BR112016010065B1 - Anticorpos anti-alfa-sinucleína humana e formulação farmacêutica que os compreend - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS ANTI-ALFA-SINUCLEÍNA E MÉTODOS DE USO. A presente invenção oferece anticorpos anti-alfa-sinucleína humana e métodos de uso dos mesmos.

Description

Campo da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a anticorpos anti-alfa- sinucleína humana e a métodos de uso dos mesmos.

Antecedentes

[002] O mal de Parkinson caracteriza-se por uma perda progressiva de neurônios dopaminérgicos (DA) do sistema nigroestriatal e pela presença de corpos de Lewy (LB) e neurites (LN), inclusões intraneuronais proteináceas compostas principalmente de agregados filamentos de alfa-sinucleína. Alfa-sinucleína é uma proteína que no cérebro desempenha um papel central no controle das funções neuronais dopaminérgicas e que se acredita estar criticamente envolvida na patofisiologia de PD. Na verdade, além do fato de que a alfa-sinucleína é o principal componente proteico de LB, estudos genéticos mostraram que certas mutações pontuais no gene da alfa-sinucleína e multiplicações do mesmo causam formas familiares de PD. Uma grande quantidade de evidências indica que a patologia de alfa-sinucleína em sinapses dopaminérgicas podem ser subjacente ao surgimento de disfunção e degeneração em células neuronais no cérebro com PD (Bellucci, A., et al., Brain Res. 1432 (2012) 95-113).

[003] Corpos de Lewy, que são depósitos de alfa-sinucleína, são o sinal patológico de mal de Parkinson (PD) (Goedert, M., Nat. Rev. Neurosci 2 (2001) 492-501). O estadiamento de patologia cerebral relacionada com PD esporádico foi reportado por Braak et al. (Neurobiology of aging 24 (2003) 197-211).

[004] Agregados fibrilares de alfa-sinucleína são o principal componente de corpos de Lewy e neurites de Lewy. Um trabalho científico recente sugere que oligômeros prefibrilares de alfa- sinucleína podem ser contribuidores essenciais na evolução do mal de Parkinson (Luk, K.C., et al., Science 338 (2012) 949-953; Auluck, P.K., et al., Science 295 (2002) 865-868; Bodner, R.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 4246-4251; Bucciantini, M., et al., J. Biol. Chem. 279 (2004) 31374-31382; El-Agnaf, O.M., et al., FASEB J. 20 (2006) 419-425; Kayed, R., et al., Science 300 (2003) 486-489; Lashuel, H.A., et al., J. Mol. Biol. 322 (2002) 1089-1102; Masliah, E., et al., Science 287 (2000) 1265-1269.).

[005] Chai, Y-J., et al., relatam que a forma oligomérica secretada da a-sinucleína afeta múltiplas etapas do trânsito de membranas (FEBS Lett. 587 (2013) 452-459). Exossomas de células BV-2 induzidos por alfa-sinucleína: mediador importante da neurodegeneração em PD são relatados por Chang, C., et al., Neurosci. Lett. 548 (2013) 190-195). Feng, R.L., et al. relatam que a alfa-sinucleína medeia alterações na condutância de membranas: um papel potencial para oligômeros de alfa-sinucleína na vulnerabilidade celular (Eur. J. Neurosci. 32 (2010) 10-17). Lee, H-J., et al. relatam que insuficiência autofágica promove a exocitose e a transferência intercelular de alfa-sinucleína (Exp. Mol. Med. 45 (2013) e22). A patologia sináptica de agregação de alfa-sinucleína em demência com corpos de Lewy, demência associada ao mal de Parkinson e demência associada ao mal de Parkinson Dementia é relatada por Schulz- Schaeffer, W.J. (Acta Neuropathol. 120 (2010) 131-143).

[006] A vasta maioria de alfa-sinucleínas no cérebro humano é acetilada no terminal N (Kellie, J.F., et al., Sci. Rep. 4 (2014) 5797) e esta acetilação no terminal N inibe a agregação de alfa-sinucleína (Bartels, T., et al., PLoS One 9 (2014) e103727).

[007] Diferentes formas oligoméricas de alfa-sinucleína recombinante já foram reportadas: oligômeros tipo A (citotóxicos, efeito sobre o influxo de Ca2+), oligômeros tipo C (espécie inoculante de agregados), fibrilas misturadas com lipídios (inoculam a agregação de agregados intracelulares), A30P/A56P/A76P mutante para triplo prolina (TP) (forma oligômeros predominantemente tóxicos (vide, por exemplo, Danzer, K.M., et al., J. Neurosci. 27 (2007) 9220-9232; Danzer, K.M., et al. J. Neurochem. 111 (2009) 192-203; Luk, C.K., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009) 20051-20056; Desplates, P., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009) 13010-13015; Karpinar, D.P., et al., EMBO J. 28 (2009) 3256-3268; Lee, H-J., et al., J. Biol. Chem. 285 (2010) 9262-9272; Hansen, C., et al., J. Clin. Invest. 121 (2011) 715-725).

[008] A transmissão de alfa-sinucleína patológica que inicia neurodegeneração semelhante a Parkinson em camundongos não transgênicos foi descrita por Luk, K.C., et al. (Science 338 (2012) 949953). A inoculação induzida por oligômeros de alfa-sinucleína fornece evidências de espalhamento da patologia de alfa-sinucleína e a transmissão exossômica de célula para célula de oligômeros de alfa- sinucleína foi descrita por Danzer, K.M., et al. (J. Neurochem. 111 (2009) 192-203; Mol. Neurodegen. 7 (2012) 42). Braidy et al. descrevem a transmissão de alfa-sinucleína e a toxicidade mitocondrial em neurônio entéricos primários de feto humano in vitro (Neurotox. Res. (2013) epub on October 5, 2013). Desplats, P., et al. descrevem a formação de inclusões e a morte de células neuronais através da transmissão de neurônio para neurônio de alfa-sinucleína (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009) 13010-13015). Que a transferência direta de alfa-sinucleína de neurônio para astróglia causa respostas inflamatórias em sinucleinopatias foi descrita por Lee et al. (J. Biol. Chem. 285 (2010) 9262-9272). Lee, S-J., et al. descrevem a transmissão de célula para célula de agregados de alfa-sinucleína (Meth. Mol. Biol. 849 (2012) 347-359; Nat. Rev. Neurol. 6 (2010) 702- 706). A evidência provavelmente mais forte de uma evolução da patologia de alfa-sinucleína por uma possível transmissão de um inóculo de agregação de alfa-sinucleína é proveniente da análise postmortem dos cérebros certos pacientes com PD que apresentaram patologia de Lewy nos neurônios fetais que foram enxertados em seus cérebros 11-16 anos antes (Li, J-Y., et al., Nat. Med. 14 (2008) 501503).

[009] A alfa-sinucleína agregada medeia a neurotoxicidade dopaminérgica in vivo (Periquet, M., et al., J. Neurosci. 27 (2007) 3338-3346). Pieri, L., et al. descrevem que montagens de alfa- sinucleína fibrilar e exon 1 huntingtin são tóxicos para as células (Biophys. J. 102 (2012) 2894-2905). Van Rooijen et al. descrevem a permeabilização de membranas por alfa-sinucleína oligomérica: em busca do mecanismo (PLoS One 5 (2010) e14292).

[0010] Muito recentemente, Wagner et al. demonstraram em ensaios celulares em um modelo de camundongo transgênico de alfa- sinucleína que a molécula pequena Anle138b age como um modulador protetor de oligômeros de alfa-sinucleína que pode ser útil para terapia modificadora de doença do mal de Parkinson (Wagner, J, et al., Acta Neuropathol. 125 (2013) 795-813). Lynch, S.M., et al. descrevem que um intracorpo scFv contra o componente não amiloide da alfa- sinucleína reduz a agregação intracelular e a toxicidade (J. Mol. Biol. 377 (2008) 136-147). Uma estratégia para desenhar inibidores da agregação e da toxicidade de alfa-sinucleínas como um novo tratamento para o mal de Parkinson e distúrbios relacionados foi descrita por El-Agnaf, O.M., et al. (FASEB J. (2004)). Emadi, S., et al. descrevem a inibição de agregação de alfa-sinucleína com fragmentos de anticorpos de cadeia única humano e o isolamento de um fragmento de anticorpo de cadeia única humano contra alfa-sinucleína oligomérica que inibe a agregação e previne a toxicidade induzida pela alfa-sinucleína (Biochem. 43 (2004) 2871-2878; J. Mol. Biol. 368 (2007) 1132-1144). Smith et al. descrevem efeitos de imunoglobulina intravenosa sobre a agregação e neurotoxicidade de alfa-sinucleína (Int. Immunopharmacol. 14 (2012) 550-557). A vetorização de alfa- sinucleína intracelular e extracelular como uma estratégia terapêutica no mal de Parkinson e outras sinucleinopatias foi descrita por Vekrelis, K. e Stefanis, L. (Expert. Opin. Ther. Targets 16 (2012) 421-432).

[0011] A depuração auxiliada por anticorpo de sinucleinopatia cerebral nos respectivos camundongos transgênicos foi demonstrada em um paradigma de imunização ativa (Masliah, E., et al., Neuron 46 (2005) 857-868) e em um paradigma de imunização passiva (Masliah, E., et al., PLoS One 6 (2011) e19338). Que a ligação de alfa- sinucleína extracelular por anticorpos específicos previne a transmissão de agregados de célula para célula foi descrita por Bae, E-J., et al. (J. Neurosci. 32 (2012) 13454-13469).

[0012] O uso de mimótopos de epítopos de alfa-sinucleína para tratar doenças com corpos de Lewy foi descrito no documento WO 2011/020133. No documento WO 2007/011907 estão descritos anticorpos para alfa-sinucleína e métodos relacionados aos mesmos. Que a fusão a uma sequência revetorizadora proteassômica altamente carregada aumenta a expressão citoplasmática solúvel e a eficácia de diversos intracorpos anti-sinucleína foi relatada por Joshi et al. (MABS 4 (2012) 686-693). Emadi et al. (J. Mol. Biol. 368 (2007) 1132-1144) descrevem o isolamento de um fragmento de anticorpo de cadeia única humano contra alfa-sinucleína oligomérica que inibe e previne a toxicidade induzida pela alfa-sinucleína. A deteção de formas oligoméricas morfologicamente distintas da alfa-sinucleína foi descrita por Emadi et al. (J. Biol. Chem. 284 (2009) 11048-11058). Zhou et al. (Mol. Ther. 10 (2004) 1023-1031) descrevem que um intracorpo Fv de cadeia única humano bloqueia efeitos celulares aberrantes de alfa- sinucleína superexpressa. Que anticorpos contra alfa-sinucleína reduzem a oligomerização em células vivas foi descrito por Nasstrom et al. (PLoS One 6 (2011) e27230). Anticorpos de ligação de protofibrila e seu uso em métodos terapêuticos e de diagnóstico para mal de Parkinson, demência com corpos de Lewy e outras alfa- sinucleinopatias estão descritos no documento WO 2011/104696. O isolamento de anticorpos recombinantes contra morfologias proteicas específicas usando microscopia de força atômica e tecnologias de exibição de fatos foi descrito por Barkhordarian et al. (Prot. Eng. Des. Select. 19 (2006) 497-502). Kvam et al. (PLoS One 4 (2009) e5727) descrevem que a vetorização conformacional de proteínas poliglutamínicas fibrilares em células vivas aumenta progressivamente a agregação e a citotoxicidade.

Sumário

[0013] A invenção oferece anticorpos anti-alfa-sinucleína humana e métodos de uso dos mesmos.

[0014] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo que se liga especificamente à alfa-sinucleína humana onde a alfa- sinucleína humana tem um resíduo metionina N-terminal livre.

[0015] O termo "resíduo metionina N-terminal livre" denota um resíduo metionina em um polipeptídio que está localizado no terminal N do polipeptídio e que não é modificado à exceção da ligação amida com a qual ele é conjugado ao resto do polipeptídio. Tal resíduo metionina N-terminal livre é em uma modalidade um resíduo metionina não modificado. Tal resíduo metionina N-terminal livre tem em uma modalidade um grupo amino livre. A alfa-sinucleína humana tem a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 40.

[0016] Em uma modalidade o anticorpo liga-se especificamente às alfa-sinucleínas humana e de camundongo onde as alfa- sinucleínas humana e de camundongo têm um resíduo metionina N- terminal livre.

[0017] Em uma modalidade a alfa-sinucleína é alfa-sinucleína monomérica.

[0018] Em uma modalidade a alfa-sinucleína é alfa-sinucleína monomérica e oligomérica.

[0019] Em uma modalidade o anticorpo liga-se ao mesmo epitope ou um epítopo sobreposto que um anticorpo compreendendo na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 15 a 17 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 18 a 20.

[0020] Em uma modalidade o anticorpo liga-se ao mesmo epitope ou um epítopo sobreposto que um anticorpo compreendendo na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 21, 22 e 17 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 23 a 25.

[0021] Em uma modalidade o anticorpo liga-se ao mesmo epitope ou um epítopo sobreposto que um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 26 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 27.

[0022] Em uma modalidade o anticorpo compreende na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 15 a 17 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 18 a 20.

[0023] Em uma modalidade o anticorpo compreende na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 21, 22 e 17 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 23 a 25.

[0024] Em uma modalidade o anticorpo fora obtido por humanização de um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 26 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 27.

[0025] Em uma modalidade o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 15 a 17 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 18 a 20, onde em cada HVR 0 a 3 resíduos aminoacídicos foram alterados.

[0026] Em uma modalidade o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 21, 22 e 17 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 23 a 25, onde em cada HVR 0 a 3 resíduos aminoacídicos foram alterados.

[0027] Em uma modalidade o anticorpo é um anticorpo humanizado e o domínio variável de cadeia pesada é derivado de um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 26 e o domínio variável de cadeia leve é derivado de um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 27.

[0028] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo ou a um epítopo sobreposto que um anticorpo compreendendo na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 15 a 17 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 18 a 20.

[0029] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo ou a um epítopo sobreposto que um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 26 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 27.

[0030] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo compreendendo na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 15 a 17 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 18 a 20.

[0031] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo compreendendo na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 21, 22 e 17 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 23 a 25.

[0032] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo variante que fora obtido a partir de um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 26 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 27.

[0033] Em uma modalidade o anticorpo variante é um anticorpo humanizado que fora obtido por humanização de um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 26 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 27.

[0034] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo humanizado compreendendo no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 15 a 17 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 18 a 20, onde em cada HVR 0 a 3 resíduos aminoacídicos foram alterados.

[0035] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo humanizado compreendendo no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 21, 22 e 17 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 23 a 25, onde em cada HVR 0 a 3 resíduos aminoacídicos foram alterados.

[0036] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo humanizado onde o domínio variável de cadeia pesada é derivado de um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 26 e o domínio variável de cadeia leve é derivado de um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 27.

[0037] Em uma modalidade de todos os aspectos anteriores o anticorpo é conjugado a um módulo de transporte pela barreira hematoencefálica.

[0038] Em uma modalidade o módulo de transporte pela barreira hematoencefálica é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente ao LRP1, LRP8, receptor de transferrina humana ou receptor do fator de crescimento semelhante à insulina humana.

[0039] Em uma modalidade de todos os aspectos anteriores o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

[0040] Em uma modalidade de todos os aspectos anteriores o anticorpo é um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.

[0041] Em uma modalidade de todos os aspectos anteriores o anticorpo é a) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG1, ou b) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG4, ou c) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG1 com as mutações L234A, L235A e P329G, d) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG4 com as mutações S228P, L235E e P329G, e) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG1 com as mutações L234A, L235A e P329G nas duas cadeias pesadas e as mutações T366W e S354C em uma cadeia pesada e as mutações T366S, L368A, Y407V e Y349C na respectiva outra cadeia pesada, ou f) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG4 com as mutações S228P, L235E e P329G nas duas cadeias pesadas e as mutações T366W e S354C em uma cadeia pesada e as mutações T366S, L368A, Y407V e Y349C na respectiva outra cadeia pesada.

[0042] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19 e SEQ ID N°: 20, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana.

[0043] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24 e SEQ ID N°: 25, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana.

[0044] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável (de coelho) não humano de SEQ ID N°: 26, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável (de coelho) não humano de SEQ ID N°: 27, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana.

[0045] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19 e SEQ ID N°: 20, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana.

[0046] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24 e SEQ ID N°: 25, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana.

[0047] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 26, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 27, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana.

[0048] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende uma primeira cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende seja as alterações aminoacídicas T366W e S354C ou as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C, b) o anticorpo compreende uma segunda cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C ou a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C, c) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19 e SEQ ID N°: 20, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana.

[0049] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende uma primeira cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende seja as alterações aminoacídicas T366W e S354C ou as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C, b) o anticorpo compreende uma segunda cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C ou a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C, c) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24 e SEQ ID N°: 25, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana.

[0050] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende uma primeira cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 26, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende seja as alterações aminoacídicas T366W e S354C ou as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C, b) o anticorpo compreende uma segunda cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 26, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C ou a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C, c) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 27, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana.

[0051] Em uma modalidade o fragmento de anticorpo, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, compreende um domínio variável de cadeia pesada que é uma forma humanizada do domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 56 e um domínio variável de cadeia leve que é uma forma humanizada do domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 57.

[0052] Em uma modalidade de todos os aspectos anteriores o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas, e/ou iv) liga-se especificamente à alfa-sinucleína que tem um resíduo metionina N-terminal livre e não se liga especificamente à alfa- sinucleína que tem um resíduo metionina N-terminal modificado.

[0053] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo que se liga especificamente à alfa-sinucleína humana, onde o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[0054] Em uma modalidade de todos os aspectos e modalidades a célula neuronal humana é uma linhagem celular derivada de células mesencefálicas humanas superexpressando v-myc e controladas por tetraciclina. Em uma modalidade de todos os aspectos e modalidades as células neuronais humanas são células mesencefálicas humanas Lund (LUHMES).

[0055] Em uma modalidade a atividade de caspase é atividade de caspase 3 e/ou caspase 7.

[0056] Em uma modalidade o anticorpo é para uso no tratamento de sinucleinopatias.

[0057] Em uma modalidade o anticorpo é para uso no tratamento de mal de Parkinson.

[0058] Em uma modalidade o anticorpo é função efetora silenciosa. Em uma modalidade o anticorpo não tem qualquer função efetora.

[0059] Em uma modalidade o anticorpo liga-se especificamente a um peptídio que consiste na sequência aminoacídica GKNEEGAPQEG (SEQ ID N°: 01).

[0060] Em uma modalidade o anticorpo tem uma afinidade de ligação para alfa-sinucleína humana monomérica inferior a 10-09 M e superior a 10-07 M.

[0061] Em uma modalidade o anticorpo liga-se especificamente à alfa-sinucleína humana monomérica e oligomérica.

[0062] Em uma modalidade o anticorpo compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 02 a 04 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 05 a 07.

[0063] Em uma modalidade o anticorpo compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 08, 09 e 04 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 10 a 12.

[0064] Em uma modalidade o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID N°: 13 e um domínio variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID N°: 14.

[0065] Em uma modalidade o anticorpo fora obtido por humanização de um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID N°: 13 e um domínio variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID N°: 14.

[0066] Em uma modalidade o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 02 a 04 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 05 a 07, onde em cada HVR até 3 resíduos aminoacídicos podem ser alterados.

[0067] Em uma modalidade o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 08, 09 e 04 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 10 a 12, onde em cada HVR até 3 resíduos aminoacídicos podem ser alterados.

[0068] Em uma modalidade o anticorpo é um anticorpo humanizado e o domínio variável de cadeia pesada é derivado de um domínio variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID N°: 13 e um domínio variável de cadeia leve é derivado de um domínio variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID N°: 14.

[0069] Em uma modalidade o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 15 a 17 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 18 a 20.

[0070] Em uma modalidade o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 21, 22 e 17 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 23 a 25.

[0071] Em uma modalidade o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID N°: 26 e um domínio variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID N°: 27.

[0072] Em uma modalidade o anticorpo fora obtido por humanização de um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID N°: 26 e um domínio variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID N°: 27.

[0073] Em uma modalidade o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 15 a 17 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 18 a 20, onde em cada HVR até 3 resíduos aminoacídicos podem ser alterados.

[0074] Em uma modalidade o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 21, 22 e 17 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 23 a 25, onde em cada HVR até 3 resíduos aminoacídicos podem ser alterados.

[0075] Em uma modalidade o anticorpo é um anticorpo humanizado e o domínio variável de cadeia pesada é derivado de um domínio variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID N°: 26 e um domínio variável de cadeia leve é derivado de um domínio variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID N°: 27.

[0076] Em uma modalidade o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 28 a 30 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 31 a 33.

[0077] Em uma modalidade o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 28, 34 e 30 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 35 a 37.

[0078] Em uma modalidade o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID N°: 38 e um domínio variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID N°: 39.

[0079] Em uma modalidade o anticorpo fora obtido por humanização de um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID N°: 38 e um domínio variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID N°: 39.

[0080] Em uma modalidade o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 28 a 30 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 31 a 33, onde em cada HVR até 3 resíduos aminoacídicos podem ser alterados.

[0081] Em uma modalidade o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 28, 34 e 30 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 35 a 37, onde em cada HVR até 3 resíduos aminoacídicos podem ser alterados.

[0082] Em uma modalidade o anticorpo é um anticorpo humanizado e o domínio variável de cadeia pesada é derivado de um domínio variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID N°: 38 e um domínio variável de cadeia leve é derivado de um domínio variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID N°: 39.

[0083] Em uma modalidade o anticorpo liga-se especificamente à alfa-sinucleína humana fibrilar e não se liga à alfa-sinucleína humana não fibrilar.

[0084] Em uma modalidade o anticorpo é conjugado a um módulo de transporte pela barreira hematoencefálica.

[0085] Em uma modalidade o módulo de transporte pela barreira hematoencefálica é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente ao LRP1, LRP8, receptor de transferrina humana ou receptor do fator de crescimento semelhante à insulina humana.

[0086] Em uma modalidade o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

[0087] Em uma modalidade o anticorpo é um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.

[0088] Em uma modalidade o anticorpo é um fragmento de anticorpo que se liga à alfa-sinucleína humana e i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[0089] Em uma modalidade o anticorpo é a) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG1, ou b) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG4, ou c) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG1 com as mutações L234A, L235A e P329G, d) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG4 com as mutações S228P, L235E e P329G, e) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG1 com as mutações L234A, L235A e P329G nas duas cadeias pesadas e as mutações T366W e S354C em uma cadeia pesada e as mutações T366S, L368A, Y407V e Y349C na respectiva outra cadeia pesada, ou f) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG4 com as mutações S228P, L235E e P329G nas duas cadeias pesadas e as mutações T366W e S354C em uma cadeia pesada e as mutações T366S, L368A, Y407V e Y349C na respectiva outra cadeia pesada.

[0090] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 02, SEQ ID N°: 03 e SEQ ID N°: 04, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 05, SEQ ID N°: 06 e SEQ ID N°: 07, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[0091] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 08, SEQ ID N°: 09 e SEQ ID N°: 04, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11 e SEQ ID N°: 12, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[0092] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável (de coelho) não humano de SEQ ID N°: 13, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável (de coelho) não humano de SEQ ID N°: 14, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[0093] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19 e SEQ ID N°: 20, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[0094] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24 e SEQ ID N°: 25, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[0095] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável (de coelho) não humano de SEQ ID N°: 26, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável (de coelho) não humano de SEQ ID N°: 27, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[0096] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 29 e SEQ ID N°: 30, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 31, SEQ ID N°: 32 e SEQ ID N°: 33, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[0097] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 34 e SEQ ID N°: 30, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 35, SEQ ID N°: 36 e SEQ ID N°: 37, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[0098] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável (de coelho) não humano de SEQ ID N°: 38, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável (de coelho) não humano de SEQ ID N°: 39, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[0099] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 02, SEQ ID N°: 03 e SEQ ID N°: 04, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 05, SEQ ID N°: 06 e SEQ ID N°: 07, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[00100] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 08, SEQ ID N°: 09 e SEQ ID N°: 04, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11 e SEQ ID N°: 12, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[00101] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 13, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 14, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[00102] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19 e SEQ ID N°: 20, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[00103] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24 e SEQ ID N°: 25, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[00104] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 26, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 27, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[00105] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 29 e SEQ ID N°: 30, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 31, SEQ ID N°: 32 e SEQ ID N°: 33, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[00106] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 34 e SEQ ID N°: 30, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 35, SEQ ID N°: 36 e SEQ ID N°: 37, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[00107] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 38, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 39, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[00108] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende uma primeira cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 02, SEQ ID N°: 03 e SEQ ID N°: 04, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende seja as alterações aminoacídicas T366W e S354C ou as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C, b) o anticorpo compreende uma segunda cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 02, SEQ ID N°: 03 e SEQ ID N°: 04, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C ou a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C, c) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 05, SEQ ID N°: 06 e SEQ ID N°: 07, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e d) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[00109] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende uma primeira cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 08, SEQ ID N°: 09 e SEQ ID N°: 04, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende seja as alterações aminoacídicas T366W e S354C ou as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C, b) o anticorpo compreende uma segunda cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 08, SEQ ID N°: 09 e SEQ ID N°: 04, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C ou a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C, c) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 10, SEQ ID N°: 11 e SEQ ID N°: 12, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e d) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[00110] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende uma primeira cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 13, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende seja as alterações aminoacídicas T366W e S354C ou as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C, b) o anticorpo compreende uma segunda cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 13, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C ou a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C, c) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 14, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e d) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[00111] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende uma primeira cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende seja as alterações aminoacídicas T366W e S354C ou as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C, b) o anticorpo compreende uma segunda cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C ou a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C, c) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19 e SEQ ID N°: 20, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e d) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[00112] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende uma primeira cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende seja as alterações aminoacídicas T366W e S354C ou as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C, b) o anticorpo compreende uma segunda cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C ou a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C, c) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24 e SEQ ID N°: 25, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e d) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[00113] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende uma primeira cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 26, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende seja as alterações aminoacídicas T366W e S354C ou as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C, b) o anticorpo compreende uma segunda cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 26, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C ou a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C, c) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 27, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e d) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[00114] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende uma primeira cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 29 e SEQ ID N°: 30, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende seja as alterações aminoacídicas T366W e S354C ou as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C, b) o anticorpo compreende uma segunda cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 29 e SEQ ID N°: 30, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C ou a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C, c) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 31, SEQ ID N°: 32 e SEQ ID N°: 33, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e d) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[00115] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende uma primeira cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 34 e SEQ ID N°: 30, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende seja as alterações aminoacídicas T366W e S354C ou as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C, b) o anticorpo compreende uma segunda cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 28, SEQ ID N°: 34 e SEQ ID N°: 30, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C ou a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C, c) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 35, SEQ ID N°: 36 e SEQ ID N°: 37, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e d) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[00116] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende uma primeira cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 38, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende seja as alterações aminoacídicas T366W e S354C ou as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C, b) o anticorpo compreende uma segunda cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 38, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C ou a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C, c) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 39, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e d) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas.

[00117] Em uma modalidade o fragmento de anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada que é uma forma humanizada do domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 56 e um domínio variável de cadeia leve que é uma forma humanizada do domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 57.

[00118] Um aspecto apresentado neste relatório é um ácido nucleico isolado codificando o anticorpo apresentado nesta invenção.

[00119] Um aspecto apresentado neste relatório é uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico apresentado nesta invenção.

[00120] Um aspecto apresentado neste relatório é um método para a produção de um anticorpo compreendendo a etapa de cultiva a célula hospedeira apresentada nesta invenção para que o anticorpo seja produzido.

[00121] Em uma modalidade o método compreende ainda a etapa de recuperar o anticorpo a partir da célula ou do meio de cultura.

[00122] Um aspecto apresentado neste relatório é uma formulação farmacêutica compreendendo o anticorpo apresentado nesta invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00123] Em uma modalidade a formulação farmacêutica compreende ainda um agente terapêutico adicional.

[00124] Um aspecto apresentado neste relatório é o anticorpo apresentado nesta invenção para uso como um medicamento.

[00125] Um aspecto apresentado neste relatório é o anticorpo apresentado nesta invenção para uso no tratamento de sinucleinopatias.

[00126] Um aspecto apresentado neste relatório é o anticorpo apresentado nesta invenção para uso no tratamento de mal de Parkinson.

[00127] Um aspecto apresentado neste relatório é o anticorpo apresentado nesta invenção para uso na inibição de citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais.

[00128] Um aspecto apresentado neste relatório é o anticorpo apresentado nesta invenção para uso na inibição da transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais.

[00129] Um aspecto apresentado neste relatório é o anticorpo apresentado nesta invenção para uso na redução da atividade de caspase induzida pela alfa-sinucleína em células neuronais ou células gliais.

[00130] Um aspecto apresentado neste relatório é o uso do anticorpo apresentado nesta invenção na produção de um medicamento.

[00131] Em uma modalidade o medicamento é para tratamento de mal de Parkinson.

[00132] Em uma modalidade o medicamento é para inibir a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais.

[00133] Em uma modalidade o medicamento é para inibir a transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais.

[00134] Em uma modalidade o medicamento é para reduzir a atividade de caspase induzida pela alfa-sinucleína em células neuronais ou células gliais.

[00135] Um aspecto apresentado neste relatório é a method of treating an individual having mal de Parkinson compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo apresentado nesta invenção.

[00136] Um aspecto apresentado neste relatório é um método para inibição da citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo apresentado nesta invenção para inibir a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais.

[00137] Um aspecto apresentado neste relatório é um método para inibição da transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo apresentado nesta invenção para inibir a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais.

[00138] Um aspecto apresentado neste relatório é o uso de um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana apresentado nesta invenção na inibição da citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais.

[00139] Um aspecto apresentado neste relatório é o uso de um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana apresentado nesta invenção na inibição da transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais.

[00140] Um aspecto apresentado neste relatório é o uso de um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana apresentado nesta invenção na redução da atividade de caspase induzida pela alfa-sinucleína em células neuronais ou células gliais.

[00141] Os anticorpos apresentados nesta invenção podem ser usados no tratamento de mal de Parkinson. Sem querermos nos ater a esta teoria, os anticorpos inibem o espalhamento de alfa-sinucleína oligomérica tóxica, ou inibem a absorção de alfa-sinucleína oligomérica tóxica pelos neurônios e células gliais, ou reduzem a neuroinflamação.

[00142] Com anticorpos apresentados nesta invenção a inibição/redução da evolução de sinucleinopatia e neuropatologia podem ser afetadas.

[00143] Os anticorpos apresentados nesta invenção podem ser usados para proteger contra o desenvolvimento de mal de Parkinson ou podem mesmo ser usados para interromper a evolução do mal de Parkinson.

[00144] Em uma modalidade o anticorpo apresentado nesta invenção i) liga-se à alfa-sinucleína em seções do cérebro de camundongos transgênicos para alfa-sinucleína e pacientes com mal de Parkinson; e/ou marca a alfa-sinucleína em células LUHMES.

[00145] Os anticorpos apresentados nesta invenção podem ser usados para o tratamento de uma sinucleinopatia. Algumas sinucleinopatias são neurodegeneração com acúmulo de ferro no cérebro tipo 1 (NBIA1), insuficiência autonômica pura, síndrome de Down, complexo de Guam, e vários distúrbios com corpos de Lewy, tais como doença difusa com corpos de Lewy (DLBD), a variante com corpos de Lewy do mal de Alzheimer (LBVAD), certas formas da doença de Gaucher e demência associada ao mal de Parkinson (PDD).

[00146] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo que se liga especificamente à sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 01 na alfa-sinucleína humana.

[00147] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 13 e o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 14.

[00148] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 26 e o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 27.

[00149] Um aspecto apresentado neste relatório é um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo o domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 38 e o domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 39.

Breve Descrição das Figuras

[00150] Figura 1: Especificidade de ligação concentração- dependente do anticorpo anti-alfa-sinucleína 0017; Faixa: 1) preparação de alfa-sinucleína fibrilar, 2) oligômeros de alfa-sinucleína mutante para triplo-prolina, 3) oligômeros de alfa-sinucleína tipo A, 4) oligômeros de alfa-sinucleína tipo C.

[00151] Figura 2: Especificidade de ligação concentração- dependente do anticorpo anti-alfa-sinucleína 0018; Faixa: 1) preparação de alfa-sinucleína fibrilar, 2) oligômeros de alfa-sinucleína mutante para triplo-prolina, 3) oligômeros de alfa-sinucleína tipo A, 4) oligômeros de alfa-sinucleína tipo C.

[00152] Figura 3: Especificidade de ligação concentração- dependente do anticorpo anti-alfa-sinucleína 0081; Faixa: 1) preparação de alfa-sinucleína fibrilar, 2) oligômeros de alfa-sinucleína mutante para triplo-prolina, 3) oligômeros de alfa-sinucleína tipo A, 4) oligômeros de alfa-sinucleína tipo C.

[00153] Figura 4: Coloração de alfa-sinucleína no tronco cerebral de um camundongo transgênico para alfa-sinucleína[A30P]; cortes sagitais do cérebro de 10 μm congelados frescos; amplificação de 40x; todas as imagens em condições de iluminação idênticas; as pontas das setas indicam inclusões semelhantes à neurite de Lewy.

[00154] Figura 5: Coloração dos anticorpos 0017 e 0018 no córtex cerebral humano de um paciente com mal de Parkinson (A), um paciente com mal de Alzheimer com comorbidez com mal de Parkinson (B) e paralisia supranuclear progressiva (PSP, tauopatia) (C); seta: inclusões semelhantes a corpos de Lewy; ponta da seta: inclusões semelhantes à neurite de Lewy.

[00155] Figura 6: Marcação de patologia cerebral associada à alfa- sinucleína em camundongos transgênicos A30P mutantes para alfa- sinucleína mediante injeção periférica aguda de mAbs específico (2x60 mg/kg de anticorpo ou PBS por 5 dias) em camundongos transgênicos A30P mutantes para alfa-sinucleína de 15 meses de idade; cortes sagitais do cérebro de 20 μm congelados frescos foram coloridos com o conjugado anti-IgG1 murina-anticorpo-AF555 ou com o respectivo anticorpo anti-alfa-sinucleína e conjugado anti-IgG1 murina-anticorpo- AF555; amplificação de 40x na região do tronco cerebral; todas as imagens com iluminação equiparável; seta: inclusões semelhantes a corpos de Lewy; ponta da seta: inclusões semelhantes à neurite de Lewy.

[00156] Figura 7: Toxicidade celular de meio condicionado proveniente de alfa-sinucleína recombinante provenientes de células SHSY5Y em células LUHMES; (A) anticorpo 0017; (B) anticorpo 0018; (C) anticorpo 12F4 (referência).

[00157] Figura 8: Tratamento de células LUHMES com meio condicionado proveniente de alfa-sinucleína recombinante expressando células SHSY5Y; tratamento de 3 dias em células LUHMES recém-plaqueadas com a) meio de controle = meio de diferenciação para células LUHMES e b) meio condicionado = meio de diferenciação de LUHMES coletada depois de 6 dias a partir de alfa- sinucleína recombinante expressando células SHSY5Y.

[00158] Figura 9: Os anticorpos 0017 e 0018 são capazes de imunodepletar oligômeros de alfa-sinucleína de meios extracelulares e assim esses anticorpos reduzem a toxicidade dos oligômeros de alfa- sinucleína.

[00159] Figura 10: Dados brutos da transição de fusão (círculos vazios, 40°C - valores mais altos) e ajustes correspondentes (linhas cheias) tal como determinado de acordo com o Exemplo 11.

[00160] Figura 11: Marcação de patologia cerebral associada à alfa-sinucleína, vasculatura, e parênquima em camundongos transgênicos A30P mutantes para alfa-sinucleína mediante injeção periférica aguda de um conjugado de anticorpo anti-alfa-sinucleína- módulo de transporte pela barreira hematoencefálica.

[00161] Figura 12: Análise por microscopia confocal de criosseções analisadas imuno-histoquímicas de cortes cerebrais de pacientes com mal de Parkinson (cenário idêntico para todas as imagens): (A) anticorpo 0017, (B) anticorpo 0018, (C) anticorpo de referência 12F4.

[00162] Figura 13: Mapeamento de epítopos CelluSpots™ do anticorpo 0018.

[00163] Figura 14: Ligação de alfa-sinucleína monomérica (de terminal N livre (1) e de terminal His-tagged (2)) e dimérica (3) ao anticorpo 0018. Os resultados mostrados são uma titulação de 5 concentrações. 1: monômero, terminal N livre, 4.2 mg/mL, nunca descongelado; 2: monômero, terminal N His-tagged, 4.8 mg/mL; 3: dímero, terminal N livre, 1.6 mg/mL.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE MODALIDADES DA INVENÇÃO I. Definições

[00164] Uma "estrutura humana aceptora" para os efeitos desta invenção é uma estrutura compreendendo a sequência aminoacídica de uma estrutura do domínio variável de cadeia leve (VL) ou de uma estrutura do domínio variável de cadeia pesada (VH) derivada de uma estrutura de imunoglobulina humana ou de uma estrutura de consenso humana, como definido abaixo. Uma estrutura humana aceptora "derivada de" uma estrutura de imunoglobulina humana ou de uma estrutura de consenso humana pode compreender a mesma sequência aminoacídica que a original, ou pode conter alterações na sequência aminoacídica. Em algumas modalidades, o número de alterações aminoacídicas é 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos. Em algumas modalidades, a estrutura humana aceptora VL é idêntica, em termos de sequência, à sequência da estrutura de imunoglobulina humana VL ou à sequência da estrutura de consenso humana.

[00165] "Afinidade" refere-se à resistência da soma total de interações não covalentes entre um sítio de ligação simples de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado em contrário, conforme usado neste relatório, "afinidade de ligação" refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para seu parceiro Y geralmente pode ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na literatura, inclusive aqueles descritos neste relatório. Modalidades ilustrativos e exemplificativas específicas para medir a afinidade de ligação estão descritas a seguir.

[00166] Um anticorpo "de afinidade amadurecida" refere-se a um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis (HVRs), em relação a um anticorpo parental que não possui tais alterações, tais alterações resultando em uma melhora na afinidade do anticorpo para o antígeno.

[00167] Os termos "anticorpo anti-alfa-sinucleína humana" e "um anticorpo que se liga à alfa-sinucleína humana" referem-se a um anticorpo que é capaz de se ligar à alfa-sinucleína humana com afinidade suficiente para que o anticorpo seja útil como agente de diagnóstico e/ou terapêutico na vetorização de alfa-sinucleína humana. Em uma modalidade, o grau de ligação de um anticorpo anti-alfa- sinucleína humana a uma proteína não-alfa-sinucleína humana não relacionada é inferior a cerca de 10 % da ligação do anticorpo à alfa- sinucleína humana medida, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA).

[00168] O termo "anticorpo" é usado neste relatório em seu sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpo, incluindo, porém sem limitação, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos contanto que eles exibam a atividade de ligação de antígeno desejada.

[00169] Um "fragmento de anticorpo" refere-se a uma molécula outra que não um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que liga o antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, porém sem limitação, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.

[00170] Um "anticorpo que se liga ao mesmo epítopo" que um anticorpo de referência refere-se a um anticorpo que tem interações de ligação com os mesmos resíduos que o anticorpo de referência no antígeno. A interação de ligação pode ser determinada usando-se ressonância de plasmon de superfície e análise do antígeno mutado e da estrutura por raios X do complexo anticorpo-aantígeno.

[00171] O termo anticorpo "quimérico" refere-se a um anticorpo no qual uma porção da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma fonte ou espécie particular, enquanto que o resto da cadeia pesada e/ou leve é derivada de uma fonte ou espécie diferente.

[00172] A "classe" de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou de região constante que possui sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias delas podem ser ainda divididas em subclasses (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados α, δ, ε, y, e μ, respectivamente.

[00173] "Funções efetoras" referem-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que varia com a classe do anticorpo. Exemplos de funções efetoras dos anticorpos incluem: ligação de C1q e citotoxicidade dependente do complemento (CDC); ligação do receptor de Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; intra-regulação de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B); e ativação células B.

[00174] Uma "quantidade eficaz" de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para obter o resultado terapêutico ou profilático desejado.

[00175] O termo "região Fc" é usado neste relatório para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada de uma imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma modalidade, uma região Fc da cadeia pesada de IgG humana estende-se a partir de Cys226, ou a partir de Pro230, para o terminal carboxila da cadeia pesada. No entanto, a lisina C-terminal (Lys447) e às vezes o dipeptídio lisina-glicina C-terminal (Gly446Lys447) da região Fc pode estar presente ou não. A menos que especificado em contrário neste relatório, a numeração dos resíduos aminoacídicos na região Fc ou na região constante é aquela de acordo com o sistema de numeração EU, também chamada de índice EU, como descrito por Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.

[00176] "Estrutura" ou "FR" refere-se a resíduos de domínio variável outros que não resíduos de região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável geralmente consiste em quatro domínios de FR: FR1, FR2, FR3, e FR4. Por conseguinte, as sequências de HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1- H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

[00177] Os termos "anticorpo de comprimento integral", "anticorpo intacto", e "anticorpo total" são usados intercambiavelmente neste relatório para indicar um anticorpo tendo uma estrutura substancialmente similar à estrutura de um anticorpo nativo ou tendo cadeias pesadas que contêm uma região Fc já definida neste relatório.

[00178] Os termos "célula hospedeira", "linhagem de célula hospedeira", e "cultura de célula hospedeira" são usados intercambiavelmente e referem-se a células nas quais um ácido nucleico exógeno fora introduzido, incluindo a progênie de tais células. Células hospedeiras incluem "transformantes" e "células transformadas", que incluem a célula transformada primária e a progênie derivada da mesma independente do número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica a uma célula parental em termos do teor de ácidos nucleicos, mas pode conter mutações. Progênies mutantes que têm a mesma função ou atividade biológica que aquela rastreada ou selecionada na célula originalmente transformada estão incluídas nesta invenção.

[00179] Uma "estrutura de consenso humana" é uma estrutura que representa os resíduos aminoacídicos de ocorrência mais comum em uma seleção de sequências de estrutura de VL ou VH da imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção de sequências de VL ou VH da imunoglobulina humana é feita de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como aquele descrito em Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3. Em uma modalidade, para a VL, o subgrupo é o subgrupo capa I como descrito em Kabat et al., supra. Em uma modalidade, para a VH, o subgrupo é o subgrupo III como descrito em Kabat et al., supra.

[00180] O anticorpo "humanizado" refere-se a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos aminoacídicos de HVRs não humanas e resíduos aminoacídicos de FRs humanas. Em certas modalidades, um anticorpo humanizado vai compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente, dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem àquelas de um anticorpo não humano, e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode opcionalmente compreender pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo de um anticorpo humano. Uma "forma humanizada" de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que sofrera humanização.

[00181] O termo "região hipervariável" ou "HVR", conforme usado neste relatório, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que são de sequência hipervariável ("regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs") e formam alças estruturalmente definidas ("alças hipervariáveis"), e/ou contêm os resíduos de contato com antígeno ("contatos de antígeno"). Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs; três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3).

[00182] As HVRs neste contexto incluem (a) alças hipervariáveis ocorrendo nos resíduos aminoacídicos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), e 96-101 (H3) (Chothia, C. e Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917); (b) CDRs ocorrendo nos resíduos aminoacídicos 24-34 ( L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), e 95-102 (H3) (Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242); (c) contatos de antígeno ocorrendo nos resíduos aminoacídicos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), e 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); e (d) combinações dos itens (a), (b), e/ou (c), incluindo os resíduos aminoacídicos de HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 4956 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), e 94-102 (H3).

[00183] A menos que indicado em contrário, os resíduos de HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos de FR) são numerados de acordo com Kabat et al., supra.

[00184] Um "imunoconjugado" é um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas heterólogas tais como um módulo de transporte pela barreira hematoencefálica.

[00185] Um "indivíduo" ou "sujeito" é um mamífero. Mamíferos incluem, porém sem limitação, animais domésticos (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cachorros, e cavalos), primatas (por exemplo, seres humanos e primatas não humanos tais como macacos), coelhos, e rodedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas modalidades, o indivíduo ou sujeito é um ser humano.

[00186] Um anticorpo "isolado" é um anticorpo que fora separado de um componente de seu ambiente natural. Em algumas modalidades, um anticorpo é purificado até mais de 95% ou 99% de pureza segundo determinado, por exemplo, por eletroforese (por exemplo, SDS-PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou cromatografia (por exemplo, HPLC de troca iônica ou em fase reversa). Para revisão dos métodos de avaliação da pureza de anticorpos, vide, por exemplo, Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87.

[00187] Um ácido nucleico "isolado" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que fora separada de um componente de seu ambiente natural. Um ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que normalmente contêm a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente extracromossomicamente ou em uma localização cromossômica que é diferente de sua localização cromossômica natural.

[00188] "Ácido nucleico isolado codificando um anticorpo anti-alfa- sinucleína humana" refere-se a uma ou mais moléculas de ácido nucleico codificando cadeias pesadas e leves de anticorpo (ou fragmentos das mesmas), incluindo tais moléculas de ácido nucleico em um único vetor ou em vetores separados, e tais moléculas de ácido nucleico presentes em uma ou mais localizações em uma célula hospedeira.

[00189] O termo "anticorpo monoclonal" conforme usado neste relatório refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos e/ou ligam-se ao mesmo epítopo, à exceção de possíveis anticorpos variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente presentes em quantidades mínimas. Ao contrário de preparações de anticorpo policlonal, que tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados como diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante em um antígeno. Assim sendo, o modificador "monoclonal" indica o caráter de o anticorpo ser obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos por uma variedade de técnicas, que incluem, porém sem limitação, o método do hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição de fagos, e métodos utilizando animais transgênicos contendo todos ou parte dos loci da imunoglobulina humana, tais métodos e outros métodos exemplificativos para fazer anticorpos monoclonais estando descritos neste relatório.

[00190] "Anticorpos nativos" referem-se a moléculas de imunoglobulina de ocorrência natural com estruturas variáveis. Por exemplo, anticorpos nativos do tipo IgG são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostos de duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que são ligadas por ligação dissulfeto. Do terminal N para o terminal C, cada cadeia pesada tem uma região variável também chamada de domínio pesado variável ou domínio variável de cadeia pesada, seguida por três domínios constantes (CH1, CH2, e CH3). Similarmente, do terminal N para o terminal C, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também chamada de domínio leve variável ou domínio variável de cadeia leve, seguida por um domínio leve constante (CL). A cadeia leve de um anticorpo pode classificada em um de dois tipos, chamados capa (K) e lamda (X), com base na sequência aminoacídica de seus domínios constantes.

[00191] O termo "bula" é usado para indicar as instruções habitualmente incluídas nas embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações acerca das indicações, uso, dosagem, administração, tearpia combinada, contraindicações e/ou alertas concernentes ao uso de tais produtos terapêuticos.

[00192] "Percentagem (%) de identidade de sequência aminoacídica" em relação uma sequência polipeptídica de referência é definida como a percentagem de resíduos aminoacídicos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos aminoacídicos na sequência polipeptídica de referência, depois de alinhamento das sequências e introdução de hiatos, se necessário, para atingir a percentagem de identidade de sequência máxima, sem considerar quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento, para efeitos de determinar a percentagem de identidade de sequência aminoacídica, pode ser obtido de várias maneiras que são de conhecimento do especialista na técnica, por exemplo, usando softwares de computador disponíveis ao público tais como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os especialistas na técnica podem determinar os parâmetros apropriados para alinhar sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para conseguir alinhamento máximo em todo o comprimento das sequências sendo comparadas. Para os efeitos desta invenção, no entanto, os valoes % de identidade de sequência aminoacídica são gerandos usando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2 foi criado pela Genentech, Inc., e o código-fonte foi arquivado com a documentação do usuário no Escritório de Direitos Autorais Norte-Americano ("U.S. Copyright Office"), Washington D.C., 20559, onde ele está registrado sob o Registro de Copyright US N° TXU510087. O programa ALIGN-2 encontra-se disponível ao público na Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código-fonte. O programa ALIGN-2 pode ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, inclusive UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequências são estipulados pelo programa ALIGN- 2 e não variam.

[00193] Nas situações em que o ALIGN-2 é empregado para comparação de sequências aminoacídicas, a % de identidade de sequência aminoacídica de uma dada sequência aminoacídica A a, com, ou contra uma sequência aminoacídica B dada (que pode ser alternativamente formulado como uma dada sequência aminoacídica A que tem ou compreende uma certa % de identidade de sequência aminoacídica a, com ou contra uma sequência aminoacídica B dada) é calculada seguinte maneira: 100 vezes a fração X/Y onde X é o número de resíduos aminoacídicos classificados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 no alinhamento de A e B pelo programa, e onde Y é o número total de resíduos aminoacídicos em B. Será apreciado que onde o comprimento da sequência aminoacídica A não for igual ao comprimento da sequência aminoacídica B, a % de identidade de sequência aminoacídica de A com B não será igual à % de identidade de sequência aminoacídica de B com A. A menos que especificamente mencionado em contrário, todos os valores de % de identidade de sequência aminoacídica usados neste relatório foram obtidos da maneira descrita no parágrafo precedente usando o programa de computador ALIGN-2.

[00194] O termo "formulação farmacêutica" refere-se a uma preparação que se encontra em uma tal forma que permite que a atividade biológica do princípio ativo nela contido seja eficaz, e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para o indivíduo ao qual a formulação seria administrada.

[00195] Um "carreador farmaceuticamente aceitável" refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, que não um princípio ativo, que é atóxico para um indivíduo. Um carreador farmaceuticamente aceitável inclui, porém sem limitação, um tampão, excipiente, estabilizante, ou preservativo.

[00196] O termo "alfa-sinucleína humana", conforme usado neste relatório, refere-se à alfa-sinucleína humana nativa (UniProt P37840). O termo abrange alfa-sinucleína humana de "comprimento integral" não processado assim como qualquer forma de alfa-sinucleína humana que resulta de processamento na célula. O termo also abrange variantes de ocorrência natural da alfa-sinucleína humana, por exemplo, mutantes, variantes de emenda ou variantes alélicas. A sequência aminoacídica da alfa-sinucleína humana está mostrada na SEQ ID N°: 40.

[00197] Conforme usado neste relatório, "tratamento" (e variações gramaticais do mesmo tais como "tratar" ou "tratando") refere-se à intervenção clínica na tentativa de alterar o curso natural do indivíduo sendo tratamento, e pode ser feito seja para profilaxia ou durante o curso da patologia clínica. Efeitos desejáveis do tratamento incluem, porém sem limitação, prevenir a ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, redução de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, diminuição da taxa de evolução da doença, melhora ou paliação do estado da doença, e remissão ou prognóstico melhorado. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou para desacelerar a evolução de uma doença.

[00198] O termo "região variável" ou "domínio variável" refere-se ao domínio da cadeia pesada ou leve de um anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo a um antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas similares, com cada domínio compreendendo quatro regiões de estrutura conservadas (FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Vide, por exemplo, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman e Co., N.Y. (2007), página 91). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação de antígeno. Além disso, anticorpos que se ligam a um antígeno particular podem ser isolados usando um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para rastrear uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).

[00199] O termo "vetor", conforme usado neste relatório, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual ela está ligada. O termo incluir o vetor como uma estrutura de ácido nucleico auto-replicante assim como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual ela fora introduzido. Certos vetores são capazes de direcionar a expressão dos ácidos nucleicos aos quais eles estão ligados operacionalmente. Tais vetores são denominados neste relatório "vetores de expressão".

II. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS

[00200] Em um aspecto, a invenção baseia-se, em parte, na descoberta de que os anticorpos apresentados neste relatório podem ser usados para reduzir/eliminar a toxicidade induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais e gliais no cérebro. Em certos aspectos, são oferecidos anticorpos que se ligam à alfa-sinucleína humana. Os anticorpos da invenção são úteis, por exemplo, para o diagnóstico ou o tratamento de sinucleinopatia e neuropatia, especialmente mal de Parkinson e mal de Alzheimer com comorbidez com mal de Parkinson.

A. Anticorpos anti-alfa-sinucleína humana exemplificativos

[00201] Os anticorpos apresentados nesta invenção foram obtidos por meio do uso de uma metodologia de imunização deliberada e seleção consciente de anticorpos com propriedades de ligação específicas.

[00202] Em primeiro lugar, coelhos foram imunizados com uma mistura de várias montagens e agregados de alfa-sinucleína recombinante. Os clones de células B isolados foram caracterizados por ELISA e os melhores ligadores foram selecionados. Na etapa seguinte os anticorpos foram caracterizados por mapeamento de epítopos usando-se a metodologia de arranjos peptídicos e determinando-se sua seletividade para alfa-sinucleína recombinante monomérica e oligomérica, por exemplo, análise da mancha ocidental. Também a ligação dos anticorpos à alfa-sinucleína recombinante e alfa-sinucleína fisiológico em células neuronais humanas e à alfa- sinucleína patológica em cortes do cérebro de camundongos transgênicos para alfa-sinucleína e pacientes com mal de Parkinson foi determinada. Com base nos dados mostrados anteriormente os candidatos foram selecionados e a ligação in vivo aguda à alfa- sinucleína patológica depois de injeção periférica foi determinada. Os ligadores mais eficientes foram selecionados depois disso. Com o ligador mais eficiente selecionado a depuração da patologia de alfa- sinucleína e/ou a interrupção da evolução da patologia de alfa- sinucleína em camundongos transgênicos para Thy1-(A30P)aSYN será determinada.

[00203] Um anticorpo preferido é o anticorpo 0017. Este anticorpo tem um amplo perfil de ligação específica à alfa-sinucleína, isto é, este anticorpo liga-se à alfa-sinucleína humana monomérica e agregada (oligomérica). Na Figura 1 a ligação concentração-dependente do anticorpo 0017 à forma monomérica e múltiplas formas agregadas de alfa-sinucleína humana está mostrada. O anticorpo 0017 é um anticorpo quimérico com domínios variáveis de um anticorpo 233 de coelho selecionado pelo procedimento descrito anteriormente e regiões constantes murinas.

[00204] Outro anticorpo preferido é o anticorpo 0018. Este anticorpo tem um perfil de ligação dependente da agregação de alfa-sinucleína, isto é, este anticorpo liga-se à alfa-sinucleína humana monomérica, dimérica e oligomérica, e com isso a ligação à alfa-sinucleína humana e à alfa-sinucleína de camundongo monoméricas será diminuída se o resíduo metionina N-terminal for modificado, por exemplo, por acetilação ou biotinilação, ou estará ausente. Na Figura 2 a ligação concentração-dependente do anticorpo 0018 a formas agregadas de diferentes maneiras da alfa-sinucleína humana está mostrada. O caráter de ligação de oligômero fica aparente a uma concentração de anticorpo abaixo de 0.5 μg/ml. O anticorpo 0018 é um anticorpo quimérico com domínios variáveis de um anticorpo 064 de coelho selecionado pelo procedimento descrito anteriormente e regiões constantes murinas.

[00205] Com o uso de peptídios N-terminalmente modificados para a determinação do sítio de ligação do anticorpo 0018 na alfa- sinucleína humana não foi possível detectar nenhuma ligação. Assim sendo a análise de epítopos do anticorpo 0018 foi feita por meio de uma biblioteca de fragmentos peptídicos sobrepostos e imobilizados (comprimento: 15 aminoácidos, deslocamento: 1 aminoácido) correspondentes às sequências dos peptídios a-sinucleína (1-140), β- sinucleína (60-134), y-sinucleína (60-127) e a-sinucleína N-acetilada (1-15), e empregando-se um método de detecção baseado em ELISA (vide Exemplo 14 e Figura 13).

[00206] Foi descoberto que o anticorpo 0018 liga-se a um peptídio ai monomérico curto (15 aminoácidos de comprimento) apresentado no arranjo peptídico. O anticorpo 0018 reconhece um epítopo no último terminal N da alfa-sinucleína. O aminoácido N-terminal metionina (M, MET) é essencial para ligação, uma vez que a remoção (ou o bloqueio) do mesmo suprime completamente a ligação do anticorpo 0018. Além disso, quando o resíduo aminoacídico metionina N-terminal écapeado por N-acetilação não é possível observar qualquer ligação. Isto é confirmado por análise por ressonância de plasmon de superfície (vide Figura 14).

[00207] Outro anticorpo preferido é o anticorpo 0081. O anticorpo anti-alfa-sinucleína 0081 mostra um padrão de reatividade dose- dependente reminiscente do anticorpo 0018 com igual redução de imunorreatividade para as formas de alfa-sinucleína na macha (Figura 3).

[00208] Na Figura 4 encontram-se mostrados os diferentes comportamentos de coloração dos anticorpos 0017 e 0018 e do anticorpo de referência 12F4 em cortes sagitais do cérebro de camundongos transgênicos A30P mutantes para alfa-sinucleína.

[00209] Na Figura 5 encontram-se mostrados os diferentes comportamentos de coloração dos anticorpos 0017 e 0018 no córtex cerebral humano de um paciente com mal de Parkinson (A), paciente com mal de Alzheimer com comorbidez com mal de Parkinson (B) e paralisia supranuclear progressiva (C). A aplicação do anticorpo 0017 resultou em uma coloração parenquimatosa assim como de corpos de Lewy e neurite de Lewy difusa. O anticorpo 0018 mostra uma coloração parenquimatosa mais fraca e colore principalmente os corpos de Lewy e neurites de Lewy. Portanto, os anticorpos 0017 e 0018 mostram diferentes padrões de coloração para agregados de alfa-sinucleína em cortes do cérebro de pacientes com mal de Parkinson.

[00210] Na Figura 6 encontra-se mostrada a marcação de patologia de alfa-sinucleína cerebral em camundongos transgênicos A30P mutantes para alfa-sinucleína mediante injeção periférica aguda de mAbs específico. Anticorpo anti-alfa-sinucleína (2x60 mg/kg por 5 dias) ou PBS foi aplicado a camundongos transgênicos A30P mutantes para alfa-sinucleína de 15 meses de idade. Cortes sagitais do cérebro de 20 μm congelados frescos foram coloridos com o conjugado IgG1 anti- murina-anticorpo-AF555 ou com o respectivo anticorpo anti-alfa- sinucleína e o conjugado IgG1 anti-murina-anticorpo-AF555.

[00211] Pela Figura 7 pode-se ver que os anticorpos 0017 e 0018 são capazes de imunodepletar oligômeros de alfa-sinucleína de meios extracelulares e portanto estes anticorpos reduzem a toxicidade de oligômeros de alfa-sinucleína.

[00212] Em um aspecto, a invenção oferece anticorpos isolados que se ligam à alfa-sinucleína humana. Em certas modalidades, o anticorpo anti-alfa-sinucleína humana: • liga-se a um peptídio que tem a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 01 e liga-se à alfa-sinucleína monomérica mas não à alfa-sinucleína fibrilar, ou • liga-se ao mesmo epítopo que um anticorpo que tem um par de domínio variáveis de SEQ ID N°: 26 e 27 ou SEQ ID N°: 38 e 39 e liga-se à alfa-sinucleína fibrilar mas não à alfa-sinucleína monomérica, • inibe a toxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônio e células gliais, • inibe a transmissão de célula para célula de agregação de alfa-sinucleína, • reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína (por exemplo, em células LUHMES).

[00213] Em um aspecto, a invenção oferece um anticorpo anti-alfa- sinucleína humana compreendendo pelo menos uma, ou duas, ou três, ou quatro, ou cinco, ou seis HVRs selecionadas dentre (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 02; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 03; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 04; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 05; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 06; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 07.

[00214] Em um aspecto, a invenção oferece um anticorpo anti-alfa- sinucleína humana compreendendo pelo menos uma, ou duas, ou três, ou quatro, ou cinco, ou seis HVRs selecionadas dentre (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 08; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 09; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 04; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 10; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 11; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 12.

[00215] Em um aspecto, a invenção oferece um anticorpo anti-alfa- sinucleína humana compreendendo pelo menos uma, ou duas, ou três, ou quatro, ou cinco, ou seis HVRs selecionadas dentre (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 15; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 16; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 17; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 18; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 19; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 20.

[00216] Em um aspecto, a invenção oferece um anticorpo anti-alfa- sinucleína humana compreendendo pelo menos uma, ou duas, ou três, ou quatro, ou cinco, ou seis HVRs selecionadas dentre (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 21; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 22; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 17; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 23; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 24; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25.

[00217] Em um aspecto, a invenção oferece um anticorpo anti-alfa- sinucleína humana compreendendo pelo menos uma, ou duas, ou três, ou quatro, ou cinco, ou seis HVRs selecionadas dentre (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 28; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 29; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 30; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 31; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 32; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 33.

[00218] Em um aspecto, a invenção oferece um anticorpo anti-alfa- sinucleína humana compreendendo pelo menos uma, ou duas, ou três, ou quatro, ou cinco, ou seis HVRs selecionadas dentre (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 28; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 34; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 30; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 35; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 36; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 37.

[00219] Em um aspecto, a invenção oferece um anticorpo compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de VH HVR selecionadas dentre i) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 02; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 03; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 04; ou ii) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 08; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 09; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 04, ou iii) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 15; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 16; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 17, ou iv) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 21; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 22; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 17, ou v) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 28; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 29; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 30, ou vi) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 28; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 34; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 30.

[00220] Em uma modalidade, o anticorpo compreende i) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 02; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 03; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 04; ou ii) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 08; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 09; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 04, ou iii) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 15; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 16; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 17, ou iv) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 21; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 22; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 17, ou v) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 28; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 29; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 30, ou vi) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 28; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 34; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 30.

[00221] Em outra modalidade o anticorpo compreende ainda pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de VH HVR selecionadas dentre i) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 05; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 06; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 07; ou ii) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 10; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 11; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 12, ou iii) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 18; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 19; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 20, ou iv) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 23; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 24; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25, ou v) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 31; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 32; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 33, ou vi) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 35; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 36; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 37.

[00222] Em ainda outra modalidade, o anticorpo compreende i) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 05; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 06; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 07; ou ii) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 10; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 11; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 12, ou iii) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 18; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 19; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 20, ou iv) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 23; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 24; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25, ou v) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 31; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 32; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 33, ou vi) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 35; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 36; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 37.

[00223] Em um aspecto, a invenção oferece um anticorpo compreendendo i) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 02; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 03; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 04; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 05; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 06; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 07, ou ii) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 08; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 09; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 04; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 10; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 11; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 12, ou iii) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 15; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 16; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 17; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 18; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 19; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 20, ou iv) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 21; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 22; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 17; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 23; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 24; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25, ou v) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 28; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 29; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 30; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 31; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 32; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 33, ou vi) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 28; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 34; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 30; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 35; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 36; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 37.

[00224] Em qualquer uma das modalidades acima, o anticorpo anti- alfa-sinucleína é humanizado. Em uma modalidade, um anticorpo anti- alfa-sinucleína humana compreende HVRs como em qualquer uma das modalidades acima, e compreende ainda uma estrutura humana aceptora, por exemplo, uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura de consenso humana.

[00225] Em outra modalidade a VH ou VL contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções, ou deleções em relação à sequência de referência, mas um anticorpo anti-alfa- sinucleína humana compreendendo aquela sequência conserva a capacidade de se ligar à alfa-sinucleína humana.

[00226] Em certas modalidades, um total de 1 a 3 aminoácidos foram substituídos, inseridos e/ou deletados em cada uma das sequências de HVR descritas mais acima.

[00227] Em outro aspecto, a invenção oferece um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana oferecido nesta invenção.

[00228] Por exemplo, em certas modalidades, é oferecido um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-alfa- sinucleína humana compreendendo a) uma sequência de VH de SEQ ID N°: 13 e uma sequência de VL de SEQ ID N°: 14, ou b) uma sequência de VH de SEQ ID N°: 26 e uma sequência de VL de SEQ ID N°: 27, ou c) uma sequência de VH de SEQ ID N°: 38 e uma sequência de VL de SEQ ID N°: 39.

[00229] Em certas modalidades, é oferecido um anticorpo que se liga a um epítopo em um fragmento de alfa-sinucleína humana consistindo nos aminoácidos 101-111 de SEQ ID N°: 40.

[00230] Em certas modalidades, é oferecido um anticorpo que se liga a um epítopo N-terminal livre (resíduo metionina N-terminal livre) em um fragmento de alfa-sinucleína humana consistindo nos aminoácidos 1-15 de SEQ ID N°: 40.

[00231] Em uma modalidade é oferecido um anticorpo que se liga à alfa-sinucleína humana que tem um resíduo metionina N-terminal livre e que se liga a um epítopo conformacional nos resíduos 1 a 15 e 188195 da alfa-sinucleína humana.

[00232] Em outro aspecto da invenção, um anticorpo anti-alfa- sinucleína humana de acordo com qualquer uma das modalidades acima é um anticorpo monoclonal, incluindo um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Em uma modalidade, um anticorpo anti-alfa- sinucleína humana é um fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento Fv, Fab, Fab', scFv, diacorpo, ou F(ab')2. Em outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo de comprimento integral, por exemplo, um anticorpo IgG1 ou IgG 4 intacto ou outra classe de anticorpo ou isótipo conforme definido neste relatório.

[00233] Em outro aspecto, um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana de acordo com qualquer uma das modalidades acima pode incoporar qualquer um dos aspectos, seja isoladamente ou combinados, descritos nas Seções 1-7 abaixo:

1. Afinidade de Anticorpos

[00234] Em certas modalidades, um anticorpo oferecido nesta invenção tem uma constante de dissociação (Kd) de < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, ou entre 1 nM e 100 nM (por exemplo, 10-7 M ou menos, por exemplo, de 10-7 M a 10-9 M).

[00235] Em uma modalidade, a Kd é medida por um ensaio de ligação de antígeno radiomarcado (RIA). Em uma modalidade, um RIA é realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno. Por exemplo, a afinidade de ligação em solução de FABs para antígeno é medida colocando em equilíbrio o Fab com uma concentração mínima de antígeno marcado com (125I) na presença de uma série de titulações de antígeno não marcado, e então capturando o antígeno ligado com uma placa revestida com anticorpo anti-Fab (vide, por exemplo, Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Para estabelecer as condições para o ensaio, placas multipoços MICROTITER® (Thermo Scientific) foram revestidas por uma noite com 5 μg/ml de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9.6), e subsequentemente bloqueadas com 2% (p/v) de albumina sérica bovina em PBS por duas a cinco horas à temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). Em uma placa não adsorvente (Nunc #269620), 100 pM ou 26 pM de [125I]-antígeno são misturados com diluições seriadas de um Fab de interesse (por exemplo, consistentes com a avaliação do anticorpo anti-VEGF, Fab- 12, em Presta, L.G. et al., Cancer Res. 57 (1997) 4593-4599). O Fab de interesse é então incubado por uma noite; no entanto, a incubação pode continuar por um período mais longo (por exemplo, cerca de 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja atingido. Em seguida, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação à temperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é então removida e a placa é lavada oito vezes com 0,1% de polissorbato 20 (TWEEN-20®) em PBS. Depois que as placas secam, 150 μl/poço de cintilante (MICROSCINT-20 TM; Packard) são acrescentados, e as placas são contadas em um contador gama TOPCOUNT TM (Packard) por dez minutos. As concentrações de cada Fab que dão uma ligação máxima menor ou igual a 20% são escolhidas para uso em ensaios de ligação competitiva.

[00236] De acordo com outra modalidade, a Kd é medida usando- se um ensaios de ressonância de plasmon de superfície BIACORE®. Por exemplo, um ensaio usando um BIACORE®-2000 ou um BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) é realizado a 25°C com chips CM5 de antígeno imobilizado a ~10 unidades de resposta (RU). Em uma modalidade, chips biossensores de dextrana carboximetilada (CM5, BIACORE, Inc.) são ativadas com cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC) e N- hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4.8, até atingir 5 μg/ml (~0.2 μM) antes de ser injetado a uma taxa de fluxo de 5 μl/minuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Subsequente à injeção de antígeno, 1 M de etanolamina é injetado para bloquear os grupos não reagidos. Para medições de cinética, diluições seriadas um para dois de Fab (0.78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0.05 % do tensoativo polissorbato 20 (TWEEN-20TM) (PBST) a 25°C a uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 μl/min. As taxas de associação (kon) e as taxas de dissociação (koff) são calculadas usando um modelo de Langmuir de ligação um para um simples (BIACOR ® Evaluation Software versão 3.2) ajustando simultaneamente os sensorgramas de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como a relação koff/kon (vide, por exemplo, Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Se a taxa de associação ("on-rate") exceder 106 M-1 s-1 pelo ensaio de ressonância de plasmon de superfície acima, então a taxa de associação pode ser determinada usando-se uma técnica de extinção de fluorescência que mede o aumento ou a diminuição na intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, faixa de passagem de 16 nm) a 25°C de um anticorpo anti-antígeno a 20 nM (forma Fab) em PBS, pH 7.2, na presença de concentrações crescentes de antígeno medidas em um espectrômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com uma torneira de fluxo ("stop-flow") (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-AMINCO TM série 8000 (ThermoSpectronic) com uma cubeta agitada.

2. Fragmentos de Anticorpo

[00237] Em certas modalidades, um anticorpo oferecido nesta invenção é um fragmento de anticorpo. Fragmentos de anticorpo incluem, porém sem limitação, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, e scFv, e outros fragmentoos descritos abaixo. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpo, vide Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134. Para uma revisão de fragmentos scFv, vide, por exemplo, Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg e Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), págs. 269-315; vide também os documentos WO 93/16185; US 5,571,894 e US 5,587,458. Para uma discussão de fragmentos Fab e F(ab')2 compreendendo resíduos de epítopo de ligação de receptor de salvamento tendo meia-vida in vivo aumentada, vide o documento US 5,869,046.

[00238] Diacorpos são fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação de antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Vide, por exemplo, os documentos EP 0 404 097; WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; e Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. Triacorpos e tetracorpos também estão descritos em Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134).

[00239] Anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo compreendendo todo ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável de cadeia leve de um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; vide, por exemplo, o documento US 6.248.516).

[00240] Fragmentos de anticorpo podem ser feitos por várias técnicas, incluindo, porém sem limitação, digestão proteolítica de um anticorpo intacto assim como produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli ou fago), como descrito neste relatório.

3. Anticorpos Quiméricos e Humanizados

[00241] Em certas modalidades, um anticorpo oferecido nesta invenção é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos estão descritos, por exemplo, no documento US 4.816.567; e em Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho, ou primata não humano, tal como um macaco) e uma região constante humana. Em outro exemplo, um anticorpo quimérico é um anticorpo de "classe mudada" no qual a classe ou subclasse fora mudada em relação àquela do anticorpo parental. Anticorpos quiméricos incluem fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos.

[00242] Em certas modalidades, um anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade para humanos, ao mesmo conservando a especificidade e a afinidade do anticorpo não humano parental. Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis nos quais as HVRs, por exemplo, CDRs, (ou porções das mesmas) são derivadas de um anticorpo não humano, e as FRs (ou porções das mesmas) são derivadas de sequências de anticorpo humano. Um anticorpo humanizado opcionalmente também vai compreender pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em algumas modalidades, alguns resíduos FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos de HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou a afinidade do anticorpo.

[00243] Anticorpos humanizados e métodos para fazer os mesmos estão descritos, por exemplo, em Almagro, J.C. e Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, e estão ainda descritos, por exemplo, em Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; US 5,821,337, US 7,527,791, US 6,982,321, e US 7,087,409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (que descreve o enxerto de regiões determinantes de especificidade (SDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (que descreve "ressurfatação"); Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 (que descreve "embaralhamento de FR"); e Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68 e Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (que descreve a abordagem da "seleção guiada" para embaralhamento de FR).

[00244] Regiões de estrutura humana que podem ser usadas para humanização incluem, porém sem limitação: regiões de estrutura selecionadas usando-se o método do "melhor ajuste" (vide, por exemplo, Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; regiões de estrutura derivadas da sequência de consendo de anticorpos humanhos de um subgrupo particular de regiões variáveis de cadeia leve e pesada (vide, por exemplo, Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; e Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); regiões de estrutura maduras humanas (somaticamente mutadas) ou regiões de estrutura da linhagem germinativa humana (vide, por exemplo, Almagro, J.C. e Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); e regiões de estrutura derivadas a partir do rastreamento de bibliotecas de FR (vide, por exemplo, Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 e Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618).

4. Anticorpos Humanos

[00245] Em certas modalidades, um anticorpo oferecido nesta invenção é um anticorpo humano. Anticorpos humanos podem ser produzidos usando-se várias técnicas conhecidas na literatura. Anticorpos humanos estão descritos de um modo geral por van Dijk, M.A. e van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 e Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459.

[00246] Anticorpos humanos podem ser preparados por administração de um imunógeno a um animal transgênico que fora modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta a um desafio antigênico. Tais animais tipicamente contêm todos ou uma porção dos loci de imunoglobulina humana, que substituem os loci de imunoglobulina endógena, ou que estão presents extracromossomicamente ou integrados aleatoriamente nos cromossomas do animal. Em tais camundongos transgênicos, os loci de imunoglobulina endógena geralmente foram inativados. Para uma revisão de métodos para obtenção de anticorpos humanos a partir de animais transgênicos, vide Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 11171125. Vide também, por exemplo, os documentos US 6.075.181 e US 6.150.584 que descrevem a tecnologia XENOMOUSETM; US 5,770,429 que descreve a tecnologia HUMAB®; US 7,041,870 que descreve a tecnologia K-M MOUSE®, e US 2007/0061900, que descreve a tecnologia VELOCIMOUSE®). As regiões variáveis humanas de anticorpos intactos geradas por tais animais podem ser ainda modificadas, por exemplo, por combinação com uma região constante humana diferente.

[00247] Anticorpos humanos também podem ser feitos por métodos baseados em hibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais já foram descritas. (Vide, por exemplo, Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), págs. 51-63; e Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Anticorpos humanos gerados via a tecnologia do hibridoma de células B humanas também estão descritos em Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562. Métodos adicionais incluem aqueles descritos, por exemplo, no documento US 7.189.826 (que descreve a produção de anticorpos monoclonais de IgM humana a partir de linhagens celulares de hibridoma) e Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268 (que descreve hibridomas humano-humano). A tecnologia do hibridoma humano (Trioma technology) também está descrita em Vollmers, H.P. e Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937 e Vollmers, H.P. e Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191.

[00248] Anticorpos humanos também podem ser gerados por isolamento de sequências de domínio variável do clone de Fv selecionadas dentre bibliotecas de exibição de fagos derivados de humanos. Tais sequências de domínio variável podem ser então combinadas com um domínio constante humano desejado. Técnicas para selecionar anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpos estão descritas abaixo.

5. Anticorpos Derivados de Bibliotecas

[00249] Os anticorpos da invenção podem ser isolados por rastreamento de bibliotecas combinatoriais para anticorpos com a atividade ou atividades desejadas. Por exemplo, são conhecidos na literatura vários métodos para gerar bibliotecas de exibição de fagos e rastrear tais bibliotecas por anticorpos que possuem as características de ligação desejadas. Tais métodos estão revistos, por exemplo, em Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37 e ainda descritos, por exemplo, por McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. e Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004)12467-12472; e Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119132.

[00250] Em certos métodos de exibição de fagos, repertórios de genes de VH e VL são separadamente clonados por reação em cadeia da polimerase (PCR) e randomicamente recombinados em bibliotecas de fagos, que podem ser então rastreadas para fago de ligação de antígeno como descrito em Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455. Fagos tipicamente exibem fragmentos de anticorpos, seja como fragmentos Fv (scFv) de cadeia única ou como fragmentos Fab. Bibliotecas provenientes de fontes imunizadas oferecem anticorpos de alta afinidade para o imunógeno sem a necessidade de construir hibridomas. Alternativamente, o repertório naive pode ser clonado (por exemplo, a partir de anticorpo humano) para oferecer uma única fonte de anticorpos para uma ampla gama de não autoantígenos e também de autoantígenos sem qualquer imunização como descrito por Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734. Finalmente, bibliotecas naives também podem ser feitas sinteticamente por clonagem de segmentos do gene V não rearranjados provenientes de células-tronco, e usando iniciadores de PCR contendo sequências aleatórias para codificar as regiões CDR3 altamente variáveis e para efetuar rearranjo in vitro, como descrito por Hoogenboom, H.R. e Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388. Publicações de Patente que descrevem bibliotecas de fagos de anticorpos humanos incluem, por exemplo: US 5.750.373, e US 2005/0079574, US 2005/0119455, US 2005/0266000,US 2007/0117126, US 2007/0160598, US 2007/0237764,US 2007/0292936, e US 2009/0002360.

[00251] Anticorpos ou fragmentos de anticorpos isolados de bibliotecas de anticorpos humanos são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos neste relatório.

6. Anticorpos Multiespecíficos

[00252] Em certas modalidades, um anticorpo oferecido nesta invenção é um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois sítios diferentes. Em certas modalidades, uma das especificidades de ligação é para alfa-sinucleína humana e a outra é para qualquer outro antígeno. Em certas modalidades, anticorpos biespecíficos podem ser ligar a dois epítopos diferentes da alfa-sinucleína humana. Anticorpos biespecíficos também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam alfa-sinucleína humana. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento integral ou fragmentos de anticorpos.

[00253] Técnicas para fazer anticorpos multiespecíficos incluem, porém sem limitação, coexpressão recombinante de dois pares de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina tendo especificidades diferentes (vide Milstein, C. e Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, WO 93/08829, e Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659), e engenharia de "knob-in-hole" (vide, por exemplo, US 5.731.168). Anticorpos multiespecíficos também podem ser feitos por manipulação de efeitos eletrostáticos de direção para fazer moléculas heterodiméricas de Fc de um anticorpo (WO 2009/089004); reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (vide, por exemplo, US 4.676.980, e Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83); uso de zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553; uso da tecnologia do "diacorpo" para fazer fragmentos de anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); e uso de dímeros de Fv de cadeia única (sFv) (vide, por exemplo, Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); e preparação de anticorpos triespecíficos como descrito, por exemplo, em Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 6069).

[00254] Anticorpos manipulados com três ou mais sítios de ligação de antígeno funcionais, incluindo "anticorpos de polvo", também estão incluídos nesta invenção (vide, por exemplo, US 2006/0025576).

[00255] O anticorpo ou fragmento desta invenção também inclui um "Fab de Ação Dupla" ou "DAF" compreendendo um sítio de ligação de antígeno que se liga à alfa-sinucleína humana assim como a outro antígeno diferente (vide, US 2008/0069820, por exemplo).

[00256] O anticorpo ou fragmento desta invenção também inclui anticorpos multiespecíficos descritos WO 2009/080251, WO 2009/080252,WO 2009/080254, WO 2010/112193,WO 2010/136172, WO 2010/145792, e WO 2010/145793.

7. Variantes de Anticorpos

[00257] Em certas modalidades, variantes das sequências aminoacídicas dos anticorpos oferecidos nesta invenção são contempladas. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes das sequências aminoacídicas de um anticorpo podem ser preparados por introdução de modificações apropriadas na sequência nucleotídica codificando o anticorpo, ou por síntese de peptídios. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções, e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas sequências aminoacídicas do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção, e substituição pode ser feita para se chegar à construção final, contanto que a construção final possua as características desejadas, por exemplo, ligação de antígeno.

a) Variantes com Substituição, Inserção e Deleção

[00258] Em certas modalidades, são oferecidas variantes de anticorpos tendo uma ou mais substituições aminoacídicas. Sítios de interesse para mutagênese substitucional incluem as HVRs e FRs. Substituições conservativas estão mostradas na Tabela 1 sob o título "substituições preferidas". Alterações substanciais adicionais estão dadas na Tabela 1 sob o título "substituições exemplificativas", e estão ainda descritas abaixo com referência às classes de cadeias laterais de aminoácidos. Substituições aminoacídicas podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos rastreados quanto a uma atividade desejada, por exemplo, ligação de antígeno conservada/melhorada, imunogenicidade diminuída, ou ADCC ou CDC melhorada. TABELA 1

[00259] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades em comum das cadeias laterais: (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

[00260] Substiuições não conservativas vão ocasionar a troca de um membro de uma destas classes por outra classe.

[00261] Um tipo de variante substitucional envolve substituir um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, as variantes resultantes selecionadas para estudo adicional terão modificações (por exemplo, melhoras) em certas propriedades biológicas (por exemplo, afinidade aumentada, imunogenicidade reduzida) em relação ao anticorpo parental e/ou terão certas propriedades biológicas substancialmente conservadas do anticorpo parental. Uma variante substitucional exemplificativa é um anticorpo de afinidade amadurecida, que pode ser convenientemente gerado, por exemplo, usando-se técnicas de amadurecimento de afinidade baseadas em exibição de fagos tais como aquelas descritas neste relatório. Em resumo, um ou mais resíduos de HVR são mutados e os anticorpos variantes são exibidos em fago e rastreados para uma atividade biológica particular (por exemplo, afinidade de ligação).

[00262] Alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em HVRs, por exemplo, para melhorar a afinidade do anticorpo. Tais alterações podem ser feitas em "hotspots" de HVR, isto é, resíduos codificados por códons que sofrem mutação em alta frequência durante o processo de amadurecimento somático (vide, por exemplo, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196), e/ou resíduos que fazem contacto com antígeno, com a VH ou VL variante resultante sendo testada quanto à afinidade de ligação. O amadurecimento da afinidade por construção e resseleção a partir de bibliotecas secundárias fora descrito, por exemplo, por Hoogenboom, H.R. et al. em Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. Em algumas modalidades de amadurecimento da afinidade, diversidade é introduzida nos genes variáveis escolhidos para amadurecimento por qualquer um de uma variedade de métodos (por exemplo, PCR propensa a erros, embaralhamento de cadeias, ou mutagênese direcionada para oligonucleotídeos). Uma segunda biblioteca é então criada. A biblioteca é então rastreada para identificar quaisquer variantes de anticorpos com a afinidade desejada. Outro método para introduzir diversidade envolve abordagens direcionadas para HVR, nas quais vários resíduos de HVR (por exemplo, 4-6 resíduos ao mesmo tempo) são randomizados. Os resíduos de HVR envolvidos na ligação de antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, usando-se mutagênese ou modelagem de varredura de alanina. CDR- H3 e CDR-L3 em particular são frequentemente visadas.

[00263] Em certas modalidades, substituições, inserções, ou deleções podem ocorrer em uma ou mais HVRs contanto que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade do anticorpo para se ligar ao antígeno. Por exemplo, alterações conservativas (por exemplo, as substituições conservativas apresentadas neste relatório) que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas em HVRs. Tais alterações podem ocorrer, por exemplo, fora dos resíduos de contato de antígeno nas HVRs. Em certas modalidades das sequências de VH e VL variantes dadas acima, cada HVR ou fica inalterada, ou contém no máximo uma, duas ou três substituições aminoacídicas.

[00264] Um método útil para identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que podem ser visadas para mutagênese é o chamado "mutagênese de varredura de alanina" descrito por Cunningham, B.C.e Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. Neste método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys, e glu) são identificados e substituídos por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Outras substituições podem ser introduzidas nas localizações dos aminoácidos demonstrando sensibilidade funcional para as substituições iniciais. Alternativamente, ou adicionalmente, uma estrutura cristalina de um complexo antígeno- anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser visados ou eliminados como candidatos para substituição. As variantes podem ser rastreadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.

[00265] Inserções em sequências aminoacídicas incluem fusões amino- e/ou carboxila-terminais de comprimento variando de um resíduo a polipeptídios contendo cem ou mais resíduos. Assim como inserções intrassequências de um único resíduo aminoacídico ou de múltiplos resíduos aminoacídicos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionil N-terminal. Outras variantes insercionais da molécula de anticorpo incluem a fusão do terminal N ou C do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídio que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo.

b) Variantes com Glicosilação

[00266] Em certas modalidades, um anticorpo oferecido nesta invenção é alterado para aumentar ou diminuir a extensão em que o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de sítios de glicosilação a um anticorpo pode ser convenientemente efetuada por alteração da sequência aminoacídica de forma que um ou mais sítios de glicosilação sejam criados ou removidos.

[00267] Onde o anticorpo compreende uma região Fc, o carboidrato preso ao mesmo pode ser alterado. Anticorpos nativos produzidos por células mamíferas tipicamente compreendem um oligossacarídeo biantenário ramificado que geralmente é preso por uma ligação N ao Asn297 do domínio CH2 da região Fc (vide, por exemplo, Wright, A. e Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32). O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactose, e ácido siálico, assim como uma fucose presa a um GlcNAc no "tronco" da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em algumas modalidades, modificações do oligossacarídeo em um anticorpo da invenção podem ser feitas a fim de criar variantes do anticorpo com certas propriedades melhoradas.

[00268] Em uma modalidade, são oferecidas variantes de anticorpos tendo uma estrutura de carboidrato que não possui fucose presa (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Por exemplo, a quantidade de fucose em tal anticorpo pode variar de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% ou de 20% a 40%. A quantidade de fucose é determinada calculando-se a quantidade média de fucose na cadeia de açúcar em Asn297, em relação à soma de todas as glicoestruturas presas ao Asn 297 (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e com alto teor de manose) medida por espectrometria de massas MALDI-TOF, como descrito no documento WO 2008/077546, por exemplo. Asn297 refere-se ao resíduo asparagina localizado em torno da posição 297 na região Fc (numeração EU de resíduos da região Fc); no entanto, Asn297 também pode estar localizado a cerca de ± 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, devido a variações de sequência mínimas nos anticorpos. Tais variantes com fucosilação podem ter a função ADCC melhorada. Vide, por exemplo, os documentos US 2003/0157108; US 2004/0093621. Exemplos de publicações referentes a varantes de anticorpos "defucosilados" our "deficientes US 2003/0157108; US 2003/0115614;US 2004/0132140; US 2004/0109865;WO 2005/035586; WO 2002/031140; Okazaki, A. et al., J. Mol.1249; Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614-622.Exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos defucosilados incluem células Lec13 CHO deficientes em fucosilação de proteínas (Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249 (1986) 533545; US 2003/0157108; e WO 2004/056312, especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares nocauteadas, tais como o gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO nocauteadas (vide, por exemplo, Yamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87 (2004) 614622; Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94 (2006) 680-688; e WO 2003/085107).

[00269] São ainda oferecidas variantes de anticorpos com oligossacarídeos bissectados, por exemplo, nas quais um oligossacarídeo biantenário preso à região Fc do anticorpo é bissectada por GlcNAc. Tais variantes de anticorpos podem ter fucosilação reduzida e/ou função ADCC melhorada. Exemplos de tais variantes de anticorpos estão descritos, por exemplo, nos documentos WO 2003/011878; US 6,602,684; e US 2005/0123546. Variantes de anticorpos com pelo menos um resíduo galactose no oligossacarídeo preso à região Fc também são oferecidas. Tais variantes de anticorpos podem ter a função CDC melhorada. Tais variantes de anticorpos estão descritas, por exemplo, nos documentos WO 1997/30087; WO 1998/58964; e WO 1999/22764.

c) Variantes da região Fc

[00270] Em certas modalidades, uma ou mais modificações aminoacídicas podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo oferecido nesta invenção, dessa forma gerando uma variante da região Fc. A variante da região Fc pode compreender uma sequência da região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) compreendendo uma modificação aminoacídica (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições aminoacídicas.

[00271] Em certas modalidades, a invenção contempla uma variante de anticorpo que possui algumas, porém não todas as funções efetoras, o que faz da mesma um candidato desejável para aplicações nas quais a meia-vida do anticorpo in vivo é importante e ainda certas funções efetoras (tais como complemento e ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais. Ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/depleção das atividades de CDC e/ou ADCC. Por exemplo, ensaios de ligação do receptor de Fc (FcR) podem ser conduzidos para garantir que o anticorpo não possui ligação de FcyR (e com isso provavelmente não possui atividade de ADCC), mas conserva a capacidade de ligação de FcRn. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam Fc(RIII apenas, enquanto que monócitos expressam Fc RI, Fc? II e Fc RIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch, J.V. e Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492. Exemplos não limitativos de ensaios in vitro para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula interesse estão descritos no documento US 5.500.362 (vide, por exemplo, Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063; e Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502); US 5,821,337 (vide Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361). Alternativamente, métodos de ensaios não radioativos podem ser empregados (vide, por exemplo, ensaio de citotoxicidade não radioativo ACTI™ para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; e ensaio de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células exterminadoras naturais (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como aquele descrito por Clynes, R. et al., em Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656. Ensaios de ligação de C1q também podem ser realizados para confirmar que o anticorpo é incapaz de se ligar à C1q e por conseguinte não possui atividade de CDC. Vide, por exemplo, ELISA de ligação de C1q e C3c nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC pode ser realizado (vide, por exemplo, Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171; Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052; e Cragg, M.S. e M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743). Determinações da ligação de FcRn e da depuração/meia-vida in vivo também pode ser feitas usando-se métodos conhecidos na literatura (vide, por exemplo, Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006: 1759-1769).

[00272] Anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com substituição de um ou mais dos resíduos 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 da região Fc (US 6.737.056). Tais mutantes de Fc incluem mutantes de Fc com substituições em duas ou mais das posições aminoacídicas 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o chamado mutante de Fc "DANA" com substituição dos resíduos 265 e 297 para alanina (US 7,332,581).

[00273] Certas variantes de anticorpos com ligação aumentada ou diminuída a FcRs já foram descritas. (Vide, por exemplo, US 6.737.056; WO 2004/056312, e Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)

[00274] Em certas modalidades, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições aminoacídicas que melhoram a ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333, e/ou 334 da região Fc (numeração EU de resíduos).

[00275] Em algumas modalidades, são feitas alterações na região Fc que resultam em ligação de C1q e/ou citotoxicidade complemento- dependente (CDC) alterada (isto é, aumentada ou diminuída), por exemplo, como descrito no documento US 6.194.551, WO 99/51642, e em Idusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184.

[00276] Anticorpos com meias-vidas aumentadas e ligação melhorada ao receptor de Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto (Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, e Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), estão descritos no documento US 2005/0014934. Esses anticorpos compreendem uma região Fc contendo uma ou mais substituições que aumentam a ligação da região Fc ao FcRn. Tais variantes de Fc incluem aquelas com substituições em um ou mais dos resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 or 434, por exemplo, substituição do resíduo 434 da região Fc (US 7,371,826).

[00277] Vide também Duncan, A.R. e Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; US 5,648,260; US 5,624,821; e WO 94/29351 para outros exemplos de variantes da região Fc.

d) Variantes de anticorpos modificadas com cisteína

[00278] Em certas modalidades, pode ser desejável criar anticorpos manipulados com cisteína, por exemplo, "tioMAbs", nos quais um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos cisteína. Em modalidades particulares, os resíduos substituídos ocorrem em sítios acessíveis do anticorpo. Com a substituição desses resíduos por cisteína, grupos tiol reativos são assim posicionados em sítios acessíveis do anticorpo e podem ser usados para conjugar o anticorpo a outras porções, tais como porções medicamentosas ou porções de ligador-droga, para criar um imunoconjugado, como descrito mais adiante. Em certas modalidades, qualquer um ou mais dos resíduos a seguir podem ser substituídos por cisteína: V205 (numeração de Kabat) of the light chain; A118 (numeração EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração EU) da região Fc de cadeia pesada. Anticorpos manipulados com cisteína podem ser gerados da maneira descrita, por exemplo, no documento US 7,521,541.

e) Derivados de Anticorpos

[00279] Em modalidades, um anticorpo oferecido nesta invenção pode ser ainda modificado para conter porções não proteináceas adicionais que são conhecidas na literatura e encontram-se facilmente disponíveis. As porções adequadas para derivatização do anticorpo incluem, porém sem limitação, polímeros solúveis em água. Exemplos não limitativos de polímeros solúveis em água incluem, porém sem limitação, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrana, polivinil álcool, polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (seja homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrana ou poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), polivinil álcool, e misturas dos mesmos. Polietileno glicol propionaldeído pode apresentar vantagens na produção devido a sua estabilidade em água. O polímero pode ter qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros presos ao anticorpo pode variar, e se mais de um polímero estiver preso, eles podem ser moléculas iguais ou diferentes. Em geral, o número e/ou o tipo de polímeros usados para derivatização podem ser determinados com base em considerações que incluem, porém sem limitação, as propriedades ou funções particulares do anticorpo a ser melhorado, se o derivado de anticorpo será usado em uma terapia em condições definidas, etc.

[00280] Em outra modalidade, são oferecidos conjugados de um anticorpo e uma porção não proteinácea que podem ser seletivamente aquecidos por exposição à radiação. Em uma modalidade, a porção não proteinácea é um nanotubo de carbono (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda, e inclui, porém sem limitação, comprimentos de onda que não prejudicam células comuns, mas esquentam a porção não proteinácea até uma temperatura à qual as células próximas ao anticorpo-porção não proteinácea são eliminadas.

f) Fusões com um módulo de transporte pela barreira hematoencefálica

[00281] Anticorpos monoclonais têm um vasto potencial terapêutico para tratamento de doenças neurológicas ou doenças do sistema nervoso central (SNC), mas sua passagem para o cérebro é limitada pela barreira hematoencefálica (BBB). Estudos anteriores mostraram que uma percentagem muito pequena (aproximadamente 0,1%) de uma IgG que circula na corrente sanguínea atravessa a BBB e atinge o COMPOSIÇÕES NUTRICIONAIS (Felgenhauer, K., Klin. Wschr. 52 (1974) 1158-1164), onde a concentração do anticorpo no SNC pode ser insuficiente para permitir um efeito robusto.

[00282] Em certas modalidades, um anticorpo oferecido nesta invenção pode ser ainda modificado para conter um ou mais módulos de transporte pela barreira hematoencefálica que são conhecidos na literatura e encontram-se facilmente disponíveis.

[00283] O um ou mais módulos de transporte pela barreira hematoencefálica podem ser fundidos a qualquer terminal da cadeia leve ou pesada. Em uma modalidade preferida o módulo de transporte pela barreira hematoencefálica é fundido ao terminal C da cadeia pesada.

[00284] O terminal C da cadeia pesada pode ser um terminal C completo terminando com os resíduos aminoacídicos PGK. O terminal C da cadeia pesada pode ser um terminal C encurtado no qual um ou dois dos resíduos aminoacídicos C-terminais foram removidos. Em uma modalidade preferida o terminal C da cadeia pesada é um terminal C encurtado terminado em PG.

[00285] O um ou mais módulos de transporte pela barreira hematoencefálica podem ser fundidos à respectiva cadeia do anticorpo seja diretamente ou via um ligador peptídico. Em uma modalidade preferida o ligador peptídico tem a sequência aminoacídica GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N°: 41).

[00286] O módulo de transporte pela barreira hematoencefálica pode ser um fragmento scFv do anticorpo. Em uma modalidade o módulo de transporte pela barreira hematoencefálica é um scFv compreendendo na direção do terminal N para o terminal C um domínio variável de cadeia leve-um domínio constante de cadeia leve- um ligador peptídico-um domínio variável de cadeia pesada-o domínio constante 1 de cadeia pesada.

[00287] Em uma modalidade preferida o módulo de transporte pela barreira hematoencefálica é o fragmento scFv do anticorpo antireceptor de transferrina 8D3 com um ligador peptídico (G4S)6 ou uma variante humanizada do mesmo.

[00288] O termo variante humanizada do mesmo denota uma molécula que fora obtida por enxerto das CDRs do anticorpo 8D3 murino em uma estrutura humana com a introdução opcional de uma a três mutações independentes uma da outra em cada uma das regiões de estrutura (FRs) e/ou das regiões hipervariáveis (HVRs).

[00289] Em um aspecto, a presente invenção oferece um polipeptídio de fusão de anticorpo anti-alfa-sinucleína humana compreendendo um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, dois ligadores peptídicos e duas entidades de ligação monovalente que se ligam a um receptor da barreira hematoencefálica, onde o ligador acopla o anticorpo anti-alfa-sinucleína humana às entidades de ligação monovalente que se ligam ao receptor da barreira hematoencefálica.

[00290] Em um aspecto, a presente invenção oferece um um polipeptídio de fusão de anticorpo anti-alfa-sinucleína humana compreendendo um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, um ligador peptídico e uma entidade de ligação monovalente que se liga a um receptor da barreira hematoencefálica, onde o ligador acopla o anticorpo anti-alfa-sinucleína humana à entidade de ligação monovalente que se liga ao receptor da barreira hematoencefálica.

[00291] Em uma modalidade, a entidade de ligação monovalente que se liga ao receptor da barreira hematoencefálica é selecionada do grupo que consiste em proteínas, polipeptídios e peptídios.

[00292] Em uma modalidade, a entidade de ligação monovalente que se liga ao receptor da barreira hematoencefálica compreende uma molécula selecionada do grupo que consiste em um ligando do receptor da barreira hematoencefálica, um scFv, um Fv, um scFab, um VHH, em uma modalidade preferida um scFv ou um scFab.

[00293] Em uma modalidade, o receptor da barreira hematoencefálica é selecionado do grupo que consiste em receptor de transferrina, receptor de insulina, receptor do fator de crescimento semelhante à insulina, proteína 8 relacionada com o receptor de lipoproteína de baixa densidade, proteína 1 relacionada com o receptor de lipoproteína de baixa densidade, e fator de crescimento semelhante ao fator de crescimento epidérmico de ligação de heparina. Em uma modalidade preferida the receptor da barreira hematoencefálica é o receptor de transferrina.

[00294] Em uma modalidade, a entidade de ligação monovalente que se liga ao receptor da barreira hematoencefálica compreende um scFab ou um scFv direcionado para o receptor de transferrina, mais particularmente um scFab ou scFv que reconhece um epítopo no receptor de transferrina compreendida na sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 52, 53 e 54.

[00295] Em uma modalidade, a entidade de ligação monovalente que se liga ao receptor da barreira hematoencefálica é acoplada à extremidade C-terminal da cadeia pesada do anticorpo anti-alfa- sinucleína humana pelo ligador.

[00296] Em uma modalidade, o ligador peptídico é uma sequência aminoacídica com um comprimento de pelo menos 15 aminoácidos, mais preferivelmente com um comprimento de 18 a 25 aminoácidos.

[00297] Em uma modalidade, o anticorpo anti-alfa-sinucleína humana é um anticorpo de comprimento integral, em uma modalidade preferida uma IgG de comprimento integral. O termo anticorpo de comprimento integral denota um anticorpo que consiste em dois polipeptídios de cadeia leve de anticorpo e dois polipeptídios de cadeia pesada de anticorpo onde nos dois polipeptídios de cadeia pesada de anticorpo o resíduo lisina C-terminal (K) pode estar presente ou não.

[00298] Em uma modalidade preferida, o polipeptídio de fusão de anticorpo anti-alfa-sinucleína humana compreende um anticorpo anti- alfa-sinucleína humana IgG de comprimento integral como entidade efetora do cérebro, um ligador da sequência GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N°: 41) e um scFab como entidade de ligação monovalente que se liga ao receptor de transferrina humana como receptor da barreira hematoencefálica, onde o scFab é acoplado pelo ligador à extremidade C-terminal (da parte Fc) de uma das cadeias pesadas do anticorpo anti-alfa- sinucleína humana de comprimento integral, e onde o scFab reconhece um epítopo no receptor de transferrina humana compreendido na sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 52, 53 e 54.

[00299] Em uma modalidade preferida, o polipeptídio de fusão de anticorpo anti-alfa-sinucleína humana compreende um anticorpo anti- alfa-sinucleína humana IgG de comprimento integral como entidade efetora do cérebro, um ligador da sequência GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N°: 41) e um scFv como entidade de ligação monovalente que se liga ao receptor de transferrina humana como receptor da barreira hematoencefálica, onde o scFab é acoplado pelo ligador à extremidade C-terminal (da parte Fc) de uma das cadeias pesadas do anticorpo anti-alfa- sinucleína humana de comprimento integral, e onde oscFab reconhece um epítopo no receptor de transferrina humana compreendido na sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 52, 53 e 54.

[00300] Em uma modalidade, a primeira cadeia pesada do anticorpo anti-alfa-sinucleína humana compreende um primeiro módulo de dimerização e a segunda cadeia pesada do anticorpo compreende um segundo módulo de dimerização permitindo heterodimerização das duas cadeias pesadas.

[00301] Em uma modalidade, o primeiro módulo de dimerização da primeira cadeia pesada do anticorpo anti-alfa-sinucleína humana é uma cadeia pesada do tipo "knob" e o módulo de dimerização da segunda cadeia pesada do anticorpo anti-alfa-sinucleína humana é uma cadeia pesada do tipo "hole") de acordo com a estratégia "knobs- into-holes").

[00302] O polipeptídio de fusão de anticorpo anti-alfa-sinucleína humana apresentado nesta invenção pode ser usado como um medicamento, em particular ele pode ser usado para o tratamento de um distúrbio neurológico tal como por exemplo, mal de Parkinson.

[00303] O polipeptídio de fusão de anticorpo anti-alfa-sinucleína humana apresentado nesta invenção pode ser usado para transportar o anticorpo anti-alfa-sinucleína humana (entidade efetora do cérebro) pela barreira hematoencefálica.

[00304] Em uma modalidade, a cadeia pesada do anticorpo anti- alfa-sinucleína humana que é acoplada em sua extremidade C- terminal da região Fc ao scFab como entidade de ligação monovalente que se liga ao receptor de transferrina humana tem a seguinte estrutura na direção do terminal N para o terminal C: • cadeia pesada de IgG, • ligador peptídico acoplando a extremidade C-terminal da região Fc da cadeia pesada de IgG à extremidade N-terminal do domínio VL do scFab, em uma modalidade preferida o ligador peptídico tem a sequência aminoacídica GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N°: 41), • domínio variável de cadeia leve (VL) e domínio de cadeia leve C-capa do scFab, • ligador peptídico acoplando a extremidade C-terminal do domínio de cadeia leve C-capa do scFab à extremidade N-terminal do domínio VH do scFab, em uma modalidade preferida o ligador peptídico tem a sequência aminoacídica (G4S)6GG (SEQ ID N°: 55), • domínio variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo scFab e domínio de cadeia pesada CH1 de IgG.

[00305] Em uma modalidade, a cadeia pesada do anticorpo anti- alfa-sinucleína humana que é acoplada em sua extremidade C- terminal da região Fc ao scFv como entidade de ligação monovalente que se liga ao receptor de transferrina humana tem a seguinte estrutura na direção do terminal N para o terminal C: • cadeia pesada de IgG, • ligador peptídico acoplando a extremidade C-terminal da parte Fc da cadeia pesada de IgG à extremidade N-terminal do domínio VL do fragmento de anticorpo scFv, em uma modalidade preferida o ligador peptídico é um peptídio com a sequência aminoacídica GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID N°: 41), • domínio variável de cadeia leve (VL), • ligador peptídico acoplando a extremidade C-terminal do domínio variável de cadeia leve à extremidade N-terminal do domínio VH do scFv, em uma modalidade preferida o ligador peptídico é um peptídio com a sequência aminoacídica (G4S)6GG (SEQ ID N°: 55), • domínio variável de cadeia pesada (VH) do fragmento de anticorpo scFv.

[00306] Em um segundo aspecto a presente invenção oferece um polipeptídio de fusão para transportar uma entidade efetora do cérebro pela barreira hematoencefálica compreendendo uma entidade CH2- CH3 Ig, um ligador peptídico e um scFab ou scFv direcionado para um receptor da barreira hematoencefálica, onde o scFab ou scFv é acoplado a uma extremidade C-terminal da entidade CH2-CH3 Ig pelo ligador peptídico.

[00307] Em uma modalidade o módulo de transporte pela barreira hematoencefálica/o scFab ou scFv direcionado para um receptor da barreira hematoencefálica é derivado de um anticorpo anti-receptor de transferrina humanizado 8D3 (vide por exemplo, Boado, R.J., et al., Biotechnol. Bioeng. 102 (2009) 1251-1258). O domínio variável de cadeia pesada murino tem a sequência aminoacídica de EVQLVESGGG LVQPGNSLTL SCVASGFTFS NYGMHWIRQA PKKGLEWIAM IYYDSSKMNY ADTVKGRFTI SRDNSKNTLY LEMNSLRSED TAMYYCAVPT SHYVVDVWGQ GVSVTVSS (SEQ ID N°: 56).

[00308] O domínio variável de cadeia leve murino (variante 1) tem a sequência aminoacídica de DIQMTQSPAS LSASLEEIVT ITCQASQDIG NWLAWYQQKP GKSPQLLIYG ATSLADGVPS RFSGSRSGTQ FSLKISRVQV EDIGIYYCLQ AYNTPWTFGG GTKLELK (SEQ ID N°: 57), e • domínio variável de cadeia leve murino (variante 2) tem a sequência aminoacídica de DIQMTQSPAS LSASLEEIVT ITCQASQDIG NWLAWYQQKP GKSPQLLIYG ATSLADGVPS RFSGSRSGTQ FSLKISRVQV EDIGIYYCLQ AYNTPWTFGG GTKVEIK (SEQ ID N°: 58).

Um módulo de transporte pela barreira hematoencefálica

[00309] Em um aspecto o polipeptídio de fusão de anticorpo anti- alfa-sinucleína humana compreende exatamente um módulo de transporte pela barreira hematoencefálica, onde o módulo de transporte pela barreira hematoencefálica compreende os domínios variáveis humanizados do anticorpo anti-receptor de transferrina humanizado 8D3, por meio do qual o módulo de transporte pela barreira hematoencefálica compreendendo os domínios variáveis humanizados do anticorpo anti-receptor de transferrina humanizado 8D3 transporta o anticorpo anti-alfa-sinucleína humana pela barreira hematoencefálica. Os domínios variáveis do anticorpo anti-receptor de transferrina humanizado 8D3 têm a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 56 e 57.

Um ou dois módulos de transporte pela barreira hematoencefálica

[00310] Em um aspecto o polipeptídio de fusão de anticorpo anti- alfa-sinucleína humana compreende um ou dois módulos de transporte pela barreira hematoencefálica, onde o módulo de transporte pela barreira hematoencefálica derivado de um anticorpo que se liga com baixa afinidade a um receptor da barreira hematoencefálica (BBB-R), por meio do qual o módulo de transporte pela barreira hematoencefálica derivado de um anticorpo que se liga com baixa afinidade a um receptor da barreira hematoencefálica transporta o anticorpo anti-alfa-sinucleína humana pela barreira hematoencefálica.

[00311] Em outro aspecto, o BBB-R é selecionado do grupo que consiste em receptor de transferrina (TfR), receptor de insulina, receptor do fator de crescimento semelhante à insulina (receptor de IGF), proteína 8 relacionada com o receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP8), proteína 1 relacionada com o receptor de lipoproteína de baixa densidade 1 (LRP1), e fator de crescimento semelhante ao fator de crescimento epidérmico de ligação de heparina (HB-EGF). Em outro tal aspecto, the BBB-R is a human BBB-R. Em um tal aspecto, o BBB-R é TfR. Em outro tal aspecto, o BBB-R é TfR e o anticorpo não inibibe a atividade do TfR. Em outro tal aspecto, o BBB-R é TfR e o anticorpo não inibe a ligação de TfR à transferrina.

[00312] Em outro aspecto, o anticorpo não prejudica a ligação da BBB-R a um ou mais de seus ligandos nativos. Em outro tal aspecto, o anticorpo liga-se especificamente ao receptor de transferrina humana (hTfR) de tal maneira que não inibe a ligação da hTfR à transferrina humana.

[00313] Em outro aspecto, o anticorpo anti-BBB-R tem uma IC50 para o BBB-R de cerca de 1 nM a cerca de 100 μM. Em outro tal aspecto, a IC50 varia de cerca de 5 nM a cerca de 100 μM. Em outro tal aspecto, a IC50 varia de cerca de 50 nM a cerca de 100 μM. Em outro tal aspecto, a IC50 varia de cerca de 100 nM a cerca de 100 μM. Em outro aspecto, o anticorpo tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 5 nM a cerca de 10 μM. Em outro tal aspecto, o anticorpo, quando se acopla ao anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 1 μM. Em outro tal aspecto, o anticorpo, quando acoplado ao anticorpo anti-alfa- sinucleína humana, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 50 nM a cerca de 1 μM. Em um aspecto, a afinidade do anticorpo anti- BBB-R ou do polipeptídio de fusão de anticorpo anti-alfa-sinucleína humana para o BBB-R é medida usando-se análise de Scatchard. Em outro aspecto, a afinidade do anticorpo anti-BBB-R ou do polipeptídio de fusão de anticorpo anti-alfa-sinucleína humana para o BBB-R é medida usando-se análise BIACORE. Em outro aspecto, a afinidade do anticorpo anti-BBB-R ou do polipeptídio de fusão de anticorpo anti- alfa-sinucleína humana para o BBB-R é medida usando-se um ELISA competitivo.

Uso dos polipeptídios de fusão de anticorpo contendo transporte pela barreira hematoencefálica

[00314] Em outra modalidade, a invenção oferece um método para aumentar a exposição do SNC aum anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, onde o anticorpo anti-alfa-sinucleína humana é acoplado a um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga com baixa afinidade a um BBB-R, dessa forma aumentando a exposição do SNC ao anticorpo anti-alfa-sinucleína humana. Em outro aspecto, o aumento na exposição do SNC ao anticorpo anti-alfa-sinucleína humana é medido em relação à exposição do SNC a um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana acoplado a um anticorpo típico que não tem afinidade reduzida para o BBB-R. Em outro aspecto, o aumento na exposição do SNC ao anticorpo anti-alfa-sinucleína humana é medida como uma relação da quantidade do anticorpo anti-alfa- sinucleína humana encontrada no SNC em relação à quantidade encontrada no soro depois da administração. Em outro tal aspecto, o aumento na exposição do SNC ao resulta em uma relação maior que 0,1%. Em outro aspecto, o aumento na exposição do SNC ao anticorpo anti-alfa-sinucleína humana é medido em relação à exposição do SNC ao anticorpo anti-alfa-sinucleína humana na ausência de um anticorpo anti-BBB-R acoplado. Em outro aspecto, o aumento na exposição do SNC ao anticorpo anti-alfa-sinucleína humana é medido por imagem. Em outro aspecto, o aumento na exposição do SNC ao anticorpo anti-alfa-sinucleína humana é medido por uma leitura indireta tal como uma modificação de um ou mais sintomas fisiológicos.

[00315] Um método para aumentar a retenção no SNC de um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana administrado a um sujeito, onde o anticorpo anti-alfa-sinucleína humana é acoplado a um anticorpo ou fragmento de anticorpo, que se liga com baixa afinidade a um BBB-R, de modo que a retenção do anticorpo anti-alfa-sinucleína humana no SNC é aumentada.

[00316] Em outra modalidade, a invenção oferece um método para otimizar a farmacocinética e/ou farmacodinâmica de um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana para ser eficaz no SNC de um sujeito, onde o anticorpo anti-alfa-sinucleína humana é acoplado a um anticorpo ou fragmento de anticorpo, que se liga com baixa afinidade a um BBB-R, onde o anticorpo ou fragmento de anticorpo é selecionado de modo que sua afinidade para o BBB-R depois de acoplamento ao anticorpo anti-alfa-sinucleína humana resulta em uma quantidade de transporte do anticorpo ou fragmento de anticorpo conjugado ao anticorpo anti-alfa-sinucleína humana pela BBB que otimiza a farmacocinética e/ou a farmacodinâmico do anticorpo anti-alfa-sinucleína humana no SNC.

[00317] Em outra modalidade a invenção oferece um método para tratar um distúrbio neurológico em um mamífero compreendendo tratar o mamífero com um anticorpo ou fragmento de anticorpo, que se liga a um BBB-R e que é acoplado a um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, onde o anticorpo fora selecionado para ter uma afinidade baixa para o BBB-R e assim aumentar a absorção no SNC do anticorpo e do anticorpo anti-alfa-sinucleína humana acoplado. Em uma modalidade, o tratamento resulta na diminuição ou eliminação dos sintomas do distúrbio. Em outro aspecto, o tratamento resulta na melhora do distúrbio neurológico.

[00318] Em uma modalidade de todos os apsectos anteriores, o anticorpo anti-BBB-R tem uma IC50 para o BBB-R de cerca de 1 nM a cerca de 100 μM. Em outra tal modalidade, a IC50 varia de cerca de 5 nM a cerca de 100 μM. Em outra tal modalidade, a IC50 varia de cerca de 50 nM a cerca de 100 μM. Em outra tal modalidade, a IC50 varia de cerca de 100 nM a cerca de 100 μM. Em outra modalidade, o anticorpo tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 5 nM a cerca de 10 μM. Em outra modalidade, o anticorpo, quando se acopla ao anticorpo anti- alfa-sinucleína humana, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 30 nM a cerca de 1 μM. Em outra modalidade, o anticorpo, quando acoplado ao anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, tem uma afinidade para o BBB-R de cerca de 50 nM a cerca de 1 μM. Em uma modalidade, a afinidade do anticorpo anti-BBB-R ou do polipeptídio de fusão de anticorpo anti-alfa-sinucleína humana para o BBB-R é medida usando-se análise de Scatchard. Em outra modalidade, a afinidade do anticorpo anti-BBB-R ou do polipeptídio de fusão de anticorpo anti-alfa-sinucleína humana para o BBB-R é medida usando- se análise BIACORE. Em outra modalidade, a afinidade do anticorpo anti-BBB-R ou do polipeptídio de fusão de anticorpo anti-alfa- sinucleína humana para o BBB-R é medida usando-se um ELISA competitivo.

[00319] Em outra modalidade, o polipeptídio de fusão de anticorpo anti-alfa-sinucleína humana é marcado. Em outra modalidade, o anticorpo anti-BBB-R ou fragmento não prejudica a ligação do BBB-R a um ou mais dos seus ligandos nativos. Em outra modalidade, o anticorpo anti-BBB-R liga-se especificamente ao hTfR de tal maneira que não inibe a ligação do hTfR à transferrina humana. Em outra modalidade, o polipeptídio de fusão de anticorpo anti-alfa-sinucleína humana é administrado a um mamífero. Em outra modalidade, o mamífero é um ser humano. Em outra modalidade, o mamífero tem um distúrbio neurológico. Em outra modalidade, o distúrbio neurológico é selecionado do grupo que consiste em mal de Alzheimer (AD), derrame, demência, distrofia muscular (MD), esclerose múltipla (MS), esclerose lateral amiotrófica (ALS), fibrose cística, síndrome de Angelman, síndrome de Liddle, mal de Parkinson, doença de Pick, doença de Paget, câncer, e lesão cerebral traumática.

B. Métodos Recombinantes e Composições

[00320] Os anticorpos podem ser produzidos usando-se métodos recombinantes e composições, por exemplo, aqueles descritos no documento US 4.816.567. Em uma modalidade, é oferecido um ácido nucleico isolado codificando um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana descrito neste relatório. Tal ácido nucleico pode codificar uma sequência aminoacídica compreendendo a VL e/ou uma sequência aminoacídica compreendendo a VH do anticorpo (por exemplo, as cadeias leves e/ou pesadas do anticorpo). Em ainda outra modalidade, são oferecidos um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) compreendendo tal ácido nucleico. Em ainda outra modalidade, é oferecida uma célula hospedeira compreendendo tal ácido nucleico. Em uma tal modalidade, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, fora transformada com): (1) um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência aminoacídica compreendendo a VL do anticorpo e uma sequência aminoacídica compreendendo a VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência aminoacídica compreendendo a VL do anticorpo e um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência aminoacídica compreendendo a VH do anticorpo. Em uma modalidade, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo, célula de ovário de hamster chinês (CHO) ou célula linfoide (por exemplo, célula Y0, NS0, Sp20). Em uma modalidade, é oferecido um método para fazer um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, onde o método compreende cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico codificando o anticorpo, como descrito acima, em condições adequadas para expressão do anticorpo, e opcionalmente recuperar o anticorpo a partir da célula hospedeira (ou meio de cultura da célula hospedeira).

[00321] Para produção recombinante de um anticorpo anti-alfa- sinucleína humana, um ácido nucleico codificando um anticorpo, por exemplo, como descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem e/ou expressão adicionais em uma célula hospedeira. Tal ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado usando-se procedimentos convenionais (por exemplo, usando-se sondas oligonucleotídicas que são capazes de se ligar especificamente a genes codificando as cadeias pesada e leve do anticorpo).

[00322] Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores codificando anticorpos incluem células procarióticas ou eucarióticas descritas neste relatório. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias. Para expressão de fragmentos de anticorpos e polipeptídios em bactérias, vide, por exemplo, os documentos US 5.648.237, US 5.789.199, e US 5.840.523. (vide também Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), págs. 245-254, que descreve a expressão de fragmentos de anticorpos em E. coli.) depois de expressão, o anticorpo pode ser isolado da pasta de células bacterianas em uma fração solúvel e pode ser ainda purificado.

[00323] Além dos procariotas, micróbios eucarióticos tais como fungos filamentosos ou levedura são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores codificando anticorpos, incluindo fungos e cepas de levedura cujas vias de glicosilação foram "humanizadas", resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcialmente ou totalmente humano. Vide Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; e Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.

[00324] Células hospedeiras adequadas para a expressão de um anticorpo glicosilado também são derivados de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células invertebradas incluem células de plantas e insetos. Já foram identificadas numerosas cepas baculovirais que podem ser usadas em conjunto com células de insetos, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

[00325] Culturas de células vegetais também podem ser utilizadas como hospedeiros. Vide, por exemplo, os documentos US 5.959.177, US 6.040.498, US 6.420.548, US 7.125.978, e US 6.417.429 (que descreve a tecnologia PLANTIBODIESTM para produzir anticorpos em plantas transgênicas).

[00326] Células vertebradas também podem ser usadas como hospedeiros. Por exemplo, linhagens celulares mamíferas que são adaptadas para crescerem em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens celulares mamíferas hospedeiras úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7); linhagem de rim embrionário humano (293 ou células 293 descritos, por exemplo, por Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); células de rim de filhote de hamster (BHK); células de Sertoli de camundongo (células TM4 descritas, por exemplo, por Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); células de rim de macaco (CV1); células de rim de marcaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de rim de cachorro (MDCK; células de fígado de rato Búfalo (BRL 3A); células de pulmão humano (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor de mama de camundongo (MMT 060562); células TRI, descritas, por exemplo, por Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens celulares hospedeiras mamíferas incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO DHFR- (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); e linhagens celulares de mieloma tais como Y0, NS0 e Sp2/0. Para revisão de certas linhagens celulares hospedeiras mamíferas adequadas para produção de anticorpos, vide, por exemplo, Yazaki, P. e Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), págs. 255-268.

C. Ensaios

[00327] Os anticorpos anti-alfa-sinucleína humana oferecidos nesta invenção podem ser identificados, rastreados, ou caracterizados por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos na literatura.

Ensaios de ligação e outros ensaios

[00328] Em um aspecto, um anticorpo da invenção é testado quanto a sua atividade de ligação de antígeno, por exemplo, por métodos conecidos tais como ELISA, alphaLISA, análise da mancha ocidental, ensaio de anticorpo ou de fase reversa, etc.

[00329] Em um ensaio ELISA ou alphaLISA exempificativo, alfa- sinucleína em solução (sobrenadante de células, lisados de células ou tecido, fluidos corporais etc.) é ligada por um anticorpo de captura, que se liga especificamente a um primeiro epítopo na alfa-sinucleína, ou alfa- sinucleína em uma certa conformação e um anticorpo de detecção acocplado a uma entidade de detecção, que se liga especificamente a um segundo epítopo ou conformação de alfa-sinucleína. A leitura baseia- se na entidade de detecção (quimioluminescência, fluorescência, luminescência induzida por transferência de energia etc.). Em alguns casos o mesmo anticorpo pode ser usado no mesmo ensaio como anticorpo de captura e detecção para detectar formas agregadas de alfa- sinucleína (vide, por exemplo, Tokuda, T. et al., Neurology 75 (2010) 1766-1772).

[00330] No caso de arranjo de anticorpos, os anticorpos são coloridos sobre chips de vidro ou nitrocelulose. As lâminas são bloqueadas e incubadas com uma solução contendo alfa-sinucleína, lavadas para remover os anticorpos não ligados e os anticorpos ligados são detectados com um anticorpo secundário correspondente marcado com fluorescência. O sinal de fluorescência é medido por um scanner de lâminas de fluorescência. Similarmente para um arranjo em fase reversa, alfa-sinucleína recombinante, sobrenadante de células, lisados de células ou tecido, fluidos corporais etc. são coloridos sobre chips de vidro ou nitrocelulose. As lâminas são bloqueadas e arranjos individuais são incubados com um anticorpo contra um epítopo específico na alfa- sinucleína. Os anticorpos não ligados são removidos por lavagem e os anticorpos ligados são detectados com um anticorpo secundário correspondente marcado com fluorescência. O sinal de fluorescência é medido por um scanner de lâminas de fluorescência (Dernick, G., et al., J. Lipid Res. 52 (2011) 2323-2331).

[00331] No exemplo de análise da mancha ocidental, alfa-sinucleína recombinante agregada ou alfa-sinucleína derivada de sobrenadante de células, lisados de células ou tecido, fluidos corporais etc. é separada por peso molecular em condições de SDS PAGE ou condições de gel nativo e manchada sobre uma membrana de nitrocelulose ou PVDF. Depois do bloqueio a membrana é incubada com anticorpos específicos para a sequência aminoacídica ou conformações de alfa-sinucleína. Depois disso a membrana é lavada para remover os anticorpos não ligados. Os anticorpos ligados são detectados por anticorpos secundários correspondentes acoplados a entidades de detecção para quimioluminescência ou fluorescência ou outros meios de detecção. Os anticorpos específicos para sequências aminoacídicas de alfa-sinucleína vão se ligar à alfa-sinucleína em várias formas agregados e consequentemente pesos moleculares contanto que o epítopo não seja ocultado pela agregação. Por outro lado, anticorpos conformação-específicos só vão detectar certas formas agregadas de alfa-sinucleína revelando apenas bandas em pesos moleculares específicos (vide, por exemplo, Towbin, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4353; Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203).

[00332] Em outro aspecto, ensaios competitivos podem ser usados para identificar um anticorpo que compete com o anticorpo 0017, com anticorpo 0018 ou com o anticorpo 0081 pela ligação à alfa-sinucleína humana. Em certas modalidades, tal anticorpo competitivo liga-se ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou conformacional) que é ligado por um anticorpo como descrito nesta invenção tal como o anticorpo 0017, o anticorpo 0018 e o anticorpo 0081. Métodos exemplificativos detalhados para mapear um epítopo ao qual um anticorpo se liga estão descritos por Morris, G.E. (ed.), Epitope Mapping Protocols, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996).

[00333] Em um ensaio competitivo exemplificativo, alfa-sinucleína humana imobilizada é incubada em uma solução compreendendo um primeiro anticorpo marcado que se liga à alfa-sinucleína humana (por exemplo, o anticorpo 0017, o anticorpo 0018 ou o anticorpo 0081) e um segundo anticorpo não marcado que é testado quanto à sua capacidade para competir com o primeiro anticorpo pela ligação à alfa- sinucleína humana. Como um controle, alfa-sinucleína humana imobilizada é incubada em uma solução compreendendo o primeiro anticorpo marcado mas não segundo anticorpo não marcado. Depois de incubação em condições que permitem a ligação do primeiro anticorpo à alfa-sinucleína humana, o excesso de anticorpo não marcado é removido, e a quantidade de marcador associado à alfa- sinucleína humana imobilizada é medida. Se a quantidade de marcador associado à alfa-sinucleína humana imobilizada for substancialmente reduzida na amostra de teste em relação à amostra de controle, então isto indica que o segundo anticorpo compete com o primeiro anticorpo pela ligação à alfa-sinucleína humana (vide por exemplo, Harlow, E. e Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)).

2. Ensaios de atividade

[00334] Em um aspecto, são oferecidos ensaios para identificar anticorpos anti-alfa-sinucleína humana tendo atividade biológica. Atividade biológica pode incluir, por exemplo, proteção/redução/inibição de citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína, e/ou proteção/redu- ção/inibição de transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica, e/ou redução da atividade de caspase induzida pela alfa-sinucleína em células neuronais humanas. Também são oferecidos anticorpos tendo tal atividade biológica in vivo e/ou in vitro.

[00335] Em certas modalidades, um anticorpo da invenção é testado quanto à tal atividade biológica.

[00336] A atividade biológica protetora pode ser avaliada por adição de meio condicionado contendo alfa-sinucleína secretada, que causa morte celular em células neuronais receptoras. Esta toxicidade pode ser revertida por adição dos anticorpos protetores descritos nesta invenção. A natureza tóxido da alfa-sinucleína secretada já fora anteriormente estabelecida (Emmanouilidou, E., et al., J. Neurosci., 30 (2010) 6838-6851).

D. Métodos e Composições para Diagnóstico e Detecção

[00337] Em certas modalidades, qualquer um dos anticorpos anti- alfa-sinucleína humana oferecidos nesta invenção é útil para detectar a presença de alfa-sinucleína humana em uma amostra biológica. O termo "detectar" conforme usado neste relatório abrange detecção quantitativa ou qualitativa. Em certas modalidades, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido, tal como tecido cerebral.

[00338] Em uma modalidade, é oferecido um anticorpo anti-alfa- sinucleína humana para uso em um método de diagnóstico ou detecção. Em outro aspecto, é oferecido um método para detectar a presença de alfa-sinucleína humana em uma amostra biológica.. Em certas modalidades, o método compreende colocar a amostra biológica em contato com um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana descrito nesta invenção em condições que permitem a ligação do anticorpo anti-alfa-sinucleína humana à alfa-sinucleína humana, e detectar se um complexo é formado entre o anticorpo anti-alfa- sinucleína humana e a alfa-sinucleína humana. Tal método pode ser um método in vitro ou in vivo. Em uma modalidade, um anticorpo anti- alfa-sinucleína humana é usado para selecionar indivíduos elegíveis para tearpia com um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, por exemplo, onde a alfa-sinucleína humana é um biomarcador para a seleção de pacientes.

[00339] Distúrbios exemplificativos que podem ser diagnosticados pelo uso de um anticorpo da invenção incluem neurodegeneração com acúmulo de ferro no cérebro tipo 1 (NBIA1), insuficiência autonômica pura, síndrome de Down, complexo de Guam, e vários distúrbios com corpos de Lewy, tais como doença difusa com corpos de Lewy (DLBD), a variante com corpos de Lewy do mal de Alzheimer (LBVAD), certas formas da doença de Gaucher, e demência associada ao mal de Parkinson (PDD).

[00340] Em certas modalidades, são oferecidos anticorpos anti-alfa- sinucleína humana marcados. Marcadores incluem, porém sem limitação, marcadores ou porções que são detectados diretamente (tais como marcadores fluorescentes, cromofóricos, elétron-densos, quimioluminescente, e radioativos), assim como porções tais como enzimas ou ligandos, que são detectados indiretamente, por exemplo, através de uma reação enzimática ou interação molecular. Marcadores exemplificativos incluem, porém sem limitação, os radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H, e 131I, fluoróforos tais como quelatos de terras raras ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, umbeliferona, luceriferases, por exemplo, luciferase de pirilampo e luciferase bacteriana (US 4,737,456), luciferina, 2,3-di-hidroftalazinadionas, peroxidase de raiz-forte (HRP), fosfatase acalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisozima, oxidases sacarídicas, por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase, e glucose-6-fosfato desidrogenase, oxidases heterocíclicas tais como uricase e xantina oxidase, acopladas com uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidar um precursor de corante tal como HRP, lactoperoxidase, ou microperoxidase, biotina/avidina, marcadores de spin, marcadores bacteriofágicos, radicais livres estáveis, entre outros. E. Formulações farmacêuticas

[00341] Formulações farmacêuticas de um anticorpo anti-alfa- sinucleína humana descrito neste relatório são preparados por misturação de tal anticorpo tendo o grau de pureza desejado com um ou mais carreadores farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)), na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Carreadores farmaceuticamente aceitáveis geralmente são atóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem, porém sem limitação: tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; preservativos (tais como cloreto de octadecil dimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenil, butil ou benzil álcool; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídios de baixo (peso molecular (inferior a cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como poli(vinilpirrolidona); aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contraíons formadores de sal tais como sódio; complexos metálicos (complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos tais como polietileno glicol (PEG). Carreadores farmaceuticamente aceitáveis exemplificativos incluem ainda agentes de dispersão de droga intersticiais tais como glicoproteínas hialuronidase neutro-ativas solúveis (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas hialuronidase PH-20 humanas solúveis, tais como rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs exemplificativas e métodos de uso, incluindo rhuPH20, estão descritos nos documentos US 2005/0260186 e US 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais tais como condroitinases.

[00342] Formulações de anticorpos liofilizadas exemplificativas estão descritas no documento US 6.267.958. Formulações de anticorpos aquosas incluem aquelas descritas nos documentos US 6.171.586 e WO 2006/044908, estas últimas formulações incluindo um tampão histidina-acetato.

[00343] A formulação desta invenção também pode conter mais de um princípio ativo conforme necessário para a indicação particular sendo tratada, preferivelmente aqueles com atividades complementares que não afetam adversamente uma à outra. Por exemplo, pode ser desejável oferecer ainda [[uma lista de drogas que podem ser combinadas com o anticorpo anti-alfa-sinucleína humana]]. Tais princípios ativos estão adequadamente presentes em combinaçao em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida.

[00344] Princípios ativos podem ser aprisionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulose ou gelatina e microcápsulas de poli-(metil metacrilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de droga coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas estãao descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980).

[00345] Preparações de liberação sistemática podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sistemática incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, matrizes estas que estão na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes, ou microcápsulas.

[00346] As formulações a serem usadas para administração in vivo geralmente são estéreis. A esterilidade pode ser facilmente obtida, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis.

F. Métodos e Composições Terapêuticos

[00347] Qualquer um dos anticorpos anti-alfa-sinucleína humana oferecidos nesta invenção pode ser usado em métodos terapêuticos.

[00348] Em um aspecto, é oferecido um anticorpo anti-alfa- sinucleína humana para uso como um medicamento. Em outros aspectos, é oferecido um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana para uso no tratamento de mal de Parkinson. Em certas modalidades, é oferecido um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana para uso em um método de tratamento. Em certas modalidades, a invenção oferece um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana para uso em um método para tratamento de um indivíduo tendo mal de Parkinson compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo anti-alfa- sinucleína humana. Em uma tal modalidade, o método compreende ainda administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, como descrito abaixo. Em outras modalidades, a invenção oferece um anticorpo anti-alfa- sinucleína humana para uso na inibição de citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, ou na inibição da transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, ou na redução da atividade de caspase induzida pela alfa-sinucleína. Em certas modalidades, a invenção oferece um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana para uso em um método para inibição da citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, ou inibição da transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, ou redução da atividade de caspase induzida pela alfa-sinucleína em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo anti-alfa-sinucleína humana para inibir a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, ou inibir a transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, ou reduzir a atividade de caspase induzida pela alfa-sinucleína. Um "indivíduo" de acordo com qualquer uma das modalidades acima é preferivelmente um ser humano.

[00349] Em outro aspecto, a invenção oferece o uso de um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana na produção ou na preparação de um medicamento. Em uma modalidade, o medicamento é para tratamento de mal de Parkinson. Em ainda outra modalidade, o medicamento é para uso em um método para tratamento de mal de Parkinson compreendendo administrar a um indivíduo com mal de Parkinson uma quantidade eficaz do medicamento. Em uma tal modalidade, o método compreende ainda administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, como descrito abaixo. Em ainda outra modalidade, o medicamento é para inibir a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, ou para inibir a transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, ou para reduzir a atividade de caspase induzida pela alfa-sinucleína. Em ainda outra modalidade, o medicamento é para uso em um método para inibição da citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, ou inibição da transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, ou redução da atividade de caspase induzida pela alfa-sinucleína em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do medicamento para inibir a citotoxicidade induzida pela alfa- sinucleína em neurônios humanos e células gliais, ou para inibir a transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, ou para reduzir a atividade de caspase induzida pela alfa-sinucleína. Um "indivíduo" de acordo com qualquer uma das modalidades acima pode ser um ser humano.

[00350] Em outro aspecto, a invenção oferece um método para tratamento de mal de Parkinson. Em uma modalidade, o método compreende administrar a um indivíduo com mal de Parkinson uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana. Em uma tal modalidade, o método compreende ainda administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, como descrito abaixo. Um "indivíduo" de acordo com qualquer uma das modalidades acima pode ser um ser humano.

[00351] Em outro aspecto, a invenção oferece um método para inibir a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, ou para inibir a transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, ou reduzir a caspase induzida pela alfa-sinucleína em um indivíduo. Em uma modalidade, o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana para inibir a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, ou para inibir a transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, ou para reduzir a atividade de caspase induzida pela alfa-sinucleína. Em uma modalidade, um "indivíduo" é um ser humano.

[00352] Em outro aspecto, a invenção oferece formulações farmacêuticas compreendendo qualquer um dos anticorpos anti-alfa- sinucleína humana oferecidos nesta invenção, por exemplo, para uso em qualquer um dos métodos terapêuticos acima. Em uma modalidade, uma formulação farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos anti-alfa-sinucleína humana oferecidos nesta invenção e um carreador farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, uma formulação farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos anti-alfa-sinucleína humana oferecidos nesta invenção e pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, como descrito abaixo.

[00353] Os anticorpos da invenção podem ser usados isoladamente ou em combinação com outros agentes em uma terapia. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser coadministrado com pelo menos um agente terapêutico adicional.

[00354] Tais terapias combinadas mencionadas acima abrangem administração cominada (onde dois ou mais agentes terapêuticos são incluídos na mesma formulação ou em formulações separadas), e administração separada, em cujo caso a administração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes, simultaneamente, e/ou depois da administração do agente ou agentes terapêuticos adicionais. Em uma modalidade, a administração do anticorpo anti-alfa-sinucleína humana e a administração de um agente terapêutico adicional ocorrem dentro de cerca de um mês, ou dentro de cerca de uma, duas ou três semanas, ou dentro de um, dois, três, quatro, cinco, ou seis dias, uma da outra.

[00355] Um anticorpo da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio adequado, que inclui administração parenteral, intrapulmonar, e intranasal, e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. Infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, ou subcutânea. A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exemplo, por injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte do fato de a administração ser breve ou crônica. Vários esquemas posológicos incluindo, porém sem limitação, uma única administração ou múltiplas administrações únicas em vários pontos do tempo, administração de bolo, e infusão pulsada são concentrados nesta invenção.

[00356] Os anticorpos da invenção serão formulados, dosados, e administrados de maneira consistente com a boa prática médica. Fatores a serem considerados neste contexto incluem o distúrbio particular sendo tratado, o mamífero particular sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o sítio de distribuição do agente, o método de administração, o esquema de administração, e outros fatores conhecidos pelos profissionais da área médica. O anticorpo não precisa ser mas opcionalmente é formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento, e de outros fatores discutidos acima. Estes geralmente são usados nas mesmas dosagens e pelas vias de administração descritas neste relatório, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas neste relatório, ou em qualquer dosagem e por qualquer via que seja empiricamente/clinicamente determinada como sendo apropriada.

[00357] Para a prevenção ou o tratamento de uma doença, a dosagem apropriada de um anticorpo da invenção (quando usado isoladamente ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais) vai depender do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo, da severidade e curso da doença, do fato de o anticorpo ser administrado com fins preventivos ou terapêuticos, da terapia anterior, do histórico clínico do paciente e da resposta ao anticorpo, e do critério do médico assistente. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente de uma só vez ou em uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,5 mg/kg - 10 mg/kg) de anticorpo pode ser um candidato à dosagem inicial a ser administrada ao paciente, seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para múltiplas administrações durante vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento geralmente será mantido até que ocorre uma supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplificativa do anticorpo varia na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Assim sendo, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) podem ser administradas ao paciente. Tais doses podem ser administradas de forma intermitente, por exemplo, semanalmente ou a cada três semanas (por exemplo, de modo que o paciente receba de cerca de duas a cerca de vinte, ou, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Uma dose inicial de carga mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas pode ser administrada. No entanto, outros esquemas posológicos podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.

[00358] Fica entendido que qualquer uma das formulações ou métodos terap6euticos acima podem ser feitos usando-se um imunoconjugado da invenção no lugar de ou adicionalmente a um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana.

III. Artigos de Manufatura

[00359] Em outro aspecto da invenção, é oferecido um artido de manufatura contendo materiais úteis para o tratamento, a prevenção e/ou o diagnóstico dos distúrbios descritos acima. O artigo de manufatura compreende um recipiente e um rótulo ou bula sobre o recipiente ou associado ao mesmo. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas para soluções IV, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente guarda uma composição que está sozinha ou combinada com outra composição eficaz para o tratamento, a prevenção e/ou o diagnóstico da condição e pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa para soluções intravenosas ou um frasco tendo uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um princípio ativo na composição é um anticorpo da invenção. O rótulo ou bula indica que a composição é usada para tratar a condição desejada. Além disso, o artigo de manufatura pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no mesmo, onde a composição compreende um anticorpo da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição contida no mesmo, onde a composição compreende outro agente citotóxico ou outro agente de alguma forma terapêutico. O artigo de manufatura nesta modalidade da invenção pode compreender ainda uma bula indicando que as composições podem ser usadas para tratar uma condição particular. Alternativamente, ou adicionalmente, o artigo de manufatura pode compreender ainda um segundo (ou terceiro) recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode incluir ainda outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, e seringas.

[00360] Fica entendido que qualquer um dos artigos de manufatura acima podem incluir um imunoconjugado da invenção no lugar de um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana ou adicionalmente ao mesmo.

IV. Modalidades Específicas

[00361] 1. Um anticorpo que se liga especificamente à alfa- sinucleína humana, onde o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células LUHMES.

[00362] 2. O anticorpo de acordo com o item 1, caracterizado pelo fato de que a atividade de caspase é atividade de caspase 3 e/ou caspase 7.

[00363] 3. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é para uso no tratamento de sinucleinopatias.

[00364] 4. O anticorpo de acordo com o item 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é para uso no tratamento de mal de Parkinson.

[00365] 5. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se especificamente a um peptídio que consiste na sequência aminoacídica GKNEEGAPQEG (SEQ ID N°: 01).

[00366] 6. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 5,caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem uma afinidade de ligação para alfa-sinucleína humana monomérica inferior a 10E-09 M e superior a 10E-07 M.

[00367] 7. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se especificamente à alfa-sinucleína humana monomérica e oligomérica e não se liga à alfa-sinucleína humana fibrilar.

[00368] 8. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 02 a 04 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 05 a 07.

[00369] 9. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 08, 09 e 04 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 10 a 12.

[00370] 10. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 8 a 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID N°: 13 e um domínio variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID N°: 14.

[00371] 11. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o anticorpo fora obtido por humanização de um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID N°: 13 e um domínio variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID N°: 14.

[00372] 12. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 02 a 04 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 05 a 07, onde em cada HVR até 3 resíduos aminoacídicos podem ser alterados.

[00373] 13. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 08, 09 e 04 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 10 a 12, onde em cada HVR até 3 resíduos aminoacídicos podem ser alterados.

[00374] 14. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 7 e 12 a 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado e o domínio variável de cadeia pesada é uma forma humanizada do (é derivado do) domínio variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID N°: 13 e o domínio variável de cadeia leve é uma forma humanizada do (é derivado do) domínio variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID N°: 14.

[00375] 15. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 15 a 17 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 18 a 20.

[00376] 16. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 21, 22 e 17 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 23 a 25.

[00377] 17. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 15 e 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID N°: 26 e um domínio variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID N°: 27.

[00378] 18. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo fora obtido por humanização de um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID N°: 26 e um domínio variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID N°: 27.

[00379] 19. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 15 a 17 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 18 a 20, onde em cada HVR até 3 resíduos aminoacídicos podem ser alterados.

[00380] 20. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 21, 22 e 17 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 23 a 25, onde em cada HVR até 3 resíduos aminoacídicos podem ser alterados.

[00381] 21. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 4 e 19 to 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado e o domínio variável de cadeia pesada é uma forma humanizada do (é derivado do) domínio variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID N°: 26 e o domínio variável de cadeia leve é uma forma humanizada do (é derivado do) domínio variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID N°: 27.

[00382] 22. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 28 a 30 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 31 a 33.

[00383] 23. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 28, 34 e 30 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 35 a 37.

[00384] 24. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 22 a 23, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID N°: 38 e um domínio variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID N°: 39.

[00385] 25. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo fora obtido por humanização de um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID N°: 38 e um domínio variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID N°: 39.

[00386] 26. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 28 a 30 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 31 a 33, onde em cada HVR até 3 resíduos aminoacídicos podem ser alterados.

[00387] 27. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 28, 34 e 30 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 35 a 37, onde em cada HVR até 3 resíduos aminoacídicos podem ser alterados.

[00388] 28. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 4 e 26 a 27, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado e o domínio variável de cadeia pesada é uma forma humanizada do (é derivado do) domínio variável de cadeia pesada consistindo na SEQ ID N°: 38 e o domínio variável de cadeia leve é uma forma humanizada do (é derivado do) domínio variável de cadeia leve consistindo na SEQ ID N°: 39.

[00389] 29. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 4 e 15 a 28, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se especificamente à alfa-sinucleína humana fibrilar e não se liga à alfa- sinucleína humana não fibrilar.

[00390] 30. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 29, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é conjugado a um módulo de transporte pela barreira hematoencefálica.

[00391] 31. O anticorpo de acordo com o item 30, caracterizado pelo fato de que o módulo de transporte pela barreira hematoencefálica é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente ao LRP1, LRP8, receptor de transferrina humana ou receptor do fator de crescimento semelhante à insulina humana.

[00392] 32. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 31, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

[00393] 33. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 32, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.

[00394] 34. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 33, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento de anticorpo que se liga à alfa-sinucleína humana e i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células LUHMES.

[00394] 35. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 34, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é a) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG1, ou b) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG4, ou c) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG1 com as mutações L234A, L235A e P329G, d) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG4 com as mutações S228P, L235E e P329G, e) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG1 com as mutações L234A, L235A e P329G nas duas cadeias pesadas e as mutações T366W e S354C em uma cadeia pesada e as mutações T366S, L368A, Y407V e Y349C na respectiva outra cadeia pesada, ou f) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG4 com as mutações S228P e P329G nas duas cadeias pesadas e as mutações T366W e S354C em uma cadeia pesada e as mutações T366S, L368A, Y407V e Y349C na respectiva outra cadeia pesada.

[00395] 36. Um ácido nucleico codificando o anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 35.

[00396] 37. Uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico do item 36.

[00397] 38. Um método para produzir um anticorpo compreendendo a etapa de cultivar a célula hospedeira do item 37 para que o anticorpo seja produzido.

[00398] 39. O método de acordo com o item 38, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a etapa de recuperar o anticorpo a partir da célula ou do meio de cultura.

[00399] 40. Uma formulação farmacêutica compreendendo o anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 35 e um carreador farmaceuticamente aceitável.

[00400] 41. A formulação farmacêutica de acordo com o item 40, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um agente terapêutico adicional.

[00401] 42. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 35 para uso como um medicamento.

[00402] 43. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 35 para uso no tratamento de sinucleinopatia.

[00403] 44. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 35 para uso no tratamento de mal de Parkinson.

[00404] 45. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 35 para uso na inibição de citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais.

[00405] 46. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 35 para uso na inibição da transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais.

[00406] 47. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 35 para uso na redução da atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais ou células gliais.

[00407] 48. Uso do anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 35 na produção de um medicamento.

[00408] 49. O uso do item 48, onde o medicamento é para tratamento de mal de Parkinson.

[00409] 50. O uso do item 48, onde o medicamento é para inibir a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais.

[00410] 51. O uso do item 48, onde o medicamento é para inibir a transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais.

[00411] 52. O uso do item 48, onde o medicamento é para reduzir a atividade de caspase induzida pela alfa-sinucleína em células neuronais ou células gliais.

[00412] 53. Um método para tratamento de um indivíduo tendo mal de Parkinson compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 35.

[00413] 54. Um método para inibição da citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 35 para inibir a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais.

[00414] 55. Um método para inibição da transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo de acordo com qualquer dos itens 1 a 35 para inibir a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais.

[00415] 56. O uso de um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana de acordo com qualquer um dos itens 1 a 35 na inibição da citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais.

[00416] 57. O uso de um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana de acordo com qualquer um dos itens 1 a 35 na inibição da transmissão de célula para célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais.

[00417] 58. O uso de um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana de acordo com qualquer um dos itens 1 a 35 na redução da atividade de caspase induzida pela alfa-sinucleína em células neuronais ou células gliais.

[00418] 59. Um anticorpo que se liga especificamente à alfa- sinucleína humana e compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de VH HVR selecionadas dentre i) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 02; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 03; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 04; ou ii) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 08; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 09; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 04, ou iii) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 15; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 16; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 17, ou iv) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 21; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 22; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 17, ou v) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 28; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 29; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 30, ou vi) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 28; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 34; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 30.

[00419] 60. Um anticorpo que se liga especificamente à alfa- sinucleína humana e compreende como sequências de VH HVR i) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 02; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 03; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 04; ou ii) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 08; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 09; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 04, ou iii) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 15; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 16; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 17, ou iv) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 21; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 22; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 17, ou v) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 28; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 29; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 30, ou vi) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 28; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 34; e (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 30.

[00420] 61. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 59 a 60, caracterizado compreendendo pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de VH HVR selecionadas dentre i) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 05; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 06; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 07; ou ii) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 10; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 11; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 12, ou iii) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 18; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 19; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 20, ou iv) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 23; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 24; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25, ou v) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 31; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 32; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 33, ou vi) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 35; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 36; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 37.

[00421] 62. O anticorpo de acordo com o item 60, caracterizado por compreender ainda como sequências de VL HVR i) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 05; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 06; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 07; ou ii) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 10; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 11; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 12, ou iii) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 18; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 19; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 20, ou iv) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 23; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 24; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25, ou v) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 31; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 32; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 33, ou vi) (a) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 35; (b) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 36; e (c) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 37.

[00422] 63. Um anticorpo que se liga especificamente à alfa- sinucleína humana e compreende como sequências de HVR i) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 02; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 03; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 04; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 05; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 06; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 07, ou ii) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 08; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 09; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 04; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 10; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 11; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 12, ou iii) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 15; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 16; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 17; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 18; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 19; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 20, ou iv) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 21; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 22; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 17; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 23; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 24; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 25, ou v) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 28; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 29; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 30; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 31; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 32; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 33, ou vi) (a) HVR-H1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 28; (b) HVR-H2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 34; (c) HVR-H3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 30; (d) HVR-L1 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 35; (e) HVR-L2 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 36; e (f) HVR-L3 compreendendo a sequência aminoacídica de SEQ ID N°: 37.

[00423] 64. Um anticorpo que se liga especificamente à alfa- sinucleína humana onde a alfa-sinucleína humana tem um resíduo metionina N-terminal livre.

[00424] 65. O anticorpo de acordo com o item 64, onde o anticorpo liga-se especificamente às alfa-sinucleínas humana e de camundongo onde as alfa-sinucleínas humana e de camundongo têm um resíduo metionina N-terminal livre.

[00425] 66. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 64 a 65, onde a alfa-sinucleína é alfa-sinucleína monomérica.

[00426] 67. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 64 a 65, onde a alfa-sinucleína é alfa-sinucleína oligomérica.

[00427] 68. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 64 a 67, onde a alfa-sinucleína é alfa-sinucleína monomérica e oligomérica.

[00428] 69. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 64 a 68, onde o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 15 a 17 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 18 a 20.

[00429] 70. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 64 a 69, onde o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 21, 22 e 17 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 23 a 25.

[00430] 71. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 64 a 70, onde o anticorpo liga-se ao mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 26 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 27.

[00431] 72. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 64 a 68, onde o anticorpo compreende na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 15 a 17 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 18 a 20.

[00432] 73. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 64 a 68, onde o anticorpo compreende na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 21, 22 e 17 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 23 a 25.

[00433] 74. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 64 a 68, onde o anticorpo fora obtido por humanização de um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 26 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 27.

[00434] 75. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 64 a 68, onde o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 15 a 17 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 18 a 20, onde em cada HVR 0 a 3 resíduos aminoacídicos foram alterados.

[00435] 76. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 64 a 68, onde o anticorpo é um anticorpo humanizado e compreende no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 21, 22 e 17 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 23 a 25, onde em cada HVR 0 a 3 resíduos aminoacídicos foram alterados.

[00436] 77. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 64 a 68, onde o anticorpo é um anticorpo humanizado e o domínio variável de cadeia pesada é derivado de um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 26 e um domínio variável de cadeia leve é derivado de um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 27.

[00437] 78. Um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo compreendendo na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 15 a 17 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 18 a 20.

[00438] 79. Um anticorpo compreendendo na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 15 a 17 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 18 a 20.

[00439] 80. Um anticorpo compreendendo na cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 21, 22 e 17 e na cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 23 a 25.

[00440] 81. Um anticorpo (variante) que fora obtido a partir de um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 26 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 27.

[00441] 82. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 64 a 68, onde o anticorpo é um anticorpo humanizado que fora obtido por humanização de um anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 26 e um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 27.

[00442] 83. Um anticorpo (humanizado) compreendendo no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 15 a 17 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 18 a 20, onde em cada HVR 0 a 3 resíduos aminoacídicos foram alterados.

[00443] 84. Um anticorpo (humanizado) compreendendo no domínio variável de cadeia pesada as HVRs de SEQ ID N°: 21, 22 e 17 e no domínio variável de cadeia leve as HVRs de SEQ ID N°: 23 a 25, onde em cada HVR 0 a 3 resíduos aminoacídicos foram alterados.

[00444] 85. Um anticorpo (humanizado) onde o domínio variável de cadeia pesada é derivado de um domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 26 e o domínio variável de cadeia leve é derivado de um domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 27.

[00445] 86. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 64 a 85, onde o anticorpo é conjugado a um módulo de transporte pela barreira hematoencefálica.

[00446] 87. O anticorpo de acordo com o item 86, onde o módulo de transporte pela barreira hematoencefálica é um anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga especificamente ao LRP1, LRP8, receptor de transferrina humana ou receptor do fator de crescimento semelhante à insulina humana.

[00447] 88. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 64 a 87, onde o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

[00448] 89. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 64 a 88, onde o anticorpo é um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.

[00449] 90. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 64 a 89, onde o anticorpo é a) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG1, ou b) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG4, ou c) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG1 com as mutações L234A, L235A e P329G, d) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG4 com as mutações S228P, L235E e P329G, e) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG1 com as mutações L234A, L235A e P329G nas duas cadeias pesadas e as mutações T366W e S354C em uma cadeia pesada e as mutações T366S, L368A, Y407V e Y349C na respectiva outra cadeia pesada, ou f) um anticorpo de comprimento integral da subclasse humana IgG4 com as mutações S228P, L235E e P329G nas duas cadeias pesadas e as mutações T366W e S354C em uma cadeia pesada e as mutações T366S, L368A, Y407V e Y349C na respectiva outra cadeia pesada.

[00450] 91. Um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19 e SEQ ID N°: 20, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana.

[00451] 92. Um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24 e SEQ ID N°: 25, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana.

[00452] 93. Um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável (de coelho) não humano de SEQ ID N°: 26, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável (de coelho) não humano de SEQ ID N°: 27, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana.

[00453] 94. Um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19 e SEQ ID N°: 20, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana.

[00454] 95. Um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24 e SEQ ID N°: 25, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana.

[00455] 96. Um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo cada uma delas compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 26, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 27, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana.

[00456] 97. Um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende uma primeira cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende seja as alterações aminoacídicas T366W e S354C ou as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C, b) o anticorpo compreende uma segunda cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 15, SEQ ID N°: 16 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C ou a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C, c) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 18, SEQ ID N°: 19 e SEQ ID N°: 20, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana.

[00457] 98. Um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende uma primeira cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende seja as alterações aminoacídicas T366W e S354C ou as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C, b) o anticorpo compreende uma segunda cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 21, SEQ ID N°: 22 e SEQ ID N°: 17, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C ou a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C, c) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável compreende as HVRs de SEQ ID N°: 23, SEQ ID N°: 24 e SEQ ID N°: 25, onde em cada HVR independentemente uma da outra 0, 1, 2 ou 3 resíduos aminoacídicos são alterados, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana.

[00458] 99. Um anticorpo anti-alfa-sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende uma primeira cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada, uma região constante de cadeia pesada, um ligador peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 26, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende seja as alterações aminoacídicas T366W e S354C ou as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C, b) o anticorpo compreende uma segunda cadeia pesada de anticorpo compreendendo na direção N-terminal para C-terminal um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 26, ii) a região constante é uma região constante da IgG1 humana, onde o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, iii) a região constante compreende as alterações aminoacídicas L234A, L235A e P329G, e iv) a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C ou a região constante compreende as alterações aminoacídicas T366S, L368A, Y407V e Y349C se a primeira cadeia pesada de anticorpo compreende as alterações aminoacídicas T366W e S354C, c) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo cada uma delas compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, onde i) o domínio variável é uma forma humanizada do domínio variável de coelho de SEQ ID N°: 27, ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve capa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana.

[00459] 100. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 94 a 99, onde o anticorpo fragment, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humana, compreende um domínio variável de cadeia pesada que é uma forma humanizada do domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID N°: 56 e um domínio variável de cadeia leve que é uma forma humanizada do domínio variável de cadeia leve de SEQ ID N°: 57.

[00460] 101. O anticorpo de acordo com qualquer dos itens 64 a 100, onde o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida pela alfa-sinucleína em neurônios humanos e células gliais, e/ou ii) inibe a transmissão de célula para célula de alfa- sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células gliais, e/ou iii) reduz a atividade de caspase induzida pela alfa- sinucleína em células neuronais humanas, e/ou iv) liga-se especificamente à alfa-sinucleína que tem um resíduo metionina N-terminal livre e não se liga especificamente à alfa-sinucleína que tem um resíduo metionina N-terminal modificado.

V. EXEMPLOS

[00461] A seguir encontram-se exemplos de métodos e composições da invenção. Deve ficar entendido que várias outras modalidades podem ser colocadas em práticas, dado a descrição geral apresentada acima.

Materiais e Métodos Técnicas do DNA recombinante

[00462] Métodos tradicionais foram usados para manipular DNA da maneira descrita por Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Os reagentes biológicos moleculares foram usados de acordo com as instruções do fabricante.

Síntese de genes e oligonucleotídeos

[00463] Segmentos gênicos desejados foram preparados por síntese química na Geneart GmbH (Regensburg, Alemanha). Os fragmentos gênicos sintetizados foram clonados em um plasmídeo de E. coli para propagação/amplificação. As sequência de DNA dos fragmentos gênicos subclonados foram verificadas por sequenciamento de DNA. Alternativamente, segmentos de DNA sintético curtos foram montados por anelamento de oligonucleotídeos sintetizados quimicamente ou via PCR. Os respectivos oligonucleotídeos foram preparados pela metabion GmbH (Pfaixagg- Martinsried, Alemanha).

Reagentes

[00464] Todos os químicos, anticorpos e kits comerciais foram usados de acordo com o protocolo do fabricante, onde não mencionado em contrário. Clones de células anticorpo 0017 = ASYN-233HC_110-IV = aSyn.S019.006A08 anticorpo 0018 = ASYN-064HC_110-II = aSyn.S003.006A11 anticorpo 0081 = ASYN-235HC_110-IV = aSyn.S019.005A08 anticorpo 0070 = anticorpo 0017 + módulo de transporte pela barreira hematoencefálica anticorpo 0076 = anticorpo 0018 + módulo de transporte pela barreira hematoencefálica Exemplo 1 Preparação do antígeno Materiais Proteínas: - alfa-sinucleína humana do tipo selvagem liofilizada (100 μg, 200 μg, ou 500 μg aliquots); - alfa-sinucleína TP humana mutante (8,2 mg/ml, dialisada em 50 mM de HEPES/100 mM de NaCl) Tampões e soluções (armazenados à temperatura ambiente e protegidos contra exposição direta à luz solar): - estoque de PB (5x): 250 mM de tampão fosfato, pH 7,0 (filtrado em filtro de 0,22 μm) - estoque de EtOH: etanol absoluto pro grau de análise (EMSURE) (Merck; Cat. N°. 1.00989.1000) - água grau de HPLC (LiChrosolv, Merck) - 50 mM de HEPES/100 mM de NaCl, pH 7.4 (filtrado em filtro de 0,22 μm) - TBS (50 mM de Tris/100 mM de NaCl) pH 7,0 (filtrado em filtro de 0,22 μm) - reagente de distribuição de proteína BioPORTER (Genlantis, Cat. N°. BP502424)

Preparação de Oligômeros A1

[00465] Para referência vide Danzer, K.M., et al., J. Neurosci. 27 (2007) 9220-9232, e Danzer, K.M., et al., J. Neurochem. 111 (2009) 192-203.

[00466] Alfa-sinucleína liofilizada foi solubilizada em água de HPLC para obter uma solução de cerca de 70 μM em alfa-sinucleína (100 μl por 100 μg de proteína). A solução foi sonicada por 30 segundos em um sonicador de banho-maria usando um dispositivo tubular flutuante. Em seguida 500 μl de água grau de HPLC, 200 μl de PB 250 mM pH 7,0, e 200 μl de EtOH absoluto pro análise foram acrescentados. A mistura foi turbilhonada à velocidade máxima por 10 segundos. Em seguida uma solução de alfa-sinucleína a 100 μg/ml em 50 mM de PB pH 7,0/20% de etanol foi gerada. Para a amostra de referência os mesmos tampões foram misturados na ausência de alfa-sinucleína. A solução foi agitada por 4 horas à temperatura ambiente em um misturador nutator. Depois da agitação, todas as soluções foram congeladas em gelo seco para liofilização imediata. A liofilização foi efetuada durante a noite à temperatura ambiente com centrifugação constate (por exemplo, em um Speedvac). O liofilizado foi ressuspendido em 0.5 ml de PB 50 mM pH 7.0 com 10 % de etanol. O etanol foi evaporaado a 20-21°C por 24 horas em um exaustor com tampa aberta (Eppendorf Thermomixer 5436, velocidade 5). Depois disso a tampa foi fechada e a agitação continuou à temperatura ambiente por 6 dias. Os oligômeros A1 foram concentrados até atingir 1 mg/ml com Vivaspin 500 (corte 30 kD) e reunidos para imunização. Para armazenamento de longo prazo os oligômeros foram mantidos a -80°C. O controle de qualidade quanto à formação apropriada de oligômeros foi feito por SDS-PAGE e EM.

Preparação de Oligômeros C1

[00467] Para referência vide Danzer, K.M., et al., J. Neurosci. 27 (2007) 9220-9232, e Danzer, K.M., et al., J. Neurochem. 111 (2009) 192-203.

[00468] Alfa-sinucleína liofilizada foi solubilizada em água grau de HPLC para obter uma solução com uma concentração de cerca de 70 μM (100 μl por 100 μg de proteína). A solução foi sonicada por 30 segundos em um sonicador de banho-maria usando um dispositivo tubular flutuante. Em seguida 500 μl de água grau de HPLC, 200 μl de PB 250 mM pH 7,0, e 200 μl de EtOH absoluto por análise foram acrescentados. A mistura foi turbilhonada à velocidade máxima por 10 segundos. Soluções de alfa-sinucleína a 100 μg/ml em 50 mM de PB pH 7,0/20 % de etanol foram geradas. Para amostras de controle os mesmos tampões foram misturados na ausência de alfa-sinucleína. As soluções foram agitadas por 16 horas à temperatura ambiente em um misturador nutator (por exemplo, por uma noite). Os oligômeros C1 foram concentrados até atingir 1 mg/ml com Vivaspin 500 (corte 30 kD) e reunidos para imunização. Para armazenamento de longo prazo os oligômeros foram mantidos a -80°C. O controle de qualidade quanto à formação apropriada de oligômeros foi feito por SDS-PAGE e EM.

Preparação de oligômeros mutantes TP de alfa-sinucleína

[00469] Adaptado de Karpinar, D.P., et al., EMBO J. 28 (2009) 3256-3268.

[00470] Alíquotas de 100 μl de alfa-sinucleína TP a 8,2 mg/ml (cerca de 590 mM) em 50 mM de HEPES/100 mM de NaCl pH 7.4 foram agitadas com uma microbarra de agitação magnética 2 x 5 mm a 37°C (200 rpm) por 6 dias. O controle de qualidade quanto à formação apropriada de oligômeros foi feito por SDS-PAGE e EM.

Formação de fibrilas de alfa-sinucleína e misturação com BioPORTER

[00471] Adaptado de Luk, K.C., et al., Biochem. 46 (2007) 12522 12526, e Luk, K.C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106 (2009) 20051-20056.

[00472] Uma alíquota de alfa-sinucleína liofilizada e armazenada a vácuo (a partir de -80°C) foi levada até a temperatura ambiente (RT) por 10-15 minutos sem que a bolsa a vácuo fosse aberta. Enquanto isso o misturador orbital tubular foi pré-aquecido até 37°C. Depois disso a bolsa contendo os tubos foi e se necessário gotas de água do lado de fora do tubo foram removidas. 100 μg de alfa-sinucleína liofilizada foram dissolvidos em 100 μl de TBS pH 7. Os tubos foram colocados em misturador orbital tubular e incubados a 37°C/1000 rpm por 96 horas. Depois disso o tubo foi centrifugado à velocidade máxima (20.000g) por 10 minutos à temperatura ambiente. 90 μl do sobrenadante foram removidos. A pelota foi suspendida em with 90 μl de TBS fresco (presumindo-se uma concentração de cerca de 1 mg/ml). O controle de qualidade quanto à formação apropriada de fibrilas foi feito por SDS-PAGE e EM. Para armazenamento de longo prazo a amostra foi mantida a -80°C.

[00473] Imediatamente antes da imunização 100 μl de fibrilas suspendidas a 1 mg/ml foram acrescentados a 20 μl do reagente ("reagent dry-film") BioPORTER e misturados vigorosamente por turbilhonamento e sonicação em banho-maria. A solução foi incubada por 10 minutos à temperatura ambiente antes de ser usada para imunização.

Exemplo 2 Imunização de coelhos

[00474] Três coelhos brancos da Nova Zelândia foram imunizados com uma mistura de oligômeros C1 de alfa-sinucleína, fibrilas de alfa- sinucleína e oligômeros mutantes TP de alfa-sinucleína (400 μg de cada componente para a primeira imunização; 200 μg de cada componente para as imunizações consecutivas; preparação vide Exemplo 1). Os animais receberam o imunógeno, emulsificado com adjuvante de Freund completo, por aplicação intradérmica no dia 0, e aplicações intramusculares e subcutâneas alternadas no dias 7, 14, 35, 63 e 91. Sangue (10% do volume total estimado de sangue) foi coletado nos dias 21, 41, 69 e 97. Foi preparado um soro, que foi usado para determinação do título por ELISA (vide abaixo). Células mononucleares periféricas foram isoladas, as quais foram usadas como uma fonte de células B antígeno-específicas no processo de clonagem de células B (Exemplos 3 e 4).

Determinação dos títulos séricos

[00475] Os títulos foram determinados separadamente para cada componente da mistura de imunógenos. Oligômeros C1 de alfa- sinucleína, fibrilas de alfa-sinucleína, ou oligômeros mutantes TP de alfa-sinucleína foram imobilizados sobre uma placa NUNC Maxisorb de 96 poços a 0,6 μg/ml, 100 μl/poço, em PBS (solução salina tamponada com fosfato), seguido por: bloqueio da placa com 2% de CroteinC em PBS, 200 μl/poço; aplicação de diluições seriadas de antissoro, em duplicatas, em 0,5% de CroteinC em PBS, 100 μl/poço; detecção com anticorpo IgG anti-coelho de burro conjungado à HRP (conjugado à peroxidase de raiz-forte (Jackson Immunoresearch) diluído 1:16.000 em 0,5% de CroteinC em PBS, 100 μl/poço. Para todas as etapas, as placas foram incubadas por uma hora a 37°C. Entre todas as etapas, as placas eram lavadas três vezes com 0,05% de Tween 20 em PBS. O sinal foi desenvolvido por adição do substrato solúvel BM Blue POD (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), 100 μl/poço, e interrompido pela adição de 1 M de HCl, 100 μl/poço. A absorvência foi lida da 450 nm, contra 690 nm como referência. O título foi definido como a diluição de antissoro resultando em sinal semimáximo.

Exemplo 3 Isolamento de células B produtoras de anticorpo anti-alfa- sinucleína humana Isolamento de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de coelho

[00476] Três coelhos (descritos no Exemplo 2) foram usados como uma fonte de sangue. EDTA contendo sangue total foi diluído 1 para 2 com PBS 1x (solução salina tamponada com fosfato; PAA, Pasching, Áustria) antes de centrifugação em gradiente de densidade utilizando "Lympholyte-Mammal") (Cedarfaixa Laboratories, Burlington, Ontário, Canadá) de acordo com as especificações do fabricante. As PBMCs foram lavadas duas vezes com PBS 1x.

Meio EL-4 B5

[00477] RPMI 1640 (Pan Biotech, Aidenbach, Alemanha) suplementado com 10% de FCS (Hyclone, Logan, UT, EUA), 2 mM de Glutamina, 1% de uma solução de penicilina/estreptomicina (PAA, Pasching, Áustria), 2 mM de piruvato de sódio, 10 mM de HEPES (PAN Biotech, Aidenbach, Alemanha) e 0.05 mM de β-mercaptoetanol (Gibco, Paisley, Scotland).

Depleção de macrófagos/monócitos

[00478] Placas de 6 poços estéreis (grau de cultura de células) foram usadas para depletar macrófagos e monócitos através de adesão inespecífica. Cada poço foi preenchido até sua capacidade máxima com 4 ml de meio e até 6x106 de PBMCs provenientes do coelho imunizado e foi deixado que ocorresse ligação por uma hora a 37°C na incubadora. As células no sobrenadante (linfócitos de sangue periférico (PBLs)) foram usadas para a etapa de peneiração de antígeno.

Revestimento das placas

[00479] Placas de 6 poços estéreis de cultura de células foram revestidas com uma mistura de dois oligômeros diferentes de alfa- sinucleína humana (1 μg/ml de oligômero C1 e 1 μg/ml de oligômero mutante TP) em tampão carbonato (0,1 M de bicarbonato de sódio, 34 mM de hidrogenocarbonato dissódico, pH 9.55) por uma noite a 4°C. As placas foram lavadas em PBS estéril três vezes antes de serem usadas.

Enriquecimento de células B em oligômeros de alfa-sinucleína humana

[00480] Placas de 6 poços de cultura de tecido revestidas com oligômeros de alfa-sinucleína humana foram semeadas com até 6x106 PBLs por 4 ml de meio e foi deixado que ocorresse ligação por uma hora a 37°C na incubadora. Depois da etapa de enriquecimento em oligômeros de alfa-sinucleína as células não aderentes foram removidas por lavagem cautelosa dos poços 1-2 vezes com PBS 1x. As células aderentes remanescentes foram destacas por tripsina por 10 minutos a 37°C na incubadora. A tripsinização foi interrompida com o meio EL-4 B5. As células foram mantidas em gelo até a coloração por imunofluorescência.

Coloração por imunofluorescência e citometria de fluxo

[00481] O conjugado anticorpo anti-IgG FITC (AbD Serotec, Düsseldorf, Alemanha) foi usado para separação das células individuais. Para coloração da superfície, as células provenientes das etapas de depleção e enriquecimento foram incubadas com o conjugado anticorpo anti-IgG FITC em PBS e incubadas por 45 minutos no escuro a 4°C. Depois da coloração, as PBMCs foram lavadas duas vezes com PBS gelado. Finalmente as PBMCs foram ressuspendidas em PBS gelado e imediatamente submetidas a análises por FACS. lodeto de propídio a uma concentração de 5 μg/ml (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) foi acrescentado antes das análises por FACS para discriminação de células mortas e células vivas.

[00482] Um Becton Dickinson FACSAria equipado com um computador e o software FACSDiva (BD Biosciences, EUA) foi usado para separação das células individuais.

Cultura de células B

[00483] A cultura das células B de coelho foi preparada por um método similar àquele descrito por Zubler et al. (J. Exp. Med. 160 (1984) 1170-1183). Em resumo, as células B de coelho classificadas individualmente foram incubadas em placas de 96 poços com 200 μl/poço de meio EL-4 B5 contendo células Pansorbin (1:100000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Alemanha), 5% de sobrenadante de timócitos de coelho (carga 20100908, produção interna) e células de timoma EL-4-B5 murinas irradiadas com radiação gama (2,5 x 104/poço) por 7 dias a 37°C em uma atmosfera de 5% CO2. Os sobrenadantes da cultura de células B foram removidos por peneiração. Paralelamente os mRNAs das células remanescentes foram imediatamente preservados em 100 μl de tampão RLT (Qiagen, Hilden, Alemanha) e os lisados foram congelados a - 80°C.

Exemplo 4 Determinação de ácidos nucleicos codificando domínios variáveis de anticorpos Amplificação por PCR de domínios V e sequenciamento

[00484] RNA total foi preparado usando o kit NucleoSpin 8/96 RNA (Macherey&Nagel; Cat-N°. 740709.4, 740698) de acordo com o protocolo do fabricante. Todas as etapas foram feitas em um sistema de manipulação de líquidos epMotion 5075 (Eppendorf). O RNA foi eluído com 60 μl água livre de RNAse. 6 μl de RNA foi usado para gerar cDNA por reação de transcriptase reversa usando a "Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix" (Invitrogen; Cat-N°. 18080-400) e um iniciador oligo dT de acordo com as instrução do fabricante. 4 μl de cDNA foram usados para amplificar as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves (VH e VL) da imunoglobulina com a "AccuPrime SuperMix" (Invitrogen; Cat-N°. 12344-040) em um volume final de 50 μl usando os iniciadores rbHCfinal.up (AAGCTTGCCACCATGGAGACTGGGC TGCGCTGGCTTC; SEQ ID N°: 42) e rbHCfinal.do (CCATTGGTG AGGGTGCCCGAG; SEQ ID N°: 43) para a cadeia pesada e rbLCfinal.up (AAGCTTGCCACCATGGACAYGAGGGCCCCCACTC; SEQ ID N°: 44) e rbLCfinal.do (CAGAGTRCTGCTGAGGTTGTAGGTAC; SEQ ID N°: 45) para a cadeia leve. As condições de PCR foram as seguintes: início quente a 94°C por 5 min.; 35 ciclos de 20 s. a 94°C, 20 s. a 70°C, 45 s. a 68°C, e uma extensão final a 68°C por 7 min.

[00485] Oito microlitros dos 50 μl da solução de PCR foram carregados em um 48 E-Gel 2% (Invitrogen; Cat-No. G8008-02). As reações de PCR positivas foram lavadas usando-se o kit NucleoSpin Extract II (Macherey&Nagel; Cat-No. 740609250) de acordo com o protocolo do fabricante e eluídas em 50 μl de tampão de eluição. 12 μl de produtos de PCR purificados foram diretamente sequenciados em ambas as direções usando-se o rbHCfinal.up e rbHCfinal.do para as cadeias pesadas e o rbLCfinal.up e rbLCfinal.do para as cadeias leves.

Exemplo 5 Humanização de anticorpos anti-alfa-sinucleína humana de coelho

[00486] Os anticorpos anti-alfa-sinucleína humana de coelho podem ser humanizados de acordo com técnicas tradicionais, tais como enxerto de CDR.

Exemplo 6 Generação de vetores de expressão recombinantes a) Geração de vetores para a expressão de cadeias pesadas de imunoglobulina usando a região constante de IgG1 de camundongo

[00487] O gene de fusão codificando IgG1 de camundongo compreendendo a região constante de IgG1 de camundongo (CH1, articulação, CH2, CH3) e um domínio VH do anticorpo anti-alfa- sinucleína derivado de coelho foi montado por fusão de um fragmento de DNA codificando para o respectivo domínio VH do anticorpo anti- alfa-sinucleína-específico a um elemento de sequência codificando a região constante de IgG1 de camundongo.

[00488] A região constante de IgG1 de camundongo tem a seguinte sequência aminoacídica: AKTTPPSVYP LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKIVPR DCGCKPCICT VPEVSSVFIF PPKPKDVLTI TLTPKVTCVV VDISKDDPEV QFSWFVDDVE VHTAQTQPRE EQFNSTFRSV SELPIMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPIE KTISKTKGRP KAPQVYTIPP PKEQMAKDKV SLTCMITDFF PEDITVEWQW NGQPAENYKN TQPIMDTDGS YFVYSKLNVQ KSNWEAGNTF TCSVLHEGLH NHHTEKSLSH SPGK (SEQ ID N°: 46).

[00489] O vetor de expressão também compreendia uma origem de replicação proveniente do vetor pUC18, que permite a replicação deste plasmídio em E. coli, e um gene de beta-lactamase que confere resistência à penicilina em E. coli.

[00490] A unidade de transcrição da cadeia pesada do anticorpo compreende os elementos funcionais a seguir na direção de 5' para 3': - o intensificador e promotor precoce imediato do citomegalovírus humano (P-CMV) incluindo o intron A, - uma região 5'-não transladada (5'UTR) da cadeia pesada de imunoglobulina humana, - uma sequência sinal da cadeia pesada de imunoglobulina murina, - um ácido nucleico codificando o domínio (VH) variável de cadeia pesada, - um ácido nucleico codificando a região constante de IgG1 de camundongo, e - a sequência de poliadenilação do fator de crescimento bovino (BGH pA).

b) Geração de vetores para a expressão de cadeias leves de imunoglobulina usando a região constante capa de Ig de camundongo

[00491] O gene de fusão codificando a cadeia leve capa de camundongo compreendendo a região constante capa de Ig de camundongo (CL-capa) e um domínio VL (capa) de anticorpo anti-alfa- sinucleína derivado de coelho foi montado por fusão de um fragmento de DNA codificando para o respectivo domínio VL (capa) de anticorpo anti-alfa-sinucleína a um elemento de sequência codificando para a região constante capa de Ig de camundongo.

[00492] A região constante capa de Ig de camundongo tem a seguinte sequência aminoacídica: RADAAPTVSI FPPSSEQLTS GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC (SEQ ID N°: 47).

[00493] O vetor de expressão também compreendia uma origem de replicação proveniente do vetor pUC18, que permite a replicação deste plasmídio em E. coli, e um gene de beta-lactamase que confere resistência à penicilina em E. coli.

[00494] A unidade de transcrição da cadeia leve capa do anticorpo compreende os elementos funcionais a seguir na direção de 5' para 3': - o intensificador e promotor precoce imediato do citomegalovírus humano (P-CMV) incluindo o intron A, - uma região 5'-não transladada (5'UTR) da cadeia pesada de imunoglobulina humana, - uma sequência sinal da cadeia pesada de imunoglobulina murina, - um ácido nucleico codificando o domínio (VL) variável de cadeia leve, - um ácido nucleico codificando a região constante capa de Ig de camundongo, e - a sequência de poliadenilação do fator de crescimento bovino (BGH pA).

c) Geração de vetores para a expressão de cadeias leves de imunoglobulina usando a região constante lambda de Ig de camundongo

[00495] O gene de fusão codificando a cadeia leve lambda de camundongo compreendendo a região constante lambda de Ig de camundongo (CL-lambda) e um domínio VL (lambda) de anticorpo anti-alfa-sinucleína derivado de coelho foi montado por fusão de um fragmento de DNA codificando para o respectivo domínio VL (lambda) de anticorpo anti-alfa-sinucleína a um elemento de sequência codificando para a região constante lambda de Ig de camundongo.

[00496] A região constante lambda de Ig de camundongo tem a seguinte sequência aminoacídica: GQPKSSPSVT LFPPSSEELE TNKATLVCTI TDFYPGVVTV DWKVDGTPVT QGMETTQPSK QSNNKYMASS YLTLTARAWE RHSSYSCQVT HEGHTVEKSL SRADCS (SEQ ID N°: 48).

[00497] O vetor de expressão também compreendia uma origem de replicação proveniente do vetor pUC18, que permite a replicação deste plasmídio em E. coli, e um gene de beta-lactamase que confere resistência à penicilina em E. coli.

[00498] A unidade de transcrição da cadeia leve lambda do anticorpo compreende os elementos funcionais a seguir na direção de 5' para 3': - o intensificador e promotor precoce imediato do citomegalovírus humano (P-CMV) incluindo o intron A, - uma região 5'-não transladada (5'UTR) da cadeia pesada de imunoglobulina humana, - uma sequência sinal da cadeia pesada de imunoglobulina murina, - um ácido nucleico codificando o domínio (VL) variável de cadeia leve, - um ácido nucleico codificando a região constante lambda de Ig de camundongo, e - a sequência de poliadenilação do fator de crescimento bovino (BGH pA).

d) Geração de vetores para a expressão de cadeias de imunoglobulina conjugadas a um módulo de transporte pela barreira hematoencefálica

[00499] No caso de vetores de expressão codificando para construções de cadeias pesadas de IgG, a parte IgG da molécula estava em uma organização genômica, isto é, introns estavam presentes no peptídio-sinal, entre os domínios VH e CH1, entre o domínio CH1 e a re-gião de articulação, entre a região de articulação e o domínio CH2, e entre os domínios CH2 e CH3. Ao mesmo (C- terminal/na extremidade 3') foi fundido um elemento de cDNA codificando para o módulo de transporte pela barreira hematoencefálica. Para produzir moléculas de anticorpo carregando apenas um módulo de transporte pela barreira hematoencefálica por molécula de anticorpo completo foi empregada a tecnologia de "knob- into-hole".

[00500] A cadeia pesada de "hole" compreende as seguintes mutações: T366W.

[00501] A cadeia pesada de "knob" compreende as seguintes mutações: T366S/L368A/Y407V.

[00502] Opcionalmente, uma ligação dissulfeto artificial pode ser introduzida entre o resíduo 354 da cadeia pesada de "hole" e o resíduo 349 da cadeia pesada de "knob". As mutações adicionalmente necessárias são S354C na cadeia pesada de "hole" e Y349C na cadeia pesada de "knob".

[00503] No caso de vetores de expressão codificando para construções de cadeias leves de Ig, a parte Ig-capa ou Ig-lambda da molécula estava em uma organização genômica, isto é, introns estavam presentes no peptídio-sinal e entre os domínios VL e CL.

[00504] Além da unidade/cassete de expressão incluindo o gene desejado a ser expresso o plasmídio de expressão mamífero básico/padrão contém

i) Geração de vetores para a expressão de cadeias pesadas de imunoglobulina contendo um módulo de transporte usando a região constante de IgG1 humana com mutação "hole"

[00505] O gene de fusão codificando IgG1 humana compreendendo a região constante da IgG1 humana (CH1, articulação, CH2, CH3) e um domínio VH do anticorpo anti-alfa-sinucleína derivado de coelho foi montado por fusão de um fragmento de DNA codificando para o respectivo domínio VH do anticorpo anti-alfa-sinucleína a um elemento de sequência codificando para the região constante de IgG1 humana contendo a mutação "hole". A construção estava em uma organização genômica, isto é, introns estavam presentes no peptídio-sinal, entre os domínios VH e CH1, entre o domínio CH1 e a região de articulação, entre a região de articulação e o domínio CH2, e entre os domínios CH2 e CH3.

[00506] A região constante da sequência aminoacídica: IgG1 humana tem a seguinte ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID N°: 49).

[00507] A região constante de "hole" da IgG1 humana tem a seguinte sequência aminoacídica: ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLWC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID N°: 50).

[00508] O vetor de expressão também compreendia uma origem de replicação proveniente do vetor pUC18, que permite a replicação deste plasmídio em E. coli, e um gene de beta-lactamase que confere resistência à penicilina em E. coli.

[00509] A unidade de transcrição da cadeia pesada de "hole" do anticorpo compreende os elementos funcionais a seguir na direção de 5' para 3': - o intensificador e promotor precoce imediato do citomegalovírus humano (P-CMV), - uma região 5'-não transladada (5'UTR) da cadeia pesada de imunoglobulina humana, - uma sequência sinal da cadeia pesada de imunoglobulina murina, - um ácido nucleico codificando o domínio (VH) variável de cadeia pesada, - uma região constante da IgG1 humana com um ácido nucleico codificando uma mutação "hole". - opcionalmente um ácido nucleico codificando o ligador GS fundido a um ácido nucleico codificando um módulo de transporte pela barreira hematoencefálica, e - a sequência de poliadenilação do fator de crescimento bovino (BGH pA).

ii) Geração de vetores para a expressão de cadeias pesadas de imunoglobulina contendo um módulo de transporte usando a região constante de IgG1 humana com mutação "knob"

[00510] O gene de fusão codificando IgG1 humana compreendendo a região constante de IgG1 humana (CH1, articulação, CH2, CH3) e um domínio VH de anticorpo anti-alfa-sinucleína derivado de coelho foi montado por fusão de um fragmento de DNA codificando para o respectivo domínio VH do anticorpo anti-alfa-sinucleína a um elemento de sequência codificando para the região constante de IgG1 humana contendo a mutação "knob". A construção estava em uma organização genômica, isto é, introns estavam presentes no peptídio-sinal, entre os domínios VH e CH1, entre o domínio CH1 e a região de articulação, entre a região de articulação e o domínio CH2, e entre os domínios CH2 e CH3.

[00511] A região constante de "knob" da IgG1 humana tem a seguinte sequência aminoacídica:

[00512] O vetor de expressão também compreendia uma origem de replicação proveniente do vetor pUC18, que permite a replicação deste plasmídio em E. coli, e um gene de beta-lactamase que confere resistência à penicilina em E. coli.

[00513] A unidade de transcrição da cadeia pesada de "knob" do anticorpo compreende os elementos funcionais a seguir na direção de 5' para 3': - o intensificador e promotor precoce imediato do citomegalovírus humano (P-CMV), - uma região 5'-não transladada (5'UTR) da cadeia pesada de imunoglobulina humana, - uma sequência sinal da cadeia pesada de imunoglobulina murina, - um ácido nucleico codificando o domínio (VH) variável de cadeia pesada, - uma região constante da IgG1 humana com um ácido nucleico codificando uma mutação "knob", - opcionalmente um ácido nucleico codificando o ligador GS fundido a um ácido nucleico codificando um módulo de transporte pela barreira hematoencefálica, e - a sequência de poliadenilação do fator de crescimento bovino (BGH pA).

iii) Geração de vetores para a expressão da cadeia leve capa de imunoglobulina usando a região constante capa de Ig humana

[00514] O gene de fusão codificando a cadeia leve capa de Ig humana compreendendo a região constante capa de Ig humana (CL- kappa) e um domínio VL (capa) do anticorpo anti-alfa-sinucleína derivado de coelho foi montado por fusão de um fragmento de DNA codificando para o respectivo domínio VL (capa) do anticorpo anti-alfa- sinucleína a um elemento de sequência codificando para a região constante capa de Ig humana. A construção estava em uma organização genômica, isto é, introns estavam presentes no peptídio- sinal e entre os domínios VL (capa) e CL-capa.

[00515] O vetor de expressão também compreendia uma origem de replicação proveniente do vetor pUC18, que permite a replicação deste plasmídio em E. coli, e um gene de beta-lactamase que confere resistência à penicilina em E. coli.

[00516] A unidade de transcrição da cadeia leve capa do anticorpo compreende os elementos funcionais a seguir na direção de 5' para 3': - o intensificador e promotor precoce imediato do citomegalovírus humano (P-CMV) - uma região 5'-não transladada (5'UTR) da cadeia pesada de imunoglobulina humana, - uma sequência sinal da cadeia pesada de imunoglobulina murina, - um ácido nucleico codificando um domínio (VL) variável da cadeia leve, - uma região constante capa de IgG humana, - opcionalmente um ácido nucleico codificando o ligador GS fundido a um ácido nucleico codificando um módulo de transporte pela barreira hematoencefálica, e - a sequência de poliadenilação do fator de crescimento bovino (BGH pA).

iv) Geração de vetores para a expressão da cadeia leve lambda de imunoglobulina usando a região constante lambda de Ig humana

[00517] O gene de fusão codificando a cadeia leve lambda de Ig humana compreendendo a região constante lambda de Ig humana (CL-lambda) e um domínio VL (lambda) do anticorpo anti-alfa- sinucleína derivado de coelho foi montado por fusão de um fragmento de DNA codificando para o respectivo domínio (lambda) VL do anticorpo anti-alfa-sinucleína a um elemento de sequência codificando para a região constante lambda de Ig humana. A construção estava em uma organização genômica, isto é, introns estavam presentes no peptídio-sinal e os domínios VL (lambda) e CL- lambda.

[00518] O vetor de expressão também compreendia uma origem de replicação proveniente do vetor pUC18, que permite a replicação deste plasmídio em E. coli, e um gene de beta-lactamase que confere resistência à penicilina em E. coli.

[00519] A unidade de transcrição da cadeia leve lambda do anticorpo compreende os elementos funcionais a seguir na direção de 5' para 3': - o intensificador e promotor precoce imediato do citomegalovírus humano (P-CMV) - uma região 5'-não transladada (5'UTR) da cadeia pesada de imunoglobulina humana, - uma sequência sinal da cadeia pesada de imunoglobulina murina, - um ácido nucleico codificando um domínio (VL) variável da cadeia leve, - uma região constante lambda de IgG humana, - opcionalmente um ácido nucleico codificando o ligador GS fundido a um ácido nucleico codificando um módulo de transporte pela barreira hematoencefálica, e - a sequência de poliadenilação do fator de crescimento bovino (BGH pA).

Exemplo 7 Produção recombinante de anticorpos anti-alfa-sinucleína humana

[00520] Os anticorpos foram produzidos em células HEK293 transfectadas transitoriamente (derivadas da linhagem de células hepáticas embrionárias humanas 293) cultivadas no meio F17 (Invitrogen Corp.). Para transfecção dos respectivos vetores descritos no Exemplo 6 foi usado o reagente de transfecção "293-Free" (Novagen). Os anticorpos e as fusões anticorpo-transporte pela barreira hematoencefálica foram expressos a partir de plasmídios de expressão individuais. As transfecções foram feitas da maneira especificada nas instruções do fabricante. Os sobrenadantes das culturas de células contendo anticorpo recombinante foram recolhidos três a sete dias depois da transfecção. Os sobrenadantes foram armazenados à temperatura reduzida (por exemplo, 80°C) até a purificação.

[00521] Informações gerais referentes à expressão recombinante de imunoglobulinas humanas em, por exemplo, células HEK293 estão dadas em: Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203.

Exemplo 8 Purificação de anticorpos recombinantes anti-alfa-sinucleína humana

[00522] Os sobrenadantes das culturas contendo anticorpo foram filtrados e purificados por duas etapas cromatográficas.

[00523] Os anticorpos foram capturados por cromatografia por afinidade usando HiTrap MabSelectSuRe (GE Healthcare) equilibrada com PBS (1 mM de KH2PO4, 10 mM de Na2HPO4, 137 mM de NaCl, 2.7 mM de KCl), pH 7.4. As proteínas não ligadas foram removidas por lavagem com tampão de equilíbrio, e o anticorpo foi recuperado com 25 mM de tampão citrato, pH 3.1, que imediatamente após eluição teve o pH ajustado em pH 6.0 com 1 M de Tris-base, pH 9.0.

[00524] Cromatografia por exclusão de tamanho em Superdex 200TM (GE Healthcare) foi usada como segunda etapa de purificação. A cromatografia por exclusão de tamanho foi efetuada em 20 mM de tampão histidina, 0.14 M de NaCl, pH 6.0. As soluções contendo anticorpo foram concentradas com uma unidade de filtro centrífuga Ultrafree-CL equipada com uma membrana Biomax-SK (Millipore, Billerica, MA, USA) e armazenadas a -80°C.Tabela: rendimentos médios por litro de sobrenadante de cultura

Exemplo 9 Caracterização de especificidade de ligação usando ressonância de plasmon de superfície

[00525] Instrumentos BIAcore 2000, 3000 ou T200 (GE Healthcare, BIAcore, Uppsala, Suécia) foram aplicados em todos os métodos descritos. Todas as etapas de imobilização e ensaios de ligação foram realizados a 25°C. As imobilizações e os ensaios de ligação foram realizados (se não especialmente mencionado) a 5 ou 30 μl min-1, respectivamente. a) Caracterização de alfa-sinucleína monomérica que se ligam a anticorpos monoclonais imobilizados Tampões: Tampão de imobilização: 10 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, 0,05% de polissorbato 20 (P20) a pH 7,5 Tampão de captura e ligação: 10 mM de Hepes, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,05% de P20

Ensaio de ligação de a-sinucleína-hexaHis monomérica purificada a anticorpos monoclonaos imobilizados no anticorpo de captura i) Imobilização de imunoglobulina IgG anti-camundongo de cabra (anticorpo de captura)

[00526] A imobilização de IgG anti-camundongo de cabra (kit de captura de anticorpo de camundongo; Cat-No. BR-1008-38; GE Healthcare, Uppsala, Suécia) foi feita em um tampão contendo 10 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, 0,05% de P20 a pH 7.5. Na primeira etapa os grupos carboxila da superfície de chips sensores CM5 foram transformados nos ésteres de succinimida reativos por contato da superfície do sensor por sete minutos com uma solução de N-etil-N- dimetil amino policarbodi-imida (EDC) 0,2 M e N-hidroxissuccinimida (NHS) 0,05 M. Depois da ativação, a superfície do sensor foi colocada em contato por 3 minutos com a IgG anti-camundongo de cabra a 30 μg/ml em tampão acetato de sódio 10 mM (pH 5,0). A IgG foi imobilizada até o nível de cerca de 3000 RUs (unidades de resposta). Por fim, o excesso de grupos carboxílicos ativados na superfície foi extinto com etanolamina (1 M, pH 8,5, 7 min.).

ii) Captura de anticorpos anti-alfa-sinucleína

[00527] Os anticorpos anti-alfa-sinucleína monoclonais (solução 100 nM em tampão de corrida) foram capturados no anticorpo IgG imobilizado até que fosse atingir uma quantidade de anticorpo capturado de 200-250 RUs. Um canal do chip sensor foi usado com anticorpo de cabra anti-camundongo imobilizado como canal de referência.

iii) Experiência ligação de alfa-sinucleína monomérica com um tag hexa-histidina N-terminal

[00528] A experiência de ligação foi realizada em um tampão contendo 10 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,05% de P20 a pH 7,5. A alfa-sinucleína-hexaHis monomérica purificada foi titulada até 334 nM (5 pontos, fator de diluição de 2) em toda a superfície dos anticorpos anti-alfa-sinucleína monoclonais capturados. Depois de cada titulação da alfa-sinucleína-hexaHis monomérica purificada, o complexo de alfa-sinucleína e anticorpo anti-alfa- sinucleína monoclonal foi removido do chip com pulsos curtos de uma solução de glicina-HCl 10 mM (pH 1.7). Depois disso novos anticorpos anti-alfa-sinucleína monoclonais foram capturados na superfície do chip. b) Caracterização de anticorpos anti-alfa-sinucleína monoclonais que se ligam à alfa-sinucleína monomérica imobilizada via His-tag em um chip de NTA (ácido nitrilotriacético) Tampões: Tampão de imobilização: 10 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, 0,05 % de P20, pH 7,5 Tampão de ligação: 10 mM de Hepes, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,05 % de P20

i) Imobilização de alfa-sinucleína monomérica purificada sobre a superfície do sensor de NTA

[00529] A imobilização de a-sinucleína-hexaHis monmérica (N- terminal) sobre a superfície do sensor de NTA (ácido nitrilotriacético) em um tampão de corrida contendo 10 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, 0,05 % de P20 a pH 7,5. A superfície do sensor de NTA foi primeiro lavada três vezes cada por 1 minuto com 0,35 M de EDTA a um fluxo de 5 μl/min. Em seguida, a superfície do sensor foi carregada com íons de Ni2+ por 1 minuto de contato da superfície do chip com NiCl2 500 μM em tampão de corrida e adicionalmente ativada por 7 minutos com EDC 0,2 M e solução 0,05 M de NHS. Além disso, alfa- sinucleína marcada com hexaHis em tampão de corrida (< 0,1 μg/ml) foi colocada em contato com a superfície do sensor para obter uma superfície de baixa densidade (até 5 RUs) permitindo ainda a detecção de ligação monovalente de anticorpos anti-alfa-sinucleína monoclonais à alfa-sinucleína. Por fim, os grupos remanescentes de éster ativo foram desativados por 5 minutos com 1 M de Tris, pH 7,5. Um canal de fluxo de alfa-sinucleína imobilizada foi usado como um canal de referência.

ii) Ensaio de ligação com anticorpos monoclonais com a-sinucleína imobilizada

[00530] O ensaio de ligação foi realizado em um tampão contendo 10 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,05% de P20 a pH 7,5. Os anticorpos anti-alfa-sinucleína monoclonais foram analisados a uma única concentração de 100 nM quanto à resposta de ligação Sim/Não ou foram titulados em tampão de corrida até uma concentração de 100 nM (injeções individuais de 5 concentrações com fator de diluição de 2) para estimar a cinética e afinidade a de ligação à alfa-sinucleína monomérica. Depois de monitoramento da curva de ligação para cada concentração de cada anticorpo anti-alfa-sinucleína, a superfície da alfa-sinucleína foi regenerada com dois pulsos curtos de ácido fosfórico 100 mM (2 x 1 min.) para remover o anticorpo ligado e permitir o monitoramento da ligação de outro anticorpo. c) Caracterização de anticorpos anti-alfa-sinucleína monoclonais que se liga à alfa-sinucleína monomérica imobilizada sobre lipossomas de DOPC:DOPS no sensor L1 Tampões: Tampão de imobilização e de ligação 50 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, pH 7,5

i) Preparação de lipossomas de DOPC:DOPS

[00531] 25 mg/ml de uma mistura (7:3 (p/p)) de lipídios DOPC:DOPS (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina:1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina) em clorofórmio foram evaporados em um balão de vidro com uma corrente de argônio sob um coifa a vácuo para obter uma película de lipídios sobre a parede do balão. A película de lipídios foi hidratada em tampão Hepes (50 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, pH 7,5) para obter uma solução de lipídios tampão 5 mM. A solução de lipídios foi extrusada com a Mini-Extrusora (Avanti Polar Lipids, Alabaster, EUA) passando-se a solução de lipídios 15 vezes através de filtros para extrusora de 100 nm para obter uma solução de lipossomas. A qualidade e o tamanho dos lipossomas foram comprovados por espalhamento de luz dinâmico.

ii) Imobilização de a-sinucleína monomérica purificada sobre lipossomas de DOPC:DOPS

[00532] A imobilização de alfa-sinucleína-hexaHis (tag N-terminal) sobre lipossomas de DOPC:DOPS foi realizada em um tampão contendo 50 mM de Hepes, 150 mM de NaCl a pH 7.5. Todos os canais de fluxo da superfície de um sensor L1 foram primeiro lavadas por 1 minuto com uma solução de Chaps 20 mM para obter uma linha basal estável. A solução de lipossomas de DOPC:DOPS obtida pela extrusão foi diluída 5 vezes no tampão de corrida e carregada sobre a superfície do sensor de todos os canais de fluxo para obter níveis de imobilização de cerca de 3000 RUs. Todos os canais de fluxo foram bloqueados na etapa seguinte com uma solução de BSA (albumina sérica bovina) a 0,1 mg/ml para reduzir a ligação inespecífica de alfa- sinucleína sobre a/à superfície do sensor. A alfa-sinucleína foi diluída no tampão de corrida até atingir uma concentração de 5,0 μg/ml e imobilizada sobre lipossomas para obter baixa densidade (< 30 RUs) sobre os canais de fluxo selecionados permitindo a detecção de anticorpos monovalentes que se ligam à alfa-sinucleína. Um canal de fluxo com lipossomas imobilizados porém sem alfa-sinucleína foi usado como um canal de referência.

iii) Ensaio de ligação com anticorpos monoclonais para alfa-sinucleína imobilizada sobre lipossomas de DOPC:DOPS

[00533] No ensaio de ligação cada anticorpo foi analisado a uma única concentração de 100 nM quanto à resposta de ligação Sim/Não ou foi titulado em tampão de corrida ao longo dos canais ativos e de referência até uma concentração de 100 nM (5 pontos com fator de diluição de 2) para estimar a cinética e afinidade a de ligação à alfa- sinucleína. Depois de monitoramento da ligação do anticorpo, a superfície do sensor foi regenerada por 1 minuto com Chaps 20 mM e equilibrada com tampão de corrida para subseqente imobilização dos lipossomas. d) Caracterização de anticorpos anti-alfa-sinucleína monoclonais que ligam a fibrilas pré-formadas (PFF) de alfa-sinucleína Tampões: Tampão de imobilização: 10 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, 0,05 % P20, pH 7,5 Tampão de ligação: 10 mM de Hepes, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,05 % P20

i) Imobilização de fibrilas pré-formadas de a-sinucleína sobre a superfície do sensor de NTA

[00534] Imobilização His-tag de PFF de alfa-sinucleína (contendo alfa-sinucleína N-terminalmente marcada com hexaHis-tag e alfa- sinucleína não marcada em uma proporção de 1:10) foi realizada sobre o sensor de NTA em tampão de corrida contendo 10 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, 0,05 % de P20 a pH 7,5. A superfície do sensor de NTA foi primeiro lavada por 1 minuto com uma solução 0,35 M de EDTA a uma taxa de fluxo de 5 μl/min. Em seguida a superfície do sensor foi carregada com íons de Ni2+ por 1 minuto de contato da superfíce com uma solução de NiCh 500 μM em tampão de corrida e adicionalmente ativada por 7 minutos com EDC 0,2 M e solução 0,05 M de NHS. A solução diluída de PFF de alfa-sinucleína em tampão de corrida foi colocada em contato com a superfície do sensor para obter várias densidades de fibrilas sobre a superfície do sensor (cerca de 20 RUs, de 200 RUs e de 2000 RUs). A desativação dos grupos livres remanescentes do éster ativo foi feita por 5 minutos com 1 M de Tris a pH 7,5. Um dos canais de fluxo, onde nenhuma fibrila de alfa-sinucleína foi imobilizada, foi usado como um canal de referência.

ii) Ensaio de ligação com anticorpos monoclonais para imobilizar PFF

[00535] A ligação de cada amostra biológica anti-alfa-sinucleína foi monitorada na experiência de titulação até uma concentração de 100 nM (5 pontos, fator de diluição de 2) em todos os quatro canais paralelamente. Depois do monitoramento da curva de ligação para cada anticorpo, a superfície das PFF de alfa-sinucleína foi regenerado com pulsos curtos (2 x 1 min.) de ácido fosfórico 100 mM para remover o anticorpo ligado.

RESULTADOS:

[00536] A ligação dos diferentes anticorpos alfa-sinucleína- antibodies apresentados nesta invenção também como fusões com um módulo de transporte pela barreira hematoencefálica e de certos anticorpos de referência determinados com SPR como descrito acima está mostrada na Tabela abaixo.Tabela: Ligação de anticorpos anti-alfa-sinucleína a diferentes formas de alfa-sinucleína. - o anticorpo 0070 é a fusão de transporte pela barreira hematoencefálica do anticorpo 0017 com o scFv do anticorpo antireceptor de transferrina 8D3; - o anticorpo 0076 é a fusão de transporte pela barreira hematoencefálica do anticorpo 0018 com o scFv do anticorpo antireceptor de transferrina 8D3.

Exemplo 10 Análise imuno-histoquímica e ensaios de citotoxicidade Análise imuno-histoquímica de cortes de cérebro com PD

[00537] Criosseções (10 μm) do cérebro de um paciente humano com mal de Parkinson foram coloridas com 5,0 μg/ml de IgG primária do anticorpo 0017, anticorpo 0018 ou anticorpo 0057 (murine Fc) e contracoloridas com 5,0 μg/ml de anticorpo anti-alfa-sinucleína de coelho (Cell Signaling; Cat. N°. 2628S).Como anticorpos secundários, foram usados o anticorpo IgG de cabra anti-camundongo conjugado a Alexa Fluor 488 (H+L) (Invitrogen, Cat. N°. A11001) e o anticorpo IgG de cabra anti-coelho conjugado a Alexa Fluor 594 (H+L) (alta adsorção cruzada, Invitrogen, Cat. N°. A11037).

[00538] Imagens dos espécimes foram feitas em um microscópio confocal LEICA (SP5x) usando lente 1.2NA 63x, Zoom 1,6x, Pinhole a 1.0AU.

[00539] Alexa 488 foi excitado a 497nm (10% WLL); Emissão a 505-571nm (98% HyD).

[00540] Alexa 594 foi excitado a 590nm (8% WLL); Emissão a 596- 680nm (92%HyD). A média das imagens foi calculada através do cálculo da média da linha 5x.

[00541] Resultados vide Figura 12.Modelo de células funcionais de células neuronais humanas (LUHMES) para proteção contra citotoxicidade mediada pela alfa- sinucleína por anticorpos terapêuticos

[00542] Células LUHMES foram diferenciadas por 5 dias em placas de 384 poços como descrito em detalhes abaixo. 24 horas depois da inoculação, sobrenadantes de culturas de células condicionais de células SHSY5Y crescendo em meio de diferenciação de LUHMES foram acrescentados às placas a uma diluição de 1:1 para induzir toxicidade mediada por alfa-sinucleína exossômica. Culturas de controle receberam meio de diferenciação de LUHMES. Os anticorpos a serem testados foram acrescentados com o meio SHSY5Y condicionado a uma concentração final de 10 μg/ml. A viabilidade celular foi determinada depois de mais 4 dias pelo ensaio CellTiterGlo (Promega, Cat. N°. REF G7571). Os valores da viabilidade estão apresentados como contagens de CPS. Métodos de cultura de células Revestimento, Meio e Aditivos: - Poli-L-Ornitina: Sigma-Aldrich, Cat. N°. P-3655-100mg - Fibronectina (solução): Sigma-Aldrich, Cat. N°. F-1141-5mg - Advanced DMEM/F-12: Gibco/Invitrogen, Cat. N°. 12634-010 - N-2: Gibco/Invitrogen, Cat. N°. 17502048 ou PAA F005-004 - L-Glutamina: Sigma-Aldrich, Cat. N°. G7513 - FGF: R&D Systems, Cat. N° 4114-TC (1 mg) - GDNF: R&D Systems, Cat. N° 212-GD (50 μg) - Tetraciclina: Sigma-Aldrich, Cat. N°. T-7660 - cAMP: Sigma-Aldrich, Cat. N° D0627 Cultura e Diferenciação de LUHMES: Revestimento (todas as placas e balões têm que ser Nunclon):

[00543] A solução d e revestimento foi introduzida nas placas e balões (balão T75: 7 ml; balão T175: 14 ml; placa de 96 poços: 50 μl por poço, placa de 24 poços: 250 μl por poço, placa de 12 poços: 500 μl por poço, placa de 6 poços: 1 ml por poço). As placas e os balões foram incubados por pelo menos 3 horas (ou por uma noite) a 37°C. Depois da incubação a solução de revestimento foi aspirada. Os balões foram lavados duas vezes com água Milli Q. Antes de serem usados as placas e os balões foram secados sob a bancada de fluxo laminar.

Subcultura:

[00544] Células que foram cultivadas em um balão de 75 cm2 em meio de proliferação foram divididas quando atingiram 80% de confluência. Primeiro as células foram lavadas duas vezes com 10 ml de PBS. Em seguida 4 ml de ATV-Tripsina foram acrescentados (2 ml da solução de estoque de ATV-Tripsina 2 x foram antes misturados com 2 ml de PBS). As células foram incubadas por 3 minutos a 37°C. Quando as células se soltaram 21 ml de meio Advanced DMEM/F12 sem aditivo foram acrescentados. A suspensão de células foi centrifugada em um tubo Falcon de 50 ml a 300 x g por 5 minutos. O sobrenadante foi removido e as células foram ressuspendidas em 5 ml de meio Advanced DMEM/F12 sem aditivos. As células foram contadas em uma câmara de Neubauer.

[00545] Para subcultura as células foram divididas depois de 2, 3 ou 4 dias. Se o objetivo é dois dias, 2*106 células (divisão 1:5) são semeadas em um balão de 75 cm2. Para uma cultura de 3 dias, 1*106 células (divisão 1:10) e para uma cultura de quatro dias 500.000 células (divisão 1:20) são suficientes. As células foram semeadas em um balão de 75 cm2 contendo 10 ml de meio de proliferação.

Pré-diferenciação:

[00546] A pré-diferenciação de células LUHMES deu-se em um balão de 175 cm2. Portanto 6*106 células foram semeadas em 20 ml de meio de proliferação. Depois de 24 horas de fixação e proliferação o meio foi trocado. O meio de proliferação foi substituído por meio de diferenciação. Depois de mais 48 goras a pré-diferenciação foi encerrada.

[00547] Células foram semeadas em placas multipoços. Logo, o meio foi aspirado. As células foram lavadas duas vezes com 10 ml de PBS. Em seguida 8 ml de ATV-Tripsina (4 ml de solução de estoque de ATV-tripsina 2 x foram antes misturados com 4 ml de PBS) foram acrescentados. As células foram incubadas por 3 a 5 minutos a 37°C. 42 ml de Advanced DMEM/F12 sem aditivos foram acrescentados. A suspensão de células foi centrifugada em um tubo Falcon de 50 ml a 300 x g por 5 minutos. O sobrenadante foi removido e as células foram ressuspendidas em 10 ml de meio de diferenciação. As células foram contadas em uma câmara de Neubauer.

Diferenciação:

[00548] Diferenciação adicional foi realizada em placas de cultura de células revestidas.

[00549] As células foram diluídas com meio de diferenciação e semeadas com o volume apropriado de meio de diferenciação em placas de cultura de células. Depois de mais 72 horas a diferenciação está completa. Para resultados vide Figuras 7 e 9.

Exemplo 11 Estabilidade térmica

[00550] Os pontos de desnaturação (pontos de fusão, Tm) dos anticorpos anti-alfa-sinucleína monoclonais (2 μM) foram determinados por um ensaio de desvio térmico usando Sypro Orange como fluoróforo repórter.

[00551] As transições de fusão foram ajustadas com uma equação sigmoidal de Boltzmann e o ponto de inflexão na amplitude de sinal semimáxima foi definido como a temperatura de fusão Tm, onde metade do anticorpo é desnaturado (Figura 10). Foram determinados valores de Tm entre 60°C e 75°C.Tabela: pontos de fusão (Tm) de anticorpos anti-alfa-sinucleína selecionados

Exemplo 12 Mapeamento de epítopos

[00552] O mapeamento de epítopos foi feito em microarranjos de peptídios PepStarTM customizados, fornecidos pela JPT Peptide Technologies. As sequências peptídicas tinham um comprimento de 15 resíduos aminoacídicos e foram desenhadas para cobrir a sequência inteira da alfa-sinucleína humana (número de acesso UniProt: P37840). Os peptídios vizinhos tinham uma sequência sobreposta de 11 aminoácidos. Peptídios adicionais compreendem sequênciam com sítios conhecidos de mutações de alfa-sinucleína relevantes em doenças (A30P, A53T, E57K) e sequências para avaliar a reatividade cruzada com alfa-sinucleína de roedores. Além disso, foram detectados 12 peptídios/proteínas que servem de controle para reatividade e especificidade de anticorpos primários e secundários. As proteínas foram as seguintes: albumina sérica bovina, IgG humana, IgG de coelho, IgG de camundongo, proteína tau humana, alfa- sinucleína humana, beta-sinucleína humana, gama-sinucleína humana, IgM humana, IgM de camundongo, fosfo-tirosina peptídio, alfa-sinucleína humana com mutação de triplo prolina (A30P, A56P, A76P).

[00553] O mapeamento de epítopos foi feito de acordo com as instruções do fabricante. Tabela: Dados de anticorpos anti-alfa-sinucleína selecionados de acordo com o mapeamento de peptídios.

Exemplo 13 Marcação in vivo aguda da patologia de alfa-sinucleína por conjugados de anticorpo anti-alfa-sinucleína-módulo de transporte pela barreira hematoencefálica Desenho do estudo

[00554] Três grupos camundongos transgênicos para Thy1- (A30P)alfa-sinucleína de 15 meses de idade (camundongos Kahle; n=3 por grupo) e controles do tipo selvagem (n=1 por grupo) receberam uma injeção de três conjugados de anticorpo anti-alfa- sinucleína-módulo de transporte pela barreira hematoencefálica diferentes: - anticorpo 0070 -> conjugado anticorpo 0017-scFab8D3 - anticorpo 0076 -> conjugado anticorpo 0018-scFab8D3 - referência -> conjugado 12F4-scFab8D3

[00555] Um camundongo transgênico e um camundongo do tipo selvagem foram incluídos como controles sem injeção. O estudo abrangeu um total de 14 camundongos.

Coloração/detecção de transporte cerebral de mAb ligado no tecido cerebral

[00556] A ocupação alvo no cérebro foi detectada com um anticorpo anti-huIgG AF555-tagged em cortes de cérebro de 20 μm feitos por um criostato (4 por camundongo; fixado com acetona, bloqueado com NGS). Uma cocoloração foi efetuada: vasos sanguíneos (anti- podocalixina, AF647); DAPI.

Resultado

[00557] Parênquima do tronco cerebral: varia de estruturas acumuladas neuríticas/alfa-sinucleína grandes à coloração pontilhada difusa similar a uma coloração sináptica.

[00558] Patologia neurítica (= o principal aspecto patológico neste modelo de camundongo) está restrita ao tronco cerebral e é altamente variável de camundongo para camundongo.

[00559] Cérebro inteiro e também em camundongos não transgênicos: principalmente coloração pontilhada; similar a uma coloração sináptica.

[00560] Vide Figura 11.

Exemplo 14 Síntese CelluSpots™ e Mapeamento de Epítopos

[00561] O arranjo de peptídios para análise de epítopos do anticorpo 0018 foi preparado usando-se a tecnologia Intavis CelluSpots™. Nesta abordagem, os peptídios foram sintetizados com um sintetizador automático (Intavis MultiPep RS) sobre discos de celulose modificada que são dissolvidos depois da síntese. As soluções dos peptídios individuais que permanecem covalentemente ligados à celulose macromolecular foram então colocados sobre lâminas de microscópio revestidas. A síntese CelluSpots™ foi realizada em etapas utilizando a quimica de 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc) sobre discos de celulose amino-modificada em uma placa de síntese de 384 poços. Em cada ciclo de acoplamento, os aminoácidos correspondentes foram ativados com uma solução de DIC/HOBt em DMF. Entre as etapas de acoplamento, os grupos amino não reagidos (isto é, livres) foram capeados com uma mistura de anidrido acético, di-isopropiletil amina e 1-hidroxibenzotriazol. Ao término da síntese, os discos de celulose foram transferidos para uma placa de 96 poços e tratados com uma mistura de ácido trifluoroacético (TFA), diclorometano, tri-isopropilsilano (TIS) e água para desproteção da cadeia lateral. Depois da remoção da solução de clivagem, os peptídios ligados à celulose foram dissolvidos com uma mistura de TFA, TFMSA (ácido trifluoroetanossulfônico), TIS e água, precipitados com di-isopropil éter e ressuspendidos em DMSO. Estas soluções de peptídios foram subsequentemente colocadas sobre lâminas Intavis CelluSpots™ usando um robô de preparo de lâminas ("slide spotting robot") Intavis.

[00562] Para análise de epítopos, as lâminas preparadas foram lavadas com etanol e em seguida com TBS (solução salina tamponada com TRIS; 50 mM de Tris, 137 mM de NaCl, 2.7 mM de KCl, pH 8) antes da realização de uma etapa de bloqueio por 16 horas a 4°C com 5 mL de "Western Blocking Reagent" 10x (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), 2,5 g de sacarose em TBS, 0,1% de Tween- 20. Depois de serem lavadas com TBS-T (TBS + 0,1% Tween-20), as lâminas foram incubadas com uma solução (1 μg/mL) de anticorpo 0018 em TBS compreendendo 0,1% de Tween-20 à temperatura ambiente por duas horas. Depois da lavagem, as lâminas foram incubadas para detecção com um anticorpo secundário anti- camundongo ou anti-coelho conjugado à peroxidase de raiz-forte (HRP) (1:20000 em TBS-T) seguido por incubação com o substrato DAB (3,3'-diaminobenzidina) / tampão peróxido (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha). SPOTs ELISA-positivos foram quantificados e através da atribuição das sequências peptídicas correspondentes os epítopos de ligação de anticorpo foram identifiados.

[00563] Embora a invenção acima tenha sido descrita com alguns detalhes por meio de ilustração e exemplos com fins de facilitar a compreensão, as descrições e os exemplos não devem interpretados como limitativos do escopo da invenção. As descrições de todas as patentes e a literatura científica citadas neste relatório estão expressamente aqui incorporadas em sua integridade a título de referência.

Claims (6)

1. Anticorpo anti-alfa sinucleína humana, caracterizado pelo fato de que compreende (i) a) ) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 15 ou 21; b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 16 ou 21; c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 17; d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 18 ou 23; e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 19 ou 24; e f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 20 ou 25; ou (ii) a) ) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 02 ou 08; b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 03 ou 09; c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 04; d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 05 ou 10; e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 06 ou 11; e f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 07 ou 12; ou (iii) a) ) HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 28; b) HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 29 ou 34; c) HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 30; d) HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 31 ou 35; e) HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 32 ou 36; e f) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 33 ou 37.

2. Anticorpo anti-alfa sinucleína humana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-alfa sinucleína é humanizado.

3. Anticorpo anti-alfa sinucleína humana, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo antialfa sinucleína compreende ainda uma estrutura aceptora humana.

4. Anticorpo anti-alfa sinucleína humana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo, cada uma compreendendo um domínio variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada, em que i) o domínio variável compreende i) os HVRs de SEQ ID NO:21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 17, ou ii) os HVRs de SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 09 e SEQ ID NO: 04, ou (iii) os HVRs de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO:30; ii) a região constante é a região constante IgG1 humana, em que o resíduo lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações de aminoácido L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo, cada uma compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, em que i) o domínio variável compreende (i) as HVRs da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 25, ou (ii) as HVRs da SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12, ou (iii) as HVRs de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 37; ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve kappa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida por alfa-sinucleína em neurônios humanos e células da glia, e/ou j) ) inibe a transmissão célula a célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células da glia, e/ou k) i) reduz a atividade de caspase induzida por alfa- sinucleína em células mesencefálicas humanas Lund, em que a numeração na região Fc está de acordo com o índice Kabat EU.

5. Anticorpo anti-alfa sinucleína humana, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a) o anticorpo compreende duas cadeias pesadas de anticorpo, cada uma compreendendo na direção do terminal N para C um domínio variável da cadeia pesada, uma região constante da cadeia pesada, um ligante peptídico e um fragmento de anticorpo scFab ou scFv, que se liga especificamente ao receptor de transferrina humano, em que i) ) o domínio variável compreende (i) as HVRs da SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 17, ou (ii) as HVRs da SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 09 e SEQ ID NO : 04, ou (iii) as HVRs de SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 30; ii) a região constante é uma região constante de IgG1 humana, em que o resíduo de lisina C-terminal pode estar presente ou ausente, e iii) a região constante compreende as alterações de aminoácidos L234A, L235A e P329G, b) o anticorpo compreende duas cadeias leves de anticorpo, cada uma compreendendo um domínio variável de cadeia leve e um domínio constante de cadeia leve, em que i) o domínio variável compreende (i) as HVRs da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 25, ou (ii) as HVRs da SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12, ou (iii) as HVRs de SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36 e SEQ ID NO: 37; ii) a região constante é uma região constante da cadeia leve kappa humana ou uma região constante da cadeia leve lambda humana, e c) o anticorpo i) inibe a citotoxicidade induzida por alfa-sinucleína em neurônios humanos e células da glia, e / ou ii) inibe a transmissão célula a célula de alfa-sinucleína humana oligomérica entre neurônios e células da glia, e / ou iii) reduz a atividade de caspase induzida por alfa- sinucleína em células LHUMES, em que a numeração na região Fc está de acordo com o índice Kabat EU.

6. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e um carreador farmaceuticamente aceitável.