JP2017504566A - 抗アルファ−シヌクレイン抗体及び使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a)ヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、又は
b)ヒトサブクラスIgG4の完全長抗体、又は
c)変異L234A、L235A及びP329Gを伴うヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、
d)変異S228P、L235E及びP329Gを伴うヒトサブクラスIgG4の完全長抗体、
e)両方の重鎖における変異L234A、L235A及びP329G並びに1つの重鎖における変異T366W及びS354C並びにそれぞれの他の重鎖における変異T366S、L368A、Y407V及びY349Cを伴うヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、又は
f)両方の重鎖における変異S228P、L235E及びP329G並びに1つの重鎖における変異T366W及びS354C並びにそれぞれの他の重鎖における変異T366S、L368A、Y407V及びY349Cを伴うヒトサブクラスIgG4の完全長抗体、
である。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号15、配列番号16及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号18、配列番号19及び配列番号20のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号21、配列番号22及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて
i)可変ドメインが、配列番号23、配列番号24及び配列番号25のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号26の非ヒト(ウサギ)可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号27の非ヒト(ウサギ)可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号15、配列番号16及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号18、配列番号19及び配列番号20のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号21、配列番号22及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号23、配列番号24及び配列番号25のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号26のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号27のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
a)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含む第1抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号15、配列番号16及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域が、アミノ酸変化T366W及びS354C又はアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cのいずれかを含み、
b)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第2抗体重鎖を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号15、配列番号16及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含む場合、アミノ酸変化T366W及びS354Cを含み、又は、定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366W及びS354Cを含む場合、アミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含み、
c)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号18、配列番号19及び配列番号20のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
a)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含む第1抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号21、配列番号22及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域が、アミノ酸変化T366W及びS354C又はアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cのいずれかを含み、
b)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第2抗体重鎖を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号21、配列番号22及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含む場合、アミノ酸変化T366W及びS354Cを含み、又は、定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366W及びS354Cを含む場合、アミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含み、
c)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号23、配列番号24及び配列番号25のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
a)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含む第1抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号26のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域が、アミノ酸変化T366W及びS354C又はアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cのいずれかを含み、
b)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第2抗体重鎖を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号26のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含む場合、アミノ酸変化T366W及びS354Cを含み、又は、定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366W及びS354Cを含む場合、アミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含み、
c)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号27のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる、及び/又は
iv)遊離のN末端メチオニン残基を有するアルファ−シヌクレインに特異的に結合し、改変N末端メチオニン残基を有するアルファ−シヌクレインには特異的に結合しない。
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)ヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、又は
b)ヒトサブクラスIgG4の完全長抗体、又は
c)変異L234A、L235A及びP329Gを伴うヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、
d)変異S228P、L235E及びP329Gを伴うヒトサブクラスIgG4の完全長抗体、
e)両方の重鎖における変異L234A、L235A及びP329G並びに1つの重鎖における変異T366W及びS354C並びにそれぞれの他の重鎖における変異T366S、L368A、Y407V及びY349Cを伴うヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、又は
f)両方の重鎖における変異S228P、L235E及びP329G並びに1つの重鎖における変異T366W及びS354C並びにそれぞれの他の重鎖における変異T366S、L368A、Y407V及びY349Cを伴うヒトサブクラスIgG4の完全長抗体、
である。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号02、配列番号03及び配列番号04のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号05、配列番号06及び配列番号07のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号08、配列番号09及び配列番号04のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号10、配列番号11及び配列番号12のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号13の非ヒト(ウサギ)可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号14の非ヒト(ウサギ)可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号15、配列番号16及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号18、配列番号19及び配列番号20のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号21、配列番号22及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号23、配列番号24及び配列番号25のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号26の非ヒト(ウサギ)可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号27の非ヒト(ウサギ)可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号28、配列番号29及び配列番号30のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号31、配列番号32及び配列番号33のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号28、配列番号34及び配列番号30のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号35、配列番号36及び配列番号37のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号38の非ヒト(ウサギ)可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号39の非ヒト(ウサギ)可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号02、配列番号03及び配列番号04のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号05、配列番号06及び配列番号07のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号08、配列番号09及び配列番号04のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号10、配列番号11及び配列番号12のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号13のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号14のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号15、配列番号16及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号18、配列番号19及び配列番号20のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号21、配列番号22及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号23、配列番号24及び配列番号25のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号26のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号27のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号28、配列番号29及び配列番号30のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号31、配列番号32及び配列番号33のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号28、配列番号34及び配列番号30のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号35、配列番号36及び配列番号37のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号38のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号39のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
c)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含む第1抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号02、配列番号03及び配列番号04のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく,
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域が、アミノ酸変化T366W及びS354C又はアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cのいずれかを含み、
b)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第2抗体重鎖を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号02、配列番号03及び配列番号04のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含む場合、アミノ酸変化T366W及びS354Cを含み、又は、定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366W及びS354Cを含む場合、アミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含み、
c)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号05、配列番号06及び配列番号07のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
d)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含む第1抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号08、配列番号09及び配列番号04のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく,
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域が、アミノ酸変化T366W及びS354C又はアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cのいずれかを含み、
b)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第2抗体重鎖を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号08、配列番号09及び配列番号04のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含む場合、アミノ酸変化T366W及びS354Cを含み、又は、定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366W及びS354Cを含む場合、アミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含み、
c)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号10、配列番号11及び配列番号12のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
d)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含む第1抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号13のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域が、アミノ酸変化T366W及びS354C又はアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cのいずれかを含み、
b)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第2抗体重鎖を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号13のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含む場合、アミノ酸変化T366W及びS354Cを含み、又は、定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366W及びS354Cを含む場合、アミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含み、
c)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号14のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
d)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含む第1抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号15、配列番号16及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域が、アミノ酸変化T366W及びS354C又はアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cのいずれかを含み、
b)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第2抗体重鎖を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号15、配列番号16及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含む場合、アミノ酸変化T366W及びS354Cを含み、又は、定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366W及びS354Cを含む場合、アミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含み、
c)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号18、配列番号19及び配列番号20のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
d)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含む第1抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号21、配列番号22及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域が、アミノ酸変化T366W及びS354C又はアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cのいずれかを含み、
b)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第2抗体重鎖を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号21、配列番号22及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含む場合、アミノ酸変化T366W及びS354Cを含み、又は、定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366W及びS354Cを含む場合、アミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含み、
c)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号23、配列番号24及び配列番号25のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
d)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含む第1抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号26のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域が、アミノ酸変化T366W及びS354C又はアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cのいずれかを含み、
b)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第2抗体重鎖を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号26のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含む場合、アミノ酸変化T366W及びS354Cを含み、又は、定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366W及びS354Cを含む場合、アミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含み、
c)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号27のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
d)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含む第1抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号28、配列番号29及び配列番号30のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域が、アミノ酸変化T366W及びS354C又はアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cのいずれかを含み、
b)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第2抗体重鎖を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号28、配列番号29及び配列番号30のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含む場合、アミノ酸変化T366W及びS354Cを含み、又は、定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366W及びS354Cを含む場合、アミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含み、
c)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号31、配列番号32及び配列番号33のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
d)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含む第1抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号28、配列番号34及び配列番号30のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域が、アミノ酸変化T366W及びS354C又はアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cのいずれかを含み、
b)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第2抗体重鎖を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号28、配列番号34及び配列番号30のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含む場合、アミノ酸変化T366W及びS354Cを含み、又は、定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366W及びS354Cを含む場合、アミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含み、
c)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号35、配列番号36及び配列番号37のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
d)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
a)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含む第1抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号38のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域が、アミノ酸変化T366W及びS354C又はアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cのいずれかを含み、
b)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第2抗体重鎖を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号38のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含む場合、アミノ酸変化T366W及びS354Cを含み、又は、定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366W及びS354Cを含む場合、アミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含み、
c)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号39のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
d)抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる。
I.定義
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン(VL)フレームワーク又は重鎖可変ドメイン(VH)フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークであり、下記の通りに定義される。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「に由来する」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含み得る、又は、それは、アミノ酸配列変化を含み得る。一部の実施形態において、アミノ酸変化の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下又は2以下である。一部の実施形態において、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と、配列において同一である。
(a)アミノ酸残基26−32(L1)、50−52(L2)、91−96(L3)、26−32(H1)、53−55(H2)及び96−101(H3)で生じる超可変ループ(Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b)アミノ酸残基24−34(L1)、50−56(L2)、89−97(L3)、31−35b(H1)、50−65(H2)及び95−102(H3)で生じるCDR(Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242);
(c) アミノ酸残基27c−36(L1)、46−55(L2)、89−96(L3)、30−35b(H1)、47−58(H2)及び93−101(H3)で生じる抗原接触(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));並びに
(d)HVRアミノ酸残基46−56(L2)、47−56(L2)、48−56(L2)、49−56(L2)、26−35(H1)、26−35b(H1)、49−65(H2)、93−102(H3)及び94−102(H3)を含む、(a)、(b)及び/又は(c)の組み合わせ。
割合X/Yの100倍
ここで、Xは、A及びBのそのプログラムのアラインメントにおいて配列アラインメントプログラムALIGN-2により完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Yは、Bにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Aの長さが、アミノ酸配列Bの長さとは等しくない場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは等しくないと理解されるであろう。他に具体的に記述しない限り、本明細書において使用する全ての%アミノ酸配列同一性の値は、直前のパラグラフにおいて記載される通りに、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して得られる。
一態様において、本発明は、部分的に、本明細書において報告する抗体が、脳における神経細胞及びグリア細胞中でのアルファ−シヌクレイン誘導性の毒性を低下/除去するために使用することができるとの知見に基づく。特定の態様において、ヒトアルファ−シヌクレインに結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、シヌクレイノパチー及び神経障害、特にパーキンソン病及びパーキンソン病の併存疾患を伴うアルツハイマー病の診断又は処置のために有用である。
本明細書において報告する抗体は、計画的な免疫化の方法論及び特異的な結合特性を伴う抗体の目的にかなった選択を適用することにより得られている。
・配列番号01のアミノ酸配列を有し、単量体アルファーシヌクレインに結合するが、原線維状アルファーシヌクレインには結合しないペプチドに結合する、又は
配列番号26及び27又は配列番号38及び39の可変ドメインの対を有し、原線維状アルファ−シヌクレインに結合するが、単量体アルファ−シヌクレインには結合しない抗体と同じエピトープに結合する、
・ニューロン及びグリア細胞におけるアルファ−シヌクレイン誘導性の毒性を阻害する、
・アルファ−シヌクレイン凝集の細胞間伝達を阻害する、
・アルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性(例えば、LUHMES細胞において)を低下させる。
i)(a)配列番号02のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号03のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号04のアミノ酸配列を含むHVR−H3;又は
ii)(a)配列番号08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号09のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号04のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
iii)(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
iv)(a)配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
v)(a)配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号29のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号30のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
vi)(a)配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号34のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号30のアミノ酸配列を含むHVR−H3。
i)(a)配列番号02のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号03のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号04のアミノ酸配列を含むHVR−H3;又は
ii)(a)配列番号08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号09のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号04のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
iii)(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
iv)(a)配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
v)(a)配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号29のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号30のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
vi)(a)配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号34のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号30のアミノ酸配列を含むHVR−H3。
i)(a)配列番号05のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号06のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号07のアミノ酸配列を含むHVR−L3;又は
ii)(a)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
iii)(a)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
iv)(a)配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
v)(a)配列番号31のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号32のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号33のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
vi)(a)配列番号35のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号36のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号37のアミノ酸配列を含むHVR−L3。
i)(a)配列番号05のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号06のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号07のアミノ酸配列を含むHVR−L3;又は
ii)(a)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
iii)(a)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
iv)(a)配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
v)(a)配列番号31のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号32のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号33のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
vi)(a)配列番号35のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号36のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号37のアミノ酸配列を含むHVR−L3。
i)(a)配列番号02のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号03のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号04のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号05のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号06のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(f)配列番号07のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
ii)(a)配列番号08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号09のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号04のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(f)配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
iii)(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(f)配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
iv)(a)配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(f)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
v)(a)配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号29のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号30のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号31のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号32のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(f)配列番号33のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
vi)(a)配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号34のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号30のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号35のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号36のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(f)配列番号37のアミノ酸配列を含むHVR−L3。
a)配列番号13のVH配列及び配列番号14のVL配列、又は
b)配列番号26のVH配列及び配列番号27のVL配列、又は
c)配列番号38のVH配列及び配列番号39のVL配列。
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体は、≦100nM、≦10nM、≦1nM又は1nM〜100nMの間(例えば10−7M以下、例えば10−7M〜10−9M)の解離定数(Kd)を有する。
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントは、Fab、Fab’、Fab’−SH、F(ab’)2、Fv及びscFvフラグメント並びに下記に記載する他のフラグメントを含むが、これらに限定されない。特定の抗体フラグメントの概説については、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照のこと。scFvフラグメントの概説については、例えば、Plueckthun, A., In;The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315を参照のこと;またWO 93/16185;US 5,571,894及びUS 5,587,458を参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するFab及びF(ab’)2フラグメントの考察については、US 5,869,046を参照のこと。
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、US 4,816,567;及びMorrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855において記載されている。一例において、キメラ抗体は、非ヒト可変領域(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ又はサル等の非ヒト霊長類に由来する可変領域)及びヒト定常領域を含む。更なる例において、キメラ抗体は、クラス又はサブクラスが、親抗体のものから変化されている「クラススイッチされた」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合フラグメントを含む。
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体を、当技術分野において公知の種々の技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は、一般的に、van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374及びLonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459において記載されている。
本発明の抗体は、所望の活性(単数)又は活性(複数)を伴う抗体について、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより単離され得る。例えば、種々の方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を持つ抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするために、当技術分野において公知である。そのような方法は、例えば、Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37において概説されており、例えば、McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554;Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628;Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597;Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175;Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310;Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093;Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472;及びLee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132において更に記載されている。
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体は、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位について結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態において、結合特異性の1つは、ヒトアルファ−シヌクレインについてであり、他方は、任意の他の抗原についてである。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、ヒトアルファ−シヌクレインの2つの異なるエピトープに結合し得る。また、二重特異性抗体を使用し、ヒトアルファ−シヌクレインを発現する細胞に細胞毒性薬剤を局在化させてもよい。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメントとして調製することができる。
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体のアミノ酸配列変異型が熟慮される。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。抗体のアミノ酸配列変異型は、抗体をコードするヌクレオチド配列中へ適切な改変を導入することにより又はペプチド合成により調製され得る。そのような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列からの欠失、及び/又はその中への挿入、及び/又はその内の残基の置換を含む。最終的な構築物が所望の特徴(例えば抗原結合)を持つという条件で、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせがなされることにより、最終的な構築物に達し得る。
特定の実施形態において、1つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異型が提供される。置換突然変異誘発のための目的の部位は、HVR及びFRを含む。保存的置換を、「好ましい置換」の見出しの下に表1において示す。より実質的な変化が、「例示的置換」の見出しの下に表1において提供され、アミノ酸側鎖クラスを参照して以下で更に記載される。アミノ酸置換は、目的の抗体中に導入してもよく、産物は、所望の活性(例えば、保持/改善された抗原結合、減少した免疫原性又は改善されたADCC若しくはCDC)についてスクリーニングされる。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖の方向に影響する残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるように変化される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、1つ以上のグリコシル化部位を作製又は除去するように、アミノ酸配列を変化させることにより簡便に達成され得る。
特定の実施形態において、1つ以上のアミノ酸改変を、本明細書において提供する抗体のFc領域中に導入してもよく、それにより、Fc領域変異型を生成する。Fc領域変異型は、1つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変(例えば、置換)を含む、ヒトFc領域配列(例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4Fc領域)を含み得る。
特定の実施形態において、抗体の1つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作抗体(例えば、「thioMAb」)を作製することが望ましいであろう。特定の実施形態において、置換された残基は、抗体の接近可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基をそれにより抗体の接近可能な部位に配置し、他の部分(例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分)に抗体をコンジュゲートするために使用し、イムノコンジュゲートを作製してもよい(本明細書において更に記載する通り)。特定の実施形態において、以下の残基のいずれか1つ以上をシステインで置換してもよい:軽鎖のV205(カバットナンバリング);重鎖のA118(EUナンバリング);及び重鎖Fc領域のS400(EUナンバリング)。システイン操作抗体を、例えば、US 7,521,541において記載される通りに生成してもよい。
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗体は、更に、当技術分野において公知であり、容易に利用可能である、追加の非タンパク質性部分を含むように改変してもよい。抗体の誘導体化のために適切な部分は、水溶性ポリマーを含むが、これに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか)、及びデキストラン又はポリ(n−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、並びにその混合物を含むが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性に起因して、製造に利点を有し得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、分岐又は非分岐であり得る。抗体に付着するポリマーの数は変動し得るが、1つを上回るポリマーが付着する場合、それらは同じ又は異なる分子であり得る。一般的に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び/又は型は、抗体誘導体が定義された条件等の下での治療において使用されるか否かにかかわらず、考察(改善される抗体の特定の特性又は機能を含むが、これらに限定されない)に基づいて決定することができる。
モノクローナル抗体は、神経学的又は中枢神経系(CNS)疾患の処置のための膨大な治療的可能性を有するが、しかし、脳中へのそれらの通路は、血液脳関門(BBB)により制限される。過去の研究によって、血流中に循環するIgGの非常に小さなパーセンテージ(約0.1%)が、BBBを通じてCNS中へ横断することが示されおり(Felgenhauer, K., Klin. Wschr. 52 (1974) 1158-1164)、ここでは、抗体のCNS濃度は、頑強な効果を可能にするために不十分であり得る。
・IgG重鎖、
・IgG重鎖のFc領域のC末端をscFabのVLドメインのN末端に共役させるペプチドリンカー(好ましい一実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列GGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号41)を有する)、
・scFabの可変軽鎖ドメイン(VL)及びCカッパ軽鎖ドメイン、
・scFabのCカッパ軽鎖ドメインのC末端をscFabのVHドメインのN末端に共役させるペプチドリンカー(好ましい一実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列(G4S)6GG(配列番号55)を有する)、
・scFab抗体の可変重鎖ドメイン(VH)及びIgG CH1重鎖ドメイン。
・IgG重鎖、
・IgG重鎖のFc部分のC末端をscFv抗体フラグメントのVLドメインのN末端に共役させるペプチドリンカー(好ましい一実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列GGSGGGGSGGGGSGGGGS(配列番号41)を有するペプチドである)、
・可変軽鎖ドメイン(VL)、
・可変軽鎖ドメインのC末端をscFvのVHドメインのN末端に共役させるペプチドリンカー(好ましい一実施形態において、ペプチドリンカーは、アミノ酸配列(G4S)6GG(配列番号55)を有するペプチドである)、
・scFv抗体フラグメントの可変重鎖ドメイン(VH)。
EVQLVESGGG LVQPGNSLTL SCVASGFTFS NYGMHWIRQA PKKGLEWIAM IYYDSSKMNY ADTVKGRFTI SRDNSKNTLY LEMNSLRSED TAMYYCAVPT SHYVVDVWGQ GVSVTVSS
(配列番号56)。
DIQMTQSPAS LSASLEEIVT ITCQASQDIG NWLAWYQQKP GKSPQLLIYG ATSLADGVPS RFSGSRSGTQ FSLKISRVQV EDIGIYYCLQ AYNTPWTFGG GTKLELK
(配列番号57)、及び
マウス軽鎖可変ドメイン(変異型2)は、以下のアミノ酸配列を有する:
DIQMTQSPAS LSASLEEIVT ITCQASQDIG NWLAWYQQKP GKSPQLLIYG ATSLADGVPS RFSGSRSGTQ FSLKISRVQV EDIGIYYCLQ AYNTPWTFGG GTKVEIK
(配列番号58)。
一態様において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体融合ポリペプチドは、正確に1つの血液脳関門シャトルモジュールを含み、それにおいて、血液脳関門シャトルモジュールは、マウス抗ヒトトランスフェリン受容体抗体8D3のヒト化可変ドメインを含み、それにより、マウス抗ヒトトランスフェリン受容体抗体8D3のヒト化可変ドメインを含む血液脳関門シャトルモジュールは、血液脳関門を横切り、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体を輸送する。抗ヒトトランスフェリン受容体抗体8D3の可変ドメインは、配列番号56及び57のアミノ酸配列を有する。
一態様において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体融合ポリペプチドは、1つ又は2つの血液脳関門シャトルモジュールを含み、それにおいて、血液脳関門シャトルモジュールは、血液脳関門受容体(BBB−R)に低い親和性で結合する抗体に由来し、それにより、血液脳関門受容体に低い親和性で結合する抗体に由来する血液脳関門シャトルモジュールは、血液脳関門を横切り、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体を輸送する。
別の実施形態において、本明細書において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体へのCNSの曝露を増加させる方法が提供され、それにおいて、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体が、BBB−Rに低い親和性で結合する抗体又は抗体フラグメントに共役されており、それにより、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体へのCNSの曝露を増加させる。別の態様において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体へのCNS曝露における増加は、BBB−Rについての低下した親和性を有さない、典型的な抗体と共役された抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体のCNS曝露と比べて測定される。別の態様において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体へのCNS曝露における増加は、投与後の血清中に見出される量と比べた、CNSにおいて見出される抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の量の比率として測定される。そのような別の態様において、CNS曝露における増加は、0.1%を上回る比率をもたらす。別の態様において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体へのCNS曝露における増加は、共役した抗BBB−R抗体の非存在下における抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体のCNS曝露と比べて測定される。別の態様において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体へのCNS曝露における増加は、イメージングにより測定される。別の態様において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体へのCNS曝露における増加は、間接的な読み出し(1つ以上の生理学的症状の改変等)により測定される。
抗体は、例えば、US 4,816,567において記載されている通りの組換え方法及び組成物を使用して産生し得る。一実施形態において、本明細書において記載する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体をコードする単離核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列及び/又はVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽鎖及び/又は重鎖)をコードし得る。更なる実施形態において、そのような核酸を含む1つ以上のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。更なる実施形態において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態において、宿主細胞は、以下を含む(例えば、以下で形質転換されている):(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクター。一実施形態において、宿主細胞は、真核細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はリンパ細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。一実施形態において、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体を作る方法が提供され、それにおいて、その方法は、上記に提供される通りの抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現のために適切な条件下で培養すること、及び、場合により宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から抗体を回収することを含む。
本明細書において提供する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体は、当技術分野において公知の種々のアッセイにより、それらの物理的/化学的特性及び/又は生物学的活性について同定、スクリーニング又は特徴付けされ得る。
一態様において、本発明の抗体は、例えば、公知の方法、例えばELISA、alphaLISA、ウエスタンブロット、抗体又は逆相アレイ等により、その抗原結合活性について試験される。
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するその抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体を同定するために提供される。生物学的活性は、例えば、ヒト神経細胞における、アルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性からの保護/その低下/その阻害、及び/又はオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達からの保護/その低下/その阻害、及び/又はアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性の低下を含み得る。インビボ及び/又はインビトロでそのような生物学的活性を有する抗体も提供される。
特定の実施形態において、本明細書において提供する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体のいずれかは、生物学的サンプル中のヒトアルファ−シヌクレインの存在を検出するために有用である。本明細書において使用する用語「検出する」は、定量的又は定性的な検出を包含する。特定の実施形態において、生物学的サンプルは、細胞又は組織(例えば脳組織)を含む。
本明細書において記載する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の医薬的製剤は、所望の純度を有するそのような抗体を1つ以上の任意の医薬的に許容可能な担体と混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980))、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で調製される。医薬的に許容可能な担体は、一般的に、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、緩衝剤(例えばリン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸);抗酸化剤(アスコルビン酸及びメチオニンを含む);保存剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリ(ビニルピロリドン);アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン;単糖類、二糖類及び他の炭水化物(グルコース、マンノース又はデキストリンを含む);キレート剤、例えばEDTA;糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属複合体(例えば、Znタンパク質複合体);及び/又は非イオン性界面活性剤、例えばポリエチレングリコール(PEG)を含むが、これらに限定されない。例示的な医薬的に許容可能な担体は、本明細書において更に、間質性薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えばヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばrhuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International, Inc.)を含む。特定の例示的なsHASEGP及び使用の方法(rhuPH20を含む)は、US 2005/0260186及びUS 2006/0104968において記載されている。一態様において、sHASEGPは、1つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ(例えばコンドロイチナーゼ)と組み合わせる。
本明細書において提供する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体のいずれかを、治療方法において使用してもよい。
本発明の別の態様において、上に記載する障害の処置、予防及び/又は診断のために有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器及び、容器上の又はそれに関連付けられるラベル又は添付文書を含む。適切な容器は、例えばボトル、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグ等を含む。容器は、種々の材料(例えばガラス又はプラスチック)から形成され得る。容器は、それ自体で又は状態を処置、予防及び/若しくは診断するために効果的な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、無菌アクセスポートを有し得る(例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針により貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る)。組成物中の少なくとも1つの活性薬剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が選んだ状態を処置するために使用されることを示す。更に、製造品は、(a)その中に含まれる組成物を伴う第1容器(それにおいて、組成物は本発明の抗体を含む);及び(b)その中に含まれる組成物を伴う第2容器(それにおいて、組成物は更に細胞毒性薬剤又は他の治療的薬剤を含む)を含み得る。本発明のこの実施形態における製造品は、組成物を使用し、特定の状態を処置することができることを示す添付文書を更に含み得る。あるいは、又は、加えて、製造品は、医薬的に許容可能な緩衝液(例えば注射用の静菌水(BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液及びブドウ糖液)を含む第2の(又は第3の)容器を更に含み得る。それは、商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料(他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針及びシリンジを含む)を更に含み得る。
1.ヒトアルファ−シヌクレインに特異的に結合する抗体であって、抗体は、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)LUHMES細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる、抗体。
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)LUHMES細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる
ことを特徴とする抗体。
a)ヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、又は
b)ヒトサブクラスIgG4の完全長抗体、又は
c)変異L234A、L235A及びP329Gを伴うヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、
d)変異S228P、L235E及びP329Gを伴うヒトサブクラスIgG4の完全長抗体、
e)両方の重鎖における変異L234A、L235A及びP329G並びに1つの重鎖における変異T366W及びS354C並びにそれぞれの他の重鎖における変異T366S、L368A、Y407V及びY349Cを伴うヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、又は
f)両方の重鎖における変異S228P及びP329G並びに1つの重鎖における変異T366W及びS354C並びにそれぞれの他の重鎖における変異T366S、L368A、Y407V及びY349Cを伴うヒトサブクラスIgG4の完全長抗体、
であることを特徴とする抗体。
i)(a)配列番号02のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号03のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号04のアミノ酸配列を含むHVR−H3;又は
ii)(a)配列番号08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号09のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号04のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
iii)(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
iv)(a)配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
v)(a)配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号29のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号30のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
vi)(a)配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号34のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号30のアミノ酸配列を含むHVR−H3。
i)(a)配列番号02のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号03のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号04のアミノ酸配列を含むHVR−H3;又は
ii)(a)配列番号08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号09のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号04のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
iii)(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
iv)(a)配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
v)(a)配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号29のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号30のアミノ酸配列を含むHVR−H3、又は
vi)(a)配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号34のアミノ酸配列を含むHVR−H2;及び(c)配列番号30のアミノ酸配列を含むHVR−H3。
i)(a)配列番号05のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号06のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号07のアミノ酸配列を含むHVR−L3;又は
ii)(a)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
iii)(a)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
iv)(a)配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
v)(a)配列番号31のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号32のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号33のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
vi)(a)配列番号35のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号36のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号37のアミノ酸配列を含むHVR−L3。
i)(a)配列番号05のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号06のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号07のアミノ酸配列を含むHVR−L3;又は
ii)(a)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
iii)(a)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
iv)(a)配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
v)(a)配列番号31のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号32のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号33のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
vi)(a)配列番号35のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(b)配列番号36のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(c)配列番号37のアミノ酸配列を含むHVR−L3。
i)(a)配列番号02のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号03のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号04のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号05のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号06のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(f)配列番号07のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
ii)(a)配列番号08のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号09のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号04のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号10のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号11のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(f)配列番号12のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
iii)(a)配列番号15のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号16のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号18のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号19のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(f)配列番号20のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
iv)(a)配列番号21のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号22のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号17のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号23のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号24のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(f)配列番号25のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
v)(a)配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号29のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号30のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号31のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号32のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(f)配列番号33のアミノ酸配列を含むHVR−L3、又は
vi)(a)配列番号28のアミノ酸配列を含むHVR−H1;(b)配列番号34のアミノ酸配列を含むHVR−H2;(c)配列番号30のアミノ酸配列を含むHVR−H3;(d)配列番号35のアミノ酸配列を含むHVR−L1;(e)配列番号36のアミノ酸配列を含むHVR−L2;及び(f)配列番号37のアミノ酸配列を含むHVR−L3。
a)ヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、又は
b)ヒトサブクラスIgG4の完全長抗体、又は
c)変異L234A、L235A及びP329Gを伴うヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、
d)変異S228P、L235E及びP329Gを伴うヒトサブクラスIgG4の完全長抗体、
e)両方の重鎖における変異L234A、L235A及びP329G並びに1つの重鎖における変異T366W及びS354C並びにそれぞれの他の重鎖における変異T366S、L368A、Y407V及びY349Cを伴うヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、又は
f)両方の重鎖における変異S228P、L235E及びP329G並びに1つの重鎖における変異T366W及びS354C並びにそれぞれの他の重鎖における変異T366S、L368A、Y407V及びY349Cを伴うヒトサブクラスIgG4の完全長抗体、
である抗体。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号15、配列番号16及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号18、配列番号19及び配列番号20のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号21、配列番号22及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号23、配列番号24及び配列番号25のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号26の非ヒト(ウサギ)可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号27の非ヒト(ウサギ)可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号15、配列番号16及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号18、配列番号19及び配列番号20のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号21、配列番号22及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号23、配列番号24及び配列番号25のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
a)抗体が、2つの抗体重鎖を含み、各々が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号26のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、並びに
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、
b)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号27のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
a)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含む第1抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号15、配列番号16及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域が、アミノ酸変化T366W及びS354C又はアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cのいずれかを含み、
b)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第2抗体重鎖を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号15、配列番号16及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含む場合、アミノ酸変化T366W及びS354Cを含み、又は、定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366W及びS354Cを含む場合、アミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含み、
c)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号18、配列番号19及び配列番号20のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
a)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含む第1抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号21、配列番号22及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域が、アミノ酸変化T366W及びS354C又はアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cのいずれかを含み、
b)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第2抗体重鎖を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号21、配列番号22及び配列番号17のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含む場合、アミノ酸変化T366W及びS354Cを含み、又は、定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366W及びS354Cを含む場合、アミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含み、
c)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号23、配列番号24及び配列番号25のHVRを含み、各々のHVRにおいて、互いに独立に、0、1、2又は3個のアミノ酸残基が変化されており、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
a)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン、重鎖定常領域、ペプチドリンカー、及びscFab又はscFv抗体フラグメントを含む第1抗体重鎖を含み、それは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合し、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号26のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域が、アミノ酸変化T366W及びS354C又はアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cのいずれかを含み、
b)抗体が、NからC末端方向において、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含む第2抗体重鎖を含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号26のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトIgG1定常領域であり、ここで、C末端リジン残基が存在する又は欠けていてもよく、
iii)定常領域が、アミノ酸変化L234A、L235A及びP329Gを含み、並びに
iv)定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含む場合、アミノ酸変化T366W及びS354Cを含み、又は、定常領域は、第1抗体重鎖がアミノ酸変化T366W及びS354Cを含む場合、アミノ酸変化T366S、L368A、Y407V及びY349Cを含み、
c)抗体が、2つの抗体軽鎖を含み、各々が、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含み、それにおいて、
i)可変ドメインが、配列番号27のウサギ可変ドメインのヒト化形態であり、
ii)定常領域が、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域である。
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる、及び/又は
iv)遊離のN末端メチオニン残基を有するアルファ−シヌクレインに特異的に結合し、改変N末端メチオニン残基を有するアルファ−シヌクレインには特異的に結合しない、
抗体。
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上記に提供する一般的な記載を前提として、種々の他の実施形態を実行し得ることが理解される。
組換えDNA技術
標準的方法を使用し、Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載される通りにDNAを操作した。分子生物学用試薬を、製造業者の使用説明書に従って使用した。
所望の遺伝子セグメントを、Geneart GmbH(Regensburg, Germany)での化学合成により調製した。合成された遺伝子フラグメントを、伝播/増幅用の大腸菌プラスミド中にクローン化した。サブクローン化された遺伝子フラグメントのDNA配列を、DNAシークエンシングにより確認した。あるいは、短い合成DNAフラグメントを、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニールすることにより又はPCRを介して組み立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドを、metabion GmbH(Planegg-Martinsried, Germany)により調製した。
全ての商業的な化学物質、抗体及びキットを、他に記述されない場合、製造業者のプロトコールに従って提供される通りに使用した。
抗体0017=ASYN−233HC_110−IV=aSyn.S019.006A08
抗体0018=ASYN−064HC_110−II=aSyn.S003.006A11
抗体0081=ASYN−235HC_110−IV=aSyn.S019.005A08
抗体0070=抗体0017+血液脳関門シャトルモジュール
抗体0076=抗体0018+血液脳関門シャトルモジュール
抗原の調製
材料
タンパク質:
−凍結乾燥されたヒト野生型アルファ−シヌクレイン(100μg、200μg又は500μg一定分量);
−ヒト変異体TPアルファ−シヌクレイン(8.2mg/mL、50mM HEPES/100mM NaCl中で透析)
緩衝液及び溶液(室温で保存し、直射的な日光曝露から保護する):
−PBストック(5×):250mMリン酸緩衝液、pH7.0(0.22μmろ過)
−EtOHストック:エタノール絶対プロ分析グレード(EMSURE)(Merck;カタログ番号1.00989.1000)
−HPLCグレード水(LiChrosolv、Merck)
−50mM HEPES/100mM NaCl、pH7.4(0.22μmろ過)
−TBS(50mM Tris/100mM NaCl)pH7.0(0.22μmろ過)
−BioPORTERタンパク質送達試薬(Genlantis、カタログ番号BP502424)
参考文献については、Danzer, K.M., et al., J. Neurosci. 27 (2007) 9220-9232、及びDanzer, K.M., et al., J. Neurochem. 111 (2009) 192-203を参照のこと。
参考文献については、Danzer, K.M., et al., J. Neurosci. 27 (2007) 9220-9232、及びDanzer, K.M., et al., J. Neurochem. 111 (2009) 192-203を参照のこと。
Karpinar, D.P., et al., EMBO J. 28 (2009) 3256-3268から適応。
Luk, K.C., et al., Biochem. 46 (2007) 12522-12526、及びLuk, K.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009) 20051-20056から適応。
ウサギの免疫化
3羽のニュージーランド白ウサギを、アルファ−シヌクレインC1オリゴマー、アルファ−シヌクレイン原線維及びアルファ−シヌクレインTP変異体オリゴマーの混合物(最初の免疫化用の400μgの各々の成分;継続的な免疫化用の200μgの各々の成分;調製については、実施例1を参照のこと)を用いて免疫化した。動物は、0日目での皮内適用により、並びに7、14、35、63及び91日目での交互の筋肉内適用及び皮下適用により、完全フロイントアジュバントを用いて乳化した免疫原を受けた。血液(推定される全血液量の10%)を、21、41、69及び97日目に採取した。血清を調製し、それをELISAによる力価決定のために使用した(以下を参照のこと)。末梢単核細胞を単離し、それをB細胞クローニングプロセスにおける抗原特異的B細胞の供給源として使用した(実施例3及び4)。
力価は、免疫原混合物の各々の成分について別々に決定した。アルファ−シヌクレインC1オリゴマー、アルファ−シヌクレイン原線維又はアルファ−シヌクレインTP変異体オリゴマーを、PBS(リン酸緩衝生理食塩水溶液)中に0.6μg/ml、100μl/ウェルで96ウェルNUNC Maxisorbプレート上に固定化し、続いて、PBS中の2%CroteinCを用いたプレートのブロッキング、200μl/ウェル;PBS中の0.5%CroteinC中で、二重反復での抗血清の連続希釈の適用、100μl/ウェル;PBS中の0.5%CroteinC中で1:16,000希釈したHRPコンジュゲート(西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート)ロバ抗ウサギIgG抗体(Jackson Immunoresearch)を用いた検出、100μl/ウェル;を行った。全ての工程において、プレートを37℃で1時間にわたりインキュベートした。全ての工程の間で、プレートをPBS中の0.05%Tween 20を用いて3回洗浄した。シグナルをBM Blue POD Substrate可溶性(Roche Diagnostics GmbH、Mannheim、Germany)(100μl/ウェル)の添加により発生させ、1M HCl(100μl/ウェル)の添加により低止させた。吸光度を、参照としての690nmに対して450nmで読み取った。力価を、最大半量のシグナルをもたらす抗血清の希釈として定義した。
B細胞を産生する抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の単離
ウサギ末梢血単核細胞(PBMC)の単離
3羽のウサギ(実施例2に記載)を血液の供給源として使用した。製造業者の仕様に従って、lympholyte哺乳動物(Cedarlane Laboratories、Burlington、Ontario、Canada)を使用した密度遠心分離の前に、全血を含むEDTAを1×PBS(リン酸緩衝生理食塩水;PAA、Pasching、Austria)を用いて2倍希釈した。PBMCを、1×PBSを用いて2回洗浄した。
10%FCS(Hyclone、Logan、UT、USA)、2mMグルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(PAA、Pasching、Austria)、2mMピルビン酸ナトリウム、10mM HEPES(PAN Biotech、Aidenbach、Germany)及び0.05mM β−メルカプトエタノール(Gibco、Paisley、Scotland)を添加したRPMI1640(Pan Biotech、Aidenbach、Germany)。
無菌6ウェルプレート(細胞培養グレード)を使用し、非特異的接着を通じてマクロファージ及び単球を枯渇させた。各々のウェルを、4mLの培地及び免疫化ウサギからの最大6×106個のPBMCを用いて最大限で充填し、37℃で1時間にわたりインキュベーター中で結合させた。上清(末梢血リンパ球(PBL))中の細胞を、抗原パニング工程のために使用した。
無菌細胞培養6ウェルプレートを、炭酸緩衝液(0.1M重炭酸ナトリウム、34mM炭酸水素二ナトリウム、pH9.55)中の2つの異なるヒトアルファ−シヌクレインオリゴマー(1μg/ml C1オリゴマー及び1μg/ml TP変異体オリゴマー)の混合物を用いて一晩4℃でコーティングした。プレートを、使用前に3回、無菌PBS中で洗浄した。
ヒトアルファ−シヌクレインオリゴマーを用いてコーティングした6ウェル組織培養プレートを、4ml培地当たり最大6×106個のPBLを用いて播種し、インキュベーター中で、37℃で1時間にわたり結合させた。アルファ−シヌクレインオリゴマー上での濃縮工程後、非接着細胞を、1×PBSを用いてウェルを1〜2回慎重に洗浄することにより除去した。残りの粘着性細胞を、インキュベーターにおいて37℃で10分間にわたりトリプシンにより剥離した。トリプシン処理は、EL−4 B5培地を用いて停止させた。細胞を、免疫蛍光染色まで氷上に保持した。
抗IgG抗体FITCコンジュゲート(AbD Serotec、Dusseldorf、Germany)を、単一細胞選別のために使用した。表面染色のために、枯渇及び濃縮工程からの細胞を、PBS中で抗IgG抗体FITCコンジュゲートとインキュベートし、45分間にわたり4℃で暗所においてインキュベートした。染色後、PBMCを氷冷PBSを用いて2倍洗浄した。最後に、PBMCを、氷冷PBS中に再懸濁し、直ぐにFACS分析に供した。濃度5μg/ml中のヨウ化プロピジウム(BD Pharmingen、San Diego、CA、USA)を、FACS分析に先立ち加え、死細胞と生細胞を識別した。
ウサギB細胞の培養は、Zubler et al.により記載されたものと同様の方法により調製した(J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183)。簡単には、単一の選別されたウサギB細胞を、Pansorbin Cells(1:100000)(Calbiochem(Merck)、Darmstadt、Deutschland)、5%ウサギ胸腺細胞上清(チャージ20100908、社内産生)及びガンマ線照射マウスEL−4−B5胸腺腫細胞(2.5×104個/ウェル)を含む200μl/ウェルのEL−4 B5培地を伴う96ウェルプレート中で、7日間にわたり37℃で5%CO2下でインキュベートした。B細胞培養の上清をスクリーニングのために除去した。並行して、残りの細胞のmRNAを直ぐに100μlのRLT緩衝液(Qiagen、Hilden、Germany)中に保存し、溶解物を−80℃で凍結した。
抗体可変ドメインコード核酸の決定
VドメインのPCR増幅及び配列決定
全RNAを、製造業者のプロトコールに従って、NucleoSpin 8/96 RNAキット(Macherey&Nagel;カタログ番号740709.4、740698)を使用して調製した。全ての工程はepMotion 5075液体ハンドリングシステム(Eppendorf)上で行った。RNAを60μlのRNAseフリー水を用いて溶出した。6μlのRNAを使用し、製造業者の使用説明書に従って、Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen;カタログ番号18080−400)及びオリゴdTプライマーを使用した逆転写酵素反応によりcDNAを生成した。4μlのcDNAを使用し、重鎖用のプライマーrbHCfinal.up(AAGCTTGCCACCATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTC;配列番号42)及びrbHCfinal.do(CCATTGGTGAGGGTGCCCGAG;配列番号43)並びに軽鎖用のプライマーrbLCfinal.up(AAGCTTGCCACCATGGACAYGAGGGCCCCCACTC;配列番号44)及びrbLCfinal.do(CAGAGTRCTGCTGAGGTTGTAGGTAC;配列番号45)を使用して、最終容積50μl中でAccuPrime SuperMix(Invitrogen;カタログ番号12344−040)を用いて、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域(VH及びVL)を増幅させた。PCR条件は以下の通りであった:94℃で5分間にわたるホットスタート;94℃で20秒間、70℃で20秒間、68℃で45秒間の35サイクル、及び68℃で7分間にわたる最終伸長。
ウサギ抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体のヒト化
ウサギ抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体は、標準的な技術(例えばCDR移植)に従ってヒト化することができる。
組換え発現ベクターの生成
a)マウスIgG1定常領域を使用した、免疫グロブリン重鎖の発現用のベクターの生成
マウスIgG1定常領域(CH1、ヒンジ、CH2、CH3)及びウサギに由来する抗アルファ−シヌクレイン抗体VHドメインを含むマウスIgG1コード融合遺伝子を、それぞれの抗アルファ−シヌクレイン特異的抗体VHドメインについてコードするDNAフラグメントを、マウスIgG1定常領域をコードする配列エレメントに融合することにより組み立てた。
AKTTPPSVYP LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKIVPR DCGCKPCICT VPEVSSVFIF PPKPKDVLTI TLTPKVTCVV VDISKDDPEV QFSWFVDDVE VHTAQTQPRE EQFNSTFRSV SELPIMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPIE KTISKTKGRP KAPQVYTIPP PKEQMAKDKV SLTCMITDFF PEDITVEWQW NGQPAENYKN TQPIMDTDGS YFVYSKLNVQ KSNWEAGNTF TCSVLHEGLH NHHTEKSLSH SPGK
(配列番号46)。
−イントロンAを含むヒトサイトメガロウイルス(P−CMV)からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−重鎖可変(VH)ドメインコード核酸、
−マウスIgG1定常領域コード核酸、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
マウスIg−カッパ定常領域(CL−カッパ)及びウサギに由来する抗アルファ−シヌクレイン抗体VL(カッパ)ドメインを含むマウスカッパ軽鎖コード融合遺伝子を、それぞれの抗アルファ−シヌクレイン抗体VL(カッパ)ドメインについてコードするDNAフラグメントをマウスIg−カッパ定常領域についてコードする配列エレメントに融合することにより組み立てた。
RADAAPTVSI FPPSSEQLTS GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC
(配列番号47)。
−イントロンAを含む、ヒトサイトメガロウイルス(P−CMV)からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−軽鎖可変(VL)ドメインコード核酸、
−マウスIg−カッパ定常領域コード核酸、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
マウスIg−ラムダ定常領域(CL−ラムダ)及びウサギに由来する抗アルファ−シヌクレイン抗体VL(ラムダ)ドメインを含むマウスラムダ軽鎖コード融合遺伝子を、それぞれの抗アルファ−シヌクレイン抗体VL(ラムダ)ドメインについてコードするDNAフラグメントをマウスIg−ラムダ定常領域についてコードする配列エレメントに融合することにより組み立てた。
GQPKSSPSVT LFPPSSEELE TNKATLVCTI TDFYPGVVTV DWKVDGTPVT QGMETTQPSK QSNNKYMASS YLTLTARAWE RHSSYSCQVT HEGHTVEKSL SRADCS
(配列番号48)。
−イントロンAを含む、ヒトサイトメガロウイルス(P−CMV)からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−可変軽鎖(VL)ドメインコード核酸、
−マウスIg−ラムダ定常領域コード核酸、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
IgG重鎖構築物についてコードする発現ベクターの場合において、分子のIgG部分は、ゲノム構成中にあり、即ち、イントロンが、シグナルペプチド中に、VHドメインとCH1ドメインの間に、CH1ドメインとヒンジ領域の間に、ヒンジ領域とCH2ドメインの間に、及びCH2ドメインとCH3ドメインの間に存在した。そこに(C末端/3’末端に)、脳シャトルモジュールについてコードするcDNAエレメントを融合させた。完全抗体分子当たり1つだけの脳シャトルモジュールを持つ抗体分子を産生するために、「ノブ−イントゥ−ホール」技術を用いた。
ヒトIgG1定常領域(CH1、ヒンジ、CH2、CH3)及びウサギに由来する抗アルファ−シヌクレイン抗体VHドメインを含むヒトIgG1コード融合遺伝子を、それぞれの抗アルファ−シヌクレイン抗体VHドメインについてコードするDNAフラグメントを、「ホール」変異を含むヒトIgG1定常領域についてコードする配列エレメントに融合することにより組み立てた。構築物は、ゲノム構成中にあり、即ち、イントロンが、シグナルペプチド中に、VHドメインとCH1ドメインの間に、CH1ドメインとヒンジ領域の間に、ヒンジ領域とCH2ドメインの間に、及びCH2ドメインとCH3ドメインの間に存在した。
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
(配列番号49)。
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
(配列番号50)。
−ヒトサイトメガロウイルス(P−CMV)からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−重鎖可変(VH)ドメインコード核酸、
−「ホール」変異コード核酸を伴うヒトIgG1定常領域、
−場合により、血液脳関門シャトルモジュールコード核酸に融合されたGSリンカーコード核酸、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
ヒトIgG1定常領域(CH1、ヒンジ、CH2、CH3)及びウサギに由来する抗アルファ−シヌクレイン抗体VHドメインを含むヒトIgG1コード融合遺伝子を、それぞれの抗アルファ−シヌクレイン抗体VHドメインについてコードするDNAフラグメントを、「ノブ」変異を含むヒトIgG1定常領域についてコードする配列エレメントに融合することにより組み立てた。構築物は、ゲノム構成中にあり、即ち、イントロンが、シグナルペプチド中に、VHドメインとCH1ドメインの間に、CH1ドメインとヒンジ領域の間に、ヒンジ領域とCH2ドメインの間に、及びCH2ドメインとCH3ドメインの間に存在した。
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLSC AVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLV SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
(配列番号51)。
−ヒトサイトメガロウイルス(P−CMV)からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−重鎖可変(VH)ドメインコード核酸、
−「ノブ」変異コード核酸を伴うヒトIgG1定常領域、
−場合により、血液脳関門シャトルモジュールコード核酸に融合されたGSリンカーコード核酸、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
ヒトIg−カッパ定常領域(CL−カッパ)及びウサギに由来する抗アルファ−シヌクレイン抗体VL(カッパ)ドメインを含むヒトIg−カッパ軽鎖コード融合遺伝子を、それぞれの抗アルファ−シヌクレイン抗体VL(カッパ)ドメインについてコードするDNAフラグメントをヒトIg−カッパ定常領域についてコードする配列エレメントに融合することにより組み立てた。構築物は、ゲノム構成中にあり、即ち、イントロンが、シグナルペプチド中に、及びVL(カッパ)ドメインとCL−カッパドメインの間に存在した。
−ヒトサイトメガロウイルス(P−CMV)からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−軽鎖可変(VL)ドメインコード核酸、
−ヒトIgGカッパ定常領域、
−場合により、血液脳関門シャトルモジュールコード核酸に融合されたGSリンカーコード核酸、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
ヒトIg−ラムダ定常領域(CL−ラムダ)及びウサギに由来する抗アルファ−シヌクレイン抗体VL(ラムダ)ドメインを含むヒトIg−ラムダ軽鎖コード融合遺伝子を、それぞれの抗アルファ−シヌクレイン抗体VL(ラムダ)ドメインについてコードするDNAフラグメントをヒトIg−ラムダ定常領域についてコードする配列エレメントに融合することにより組み立てた。構築物は、ゲノム構成中にあり、即ち、イントロンが、シグナルペプチド中に、及びVL(ラムダ)ドメインとCL−ラムダドメインの間に存在した。
−ヒトサイトメガロウイルス(P−CMV)からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
−ヒト重鎖免疫グロブリン5’−非翻訳領域(5’UTR)、
−マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−軽鎖可変(VL)ドメインコード核酸、
−ヒトIgGラムダ定常領域、
−場合により、血液脳関門シャトルモジュールコード核酸に融合されたGSリンカーコード核酸、及び
−ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列(BGH pA)。
抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の組換え産生
抗体を、F17 Medium(Invitrogen Corp.)中で培養した一過性トランスフェクトHEK293細胞(ヒト胎児腎臓細胞株293由来)中で産生させた。実施例6において記載する通りのそれぞれのベクターのトランスフェクションのために、「293-Free」Transfection Reagent(Novagen)を使用した。抗体及び抗体血液脳関門シャトル融合体を、個々の発現プラスミドから発現させた。トランスフェクションを、製造業者の使用説明書において指定される通りに実施した。組換え抗体を含む細胞培養上清を、トランスフェクションの3〜7日後に収集した。上清を、精製まで、低温(例えば、−80℃)で保存した。
組換え抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体の精製
抗体を含む培養上清をろ過し、2つのクロマトグラフィー工程により精製した。
表面プラズモン共鳴を使用した結合特異性の特徴付け
BIAcore 2000、3000又はT200機器(GE Healthcare、BIAcore、Uppsala、Sweden)を、全ての記載された方法において適用した。全ての固定化工程及び結合アッセイを25℃で実施した。固定化及び結合アッセイを、それぞれ5又は30μl/分で実施した(特に言及しない場合)。
緩衝液:
固定化緩衝液:10mM Hepes、150mM NaCl、0.05% ポリソルベート20(P20)(pH7.5)
捕捉及び結合緩衝液:10mM Hepes(pH7.5)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% P20
i)ヤギ抗マウス免疫グロブリンIgG(捕捉抗体)の固定化
ヤギ抗マウスIgG(マウス抗体捕捉キット;カタログ番号BR−1008−38;GE Healthcare、Uppsala、Sweden)の固定化を、10mM Hepes、150mM NaCl、0.05% P20を含む緩衝液(pH7.5)中で実施した。最初の工程において、CM5センサーチップ表面のカルボキシル基が、センサー表面を0.2M N−エチル−N−ジメチルアミノポリカルボジイミド(EDC)及び0.05M N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)の溶液と7分間接触させることにより、反応性スクシンイミドエステルに変換された。活性化後、センサー表面を、10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.0)中の30μg/mlのヤギ抗マウスIgGと3分間接触させた。IgGを、約3000RU(応答単位)のレベルに固定化した。最後に、表面上の過剰の活性化カルボキシル基をエタノールアミン(1M、pH8.5、7分間)でクエンチした。
モノクローナル抗アルファ−シヌクレイン抗体(泳動緩衝液中の100nM溶液)を、200〜250RUの捕捉抗体の量に達するまで、固定化IgG抗体上に捕捉した。センサーチップの1つのチャネルを、参照チャネルとして、固定化ヤギ抗マウス抗体を用いて使用した。
結合実験を、10mM Hepes、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% P20を含む緩衝液(pH7.5)中で実施した。精製単量体アルファ−シヌクレイン−ヘキサHisを、捕捉モノクローナル抗アルファ−シヌクレイン抗体の表面上で、334nM(5ポイント、希釈係数2)まで滴定した。精製単量体アルファ−シヌクレイン−ヘキサHisの各々の滴定後、アルファ−シヌクレイン及びモノクローナル抗アルファ−シヌクレイン抗体の複合体を、10mM グリシン−HCl溶液(pH1.7)の短いパルスを用いて、チップから除去した。新たなモノクローナル抗アルファ−シヌクレイン抗体を、その後、チップ表面上で捕捉した。
緩衝液:
固定化緩衝液:10mM Hepes、150mM NaCl、0.05% P20(pH7.5)
結合緩衝液:10mM Hepes(pH7.5)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% P20
NTA(ニトリロ三酢酸)センサー表面上での単量体α−シヌクレイン−ヘキサHis(N末端)の固定化を、10mM Hepes、150mM NaCl、0.05%P20を含む泳動緩衝液(pH7.5)中で実施した。NTAセンサー表面を、最初に、5μl/分の流量で0.35M EDTAを用いて、各々1分間にわたり3回洗浄した。その後、センサー表面に、チップ表面と泳動緩衝液中の500μM NiCl2との1分間の接触により、Ni2+イオンを添加し、更に0.2M EDC及び0.05M NHS溶液を用いて7分間にわたり活性化した。更に、泳動緩衝液中のヘキサHis標識アルファ−シヌクレイン(<0.1μg/ml)をセンサー表面と接触させ、低密度面(5RUまで)を達成し、アルファ−シヌクレインへのモノクローナル抗アルファ−シヌクレイン抗体の一価の結合の更なる検出を可能にした。最後に、活性エステルの残りの基を、1M Tris(pH7.5)を用いて5分間にわたり不活性化させた。固定化アルファ−シヌクレインを伴わないフローチャネルを、参照チャネルとして使用した。
結合アッセイを、10mM Hepes、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% P20を含む緩衝液(pH7.5)中で実施した。モノクローナル抗アルファ−シヌクレイン抗体をイエス/ノー結合応答について100nMの単一濃度で分析し、又は100nMまでの濃度(希釈係数2を伴う5つの濃度の単回注射)の泳動緩衝液中で滴定し、単量体アルファ−シヌクレインに対する結合動態及び親和性を推定した。各々の抗アルファ−シヌクレイン抗体の各々の濃度についての結合曲線のモニタリング後、アルファ−シヌクレイン表面を、100mM リン酸の2つの短いパルス(2×1分間)を用いて再生し、結合抗体を洗い流し、別の抗体結合のモニタリングを可能にした。
緩衝液:
固定化及び結合緩衝液:50mM Hepes、150mM NaCl(pH7.5)
クロロホルム中の脂質DOPC:DOPS(1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン:1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−L−セリン)の25mg/mL(7:3(w/w))混合物を、真空フード下でアルゴン流を用いて、ガラスフラスコ中で蒸発させ、フラスコ壁上で脂質フィルムを得た。脂質フィルムを、Hepes緩衝液(50mM HEPES、150mM NaCl、pH7.5)中で水和させ、5mM緩衝脂質溶液を得た。脂質溶液をMini-Extruder(Avanti Polar Lipids、Alabaster、USA)を用いて、100nM押出機フィルターを介した脂質溶液の15回の通過により押出し、リポソーム溶液を得た。リポソームの質及びサイズを、動的光散乱法により証明した。
DOPC:DOPSリポソーム上でのアルファ−シヌクレイン−ヘキサHis(N末端タグ)の固定化を、50mM Hepes、150mM NaClを含む緩衝液(pH7.5)中で実施した。L1センサー表面の全てのフローチャネルを、最初に、20mM Chaps溶液を用いて1分間にわたり洗浄し、安定したベースラインを得た。押出により得られたDOPC:DOPSリポソーム溶液を、泳動緩衝液中で5倍希釈し、全てのフローチャネルのセンサー表面上に添加し、約3000RUの固定化レベルを得た。全てのフローチャネルを、次の工程において、BSA(ウシ血清アルブミン)溶液(0.1mg/mL)を用いてブロックし、センサー表面上での/へのアルファ−シヌクレインの非特異的結合を低下させた。アルファ−シヌクレインを、泳動緩衝液中で濃度5.0μg/mlに希釈し、選択されたフローチャネル上で低密度(<30RU)にリポソーム上に固定化し、アルファ−シヌクレインに結合する一価抗体の検出を可能にした。固定化されたリポソームを伴うが、アルファ−シヌクレインを伴わないフローチャネルを、参照チャネルとして使用した。
結合アッセイにおいて、各々の抗体を、イエス/ノー結合応答について、100nMの単一濃度で分析した、又は、100nMの濃度まで(希釈係数2を伴う5ポイント)、アクティブチャネル及び参照チャネル上で、泳動緩衝液中で滴定し、アルファ−シヌクレインへの結合動態及び親和性を推定した。抗体結合のモニタリング後、センサー表面を、20mM Chapsを用いて1分間にわたり再生させ、リポソームの次の固定化のために、泳動緩衝液を用いて平衡化した。
緩衝液:
固定化緩衝液:10mM Hepes、150mM NaCl、0.05% P20(pH7.5)
結合緩衝液:10mM Hepes(pH7.5)、150mM NaCl、3mM EDTA、0.05% P20
アルファ−シヌクレインPFF(N末端ヘキサHisタグ標識アルファ−シヌクレイン及び非標識アルファ−シヌクレインを比率1:10で含む)のHisタグ固定化を、10mM Hepes、150mM NaCl、0.05% P20を含む泳動緩衝液(pH7.5)中で、NTAセンサー上で実施した。NTAセンサー表面を、最初に、5μl/分の流量で0.35M EDTA溶液を用いて、1分間にわたり洗浄した。その後、センサー表面に、表面と泳動緩衝液中の500μM NiCl2溶液との1分間の接触により、Ni2+イオンを添加し、更に0.2M EDC及び0.05M NHS溶液を用いて7分間にわたり活性化した。泳動緩衝液中のアルファ−シヌクレインPFFの希釈溶液を、センサー表面と接触させ、センサー表面上で種々の原線維密度(約20RU、約200RU及び約2000RU)を達成した。活性エステルの残りの遊離基の不活性化を、1M Tris(pH7.5)を用いて5分間にわたり実施した。アルファ−シヌクレイン原線維が固定化されなかったフローチャネルの1つを、参照チャネルとして使用した。
各々の抗アルファ−シヌクレイン抗体の結合を、並列における全ての4つのチャネルで、100nMの濃度まで(5ポイント、希釈係数2)滴定実験においてモニターした。各々の抗体についての結合曲線のモニタリング後、アルファ−シヌクレインPFF表面を、100mM リン酸の短いパルス(2×1分間)を用いて再生し、結合抗体を洗い流した。
また、血液脳関門シャトルモジュールを伴う融合体として、本明細書において報告する通りの異なるアルファ−シヌクレイン抗体の、及び、上に記載する通りのSPRを用いて決定された特定の参照抗体の結合を、下の表中に示す。
−抗体0076は、抗体0018と抗トランスフェリン受容体抗体8D3のscFvとの血液脳関門シャトル融合体である。
免疫組織化学分析及び細胞毒性アッセイ
PD脳切片の免疫組織化学分析
ヒトパーキンソン病患者の脳の凍結切片(10μm)を、抗体0017、抗体0018又は抗体0057(マウスFc)の5.0μg/ml 一次IgGを用いて染色し、5.0μg/ml ウサギ抗アルファ−シヌクレイン抗体(Cell Signaling;カタログ番号2628S)を用いて対比染色した。
LUHMES細胞を、下に詳細に記載する通り、384ウェルプレート中で5日間にわたり分化させた。播種から24時間後、LUHMES分化培地中で成長するSHSY5Y細胞からの条件細胞培養上清を、1:1希釈でプレートに加え、エキソソーム媒介性アルファ−シヌクレイン毒性を誘導した。対照培養物は、LUHMES分化培地を受けた。試験する抗体を、最終濃度10μg/mlで、条件SHSY5Y培地と一緒に加えた。細胞生存率を、CellTiterGloアッセイ(Promega、カタログ番号REF G7571)により、追加の4日後に決定した。生存率の値は、CPSカウントとして表示される。
コーティング、培地及び添加物:
−ポリ−L−オルニチン:Sigma-Aldrich、カタログ番号P−3655−100mg
−フィブロネクチン(溶液):Sigma-Aldrich、カタログ番号F−1141−5mg
−アドバンストDMEM/F−12:Gibco/Invitrogen、カタログ番号12634−010
−N−2:Gibco/Invitrogen、カタログ番号17502048又はPAA F005−004
−L−グルタミン:Sigma-Aldrich、カタログ番号G7513
−FGF:R&D Systems、カタログ番号4114−TC(1mg)
−GDNF:R&D Systems、カタログ番号212−GD(50μg)
−テトラサイクリン:Sigma-Aldrich、カタログ番号T−7660
−cAMP:Sigma-Aldrich、カタログ番号D0627
コーティング(全てのプレート及びフラスコは、Nunclonでなければならない):
75cm2フラスコにおいて増殖培地中で培養した細胞を、80%のコンフルエンスに達した際に分割した。最初に、細胞を10mlのPBSで2回洗浄した。次に、4mlのATV−トリプシンを加えた(2mlの2×ATV−トリプシンストック溶液を、2mlのPBSと先に混合する)。細胞を、3分間にわたり37℃でインキュベートした。細胞が剥離した際、添加剤を伴わない21mlのアドバンストDMEM/F12培地を加えた。細胞懸濁液を、300×gで5分間にわたり50ml Falconチューブ中で遠心分離した。上清を除去し、細胞を、添加剤を伴わない5mlのアドバンストDMEM/F12培地中に再懸濁した。細胞をNeubauerチャンバー中でカウントした。
LUHMES細胞の前分化は、175cm2フラスコ中で行われた。したがって、6*106個の細胞を、20mlの増殖培地中に播種した。付着及び増殖の24時間後、培地を交換した。増殖培地を分化培地に交換した。追加の48時間後、前分化を終了した。
更なる分化を、コーティングされた細胞培養プレート中で行った。
熱安定性
モノクローナル抗アルファ−シヌクレイン抗体(2μM)の変性点(融点、Tm)を、レポーターフルオロフォアとしてSypro Orangeを使用した熱シフトアッセイにより決定した。
エピトープマッピング
エピトープマッピングは、JPT Peptide Technologiesにより提供される特別注文のPepStar(商標)ペプチドマイクロアレイ上で実施した。ペプチド配列は、15アミノ酸残基長を有し、ヒトアルファ−シヌクレイン(UniProtアクセッション番号:P37840)の全配列をカバーするように設計した。隣接ペプチドは、11アミノ酸の重複配列を有した。追加のペプチドは、疾患関連アルファ−シヌクレイン変異の公知の部位(A30P、A53T、E57K)を伴う配列及びげっ歯類アルファ−シヌクレインへの交差反応性を評価するための配列を含む。更に、12ペプチド/タンパク質をスポットし、それらは、一次及び二次抗体の反応性及び特異性の対照としての役割を果たした。タンパク質は、以下の通りであった:ウシ血清アルブミン、ヒトIgG、ウサギIgG、マウスIgG、ヒトタウタンパク質、ヒトアルファ−シヌクレイン、ヒトベータ−シヌクレイン、ヒトガンマ−シヌクレイン、ヒトIgM、マウスIgM、ホスホ−チロシンペプチド、ヒトアルファ−三重プロリン変異シヌクレイン(A30P、A56P、A76P)。
抗アルファ−シヌクレイン抗体−血液脳関門シャトルモジュールコンジュゲートによるアルファ−シヌクレイン病理の急性インビボ標識
研究デザイン
15カ月齢Thy1−(A30P)アルファ−シヌクレイントランスジェニックマウスの3群(Kahleマウス;n=3/群)及び野生型対照(n=1/群)に、3つの異なる抗アルファ−シヌクレイン抗体−血液脳関門シャトルモジュールコンジュゲートを注射した:
−抗体0070 −> 抗体0017−scFab8D3コンジュゲート
−抗体0076 −> 抗体0018−scFab8D3コンジュゲート
−参照 −> 12F4−scFab8D3コンジュゲート。
脳における標的占有率を、20μmクライオスタット脳切片(4/マウス;アセトン固定し、NGSでブロック)上でAF555タグ抗huIgG抗体を用いて検出した。同時染色を実施した:血管(抗ポドカリキシン、AF647);DAPI。
脳幹の実質は:大きな神経炎/アルファ−シヌクレイン蓄積構造からシナプス染色と類似したびまん性点状染色まで変動する。
CelluSpots(商標)合成及びエピトープマッピング
抗体0018のエピトープ分析用のペプチドアレイを、Intavis CelluSpots(商標)技術を使用することにより調製した。このアプローチにおいて、ペプチドを、合成後に溶解される改変セルロースディスク上で、自動合成器(Intavis MultiPep RS)を用いて合成した。高分子セルロースに共有結合的に連結されたままである個々のペプチドの溶液を、次に、コーティングされた顕微鏡スライド上にスポットした。CelluSpots(商標)合成は、384ウェル合成プレートにおいて、アミノ改変セルロースディスク上での9−フルオレニルメトキシカルボニル(Fmoc)化学を利用して、段階的に行った。各々のカップリングサイクルにおいて、対応するアミノ酸は、DMF中のDIC/HOBt溶液を用いて活性化された。カップリング工程の間、未反応(即ち、遊離)アミノ基を、無水酢酸、ジイソプロピルエチルアミン及び1−ヒドロキシベンゾトリアゾールの混合物を用いてキャップした。合成の完了時、セルロースディスクを96ウェルプレートに移し、側鎖の脱保護のために、トリフルオロ酢酸(TFA)、ジクロロメタン、トリイソプロピルシラン(TIS)及び水の混合物で処理した。切断溶液の除去後、セルロース結合ペプチドを、TFA、TFMSA(トリフルオロエタンスルホン酸)、TIS及び水の混合物を用いて溶解し、ジイソプロピルエーテルを用いて沈殿させ、DMSO中に再懸濁した。これらのペプチド溶液を、その後、Intavisスライドスポッティングロボットを使用し、Intavis CelluSpots(商標)スライド上にスポットした。
Claims (27)
- ヒトアルファ−シヌクレインが遊離のN末端メチオニン残基を有する、ヒトアルファ−シヌクレインに特異的に結合する抗体。
- 抗体が、ヒト及びマウスのアルファ−シヌクレインに特異的に結合し、ヒト及びマウスのアルファ−シヌクレインが遊離のN末端メチオニン残基を有する、請求項1記載の抗体。
- アルファ−シヌクレインが単量体及び/又はオリゴマーアルファ−シヌクレインである、請求項1〜2のいずれか一項記載の抗体。
- 抗体が、重鎖において配列番号15〜17のHVR、及び軽鎖において配列番号18〜20のHVRを含む抗体と同じエピトープに結合する、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗体。
- 抗体が、配列番号26の重鎖可変ドメイン及び配列番号27の軽鎖可変ドメインを含む抗体と同じエピトープに結合する、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗体。
- 抗体が、重鎖において配列番号21、22及び17のHVR、並びに軽鎖において配列番号23〜25のHVRを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の抗体。
- 抗体が、配列番号26の重鎖可変ドメイン及び配列番号27の軽鎖可変ドメインを含む抗体をヒト化することにより得られている、請求項1〜3及び6のいずれか一項記載の抗体。
- 抗体が、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインにおいて配列番号15〜17のHVR、及び軽鎖可変ドメインにおいて配列番号18〜20のHVRを含み、各々のHVRにおいて、0〜3個のアミノ酸残基が変化されている、請求項1〜7のいずれか一項記載の抗体。
- 抗体が、ヒト化抗体であり、重鎖可変ドメインが、配列番号26の重鎖可変ドメインに由来し、軽鎖可変ドメインが、配列番号27の軽鎖可変ドメインに由来する、請求項1〜8のいずれか一項記載の抗体。
- 重鎖において配列番号15〜17のHVR、及び軽鎖において配列番号18〜20のHVRを含む抗体と同じエピトープに結合する抗体。
- 重鎖において配列番号21、22及び17のHVR、並びに軽鎖において配列番号23〜25のHVRを含む抗体と同じエピトープに結合する抗体。
- 重鎖において配列番号15〜17のHVR、及び軽鎖において配列番号18〜20のHVRを含む抗体。
- 重鎖において配列番号21、22及び17のHVR、並びに軽鎖において配列番号23〜25のHVRを含む抗体。
- 配列番号26の重鎖可変ドメイン及び配列番号27の軽鎖可変ドメインを含む抗体から得られた抗体。
- 重鎖可変ドメインにおいて配列番号15〜17のHVR、及び軽鎖可変ドメインにおいて配列番号18〜20のHVRを含むヒト化抗体であって、各々のHVRにおいて、0〜3個のアミノ酸残基が変化されている抗体。
- 重鎖可変ドメインにおいて配列番号21、22及び17のHVR、並びに軽鎖可変ドメインにおいて配列番号23〜25のHVRを含むヒト化抗体であって、各々のHVRにおいて、0〜3個のアミノ酸残基が変化されている抗体。
- 重鎖可変ドメインが、配列番号26の重鎖可変ドメインに由来し、軽鎖可変ドメインが、配列番号27の軽鎖可変ドメインに由来するヒト化抗体。
- 抗体が、血液脳関門シャトルモジュールにコンジュゲートされる、請求項1〜17のいずれか一項記載の抗体。
- 血液脳関門シャトルモジュールが、LRP1、LRP8、ヒトトランスフェリン受容体又はヒトインスリン様成長因子受容体に特異的に結合する抗体又は抗体フラグメントである、請求項18記載の抗体。
- 請求項1〜19のいずれか一項記載の抗体であって、抗体が、
a)ヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、又は
b)ヒトサブクラスIgG4の完全長抗体、又は
c)変異L234A、L235A及びP329Gを伴うヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、
d)変異S228P、L235E及びP329Gを伴うヒトサブクラスIgG4の完全長抗体、
e)両方の重鎖における変異L234A、L235A及びP329G並びに1つの重鎖における変異T366W及びS354C並びにそれぞれの他の重鎖における変異T366S、L368A、Y407V及びY349Cを伴うヒトサブクラスIgG1の完全長抗体、又は
f)両方の重鎖における変異S228P、L235E及びP329G並びに1つの重鎖における変異T366W及びS354C並びにそれぞれの他の重鎖における変異T366S、L368A、Y407V及びY349Cを伴うヒトサブクラスIgG4の完全長抗体、である抗体。 - 請求項1〜20のいずれか一項記載の抗体であって、抗体が、
i)ヒトニューロン及びグリア細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性の細胞毒性を阻害する、及び/又は
ii)ニューロンとグリア細胞の間でのオリゴマーヒトアルファ−シヌクレインの細胞間伝達を阻害する、及び/又は
iii)ヒト神経細胞においてアルファ−シヌクレイン誘導性のカスパーゼ活性を低下させる、及び/又は
iv)遊離のN末端メチオニン残基を有するアルファ−シヌクレインに特異的に結合し、改変N末端メチオニン残基を有するアルファ−シヌクレインには特異的に結合しない、
抗体。 - 請求項1〜21のいずれか一項記載の抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬的製剤。
- 医薬としての使用のための、請求項1〜21のいずれか一項記載の抗体。
- シヌクレイノパチーの処置における使用のための、請求項1〜21のいずれか一項記載の抗体。
- パーキンソン病の処置における使用のための、請求項1〜21のいずれか一項記載の抗体。
- 医薬の製造における、請求項1〜21のいずれか一項記載の抗体の使用。
- 医薬が、パーキンソン病の処置のためである、請求項26記載の使用。
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