)结构域或其片段或变体，并且还可以包含Cμ1结构域、Cμ2结构域、Cμ3结构域或其任何组合。在某些实施方案中，多聚体抗体或抗体样分子是五聚体，并且还包含J链或其功能性片段或其功能性变体。在某些实施方案中，每个结合单元还包含两条轻链，每条轻链包含轻链恒定区或其片段或变体，并且其中至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个轻链恒定区与抗原结合结构域的提供的VL的拷贝融合。在某些实施方案中，多聚体抗体或抗体样分子是人抗体。

在某些实施方案中，如本文所提供的抗体或抗体样分子可以是多特异性的。

在某些实施方案中，所提供的抗原结合结构域或抗体或其片段或衍生物、包含抗原结合结构域的抗体样分子可以特异性结合人CD123。在某些实施方案中，所提供的抗原结合结构域或包含抗原结合结构域的抗体或片段或衍生物结合CD123，其亲和力的特征为不超过500nM、100nM、50.0nM、40.0nM、30.0nM、20.0nM、10.0nM、9.0nM、8.0nM、7.0nM、6.0nM、5.0nM、4.0nM、3.0nM、2.0nM、1.0nM、0.50nM、0.10nM、0.050nM、0.01nM、0.005nM或0.001nM的解离常数KD；并且其中CD123是人CD123。

IgM抗体、IgM样抗体和IgM衍生的结合分子

IgM是B细胞响应抗原刺激而产生的第一免疫球蛋白，并且以约1.5mg/ml自然存在于血清中，其中半衰期为约5天。IgM是五聚体或六聚体分子，并因此包含五个或六个结合单元。IgM结合单元通常包含两条轻链和两条重链。虽然IgG重链恒定区含有三个重链恒定结构域(CH1、CH2和CH3)，但是IgM的重链(μ)恒定区另外含有第四个恒定结构域(CH4)并包含C末端μ“尾片”(μtp)。虽然存在若干人类等位基因，但人IgM恒定区通常包含氨基酸序列SEQID NO:1(IMGT等位基因IGHM*03，与例如GenBank登录号pir||S37768相同)或SEQ ID NO:2(IMGT等位基因IGHM*04，与例如GenBank登录号sp|P01871.4相同)。人Cμ1区的范围是SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的约氨基酸5至约氨基酸102；人Cμ2区的范围是SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的约氨基酸114至约氨基酸205；人Cμ3区的范围是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的约氨基酸224至约氨基酸319；Cμ4区的范围是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的约氨基酸329至约氨基酸430；并且尾片的范围是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的约氨基酸431至约氨基酸453。

存在具有微小序列变异的人IgM恒定区的其他形式，包括但不限于GenBank登录号CAB37838.1和pir||MHHU。与本公开别处描述和要求保护的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2相对应的位置处的氨基酸取代、插入和/或缺失同样可以并入替代的人IgM序列中，以及并入到其他物种的IgM恒定区氨基酸序列中。

每个IgM重链恒定区与抗原结合结构域(例如，scFv)或抗原结合结构域的亚基(例如，VH区)缔合。

五个IgM结合单元可以与另一个小多肽链(J链)或其功能片段、变体或衍生物形成复合物，以形成五聚体IgM抗体或IgM样抗体。人J链的前体形式表示为SEQ ID NO:1。信号肽(带下划线)从SEQ ID NO:1的氨基酸1延伸至约氨基酸22，并且成熟的人J链从SEQ ID NO:1的约氨基酸23延伸至氨基酸159。成熟人J链具有氨基酸序列SEQ ID NO:2。

本文别处提供了示例性的变体和经修饰的J链。在没有J链的情况下，IgM抗体或IgM样抗体通常组装成六聚体，六聚体包含六个结合单元和至多十二个与结合单元缔合的抗原结合结构域。在有J链的情况下，IgM抗体或IgM样抗体通常组装成五聚体，所述五聚体包含五个结合单元和至多十个与结合单元缔合的抗原结合结构域，或者如果J链是包含一个或多个异源多肽(异源多肽可以是例如另外的、与J链缔合的抗原结合结构域)的经修饰的J链，则五聚体包含更多个抗原结合结构域。五个或六个IgM结合单元组装成五聚体或六聚体IgM抗体或IgM样抗体被认为涉及Cμ4与μ尾片结构域之间的相互作用。参见，例如，Braathen,R.等人,J.Biol.Chem.277:42755-42762(2002)。因此，本公开中提供的五聚体或六聚体IgM抗体或抗体样分子的恒定区通常至少包含Cμ4和/或μ尾片结构域。因此，IgM重链恒定区的“多聚化片段”至少包含Cμ4结构域和μtp结构域。IgM重链恒定区可以另外包含Cμ3结构域或其片段、Cμ2结构域或其片段和/或Cμ1结构域或其片段。在某些实施方案中，如本文所提供的结合分子(例如，IgM抗体或IgM样抗体)可以包含完整的IgM重(μ)链恒定结构域(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)或其多聚化变体、衍生物或类似物(例如，如本文所提供的)。

在某些实施方案中，本公开提供一种五聚体IgM或IgM样抗体，其包含五个二价结合单元，其中每个结合单元包含两个IgM重链恒定区或其多聚化片段或变体，IgM重链恒定区或其多聚化片段或变体各自与抗原结合结构域或抗原结合结构域的亚基缔合。在某些实施方案中，两个IgM重链恒定区为人重链恒定区。

在本文提供的IgM或IgM样抗体是五聚体的情况下，IgM或IgM样抗体通常还包含J链或其功能片段或变体。在一些实施方案中，J链是包含异源部分的修饰的J链，例如，与J链缔合的抗原结合结构域。在某些实施方案中，与J链缔合的抗原结合结构域特异性结合免疫效应细胞，例如，CD8+细胞毒性T细胞或NK细胞。在某些实施方案中，经修饰的J链包含一个或多个与其附接的异源部分，例如免疫刺激剂。在某些实施方案中，可以使J链突变以影响(例如，增强)本文提供的IgM或IgM样抗体的血清半衰期，如本公开中别处所讨论的。在某些实施方案中，可以使J链突变以影响糖基化，如本公开中别处所讨论的。

在一些实施方案中，本文提供的IgM或IgM样抗体是六聚体并且包含六个二价结合单元。在一些实施方案中，每个结合单元包含两个IgM重链恒定区或其多聚化片段或变体。

IgM重链恒定区可以包含以下中的一种或多种：Cμ1结构域或其片段或变体、Cμ2结构域或其片段或变体、Cμ3结构域或其片段或变体、Cμ4结构域或其片段或变体和/或μ尾片(μtp)或其片段或变体，前提条件是恒定区可以在IgM或IgM样抗体中发挥期望的功能，例如，与第二IgM恒定区缔合以形成具有一个、两个或更多个抗原结合结构域的结合单元，和/或与其他结合单元(以及在五聚体的情况下的J链)缔合以形成六聚体或五聚体。在某些实施方案中，在单个结合单元中的两个IgM重链恒定区或其片段或变体各自包含：Cμ4结构域或其片段或变体；μ尾片(μtp)或其片段或变体；或Cμ4结构域和μtp或其片段或变体的组合。在某些实施方案中，在单个结合单元中的两个IgM重链恒定区或其片段或变体各自还包含：Cμ3结构域或其片段或变体；Cμ2结构域或其片段或变体；Cμ1结构域或其片段或变体；或其任何组合。

在一些实施方案中，IgM或IgM样抗体的结合单元包含两条轻链。在一些实施方案中，IgM或IgM样抗体的结合单元包含两条轻链片段。在一些实施方案中，轻链是κ轻链。在一些实施方案中，轻链是λ轻链。在一些实施方案中，轻链是杂合κ和λ轻链。在一些实施方案中，每个结合单元包含两条免疫球蛋白轻链，每条轻链包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基末端的VL。

具有增强的血清半衰期的IgM抗体、IgM样抗体和IgM衍生的结合分子

本文提供的某些IgM衍生的多聚体结合分子(例如，抗体或抗体样分子)可以被修饰以具有增强的血清半衰期。可以增强IgM衍生的结合分子的血清半衰期的示例性IgM重链恒定区突变在美国专利号10,899,835中公开，其以引用的方式整体并入本文。例如，如本文所提供的IgM衍生的结合分子的变体IgM重链恒定区可以包含与野生型人IgM恒定区(例如，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2)的氨基酸S401、E402、E403、R344和/或E345相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代。“与野生型人IgM恒定区的氨基酸S401、E402、E403、R344和/或E345相对应的氨基酸”意指与人IgM恒定区中的S401、E402、E403、R344和/或E345同源的任何物种的IgM恒定区的序列中的氨基酸。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的S401、E402、E403、R344和/或E345相对应的氨基酸可以被任何氨基酸(例如，丙氨酸)取代。

具有降低的CDC活性的IgM抗体、IgM样抗体和IgM衍生的结合分子

相对于具有对应参考人IgM恒定区的、除赋予降低的CDC活性的突变之外都相同的参考IgM抗体或IgM样抗体，如本文所提供的某些IgM衍生的多聚体结合分子(例如，抗体或抗体样分子)可以被工程化以在补体存在的情况下表现出对细胞的降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。这些CDC突变可以与如本文所提供的阻断N-连接糖基化和/或赋予增加的血清半衰期的任何突变组合。“对应参考人IgM恒定区”意指人IgM恒定区或其部分(例如，Cμ3结构域)，其与变体IgM恒定区除了恒定区中的影响CDC活性的一个或多个修饰之外都相同。在某些实施方案中，变体人IgM恒定区相对于野生型人IgM恒定区(例如，描述于美国专利申请公开号US2021-0147567中，其以引用的方式整体并入本文)包含一个或多个氨基酸取代(例如，在Cμ3结构域中)。本领域的普通技术人员熟知用于测量CDC的测定，并且示例性测定描述于例如美国专利申请公开号2021-0147567中，其以引用的方式整体并入本文。

在某些实施方案中，赋予降低的CDC活性的变体人IgM恒定区包含与SEQ ID NO:1(人IgM恒定区等位基因IGHM*03)或SEQ ID NO:2(人IgM恒定区等位基因IGHM*04)的位置L310、P311、P313和/或K315处的野生型人IgM恒定区相对应的氨基酸取代。在某些实施方案中，赋予降低的CDC活性的变体人IgM恒定区包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置P311处的野生型人IgM恒定区相对应的氨基酸取代。在其他实施方案中，如本文所提供的变体IgM恒定区含有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置P313处的野生型人IgM恒定区相对应的氨基酸取代。在其他实施方案中，如本文所提供的变体IgM恒定区含有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置P311和/或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置P313处的野生型人IgM恒定区相对应的取代的组合。这些脯氨酸残基可以被任何氨基酸(例如，丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸)独立地取代。在某些实施方案中，赋予降低的CDC活性的变体人IgM恒定区包含与SEQID NO:1或SEQ ID NO:2的位置K315处的野生型人IgM恒定区相对应的氨基酸取代。赖氨酸残基可以被任何氨基酸(例如，丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸或天冬氨酸)独立地取代。在某些实施方案中，赋予降低的CDC活性的变体人IgM恒定区包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置K315处的野生型人IgM恒定区相对应的用天冬氨酸进行的氨基酸取代。在某些实施方案中，赋予降低的CDC活性的变体人IgM恒定区包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置L310处的野生型人IgM恒定区相对应的氨基酸取代。赖氨酸残基可以被任何氨基酸(例如，丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸或天冬氨酸)独立地取代。在某些实施方案中，赋予降低的CDC活性的变体人IgM恒定区包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置L310处的野生型人IgM恒定区相对应的用天冬氨酸进行的氨基酸取代。

糖修饰的IgM抗体、IgM样抗体和IgM衍生的结合分子

人和某些非人灵长类IgM恒定区通常包括五个(5个)自然存在的天冬酰胺(N)连接糖基化基序或位点。如本文所用，“N连接糖基化基序”包含氨基酸序列N-X₁-S/T或由其组成，其中N是天冬酰胺，X₁是除脯氨酸(P)之外的任何氨基酸，并且S/T是丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。聚糖附接到天冬酰胺残基的氮原子上。参见，例如，Drickamer K,Taylor ME(2006),Introduction to Glycobiology(第2版).Oxford University Press,USA。N连接糖基化基序出现在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的人IgM重链恒定区中，始于位置46(“N1”)、209(“N2”)、272(“N3”)、279(“N4”)和440(“N5”)。这五个基序在非人灵长类IgM重链恒定区中是保守的，并且五个基序中的四个在小鼠IgM重链恒定区中是保守的。因此，在一些实施方案中，如本文所提供的多聚体结合分子的IgM重链恒定区包含5个N连接糖基化基序：N1、N2、N3、N4和N5。在一些实施方案中，每个IgM重链恒定区上的至少三个N连接糖基化基序(例如，N1、N2和N3)被复合聚糖占据。

在某些实施方案中，至少一个、至少两个、至少三个或至少四个N-X₁-S/T基序可以包含阻止所述基序处的糖基化的氨基酸插入、缺失或取代。在某些实施方案中，IgM衍生的多聚体结合分子可以包含N1基序、N2基序、N3基序、N5基序或N1、N2、N3或N5基序中的两个或更多个、三个或更多个或全部四个的任何组合处的氨基酸插入、缺失或取代，其中氨基酸插入、缺失或取代阻止所述基序处的糖基化。在一些实施方案中，相对于野生型人IgM恒定区，IgM恒定区包含在SEQ ID NO:1(人IgM恒定区等位基因IGHM*03)或SEQ ID NO:2(人IgM恒定区等位基因IGHM*04)的位置46、209、272或440处的一个或多个取代。参见，例如，PCT申请公开号WO 2021/041250，其以引用的方式整体并入本文。

IgA抗体、IgA样抗体和IgA衍生的结合分子

IgA在粘膜免疫中起关键作用，并且组成产生的总免疫球蛋白的约15％。IgA可以是单体或多聚体，主要形成二聚体分子，但也可以组装成三聚体、四聚体和/或五聚体。参见，例如，de Sousa-Pereira,P.和J.M.Woof,Antibodies 8:57(2019)。

在一些实施方案中，多聚体结合分子是二聚体并且包含两个二价结合单元或其变体或片段。在一些实施方案中，多聚体结合分子是二聚体或四聚体，分别包含两个或四个二价结合单元或其变体或片段，并且还包含如本文所述的J链或其功能片段或变体。在一些实施方案中，多聚体结合分子是二聚体，包含两个二价结合单元或其变体或片段，并且还包含如本文所述的J链或其功能片段或变体，其中每个结合单元包含两个IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体。

在一些实施方案中，多聚体结合分子是四聚体并且包含四个二价结合单元或其变体或片段。在一些实施方案中，多聚体结合分子是四聚体，包含四个二价结合单元或其变体或片段，并且还包含如本文所述的J链或其功能片段或变体。在一些实施方案中，多聚体结合分子是四聚体，包含四个二价结合单元或其变体或片段，并且还包含如本文所述的J链或其功能片段或变体，其中每个结合单元包含两个IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体。

在某些实施方案中，本公开提供的多聚体结合分子是二聚体结合分子，其包含四个IgA重链恒定区或其多聚化片段，IgA重链恒定区或其多聚化片段各自与抗原结合结构域缔合，总共四个抗原结合结构域。如本文所提供的，二聚体IgA抗体、IgA衍生的结合分子或IgA样抗体包含两个结合单元以及J链，例如经修饰的J链，其包含与CD3结合的scFv抗体片段或与经修饰的J链融合的IL-15和/或IL-15受体-α寿司(sushi)结构域，如本文别处所述的。所提供的每个结合单元包含两个IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体。在某些实施方案中，多聚体结合分子的至少三个或所有四个抗原结合结构域与相同的靶抗原结合。在某些实施方案中，多聚体结合分子的至少三个或所有四个结合多肽是相同的。

二价IgA衍生的结合单元包含两个IgA重链恒定区，并且二聚体IgA衍生的结合分子包含两个结合单元。IgA含有以下重链恒定结构域：Cα1(或另选地CA1或CH1)、铰链区、Cα2(或另选地CA2或CH2)和Cα3(或另选地CA3或CH3)以及C末端“尾片”。人IgA具有两种亚型：IgA1和IgA2。人IgA1恒定区通常包含氨基酸序列SEQ ID NO:3。人Cα1结构域从SEQ ID NO:3的约氨基酸6延伸至约氨基酸98；人IgA1铰链区从SEQ ID NO:3的约氨基酸102延伸至约氨基酸124，人Cα2结构域从SEQ ID NO:3的约氨基酸125延伸至约氨基酸219，人Cα3结构域从SEQ ID NO:3的约氨基酸228延伸至约氨基酸330，并且尾片从SEQ ID NO:3的约氨基酸331延伸至约氨基酸352。人IgA2恒定区通常包含氨基酸序列SEQ ID NO:4。人Cα1结构域从SEQID NO:4的约氨基酸6延伸至约氨基酸98；人IgA2铰链区从SEQ ID NO:4的约氨基酸102延伸至约氨基酸111，人Cα2结构域从SEQ ID NO:4的约氨基酸113延伸至约氨基酸206，人Cα3结构域从SEQ ID NO:4的约氨基酸215延伸至约氨基酸317，并且尾片从SEQ ID NO:4的约氨基酸318延伸至约氨基酸340。

两个IgA结合单元可以与两条另外的多肽链：J链(例如，SEQ ID NO:7)和分泌组分(前体，SEQ ID NO:5，成熟，SEQ ID NO:5的约氨基酸19至约氨基酸764)形成复合物，以形成如本文所提供的二价分泌性IgA(sIgA)衍生的结合分子。两个IgA结合单元组装成二聚体IgA衍生的结合分子被认为涉及Cα3和尾片结构域。参见，例如，Braathen,R.等人,J.Biol.Chem.277:42755-42762(2002)。因此，本公开中提供的多聚化二聚体IgA衍生的结合分子通常包含至少包含Cα3和α尾片结构域的IgA恒定区。四个IgA结合单元同样可以与J链形成四聚体复合物。sIgA抗体也可以形成为更高级别的多聚体，例如四聚体。

IgA重链恒定区可以另外包含Cα2结构域或其片段、IgA铰链区或其片段、Cα1结构域或其片段和/或包括例如IgG铰链区的其他IgA(或其他免疫球蛋白，例如IgG)重链结构域。在某些实施方案中，如本文所提供的结合分子可以包含完整的IgA重(α)链恒定结构域(例如，SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4)或其变体、衍生物或类似物。在一些实施方案中，IgA重链恒定区或其多聚化片段是人IgA恒定区。

在某些实施方案中，如本文所提供的多聚体结合分子的每个结合单元包含两个IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体，每个IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体至少包含IgA Cα3结构域和IgA尾片结构域。在某些实施方案中，IgA重链恒定区还可以各自包含位于IgA Cα3结构域和IgA尾片结构域的N末端的IgA Cα2结构域。例如，IgA重链恒定区可以包含SEQ ID NO:3的氨基酸125至353或SEQ ID NO:4的氨基酸113至340。在某些实施方案中，IgA重链恒定区还可以各自包含位于IgA Cα2结构域的N末端的IgA或IgG铰链区。例如，IgA重链恒定区可以包含SEQ ID NO:3的氨基酸102至353或SEQ ID NO:4的氨基酸102至340。在某些实施方案中，IgA重链恒定区还可以各自包含位于IgA铰链区的N末端的IgA Cα1结构域。

在一些实施方案中，IgA抗体、IgA样抗体或其他IgA衍生的结合分子的每个结合单元包含两条轻链。在一些实施方案中，IgA抗体、IgA样抗体或其他IgA衍生的结合分子的每个结合单元包含两条片段轻链。在一些实施方案中，轻链是κ轻链。在一些实施方案中，轻链是λ轻链。在一些实施方案中，轻链是嵌合κ-λ轻链。在一些实施方案中，每个结合单元包含两条免疫球蛋白轻链，每条轻链包含位于免疫球蛋白轻链恒定区的氨基末端的VL。

经修饰的J链和/或变体J链

在某些实施方案中，本文提供的多聚体结合分子(例如，抗体或抗体样分子)包含J链或其功能片段或变体。在某些实施方案中，本文提供的多聚体结合分子是五聚体IgM抗体或IgM抗体样分子，并且包含J链或其功能片段或变体。在某些实施方案中，本文提供的多聚体结合分子是二聚体IgA抗体或IgA抗体样分子，并且包含J链或其功能片段或变体。在一些实施方案中，多聚体结合分子可以包含自然存在的J链，诸如成熟人J链序列(例如，SEQ IDNO:7)。在一些实施方案中，多聚体结合分子可以包含自然存在的J链的功能性片段或功能性变体。

在某些实施方案中，如本文所提供的五聚体IgM或IgM样抗体或二聚体IgA或IgA样抗体的J链可以例如通过引入一个异源部分或两个或更多个异源部分(例如，多肽)进行修饰，而不干扰IgM或IgM样抗体或IgA或IgA样抗体组装和结合其结合靶的能力。参见美国专利号9,951,134、10,975,147、10,400,038和10,618,978以及美国专利申请公开号US-2019-0185570，其各自以引用的方式整体并入本文。因此，如本文所提供的IgM或IgM样抗体或IgA或IgA样抗体，包括如本文别处所述的双特异性或多特异性IgM或IgM样抗体或IgA或IgA样抗体，可以包含经修饰的J链或其功能片段或变体，经修饰的J链或其功能片段或变体还包含异源部分，例如异源多肽，其被引入到J链或其片段或变体中。在某些实施方案中，异源部分可以是与J链或其片段或变体框内融合或化学缀合的肽或多肽。例如，异源多肽可以与J链或其功能片段或变体融合。在某些实施方案中，异源多肽经由接头(例如，由至少5个氨基酸但通常不超过25个氨基酸组成的肽接头)与J链或其功能片段或变体融合。在某些实施方案中，肽接头由以下组成：GGGGS(SEQ ID NO:9)、GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:10)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:11)、GGGGS GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:12)或GGGGSGGGGSGGGG SGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:13)。在某些实施方案中，异源部分可以是与J链缀合的化学部分。要附接到J链的异源部分可以包括但不限于：结合部分，例如抗体或其抗原结合片段，例如单链Fv(scF v)分子；可以增加IgM或IgM样抗体的半衰期的稳定肽；或化学部分诸如聚合物或细胞毒素。在一些实施方案中，异源部分包含可以增加结合分子(例如，人血清白蛋白(HSA)或HSA结合分子)的半衰期的稳定肽。

在一些实施方案中，经修饰的J链包含与J链缔合的抗原结合结构域，例如能够特异性结合靶抗原的多肽。在某些实施方案中，与J链缔合的抗原结合结构域可以是抗体或其抗原结合片段，如本文别处所述的。在某些实施方案中，与J链缔合的抗原结合结构域可以是来源于例如骆驼科或软骨鱼抗体的单链Fv(scFv)抗原结合结构域或单链抗原结合结构域。可以在任何允许与J链缔合的抗原结合结构域结合其结合靶而不干扰J链的功能或缔合的IgM或IgA抗体的功能的位置处将与J链缔合的抗原结合结构域引入到J链中。插入位置包括但不限于C末端处或其附近、N末端处或其附近或基于J-链的三维结构可接近的内部位置。在某些实施方案中，与J链缔合的抗原结合结构域可以被引入到SEQ ID NO:7的成熟人J链中，介于SEQ ID NO:7的半胱氨酸残基92与101之间。在另一个实施方案中，可以在糖基化位点处或附近将与J链缔合的抗原结合结构域引入到SEQ ID NO:7的人J链中。在另一个实施方案中，可以将与J链缔合的抗原结合结构域在距C末端约10个氨基酸残基以内或距N末端约10个氨基酸残基以内引入到SEQ ID NO:7的人J链中。如本文别处所述，本公开提供一种包含经修饰的J链的多聚体双特异性结合分子，其中经修饰的J链包含特异性结合免疫效应细胞(例如，T细胞，诸如CD4+T细胞或CD8+细胞毒性T细胞或NK细胞)的与J链缔合的抗原结合结构域。

在一些实施方案中，经修饰的J链还可以包含免疫刺激剂(ISA)，例如细胞因子(例如，白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15))或其受体结合片段或变体)，在某些实施方案中细胞因子可以经由结合或共价附接与其受体的一部分(例如，IL-15受体-α的寿司结构域)缔合。此类ISA详述于PCT公开号WO 2021/030688中，其以引用的方式整体并入本文。

在某些实施方案中，如本文所提供的IgM抗体、IgM样抗体、IgA抗体、IgA样抗体或IgM或IgA衍生的结合分子的J链是变体J链，其包含一个或多个可以改变例如本文提供的IgM抗体、IgM样抗体、IgA抗体、IgA样抗体或IgM或IgA衍生的结合分子的血清半衰期的氨基酸取代。例如，相对于除了变体J链中的一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入之外都相同的并且以相同方法对相同的动物物种施用的参考IgM衍生的结合分子，某些氨基酸取代、缺失或插入可以导致IgM衍生的结合分子在对受试动物施用时表现出增加的血清半衰期。在某些实施方案中，变体J链相对于参考J链可以包含一个、两个、三个或四个单一氨基酸取代、缺失或插入。

在一些实施方案中，多聚体结合分子可以包含变体J链序列，诸如本文所述的具有降低的糖基化或与一种或多种聚合Ig受体(例如，pIgR、Fcα-μ受体(FcαμR)或Fcμ受体(FcμR))的降低的结合的变体序列。参见，例如，美国专利号10,899,835，其以引用的方式整体并入本文。在某些实施方案中，变体J链可以包含与成熟野生型人J链(SEQ ID NO:7)的氨基酸Y102相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代。“与成熟野生型人J链的氨基酸Y102相对应的氨基酸”意指与人J链中Y102同源的任何物种的J链序列中的氨基酸。参见美国专利号10,899,835，其以引用的方式整体并入本文。与SEQ ID NO:7中的Y102相对应的位置在至少43种其他物种的J链氨基酸序列中是保守的。参见美国专利号9,951,134的图4，其以引用的方式并入本文。与SEQ ID NO:7的Y102相对应的位置处的某些突变可以抑制某些免疫球蛋白受体(例如，人或鼠Fcαμ受体、鼠Fcμ受体和/或人或鼠聚合物Ig受体(pIg受体))与包含突变J链的IgM五聚体结合。相比于除取代之外都相同并且以相同的方式对相同的物种施用的对应抗体、抗体样分子或结合分子，包含与SEQ ID NO:7的Y102相对应的氨基酸处的突变的IgM抗体、IgM样抗体和IgM衍生的结合分子在对动物施用时具有改善的血清半衰期。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:7的Y102相对应的氨基酸可以被任何氨基酸取代。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:7的Y102相对应的氨基酸可以被丙氨酸(A)、丝氨酸(S)或精氨酸(R)取代。在特定的实施方案中，与SEQ ID NO:7的Y102相对应的氨基酸可以被丙氨酸取代。在特定的实施方案中，J链或其功能片段或变体是变体人J链并且包含氨基酸序列SEQ ID NO:8(在本文中称为“J*”的J链)。

野生型J链通常包括一个N连接糖基化位点。在某些实施方案中，如本文所提供的多聚体结合分子的变体J链或其功能片段包含天冬酰胺(N)连接糖基化基序N-X₁-S/T(例如，始于与成熟人J链(SEQ ID NO:7)或J*(SEQ ID NO:8)的氨基酸49(N6基序)相对应的氨基酸位置处)内的突变，其中N是天冬酰胺，X₁是除脯氨酸之外的任何氨基酸，并且S/T是丝氨酸或苏氨酸，并且其中突变阻止所述基序处的糖基化。如美国专利号10,899,835中所展示的，阻止此位点处的糖基化的突变可以导致在对受试动物施用时，如本文所提供的多聚体结合分子相对于除了阻止变体J链中的糖基化的一个或多个突变之外都相同的并且以相同方式对相同的动物物种施用的参考多聚体结合分子表现出增加的血清半衰期。

例如，在某些实施方案中，如本文所提供的包含J链的结合分子的变体J链或其功能片段可以包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸N49或氨基酸S51相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代，前提条件是与S51相对应的氨基酸不被苏氨酸(T)取代，或其中变体J链包含与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸N49和S51两者相对应的氨基酸位置处的氨基酸取代。在某些实施方案中，与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的N49相对应的位置被任何氨基酸(例如，丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、丝氨酸(S)或天冬氨酸(D))取代。在特定的实施方案中，与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的N49相对应的位置可以被丙氨酸(A)取代。在另一个实施方案中，与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的N49相对应的位置可以被天冬氨酸(D)取代。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的S51相对应的位置被丙氨酸(A)或甘氨酸(G)取代。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的S51相对应的位置被丙氨酸(A)取代。

具有结合免疫效应细胞的经修饰的J链的多聚体双特异性或多特异性抗CD123结合分子。

本公开提供一种用于治疗癌症(例如血液学癌症，例如急性髓系白血病(AML))的多聚体、双特异性或多特异性结合分子，其中结合分子是双特异性的并且以高亲合力靶向癌细胞上的CD123(IL-3Rα)，同时还经由单个抗原结合结构域靶向免疫效应细胞(例如，CD4+或CD8+T细胞或NK细胞)，从而有助于效应细胞介导的癌细胞杀伤，同时最大限度地减少细胞因子的过度释放。在某些实施方案中，多聚体、双特异性抗CD123结合分子是抗CD123 x抗CD3结合分子。

因此，本公开提供一种多聚体、双特异性或多特异性结合分子，其包含两个IgA或IgA样二价结合单元或五个IgM或IgM样二价结合单元以及经修饰的J链，其中经修饰的J链至少包含野生型J链或其功能片段或变体和特异性结合免疫效应细胞的与J链缔合的抗原结合结构域。每个结合单元包含两条抗体重链，每条重链包含IgA、IgA样、IgM或IgM样重链恒定区或其多聚化片段(如本文别处所述)并至少包含与结合单元缔合的抗原结合结构域的重链可变区(VH)部分。与结合单元缔合的抗原结合结构域中的至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或全部十个特异性结合CD123。如本文所提供的结合分子可以诱导免疫效应细胞依赖性细胞(例如，表达CD123的癌细胞)杀伤。

在某些实施方案中，本文提供的结合分子的经修饰的J链包含野生型J链或其片段的变体，其中相对于野生型J链，所述变体包含一个或多个可以影响结合分子的血清半衰期的单一氨基酸取代、缺失或插入；并且其中在对动物施用时，结合分子相对于除J链中的一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入之外都相同并且以相同的方式对相同的动物物种施用的参考结合分子表现出增加的血清半衰期。例如，在某些实施方案中，J链是包含氨基酸序列SEQ ID NO:8(“J*”)的变体人J链。

在某些实施方案中，所提供的结合分子的与J链缔合的抗原结合结构域包含抗体或其片段。在某些实施方案中，抗体片段是单链Fv(scFv)。scFv可以与J链或片段或变体(例如，J*)融合或化学缀合。在某些实施方案中，scFv经由肽接头(例如，SEQ ID NO:9至13)与J链融合。如本公开中别处指出的，scFv可以以任何方式与J链或其片段或变体融合，只要J链的功能(即，与IgM、IgM样、IgA或IgA样结合单元组装以形成二聚体或五聚体)不被影响。例如，scFv可以与J链或其片段或变体的N末端融合、与J链或其片段或变体的C末端融合或与J链或其片段或变体的N末端和C末端两者融合。

由经修饰的J链的抗原结合结构域结合的免疫效应细胞可以是在与CD123靶向的癌细胞缔合时赋予有益效果(例如，介导基于细胞的CD123+癌细胞杀伤)的任何免疫效应细胞。在某些实施方案中，免疫效应细胞可以是但不限于：T细胞(例如，CD4+T细胞、CD8+T细胞、NKT细胞或γδT细胞)、B细胞、浆细胞、巨噬细胞、树突状细胞或自然杀伤(NK)细胞。在某些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞，例如CD4+或CD8+T细胞。在某些实施方案中，免疫效应细胞是CD8+细胞毒性T细胞。在某些实施方案中，免疫效应细胞是NK细胞。

在免疫效应细胞是T细胞(例如CD8+T细胞)的情况下，与J链缔合的抗体或其片段(例如，scFv)可以与T细胞表面抗原CD3(例如，CD3ε)特异性结合。在某些实施方案中，抗CD3scFv包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH包含VH互补决定区VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，并且VL包含VL互补决定区VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41；SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65；或SEQ ID NO:67、SEQID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73；具有零个、一个或两个氨基酸取代。在一些实施方案中，scFv分别包含VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:18和SEQID NO:22、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34和SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:62或SEQ IDNO:66和SEQ ID NO:70。

在某些其他实施方案中，免疫效应细胞是NK细胞，并且与J链缔合的抗体或其片段(例如，scFv)可以特异性结合CD16或CD56。许多CD16和CD56 scFv是已知的，诸如公开于以下中的那些：美国专利号9,035,026、9,701,750、10,730,941、11,001,633，McCall等人,1999.Mol Immunol.7:433-445。

如本文所提供的多聚体双特异性抗CD123结合分子(例如，抗CD123 x抗CD3结合分子)的经修饰的J链可以被进一步修饰以包含附接到J链的另外的异源部分。示例性部分描述于例如美国专利号9,951,134和美国专利申请公开号US2019-0185570和美国专利号10,618,978以及PCT公开号WO2021/030688中，所有这些以引用的方式整体并入本文。在某些实施方案中，如本文所提供的多聚体双特异性抗CD123结合分子(例如，抗CD123 x抗CD3结合分子)的经修饰的J链还可以包含与J链或其片段或变体融合或化学缀合的免疫刺激剂(“ISA”)。例如，ISA可以包含细胞因子或其受体结合片段或变体。在特定的实施方案中，与J链缔合的ISA可以包含：(a)白介素-15(IL-15)蛋白或其受体结合片段或变体(“I”)；和(b)白介素-15受体-α(IL-15Rα)片段(“R”)，其包含能够与I缔合的寿司结构域或其变体；其中J链或其片段或变体与I和R中的至少一者或I和R两者缔合为融合蛋白，并且其中I和R可以缔合以用作ISA。在某些实施方案中，ISA可以经由肽接头与J链融合。

多核苷酸、载体和宿主细胞

本公开还提供了一种多核苷酸，例如，分离的、重组的和/或非自然存在的多核苷酸，其包含编码如本文所提供的抗原结合结构域或抗体或抗体样分子(例如，如本文所提供的二聚体、六聚体或五聚体抗体或抗体样分子)的多肽亚基的核酸序列。“多肽亚基”意指可以独立翻译的抗体或抗体样分子的一部分，即结合单元或抗原结合结构域。实例包括但不限于：抗体可变结构域，例如，VH或VL；J链，包括如本文所提供的经修饰的J链；分泌组分；单链Fv；抗体重链；抗体轻链；抗体重链恒定区；抗体轻链恒定区；和/或其任何片段、变体或衍生物。

在某些实施方案中，多核苷酸包含编码本文所述的结合分子的多肽亚基的核酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸编码包含结合分子的重链恒定区和结合结构域的至少抗体VH部分的多肽亚基。在一些实施方案中，多核苷酸编码包含结合分子的重链的多肽亚基。在一些实施方案中，多核苷酸编码包含VH的多肽亚基，所述VH包含HCDR1、HCDR2和HCDR3区，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ IDNO:80、SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82的氨基酸序列。

在一些实施方案中，多核苷酸编码包含结合分子的轻链恒定区和结合结构域的至少抗体VL部分的多肽亚基。在一些实施方案中，多核苷酸编码包含结合分子的轻链的多肽亚基。在一些实施方案中，多核苷酸编码包含VL的多肽亚基，所述VL包含LCDR1、LCDR2和LCDR3区，其中LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO:79或SEQ ID NO:83的氨基酸序列。

在某些实施方案中，多肽亚基可以包含IgM重链恒定区或IgM样重链恒定区或其多聚化片段，或IgA重链恒定区或IgA样重链恒定区或其多聚化片段，其与抗原结合结构域或其亚基融合，例如与抗原结合结构域的VH部分或抗原结合结构域的VL部分融合，所述各物都如本文所提供。在某些实施方案中，多核苷酸可以编码包含以下的多肽亚基：人IgM重链恒定区、人IgM样重链恒定区、人IgA重链恒定区、人IgA样重链恒定区或它们的多聚化片段(例如，SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4)，这些中的任一者都与抗原结合结构域或其亚基(例如，VH的C末端)缔合，例如，融合。

为了形成特异性结合CD123的抗体的抗原结合结构域或可变区，可以将所提供的多核苷酸插入表达载体模板中，例如，对于单体抗体，例如，IgG抗体，或对于IgM和/或IgA结构，从而产生包含单个结合单元的单体抗体，或其具有至少两个二价结合单元的多聚体抗体或多聚化片段或衍生物。简而言之，编码重链和轻链可变结构域序列的核酸序列可以从现有分子合成或扩增，并以正确的取向且在框内插入载体，使得在表达时，载体将产生全长重链或轻链。可用于这些目的的载体是本领域已知的。此类载体还可以包含实现所需链表达需要的增强子和其他序列。可以使用多个载体或单个载体。这些载体被转染到宿主细胞中，然后链被表达和纯化。表达后，链形成功能齐全的多聚体结合分子，如文献中所报道的那样。然后可以通过标准方法纯化完全组装的多聚体结合分子。如果需要的话，表达和纯化过程可以以商业规模进行。

本公开还提供了包含两种或更多种多核苷酸的组合物，其中两种或更多种多核苷酸可以共同编码抗原结合结构域或抗体或抗体样分子，例如，如本文所述的单体、二聚体、六聚体或五聚体抗体。在某些实施方案中，组合物可以包含编码IgG、IgM和/或IgA重链(例如，如上所述的人IgG、IgM或IgA重链，其中IgG、IgM和/或IgA重链至少包含如本文所提供的CD123抗原结合结构域的提供的VH)或其片段的多核苷酸，和编码轻链(例如，至少包含如本文所提供的CD123抗原结合结构域的提供的VL的人κ或λ轻链)或其片段的多核苷酸。所提供的多核苷酸组合物还可以包含编码J链(例如，人J链或其片段、变体或衍生物)的多核苷酸。在某些实施方案中，构成如本文所提供的组合物的多核苷酸可以位于两个、三个或更多个单独的载体(例如，表达载体)上。此类载体由本公开提供。在某些实施方案中，构成如本文所提供的组合物的两个或更多个多核苷酸可以位于单个载体(例如，表达载体)上。此种载体由本公开提供。

在某些实施方案中，本公开提供一种组合物，其包含两个、三个或更多个如本文所提供的多核苷酸，其中多核苷酸可以一起编码如本文所提供的抗CD123结合分子，例如，多聚体双特异性抗CD123结合分子，例如，抗CD123 x抗CD3结合分子。在某些实施方案中，多核苷酸可以位于单独的载体上。在某些实施方案中，多核苷酸中的两个或更多个可以位于同一载体上。此类载体同样由本公开提供。

本公开还提供一种宿主细胞(例如，原核或真核宿主细胞)，其包含：编码如本文所提供的抗CD123结合分子(例如，多聚体双特异性抗CD123结合分子，例如，抗CD123 x抗CD3结合分子)或其任何亚基的一个多核苷酸或两个或更多个多核苷酸；如本文所提供的多核苷酸组合物；或共同编码如本文所提供的结合分子或其任何亚基的一个载体或两个、三个或更多个载体。

在相关实施方案中，本公开提供一种产生如本公开所提供的多聚体结合分子的方法，其中方法包括培养如本文所提供的宿主细胞和回收多聚体结合分子。

使用方法

本公开还提供一种治疗需要治疗的受试者的疾病或病症(例如，癌症或其他恶性肿瘤，例如，血液学癌症或恶性肿瘤)的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的如本文所提供的抗CD123抗体或其抗原结合片段或衍生物，例如，抗CD123 x抗CD3抗体。“治疗有效剂量或量”或“有效量”意指结合分子在施用时于受试者中产生积极反应(例如，肿瘤细胞杀伤)的量。

在某些实施方案中，待治疗的癌症可以是其中恶性细胞表达或过表达CD123的任何癌症。例如，癌症可以是急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性髓系白血病(CML)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B细胞ALL)、经典型霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、系统性肥大细胞增多症或浆细胞样树突状细胞白血病。

用于治疗癌症的组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施用方式、靶位点、受试者的生理状态、受试者是人类还是动物、所施用的其他药物以及治疗是预防性还是治疗性。通常，受试者是人，但是也可治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。

待治疗的受试者可以是任何需要治疗的哺乳动物，在某些实施方案中，受试者是人受试者。

以其最简单的形式，待向受试者施用的制剂是以常规剂型施用的如本文所提供的抗CD123抗体或其抗原结合片段或衍生物，例如，抗CD123 x抗CD3抗体，其可以与如本文别处所述的药物赋形剂、载剂或稀释剂组合。

可以通过任何合适的方法来施用本公开的组合物，例如，胃肠外、心室内、口服、通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或经由植入式贮存器施用。如本文所用的术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。

药物组合物和施用方法

根据本公开，本领域的技术人员熟知或容易地确定制备如本文所提供的抗CD123抗体或其抗原结合片段或衍生物，例如，抗CD123 x抗CD3抗体和将其施用于对其有需要的受试者的方法。施用途径可以是例如瘤内、口服、胃肠外、吸入或局部施用。如本文所用的术语胃肠外包括，例如，静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道施用。虽然这些施用形式被设想为合适的形式，但是施用形式的另一个实例将是用于注射的溶液，用于肿瘤内、静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。合适的药物组合物可以包含缓冲液(例如，乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如，聚山梨酯)、任选地稳定剂(例如，人白蛋白)等。

如本文所讨论的，可以以药学有效量施用如本文所提供的抗CD123抗体或其抗原结合片段或衍生物，例如，抗CD123 x抗CD3抗体，用于治疗对其有需要的受试者。在这方面，应当理解，可配制所公开的抗体或其抗原结合片段或衍生物，以有利于施用和促进活性剂的稳定性。因此，药物组合物可以包含药学上可接受的无毒无菌载剂(诸如生理盐水)、无毒缓冲液、防腐剂等。如本文所提供的抗体或其抗原结合片段或衍生物的药学有效量意指足以实现与靶标的有效结合并实现治疗益处的量。合适的制剂在Remington'sPharmaceutical Sciences,例如,第21版(Lippincott Williams&Wilkins)(2005)中描述。

本文提供的某些药物组合物可以以可接受的剂型口服施用，所述剂型包括例如，胶囊、片剂、水性混悬液或溶液。某些药物组合物还可以通过鼻气雾剂或吸入来施用。采用苄醇或其他合适的防腐剂、增强生物利用率的吸附促进剂和/或其他常规稳定剂或分散剂可以将此类组合物制备成盐水中的溶液。

可以与载剂材料组合以产生单一剂型的抗CD123抗体或抗体样分子(例如，抗CD123 x抗CD3抗体)的量将根据例如所治疗的受试者和特定施用模式而变化。组合物可以作为单剂量、多剂量或以输注的形式在确立的时间段内施用。还可以调整剂量方案以提供最佳的期望反应(例如，治疗反应或预防反应)。

与本公开的范围一致，可以以足以产生治疗效果的量向需要治疗的受试者施用如本文所提供的抗CD123抗体或抗体样分子(例如，抗CD123 x抗CD3抗体)。可以以常规剂型向受试者施用如本文所提供的抗CD123抗体或抗体样分子(例如，抗CD123 x抗CD3抗体)，所述常规剂型通过根据已知技术将本公开的抗体或抗体样分子与常规的药学上可接受的载剂或稀释剂组合来制备。药学上可接受的载剂或稀释剂的形式和特性可以由与其组合的活性成分的量、施用途径和其他熟知的变量决定。

本公开还提供如本文所提供的抗CD123抗体或抗体样分子(例如，抗CD123 x抗CD3抗体)在制造用于治疗、预防或控制癌症或其他恶性肿瘤的药物中的用途。本公开还提供在治疗、预防或控制癌症中使用的如本文所提供的抗CD123抗体或抗体样分子，例如，抗CD123x抗CD3结合分子。

除非另外指明，否则本公开采用本领域的技术范围内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。此类技术在文献中得到了充分的解释。参见，例如，Green和Sambrook编(2012)Molecular Cloning A LaboratoryManual(第4版；Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Sambrook等人编(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(Cold Springs Harbor Laboratory,NY)；D.N.Glover和B.D.Hames编,(1995)DNA Cloning第2版(IRL Press),第1-4卷；Gait编(1990)Oligonucleotide Synthesis(IRL Press)；Mullis等人美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编(1985)Nucleic Acid Hybridization(IRL Press)；Hames和Higgins编(1984)Transcription And Translation(IRL Press)；Freshney(2016)Culture OfAnimal Cells,第7版(Wiley-Blackwell)；Woodward,J.,Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press)(1985)；Perbal(1988)APractical Guide To Molecular Cloning；第2版(Wiley-Interscience)；Miller和Calos编(1987)Gene Transfer Vectors For MammalianCells,(Cold Spring Harbor Laboratory)；S.C.Makrides(2003)Gene Transfer andExpression in Mammalian Cells(Elsevier Science)；Methods in Enzymology,第151-155卷(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Mayer和Walker编(1987)Immunochemical Methodsin Cell and Molecular Biology(Academic Press,London)；Weir和Blackwell编；以及Ausubel等人(1995)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons)。

抗体工程化的一般原理提出于，例如，Strohl,W.R.和L.M.Strohl(2012),Therapeutic Antibody Engineering(Woodhead Publishing)中。蛋白质工程化的一般原理提出于，例如，Park和Cochran编(2009),Protein Engineering and Design(CDC Press)中。免疫学的一般原理提出于，例如，Abbas和Lichtman(2017)Cellular and MolecularImmunology第9版(Elsevier)中。此外，可以遵循本领域中已知的免疫学标准方法，例如Current Protocols in Immunology(Wiley Online Library)；Wild,D.(2013),TheImmunoassay Handbook第4版(Elsevier Science)；Greenfield编(2013),Antibodies,aLaboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Press)；以及Ossipow和Fischer编,(2014),Monoclonal Antibodies:Methods and Protocols(Humana Press)中的方法。

上文引用的所有参考文献以及本文引用的所有参考文献均以引用的方式整体并入本文。

以说明而非限制的方式提供以下实施例。

示例性实施方案

提供的实施方案包括：

实施方案1.一种抗体或其抗原结合片段或衍生物，其包含特异性结合CD123的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH和VL分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:81和SEQ IDNO:83以及SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83。

实施方案2.如实施方案1所述的抗体或其片段或衍生物，其中所述VH和VL分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:79。

实施方案3.如实施方案1或实施方案2所述的抗体或其片段或衍生物，其是多聚体抗体，包含五个、六个或两个二价结合单元和十个、十二个或四个抗原结合结构域，其中至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个抗原结合结构域特异性结合CD123；其中每个结合单元包含两条重链，每条重链包含IgM或IgA恒定区或其多聚化片段或变体，并且其中所述多聚体抗体的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个重链恒定区与所述VH的拷贝缔合。

实施方案4.如实施方案1或实施方案2所述的抗体或其片段或衍生物，其包含有包含两个抗原结合结构域的单个二价结合单元，其中至少一个抗原结合结构域特异性结合CD123，其中所述结合单元包含两条重链，每条重链包含重链恒定区或其片段或变体，并且其中所述结合单元的至少一个重链恒定区或其片段或变体与所述VH的拷贝缔合。

实施方案5.如实施方案4所述的抗体或其片段或衍生物，其中所述重链包含IgG重链恒定区或其片段或变体。

实施方案6.如实施方案1或实施方案2所述的抗体或其片段或衍生物，其是Fv片段、单链Fv片段(scFv)或二硫键连接的Fv片段(sdFv)。

实施方案7.如实施方案1至6中任一项所述的抗体或其片段或衍生物，其是多特异性的。

实施方案8.如实施方案7所述的抗体或其片段或衍生物，其是双特异性的。

实施方案9.如实施方案7或实施方案8所述的抗体或其片段或衍生物，其可以结合CD3。

实施方案10.如实施方案1至9中任一项所述的抗体或其片段或衍生物，其可以特异性结合人CD123。

实施方案11.如实施方案10所述的抗体或其片段或衍生物，其以特征为解离常数KD不超过500nM、100nM、50.0nM、40.0nM、30.0nM、20.0nM、10.0nM、9.0nM、8.0nM、7.0nM、6.0nM、5.0nM、4.0nM、3.0nM、2.0nM、1.0nM、0.50nM、0.10nM、0.050nM、0.01nM、0.005nM或0.001nM的亲和力特异性结合人CD123。

实施方案12.一种多聚体抗体，其包含五个、六个或两个二价结合单元和十个、十二个或四个抗原结合结构域，其中至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个抗原结合结构域特异性结合CD123；其中抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中VH和VL分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:76和SEQ IDNO:79、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80和SEQID NO:83、SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:83以及SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83，其中每个结合单元包含两条重链，每条重链包含IgM或IgA恒定区或其多聚化片段或变体，并且其中多聚体抗体的至少三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个重链恒定区与VH的拷贝缔合。

实施方案13.如实施方案12所述的多聚体抗体，其中VH和VL分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:79。

实施方案14.如实施方案12或实施方案13所述的多聚体抗体，其为五聚体或六聚体并且包含五个或六个二价IgM结合单元，其中每个结合单元包含Cμ4结构域和μ-尾片(μtp)结构域或其多聚化片段或变体。

实施方案15.如实施方案14所述的多聚体抗体，其中所述IgM重链恒定区或其多聚化片段或变体各自还包含Cμ1结构域、Cμ2结构域、Cμ3结构域或其任何组合。

实施方案16.如实施方案12至15中任一项所述的多聚体抗体，其中每个IgM重链恒定区是人IgM恒定区或其多聚化变体或片段，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或其多聚化变体或片段。

实施方案17.如实施方案15或实施方案16所述的多聚体抗体，其包含变体人IgM恒定区，其中所述多聚体抗体相对于包含有包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的IgM重链恒定区的多聚体抗体具有降低的CDC活性。

实施方案18.如实施方案17所述的多聚体抗体，其中每个变体人IgM恒定区包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置P311相对应的氨基酸取代、与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的位置P313相对应的氨基酸取代，或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的位置P311和P313相对应的氨基酸取代。

实施方案19.如实施方案15至18中任一项所述的多聚体抗体，其中每个IgM重链恒定区或其多聚化变体或片段是变体人IgM恒定区，其相对于与所述变体IgM重链恒定区除一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入之外都相同的参考IgM重链恒定区具有一个或多个单一氨基酸取代、缺失或插入；并且其中在施用于受试动物时，所述多聚体抗体相对于包含所述参考IgM重链恒定区的以相同方式施用于相同动物物种的多聚体抗体表现出增加的血清半衰期。

实施方案20.如实施方案19所述的多聚体抗体，其中所述变体IgM重链恒定区包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸E345、S401、E402或E403相对应的一个或多个氨基酸位置处的氨基酸取代。

实施方案21.如实施方案15至20中任一项所述的多聚体抗体，其中所述IgM重链恒定区或其多聚化变体或片段各自与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸位置N46、N209、N272或N440相对应的一个或多个单一氨基酸取代，并且其中所述一个或多个单一氨基酸取代防止天冬酰胺(N)-连接的糖基化。

实施方案22.如实施方案12至21中任一项所述的多聚体抗体，其中每个重链恒定区或其多聚化片段或变体与所述VH的拷贝缔合。

实施方案23.如实施方案12至22中任一项所述的多聚体抗体，其中每个结合单元还包含两条轻链，每条轻链包含轻链恒定区或其片段或变体，并且其中至少三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个轻链恒定区或其片段或变体与所述VL的拷贝缔合。

实施方案24.如实施方案23所述的多聚体抗体，其中每个轻链恒定区或其片段或变体与所述VL的拷贝缔合。

实施方案25.如实施方案14至20中任一项所述的多聚体抗体，其为五聚体，并且还包含J链或其片段或其变体。

实施方案26.如实施方案12或实施方案13所述的多聚体抗体，其为二聚体并且包含两个二价IgA结合单元以及J链或其片段或变体，其中每个结合单元包含Cα3结构域和α-尾片(αtp)结构域。

实施方案27.如实施方案26所述的多聚体抗体，其中所述J链或其片段或变体是包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或其片段或其变体的成熟人J链。

实施方案28.如实施方案26或实施方案27所述的多聚体抗体，其中所述IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体各自还包含Cα1结构域、Cα2结构域、IgA铰链区或其任何组合。

实施方案29.如实施方案28所述的多聚体抗体，其中所述IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体是IgA1重链恒定区或其多聚化片段或变体。

实施方案30.如实施方案29所述的多聚体抗体，其中所述IgA重链恒定区包含SEQID NO:3。

实施方案31.如实施方案28所述的多聚体抗体，其中所述IgA重链恒定区或其多聚化片段或变体是IgA2重链或其多聚化片段或变体。

实施方案32.如实施方案31所述的多聚体抗体，其中所述IgA重链恒定区包含SEQID NO:4。

实施方案33.如实施方案25至32中任一项所述的多聚体抗体，其还包含分泌性组分或其片段或变体。

实施方案34.如实施方案12至33中任一项所述的多聚体抗体，其是多特异性的。

实施方案35.如实施方案34所述的多聚体抗体，其是双特异性的。

实施方案36.如实施方案34或实施方案35所述的多聚体抗体，其可以结合CD3。

实施方案37.如实施方案25所述的多聚体抗体，其中所述J链或其片段或变体是包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或其片段或其变体的成熟人J链。

实施方案38.如实施方案37所述的多聚体抗体，其中所述变体J链或其片段是在与SEQ ID NO:7的氨基酸Y102相对应的氨基酸位置处包含氨基酸取代的变体J链，并且其中在施用于动物时，包含变体J链的IgM抗体相对于除了J链中的氨基酸取代之外都相同的，并且以相同的方式施用于相同动物物种的参考IgM抗体表现出增加的血清半衰期。

实施方案39.如实施方案38所述的多聚体抗体，其中与SEQ ID NO:7的Y102相对应的氨基酸被丙氨酸(A)取代。

实施方案40.如实施方案39所述的多聚体抗体，其中所述变体J链包含氨基酸序列SEQ ID NO:8。

实施方案41.如实施方案25至40中任一项所述的多聚体抗体，其中所述J链或其片段或变体是修饰的J链，其还包含异源部分，其中所述异源部分与所述J链或其片段或变体融合或缀合。

实施方案42.如实施方案41所述的多聚体抗体，其中所述异源部分是与所述J链或其片段或变体融合的异源多肽。

实施方案43.如实施方案42所述的多聚体抗体，其中所述异源多肽经由肽接头与J链或其片段或变体融合，所述肽接头包含至少5个氨基酸但不超过25个氨基酸。

实施方案44.如实施方案42或实施方案43所述的多聚体抗体，其中所述异源多肽与J链或其片段或变体的N末端融合、与J链或其片段或变体的C末端融合，或与J链或其片段或变体的N末端和C末端两者融合，其中与N末端和C末端两者融合的异源多肽可以是相同的或不同的。

实施方案45.如实施方案42至44中任一项所述的多聚体抗体，其中所述异源多肽是抗体抗原结合结构域或其亚基。

实施方案46.如实施方案45所述的多聚体抗体，其中所述抗体抗原结合结构域包含scFv片段。

实施方案47.如实施方案44至46中任一项所述的多聚体抗体，其中所述异源多肽结合CD3。

实施方案48.如实施方案46或实施方案47所述的多聚体抗体，其中抗体抗原结合结构域结合CD3并包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH包含VH互补决定区VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，并且所述VL包含VL互补决定区VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33；SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25；SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41；SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49；SEQID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:57；SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65；或SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72和SEQ IDNO:73。

实施方案49.如实施方案48所述的多聚体抗体，其中所述VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33。

实施方案50.如实施方案48所述的多聚体抗体，其中抗体抗原结合结构域分别包含与SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34和SEQID NO:38、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:70至少80％、85％、90％、95％或100％相同的VH和VL氨基酸序列。

实施方案51.如实施方案50所述的多聚体抗体，其中抗体抗原结合结构域分别包含VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:30、SEQID NO:34和SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:62或SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:70。

实施方案52.如实施方案51所述的多聚体抗体，其中所述抗体抗原结合结构域分别包含VH和VL氨基酸序列SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:30。

实施方案53.如实施方案12至52中任一项所述的多聚体抗体，其可以特异性结合人CD123。

实施方案54.如实施方案53所述的多聚体抗体，其以特征为解离常数KD不超过500nM、100nM、50.0nM、40.0nM、30.0nM、20.0nM、10.0nM、9.0nM、8.0nM、7.0nM、6.0nM、5.0nM、4.0nM、3.0nM、2.0nM、1.0nM、0.50nM、0.10nM、0.050nM、0.01nM、0.005nM或0.001nM的亲和力特异性结合人CD123。

实施方案55.一种组合物，其包含如实施方案1至11中任一项所述的抗体或其片段或衍生物或如实施方案12至54中任一项所述的多聚体抗体。

实施方案56.一种多核苷酸，其包含编码如实施方案1至11中任一项所述的抗体或其片段或衍生物或如实施方案12至54中任一项所述的多聚体抗体或其亚基的核酸序列。

实施方案57.一种载体，其包含如实施方案56所述的多核苷酸。

实施方案58.一种宿主细胞，其包含如实施方案57所述的载体。

实施方案59.一种产生如实施方案1至11中任一项所述的抗体或其片段或衍生物或如实施方案12至54中任一项所述的多聚体抗体的方法，其包括培养如实施方案58所述的宿主细胞和回收所述抗体或其片段或衍生物或所述多聚体抗体。

实施方案60.一种治疗癌症的方法，其包括向需要治疗的受试者施用有效量的如实施方案1至11中任一项所述的抗体或其片段或衍生物或如实施方案12至54中任一项所述的多聚体抗体。

实施方案61.如实施方案60所述的方法，其中所述受试者是人。

实施方案62.如实施方案60或实施方案61所述的方法，其中所述癌症是血液癌症。

实施方案63.如实施方案62所述的方法，其中所述血液癌症是急性髓系白血病(AML)。

实施例

实施例1：抗CD123抗体的人源化

抗CD123抗体32716的序列描述于Du(2007)J Immunother30:607-13中。基于小鼠Ab 2H4(PDB 5YWF)的晶体结构，在BioLuminate中生成了32716的同源模型。使用序列比对确定32716与Ab 2H4的同源性如下：VH同一性81％、VL同一性71％、VH框架同一性91％、VL框架同一性80％，此外，5/6的CDR(除去轻链CDR1)的CDR长度相同。

选择两种人抗体作为构架受体：4D9Q，VH框架同一性为75％(图1A)且VK框架同一性为70％(图1B)；以及4NWT，VH框架同一性为65％(图1C)且VK框架同一性为80％(图1D)。基于每个框架图1A至图1D设计了若干人源化序列。亲本32716VH和VL以及人源化32716VH和VL序列的6种组合根据标准克隆方案克隆为如表2所述的人IgG格式。通过商业供应商(ATUM和Celltheon)合成、表达和纯化人IgG结构。

表2：抗CD123抗体

实施例2：人源化32716IgG抗体的生物层干涉亲和力测量测定

亲本32716IgG和人源化变体与重组人CD123蛋白(CD123)-His Acrobio#ILA-H52H6)的结合亲和力通过BLI在Octet-384(Sartorius/Fortebio,NY,USA)上使用Anti-penta His生物传感器(Sartorius)进行测定。PBST(1xPBS+1％ BSA+0.05％Tween-20)缓冲液用作抗体/CD123稀释液和传感器水合缓冲液。实验在24℃下进行了五步连续测定。首先，将生物传感器水合10分钟。在384孔板中应用样品和缓冲液。在60s的初始基线后，传感器加载7nM hu IL-3Rα(CD123)-His Acrobio#ILA-H52H6。将生物传感器浸入PBST中20s以达到基线，然后用2倍连续稀释的抗CD123抗体孵育420s，从10nM开始进行缔合，然后在PBST中900s进行解离。结果通过ForteBio数据分析软件9.0使用1:1全局拟合模型进行分析。

亲本32716IgG与人源化变体的结合分别示于图2A至图2G。K_D、k_on和k_dis示于表3。人源化IgG抗体对CD123的亲和力保持在原始小鼠抗体的1.5倍以内。与原始鼠IgG抗体相比，h32716-3-1IgG显示出略微更好的亲和力。

表3：人源化IgG抗体的结合动力学结果

实施例3：与表达CD123的细胞系的结合

为了评估IgG抗体与表达人CD123的CHO细胞上的CD123结合的能力，进行结合测定。使用胰蛋白酶将表达人CD123的CHO细胞从烧瓶中分离出来。将细胞(1x10⁵个)移取到圆底96孔板的孔中，用FACS染色缓冲液(BD Pharmigen目录号#554656)洗涤，并在室温下与FcBlock(BD,#564220)预孵育10分钟，然后在4℃下用系列稀释的32716或h32716 IgG抗体孵育30分钟。将细胞洗涤两次并用与Alexa647(Southern Biotech，克隆SB81a)缀合的小鼠抗人κ抗体染色。通过流式细胞术分析细胞。结果示于图3。使用GraphPad Prism用4参数逻辑模型分析平均荧光强度(MFI)值。数据示于表4。32716抗CD123的所有人源化IgG抗体都以类似的亲和力和强度结合。

表4.人源化IgG抗体与表达CD123的CHO细胞的结合

抗体	最大结合强度(MFI)	梯度	IC50(nM)
				32716IgG	910000	2.2	11
h32716-1-1IgG	950000	2.0	7.4
				h32716-2-1IgG	930000	1.7	11
h32716-3-1IgG	940000	1.9	10
				h32716-4-2IgG	980000	2.4	6.8
h32716-5-2IgG	1100000	2.2	7.2
				h32716-6-2IgG	1000000	1.9	11

实施例4：人源化32716抗CD123转化为IgM与CD123的结合动力学

为了生成IgM人源化构建体，将两个人源化抗CD123序列的VH和VL区并入IgM中，其具有包含CD3结合scFv(SEQ ID NO:84)的经修饰的J链，以根据标准克隆方案形成双特异性IgM抗体。IgM抗体构建体在Expi293或CHO细胞中表达。根据描述于Keyt,B.等人Antibodies:9:53,doi:10.3390/antib9040053(2020)中的方法纯化IgM抗体。IgM抗体组装成带有J链的五聚体。

CD123XCD3 IgM抗体32716IgM、h32716-1-1IgM和h32716-4-2IgM与重组人CD123蛋白(CD123、Fc-融合(IgG1)Avi-Tag、生物素标记的、BPS Bioscience目录号100068-2)的结合亲和力通过BLI在Octet-384(Sartorius/Fortebio,NY,USA)上使用抗人Fc(AFC)生物传感器(Sartorius目录号185064)如实施例2中所述测定。

亲本32716IgM、h32716-1-1IgM和h32716-4-2IgM与CD123的结合分别示于图4A至图4C。K_D、k_on和k_dis示于表5。人源化IgM抗体对CD123的亲和力保持在原始小鼠抗体的1.5倍以内。

表5：人源化IgM抗体的结合动力学

抗体	KD[M]	kon(1/Ms)	kdis(1/s)	R^2
					32716IgM	<1.0E-12	4.10E+06	<1.0E-07	0.9933
h32716-1-1IgM	<1.0E-12	3.90E+06	<1.0E-07	0.9947
					h32716-4-2IgM	4.43E-12	3.82E+06	1.69E-05	0.996

实施例5：通过ELISA测量的IgM抗体特异性

抗CD123xCD3 IgM抗体32716IgM、h32716-1-1IgM和h32716-4-2IgM对人CD123和CD3ε的特异性在ELISA测定中如下测量。96孔白色聚苯乙烯ELISA板(Pierce 15042)每孔涂覆100μL 0.2μg/mL重组人CD123蛋白(Sino Biological 10518-H08H-50)或0.5μg/ml重组人CD3ε蛋白(Acro Biosystems,CDE-H5256-100)，在4℃下过夜。然后，将板用0.05％ PBS-Tween洗涤5次，并用2％ BSA-PBS封闭。在封闭后，将100μL的CD123xCD3 IgM抗体的连续稀释液、标准物和对照添加到孔中，并且在室温下孵育2小时。然后将板洗涤10次并与HRP缀合的小鼠抗人κ(Southern Biotech,9230-05.1:6000稀释于2％ BSA-PBS中)一起孵育30min。在使用0.05％ PBS-Tween进行10次最终洗涤后，使用SuperSignal化学发光底物(ThermoFisher,37070)进行读板。在EnVision读板仪(Perkin-Elmer)上收集发光数据，并使用GraphPad Prism用4参数逻辑模型进行分析。IgM双特异性抗体与CD123的结合示于图5A，并且与CD3ε的结合示于图5B。

实施例6：IgM抗体与MV411 AML细胞系的结合

为了评估抗CD123xCD3 IgM抗体32716IgM、h32716-1-1IgM和h32716-4-2IgM结合表达CD123蛋白的AML细胞上的CD123的能力，进行了结合测定。用FACS染色缓冲液(BDPharmingen目录号554656)洗涤MV411细胞，并在室温下与Fc Block(BD,564220)预孵育10分钟。在4℃下将5x10⁴个细胞用系列稀释的IgM抗体染色30分钟。将细胞洗涤两次，然后在4℃下用5μg/mL抗人IgM-PE标记的二抗(SB，克隆SA-DA4)染色30分钟。将细胞洗涤两次，重悬于FACS染色缓冲液中，并通过流式细胞术获得细胞。结果示于FIG.6。

实施例7：人源化32716IgM双特异性抗体保留T细胞定向AML细胞杀伤效能

为了证明抗CD123xCD3 IgM抗体32716IgM、h32716-1-1IgM和h32716-4-2IgM在存在人T细胞的情况下杀伤靶细胞的能力，我们进行了共培养实验。7×10³个肿瘤细胞KG1a和MV4-11(表达萤火虫荧光素酶)在100μL总体积的AIM-V细胞培养基(GIBCO,#12055091)中存在系列稀释的抗CD123xCD3 IgM抗体的情况下，在每孔补充有3％热灭活胎牛血清(FBS,HyClone,#SH3007103HI)的96孔圆底组织培养板上与T细胞以7:1的效应物与靶标(E:T)比率共培养。在37℃5％ CO₂培养箱中孵育72小时后，去除50μl上清液，并在-80℃下冷冻，用于后续细胞因子释放分析。50μl荧光素酶底物例如，ONE-Glo EX荧光素酶测定系统，Promega被添加到孔中。将板短暂摇动以混合试剂，并在EnVision读板仪(Perkin-Elmer)上测量荧光素酶发光信号。然后用GraphPad Prism分析数据以确定EC₅₀。KG1a和MV411的代表性剂量反应曲线示于图7A至图7B并且最大杀伤百分比和EC50值示于表6。

表6：抗CD123xCD3 IgM抗体的体外杀伤效能

实施例8：人源化对IgM稳定性和聚集的影响

在相同的缓冲溶液中配制等浓度的32716IgM、h32716-1-1IgM和h32716-4-2IgM。通过尺寸排阻高效液相色谱法(HPLC)确定高分子量聚集体(即，分子质量大于具有J链的五聚体IgM的分子)的初始(t＝0)百分比(％HMW)。将每种抗体的等分试样进行3或5个冷冻和解冻循环，其中等分试样在-80℃下储存2-20小时，并在25℃下储存2小时。其他等分试样在4℃或40℃下储存一周。处理后测量所有等分试样的％HMW。结果示于图8。

与32716IgM和h32716-4-2IgM相比，h32716-1-1IgM示出了更好的稳定性特征和更低的聚集倾向。

实施例9：用人源化32716的体内治疗

8周大的雌性MHC-/-NSG小鼠购自Jackson Laboratory。通过每只小鼠移植10x10⁶个健康人供体来源的外周血单核细胞(PBMC)对小鼠进行人源化。人PBMC移植后10天，将与基质胶混合(1:1与1x磷酸盐缓冲盐水(PBS)混合)的5x10⁶个MV4-11-gfp-luc肿瘤细胞皮下植入小鼠右侧。肿瘤植入后一天，每三天向小鼠静脉内(i.v.)给药媒介物，总共8剂，每三天静脉注射0.1mg/kg抗CD123XCD3 IgG#1(包含SEQ ID NO:85和86的CD123 VH和VL以及SEQID NO:87的CD3 scFv)5剂，每三天静脉注射5mg/kg h32716-1-1IgM抗体8剂，或每三天静脉注射15mg/kg h32716-1-1IgM抗体8剂。(n＝10只动物/组)。

75天内随时间变化的平均肿瘤体积示于图9A。第75天的个体肿瘤体积示于图9B。75天中随时间推移的对于媒介物、抗CD123XCD3 IgG#1治疗、5mg/kg h32716-1-1IgM抗体和15mg/kg h32716-1-1IgM抗体的个体肿瘤体积分别示于图10A至图10D。

与媒介物治疗相比，用5mg/kg h32716-1-1IgM抗体治疗显著减小了肿瘤体积。在研究的第75天，在5mg/kg h32716-1-1IgM抗体组中，10只小鼠中有7只没有肿瘤，并且在15mg/kg h32716-1-1IgM抗体组中，10只小鼠中有6只没有肿瘤。

实施例10：CD123xCD3 IgM抑制体外人AML集落形成

为了检测CD123xCD3 IgM对体外多发性骨髓瘤细胞生长的影响，使用集落形成测定。来自四个不同的急性髓系白血病(AML)供体的冷冻骨髓单核细胞被解冻并以0.5x 10⁶个细胞/mL重悬于含有细胞因子(IL-3、GM-CSF和SCF)的液体基培养基中，并铺入12孔板的孔中。向每个孔中添加7种不同浓度(150、50、10、2、0.4、0.08、0.06μg/mL)的测试抗体。此外，还评估了50、10和1nM的柔红霉素对照。还包括一个仅含有溶剂对照的孔。将12孔板置于37℃、5％ CO₂的加湿培养箱中孵育72小时。孵育后，通过移液小心地分散每个孔内的细胞。从每个孔中取出400μL细胞(和培养基)并添加到4.0mL含有IL-3、GM-CSF和SCF的甲基纤维素中。涡旋甲基纤维素管以确保细胞在整个基质中均匀分布。每种条件都在35mm培养皿中设置一式三份培养物。平行测定培养皿置于37℃、5％ CO₂下总共14-16天，之后基于形态评估和计数所得集落。用于每个供体的效应细胞比T细胞比率(E:T)示于图11。

图11示出了在用h32716-1-1处理后，来自四个不同供体的多发性骨髓瘤细胞的体外集落形成。用h32716-1-1处理减少了所有测试供体的集落形成。

实施例11：CD123XCD3 IgM抗体的药代动力学特性

如下在体内小鼠模型中测量各种CD123XCD3 IgM抗体的药代动力学参数。经由静脉推注施用向Balb/c小鼠注射5mg/kg h32716、h32716-4-2或h32716-1-1。每种抗体在总共8个时间点收集血样，每个时间点2只小鼠。使用夹心ELISA测定测量每种抗体在每个时间点的血浆浓度。验证了所有ELISA质量指标，并且PK参数包括t_1/2、清除率(CL)、浓度曲线下面积(AUC)和最大浓度(Cmax)是使用非线性曲线拟合技术(WinNonLin,Phoenix Software)得出的。随时间变化的浓度曲线示于图12。PK参数示于表7。

表7：PK参数

参数	单位	32716	h32716-1-1	h32716-4-2
					剂量	mg/kg	5	5	5
CL	mL/天/kg	129.5	162	171.6
					t1/2	小时	6.9	10.5	15.5
Vss	mL/kg	298.7	103.3	126.6
					Cmax	ug/mL	100.5	76.2	61.9
AUCinf	天数*ug/mL	38.6	30.8	29.1
					％Extrap	％	0.21	1.02	2.55

实施例12：CD123xCD3 IgM从T细胞诱导较低水平的细胞因子

TDCC测定方法

根据制造商的说明，使用PKH26红色荧光细胞接头试剂盒(Sigma-Aldrich,目录号MINI26-1kt)用PKH26红色荧光标签标记MV4-11白血病细胞。简而言之，用无血清RPMI-1640培养基(Gibco,REF22400-071)洗涤5x10⁶个MV4-11细胞。离心后，将0.25ml稀释剂C添加到细胞沉淀中，并轻轻移液以重悬。在染色之前，将4μl PKH26乙醇染料溶液添加到聚丙烯离心管中的1.5ml稀释剂C(2X)中，并充分混合以分散，从而得到2X染料溶液。将0.25ml 2X染料溶液快速添加到0.25ml 2X细胞悬液中，并立即混合样品。将样品孵育5min并添加0.5ml热灭活FBS以停止染色。将细胞离心并重悬于培养基中，使终浓度为2.5x10⁵/ml。洗涤人外周血单核细胞(PBMC)(IQ Biosciences，IQB-PBMC103)并以2x10⁶/ml重悬于培养基中。将80μl MV4-11细胞、100μl PBMC和20μl 5x系列稀释测试抗体添加到每个孔中，最高终浓度为5nM。将板孵育48和72小时。进行FACS分析以确定活肿瘤细胞的数量。

MSD测定方法

用MSD Proinflammatory Panel 1(人)试剂盒(V-PLEX,目录号K15049D-2)测量48和72小时时来自收获自MV4-11细胞TDCC测定的上清液的细胞因子水平。简而言之，用稀释剂2将TDCC培养基稀释25倍、5倍或2倍。通过将60μL SULFO-TAG抗人IFN-γ、IL-6或IL-10添加到2.4mL稀释剂3中来制备检测抗体溶液。将板用200μl/孔的洗涤缓冲液洗涤三次，然后与50μL/孔的稀释样品或校准品在室温下一起孵育，振荡2小时。用200μl/孔洗涤缓冲液洗涤三次后，将板与25μL检测抗体溶液在室温下一起孵育，振荡2小时。然后用200μl/孔洗涤缓冲液洗涤板三次。将150uL 2X Read Buffer T添加到板的每个孔中，并在MSD仪器上分析板。

用于计算分析物浓度的校准曲线是通过将来自校准品的信号拟合到具有1/Y²加权的4参数逻辑模型而建立的。通过反拟合到校准曲线，从ECL信号确定分析物浓度。建立校准曲线和确定浓度的计算是使用MSDDISCOVERY WORKBENCH分析软件进行的。

用CD123xCD3 IgG#1或h32716-1-1进行TDCC 48小时后的活细胞数量、IFNγ、IL-6和IL-10的量分别示于图13A至图13D，并且用CD123xCD3 IgG#1或h32716-1-1进行TDCC 72小时后的活细胞数量、IFNγ、IL-6和IL-10的量分别示于图14A至图14D。在导致相同水平细胞杀伤的浓度下，与CD123xCD3 IgG#1相比，h32716-1-1导致产生低得多的细胞因子水平。

表8：示例性CD3结合物的序列

/>

/>

表9：公开中的其他序列

/>

/>

/>

/>

/>

序列表

<110> IGM生物科学股份有限公司(IGM BIOSCIENCES, INC.)

<120> 抗CD123结合分子及其用途

<130> 001-038WO1

<140>

<141>

<150> 63/249,455

<151> 2021-09-28

<150> 63/150,488

<151> 2021-02-17

<160> 87

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 453

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn

1 5 10 15

Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp

20 25 30

Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser

35 40 45

Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln

65 70 75 80

Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn

85 90 95

Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys

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Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg

115 120 125

Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile

130 135 140

Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr

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Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr

165 170 175

Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln

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Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln

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Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val

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Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr

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450

<210> 2

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn

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Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp

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Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser

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Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys

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Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln

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Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn

85 90 95

Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys

100 105 110

Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg

115 120 125

Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile

130 135 140

Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr

145 150 155 160

Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr

165 170 175

Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Gly Gln

180 185 190

Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln

195 200 205

Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val

210 215 220

Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr

225 230 235 240

Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr

245 250 255

Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn

260 265 270

Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala

275 280 285

Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr

290 295 300

Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg

305 310 315 320

Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro

325 330 335

Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu

340 345 350

Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg

355 360 365

Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro

370 375 380

Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val

385 390 395 400

Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Ala

405 410 415

His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser

420 425 430

Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr

435 440 445

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450

<210> 3

<211> 353

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 3

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100 105 110

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115 120 125

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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325 330 335

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<210> 4

<211> 340

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 4

Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr

1 5 10 15

Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe

20 25 30

Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val

35 40 45

Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr

50 55 60

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65 70 75 80

Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Ser Ser Gln Asp

85 90 95

Val Thr Val Pro Cys Arg Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro

100 105 110

Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser

115 120 125

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130 135 140

Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly

145 150 155 160

Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu

165 170 175

Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr

180 185 190

Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn Ile Thr Lys

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln

245 250 255

Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro

260 265 270

Ser Gln Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala

275 280 285

Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Glu Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His

290 295 300

Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Met Ala

305 310 315 320

Gly Lys Pro Thr His Ile Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Ala Asp

325 330 335

Gly Thr Cys Tyr

340

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Met Leu Leu Phe Val Leu Thr Cys Leu Leu Ala Val Phe Pro Ala Ile

1 5 10 15

Ser Thr Lys Ser Pro Ile Phe Gly Pro Glu Glu Val Asn Ser Val Glu

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Gly Ile Asn Ser Arg Gly Leu Ser Phe Asp Val Ser Leu Glu Val Ser

115 120 125

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130 135 140

Gly Arg Thr Val Thr Ile Asn Cys Pro Phe Lys Thr Glu Asn Ala Gln

145 150 155 160

Lys Arg Lys Ser Leu Tyr Lys Gln Ile Gly Leu Tyr Pro Val Leu Val

165 170 175

Ile Asp Ser Ser Gly Tyr Val Asn Pro Asn Tyr Thr Gly Arg Ile Arg

180 185 190

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195 200 205

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Glu Pro Glu Leu Val Tyr Glu Asp Leu Arg Gly Ser Val Thr Phe His

245 250 255

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260 265 270

Gln Ser Ser Gly Glu Asn Cys Asp Val Val Val Asn Thr Leu Gly Lys

275 280 285

Arg Ala Pro Ala Phe Glu Gly Arg Ile Leu Leu Asn Pro Gln Asp Lys

290 295 300

Asp Gly Ser Phe Ser Val Val Ile Thr Gly Leu Arg Lys Glu Asp Ala

305 310 315 320

Gly Arg Tyr Leu Cys Gly Ala His Ser Asp Gly Gln Leu Gln Glu Gly

325 330 335

Ser Pro Ile Gln Ala Trp Gln Leu Phe Val Asn Glu Glu Ser Thr Ile

340 345 350

Pro Arg Ser Pro Thr Val Val Lys Gly Val Ala Gly Gly Ser Val Ala

355 360 365

Val Leu Cys Pro Tyr Asn Arg Lys Glu Ser Lys Ser Ile Lys Tyr Trp

370 375 380

Cys Leu Trp Glu Gly Ala Gln Asn Gly Arg Cys Pro Leu Leu Val Asp

385 390 395 400

Ser Glu Gly Trp Val Lys Ala Gln Tyr Glu Gly Arg Leu Ser Leu Leu

405 410 415

Glu Glu Pro Gly Asn Gly Thr Phe Thr Val Ile Leu Asn Gln Leu Thr

420 425 430

Ser Arg Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Leu Thr Asn Gly Asp Thr Leu

435 440 445

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Pro Cys His Phe Pro Cys Lys Phe Ser Ser Tyr Glu Lys Tyr Trp Cys

485 490 495

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Ala Val Glu Glu Arg Lys Ala Ala Gly Ser Arg Asp Val Ser Leu Ala

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Lys Ala Asp Ala Ala Pro Asp Glu Lys Val Leu Asp Ser Gly Phe Arg

580 585 590

Glu Ile Glu Asn Lys Ala Ile Gln Asp Pro Arg Leu Phe Ala Glu Glu

595 600 605

Lys Ala Val Ala Asp Thr Arg Asp Gln Ala Asp Gly Ser Arg Ala Ser

610 615 620

Val Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Gln Gly Gly Ser Ser Arg Ala Leu

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Val Ser Thr Leu Val Pro Leu Gly Leu Val Leu Ala Val Gly Ala Val

645 650 655

Ala Val Gly Val Ala Arg Ala Arg His Arg Lys Asn Val Asp Arg Val

660 665 670

Ser Ile Arg Ser Tyr Arg Thr Asp Ile Ser Met Ser Asp Phe Glu Asn

675 680 685

Ser Arg Glu Phe Gly Ala Asn Asp Asn Met Gly Ala Ser Ser Ile Thr

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Ser Thr Thr Glu Thr Lys Glu Pro Lys Lys Ala Lys Arg Ser Ser Lys

725 730 735

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<210> 6

<211> 159

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

Met Lys Asn His Leu Leu Phe Trp Gly Val Leu Ala Val Phe Ile Lys

1 5 10 15

Ala Val His Val Lys Ala Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp

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<211> 137

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu Val Asp Asn Lys Cys Lys Cys Ala

1 5 10 15

Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg Ser Ser Glu Asp Pro Asn Glu Asp

20 25 30

Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile Ile Val Pro Leu Asn Asn Arg Glu

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Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro Leu Arg Thr Arg Phe Val Tyr His

50 55 60

Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys Asp Pro Thr Glu Val Glu Leu Asp

65 70 75 80

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85 90 95

Ala Thr Glu Thr Cys Tyr Thr Tyr Asp Arg Asn Lys Cys Tyr Thr Ala

100 105 110

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115 120 125

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130 135

<210> 8

<211> 137

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 8

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1 5 10 15

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100 105 110

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<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 9

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 10

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 12

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 12

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 13

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 13

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

<210> 14

<211> 378

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

Met Val Leu Leu Trp Leu Thr Leu Leu Leu Ile Ala Leu Pro Cys Leu

1 5 10 15

Leu Gln Thr Lys Glu Asp Pro Asn Pro Pro Ile Thr Asn Leu Arg Met

20 25 30

Lys Ala Lys Ala Gln Gln Leu Thr Trp Asp Leu Asn Arg Asn Val Thr

35 40 45

Asp Ile Glu Cys Val Lys Asp Ala Asp Tyr Ser Met Pro Ala Val Asn

50 55 60

Asn Ser Tyr Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val Thr Asn

65 70 75 80

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85 90 95

Pro Glu Asn Ser Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn Leu Thr Cys

100 105 110

Trp Ile His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala Val Gly Pro

115 120 125

Gly Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Val Ala Asn

130 135 140

Arg Arg Gln Gln Tyr Glu Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala Gln Gly

145 150 155 160

Thr Arg Ile Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ser Arg Leu Ser Ser Gly

165 170 175

Ser Gln Ser Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala Ala Phe Gly

180 185 190

Ile Pro Cys Thr Asp Lys Phe Val Val Phe Ser Gln Ile Glu Ile Leu

195 200 205

Thr Pro Pro Asn Met Thr Ala Lys Cys Asn Lys Thr His Ser Phe Met

210 215 220

His Trp Lys Met Arg Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg Tyr Glu Leu

225 230 235 240

Gln Ile Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Ile Thr Glu Gln Val Arg Asp

245 250 255

Arg Thr Ser Phe Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Tyr Thr Val Gln Ile

260 265 270

Arg Ala Arg Glu Arg Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Ser Thr Pro

275 280 285

Gln Arg Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Asn Thr Arg Ala Trp

290 295 300

Arg Thr Ser Leu Leu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Leu Ala Leu Val Cys

305 310 315 320

Val Phe Val Ile Cys Arg Arg Tyr Leu Val Met Gln Arg Leu Phe Pro

325 330 335

Arg Ile Pro His Met Lys Asp Pro Ile Gly Asp Ser Phe Gln Asn Asp

340 345 350

Lys Leu Val Val Trp Glu Ala Gly Lys Ala Gly Leu Glu Glu Cys Leu

355 360 365

Val Thr Glu Val Gln Val Val Gln Lys Thr

370 375

<210> 15

<211> 300

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 15

Met Val Leu Leu Trp Leu Thr Leu Leu Leu Ile Ala Leu Pro Cys Leu

1 5 10 15

Leu Gln Thr Lys Glu Gly Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn Leu

20 25 30

Thr Cys Trp Ile His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala Val

35 40 45

Gly Pro Gly Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Val

50 55 60

Ala Asn Arg Arg Gln Gln Tyr Glu Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala

65 70 75 80

Gln Gly Thr Arg Ile Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ser Arg Leu Ser

85 90 95

Ser Gly Ser Gln Ser Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala Ala

100 105 110

Phe Gly Ile Pro Cys Thr Asp Lys Phe Val Val Phe Ser Gln Ile Glu

115 120 125

Ile Leu Thr Pro Pro Asn Met Thr Ala Lys Cys Asn Lys Thr His Ser

130 135 140

Phe Met His Trp Lys Met Arg Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg Tyr

145 150 155 160

Glu Leu Gln Ile Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Ile Thr Glu Gln Val

165 170 175

Arg Asp Arg Thr Ser Phe Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Tyr Thr Val

180 185 190

Gln Ile Arg Ala Arg Glu Arg Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Ser

195 200 205

Thr Pro Gln Arg Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Asn Thr Arg

210 215 220

Ala Trp Arg Thr Ser Leu Leu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Leu Ala Leu

225 230 235 240

Val Cys Val Phe Val Ile Cys Arg Arg Tyr Leu Val Met Gln Arg Leu

245 250 255

Phe Pro Arg Ile Pro His Met Lys Asp Pro Ile Gly Asp Ser Phe Gln

260 265 270

Asn Asp Lys Leu Val Val Trp Glu Ala Gly Lys Ala Gly Leu Glu Glu

275 280 285

Cys Leu Val Thr Glu Val Gln Val Val Gln Lys Thr

290 295 300

<210> 16

<211> 378

<212> PRT

<213> 食蟹猕猴(Macaca fascicularis)

<400> 16

Met Thr Leu Leu Trp Leu Thr Leu Leu Leu Val Ala Thr Pro Cys Leu

1 5 10 15

Leu Arg Thr Lys Glu Asp Pro Asn Ala Pro Ile Arg Asn Leu Arg Met

20 25 30

Lys Glu Lys Ala Gln Gln Leu Met Trp Asp Leu Asn Arg Asn Val Thr

35 40 45

Asp Val Glu Cys Ile Lys Gly Thr Asp Tyr Ser Met Pro Ala Met Asn

50 55 60

Asn Ser Tyr Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val Thr Asn

65 70 75 80

Tyr Thr Val Arg Val Ala Ser Pro Pro Phe Ser Thr Trp Ile Leu Phe

85 90 95

Pro Glu Asn Ser Gly Thr Pro Arg Ala Gly Ala Glu Asn Leu Thr Cys

100 105 110

Trp Val His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Val Val Gly Pro

115 120 125

Ala Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Asn Pro Asn

130 135 140

Ser His Glu Gln Tyr Arg Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala Arg Gly

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Thr Gln Ile Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ala Pro Leu Ser Arg Gly

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Ser Gln Ser Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala Ala Val Ser

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Arg Ile Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Arg Thr Glu Gln Val Arg Asp

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Arg Ile Pro His Met Lys Asp Pro Ile Gly Asp Thr Phe Gln Gln Asp

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Lys Leu Val Val Trp Glu Ala Gly Lys Ala Gly Leu Glu Glu Cys Leu

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Val Ser Glu Val Gln Val Val Glu Lys Thr

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<210> 17

<211> 396

<212> PRT

<213> 小家鼠(Mus musculus)

<400> 17

Met Ala Ala Asn Leu Trp Leu Ile Leu Gly Leu Leu Ala Ser His Ser

1 5 10 15

Ser Asp Leu Ala Ala Val Arg Glu Ala Pro Pro Thr Ala Val Thr Thr

20 25 30

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Asp Pro Ala Pro Gly Ala Asp Ile Thr Thr Gly Ala Phe Cys Arg Lys

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Glu Gly Gln Leu Ser Cys Gln Trp Glu Arg Gly Pro Lys Ala Thr Gly

130 135 140

Asp Val His Tyr Arg Met Phe Trp Arg Asp Val Arg Leu Gly Pro Ala

145 150 155 160

His Asn Arg Glu Cys Pro His Tyr His Ser Leu Asp Val Asn Thr Ala

165 170 175

Gly Pro Ala Pro His Gly Gly His Glu Gly Cys Thr Leu Asp Leu Asp

180 185 190

Thr Val Leu Gly Ser Thr Pro Asn Ser Pro Asp Leu Val Pro Gln Val

195 200 205

Thr Ile Thr Val Asn Gly Ser Gly Arg Ala Gly Pro Val Pro Cys Met

210 215 220

Asp Asn Thr Val Asp Leu Gln Arg Ala Glu Val Leu Ala Pro Pro Thr

225 230 235 240

Leu Thr Val Glu Cys Asn Gly Ser Glu Ala His Ala Arg Trp Val Ala

245 250 255

Arg Asn Arg Phe His His Gly Leu Leu Gly Tyr Thr Leu Gln Val Asn

260 265 270

Gln Ser Ser Arg Ser Glu Pro Gln Glu Tyr Asn Val Ser Ile Pro His

275 280 285

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325 330 335

Ser Val Ala Thr Val Leu Gly Ala Gly Leu Val Ala Ala Gly Leu Leu

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<210> 18

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 18

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<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 19

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<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 20

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 21

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 22

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<223> 人工序列的描述：合成肽

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<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 24

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 人工序列的描述：合成肽

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<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 26

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Thr Tyr

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 27

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<212> PRT

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<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 28

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 29

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 30

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Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 31

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 32

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<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 33

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 34

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<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 35

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<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 36

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Val Lys Asp

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<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 37

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<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 38

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 39

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 40

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 41

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 42

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 43

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 44

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Gly

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 45

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<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 46

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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 47

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala Arg Thr Gly Lys Asn Tyr Leu

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Ala

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 48

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 49

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 50

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

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<212> PRT

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 51

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 52

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Gly

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<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 53

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<210> 54

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 54

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

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<210> 55

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 55

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Ala

<210> 56

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 56

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

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<210> 57

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 57

Lys Gln Ser Tyr Phe Arg Arg Thr

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<210> 58

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 58

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 59

Asp Tyr Tyr Met His

1 5

<210> 60

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 60

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Gly

<210> 61

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 61

Asp Ala Tyr Gly Gln Tyr Phe Tyr Asp Val

1 5 10

<210> 62

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 62

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

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Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala

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<210> 63

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 63

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala Arg Thr Gly Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 64

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 64

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 65

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 65

Thr Gln Ser Tyr Phe Arg Arg Thr

1 5

<210> 66

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 66

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 67

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 67

Ser Tyr Thr Met His

1 5

<210> 68

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 68

Tyr Ile Asn Pro Arg Ser Gly Tyr Thr His Tyr Asn Gln Lys Leu Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 69

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 69

Ser Ala Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 70

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 70

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 71

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 71

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn

1 5 10

<210> 72

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 72

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 73

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成肽

<400> 73

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 74

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 74

Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Ser Phe Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ser Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu His Ile Asn Asp Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Asp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 75

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 75

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn

65 70 75 80

Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 76

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 76

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ser Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Asp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 77

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 77

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ser Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Thr Leu Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Asp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 78

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 78

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Phe Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ser Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Phe Thr Leu Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Asp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 79

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 79

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 80

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 80

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ser Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Asp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 81

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 81

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ser Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Asp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 82

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 82

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Phe Lys Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Ser Thr Tyr Ser Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Gly Tyr Asp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 83

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 83

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr

20 25 30

Gly Asn Thr Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 84

<211> 401

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 84

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Glu Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Ala Asn Phe Gly Ala Gly Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Thr Val Val

130 135 140

Thr Gln Glu Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu

145 150 155 160

Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

165 170 175

Trp Val Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly

180 185 190

Thr Asp Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Leu

195 200 205

Leu Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp

210 215 220

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe

225 230 235 240

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

245 250 255

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Glu Asp Glu Arg Ile Val Leu

260 265 270

Val Asp Asn Lys Cys Lys Cys Ala Arg Ile Thr Ser Arg Ile Ile Arg

275 280 285

Ser Ser Glu Asp Pro Asn Glu Asp Ile Val Glu Arg Asn Ile Arg Ile

290 295 300

Ile Val Pro Leu Asn Asn Arg Glu Asn Ile Ser Asp Pro Thr Ser Pro

305 310 315 320

Leu Arg Thr Arg Phe Val Tyr His Leu Ser Asp Leu Cys Lys Lys Cys

325 330 335

Asp Pro Thr Glu Val Glu Leu Asp Asn Gln Ile Val Thr Ala Thr Gln

340 345 350

Ser Asn Ile Cys Asp Glu Asp Ser Ala Thr Glu Thr Cys Ala Thr Tyr

355 360 365

Asp Arg Asn Lys Cys Tyr Thr Ala Val Val Pro Leu Val Tyr Gly Gly

370 375 380

Glu Thr Lys Met Val Glu Thr Ala Leu Thr Pro Asp Ala Cys Tyr Pro

385 390 395 400

Asp

<210> 85

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 85

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Lys Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 86

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 86

Asp Phe Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Thr

20 25 30

Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 87

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 人工序列的描述：合成多肽

<400> 87

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Lys Pro

115 120 125

Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly

130 135 140

Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly

145 150 155 160

Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr

165 170 175

Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg

180 185 190

Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg

195 200 205

Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly

210 215 220

Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser

225 230 235 240

Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

245 250

Claims (27)

1.一种抗体或其抗原结合片段或衍生物，其包含特异性结合CD123的抗原结合结构域，其中所述抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH和VL分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:83以及SEQID NO:82和SEQ ID NO:83。

2.如权利要求1所述的抗体或其片段或衍生物，其包含有包含两个抗原结合结构域的单个二价结合单元，其中至少一个抗原结合结构域特异性结合CD123，其中所述结合单元包含两条重链，每条重链包含重链恒定区或其片段或变体，并且其中所述结合单元的至少一个重链恒定区或其片段或变体与所述VH的拷贝缔合。

3.一种多聚体抗体，其包含五个、六个或两个二价结合单元和十个、十二个或四个抗原结合结构域，其中至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个抗原结合结构域特异性结合CD123；

其中所述抗原结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH和VL分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:76和SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:79、SEQ IDNO:78和SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:83或SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83，

其中每个结合单元包含两条重链，每条重链包含IgM或IgA恒定区或其多聚化片段或变体，并且其中所述多聚体抗体的至少三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个重链恒定区与所述VH的拷贝缔合。

4.如权利要求3所述的多聚体抗体，其中每个重链恒定区或其多聚化片段或变体与所述VH的拷贝缔合。

5.如权利要求4所述的多聚体抗体，其中每个结合单元还包含两条轻链，每条轻链包含轻链恒定区或其片段或变体，并且其中至少三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个或十二个轻链恒定区或其片段或变体与所述VL的拷贝缔合。

6.如权利要求3所述的多聚体抗体，其为五聚体或六聚体并且包含五个或六个二价IgM结合单元，其中每个结合单元包含Cμ4结构域和μ-尾片(μtp)结构域或其多聚化片段或变体。

7.如权利要求6所述的多聚体抗体，其中所述IgM重链恒定区或其多聚化片段或变体各自还包含Cμ1结构域、Cμ2结构域、Cμ3结构域或其任何组合。

8.如权利要求7所述的多聚体抗体，其中每个IgM重链恒定区是人IgM恒定区或其多聚化变体或片段，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或其多聚化变体或片段。

9.如权利要求3至8中任一项所述的多聚体抗体，其为五聚体，并且还包含J链或其片段或其变体。

10.如权利要求3所述的多聚体抗体，其为二聚体并且包含两个二价IgA结合单元以及J链或其片段或变体，其中每个结合单元包含Cα1结构域、Cα2结构域、IgA铰链区、Cα3结构域和α-尾片(αtp)结构域。

11.如权利要求9或权利要求10所述的多聚体抗体，其中所述J链或其片段或变体是包含氨基酸序列SEQ ID NO:7或其片段或其变体的成熟人J链。

12.如权利要求11所述的多聚体抗体，其中所述J链或其片段是在与SEQ ID NO:7的氨基酸Y102相对应的氨基酸位置处包含氨基酸取代的变体J链，并且其中在施用于动物时，包含所述变体J链的IgM抗体相对于除了所述J链中的氨基酸取代之外都相同的，并且以相同的方式施用于相同动物物种的参考IgM抗体表现出增加的血清半衰期。

13.如权利要求12所述的多聚体抗体，其中所述与SEQ ID NO:7的氨基酸Y102相对应的氨基酸位置被丙氨酸(A)取代，并且其中所述变体J链包含氨基酸序列SEQ ID NO:8。

14.如权利要求9至13中任一项所述的多聚体抗体，其中所述J链或其片段或变体是修饰的J链，其还包含异源部分，其中所述异源部分与所述J链或其片段或变体融合或缀合。

15.如权利要求14所述的多聚体抗体，其中所述异源部分是与所述J链或其片段或变体融合的异源多肽。

16.如权利要求15所述的多聚体抗体，其中所述异源多肽是抗体抗原结合结构域或其亚基。

17.如权利要求16所述的多聚体抗体，其中所述抗体抗原结合结构域包含scFv片段。

18.如权利要求17所述的多聚体抗体，其中所述抗体抗原结合结构域结合CD3。

19.一种组合物，其包含如权利要求1所述的抗体或其片段或衍生物或如权利要求3至18中任一项所述的多聚体抗体。

20.一种多核苷酸，其包含编码如权利要求1所述的抗体或其片段或衍生物或如权利要求3至18中任一项所述的多聚体抗体或其亚基的核酸序列。

21.一种载体，其包含如权利要求20所述的多核苷酸。

22.一种宿主细胞，其包含如权利要求21所述的载体。

23.一种产生如权利要求1所述的抗体或其片段或衍生物或如权利要求3至18中任一项所述的多聚体抗体的方法，其包括培养如权利要求22所述的宿主细胞和回收所述抗体或其片段或衍生物或所述多聚体抗体。

24.一种治疗癌症的方法，其包括向需要治疗的受试者施用有效量的如权利要求1所述的抗体或其片段或衍生物或如权利要求3至18中任一项所述的多聚体抗体。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述受试者是人。

26.如权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述癌症是血液癌症。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述血液癌症是急性髓系白血病(AML)。