KR20160104628A - 이중특이성 항-합텐/항-혈액뇌장벽 수용체 항체, 그의 복합체 및 혈액뇌장벽 셔틀로서 그의 용도 - Google Patents

이중특이성 항-합텐/항-혈액뇌장벽 수용체 항체, 그의 복합체 및 혈액뇌장벽 셔틀로서 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 및 혈액뇌장벽 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이성 항체를 보고한다.

Description

이중특이성 항-합텐/항-혈액뇌장벽 수용체 항체, 그의 복합체 및 혈액뇌장벽 셔틀로서 그의 용도{BISPECIFIC ANTI-HAPTEN/ANTI-BLOOD BRAIN BARRIER RECEPTOR ANTIBODIES, COMPLEXES THEREOF AND THEIR USE AS BLOOD BRAIN BARRIER SHUTTLES}
본 발명은 이중특이성 항-합텐/항-혈액뇌장벽 수용체 항체, 합텐화된(haptenylated) 페이로드와 그의 공유 및 비-공유 복합체, 및 혈액뇌장벽 셔틀로서 상기 항체 및 그의 복합체의 용도를 보고한다.
폴리펩타이드의 치료학적 용도에 대한 주요 장애는 그의 제한된 용해도, 생체내 안정성, 짧은 혈청 반감기 및 혈류로부터의 빠른 제거이다.
이를 다루는 상이한 접근법들이 보고되어 있다. 치료학적 폴리펩타이드의 PK/안정성 및 생물물리학적 양상을 개선시키기 위한 한 가지 접근법은 상기 폴리펩타이드를 그를 안정화시키는 존재에 융합시키고, 이를 용액 중에서 유지시키고, 그의 반감기를 연장시키는 것이다. 상기와 같은 존재의 예는 인간 혈청 알부민 또는 인간 면역글로불린 Fc-영역이다. 치료학적 폴리펩타이드의 PK/안정성 및 생물물리학적 양상을 개선시키기 위한 또 다른 접근법은 예를 들어 PEG화 또는 HES화에 의한 중합체에의 화학적 또는 효소적 접합이다.
미국특허 제 5,804,371 호는 합텐-표지된 펩타이드 및 면역학적 검출 방법에서 그의 용도를 보고한다. 디곡시제닌-표지된 펩타이드(브래디키닌), 및 염증 조직 중 브래디키닌의 화학발광효소 면역분석에의 그의 적용이 문헌[Decarie A., et al. , Peptides 15 (1994) 511-518]에 보고되어 있다.
WO 2004/065569에서 다기능성 항체가 보고된다.
WO 2011/003780에서 이중특이성 디곡시제닌 결합 항체가 보고된다.
WO 2012/093068에서 펩타이드에 접합된 디곡시제닌 및 항-DIG 항체의 복합체의 약학 조성물이 보고된다.
WO 2014/006124에서 항-합텐 항체 및 합텐화된 페이로드의 공유 복합체가 보고된다.
단클론 항체는 신경학적 또는 중추신경계(CNS) 질병의 치료에 방대한 치료학적 잠재성을 갖지만, 그의 뇌로의 통과는 혈액-뇌-장벽(BBB)에 의해 제한된다. 과거의 연구들은, 혈류 중에서 순환하는 IgG의 매우 적은 비율(대략 0.1%)이 상기 BBB를 통과하여 CNS로 들어가며(문헌[Felgenhauer, K., Klin. Wschr. 52 (1974) 1158-1164]), 이때 상기 항체의 CNS 농도는 확고한 효과를 허용하기에 불충분할 수 있음을 입증하였다.
혈액-뇌-장벽 수용체(BBBR)에 특이적으로 결합하여 1가로 되는 항체 또는 항체 단편의 결합 방식을 한정함으로써 BBB 트랜스사이토시스 성질을 갖는 BBB-셔틀 모듈을 획득할 수 있음이 보고되었다(WO 2014/033074).
매질 친화성을 갖는 BBBR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편을 사용함으로써 BBB 트랜스사이토시스 성질을 갖는 BBB-셔틀 모듈을 획득할 수 있음이 보고되었다(WO 2012/075037).
상이한 pH 값에서 측정된 특정 비의 EC50 값을 갖는 항체 또는 항체 단편을 사용함으로써 BBB 트랜스사이토시스 성질을 갖는 BBB-셔틀 모듈을 획득할 수 있음이 보고되었다(WO 2012/143379).
파드리지(Pardridge, W.M.)는 트로이 목마(Trojan horse) 분자를 뇌에 전달하기 위한 생물약제의 리-엔지니어링을 보고한다(문헌[Bioconjug. Chem. 19 (2008) 1327-1338]). 상기 BBB를 가로지르는 약물의 수용체-매개된 수송이 문헌[Feng Ji-Ming et al., Neurometh. 45 (2010) 15-34]에 보고되어 있다. 조우(Zhou, Q-H.) 등은 IgG-아비딘 융합 단백질과 함께 펩타이드 방사성약제를 뇌로 전달함을 보고한다(문헌[Bioconjug. Chem. 22 (2011) 1611-1618]). 마우스에서 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 Fab의 화물을 갖는 항-트랜스페린 수용체 항체의 트랜스사이토시스의 연구가 보고되어 있다(문헌[Manich, G., et al., Eur. J. Pharm. Sci. 49 (2013) 556-564]).
본 발명에서 합텐에 대한 제1 결합 특이성 및 혈액뇌장벽 수용체(BBBR)에 대한 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이성 항체인 혈액뇌장벽-셔틀 모듈(BBB-셔틀 모듈)을 보고한다. 상기와 같은 BBB-셔틀 모듈은 혈액뇌장벽상의 트랜스사이토시스 가능한 세포 표면 표적(예를 들어 TfR, LRP 또는 다른 표적들, BBBR)을 인식하고 동시에 합텐화된 페이로드에 결합한다.
결합가, 항체 포맷, BBBR 결합 친화성에 관한 추가의 요구들을 충족시킬 필요는 없는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체-기재 셔틀 모듈은 합텐화된 페이로드의 트랜스사이토시스를 매개하기 위해서 상기 혈액뇌장벽의 내피 세포로부터 방출될 것이 요구되지 않음이 또한 밝혀졌다. 대신에, 상기 BBBR에 결합시 상기 이중특이성 항체-기재 셔틀 모듈에 의해 복합체화되고/상기 모듈에 결합되는 합텐화된 페이로드가 상기 BBB 세포내에서, 즉 세포내 소포계에서 상기 이중특이성 항체-기재 셔틀 모듈로부터 방출되고, 상기 셔틀 모듈로부터 분리되고 후속으로 상기 BBB 세포로부터 뇌로 엑소사이토시스되어 상기 이중특이성 항체를 상기 BBB 세포에 남긴다. 이를 또한 공유 복합체가 사용될 때도 적용할 수 있다.
본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체-기재 셔틀 모듈은 결합 특이성 결합가뿐만 아니라 BBBR 결합 특이성의 친화성에 관하여 매우 가변적이다. 동시에 상기 모듈은 상기 셔틀 모듈로부터 페이로드 방출을 가능하게 한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 및 혈액뇌장벽 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 포함하는 이중특이성 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 및 혈액뇌장벽 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이성 항체 및 합텐화된 페이로드를 포함하는 비-공유 복합체이며, 여기에서 상기 합텐화된 페이로드는 상기 제1 결합 특이성에 의해 특이적으로 결합된다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 i) 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 및 혈액뇌장벽 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이성 항체, 및 ii) 합텐화된 페이로드(여기에서 상기 합텐화된 페이로드는 상기 제1 결합 특이성에 의해 특이적으로 결합된다)를 포함하고, 상기 합텐화된 페이로드와 상기 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 사이에 공유 결합을 갖는 공유 접합체이다.
하나의 실시태양에서 상기 합텐화된 페이로드는 비오틴화된 페이로드, 테오필린화된 페이로드, 디곡시제닌화된 페이로드, 카보란화된 페이로드, 플루오레세인화된 페이로드, 헬리카화된 페이로드 및 브로모데옥시유리딘화딘 페이로드를 포함하는 군 중에서 선택된다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은
i) 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 및 혈액뇌장벽 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이성 항체, 및
ii) 합텐화된 페이로드
를 포함하는 공유 접합체이며, 여기에서
상기 합텐화된 페이로드는 상기 제1 결합 특이성에 의해 특이적으로 결합되고,
상기 공유 접합체는 상기 합텐화된 페이로드와 상기 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 사이에 공유 결합을 가지고,
상기 합텐화된 페이로드는 비오틴화된 페이로드, 테오필린화된 페이로드, 디곡시제닌화된 페이로드, 카보란화된 페이로드, 플루오레세인화된 페이로드, 헬리카화된 페이로드 및 브로모데옥시유리딘화딘 페이로드로 이루어진 군 중에서 선택된다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 공유 접합체는 비-영구적인 공유 접합체이다. 하나의 실시태양에서 상기 공유 접합체는 세포내 절단 가능한 공유 접합체이다.
하나의 실시태양에서 상기 혈액뇌장벽 수용체는 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장인자 수용체(IGF 수용체), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(LRP8), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1(LRP1), 및 헤파린-결합 상피성장인자-유사 성장인자(HB-EGF)로 이루어진 군 중에서 선택된다.
하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 효과기 기능이 없다.
하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는
a) 합텐화된 페이로드에 대한 하나의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 하나의 결합 부위, 또는
b) 합텐화된 페이로드에 대한 2개의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 하나의 결합 부위, 또는
c) 합텐화된 페이로드에 대한 하나의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 2개의 결합 부위, 또는
d) 합텐화된 페이로드에 대한 2개의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 2개의 결합 부위
를 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 상기 항체의 CDR2 중의 아미노산 잔기에 시스테인 잔기를 포함하고, 이때 상기 CDR2는 카밧(Kabat)에 따라 결정된다.
하나의 실시태양에서 공유 결합은 상기 항체의 CDR2 중의 시스테인 잔기와 합텐화된 페이로드 중의 티올기 사이에 존재한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 태양은
i) 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 및 트랜스페린 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이성 항체, 및
ii) 합텐화된 페이로드
를 포함하는 공유 접합체이며, 여기에서
상기 합텐화된 페이로드는 상기 제1 결합 특이성에 의해 특이적으로 결합되고,
상기 공유 접합체는 상기 합텐화된 페이로드와 상기 제1 결합 특이성의 중쇄 CDR2 중의 52b 또는 53번 위치의 시스테인 잔기간에 다이설파이드 결합을 가지며(이때 상기 넘버링은 카밧에 따른다),
상기 합텐화된 페이로드는 비오틴화된 페이로드, 테오필린화된 페이로드, 디곡시제닌화된 페이로드, 카보란화된 페이로드, 플루오레세인화된 페이로드, 헬리카화된 페이로드 및 브로모데옥시유리딘화딘 페이로드로 이루어진 군 중에서 선택되고,
상기 이중특이성 항체는
a) 합텐화된 페이로드에 대한 하나의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 하나의 결합 부위, 또는
b) 합텐화된 페이로드에 대한 2개의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 하나의 결합 부위, 또는
c) 합텐화된 페이로드에 대한 하나의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 2개의 결합 부위, 또는
d) 합텐화된 페이로드에 대한 2개의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 2개의 결합 부위
를 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 합텐은 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드의 유도체 또는 유사체이다. 하나의 실시태양에서 상기 합텐은 아미노산의 유도체 또는 유사체이다.
하나의 실시태양에서 상기 혈액뇌장벽 수용체는 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장인자 수용체(IGF 수용체), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(LRP8), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1(LRP1), 및 헤파린-결합 상피성장인자-유사 성장인자(HB-EGF)로 이루어진 군 중에서 선택된다.
하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 2개의 결합 부위를 포함하는 전장 항체이다.
하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 하나 또는 2개의 scFv 또는 scFab가 융합되고 3 또는 4개의 결합 부위를 포함하는 전장 항체이다.
하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 항체 단편이다. 하나의 실시태양에서 상기 항체 단편은 F(ab')2 및 다이아바디 중에서 선택된다.
하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 인간화된 또는 인간 항체이다.
하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 효과기 기능이 없다. 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 기능성 Fc-영역을 갖지 않는다. 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 Fc-영역을 갖지 않는다. 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 인간 IgG1 하위부류의 Fc-영역을 가지고, 여기에서 상기 위치들은 카밧(카밧 EU 색인)의 Fc-영역 넘버링에 따라 결정된다. 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 갖는 인간 IgG4 하위부류의 Fc-영역을 가지고, 여기에서 상기 위치들은 카밧(카밧 EU 색인)의 Fc-영역 넘버링에 따라 결정된다.
하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는
a) 합텐화된 페이로드에 대한 하나의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 하나의 결합 부위, 또는
b) 합텐화된 페이로드에 대한 2개의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 하나의 결합 부위, 또는
c) 합텐화된 페이로드에 대한 하나의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 2개의 결합 부위, 또는
d) 합텐화된 페이로드에 대한 2개의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 2개의 결합 부위
를 포함한다.
선행 실시태양의 b) 및 c)의 경우에 상기 이중특이성 항체의 하나의 중쇄는 홀(hole) 돌연변이를 포함하고 각각의 다른 쇄는 놉(knob) 돌연변이를 포함한다.
하나의 바람직한 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 합텐화된 페이로드에 대한 2개의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 2개의 결합 부위를 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 합텐화된 페이로드는 합텐과 페이로드 사이에 링커를 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기 링커는 펩타이드 링커이다. 하나의 실시태양에서 상기 링커는 화학적 링커(비-펩타이드 링커)이다.
합텐화된 페이로드를 항-합텐 항체에 공유 커플링시킴으로써, 상기 페이로드의 안정화 및 PK-성질 개선을 성취할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 혈액뇌장벽을 가로질러 합텐화된 페이로드의 표적화된 전달을 위한
i) 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 및 혈액뇌장벽 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이성 항체, 및
ii) 합텐화된 페이로드
를 포함하는 공유 접합체의 용도이며, 여기에서
상기 합텐화된 페이로드는 상기 제1 결합 특이성에 의해 특이적으로 결합되고,
상기 공유 접합체는 상기 합텐화된 페이로드와 상기 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 사이에 공유 결합을 가지고,
상기 합텐화된 페이로드는 비오틴화된 페이로드, 테오필린화된 페이로드, 디곡시제닌화된 페이로드, 카보란화된 페이로드, 플루오레세인화된 페이로드, 헬리카화된 페이로드 및 브로모데옥시유리딘화딘 페이로드로 이루어진 군 중에서 선택된다.
하나의 태양에서 상기 용도는 상기 혈액뇌장벽을 가로지르는 유리(즉 단리된) 합텐화된 페이로드의 표적화된 전달을 위한 것이다.
하나의 실시태양에서 상기 혈액뇌장벽 수용체는 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장인자 수용체(IGF 수용체), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(LRP8), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1(LRP1), 및 헤파린-결합 상피성장인자-유사 성장인자(HB-EGF)로 이루어진 군 중에서 선택된다.
하나의 실시태양에서 상기 혈액뇌장벽 수용체는 트랜스페린 수용체 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8이다.
하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 효과기 기능이 없다.
하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는
a) 합텐화된 페이로드에 대한 하나의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 하나의 결합 부위, 또는
b) 합텐화된 페이로드에 대한 2개의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 하나의 결합 부위, 또는
c) 합텐화된 페이로드에 대한 하나의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 2개의 결합 부위, 또는
d) 합텐화된 페이로드에 대한 2개의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 2개의 결합 부위
를 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 상기 항체의 CDR2 중의 아미노산 잔기에 시스테인 잔기를 포함하고, 이때 상기 CDR2는 카밧에 따라 결정된다.
하나의 실시태양에서 공유 결합은 상기 항체의 CDR2 중의 시스테인 잔기와 합텐화된 페이로드 중의 티올기 사이에 존재한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체 및 합텐화된 페이로드는 각각 작용기를 포함하고, 이때 상기 이중특이성 항체에 의한 합텐화된 페이로드의 결합시 상기 합텐화된 페이로드와 상기 이중특이성 항체 사이에 공유결합이 형성된다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 상기 항체의 CDR2 중의 아미노산 잔기에 작용기를 포함하고, 이때 상기 CDR2는 카밧에 따라 결정된다. 하나의 실시태양에서 상기 항체의 CDR2 중의 아미노산 잔기의 작용기는 티올기이다. 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 상기 항체의 CDR2 중에 시스테인 아미노산 잔기를 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 합텐화된 페이로드는 상기 합텐 중에 또는 존재하는 경우 상기 합텐과 페이로드 사이의 링커 중에 작용기를 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기 작용기는 티올 또는 말레이미드 또는 할로아세틸이다. 하나의 실시태양에서 상기 합텐 또는 존재하는 경우 링커 중의 작용기는 티올기이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체의 CDR2 중의 시스테인 잔기와 상기 합텐화된 페이로드 중의 티올기 사이에 공유 결합이 존재한다. 하나의 실시태양에서 상기 공유 결합은 다이설파이드 결합이다. 하나의 실시태양에서 상기 공유 결합은 다이설파이드 결합이며 상기 결합은 산화환원 활성제의 첨가 없이 형성된다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 CDR2는 비오틴화된 페이로드, 테오필린화된 페이로드, 디곡시제닌화된 페이로드 및 플루오레세인화된 페이로드로 이루어진 군 중에서 선택된 합텐화된 페이로드의 경우에 중쇄 CDR2이다. 하나의 실시태양에서 상기 항체의 중쇄 CDR2 중의 시스테인 잔기는 카밧의 중쇄 가변 도메인 넘버링에 따른 52번 위치, 또는 52a번 위치, 또는 52b번 위치, 또는 52c번 위치, 또는 52d번 위치, 또는 53번 위치에 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 항체의 중쇄 CDR2 중의 시스테인 잔기는 카밧의 중쇄 가변 도메인 넘버링에 따른 52a번 위치, 또는 52b번 위치, 또는 52c번 위치, 또는 53번 위치에 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 항체의 중쇄 CDR2 중의 시스테인 잔기는 카밧의 중쇄 가변 도메인 넘버링에 따른 52b번 위치 또는 53번 위치에 있다.
상기 합텐화된 페이로드와 상기 항체의 중쇄 CDR2 중의 아미노산 잔기 간의 공유 결합의 형성을 위한 작용기를 포함하는 범용 링커로 유도체화시 상기 합텐화된 페이로드에 임의의 페이로드를 사용할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 범용 링커 중의 작용기의 위치는 상기 페이로드가 변화하는 경우 상기 항체의 중쇄 CDR2 중의 작용기의 위치 및 합성의 리-엔지니어링(re-engineering)이 필요하지 않다는 이점을 갖는다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 CDR2는 헬리카화된(helicarylated) 페이로드의 경우에 경쇄 CDR2이다. 하나의 실시태양에서 상기 항체의 경쇄 CDR2 중의 시스테인 잔기는 카밧의 경쇄 가변 도메인 넘버링에 따른 51번 위치 또는 55번 위치에 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 항체의 경쇄 CDR2 중의 시스테인 잔기는 카밧의 경쇄 가변 도메인 넘버링에 따른 55번 위치에 있다.
상기 헬리카화된 페이로드와 상기 항체의 경쇄 CDR2 중의 시스테인 잔기 간의 공유 다이설파이드 결합의 형성을 위한 작용기를 포함하는 시스테인으로 상기 헬리카 아미노산 서열의 유도체화시 상기 헬리카화된 페이로드에 임의의 페이로드를 사용할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 헬리카 동기 아미노산 서열 중의 시스테인(티올 작용기)의 위치는 상기 페이로드가 변화하는 경우 상기 항체의 경쇄 CDR2 중의 시스테인 잔기의 위치 및 합성의 리-엔지니어링이 필요하지 않다는 이점을 갖는다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 CDR2당 정확히 하나의 공유 결합이 형성된다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 페이로드는 결합 부분, 표지화 부분, 및 생물 활성 부분 중에서 선택된다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 생물 활성 부분은 항체, 폴리펩타이드, 하나 이상의 CNS 표적(들)의 천연 리간드, 하나 이상의 CNS 표적(들)의 천연 리간드의 변형된 버전, 앱타머, 억제성 핵산(즉 작은 억제성 RNA(siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)), 잠금 핵산(LNA), 리보자임, 및 소분자, 및 상기 중 임의의 것의 활성 단편을 포함하는 군 중에서 선택된다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 페이로드는 핵산 또는 핵산 유도체이다. 하나의 실시태양에서 상기 핵산은 iRNA 또는 LNA이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 페이로드는 폴리펩타이드이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 페이로드는 전장 항체 또는 항체 단편이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 합텐화된 페이로드는 합텐화된 전장 항-알파 시누클레인 항체이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 합텐화된 페이로드는 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하는 합텐화된 항-알파 시누클레인 항체 단편이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 합텐은 비오틴이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 중쇄 가변 도메인 중에 서열번호 243 내지 245의 HVR 및 경쇄 가변 도메인 중에 서열번호 246 내지 248의 HVR을 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 중쇄 가변 도메인 중에 서열번호 249, 250 및 245의 HVR 및 경쇄 가변 도메인 중에 서열번호 251 내지 253의 HVR을 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 서열번호 254로 이루어진 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 255로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 서열번호 254로 이루어진 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 255로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 인간화시킴으로써 획득되었다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인 중에 서열번호 243 내지 245의 HVR 및 경쇄 가변 도메인 중에 서열번호 246 내지 248의 HVR을 포함하고, 여기에서 각 HVR 중 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인 중에 서열번호 249, 250 및 245의 HVR 및 경쇄 가변 도메인 중에 서열번호 251 내지 253의 HVR을 포함하고, 여기에서 각 HVR 중 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인은 서열번호 254로 이루어진 중쇄 가변 도메인으로부터 유래되고 경쇄 가변 도메인은 서열번호 255로 이루어진 경쇄 가변 도메인으로부터 유래된다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 중쇄 중에 서열번호 256 내지 258의 HVR 및 경쇄 중에 서열번호 259 내지 261의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 중쇄 중에 서열번호 262, 263 및 258의 HVR 및 경쇄 중에 서열번호 264 내지 266의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 서열번호 267로 이루어진 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 268로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 서열번호 267로 이루어진 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 268로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 인간화시킴으로써 획득되었다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인 중에 서열번호 256 내지 258의 HVR 및 경쇄 가변 도메인 중에 서열번호 259 내지 261의 HVR을 포함하고, 여기에서 각 HVR 중 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인 중에 서열번호 262, 263 및 258의 HVR 및 경쇄 가변 도메인 중에 서열번호 264 내지 266의 HVR을 포함하고, 여기에서 각 HVR 중 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인은 서열번호 267로 이루어진 중쇄 가변 도메인으로부터 유래되고 경쇄 가변 도메인은 서열번호 268로 이루어진 경쇄 가변 도메인으로부터 유래된다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 중쇄 중에 서열번호 269 내지 271의 HVR 및 경쇄 중에 서열번호 272 내지 274의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 중쇄 중에 서열번호 269, 275 및 271의 HVR 및 경쇄 중에 서열번호 276 내지 278의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 서열번호 279로 이루어진 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 280으로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 서열번호 279로 이루어진 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 280으로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 인간화시킴으로써 획득되었다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인 중에 서열번호 269 내지 271의 HVR 및 경쇄 가변 도메인 중에 서열번호 272 내지 274의 HVR을 포함하고, 여기에서 각 HVR 중 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인 중에 서열번호 269, 275 및 271의 HVR 및 경쇄 가변 도메인 중에 서열번호 276 내지 278의 HVR을 포함하고, 여기에서 각 HVR 중 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인은 서열번호 279로 이루어진 중쇄 가변 도메인으로부터 유래되고 경쇄 가변 도메인은 서열번호 280으로 이루어진 경쇄 가변 도메인으로부터 유래된다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 합텐화된 페이로드는 합텐화된 전장 항-인간 Tau(pS422) 항체이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 합텐화된 페이로드는 422번 위치의 세린에서 인산화된 인간 Tau에 특이적으로 결합하는 합텐화된 항-인간 Tau(pS422) 항체 단편이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 합텐은 비오틴이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항-인간 Tau(pS422) 항체는
a) 중쇄 가변 도메인에 서열번호 230, 239 및 232의 HVR, 또는
b) 중쇄 가변 도메인에 서열번호 230, 231 및 232의 HVR
을 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는
a) 경쇄 가변 도메인에 서열번호 234, 235 및 236의 HVR, 또는
b) 경쇄 가변 도메인에 서열번호 233, 229 및 236의 HVR
을 추가로 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는
a) 중쇄 가변 도메인에 서열번호 230, 239 및 232의 HVR, 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 234, 235 및 236의 HVR, 또는
b) 중쇄 가변 도메인에 서열번호 230, 231 및 232의 HVR, 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 233, 229 및 236의 HVR, 또는
c) 중쇄 가변 도메인에 서열번호 230, 231 및 232의 HVR, 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 234, 235 및 236의 HVR
을 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는
a) 서열번호 241의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 238의 경쇄 가변 도메인, 또는
b) 서열번호 240의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 237의 경쇄 가변 도메인, 또는
c) 서열번호 240의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 238의 경쇄 가변 도메인, 또는
d) 서열번호 242의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 238의 경쇄 가변 도메인
을 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 합텐화된 페이로드는 합텐화된 전장 항-A베타 항체이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 합텐화된 페이로드는 인간 A베타에 특이적으로 결합하는 합텐화된 항-A베타 항체 단편이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 합텐은 비오틴이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 항-A베타 항체는 중쇄 가변 도메인에 서열번호 281, 282 및 283의 HVR을 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 경쇄 가변 도메인에 서열번호 284, 285 및 286의 HVR을 추가로 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는 중쇄 가변 도메인에 서열번호 281, 282 및 283의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 284, 285 및 286의 HVR을 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 항체는
a) 서열번호 287의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 290의 경쇄 가변 도메인, 또는
b) 서열번호 288의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 291의 경쇄 가변 도메인, 또는
c) 서열번호 289의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 292의 경쇄 가변 도메인
을 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 페이로드는 소분자(비-폴리펩타이드 생물 활성 부분)이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 생물 활성 부분은 폴리펩타이드이다. 하나의 실시태양에서 상기 폴리펩타이드는 5 내지 500 아미노산 잔기로 이루어진다. 하나의 실시태양에서 상기 폴리펩타이드는 10 내지 450 아미노산 잔기를 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기 폴리펩타이드는 15 내지 400 아미노산 잔기를 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기 폴리펩타이드는 18 내지 350 아미노산 잔기를 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 디곡시제닌화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성(항-디곡시제닌 결합 특이성; 항-DIG 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성; 항-(h)TfR 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성; 항-LRP8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 디곡시제닌화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성(2개의 항-디곡시제닌 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(2개의 항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성을 갖는다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 디곡시제닌화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 디곡시제닌화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 인간화된 결합 특이성이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 디곡시제닌화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 상기 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 CDR 및 수용체 인간 프레임워크(예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크)를 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 디곡시제닌화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 9 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 10 또는 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 11 또는 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 13 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 14 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 15 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 디곡시제닌화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 4 또는 12 또는 20 또는 28의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-디곡시제닌 항체는 디곡시제닌에 결합하는 능력을 보유한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 1 또는 9 또는 17 또는 25에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다. 임의로, 상기 항-디곡시제닌 항체는 서열번호 1 또는 9 또는 17 또는 25 중의 VH 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 디곡시제닌화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 8 또는 16 또는 24 또는 32의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 추가로 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-디곡시제닌 항체는 디곡시제닌에 결합하는 능력을 보유한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 8 또는 16 또는 24 또는 32에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다. 임의로, 상기 항-디곡시제닌 항체는 서열번호 8 또는 16 또는 24 또는 32 중의 VL 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 비오틴화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성(항-비오틴 결합 특이성; 항-BI 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성; 항-(h)TfR 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성; 항-LRP8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 비오틴화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성(2개의 항-비오틴 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(2개의 항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성을 갖는다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 비오틴화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 비오틴화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 인간화된 결합 특이성이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 비오틴화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 상기 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 CDR 및 수용체 인간 프레임워크(예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크)를 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 비오틴화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 41 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 42 또는 58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 43 또는 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 45 또는 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 46 또는 62의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 47 또는 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 비오틴화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 36 또는 44 또는 52 또는 60의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-비오틴 항체는 비오틴에 결합하는 능력을 보유한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 36 또는 44 또는 52 또는 60에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다. 임의로, 상기 항-비오틴 항체는 서열번호 36 또는 44 또는 52 또는 60 중의 VH 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 비오틴화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 40 또는 48 또는 56 또는 64의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 추가로 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-비오틴 항체는 비오틴에 결합하는 능력을 보유한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 40 또는 48 또는 56 또는 64에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다. 임의로, 상기 항-비오틴 항체는 서열번호 40 또는 48 또는 56 또는 64 중의 VL 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 테오필린화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성(항-테오필린 결합 특이성; 항-THEO 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성; 항-(h)TfR 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성; 항-LRP8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 테오필린화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성(2개의 항-테오필린 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(2개의 항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성을 갖는다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 테오필린화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 테오필린화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성인 인간화된 결합 특이성이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 테오필린화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 상기 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 CDR 및 수용체 인간 프레임워크(예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크)를 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 테오필린화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 73 또는 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 74 또는 90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 75 또는 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 77 또는 93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 78 또는 94의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 79 또는 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 테오필린화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 68 또는 76 또는 84 또는 92의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-테오필린 항체는 테오필린에 결합하는 능력을 보유한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 68 또는 76 또는 84 또는 92에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다. 임의로, 상기 항-테오필린 항체는 서열번호 68 또는 76 또는 84 또는 92 중의 VH 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 테오필린화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 72 또는 80 또는 88 또는 96의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 추가로 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-테오필린 항체는 테오필린에 결합하는 능력을 보유한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 72 또는 80 또는 88 또는 96에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 임의로 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다. 임의로, 상기 항-테오필린 항체는 서열번호 72 또는 80 또는 88 또는 96 중의 VL 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 플루오레세인화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성(항-플루오레세인 결합 특이성; 항-FLUO 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성; 항-(h)TfR 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성; 항-LRP8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 플루오레세인화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성(2개의 항-플루오레세인 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(2개의 항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성을 갖는다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 플루오레세인화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 플루오레세인화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성인 인간화된 결합 특이성이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 플루오레세인화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 상기 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 CDR 및 수용체 인간 프레임워크(예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크)를 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 플루오레세인화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 105 또는 113의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 106 또는 114의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 107 또는 115의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 109 또는 117의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 110 또는 118의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 111 또는 119의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 플루오레세인 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 108 또는 116의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-플루오레세인 항체는 플루오레세인에 결합하는 능력을 보유한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 108 또는 116에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다. 임의로, 상기 항-플루오레세인 항체는 서열번호 108 또는 116 중의 VH 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 플루오레세인화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 112 또는 120의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 추가로 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-플루오레세인 항체는 플루오레세인에 결합하는 능력을 보유한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 112 또는 120에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다. 임의로, 상기 항-플루오레세인 항체는 서열번호 112 또는 120 중의 VL 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 브로모데옥시유리딘화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성(항-브로모데옥시유리딘 결합 특이성; 항-BrdU 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성; 항-(h)TfR 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성; 항-LRP8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 브로모데옥시유리딘화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성(2개의 항-브로모데옥시유리딘 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(2개의 항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성을 갖는다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 브로모데옥시유리딘화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 216의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 218의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 219의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 220의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 221의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 브로모데옥시유리딘화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성인 인간화된 결합 특이성이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 브로모데옥시유리딘화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 상기 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 CDR 및 수용체 인간 프레임워크(예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크)를 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 브로모데옥시유리딘화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 214 또는 215의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 216 또는 217의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 218의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 219의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 220의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 221의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 브로모데옥시유리딘화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 222 또는 224의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-브로모데옥시유리딘 항체는 브로모데옥시유리딘에 결합하는 능력을 보유한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 222 또는 224에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 임의로 상기 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다. 임의로, 상기 항-브로모데옥시유리딘 항체는 서열번호 222 또는 224 중의 VH 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 브로모데옥시유리딘화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 223 또는 225의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 추가로 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다. 몇몇 실시태양에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-브로모데옥시유리딘 항체는 브로모데옥시유리딘에 결합하는 능력을 보유한다. 몇몇 실시태양에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 223 또는 225에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 몇몇 실시태양에서, 임의로 상기 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다. 임의로, 상기 항-브로모데옥시유리딘 항체는 서열번호 223 또는 225 중의 VL 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 제형이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 본 발명에 보고된 바와 같은 비-공유 복합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 제형이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 본 발명에 보고된 바와 같은 공유 접합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 제형이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 비-공유 복합체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 공유 접합체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 암 또는 신경학적 질환의 치료를 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 암 또는 신경학적 질환의 치료를 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 비-공유 복합체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 암 또는 신경학적 질환의 치료를 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 공유 접합체이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 약제의 제조에서 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 약제의 제조에서 본 발명에 보고된 바와 같은 비-공유 복합체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 약제의 제조에서 본 발명에 보고된 바와 같은 공유 접합체의 용도이다.
하나의 실시태양에서 상기 약제는 암 치료용이다.
하나의 실시태양에서 상기 약제는 신경학적 질환의 치료용이다.
하나의 실시태양에서 상기 신경학적 질환은 알쯔하이머병(AD)(비제한적으로 경도 인지 장애 및 전구성 AD), 뇌졸중, 치매, 근이영양증(MD), 다발성 경화증(MS), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 낭성 섬유증, 앤젤만 증후군, 리들 증후군, 파킨슨병, 픽병, 파제트병, 암(예를 들어 CNS 또는 뇌를 침범한 암), 및 외상성 뇌 손상 중에서 선택된다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 진단제로서 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 진단제로서 본 발명에 보고된 바와 같은 비-공유 복합체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 진단제로서 본 발명에 보고된 바와 같은 공유 접합체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 페이로드의 안정성을 증가시키기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 비-공유 복합체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 페이로드의 안정성을 증가시키기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 공유 접합체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 페이로드의 활성을 증가시키기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 비-공유 복합체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 페이로드의 활성을 증가시키기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 공유 접합체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 페이로드의 생체내 반감기를 증가시키기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 비-공유 복합체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 페이로드의 생체내 반감기를 증가시키기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 공유 접합체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 질병의 치료에서 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 질병의 치료에서 본 발명에 보고된 바와 같은 비-공유 복합체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 질병의 치료에서 본 발명에 보고된 바와 같은 공유 접합체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 질병이 있는 개체에게 유효량의 본 발명에 보고된 바와 같은 비-공유 복합체를 투여함을 포함하는 상기 개체의 치료 방법이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 질병이 있는 개체에게 유효량의 본 발명에 보고된 바와 같은 공유 접합체를 투여함을 포함하는 상기 개체의 치료 방법이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 개체에게 유효량의 본 발명에 보고된 바와 같은 비-공유 복합체를 투여함을 포함하는 상기 개체에서 질병의 치료 방법이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 개체에게 유효량의 본 발명에 보고된 바와 같은 공유 접합체를 투여함을 포함하는 상기 개체에서 질병의 치료 방법이다.
하나의 실시태양에서 상기 질병은 암이다.
하나의 실시태양에서 상기 질병은 신경학적 질환이다.
하나의 실시태양에서 상기 신경학적 질환은 알쯔하이머병(AD)(비제한적으로 경도 인지 장애 및 전구성 AD), 뇌졸중, 치매, 근이영양증(MD), 다발성 경화증(MS), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 낭성 섬유증, 앤젤만 증후군, 리들 증후군, 파킨슨병, 픽병, 파제트병, 암(예를 들어 CNS 또는 뇌를 침범한 암), 및 외상성 뇌 손상 중에서 선택된다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 혈액뇌장벽을 가로질러 합텐화된 페이로드의 표적화된 전달을 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 혈액뇌장벽을 가로질러 합텐화된 페이로드의 표적화된 전달을 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 비-공유 복합체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 혈액뇌장벽을 가로질러 합텐화된 페이로드의 표적화된 전달을 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 공유 접합체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 혈액뇌장벽을 가로질러 합텐화된 페이로드의 표적화된 전달 및 상기 혈액뇌장벽내 또는 상기 뇌 중의 합텐화된 페이로드의 방출을 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체의 용도이다.
본 발명에 보고된 바와 같은 하나의 태양은 혈액뇌장벽을 가로질러 합텐화된 페이로드의 표적화된 전달 및 상기 혈액뇌장벽내 또는 상기 뇌 중의 합텐화된 페이로드의 방출을 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 비-공유 복합체의 용도이다.
하나의 실시태양에서 상기 합텐화된 페이로드의 전달은 상기 이중특이성 항체 부재하에서의 전달에 비해 더 높다. 하나의 실시태양에서 상기 전달은 2배 더 높다. 하나의 실시태양에서 상기 전달은 10배 더 높다.
하나의 실시태양에서 상기 합텐화된 페이로드는 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체의 존재하에서보다 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체의 부재하에서 더 높은 생물 활성을 갖는다. 하나의 실시태양에서 상기 생물 활성은 상기 이중특이성 항체의 부재하에서 2배 더 높다. 하나의 실시태양에서 상기 생물 활성은 상기 이중특이성 헝체의 부재하에서 10배 더 높다.
도 1: 펩타이드의 디곡시제닌화(펩타이드에의 디곡시제닌의 접합) 과정(도 1A). 디곡시제닌화된 표지(형광단 Dig-Cy5; 도 1B) 및 디곡시제닌화된 폴리펩타이드(PYY-유도체(DIG-PYY); 도 1C)의 예.
도 2: 단일특이성 2가 항-디곡시제닌 항체 및 디곡시제닌-Cy5 접합체의 복합체(도 2A) 및 단일특이성 2가 항-디곡시제닌 항체 및 디곡시제닌-폴리펩타이드 접합체의 복합체(도 2B)의 도해. 이중특이성 4가 항-디곡시제닌 항체 및 디곡시제닌-폴리펩타이드 접합체의 복합체의 도해(도 2C).
도 3: 한정된 크기의 복합체의 단일 피크를 도시하는, 항-디곡시제닌 항체 및 펩타이드에 접합된 디곡시제닌(DIG-PYY)을 포함하는 복합체의 크기 배제 크로마토그램(280 ㎚에서 기록됨).
도 4: A: 디곡시제닌(원내)이 VH 및 VL 영역의 CDR에 의해 형성된 심부 포켓 중에 포획된 것을 도시하는 항-디곡시제닌 Fab의 구조 모델(좌측). B: 바이오시틴아미드(원내)가 VH 및 VL 영역의 CDR에 의해 형성된 심부 포켓 중에 포획된 것을 도시하는 항-비오틴 Fab의 구조 모델(우측).
도 5: VH53C 돌연변이가 도입된 및 도입되지 않은 재조합 인간화된 항-비오틴 항체의 결합의 비교. 결합 성질을 비아코어 T100 또는 비아코어 3000 장비를 사용하여 표면 플라스몬 공명(SPR) 기술에 의해 분석하였다. a) 인간화된 항-비오틴 항체. 인간화된 항-비오틴 항체, KD=624 pM에의 비오틴화된 siRNA의 결합; b) 인간화된 Cys53 돌연변이된 항-비오틴 항체. 비오틴화된 siRNA, KD=643 pM의 결합; siRNA 농도: 0.14, 0.41, 1.23, 3.70, 11.1, 33.3 및 100 nM; 항-비오틴 항체 농도: 2 nM; 센서 칩 CM3; 항-인간 IgG Fc 항체를 통한 항체의 결합
Figure pct00001

도 6: 합텐뿐만 아니라 항체 중의 적합한 위치에서의 SH 작용기의 도입은 상기 항체 및 합텐이 공유 결합을 형성하여 접합체를 생성시킬 수 있게 한다.
도 7: SDS-PAGE 자발-형광 밴드 패턴의 도해(상기 SDS-PAGE 젤의 추가적인 염색 없음):
A: 환원 또는 비-환원 조건 모두하에서 상기 항체와 합텐-형광단 접합체 사이에 공유 결합이 형성되지 않은 경우 유리 합텐-형광단 접합체의 분자량에서 하나의 자발-형광 밴드가 검출될 수 있다.
B: 비-환원 조건하에서 상기 항체와 합텐-형광단 접합체 사이에 공유 결합이 형성되는 경우 상기 항체 및 상기 합텐-형광단 접합체를 합한 분자량에서 하나의 자발-형광 밴드가 검출될 수 있다. 환원 조건하에서 상기 항체의 접합체 및 상기 합텐-형광단 접합체(합텐화된 화합물) 중의 다이설파이드 가교가 절단되며 유리 합텐-형광단 접합체의 분자량에서 하나의 자발-형광 밴드가 검출될 수 있다.
도 8: 산화환원 활성제: 산화제(글루타치온 다이설파이드, GSSG) 및 환원제(다이티오에리쓰리톨, DTE)의 존재하에서 합텐-결합 Cys-돌연변이된 항체와 합텐-Cys-형광 표지 접합체(합텐화된 화합물)의 접합체 형성: 한정된 위치에서 항체 복합체화 및 후속의 공유 결합이 SDS PAGE 분석에서 형광 신호에 의해 검출된다. 비-환원(상부 영상) 및 환원(하부 영상) SDS-PAGE 분석이 실시예 11에 개시된 바와 같이 수행되었다. 공유적으로 항체 결합된 합텐은 비-환원 조건하에서 적합한 위치에서 보다 큰 크기의 단백질 결합된 신호로서 검출될 수 있다. 이들 신호는 환원시 단백질로부터 탈착되고 환원조건하에서 작은 존재로서 가시적이다.
좌측: 형광 영상
우측: 쿠마씨 블루 염색
시리즈 1: 52bC 돌연변이를 갖는 항-디곡시제닌 항체
시리즈 2: 52b번 위치에서 야생형 잔기를 갖는 항-디곡시제닌 항체
(A) 3 mM DTE 및 10 mM GSSG와의 공유 커플링;
(B) 0.3 mM DTE 및 1 mM GSSG와의 공유 커플링;
(C) 0.03 mM DTE 및 0.1 mM GSSG와의 공유 커플링.
도 9: 산화제(글루타치온 다이설파이드, GSSG)만의 존재하에서, 그러나 환원제의 부재하에서, 또는 상기 둘 다의 부재하에서 합텐-결합 Cys 돌연변이된 항체와 합텐-Cys-형광 표지 접합체와의 복합체 형성: 한정된 위치에서 항체 복합체화 및 후속의 공유 결합은 SDS PAGE 분석에서 형광 신호에 의해 검출된다. 비-환원(상부 영상) 및 환원(하부 영상) SDS-PAGE 분석을 실시예 12에 개시된 바와 같이 수행하였다. 공유적으로 항체 결합된 합텐은 비-환원 조건하에 적합한 위치에서 보다 큰 크기의 단백질 결합된 신호로서 검출될 수 있다. 상기 신호는 환원시 단백질로부터 탈착되고 환원조건하에서 작은 존재로서 가시적이다.
좌측: 형광 영상
우측: 쿠마씨 블루 염색
시리즈 1: 52bC 돌연변이를 갖는 항-디곡시제닌 항체
시리즈 2: 52b번 위치에서 야생형 잔기를 갖는 항-디곡시제닌 항체
(A) 첨가제 없음
(B) 1 mM GSSG와의 공유 커플링;
(C) 0.1 mM GSSG와의 공유 커플링.
도 10: Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)의 구조.
도 11: DIG-3-cme-eda-Cy5의 구조.
도 12: DIG-말레이미드-Cy5의 구조.
도 13: DIG-eda-Cys-Cy5의 구조.
도 14: DIG-Ahx-Cys-Cy5의 구조.
도 15: DIG-Cys-MR121의 구조.
도 16: Ac-PYY(PEG3-Dig)의 구조.
도 17: Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)의 구조.
도 18: PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)의 구조.
도 19: Dy636-eda-Btn의 구조.
도 20: Dy636-Ser-Btn의 구조.
도 21: Dy636-Cys-Btn의 구조.
도 22: Cy5-Cys-Btn의 구조.
도 23: Cy5-Ser-Btn의 구조.
도 24: Ac-PYY(PEG2-Btn)의 구조.
도 25: Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Btn의 구조.
도 26: Ac-PYY-PEG3-Ser-PEG2-Btn의 구조.
도 27: Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Btn의 구조.
도 28: Ac-PYY(PEG3-Cys-4-Abu-5-Fluo)의 구조.
도 29: Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)의 구조.
도 30: Ac-PYY(PEG2-Btn)의 생성을 위한 도해.
도 31: Ac-PYY(PEG3-Cys-β-Ala-Btn)의 생성을 위한 도해.
도 32: Ac-PYY(PEG3-Cys-4-Abu-Dig)의 생성을 위한 도해.
도 33: 바이오시틴아미드와의 복합체 중의 쥐 항-비오틴 항체의 X-선 구조. 바이오시틴아미드와 상호작용하는 아미노산 잔기를 스틱 표현으로 도시한다.
도 34: 복합체화되지 않은 항원/합텐에 비해 공유 접합체 및 비-공유 복합체에 대한 생체내 혈액 PK 연구의 결과; 비오틴-Cy5 비-공유 복합체(도 34A) 및 공유(다이설파이드-가교된) 접합체(도 35B)뿐만 아니라 복합체화되지 않은 비오틴-Ser-Cy5(별표)의 Cy5-매개된 형광의 상대적으로 남은 형광 강도(%, 채운 마크)를 도시하며; 시점 t = 0.08 h에서의 형광 신호를 100%로 설정하였고; 추가로, 마우스 혈청 샘플 중 인간 IgG의 상대적으로 남은 양을 도시하며(빈 마크); t = 0.08 h에서 IgG 혈청 농도(㎎/㎖)를 100%로 설정하였다.
도 35: 마우스 혈청 중 다곡시제닌화된 PYY 폴리펩타이드량의 측정에 대한 웨스턴 블럿(western blot).
도 36: 합텐화된 화합물과 항-합텐 항체와의 친화성-구동된 복합체화의 분석.
한정된 위치에서의 항체 복합체화 및 후속의 공유 결합은 SDS PAGE 분석(실시예 20에 개시된 바와 같이 수행되었다)에서 형광 신호에 의해 지시된다.
좌측: 비-환원(젤의 좌측면) 및 환원(젤의 우측면) 샘플에 대한 형광 영상.
우측: 쿠마씨 블루 염색.
1: 인간화된 항-디곡시제닌 항체 + 비오틴-Cys-Cy5
2: 인간화된 항-디곡시제닌 항체 VH52bC + 비오틴-Cys-Cy5
3: 인간화된 항-비오틴 항체 + 비오틴-Cys-Cy5
4: 인간화된 항-비오틴 항체 VH53C + 비오틴-Cys-Cy5
흰색 화살표는 과잉의(커플링되지 않은) 비오틴-Cys-Cy5를 표시하며, 이는, 접합 반응이 상기 경우에 친화성 구동되지 않기 때문에, 항-디곡시제닌 항체 VH52bC가 사용되는 경우 현저하게 더 많다.
도 37: 합텐-매개된 부위-지향된 직접 공유 페이로드 커플링을 위해 52b번 위치에 추가적인 시스테인을 갖는 Dig-결합 항체를 형성시키는데 필요한, Fab 영역 내 시스테인 위치 및 다이설파이드 패턴. (A) 기능성 Fab 단편을 형성하기 위해 필요한 VH 및 CH1 도메인 및 VL 및 CL 도메인 중의 시스테인 및 다이설파이드 패턴. (B) 합텐-매개된 부위-지향된 직접 공유 페이로드 커플링을 위해 52b번 위치에 추가적인 시스테인을 갖는 기능성 Fab 단편을 형성시키는데 필요한 VH 및 CH1 도메인 및 VL 및 CL 도메인 중의 시스테인 및 다이설파이드 패턴. (C 및 D) 잘못 폴딩된 비기능성 항체를 생성시키는 VH52b 변이체의 VH 도메인내에 올바르지 않은 다이설파이드 결합을 형성할 가능성. E) 잘못 폴딩된 비기능성 항체를 생성시키는 VH52b 변이체의 Fv 영역내에 잠재적인 올바르지 않은 도메인간 다이설파이드 결합에 대한 예.
도 38: 합텐-매개된 부위-지향된 직접 공유 페이로드 커플링을 위해 52b번 위치에 추가적인 시스테인을 갖는 Dig-결합 다이설파이드-안정화된 단쇄 Fv를 형성시키는데 필요한 시스테인 위치 및 다이설파이드 패턴. (A) 기능성 scFv, dsscFv 및 52b 돌연변이된 dsscFv를 형성시키는데 필요한 VH 및 VL 도메인 중의 시스테인. (B) 기능성 scFv, dsscFv 및 52b 돌연변이된 dsscFv를 생성시키기 위해 형성되어야 하는 다이설파이드 결합의 올바른 패턴. (C) 잘못 폴딩된 비기능성 scFv를 생성시키는 올바르지 않은 다이설파이드 결합을 형성할 가능성. (D) 잘못 폴딩된 비기능성 dsscFv를 생성시키는 올바르지 않은 다이설파이드 결합을 형성할 가능성. (E) 잘못 폴딩된 비기능성 52b 돌연변이된 dsscFv를 생성시키는 올바르지 않은 다이설파이드 결합을 형성할 가능성.
도 39: 공유 커플링된 페이로드에 대한 전달 비히클로서 LeY-Dig 이중특이성 항체 유도체의 조성.
도 40: 공유 커플링된 페이로드의 표적화된 전달을 위한 이중특이성 항-합텐 항체 유도체의 발현 및 정제. (A) 웨스턴 블럿 분석을 위해서, 모든 배양 상등액에 SDS PAGE(NuPAGE 4-12% 비스-트리스 젤(1.0 ㎜ x 12웰)(인비트로젠(Invitrogen); 카탈로그 번호 NP0322)를 수행하고 단백질을 후속으로 임모빌론 트랜스퍼 멤브레인(Immobilon Transfer Membranes)(임모빌론-P)(밀리포어(Millipore); 카탈로그 번호 IPVH07850), 기공 크기: 0.45 ㎛를 갖는 PVDF로 옮겼다. 항체 유도체를 1:1000 희석비의, 염소에서 생산된 항-인간 카파 경쇄)-알칼리성 포스파타제 항체(친화성 정제된), 시그마(Sigma)(카탈로그 번호 A3813) 및 1:1000 희석비의, 염소에서 생산된 항-인간 IgG(Fc 특이성)-알칼리성 포스파타제 항체, 시그마(카탈로그 번호 A9544)에 의해 검출하였다. 기질 BCIP/NBT-블루 액체 기질(시그마 카탈로그 번호 B3804)을 웨스턴 블럿의 전개를 위해 적용하였다. 레인 1 - 분자량 마커; 레인 2 및 3 - 변형되지 않은 중쇄를 갖는 대조용 항체; 레인 4 연장된 H-쇄를 갖는 LeY-Dig(52bC) 이중특이성 항체.
(B) SDS-PAGE 분석(NuPAGE 4 - 12% 비스-트리스 젤[인비트로젠] 및 후속의 쿠마씨 브릴리언트 블루에 의한 염색은 단백질 제제의 순도를 입증하며 계산된 분자량에 상응하는 겉보기 분자 크기를 갖는 IgG와 관련된 폴리펩타이드 쇄를 가시화한다. 레인 1 - 분자량 마커; 레인 2 - 환원된 연장된 H-쇄를 갖는 LeY-Dig(52bC) 이중특이성 항체, 레인 3 - 비-환원된 연장된 중쇄를 갖는 LeY-Dig(52bC) 이중특이성 항체;
(C) 크기 배제 크로마토그래피(슈퍼덱스(Superdex) 200)는 단백질 A 정제 후 LeY-Dig(52bC) 이중특이성 항체 유도체의 단백질 제제 중의 동종성 및 응집체의 결여를 입증한다.
도 41: 비-복합체화된 합텐 화합물 Dig-Cy5와 비교된 공유 접합체 및 비-공유 복합체에 대한 생체내 혈액 약동학 연구의 결과; Dig-Cy5 비-공유 복합체(상부 패널), Dig-Cys-Cy5 공유(다이설파이드-가교된) 접합체(하부 패널)뿐만 아니라 복합체화되지 않은 Dig-Cy5(회색 삼각형)의 상대적으로 남은 형광 강도(%)를 도시하며; 시점 t = 0.08 시간에서의 형광 신호를 100%로 설정하였고; 추가로, 마우스 혈청 샘플 중 인간 IgG의 상대적으로 남은 양을 도시하며; t = 0.08 시간에서 IgG 혈청 농도(㎎/㎖)를 100%로 설정하였다.
도 42: Cy5 형광의 생체내 약동학을 각각 비오틴-Cy5 또는 비오틴-Cys-Cy5를 함유하는 비-공유 복합체 또는 공유(다이설파이드-가교된) 접합체, 또는 복합체화되지 않은 비오틴-Cy5의 주입 후 비-침습적인 육안 영상화에 의해 측정하였다. 짙은 다이아몬드: 비오틴-Cys5; 짙은 사각형 비오틴-Cy5 항-비오틴 항체 복합체; 삼각형: 비오틴-Cy5 항-비오틴 항체 접합체.
도 43: a) 테오필린-Cys-Cy5의 조성, 구조 및 분자량; b) 크기 배제 크로마토그래피는 정제된 테오필린-결합 항체 변이체의 순도 및 동종성을 입증한다; 피크 #2는 정제된 생성물을 도시하고, 피크 #1의 결여는 상기와 같은 제제에 응집체가 없음을 암시하며; c) 비-환원(좌측 레인) 및 환원(우측 레인) SDS PAGE에 의해 입증된 바와 같은 테오필린-결합 항체와 테오필린-Cys-Cy5간의 공유 복합체의 형성; Cy5는 테오필린-Cys-Cy5 및 Cys-돌연변이된 항체를 함유하는 샘플에서만 비-환원 조건하에서 H-쇄에 커플링되는 것으로 보이며, 상기 공유 접합체는 환원시 붕괴된다(우측 레인); 레인 1: 분자량 마커; 2-4: 비-환원 - 2: 항-테오필린 항체(Cys-돌연변이 없이) + 테오필린-Cys-Cy5(복합체); 3: 항-테오필린 항체-cys_55 + 테오필린-Cys-Cy5(접합체); 4: 항-테오필린 항체-cys_54 + 테오필린-Cys-Cy5(접합체); 5-7 환원 - 5: 항-테오필린 항체(Cys-돌연변이 없이) + 테오필린-Cys-Cy5(복합체); 6: 항-테오필린 항체-cys_55 + 테오필린-Cys-Cy5(접합체); 7: 항-테오필린 항체-cys_54 + 테오필린-Cys-Cy5(접합체).
도 44: 비오틴-결합 항체와 비오틴-Cys-Cy5 간의 공유 복합체의 형성이 비-환원 및 환원 SDS-PAGE에 의해 입증되고; 커플링 반응이 37 ℃에서 1 시간 동안 쥐 혈청 중에서 수행되었다. Cy5는 비오틴-Cys-Cy5 및 Cys-돌연변이된 항체를 함유하는 샘플에서만 비-환원 조건하에서 H-쇄에 커플링되는 것으로 보이며; 상기 공유 접합체는 환원시 붕괴된다(우측 레인); 레인 1: 분자량 마커; 2-3: 비-환원 - 2: 항-비오틴 항체(Cys-돌연변이 없이) + 비오틴-Cys-Cy5(복합체); 3: 항-비오틴 항체-Cys + 비오틴-Cys-Cy5(접합체); 4-5: 환원 - 5: 항-비오틴 항체(Cys-돌연변이 없이) + 비오틴-Cys-Cy5(복합체); 6: 항-비오틴 항체-Cys + 비오틴-Cys-Cy5(접합체).
도 45: Cy5 형광의 생체내 약동학을 비-공유 복합체-형성 항체 또는 공유(다이설파이드-가교된) 접합체-형성 항체의 주입에 이어서 비오틴-Cy5의 주입 후 비-침습적인 육안 영상화에 의해 측정하였다; 짙은 다이아몬드: 오직 비오틴-Cys5만 투여됨, 짙은 원: 항-비오틴 항체 투여 후 24 시간째에 투여된 비오틴-Cy5(생체내 복합체 형성); 짙은 사각형: 항-비오틴 항체-Cys의 투여 후 24 시간 째에 투여된 비오틴-Cys-Cy5(생체내 접합체 형성).
도 46: 쥐 항-비오틴 항체-Fab-단편의 단백질 구조를 바이오시틴아미드와의 복합체 중에서 측정하였다: 상기 복합체화된 합텐을 아미노산의 음으로 하전된 클러스터에 가깝게 위치시키며; 카복시기에서 페이로드 커플링을 위해 유도체화된 비오틴(합텐으로서)은, 상기 위치에서 전하 반발이 없으므로(COOH기의 결여로 인해), 양호한 효능으로 결합하고; 대조적으로, 유리(정상) 비오틴은 그의 카복시기가 상기 음전하 클러스터에 가깝게 있을 수 있고, 따라서 반발되므로 상기 항체에 효율적으로 결합할 수 없다.
도 47: 혈액뇌장벽-셔틀 모듈 조성물의 도해.
도 48: 실시예 27에서 생성된 바와 같은 혈액뇌장벽-셔틀 모듈의 SEC 프로파일 및 SDS PAGE.
도 49: TfR 발현 BBB-유래된 세포주로서 hCMEC/D3 세포 및 형광 페이로드로서 Dig-Cy5를 사용하는, FACS 분석의 결과.
도 50: 합텐-결합 이중특이성 항체 혈액뇌장벽-셔틀 모듈의 내피세포로부터의 트랜스사이토시스 및 방출; A: 항-CD33-dig 항체 트랜스웰 분석, huFc ELISA; B: 항-TfR1 항체 트랜스웰 분석, huFc ELISA; C: 항-TfR1 항체-Dig 트랜스웰 분석, huFc ELISA; D: 항-TfR2 항체 트랜스웰 분석, huFc ELISA; E: 항-TfR2-항체 Dig 트랜스웰 분석, huFc ELISA.
도 51: A: 이중특이성 항체-합텐화된 페이로드 비-공유 복합체의 조성 및 정량분석; B: TfR에 대해 감소된 친화성을 갖는 이중특이성 항체를 사용하는 합텐화된 페이로드의 내피세포로부터의 방출 및 트랜스사이토시스(A: 항-CD33-Dig + Dig-DNA 트랜스웰 분석, qPCR; B: 항-CD33-Bio + Bio-DNA 트랜스웰 분석, qPCR, C: 항-TfR2-Dig + Dig-DNA 트랜스웰 분석, qPCR, D: 항-TfR2-Bio + Bio-DNA 트랜스웰 분석, qPCR).
도 52: TfR에 대해 높은 친화성을 갖는 비-방출성 혈액뇌장벽-셔틀 모듈을 적용하는 합텐화된 페이로드의 내피세포로부터의 방출 및 트랜스사이토시스; A: 항-TrF1-Dig + Dig-DNA 트랜스웰 분석, qPCR, B: 항-TfR1 항체-Bio + Bio-DNA 트랜스웰 분석, qPCR).
도 53: TfR에 대해 높은 친화성을 갖는 비-방출성 혈액뇌장벽-셔틀 모듈로부터의 합텐화된 페이로드의 결합, 흡수 및 세포내 분리; 37 ℃에서 3 시간 배양에 따른 hCMEC/D3 세포에서 이중특이성 항체-복합체화된 합텐화된 형광 페이로드의 세포이하 분리를 도시한다. DIG-DNA 내지 CY5 또는 바이오-DNA 내지 Cy5(짙은 회색)가 별개의 세포내 소포에서 보이며, 이는 내면화된 항-디곡시제닌- 또는 항-비오틴-결합 이중특이성 항체(중간 회색)와 겹치지 않는다.
도 54: 2.5몰 과잉의 헬리카 동기 아미노산 서열 함유 화합물을 사용하여 공유 복합체 0156을 형성하는, 헬리카 동기 아미노산 서열 시스테인 변이체 2와 항체 0155의 커플링에 대한 SDS PAGE 젤; 1 = 헬리카 동기 아미노산 서열 시스테인 변이체 2; 2 = 항체 0019; 3 = 항체 0155.
도 55: 헬리카 동기 아미노산 서열 시스테인 변이체 1과 항체 0157의 커플링의 SDS PAGE 젤; 1 = 헬리카 동기 아미노산 서열 시스테인 변이체 1(산화된); 2 = 대조용 커플링(산화된); 3 = 공유 접합체(산화된); 4 = 분자량 마커; 5 = 공유 접합체(환원된); 6 = 대조용 커플링(환원된); 7 = 헬리카 동기 아미노산 서열 시스테인 변이체 1(환원된).
도 56: 항체 0155, 서열번호 28의 C-말단 리신 잔기 결실된 헬리카 동기 아미노산 서열 시스테인 변이체 1 함유 슈도모나스 외독소 분자 LR8M 및 그의 공유 접합체의 SEC 크로마토그램.
도 57: 비환원 샘플에 대한 SDS-CE, 캘리퍼에 의한 접합 효율의 분석.
도 58: A: SEC-MALLS 분석을 수행하여 BRDU-표지된 DNA를 갖는 항-TfR/BRDU 이중특이성 항체의 복합체뿐만 아니라 유리 이중특이성 항체 및 유리 BRDU-DNA를 확인하고 특성화하였다. 복합체는 244.9 kDa의 MW에서 컬럼으로부터 용리되고, 유리 이중특이성 항체는 215.4 kDa의 MW에서 검출되며, 유리 BRDU-DNA는 16.4 kDa의 MW에서 검출된다.
B: SEC-MALLS 분석을 수행하여 BRDU-표지된 DNA를 갖는 항-TfR/BRDU 이중특이성 항체의 복합체뿐만 아니라 유리 이중특이성 항체 및 유리 BRDU-DNA를 확인하고 특성화하였다. 복합체는 6.8 ㎚의 유체역학적 반경을 나타내는 반면, 유리 이중특이성 항체는 6.2 ㎚의 유체역학적 반경을 나타낸다.
도 59: A: SEC-MALLS 분석을 수행하여 비오틴-표지된 항-pTau 항체와 항-TfR/비오틴 이중특이성 항체의 복합체뿐만 아니라 유리 이중특이성 항체 및 유리 비오틴-표지된 항-pTau 항체를 확인하고 특성화하였다. 복합체는 8.0 ㎚의 유체역학적 반경을 나타내는 반면, 유리 이중특이성 항체는 6.2 ㎚의 유체역학적 반경을 나타내고 유리 비오틴-표지된 항-pTau 항체는 5.5 ㎚의 유체역학적 반경을 나타낸다.
B: SEC-MALLS 분석을 수행하여 비오틴-표지된 항-pTau 항체와 항-TfR/비오틴 이중특이성 항체의 복합체뿐만 아니라 유리 이중특이성 항체 및 유리 비오틴-표지된 항-pTau 항체를 확인하고 특성화하였다. 복합체는 501 kDa의 MW에서 컬럼으로부터 용리되고, 유리 이중특이성 항체는 205 kDa의 MW에서 검출되며 유리 비오틴-표지된 항-pTau 항체는 150 kDa의 MW에서 검출된다.
C: 합텐 및 항-합텐 항체의 잘못된 조합을 사용하는 경우 복합체는 형성되지 않는다.
도 60: 비오틴-표지된 항-pTau 항체 및 항-CD33/비오틴 이중특이성 항체(상부 좌측 패널)의 복합체 및 유리 비오틴-표지된 항-pTau 항체(상부 우측 패널)는 유효하게 엔도사이토시스되지 않고(세포 용해물, 라인), 측저(좌측 컬럼, 밝은 회색) 또는 정상(우측 컬럼, 검은색) 구획내로 수송되지 않는다(로딩 3.8 ㎍/㎖).
비오틴-표지된 항-pTau 항체와 항-TfR/비오틴 이중특이성 항체 1(하부 좌측 패널) 또는 항-TfR/비오틴 이중특이성 항체 2(하부 우측 패널)와의 복합체화는 유효 엔도사이토시스(세포 용해물, 라인) 및 후속의 비오틴-표지된 항-pTau 항체의 측저내(좌측 컬럼, 밝은 회색)뿐만 아니라 다시 정상내(우측 컬럼, 검은색) 구획으로의 비오틴-표지된 항-pTau 항체의 수송(로딩 3.8 ㎍/㎖)을 매개한다.
도 61: 합텐화된 페이로드 및 합텐-결합 이중특이성 항체 혈액뇌장벽-셔틀 모듈의 내피세포로부터의 방출 및 트랜스사이토시스의 트랜스웰 분석; TfR(TfR2)에 대해 감소된 친화성을 갖는 이중특이성 항체 및 비-결합 이중특이성 항체(항-CD33) 및 34머 올리고뉴클레오타이드 페이로드(올리고뉴클레오타이드 S1)를 사용한다
A, B, C, D: DNA 페이로드의 qPCR 정량분석
E, F, G, H: 혈액뇌장벽-셔틀 모듈(이중특이성 항체)의 ELISA 정량분석
A, E: 항-TfR2-Bio + Bio-DNA 올리고뉴클레오타이드 S1
B, F: 항-CD33-Bio + Bio-DNA 올리고뉴클레오타이드 S1
C, G: 항-TfR2-Dig + Dig-DNA 올리고뉴클레오타이드 S1
D, H: 항-CD33-Dig + Dig-DNA 올리고뉴클레오타이드 S1.
도 62: 합텐화된 페이로드 및 합텐-결합 이중특이성 항체 혈액뇌장벽-셔틀 모듈의 내피세포로부터의 방출 및 트랜스사이토시스의 트랜스웰 분석; TfR(TfR2)에 대해 감소된 친화성을 갖는 이중특이성 항체 및 비-결합 이중특이성 항체(항-CD33) 및 28머 올리고뉴클레오타이드 페이로드(올리고뉴클레오타이드 S2)를 사용한다
A, B, C, D, H: 올리고뉴클레오타이드 페이로드의 qPCR 정량분석
E, F, G: 혈액뇌장벽-셔틀 모듈(이중특이성 항체)의 ELISA 정량분석
A, E: 항-TfR2-Bio + Bio-DNA 올리고뉴클레오타이드 S2
B, F: 항-CD33-Bio + Bio-DNA 올리고뉴클레오타이드 S2
C, G: 항-TfR2-Dig + Dig-DNA 올리고뉴클레오타이드 S2
D: 항-CD33-Dig + Dig-DNA 올리고뉴클레오타이드 S2
H: Dig-DNA 올리고뉴클레오타이드 S2 페이로드 단독.
도 63: 합텐화된 페이로드 및 합텐-결합 이중특이성 항체 혈액뇌장벽-셔틀 모듈의 내피세포로부터의 방출 및 트랜스사이토시스의 트랜스웰 분석; TfR(TfR1)에 대해 높은 친화성을 갖는 이중특이성 항체 및 34머 올리고뉴클레오타이드 페이로드(올리고뉴클레오타이드 S1) 또는 28머 올리고뉴클레오타이드 페이로드(올리고뉴클레오타이드 S2)를 사용한다
A, B, C, D: DNA 페이로드의 qPCR 정량분석
E, F, G, H: 혈액뇌장벽-셔틀 모듈(이중특이성 항체)의 ELISA 정량분석
A, E: 항-TfR1-Bio + Bio-DNA 올리고뉴클레오타이드 S1
B, F: 항-TfR1-Dig + Dig-DNA 올리고뉴클레오타이드 S1
C, G: 항-TfR1-Bio + Bio-DNA 올리고뉴클레오타이드 S2
D, H: 항-TfR1-Dig + Dig-DNA 올리고뉴클레오타이드 S2.
I. 정의
본 발명에 사용되는 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 모든 불변 영역 및 도메인의 아미노산 위치는 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 개시된 카밧 넘버링 시스템에 따라 넘버링되며 본 발명에서 "카밧에 따른 넘버링"이라 지칭된다. 구체적으로 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 카밧 넘버링 시스템(페이지 647-660 참조)이 카파 및 람다 아이소타입의 경쇄 불변 도메인 CL에 대해 사용되고 카밧 EU 색인 넘버링 시스템(페이지 661-723 참조)이 불변 중쇄 도메인(CH1, 힌지, CH2 및 CH3)에 대해 사용된다.
본 발명의 목적을 위한 "수용체 인간 프레임워크"는 하기에 정의되는 바와 같은, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인(VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인(VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로 부터 유래된" 수용체 인간 프레임워크는 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 일부 실시태양에서, 상기 VL 수용체 인간 프레임워크는 상기 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열이 일치한다.
"아미노산"이란 용어는 천연, 즉 직접 또는 전구체의 형태로 핵산에 의해 암호화될 수 있는, 또는 비천연인 카복시 α-아미노산 기를 나타낸다. 상기 개별적인 천연 아미노산은 3개의 뉴클레오타이드, 소위 코돈 또는 염기-트리플릿으로 이루어진 핵산에 의해 암호화된다. 각각의 아미노산은 적어도 하나의 코돈에 의해 암호화된다. 이는 "유전 암호의 축퇴"로서 공지되어 있다. 본 출원내에 사용되는 바와 같은 "아미노산"이란 용어는 알라닌(3문자 암호: ala, 1문자 암호: A), 아르기닌(Arg, R), 아스파라진(Asn, N), 아스파트산(Asp, D), 시스테인(Cys, C), 글루타민(Gln, Q), 글루탐산(Glu, E), 글리신(Gly, G), 히스티딘(His, H), 아이소류신(Ile, I), 류신(Leu, L), 리신(Lys, K), 메티오닌(Met, M), 페닐알라닌(Phe, F), 프롤린(Pro, P), 세린(Ser, S), 쓰레오닌(Thr, T), 트립토판(Trp, W), 타이로신(Tyr, Y), 및 발린(Val, V)을 포함하는 천연 카복시 α-아미노산을 나타낸다. 비천연 아미노산의 예는 비제한적으로 Aad(알파-아미노아디프산), Abu(아미노부티르산), Ach(알파-아미노사이클로헥산-카복실산), Acp(알파-아미노사이클로펜탄-카복실산), Acpc(1-아미노사이클로프로판-1-카복실산), Aib(알파-아미노아이소부티르산), Aic(2-아미노인단-2-카복실산; 또한 2-2-Aic라 칭함), 1-1-Aic(1-아미노인단-1-카복실산), (2-아미노인단-2-카복실산), 알릴글리신(AllylGly), 알로아이소류신(allo-Ile), Asu(알파-아미노수베르산, 2-아미노옥탄디오산), Bip(4-페닐-페닐알라닌-카복실산), BnHP((2S,4R)-4-하이드록시프롤린), Cha(베타-사이클로헥실알라닌), Cit(시트룰린), 사이클로헥실글리신(Chg), 사이클로펜틸알라닌, 베타-사이클로프로필 알라닌, Dab(1,4-다이아미노부티르산), Dap(1,3-다이아미노프로피온산), p(3,3-다이페닐알라닌-카복실산), 3,3-다이페닐알라닌, 다이-n-프로필글리신(Dpg), 2-퓨릴알라닌, 호모사이클로헥실알라닌(HoCha), 호모시트룰린(HoCit), 호모사이클로류신, 호모류신(HoLeu), 호모아르기닌(HoArg), 호모세린(HoSer), 하이드록시프롤린, Lys(Ac), (1) Nal(1-나프틸 알라닌), (2) Nal(2-나프틸 알라닌), 4-MeO-Apc(1-아미노-4-(4-메톡시페닐)-사이클로헥산-1-카복실산), 노르-류신(Nle), Nva(노르발린), 오마틴, 3-Pal(알파-아미노-3-피리딜알라닌-카복실산), 4-Pal(알파-아미노-4-피리딜알라닌-카복실산), 3,4,5,F3-Phe(3,4,5-트라이플루오로-페닐알라닌), 2,3,4,5,6,F5-Phe(2,3,4,5,6-펜타플루오로-페닐알라닌), Pqa(4-옥소-6-(1-피페라지닐)-3(4H)-퀴나졸린-아세트산(CAS 889958-08-1)), 피리딜알라닌, 퀴놀릴알라닌, 사르코신(Sar), 티아졸릴알라닌, 티에닐알라닌, Tic(알파-아미노-1,2,3,4,테트라하이드로아이소퀴놀린-3-카복실산), Tic(OH), Tle(테트라부틸글리신) 및 Tyr(Me)을 포함한다.
"아미노산 서열 변이체"란 용어는 고유/모/야생형 아미노산 서열과 어느 정도 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 임의로, 아미노산 서열 변이체는 상기 고유/모/야생형 아미노산 서열과 적어도 약 70% 서열 일치성을 가질 것이다. 일부 실시태양에서 상기 변이체는 상기 고유/모/야생형 아미노산 서열과 약 80% 이상의 서열 일치성을 가질 것이다. 일부 실시태양에서 상기 변이체는 상기 고유/모/야생형 아미노산 서열과 약 90% 이상의 서열 일치성을 가질 것이다. 일부 실시태양에서 상기 변이체는 상기 고유/모/야생형 아미노산 서열과 약 95% 서열 일치성을 가질 것이다. 일부 실시태양에서 상기 변이체는 상기 고유/모/야생형 아미노산 서열과 약 98% 이상의 서열 일치성을 가질 것이다. 상기 아미노산 서열 변이체는 상기 고유/모/야생형 아미노산 서열의 아미노산 서열내 일정 위치에 치환, 결실 및/또는 삽입을 갖는다. 아미노산을 통상적인 명칭, 1-문자 및 3-문자 암호에 의해 표시할 수 있다.
본 발명에서 "항체"란 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며 다양한 항체 구조물들, 예를 들어 비제한적으로 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이성 항체(예를 들어 이중특이성 항체), 및 항체 단편(목적하는 항원-결합 활성 및 특이성을 나타내는 한)을 포함한다.
"항체 단편"이란 용어는 완전 항체가 또한 특이적으로 결합하는 항원에 특이적으로 결합하는 상기 완전 항체의 일부를 포함하는 상기 완전 항체 이외의 분자를 나타낸다. 항체 단편의 예는 비제한적으로 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 다이아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자(예를 들어 scFv), 단쇄 Fab 단편(scFab), 단일 중쇄 항체(VHH) 및 항체 단편으로부터 형성되는 다중특이성 항체를 포함한다.
항체의 파파인 절단은 2개의 동일한 항원-결합 단편("Fab" 단편이라 칭하며, 이들은 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는다), 및 잔류 "Fc" 단편을 생성시키며, 이들의 명칭은 쉽게 결정화되는 그들의 능력을 반영한다. 펩신 처리는, 2개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원과 가교결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 제공한다.
상기 Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에 몇몇 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본 발명에서 상기 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 적어도 하나의 유리 티올기를 갖는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 Fab' 단편들의 쌍(이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는다)으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링들이 또한 공지되어 있다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 상기 영역은 긴밀한 비-공유 회합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 상기 배열에서 각각의 가변 도메인의 3개의 초가변 영역들이 상호작용하여 상기 VH-VL 이량체의 표면상에 항원 결합 부위를 한정한다. 집합적으로, 6개의 초가변 영역이 상기 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일의 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 단지 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)이, 전체 결합 부위보다 낮은 친화성이기는 하지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
"비오틴", 간단히 "BI"란 용어는 5-[(3aS,4S,6aR)-2-옥소헥사하이드로-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-일]펜탄산을 나타낸다. 비오틴은 또한 비타민 H 또는 조효소 R로서 공지된다.
"비오틴화된 페이로드"란 용어는 비오틴 부분, 임의로 링커 및 페이로드를 포함하는 접합된 존재를 나타낸다. 상기 링커는 임의의 링커, 예를 들어 펩타이드 링커 또는 화학적 링커일 수 있다.
"이중특이성 항체"란 용어는 2개의 상이한(항원/합텐) 결합 특이성을 갖는 항체를 나타낸다. 하나의 실시태양에서 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체는 2개의 상이한 항원, 즉 합텐 및 비-합텐 항원에 특이적이다.
"브로모데옥시유리딘", 간단히 "BrdU"란 용어는 5-브로모-2'-데옥시유리딘을 나타낸다. 브로모데옥시유리딘은 또한 브록슈리딘, BudR, BrdUrd로서 공지된다.
"브로모데옥시유리딘화된 페이로드"란 용어는 브로모데옥시유리딘 부분, 임의로 링커 및 페이로드를 포함하는 접합된 존재를 나타낸다. 상기 링커는 임의의 링커, 예를 들어 펩타이드 링커 또는 화학적 링커일 수 있다.
"키메릭" 항체란 용어는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 출처 또는 종으로부터 유래하는 반면 상기 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 출처 또는 종으로부터 유래하는 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 상기 항체의 중쇄가 갖는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5개의 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하며, 이들 중 다수는 하위부류(아이소타입)들, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 세분될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류들에 상응하는 중쇄 불변 도메인을 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "세포독성제"란 용어는 세포 기능을 억제하거나 방지하고/하거나 세포사 또는 세포파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 특수 페이로드이다. 세포독성제는 비제한적으로 방사성 동위원소(예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물(예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 끼어들기 약물(intercalating agent)); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵분해 효소; 항생제; 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 독소, 예를 들어 소분자 독소 또는 효소 활성 독소 및 그의 단편 및/또는 변이체; 및 하기에 개시된 다양한 항종양 또는 항암제를 포함한다.
"디곡시제닌", 간단히 "DIG"란 용어는 3-[(3S,5R,8R,9S,10S,12R,13S,14S,17R)-3,12,14-트라이하이드록시-10,13-다이메틸-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,15,16,17-테트라데카하이드로-사이클로펜타[a]-펜안트렌-17-일]-2H-퓨란-5-온(CAS 번호 1672-46-4)을 나타낸다. 디곡시제닌(DIG)은 디기탈리스 푸르푸레아(Digitalis purpurea), 디기탈리스 오리엔탈리스(Digitalis orientalis) 및 디기탈리스 라나타(Digitalis lanata)(폭스글로브) 식물의 꽃 및 잎에서 광범위하게 발견되는 스테로이드이다(문헌[Polya, G., Biochemical targets of plant bioactive compounds, CRC Press, New York (2003) p. 847]).
"디곡시제닌화된 페이로드"란 용어는 디곡시제닌 부분, 임의로 링커 및 페이로드를 포함하는 접합된 존재를 나타낸다. 상기 링커는 임의의 링커, 예를 들어 펩타이드 링커 또는 화학적 링커일 수 있다.
"효과기 기능"이란 용어는 항체의 Fc-영역에 기인할 수 있는 생물 활성들을 나타내며, 상기 활성들은 상기 항체 부류에 따라 변한다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다. 효과기 기능이 없는 Fc-영역(=효과기-없는 Fc-영역)은 상기 Fc-영역의 C1q 또는 Fcγ-수용체에의 결합을 없애는 아미노산 서열 중의 돌연변이를 포함한다.
작용제, 예를 들어 약학 제형의 "유효량"이란 용어는 목적하는 치료학적 또는 예방학적 결과를 성취하기에 필요한 투여량에서 및 상기에 필요한 기간 동안 상기 성취에 유효한 양을 나타낸다.
본 발명에서 "Fc-영역"이란 용어는 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 한정하는데 사용된다. 상기 용어는 고유 서열 Fc-영역 및 변형 Fc-영역을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 인간 IgG 중쇄 Fc-영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 상기 중쇄의 카복시-말단까지 연장된다. 그러나, 상기 Fc-영역의 C-말단 리신(Lys447)은 존재할 수도, 존재하지 않을 수도 있다. 본 발명에서 달리 명시되지 않는 한, 상기 Fc-영역 또는 불변 영역 중 아미노산 잔기들의 넘버링은 문헌[Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]에 개시된 바와 같은 EU 넘버링 시스템(또한 EU 색인이라 칭함)에 따른다.
"플루오레세인", 간단히 "FLUO"란 용어는 6-하이드록시-9-(2-카복시페닐)-(3H)-잔텐-3-온, 한편으로 2-(6-하이드록시-3-옥소-(3H)-잔텐-9-일)-벤조산을 나타낸다. 플루오레세인은 또한 레소르시놀프탈레인, C.I. 45350, 용매 옐로우 94, D 및 C 옐로우 7번, 안지오플루오르, 재팬 옐로우 201, 또는 솝 옐로우로서 공지되어 있다.
"플루오레세인화된 페이로드"란 용어는 플루오레세인 부분, 임의로 링커 및 페이로드를 포함하는 접합된 존재를 나타낸다. 상기 링커는 임의의 링커, 예를 들어 펩타이드 링커 또는 화학적 링커일 수 있다.
"프레임워크", 간단히 "FR"이란 용어는 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 아미노산 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인, 즉 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 이루어진다. 상응하게, 상기 HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기의 순서로 존재한다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"인공 시스테인 잔기"란 용어는, (모)항체 또는 (모)폴리펩타이드로 조작되었고, 티올 작용기(SH)를 가지고, 분자내 다이설파이드 가교로서 쌍을 이루지 않는 시스테인 아미노산 잔기를 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 상기 인공 시스테인 잔기는 예를 들어 글루타치온과 분자간 다이설파이드 가교로서 쌍을 이룰 수 있다.
"전장 항체"란 용어들은 본 발명에서 본 발명에 정의된 바와 같은 Fc-영역을 함유하는 중쇄를 갖거나 또는 고유 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 나타낸다. 고유 IgG 항체는 다이설파이드-결합되는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N-에서부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 영역(VH)(또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인이라 칭한다)에 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-에서부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 영역(VL)(또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인이라 칭한다)에 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄를 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 근거로, 카파(κ) 및 람다(λ)라 칭하는 2가지 유형 중 하나로 지정할 수 있다.
"전장 항체"는 VL 및 VH 도메인뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인(CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 항체이다. 상기 불변 도메인은 고유 서열 불변 도메인(예를 들어 인간 고유 서열 불변 도메인) 또는 그의 아미노산 서열 변이체일 수 있다. 상기 전장 항체는 항체의 Fc 불변 영역(고유 서열 Fc-영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc-영역)에 기인할 수 있는 생물 활성들을 지칭하는 하나 이상의 "효과기 기능"을 가질 수 있다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC); 식작용; 및 세포 표면 수용체, 예를 들어 B-세포 수용체 및 BCR의 하향 조절을 포함한다.
"합텐"이란 용어는 단백질과 같은 큰 담체에 부착시에만 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 소분자를 나타낸다. 예시적인 합텐은 아닐린, o-, m- 및 p-아미노벤조산, 퀴논, 히스타민-숙시닐-글리신(HSG), 하이드라라진, 할로탄, 인듐-DTPA, 플루오레세인, 비오틴, 디곡시제닌, 테오필린, 브로모데옥시유리딘 및 다이나이트로페놀이다. 하나의 실시태양에서 상기 합텐은 비오틴 또는 디곡시제닌 또는 테오필린 또는 플루오레세인 또는 브로모데옥시유리딘이다.
"합텐화된 페이로드"란 용어는 페이로드에 (공유적으로)접합된 합텐을 나타낸다. 활성화된 합텐 유도체를 상기와 같은 접합체의 형성을 위한 출발 물질로서 사용할 수 있다. 하나의 실시태양에서 상기 합텐은 링커를 통해 페이로드에 접합된다(하나의 실시태양에서 그의 3-하이드록시 기를 통해). 하나의 실시태양에서 상기 링커는 a) 하나 이상(하나의 실시태양에서 3 내지 6)의 메틸렌-카복시-메틸기(-CH2-C(O)-), 및/또는 b) 1 내지 10(하나의 실시태양에서 1 내지 5)의 아미노산 잔기(하나의 실시태양에서 글리신, 세린, 글루타메이트, β-알라닌, γ-아미노부티르산, ε-아미노카프로산 또는 리신), 및/또는 c) 화학식 NH2-[(CH2)nO]xCH2-CH2-COOH(여기에서 n은 2 또는 3이고 x는 1 내지 10이고, 하나의 실시태양에서 1 내지 7이다)을 갖는 하나 이상(하나의 실시태양에서 1 또는 2)의 화합물을 포함한다. 최종 요소는 화학식 NH-[(CH2)nO]xCH2-CH2-C(O)-의 링커(부분)를 (적어도 부분적으로)생성시킨다. 상기와 같은 화합물의 일례는 예를 들어 12-아미노-4,7,10-트라이옥사도데칸산(TEG(트라이에틸렌글리콜) 링커를 생성시킨다)이다. 하나의 실시태양에서 상기 링커는 추가로 말레이미도기를 포함한다. 상기 링커는 전하를 함유하고/하거나 수소 가교를 형성할 수 있기 때문에 안정화 및 용해 효과를 갖는다. 또한 상기 링커는 상기 합텐화된 페이로드에의 상기 항-합텐 항체의 결합을 입체적으로 촉진할 수 있다. 하나의 실시태양에서 상기 링커를 상기 페이로드(하나의 실시태양에서 폴리펩타이드)의 아미노산의 측쇄에 접합시킨다(예를 들어 아미노 또는 티올기를 통해 리신 또는 시스테인 측쇄에 접합시킨다). 하나의 실시태양에서 상기 링커를 상기 페이로드(하나의 실시태양에서 폴리펩타이드)의 아미노 말단 또는 카복시 말단에 접합시킨다. 상기 페이로드에 대한 상기 링커의 접합 위치는 전형적으로 상기 링커에의 접합이 상기 페이로드의 생물 활성에 영향을 미치지 않는 영역 중에 있도록 선택된다. 따라서 상기 링커의 부착 위치는 상기 페이로드의 성질 및 상기 페이로드의 생물 활성에 기여하는 관련된 구조 요소에 따라 변한다. 합텐이 부착된 페이로드의 생물 활성을 시험관내 분석에서 접합 전후에 시험할 수 있다.
"숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"이란 용어는 호환적으로 사용되며 상기와 같은 세포의 자손을 포함하여, 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하고, 이들은 계대의 수와 상관 없이 1차 형질전환된 세포 및 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 완전히 동일할 필요는 없으며, 돌연변이를 함유할 수도 있다. 원래 형질전환된 세포에 대해 선별되거나 선택된 바와 동일한 기능 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이 자손은 본 발명에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-암호화 서열을 사용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 것이다. 인간 항체의 상기 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화된 항체를 특별히 제외한다.
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메릭 항체를 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기에서 상기 HVR(예를 들어 CDR)의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 항체의 것들에 상응하며, 상기 FR의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화된 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "초가변 영역" 또는 "HVR"이란 용어는 서열이 초가변성("상보성 결정 영역" 또는 "CDR")이고/이거나 구조적으로 한정된 고리("초가변 고리)를 형성하고/하거나, 항원-접촉 잔기("항원 접촉부")를 함유하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역들을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR; VH 중 3개(H1, H2, H3) 및 VL 중 3개(L1, L2, L3)를 포함한다.
본 발명에서 HVR은
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에 존재하는 초가변 고리들(문헌[Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917]);
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에 존재하는 CDR(문헌[Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242]);
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에 존재하는 항원 접촉부(문헌[MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)]); 및
(d)(a), (b) 및/또는 (c)의 조합, 예를 들어 HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3).
"개체" 또는 "피실험자"는 포유동물이다. 포유동물은 비제한적으로 가축(예를 들어 소, 양, 개, 고양이 및 말), 영장류(예를 들어 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 개체 또는 피실험자는 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 일부 실시태양에서, 항체를 예를 들어 전기영동(예를 들어 SDS-PAGE, 등전점 전기영동(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되는 바와 같이 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제시킨다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 리뷰를 위해서, 예를 들어 문헌[Flatman, S. et al., J. Chrom. B 848(2007) 79-87]을 참조하시오.
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은, 통상적으로 핵산 분자를 함유하지만 상기 핵산 분자가 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재하는 세포 중에 함유된 핵산 분자를 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "단클론 항체"란 용어는 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 획득되는 항체를 지칭한다, 즉 상기 집단을 포함하는 개별적인 항체들은 동일하고/하거나, 상기 단클론 항체의 생성 중 발생할 수 있는 가능한 변이체(상기와 같은 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다)를 제외하고 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 상기 항원상의 단일 결정인자에 대한 것이다. 따라서, "단클론"이라는 수식어구는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 획득된다는 항체의 특징을 가리키며, 임의의 특정한 방법에 의한 상기 항체의 생성을 요구하는 것으로서 해석해서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단클론 항체를 다양한 기법들, 예를 들어 비제한적으로 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 상기 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 부분을 함유하는 트랜스제닉 동물을 사용하는 방법에 의해 제조할 수 있으며, 상기와 같은 방법 및 단클론 항체의 다른 예시적인 제조 방법들은 본 발명에 개시되어 있다.
"단일특이성 항체"란 용어는, 각각의 결합 부위가 동일한 결합 특이성을 갖는, 즉 동일한 항원 또는 합텐에 결합하는 하나 이상의 상기 결합 부위를 갖는 항체를 나타낸다.
"네이키드 항체"는 이종 부분(예를 들어 세포독성 부분) 또는 방사성표지에 접합되지 않는 항체를 지칭한다. 상기 네이키드 항체는 약학 제형 중에 존재할 수도 있다.
"패키지 삽입물"이란 용어는 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 용량, 투여, 복합 요법, 금기 및/또는 경고에 관한 정보를 함유하는 상기 치료 제품의 상업적인 패키지 중에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하는데 사용된다.
"페이로드"란 용어는 합텐에 접합될 수 있는 임의의 분자 또는 분자들의 조합을 나타낸다. "페이로드"란 용어는 또한 세포 또는 조직에 전달되고/되거나 국소화시키기 원하는 생물 활성을 갖는 부분을 나타낸다. 페이로드는 비제한적으로 표지, 화학요법제, 혈관형성 억제제, 세포독소(예를 들어 슈도모나스 외독소, 리신, 아브린, 디프테리아 독소 등), 사이토킨, 전구약물, 효소, 성장 인자, 전사 인자, 약물, 방사성핵종, 리간드, 항체 또는 그의 단편, 리포솜, 나노입자, 바이러스 입자, 사이토킨 등을 포함한다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물을 지칭한다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 사이클로포스파미드(사이톡산(CYTOXAN)(상표)); 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메튜레도파, 및 유레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트라이에틸렌멜라민, 트라이에틸렌포스포아미드, 트라이에틸렌티오포스포아미드 및 트라이메틸로멜라민; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라머스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 펜에스테린, 프레드니머스틴, 트로포스파미드, 유라실 머스타드; 니트로소유레아, 예를 들어 카머스틴, 클로로조토신, 포테머스틴, 로머스틴, 니머스틴, 라니머스틴; 항생제, 예를 들어 아클라시노마이신, 액티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-다이아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 펩플로마이신, 포리피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 대사길항물질, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로유라실(5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트라이메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모퓨어, 시타라빈, 다이데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록슈리딘, 5-FU; 안드로젠, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레뷸린산; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 다이아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 하이드록시유레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK(등록상표); 라족산; 시조피란; 스피로제르마늄; 테누아존산; 트라이아지쿠온; 2,2',2'-트라이클로로트라이에틸아민; 유레탄; 빈데신; 다카바진; 만노머스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁산, 예를 들어 패클리탁셀(탁솔(TAXOL)(등록상표), 브리스톨-마이어스 스큅 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 미국 뉴저지주 프린스톤 소재) 및 도세탁셀(탁소테레(TAXOTERE)(등록상표), 롱-푸랑 로라(Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 안토니 소재); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미토잔트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-II; 35 국소이성화효소 억제제 RFS 2000; 다이플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기 중 어느 하나의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한 종양상의 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예를 들어 항-에스트로젠, 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제성 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트라이옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(파레스톤); 및 항-안드로젠, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 바이칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린; 및 상기 중 어느 하나의 약학적으로 허용 가능한 염, 산 또는 유도체가 상기 정의에 포함된다.
"혈관형성 억제제"는 혈관의 발생을 어느 정도 차단하거나 방해하는 화합물을 지칭한다. 상기 혈관형성 억제제는 예를 들어 혈관형성의 촉진에 관련된 성장 인자 또는 성장 인자 수용체에 결합하는 소분자 또는 항체일 수 있다. 상기 혈관형성 억제인자는 하나의 실시태양에서 혈관 내피 성장인자(VEGF)에 결합하는 항체이다.
"사이토킨"이란 용어는 세포간 매개체로서 또 다른 세포상에서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출된 단백질에 대한 일반 용어이다. 상기와 같은 사이토킨의 예는 림포킨, 모노킨, 및 전통적인 폴리펩타이드 호르몬이다. 상기 사이토킨 가운에 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 타이록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예를 들어 여포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체 호르몬(LH); 간 성장인자; 섬유아세포 성장인자; 프로락틴; 태반 락토젠; 종양 괴사 인자-a 및 -P; 뮬러리안-억제 물질; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩타이드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장인자, 예를 들어 NGF-p; 혈소판 성장인자; 형질전환 성장 인자(TGF), 예를 들어 TGF-a 및 TGF-p; 인슐린-유사 성장인자-I 및 -II; 에리쓰로포이에틴(EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예를 들어 인터페론-a, -P 및 -y; 콜로니 자극 인자(CSF), 예를 들어 대식세포-CSF(M-CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(GCSF); 인터류킨(IL), 예를 들어 IL-I, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-IO, IL-II, IL-12; 종양 괴사 인자, 예를 들어 TNF-α 또는 TNF-P; 및 다른 폴리펩타이드 인자, 예를 들어 LIF 및 키트 리간드(KL)가 포함된다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, 사이토킨이라는 용어는 천연 공급원으로부터 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 고유 서열 사이토킨의 생물 활성 균등물을 포함한다.
"fMLP"란 용어는 N-폼일메티오닌, 류신 및 페닐알라닌으로 이루어진 트라이펩타이드를 나타낸다. 하나의 실시태양에서 상기 효과기 부분은 fMLP 또는 그의 유도체이다.
"전구약물"이란 용어는 모 약물에 비해 종양 세포에 대해 덜 세포독성이고, 보다 활성인 모 형태로 효소적으로 활성화되거나 전환될 수 있는 약학적으로 활성인 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 지칭한다. 예를 들어 문헌[Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, Vol. 14, 615th Meeting Belfast (1986) pp. 375-382] 및 문헌[Stella, et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt, et al., (eds.), pp. 247-267, Humana Press (1985)]을 참조하시오. 효과기 부분으로서 사용될 수 있는 전구약물은 비제한적으로 보다 활성인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 포스페이트-함유 전구약물, 티오포스페이트-함유 전구약물, 설페이트-함유 전구약물, 펩타이드-함유 전구약물, D-아미노산-변형된 전구약물, 글리코실화된 전구약물, b-락탐-함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 전구약물, 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 다른 5-플루오로유리딘 전구약물을 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 전구약물 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예는 비제한적으로 상술한 화학요법제들을 포함한다.
"세포독소"란 용어는 세포 기능을 억제하거나 방지하고/하거나 세포사 또는 세포 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 세포독소는 비제한적으로 방사성 동위원소(예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물(예를 들어 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 끼어들기 약물), 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예를 들어 핵산분해 효소; 항생제; 독소, 예를 들어 소분자 독소 또는 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소(그의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 본 발명에 개시되는 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함한다.
기준 폴리펩타이드 서열에 관한 "아미노산 서열 일치성 퍼센트(%)"는, 필요한 경우 최대의 서열 일치성 퍼센트를 성취하기 위해서, 및 상기 서열 일치성의 부분으로서 어떠한 보존적인 치환도 고려하지 않고, 서열과 도입 틈을 정렬시킨 후에, 기준 폴리펩타이드 서열 중의 아미노산 잔기들과 일치하는 후보 서열 중의 아미노산 잔기들의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 일치성 퍼센트를 측정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식들로, 예를 들어 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALGN 또는 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 성취될 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 서열들을 정렬시키기에 적합한 매개변수들, 예를 들어 비교하는 서열들의 전체길이에 대해 최대의 정렬을 성취하기 위해 필요한 임의의 연산을 결정할 수 있다. 그러나, 본 발명의 목적을 위해서, 아미노산 서열 일치성%를 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성시킨다. 상기 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 저술되었으며, 소스 암호는 미국 저작권 관청(미국 워싱톤 D.C. 20559 소재)에 사용자 문서와 함께 제출되었다(이때 상기 코드는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다). 상기 ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 제넨테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 입수할 수 있거나, 또는 상기 소스 암호로부터 편집될 수 있다. 상기 ALIGN-2 프로그램을, 디지털 UNIX V4.0D를 포함하여, UNIX 실행 시스템상에서 사용하기 위해 편집해야 한다. 모든 서열 비교 매개변수들은 상기 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되며 변하지 않는다.
ALIGN-2를 아미노산 서열 비교를 위해 사용하는 경우에, 주어진 아미노산 서열 A의 주어진 아미노산 서열 B에의, 상기 B와의, 또는 상기 B에 대한 아미노산 서열 일치성%(이는 한편으로 주어진 아미노산 서열 B에, 상기 B와, 또는 상기 B에 대해 일정한 아미노산 서열 일치성%를 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있다)를 하기와 같이 계산한다:
100 x X/Y 분수
상기에서, X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2의 정렬에서 상기 프로그램에 의해 일치성 합치로서 채점되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B 중 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, A 대 B의 아미노산 서열 일치성%는 B 대 A의 아미노산 서열 일치성%와 동일하지 않음을 알 것이다. 달리 구체적으로 서술되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 아미노산 서열 일치성% 값들은 상기 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 단락에 개시된 바와 같이 획득된다.
"약학 제형"이란 용어는 제형 중에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 유효하도록 하는 형태로 존재하고 상기 제형이 투여되는 환자에게 허용 가능하지 않게 독성인 추가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약학적으로 허용 가능한 담체"는 환자에게 무독성인, 활성 성분 이외의 약학 제형 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 비제한적으로 완충제, 부형제, 안정제, 또는 보존제를 포함한다.
"폴리펩타이드"는 천연으로 생성되든 합성으로 생성되든, 펩타이드 결합에 의해 결합된 아미노산들로 이루어진 중합체이다. 약 20개 미만의 아미노산 잔기의 폴리펩타이드를 "펩타이드"라 칭할 수 있는 반면, 2개 이상의 폴리펩타이드로 이루어지거나 또는 100개 초과의 아미노산 잔기의 하나의 폴리펩타이드를 포함하는 분자를 "단백질"이라 칭할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 비-아미노산 성분, 예를 들어 탄수화물 기, 금속 이온, 또는 카복실산 에스터를 포함할 수 있다. 상기 비-아미노산 성분은 상기 폴리펩타이드를 발현하는 세포에 의해 첨가될 수 있으며, 세포의 유형에 따라 다양할 수 있다. 폴리펩타이드는 그의 아미노산 주쇄 구조 또는 그를 암호화하는 핵산에 관하여 본 발명에서 정의된다. 탄수화물 기와 같은 첨가는 일반적으로 명시되지 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
모든 폴리펩타이드 서열은 일반적으로 허용되는 규약에 따라 기재되며, 이때 알파-N-말단 아미노산 잔기는 좌측에 있고 알파-C-말단 아미노산 잔기는 우측에 있다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, "N-말단"이란 용어는 폴리펩타이드 중의 아미노산의 유리 알파-아미노기를 지칭하며, "C-말단"이란 용어는 폴리펩타이드 중의 아미노산의 유리 a-카복실산 말단을 지칭한다. 하나의 기로 N-종결된 폴리펩타이드는 상기 N-말단 아미노산 잔기의 알파-아미노 질소상에 하나의 기를 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 하나의 기로 N-종결된 아미노산은 알파-아미노 질소상에 하나의 기를 갖는 아미노산을 지칭한다.
접두사 "D", 예를 들어 D-Ala 또는 N-Me-D-Ile에 의해 달리 나타내거나 또는 소문자 포맷, 예를 들어 a, i, l(Ala, Ile, Leu의 D 버전)로 기재되지 않는 한, 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 개시된 폴리펩타이드 중의 아미노산 및 아미노아실 잔기의 알파-탄소의 입체화학은 천연 또는 "L" 배열이다. 칸-잉골드-프레로그(Cahn-Ingold-Prelog) "R" 및 "S" 명칭을 사용하여 상기 폴리펩타이드의 N-말단에서 몇몇 아실 치환체의 키랄 중심의 입체화학을 명시한다. 명칭 "R,S"는 2개의 거울상 이성질체 형태의 라세미 혼합물을 가리키고자 한다. 이러한 명몇법은 문헌[Cahn, R.S., et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 5 (1966) 385-415]에 개시된 바를 따른다.
"단쇄 Fv", 간단히 "scFv"란 용어는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 나타내며, 여기에서 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄 중에 존재한다. 하나의 실시태양에서, 상기 Fv 폴리펩타이드는 상기 scFv가 항원 결합에 목적하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 리뷰를 위해서, 문헌[Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore (Eds), Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조하시오.
"테오필린", 간단히 "THEO"란 용어는 1,3-다이메틸-7H-퓨린-2,6-다이온을 나타낸다. 테오필린은 또한 다이메틸잔틴으로서 공지된다.
"테오필린화된 페이로드"란 용어는 테오필린 부분, 임의로 링커 및 페이로드를 포함하는 접합된 존재를 나타낸다. 상기 링커는 임의의 링커, 예를 들어 펩타이드 링커 또는 화학적 링커일 수 있다.
"치료"(및 "치료하다" 및 "치료하는"과 같은 그의 문법상 어미변화)는 치료 중인 개체의 자연적인 과정을 변경시키고자 하는 임상적 중재를 지칭하며, 예방을 위해서 또는 임상적 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 비제한적으로 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 상기 질병의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 진정 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체를 사용하여 질병의 발생을 지연시키거나 또는 질병의 진행을 늦춘다.
"x-가", 예를 들어 "1가" 또는 "2가" 또는 "3가" 또는 "4가"란 용어는 항체 분자 중의 명시된 결합 부위의 수, 즉 "x"의 존재를 나타낸다. 이와 같이, "2가", "4가" 및 "6가"란 용어는 항체 분자 중에 각각 2개의 결합 부위, 4개의 결합 부위, 및 6개의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체는 적어도 "2가"이며 "3가" 또는 "다가"(예를 들어 "4가" 또는 "6가")일 수 있다. 하나의 실시태양에서 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체는 2가, 3가 또는 4가이다. 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 2가이다. 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 3가이다. 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 4가이다.
몇몇 태양 및 실시태양에서 본 발명에 보고된 바와 같은 항체는 2개 이상의 결합 부위를 가지며 이중특이성이다. 즉, 상기 항체는 2개 초과의 결합 부위가 존재하는(즉 상기 항체가 3가 또는 다가인) 경우에조차 이중특이성일 수 있다. 이중특이성 항체란 용어는 예를 들어 다가 단쇄 항체, 다이아바디 및 트라이아바디뿐만 아니라, 추가의 항원-결합 부위(예를 들어 단쇄 Fv, VH 도메인 및/또는 VL 도메인, Fab 또는 (Fab)2)가 하나 이상의 펩타이드-링커를 통해 결합된 전장 항체의 불변 도메인 구조를 갖는 항체를 포함한다. 상기 항체는 단일 종으로부터의 전장이거나 또는 키메라화 또는 인간화될 수 있다. 2개 초과의 항원 결합 부위를 갖는 항체의 경우, 일부 결합 부위는, 상기 단백질이 2개의 상이한 항원에 대한 결합 부위를 갖는 한 동일할 수 있다. 즉, 제1 결합 부위가 합텐에 특이적인 반면, 제2 결합 부위는 비-합텐 항원에 특이적이며, 이와 역도 같다.
"가변 영역"이란 용어는 항원에 대한 항체의 결합과 관련된 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 나타낸다. 고유 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조들을 가지고, 이때 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다(예를 들어 문헌[Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91]을 참조하시오). 단일의 VH 또는 VL 도메인이면 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱 또한, 특정 항원에 결합하는 항체를, 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별하기 위해 상기 항원에 결합하는 상기 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리시킬 수 있다(예를 들어 문헌[Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887]; 문헌[Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628]을 참조하시오).
본 발명에 사용된 바와 같은 "벡터"란 용어는 결합된 또 다른 핵산을 전파할 수 있는 핵산 분자를 나타낸다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조물로서 벡터뿐만 아니라 상기 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈내에 통합된 벡터를 포함한다. 몇몇 벡터는 상기 벡터가 작동적으로 연결되는 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 상기와 같은 벡터를 본 발명에서 "발현 벡터"라 칭한다.
II. 본 발명에 보고된 바와 같은 접합체
본 발명에서 합텐에 대한 제1 결합 특이성 및 혈액뇌장벽 수용체(BBBR)에 대한 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이성 항체인 혈액뇌장벽-셔틀 모듈(BBB-셔틀 모듈)을 보고한다. 상기와 같은 BBB-셔틀 모듈은 혈액뇌장벽상의 트랜스사이토시스 가능한 세포 표면 표적(예를 들어 TfR, LRP 또는 다른 표적들, BBBR)을 인식하고 동시에 합텐화된 페이로드에 결합한다.
결합가, 항체 포맷, BBBR 결합 친화성에 관한 추가의 요구들을 충족시킬 필요는 없는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체-기재 셔틀 모듈은 합텐화된 페이로드의 트랜스사이토시스를 매개하기 위해서 상기 혈액뇌장벽의 내피 세포로부터 방출될 것이 요구되지 않음이 또한 밝혀졌다. 대신에, 상기 BBBR에 결합시 상기 이중특이성 항체-기재 셔틀 모듈에 의해 복합체화되고/상기 모듈에 결합되는 합텐화된 페이로드가 상기 BBB 세포내에서, 즉 세포내 소포계에서 상기 이중특이성 항체-기재 셔틀 모듈로부터 방출되고, 상기 셔틀 모듈로부터 분리되고 후속으로 상기 BBB 세포로부터 뇌로 엑소사이토시스되어 상기 이중특이성 항체를 상기 BBB 세포에 남긴다.
본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체-기재 셔틀 모듈은 결합 특이성 결합가뿐만 아니라 BBBR 결합 특이성의 친화성에 관하여 매우 가변적이다. 동시에 상기 모듈은 상기 셔틀 모듈로부터 페이로드 방출을 가능하게 한다.
비-공유 복합체
본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체는 치료학적 또는 진단학적 페이로드에 대한 합텐화된 페이로드 전달 비히클로서 사용된다. 상기 치료학적 또는 진단학적 페이로드는 상기 합텐과 접합되고 따라서 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체의 합텐-결합 부위에 의해 복합체화된다. 상기 복합체는 한정되며 안정하고 상기 합텐화된 페이로드를 표적 세포 또는 조직으로 특이적으로 전달한다. 상기 합텐화된 치료학적 또는 진단학적 페이로드는 상기 이중특이성 항체에 의해 비-공유 방식으로 복합체화되므로, 상기 합텐화된 페이로드는 한편으로 순환하는 동안 그의 전달 비히클(=이중특이성 항체)에 결합되지만, 다른 한편으로 내면화 또는 트랜스사이토시스 후 효율적으로 방출될 수 있다. 상기 합텐과의 접합을 상기 치료학적 또는 진단학적 페이로드의 활성을 방해하지 않으면서 수행할 수 있다. 상기 이중특이성 항체는 생소한 공유 첨가를 함유하지 않으며 따라서 임의의 면역원성 위험을 제거한다. 따라서 상기 간단한 복합체화 과정을 단지 하나의 항-합텐 항체; 예를 들어 펩타이드, 단백질, 소분자, 영상화 시약 및 핵산과 함께 임의의 페이로드에 사용할 수 있다. 합텐화된 진단학적 또는 치료학적 페이로드와, 합텐-특이성 결합 부위를 함유하는 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체의 복합체는 양성 생물물리학적 양상 및 개선된 PK 매개변수를 상기 진단학적 또는 치료학적 페이로드, 예를 들어 진단학적 또는 치료학적 폴리펩타이드 또는 소분자에 부여한다. 더욱 또한, 상기와 같은 복합체는 상기 전달 로드를, 상기 이중특이성 항체의 제2 결합 특이성에 의해 인식되는 항원을 나타내는 세포 또는 조직에 표적화할 수 있다.
핵산의 표적 조직 및 표적 세포에의, 및 상기 조직 및 표적 세포 내로의 특이적인 표적화 및 전달이 주된 임무이다. 치료학적 용도를 위해서, 동종의 한정된 존재가 바람직하다. 항체 또는 항체-단편-매개된 핵산 전달이 일부 예에서 입증되었다(예를 들어 문헌[Lieberman et al., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 709]). 특히 중요한 것은 이중 가닥 RNA 분자(dsRNA)의 표적 조직 및 표적 세포에의 및 상기 조직 및 세포내로의 특이적인 표적화 및 전달이다. 이중-가닥 리보핵산(dsRNA) 분자는 RNA 간섭(RNAi)으로서 공지된 고도로 보존된 조절 기전에서 유전자 발현을 차단하는 것으로 나타났다. dsRNA를 양호한 안정성으로 항체에 접합시켜 특이적인 표적화를 보장하고 전신적인 비-특이적 방출을 피할 수 있다. 다른 한편으로, 상기 dsRNA를 세포내에 진입할 수 있도록 표적 세포에서 또는 상기 세포내에서 방출되게 해야 한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체를 핵산(DNA 또는 RNA)의 전달 비히클로서 사용할 수 있다. 따라서 본 발명은 표적화된 유전자 요법, 표적화된 RNAi 및 표적화된 LNA 전달을 위한 특이적인 전달 플랫폼을 제공한다.
하나의 실시태양에서 본 발명에 보고된 바와 같은 합텐화된 핵산 및 이중특이성 항체의 복합체를 핵산의 세포 또는 조직으로의 특이적인 표적화된 전달에 사용한다. 상기 핵산은 합텐화될 뿐만 아니라 항체에 의해 복합체화됨에도 불구하고 그의 기능성을 유지한다. 또한, 상기 이중특이성 항체의 혈액뇌장벽 수용체 결합 부위는 복합체화된 합텐화된 핵산의 존재하에서 그의 결합 특이성 및 친화성을 유지한다. 상기 합텐화된 핵산과 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체와의 복합체를 사용하여 상기 핵산을 상기 혈액뇌장벽 수용체를 발현하는 세포에 특이적으로 표적화할 수 있다. 이에 의해, 상기 혈액뇌장벽 수용체에 의해 인식되는 세포 또는 트랜스사이토시스 후의 뇌는 상기 핵산에 의해 선택적으로 다루어지고, 따라서 상기 핵산에 의해 야기된 활성(예를 들어 RNAi 또는 핵산 매개된 세포독성)이 상기 혈액뇌장벽 수용체 발현 세포 또는 뇌에서 증대된다. 하나의 실시태양에서, 이들 활성은 표적화된 엔도솜 조절제를 추가로 적용함으로써 더욱 증대된다. 상기 핵산은 항원 발현 세포로 특이적으로 전달될 뿐만 아니라 상기 표적 세포내로 내면화된다. 상기 합텐화된 핵산은 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체에 비-공유 방식으로 커플링되므로, 상기 페이로드(즉 핵산)가 내면화 또는 트랜스사이토시스 후 방출될 수 있다.
하나의 바람직한 실시태양에서 상기 핵산은 DNA이다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 핵산은 dsRNA이다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 핵산은 LNA이다.
치료학적 또는 진단학적 핵산은 그의 활성(예를 들어 siRNA에 의한 mRNA의 특이적 파괴)을 매개하기 위해서, 그의 표적 세포의 세포질에 접근해야 한다. 특이적인 핵산 활성의 전달에 중요한 한 가지 인자는 상기 분자가 세포로 전달될 뿐만 아니라, 충분한 양의 상기 핵산이 상기 세포의 세포질내로 전달되어야 한다는 것이다. 이를 위해서, 상기 분자는 적어도 한번은 생물학적 막을 침투해야 한다. 생물제제는 막을 쉽게 관통하지 못하기 때문에, 이 과정은 핵산 활성의 유효 전달을 위해 극복되어야 하는 장애이다. 이러한 장애를 극복하기 위한 수단은 막 침투, 막을 가로지르는 단백질 이동, 또는 막 파괴 과정을 수반할 수 있는 엔도솜-이탈 또는 소포-이탈 기전일 수 있다.
하나의 실시태양에서 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체와 합텐화된 핵산과의 비-공유 복합체를, 엔도솜 기능성의 조절제 또는 엔도솜 이탈/파괴 모듈이 결합되는 핵산 전달 모듈로서 사용한다. 하나의 실시태양에서 상기 엔도솜 이탈 모듈은 펩타이드를 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 엔도솜 이탈 모듈은 동적인 다중 접합체(DPC)를 포함한다. DPC는 세포 결합 및 내면화시 siRNA의 엔도솜 이탈을 야기하는 화학적 존재이다(문헌[Rozema, D.B., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(2007) 12982-12987]). 상기와 같은 DPC는 PEG 분자가 이중작용성 말레아메이트 결합을 사용하여 가역적으로 부착된 PBAVE(부틸-아미노비닐 에테르의 중합체) 스캐폴드로 구성된다. 후자의 경우, 카복실화된 다이메틸 말레산(CDM)을 적용할 수 있다. 상기 PEG 단위를 사용하여 상기 PBAVE의 엔도솜용해성 양전하를 차폐한다. 또한 상기 PBAVE에 siRNA 화물을 결합시킨다(예를 들어 가역적인 다이설파이드 결합을 통해). 상기 생성되는 전달 비히클을, siRNA, 차폐 기(및 추가적인 표적화 리간드)가 중합체에 가역적인 방식으로 접합되기 때문에 siRNA 동적인 다중 접합체라 칭한다. siRNA의 세포질 전달을 야기하는 상기와 같은 DPC의 엔도솜용해성 성질은 그의 화학적 환경에 의해 유도된다. 성숙화 엔도라이솜내 pH의 감소는 CDM-PEG의 방출을 유도하여, PBAVE의 양전하를 노출시키고 차례로 엔도솜용해를 매개한다.
따라서, 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 합텐화된 페이로드 전달 시스템의 특이적인 표적화 성질을 DPC의 엔도솜분해 특성과 결합시킨다.
하나의 실시태양에서 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체 및 합텐화된 핵산의 비-공유 복합체를 영상화 분석에 사용한다. 본 실시태양에서, 상기 핵산을 합텐 및 검출성 표지에 동시에 접합시킨다. 이에 의해 현미경검사 또는 다른 영상화 기술에 의해, 혈액뇌장벽 수용체 발현 세포에 표적화된 핵산의 국소화를 가시화할 수 있다. 하나의 실시태양에서 상기 검출성 표지는 형광 표지이다. 하나의 실시태양에서 상기 핵산의 국소화가 세포에서, 즉 시험관내에서 가시화된다. 또 다른 실시태양에서 상기 핵산의 국소화가 생체내에서 가시화된다.
화학적 및 물리적 성질, 예를 들어 분자량 및 2차 변형을 포함한 도메인 구조로 인해, 항체의 하류 과정이 매우 복잡하다. 예를 들어, 제형화된 약물뿐만 아니라 하류 과정의 중간체(DSP)에 대해서 경제적인 취급 및 적용 보관을 위해 적은 부피를 성취하기 위해서 농축된 용액이 요구된다.
그러나 상기 항체의 증가하는 농도에 따라, 응집체를 형성하는 경향이 관찰될 수 있다. 이들 응집된 항체는 단리된 항체에 비해 손상된 특성을 갖는다. 본 발명에 보고된 바와 같은 항체의 응집을, 단일특이성 2가 모항체에 연결된 단쇄 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인간의 다이설파이드 결합의 도입에 의해 감소시킬 수 있다. 이러한 개선된 안정성은 생산 과정 동안 유용할 뿐만 아니라 항체의 보관에도 유용하다. 하나의 실시태양에서 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체 중에 포함된 단쇄 항체의 가변 도메인들간의 다이설파이드 결합은 각각의 단쇄 항체에 대해 하기 중에서 독립적으로 선택된다:
i) 44번 위치의 중쇄 가변 도메인 대 100번 위치의 경쇄 가변 도메인,
ii) 105번 위치의 중쇄 가변 도메인 대 43번 위치의 경쇄 가변 도메인, 또는
iii) 101번 위치의 중쇄 가변 도메인 대 100번 위치의 경쇄 가변 도메인.
하나의 실시태양에서 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체 중에 포함된 단쇄 항체의 가변 도메인들간의 다이설파이드 결합은 44번 위치의 중쇄 가변 도메인과 100번 위치의 경쇄 가변 도메인 사이이다.
하나의 실시태양에서 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체 중에 포함된 단쇄 항체의 가변 도메인들간의 다이설파이드 결합은 105번 위치의 중쇄 가변 도메인과 43번 위치의 경쇄 가변 도메인 사이이다.
공유 접합체
합텐화된 페이로드의 항-합텐 항체에의 공유 커플링에 의해 상기 페이로드의 안정화 및 PK-성질 개선이 성취될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
합텐화된 페이로드 및 항-합텐 항체의 공유 접합체는 상기 폴리펩타이드에 양성 생물물리학적 양상 및 개선된 PK 성질을 부여할 수 있다. 더욱 또한, 이중특이성 항체가 사용되는 경우에, 상기 접합체를 사용하여 상기 폴리펩타이드를, 상기 이중특이성 항체의 제2 결합 특이성에 의해 인식되는 항원을 나타내는 세포에 표적화할 수 있다. 상기와 같은 접합체는 하나의 항-합텐 결합 특이성 및 하나의 (비-합텐) 항원 결합 특이성으로 구성된다. 항체 대 합텐화된 페이로드의 화학량론적 비는 상기 이중특이성 항체의 포맷에 따라 변하며 1:1, 1:2, 2:1, 2:2, 2:4 및 4:2(항체:합텐-폴리펩타이드)일 수 있다.
상기 페이로드는 합텐에 접합될뿐만 아니라 항체에 접합됨에도 불구하고, 양호한 생물 활성을 유지하는 것이 바람직하다. 또한, (이중특이성 표적 모듈의 경우에) 상기 이중특이성 항체의 세포 표면 표적 결합 부위가 상기 공유 접합된 합텐화된 페이로드의 존재하에서 그의 결합 특이성 및 친화성을 유지하는 것이 바람직하다.
상기 합텐화된 페이로드 중의 반응기는 임의의 반응기, 예를 들어 말레이미드, 예를 들어 N-에틸 말레이미드(NEM), 요오도아세트아미드, 피리딜 다이설파이드, 또는 다른 반응성 접합 짝일 수 있다(예를 들어 문헌[Haugland, 2003, Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.]; 문헌[Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2]; 문헌[Garman, 1997, Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press, London]; 문헌[Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2]; 문헌[Hermanson, G. in Bioconjugate Techniques (1996)Academic Press, San Diego, pp. 40-55 and 643-671]을 참조하시오).
상기 항체상의 반응기는 선택적으로, 즉 특이적으로 생성되는 위치일 수 있는 것들로 제한된다. 따라서, 상기 반응기는 아미노산 잔기 시스테인, 세린, 아스파라진, 글루타민, 타이로신, 리신, 아르기닌, 아스파트산 및 글루탐산의 측쇄 기로 제한된다.
상기 항체와 상기 합텐화된 페이로드간의 공유 접합체의 형성을 위해서 상기 두 화합물을 모두 반응기의 도입에 의해 변형시켜야 한다. 상기 항체에 의한 상기 합텐화된 페이로드의 결합시 2개의 반응기를 가깝게 하여 공유 결합이 형성되게 한다. 하나의 실시태양에서 상기 변형은 상기 각각의 화합물 중의 티올 작용기의 도입이다. 하나의 실시태양에서 상기 티올 화합물은 시스테인 잔기이다.
상기 작용기를 포함하는 위치는 2개의 요건을 동시에 충족시켜야 한다: (i) 커플링 위치는 지시된 커플링에 합텐 위치결정 효과를 사용하기 위해서 항체의 항-합텐 결합 특이성의 결합 영역에 근접해야 한다, 및 (ii) 돌연변이 및 커플링 위치는 합텐 결합이 단독으로 영향을 받지 않는 방식으로 위치해야 한다. 적합한 위치를 발견하기 위한 이들 요건은, 요건 (i)가 결합 부위에 가까운 위치에 의해 가장 잘 제공되는 반면, 요건 (ii)는 상기 결합 부위에서 먼 위치에 의해 가장 안전하게 성취되기 때문에, 사실상 서로 '상충된다'.
이러한 실질적으로 배타적인 요건에도 불구하고, 합텐 위치결정에 영향을 미치지 않으면서 돌연변이될 수 있고, 그럼에도 불구하고 지시된 공유 커플링을 동시에 허용하는 위치들이 확인되었다.
첫 번째 위치는 중쇄 가변 도메인의 카밧 넘버링에 따른, 각각 VH52b번 위치 또는 VH53번 위치에 위치한다. 항체가 짧은 VH CDR2(간헐적인 잔기, 예를 들어 52a, 52c, 52c 및 52d를 갖지 않는다)를 갖는 경우, 상기 위치는 53번이다(항체 중쇄 가변 도메인에 대해 카밧의 넘버링 설계 및 규칙에 따른 넘버링 및 정렬). 상기 항체가 잔기 52a 및 52b, 및 임의로 52c 및 52d 등으로서 추가의 잔기를 포함하는 긴 VH CDR2를 갖는 경우, 상기 위치는 52b번이다(항체 중쇄 가변 도메인에 대해 카밧의 넘버링 설계 및 규칙에 따른 넘버링 및 정렬).
상기 합텐화된 페이로드(비오틴화된 페이로드, 테오필린화된 페이로드, 디곡시제닌화된 페이로드 및 플루오레세인화된 페이로드로 이루어진 군 중에서 선택된 합텐화된 페이로드의 경우에)와 상기 항체의 중쇄 CDR2 중의 아미노산 잔기 간의 공유 결합의 형성을 위한 작용기를 포함하는 범용 링커로 유도체화시 상기 합텐화된 페이로드에 임의의 페이로드를 사용할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 범용 링커 중의 작용기의 위치는 상기 페이로드가 변화하는 경우 상기 항체의 중쇄 CDR2 중의 작용기의 위치 및 합성의 리-엔지니어링이 필요하지 않다는 이점을 갖는다.
상기 헬리카 아미노산 서열을, 상기 헬리카화된 페이로드와 상기 항체의 경쇄 CDR2 중의 시스테인 잔기 간의 공유 다이설파이드 결합의 형성을 위한 작용기를 포함하는 시스테인으로 유도체화시 상기 헬리카화된 페이로드에 임의의 페이로드를 사용할 수 있는 것으로 또한 밝혀졌다. 상기 헬리카 동기 아미노산 서열 중의 시스테인 잔기(티올 작용기)의 위치는 상기 페이로드가 변화하는 경우 상기 항체의 경쇄 CDR2 중의 시스테인 잔기의 위치 및 합성의 리-엔지니어링이 필요하지 않다는 이점을 갖는다.
두 번째 위치는 카밧 넘버링에 따른 VH28번 위치에 위치한다.
예를 들어, 항-디곡시제닌 항체 구조에서, 합텐은 소수성 잔기에 의해 형성된 심부 포켓 중에 결합된다. 형광 디곡시제닌-Cy5 접합체가 상기 결정학 연구에 사용되었으며, 여기에서 디곡시제닌과 Cy5 사이의 링커뿐만 아니라 형광단은 결정 중에 생성된 무질서 및 높은 가요성으로 인해 상기 구조에서 볼 수 없었다. 그러나, 상기 링커 및 Cy5는 중쇄의 CDR2의 방향을 향한 디곡시제닌의 O32에 부착된다. 카밧에 따른 52b번 위치 중의 아미노산 잔기의 Cα에 대한 디곡시제닌의 O32간의 거리는 약 10.5 Å이다.
상기 위치들은 "보편적인" 위치인 것으로, 즉 상기 위치를 각각 임의의 (항-합텐) 항체 또는 임의의 헬리카화된 페이로드에 적용할 수 있는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 매번 처음부터, 예를 들어 결정 구조를 제공하고 합텐-위치한 공유 커플링을 가능하게 하는 적합한 위치를 결정함으로써 새로운 공유 복합체를 생성시켜야 할 필요가 없다.
본 발명에 보고된 바와 같이 변형된 항체는 그의 모(즉 야생형) 항체 대응물의 합텐(항원) 결합 능력을 유지한다. 따라서, 상기 조작된 항체는 합텐(항원)에 결합할 수 있으며, 하나의 실시태양에서 특이적으로 결합할 수 있다.
"에 특이적으로 결합하는 결합 부위" 또는 "에 특이적으로 결합하는 항체"란 용어는 상기 결합 부위 또는 항체를 포함하는 분자가 특이적인 방식으로 추가의 분자와 복합체를 형성할 수 있음을 나타낸다. 상기 결합은 시험관내 분석에서, 예를 들어 플라스몬 공명 분석(비아코어, GE-헬쓰케어, 스웨덴 웁살라 소재)에서 검출될 수 있다. 상기 복합체 형성의 친화성은 ka(복합체를 형성하는 화합물의 결합 속도 상수), kD(해리 상수, 복합체의 해리), 및 KD(kD/ka)란 용어들에 의해 한정된다. 결합하는 또는 특이적으로 결합하는은 약 10-7M 이하의 결합 친화성(KD)을 의미한다.
시스테인-변형된 항체와, 합텐과 페이로드 간의 링커에 또는 상기 합텐 내에 또는 상기 페이로드 내에 시스테인 잔기를 갖는 시스테인-변형된 합텐화된 페이로드 사이의 공유 결합의 형성은, 상기 형성된 결합이 다이설파이드 결합인 경우 환원제 및/또는 산화제를 첨가할 필요 없이 상기 합텐화된 페이로드에 상기 항체의 결합시 발생하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상기 2개 화합물 사이의 다이설파이드 가교가 상기 비-공유 복합체의 형성시에 자발적으로 형성된다. 따라서, 본 발명에 보고된 바와 같은 공유 복합체의 형성 방법은 단순히 상기 두 화합물의 혼합을 요한다. 상기 다이설파이드 결합의 형성에 유일한 선행요건은 서로에 대한 상기 두 화합물의 적합한 배향이다.
각각 VH52b 및 VH53번 위치(카밧 넘버링 설계에 따른)의 아미노산 잔기의 Cys 잔기에 의한 치환은, 항-디곡시제닌 항체-VH52bC의 경우 서열번호 20 및 28에, 항-테오필린 항체-VH53C의 경우 서열번호 84 및 92에, 항-비오틴 항체-VH53C의 경우 서열번호 52 및 60에, 항-플루오레세인 항체-VH52bC의 경우 서열번호 108에, 및 항-브로모데옥시유리딘 항체-VH53C의 경우 서열번호 226에 나열된 중쇄 가변 영역 서열을 갖는 항체 유도체를 생성시켰다.
VH28번 위치(카밧 넘버링 설계에 따른)에서 중쇄 가변 도메인 아미노산 잔기의 Cys 잔기에 의한 치환은 각각 서열번호 116, 124, 132, 140, 148, 156 및 164에 나열된 중쇄 가변 영역 서열을 갖는 항체 유도체를 생성시켰다.
변형점으로서 확인된 추가의 위치는 카밧 넘버링에 따른 VH28번 위치이다.
카밧에 따른 VH28번 위치의 아미노산 잔기의 Cys에 의한 치환은, 항-디곡시제닌 항체-VH28C의 경우 서열번호 124 및 132에, 항-테오필린 항체-VH28C의 경우 서열번호 156 및 164에, 항-비오틴 항체-VH28C의 경우 서열번호 140 및 148에, 항-플루오레세인 항체-VH28C의 경우 서열번호 116에, 및 항-브로모데옥시유리딘 항체-VH28C의 경우 서열번호 227에 나열된 중쇄 가변 영역 서열을 갖는 항체 유도체를 생성시켰다.
ESI-MS 분석은 합텐화된 페이로드(페이로드 = 치료학적 펩타이드)의 공유 항체 접합이 비-복합체화된 항체 또는 비-복합체화된 펩타이드보다 더 큰 한정된 크기를 갖는 접합체를 생성시킴을 입증한다.
Figure pct00002
Figure pct00003
1) HC w N-말단 피로-글루탐산
2) HC w/o C-말단 Lys
3) HC w N -> D(데글리코실화로 인해 글리코실화 부위에서)
4) LC w N-말단 피로-글루탐산
상기 생체내 실험의 결과는 합텐- 및 TfR-결합 이중특이성 BBB-셔틀 비히클이 합텐화된 페이로드 항체에 결합하고 상기 BBB를 가로질러 상기 페이로드를 수송할 수 있음을 입증한다. 이들 실험 결과는 또한 상기 페이로드가 상기 셔틀 비히클로부터 방출되어 후속으로 뇌에서 그의 표적에 결합하고 상기 표적상에 축적될 수 있음을 입증한다.
항체 친화성
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 자체 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 복합체 중의 항체는 ≤　10 nM, ≤　1 nM, ≤　0.1 nM, ≤　0.01 nM, 또는 ≤　0.001 nM(예를 들어 약 10-8 M 이하, 예를 들어 약 10-8 M 내지 약 10-13 M, 예를 들어 약 10-9 M 내지 약 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 갖는다.
하나의 실시태양에서, Kd를 하기의 분석에 의해 개시되는 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원으로 수행되는 방사성 표지된 항원 결합 분석(RIA)에 의해 측정한다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화성을, 표지되지 않은 항원의 적정 시리즈의 존재하에서 최소 농도의 (125I)-표지된 항원으로 Fab를 평형화시키고, 이어서 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정한다(예를 들어 문헌[Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293(1999) 865-881]을 참조하시오). 상기 분석에 대한 조건들을 확립시키기 위해서, 마이크로티터(MICROTITER)(등록상표) 다중-웰 플레이트(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 나트륨 카보네이트(pH 9.6) 중의 5 ㎍/㎖의 포획 항-Fab 항체(카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅하고, 후속으로 실온(대략 23 ℃)에서 2 내지 5 시간 동안 PBS 중의 2%(w/v) 소 혈청 알부민으로 차단한다. 비-흡착성 플레이트(눙크(Nunc) #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM[125I]-항원을 관심 Fab의 일련의 희석물과 혼합한다(예를 들어 문헌[Presta, L.G. et al., Cancer Res. 57(1997) 4593-4599]에서 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치하게). 이어서 상기 관심 Fab를 밤새 배양한다; 그러나, 상기 배양을 평형에 도달하도록 보다 오랜 기간(예를 들어 약 65 시간) 동안 계속할 수도 있다. 그 후에, 상기 혼합물을 실온에서(예를 들어 1 시간 동안) 배양을 위해 포획 플레이트로 옮긴다. 이어서 상기 용액을 제거하고 상기 플레이트를 PBS 중의 0.1% 폴리솔베이트 20(트윈-20(등록상표))으로 8회 세척한다. 상기 플레이트가 건조되었을 때, 150 ㎕/웰의 섬광제(마이크로신트(MICROSCINT)-20(상표); 패카드(Packard))를 가하고, 상기 플레이트를 10 분 동안 탑카운트(TOPCOUNT)(상표) 감마 카운터(패카드)상에서 카운트한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 경쟁 결합 분석에 사용하기 위해 선택한다.
또 다른 실시태양에 따라, Kd를, 비아코어(등록상표)-2000 또는 비아코어(등록상표)-3000(비아코어 인코포레이티드, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용하는 표면 플라스몬 공명 분석을 25 ℃에서 고정화된 항원 CM5 칩과 함께 약 10 응답 단위(RU)로 측정한다. 간단히, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 비아코어 인코포레이티드)을 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 4.8)로 5 ㎍/㎖(약 0.2 μM)로 희석한 후에 5 ㎕/분의 유량으로 주입하여 대략 10 응답 단위(RU)의 결합된 단백질을 성취한다. 상기 항원의 주입에 이어서, 1 M 에탄올아민을 주입하여 반응하지 않은 기를 차단한다. 동역학적 측정을 위해서, Fab의 2배 연속 희석물(0.78 nM 내지 500 nM)을 25 ℃에서 대략 25 ㎕/분의 유량으로 0.05% 폴리솔베이트 20(트윈-20(상표)) 계면활성제(PBST)와 함께 PBS 중에서 주입한다. 결합율(kon) 및 해리율(koff)을 결합 및 해리 센서그램을 동시에 정합시킴으로써 간단한 1 대 1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델(비아코어(등록상표) 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수(Kd)를 koff/kon 비로서 계산한다(예를 들어 문헌[Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293(1999) 865-881]을 참조하시오). 상기 온-율이 상기 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 106 M-1s-1을 초과하는 경우, 상기 온-율을 분광계, 예를 들어 스탑-플로우(stop-flow) 구비된 분광광도계(아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments) 또는 교반식 큐벳을 갖는 8000-시리즈 SLM-AMINCO(상표) 분광광도계(써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정되는 바와 같이 증가하는 농도의 항원의 존재하에서 25 ℃에서 PBS(pH 7.2) 중의 20 nM 항-항원 항체(Fab 형태)의 형광 방출 강도(여기 = 295 ㎚; 방출 = 340 ㎚, 16 ㎚ 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 소광 기법을 사용하여 측정할 수 있다.
항체 단편
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 접합체 중의 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 비제한적으로 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편 및 이들의 접합체, 및 하기에 개시되는 다른 단편들(상기 단편들이 2가이고 이중특이성이거나 또는 결합하여 2가의 이중특이성 항체 단편 융합 폴리펩타이드를 형성하는 한)을 포함한다. 몇몇 항체 단편의 리뷰를 위해서, 문헌[Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]을 참조하시오. scFv 단편의 리뷰를 위해서 예를 들어 문헌[Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315]; 또한 WO 93/16185; 미국특허 제 5,571,894 호 및 미국특허 제 5,587,458 호를 참조하시오. 구조 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의에 대해서, 미국특허 제 5,869,046 호를 참조하시오.
다이아바디는 2가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어 EP 0 404 097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134]; 및 문헌[Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448]을 참조하시오. 트라이아바디 및 테트라바디가 또한 문헌[Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134)]에 개시되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부 또는 경쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 단편이다. 몇몇 실시태양에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다(문헌[Domantis, Inc., Waltham, MA]; 예를 들어 미국특허 제 6,248,516 호를 참조하시오).
항체 단편을 본 발명에 개시된 바와 같은 다양한 기법들, 예를 들어 비제한적으로 완전 항체의 단백질분해 절단뿐만 아니라 재조합 숙주 세포(예를 들어 에스케리키아 콜라이 또는 파지)에 의한 생산에 의해 제조할 수 있다.
키메릭 및 인간화된 항체
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 접합체 중의 항체는 키메릭 항체이다. 몇몇 키메릭 항체들이 예를 들어 미국특허 제 4,816,567 호; 및 문헌[Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855)]에 개시되어 있다. 일례로, 키메릭 항체는 비-인간 가변 영역(예를 들어 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메릭 항체는 상기 부류 또는 하위부류가 모 항체의 부류 또는 하위부류로부터 변화된 "부류 변환된(switched)" 항체이다. 키메릭 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 키메릭 항체는 인간화된 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화성은 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화된 항체는 HVR, 예를 들어 CDR(또는 그의 부분들)이 비-인간 항체로부터 유래되고 FR(또는 그의 부분들)이 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 일부 실시태양에서, 인간화된 항체 중의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화성을 복원하거나 개선시키기 위해서 비-인간 항체(예를 들어 HVR 잔기가 유래되는 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화된 항체 및 그의 제조 방법들이 예를 들어 문헌[Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633]에 리뷰되어 있으며, 예를 들어 문헌[Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329]; 문헌[Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033]; 미국특허 제 5,821,337 호, 미국특허 제 7,527,791 호, 미국특허 제 6,982,321 호 및 미국특허 제 7,087,409 호; 문헌[Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34](SDR(a-CDR) 그래프트화를 개시함); 문헌[Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498]("재표면화"를 개시함); 문헌[Dall'Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60]("FR 셔플링"을 개시함); 및 문헌[Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68] 및 문헌[Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260](FR 셔플링으로의 "유도된 선택" 접근을 개시함)에 추가로 개시되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 비제한적으로 "최적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308]을 참조하시오); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위그룹의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289]; 및 문헌[Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632]을 참조하시오); 인간 성숙(체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식세포계열 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633]을 참조하시오); 및 FR 라이브러리 선별로부터 유도된 프레임워크 영역(예를 들어 문헌[Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684] 및 문헌[Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618)]을 참조하시오)을 포함한다.
인간 항체
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 접합체 중의 항체는 인간 항체이다. 인간 항체를 당해 분야에 공지된 다양한 기법을 사용하여 생성시킬 수 있다. 인간 항체는 문헌[van Dijk, M.A. and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374] 및 문헌[Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450-459]에 일반적으로 개시되어 있다.
인간 항체를, 항원 공격에 응답하여 완전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 완전 항체를 생성하도록 변형시킨 트랜스제닉 동물에게 투여함으로써 제조할 수 있다. 상기와 같은 동물은 전형적으로는 인간 면역글로불린 유전자좌의 일부 또는 전부를 함유하며, 상기 자리는 내인성 면역글로불린 유전자좌로 대체되거나 또는 염색체외에 존재하거나 또는 상기 동물의 염색체내로 무작위로 삽입된다. 상기와 같은 트랜스제닉 마우스에서, 상기 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하기 위한 방법의 리뷰에 대해서, 문헌[Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125]을 참조하시오. 또한 예를 들어 제노마우스(XENOMOUSE)(상표) 기술을 개시하는 미국특허 제 6,075,181 호 및 미국특허 제 6,150,584 호; 휴맵(HUMAB)(등록상표) 기술을 개시하는 미국특허 제 5,770,429 호; 케이엠 마우스(K-M MOUSE)(등록상표) 기술을 개시하는 미국특허 제 7,041,870 호; 및 벨로시마우스(VELOCIMOUSE)(등록상표) 기술을 개시하는 US 2007/0061900을 참조하시오. 상기와 같은 동물들로부터 생성된 완전 항체로부터의 인간 가변 영역들을 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과의 조합에 의해 추가로 변형시킬 수도 있다.
인간 항체를 또한 하이브리도마-기재 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 단클론 항체의 생성을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 개시되었다(예를 들어 문헌[Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005]; 문헌[Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987), pp. 51-63]; 및 문헌[Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95]을 참조하시오). 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 또한 문헌[Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562]에 개시되어 있다. 추가의 방법은 예를 들어 미국특허 제 7,189,826 호(하이브리도마 세포주로부터 단클론 인간 IgM 항체의 생성을 개시한다) 및 문헌[Ni, J., Xiandai Mianyixue 26 (2006) 265-268](인간-인간 하이브리도마를 개시한다)에 개시된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술(트라이오마(Trioma) 기술)이 또한 문헌[Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937] 및 문헌[Vollmers, H.P. and Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191]에 개시되어 있다.
인간 항체를 또한, 인간-유래된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성시킬 수 있다. 이어서 상기와 같은 가변 도메인 서열을 목적하는 인간 불변 도메인과 병용할 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하는 기법을 하기에 개시한다.
라이브러리- 유래된 항체
본 발명의 항체 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 접합체 중의 항체를 목적하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 선별함으로써 단리할 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시키고 상기와 같은 라이브러리를 목적하는 결합 특성을 갖는 항체들에 대해 선별하는 다양한 방법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 상기와 같은 방법들은 예를 들어 문헌[Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37]에 리뷰되어 있으며 예를 들어 문헌[McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554]; 문헌[Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628]; 문헌[Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597]; 문헌[Marks, J.D. and Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175]; 문헌[Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310]; 문헌[Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093]; 문헌[Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472]; 및 문헌[Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132]에 추가로 개시되어 있다.
몇몇 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리를 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 별도로 클로닝하고 파지 라이브러리에 무작위로 재조합시키고, 이어서 상기 라이브러리를 문헌[Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455]에 개시된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 선별할 수 있다. 파지는 전형적으로 단쇄 Fv(scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 표시한다. 면역된 출처로부터의 라이브러리들은 하이브리도마 제작의 필요 없이 면역원에 대한 고-친화성 항체를 제공한다. 한편으로, 미경험 레퍼토리를 문헌[Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734]에 개시된 바와 같이 클로닝하여(예를 들어 인간으로부터) 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기-항원에 대한 단일 출처의 항체를 제공할 수 있다. 최종적으로, 미경험 라이브러리를 또한, 줄기세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용하여 고도로 가변성인 CDR3 영역을 암호화하고 시험관내에서 재배열을 수행함으로써 합성적으로 제조할 수 있다(문헌[Hoogenboom, H.R. and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388]에 개시되어 있다). 인간 항체 파지 라이브러리를 개시하는 특허 공보들은 예를 들어 미국특허 제 5,750,373 호, 및 미국특허 공보 제 2005/0079574 호, 미국특허 공보 제 2005/0119455 호, 미국특허 공보 제 2005/0266000 호, 미국특허 공보 제 2007/0117126 호, 미국특허 공보 제 2007/0160598 호, 미국특허 공보 제 2007/0237764 호, 미국특허 공보 제 2007/0292936 호, 및 미국특허 공보 제 2009/0002360 호를 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본 발명에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
항체 포맷
상기 개략된 항체 및 항체 단편을 다수의 방식으로 병용하여 상이한 항체 포맷을 생성시킬 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 scFv 항체 단편을 완전 항체의 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄의 C-말단에 융합시킬 수 있다. 특히 각각의 중쇄 C-말단 또는 각각의 경쇄 C-말단에 scFv 항체 단편을 융합시킬 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 항체 Fab 단편을 완전 항체의 하나 이상의 폴리펩타이드 쇄의 C-말단에 융합시킬 수 있다. 특히 각각의 중쇄 C-말단 또는 각각의 경쇄 C-말단에 항체 Fab 단편을 융합시킬 수 있다.
예를 들어, 하나의 scFv 및 하나의 항체 Fab 단편을 항체 Fc-영역의 N-말단에 융합시킬 수 있다.
예를 들어 하나의 scFv 또는 항체 Fab 단편을 항체 Fc-영역의 N-말단에 융합시키고 하나의 scFv 또는 항체 Fab 단편을 항체 Fc-영역의 각각의 다른 쇄의 C-말단에 융합시킬 수 있다.
다중특이성 항체
광범위하게 다양한 재조합 항체 포맷, 예를 들어 IgG 항체 포맷 및 단쇄 도메인의 융합에 의한 4가 이중특이성 항체가 개발되었다(예를 들어 문헌[Coloma, M.J., et al., Nature Biotech 15 (1997) 159-163]; WO 2001/077342; 및 문헌[Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234]을 참조하시오).
또한 항체 코어 구조(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)가 더 이상 유지되지 않는 다수의 다른 포맷들, 예를 들어 다이아-, 트라이아- 또는 테트라바디, 미니바디, 다수의 단쇄 포맷(scFv, Bis-scFv)(이들은 2개 이상의 항원을 결합시킬 수 있다)이 개발되었다(문헌[Holliger, P., et al., Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136]; 문헌[Fischer, N., Leger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14]; 문헌[Shen, J., et al., Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74]; 문헌[Wu, C., et al., Nature　Biotech. 25 (2007) 1290-1297)]).
모든 상기와 같은 포맷은 링커를 사용하여 항체 코어(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)를 추가의 결합 단백질(예를 들어 scFv)에 융합시키거나 또는 예를 들어 2개의 Fab 단편 또는 scFv를 융합시킨다(문헌[Fischer, N. and L?ger, O., Pathobiology 74 (2007) 3-14]). 천연 항체와 고도의 유사성을 유지시킴으로써 효과기 기능, 예를 들어 Fc 수용체 결합을 통해 매개되는 보체-의존성 세포독성(CDC) 또는 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)을 유지시키기를 원할 수도 있음을 명심해야 한다.
WO 2007/024715에서 조작된 다가 및 다중특이성 결합 단백질로서 이중 가변 도메인 면역글로불린이 보고된다. 생물 활성 항체 이량체의 제조 방법이 미국특허 제 6,897,044 호에 보고되어 있다. 서로 펩타이드 링커를 통해 결합되는 적어도 4개의 가변 도메인을 갖는 다가 Fv 항체 구조물이 미국특허 제 7,129,330 호에 보고되어 있다. 이량체성 및 다량체성 항원 결합 구조가 US 2005/0079170에 보고되어 있다. 연결 구조에 의해 서로 공유적으로 결합된 3개 또는 4개의 Fab 단편을 포함하는 3가 또는 4가 단일특이성 항원-결합 단백질(상기 단백질은 천연 면역글로불린이 아니다)이 미국특허 제 6,511,663 호에 보고되어 있다. WO 2006/020258에서 원핵생물 및 진핵생물 세포에서 효율적으로 발현될 수 있고 치료 및 진단 방법에 유용한 4가 이중특이성 항체가 보고된다. 2가지 유형의 폴리펩타이드 이량체를 포함하는 혼합물로부터 적어도 하나의 쇄간 다이설파이드 결합을 통해 결합되지 않은 이량체로부터 적어도 하나의 쇄간 다이설파이드 결합을 통해 결합된 이량체를 분리시키거나 또는 우선적으로 합성하는 방법이 US 2005/0163782에 보고되어 있다. 이중특이성 4가 수용체가 미국특허 제 5,959,083 호에 보고되어 있다. 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 WO 2001/077342에 보고되어 있다.
다중특이성 및 다가 항원-결합 폴리펩타이드가 WO 1997/001580에 보고되어 있다. WO 1992/004053은 전형적으로 동일한 항원 결정인자에 결합하는 IgG 부류의 단클론 항체로부터 제조되고 합성 가교결합에 의해 가교 결합된 유사접합체를 보고한다. 항원에 대해 높은 결합활성을 갖는 올리고머성 단클론 항체가 WO 1991/06305에 보고되어 있으며, 이때 함께 회합되어 4가 또는 6가 IgG 분자를 형성하는 2개 이상의 면역글로불린 단량체를 갖는, 전형적으로 상기 IgG 부류의 올리고머가 분비된다. 양-유래된 항체 및 조작된 항체 구조물이 미국특허 제 6,350,860 호에 보고되어 있으며, 이들을 인터페론 감마 활성이 병원성인 질병의 치료에 사용할 수 있다. US 2005/0100543에서 이중특이성 항체의 다가 담체인 표적화 가능한 구조물이 보고된다, 즉 표적화 가능한 구조물의 각 분자는 2개 이상의 이중특이성 항체의 담체로서 작용할 수 있다. 유전 공학 이중특이성 4가 항체가 WO 1995/009917에 보고되어 있다. WO 2007/109254에서 안정화된 scFv로 이루어지거나 또는 상기를 포함하는 안정화된 결합 분자가 보고된다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 접합체 중의 항체는 다중특이성 항체, 예를 들어 이중특이성 항체이다. 다중특이성 항체는 적어도 2개의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 단클론 항체이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 결합 특이성 중 하나는 합텐에 대한 것이고 다른 하나는 임의의 다른(비-합텐) 항원에 대한 것이다. 이중특이성 항체를 또한 세포에 세포독성제를 국소화시키기 위해 사용할 수 있다. 이중특이성 항체를 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조할 수 있다.
다중특이성 항체의 제조 기법은 비제한적으로 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시-발현(문헌[Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540], WO 93/08829, 및 문헌[Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659]을 참조하시오), 및 "놉-인-홀(knob-in-hole)" 공학(예를 들어 미국특허 제 5,731,168 호를 참조하시오)을 포함한다. 다중특이성 항체를 또한, 항체 Fc-이종이량체성 분자의 제조를 위해 정전기적 조향(steering) 효과를 조작하고(WO 2009/089004); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합시키고(예를 들어 미국특허 제 4,676,980 호, 및 문헌[Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83]을 참조하시오); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이성 항체를 생성시키고(예를 들어 문헌[Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553]을 참조하시오); 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 "다이아바디" 기술을 사용하고(예를 들어 문헌[Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448]을 참조하시오); 단쇄 Fv(scFv) 이량체를 사용하고(예를 들어 문헌[Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374]을 참조하시오); 예를 들어 문헌[Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 60-69]에 개시된 바와 같이 삼중특이성 항체를 제조함으로써 제조할 수 있다.
하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체의 중쇄의 CH3 도메인을 예를 들어 WO　96/027011, WO　98/050431, 문헌[Ridgway J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621, Merchant, A.M., et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681]의 다수의 실시예들과 함께 상세히 개시되는 "놉-인-홀" 기술에 의해 변경시킨다. 상기 방법에서 2개의 CH3 도메인의 상호작용 표면을, 이들 2개의 CH3 도메인을 함유하는 2개의 중쇄 모두의 이종이량체화를 증가시키도록 변경시킨다. 상기 2개의 CH3 도메인(상기 2개의 중쇄의)은 각각 "놉"일 수 있는 반면, 다른 것은 "홀"이다. 다이설파이드 가교의 도입은 이종이량체를 안정화시키고(문헌[Merchant, A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681, Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35]) 수율을 증가시킨다.
모든 태양의 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는
- 하나의 중쇄의 CH3 도메인 및 다른 중쇄의 CH3 도메인이 각각 항체 CH3 도메인들간의 원래 계면을 포함하는 계면에서 만나며, 여기에서
상기 계면은 상기 이중특이성 항체의 형성을 촉진하도록 변경되고, 여기에서 상기 변경은
a) 원래의 계면내에서 하나의 중쇄의 CH3 도메인이 상기 이중특이성 항체내의 다른 중쇄의 CH3 도메인의 원래의 계면과 만나고
아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환되고, 이에 의해 다른 중쇄의 CH3 도메인의 계면내의 공동에 위치할 수 있는 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 계면내에 돌기를 생성시키도록
상기 하나의 중쇄의 CH3 도메인을 변경시키고,
b) 제2 CH3 도메인의 원래의 계면내에서 상기 이중특이성 항체내의 제1 CH3 도메인의 원래의 계면과 만나고
아미노산 잔기가 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환되고, 이에 의해 상기 제1 CH3 도메인의 계면내의 돌기가 위치할 수 있는 상기 제2 CH3 도메인의 계면내에 공동을 생성시키도록
상기 다른 중쇄의 CH3 도메인을 변경시킴
을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명에 보고된 바와 같은 항체는 하나의 실시태양에서
- 전장 항체의 제1 중쇄의 CH3 도메인 및 전장 항체의 제2 중쇄의 CH3 도메인이 각각 상기 항체 CH3 도메인들간의 원래 계면에 변경을 포함하는 계면에서 만나고,
여기에서 i) 상기 제1 중쇄의 CH3 도메인에서
아미노산 잔기는 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환되고, 이에 의해 다른 중쇄의 CH3 도메인의 계면내의 공동에 위치할 수 있는 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 계면내에 돌기를 생성시키고,
ii) 상기 제2 중쇄의 CH3 도메인에서
아미노산 잔기는 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환되고, 이에 의해 상기 제1 CH3 도메인의 계면내의 돌기가 위치할 수 있는 상기 제2 CH3 도메인의 계면내에 공동을 생성시킴
을 특징으로 한다.
하나의 실시태양에서 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W)으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
하나의 실시태양에서 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 쓰레오닌(T), 발린(V)으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
하나의 실시태양에서 상기 두 CH3 도메인을 상기 두 CH3 도메인들 간에 다이설파이드 가교가 형성될 수 있도록 각 CH3 도메인의 상응하는 위치 중에 아미노산으로서 시스테인(C)을 도입시킴으로써 추가로 변경시킨다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 다중특이성 항체는 "놉 쇄"의 제1 CH3 도메인 중에 아미노산 T366W 돌연변이 및 "홀 쇄"의 제2 CH3 도메인 중에 아미노산 T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다. 상기 CH3 도메인들 간의 추가적인 쇄간 다이설파이드 가교를 또한, 예를 들어 "홀 쇄"의 CH3 도메인 중에 아미노산 Y349C 돌연변이 및 "놉 쇄"의 CH3 도메인 중에 아미노산 E356C 돌연변이 또는 아미노산 S354C 돌연변이를 도입시킴으로써 사용할 수 있다(문헌[Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681]).
하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 상기 2개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이 및 상기 2개의 CH3 도메인 중의 다른 하나에 E356C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 상기 2개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이 및 상기 2개의 CH3 도메인 중의 다른 하나에 S354C, T366S, L368A, Y407A 돌연변이를 포함한다(상기 하나의 CH3 도메인 중의 추가적인 Y349C 돌연변이 또는 다른 CH3 도메인 중의 추가적인 E356C 또는 S354C 돌연변이는 쇄간 다이설파이드 가교를 형성한다)(카밧의 EU 색인에 따른 넘버링; (문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)])). EP 1 870 459 A1에 의해 개시된 바와 같은 추가의 놉-인-홀 기술을 대안으로 또는 추가로 사용할 수 있다. 따라서 상기 이중특이성 항체의 또 다른 예는 "놉 쇄"의 CH3 도메인 중의 R409D, K370E 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인 중의 D399K, E357K 돌연변이이다(카밧의 EU 색인에 따른 넘버링; (문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)])).
하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 T366W 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인에 T366S, L368A, Y407V 돌연변이 및 추가로 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 R409D, K370E 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인에 D399K, E357K 돌연변이를 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 2개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이 및 상기 2개의 CH3 도메인 중의 다른 하나에 S354C, T366S, L368A, Y407A 돌연변이를 포함하거나, 또는 상기 이중특이성 항체는 상기 2개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이 및 상기 2개의 CH3 도메인 중의 다른 하나에 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이 및 추가로 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 R409D, K370E 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인에 D399K, E357K 돌연변이를 포함한다. 상기 CH3 도메인 중의 상기와 같은 놉 및 홀 돌연변이는 전형적으로는 서열번호 169, 서열번호 170, 서열번호 171 또는 서열번호 172(인간 IgG1 하위부류 알로타입(백인 및 흑인 또는 돌연변이 L234A/L235A, 및 L234A/L235A/P329G), 서열번호 173, 서열번호 174 또는 서열번호 175(인간 IgG4 하위부류 또는 돌연변이 S228P, L235E 및 S228P/L235E/P329G)의 인간 중쇄 불변 영역에 사용된다(카밧 등의 EU 색인에 따른 넘버링; (문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)])).
하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체는 상기 CH3 도메인 중에 상기와 같은 "놉" 및 "홀" 돌연변이(예를 들어 상기 2개의 CH3 도메인 중의 하나에 Y349C, T366W 돌연변이 및 상기 2개의 CH3 도메인 중의 다른 하나에 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이)(카밧 등의 EU 색인에 따른 넘버링; (문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]))를 추가로 포함하여 서열번호 169, 서열번호 170, 서열번호 171, 또는 서열번호 172, 서열번호 173, 서열번호 174 또는 서열번호 175의 인간 중쇄 불변 영역을 포함한다.
"옥토퍼스 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본 발명에 포함된다(예를 들어 US　2006/0025576을 참조하시오).
본 발명에서 항체 또는 단편은 또한 합텐뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 Fab" 또는 "DAF"를 포함한다(예를 들어 US 2008/0069820을 참조하시오).
본 발명에서 항체 또는 단편은 또한 WO　2009/080251, WO　2009/080252, WO　2009/080253, WO　2009/080254, WO　2010/112193, WO　2010/115589, WO　2010/136172, WO　2010/145792, 및 WO 2010/145793에 개시된 다중특이성 항체들을 포함한다.
하나의 바람직한 실시태양에서, 상기 다중특이성 항체(각 중쇄에 CH3 도메인을 포함한다)는 상기 2개의 CH3 도메인 중 하나에 아미노산 S354C, T366W 돌연변이 및 상기 2개의 CH3 도메인 중의 다른 하나에 아미노산 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다(상기 하나의 CH3 도메인 중의 추가적인 아미노산 S354C 돌연변이 및 다른 CH3 도메인 중의 추가적인 아미노산 Y349C 돌연변이는 쇄간 다이설파이드 가교를 형성한다)(카밧에 따른 넘버링).
이종이량체화를 실행하기 위한 CH3-변형에 대한 다른 기법들이 대안으로서 고려되며 예를 들어 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO　2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO　2013/157954, WO 2013/096291에 개시되어 있다.
하나의 실시태양에서 EP 1 870 459 A1에 의해 개시된 이종이량체화 접근법이 사용된다. 상기 접근법은 상기 두 중쇄 모두간의 CH3/CH3 도메인 계면에서 특정 아미노산 위치에 반대 전하를 갖는 하전된 아미노산의 치환/돌연변이의 도입에 근거한다. 하나의 바람직한 실시태양에서 상기 다중특이성 항체는 제1 중쇄의(상기 다중특이성 항체의) CH3 도메인 중의 아미노산 R409D, K370E 돌연변이 및 제2 중쇄의(상기 다중특이성 항체의) 제2 CH3 도메인 중의 아미노산 D399K, E357K 돌연변이를 포함한다(카밧에 따른 넘버링).
또 다른 실시태양에서 상기 다중특이성 항체는 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 아미노산 T366W 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인에 아미노산 T366S, L368A, Y407V 돌연변이 및 추가로 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 아미노산 R409D, K370E 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인에 아미노산 D399K, E357K 돌연변이를 포함한다.
또 다른 실시태양에서 상기 다중특이성 항체는 2개의 CH3 도메인 중 하나에 아미노산 S354C, T366W 돌연변이 및 상기 2개의 CH3 도메인 중의 다른 하나에 아미노산 Y349C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함하거나, 또는 상기 다중특이성 항체는 상기 2개의 CH3 도메인 중 하나에 아미노산 Y349C, T366W 돌연변이 및 상기 2개의 CH3 도메인 중의 다른 하나에 아미노산 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이 및 추가로 "놉 쇄"의 CH3 도메인에 아미노산 R409D, K370E 돌연변이 및 "홀 쇄"의 CH3 도메인에 아미노산 D399K, E357K 돌연변이를 포함한다.
하나의 실시태양에서 WO2013/157953에 개시된 상기 이종이량체화 접근법이 사용된다. 하나의 실시태양에서 상기 제1 CH3 도메인은 아미노산 T366K 돌연변이를 포함하고 상기 제2 CH3 도메인은 아미노산 L351D 돌연변이를 포함한다. 추가의 실시태양에서 상기 제1 CH3 도메인은 아미노산 L351K 돌연변이를 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서 상기 제2 CH3 도메인은 Y349E, Y349D 및 L368E 중에서 선택된 아미노산 돌연변이(바람직하게는 L368E)를 추가로 포함한다.
하나의 실시태양에서 WO2012/058768에 개시된 이종이량체화 접근법이 사용된다. 하나의 실시태양에서 상기 제1 CH3 도메인은 아미노산 L351Y, Y407A 돌연변이를 포함하고 상기 제2 CH3 도메인은 아미노산 T366A, K409F 돌연변이를 포함한다. 추가의 실시태양에서 상기 제2 CH3 도메인은 예를 들어 a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E 또는 T411W, b) D399R, D399W, D399Y 또는 D399K, c) S400E, S400D, S400R 또는 S400K, F405I, F405M, F405T, F405S, F405V 또는 F405W, N390R, N390K 또는 N390D, K392V, K392M, K392R, K392L, K392F 또는 K392E 중에서 선택된 T411, D399, S400, F405, N390 또는 K392번 위치에서 추가의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 추가의 실시태양에서 상기 제1 CH3 도메인은 아미노산 L351Y, Y407A 돌연변이를 포함하고 상기 제2 CH3 도메인은 아미노산 T366A, K409F 돌연변이를 포함한다. 추가의 실시태양에서 상기 제1 CH3 도메인은 아미노산 Y407A 돌연변이를 포함하고 상기 제2 CH3 도메인은 아미노산 T366A, K409F 돌연변이를 포함한다. 추가의 실시태양에서 상기 제2 CH3 도메인은 아미노산 K392E, T411E, D399R 및 S400R 돌연변이를 추가로 포함한다.
하나의 실시태양에서 WO2011/143545에 개시된 이종이량체화 접근법을, 예를 들어 368 및 409로 이루어진 군 중에서 선택된 위치의 아미노산 변형과 함께 사용한다.
하나의 실시태양에서 WO2011/090762에 개시된, 또한 상술한 놉-인-홀 기술을 사용하는 이종이량체화 접근법이 사용된다. 하나의 실시태양에서 상기 제1 CH3 도메인은 아미노산 T366W 돌연변이를 포함하고 상기 제2 CH3 도메인은 아미노산 Y407A 돌연변이를 포함한다. 하나의 실시태양에서 상기 제1 CH3 도메인은 아미노산 T366Y 돌연변이를 포함하고 상기 제2 CH3 도메인은 아미노산 Y407T 돌연변이를 포함한다.
하나의 실시태양에서 상기 다중특이성 항체는 IgG2 아이소타입을 가지며 WO2010/129304에 개시된 이종이량체화 접근법이 사용된다.
하나의 실시태양에서 WO2009/089004에 개시된 이종이량체화 접근법이 사용된다. 하나의 실시태양에서 상기 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D), 바람직하게는 K392D 또는 N392D)에 의한 아미노산 잔기 K392 또는 N392의 치환을 포함하고, 상기 제2 CH3 도메인은 양으로-하전된 아미노산(예를 들어 리신(K) 또는 아르기닌(R), 바람직하게는 D399K, E356K, D356K 또는 E357K 및 보다 바람직하게는 D399K 및 E356K)에 의한 아미노산 잔기 D399, E356, D356 또는 E357의 치환을 포함한다. 추가의 실시태양에서 상기 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D), 바람직하게는 K409D 또는 R409D)에 의한 아미노산 잔기 K409 또는 R409의 치환을 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서 상기 제1 CH3 도메인은 추가로 또는 한편으로 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 글루탐산(E) 또는 아스파트산(D))에 의한 아미노산 잔기 K439 및/또는 K370의 치환을 포함한다.
하나의 실시태양에서 WO2007/147901에 개시된 이종이량체화 접근법이 사용된다. 하나의 실시태양에서 상기 제1 CH3 도메인은 아미노산 K253E, D282K 및 K322D 돌연변이를 포함하고 상기 제2 CH3 도메인은 아미노산 D239K, E240K 및 K292D 돌연변이를 포함한다.
하나의 실시태양에서 WO2007/110205에 개시된 이종이량체화 접근법이 사용된다.
하나의 실시태양에서 상기 이중특이성 항체의 제1 결합 특이성은 합텐에 대한 것이며 제2 결합 특이성은 비-합텐 항원에 대한 것이다. 하나의 실시태양에서 상기 비-합텐 항원은 백혈구 마커, CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD11a,b,c, CD13, CD14, CD18, CD19, CD22, CD23, CD27 및 그의 리간드, CD28 및 그의 리간드 B7.1, B7.2, B7.3, CD29 및 그의 리간드, CD30 및 그의 리간드, CD40 및 그의 리간드 gp39, CD44, CD45 및 동형, CD56, CD58, CD69, CD72, CTLA-4, LFA-1 및 TCR; 조직적합성 항원, MHC 부류 I 또는 II, 루이스 Y 항원, SLex, SLey, SLea, 및 SLeb; 인테그린, VLA-1, VLA-2, VLA-3, VLA-4, VLA-5, VLA-6, αVβ3, 및 LFA-1, Mac-1, 및 pl50,95, αVβ1, gpIIbIIIa, αRβ3, α6β4, αVβ5, αVβ6 및 αV 62 7; 셀렉닌, L-셀렉틴, P-셀렉틴, 및 E-셀렉틴 및 그의 역 수용체 VCAM-1, ICAM-1, ICAM-2, 및 LFA-3; 인터류킨, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, 및 IL-15 중에서 선택되고; 상기 인터류킨 수용체는 IL-1R, IL-2R, IL-3R, IL-4R, IL-5R, IL-6R, IL-7R, IL-8R, IL-9R, IL-10R, IL-11R, IL-12R, IL-13R, IL-14R, 및 IL-15R로 이루어진 군 중에서 선택되고; 상기 케모킨은 PF4, RANTES, MIP1α, MCP1, NAP-2, Groα, Groβ, 및 IL-8로 이루어진 군 중에서 선택되고; 상기 성장 인자는 TNF알파, TGF베타, TSH, VEGF/VPF, VEGFA, VEGFB, VEGF111, VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206, PTHrP, EGF 과, PDGF 과, 엔도텔린, 피브로신(FSF-1), 인간 라미닌, 및 가스트린 방출 펩타이드(GRP), PLGF, HGH, HGHR로 이루어진 군 중에서 선택되고; 상기 성장 인자 수용체는 TNF알파R, RGF베타R, TSHR, VEGFR/VPFR, EGFR, PTHrPR, PDGFR 과, EPO-R, GCSF-R 및 다른 조혈 수용체로 이루어진 군 중에서 선택되고; 상기 인터페론 수용체는 IFNCαR, IFNβR, 및 IFNγR로 이루어진 군 중에서 선택되고; 상기 Ig 및 그의 수용체는 IgE, FcγRI, 및 FcγRII로 이루어진 군 중에서 선택되고; 상기 종양 항원은 her2-neu, 뮤신, CEA 및 엔도시알린으로 이루어진 군 중에서 선택되고; 상기 알레르겐은 집먼지 진드기 항원, lol p1(잔디) 항원, 및 우루시올로 이루어진 군 중에서 선택되고; 상기 바이러스 폴리펩타이드는 CMV 당단백질 B, H 및 gCIII, HIV-1 외막 당단백질, RSV 외막 당단백질, HSV 외막 당단백질, HPV 외막 당단백질, 간염 과 표면 항원으로 이루어진 군 중에서 선택되고; 상기 독소는 슈도모나스 내독소 및 오스테오폰틴/유로폰틴, 뱀독, 거미독 및 벌독 코노톡신으로 이루어진 군 중에서 선택되고; 상기 혈액 인자는 보체 C3b, 보체 C4a, 보체 C4b-9, Rh 인자, 피브리노겐, 피브린 및 마이엘린 관련 성장 억제제로 이루어진 군 중에서 선택되고; 상기 효소는 콜레스테롤 에스터 전달 폴리펩타이드, 막결합 기질 메탈로프로테아제, 및 글루탐산 데카복실라제(GAD)로 이루어진 군 중에서 선택된다.
항체 변이체
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체를 고려한다. 예를 들어, 상기 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 성질들을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체를, 상기 항체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 적합한 변형을 도입시키거나, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기와 같은 변형은 예를 들어 상기 항체의 아미노산 서열로부터의 잔기들의 결실, 및/또는 상기 서열내로의 잔기들의 삽입 및/또는 상기 서열내에서 잔기들의 치환을 포함한다. 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합을 최종 구조물에 도달하도록 수행할 수 있으나, 단 최종 구조물은 목적하는 특성, 예를 들어 항원-결합성을 가져야 한다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체를 제공한다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 아미노산 치환을 관심 항체에 도입시키고 생성물을 목적하는 활성, 예를 들어 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별할 수 있다.
원래 잔기 예시적인 치환 바람직한 치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
아미노산들을 공통 측쇄 성질에 따라 분류할 수도 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적인 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류에 대해 교환함을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 모 항체(예를 들어 인간화된 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환시킴을 수반한다. 일반적으로, 추가의 연구를 위해 선택되는 상기 생성되는 변이체(들)는 모 항체에 비해 몇몇 생물학적 성질들(예를 들어 증가된 친화성, 감소된 면역원성)의 변형(예를 들어 개선)을 갖고/갖거나, 상기 모 항체의 몇몇 생물학적 성질들을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화성 성숙된 항체이며, 상기 항체를 편의상, 예를 들어 파지 디스플레이-기재 친화성 성숙 기법, 예를 들어 본 발명에 개시된 것들을 사용하여 생성시킬 수 있다. 간단히, 하나 이상의 HVR 잔기를 돌연변이시키고 변이체 항체를 파지상에 표시하고 특정한 생물학적 활성(예를 들어 결합 친화성)에 대해 선별한다.
변경(예를 들어 치환)을, 예를 들어 항체 친화성을 개선시키기 위해 HVR에서 수행할 수 있다. 상기와 같은 변경을 HVR "핫스폿", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 암호화된 잔기(예를 들어 문헌[Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196]을 참조하시오), 및/또는 SDR(a-CDR)에서 수행할 수 있으며, 이때 생성되는 변형 VH 또는 VL을 결합 친화성에 대해 시험한다. 2차 라이브러리로부터의 제작 및 재선택에 의한 친화성 성숙이 예를 들어 문헌[Hoogenboom, H.R. et al. in Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37]에 개시되었다. 친화성 성숙의 일부 실시태양에서, 다양한 방법들 중 임의의 방법(예를 들어 오류유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오타이드-지시된 돌연변이유발)에 의해 성숙화용으로 선택된 가변 유전자내에 다양성을 도입시킨다. 이어서 2차 라이브러리를 생성시킨다. 이어서 상기 라이브러리를 목적하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 선별한다. 다양성을 도입시키는 또 다른 방법은 HVR-지시된 접근법을 포함하고, 상기 접근법에서 다수의 HVR 잔기들(예를 들어 한 번에 4 내지 6개의 잔기)이 무작위화된다. 항원 결합에 관련된 HVR 잔기를 예를 들어 알라닌 주사 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 특이적으로 확인할 수 있다. 특히 중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR3를 종종 표적화한다.
몇몇 실시태양에서, 치환, 삽입 또는 결실이, 상기와 같은 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화성을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경(예를 들어 본 발명에 제공되는 바와 같은 보존적 치환)을 HVR에서 수행할 수 있다. 상기와 같은 변경은 HVR "핫스폿" 또는 SDR의 밖에서 있을 수 있다. 상기에 제공된 변형 VH 및 VL 서열의 몇몇 실시태양에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법을 문헌[Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244(1989) 1081-1085]에 개시된 바와 같이 "알라닌 주사 돌연변이유발"이라 칭한다. 상기 방법에서, 표적 잔기들(예를 들어 하전된 잔기, 예를 들어 Arg, Asp, His, Lys 및 Glu)의 잔기 또는 기가 확인되며 이들을, 상기 항원과 항체와의 상호작용이 영향을 받는지를 측정하기 위해 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(예를 들어 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 치환시킨다. 추가의 치환을 상기 아미노산 위치들에 도입시켜 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 입증할 수 있다. 한편으로, 또는 추가로, 항체와 항원간의 접촉 지점들을 확인하기 위한 상기 항원-항체 복합체의 결정 구조. 상기와 같은 접촉 잔기 및 이웃하는 잔기들을 치환용 후보로서 표적화하거나 제거할 수 있다. 변이체를, 상기 변이체가 목적하는 성질을 함유하는지를 측정하기 위해서 선별할 수도 있다.
아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드까지의 길이 범위에 이르는 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기들의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소(예를 들어 ADEPT를 위한) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩타이드에의 항체의 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공되거나 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 접합체 중에 포함된 항체를 상기 항체가 글리코실화되는 정도가 증가하거나 또는 감소하도록 변경시킨다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 첨가 또는 결실을 편의상 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 수행할 수 있다.
상기 항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 상기에 부착된 탄수화물을 변경시킬 수도 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 고유 항체는 전형적으로 상기 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-결합에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 이중촉각 올리고사카라이드를 포함한다(예를 들어 문헌[Wright, A. and Morrison, S.L., et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조하시오). 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물들, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코스아민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산뿐만 아니라 상기 이중촉각 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 중 GlcNAc에 부착된 퓨코스를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 발명의 항체에서 상기 올리고사카라이드의 변형을 몇몇 개선된 성질들을 갖는 항체 변이체를 생성시키기 위해 수행할 수도 있다.
하나의 실시태양에서, Fc 영역에 부착된(직접 또는 간접적으로) 퓨코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변이체를 제공한다. 예를 들어, 상기와 같은 항체 중 퓨코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 상기 퓨코스의 양을, 예를 들어 WO 2008/077546에 개시된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 측정된 바와 같이 Asn297에 부착된 모든 당구조물들(예를 들어 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조물)의 합에 대해, Asn297에서 상기 당 쇄 중 퓨코스의 평균량을 계산함으로써 측정한다. Asn297은 상기 Fc 영역 중 대략 297번(Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라진 잔기를 지칭하나; Asn297은 또한 297번 위치의 상류 또는 하류 대략 ±3 아미노산에, 즉 항체 중 작은 서열 변동으로 인해 294 내지 300번 위치에 위치할 수도 있다. 상기와 같은 퓨코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어 US 2003/0157108; US 2004/0093621을 참조하시오. "탈퓨코실화된" 또는 "퓨코스-결핍된" 항체 변이체에 관한 발행물들의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌[Okazaki, A. et al . J. Mol . Biol. 336:1239-1249 (2004)]; 문헌[Yamane-Ohnuki, N. et al ., Biotech . Bioeng. 87: 614-622 (2004)]. 탈퓨코실화된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 퓨코실화 결함 Lec13 CHO 세포(문헌[Ripka, J. et al . Arch . Biochem . Biophys . 249:533-545 (1986)]; US 2003/0157108; 및 WO　2004/056312(특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예를 들어 알파-1,6-퓨코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들어 문헌[Yamane-Ohnuki, N. et al . Biotech . Bioeng . 87: 614-622 (2004)]; 문헌[Kanda, Y. et al ., Biotechnol . Bioeng ., 94:680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107을 참조하시오)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중촉각 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된 항체 변이체를 추가로 제공한다. 상기와 같은 항체 변이체는 감소된 퓨코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체의 예는 예를 들어 WO 2003/011878; 미국특허 제 6,602,684 호; 및 US 2005/0123546에 개시되어 있다. 상기 Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 중에 하나 이상의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체를 또한 제공한다. 상기와 같은 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 상기와 같은 항체 변이체는 예를 들어 WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 개시되어 있다.
c) Fc-영역 변이체
몇몇 실시태양에서, 하나 이상의 아미노산 변형을 본 발명에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입시켜 Fc 영역 변이체를 생성시킬 수 있다. 상기 Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명은 일부(전부는 아닌) 효과기 기능(이는 항체 변이체를, 생체내에서 항체의 반감기가 중요하지만 몇몇 효과기 기능(예를 들어 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 유해한 용도에 바람직한 후보로 만든다)을 갖는 항체 변이체를 고려한다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 수행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들어 Fc 수용체(FcR) 결합 분석을, 항체가 FcγR 결합은 없지만(따라서 ADCC 활성이 없는 듯하다) FcRn 결합 능력은 유지함을 확실히 하기 위해 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포, NK 세포는 FcRIII 만을 발현하는 반면, 단세포는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈세포상의 FcR 발현이 문헌[Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu . Rev . Immunol. 9:457-492 (1991)]의 464 페이지, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적인 예들이 미국특허 제 5,500,362 호(예를 들어 문헌[Hellstrom, I. et al . Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 83:7059-7063 (1986)]을 참조하시오) 및 문헌[Hellstrom, I et al ., Proc . Nat'l Acad. Sci . USA 82:1499-1502 (1985)]; 미국특허 제 5,821,337 호(문헌[Bruggemann, M. et al ., J. Exp . Med . 166:1351-1361 (1987)]을 참조하시오)에 개시되어 있다. 한편으로, 비-방사성 분석 방법을 사용할 수도 있다(예를 들어 유식 세포측정을 위한 ACTI(상표) 비-방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰 소재); 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 참조하시오). 상기와 같은 분석에 유용한 효과기 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 천연 살해(NK) 세포를 포함한다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 관심 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들어 문헌[Clynes R., et al. Proc . Nat'l Acad . Sci . USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 평가할 수도 있다. C1q 결합 분석을 또한, 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 없음을 확인하기 위해서 수행할 수 있다. 예를 들어 WO　2006/029879 및 WO　2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조하시오. 보체 활성화를 평가하기 위해서, CDC 분석을 수행할 수도 있다(예를 들어 문헌[Gazzano-Santoro, H. et al ., J. Immunol . Methods 202:163-171 (1996)]; 문헌[Cragg, M.S. et al ., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 문헌[Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)]을 참조하시오). FcRn 결합 및 생체내 제거/반감기 측정을 또한 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다(예를 들어 문헌[Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18:1759-1769 (2006)]을 참조하시오).
감소된 효과기 기능을 갖는 항체들은 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국특허 제 6,737,056 호). 상기와 같은 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체(알라닌으로의 잔기 265 및 297의 치환을 갖는 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함(미국특허 제 7,332,581 호))를 포함한다.
FcR에 대한 개선된 또는 감소된 결합을 갖는 몇몇 항체 변이체들이 개시되어 있다(예를 들어 미국특허 제 6,737,056 호; WO 2004/056312, 및 문헌[Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276: 6591-6604 (2001)]을 참조하시오).
몇몇 실시태양에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 상기 Fc 영역의 298, 333 및/또는 334번 위치(잔기의 EU 넘버링)의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일부 실시태양에서, 예를 들어 미국특허 제 6,194,551 호, WO　99/51642, 및 문헌[Idusogie, E.E. et al . J. Immunol . 164: 4178-4184 (2000)]에 개시된 바와 같이, Fc 영역에서, 변경된(즉 개선되거나 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적인 세포독성(CDC)을 생성시키는 변경을 수행한다.
증가된 반감기 및 신생아 Fc 수용체(RcRn)(모 IgG의 태아로의 전달을 맡고 있다)(문헌[Guyer, R.L. et al ., J. Immunol . 117:587-593 (1976)] 및 문헌[Kim J.K. et al ., J. Immunol . 24:2429-2434 (1994)])에의 개선된 결합을 갖는 항체들이 US2005/0014934에 개시되어 있다. 상기 항체들은 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 상기 Fc 영역을 포함한다. 상기와 같은 Fc 변이체들은 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 및 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434에서의 치환(미국특허 제 7,371,826 호)을 갖는 것들을 포함한다.
또한 Fc 영역 변이체의 다른 예들에 관한 문헌[Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322:738-740 (1988)]; 미국특허 제 5,648,260 호; 미국특허 제 5,624,821 호; 및 WO 94/29351을 참조하시오.
하나의 바람직한 실시태양에서 상기 항체는 상기 두 중쇄 모두에 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G(EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
몇몇 실시태양에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 "티오MAb"를 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 상기 치환된 잔기는 상기 항체의 접근 가능한 부위에 존재한다. 상기 잔기를 시스테인으로 치환시킴으로써, 반응성 티올기가 상기 항체의 접근 가능한 부위에 위치되며 이를 사용하여 본 발명에 추가로 개시된 바와 같이 상기 항체를 다른 부분, 예를 들어 약물 부분 또는 링커-약물 부분에 접합시켜 면역접합체를 생성시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 하기의 잔기들 중 임의의 하나 이상을 시스테인으로 치환시킬 수도 있다: 경쇄의 V205(카밧 넘버링); 중쇄의 A118(EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체를 예를 들어 미국특허 제 7,521,541 호에 개시된 바와 같이 생성시킬 수 있다.
e) 항체 유도체
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 제공된 항체를 당해 분야에 공지되고 쉽게 입수할 수 있는 추가적인 비단백질성 부분을 함유하도록 추가로 변형시킬 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 부분은 비제한적으로 수용성 중합체를 포함한다. 수용성 중합체의 비제한적인 예는 비제한적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-다이옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화된 폴리올(예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 그의 수 중 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 상기 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있으며 분지되거나 분지되지 않을 수도 있다. 상기 항체에 부착된 중합체들의 수는 변할 수 있으며, 하나보다 많은 중합체가 부착되는 경우, 이들 중합체는 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 상기 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형을 비제한적으로, 개선시키고자 하는 상기 항체의 특정한 성질, 상기 항체 유도체를 한정된 조건하에서 치료법에 사용할 것인지의 여부 등을 포함한 고려사항을 기준으로 결정할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 방사선에의 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 항체 및 비단백질성 부분의 접합체를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 비단백질성 부분은 탄소 나노튜브이다(문헌[Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 상기 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있으며, 비제한적으로 통상적인 세포에는 해롭지 않지만 상기 비단백질성 부분을 상기 항체-비단백질성 부분에 근접한 세포를 죽이는 온도로 가열하는 파장을 포함한다.
합텐화된 화합물
본 발명에 보고된 바와 같은 접합체 중의 합텐을, 상기 분자 중 하나가 단독이 아닌 경우, 치료제(약물), 세포독성제(예를 들어 독소루비신 또는 백일해 독소와 같은 독소), 형광단, 예를 들어 플루오레세인 또는 로다민과 같은 형광 염료, 영상화 또는 방사성치료성 금속용 킬레이트화제, 펩티딜 또는 비-펩티딜 표지 또는 검출 태그, 또는 제거-변형제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜의 다양한 이성질체, 제3 성분에 결합하는 펩타이드, 또는 또 다른 탄수화물 또는 친지성 작용제에 접합시킬 수 있다. 상기와 같은 접합체를 합텐화된 화합물로서 나타낸다. 상기 접합은 직접적으로 또는 중재 링커를 통할 수 있다.
a) 치료학적 부분
상기 합텐-약물 접합체(ADC, 합텐화된 약물)의 약물 부분은 세포독성 또는 세포발육정지 효과를 갖는 임의의 화합물, 부분 또는 기일 수 있다. 약물 부분은 (i) 미세소관 억제제, 유사분열 억제제, 국소이성화효소 억제제, 또는 DNA 삽입제로서 기능할 수 있는 화학요법제; (ii) 효소적으로 기능할 수 있는 단백질 독소; 및 (iii) 방사성동위원소를 포함한다.
예시적인 약물은 비제한적으로 메이탄시노이드, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 트라이코테센, CC1065, 칼리케아미신 및 다른 에네디인 항생제, 탁산, 안트라사이클린, 및 입체이성질체, 그의 동배체, 유사체 또는 유도체를 포함한다.
단백질 독소는 디프테리아-A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사로부터), 리신 A 쇄(문헌[Vitetta et al (1987) Science, 238:1098]), 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알류라이테스 포르디이 단백질, 다이안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테센(WO 93/21232)을 포함한다.
치료학적 방사성 동위원소는 32P, 33P, 90Y, 125I, 131I, 131In, 153Sm, 186Re, 188Re, 211At, 212B, 212Pb, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다.
상기 방사성 동위원소 또는 다른 표지를 공지된 방식으로 통합시킬 수 있다(문헌[Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57; "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" Chatal, CRC Press 1989]). 탄소-14-표지된 1-아이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산(MX-DTPA)이 상기 복합체에 방사성핵종의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다(WO 94/11026).
b) 표지
합텐화된 화합물은 합텐화된 표지일 수 있다. 상기 합텐에 공유 부착될 수 있는 임의의 표지 부분을 사용할 수 있다(예를 들어 문헌[Singh et al (2002) Anal. Biochem. 304:147-15]; 문헌[Harlow E. and Lane, D. (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]; 문헌[Lundblad R. L. (1991) Chemical Reagents for Protein Modification, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, Fla]을 참조하시오). 상기 표지는 (i) 검출 가능한 신호를 제공하거나, (ii) 제2 표지와 상호작용하여 제1 또는 제2 표지에 의해 제공된 검출 가능한 신호를 변형시키거나, 예를 들어 FRET(형광 공명 에너지 전달)를 제공하거나; (iii) 전하, 소수성, 모양 또는 다른 물리적 매개변수에 의해 이동성, 예를 들어 진기영동 이동성 또는 세포-투과성에 영향을 미치거나, 또는 (iv) 예를 들어 이온성 복합체화를 조절하기 위해 포획 부분을 제공하는 기능을 할 수 있다.
본 발명에 보고된 바와 같은 합텐화된 표지를 포함하는 접합체는, 예를 들어 특정 세포, 조직 또는 혈청 중의 관심 항원의 발현을 검출하기 위한 진단 분석에 유용할 수 있다. 진단용으로, 제1 결합 특이성은 표적에 결합하고 제2 결합 특이성은 합텐화된 표지에 결합하는 이중특이성 항체가 사용될 것이다. 상기 합텐은 전형적으로 검출 가능한 부분으로 표지될 것이다. 하기의 범주로 일반적으로 분류될 수 있는 다수의 표지들을 입수할 수 있다:
(a) 방사성 동위원소(방사성핵종), 예를 들어 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 35S, 64Cu, 68Gn, 86Y, 89Zr, 99TC, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 177Lu, 211At, 또는 131Bi. 방사성 동위원소 표지된 접합체는 수용체 표적화된 영상화 실험에 유용하다. 상기 항원(합텐)을 문헌[Current Protocols in Immunology, (1991) Volumes 1 and 2, Coligen et al, Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs]에 개시된 기법을 사용하여 방사성 동위원소 금속에 결합하거나, 킬레이트화하거나, 또는 달리 복합체화하는 리간드 시약으로 표지할 수 있다. 금속 이온과 복합체화할 수 있는 킬레이트화 리간드는 DOTA, DOTP, DOTMA, DTPA 및 TETA(마크로사이클릭스(Macrocyclics), 미국 텍사스주 달라스 소재)를 포함한다. 방사성핵종을 본 발명에 보고된 바와 같은 복합체와의 복합체화를 통해 표적화할 수 있다(문헌[Wu et al, Nature Biotechnology 23(9)(2005) 1137-1146]). 방사성핵종 표지된 복합체에 의한 수용체 표적 영상화는 종양 조직 중 복합체 또는 상응하는 치료 항체의 검출 및 점진적인 축적의 정량분석에 의한 경로 활성화의 마커를 제공할 수 있다(문헌[Albert et al (1998) Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210]).
영상화 실험에 표지로서 적합한 금속-킬레이트 복합체(US　2010/0111856; 미국특허 제 5,342,606 호; 미국특허 제 5,428,155 호; 미국특허 제 5,316,757 호; 미국특허 제 5,480,990 호; 미국특허 제 5,462,725 호; 미국특허 제 5,428,139 호; 미국특허 제 5,385,893 호; 미국특허 제 5,739,294 호; 미국특허 제 5,750,660 호; 미국특허 제 5,834,456 호; 문헌[Hnatowich et al, J. Immunol. Methods 65 (1983) 147-157]; 문헌[Meares et　al, Anal. Biochem. 142 (1984) 68-78]; 문헌[Mirzadeh et al, Bioconjugate Chem.　1 (1990) 59-65]; 문헌[Meares et al, J. Cancer (1990), Suppl. 10:21-26]; 문헌[Izard et al, Bioconjugate Chem. 3 (1992) 346-350]; 문헌[Nikula et al, Nucl. Med. Biol. 22 (1995) 387-90]; 문헌[Camera et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 955-62]; 문헌[Kukis et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 2105-2110]; 문헌[Verel et al., J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670]; 문헌[Camera et al, J. Nucl. Med. 21 (1994) 640-646]; 문헌[Ruegg et al, Cancer Res. 50 (1990) 4221-4226]; 문헌[Verel et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1663-1670]; 문헌[Lee et al, Cancer Res. 61 (2001) 4474-4482]; 문헌[Mitchell, et al, J. Nucl. Med. 44 (2003) 1105-1112]; 문헌[Kobayashi et al Bioconjugate Chem. 10 (1999) 103-111]; 문헌[Miederer et al, J. Nucl. Med. 45 (2004) 129-137]; 문헌[DeNardo et al, Clinical Cancer Research 4 (1998) 2483-90]; 문헌[Blend et al, Cancer Biotherapy 및 Radiopharmaceuticals 18 (2003) 355-363]; 문헌[Nikula et al J. Nucl. Med. 40 (1999) 166-76]; 문헌[Kobayashi et al, J. Nucl. Med. 39 (1998) 829-36]; 문헌[Mardirossian et al, Nucl. Med. Biol. 20 (1993) 65-74]; 문헌[Roselli et al, Cancer Biotherapy 및 Radiopharmaceuticals, 14 (1999) 209-20]).
(b) 형광 표지, 예를 들어 희토류 킬레이트(유로피움 킬레이트), 플루오레세인 유형, 예를 들어 FITC, 5-카복시플루오레세인, 6-카복시 플루오레세인; 로다민 유형, 예를 들어 TAMRA; 단실; 리사민; 시아닌; 피코에리쓰린; 텍사스 레드; 및 그의 유사체. 상기 형광 표지를 예를 들어 상기 문헌[Current Protocols in Immunology]에 개시된 기법을 사용하여 항원(합텐)에 접합시킬 수 있다. 형광 염료 및 형광 표지 시약은 인비트로젠/몰레큘라 프로브스(Invitrogen/Molecular Probes)(미국 오레곤주 유진 소재) 및 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(Pierce Biotechnology, Inc.)(미국 일리노이주 록포드 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있는 것들을 포함한다.
검출 표지, 예를 들어 형광 염료 및 화학발광 염료(문헌[Briggs et al "Synthesis of Functionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and Amino Acids," J. Chem. Soc., Perkin-Trans. 1 (1997) 1051-1058])는 검출 가능한 신호를 제공하며, 특히 하기의 성질들과 함께 표지화에 일반적으로 적용될 수 있다: (i) 표지된 접합체는 소량의 접합체가 무세포 및 세포-기반 분석 모두에서 민감하게 검출될 수 있도록 낮은 배경의 매우 높은 신호를 생산해야 하며; (ii) 상기 표지된 접합체는 상기 형광 신호가 현저한 광퇴색 없이 관찰되고, 모니터되고 기록될 수 있도록 광안정성이어야 한다. 막 또는 세포 표면에의 표지된 접합체의 세포 표면 결합을 수반하는 용도의 경우, 특히 살아있는 세포의 경우, 상기 표지는 (iii) 유효한 접합체 농도 및 검출 감도를 성취하기 위해 양호한 수용해도를 가져야 하며, (iv) 상기 세포의 정상적인 대사 과정을 붕괴시키거나 또는 조기 세포사를 야기하지 않도록 살아있는 세포에 무독성이어야 한다.
(c) 다양한 효소-기질 표지를 입수할 수 있거나 또는 상기 표지는 개시되어 있다(예를 들어 미국특허 제 4,275,149 호를 참조하시오). 상기 효소는 일반적으로 다양한 기법을 사용하여 측정될 수 있는 색소생산성 기질의 화학적 변경을 촉매화한다. 예를 들어, 상기 효소는 기질 중의 색상 변화를 촉매화할 수 있으며, 상기 변화는 분광광도측정에 의해 측정될 수 있다. 한편으로, 상기 효소는 상기 기질의 형광 또는 화학발광성을 변경시킬 수 있다. 상기 화학발광성 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기되고 이어서 측정될 수 있는(예를 들어 화학발광계를 사용하여) 빛을 방출하거나 또는 형광 수용체에 에너지를 제공한다. 효소 표지의 예는 루시페라제(예를 들어 개똥벌레 루시페라제 및 세균 루시페라제; 미국특허 제 4,737,456 호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진디온, 말레이트 데하이드로게나제, 유레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제(AP), 3-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제(예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제(예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 폴리펩타이드에 접합시키는 기법은 문헌[O'Sullivan et al "Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay", in Methods in Enzym. (ed. by J. Langone 및 IT Van Vunakis), Academic Press, New York, 73 (1981) 147-166]에 개시되어 있다.
효소-기질 조합의 예(미국특허 제 4,275,149 호; 미국특허 제 4,318,980 호)는 예를 들어
(i) 기질로서 수소 퍼옥시다제와 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)(여기에서 상기 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체, 예를 들어 오쏘페닐렌 다이아민(OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 하이드로클로라이드(TMB))를 산화시킨다);
(ii) 색소생산성 기질로서 파라-나이트로페닐 포스페이트와 알칼리성 포스파타제(AP); 및
(iii) 색소생산성 기질(예를 들어 p-나이트로페닐-(3-D-갈락토시다제) 또는 형광생성 기질 4-메틸움벨리페릴-(3-D-갈락토시다제)와 3-D-갈락토시다제(3-D-Gal)
를 포함한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 표지된 접합체를 임의의 공지된 분석 방법, 예를 들어 ELISA, 경쟁 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석에 사용할 수 있다(문헌[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (1987) pp. 147-158, CRC Press, Inc.]).
본 발명에 보고된 바와 같은 표지된 접합체는 다양한 생물의학 및 분자 영상화 방법 및 기법, 예를 들어 (i) MRI(자기 공명 영상화); (ii) MicroCT(컴퓨터 단층촬영); (iii) SPECT(단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영); (iv) PET(양전자 방출 단층촬영)(문헌[Tinianow, J. et al Nuclear Medicine and Biology, 37(3)(2010) 289-297]; 문헌[Chen et al, Bioconjugate Chem. 15 (2004) 41-49]; US 2010/0111856); (v) 생물발광; (vi) 형광; 및 (vii) 초음파에 의한 영상화 생물마커 및 탐침으로서 유용하다. 면역섬광조영술은 방사성 물질로 표지된 접합체를 동물 또는 인간 환자에게 투여하고 상기 접합체가 위치한 신체의 부위를 촬영하는 영상화 과정이다(미국특허 제 6,528,624 호). 영상화 생물마커를 객관적으로 측정하고 통상적인 생물학적 과정, 발병 과정, 또는 치료학적 중재에 대한 약물학적 반응의 지표로서 평가할 수 있다. 생물마커는 다수의 유형을 가질 수 있다: 0 타입 마커는 질병의 천연 병력 마커이고 공지된 임상 지수, 예를 들어 류마티스성 관절염에서 활액 염증의 MRI 평가와 장기적으로 상관 있다; I 타입 마커는, 작용 기전이 임상적 결과와 관련되지 않을 수도 있지만, 상기 작용 기전에 따른 중재의 효과를 포착한다; II 타입 마커는 생물마커의 변화 또는 상기 마커로부터의 신호가 표적 반응, 예를 들어 CT에 의해 류마티스성 관절염에서 측정된 골미란을 "확인하는" 임상적 이점을 예견하는 대용 종점으로서 기능한다. 영상화 생물마커는 따라서 (i) 표적 단백질의 발현, (ii) 상기 표적 단백질에 대한 치료제의 결합, 즉 선택성, 및 (iii) 제거 및 반감기 약동학적 데이터에 관한 약동학적(PD) 치료학적 정보를 제공할 수 있다. 실험-기반 생물마커에 비교된 생체내 영상화 생물마커의 이점은 비-침습적인 처리, 정량분석 가능함, 전신 평가, 반복적인 투여 및 평가, 즉 다수의 시점, 및 전임상(작은 동물)으로부터 임상(인간) 결과로의 잠재적으로 이전가능한 효과를 포함한다. 일부 용도의 경우, 생물영상화는 전임상 연구에서 동물 실험의 수를 보충하거나 최소화한다.
펩타이드 표지화 방법이 주지되어 있다. 문헌[Haugland (2003) Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.]; 문헌[Brinkley (1992) Bioconjugate Chem. 3:2]; 문헌[Garman, (1997) Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press, London]; 문헌[Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2]; 문헌[Glazer et al Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work and E. Work, Eds.) American Elsevier Publishing Co., New York]; 문헌[Lundblad, R. L. and Noyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York]; 문헌[Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche, Ed., Walter DeGruyter, Berlin and New York]; 문헌[Wong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.)]; 문헌[DeLeon-Rodriguez et al, Chem. Eur.　J. 10 (2004) 1149-1155]; 문헌[Lewis et al, Bioconjugate Chem. 12 (2001) 320-324]; 문헌[Li et al, Bioconjugate Chem. 13 (2002) 110-115]; 문헌[Mier et al Bioconjugate Chem. 16 (2005) 240-237]을 참조하시오.
항체 접합체
본 발명에 보고된 바와 같은 접합체 중의 항체를, 상기 분자 중 하나가 단독이 아닌 경우, 치료제(약물), 세포독성제(예를 들어 독소루비신 또는 백일해 독소와 같은 독소), 형광단, 예를 들어 플루오레세인 또는 로다민과 같은 형광 염료, 영상화 또는 방사성치료성 금속용 킬레이트화제, 펩티딜 또는 비-펩티딜 표지 또는 검출 태그, 또는 제거-변형제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜의 다양한 이성질체, 제3 성분에 결합하는 펩타이드, 또는 또 다른 탄수화물 또는 친지성 작용제에 추가로 접합시킬 수 있다.
면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예를 들어 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 접합체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
하나의 실시태양에서, 면역접합체는, 항체가 하나 이상의 약물, 예를 들어 비제한적으로 메이탄시노이드(미국특허 제　5,208,020 호, 미국특허 제 5,416,064 호 및 EP 0 425 235 B1를 참조하시오); 아우리스타틴, 예를 들어 모노메틸 아우리스타틴 약물 부분 DE 및 DF(MMAE 및 MMAF)(미국특허 제 5,635,483 호, 미국특허 제 5,780,588 호, 및 미국특허 제 7,498,298 호); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체(미국특허 제 5,712,374 호, 미국특허 제 5,714,586 호, 미국특허 제 5,739,116 호, 미국특허 제 5,767,285 호, 미국특허 제 5,770,701 호, 미국특허 제 5,770,710 호, 미국특허 제 5,773,001 호, 및 미국특허 제 5,877,296 호; 문헌[Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 3336-3342]; 및 문헌[Lode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928]을 참조하시오); 안트라사이클린, 예를 들어 다우노마이신 또는 독소루비신(문헌[Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523]; 문헌[Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358-362]; 문헌[Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721]; 문헌[Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834]; 문헌[Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. 및 Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532]; 문헌[King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (2002) 4336-4343]; 및 미국특허 제 6,630,579 호를 참조하시오); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예를 들어 도세탁셀, 패클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀; 트라이코테센; 및 CC1065를 포함하는 약물에 접합된 항체-약물 접합체(ADC)이다.
또 다른 실시태양에서, 면역접합체는 효소 활성 독소 또는 그의 단편, 예를 들어 비제한적으로 디프테리아-A 쇄, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알류라이테스 포르디이 단백질, 다이안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트라이코테센에 접합된 본 발명에 개시된 바와 같은 항체를 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사성접합체를 형성하는 본 발명에 개시된 바와 같은 항체 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 복합체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소들을 방사성접합체의 생성에 이용할 수 있다. 예를 들어 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 상기 방사성접합체가 검출에 사용되는 경우 상기 접합체는 섬광조영술 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 TC99m 또는 I123, 또는 핵자기 공명(NMR) 영상화(또한 자기공명 영상화, MRI로서 공지됨)용 스핀 표지, 예를 들어 다시 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체를 다양한 이중기능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스터의 이중작용성 유도체(예를 들어 다이메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스터(예를 들어 다이숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들어 비스(p-아지도벤조일) 헥산다이아민), 비스-다이아조늄 유도체(예를 들어 비스-(p-다이아조늄벤조일)-에틸렌다이아민), 다이아이소시아네이트(예를 들어 톨루엔 2,6-다이아이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어 1,5-다이플루오로-2,4-다이나이트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소를 문헌[Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104]에 개시된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-아이소티오시아네이토벤질-3-메틸다이에틸렌 트라이아민 펜타아세트산(MX-DTPA)은 상기 항체에의 방사성핵종의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO 94/11026을 참조하시오. 상기 링커는 세포 중의 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단성 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광불안정성 링커, 다이메틸 링커 또는 다이설파이드-함유 링커(문헌[Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131]; 미국특허 제 5,208,020 호)를 사용할 수 있다.
상기 면역접합체 또는 ADC는 가교결합제 시약, 예를 들어 비제한적으로 BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(숙신이미딜-4-(비닐설폰)벤조에이트)(이들은 예를 들어 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드(미국 일리노이주 록빌 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있다)로 제조된 상기와 같은 접합체가 본 발명에서 명백히 고려된다.
링커
"링커"란 용어는 상기 항원(예를 들어 합텐)을 다른 부분, 예를 들어 검출 가능한 표지 또는 약물에 접합(결합)시키는데 사용될 수 있는 이중기능성 또는 다중기능성 부분을 나타낸다. 항원(합텐) 접합체를 편의상 상기 약물, 상기 항원(합텐) 및 상기 항-합텐 합체에의 결합에 대해 반응성 작용기를 갖는 링커를 사용하여 제조할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 링커는 상기 항-합텐 항체상에 존재하는 친핵성기에 반응성인 친전자성기를 갖는 반응성 부위를 갖는다. 예를 들어 상기 항체상의 시스테인 티올기는 링커상의 친전자성기와 반응성이며 링커에 공유 결합을 형성한다. 유용한 친전자성기는 비제한적으로 또 다른 티올, 말레이미드 및 할로아세트아미드기를 포함한다(예를 들어 문헌[Klussman et al, Bioconjugate Chemistry 15(4)(2004) 765-773]의 766 페이지의 접합 방법을 참조하시오).
티올-반응 작용기의 예는 비제한적으로 티올, 말레이미드, 알파-할로아세틸, 활성화된 에스터, 예를 들어 숙신이미드 에스터, 4-나이트로페닐 에스터, 펜타플루오로페닐 에스터, 테트라플루오로페닐 에스터, 무수물, 산 염화물, 설포닐 염화물, 아이소시아네이트 및 아이소티오시아네이트를 포함한다.
상기 링커는 상기 항원(합텐)을 상기 페이로드에 결합시키는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 상기 아미노산 잔기는 다이펩타이드, 트라이펩타이드, 테트라펩타이드, 펜타펩타이드, 헥사펩타이드, 헵타펩타이드, 옥타펩타이드, 노나펩타이드, 데카펩타이드, 운데카펩타이드 또는 도데카펩타이드 단위를 형성할 수 있다. 아미노산 잔기는 천연뿐만 아니라 비천연 아미노산 유사체, 예를 들어 시트룰린 또는 β-아미노산, 예를 들어 β-알라닌, 또는 ω-아미노산, 예를 들어 4-아미노-부티르산을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 링커는 상기 항원(합텐) 또는 상기 항체(항-합텐 항체)상에 존재하는 친전자성기에 반응성인 친핵성기를 갖는 반응성 작용기를 갖는다. 유용한 친전자성기는 비제한적으로 알데하이드 및 케톤 카보닐기를 포함한다. 링커의 친핵성기의 헤테로원자는 상기 합텐 또는 상기 항체상의 친전자성기와 반응하여 항원(합텐) 또는 항체에 공유 결합을 형성할 수 있다. 링커상의 유용한 친핵성기는 비제한적으로 하이드라지드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트 및 아릴하이드라지드를 포함한다. 항원(합텐)상의 친전자성기는 링커에 부착하기에 편리한 부위를 제공한다.
전형적으로, 펩타이드-유형 링커는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩타이드 단편 사이에 펩타이드 결합을 형성시킴으로써 제조될 수 있다. 상기와 같은 펩타이드 결합을 예를 들어 펩타이드 화학 분야에 주지된 액상 합성 방법(문헌[E. Schroder and K. Lubke "The Peptides", volume 1 (1965) 76-136, Academic Press])에 따라 제조할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 링커를 용해도 또는 반응성을 조절하는 기로 치환시킬 수도 있다. 예를 들어, 하전된 치환체, 예를 들어 설포네이트(SO3 -) 또는 암모늄 또는 PEG와 같은 중합체는 상기 시약의 수용해도를 증가시킬 수 있으며 상기 링커 시약과 상기 항원(합텐) 또는 상기 약물 부분과의 커플링 반응을 촉진하거나 또는 사용되는 합성 경로에 따라 상기 커플링 반응을 촉진할 수도 있다.
본 발명에 보고되는 바와 같은 약물 또는 표지를 포함하는 접합체는 링커 시약: BMPEO, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 및 설포-SMPB, 및 SVSB(숙신이미딜-4-(비닐설폰)벤조에이트) 및 비스-말레이미드 시약: DTME, BMB, BMDB, BMH, BMOE, BM(PEO)3 및 BM(PEO)4(이들은 예를 들어 피어스 바이오테크놀로지 인코포레이티드로부터 상업적으로 입수할 수 있다)로 제조된 복합체를 본 발명에서 명백히 고려하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 비스-말레이미드 시약은 예를 들어 티올기의 티올-함유 약물 부분, 표지 또는 링커 중간체에의 연속적인 또는 동시적인 방식의 부착을 허용한다. 말레이미드 외에, 예를 들어 티올기와 반응성인 다른 작용기는 요오도아세트아미드, 브로모아세트아미드, 비닐 피리딘, 다이설파이드, 피리딜 다이설파이드, 아이소시아네이트 및 아이소티오시아네이트를 포함한다.
예시적인 링커는 말레이미드 스트레처 및 파라-아미노벤질카바모일(PAB) 자기-희생 스페이서를 갖는 발린-시트룰린(val-cit 또는 vc) 다이펩타이드 링커 시약 및 말레이미드 스트레처 단위 및 p-아미노 벤질 자기-희생 스페이서를 갖는 phe-lys(Mtr) 다이펩타이드 링커 시약을 포함한다.
시스테인 티올기는 친핵성이며 반응하여 링커 시약 및 합텐화된 화합물상의 친전자성기, 예를 들어 i) 활성 에스터, 예를 들어 NHS 에스터, HOBt 에스터, 할로포메이트, 및 산 할라이드; (ii) 알킬 및 벤질 할라이드, 예를 들어 할로아세트아미드; (iii) 알데하이드, 케톤, 카복실, 및 말레이미드기; 및 (iv) 설파이드 교환을 통한 다이설파이드, 예를 들어 피리딜 다이설파이드와 공유 결합을 형성할 수 있다. 합텐화된 화합물상의 친핵성기는 비제한적으로, 반응하여 링커 부분 또는 링커 시약상의 친전자성기와 공유 결합을 형성할 수 있는 아민, 티올, 하이드록실, 하이드라지드, 옥심, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트, 및 아릴하이드라지드기를 포함한다.
III. 핵산
본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 본 발명에 보고된 바와 같은 접합체 중에 포함된 바와 같은 항체의 아미노산 서열 변이체를 암호화하는 DNA를 당해 분야에 공지된 다양한 방법들에 의해 제조할 수 있다. 이들 방법은 비제한적으로 부위-지향된(또는 올리고뉴클레오타이드-매개된) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 앞서 제조된 DNA의 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함한다. 재조합 항체의 변이체를 또한 제한 단편 조작에 의해서 또는 합성 올리고뉴클레오타이드와의 중복 연장 PCR에 의해서 제작할 수 있다. 돌연변이유발성 프라이머는 시스테인 코돈 치환(들)을 암호화한다. 표준 돌연변이유발 기법들을 사용하여 상기와 같은 변형된 조작된 항체를 암호화하는 DNA를 생성시킬 수 있다. 일반적인 지침은 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]; 및 문헌[Ausubel et al Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, N.Y., 1993]에서 찾을 수 있다.
IV. 발현 및 정제
항체를 예를 들어 미국특허 제 4,816,567 호에 개시된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에 개시된 항-인간 알파-시누클레인 항체를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 상기와 같은 핵산은 항체(예를 들어 상기 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)의 VH을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 상기와 같은 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어 발현 벡터)를 제공한다. 추가의 실시태양에서, 상기와 같은 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 상기 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 상기 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 상기 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함한다(예를 들어 이들 벡터로 형질전환되었다). 하나의 실시태양에서, 상기 숙주 세포는 진핵생물, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프양 세포(예를 들어 Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 하나의 실시태양에서, 본 발명에 보고된 바와 같은 항체의 제조 방법을 제공하며, 여기에서 상기 방법은 항체의 발현에 적합한 조건하에서, 상기에 제공된 바와 같은, 상기 항체를 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하고, 임의로 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 회수함을 포함한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 항체의 재조합 생성을 위해서, 예를 들어 상술한 바와 같은, 항체를 암호화하는 핵산을 단리하고 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 상기와 같은 핵산을 통상적인 과정을 사용하여(예를 들어 상기 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 탐침을 사용함으로써) 쉽게 단리하고 서열분석할 수 있다.
항체-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본 발명에 개시된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들어, 항체를, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않은 경우, 세균에서 생성시킬 수 있다. 세균에서의 항체 단편 및 폴리펩타이드의 발현에 대해서, 예를 들어 미국특허 제 5,648,237 호, 미국특허 제 5,789,199 호 및 미국특허 제 5,840,523 호를 참조하시오. (또한 에스케리키아 콜라이에서의 항체 단편의 발현을 개시하는 문헌[Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254]을 참조하시오). 발현 후에, 상기 항체를 용액 분획 중 세균 세포 페이스트로부터 단리하고 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 외에, 진핵 미생물, 예를 들어 섬유상 진균 또는 효모, 예를 들어 글리코실화 경로가 "인간화되어" 부분적인 또는 완전한 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생산하는 진균 및 효모 균주가 항체-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414]; 및 문헌[Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215]을 참조하시오.
글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포이다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 미국특허 제 5,959,177 호, 미국특허 제　6,040,498 호, 미국특허 제 6,420,548 호, 미국특허 제 7,125,978 호 및 미국특허 제　6,417,429 호(트랜스제닉 식물에서 항체를 생성시키기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)(상표) 기술을 개시한다)를 참조하시오.
척추동물 세포를 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어 현탁액에서 증식시키기에 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통; 인간 배아 신장 계통(예를 들어 문헌[Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74]에 개시된 바와 같은 293 또는 293 세포); 아기 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들어 문헌[Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252]에 개시된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 래트 간세포(BRL 3A); 인간 폐세포(W138); 인간 간세포(Hep G2); 마우스 유방 종양(MMT 060562); 예를 들어 문헌[Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68]에 개시된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포(문헌[Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220]); 및 골수종 세포주, 예를 들어 Y0, NS0 및 Sp2/0를 포함한다. 항체 생산에 적합한 몇몇 포유동물 숙주 세포주에 대한 리뷰에 대해서, 예를 들어 문헌[Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268]을 참조하시오.
V. 진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 보고된 바와 같은 항체, 특히 이중특이성 항체 및 접합체는 생물학적 샘플 중의 하나 이상의 표적 분자의 존재를 검출하기에 유용하다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "검출하는"이란 용어는 정량적인 또는 정성적인 검출을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 접합체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 방법은 상기 생물학적 샘플을 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 접합체의 표적에의 결합을 허용하는 조건하에서 상기 항체 또는 접합체와 접촉시키고, 상기 항체 또는 상기 접합체와 상기 표적간에 복합체가 형성되는 지를 검출함을 포함한다. 상기와 같은 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 표지된 항체 또는 접합체를 제공한다. 표지는 비제한적으로 직접 검출되는 표지 또는 부분(예를 들어 형광성, 발색성, 전자-밀집성, 화학발광성 및 방사성 표지)뿐만 아니라, 예를 들어 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 부분들, 예를 들어 효소 또는 리간드를 포함한다. 예시적인 표지는 비제한적으로 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예를 들어 희토 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라제, 예를 들어 개똥벌레 루시페라제 및 세균 루시페라제(미국특허 제 4,737,456 호), 루시페린, 2,3-다이하이드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 헤테로사이클릭 옥시다제, 예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제(과산화 수소를 사용하여 염료 전구체, 예를 들어 HRP를 산화시키는 효소와 결합된), 락토퍼옥시다제, 또는 미세퍼옥시다제, 비오틴/아비딘, 회전 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 유리 라디칼 등을 포함한다.
VI. 약학 제형
본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 접합체의 약학 제형을, 목적하는 정도의 순도를 갖는 상기와 같은 항체 또는 접합체를 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용 가능한 담체(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조한다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성이며, 상기 담체는 비제한적으로 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예를 들어 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 다이사카라이드, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨; 염-형성 대이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 본 발명에서 예시적인 약학적으로 허용 가능한 담체는 간질성 약물 분산제, 예를 들어 용해성 중성-활성 히아루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어 인간 용해성 PH-20 히아루로니다제 당단백질, 예를 들어 rHuPH20(하이레넥스(HYLENEX)(등록상표), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함한 몇몇 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 미국특허 공보 2005/0260186 및 2006/0104968에 개시되어 있다. 하나의 태양에서, sHASEGP를 하나 이상의 추가적인 클리코스아미노글리카나제, 예를 들어 콘드로이티나제와 병용한다.
예시적인 동결건조된 제형들이 미국특허 제 6,267,958 호에 개시되어 있다. 수성 항체 제형은 미국특허 제 6,171,586 호 및 WO2006/044908에 개시된 것들을 포함하고, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본 발명의 제형은 또한 치료하려는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 성분들, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보성 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 상기와 같은 활성 성분들은 의도하는 목적에 유효한 양으로 함께 적합하게 존재한다.
활성 성분을 예를 들어 코아세르베이션 기법에 의해서 또는 계면 중합에 의해서 제조된 미세캡슐, 예를 들어 콜로이드 약물 전달 시스템(예를 들어 리포솜, 알부민 미소구, 미세유화액, 나노-입자 및 나노캡슐) 중의 또는 거대유화액 중의 각각의 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미세캡슐 및 폴리-(메틸메트아크릴레이트) 미세캡슐 중에 포집할 수 있다. 상기와 같은 기법들은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
서방성 제제를 제조할 수도 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 상기 항체 또는 접합체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 기질(상기 기질은 성형품, 예를 들어 필름 또는 미세캡슐의 형태이다)을 포함한다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균성이다. 멸균은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 수행될 수 있다.
VII. 치료 방법 및 조성물
본 발명에 보고된 항체 및 접합체 중 어느 하나를 치료 방법에 사용할 수 있다.
하나의 태양에서, 약제로서 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 접합체를 제공한다. 추가의 태양에서, 질병의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 접합체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 접합체를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 접합체를 투여함을 포함하는, 상기 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 접합체를 제공한다.
하나의 상기와 같은 실시태양에서, 상기 방법은 상기 개체에게 유효량의, 예를 들어 하기에 개시하는 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 투여함을 추가로 포함한다. 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가의 태양에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에서 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 접합체의 용도를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 약제는 질병 치료용이다. 추가의 실시태양에서, 상기 약제는 질병이 있는 개체에게 유효량의 상기 약제를 투여함을 포함하는 상기 질병의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 상기 방법은 상기 개체에게 유효량의, 예를 들어 하기에 개시하는 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 투여함을 추가로 포함한다. 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 "개체"은 인간일 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명은 질병의 치료 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 방법은 상기와 같은 질병이 있는 개체에게 유효량의 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 접합체를 투여함을 포함한다. 하나의 상기와 같은 실시태양에서, 상기 방법은 상기 개체에게 유효량의, 하기에 개시하는 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 투여함을 추가로 포함한다. 상기 실시태양들 중 어느 하나에 따른 "개체"은 인간일 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명은 예를 들어 상기 치료 방법들 중 어느 하나에 사용하기 위한, 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 및 접합체 중 어느 하나를 포함하는 약학 제형을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 약학 제형은 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 및 접합체 중 어느 하나 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 제형은 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 및 접합체 중 어느 하나, 및 예를 들어 하기에 개시하는 바와 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 포함한다.
본 발명에 보고된 바와 같은 항체 및 접합체를 치료법에서 단독으로 또는 다른 작용제들과 함께 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 접합체를 적어도 하나의 추가적인 치료제와 함께 투여할 수 있다.
상기에 나타낸 상기와 같은 복합 요법은 병행 투여(이때 2개 이상의 치료제를 동일한 또는 별도의 제형 중에 포함시킨다), 및 별도 투여(이 경우에 본 발명의 항체의 투여를 추가적인 치료제 및/또는 항원보강제의 투여 전에, 상기 투여와 동시에, 및/또는 상기 투여에 이어서 수행할 수 있다)를 포함한다. 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 및 접합체를 또한 방사선 요법과 함께 사용할 수도 있다.
본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 접합체(및 임의의 추가적인 치료제)를 임의의 적합한 수단, 예를 들어 비경구, 폐내 및 비내, 및 국소 치료를 원하는 경우, 병변내 투여에 의해 투여할 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 부분적으로 투여가 짧은지 또는 만성적인지에 따라, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사에 의할 수 있다. 본 발명에서는 비제한적으로 다양한 시점들에 걸친 단일 또는 수회 투여, 일시 투여, 및 펄스 주입을 포함한 다양한 투여 스케줄이 고려된다.
본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 접합체를 양호한 의학적 실행과 일관되는 방식으로 제형화하고, 복용시키고, 투여할 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 인자들은 치료되는 특정 질환, 치료되는 특정 포유동물, 개체 환자의 임상적 조건, 질환의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 인자들을 포함한다. 상기 항체 또는 접합체는 문제의 질환을 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와, 필요하지는 않지만, 임의로 제형화한다. 상기와 같은 다른 작용제의 유효량은 상기 제형 중에 존재하는 항체 또는 접합체의 양, 질환 또는 치료제의 유형, 및 상기에 논의된 다른 인자들에 따라 변한다. 이들은 본 발명에 개시된 바와 동일한 투여량으로 및 투여 경로에 따라, 또는 본 발명에 개시된 투여량의 대략 1 내지 99%, 또는 실험적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 일반적으로 사용된다.
질병의 예방 또는 치료를 위해서, 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 접합체의 적합한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 함께 사용될 때)은 치료되는 질병의 유형, 항체 또는 접합체의 유형, 상기 질병의 중증도 및 과정, 상기 항체 또는 접합체가 예방 또는 치료 목적으로 사용되는지의 여부, 선행 치료법, 환자의 임상 병력 및 상기 항체 또는 접합체에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 변할 것이다. 상기 항체 또는 접합체를 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여한다. 상기 질병의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/㎏ 내지 15 ㎎/㎏(예를 들어 0.5 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏)의 항체 또는 접합체가, 예를 들어 1회 이상의 분리 투여에 의한 것이든 또는 연속 주입에 의한 것이든 간에, 상기 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 임의의 전형적인 1일 투여량은 상기 언급한 인자들에 따라 약 1 ㎍/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸쳐 반복된 투여를 위해서, 상기 조건에 따라, 상기 치료를 일반적으로는 질병 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 지속할 수 있다. 상기 항체 또는 접합체의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 용량을 상기 환자에게 투여할 수 있다. 상기와 같은 용량을 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다(예를 들어 상기 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 상기 항체를 수령하도록) 투여할 수 있다. 초기의 보다 높은 부하 용량에 이어서 하나 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수도 있다. 그러나, 다른 복용 섭생이 유용할 수도 있다. 상기 치료법의 진행을 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터한다.
상기 제형들 및 치료 방법들 중 어느 하나를 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 접합체 대신에 또는 상기 항체 또는 접합체 외에 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행할 수 있는 것으로 생각된다.
VIII. 제조 물품
본 발명의 또 다른 태양에서, 상술한 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품을 제공한다. 상기 제조 물품은 용기 및 상기 용기 상의 또는 상기 용기와 결합된 표지 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 주머니 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질들, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 조성물을 단독으로, 또는 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 함께 유지하며 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들어 상기 용기는 정맥내 용액 주머니 또는 피하주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 상기 조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 복합체이다. 상기 표지 또는 패키지 삽입물은 상기 조성물이 선택 상태의 치료에 사용됨을 가리킨다. 더욱이, 상기 제조 물품은 (a) 조성물이 함유된 제1 용기(여기에서 상기 조성물은 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 복합체를 포함한다); 및 (b) 조성물이 함유된 제2 용기(여기에서 상기 조성물은 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 실시태양에서 제조 물품은 상기 조성물을 사용하여 특정 상태를 치료할 수 있음을 가리키는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 한편으로, 또는 추가로, 상기 제조 물품은 약학적으로 허용 가능한 완충제, 예를 들어 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 물품은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직할 수 있는 다른 물질, 예를 들어 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 추가로 포함할 수도 있다.
상기 제조 물품 중 임의의 물품이 본 발명에 보고된 바와 같은 항체 또는 접합체 대신에 또는 상기 항체 또는 접합체 외에 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 생각된다.
IX. 구체적인 실시태양
1. i) 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 및 혈액뇌장벽 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이성 항체, 및
ii) 합텐화된 페이로드
를 포함하는 공유 접합체로, 여기에서
상기 합텐화된 페이로드는 상기 제1 결합 특이성에 의해 특이적으로 결합되고,
상기 공유 접합체는 상기 합텐화된 페이로드와 상기 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 사이에 공유 결합을 가지고,
상기 합텐화된 페이로드는 비오틴화된 페이로드, 테오필린화된 페이로드, 디곡시제닌화된 페이로드, 카보란화된 페이로드, 플루오레세인화된 페이로드, 헬리카화된 페이로드 및 브로모데옥시유리딘화딘 페이로드로 이루어진 군 중에서 선택된다.
2. 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 및 혈액뇌장벽 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이성 항체 및 합텐화된 페이로드를 포함하는 비-공유 복합체로, 여기에서 상기 합텐화된 페이로드는 상기 제1 결합 특이성에 의해 특이적으로 결합된다.
3. 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 및 혈액뇌장벽 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이성 항체 및 합텐화된 페이로드를 포함하는 공유 접합체로, 여기에서 상기 합텐화된 페이로드는 상기 제1 결합 특이성에 의해 특이적으로 결합되며, 합텐화된 페이로드와 상기 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 간에 공유 결합을 갖는다.
4. 제1 실시태양 내지 제3 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 합텐화된 페이로드는 비오틴화된 페이로드, 테오필린화된 페이로드, 디곡시제닌화된 페이로드, 카보란화된 페이로드, 플루오레세인화된 페이로드, 헬리카화된 페이로드 및 브로모데옥시유리딘화딘 페이로드로 이루어진 군 중에서 선택된다.
5. 제1 실시태양 내지 제4 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 합텐은 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드의 유도체 또는 유사체이다. 하나의 실시태양에서 상기 합텐은 아미노산의 유도체 또는 유사체이다.
6. 제1 실시태양 내지 제5 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 혈액뇌장벽 수용체는 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장인자 수용체(IGF 수용체), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(LRP8), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1(LRP1), 및 헤파린-결합 상피성장인자-유사 성장인자(HB-EGF)로 이루어진 군 중에서 선택된다.
7. 제1 실시태양 내지 제6 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 2개의 결합 부위를 포함하는 전장 항체이다.
8. 제1 실시태양 내지 제7 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 하나 또는 2개의 scFv 또는 scFab가 융합되고 3 또는 4개의 결합 부위를 포함하는 전장 항체이다.
9. 제1 실시태양 내지 제8 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 항체 단편이다. 하나의 실시태양에서 상기 항체 단편은 F(ab')2 및 다이아바디 중에서 선택된다.
10. 제1 실시태양 내지 제9 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 인간화된 또는 인간 항체이다.
11. 제1 실시태양 내지 제10 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 효과기 기능이 없다.
12. 제1 실시태양 내지 제11 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 기능성 Fc-영역을 갖지 않는다.
13. 제1 실시태양 내지 제12 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 Fc-영역을 갖지 않는다.
14. 제1 실시태양 내지 제13 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 돌연변이 L234A, L235A 및 P329G를 갖는 인간 IgG1 하위부류의 Fc-영역을 가지고, 여기에서 상기 위치들은 카밧(카밧 EU 색인)의 Fc-영역 넘버링에 따라 결정된다.
15. 제1 실시태양 내지 제14 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 돌연변이 S228P, L235E 및 P329G를 갖는 인간 IgG4 하위부류의 Fc-영역을 가지고, 여기에서 상기 위치들은 카밧(카밧 EU 색인)의 Fc-영역 넘버링에 따라 결정된다.
16. 제1 실시태양 내지 제15 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는
a) 합텐화된 페이로드에 대한 하나의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 하나의 결합 부위, 또는
b) 합텐화된 페이로드에 대한 2개의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 하나의 결합 부위, 또는
c) 합텐화된 페이로드에 대한 하나의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 2개의 결합 부위, 또는
d) 합텐화된 페이로드에 대한 2개의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 2개의 결합 부위
를 포함한다.
17. 제1 실시태양 내지 제16 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 합텐화된 페이로드에 대한 2개의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 2개의 결합 부위를 포함한다.
18. 제1 실시태양 내지 제17 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 합텐화된 페이로드는 합텐과 페이로드 사이에 링커를 포함한다.
19. 제1 실시태양 내지 제18 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 링커는 펩타이드 링커이다.
20. 제18 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 링커는 화학적 링커(비-펩타이드 링커)이다.
21. 제1 실시태양 내지 제20 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체 및 합텐화된 페이로드는 각각 작용기를 포함하고, 이때 상기 이중특이성 항체에 의한 합텐화된 페이로드의 결합시 상기 합텐화된 페이로드와 상기 이중특이성 항체 사이에 공유결합이 형성된다.
22. 제1 실시태양 내지 제21 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 상기 항체의 CDR2 중의 아미노산 잔기에 작용기를 포함하고, 이때 상기 CDR2는 카밧에 따라 결정된다.
23. 제22 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체의 CDR2 중의 아미노산 잔기의 작용기는 티올기이다.
24. 제1 실시태양 내지 제23 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 상기 항체의 CDR2 중에 시스테인 아미노산 잔기를 포함한다.
25. 제1 실시태양 내지 제24 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 합텐화된 페이로드는 상기 합텐 중에 또는 존재하는 경우 상기 합텐과 페이로드 사이의 링커 중에 작용기를 포함한다.
26. 제25 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 작용기는 티올 또는 말레이미드 또는 할로아세틸이다.
27. 제25 실시태양 또는 제26 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 합텐 또는 존재하는 경우 링커 중의 작용기는 티올기이다.
28. 제1 실시태양 내지 제27 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체의 CDR2 중의 시스테인 잔기와 상기 합텐화된 페이로드 중의 티올기 사이에 공유 결합이 존재한다.
29. 제28 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 공유 결합은 다이설파이드 결합이다.
30. 제28 실시태양 또는 제29 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 공유 결합은 다이설파이드 결합이며 상기 결합은 산화환원 활성제의 첨가 없이 형성된다.
31. 제1 실시태양 내지 제30 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 CDR2는 비오틴화된 페이로드, 테오필린화된 페이로드, 디곡시제닌화된 페이로드 및 플루오레세인화된 페이로드로 이루어진 군 중에서 선택된 합텐화된 페이로드의 경우에 중쇄 CDR2이다.
32. 제31 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체의 중쇄 CDR2 중의 시스테인 잔기는 카밧의 중쇄 가변 도메인 넘버링에 따른 52번 위치, 또는 52a번 위치, 또는 52b번 위치, 또는 52c번 위치, 또는 52d번 위치, 또는 53번 위치에 있다.
33. 제31 실시태양 또는 제32 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체의 중쇄 CDR2 중의 시스테인 잔기는 카밧의 중쇄 가변 도메인 넘버링에 따른 52a번 위치, 또는 52b번 위치, 또는 52c번 위치, 또는 53번 위치에 있다.
34. 제31 실시태양 내지 제33 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체의 중쇄 CDR2 중의 시스테인 잔기는 카밧의 중쇄 가변 도메인 넘버링에 따른 52b번 위치, 또는 53번 위치에 있다.
35. 제1 실시태양 내지 제30 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 CDR2는 헬리카화된 페이로드의 경우에 경쇄 CDR2이다.
36. 제35 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체의 경쇄 CDR2 중의 시스테인 잔기는 카밧의 경쇄 가변 도메인 넘버링에 따른 51번 위치 또는 55번 위치에 있다.
37. 제35 실시태양 또는 제36 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체의 경쇄 CDR2 중의 시스테인 잔기는 카밧의 경쇄 가변 도메인 넘버링에 따른 55번 위치에 있다.
38. 제1 실시태양 내지 제37 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, CDR2당 정확히 하나의 공유 결합이 형성된다.
39. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 페이로드는 결합 부분, 표지화 부분, 및 생물 활성 부분 중에서 선택된다.
40. 제1 실시태양 내지 제39 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 생물 활성 부분은 항체, 항체 단편, 항체 접합체 폴리펩타이드, 하나 이상의 CNS 표적(들)의 천연 리간드, 하나 이상의 CNS 표적(들)의 천연 리간드의 변형된 버전, 앱타머, 억제성 핵산(즉 작은 억제성 RNA(siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)), 잠금 핵산(LNA), 리보자임, 및 소분자, 및 상기 중 임의의 것의 활성 단편을 포함하는 군 중에서 선택된다.
41. 제1 실시태양 내지 제40 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 페이로드는 핵산 또는 핵산 유도체이다.
42. 제1 실시태양 내지 제41 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 핵산은 iRNA 또는 LNA이다.
43. 제1 실시태양 내지 제42 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 페이로드는 폴리펩타이드이다.
44. 제1 실시태양 내지 제43 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 페이로드는 소분자(비-폴리펩타이드 생물 활성 부분)이다.
45. 제1 실시태양 내지 제44 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 생물 활성 부분은 폴리펩타이드이다.
46. 제45 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 폴리펩타이드는 5 내지 500 아미노산 잔기로 이루어진다.
47. 제45 실시태양 또는 제46 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 폴리펩타이드는 10 내지 450 아미노산 잔기를 포함한다.
48. 제45 실시태양 내지 제47 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 폴리펩타이드는 15 내지 400 아미노산 잔기를 포함한다.
49. 제45 실시태양 내지 제48 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 폴리펩타이드는 18 내지 350 아미노산 잔기를 포함한다.
50. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 디곡시제닌화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성(항-디곡시제닌 결합 특이성; 항-DIG 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성; 항-(h)TfR 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성; 항-LRP8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 포함한다.
51. 제1 실시태양 내지 제50 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 디곡시제닌화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성(2개의 항-디곡시제닌 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(2개의 항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성을 갖는다.
52. 제1 실시태양 내지 제51 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 디곡시제닌화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
53. 제1 실시태양 내지 제52 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 디곡시제닌화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 인간화된 결합 특이성이다.
54. 제1 실시태양 내지 제53 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 디곡시제닌화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 상기 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 CDR 및 수용체 인간 프레임워크(예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크)를 포함한다.
55. 제1 실시태양 내지 제54 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 디곡시제닌화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 9 또는 25의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 10 또는 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 11 또는 27의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 13 또는 29의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 14 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 15 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
56. 제1 실시태양 내지 제55 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 디곡시제닌화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 4 또는 12 또는 20 또는 28의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
57. 제1 실시태양 내지 제56 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-디곡시제닌 항체는 디곡시제닌에 결합하는 능력을 보유한다.
58. 제1 실시태양 내지 제57 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 1 또는 9 또는 17 또는 25에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다.
59. 1항 내지 58항 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다.
60. 제1 실시태양 내지 제59 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항-디곡시제닌 항체는 서열번호 1 또는 9 또는 17 또는 25 중의 VH 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
61. 제1 실시태양 내지 제60 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 디곡시제닌화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 8 또는 16 또는 24 또는 32의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 추가로 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
62. 제1 실시태양 내지 제61 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-디곡시제닌 항체는 디곡시제닌에 결합하는 능력을 보유한다.
63. 제1 실시태양 내지 제62 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 8 또는 16 또는 24 또는 32에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고, 임의로 상기 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다.
64. 제1 실시태양 내지 제63 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항-디곡시제닌 항체는 서열번호 8 또는 16 또는 24 또는 32 중의 VL 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
65. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 비오틴화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성(항-비오틴 결합 특이성; 항-BI 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성; 항-(h)TfR 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성; 항-LRP8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 포함한다.
66. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제65 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 비오틴화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성(2개의 항-비오틴 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(2개의 항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성을 갖는다.
67. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양, 제65 실시태양 및 제66 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 비오틴화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
68. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제65 실시태양 내지 제67 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 비오틴화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 인간화된 결합 특이성이다.
69. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제65 실시태양 내지 제68 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 비오틴화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 상기 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 CDR 및 수용체 인간 프레임워크(예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크)를 포함한다.
70. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제65 실시태양 내지 제69 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 비오틴화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 41 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 42 또는 58의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 43 또는 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 45 또는 61의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 46 또는 62의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 47 또는 63의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
71. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제65 실시태양 내지 제70 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 비오틴화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 36 또는 44 또는 52 또는 60의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
72. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제65 실시태양 내지 제71 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-비오틴 항체는 비오틴에 결합하는 능력을 보유한다.
73. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제65 실시태양 내지 제72 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 36 또는 44 또는 52 또는 60에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고, 임의로 상기 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다.
74. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제65 실시태양 내지 제73 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항-비오틴 항체는 서열번호 36 또는 44 또는 52 또는 60 중의 VH 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
75. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제65 실시태양 내지 제74 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 비오틴화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 40 또는 48 또는 56 또는 64의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 추가로 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
76. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제65 실시태양 내지 제75 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-비오틴 항체는 비오틴에 결합하는 능력을 보유한다.
77. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제65 실시태양 내지 제76 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 40 또는 48 또는 56 또는 64에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고, 임의로 상기 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다.
78. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제65 실시태양 내지 제77 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항-비오틴 항체는 서열번호 40 또는 48 또는 56 또는 64 중의 VL 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
79. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 테오필린화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성(항-테오필린 결합 특이성; 항-THEO 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성; 항-(h)TfR 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성; 항-LRP8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 포함한다.
80. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제79 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 테오필린화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성(2개의 항-테오필린 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(2개의 항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성을 갖는다.
81. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양, 제79 실시태양 및 제80 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 테오필린화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 67의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 71의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
82. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제79 실시태양 내지 제81 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 테오필린화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 인간화된 결합 특이성이다.
83. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제79 실시태양 내지 제82 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 테오필린화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 상기 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 CDR 및 수용체 인간 프레임워크(예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크)를 포함한다.
84. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제79 실시태양 내지 제83 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 테오필린화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 73 또는 89의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 74 또는 90의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 75 또는 91의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 77 또는 93의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 78 또는 94의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 79 또는 95의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
85. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제79 실시태양 내지 제84 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 테오필린화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 68 또는 76 또는 84 또는 92의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
86. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제79 실시태양 내지 제85 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-테오필린 항체는 테오필린에 결합하는 능력을 보유한다.
87. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제79 실시태양 내지 제86 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 68 또는 76 또는 84 또는 92에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고, 임의로 상기 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다.
88. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제79 실시태양 내지 제87 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항-테오필린 항체는 서열번호 68 또는 76 또는 84 또는 92 중의 VH 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
89. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제79 실시태양 내지 제88 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 테오필린화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 72 또는 80 또는 88 또는 96의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 추가로 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
90. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제79 실시태양 내지 제89 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-테오필린 항체는 테오필린에 결합하는 능력을 보유한다.
91. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제79 실시태양 내지 제90 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 72 또는 80 또는 88 또는 96에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고, 임의로 상기 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다.
92. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제79 실시태양 내지 제91 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항-테오필린 항체는 서열번호 72 또는 80 또는 88 또는 96 중의 VL 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
93. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 플루오레세인화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성(항-플루오레세인 결합 특이성; 항-FLUO 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성; 항-(h)TfR 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성; 항-LRP8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 포함한다.
94. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제93 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 플루오레세인화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성(2개의 항-플루오레세인 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(2개의 항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성을 갖는다.
95. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양, 제93 실시태양 및 제94 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 플루오레세인화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 97의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 98의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 99의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 103의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
96. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제93 실시태양 내지 제95 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 플루오레세인화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 인간화된 결합 특이성이다.
97. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제93 실시태양 내지 제96 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 플루오레세인화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 상기 실시태양들 중 어느 하나에서와 같은 CDR 및 수용체 인간 프레임워크(예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크)를 포함한다.
98. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제93 실시태양 내지 제97 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 플루오레세인화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 105 또는 113의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 106 또는 114의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 107 또는 115의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 109 또는 117의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 110 또는 118의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 111 또는 119의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
99. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제93 실시태양 내지 제98 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 플루오레세인 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 108 또는 116의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
100. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제93 실시태양 내지 제99 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-플루오레세인 항체는 플루오레세인에 결합하는 능력을 보유한다.
101. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제93 실시태양 내지 제100 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 108 또는 116에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고, 임의로 상기 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다.
102. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제93 실시태양 내지 제101 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항-플루오레세인 항체는 서열번호 108 또는 116 중의 VH 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
103. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제93 실시태양 내지 제102 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 플루오레세인화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 112 또는 120의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 추가로 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
104. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제93 실시태양 내지 제103 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-플루오레세인 항체는 플루오레세인에 결합하는 능력을 보유한다.
105. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제93 실시태양 내지 제104 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 112 또는 120에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고, 임의로 상기 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다.
106. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제93 실시태양 내지 제105 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항-플루오레세인 항체는 서열번호 112 또는 120 중의 VL 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
107. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 브로모데옥시유리딘화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성(항-브로모데옥시유리딘 결합 특이성; 항-BrdU 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성; 항-(h)TfR 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성; 항-LRP8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 포함한다.
108. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제107 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 이중특이성 항체는 브로모데옥시유리딘화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성(2개의 항-브로모데옥시유리딘 결합 특이성) 및 (인간) 트랜스페린 수용체(2개의 항-(인간) 트랜스페린 수용체 결합 특이성) 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(항-저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8 결합 특이성)에 특이적으로 결합하는 2개의 결합 특이성을 갖는다.
109. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양, 제107 실시태양 및 제108 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 브로모데옥시유리딘화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 214의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 216의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 218의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 219의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 220의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 221의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
110. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제107 실시태양 내지 제109 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 브로모데옥시유리딘화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 인간화된 결합 특이성이다.
111. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제107 실시태양 내지 제110 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 브로모데옥시유리딘화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 비-인간 항체로부터의 CDR 및 수용체 인간 프레임워크(예를 들어 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크)를 포함한다.
112. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제107 실시태양 내지 제111 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 브로모데옥시유리딘화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 (a) 서열번호 214 또는 215의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1, (b) 서열번호 216 또는 217의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2, (c) 서열번호 218의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3, (d) 서열번호 219의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1, (e) 서열번호 220의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2, 및 (f) 서열번호 221의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
113. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제107 실시태양 내지 제112 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 브로모데옥시유리딘화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 222 또는 224의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열을 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
114. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제107 실시태양 내지 제113 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VH 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-브로모데옥시유리딘 항체는 브로모데옥시유리딘에 결합하는 능력을 보유한다.
115. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제107 실시태양 내지 제114 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 222 또는 224에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고, 임의로 상기 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다.
116. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제107 실시태양 내지 제115 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항-브로모데옥시유리딘 항체는 서열번호 223 또는 225 중의 VH 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
117. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제107 실시태양 내지 제116 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 브로모데옥시유리딘화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 결합 특이성은 서열번호 223 또는 225의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL)을 추가로 포함하는 한 쌍의 항체 중쇄 가변 도메인 및 항체 경쇄 가변 도메인이다.
118. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제107 실시태양 내지 제117 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 일치성을 갖는 VL 서열은 기준 서열에 비해 치환(예를 들어 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 상기 서열을 포함하는 항-브로모데옥시유리딘 항체는 브로모데옥시유리딘에 결합하는 능력을 보유한다.
119. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제107 실시태양 내지 제118 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 총 1 내지 10개 아미노산이 서열번호 223 또는 225에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었고, 임의로 상기 치환, 삽입 또는 결실은 상기 CDR 밖의 영역에서(즉 FR 중에서) 발생한다.
120. 제1 실시태양 내지 제49 실시태양 및 제107 실시태양 내지 제119 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항-브로모데옥시유리딘 항체는 서열번호 223 또는 225 중의 VL 서열을, 상기 서열의 번역-후 변형을 포함하여 포함한다.
121. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제120 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 페이로드는 합텐화된 전장 항체 또는 합텐화된 항체 단편이다.
122. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제121 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 합텐화된 페이로드는 합텐화된 전장 항-알파 시누클레인 항체이다.
123. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제121 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 합텐화된 페이로드는 알파-시누클레인에 특이적으로 결합하는 합텐화된 항-알파 시누클레인 항체 단편이다.
124. 제121 실시태양 내지 제123 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 합텐은 비오틴이다.
125. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제124 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 중쇄 가변 도메인 중에 서열번호 243 내지 245의 HVR 및 경쇄 가변 도메인 중에 서열번호 246 내지 248의 HVR을 포함한다.
126. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제125 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 중쇄 가변 도메인 중에 서열번호 249, 250 및 245의 HVR 및 경쇄 가변 도메인 중에 서열번호 251 내지 253의 HVR을 포함한다.
127. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제126 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 서열번호 254로 이루어진 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 255로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
128. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제127 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 서열번호 254로 이루어진 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 255로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 인간화시킴으로써 획득되었다.
129. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제128 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인 중에 서열번호 243 내지 245의 HVR 및 경쇄 가변 도메인 중에 서열번호 246 내지 248의 HVR을 포함하고, 여기에서 각 HVR 중 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
130. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제129 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인 중에 서열번호 249, 250 및 245의 HVR 및 경쇄 가변 도메인 중에 서열번호 251 내지 253의 HVR을 포함하고, 여기에서 각 HVR 중 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
131. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제130 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인은 서열번호 254로 이루어진 중쇄 가변 도메인으로부터 유래되고 경쇄 가변 도메인은 서열번호 255로 이루어진 경쇄 가변 도메인으로부터 유래된다.
132. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제131 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 중쇄 중에 서열번호 256 내지 258의 HVR 및 경쇄 중에 서열번호 259 내지 261의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
133. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제132 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 중쇄 중에 서열번호 262, 263 및 258의 HVR 및 경쇄 중에 서열번호 264 내지 266의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
134. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제133 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 서열번호 267로 이루어진 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 268로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
135. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제134 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 서열번호 267로 이루어진 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 268로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 인간화시킴으로써 획득되었다.
136. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제135 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인 중에 서열번호 256 내지 258의 HVR 및 경쇄 가변 도메인 중에 서열번호 259 내지 261의 HVR을 포함하고, 여기에서 각 HVR 중 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
137. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제136 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인 중에 서열번호 262, 263 및 258의 HVR 및 경쇄 가변 도메인 중에 서열번호 264 내지 266의 HVR을 포함하고, 여기에서 각 HVR 중 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
138. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제137 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인은 서열번호 267로 이루어진 중쇄 가변 도메인으로부터 유래되고 경쇄 가변 도메인은 서열번호 268로 이루어진 경쇄 가변 도메인으로부터 유래된다.
139. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제138 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 중쇄 중에 서열번호 269 내지 271의 HVR 및 경쇄 중에 서열번호 272 내지 274의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
140. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제139 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 중쇄 중에 서열번호 269, 275 및 271의 HVR 및 경쇄 중에 서열번호 276 내지 278의 HVR을 포함하는 항체와 동일한 에피토프에 결합한다.
141. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제140 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 서열번호 279로 이루어진 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 280으로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
142. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제141 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 서열번호 279로 이루어진 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 280으로 이루어진 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체를 인간화시킴으로써 획득되었다.
143. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제142 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인 중에 서열번호 269 내지 271의 HVR 및 경쇄 가변 도메인 중에 서열번호 272 내지 274의 HVR을 포함하고, 여기에서 각 HVR 중 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
144. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제143 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인 중에 서열번호 269, 275 및 271의 HVR 및 경쇄 가변 도메인 중에 서열번호 276 내지 278의 HVR을 포함하고, 여기에서 각 HVR 중 3개 이하의 아미노산 잔기가 변화될 수 있다.
145. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제144 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 인간화된 항체이며 중쇄 가변 도메인은 서열번호 279로 이루어진 중쇄 가변 도메인으로부터 유래되고 경쇄 가변 도메인은 서열번호 280으로 이루어진 경쇄 가변 도메인으로부터 유래된다.
146. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제121 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 합텐화된 페이로드는 합텐화된 전장 항-인간 Tau(pS422) 항체이다.
147. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양, 제45 실시태양 내지 제121 실시태양 및 제146 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 합텐화된 페이로드는 422번 위치의 세린에서 인산화된 인간 Tau에 특이적으로 결합하는 합텐화된 항-인간 Tau(pS422) 항체 단편이다.
148. 제146 실시태양 또는 제147 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 합텐은 비오틴이다.
149. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양, 제45 실시태양 내지 제121 실시태양 및 제146 실시태양 내지 제148 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항-인간 Tau(pS422) 항체는
a) 중쇄 가변 도메인에 서열번호 230, 239 및 232의 HVR, 또는
b) 중쇄 가변 도메인에 서열번호 230, 231 및 232의 HVR
을 포함한다.
150. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양, 제45 실시태양 내지 제121 실시태양 및 제146 실시태양 내지 제149 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는
a) 경쇄 가변 도메인에 서열번호 234, 235 및 236의 HVR, 또는
b) 경쇄 가변 도메인에 서열번호 233, 229 및 236의 HVR
을 추가로 포함한다.
151. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양, 제45 실시태양 내지 제121 실시태양 및 제146 실시태양 내지 제150 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는
a) 중쇄 가변 도메인에 서열번호 230, 239 및 232의 HVR, 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 234, 235 및 236의 HVR, 또는
b) 중쇄 가변 도메인에 서열번호 230, 231 및 232의 HVR, 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 233, 229 및 236의 HVR, 또는
c) 중쇄 가변 도메인에 서열번호 230, 231 및 232의 HVR, 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 234, 235 및 236의 HVR
을 포함한다.
152. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양, 제45 실시태양 내지 제121 실시태양 및 제146 실시태양 내지 제151 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는
a) 서열번호 241의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 238의 경쇄 가변 도메인, 또는
b) 서열번호 240의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 237의 경쇄 가변 도메인, 또는
c) 서열번호 240의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 238의 경쇄 가변 도메인, 또는
d) 서열번호 242의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 238의 경쇄 가변 도메인
을 포함한다.
153. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양 및 제45 실시태양 내지 제121 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 합텐화된 페이로드는 합텐화된 전장 항-A베타 항체이다.
154. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양, 제45 실시태양 내지 제121 실시태양 및 제154 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 합텐화된 페이로드는 인간 A베타에 특이적으로 결합하는 합텐화된 항-A베타 항체 단편이다.
155. 제153 실시태양 또는 제154 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 합텐은 비오틴이다.
156. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양, 제45 실시태양 내지 제121 실시태양 및 제153 실시태양 내지 제155 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 항-A베타 항체는 중쇄 가변 도메인에 서열번호 281, 282 및 283의 HVR을 포함한다.
157. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양, 제45 실시태양 내지 제121 실시태양 및 제153 실시태양 내지 제156 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 경쇄 가변 도메인에 서열번호 284, 285 및 286의 HVR을 추가로 포함한다.
158. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양, 제45 실시태양 내지 제121 실시태양 및 제153 실시태양 내지 제157 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는 중쇄 가변 도메인에 서열번호 281, 282 및 283의 HVR 및 경쇄 가변 도메인에 서열번호 284, 285 및 286의 HVR을 포함한다.
159. 제1 실시태양 내지 제38 실시태양, 제40 실시태양, 제43 실시태양, 제45 실시태양 내지 제121 실시태양 및 제153 실시태양 내지 제158 실시태양 중 어느 한 실시태양에 따른 복합체 또는 접합체에서, 상기 항체는
a) 서열번호 287의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 290의 경쇄 가변 도메인, 또는
b) 서열번호 288의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 291의 경쇄 가변 도메인, 또는
c) 서열번호 289의 중쇄 가변 도메인 및 서열번호 292의 경쇄 가변 도메인
을 포함한다.
160. 제1 실시태양 내지 제159 실시태양 중 어느 한 항에 따른 복합체 또는 접합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 제형.
161. 약제로서 사용하기 위한 제1 실시태양 내지 제159 실시태양 중 어느 한 항에 따른 복합체 또는 접합체.
162. 암 또는 신경학적 질환의 치료를 위한 제1 실시태양 내지 제159 실시태양 중 어느 한 항에 따른 접합체.
163. 약제의 제조에서 제1 실시태양 내지 제159 실시태양 중 어느 한 항에 따른 복합체 또는 접합체의 용도.
164. 제163 실시태양에 따른 용도에서, 상기 약제는 암 치료용이다.
165. 제163 실시태양에 따른 용도에서, 상기 약제는 신경학적 질환의 치료용이다.
166. 제165 실시태양에 따른 용도에서, 상기 신경학적 질환은 알쯔하이머병(AD)(비제한적으로 경도 인지 장애 및 전구성 AD), 뇌졸중, 치매, 근이영양증(MD), 다발성 경화증(MS), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 낭성 섬유증, 앤젤만 증후군, 리들 증후군, 파킨슨병, 픽병, 파제트병, 암(예를 들어 CNS 또는 뇌를 침범한 암), 및 외상성 뇌 손상 중에서 선택된다.
167. 진단제로서 제1 실시태양 내지 제159 실시태양 중 어느 한 항에 따른 복합체 또는 접합체의 용도.
168. 페이로드의 안정성을 증가시키기 위한 제1 실시태양 내지 제159 실시태양 중 어느 한 항에 따른 복합체 또는 접합체의 용도.
169. 페이로드의 활성을 증가시키기 위한 제1 실시태양 내지 제159 실시태양 중 어느 한 항에 따른 복합체 또는 접합체의 용도.
170. 페이로드의 생체내 반감기를 증가시키기 위한 제1 실시태양 내지 제159 실시태양 중 어느 한 항에 따른 복합체 또는 접합체의 용도.
171. 질병의 치료에서 제1 실시태양 내지 제159 실시태양 중 어느 한 항에 따른 복합체 또는 접합체의 용도.
172. 질병이 있는 개체에게 유효량의 제1 실시태양 내지 제159 실시태양 중 어느 한 항에 따른 복합체 또는 접합체를 투여함을 포함하는 상기 개체의 치료 방법.
173. 개체에게 유효량의 제1 실시태양 내지 제159 실시태양 중 어느 한 항에 따른 복합체 또는 접합체를 투여함을 포함하는 상기 개체의 질병의 치료 방법.
174. 제171 실시태양 내지 제173 실시태양 중 어느 한 항에 따른 용도 또는 방법에서, 상기 질병은 암이다.
175. 제171 실시태양 내지 제173 실시태양 중 어느 한 항에 따른 용도 또는 방법에서, 상기 질병은 신경학적 질환이다.
176. 제175 실시태양에 따른 용도 또는 방법에서, 상기 신경학적 질환은 알쯔하이머병(AD)(비제한적으로 경도 인지 장애 및 전구성 AD), 뇌졸중, 치매, 근이영양증(MD), 다발성 경화증(MS), 근위축성 측삭 경화증(ALS), 낭성 섬유증, 앤젤만 증후군, 리들 증후군, 파킨슨병, 픽병, 파제트병, 암(예를 들어 CNS 또는 뇌를 침범한 암), 및 외상성 뇌 손상 중에서 선택된다.
177. 혈액뇌장벽을 가로질러 합텐화된 페이로드의 표적화된 전달을 위한 제1 실시태양 내지 제159 실시태양 중 어느 한 항에 따른 복합체 또는 접합체의 용도.
178. 제177 실시태양에 따른 용도에서, 상기 용도는 혈액뇌장벽을 가로질러 유리(즉 단리된) 합텐화된 페이로드의 표적화된 전달을 위한 것이다.
179. 혈액뇌장벽을 가로질러 합텐화된 페이로드의 표적화된 전달 및 상기 혈액뇌장벽내 또는 상기 뇌 중의 합텐화된 페이로드의 방출을 위한 제1 실시태양, 제2 실시태양 및 제4 실시태양 내지 제159 실시태양 중 어느 한 항에 따른 복합체의 용도.
180. 제179 실시태양에 따른 용도에서, 상기 합텐화된 페이로드의 전달은 상기 이중특이성 항체 또는 복합체의 부재하에서의 전달에 비해 더 높다.
181. 제180 실시태양에 따른 용도에서, 상기 전달은 2배 더 높다.
182. 제180 실시태양 또는 제181 실시태양에 따른 용도에서, 상기 전달은 10배 더 높다.
183. 제179 실시태양 내지 제182 실시태양 중 어느 한 항에 따른 용도에서, 상기 합텐화된 페이로드는 상기 이중특이성 항체 또는 복합체의 존재하에서보다 상기 이중특이성 항체 또는 복합체의 부재하에서 더 높은 생물 활성을 갖는다.
184. 제183 실시태양에 따른 용도에서, 상기 생물 활성은 상기 이중특이성 항체 또는 복합체의 부재하에서 2배 더 높다.
185. 제183 실시태양 또는 제184 실시태양에 따른 용도에서, 상기 생물 활성은 상기 이중특이성 항체 또는 복합체의 부재하에서 10배 더 높다.
본 발명에 인용된 모든 참고문헌들의 내용은 본 발명에 참고로 인용된다.
하기의 실시예, 도면 및 서열은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 그의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 진술된다. 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 상기 제시된 과정에서 변형을 수행할 수 있는 것으로 생각된다.
실시예
실시예 1
마우스 하이브리도마로부터의 카파 경쇄를 갖는 IgG1 부류의 쥐 항-디곡시제닌 항체 및 쥐 항-비오틴 항체의 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 cDNA의 단리 및 특성화
항-디곡시제닌 항체의 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 cDNA의 단리 및 특성화, RNA 제조, DNA 단편의 생성, DNA 단편의 플라스미드 내로의 클로닝 및 DNA- 및 아미노산 서열의 측정이 각각 WO 2011/003557 및 WO 2011/003780에 개시되었다.
상기 쥐 합텐-결합 항체의 VH 및 VL 도메인의 단백질 및 (DNA) 서열 정보를 하이브리도마 클론들로부터 직접적으로 획득하였다. 수행된 실험 단계들은 연속적으로 (i) 항체 생산 하이브리도마 세포로부터 RNA의 단리, (ii) 상기 RNA의 cDNA로의 전환, VH 및 VL 함유 PCR 단편내로의 전달, 및 (iii) 에스케리키아 콜라이에서의 번식을 위한 상기 PCR 단편의 플라스미드 벡터에의 통합 및 이들의 DNA(및 추론된 단백질) 서열의 측정이었다.
하이브리도마 세포로부터 RNA 제조:
RNA를 RNAeasy-키트(퀴아겐(Qiagen))를 적용하여 5 x 106 항체 발현 하이브리도마 세포로부터 제조하였다. 간단히, 상기 침강된 세포를 PBS 중에서 1회 세척하고 후속으로 500 ㎕ RLT-완충제(+β-ME) 중에 용해를 위해 재현탁시켰다. 상기 세포를 퀴아슈레더(Qiashredder)(퀴아겐)에 통과시킴으로써 완전히 용해시키고 이어서 제조사의 매뉴얼에 개시된 바와 같이 기질-매개된 정제 과정(ETOH, RNAeasy 컬럼)을 가하였다. 최종 세척 단계 후에, 50 ㎕ RNAse-없는 수 중에서 상기 컬럼으로부터 RNA를 회수하였다. 상기 회수된 RNA의 농도를 1:20 희석된 샘플의 A260 및 A280의 정량분석에 의해 측정하였다. 상기 단리된 RNA 샘플의 보전(질, 분해 정도)을 폼아미드-아가로스 젤상에서 변성 RNA 젤 전기영동에 의해 분석하였다(마니아티스(Maniatis) 매뉴얼 참조). 완전한 18s 및 28s 리보솜 RNA를 나타내는 분리된 밴드들을 획득하였으며 이들 밴드의 완전성(및 대략 2:1 강도 비)은 상기 RNA 제제의 양호한 질을 암시하였다. 상기 하이브리도마로부터 단리된 RNA를 동결시키고 -80 ℃에서 나누어 보관하였다.
RACE PCR에 의한 VL 및 VH 암호화 DNA 단편의 생성, 상기 DNA 단편의 플라스 미드내로의 클로닝 및 그의 DNA- 및 아미노산 서열의 측정
후속(RACE-) PCR 반응을 위한 cDNA를 국제 특허 출원 WO 2012/093068에 개시된 바와 같은 기술을 적용시켜 RNA 제제로부터 제조하였다. 후속으로, 상기 VH 및 VL-암호화 PCR 단편을 아가로스 젤 추출에 의해 단리하고 표준 분자 생물학 기법에 의해 후속 정제하였다. PWO-생성된 정제된 PCR 단편을 정확히 제조사의 설명에 따라 pCR 블런트(blunt)II 토포 키트(인비트로젠(Invitrogen))를 적용하여 벡터 pCR 블런트II 토포내에 삽입하였다. 상기 토포-연결 반응을 에스케리키아 콜라이 토포 10-원-샷 수용 세포로 형질전환시켰다. 그 후에, VL- 또는 VH 함유 삽입물을 갖는 벡터를 함유하는 에스케리키아 콜라이 클론을 LB-가나마이신 아가 플레이트상에서 콜로니로서 동정하였다. 플라스미드를 상기 콜로니로부터 제조하고 상기 벡터 중의 목적하는 삽입물의 존재를 EcoRI에 의한 제한 절단에 의해 확인하였다. 상기 벡터 주쇄가 상기 삽입물의 양쪽에 인접한 EcoRI 제한 인식 부위를 함유하기 때문에, 삽입물을 갖는 플라스미드는 대략 800 bp(VL의 경우) 또는 600 bp(VH의 경우)의 EcoRI-방출성 삽입물을 가짐에 의해 한정되었다. 상기 DNA 서열 및 상기 VL 및 VH의 추론된 단백질 서열은 VH 및 VL에 대한 다수 클론상에서의 자동화된 DNA 서열분석에 의해 측정되었다.
상기 항-비오틴 항체의 쥐 VL 서열을 서열번호 40에 나타낸다. 상기 항-비오틴 항체의 쥐 VH 서열을 서열번호 36에 나타낸다.
상기 항-디곡시제닌 항체의 쥐 VL 서열을 서열번호 8에 나타낸다. 상기 항-디곡시제닌 항체의 쥐 VH 서열을 서열번호 4에 나타낸다.
실시예 2
마우스 하이브리도마로부터의 카파 경쇄를 갖는 IgG1 부류의 쥐 항-테오필린 항체의 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 cDNA의 단리 및 특성화
상기 항-테오필린 항체의 서열을 실시예 1에 개략된 바와 같이 획득하였다.
상기 항-테오필린 항체의 쥐 VL 서열을 서열번호 72에 나타낸다. 상기 항-테오필린 항체의 주 VH 서열을 서열번호 68에 나타낸다.
실시예 3
쥐 항-디곡시제닌 항체 및 항-비오틴 항체의 VH 및 VL 도메인의 인간화
상기 디곡시제닌-결합 항체의 인간화된 변이체의 생성은 WO 2011/003557 및 WO 2011/003780에 상세히 개시되었다. 쥐 비오틴-결합 항체 muM33이 하기와 유사한 방식으로 인간화되었다:
마우스 하이브리도마로부터의 카파 경쇄를 갖는 IgG1 부류의 쥐 항-비오틴 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 암호화 서열 및 아미노산 서열의 생성 및 특성화가 WO 2011/003557 및 WO 2011/003780에 개시되어 있다. 상기 정보를 기반으로, 상응하는 인간화된 항-비오틴 항체를 인간 생식세포계열 프레임워크 IGHV1-69-02 및 IGKV1-27-01 조합을 기본으로 생성시켰다(huM33). VL의 경우, 상기 인간 IGKV1-27-01 및 상기 IGKJ2-01 생식세포계열의 인간 J 요소의 프레임워크에 임의의 복귀 돌연변이를 통합시킬 필요는 없었다. 상기 인간화된 VH는 인간 IGHV1-69-02 생식세포계열 및 상기 IGHJ4-01-3 생식세포계열의 인간 J 요소를 기본으로 한다. 프레임워크 영역 1중의 24번 위치(A24S) 및 프레임워크 영역 3중의 73번 위치(K73T)에 2개의 복귀 돌연변이를 도입시켰다. 상기 인간화된 VH의 아미노산 서열을 서열번호 44에 나타내고 상기 인간화된 VL의 아미노산 서열을 서열번호 48에 나타낸다.
실시예 4
쥐 항-테오필린 항체의 VH 및 VL 도메인의 인간화
상기 쥐 테오필린-결합 항체를 하기와 같이 인간화하였다: 인간화된 항-테오필린 항체를 인간 생식세포계열 프레임워크 IGHV4-31-02 및 IGKV2-30-01 조합을 기본으로 생성시켰다. 상기 인간화된 VH는 인간 IGHV4-31-02 생식세포계열 및 IGHJ4-01-3 생식세포계열의 인간 J 요소를 기본으로 한다. 프레임워크 영역 3중의 71번 위치에 하나의 복귀 돌연변이(V71R)를 도입시켰다. 상기 인간화된 VL은 인간 IGHV2-30-01 생식세포계열 및 IGKJ2-01 생식세포계열의 인간 J 요소를 기본으로 한다. 프레임워크 영역 2중의 46번 위치에 하나의 복귀 돌연변이(R46L)를 도입시켰다. 상기 인간화된 VH의 아미노산 서열을 서열번호 76에 나타내고 상기 인간화된 VL의 아미노산 서열을 서열번호 80에 나타낸다.
실시예 5
디곡시제닌 존재하의 쥐 항-디곡시제닌 Fv 영역의 결합 영역, 및 비오틴 존재하의 쥐 항-비오틴 Fv 영역의 결합 영역의 결정화 및 X-선 구조 측정
상기 디곡시제닌-결합 항체의 Fab 단편의 구조의 측정은 WO　2011/003557 및 WO　2011/003780에 상세히 개시되었으며, 문헌[Metz, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 8194-8199]에 또한 공개되었다(3RA7).
상기 쥐 항-비오틴 항체의 구조를 측정하였다. 따라서, Fab 단편을 주지된 상태의 당해 분야의 방법(파파인 절단)을 적용하여, 정제된 IgG의 프로테아제 절단에 의해 생성시키고 후속으로 정제하였다.
20 mM His-HCl 중의 apo Fab 단편(정제된 Fab)의 결정화를 위해서, 140 mM NaCl, pH 6.0을 13 ㎎/㎖로 농축시켰다. 증기 확산 시팅 드롭(sitting drop) 실험에서 21 ℃에서 0.2 ㎕의 단백질 용액을 0.2 ㎕의 저장 용액과 혼합하여 결정화 소적을 제공하였다. 결정이 5일 이내에 0.1M 트리스 pH 8.5, 0.01M 코발트 클로라이드, 20% 폴리비닐피롤리돈 K15로부터 나타났으며 8일 이내에 0.3 ㎜ x 0.06 ㎜ x 0.03 ㎜의 최종 크기로 성장하였다.
결정을 저온보호물질로서 15% 글리세롤로 수확하고 이어서 액체 N2 중에서 급속 동결시켰다. 회절 영상들을 스위스 라이트 소스(Swiss Light Source)의 광선 X10SA에서 100K의 온도로 필라투스(Pilatus) 6M 검출기로 수집하고, 프로그램 XDS(문헌[Kabsch, W., J.　Appl. Cryst. 26 (1993) 795-800])로 처리하고 SCALA(브루커(BRUKER) AXS로부터 획득됨)로 평가하여, 데이터를 2.22 Å 분해능으로 제공하였다. 상기 Fab 단편 결정은 a=90.23 Å b=118.45 Å c=96.79 Å 및 β=117.53°의 세포 치수를 갖는 단사정계 공간군 P21에 속하며 결정학적 비대칭 단위당 4개의 Fab 분자를 함유한다(표 3 참조).
CCP4 소프트웨어 스윗으로부터의 표준 결정학 프로그램을 사용하여 상기 구조를 검색 모델로서 PDB 엔트리 3PQP에 의한 분자 치환에 의해 분석하여 전자 밀도를 계산하고, x-선 구조를 정제하였다(CCP4, 문헌[Collaborative Computational Project, Acta Crystallogr. D, 760-763 (1994)]). 상기 구조 모델을 COOT를 사용하여 전자 밀도로 재건하였다(문헌[Emsley, P., et al. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60 (2010) 486-501]). 좌표를 REFMAC5(문헌[Murshudov, G.N., et al. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53 (1997) 240-55]) 및 autoBUSTER(글로벌 페이싱 리미티드(Global Phasing Ltd.))로 정제하였다.
단사정계 muM33 Fab 단편 apo -결정에 대한 데이터 수집 및 구조 정제 통계
데이터 수집
파장 (Å) 1.0
분해능1 (Å) 2.22 (2.34-2.22)
독특한 반사1 77716 (11301)
완전성 (%)1 98.0 (100)
Rmerge (%)1,2 6.4 (44.4)
<I/s>1 8.3 (1.7)
단위 세포 (공간군 C2) a=90.23 Å b=118.45 Å c=96.73 Å 및 β=117.53°
정제
분해능 (Å) 2.2 (2.28-2.22)
Rcryst 1 ,3 20.66 (21.84))
Rfree 1 ,4 25.23 (26.47)
정제 중 원자의 수 13314
이상으로부터 R.m.s. 편차
결합 길이(Å)/각도(°)		 0.01 / 1.21
주쇄 이면각(%)
가장 유리함/허용됨/관용/허용되지 않음 5 		90.4 / 9.1 / 0.3 / 0.2
1 괄호 안의 값들은 최고 분해능 궤를 지칭한다.
2 Rmerge=∑│I-<I>│∑I (여기에서 I는 강도이다).
3 Rcryst=∑│F0-<Fc>│∑Fo (여기에서 Fo는 관측치이고 Fc는 계산된 구조 인자 폭이다).
4 Rfree 는 정제 중 생략된 전체 데이터의 5%를 기준으로 계산되었다.
5 PROCHECK(문헌[Laskowski, R.A., et al., J. Appl. Crystallogr. 26, 283-291 (1993)])에 의해 계산됨.
비오틴-유도체와의 복합체 중 Fab-단편의 결정화를 위해서, 침액 실험에 사용된 Fab 단편의 apo 결정은 선별후 3일 이내에 0.8M 숙신산으로부터 유래되었고 5일 이내에 0.25 ㎜ x 0.04 ㎜ x 0.04 ㎜의 최종 크기로 성장하였다. 바이오시틴아미드를 수중에 100 mM로 용해시켰다. 후속으로, 상기 화합물을 결정화 용액 중에서 10 mM 작용 농도로 희석하고 상기 결정화 소적 중의 결정에 적용하였다. 결정을 2 ㎕의 10 mM 화합물 용액으로 3회 세척하고 최종적으로 21 ℃에서 바이오시틴아미드와 함께 16시간 동안 배양하였다.
결정을 저온보호물질로서 15% 글리세롤로 수확하고 이어서 액체 N2 중에서 급속 동결시켰다. 회절 영상들을 스위스 라이트 소스의 광선 X10SA에서 100K의 온도로 필라투스 6M 검출기로 수집하고, 프로그램 XDS(문헌[Kabsch, W., J.　Appl. Cryst. 26 (1993) 795-800])로 처리하고 SCALA(브루커 AXS로부터 획득됨)로 평가하여, 데이터를 2.35 Å 분해능으로 제공하였다. 상기 Fab 단편 결정은 a=89.09 Å b=119.62 Å c=96.18 Å 및 β=117.15°의 세포 치수를 갖는 단사정계 공간군 P21에 속하며 결정학적 비대칭 단위당 4개의 Fab 분자를 함유한다(표 4 참조).
CCP4 소프트웨어 스윗으로부터의 표준 결정학 프로그램을 사용하여 상기 구조를 검색 모델로서 apo Fab 단편의 좌표와 함께 분자 치환에 의해 분석하여 전자 밀도를 계산하고, x-선 구조를 2.5 Å(CCP4)의 분해능으로 정제하였다. 상기 구조 모델을 COOT를 사용하여 전자 밀도로 재건하였다(문헌[Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W.G. 및 Cowtan, K. Features and development of COOT. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 486-501 (2010)]). 좌표를 REFMAC5(문헌[Murshudov, G.N., et al. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 53 (1997) 240-255]) 및 autoBUSTER(글로벌 페이싱 리미티드)로 정제하였다.
단사정계 muM33 Fab 단편 바이오시틴아미드 복합체 결정에 대한 데이터 수집 및 구조 정제 통계
데이터 수집
파장 (Å) 1.0
분해능1 (Å) 2.35 (2.45-2.35)
독특한 반사1 74645 (8714)
완전성 (%)1 99.9 (99.9)
Rmerge (%)1,2 6.30 (65.00)
<I/s>1 10.29 (1.18)
단위 세포 (공간군 C2) a=89.09 Å b=119.62 Å c=96.18 Å 및 β=117.15°
정제
분해능 (Å) 2.5 (2.565-2.500)
Rcryst 1 ,3 20.92 (36.86))
Rfree 1 ,4 27.56 (47.5)
정제 중 원자의 수 13656
이상으로부터 R.m.s. 편차
결합 길이(Å)/각도(°)		 0.009 / 1.43
주쇄 이면각(%)
가장 유리함/허용됨/관용/허용되지 않음 5 		87.5 / 12.0 / 0.2 / 0.3
1 괄호 안의 값들은 최고 분해능 궤를 지칭한다.
2 Rmerge=∑│I-<I>│∑I (여기에서 I는 강도이다).
3 Rcryst=∑│F0-<Fc>│∑Fo (여기에서 Fo는 관측치이고 Fc는 계산된 구조 인자 폭이다).
4 Rfree 는 정제 중 생략된 전체 데이터의 5%를 기준으로 계산되었다.
5 PROCHECK(문헌[Laskowski, R.A., MacArthur, M.W., Moss, D.S. 및 Thornton, J.M. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structure. J. Appl. Crystallogr. 26, 283-291 (1993)])에 의해 계산됨.
상기 실험 구조 측정의 결과를 도 33에 나타낸다. 상기 복합체의 결정 형태는 비대칭 단위 중에 4개의 독립적인 바이오시틴아미드:항-비오틴 Fab 복합체를 함유하였으며, 이때 바이오시틴아미드는 모든 Fab 분자들에 의해 유사하게 결합되었다. 바이오시틴아미드는 중쇄의 CDR1 및 3, 및 3개의 경쇄 CDR 모두에 의해 형성된 포켓 중에서 결합된다. 상기 리간드의 결합 포켓은 상기 중쇄로부터의 잔기 ASN29, ASP31, THR32, PHE33, GLN35, TRP99 및 TRP106, 및 상기 경쇄로부터의 잔기 ASN31, TYR32, LEU33, SER34, TYR49, SER50, PHE91 및 TYR96에 의해 한정된다. 상기 비오틴 헤드 그룹은 상기 포켓의 한 쪽 단부에서 CDR2 및 CDR1의 잔기들과 수소 결합을 형성한다: 바이오시틴아미드의 N3은 Ser50의 하이드록실-산소와 상호작용하는 반면 O22는 동일한 잔기의 주쇄-아미드 질소와 접촉한다. 또한, 바이오시틴아미드의 O22는 또한 Ser34의 하이드록실-기 산소에 수소-결합된다. 상기 외에, 바이오시틴아미드와 상기 결합 포켓 내층의 방향족 측쇄 사이에 소수성 상호작용이 관찰된다. 상기 비오틴의 (CH2)4 지방족 꼬리의 단부의 아미드 결합은 중쇄 CDR1의 PHE33상에 적층되고 PHE33의 주쇄 아미드 질소 및 Asp31에의 추가적인 수소 결합에 의해 안정화된다. 이는 상기 활성 존재에 대한 결합 부위인 아미드 질소를, 질소 다음에 있는 원자들이 용매를 향해 상기 결합 포켓에서 멀리 가리키는 방식으로 위치시킨다.
2.5 Å의 분해능에서 상기 결합 영역의 실험 측정 결과는 상기 리간드의 그의 항체에의 결합 방식을 특성화할 수 있게 하며, 이는 재조합 비오틴 결합 모듈의 단백질 공학을 통한 상세한 모델링 및 추가의 개선에 선행 요건이다.
실시예 6
공유 접합을 위해 도입된 작용기를 갖는 항-합텐 항체의 정의 및 생성
상술한 항-합텐 항체의 인간화된 VH 및 VL 서열의 유도체화를 수행하여, 한정된 위치에서 상기 항체에의 항원/합텐의 공유 커플링을 허용하는 화합물을 생성시켰다.
디곡시제닌에 결합된 항-디곡시제닌 Fab-단편의 실험적으로 결정된 구조(3RA7)(문헌[Metz, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (2011) 8194-8199])를 사용하여, 변경이 상기 항체와 그의 복합체화된 항원/합텐간에 부위-지향된 커플링 반응이 일어날 수 있게 하는 위치를 확인하였다. 상기 바이오시틴아미드에 결합된 항-비오틴 Fab-단편의 구조(실시예 5 참조)를 사용하여 상기 비오틴-결합 항체 단편에 대한 상기 도입된 시스테인 잔기의 올바른 위치를 확인하고 상기 확인된 위치(들)의 일반적인 적용가능성의 증거를 제공하였다.
상기 돌연변이되는 위치는 2가지 요건을 동시에 충족시켜야 한다: (i) 상기 커플링 위치는 직접 커플링에 상기 항원/합텐 위치결정 효과를 사용하기 위해 상기 결합 영역에 근접하여 위치하여야 하며, (ii) 상기 돌연변이 및 커플링 위치는 항원/합텐 결합이 단독으로 영향을 받지 않는 방식으로 위치하여야 한다. 적합한 위치를 찾기 위한 이들 요건은 사실상, 요건 (i)은 상기 결합 부위에 가까운 위치에 의해 최선으로 제공되는 반면, 요건 (ii)는 상기 결합 부위로부터 먼 위치에 의해 가장 안전하게 성취되므로 서로 '상충'된다.
실질적으로 상기 요건들을 배제시킴에도 불구하고, 본 발명자들은 합텐 위치결정에 영향을 미치지 않으면서 돌연변이될 수 있고 그럼에도 불구하고 합텐화된 화합물의 지시된 공유 커플링을 동시에 허용할 수 있는 위치들을 확인할 수 있었다.
첫 번째 위치는 각 항체의 CDR2의 실제 길이에 따라 변하는 상기 카밧 넘버링에 따르는 VH52b 또는 VH53번 위치에 위치한다. 상기 항-디곡시제닌 항체 구조에서, 상기 합텐은 소수성 잔기에 의해 형성된 깊은 포켓에 결합된다. 형광성 디곡시제닌-Cy5 접합체가 상기 결정학 연구에 사용되었으며, 여기에서 디곡시제닌과 Cy5 사이의 링커뿐만 아니라 형광단을, 상기 결정 중의 높은 가요성 및 생성되는 무질서로 인해 상기 구조에서 볼 수 없었다. 그러나, 상기 링커 및 Cy5는 상기 중쇄의 CDR2의 방향을 가리키는 디곡시제닌의 O32에 부착된다. 카밧 넘버링에 따른 52b번 위치의 아미노산 잔기의 Cα까지의 디곡시제닌의 O32(상기 참조)간의 거리는 10.5 Å이다.
Cys에 의한 VH52b/VH53번 위치의 아미노산의 치환은 항-디곡시제닌 항체-VH52bC에 대해 서열번호 20 및 28, 항-테오필린 항체-VH53C에 대해 서열번호 84 및 92, 항-비오틴 항체-VH53C에 대해 서열번호 52 및 60, 및 항-플루오레세인 항체-VH52bC에 대해 서열번호 108로서 나열된 중쇄 가변 영역 서열들을 갖는 항체 유도체를 생성시켰다.
변형점으로서 확인된 추가의 위치는 카밧 넘버링에 따른 VH28번 위치이다.
결과적으로, 시스테인을 VH28번 카밧 위치에 도입시켰다. VH28번 위치의 아미노산의 Cys에 의한 치환은 항-디곡시제닌 항체-VH28C에 대해 서열번호 124 및 132, 항-테오필린 항체-VH28C에 대해 서열번호 156 및 164, 항-비오틴 항체-VH28C에 대해 서열번호 140 및 148, 및 항-플루오레세인 항체-VH28C에 대해 서열번호 116으로서 나열된 중쇄 가변 영역 서열들을 갖는 항체 유도체를 생성시켰다.
이들 위치 중 하나는 '범용' 위치, 즉 어떠한 항체에도 적용 가능한 위치이며, 따라서 매번 처음부터, 상기 결정 구조를 제공하고 합텐-위치한 공유 커플링을 가능하게 하는 적합한 위치를 결정함으로써 신규 항체를 변형시켜야 할 필요가 없는 것으로 밝혀졌다.
각각 카밧 중쇄 가변 영역 넘버링에 따른 돌연변이 VH52bC 또는 VH53C를 각각의 합텐-결합 항체(항-합텐 항체)에 사용할 수 있었다. 상기 항체들 및 이들의 결합 포켓의 구조가 매우 다양하다 하더라도, 상기 VH52bC/VH53C 돌연변이를 디곡시제닌, 비오틴, 플루오레세인뿐만 아니라 테오필린에 결합하는 항체에의 항원/합텐의 공유 부착에 사용할 수 있음이 입증되었다.
이들 서열로 구성된 결합 존재들을 표준 단백질 A- 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 발현 및 정제시킬 수 있었다(실시예 7 참조). 생성되는 분자들은 충분히 기능성이며 그들의 변형되지 않은 모 분자와 동일한 방식으로 그들의 동족 합텐에 대한 친화성을 보유하였다. 이는 표면-플라스몬-공명(SPR) 실험에 의해 입증되었다(실시예 9 참조).
실시예 7
재조합 항-합텐 항체의 조성, 발현 및 정제
쥐 및 인간화된 항-합텐 항체 가변 영역들을 인간 기원의 불변 영역들과 합하여 단일- 또는 이중특이성 키메릭 또는 인간화된 항체를 형성시켰다.
합텐뿐만 아니라 상이한 비-합텐 표적(예를 들어 수용체 타이로신 키나제 또는 IGF-1R)에 특이적으로 결합하는 단일특이성 인간화된 항-합텐 항체 및 이중특이성 인간화된 항-합텐 항체의 생성은 (i) 상기와 같은 분자에 대한 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열의 디자인 및 정의, (ii) 형질감염된 배양된 포유동물 세포에서 상기 분자의 발현, 및 (iii) 형질감염된 세포의 상등액으로부터 상기 분자의 정제를 필요로 하였다. 이들 단계를 앞서 WO 2012/093068에 개시된 바와 같이 수행하였다.
일반적으로, (원래) 쥐 항-합텐 항체의 결합 특이성을 갖는 IgG 부류의 인간화된 항체를 생성시키기 위해서, 상기 인간화된 VH 서열을 하위부류 IgG1의 인간 Fc-영역의 CH1-힌지-CH2-CH3의 N-말단에 인프레임 융합시켰다. 유사하게, 상기 인간화된 VL 서열을 인간 CL카파 불변 영역의 N-말단에 인프레임 융합시켰다.
상기 합텐-결합 특이성뿐만 아니라 다른 표적들에 대한 특이성을 함유하는 이중특이성 항체 유도체를 생성시키기 위해서, 상기 항-합텐 항체, scFv 또는 Fab 단편을 앞서 개시된 항체의 중쇄의 C-말단에 인프레임 융합시켰다. 다수의 경우에, 상기 적용된 항-합텐 scFv를 앞서 개시된 VH44-VL100 다이설파이드 결합의 도입에 의해 추가로 안정화시켰다(예를 들어 문헌[Reiter, Y., et al., Nature biotechnology 14 (1996) 1239-1245]).
발현 플라스미드
상기 중쇄 및 경쇄의 발현에 대한 발현 카세트를 포함하는 발현 플라스미드를 포유동물 세포 발현 벡터에서 별도로 조립하였다.
이에 의해 개별적인 요소들을 암호화하는 유전자 분절들을 상기 개략된 바와 같이 결합시켰다.
코돈 사용을 추론할 수 있는 인간 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오타이드 서열에 과한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication No 91-3242]에 제공되어 있다.
상기 κ-경쇄의 전사 단위는 하기의 요소들로 구성된다:
- 인간 거대세포바이러스(hCMV)로부터의 초기 인헨서 및 프로모터,
- 코작(kozak) 서열을 포함하는 합성 5'-UT,
- 신호 서열 인트론을 포함하는 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 5' 단부에 독특한 BsmI 제한 부위 및 이어 맞추기 공여체 부위, 및 3' 단부에 독특한 NotI 제한 부위가 배열된 클로닝된 가변 경쇄 cDNA,
- 인트론 2 마우스 Ig-κ 인헨서를 포함한, 게놈 인간 κ-유전자 불변 영역(문헌[Picard, D., and Schaffner, W. Nature 307 (1984) 80-82]), 및
- 인간 면역글로불린 κ-폴리아데닐화("폴리 A") 신호 서열.
상기 γl-중쇄의 전사 단위는 하기의 요소들로 구성된다:
- 인간 거대세포바이러스(hCMV)로부터의 초기 인헨서 및 프로모터,
- 코작 서열을 포함하는 합성 5'-UT,
- 신호 서열 인트론을 포함하는 변형된 쥐 면역글로불린 중쇄 신호 서열,
- 5' 단부에 독특한 BsmI 제한 부위 및 이어 맞추기 공여체 부위, 및 3' 단부에 독특한 NotI 제한 부위가 배열된 클로닝된 단일특이성 가변 경쇄 cDNA 또는 클로닝된 이중특이성 융합 scFv-가변 중쇄 cDNA,
- 마우스 Ig μ-인헨서를 포함한, 게놈 인간 γl-중쇄 유전자 불변 영역(문헌[Neuberger, M.S., EMBO J. 2 (1983) 1373-1378]), 및
- 인간 γI-면역글로불린 폴리아데닐화("폴리A") 신호 서열.
상기 κ-경쇄 또는 γl-중쇄 발현 카세트 외에, 상기 플라스미드는
- 하이그로마이신 내성 유전자,
- 엡스타인-바 바이러스(EBV)의 복제 기원, oriP,
- 에스케리키아 콜라이에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18로부터의 복제 기원, 및
- 에스케리키아 콜라이에서 암피실린 내성을 부여하는 β-락타마제 유전자
를 함유한다.
재조합 DNA 기법
클로닝을 문헌[Sambrook et al., 1999](상기)에 개시된 바와 같은 표준 클로닝 기법을 사용하여 수행하였다. 모든 분자 생물학적 시약들을 상업적으로 입수할 수 있으며(달리 지시되지 않는 경우) 제조사의 설명에 따라 사용하였다.
암호화 서열, 돌연변이 또는 추가의 유전 요소들을 함유하는 DNA가 진아트(Geneart) AG(독일 레겐스부르크 소재)에 의해 합성되었다.
DNA 서열을 세스퀴서브(SequiServe)(세스퀴서브 GmbH, 독일 소재)에서 수행된 이중 가닥 서열분석에 의해 측정하였다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 처리
벡터(Vector) NTI 어드밴스 스윗 버전 9.0이 서열 생성, 지도화, 분석, 주해, 및 예시에 사용되었다.
항- 합텐 항체 및 유도체의 발현
항-합텐 항체를 현탁액 중의 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포의 일시적인 형질감염에 의해 발현시켰다. 이를 위해서, 상응하는 단일- 또는 이중특이성 항체의 경쇄 및 중쇄를 상기에 개략된 바와 같은 원핵생물 및 진핵생물 선택 마커를 지니는 발현 벡터 중에서 제작하였다. 이들 플라스미드를 에스케리키아 콜라이에서 증폭시키고, 정제하고 후속으로 일시적인 형질감염에 적용하였다. 표준 세포 배양 기법들을 문헌[Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley 및 Sons, Inc.]에 개시된 바와 같이 세포의 취급에 사용하였다.
상기 세포를 적합한 발현 배지에서 37 ℃/8% CO2에서 배양하였다. 형질감염일에, 상기 세포를 새로운 배지에 1 내지 2 x 106 생육성 세포/㎖의 밀도로 시딩하였다. 상기 형질감염 시약과의 DNA-복합체를, 250 ㎖ 최종 형질감염 부피에 대해 1:1 몰비로 250 ㎍의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA를 포함하는 옵티(Opti)-MEM I 배지(인비트로젠, 미국 소재) 중에서 제조하였다. 상기 단일특이성 또는 이중특이성 항체 함유 세포 배양 상등액을 형질감염 후 7일째에 14,000 g에서 30 분 동안 원심분리에 의해 등명화하고 멸균 필터(0.22 ㎛)를 통해 여과하였다. 상등액을 정제시까지 -20 ℃에서 보관하였다.
상기 세포 배양 상등액 중의 항체 및 유도체의 농도를 측정하기 위해서, 친화성 HPLC 크로마토그래피를 적용하였다. 이를 위해서, 상기 단백질-A에 결합하는 단일- 또는 이중특이성 항체 또는 그의 유도체를 함유하는 세포 배양 상등액을 200 mM KH2PO4, 100 mM 나트륨 시트레이트를 포함하는 용액(pH 7.4) 중에서 어플라이드 바이오시스템스 포로스(Applied Biosystems Poros) A/20 컬럼에 적용시켰다. 상기 크로마토그래피 물질로부터의 용리를 200 mM NaCl, 100 mM 시트르산을 포함하는 용액(pH 2.5)을 적용시킴으로써 수행하였다. 얼티메이트(UltiMate) 3000 HPLC 시스템(다이오넥스(Dionex))을 사용하였다. 상기 용리된 단백질을 UV 흡광도 및 피크 면적의 적분에 의해 정량분석하였다. 정제된 IgG1 항체가 표준으로서 작용하였다.
디곡시제닌 , 플루오레세인, 테오필린 또는 비오틴에 결합하는 항- 합텐 항체의 정제
형질감염 후 7일째에 HEK 293 세포 상등액을 수확하였다. 상기 중에 함유된 재조합 항체(또는 -유도체)를 단백질 A-세파로스(상표) 친화성 크로마토그래피(GE 헬쓰케어, 스웨덴 소재)를 사용하는 친화성 크로마토그래피 및 슈퍼덱스200 크기 배제 크로마토그래피에 의해 2 단계로 상기 상등액으로부터 정제하였다. 간단히, 상기 항체 함유 등명화된 배양 상등액을 PBS 완충제(10 mN Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4)로 평형화된 MabSelectSuRe 단백질 A(5 내지 50 ㎖) 컬럼상에 적용하였다. 결합되지 않은 단백질을 평형 완충제로 세척하였다. 상기 항체(또는 -유도체)를 50 mM 시트레이트 완충제, pH 3.2로 용리시켰다. 상기 단백질 함유 분획을 0.1 ㎖의 2M 트리스 완충제, pH 9.0으로 중화시켰다. 이어서, 상기 용리된 단백질 분획들을 모으고, 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 원심분리 필터 장치(MWCO: 30 K, 밀리포어)로 농축시키고, pH 6.0에서 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl로 평형화시킨 슈퍼덱스200 HiLoad 26/60 젤 여과 컬럼(GE 헬쓰케어, 스웨덴 소재)상에 로딩하였다. 정제된 항체 및 유도체의 단백질 농도를 문헌[Pace et. al., Protein Science 4 (1995) 2411-2423]에 따른 아미노산 서열을 토대로 계산된 몰 소광 계수를 사용하여, 배경 보정으로서 320 ㎚에서의 OD와 함께 280 ㎚에서 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 측정하였다. 단량체성 항체 분획들을 모으고, 급속-동결시키고 -80 ℃에서 보관하였다. 상기 샘플의 일부는 후속의 단백질 분석 및 특성화를 위해 제공되었다.
상기 항체의 동종성을 환원제(5 mM 1,4-다이티오트레이톨)의 존재 및 부재하에서 SDS-PAGE 및 쿠마씨 브릴리언트 블루에 의한 염색에 의해 확인하였다. NuPAGE(등록상표) Pre-Cast 젤 시스템(인비트로젠, 미국 소재)을 제조사의 설명에 따라 사용하였다(4 내지 20% 트리스-글리신 젤).
환원 조건하에서, 상기 IgG와 관련된 폴리펩타이드 쇄를 계산된 분자량과 유사한 겉보기 분자 크기에서 SDS-PAGE 후에 확인하였다. 모든 구조물의 발현 수준을 단백질 A에 의해 분석하였다. 평균 단백질 수율은 상기와 같은 비-최적화된 일시적인 발현 실험에서 세포-배양 상등액의 리터당 6 ㎎ 내지 35 ㎎의 정제된 단백질이었다.
실시예 8
합텐화된 화합물의 생성
비-공유 복합체화뿐만 아니라 접합(공유 복합체화)을 위한 화합물의 생성을 위해서, (i) 상기 합텐을 적합한 링커를 통해 화합물(=페이로드)에 커플링시키고, (ii) 상기 커플링이, 상기 화합물이 그의 기능을 유지하게 하는 방식으로 확실히 발생하게 할 필요가 있다.
a) 합텐-폴리펩타이드 접합체:
임의의 폴리펩타이드를, 반응성 잔기, 예를 들어 시스테인 잔기가 폴리펩타이드와 합텐 사이의 링커내로 도입될 수 있는 한, 상기 합텐 함유 링커에 의해 N- 또는 C-말단 또는 측쇄 위치에서 유도체화시킬 수 있다. 특히 상기 폴리펩타이드는 비-천연 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
예시적인 합텐화된 화합물을 하기 표 5에 나열한다.
화합물 도면
Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)
Ac-Ile-Lys(N-프로필-(OCH2CH2)3-Cys-4Abu-NH2)-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg-Tyr-NH2 		10
DIG-3-cme-eda-Cy5 11
DIG-말레이미드-Cy5 12
DIG-eda-Cys-Cy5 13
DIG-Ahx-Cys-Cy5 14
DIG-Cys-MR121 15
Ac-PYY(PEG3-Dig)
Ac-Ile-Lys(N-(디곡시제닌-3-카복실메틸-N-12-아미노-4,7,10-트라이옥사도데칸산)-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg-Tyr-NH2 		16
Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)
Ac-Ile-Lys(N-(디곡시제닌-3-카복실메틸-N-4-아미노-부티르산일-N-시스테이닐-N-12-아미노-4,7,10-트라이옥소도데칸산)-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg-Tyr-NH2 		17
PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)
3,6,9-트라이옥소-데칸산일-Ile-Lys(N-프로필-(OCH2CH2)3-Cys-Abu-Dig-3cme)-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg-Tyr-NH2		 18
Dy636-eda-Btn 19
Dy636-Ser-Btn 20
Dy636-Cys-Btn 21
Cy5-Cys-Btn 22
Cy5-Ser-Btn 23
Ac-PYY(PEG2-Btn)
Ac-Ile-Lys(N-카복시메틸-(OCH2CH2)2-NH-Btn)-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg-Tyr-NH2 		24
Ac-PYY(PEG3-Cys-β-Ala-Btn)
Ac-Ile-Lys(N-카복시메틸-(OCH2CH2)3-NH-Cys-β-Ala-Btn)-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg-Tyr-NH2 		25
Ac-PYY(PEG3-Ser-PEG2-Btn)
Ac-Ile-Lys(N-카복시메틸-(OCH2CH2)3-NH-Ser-카복시메틸-(OCH2CH2)2-NH-Btn)-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg-Tyr-NH2 		26
Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Btn)
Ac-Ile-Lys(N-카복시메틸-(OCH2CH2)3-NH-Cys-카복시메틸-(OCH2CH2)2-NH-Btn)-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg-Tyr-NH2 		27
Ac-PYY(PEG3-Cys-4-Abu-5-Fluo)
Ac-Ile-Lys(N-카복시메틸-(OCH2CH2)3-NH-Cys-4Abu-5-Fluo)-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg-Tyr-NH2 		28
Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)
Ac-Ile-Lys(N-카복시메틸-(OCH2CH2)3-NH-Cys-카복시메틸-(OCH2CH2)2-NH-5-Fluo)-Pqa-Arg-His-Tyr-Leu-Asn-Trp-Val-Thr-Arg-Gln-(NMe)Arg-Tyr-NH2 		29
약어: 4Abu = 4-아미노-부티르산
Ahx = 아미노헥산산
Btn = 비오티닐
cme = 카복시메틸
Cy5 = 인도다이카보시아닌, 시아닌-5
Dadoo = 1,8-다이아미노-3,6-다이옥소-옥탄
DCM = 다이클로로메탄
Dig(OSu) = 디곡시제닌-3-카복실메틸-N-하이드록시숙신이미드
Dy636 = 형광단
eda = 에틸렌다이아민
Fluo = 5-카복시-플루오레세인
HATU = 0-(7-Aza-1H-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 헥사플루오로포스페이트
HFIP = 1,1,1,3,3,3,-헥사플루오로-2-프로판올
Mmt = 4-메톡시트리틸
MR121 = 옥사진 형광단
MTBE = 3급 부틸-메틸-에테르
NMM = N-메틸-모폴린
NMP = N-메틸-2-피롤리돈
PEG2 = 8-아미노-3,6-다이옥사-옥탄산
PEG3 = 12-아미노-4,7,10-트라이옥사도데칸산
O2Oc = 8-아미노-3,6-다이옥사-옥탄산
Pip = 피페리딘
Pqa = 4-옥소-6-피페라진-1-일-4H-퀴나졸린-3-일)-아세트산
TBTU = 2-(1H-벤조트라이아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 테트라플루오로보레이트
TCEP = 트리스(2-클로로에틸)포스페이트
TFE = 2,2,2,트라이플루오로에탄올
TIS = 트라이아이소프로필실란
상기 커플링 과정의 설계 및 사용된 시약들을 도 30, 31 및 32에 나타낸다.
본 발명에 사용된 예시적인 폴리펩타이드는 뉴로펩타이드-2-수용체 작용물질 유도체였다. 상기 폴리펩타이드는 WO 2007/065808에 보고된 바와 같은 펩타이드 타이로신 타이로신 또는 췌장 펩타이드 YY 짧은 PYY(3-36) 유사체이다. 상기 폴리펩타이드를 2번 위치에서 아미노산 잔기 리신을 통해 디곡시제닌화하였다. 상기 디곡시제닌화된 PYY 폴리펩타이드를, 상기 디곡시제닌 잔기에 대한 상기 폴리펩타이드의 측쇄 결합에 관계 없이 하기에서 DIG-PYY라 칭한다.
다른 예시적인 화합물들은 비-펩타이드 형광 염료 Cy5, Dy636 및 MR121이다. 이들 화합물을 NHS-에스터 화학을 통해 상기 디곡시제닌 또는 비오틴 함유 링커 시스템에 커플링시킬 수 있다.
i) PYY (3-36)- 유래된 폴리펩타이드 접합 전구체의 생성을 위한 일반적인 방법
자동화된 다중 합성기상에서의 PYY 유도체에 대한 표준 프로토콜:
합성기: 와동 교반 시스템을 갖는 다중 합성기 SYRO I(멀티신테크 게엠베하(MultiSynTech GmbH), 독일 비텐 소재)
수지: 200 ㎎ 텐타젤(TentaGel) S RAM(0.25 mmol/g), RAPP 폴리미어(Polymere)(독일 튀빙겐 소재), 반응 용기로서 테플론 프릿을 갖는 10 ㎖ 플라스틱 주사기
모액:
Fmoc 아미노산: DMF 또는 NMP 중의 0.5 M
차단해제 시약: DMF 중의 30% 피페리딘
활성화제: 각각 0.5 M TBTU 및 HATU
염기: NMP 중의 50% NMM
커플링:
Fmoc 아미노산: 519 ㎕
염기: 116 ㎕
활성화제: 519 ㎕
반응시간: 이중 커플링: 2 x 30 분
Fmoc -차단해제:
차단해제 시약: 1200 ㎕
반응시간: 5 분 + 12 분
세척:
용매: 1200 ㎕
부피 1300 ㎕
반응시간: 5 x 1 분
최종 절단:
절단 시약: 8 ㎖ TFA/티오아니솔/티오크레졸/TIS(95:2, 5:2, 5:3)
반응시간: 4 시간
후처리: 상기 절단 용액을 여과하고 1 내지 2 ㎖로 농축시키고, 상기 펩타이드를 MTBE의 첨가에 의해 침전시켰다. 백색 고체를 원심분리에 의해 수집하고, MTBE로 2회 세척하고 건조시켰다.
Ac - IK - Pqa - R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(But)R ( Pbf )Q( Trt )- MeArg ( Mtr )-Y(tBu)-텐타젤 S RAM 수지(서열번호 176)
상기 PYY(3-36)-폴리펩타이드 유도체(PYY라 칭함)를 수지-결합된 펩타이드 서열 Ac-IK(Mmt)-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(tBu)R(Pbf)Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-텐타젤-RAM 수지의 자동화된 고상 합성에 의해 획득하였다. 펩타이드 합성을 Fmoc 화학을 사용하여 와동 교반 시스템을 갖는 다중 합성기 SYRO I(멀티신테크 GmbH, 독일 비텐 소재)에 따라 수행하였다. 텐타젤 RAM 수지(로딩: 0.25 mmol/g; 랩 폴리머스(Rapp Polymers), 독일 소재)를 사용하여, 상기 펩타이드 서열을 상응하는 Fmoc-아미노산(규모: 0.05 mmol)의 연속 커플링에 의해 반복하는 주기로 조립하였다. 모든 커플링 단계에서, 상기 N-말단 Fmoc-기를, 상기 수지(5 분 + 12 분)를 다이메틸폼아미드(DMF) 중의 30% 페피레딘으로 처리하여 제거하였다. 커플링을 1, 13, 14 및 15번 위치에서 TBTU(0.25 mmol) 및 NMP 중의 50% NMM(이중 커플링 2 x 30 분 와동)에 의해 활성화된 Fmoc-보호된 아미노산(0.25 mmol)을 사용하여 수행하였다. 모든 다른 위치들에서 HATU(0.25 mmol) 및 NMP 중의 50% NMM을 활성화제로서 사용하였다. 각각의 커플링 단계 사이에서 상기 수지를 DMF로 5 x 1 분 세척하였다. 상기 선형 전구체의 합성 후에, 15 분 동안 DMF/DIPEA/Ac2O와의 반응 및 DMF에 의한 세척에 의해 아세틸화를 수행하여 Ac-IK(Mmt)-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(tBu)R(Pbf)Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-텐타젤 S RAM 수지를 제공하였다.
상기 Mmt 기의 제거를 위해서, 상기 펩타이드를 DCM/HFIP/TFE/TIS (6.5:2:1:0.5)로 2　x　1 시간 처리하여, DMF로 세척 후에 부분 차단해제된 전구체 Ac-IK-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(But)R(Pbf)Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-텐타젤 S RAM 수지를 제공하였다.
Ac - PYY ( PEG3 - Dig )/ Ac - IK ( PEG3 - Dig )- Pqa - RHYLNWVTRQ - MeArg -Y- NH 2 (서열번호 177)
합성을 또한 WO　2012/093068을 참조하시오.
수(5 ㎖) 중의 펩타이드 Ac-IK(H2N-TEG)-Pqa-RHYLNWVTRQ(N-메틸)RY(100 ㎎, 40.6 μmol)의 용액에 NMP(1 ㎖) 중에 용해된 디곡시제닌-3-카복시-메틸-N-하이드록시숙신이미드(26.6 ㎎, 48.8 μmol)를 가하였다. 트라이에틸아민(13.6 L, 97.6 μmol)을 가하고 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 텀블링하였다. 후속으로, NMP(0.5 ㎖) 중에 용해된 추가의 디곡시제닌-3-카복시-메틸-N-하이드록시숙신이미드(13.3 ㎎, 24.4 μmol), 및 트라이에틸아민(6.8 ㎕, 48.8 μmol)을 가하고 상기 용액을 15 시간 동안 텀블링하였다. 상기 조 생성물을 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스(Merck Chromolith) 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 정제시켜 무색 고체로서 Dig-PYY 펩타이드(29 ㎎, 10.0 μmol, 25%)를 제공하였다. 상기 펩타이드 유도체의 분석학적 특성화를 위해서, 하기의 조건들을 적용하고 하기의 데이터를 수령하였다: 분석학적 HPLC = tR = 11.3 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 4.6 ㎜, 수 + 0.1% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.1% TFA 80:20, 25 분); ESI-MS(양이온 모드); m/z: C140H207N35O32에 대한 계산치: 2829.4; 실측치: 964.9[M+2H]2+, 계산치: 965.1. 상기 항체에 대한 복합체화 시점까지, 상기 디곡시제닌화된 펩타이드를 4 ℃에서 동결건조물로서 보관하였다. 도 2C는 DIG-moPYY의 구조를 도시한다.
ii) 시스테인 함유 링커에 의한 디곡시제닌화된 PYY (3-36)- 유래된 폴리펩타 이드의 생성
Ac - IK ( PEG3 - Cys -4 Abu - NH 2 )- Pqa - RHYLNWVTRQ - MeArg -Y- NH 2 (서열번호 178)
상기 펩타이드 합성을 전구체 Ac-IK-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(But)R(Pbf)Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-텐타젤 S RAM 수지(서열번호 176)로 출발하여 하기 단계에 따라 속행하였다:
1.2 ㎖ DMF 중의 66.5 ㎎(3 당량) Fmoc-12-아미노-4,7,10-트라이옥사도데칸산(PEG3-이격자), 57.0 ㎎(3 당량) HATU 및 16.7 ㎕(3 당량) NMM과의 수동 이중 커플링. DMF(5 x 1 분)에 의한 세척 후에, 상기 Fmoc-기를 30% Pip/DMF로 절단하고 상기 수지를 표준 프로토콜을 사용하여 DMF로 세척하였다.
다음 Fmoc-Cys(Trt)-OH 및 Fmoc-4-Abu-OH의 이중 커플링을 자동화된 다중 합성기상에서 PYY 유도체에 대한 표준 프로토콜에 개시된 바와 같은 프로토콜에 의해 SYRO 1 합성기에서 자동적으로 수행하였다. 최종적으로 상기 수지를 DMF, EtOH, MTBE로 세척하고 건조시켰다.
상기 수지로부터의 절단을 4시간 동안 8 ㎖의 TFA/티오아니솔/티오크레졸/TIS(95:2.5:2.5:3)로 수행하였다. 상기 절단 용액을 여과하고 1 내지 2 ㎖로 농축시키고 상기 펩타이드를 MTBE의 첨가에 의해 침전시켰다. 백색 고체를 원심분리에 의해 수집하고, MTBE로 2회 세척하고, 건조시켰다.
조 생성물을 예비 역상 HPLC에 의해 정제하여 무색 고체를 제공하였다. 수율: 28.0 ㎎.
정제 프로토콜
HPLC: UV-Vis-검출기 SPD-6A를 갖는 시마츠(Shimadzu) LC-8A
용매 A: 수 중 0.05% TFA
용매 B: 80% 아세토나이트릴/수 중 0.05% TFA
컬럼: 울트라셉(UltraSep) ES, RP-18, 10 ㎛, 250 x 20 ㎜ (셉세르브(SEPSERV), 독일 베를린 소재)
유량: 15 ㎖/분
검출: 230 ㎚
구배: 30 분 동안 20 내지 50% B
분석 데이터:
HPLC: 광다이오드 배열-검출기 SPD-M6A를 갖는 시마츠 LC-9A
용매 A: 수 중 0.05% TFA
용매 B: 80% 아세토나이트릴/수 중 0.05% TFA
컬럼: 울트라셉 ES, RP-18, 7 ㎛, 250 x 3 ㎜(셉세르브, 독일 베를린 소재)
유량: 0.6 ㎖/분
구배: 30 분 동안 5 내지 80% B
MS: 시마츠 비행시간 질량 분광계 AXIMA 리니어(MALDI-TOF), 분자량을 평균 질량으로서 계산한다.
m/z: C122H185N37O28S에 대한 계산치 = 2650.13; 실측치: 2650.3
Ac - IK ( PEG3 - Cys -4 Abu - Dig )- Pqa - RHYLNWVTRQ - MeArg -Y- NH 2 (서열번호 179)
50 ㎕ DMSO 중의 15 ㎎의 펩타이드 Ac-IK(PEG3-Cys-4Abu-NH2)-Pqa-RHYLNWVTRQ-MeArg-Y-아미드(서열번호 180)의 용액에, 250 ㎕ PBS 완충제(pH 7.4)를 가하고 상기 용액을 밤새 교반하였다. 이량체 형성을 HPLC에 의해 조절하였다. 18시간 후에, 상기 이량체의 약 90%가 형성되었다.
상기 용액에 100 ㎕ dMF 중에 용해된 7.3 ㎎의 디곡시제닌-3-카복시-네틸-N-하이드록시숙신이미드(Dig-OSu)를 가하고 상기 혼합물을 실온에서 5 시간 동안 교반하였다. 후속으로, 추가의 100 ㎕ DMF 중의 16.9 ㎎ Dig-OSu를 가하고 2 시간 동안 교반하였다. 추가량의 100 ㎕ DMF 중의 6.9 ㎎을 가하고 18시간 동안 교반하였다. 상기 이량체의 환원을 위해서 TCEP를 가하고, 3 시간 동안 교반하고 상기 용액을 예비 역상 HPLC에 의해 정제에 직접 사용하였다.
분석 데이터:
조건은 서열번호 178에 대해 개시된 바와 동일하였다
예비 HPLC에 대한 구배: 30 분 동안 38 내지 58% B.
수율: 5.3 ㎎
m/z: C147H219N37O34S에 대한 계산치 = 3080.7; 실측치: 3079.8
PEG3 - IK ( PEG3 - Cys -4 Abu - Dig )- Pqa - RHYLNWVTRQ - MeArg -Y- NH 2 (서열번호 180)
수지-결합된 PYY 서열의 자동화된 고상 합성:
PEG2-IK(ivDde)-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(tBu)R(Pbf)Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-텐타젤-RAM 수지(서열번호 181)
상기 펩타이드 합성을 Fmoc 화학을 사용하여 자동화된 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) ABI 433A 펩타이드 합성기에서 확립된 프로토콜(FastMoc 0.25 mmol)에 따라 수행하였다. 텐타젤 RAM 수지(로딩: 0.18 mmol/g; 랩 폴리머스, 독일 소재)를 사용하여, 상기 펩타이드 서열을 상응하는 Fmoc-아미노산(규모: 0.25 mmol)의 연속적인 커플링에 의해 반복적인 주기로 조립하였다. 모든 커플링 단계에서, N-말단 Fmoc-기를, 상기 수지(3 x 2.5 분)를 N-메틸 피롤리돈(NMP) 중의 20% 피페리딘으로 처리하여 제거하였다. 커플링을, DMF(45 분 내지 60 분 와동) 중의 HBTU/HOBt(각각 1 mmol) 및 DIPEA(2 mmol)에 의해 활성화된 Fmoc-보호된 아미노산(1 mmol)을 사용하여 수행하였다. 각각 2, 3 및 14번 위치에서, 상기 아미노산 유도체 Fmoc-Lys(ivDde)-OH, Fmoc-Pqa-OH 및 Fmoc-N-Me-Arg(Mtr)-OH를 상기 합성 서열에 통합시켰다. 모든 커플링 단계 후에, 반응하지 않은 아미노기는 NMR(10 분 와동) 중의 Ac2O(0.5 M), DIPEA(0.125 M) 및 HOBt(0.015 M)의 혼합물로 처리하여 캡핑하였다. 각 단계 사이에, 상기 수지를 N-메틸 피롤리돈 및 DMF로 광범위하게 세척하였다. 입체 장애 아미노산의 통합을 자동화된 이중 커플링으로 수행하였다. 이를 위해서, 상기 수지를 커플링 주기 사이에 캡핑 단계 없이 1 mmol의 활성화된 구성 블록으로 2회 처리하였다. 상기 표적 서열의 완료 후에, N-말단 Fmoc-기를 NMP 중의 20% 피페리딘으로 제거하고 HBTU/HOBt(각각 2 mmol) 및 DIPEA(4 mmol)로 활성화 후에 2-[2-(메톡시에톡시)-에톡시]아세트산(4 mmol)을 커플링시켰다. 후속으로, 상기 수지를 추가의 조작을 위해서 프릿화된 고상 반응기로 옮겼다.
PEG2 - IK ( PEG3 - Cys - Abu - NH 2 )- Pqa - RHYLNWVTRQ - MeArg -Y- NH 2 (서열번호 182)
상기 ivDde 기의 제거를 위해서, 상기 펩타이드 수지(PEG2-IK(ivDde)-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(tBu)R(Pbf)Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-텐타젤-RAM 수지; 서열번호 181)를 DMF로 30 분 동안 팽윤시키고, 후속으로 2 시간 동안 DMF(60 ㎖) 중의 하이드라진 하이드레이트 2% 용액으로 처리하였다. 상기 수지를 아이소프로판올 및 DMF로 광범위하게 세척한 후에, DMF(3 ㎖) 중의 Fmoc-12-아미노-4,7,10-트라이옥사도데칸산(PEG3-이격자)(887 ㎎, 2 mmol), HBTU(2 mmol), HOBt(2 mmol) 및 2M 다이아이소프로필에틸 아민(2 ㎖, 4 mmol)의 용액을 가하고, 상기 혼합물을 3 시간 동안 진탕시켰다. 상기 수지를 DMF로 세척하고 상기 Fmoc-기를 DMF 중의 20% 피리딘 혼합물로 절단하였다. 후속으로, 상기 수지를 2 시간 동안 Fmoc-Cys(Trt)-OH(1.2 g; 2 mmol), HBTU/HOBt(각각 2 mmol) 및 DIPEA(4 mmol)의 혼합물로 처리하였다. 상기 수지를 DMF로 세척하고, 상기 Fmoc-기를 DMF 중의 20% 피리딘의 혼합물로 절단하고 HBTU/HOBt(각각 2 mmol) 및 DIPEA(4 mmol)로 활성화된 Fmoc-4-아미노부티르산(0.65 g, 2 mmol)을 커플링시켰다(2 시간). 상기 N-말단 Fmoc-기를 NMP 중의 20% 피페리딘으로 제거하고 상기 수지를 DMF로 반복해서 세척하였다. 후속적으로, 상기 수지를 2.5 시간 동안 트라이플루오로아세트산, 물 및 트라이아이소프로필실란(19 ㎖:0.5 ㎖:0.5 ㎖)의 혼합물로 처리하였다. 상기 절단 용액을 여과하고 상기 펩타이드를 저온(0 ℃) 다이아이소프로필 에테르(300 ㎖)의 첨가에 의해 침전시켜 무색 고체를 제공하고, 이를 다이아이소프로필 에테르로 반복해서 세척하였다. 조 생성물을 아세트산/수의 혼합물에 재용해시키고 동결건조시키고 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 정제하였다.
분석 HPLC: tR=8.6 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 4.6　㎜, 수 + 0.1% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.1% TFA 80:20, 25 분); ESI-MS(양이온 모드): m/z: C127H195N37O31S에 대한 계산치: 2768.3; 실측치: 1385.0 [M+2H]2+, 계산치: 1385.1; 923.7 [M+3H]3+, 계산치: 923.8; 693.1 [M+4H]4+, 계산치: 693.1.
PEG2 - IK ( PEG3 - Cys -4 Abu - Dig )- Pqa - RHYLNWVTRQ - MeArg -Y-NH 2 ( PEG2 -PYY( PEG3 -Cys-4Abu-Dig)(서열번호 183)
DMF(3 ㎖) 중의 펩타이드 PEG2-IK(PEG3-Cys-Abu-NH2)-Pqa-RHYLNWVTRQ-MeArg-Y-NH2(서열번호 182, 4.1 ㎎, 1.48 μmol)의 용액에 NMP(1 ㎖) 중에 용해된 디곡시제닌-3-카복시-메틸-N-하이드록시숙신이미드(0.81 ㎎, 1.48 μmol)를 가하였다. DMF 중의 트라이에틸아민(0.41 ㎕, 97.6 μmol)을 가하고 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 텀블링하였다. 조 생성물을 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 정제시켜 무색 고체로서 PEG3-Cys-4Abu-Dig 펩타이드(1.2 ㎎, 0.375 μmol, 25%)를 제공하였다.
분석 HPLC: tR=10.2 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 4.6　㎜, 수 + 0.1% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.1% TFA 80:20, 25 분); ESI-MS(양이온 모드): m/z: C152H229N37O37S에 대한 계산치: 3198.8; 실측치: 1067.3 [M+3H]3+, 계산치: 1067.3.
iii) 비오틴 또는 비오틴과 시스테인 함유 링커에 의한 PYY(3-36)-유래된 폴리펩타이드의 생성
Ac - IK ( PEG2 -비오틴)- Pqa - RHYLNWVTRQ - MeArg -Y-아미드/ Ac - PYY ( PEG2 - Biot)( 서열번호 184)
통상적인 전구체 펩타이드 수지(서열번호 176)로 출발하여, 상기 펩타이드를 1.2 ㎖ DMF 중의 57.8 ㎎(3 당량) Fmoc-8-아미노-다이옥사옥탄산(PEG2 이격자), 48.2 ㎎(3 당량) TBTU 및 33.3 ㎕(6 당량) NMM으로 2회 수동으로 각각 30 분 커플링시키고, DMF로 세척하였다. 상기 Fmoc-기를 서열번호 176에 대해 개시된 표준 프로토콜을 사용하여 30% Pip/DMF로 절단하고, 상기 수지를 DMF로 세척하고 2 시간 동안 NMP 중의 비오틴-OBt 용액(1.2 ㎖ NMP 중의 48.9 ㎎ 비오틴(4 당량), 64.2 ㎎ TBTU(4 당량) 및 44.4 ㎕ NMM(8 당량), 예비-활성화 3 분)으로 처리하였다. DMF, EtOH 및 MTBE로 세척 후에, 상기 펩타이드 수지를 건조시켰다.
최종 절단을 상술한 바와 같이 수행하였다. 조 생성물을 30 분 동안 22 내지 52% B의 구배를 사용하여 예비 역상 HPLC에 의해 정제하여 고체를 제공하였다. 수율: 42 ㎎.
정제 프로토콜
HPLC: UV-Vis-검출기 SPD-6A를 갖는 시마츠 LC-8A
용매 A: 수 중 0.05% TFA
용매 B: 80% 아세토나이트릴/수 중 0.05% TFA
컬럼: 울트라셉 ES, RP-18, 10 ㎛, 250 x 20 ㎜(셉세르브, 독일 베를린 소재)
유량: 15 ㎖/분
검출: 230 ㎚
분석 데이터:
HPLC: 광다이오드 배열-검출기 SPD-M6A를 갖는 시마츠 LC-9A
용매 A: 수 중 0.05% TFA
용매 B: 80% 아세토나이트릴/수 중 0.05% TFA
컬럼: 울트라셉 ES, RP-18, 7 ㎛, 250 x 3 ㎜(셉세르브, 독일 베를린 소재)
유량: 0.6 ㎖/분
구배: 30 분 동안 5 내지 80% B
MS: 시마츠 비행시간 질량 분광계 AXIMA 리니어(MALDI-TOF), 분자량을 평균 질량으로서 계산한다.
m/z: C122H181N37O27S에 대한 계산치 = 2630.10; 실측치: 2631.5
Ac - IK ( PEG3 - Cys -β- Ala -비오틴)- Pqa - RHYLNWVTRQ - MeArg -Y-NH 2 / Ac - PYY ( PEG3 -Cys-β-Ala-Biot)(서열번호 185)
전구체 Ac-IK-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(But)R(Pbf)Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-텐타젤 S RAM 수지(서열번호 176)로 출발하여, 상기 펩타이드를 1.2 ㎖ DMF 중의 66.5 ㎎(3 당량) Fmoc-12-아미노-4,7,10-트라이옥사도데칸산(PEG3-이격자), 57.0 ㎎(3 당량) HATU 및 16.7 ㎕(3 당량) NMM으로 2회 30 분 동안 수동으로 커플링시켰다. DMF로 세척 후에, 상기 Fmoc-기를 30% Pip/DMF로 절단하고 상기 수지를 표준 프로토콜을 사용하여 DMF로 세척하였다.
다음 Fmoc-Cys(Trt)-OH 및 Fmoc-β-Ala-OH의 이중 커플링을 표준 프로토콜에 의해 SYRO 1 합성기에서 자동으로 수행하고, NMP 중의 비오틴-OBt의 용액(1.2 ㎖ NMP 중의 48.9 ㎎ 비오틴(4 당량), 64.2 ㎎ TBTU(4 당량) 및 44.4 ㎕ NMM(8 당량)으로부터 제조됨, 3분 예비 활성화)을 수동으로 가하고 실온에서 교반하였다. 2 시간 후에 상기 수지를 DMF, EtOH, MTBE로 세척하고 건조시켰다.
최종 절단을 상술한 바와 같이 수행하였다. 조 생성물을 서열번호 184에 대해 개시된 바와 같이 예비 역상 HPLC에 의해 정제시켜 무색 고체를 제공하였다. 수율: 41.4 ㎎
분석 데이터:
예비 HPLC에 대한 구배: 30 분 동안 28 내지 58% B.
m/z: C131H197N39O30S2에 대한 계산치 = 2862.4; 실측치: 2862.4
Ac - IK ( PEG3 - Cys - PEG2 -비오틴)- Pqa - RHYLNWVTRQ - MeArg -Y-NH 2 / Ac - PYY ( PEG3 - Cys -PEG2-Biot)(서열번호 186)
전구체 Ac-IK-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(But)R(Pbf)Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-텐타젤 S RAM 수지(서열번호 176)로부터 출발하여, 상기 펩타이드 합성을 하기 단계에 따라 속행하였다:
Fmoc-PEG3-OH와의 이중 커플링(표준 프로토콜에 의해서),
Fmoc-Cys(Trt)-OH와의 이중 커플링(표준 프로토콜에 의해서),
Fmoc-PEG2-OH와 1.2 ㎖ DMF 중의 57.8 ㎎(3 당량) Fmoc-8-아미노-다이옥사옥탄산(PEG2 이격자), 48.2 ㎎(3 당량) TBTU 및 33.3 ㎕(6 당량) NMM과의 이중 커플링 및 1.2 ㎖ NMP 중의 48.9 ㎎ 비오틴(4 당량), 64.2 ㎎ TBTU(4 당량) 및 44.4 ㎕ NMM(8 당량)의 용액에 의한 비오틴화(예비 활성화 3분), 단일 커플링 2 시간.
상기 수지로부터의 절단, 정제 및 분석을 서열번호 184에 대해 개시된 바와 같이 수행하였다. 수율: 47.7 ㎎
분석 데이터:
서열번호 184에 대한 조건과 동일한 조건. 예비 HPLC에 대한 구배: 30 분 동안 25 내지 45% B.
m/z: C134H203N39O32S2에 대한 계산치 = 2936.5; 실측치: 2937.8
iv) 플루오레세인 또는 플루오레세인과 시스테인 함유 링커에 의한 PYY(3-36)-유래된 폴리펩타이드의 생성
Ac - IK ( PEG3 - Cys -4- Abu -5- Fluo )- Pqa - RHYLNWVTRQ - MeArg -Y-NH 2 / Ac - PYY ( PEG3 -Cys-4-Abu-5-Fluo)(서열번호 187)
전구체 Ac-IK-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(But)R(Pbf)Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-텐타젤 S RAM 수지(서열번호 176)로 출발하여, 상기 펩타이드 합성을 서열번호 179와 유사하게 속행하였다. 표지화를 위해서 DMF 중의 54.2 ㎎ 5-카복시플루오레세인, 33.1 ㎎ HOBt 및 35.6 ㎕ DIC의 용액을 가하고 실온에서 18시간 동안 교반하였다.
상기 수지로부터의 절단, 정제 및 분석을 서열번호 179에 대해 개시된 바와 같이 수행하였다. 수율: 41.6 ㎎
분석 데이터:
예비 HPLC에 대한 구배: 30 분 동안 29 내지 49% B.
m/z: C143H195N37O34S에 대한 계산치 = 3008.44; 실측치: 3007.2
Ac - IK ( PEG3 - Cys - PEG2 -5- Fluo )- Pqa - RHYLNWVTRQ - MeArg -Y-NH 2 / Ac -PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo)(서열번호 188)
전구체 Ac-IK-Pqa-R(Pbf)H(Trt)Y(tBu)LN(Trt)W(Boc)VT(But)R(Pbf)Q(Trt)-MeArg(Mtr)-Y(tBu)-텐타젤 S RAM 수지(서열번호 176)로 출발하여, 상기 펩타이드 합성을 하기 단계에 따라 속행하였다.
Fmoc-PEG3-OH와의 이중 커플링(표준 프로토콜에 의해서),
Fmoc-Cys(Trt)-OH와의 이중 커플링(표준 프로토콜에 의해서),
Fmoc-PEG2-OH(서열번호 186 참조) 이중 커플링.
표지화를 위해서 상기 펩타이드 수지를 DMF 중의 56.7 ㎎ 5-카복시플루오레세인, 34.6 ㎎ HOBt 및 37.3 ㎕ DIC의 용액과 함께 18시간 동안 교반하였다. 상기 수지로부터의 절단, 정제 및 분석을 서열번호 185에 대해 개시된 바와 같이 수행하였다. 수율: 41.7 ㎎
분석 데이터:
예비 HPLC에 대한 구배: 30 분 동안 34 내지 64% B.
m/z: C145H199N37O36S1에 대한 계산치 = 3068.5; 실측치: 3069.2
b) 합텐-표지된 형광 염료:
i) 디곡시제닌화된 Cy5의 생성
합성은 WO 2012/093068을 참조하시오
ii ) Dig - Cys -MR121의 생성
삼각 플라스크에서 1,2-다이아미노-프로판 트리틸 수지(250 ㎎, 0.225 mmol, 로딩 0.9 mmol/g)를 30 분 동안 DMF(5 ㎖)로 팽윤시켰다. 후속으로, DMF(2 ㎖) 중의 Fmoc-Cys(Trt)-OH(395 ㎎, 0.675 mmol)의 용액 및 DMF(8 ㎖) 중의 HATU(433 ㎎, 1.2375 mmol) 및 HOAt(164 ㎎, 1.2375 mmol)의 용액을 상기 수지에 가하였다. 상기 현탁액에 DIPEA(385 ㎕, 2.25 mmol)를 가하고 상기 혼합물을 주변 온도에서 16시간 동안 젓고, 여과하고 DMF로 반복해서 세척하였다. 커플링 단계 후에, 반응하지 않은 아미노기를, DMF 중의 Ac2O(20%)의 혼합물로 처리하여 캡핑한 다음 DMF로 세척하였다. N-말단 Fmoc 기의 제거를, 상기 수지를 DMF 중의 피페리딘(20%)으로 2 시간 동안 처리하여 수행하였다. 그 후에, 상기 수지를 DMF 및 아이소프로판올, 및 다시 DMF로 철저히 세척하고, 이어서 DMF(10 ㎖) 중의 1% DIPEA 중의 MR121(25 ㎎, 0.05 mmol)의 용액으로 16시간 동안 처리하였다. 여과 및 DMF에 의한 세척 후에, 상기 수지를 트라이플루오로아세트산, 물 및 트라이아이소프로필실란(9 ㎖:9 ㎖:1 ㎖)의 혼합물로 3 시간 동안 처리하였다. 상기 절단 용액을 여과하고, 감압하에서 농축시키고, 생성 고체를 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 정제시키고 동결건조시켰다. 분석 HPLC: tR = 7.7 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 4.6 ㎜, 수 + 0.1% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.1% TFA 80:20, 25 분. 후속적으로, 상기 중간체의 일부(10.0 ㎎, 17.6 μmol)를 DMF(1 ㎖)에 용해시키고 DMF(1 ㎖) 중의 디곡시제닌-3-카복시-메틸-N-하이드록시숙신이미드(9.6 ㎎, 17.6 μmol) 및 DMF(2 ㎖) 중의 1% 트라이에틸아민의 용액을 가하고 상기 혼합물을 16시간 동안 텀블링하였다. 상기 용액을 그 후에 농축시키고, 표적 화합물을 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 정제시켰다. 수율: 1.0 ㎎. 분석 HPLC: tR = 10.1 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 4.6 ㎜, 수 + 0.1% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.1% TFA 80:20, 25 분. ESI-MS(양이온 모드): m/z: [M]에 대한 계산치: 996.3; 실측치: 995.8[M]1+.
iii ) DIG - Cys - Ahx - Cy5의 생성
삼각 플라스크에서 1,2-다이아미노-프로판 트리틸 수지(250 ㎎, 0.225 mmol, 로딩 0.9 mmol/g)를 30 분 동안 DMF(5 ㎖)로 팽윤시켰다. 후속으로, DMF(2 ㎖) 중의 Fmoc-Cys(Trt)-OH(395 ㎎, 0.675 mmol)의 용액 및 DMF(8 ㎖) 중의 HATU(433 ㎎, 1.2375 mmol) 및 HOAt(164 ㎎, 1.2375 mmol)의 용액을 상기 수지에 가하였다. 상기 현탁액에 DIPEA(385 ㎕, 2.25 mmol)를 가하고 상기 혼합물을 주변 온도에서 16시간 동안 젓고, 여과하고 DMF로 반복해서 세척하였다. 커플링 단계 후에, 반응하지 않은 아미노기를, DMF 중의 Ac2O(20%)의 혼합물로 처리하여 캡핑한 다음 DMF로 세척하였다. N-말단 Fmoc 기의 제거를, 상기 수지를 DMF 중의 피페리딘(20%)으로 처리하여 수행하였다. 그 후에, 상기 수지를 DMF 및 아이소프로판올, 및 다시 DMF로 철저히 세척하고, 이어서 DMF(10 ㎖) 중의 1% DIPEA 중의 Cy5-모노 NHS-에스터(25 ㎎, 0.0316 mmol)의 용액으로 16시간 동안 처리하였다. 여과 및 DMF에 의한 세척 후에, 상기 수지를 트라이플루오로아세트산, 물 및 트라이아이소프로필실란(9 ㎖:9 ㎖:1 ㎖)의 혼합물로 3 시간 동안 처리하였다. 상기 절단 용액을 여과하고, 감압하에서 농축시키고, 생성 고체를 물에 재용해시키고 동결건조시켰다. 상기 중간체의 정제를 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 수행하여 동결건조 후에 청색 고체를 생성시켰다. 분석 HPLC: tR = 6.2 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 4.6 ㎜, 수 + 0.1% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.1% TFA 80:20, 25 분. 후속적으로, 상기 중간체의 일부(6.5 ㎎, 7.9 μmol)를 DMF(1 ㎖)에 용해시키고 DMF(1 ㎖) 중의 Dig-Amcap-OSu(5.2 ㎎, 7.9 μmol) 및 DMF(2 ㎖) 중의 1% 트라이에틸아민의 용액을 가하고 상기 혼합물을 16시간 동안 텀블링하였다. 상기 용액을 그 후에 농축시키고, 표적 화합물을 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 정제시켰다. 수율: 3 ㎎. 분석 HPLC: tR = 8.7 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 4.6 ㎜, 수 + 0.1% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.1% TFA 80:20, 25 분. ESI-MS(양이온 모드): m/z: [M]에 대한 계산치: 1360.0; 실측치: 1360.7[M+H]1+.
iv ) 비오틴- eda - Dy636의 생성
0.1M K3PO4 완충제(pH 8.0, 500 ㎕) 중의 비오틴-에틸렌다이아민 하이드로브로마이드(2.14 ㎎, 5.83 μmol)의 용액에 0.1M K3PO4 완충제(pH 8.0, 500 ㎕) 중의 Dy636-OSu(5 ㎎, 5.83 μmol)의 용액을 가하고 생성 혼합물을 주변 온도에서 2 시간 동안 텀블링시키고, 여과하고, 표적 화합물을 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 단리시켰다. 동결건조 후에 상기 Dy636-에틸렌다이아민-Bi 접합체를 무색 고체(2.8 ㎎, 48%%)로서 수득하였다. 분석 HPLC: tR = 8.5 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 4.6 ㎜, 수 + 0.1% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.1% TFA 80:20, 25 분). ESI-MS(양이온 모드): m/z: C50H65N6O10S3에 대한 계산치: 1006.3; 실측치: 1007.3[M+H]+.
v) 비오틴- Ser - Dy636의 생성
단계 1: 비오틴-O2Oc-Ser-O2Oc-DADOO-NH2
O-비스-(아미노에틸)에틸렌 글리콜 트리틸 수지(176 mg, 0.125 mmol, 로딩 0.71 mmol/g, 노바바이오켐(Novabiochem))상에 Fmoc-O2Oc-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-O2Oc-OH(모두 아이리스 바이오테크(Iris Biotech)), 및 DMTr-D-비오틴(롯슈)을 연속적으로 커플링시켰다. 펩타이드 합성을 Fmoc 화학(서열번호 180에 대해 개시된 바와 같은)을 사용하는 자동화된 어플라이드 바이오시스템스 ABI 433A 펩타이드 합성기에서 확립된 프로토콜(FastMoc 0.25 mmol)에 따라 수행하였다.
합성 후에, 상기 수지를 DMF, 메탄올, 다이클로로메탄으로 철저히 세척하고, 진공 하에서 건조시켰다. 이어서, 상기 수지를 삼각 플라스크에 넣고 실온에서 2 시간 동안 트라이플루오로아세트산, 물 및 트라이아이소프로필실란(9.5 ㎖:250 ㎕:250 ㎕)의 혼합물로 처리하였다. 상기 절단 용액을 여과하고 상기 펩타이드를 저온(0 ℃) 다이아이소프로필 에테르(80 ㎖)의 첨가에 의해 침전시켜 무색 고체를 제공하고, 이를 다이아이소프로필 에테르로 반복해서 세척하였다. 조 생성물을 물에 재용해시키고, 동결건조시키고, 후속으로 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 정제시켜 동결건조 후에 무색 고체를 생성시켰다. 수율: 56 ㎎. 분석 HPLC: tR = 4.5 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 3 ㎜, 수 + 0.1% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.1% TFA 80:20, 25 분). ESI-MS(양이온 모드): m/z: [M]에 대한 계산치: 751.9; 실측치: 752.4[M+H]+; 376.9[M+2H]2+.
단계 2: 비오틴-O2Oc-Ser-O2Oc-DADOO-Dy-636 (Bi-Ser-Dy-636)
상기 펩타이드(5.3 ㎎, 7.0 μmol)를 200 mM 칼륨 포스페이트 완충제, pH 7.5(583 ㎕) 중에 용해시켰다. Dy-636 NHS-에스터(4 ㎎, 4.7 μmol, 다이오믹스(Dyomics))를 물(583 ㎕)에 용해시키고 상기 펩타이드 용액에 가하였다. 상기 반응 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하고 후속으로 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 정제시켜 동결건조 후에 청색 고체를 생성시켰다. 수율: 3.9 ㎎(55%). 분석 HPLC: tR = 8.3 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 3 ㎜, 수 + 0.025% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.023% TFA 80:20, 25 분). ESI-MS(양이온 모드): m/z: [M]에 대한 계산치: 1472.8; 실측치: 1472.8[M+H]+; 737.0[M+2H]2+.
vi ) 비오틴- Cys - Dy636의 생성
단계 1: 비오틴-O2Oc-Cys-O2Oc-DADOO-NH2
O-비스-(아미노에틸)에틸렌 글리콜 트리틸 수지(352 mg, 0.25 mmol, 로딩 0.71 mmol/g, 노바바이오켐)상에 Fmoc-O2Oc-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-O2Oc-OH(모두 아이리스 바이오테크), 및 DMTr-D-비오틴(롯슈)을 연속적으로 커플링시켰다. 펩타이드 합성을 Fmoc 화학(서열번호 180에 대해 개시된 바와 같은)을 사용하는 자동화된 어플라이드 바이오시스템스 ABI 433A 펩타이드 합성기에서 확립된 프로토콜(FastMoc 0.25 mmol)에 따라 수행하였다.
합성 후에, 상기 수지를 DMF, 메탄올, 다이클로로메탄으로 철저히 세척하고, 진공 하에서 건조시켰다. 이어서, 상기 수지를 삼각 플라스크에 넣고 실온에서 2 시간 동안 트라이플루오로아세트산, 물 및 트라이아이소프로필실란(9.5 ㎖:250 ㎕:250 ㎕)의 혼합물로 처리하였다. 상기 절단 용액을 여과하고 상기 펩타이드를 저온(0 ℃) 다이아이소프로필 에테르(100 ㎖)의 첨가에 의해 침전시켜 무색 고체를 제공하고, 이를 다이아이소프로필 에테르로 반복해서 세척하였다. 조 생성물을 물에 재용해시키고, 동결건조시키고, 후속으로 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 정제시켜 동결건조 후에 무색 고체를 생성시켰다. 수율: 79 ㎎(41%). 분석 HPLC: tR = 5.3 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 3 ㎜, 수 + 0.1% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.1% TFA 80:20, 25 분). ESI-MS(양이온 모드): m/z: [M]에 대한 계산치: 767.9; 실측치: 768.4[M+H]+; 384.8[M+2H]2+.
단계 2: 비오틴-O2Oc-Cys(TNB)-O2Oc-DADOO-NH2
상기 펩타이드(30 ㎎, 39 μmol)를 100 mM 칼륨 포스페이트 완충제, pH 7.5(4 ㎖) 중에 용해시키고 5,5'-다이티오비스(2-나이트로벤조산)(77 ㎎, 195 μmol)을 가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하고 후속으로 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 정제시켜 동결건조 후에 황색 고체를 생성시켰다. 수율: 31 ㎎(83%). 분석 HPLC: tR = 5.4 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 3 ㎜, 수 + 0.025% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.023% TFA 80:20, 25 분). ESI-MS(양이온 모드): m/z: [M]에 대한 계산치: 965.1; 실측치: 965.4[M+H]+; 483.3[M+2H]2+.
단계 3: 비오틴-O2Oc-Cys(TNB)-O2Oc-DADOO-Dy-636
상기 TNB 보호된 펩타이드(1.35 ㎎, 1.4 μmol)를 200 mM 칼륨 포스페이트 완충제, pH 7.5(291 ㎕) 중에 용해시켰다. Dy-636 NHS-에스터(1 ㎎, 1.2 μmol, 다이오믹스)를 물(291 ㎕)에 용해시키고 상기 펩타이드 용액에 가하였다. 상기 반응 용액을 실온에서 1 시간 동안 교반하고 후속으로 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 정제시켜 동결건조 후에 청색 고체를 생성시켰다. 수율: 1 ㎎(50%). 분석 HPLC: tR = 9.0 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 3 ㎜, 수 + 0.025% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.023% TFA 80:20, 25 분). ESI-MS(양이온 모드): m/z: [M]에 대한 계산치: 1686.0; 실측치: 1686.7[M+H]+; 844.2[M+2H]2+.
단계 4: 비오틴-O2Oc-Cys-O2Oc-DADOO-Dy-636(Bi-Cys-Dy-636)
상기 TNB 보호된 및 염료 표지된 펩타이드(1 ㎎, 0.6 μmol)를 200 mM 칼륨 포스페이트 완충제, pH 7.5(250 ㎕) 및 물(192 ㎕)의 혼합물 중에 용해시켰다. 100 mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드 용액(58 ㎕)을 가하고 상기 반응 용액을 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 정제를 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 수행하여 동결건조 후에 청색 고체를 생성시켰다. 수율: 0.7 ㎎(79%). 분석 HPLC: tR = 8.6 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 3 ㎜, 수 + 0.025% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.023% TFA 80:20, 25 분). ESI-MS(양이온 모드): m/z: [M]에 대한 계산치: 1488.9; 실측치: 1488.6[M+H]+; 745.1[M+2H]2+.
vii ) 비오틴- Cys - Cy5의 생성
단계 1: 비오틴-O2Oc-Cys-O2Oc-DADOO-NH2
O-비스-(아미노에틸)에틸렌 글리콜 트리틸 수지(352 mg, 0.25 mmol, 로딩 0.71 mmol/g, 노바바이오켐)상에 Fmoc-O2Oc-OH, Fmoc-Cys(Trt)-OH, Fmoc-O2Oc-OH(모두 아이리스 바이오테크), 및 DMTr-D-비오틴(롯슈)을 연속적으로 커플링시켰다. 펩타이드 합성을 Fmoc 화학(서열번호 180에 대해 개시된 바와 같은)을 사용하는 자동화된 어플라이드 바이오시스템스 ABI 433A 펩타이드 합성기에서 확립된 프로토콜(FastMoc 0.25 mmol)에 따라 수행하였다.
합성 후에, 상기 수지를 DMF, 메탄올, 다이클로로메탄으로 철저히 세척하고, 진공 하에서 건조시켰다. 이어서, 상기 수지를 삼각 플라스크에 넣고 실온에서 2 시간 동안 트라이플루오로아세트산, 물 및 트라이아이소프로필실란(9.5 ㎖:250 ㎕:250 ㎕)의 혼합물로 처리하였다. 상기 절단 용액을 여과하고 상기 펩타이드를 저온(0 ℃) 다이아이소프로필 에테르(100 ㎖)의 첨가에 의해 침전시켜 무색 고체를 제공하고, 이를 다이아이소프로필 에테르로 반복해서 세척하였다. 조 생성물을 물에 재용해시키고, 동결건조시키고, 후속으로 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 정제시켜 동결건조 후에 무색 고체를 생성시켰다. 수율: 79 ㎎(41%). 분석 HPLC: tR = 5.3 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 3 ㎜, 수 + 0.1% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.1% TFA 80:20, 25 분). ESI-MS(양이온 모드): m/z: [M]에 대한 계산치: 767.9; 실측치: 768.4[M+H]+; 384.8[M+2H]2+.
단계 2: 비오틴-O2Oc-Cys(TNB)-O2Oc-DADOO-NH2
상기 펩타이드(30 ㎎, 39 μmol)를 100 mM 칼륨 포스페이트 완충제, pH 7.5(4 ㎖) 중에 용해시키고 5,5'-다이티오비스(2-나이트로벤조산)(77 ㎎, 195 μmol)을 가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하고 후속으로 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 정제시켜 동결건조 후에 황색 고체를 생성시켰다. 수율: 31 ㎎(83%). 분석 HPLC: tR = 5.4 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 3 ㎜, 수 + 0.025% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.023% TFA 80:20, 25 분). ESI-MS(양이온 모드): m/z: [M]에 대한 계산치: 965.1; 실측치: 965.4[M+H]+; 483.3[M+2H]2+.
단계 3: 비오틴-O2Oc-Cys(TNB)-O2Oc-DADOO-Cy5
상기 TNB 보호된 펩타이드(9.9 ㎎, 10.3 μmol)를 200 mM 칼륨 포스페이트 완충제, pH 7.5(1026 ㎕) 중에 용해시켰다. Cy5-모노 NHS-에스터(6.5 ㎎, 8.2 μmol, GE 헬쓰케어)를 물(1026 ㎕)에 용해시키고 상기 펩타이드 용액에 가하였다. 상기 반응 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하고 후속으로 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 정제시켜 동결건조 후에 청색 고체를 생성시켰다. 수율: 10 ㎎(80%). 분석 HPLC: tR = 7.2 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 3 ㎜, 수 + 0.025% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.023% TFA 80:20, 25 분). ESI-MS(양이온 모드): m/z: [M]에 대한 계산치: 1603.9; 실측치: 1604.9[M+H]+; 803.1[M+2H]2+.
단계 4: 비오틴-O2Oc-Cys-O2Oc-DADOO-Cy5(Bi-Cys-Cy5)
상기 TNB 보호된 및 염료 표지된 펩타이드(10 ㎎, 6.1 μmol)를 200 mM 칼륨 포스페이트 완충제, pH 7.5(1522 ㎕) 및 물(1218 ㎕)의 혼합물 중에 용해시켰다. 100 mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드 용액(304 ㎕)을 가하고 상기 반응 혼합물을 실온에서 30 분 동안 교반하였다. 정제를 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 수행하여 동결건조 후에 청색 고체를 생성시켰다. 수율: 7.6 ㎎(86%). 분석 HPLC: tR = 6.4 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 3 ㎜, 수 + 0.025% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.023% TFA 80:20, 25 분). ESI-MS(양이온 모드): m/z: [M]에 대한 계산치: 1406.8; 실측치: 1406.8[M+H]+; 704.0[M+2H]2+.
viii ) 비오틴- Ser - Cy5의 생성
단계 1: 비오틴-O2Oc-Ser-O2Oc-DADOO-NH2
O-비스-(아미노에틸)에틸렌 글리콜 트리틸 수지(176 mg, 0.125 mmol, 로딩 0.71 mmol/g, 노바바이오켐)상에 Fmoc-O2Oc-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-O2Oc-OH(모두 아이리스 바이오테크), 및 DMTr-D-비오틴(롯슈)을 연속적으로 커플링시켰다. 펩타이드 합성을 Fmoc 화학(서열번호 180에 대해 개시된 바와 같은)을 사용하는 자동화된 어플라이드 바이오시스템스 ABI 433A 펩타이드 합성기에서 확립된 프로토콜(FastMoc 0.25 mmol)에 따라 수행하였다.
합성 후에, 상기 수지를 DMF, 메탄올, 다이클로로메탄으로 철저히 세척하고, 진공 하에서 건조시켰다. 이어서, 상기 수지를 삼각 플라스크에 넣고 실온에서 2 시간 동안 트라이플루오로아세트산, 물 및 트라이아이소프로필실란(9.5 ㎖:250 ㎕:250 ㎕)의 혼합물로 처리하였다. 상기 절단 용액을 여과하고 상기 펩타이드를 저온(0 ℃) 다이아이소프로필 에테르(80 ㎖)의 첨가에 의해 침전시켜 무색 고체를 제공하고, 이를 다이아이소프로필 에테르로 반복해서 세척하였다. 조 생성물을 물에 재용해시키고, 동결건조시키고, 후속으로 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 정제시켜 동결건조 후에 무색 고체를 생성시켰다. 수율: 56 ㎎(60%). 분석 HPLC: tR = 4.5 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 3 ㎜, 수 + 0.1% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.1% TFA 80:20, 25 분). ESI-MS(양이온 모드): m/z: [M]에 대한 계산치: 751.9; 실측치: 752.4[M+H]+; 376.9[M+2H]2+.
단계 2: 비오틴-O2Oc-Ser-O2Oc-DADOO-Cy5(Bi-Ser-Cy5)
상기 펩타이드(5.7 ㎎, 7.6 μmol)를 200 mM 칼륨 포스페이트 완충제, pH 7.5(789 ㎕) 중에 용해시켰다. Cy5-모노 NHS-에스터(5 ㎎, 6.3 μmol, GE 헬쓰케어)를 물(789 ㎕)에 용해시키고 상기 펩타이드 용액에 가하였다. 상기 반응 용액을 실온에서 2 시간 동안 교반하고 후속으로 0.1% TFA를 함유하는 아세토나이트릴/물 구배를 사용하는 예비 역상 HPLC(메르크 크로모리스 프렙 RP-18e 컬럼, 100 x 25 ㎜)에 의해 정제시켜 동결건조 후에 청색 고체를 생성시켰다. 수율: 6 ㎎(58%). 분석 HPLC: tR = 6.1 분(메르크 크로모리스 퍼포먼스 RP-18e, 100 x 3 ㎜, 수 + 0.025% TFA → 아세토나이트릴/수 + 0.023% TFA 80:20, 25 분). ESI-MS(양이온 모드): m/z: [M]에 대한 계산치: 1390.72; 실측치: 1391.2[M+H]+.
실시예 9
비오틴-표지된 화합물(합텐화된 화합물)에의 재조합 인간화된 항-비오틴 항체의 결합
인간화 과정 및 후속의 시스테인 돌연변이의 도입이 완전한 결합 활성을 유지한 유도체를 생성시키는 지의 여부를 측정하기 위해서 하기의 실험을 수행하였다.
상기 재조합 항-비오틴 항체 유도체의 결합 성질을 옥텟(Octet) QK 장비(포르테바이오 인코포레이티드(Fortebio Inc.))를 사용하여 생물층 간섭측정(BLI)에 의해 분석하였다. 상기 시스템은 분자 상호작용 연구에 대해 잘 확립되어 있다. BLi-기술은 바이오센서 팁의 표면으로부터 반사된 백색광의 간섭 패턴 및 내부 기준의 측정을 기본으로 한다. 상기 바이오센서 팁에 대한 분자의 결합은 측정될 수 있는 상기 간섭 패턴의 이동을 생성시킨다. 상술한 인간화 과정이 비오틴에 결합하는 항-비오틴 항체의 능력을 감소시키는 지를 분석하기 위해서, 비오틴화된 단백질에 결합하는 능력에 있어서 상기 항체의 키메릭 및 인간화된 버전의 성질을 직접 비교하였다. 결합 연구를 항-huIgG Fc 항체 포획(AHC) 바이오센서(포르테바이오 인코포레이티드)상에 항-비오틴 항체를 포획함으로써 수행하였다. 먼저, 바이오센서를 항체 용액 중에서 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 중의 0.5 ㎎/㎖의 농도로 1분 동안 배양하였다. 그 후에, 상기 바이오센서를 1x PBS pH 7.4 중에서 1분 동안 배양하여 안정한 기준선에 도달시켰다. 상기 항체-코팅된 바이오센서를 비오틴화된 단백질을 함유하는 용액 중에서 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 중의 0.06 ㎎/㎖의 농도로 5 분 동안 배양하여 결합을 측정하였다. 해리를 1x PBS pH 7.4 중에서 5 분 동안 모니터하였다. 키메릭 및 인간화된 항-비오틴 항체에 대해 생성되는 결합 곡선을 직접 비교하였다.
상기 항체의 인간화된 버전은 상기 키메릭 항체보다 동일하거나 또는 심지어 보다 양호한 비오틴화된 항원의 결합을 나타내었다. 이는 VH53번 카밧 위치에서 Cys 돌연변이를 갖는 인간화된 항체의 경우에 사실이다. 상기 비오틴화된 단백질은 상기 바이오센서를 허셉틴(비오틴에 결합하지 않는다)으로 코팅시킨 경우 감소되는 상기 바이오센서에 대한 잔류 불특정 결합을 나타내었다. 따라서, 상기 항-비오틴 항체의 기능성이 그의 인간화된 변이체(서열번호 44 및 48, 서열번호 60 및 64에 나타낸 바와 같은 서열들에 의해 한정된다)에서 유지되었다.
표면 플라스몬 공명
표면 플라스몬 공명 측정을 25 ℃에서 비아코어(등록상표) T200 장비(GE 헬쓰케어 바이오사이언시즈 AB, 스웨덴 소재)상에서 수행하였다. 대략 4300 공명 단위(RU)의 포획 시스템(인간 항체 포획 키트, BR-1008-39, GE 헬쓰케어 바이오사이언시즈 AB, 스웨덴 소재로부터의 10 ㎍/㎖의 항-인간 캡쳐(IgG Fc))을 GE 헬쓰케어에 의해 공급된 표준 아민 커플링 키트(BR-1000-50)를 사용하여 pH 5.0에서 CM3 칩(GE 헬쓰케어, BR-1005-36)상에 커플링시켰다. 아민 커플링을 위한 실행 완충제는 HBS-N(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, GE 헬쓰케어, BR-1006-70)이었다. 후속 결합 연구를 위한 실행 및 희석 완충제는 PBS-T(0.05% 트윈 20을 포함하는 10 mM 포스페이트 완충된 염수) pH 7.4였다. 상기 인간화된 항-비오틴 항체를 5 ㎕/분의 유량으로 60초 동안 2 nM 용액을 주입함으로써 포획하였다. 비오틴화된 siRNA를 PBS-T로 0.14 내지 100 nM(일련의 1:3 희석)의 농도로 희석하였다. 결합을 30 ㎕/분의 유량, 해리 시간 600초에서 180초 동안 각 농도를 주입함으로써 측정하였다. 상기 표면을 3 M MgCl2 용액으로 5 ㎕/분의 유량으로 30초 세척하여 재생시켰다. 데이터를 BIA평가 소프트웨어(GE 헬쓰케어 바이오사이언시즈 AB, 스웨덴 소재)를 사용하여 평가하였다. 벌크 굴절율 차이를 항-인간 IgG Fc 표면으로부터 획득된 반응을 공제함으로써 보정하였다. 블랭크 주입을 또한 공제하였다(=이중 참조). KD 및 동역학적 매개변수의 계산을 위해서 랭뮤어 1:1 모델을 사용하였다.
표면 플라스몬 공명(SPR)에 의한 동역학적 결합 분석을 인간화된 항-비오틴 항체 서열번호 44 및 48, 및 인간화된 항-비오틴 항체 VH53C 서열번호 60 및 64에 대해 수행하였다. 2 nM 농도의 항-비오틴 항체를 CM3 센서 칩에 결합된 항-인간 IgG Fc 항체에 의해 포획하였다. 비오틴화된 siRNA(Mw: 13868 Da)의 결합을 0.41, 1.23, 3.7, 11.1, 33.3, 100 및 300 nM 농도에서 기록하였다. 측정을 중복 수행하였다. 인간화된 항-비오틴 항체 및 인간화된 항-비오틴 항체 VH53C에 대해 계산된 KD는 각각 0.633 nM 및 0.654 nM이었다.
실시예 10
항-합텐 항체와 합텐화된 화합물과의 비-공유 복합체의 생성
일반적인 방법:
항-합텐 항체와 합텐화된 화합물(=페이로드에 접합된 합텐)과의 복합체의 생성은 한정된 복합체를 생성시킬 것이며 이들 복합체 중의 화합물(=페이로드)이 그의 활성을 유지함을 보장할 것이다. 합텐화된 화합물과 각 항-합텐 항체와의 복합체의 생성을 위해서 상기 합텐화된 화합물을 H2O에 1 ㎎/㎖의 최종 농도로 용해시켰다. 상기 항체를 20 mM 히스티딘 완충제, 140 mM NaCl, pH = 6.0 중의 1 ㎎/㎖(4.85 μM)의 최종 농도로 농축시켰다. 합텐화된 페이로드 및 항체를 상하로 피펫팅하여 2:1 몰비(화합물 대 항체)로 혼합하고 RT에서 15 분 동안 배양하였다.
한편으로, 상기 합텐화된 화합물을 100% DMF 중에 10 ㎎/㎖의 최종 농도로 용해시켰다. 상기 항체를 50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH = 8.2 중에 10 ㎎/㎖의 최종 농도로 농축시켰다. 합텐화된 화합물 및 항체를 상하로 피펫팅하여 2.5:1 몰비(화합물 대 항체)로 혼합하고 RT 및 350 rpm에서 60 분 동안 배양하였다.
합텐화된 형광 염료 및 항- 합텐 항체의 복합체 - 비-공유 디곡시제닌 - Cy5 복합체의 형성에 대한 예시적인 방법
인간화된 및 쥐 항-디곡시제닌 항체 또는 이중특이성 항-디곡시제닌 항체 유도체를 항체 성분들로서 사용하였다. 디곡시제닌화된 Cy5와 항-디곡시제닌 항체와의 복합체의 생성을 위해서 상기 Cy5-디곡시제닌 접합체를 PBS에 0.5 ㎎/㎖의 최종 농도로 용해시켰다. 상기 항체를 20 mM 히스티딘 및 140 mM NaCl, pH 6으로 구성된 완충제 중에 1 ㎎/㎖(약 5 μM)의 농도로 사용하였다. 디곡시제닌화딘 Cy5 및 항체를 2:1 몰비(디곡시제닌화된 Cy5 대 항체)로 혼합하였다. 상기 과정은 한정된 조성의 복합체의 동종 제제를 생성시켰다.
상기 복합체화 반응을 크기 배제 컬럼상의 항체-결합된 형광단의 형광(650/667 ㎚)을 측정함으로써 모니터할 수 있다. 이들 실험의 결과는 복합체화는 오직 상기 항체가 디곡시제닌에 대한 결합 특이성을 함유하는 경우에만 발생함을 입증한다. 디곡시제닌에 대한 결합 특이성이 없는 항체는 상기 디곡시제닌-Cy5 접합체에 결합하지 않는다. 2:1의 디곡시제닌-Cy5 접합체 대 항체 비가 될 때까지 2가 항-디곡시제닌 항체에 대해 증가하는 신호가 관찰될 수 있다. 그 후에, 상기 조성물 의존성 형광 신호는 평탄역에 도달한다.
합텐화된 형광 염료 및 항- 합텐 항체의 복합체 - 비오틴- Cy5 / 키메릭 항-비오틴 항체(인간 IgG 하위부류) 복합체의 형성에 대한 예시적인 방법
시스테인화된 링커를 함유하는 비오틴-유도체화된-Cy5(비오틴-Cys-Cy5)의 복합체의 생성을 위해서, 0.16 ㎎의 비오틴-Cys-Cy5를 100% DMF에 10 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 1 ㎎의 상기 항체를 50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2로 구성된 완충제 중에 10.1 ㎎/㎖(약 69 μM)의 농도로 사용하였다. 비오틴-Cys-Cy5 및 항체를 2.5:1의 몰비(비오틴-Cys-Cy5 대 항체)로 혼합하고 RT에서 60 분 동안 배양하고, 350 rpm에서 진탕시켰다. 생성 접합체를 실시예 11a에 개시된 바와 같이 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 형광의 검출을 실시예 11a에 개시된 바와 같이 수행하였다.
비오틴화된 형광 염료 및 항-비오틴 항체 - 비오틴- Ser - Cy5 /인간화된 항-비오틴 항체의 접합체의 형성에 대한 예시적인 방법
상기 링커내에 세린 잔기를 함유하는 비오틴-유도체화된-Cy5(비오틴-Ser-Cy5)의 복합체의 생성을 위해서, 0.61 ㎎의 비오틴-Ser-Cy5를 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0에 10 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 18.5 ㎎의 인간화된 항-비오틴 항체를 50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2로 구성된 완충제 중에 10 ㎎/㎖(약 69 μM)의 농도로 사용하였다. 비오틴-Ser-Cy5 및 항체를 2.5:1 몰비(비오틴-Ser-Cy5 대 항체)로 혼합하고 RT에서 60 분 동안 배양하고, 350 rpm에서 진탕시켰다. 이어서 상기 샘플에 슈퍼덱스(Superdex) 200 16/60 높이 로드 프렙 등급 컬럼(GE 헬쓰케어)을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피를 1.5 ㎖/분의 유량 및 이동상으로서 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0으로 수행하였다. 피크 분획들을 수집하고 SDS-PAGE에 의해 순도에 대해 분석하였다. 상기 염료 대 항체 비를 (1) 파장 280 ㎚(단백질) 및 650 ㎚(Cy5)에서 상기 샘플의 흡광도를 측정하고; (2) 식: 표지된 단백질의 A650/ε(Cy5)*단백질 농도(M) = 염료 몰/단백질 몰(여기에서 ε(Cy5) = 250000 M-1㎝-1, 복합체의 A650 = 47.0 및 단백질 농도는 86.67 μM이다)을 사용하여 계산하였다. 상기 염료 대 항체 분자의 생성비는 2.17이었으며, 이는 모든 항체 파라토프가 비오틴-Cy5 분자로 포화됨을 가리킨다.
합텐화된 폴리펩타이드 및 항- 합텐 항체의 복합체 - 디곡시제닌 - PYY (3-36)/항-디곡시제닌 항체 복합체의 형성에 대한 예시적인 방법
디곡시제닌화된 폴리펩타이드와 항-디곡시제닌 항체와의 비-공유 복합체의 생성을 위해서 쥐 하이브리도마-유래된 항체(10 mM KPO4, 70 mM NaCl; pH 7.5로부터 동결건조물)를 12 ㎖ 수에 용해시키고 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0을 포함하는 용액에 대해 투석시켜 11 ㎖ 완충제 중의 300 ㎎(2 x 10- 6 mol)(c = 27.3 ㎎/㎖)을 제공하였다. 디곡시제닌-PYY(3-36) 접합체(11.57 ㎎, 4 x 10- 6 mol, 2 당량)를 1 시간 내에 4회 분취량의 2.85 ㎎에 가하고 실온에서 추가의 시간 동안 배양하였다. 상기 복합체화 반응의 완료 후에, 상기 복합체를 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl 중의 슈퍼덱스 200 26/60 GL 컬럼(320 ㎖)을 통해 pH 6.0에서 2.5 ㎖/분의 유량으로 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 용리된 복합체를 4 ㎖ 분획으로 수집하고, 모으고 0.2 ㎛ 필터상에서 멸균시켜 234 ㎎의 복합체를 14.3 ㎎/㎖의 농도로 제공하였다. 유사한 방식으로, 상기 인간화된 항-디곡시제닌 항체의 복합체의 생성을 위해서 상기 항체를 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 중의 10.6 ㎎/㎖(9.81 ㎎, 0.93 ㎖ 중의 6.5 x 10-8 mol)의 농도로 조절하였다. 0.57 ㎎ = 1.97 x 10- 7 mol = 3.03 당량의 상기 디곡시제닌화된 폴리펩타이드(DIG-PYY)를 동결건조물로서 상기 항체 용액에 가하였다. 폴리펩타이드 및 항체를 실온에서 1.5 시간 동안 배양하였다. 과잉의 폴리펩타이드를 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl 중의 슈퍼로스(Superose) 6 10/300 GL 컬럼을 통해 pH 6.0에서 0.5 ㎖/분의 유량으로 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 용리된 복합체를 0.5 ㎖ 분획으로 수집하고, 모으고, 0.2 ㎛ 필터상에서 멸균시켜 4.7 ㎎의 상기 복합체를 1.86 ㎎/㎖의 농도로 제공하였다.
상기 생성되는 합텐화된 폴리펩타이드-항-합텐 항체 복합체는 크기 배제 크로마토그래피에서 단일 피크의 출현을 통해 단량체성 IgG-유사 분자로서 한정되었다. 상기 생성되는 복합체는 항체 분자당 2개의 디곡시제닌-PYY 유도체를 갖는, 단량체성 IgG-유사 분자로서 한정되었다. 이들 펩타이드 복합체의 한정된 조성을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 확인하였으며, 이는 또한 단백질 응집체의 부재를 가리켰다. 이들 이중특이성 펩타이드 복합체의 한정된 조성(및 2:1의 폴리펩타이드 대 단백질 비)을 SEC-MALLS(크기 배제 크로마토그래피 - 다중각 광산란)에 의해 추가로 확인하였다. SEC-MALLS 분석을 위해서, 100 내지 500 ㎍의 각 샘플을, 이동상으로서 1x PBS pH 7.4를 갖는 슈퍼덱스 200 10/300 GL 크기 배제 컬럼에 0.25 내지 0.5 ㎖/분의 유량으로 적용하였다. 광산란을 와이어트 미니던(Wyatt MiniDawn) TREOS/QELS 검출기로 검출하고, 굴절률을 와이어트 옵티랩(Optilab) rEX-검출기로 측정하였다. 생성 데이터를 소프트웨어 ASTRA(버전 5.3.4.14)를 사용하여 분석하였다. SEC-MALLS 분석의 결과는 상기 복합체의 질량, 반경 및 크기에 관한 정보를 제공한다. 이어서 상기 데이터를 상응하는 비-복합체화된 항체의 데이터와 비교하였다. 이들 실험의 결과는 디곡시제닌화된-PYY의 항-디곡시제닌 항체에의 노출이 하나의 항체 분자당 2개의 디곡시제닌-PYY 유도체를 함유하는 복합체를 생성시킴을 입증한다. 따라서, 디곡시제닌화된 PYY는 한정된 부위(결합 영역)에서 항-디곡시제닌 항체와, 한정된 화학량론으로 복합체화할 수 있다.
표면 플라스몬 공명 연구에 의한 상기 복합체의 특성화는 상기 복합체화 반응이 한정되고 완전히 복합체화된 분자를 생성시킨다는 추가적인 증거를 제공하였다. 상기 항-디곡시제닌 항체를, 신호 증가를 생성시키는 SPR 칩에 결합시킬 수 있다. 디곡시제닌-PYY 접합체의 후속 첨가는 모든 결합 부위가 완전히 점유될 때까지 추가적인 신호 증가를 생성시킨다. 이러한 조건에서, 더 많은 디곡시제닌-PYY의 첨가는 상기 신호를 추가로 증가시키지 않는다. 이는 상기 복합체화 반응이 특이적이며 상기 신호가 상기 디곡시제닌화된 폴리펩타이드의 비-특이적인 점착성에 의해 유발되지 않음을 암시한다.
합텐화된 폴리펩타이드 및 항- 합텐 항체의 복합체 - Ac - PYY - PEG3 - Cys -β-Ala-Biot/키메릭 항-비오틴 항체 복합체의 형성에 대한 예시적인 방법
시스테인화된 링커를 함유하는 비오틴화된-PYY-폴리펩타이드의 비-공유 복합체의 생성을 위해서, 0.19 ㎎의 Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot를 100% DMF에 10 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 상기 항체를 50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2로 구성된 완충제 중에 10.7 ㎎/㎖(약 73 μM)의 농도로 사용하였다. Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot 및 항체를 2.5:1 몰비(Ac-PYY-PEG3-Cys-β-Ala-Biot 대 항체)로 혼합하고 RT 및 350 rpm에서 60 분 동안 배양하였다. 생성되는 복합체는 크기 배제 크로마토그래피에서 단일 피크의 존재를 통해 단량체성 IgG-유사 분자로서 한정되었다(95% 단량체). 상기 생성되는 복합체를 SDS-PAGE 및 후속의 웨스턴 블럿 분석에 의해 추가로 분석하였다. 10 ㎍의 상기 복합체를 4x LDS 샘플 완충제(인비트로젠)와 혼합하고 95 ℃에서 5 분 동안 배양하였다. 상기 샘플을 4 내지 12% 비스-트리스 폴리아크릴아미드-젤(NuPAGE, 인비트로젠)에 적용하고 200V 및 120 mA에서 35 분 동안 실행시켰다. 상기 폴리아크릴아미드-젤에서 분리된 분자들을 25V 및 160 mA에서 40 분 동안 PVDF 멤브레인(0.2 ㎛ 기공 크기, 인비트로젠)으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 RT에서 1 시간 동안 1x PBST(1x PBS + 0.1% 트윈20) 중의 1%(w/v) 탈지유로 차단하였다. 상기 멤브레인을 1x PBST 중에서 5 분 동안 3회 세척하고 후속적으로 스트렙트아비딘-POD-접합체(2900 U/㎖, 롯슈)(1:2000 희석으로 사용되었다)와 함께 배양하였다. 상기 멤브레인상의 비오틴에 결합된 스트렙트아비딘-POD의 검출을 루미-라이트(Lumi-Light) 웨스턴 블럿팅 기질(롯슈)을 사용하여 수행하였다.
합텐화된 폴리펩타이드 및 항- 합텐 항체의 복합체 - Ac - PYY - PEG3 - Cys - PEG2 -Biot/키메릭 항-비오틴 항체 복합체의 형성에 대한 예시적인 방법
시스테인화된 링커를 함유하는 비오틴화된-PYY-폴리펩타이드의 비-공유 복합체의 생성을 위해서, 0.16 ㎎의 Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot를 100% DMF에 10 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 상기 항체를 50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2로 구성된 완충제 중에 10.7 ㎎/㎖(약 73 μM)의 농도로 사용하였다. Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot 및 항체를 2.5:1 몰비(Ac-PYY-PEG3-Cys-PEG2-Biot 대 항체)로 혼합하고 RT 및 350 rpm에서 60 분 동안 배양하였다. 생성되는 복합체는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 63% 단량체성 IgG-유사 분자 및 37% 이량체성 용해성 응집체로서 한정되었다. 상기 생성되는 복합체를 SDS-PAGE 및 후속의 웨스턴 블럿 분석에 의해 추가로 분석하였다. 10 ㎍의 상기 복합체를 4x LDS 샘플 완충제(인비트로젠)와 혼합하고 95 ℃에서 5 분 동안 배양하였다. 상기 샘플을 4 내지 12% 비스-트리스 폴리아크릴아미드-젤(NuPAGE, 인비트로젠)에 적용하고 200V 및 120 mA에서 35 분 동안 실행시켰다. 상기 폴리아크릴아미드-젤에서 분리된 분자들을 25V 및 160 mA에서 40 분 동안 PVDF 멤브레인(0.2 ㎛ 기공 크기, 인비트로젠)으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 RT에서 1 시간 동안 1x PBST(1x PBS + 0.1% 트윈20) 중의 1%(w/v) 탈지유로 차단하였다. 상기 멤브레인을 1x PBST 중에서 5 분 동안 3회 세척하고 후속적으로 스트렙트아비딘-POD-접합체(2900 U/㎖, 롯슈)(1:2000 희석으로 사용되었다)와 함께 배양하였다. 상기 멤브레인상의 비오틴에 결합된 스트렙트아비딘-POD의 검출을 루미-라이트 웨스턴 블럿팅 기질(롯슈)을 사용하여 수행하였다.
합텐화된 폴리펩타이드 및 항- 합텐 항체의 복합체 - Ac - PYY -( PEG3 - Cys - PEG2-5-Fluo)/키메릭 항-플루오레세인 항체 복합체의 형성에 대한 예시적인 방법
시스테인화된 링커를 함유하는 플루오레세인-접합된-PYY-폴리펩타이드의 비-공유 복합체의 생성을 위해서, 0.33 ㎎의 Ac-PYY-(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo를 100% DMF에 10 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 상기 항체를 50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2로 구성된 완충제 중에 9.99 ㎎/㎖(약 68 μM)의 농도로 사용하였다. Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo 및 항체를 2.5:1 몰비(Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-5-Fluo) 대 항체)로 혼합하고 RT 및 350 rpm에서 60 분 동안 배양하였다. 생성되는 복합체는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 76% 단량체성 IgG-유사 분자 및 24% 이량체성 용해성 응집체로서 한정되었다. 상기 생성되는 복합체를 SDS-PAGE 및 후속의 폴리아크릴아미드-젤에서 플루오레세인-관련된 형광의 검출에 의해 추가로 분석하였다. 8 ㎍의 상기 복합체를 4x LDS 샘플 완충제(인비트로젠)와 혼합하고 95 ℃에서 5 분 동안 배양하였다. 플루오레세인-관련된 형광을 645 ㎚의 여기 파장에서 루미이미저(LumiImager) F1 장치(롯슈)를 사용하여 기록하였다.
실시예 11
산화환원제의 존재하에서 합텐화된 염료 또는 폴리펩타이드와 항-합첸 항체 VH52bC/VH53C와의 한정된 공유 접합체의 생성
합텐화된 형광 염료 및 항- 합텐 항체 - Dig - Cys - Ahx - Cy5 /항- 디곡시제닌 항체 VH52bC의 접합체의 형성에 대한 예시적인 방법
시스테인-링커를 함유하는 항-합텐 항체 및 합텐화된 형광 염료의 공유 접합체의 생성은 한정된 접합체를 생성시키며, 이때 다이설파이드 가교가 상기 합텐과 형광 염료 사이의 링커 중의 시스테인 및 항-합텐 항체의 CDR2 중의 VH52bC 사이의 특정 위치에 형성된다. 상기 접합 반응을 산화환원 시약의 존재하에서 수행하였다. Dig-Cys-Ahx-Cy5를 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 중에 용해시켰다. 용해를 10%(v/v) 아세트산의 적가에 의해 촉진하였다. 최종 농도를 0.4 ㎎/㎖로 조절하였다. 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 중의 항-디곡시제닌 항체 VH52bC를 10 ㎎/㎖의 농도로 만들었다. 항-디곡시제닌 항체를 대조용으로서 사용하였으며 항-디곡시제닌 항체 VH52bC와 동일한 방식으로 처리하였다. 4.7 nmol의 각각의 항체를 2.5 몰 당량의 Dig-Cys-Ahx-Cy5와 혼합하였다. 이를, 11.7 nmol의 상기 물질을 15 분 마다 4회 분취량(각각 2.9 nmol)으로 가하여 성취하였다. 이들 첨가 사이에서, 상기 샘플을 서서히 진탕시키면서 25 ℃에서 배양하였다. 최종 분취량의 첨가 후에, 0.64 nmol의 각각의 항체-Dig-Cys-Ahx-Cy5 복합체를 하기의 산화환원 시약: 3 mM DTE(다이티오에리쓰리톨) + 10 mM GSSG(산화된 글루타치온), 0.3 mM DTE + 1 mM GSSG 및 0.03 mM DTE + 0.1 mM GSSG를 함유하는 완충제로 옮겼다. 모든 샘플을 상기 조건에서 15 분 동안 배양하였다. 상기 배양 후에, 샘플들을 절반(각각 0.34 nmol)으로 분할하고 SDS 젤 전기영동을 위해 제조하였다. 이를 위해서, 4x LDS 샘플 완충제(인비트로젠)를 가하였다. 각각의 샘플에 대해서 또한 10x NuPAGE 샘플 환원제(인비트로젠)의 첨가에 의해 환원된 버전을 제조하였다. 모든 샘플을 70 ℃에서 5 분 동안 배양한 후에 1x MOPS 완충제(인비트로젠)를 사용하여 4 내지 12% 비스-트리스 폴리아크릴아미드 젤(NuPAGE, 인비트로젠)상에서 전기영동하였다. 상기 젤 중의 Cy5-관련된 형광을 645 ㎚의 여기 파장에서 루미이미저 F1 장치(롯슈)로 검출하였다. 형광의 검출 후에, 상기 젤을 심플리블루 세이프스테인(SimplyBlue SafeStain)(인비트로젠)으로 염색하였다. 젤을 도 8에 도시한다.
부위-특이적인 다이설파이드 결합 형성이, CDR2 중의 시스테인 없이 항-디곡시제닌 항체를 사용하는 경우(레인 2 A 내지 C) 낮은 배경 형광 신호와 함께 항-디곡시제닌 항체 VH52bC(도 8, 상부의 젤, 레인 1 A 내지 C)에 대해 나타났다. 대조용 반응에서 배경 신호는 항체-쇄간 다이설파이드 결합의 형성에 통상적으로 관련되는 시스테인에 대한 Dig-Cys-Ahx-Cy5의 커플링에 의해 설명될 수 있다. 증가량의 산화환원 시약은 실질적으로, 항체 중쇄 및 경쇄를 결합시켜 주로 ¾ 항체(-1x LC), HC-이량체(-2x LC) 및 ½ 항체(1x HC + 1x LC)를 생성시키는 다이설파이드 가교를 환원시킨다. 상기 젤의 기부에서 상기 항체에 공유 결합되지 않은 Dig-Cys-Ahx-Cy5의 형광이 검출될 수 있다. 도 8의 기부의 젤은, 상기 샘플의 환원시, Cy5-관련된 형광이 상기 항체 중쇄 및 경쇄 부근에서 검출될 수 없음을 나타내며, 이는 공유 결합이 실제로 다이설파이드 가교에 의해 형성되었음을 암시한다. 각 젤의 쿠마씨 염색은 각 레인 중의 단백질의 총량이 동일함을 나타낸다.
합텐화된 형광 염료 및 항- 합텐 항체 - Dig - Cys - Cy5 /항- 디곡시제닌 항체 VH52bC의 접합체의 형성에 대한 예시적인 방법
Dig-Cys-Cy5를 8.3 mM HCl, 10%(v/v) DMF에 3.25 ㎎/㎖의 최종 농도로 용해시켰다. 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 중의 항-디곡시제닌 항체 VH52bC 항체를 15 ㎎/㎖의 농도로 만들었다. 항-디곡시제닌 항체를 대조용으로서 사용하였으며 항-디곡시제닌 항체 VH52bC와 동일한 방식으로 처리하였다. 13.3 nmol의 각 항체를 1 mM GSH(환원된 글루타치온) 및 5 mM GSSG(산화된 글루타치온)의 존재하에서 2 몰 당량의 Dig-Cys-Cy5와 10 ㎎/㎖의 최종 항체 농도로 혼합하였다. 이를, 26.6 nmol의 상기 물질을 5 분 마다 2회 분취량으로 가하여 성취하였다. 이들 첨가 사이에서, 상기 샘플을 서서히 진탕시키면서 RT에서 배양하였다. 최종 분취량의 첨가 후에, 상기 샘플을 RT에서 1 시간 동안 배양하였다. 상기 커플링 반응의 효율을 SDS-PAGE 및 후속적인 Cy5-관련된 형광 신호의 기록에 의해 평가하였다. 5, 10 및 20 ㎍의 각 샘플을 SDS-PAGE를 위해 제조하였다. 이를 위해서, 4x LDS 샘플 완충제(인비트로젠)를 가하였다. 모든 샘플을 70 ℃에서 5 분 동안 배양한 후에 1x MOPS 완충제(인비트로젠)를 사용하여 4 내지 12% 비스-트리스 폴리아크릴아미드 젤(NuPAGE, 인비트로젠)상에서 전기영동하였다. 상기 젤 중의 Cy5-관련된 형광을 645 ㎚의 여기 파장에서 루미이미저 F1 장치(롯슈)로 검출하였다. 형광의 검출 후에, 상기 젤을 심플리블루 세이프스테인(인비트로젠)으로 염색하였다.
합텐화된 폴리펩타이드 및 항- 합텐 항체 - PEG3 - PYY ( PEG3 - Cys - 4Abu - Dig )/인간화된 항-디곡시제닌 항체 VH52bC의 접합체의 형성에 대한 예시적인 방법
시스테인화된 링커를 함유하는 디곡시제닌-유도체화된-PYY-폴리펩타이드의 접합체의 생성을 위해서, 1.4 ㎎의 PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)를 100% DMF에 10 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 1 ㎎의 상기 항체를 5 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM GSH, 5 mM GSSG, pH 8.2로 구성된 완충제 중에 10 ㎎/㎖(약 68 μM)의 농도로 사용하였다. PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig) 및 항체를 2:1 몰비(PEG3-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig) 대 항체)로 혼합하고 RT에서 60 분 동안 배양하고, 100 rpm에서 교반하였다. 생성되는 접합체를 질량 분광분석법에 의해 분석하였다. 검출된 종의 43%는 2 폴리펩타이드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었고, 46%는 1 폴리펩타이드 분자에 커플링된 항체였으며 11%는 커플링되지 않은 항체로서 확인되었다.
실시예 12
산화환원제의 부재하에서 합텐화된 염료 및 폴리펩타이드와 항-합텐 항체 VH52bC/VH53C와의 한정된 공유 접합체의 생성
공유 항-합텐 항체/합텐화된 폴리펩타이드 또는 합텐화된 염료 다이설파이드-결합된 접합체의 생성을 위해서 (i) 상기 합텐(예를 들어 디곡시제닌, 플루오레세인, 비오틴 또는 테오필린)을 적합한 반응기(예를 들어 시스테인, 말레이미드) 함유 링커를 통해 폴리펩타이드, 또는 상기 폴리펩타이드를 항체 표면 위에 노출되게 하고 따라서 그의 활성을 유지하게 하는 염료에 커플링시키고, (ii) 상기 합텐화된 폴리펩타이드와 시스테인 돌연변이를 갖는 항-합텐 항체(=항체 VH52bC/VH53C)와의 공유 부위 특이적 접합체(여기에서 상기 폴리펩타이드의 생물 활성이 유지된다)를 생성시키고, (iii) 항체 쇄-간 다이설파이드 가교의 환원을 피하기 위해서 환원제의 부재하에서 상기 반응을 수행하는 것이 필요하다.
일반적인 방법:
항-합텐 항체와 합텐화된 화합물과의 접합체의 생성은 한정된 화학량론을 갖는 접합체를 생성시킬 것이며 상기 접합체 중의 상기 화합물이 그의 활성을 확실히 유지하게 할 것이다. 합텐화된 화합물과 각각의 항-합텐 항체와의 접합체의 생성을 위해서 상기 합텐화된 화합물을 100% DMF 중에 10 ㎎/㎖의 최종 농도로 용해시켰다. 상기 항-합텐 항체 VH52bC/VH53C를 50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH = 8.2에 10 ㎎/㎖의 농도로 만들었다. 합텐화된 화합물 및 항-합텐 항체 VH52bC/VH53C를 상하 피펫팅에 의해 2.5:1 몰비(화합물 대 항체)로 혼합하고 RT 및 350 rpm에서 60 분 동안 배양하였다.
시스테인 함유 링커를 통해 상기 합텐에 접합된 폴리펩타이드를 하기에서 합텐-Cys-폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드-Cys-합텐이라 칭한다. 상기 폴리펩타이드는 유리 N-말단 또는 예를 들어 아세틸-기(Ac-폴리펩타이드-Cys-합텐) 또는 PEG-잔기(PEG-폴리펩타이드-Cys-합텐)으로 캡핑된 N-말단을 가질 수 있다.
시스테인 함유 링커를 통해 상기 합텐에 접합된 형광 염료를 하기에서 염료-Cys-합텐 또는 합텐-Cys-염료라 칭한다.
합텐화된 형광 염료 및 항- 합텐 항체 - Dig - Cys - Ahx - Cy5 /항- 디곡시제닌 항체 VH52bC의 접합체의 형성에 대한 예시적인 방법
샘플을 정확히 실시예 11a에 개시된 바와 같이 제조하였으며, 이때 차이는 항체-Dig-Cys-Ahx-Cy5 복합체를 산화환원 화합물, 0.1 mM GSSG(산화된 글루타치온) 또는 1 mM GSSG를 함유하지 않는 완충제로 옮겼다는 것이다. 생성되는 형광-스캐닝되고 쿠마씨 염색된 폴리아크릴아미드 젤을 도 9에 도시한다. 3개의 조건은 모두 낮은 수준의 배경 반응(도 9, 레인 2 A 내지 C)과 함께 부위-특이적인 다이설파이드 결합 형성(도 9, 상부 젤, 레인 1 A 내지 C)에 대해 유사한 특이성을 나타낸다. 이는 상기 다이설파이드 결합의 형성이 환원제의 필요 없이 수행될 수 있음을 입증한다. 이는 실시예 11에 비해 단지 잔량의 ¾ 항체(-1x LC), HC-이량체(-2x LC) 및 ½ 항체(1x HC + 1x LC)만이 검출되기 때문에, 상기 항체를 현저하게 안정화시키고/항체 분해를 감소시킨다.
합텐화된 형광 염료 및 항- 합텐 항체 - Dig - Cys - Cy5 /항- 디곡시제닌 항체 VH52bC의 접합체의 형성에 대한 예시적인 방법
샘플을 정확히 실시예 11b에 개시된 바와 같이 제조하였으며, 이때 차이는 13.3 nmol의 항체를 산화환원 시약의 부재하에서 2 몰 당량의 Dig-Cys-Cy5와 10 ㎎/㎖의 최종 항체 농도로 혼합하였다는 것이다.
합텐화된 형광 염료 및 항- 합텐 항체 - 비오틴- Cys - Cy5 / 키메릭 항-비오틴 항체 VH53C의 접합체의 형성에 대한 예시적인 방법
시스테인화된 링커를 함유하는 비오틴-유도체화된-Cy5의 접합체의 생성을 위해서, 0.16 ㎎의 비오틴-Cys-Cy5를 100% DMF에 10 ㎎/㎖의 최종 농도로 용해시켰다. 1 ㎎의 항-비오틴 항체 VH53C를 50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2로 구성된 완충제 중에 9.7 ㎎/㎖(약 68 μM)의 농도로 사용하였다. 비오틴-Cys-Cy5 및 항체를 2.5:1 몰비(Ac-비오틴-Cys-Cy5 대 항체)로 혼합하고 RT에서 60 분 동안 배양하고, 350 rpm에서 진탕시켰다. 생성되는 접합체를 실시예 11a에 개시된 바와 같이 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 형광의 검출을 실시예 11a에 개시된 바와 같이 수행하였다.
합텐화된 형광 염료 및 항- 합텐 항체 - 비오틴- Cys - Cy5 /인간화된 항-비오틴 항체 VH53C의 접합체의 형성에 대한 예시적인 방법
시스테인화된 링커를 함유하는 비오틴-유도체화된-Cy5의 접합체의 생성을 위해서, 0.16 ㎎의 비오틴-Cys-Cy5를 100% DMF에 10 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 1 ㎎의 인간화된 항-비오틴 항체 VH53C를 50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2로 구성된 완충제 중에 7.4 ㎎/㎖(약 51 μM)의 농도로 사용하였다. 비오틴-Cys-Cy5 및 항체를 2.5:1 몰비(Ac-비오틴-Cys-Cy5 대 항체)로 혼합하고 RT에서 60 분 동안 배양하고, 350 rpm에서 진탕시켰다. 생성되는 접합체를 실시예 11a에 개시된 바와 같이 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 형광의 검출을 실시예 11a에 개시된 바와 같이 수행하였다.
합텐화된 폴리펩타이드 및 항- 합텐 항체 - Ac - PYY ( PEG3 - Cys - 4Abu - Dig )/인간화된 항- 디곡시제닌 항체 VH52bC의 접합체의 형성에 대한 예시적인 방법
시스테인화된 링커를 함유하는 디곡시제닌-유도체화된-PYY-폴리펩타이드의 접합체의 생성을 위해서, 2.4 ㎎의 Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig)를 20% 아세테이트에 5 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 10 ㎎의 상기 인간화된 항-디곡시제닌 항체 VH52bC(68.4 nmol)를 20 mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0으로 구성된 완충제 중에 19.5 ㎎/㎖(약 133 μM)의 농도로 사용하였다. Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig) 및 항체를 2:1 몰비(Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-Dig) 대 항체)로 혼합하고 RT에서 60 분 동안 배양하고, 100 rpm에서 교반하였다. 생성되는 접합체를 질량 분광분석법에 의해 분석하였다. 검출된 종의 7.4%는 2 펩타이드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었고, 40%는 1 펩타이드 분자에 커플링된 항체였으며 52%는 커플링되지 않은 항체로서 확인되었다.
합텐화된 폴리펩타이드 및 항- 합텐 항체 - Ac - PYY ( PEG3 - Cys - βAla - Biot )/ 키 메릭 항-비오틴 항체 VH53C의 접합체의 형성에 대한 예시적인 방법
시스테인화된 링커를 함유하는 비오틴-유도체화된-PYY-폴리펩타이드의 접합체의 생성을 위해서, 0.19 ㎎의 Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biot)를 100% DMF에 10 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 1 ㎎의 상기 키메릭 항-비오틴 항체 VH53C를 50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2로 구성된 완충제 중에 9.7 ㎎/㎖(약 67 μM)의 농도로 사용하였다. Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot 및 항체를 2.5:1 몰비(Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot] 대 항체)로 혼합하고 RT에서 60 분 동안 배양하고, 350 rpm에서 진탕하였다. 생성되는 접합체를 질량 분광분석법에 의해 분석하였다. 검출된 종의 87.7%는 2 펩타이드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었고, 12.3%는 1 펩타이드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었다.
합텐화된 폴리펩타이드 및 항- 합텐 항체 - Ac - PYY ( PEG3 - Cys - PEG2 - Biot )/ 키메 릭 항-비오틴 항체 VH53C의 접합체의 형성에 대한 예시적인 방법
시스테인화된 링커를 함유하는 비오틴-유도체화된 PYY-폴리펩타이드의 접합체의 생성을 위해서, 0.16 ㎎의 Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biot)를 100% DMF 중에 10 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 1 ㎎의 상기 키메릭 항-비오틴 항체 VH53C를 50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2로 구성된 완충제 중에 9.9 ㎎/㎖(약 68 μM)의 농도로 사용하였다. Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot 및 항체를 2.5:1 몰비(Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot] 대 항체)로 혼합하고 RT에서 60 분 동안 배양하고, 350 rpm에서 진탕시켰다. 상기 생성되는 접합체를 질량 분광분석법에 의해 분석하였다. 검출된 종의 100%는 2 펩타이드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었다.
합텐화된 폴리펩타이드 및 항- 합텐 항체 - Ac - PYY ( PEG3 - Cys - βAla - Biot )/인간화된 항-비오틴 항체 VH53C의 접합체의 형성에 대한 예시적인 방법
시스테인화된 링커를 함유하는 비오틴-유도체화된-PYY-폴리펩타이드의 접합체의 생성을 위해서, 0.06 ㎎의 Ac-PYY(PEG3-Cys-βAla-Biot)를 100% DMF에 10 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 0.8 ㎎의 상기 인간화된 항-비오틴 항체 VH53C를 50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2로 구성된 완충제 중에 9 ㎎/㎖(약 62 μM)의 농도로 사용하였다. Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot 및 항체를 2.5:1 몰비(Ac-PYY[PEG3-Cys-βAla-Biot] 대 항체)로 혼합하고 RT에서 60 분 동안 배양하고, 350 rpm에서 진탕하였다. 생성되는 접합체를 질량 분광분석법에 의해 분석하였다. 검출된 종의 62.2%는 2 펩타이드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었고, 33.9%는 1 펩타이드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었으며, 3.9%는 커플링되지 않은 항체로서 확인되었다.
합텐화된 폴리펩타이드 및 항- 합텐 항체 - Ac - PYY ( PEG3 - Cys - PEG2 - Biot )/인간화된 항-비오틴 항체 VH53C의 접합체의 형성에 대한 예시적인 방법
시스테인화된 링커를 함유하는 비오틴-유도체화된-PYY-폴리펩타이드의 접합체의 생성을 위해서, 0.08 ㎎의 Ac-PYY(PEG3-Cys-PEG2-Biot)를 100% DMF에 10 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 0.8 ㎎의 상기 인간화된 항-비오틴 항체 VH53C를 50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2로 구성된 완충제 중에 9 ㎎/㎖(약 62 μM)의 농도로 사용하였다. Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot 및 항체를 2.5:1 몰비(Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Biot] 대 항체)로 혼합하고 RT에서 60 분 동안 배양하고, 350 rpm에서 진탕하였다. 생성되는 접합체를 질량 분광분석법에 의해 분석하였다. 검출된 종의 71.4%는 2 펩타이드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었고, 26%는 1 펩타이드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었으며, 2.5%는 커플링되지 않은 항체로서 확인되었다.
합텐화된 폴리펩타이드 및 항- 합텐 항체 - Ac - PYY ( PEG3 - Cys - EPG2 - Fluo )/항-플루오레세인 항체 VH52bC의 접합체의 형성에 대한 예시적인 방법
시스테인화된 링커를 함유하는 비오틴-유도체화된-PYY-폴리펩타이드의 접합체의 생성을 위해서, 0.33 ㎎의 Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo를 100% DMF에 10 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 1 ㎎의 상기 항-플루오레세인 항체 VH52bC를 50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2로 구성된 완충제 중에 9.3 ㎎/㎖(약 63 μM)의 농도로 사용하였다. Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo 및 항체를 2.5:1 몰비(Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo] 대 항체)로 혼합하고 RT에서 60 분 동안 배양하고, 350 rpm에서 진탕하였다. 생성되는 접합체를 질량 분광분석법에 의해 분석하였다. 검출된 종의 95%는 2 펩타이드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었고, 5%는 1 펩타이드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었다.
합텐화된 폴리펩타이드 및 항- 합텐 항체 - Ac - PYY ( PEG3 - Cys - EPG2 - Fluo )/항-플루오레세인 항체 VH28C의 접합체의 형성에 대한 예시적인 방법
시스테인화된 링커를 함유하는 비오틴-유도체화된-PYY-폴리펩타이드의 접합체의 생성을 위해서, 0.33 ㎎의 Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo를 100% DMF에 10 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 1 ㎎의 상기 항-플루오레세인 항체 VH28C를 50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2로 구성된 완충제 중에 9.5 ㎎/㎖(약 63 μM)의 농도로 사용하였다. Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo 및 항체를 2.5:1 몰비(Ac-PYY[PEG3-Cys-PEG2-Fluo] 대 항체)로 혼합하고 RT에서 60 분 동안 배양하고, 350 rpm에서 진탕하였다. 생성되는 접합체를 질량 분광분석법에 의해 분석하였다. 검출된 종의 100%가 2 펩타이드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었다.
실시예 13
공유 테오필린-항-테오필린 항체 복합체의 생성
합텐 인식 시스템으로서 테오필린 및 테오필린-결합 항체를 사용하는 공유 항체 복합체의 형성을 평가하기 위해서, 테오필린-Cys-Cy5를, 합텐을 테오필린에 대해 교환하였음을 제외하고 일반적으로 디곡시제닌-Cys-Cy5 또는 비오틴-Cys-Cy5에 대해 개시된 합성 및 정제 기술을 적용하여(실시예 8 및 도 13, 14 및 22 참조) 형광 페이로드로서 생성시켰다. 상기 합성된 테오필린-Cys-Cy5 유도체의 조성을 도 43a)에 나타낸다. 공유 다이설파이드의 형성을 입증하기 위해서, 중쇄 가변 영역의 54번 또는 55번 위치에 디자인된 Cys(항-테오필린 항체-Cys)를 함유하는 테오필린-결합 항체를 생성시켰다. 상기 항체의 순도는 도 43b에서 Y54C 변이체에 대해 예시적으로 나타낸다. 이들 항체 유도체를 테오필린-Cys-Cy5와 복합체화하고 후속적으로 실시예 12에 개시된 바와 같이 비-환원 및 환원 조건하에서 SDS-PAGE를 수행하였다. 비-환원 조건하에서, 다이설파이드-결합된 항-테오필린-항체 복합체화된 Cy5가 실시예 12에 개시된 바와 동일한 방식으로 젤 내에 그의 H-쇄 관련된 형광에 의해 검출되었다. 이는 도 43c)에 도시되어 있으며, 상기 도면은 항체간의 공유 복합체가 합텐으로서 디곡시제닌, 플루오레세인 또는 비오틴을 사용하는 경우 관찰된 다이설파이드와 동일한 방식으로 간단한 로딩 반응의 결과로서 형성되었음을 입증한다. 이들 복합체는 환원시 예상된 바와 같이 해리되었다, 즉 다이설파이드가 환원된 경우에만 H-쇄로부터 페이로드를 방출하였다(도 43c)).
실시예 14
생체내 유사 조건하에서 공유 합텐-항체 복합체의 생성, 및 생체내에서 직접적인 다이설파이드-형성에 대한 증거
생체내 유사 조건하에서 공유 합텐-항체 복합체의 형성을 평가하기 위해서, 항-비오틴 항체-Cys를 37 ℃에서 60 분 동안 비오틴-Cys-Cy5를 갖는 쥐 혈청 중에서 배양하였다. 후속적으로, 상기 항체를 단백질-A에 의해 상기 쥐 혈청으로부터 포획하였다. 그 후에 상기 포획된 항체에 실시예 12에 개시된 바와 같이 비-환원 및 환원 조건하에서 SDS-PAGE를 가하였다. 다이설파이드-결합된 항체-복합체화된 Cy5가 실시예 12에 개시된 바와 동일한 방식으로 젤 내에 그의 H-쇄 관련된 형광에 의해 검출되었다. 도 44는 항체간의 공유 복합체가 37 ℃에서 혈청 중에서, 즉 생체내 조건을 닮은 조건하에서 형성됨을 입증한다. 이들 복합체는 환원시 예상된 바와 같이 해리된다, 즉 페이로드가 다이설파이드가 환원되는 경우에만 H-쇄로부터 방출된다(도 44). 합텐-위치결정시 항체와 페이로드간의 직접적인 다이설파이드 결합이 혈청의 존재하에서도 형성될 수 있다는 관찰은, 혈청이 다량의 단백질, 펩타이드 및 다른 화합물들(이들은 다이설파이드-형성 반응을 방해할 수 있다)을 함유하기 때문에 뜻밖이다. 합텐-위치결정시 항체와 페이로드간의 직접적인 다이설파이드 결합이 37 ℃에서 혈청 중에서 형성될 수 있다는 관찰은 또한 상기 PK-조절 시스템을 예비-표적화 환경, 즉 항체 및 합텐-페이로드의 별도의 적용, 이어서 항체 복합체의 생체내-조립 및 후속의 다이설파이드 형성에 적용할 가능성을 열어둔다.
잠재적인 생체내 '예비-표적화' 용도를 추가로 평가하기 위해서, 비오틴-Cy5의 약동학을 실시예 19에 개시된 바와 같이 동물 눈의 비-침습적인 광학 영상화 기술에 의해 예비-표적화 조건하에서 측정하였다. 이들 실험에서, Cy5의 존재를 동물 눈의 광학 영상화에 의해 비-침습적으로 측정하였으며, 모세관 중 Cy5의 형광을 드러내었다. 우리가 비오틴-Cy5의 주입 후 10 분째에 마우스의 눈에서 검출한 Cy5-매개된 형광값을 100% 값으로서 설정하였으며, 후속의 시점들에서 측정된 형광값을 이에 대해 상대적으로 나타내었다. 상기 실험에서, 1 ㎎ 항체(항-비오틴 항체 또는 항-비오틴 항체-Cys(=항-비오틴 항체의 Cys-돌연변이체))를 상기 비오틴-Cy5의 주입 및 눈 영상화의 개시 24 시간 전에 적용하였다. 대조군은 상기 항-비오틴 항체를 사전-주입하지 않았다.
이들 실험의 결과를 도 45에 나타낸다: 사전-주입된 항체를 수령하지 않은 동물에의 비오틴-Cy5의 주입은 낮은 혈정 반감기 및 낮은 노출 수준으로 제거되었다(다이아몬드). 항-비오틴 항체(Cys 돌연변이 없음)가 24 시간 사전-주입된 동물에게 주입된 비오틴-Cy5의 혈청 수준 및 반감기는 크게 증가하였다. 이는 상기 항체가 순환시 그의 항원(페이로드와 함께)을 포획하며, 상기 항원의(및 마찬가지로 상기 접합된 페이로드의) 혈청 반감기를 연장시킴을 나타낸다. 상기 항-비오틴 항체 Cys(즉 공유 페이로드 커플링에 대해 본 발명에 보고된 바와 같은 Cys 돌연변이를 함유하는 항체)가 24 시간 사전-주입된 동물에게 주입된 비오틴-Cys-Cy5의 상대적인 혈청 수준 및 반감기는 훨씬 더 증가하였다. 이들 샘플에서, 상대적인 Cy5 수준은 복합체화되지 않은 화합물의 경우보다 더 높을 뿐만 아니라, 복합체화된(그러나 다이설파이드-결합되지는 않은) Cy5의 수준보다 더 높다. 따라서, 합텐-복합체화된 다이설파이드-결합된 페이로드(생체내 사전-표적화 조건하에서 형성된다)는 순환 중에 보다 안정하며, 비-공유 복합체화된 페이로드보다 더 높은 노출 수준에 도달할 수 있다.
실시예 15
항-합텐 항체를 갖는 접합체 및 복합체 중의 폴리펩타이드는 기능성을 유지한다.
우리는 앞서 항-합텐 항체를 갖는 비-공유 합텐-폴리펩타이드 접합체 및 복합체의 부분인 폴리펩타이드가 기능성을 유지함을 입증하였다(WO2011/003557, WO 2011/003780 및 WO　2012/093068). 커플링된 펩타이드가 공유 다이설파이드-커플링시 또한 기능성을 유지하는지를 입증하기 위해서, 항-디곡시제닌 항체 복합체화된 폴리펩타이드 및 항-디곡시제닌 항체 VH52bC를 갖는 그의 다이설파이드-접합체의 생물 활성을 비교하였다.
PYY-유래된 펩타이드의 치료학적으로 목적하는 기능성은 그의 동족 수용체 NPY2의 신호전달에 결합하여 이를 방해하는 것이다. 상기 NPY2 수용체를 통한 신호전달은 대사 과정에 관련되고/되거나 상기 과정을 조절한다.
폴리펩타이드 Dig-PYY와 항-디곡시제닌 항체와의 복합체화 또는 SS-접합 또는 폴리펩타이드 Dig-Cys-PYY와 항-디곡시제닌 항체 VH52bC와의 접합이 각각 그의 활성에 영향을 미치는지의 여부를 평가하기 위해서, 우리는 상기 NPY2 수용체를 발현하는 HEK293 세포 중 포스콜린(Forskolin) 자극된 cAMP 축적을 억제하는 그의 능력을 평가하였다(cAMP 분석).
하기 표 6은 PYY(3-36), 그의 Y2 수용체 특이적 변형된 유사체 moPYY, 그의 항체-복합체화된 Dig-변이체 및 그의 다이설파이드-접합된 Dig-Cys-유도체의 생물 활성을 평가하기 위해 수행된 cAMP-분석의 결과를 나타낸다.
제1일 제2일
샘플 EC50 [nM] EC50 [nM]
PYYwt 0.09 0.1
moPYY 0.14 0.15
moPYY(Cys-Dig)-다이설파이드 접합된-항-디곡시제닌 항체 VH52bC 5.38 5.33
moPYY(Dig) - 항-디곡시제닌 항체 복합체 9.26 12.55
상기 cAMP 작용물질 분석을 위해서, 하기의 물질들을 사용하였다: 384-웰 플레이트; 트로픽스(Tropix) cAMP-스크린 키트; cAMP ELISA 시스템(어플라이드 바이오시스템스, 카탈로그 번호 T1505; CS 20000); 포스콜린(칼바이오켐(Calbiochem) 카탈로그 번호 344270); 세포: HEK293/hNPY2R; 생육 배지: 둘베코의 변형된 이글 배지(D-MEM, 깁코(Gibco)); 10% 소 태아 혈청(FBS, 깁코), 열불활성화됨; 1% 페니실린/스트렙토마이신(펜 10000 단위/㎖: 스트렙 10000 ㎎/㎖, 깁코); 500 ㎍/㎖ G418(제네티신, 깁코 카탈로그 번호 11811-031); 및 도말 배지: DMEM/F12 w/o 페놀 레드(깁코); 10% FBS(깁코, 카탈로그 번호 10082-147), 열불활성화됨; 1% 페니실린/스트렙토마이신(깁코, 카탈로그 번호 15140-122); 500 ㎍/㎖ G418(제네티신, 깁코, 카탈로그 번호 11811-031).
상기 분석을 수행하기 위해서, 제1일에 배지를 버리고, 단층 세포를 플라스크(T222)당 10 ㎖ PBS로 세척하였다. PBS를 경사분리시킨 후에, 5 ㎖ 베르센(VERSENE)(깁코, 카탈로그 번호 1504006)을 사용하여 세포를 옮겼다(37 ℃에서 5 분). 상기 플라스크를 부드럽게 탭핑하여 세포 현탁액을 모았다. 각 플라스크를 10 ㎖ 도말 배지로 세정하고 1000 rpm에서 5 분 동안 원심분리시켰다. 상기 현탁액을 모으고 카운트하였다. 상기 현탁액을 도말 배지에 HEK293/hNPY2R의 경우 2.0x105 세포/㎖의 밀도로 재현탁시켰다. 50 ㎕의 세포(HEK293/hNPY2R - 10,000 세포/웰)를 다중-드롭 분배기를 사용하여 384-웰 플레이트로 옮겼다. 상기 플레이트를 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 제2일에, 상기 세포를 75 내지 85% 세포밀집도에 대해 검사하였다. 상기 배지 및 시약을 실온으로 되게 하였다. 희석액의 제조 전에, 다이메틸 설폭사이드(DMSO, 시그마, 카탈로그 번호 D2650) 중의 자극 화합물의 모액을 5 내지 10 분 동안 32 ℃까지 가온되게 하였다. 상기 희석액을 DMEM/F12에서 0.5 mM 3-아이소부틸-1-메틸잔틴(IBMX, 칼바이오켐, 카탈로그 번호 410957) 및 0.5 ㎎/㎖ BSA와 함께 제조하였다. 상기 자극 배지 중의 최종 DMSO 농도는 5 μM의 포스콜린 농도와 함께 1.1%였다. 상기 세포 배지를 종이 타월상에서 상기 세포 플레이트를 부드럽게 뒤집어 탭핑하였다. 웰당 50 ㎕의 자극 배지를 놓았다(각각의 농축이 4회 중복하여 수행되었다). 상기 플레이트를 실온에서 30 분 동안 배양하고, 상기 세포를 독성에 대해 현미경하에서 검사하였다. 30 분의 처리 후에, 상기 자극 배지를 버리고 50 ㎕/웰의 분석 용해 완충제(상기 트로픽스 키트 중에 제공됨)를 가하였다. 상기 플레이트를 37 ℃에서 45 분 동안 배양하였다. 20 ㎕의 상기 용해물을 자극 플레이트로부터 상기 트로픽스 키트로부터의 예비-코팅된 항체 플레이트(384-웰)로 옮겼다. 10 ㎕의 AP 접합체 및 20 ㎕의 항-cAMP 항체를 가하였다. 상기 플레이트를 1 시간 동안 진탕시키면서 실온에서 배양하였다. 이어서 상기 플레이트를, 각 세척에 대해 웰당 70 ㎕의 세척 완충제로 5회 세척하였다. 상기 플레이트를 탭핑 건조시켰다. 30 ㎕/웰의 CSPD/사파이어-II RTU 기질/인헨서 용액을 가하고 RT에서 45 분 동안 배양하였다(진탕). 루미노미터(VICTOR-V)에서 1 초/웰로 신호를 측정하였다.
상기 분석의 결과(표 6)는 상기 변형된 펩타이드 유도체 moPYY가 야생형 PYY보다 무시할 정도로 더 낮은 활성을 가짐을 나타낸다. 상기 cAMP 분석의 IC50 값은 야생형 PYY의 경우 0.09 nM이고 변형된 유사체의 경우 0.14 nM이었다. 공유 다이설파이드-접합은 생물 활성의 약간의 감소를 생성시켰다. 상기 IC50 값은 상기 접합체의 경우 5 내지 36 nM이었다. 놀랍게도 상기 공유 다이설파이드-접합체는 10.91 nM의 IC50 값을 갖는 비-공유 복합체보다 2배 더 활성이다.
실시예 16
인간화된 항-비오틴 항체 VH53C와의 비오틴화된 Cy5의 공유 접합체와 비교된, 인간화된 항-비오틴 항체와의 비오틴화된 Cy5의 복합체의 혈청 안정성
개시된 펩타이드 변형 기술의 목적은 펩타이드의 치료학적 적용성을 개선시키는 것이다. 펩타이드의 치료학적 적용에 주된 장애는 현재 제한된 생체내 안정성 및/또는 짧은 혈청 반감기 및 빠른 제거이다. 형광단의 항체 접합체의 PK 매개변수를 생체내에서 측정하고 비-공유 항체-형광단 복합체의 PK와 비교하였다. 따라서, (i) 항-비오틴 항체 VH53C를 비오틴화된 형광단 Biot-Cys-Cy5에 공유 접합시키고, (ii) 비오틴화된 형광단 Biot-Cy5와 항-비오틴 항체와의 비-공유 복합체를 생성시키고, (iii) 상기 공유 접합된 및 비-공유 복합체화된 화합물을 동물에게 투여하고, (iv) 상기 동물에서 시간에 따른 상기 화합물들의 혈청 농도를, Cy5의 형광(A650)의 측정 및 상기 인간화된 항체를 특이적으로 검출하는 ELISA 방법에 의한 상응하는 항체의 측정에 의해 측정하였다.
실험 과정
작은 형광 기질의 항체-복합체화 또는 항체-접합의 PK 매개변수에 대한 영향을 분석하기 위해서, 20 mM 히스티딘/140 mM NaCl, pH 6.0 중의 13 nmol의 Cy5-비오틴/인간화된 항-비오틴 항체 VH53C-접합체, 또는 상응하는 항체 비-공유 복합체화된 화합물, 또는 상기 형광 화합물 단독을 각각의 물질에 대해 6마리의 암컷 마우스(NMRI 계통)에게 투여하였다. 약 0.1 ㎖의 혈액 샘플을 하기의 시점 후에 수집하였다: 첫 번째 군에서 마우스 1, 2 및 3에 대해 0.08 시간, 4 시간 및 48 시간, 및 두 번째 군에서 마우스 1, 2 및 3에 대해 0.08 시간, 24 시간 및 72 시간. 약 50 ㎕의 혈청 샘플을 원심분리(9300 x g, 3분, 4 ℃)에 의해 RT에서 1 시간 후에 수득하였다. 혈청 샘플을 -80 ℃에서 보관하였다.
주어진 시점들에서 혈청 중 화합물(형광단)의 양을 측정하기 위해서, Cy5의 형광 성질을 이용하였다: 혈청 샘플 중 Cy5 형광을 캐리 이클립스(Cary Eclipse) 형광 분광광도계(배리안(Varian))를 사용하여 실온에서 120 ㎕ 석영 큐벳에서 측정하였다. 여기 파장은 640 ㎚에서, 방출은 667 ㎚에서 측정하였다. 혈청 샘플을 1x PBS 중에 적합한 범위의 방출 강도에 도달하도록 희석하였다. 각각의 샘플과 동일한 희석비의 1x PBS 중의 처리되지 않은 마우스의 혈청을 블랭크 탐침으로서 사용하였으며 어떠한 형광 신호도 나타내지 않았다.
주어진 시점들에서 상기 혈청 중 인간 IgG 항체의 양을 측정하기 위해서, 하기의 분석 원칙을 사용하였다: 혈청 샘플 중 인간 IgG1 항체를 항-인간 카파-쇄 단클론 IgG 항체로 코팅한 고체 상(맥시솝(Maxisorb)(등록상표) 미세적정 플레이트, NUNC-임뮤노(Immuno)(상표)) 상에 포획하였다. 혈청 샘플을 1:105 및 1:106 희석하고 상기 희석액 중 100 ㎕를 상기 웰들에 가하였다. 배양 후에, 웰들을 각각 300㎕의 PBS/0.05% 트윈20으로 3회 세척하였다. 인간 IgG 항체의 검출을, 먼저 100 ㎕의 항-인간 CH1-도메인 IgG(C-말단에서 0.25 ㎍/㎖의 농도로 디곡시제닌화된다)를 가하여 수행하였다. 각각 300 ㎕의 1x PBS/0.05% 트윈20으로 3회 세척 후에, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 접합된 항-디곡시제닌 항체 Fab-단편 100 ㎕를 25 mU/㎖의 농도로 가하였다. 최종적으로, 웰당 100 ㎕의 ABTS(등록상표)를 가하였다. 주변 온도에서 30 분 배양 후에, 소광(OD)을 상업적인 미세적정 플레이트 ELISA 리더(예를 들어 테칸 선라이즈(Tecan Sunrise))에서 405 ㎚ 및 492 ㎚[405/492]에서 측정하였다.
도 34는 항체-비오틴-Cy5-복합체 및 -접합체로 처리된 마우스에서 인간 IgG의 혈청 수준뿐만 아니라 Bio-Cy5 혈청 수준을 나타낸다. 상기 데이터를 주입후 5 분째의 (피크)혈청 수준에 표준화된 상대적인(%) 인간 IgG 또는 형광 수준으로서 나타낸다. 항체-합텐-복합체 및 -접합체 모두의 상대적인 인간 IgG 혈청 수준은 상기 항체-합텐 접합체에 대해 측정된 상대적인 형광과 일치한다. 따라서, 상기 비오틴-Cys-Cy5 화합물은 상기 항체가 접합된 바와 유사한 생체내 안정성을 나타내며, 이는 상기 항체-합텐 접합체가 생체내에서 완전하게 머무름을 의미한다. 이는 상대적인 Cy5-매개된 형광이 상기 상대적인 인간 IgG 혈청 수준보다 빠르게 감소하는 항체-합텐 복합체의 경우는 명백히 아니다. 이는 상기 복합체가 상기 페이로드를 생체내에서 시간에 따라 방출함을 의미한다.
요약하면, 상기 합텐화된 화합물의 생체내 안정성은 항-합텐 항체에 의해 결합될 때 현저하게 증가한다. 그러나, 항체-합텐 복합체는 상기 합텐-Cy5 혈청 수준의 감소가 항체 혈청 수준의 감소보다 더 빠르기 때문에 생체내에서 그다지 안정하지 않다. 이는 통상적인 IgG 항체와 유사한 생체내 양상을 보이는 항체-합텐-Cy5 접합체에 대한 경우는 아니다.
실시예 17
디곡시제닌-Cys-Cy5와 인간화된 항-디곡시제닌 항체와의 공유 접합체와 비교된, 디곡시제닌-Cy5와 인간화된 항-디곡시제닌 항체와의 복합체의 혈청 안정성
항체 복합체 또는 항체 접합체의 약동학에 대한 상이한 합텐들의 영향을 분석하기 위해서, 디곡시제닌-Cy5와 복합체화된 또는 디곡시제닌-Cys-Cy5와 공유 접합된 항-디곡시제닌 항체의 PK 매개변수를 생체내에서 측정하였다. 비오틴-Cy5 또는 비오틴-Cys-Cy5에 대해 개시된 바와 동일한 방식으로(실시예 16 참조), 디곡시제닌-Cy5 또는 항체-복합체화된 또는 항체-Cys-결합된 디곡시제닌-(Cys)-Cy5를 암컷 NMRI 마우스에게 투여한 다음 혈액을 0.08 시간, 2 시간, 4 시간 및 24 시간에서 수집하였다. 디곡시제닌-(Cys)-Cy5 수준을 그의 형광을 측정함으로써 측정하였으며, 상응하는 항체 농도를 실시예 16에 개시된 바와 같이 ELISA에 의해 측정하였다. 상기 데이터를 주입후 5 분째의 (피크)혈청 수준에 표준화된 상대적인(%) 인간 IgG 또는 형광 수준으로서 도 41에 나타낸다. 이들 실험의 결과는 디곡시제닌-Cy5에 대해서 적용된(5 분 값) 형광의 10% 미만이 주입 후 2 시간째에 검출될 수 있었음을 입증한다. 주입 후 나중의 시점들, 각각 4시간 및 24 시간째에, 복합체화되지 않은 디곡시제닌-Cy5 신호는 검출될 수 없었다(도 41, 2개의 그래프 모두에서 회색 삼각형). 복합체화되지 않은 화합물과 대조적으로, 항체-복합체화된 화합물이 훨씬 더 높은 수준에서 및 보다 나중의 시점들에서 검출될 수 있었다(도 41, 상부 그래프). 이는 항체 복합체화가 상기 소 화합물 디곡시제닌-Cy5의 혈청 반감기를 증가시킴을 암시한다. 더욱 또한, 공유 결합된 페이로드는 비-공유 결합된 복합체에 비해 더 큰 혈청 안정성을 나타낸다. 상기 디곡시제닌-Cy5 수준 및 항체 수준의 직접적인 비교는 시간에 따른 상기 항체로부터의 복합체화된 페이로드의 상실을 가리키며, 이때 Cy5 수준은 항체 수준보다 더 빠르게 감소한다. 대조적으로, 공유 결합된 디곡시제닌-접합체는 거의 동일한 Cy5 및 IgG 혈청 반감기를 나타내었다(도 41, 하부 그래프). 이는 상기 다이설파이드-결합된 페이로드가 상기 항체에 안정하게 결합된 채로 남아있는 반면 상기 비-공유 복합체는 시간에 따라 해리됨을 암시한다.
실시예 18
인간화된 항-디곡시제닌 항체와 복합체화된 디곡시제닌화된 폴리펩타이드의 혈청 안정성
디곡시제닌화된 폴리펩타이드의 항체-복합체화의 PK 매개변수에 대한 영향을 분석하기 위해서, 20 mM 히스티딘/140 mM NaCl, pH 6.0 중의 32.1 nmol의 상기 폴리펩타이드, 또는 32.1 nmol의, 상기 디곡시제닌화된 폴리펩타이드와 상응하는 항-디곡시제닌 항체간의 비-공유 복합체를 각각 2마리의 암컷 마우스(NMRI 계통)에게 투여하였다. 약 0.1 ㎖의 혈액 샘플을 하기의 시점 후에 수집하였다: 마우스 1에 대해 0.08 시간, 2 시간 및 24 시간, 및 마우스 2에 대해 0.08 시간, 4 시간 및 24 시간. 약 50 ㎕의 혈청 샘플을 원심분리(9300 x g, 3분, 4 ℃)에 의해 RT에서 1 시간 후에 수득하였다. 혈청 샘플을 -80 ℃에서 보관하였다.
주어진 시점에서 상기 혈청 중 디곡시제닌화된 펩타이드의 양의 측정은, 혈청 샘플 중에서 상기 폴리펩타이드를 검출하는 직접적인 수단을 입수할 수 없기 때문에 Dig-Cy5의 검출에 비해 어려웠다. 따라서, 혈청 중 디곡시제닌화된 펩타이드를 검출하기 위한 웨스턴 블럿-관련된 분석이 확립되었다. 첫 번째 단계에서, 상기 혈청 샘플을 환원 SDS-PAGE상에서 분리시켰다. 샘플 제조는 상기 혈청의 고농도 SDS 및 환원제에의 노출을 포함하였기 때문에, 복합체화된 Dig-폴리펩타이드 접합체는 상기 (완전히 변성된/폴딩되지 않은) 항-디곡시제닌 항체로부터 방출되어질 수 있는 반면 공유 접합체는 결합된 채로 남아있었다. 상기 비-공유 항체 복합체로부터 상기 폴리펩타이드의 방출을 매개하고 SDS-PAGE에 의해 개별적인 성분들을 분리시키기 위해서, 2 ㎕의 각 혈청 샘플을 18 ㎕의 20 mM 히스티딘/140 mM NaCl pH 6.0 중에서 희석하고, 6.7 ㎕의 4x LDS 샘플 완충제 및 3 ㎕의 10x 샘플 환원제(NuPAGE, 인비트로젠)와 95 ℃에서 5 분 동안 혼합하였다. 대조용으로서, 2 ㎕의 동일 계통의 처리되지 않은 마우스의 혈청을 사용하였다. 샘플들을 실행 완충제로서 1x MES(인비트로젠)를 사용하여 20 분 동안 200V/120 mA에서 실행되는 4 내지 12% 비스-트리스 젤(NuPAGE, 인비트로젠)에 적용하였다. 후속적으로, 분리된 폴리펩타이드를 25V/130 mA에서 40 분 동안 XCell 슈어 록(Sure Lock)(등록상표) 미니-셀 시스템(인비트로젠)을 사용하여 PVDF 멤브레인(0.22 ㎛ 기공 크기, 인비트로젠) 상에 블럿팅하였다. 멤브레인을 RT에서 1 시간 동안 1x PBS + 1% 트윈20(PBST) 중의 1% 탈지유로 차단하였다. 디곡시제닌화된 폴리펩타이드를 후속적으로 항-디곡시제닌 항체로 상기 멤브레인상에서 검출하였다. 이를 위해서, 항-디곡시제닌 항체를 상기 멤브레인에 RT에서 2 시간 동안 10 ㎖의 1% 탈지유/PBST 중의 13 ㎍/㎖의 농도로 적용하였다. 멤브레인을 1x PBST로 3 x 5 분 동안 세척하였다. 루미라이트(LumiLight)PLUS 웨스턴 블럿팅 키트(롯슈)로부터의 POD에 커플링된 항-마우스 IgG Fab-단편을 RT에서 1 시간 동안 10 ㎖의 1% 탈지유/PBST 중에서 1:25 희석으로 적용하였다. 멤브레인을 1x PBST로 3 x 5 분 세척하였다. 검출을, 상기 멤브레인을 RT에서 5 분 동안 4 ㎖의 루미라이트 웨스턴 블럿팅 기질 중에서 배양함으로써 수행하였다. 화학발광을 20 분의 노출 시간으로 루미이미저(LumiImager) F1(롯슈)로 검출하였다.
상기 분석의 결과를 도 35A 및 B에 나타낸다. 상이한 시점들에서 쥐 혈청 중의 디곡시제닌 폴리펩타이드의 존재/양을 측정하였다. 항체 복합체화된 펩타이드를 수령한 마우스(도 35 좌측)는 가장 이른 시점(투여후 5 분)에서 강한 신호를 나타내었다. 상기 신호는 상기 대조용의 블럿상에서 크기 및 위치에 의해 입증된 바와 같이 명백히 지정될 수 있었다. 항체-복합체화된 폴리펩타이드로 처리된 마우스의 혈청에서, 폴리펩타이드-관련된 신호는 초기 시점들에서 가장 강하였으며 시간에 따라 감소하였다. 그럼에도 불구하고, 폴리펩타이드는 여전히 모든 시점들에서 및 투여후 24 시간째에 조차 양호한 신호로 검출 가능하였다.
비-복합체화된 폴리펩타이드를 수령한 마우스에서, 가장 이른 시점에서조차, 작은 폴리펩타이드에 관련될 수 있는 어떠한 신호도 좀처럼 검출할 수 없었다. 도 35는 우측에, 통상적인 노출 조건하에서 블럿상에서 유리 폴리펩타이드를 볼 수 없음을 나타낸다. 상기 블럿의 대비 증강은 투여후 5 분째에 일부 폴리펩타이드의 존재를 드러내었지만, 단지 잔량이었다. 나중의 시점들에서, 한정된 폴리펩타이드 밴드는 검출될 수 없었다.
비-복합체화된 합텐-Cy5와 유사하게, 비-복합체화된 폴리펩타이드는 마우스의 혈청에서 매우 짧은 반감기를 가짐을 알 수 있다. 동일한 폴리펩타이드를 수령하였지만 항체 복합체화된 형태인 마우스는 증가된 기간 동안 혈청 중의 상기 폴리펩타이드의 존재를 나타낸다. 주입후 24 시간째에 폴리펩타이드는 여전히 상기 마우스의 혈청 중에서 측정될 수 있다.
실시예 19
공유 결합된 합텐-항체 접합체 및 비-공유 복합체의 혈청 반감기 및 노출 수준의 생체내 실시간 측정
공유 결합된 합텐 화합물에 비해 비-공유 복합체화된 합텐 화합물의 약동학적 성질을 추가로 분석하기 위해서, 비오틴-Cy5 또는 비오틴-Cys-Cy5 및 상응하는 항-비오틴 항체간의 주입된 복합체 또는 접합체의 생체내 동역학을 비-침습적인 광학 영상화 기술을 통해 측정하였으며, 상기 기술은 동물 눈의 모세관 중 Cy5 형광을 밝혀내었다. 값들을 100%로서 설정된 10 분값에 대해 표준화하였다. 이들 실험의 결과를 도 42에 나타낸다: 비-복합체화된 비오틴-Cy5는 단독으로 짧은 혈청 반감기 및 낮은 노출 수준을 갖는다. 공유 결합되지 않은 항체-복합체화된 비오틴-Cy5는 훨씬 더 높은 수준 및 연장된 반감기로 검출될 수 있었다. 공유 결합된 페이로드는 훨씬 더 큰 혈청 안정성을 나타내었으며, 이는 상기 비-공유 결합된 복합체에 비해 더 높은 혈청 수준에 의해 암시된다. 이들 실험은 공유 다이설파이드-결합된 페이로드가 순환 중에 더 안정하며, 비-공유 복합체화된 페이로드보다 더 높은 노출 수준에 도달할 수 있음을 입증한다.
실시예 20
상이한 합텐에 결합하는 항체와의 펩타이드-복합체화 및 공유 접합
합텐화된 화합물(=페이로드)을 표적화 비히클에 커플링시키기 위해 합텐 결합 모듈을 적용하는 것은 합텐-매개된 전달을 실현시킬 수 있는 하나의 기술적 가능성이다. 상기 개념을 화합물을 포획하고 이를 표적화 모듈에 연결시키는 추가적인 합텐 또는 다른 존재들로 확장시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드 전달 또는 안정화의 경우, 디곡시제닌 또는 다른 합텐에 결합하는 단일- 또는 이중특이성 항체를 치료학적 성질의 안정화 및 PK-최적화에 적용할 수 있다.
폴리펩타이드 포획 모듈로서의 적용에 선행 요건은 (i) 합텐에의 화합물의 커플링이 폴리펩타이드 활성을 심하게 방해하지 않는 것과, (ii) 합텐화된 화합물에의 상기 항체의 유효 결합/복합체화의 가능성이다.
합텐-지시된 결합은 합텐화된 염료 또는 폴리펩타이드와 항-합텐 시스테인화된 항체와의 효율적인 공유 커플링에 선행 요건이다.
합텐화된 화합물과 항-합텐 항체와의 친화성-구동된 복합체화가 효율적인 다이설파이드-결합 형성에 선행 요건임을 나타내기 위해서, 비오틴-Cys-Cy5를 인간화된 항-디곡시제닌 항체 및 인간화된 항-디곡시제닌 항체 VH53C와 배양하였다. 비오틴-Cys-Cy5와 인간화된 항-비오틴 항체 및 인간화된 항-비오틴 항체 VH53C와의 배양을 대조용 반응으로서 수행하였다.
0.13 ㎎의 비오틴-Cys-Cy5를 100% DMF에 10 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 0.7 ㎎의 각 항체를 50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2로 구성된 완충제에 6.7 ㎎/㎖(약 46 μM)의 농도로 사용하였다. 비오틴-Cys-Cy5 및 항체를 2.5:1 몰비(Ac-비오틴-Cys-Cy5 대 항체)로 혼합하고 RT에서 60 분 동안 배양하고, 350 rpm에서 진탕하였다. 상기 생성되는 복합체/접합체를 SDS-PAGE 및 폴리아크릴아미드-젤 중 Cy5-관련된 형광의 후속 검출에 의해 추가로 분석하였다. 15 ㎍의 상기 복합체/접합체를 4x LDS 샘플 완충제(인비트로젠)와 혼합하고 95 ℃에서 5 분 동안 배양하였다. Cy5-관련된 형광을 645 ㎚의 여기 파장에서 루미이미저 F1 장치(롯슈 다이아그노스틱스 게엠베하(Roche Diagnostics GmbH), 독일 만하임 소재)를 사용하여 기록하였다.
상기 비-환원된 샘플은 CDR2 중에 시스테인 없이 인간화된 항-비오틴 항체 사용시(도 36, 레인 3) 매우 낮은 배경 형광 신호와 함께 인간화된 항-비오틴 항체 VH53C(도 36, 레인 4)에 대한 공유적인 비-특이적 다이설파이드 결합 형성을 나타낸다. 비오틴-Cys-Cy5가 또한, 인간화된 항-디곡시제닌 항체의 사용시(도 36, 레인 1) 낮은 배경 신호와 함께 인간화된 항-디곡시제닌 항체 VH52bC에 공유 커플링되었으나(도 36, 레인 2), 효율은 현저하게 더 낮았다. 이는 상기 젤의 기부(화살표)에서 검출되는 과잉의 비오틴-Cys-Cy5로부터 추론될 수 있다. 인간화된 항-디곡시제닌 항체 VH52bC의 경우에 인간화된 항-비오틴 항체 VH53C(레인 4)의 경우보다 현저하게 더 많은 커플링되지 않은 비오틴-Cys-Cy5가 검출될 수 있다(레인 2). 상기 샘플의 환원시, 상기 항체 중쇄 및 경쇄 부근에서 Cy5-관련된 형광은 검출될 수 없으며, 이는 상기 공유 결합이 실제로는 다이설파이드 가교에 의해서 형성되었음을 암시한다. 각 젤의 쿠마씨 염색은 각 레인 중 단백질의 총량이 동일함을 나타낸다.
실시예 21
합텐-지시된 결합은 합텐화된 염료 또는 폴리펩타이드와 항-합텐 시스테인화된 항체와의 효율적인 공유 커플링에 선행요건이다.
합텐화된 화합물과 항-합텐 항체와의 친화성-구동된 복합체화가 효율적인 다이설파이드-결합 형성에 선행요건임을 나타내기 위해서, 비-합텐화된 펩타이드 Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)(바이오신탄(Biosynthan) 1763.1, 서열번호 178)를 인간화된 항-디곡시제닌 항체 VH52bC 및 인간화된 항-디곡시제닌 항체와 배양하였다. 1.4 ㎎의 Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2)를 100% DMF 중에 10 ㎎/㎖의 농도로 용해시켰다. 2 ㎎의 각 항체를 50 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.2로 구성된 완충제 중에 11 내지 13 ㎎/㎖(약 75 내지 89 μM)의 농도로 사용하였다. Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2) 및 항체를 2.1:1 몰비(Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2 대 항체))로 혼합하였다. 상기 용액을 교반 막대로 500 rpm에서 교반하면서 상기 펩타이드를 3회 분취량으로 가하였다. 각 첨가 사이에서, 샘플을 200rpm에서 5 분 동안 배양하였다. 최종 분취량의 첨가 후에, 샘플들을 RT 및 200 rpm에서 1 시간 동안 배양하였다.
상기 생성되는 복합체/접합체는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 상기 Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2):인간화된 항-디곡시제닌 항체 VH52bC 접합체의 경우 97% 단량체성 IgG-유사 분자 및 3% 이량체성 용해성 응집체로서, 및 상기 Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2):인간화된 항-디곡시제닌 항체 복합체의 경우 100% 단량체로서 한정되었다. 더욱 또한, 상기 생성되는 복합체/접합체를 질량 분광분석법에 의해 분석하였다. 상기 Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2):인간화된 항-디곡시제닌 항체 VH52bC 접합체의 경우 상기 검출된 종의 17%는 2 펩타이드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었고, 51%는 1 펩타이드 분자에 커플링된 항체로서 확인되었으며, 32%는 커플링된 펩타이드가 없는 항체로서 확인되었다. 상기 Ac-PYY(PEG3-Cys-4Abu-NH2):인간화된 항-디곡시제닌 항체 복합체의 경우 상기 항체의 100%가 커플링되지 않았다.
실시예 22
공유 페이로드 커플링을 위한 시스테인 돌연변이를 갖는 적합하게 폴딩된 기능성 합텐-결합 항체의 형성에 필요한 다이설파이드 패턴
공유 화합물/페이로드 커플링을 위한 합텐-결합 모듈은 '표준' 항체, 예를 들어 합텐화된 화합물/페이로드의 공유 부착을 가능하게 하는 여분의 시스테인을 함유하는 IgG로 구성될 수 있다. 본 발명에 보고된 바와 같은 방법은 폴딩된 도메인내에 필요한 기능성(시스테인)을 도입시키며, 상기 도메인의 구조 및 서열은 항체 기능성에 대한 토대를 제공한다. 상기 항체의 도메인들 사이뿐만 아니라 상기 도메인 내에 한정된 다이설파이드 결합의 올바른 형성이 올바른 구조 및 기능성의 형성 및 유지에 필수적이다. 도 37(A)는 기능성 결합 가지, 예를 들어 변형되지 않은 항체의 Fab를 형성하는데 필요한 다이설파이드 패턴을 도시하고 도 37(B)는 VH52cB/VH53C 돌연변이된 항체 유도체의 구조 및 기능성을 유지하는데 필요한 다이설파이드 패턴을 도시한다. 적합한 다이설파이드 패턴을 유지시키기 위해서, 상기 VH 도메인에 도입된 추가적인 시스테인은 비어있어야 하며 이웃하는 시스테인을 방해하거나 상기와 반응하지 않아야 한다. 도 37(C) 및 (D)는 상기 여분의 시스테인의 첨가가 상기와 같은 분자의 생합성 동안 상기 VH 도메인 내에 잘못된 다이설파이드를 형성시킬 가능성을 발생시킴을 나타낸다. 상기 VH52bC/VH53C 위치가 상기 VH 도메인내(및 다른 시스테인들에 매우 가깝게)에 위치한다는 사실은 잘못된 다이설파이드가 상기 중쇄의 생합성 도중 형성될 수 있을 위험을 악화시킨다. 또 다른 잠재적인 문제점은 VH 및 VL 도메인이 하나의 Fv 단편으로의 분비 경로 내에서 조립된다는 것이다. 상기 분비 경로는 산화환원-셔플링 조건 및 다이설파이드 형성 및 -셔플링 효소를 수반한다. 따라서, 상기 VH52bC/VH53C 돌연변이의 첨가에 의해 잘못된 다이설파이드를 도입시킬 잠재성이 또한 상기 경쇄의 다이설파이드까지 '확산'될 수도 있다(도 37(E)에 예시적으로 도시됨). 이는 부적합하게 폴딩된 비-기능성 분자가 수득/생성될 위험을 더욱 증대시킨다. 따라서, 이러한 위험성에도 불구하고, 상기 VH52bC/VH53C 돌연변이를 함유하는 양호한 양의 동종의 기능성 항체 유도체가 발현되고 수득될 수 있고, 합텐화된 화합물/페이로드에 공유 결합될 수 있음은 매우 놀라운 것이다.
실시예 23
공유 커플링을 위해 시스테인 돌연변이를 갖는 항-합텐 다이설파이드-안정화된 단쇄 Fv 단편의 조성 및 생성
공유 화합물/페이로드 커플링을 위한 합텐-결합 모듈은 IgG와 같은 '표준' 항체로 이루어질 수 있다. 한편으로, 상기 모듈은 변형된 존재, 예를 들어 재조합 Fv 또는 Fab 단편, 또는 이들의 유도체일 수 있다. 단쇄 Fv 단편은 전장 항체에 대한 대안으로서, 특히 이중- 또는 다중특이성 항체 유도체의 생성에 작은 모듈 크기가 요구되거나, 또는 추가적인 결합 분자가 요구되는 경우의 용도에 빈번히 적용된다. 생성된 항-합텐 Fv-유래된 존재에 대한 일례는, 디곡시제닌화된 화합물/페이로드에 결합하고 공유적으로 연결되는 다이설파이드-안정화된 단쇄 Fv이다. Dig-결합 특이성을 갖는 다이설파이드-안정화된 단쇄 Fv를, 항-디곡시제닌 항체 VH 및 VL 도메인을 가요성 Gly 및 Ser 풍부 링커를 통해 서로 연결시킴으로써 생성시켰다. 이들 VH 및 VL 도메인은 VH의 44번 위치 및 VL의 100번 위치(카밧 등에 따른 위치)에 추가의 시스테인 돌연변이를 가졌다. 이러한 추가적인 시스테인은 VH와 VL 사이에 안정한 분자간 다이설파이드 결합을 형성한다. 상기는 앞서 개시된 바와 같이 scFv를 안정화시킨다(문헌[Reiter, Y., et al., Nature Biotechnology 14 (1996) 1239-1245]).
상기 외에, 또 다른 시스테인을 각각 52b번 위치 또는 53번 위치(카밧 넘버링에 따른)에 도입시켜 상기 Fv 단편에 공유 결합 기능성을 더하였다.
그러나, 상기와 같은 돌연변이를 다이설파이드-안정화된 Fv 단편에 도입시키는 것은 상기를 전장 항체내에 놓는것보다 훨씬 더 도전적이다. 단쇄 Fv 단편은 본래, 안정화 및 이종이량체화 강제성 존재로서 불변 도메인이 없기 때문에 전장 IgG 또는 Fab 단편보다 덜 안정성이다. 안정성은 추가적인 시스테인 돌연변이를 상기 Fv에, 예를 들어 VH44-VL100 다이설파이드에 놓음으로써 부여될 수 있다. 그러나, 이러한 안정화 원리는 오직 상기 다이설파이드가 올바른 시스테인 사이의 올바른 위치에서 형성되는 경우에만 작용한다. 따라서, 한정된 도메인내 다이설파이드(VH 중에 하나 및 VL 중에 하나) 외에, 하나의 단일의 한정된 올바른 도메인간 다이설파이드를 형성시킬 필요가 있다. 불합치 시스테인간의 다이설파이드 연결은 잘못 폴딩된 불안정하고 비-기능성인 존재를 생성시킬 것이다. 다이설파이드-안정화된 Fv 단편이 6개의 시스테인을 함유함을 고려하여, 21개의 상이한 다이설파이드 연결이 이론적으로 형성될 수 있으나, 단지 3개의 한정된 다이설파이드의 바른 조합만이 기능상 안정화된 dsscFv를 형성할 것이다. 상기 도전은 또 다른 유리 시스테인의 VH 도메인내로의 첨가시 악화된다. 목적하는 안정화된 dsscFv는 2개의 한정된 도메인내 다이설파이드(VH 및 VL 중에 각각 하나), 하나의 한정된 도메인간 다이설파이드(VH와 VL 사이), 및 더욱 또한 합텐화된 화합물/페이로드 커플링을 위한 하나의 유리 시스테인(VH 중의 52b/53번 위치)을 함유한다. 공유 커플링을 위한 여분의 시스테인 돌연변이를 갖는 다이설파이드-안정화된 Fv 단편이 7개의 시스테인을 함유함을 고려하여, 다수의 상이한 다이설파이드 연결이 이론적으로 형성될 수 있으나, 단지 상기 3개의 한정된 다이설파이드의 바른 조합만이, VH52b/VH53의 정확한 유리 시스테인 위치에, 기능상 안정화된 공유 커플링 수용성 dsscFv를 생성시킬 것이다. 하나의 추가적인 도전은 상기 추가적인 유리 시스테인(VH52b/VH53)이 VH44 시스테인(상기는 천연 시스테인이 아니고 다이설파이드 안정화를 위해 도입된 돌연변이이다)에 가깝게 위치한다는 점이다. VH44C는 올바른 도메인간 다이설파이드 결합의 형성에 필요하며, 상기 이론에 얽매이는 것은 아니지만 가장 그럴듯하게는 상기 다이설파이드는 VH 및 VL의 독립적인 폴딩 및 조립 후에 형성된다. VH44C 및 VH52bC/VH53C의 근접은 상기 도메인내 다이설파이드가 올바른 방식으로 형성되지 않을 위험성을 악화시킨다. 그러나, 디곡시제닌에 결합하고 동시에 디곡시제닌화된 페이로드에 공유적으로 연결될 수 있는 기능성 다이설파이드 안정화된 단쇄 Fv 모듈을 생성시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 올바른 다이설파이드 및 올바른 위치의 유리 시스테인을 함유하는 다이설파이드-안정화된 단쇄 Fv 분자의 조성 및 바람직하지 못한 틀리게 폴딩된 분자와의 그의 비교를 도 38에 나타낸다. VH52bC 돌연변이 Fv 항체 유도체를 갖는 상기 Dig-결합 dsscFv의 경쇄 가변 영역 및 변형된 중쇄 가변 영역을 암호화하는 서열들을 서열번호 190(VH) 및 상응하는 서열번호 189(VL)에 나열한다. 이중특이성 항체 유도체의 생성을 위한 모듈로서 상기와 같은 dsscFv의 성공적인 생성을 실시예 24(하기)뿐만 아니라 도 40(A), 도 40(B) 및 도 40(C)에 개시한다.
실시예 24
공유 커플링된 화합물/페이로드의 표적화된 전달을 위한 이중특이성 항-합텐 항체 유도체의 조성, 발현 및 정제
공유 화합물/페이로드 커플링을 위한 합텐-결합 항체 모듈을 함유하는 이중특이성 항체를 생성시켰다. 이들 항체는 다른 항원에 표적화가 가능한 결합 모듈을 추가로 함유한다. 상기와 같은 이중특이성 항체의 용도는 합텐화된 화합물/페이로드의, 표적화 항원을 갖는 세포 또는 조직에의 특이적인 표적화를 포함한다. 생성된 상기와 같은 분자의 일례는 종양 관련된 탄수화물 항원 LeY를 인식하는 결합 영역, 및 동시에 디곡시제닌화된 화합물/페이로드에 결합하고 공유적으로 연결되는 다이설파이드-안정화된 Fv를 갖는 이중특이성 항체이다. 따라서, 다이설파이드-안정화된 단쇄 Fv를 가요성 Gly 및 Ser 풍부 연결인자 펩타이드를 통해 LeY 항체의 CH3 도메인의 C-말단에 연결시켜, 2개의 LeY 결합 가지 및 추가로 2개의 디곡시제닌 결합 존재를 갖는 4가 분자를 생성시켰다. 상기 디곡시제닌-결합 존재는 앞서 개시된 VH44-VL100 다이설파이드 결합을 가졌다(예를 들어 문헌[Reiter, Y., et al., Nature Biotechnology 14 (1996) 1239-1245]). 상기 디곡시제닌 결합 존재는 또한 공유 커플링을 위한 VH52bC 돌연변이를 함유하였다. 상기 LeY-Dig 항체 유도체의 경쇄 및 변형된 중쇄를 암호화하는 서열들을 서열번호 191 및 서열번호 192에 나열한다. 공유 커플링된 화합물/페이로드에 대한 전달 비히클로서의 상기 LeY-Dig 이중특이성 항체 유도체의 조성을 도 39에 도식적으로 나타낸다.
상기 이중 특이성 분자를 분자 생물학 기법에 의해 생성시키고, 배양된 세포로부터의 분비에 의해 발현시키고, 후속으로 상술한 바와 동일한 방식으로 배양 상등액으로부터 정제하였다. 도 40(A)는, 항체 L-쇄 및 H 쇄를 검출하는 웨스턴 블럿 분석에서 가시화된, 세포 배양 상등액 중의 상기 LeY-Dig(52bC) 이중특이성 항체의 변형된 H-쇄 및 L-쇄의 존재를 도시한다. 도 40(B)는 환원제의 존재하에서 SDS-PAGE에 의한 정제 후에 상기 항체의 동종성을 입증한다. 쿠마씨 브릴리언트 블루에 의한 상기 SDS-PAGE의 염색은 계산된 분자량과 유사한 겉보기 분자 크기를 갖는 IgG와 관련된 폴리펩타이드 쇄를 가시화한다. 도 40(C)는 단백질 A 정제 후 상기 LeY-Dig(52bC) 이중특이성 항체의 SEC 프로파일을 도시하며, 이는 상기 단백질 제제 중의 동종성 및 응집체의 결여를 입증한다. 따라서, 표적화 모듈뿐만 아니라 합텐화된 화합물/페이로드의 공유 커플링을 위한 모듈을 함유하는 이중특이성 항체를 생성시키고 동종성으로 정제할 수 있다.
실시예 25
바이오시틴아미드와의 복합체 중의 쥐 항-비오틴 항체-Fab-단편의 X-선 구조 측정
쥐 항-비오틴 항체 Fab-단편의 단백질 구조를 바이오시틴아미드와의 복합체 중에서 측정하였다. 따라서, 상기 Fab-단편의 결정을 0.8M 숙신산 중에서 성장시킨 다음, 상기 항체 결정에 바이오시틴아미드(결정화 용액 중에 10 mM 작용 농도로 희석하고, 결정화 소적 중의 결정에 적용시킴)를 충전시켰다. 결정을 2 ㎕의 10 mM 바이오시틴아미드 용액으로 3회 세척하고 최종적으로 16시간 동안 21 ℃에서 바이오시틴아미드와 함께 배양하고, 저온보호물질로서 15% 글리세롤로 수확하고 액체 질소 중에서 급속 동결시켰다. 처리된 회절 영상은 2.5 Å 분해능에서 단백질 구조를 제공하였다. 상기 비오틴-결합 가변 영역의 구조 및 전하 조성을 도 46에 나타낸다: 비오틴은 CDR 영역들로부터의 아미노산으로 구성된 하전된 영역에 인접한 표면 포켓에 결합한다. 상기 복합체화된 합텐을 아미노산의 음으로 하전된 클러스터에 근접하여 위치시킨다. 합텐으로서 카복시기에서 페이로드 커플링을 위해 유도체화된 비오틴은 상기 위치에서 전하 반발이 존재하지 않기 때문에(COOH기의 결여로 인해) 양호한 효능으로 결합한다. 대조적으로, 유리(통상적인) 비오틴은 카복시기가 상기 음전하 클러스터에 근접하여 있을 것이며 따라서 반발하게 되므로 상기 항체에 효율적으로 결합할 수 없다.
실시예 26
혈액뇌장벽-셔틀 모듈의 조작
합텐-결합 이중특이성 혈액뇌장벽-셔틀 모듈을, 다이설파이드-안정화된 합텐-결합 단쇄 Fv를 항-TfR 항체의 CH3 도메인의 C-말단에 융합시킴으로써 생성시켰다. 유사한 디자인 및 기술들이 앞서 개시된 바와 같이 적용되었다(예를 들어 PCT/EP2013/064100을 참조하시오). 이들 혈액뇌장벽-셔틀 모듈의 조성에 대한 일례를 도 47에 나타낸다.
상기 혈액뇌장벽-셔틀 모듈은 상기 혈액뇌장벽의 내피세포상의 트랜스사이토시스 가능한 세포 표면 표적(혈액뇌장별 수용체)을 인식한다. 예시적으로, 상이한 친화성으로 트랜스페린 수용체에 결합하는 2개의 상이한 항체를 사용하였다. 항체 TfR1은 트랜스페린 수용체에 높은 친화성으로 결합하고 항체 TfR2는 상기 트랜스페린 수용체에 감소된 친화성으로 결합한다(예를 들어 WO 2012/075037을 참조하시오). 이들 항-TfR 항체로부터 유래된 TfR-결합 부위를 이중특이성 항체내로의 변경되지 않은 Fab 가지로서 지정하여 2가 전장 IgG 모듈을 획득하였다. 다이설파이드-안정화된 합텐-결합 단쇄 Fv를 짧은 GS-링커를 통해 상기 생성된 이중특이성 항체의 CH3 도메인의 C-말단에 융합시켰다. 예시적으로, 앞서 개시된 항-합텐 결합 부위로서 디곡시제닌(Dig) 또는 비오틴(Bio)의 유도체에 결합하는 존재들을 사용하였다(서열에 대해서 상기를 참조하시오).
이들 셔틀 비히클의 서열 조성에 대한 예를 서열번호 193(LC 항-TfR1 항체), 서열번호 194(scFv 항-디곡시제닌 항체 단편에 접합된 HC 항-TfR1 항체), 서열번호 195(scFv 항-비오틴 항체 단편에 접합된 HC 항-TfR1 항체), 서열번호 196(LC 항-TfR2 항체), 서열번호 197(scFv 항-디곡시제닌 항체 단편에 접합된 HC 항-TfR2 항체), 서열번호 198(scFv 항-비오틴 항체 단편에 접합된 HC 항-TfR2 항체)로서 열거하였다.
실시예 27
이중특이성 항체(혈액뇌장벽-셔틀 모듈)의 발현 및 정제
혈액뇌장벽-셔틀 모듈 이중특이성 항체를 앞서 개시된 바와 같이(상기 참조) 한정된 무혈청 배지에서 포유동물 세포에서 생성시켰다. HEK293 현탁액 세포를 L- 및 H-쇄 암호화 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염시켜 상기 혈액뇌장벽-셔틀 모듈 이중특이성 항체를 발현하는 배양물을 생성시켰다.
TfR에 높은 친화성으로 결합하는 디곡시제닌화된 페이로드 결합 혈액뇌장벽-셔틀 모듈을 생성시키기 위해서, 서열번호 193 암호화 핵산/발현 카세트를 함유하는 발현 플라스미드를 서열번호 194 암호화 핵산/발현 카세트를 함유하는 발현 플라스미드로 동시-형질감염시켰다.
TfR에 높은 친화성으로 결합하는 비오틴화된 페이로드 결합 혈액뇌장벽-셔틀 모듈을 생성시키기 위해서, 서열번호 193 암호화 핵산/발현 카세트를 함유하는 발현 플라스미드를 서열번호 195 암호화 핵산/발현 카세트를 함유하는 발현 플라스미드로 동시-형질감염시켰다.
TfR에 감소된 친화성으로 결합하는 디곡시제닌화된 페이로드 결합 혈액뇌장벽-셔틀 모듈을 생성시키기 위해서, 서열번호 196 암호화 핵산/발현 카세트를 함유하는 발현 플라스미드를 서열번호 197 암호화 핵산/발현 카세트를 함유하는 발현 플라스미드로 동시-형질감염시켰다.
TfR에 감소된 친화성으로 결합하는 비오틴화된 페이로드 결합 혈액뇌장벽-셔틀 모듈을 생성시키기 위해서, 서열번호 196 암호화 핵산/발현 카세트를 함유하는 발현 플라스미드를 서열번호 198 암호화 핵산/발현 카세트를 함유하는 발현 플라스미드로 동시-형질감염시켰다.
L- 및 H-쇄 암호화 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염된 HEK293 현탁액 세포의 상등액으로부터 단백질 A 크로마토그래피(상기 참조)에 의해 이중특이성 항체를 정제하였다. 후속으로, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 적용시켜 응집체 또는 오염물질이 없는 이중특이성 항체를 획득하였다. 상기 정제된 혈액뇌장벽-셔틀 모듈의 순도 및 조성의 예를 도 48에 SEC 프로파일 및 SDS PAGE로서 나타낸다.
실시예 28
이중특이성 합텐-결합 혈액뇌장벽-셔틀 모듈은 합텐화된 페이로드 및 혈액뇌장벽 수용체와 동시에 결합한다.
이중특이성 항체의 혈액뇌장벽-셔틀 기능성을 가능하게 하기 위해서, 상기 항체는 혈액뇌장벽의 내피세포상의 혈액뇌장벽 수용체, 및 왕복하는 합텐화된 페이로드에 동시에 결합해야 한다. 본 발명에 보고된 바와 같은 합텐-결합 이중특이성 항체의 상기 기능성을 평가하기 위해서, 동시적인 세포 표면 및 페이로드 결합을 FACS 분석에 의해 다루었다. 이들 분석을 위해서, 상기 혈액뇌장벽-셔틀 모듈(=이중특이성 항체)의 세포 결합을 피토에리트린-표지된 IgG 인식 2차 항체에 의해 검출하였다. 동시적인 페이로드 결합을 합텐화된 형광 페이로드(디곡시제닌화된 Cy5; DIG-Cy5(상기 참조))의 적용에 의해 검출하였다 TfR 발현 BBB-유래된 세포주로서 hCMEC/D3 세포 및 형광 페이로드로서 Dig-Cy5를 사용하는, 상기 FACS 분석의 결과를 도 49에 나타낸다: 상기 두 트랜스페린 수용체 결합 이중특이성 항체들은 항-IgG-PE 관련된 신호에 의해 입증된 바와 같이 hCMEC/D3에 결합한다. 유사하게, 상기 두 이중특이성 항체들은 모두 세포-관련된 Cy5 기인성 신호에 의해 입증되는 바와 같이 또한, 그리고 동시에 Dig-Cy5에 결합한다. 상기 (높은 친화성) TfR1 이중특이성 항체와 상기 (감소된 친화성) TfR2 이중특이성 항체간의 신호 강도의 비교는 (예상된 바와 같이) 중간 친화성 이중특이성 항체에 비해 높은 친화성을 갖는 세포상에서 보다 높은 신호 강도를 나타낸다. hCMEC/D3상에 검출 가능한 양으로 존재하지 않는 항원을 인식하는 대조용 이중특이성 항체(CD33-Dig)는 (예상된 바와 같이) 항-IgG 항체도, Dig-Cy5와도 관련 신호를 생성시키지 않는다.
이들 결과는 이중특이성 합텐-결합 혈액뇌장벽-셔틀 모듈이 내피세포의 표면상의 그들의 표적에 특이적으로 결합함을 나타낸다. 더욱 또한, 이들 이중특이성 항체는 합텐화된 페이로드에 동시에 결합하고 이에 의해 상기 페이로드를 상기 혈액뇌장벽의 내피세포로 향하게 할 수 있다.
실시예 29
혈액뇌장벽-셔틀 모듈의 수용체 결합 방식은 뇌 내피세포로부터의 방출에 영향을 미친다.
본 발명에 보고된 바와 같은 셔틀 모듈의 세포 결합 및 트랜스사이토시스를 조사하기 위해서 내피세포(hCMEC/D3)를 사용하였다. 선행 연구(문헌[Crepin et al., 2010]; 문헌[Lesley et al., 1989], WO 2012/075037, WO　2014/033074])는 TfR 결합 항체의 결합가 및 친화성이 상기 혈액뇌장벽의 내피세포에의 결합, 트랜스사이토시스 및 상기 세포로부터의 방출 효능에 영향을 미친다는 것을 보고하였다. hCMEC/D3에서 세포 결합 및 트랜스사이토시스를 조사하기 위해서, 필터 삽입물상에서 배양된 hCMEC/D3 세포를 37 ℃에서 1 시간 동안 상기 이중특이성 항체 또는 모 항체(대조용으로서 합텐-결합 scFv 없이)와 함께 정상에서 배양하였다. 세포 단층을 RT에서 무혈청 배지 중에서 정상에서(400 ㎕) 및 측저에서(1600 ㎕) 매번 3 내지 5 분 동안 3회 세척하였다. 모든 세척 부피를 수집하여 결합되지 않은 리간드 또는 항체의 제거 효율을 모니터하였다. 예온된 배지를 상기 정상 챔버에 가하고 상기 필터를, 1600 ㎕ 예온된 배지를 함유하는 새로운 12 웰 플레이트(1% BSA를 함유하는 PBS로 밤새 차단됨)로 옮겼다. 이 시점에서, 상기 필터 중 일부상의 세포를, 특이적인 흡수를 측정하기 위해서 500 ㎕ RIPA 완충제(시그마, 독일 뮌헨 소재, #R0278) 중에 용해시켰다. 나머지 필터를 37 ℃에서 배양하고, 세포 및 측저 및 정상 배지의 샘플들을 다양한 시점들에서 수집하여 정상 및/또는 측저 방출을 측정하였다. 상기 샘플 중 항체의 함량을 고도로 민감성인 IgG ELISA를 사용하여 정량분석하였다. 이들 분석의 결과를 도 50에 나타낸다: 높은 친화성 2가 항-TfR 항체(TfR1)는 상기 세포에 효율적으로 결합하게 되지만, 정상 또는 측저 구획으로는 방출되지 않는다. 동일한 방식으로, 상기 높은 친화성 TfR 결합 부위를 함유하는 이중특이성 항체(TfR1-Dig, TfR1-Bio)는 상기 세포에 효율적으로 결합하게 되지만, 정상 또는 측저 구획으로는 방출되지 않는다. 대조적으로, 감소된 친화성을 갖는 2가 항-TfR 항체(TfR2)는 상기 세포에 효율적으로 결합하게 되며, 후속적으로 시간이 지남에 따라 정상 또는 측저 구획으로 방출되게 된다. 감소된 친화성 2가 TfR 결합 부위를 함유하는 이중특이성 항체(TfR2-Dig, TfR2-Bio)는 또한 상기 세포에 효율적으로 결합하게 되며, 정상 또는 측저 구획으로 모 항체와 동일한 정도로 방출된다. hCMEC/D3상에 존재하지 않는 항원과 결합하는 대조용 이중특이성 항체(CD33-Dig, CD33-Bio)는 이들 세포에 결합하지 않으며 따라서 또한 시간이 지남에 따라 정상 또는 측저 구획내로 방출되지도 않는다.
실시예 30
내피세포를 가로질러 TfR 셔틀에 대해 감소된 친화성을 갖는 혈액뇌장벽-셔틀 모듈은 합텐화된 페이로드의 트랜스사이토시스 및 방출을 지지한다.
뇌 내피세포(hCMEC/D3)를 사용하여 합텐-결합 혈액뇌장벽-셔틀 모듈과의 비-공유 복합체를 형성하는 합텐화된 페이로드의 세포 결합 및 트랜스사이토시스를 조사하였다. 페이로드 트랜스사이토시스가 비-공유 복합체화된 페이로드에 대해 본 발명에 보고된 바와 같은 합텐-결합 혈액뇌장벽-셔틀 모듈(이중특이성 항체)을 통해 성취될 수 있는 지를 평가하기 위해서, 트랜스-웰 시스템에서 hCMEC/D3 세포를, TfR 결합을 허용하도록 1 시간 동안 본 발명에 보고된 바와 같은(예시적인 구조물에 대해서 선행 실시예를 참조하시오) 이중특이성 항체에 의해 복합체화된 합텐화된 페이로드에 노출시켰다. 세척에 의한 셔틀 및 페이로드의 제거(실시예 28 참조)에 이어서, 페이로드의 결합된 분자, 내면화, 세포내 분류, 트랜스사이토시스 및 방출을 상기 셔틀 모듈에 대해 실시예 28에 개시된 바와 유사한 방식으로 시간에 따라(상기 실험 = 세척 단계 개시 후 0 내지 5 시간) 모니터하였다. 본 실시예에 사용된 페이로드는 단일-합텐화된 DNA이었으며, 이는 도 51A에 도시된 바와 같이, 본 발명에 보고된 바와 같은 이중특이성 항체와 배양시 2:1(몰)비로 비-공유 복합체화된다. 상기 페이로드의 존재는 검출될 수 있으며, qPCR에 의해 세포 추출물, 정상 및 측저 구획에서 정량분석될 수 있다. 예시적으로, 롯슈 라이트사이클러(LightCycler) 상에서 2개의 PCR 프라이머 PrFor(서열번호 200) 및 PrRev(서열번호 201)를 사용하는 페이로드로서 말단 단일-비오틴화된 또는 단일-디곡시제닌화된 단일 가닥 DNA 50머(서열번호 199)의 정량분석을 도 51A에 나타낸다. 이들 분석의 결과(도 51B)는 상기 비-공유 부착된 합텐화된 페이로드가 세포에 결합하고, 내면화되며 후속적으로 정상 및 측저 구획내로 방출되게 됨을 입증한다. 결합 및 후속 방출은, CD33-결합 대조용 이중특이성 항체가 적용되는 경우 세포에 대한 결합도, 방출도 검출되지 않기 때문에, 상기 TfR-결합 혈액뇌장벽-셔틀 모듈에 의해 매개된다. 더욱 또한, 이중특이성 항체가 없는 합텐화된 페이로드를 적용하는 경우 세포에 대한 결합도 방출도 검출되지 않는다. 비-공유 복합체화된 페이로드의 트랜스사이토시스가 이중특이성 항체 및 상응하는 합텐화된 페이로드를 포함하는 비오틴 결합 부위에 대해서 뿐만 아니라 디곡시제닌 결합 부위에 대해서도 관찰되었다. 이는 상이한 합텐을 사용하여 비-공유 이중특이성 항체 혈액뇌장벽-셔틀 모듈을 디자인할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 상기 혈액뇌장벽을 가로지르는 페이로드 트랜스사이토시스를 비-공유 복합체화된 합텐화된 페이로드에 대한 합텐-결합 이중특이성 항체를 사용하여 성취할 수 있다.
실시예 31
TfR에 대해 높은 친화성을 갖는 결합 부위를 갖는 혈액뇌장벽-셔틀 모듈은 내피세포에 결합하지만 상기로부터 방출되지 않고, 합텐화된 페이로드의 트랜스사이토시스 및 방출을 여전히 지지한다.
뇌 내피세포(hCMEC/D3)를 사용하여 선행 실시예 30에 개시된 바와 동일한 방식으로 합텐-결합 혈액뇌장벽-셔틀 모듈과 비-공유 복합체를 형성할 수 있는 합텐화된 페이로드의 세포 결합 및 트랜스사이토시스를 조사하였다. 트랜스-웰 시스템에서 hCMEC/D3 세포를, TfR 결합, 내면화 및 세포내 분류, 및 트랜스사이토시스를 허용하도록 1 시간 동안 혈액뇌장벽-셔틀 모듈(이중특이성 항체)에 의해 복합체화된 합텐화된 페이로드에 노출시켰다. 상기 페이로드는 단일-합텐화된 DNA이었으며, 이는 도 51A에 도시된 바와 같이, 상기 이중특이성 항체와 배양시 2:1(몰)비로 비-공유 복합체화된다. 단일-비오틴화된 또는 단일-디곡시제닌화된 단일가닥 DNA 50머(서열번호 199)의 존재를 선행 실시에 30에 개시된 바와 같이 세포 추출물, 정상 및 측저 구획에서 qPCR에 의해 정량분석하였다.
이들 분석의 결과(도 52)는 상기 비-공유 복합체화된 합텐화된 페이로드가 세포에 결합하고, 내면화되며 후속적으로 정상 및 측저 구획내로 방출되게 됨을 입증한다. 이는 상기 2가의 높은 친화성 셔틀 모듈이 단독으로는 상기 세포로부터 방출되지 않기 때문에 놀라운 발견이었다. 결합 및 후속의 페이로드 방출은, CD33-결합 대조용 이중특이성 항체가 적용되는 경우 세포에 대한 결합도, 방출도 검출되지 않기 때문에, 상기 TfR-결합 혈액뇌장벽-셔틀 모듈에 의해 매개된다. 더욱 또한, 이중특이성 항체 혈액뇌장벽-셔틀 모듈이 없는 합텐화된 페이로드를 적용하는 경우 세포에 대한 결합도 방출도 검출되지 않는다. 비-공유 복합체화된 페이로드의 트랜스사이토시스 및 방출이 이중특이성 항체 및 상응하는 합텐화된 페이로드를 포함하는 비오틴 결합 부위에 대해서뿐만 아니라 디곡시제닌 결합 부위에 대해서도 관찰되었다. 이는 상이한 합텐을 사용하여 합텐화된 페이로드와 이중특이성 항체 혈액뇌장벽-셔틀 모듈의 비-공유 복합체를 디자인할 수 있음을 나타낸다. 상기 혈액뇌장벽을 포함하는 세포를 가로지르는 페이로드 트랜스사이토시스는 혈액뇌장벽-셔틀 모듈(이중특이성 항체)에 의해 비-공유 복합체화된 합텐화된 페이로드를 통해 성취될 수 있다. 놀랍게도, 트랜스사이토시스는, 상기 페이로드가 방출되지 않는 셔틀 모듈의 적용시에조차 방출되기 때문에, 상기 셔틀 비히클 자체의 방출에 의존하지 않는다.
실시예 32
합텐화된 페이로드는 소포 구획내 혈액뇌장벽-셔틀 모듈로부터 분리된다.
내피세포에 결합하지만 상기 세포로부터 자신을 방출시키지 않는 혈액뇌장벽-셔틀 모듈(TfR1)을 포함하는 높은 친화성 TfR 결합 부위에 대한 트랜스사이토시스 분석은 놀라운 결과를 나타내었다: 합텐화된 페이로드는, 상기 셔틀 모듈 자체가 세포에 부착된 채로 남아있고/상기 세포 중에 함유되었다 하더라도, 세포를 가로질러 왕복하고 정상 및 측저 구획내로 방출된다. 페이로드의 이중특이성 항체 매개된 세포 결합, 흡수 및 분포를 공초점 현미경검사에 의해 분석하였다. 따라서, 뇌 내피세포(hCMEC/D3)를 이중특이성 항체-복합체화된 합텐화된 형광 페이로드(합텐-Cy5 또는 합텐-DNA 내지 Cy5)에 노출시키고 공초점 형광 현미경검사에 의해 분석하였다. 따라서, hCMEC/D3 세포를 현미경 등급 유리 커버슬립상에 시딩하고 세포 배양 배지에서 37 ℃에서 3 시간 동안 50 nM 이중특이성 항체-복합체화된 합텐화된 형광 페이로드와 함께 배양하였다. 이어서 세포를 세척하고, 고정시키고(4% 파라폼알데하이드), 상기 셔틀 모듈의 IgG 부분을 항-카파 경쇄 특이성 항체에 의한 대조염색에 이어서 ALEXA Fluor 488에 접합된 2차 항체에 의해 검출하였다. ALEXAFluor488(IgG) 및 CY5(합텐-DNA 내지 CY5 페이로드)에 적합한 대역통과 필터 세팅을 사용하여 100x/1.46NA 대물렌즈를 사용하는 LEICA SP5x 공초점 현미경상에서 영상들을 촬영하였다. 이들 분석의 결과를 도 53에 나타낸다. 높은 친화성 이중특이성 항체와 형광 표지된 합텐화된 페이로드(DNA 내지 Cy5)와의 복합체는 TfR에 결합하며 처음에 세포 표면상에 위치한다. 후속적으로, 상기 복합체는 그의 동족 수용체와 동시-내면화되며 세포내 소포 구획, 즉 엔도솜 및 라이소솜 중에서 나타난다. 내면화 직후(3 시간후), 우리는 상기 합텐화된 페이로드에 기인할 수 있는 형광 신호로부터 상기 셔틀 모듈에 기인할 수 있는 신호의 실질적인 분리를 관찰하였다. 따라서, 본 발명에 보고된 바와 같은 혈액뇌장벽-셔틀 모듈 및 합텐화된 페이로드의 비-공유 복합체는 상기 세포내에서 상이한 소포 구획들로 해리될 수 있다. 이에 의해, 상기 페이로드는 상기 셔틀 모듈로부터 방출되게 되고 상기 셔틀 모듈이 세포에 결합된 채로 있고/상기 세포내에 유지되는 경우에조차 트랜스사이토시스를 통해 내피세포로부터 빠져나갈 수 있다. 비-공유 복합체화된 합텐화된 페이로드의 세포내 분리는 비오틴-결합 혈액뇌장벽-셔틀 모듈(이중특이성 항체) 및 상응하는 합텐화된 페이로드뿐만 아니라 디곡시제닌-결합에 대해서 관찰되었다. 따라서, 상이한 합텐들을 사용하여 페이로드 트랜스사이토시스를 가능하게 하는 혈액뇌장벽-셔틀 모듈과 합텐화된 페이로드의 비-공유 복합체를 디자인할 수 있다.
실시예 33
펩타이드 YY를 함유하는 헬리카 동기 아미노산 서열
펩타이드 YY는 식사에 반응하여 회장 및 결장 중 세포에 의해 방출되는 짧은(36-아미노산) 펩타이드이다. 인간에서 상기 펩타이드는 식욕을 감소시키는 것으로 보인다. 순환하는 PYY의 가장 통상적인 형태는 PYY3 -36이며, 이는 Y과 수용체중 Y2 수용체(Y2R)에 결합한다. PYY는 위장관의 점막, 특히 회장 및 결장 중 L 세포에서 발견된다. 또한, 소량, 약 1 내지 10%의 PYY는 식도, 위, 십이지장 및 공장에서 발견된다. 순환시, PYY 농도는 음식물 섭취 후에 증가하고 금식 중에 감소한다. PYY는 NPY 수용체를 통해 그의 작용을 발휘하며; 위 운동을 억제하고 결장에서 물 및 전해질 흡수를 증가시킨다. PYY 및 PYY 유사물질을 사용하여 비만증을 다루어 왔다.
PYY를 헬리카 동기 아미노산 서열을 포함하도록 변형시키고, 항체의 약동학적 성질의 이점을 획득하고 상기 PYY의 본래의 불안정성을 피하기 위해서 항-헬리카 동기 아미노산 서열 항체에 의해 복합체화하였다.
비-공유 복합체 형성
상기 PYY3 -36 펩타이드의 구조 연구(문헌[Nygaard, R., et al., Biochem. 45 (2006) 8350-8357]; 서열번호 211])는 중심 아미노산에 대한 헬리카 동기(헬리카-유사 동기 아미노산 서열)를 밝혀내었다. N-말단 아이소류신 및 변형된 C-말단이 상기 펩타이드의 기능 활성에 필수적인 것으로서 개시되었기 때문에, 상기 헬리카 동기 아미노산 서열 중 아미노산을 반영하기 위해서 상기 중심 나선을 변형시켰다.
PYY(3-36) 3 36
(서열번호 211) IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRYNH2
헬리카 동기 AHLENEVARLKK
PYY_헬리카 IKPEAPGEDASPEAHLANEVARLHYLNLVTRQRYNH2
(서열번호 212) (YNH2 = 타이로신 아미드)
Figure pct00004
완전 IgG1 항-헬리카 동기 아미노산 서열 항체를, 각각 불변 인간 IgG1 및 불변 인간 람다 도메인을 함유하는 벡터에 삽입된 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 함유하는 2개의 플라스미드를 형질감염시킴으로써 HEK293 세포에서 생성시켰다. 상기 항-헬리카 동기 아미노산 서열 항체(0019)를 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 표준 과정에 의해 정제하였다. 질량 분광학 실험은 항체 0019의 정체를 입증하였다.
항체 0019와 변형된 PYY 펩타이드 PYY_헬리카 사이의 복합체를, 상기 항체 용액에 소량 과잉의 상기 펩타이드를 적용시킴으로써 시험관내에서 획득하였다. 복합체 0052가 형성되었다. 상기 복합체의 화학량론은 SEC-MALLS 분석 실험에 의해 하나의 2가 항체상에 1.6 펩타이드가 복합체화되는 것으로 측정되었다.
상기 항체 0019, 상기 PYY(3-36) 야생형, 상기 PYY_헬리카 및 상기 복합체 0052를 Y2수용체과에 대한 이들의 효과에 대해서 시험하였다.
Figure pct00005
입증된 바와 같이(문헌[Hoffmann, E., et al., J. Cont. Rel. 171 (2013) 48-56]), 항체에 의해 복합체화된 펩타이드는 생체내에서 연장된 반감기를 갖는다. 더욱이, 놀랍게도, 상기 복합체는 비-복합체화된 펩타이드에 비해 NPY2R 수용체에 대해 약간 더 양호한 친화성을 나타내며; 상기 항체는 상기 폴리펩타이드를 안정화시키고 상기 펩타이드를 그의 고정된 생물 활성 배치로 제공한다.
공유 복합체 형성(공유 다이설파이드 결합)
상기 항-헬리카 동기 아미노산 서열 항체 및 상기 헬리카 동기 아미노산 서열 함유 화합물간의 복합체의 시험관내 및 생체내 안정성을 증가시키기 위해서, 결합시 다이설파이드 가교의 형성을 사용하였다.
첫 번째 단계는 특이성 인식 단계(높은 친화성 상호작용), 즉 상기 헬리카 동기 아미노산 서열 함유 화합물-항-헬리카 동기 아미노산 서열 항체 복합체의 형성 단계이다. 이어서 두 번째 단계에서 다이설파이드 가교의 자발적인 셔플링에 의해 안정성 개선된 공유 복합체가 형성된다.
12-머 펩타이드(헬리카 동기 아미노산 서열)는 비교적 강한 존재이므로(적어도 특이적인 항-헬리카 동기 아미노산 서열 항체에 의해 복합체화될 때), 상기 다이설파이드 가교에 대한 구조적으로 특이한 디자인을 사용해야 하는 것으로 밝혀졌다. 상기 복합체 형성 및 그 후에 실행된 공유 커플링은 2개의 재조합적으로 생산된 존재들 사이에서 있으므로, 공유 다이설파이드 결합의 형성을 위해 도입된 인공 시스테인 잔기는 반드시 유리 시스테인 잔기로서 생성되는 것은 아니며, 환원된 형태로 발현된다, 즉 유리 시스테인 또는 호모 시스테인 아미노산에 접합된다.
상기 인공 유리 시스테인 잔기가 도입되는 항-헬리카 동기 아미노산 서열 항체 가변 도메인의 아미노산 서열 중의 위치는 중요하다. 상기 항체 가변 도메인 아미노산 서열 중의 비-노출된 시스테인은 유리 시스테인(접합되지 않은)으로서 발현될 확률이 높은 반면, 상기 결합 포켓에 가까운 노출된 시스테인 잔기는 유리 시스테인과 같은 추가적인 부분에의 시스테인 접합에 의해 유도된 입체 장애로 인해 상기 12-머 펩타이드(헬리카 동기 아미노산 서열)의 결합을 없앨 수 있다.
a) 헬리카 동기 아미노산 서열 함유 형광 화합물과의 복합체
입체 장애 및 강한 친화성 감소의 최소의 위험성을 갖는 적합한 위치를 확인하기 위해서, 상기 헬리카 동기 아미노산 서열 중 인공 시스테인 잔기의 도입을 위한 상이한 위치들을 시험하였다. 상기 시스테인 잔기를 상기 파라토프의 주요 부분이 변하지 않도록 하기 위해서 상기 12머(헬리카 동기 아미노산 서열)의 C-말단 단부에 도입시켰다. 상기 펩타이드를 합성하고 형광 동기에 융합시켰다.
야생형: AHLENEVARLKK (서열번호 202)
시스테인 변이체 1: AHLENEVARCKK (서열번호 203)
-> AHLENEVARCKK(5-Fluo)-OH
시스테인 변이체 2: AHLENEVARLCK (서열번호 204)
-> AHLENEVARLCK(5-Fluo)-OH x TFA
상기 항체 상에서, 구조 디자인을, 상이한 3D 환경에서 각각의 시스테인을 포함하는 2개의 디자인된 펩타이드 모두에 대해서 다이설파이드 가교의 형성이 허용되도록 수행하였다.
상기 12-머 헬리카 펩타이드 AHLENEVARLKK(헬리카 동기 아미노산 서열)를 VH 및 VH 도메인으로 설계한다. 상기 펩타이드의 C-말단에서 잔기 L10 및 K11이 가능한 위치로서 확인되며 경쇄 가변 도메인에서 카밧 경쇄 넘버링에 따른 N55 및 G51번 위치가 확인된다.
상기 항-헬리카 동기 아미노산 서열 항체(0019)의 중쇄 가변 도메인은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00006
(서열번호 205)
상기 항-헬리카 동기 아미노산 서열 항체(0019)의 경쇄 가변 도메인은 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00007
(서열번호 206)
상기 항-헬리카 동기 아미노산 서열 항체(0155)의 경쇄 가변 도메인 N55C 변이체는 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00008
(서열번호 207)
상기 항-헬리카 동기 아미노산 서열 항체(0157)의 경쇄 가변 도메인 N51C 변이체는 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
Figure pct00009
(서열번호 208)
i) 헬리카 동기 아미노산 서열 함유 화합물과 항체 0155와의 공유 접합체
2가 항체 0155를 유리 시스테인 없이 그의 모 분자 Y2R(bck)-0019와 유사하게 HEK293 세포에서 발현시킨다. 상기 변형된 항체를 항체 0019에 사용된 동일한 프로토콜을 사용하여 정제시킨다. 질량 분광분석은 상기 데글리코실화된 항체의 실험적으로 측정된 질량이 142,001 Da임을 보인다. 이는 계산된 질량을 259 Da까지 초과한다. 상기 환원된 쇄는 48,167 Da(완전 중쇄, 계산치 48,168 Da, Cys = SH, C-Term = -K) 및 22,720 Da(완전 경쇄, N55C, 계산치 22,720 Da, Cys = SH)의 실험적으로 측정된 질량을 갖는다. 상기 쇄들의 서열은 환원 후에 확인되었다.
항체 0155를 100% DMF 중에서 2.5 몰 과잉의 헬리카 동기 아미노산 서열 함유 화합물을 사용하여 상기 헬리카 동기 아미노산 서열 시스테인 변이체 2에 커플링시켜 공유 복합체 0156을 형성시켰다.
SDS page(변성 조건, 도 54 참조)상에서, 형광은 오직 항체 0155상에서만 관찰되며; 환원 조건하에서는 오직 작은 펩타이드만을 볼 수 있다.
결과:
상기 헬리카 동기 아미노산 서열 함유 형광 화합물의 상기 항-헬리카 동기 아미노산 서열 항체에의 공유 접합은 성공적이었다. 상기 항-헬리카 동기 아미노산 서열 항체의 총 약 43%가 2개의 헬리카 동기 아미노산 서열에 공유 접합되었고, 상기 항-헬리카 동기 아미노산 서열 항체의 약 40%는 하나의 헬리카 동기 아미노산 서열에 공유 접합되었으며, 상기 항-헬리카 동기 아미노산 서열의 약 17%는 접합되지 않았다.
2개의 헬리카 동기 아미노산 서열을 포함하는 접합체는 약 50%까지 변형된다. 상기 종은 정량분석이 고려되지 않았다. 상기 출발 물질에 대해 이미 측정된 바와 같이 헬리카 동기 아미노산 서열이 없는 상기 항체는 약 128 Da의 2개의 변형을 함유한다. 하나의 헬리카 동기 아미노산 서열에 접합된 항체는 약 128 Da의 단지 하나의 변형만을 갖는다.
ii) 헬리카 동기 아미노산 서열 함유 화합물과 항체 0157과의 공유 접합체
항체 0155와 유사하게 항체 0157은 대개 시스테인화된 형태로서 발현된다. 질량 분광분석법은 상기 데글리코실화된 항체의 실험적으로 측정된 질량이 141,863 Da임을 보인다. 이는 계산된 질량을 3 Da까지 초과한다. 상기 항체는 주로 단일 또는 이중 호모시스테인화된 형태로서 존재한다. 상기 환원된 쇄는 48,168 Da(완전 중쇄, 계산치 48,168 Da, Cys = SH, C-Term = -K) 및 22,777 Da(완전 경쇄, N51C, 계산치 22,777 Da, Cys = SH)의 실험적으로 측정된 질량을 갖는다. 상기 쇄들의 서열은 환원 후에 확인되었다.
항체 0157과 헬리카 동기 아미노산 서열 시스테인 변이체 1과의 커플링은 예상된 공유 복합체를 생성시키지 않았다. 형광은 예상된 레인에서 보이지 않고 본 실험에서 음성이어야 하는 기준에서 보인다(도 55 참조).
항체 0157을 헬리카 동기 아미노산 서열 시스테인 변이체 1과 함께 배양하였다. 대조용으로서 항체 0019를 동일한 헬리카 동기 아미노산 서열 시스테인 변이체 1과 함께 배양하였다.
결과:
상기 헬리카 동기 아미노산 서열 함유 형광 화합물의 상기 항-헬리카 동기 아미노산 서열 항체에의 공유 접합은 성공적이지 않았다. 상기 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 이 경우 상기 항체 시스테인화가 상기 결합 포켓 중에서 너무 깊어 상기 헬리카 동기 아미노산 서열 함유 형광 화합물이 C51을 공격하기에 적합한 위치 중에 친핵성 티올 그룹을 효율적으로 결합하고 전달하지 못하는 것으로 추정된다.
b) 헬리카 동기 아미노산 서열 함유 재조합 폴리펩타이드와의 복합체
상기 헬리카 기반 방법은 재조합적으로 생산된 헬리카 동기 아미노산 서열 함유 폴리펩타이드와의 공유 복합체의 형성을 고려할 때 특히 매력적으로 된다.
상기 헬리카 동기 아미노산 서열 시스테인 변이체 1(AHLENEVARLCK; 서열번호 203)과 VL-N55C 돌연변이를 함유하는 항체 0155와의 접합은 대안(헬리카 동기 아미노산 서열 시스테인 변이체 2(AHLENEVARCKK; 서열번호 204)를 갖는 VL상의 G51C)에 비해 훨씬 더 양호하게 수행되었기 때문에, 헬리카 동기 아미노산 서열 시스테인 변이체 1 함유 폴리펩타이드와 0155와의 접합을 추가로 조사하였다. 상기 폴리펩타이드는 N-말단에 융합된 헬리카 동기 아미노산 서열 시스테인 변이체 1(AHLENEVARLCK; 서열번호 203)을 함유하였다.
C-말단 리신 잔기가 결실된(0236; 서열번호 213) 상기 헬리카 동기 아미노산 서열 시스테인 변이체 1 함유 슈도모나스 외독소 분자 LR8M이 에스케리키아 콜라이에서 생산되었으며 음이온 교환 크로마토그래피 및 SEC의 조합을 사용하여 정제되었다(예를 들어 WO 2011/032022 참조).
항체 0155를 상기 서열번호 213의 C-말단 리신 잔기 결실된 헬리카 동기 아미노산 서열 시스테인 변이체 1 함유 슈도모나스 외독소 분자 LR8M과 공유 접합시킨다. 상기 SEC 크로마토그램을 도 56에 나타낸다. 상기 접합 효율을 비환원된 샘플에 대해서 SDS-CE, 캘리퍼에 의해 분석한다(도 57 참조).
상기 항-헬리카 동기 아미노산 서열 항체의 총 약 4%가 서열번호 213의 2개의 폴리펩타이드에 공유 접합되었고, 상기 항-헬리카 동기 아미노산 서열 항체의 약 41%는 서열번호 213의 하나의 폴리펩타이드에 공유 접합되었으며, 상기 항-헬리카 동기 아미노산 서열의 약 55%는 접합되지 않았다.
결론적으로, 상기 항-헬리카 동기 아미노산 서열 단클론 항체를 사용하여 12-머 헬리카 동기 아미노산 서열의 높은 친화성 인식을 통해 펩타이드, 펩타이드 링커를 갖는 소분자, 및 재조합 단백질을 복합체화할 수 있다. 나선으로서 폴딩하는 성향을 갖는 펩타이드를, 원래의 12-머 헬리카 동기 아미노산 서열 AHLENEVARLKK(서열번호 202)을 모방하도록 변형시킬 수 있으며 그 후에 상기 항-헬리카 동기 아미노산 서열 단클론 항체와 복합체화할 수 있다. 상기 높은 친화성 복합체화 외에, 안정한 다이설파이드 결합의 형성을 통해 CDR 중에 시스테인을 함유하는 변형된 항-헬리카 동기 아미노산 서열 항체 및 시스테인을 함유하는 서열번호 202의 시스테인 변이체를 공유 접합시킬 수 있다. 그 후에 상이한 시스템에 의해 발현된 재조합 단백질을 특정한 반응 조건 없이, 그러나 자발적인 다이설파이드 가교 셔플링을 통해 시험관내에서 접합시킬 수 있다.
실시예 34
BrdU 함유 페이로드와의 복합체로부터의 BrdU-결합 이중특이성 항체
SEC-MALLS 분석을 적용하여 트랜스페린 수용체(TfR)- 및 브로모데옥시유리딘(BRDU)-결합 이중특이성 항체(bsAb)가 BRDU 함유 페이로드에 결합할 수 있는 지의 여부 및 결합 정도를 평가하였다. 따라서, BRDU-DNA를 TfR-BRDU bsAb에 2:1의 화학량론적 비(350 ㎍; 2.5 ㎎/㎖)로 가하고 bsAb/페이로드-복합체의 형성을 위해 실온에서 30 분 동안 배양하였다. 대조용 시약으로서 우리는 유리 이중특이성 항체(2.5 ㎎/㎖) 및 유리 BRDU-DNA(3.2 ㎎/㎖)를 제조하였다. BRDU-DNA(BRDU-ACC AAG CCT AGA GAG GAG CAA TAC AAC AGT ACA TAT CGC GTG GTA AGC GT; 서열번호 228)는 상기 DNA의 5' 단부에 DNA 분자당 하나의 BRDU를 함유하였다. 복합체 및 대조용 시약들을 분석시까지 -80 ℃에서 보관하였다.
이에 의해 생성된 복합체 및 대조용 시약들에 SEC-MALLS 분석을 수행하여 유리 이중특이성 항체, 유리 페이로드 및 이 둘의 복합체를 확인하고 특성화하였다. SEC-MALLS 분석을 와이어트 미니던TREOS/QELS 및 옵티랩 rEX 검출기가 구비된 다이오넥스 얼티메이트(Dionex Ultimate) 3000 HPLC상에서 수행하였다. 분석물을 PBS 완충제 pH 7.4 중에 1 ㎎/㎖로 용해시키고, 슈퍼덱스200 10/300GL 컬럼에 0.5 ㎖/분의 유량으로 적용하고 PBS 완충제 pH 7.4로 60 분 동안 용리시켰다.
이들 분석의 결과(도 58에 도시됨)는 BRDU-함유 DNA가 상기 이중특이성 항체와 한정된 복합체를 형성함을 암시한다. 이들 복합체는 상기 컬럼으로부터 244.9 kDa의 MW로 용리되며(도 58A) 6.8 ㎚의 유체역학적 반경(도 58B)을 나타내어, 이중특이성 항체 분자당 대략 2(1.8) DNA 분자의 화학량론적 비의 계산을 허용한다. 이와 비교하여, 유리 이중특이성 항체가 215.4 kDa의 MW에서 검출되었으며 그의 유체역학적 반경은 6.2 ㎚에서 측정되었다. 유리 BRDU-DNA는 16.4 kDa의 MW에서 검출되었다.
따라서, BRDU-함유 DNA는 상기 항-TfR/BRDU 이중특이성 항체에 의해 유효하고 화학량론적으로 결합되어, 2:1 몰비의 복합체를 생성시키는 것으로 나타났다.
실시예 35
비오틴-결합 이중특이성 항체는 비오틴-함유 IgG에 결합한다.
상기 TfR/비오틴 이중특이성 항체가 모노-비오틴화된 전장 IgG에 결합할 수 있는지의 여부 및 결합 정도를 분석하기 위해서, 상기 pTau에 특이적으로 결합하는 IgG 아이소타입의 모노-비오틴화된 항체(비오틴-표지된 항-pTau 항체, BIO-pTau)를 항-TfR/비오틴 이중특이성 항체에 2:1의 화학량론적 비(300 ㎍, 1.3 ㎎/㎖)로 가하였으며, 상기 혼합물을 실온에서 30 분 동안 배양하였다(이중특이성 항체-페이로드 복합체의 형성). IgG 아이소타입의 놉-인-홀 이종이량체성 항체의 하나의 쇄의 C-말단에 Avi-태그를 갖는 IgG-유도체를 생성시킴으로써 모노-비오틴화된 IgG를 생성시켰다. 상기 Avi-태그는 한정된 방식으로 하나의 비오틴에 효소적으로 접합되게 된다.
복합체 형성의 특이성에 대한 대조용으로서, 항-TfR/디곡시제닌 이중특이성 항체를 BIO-pTau와 혼합하였다. 추가적인 대조용 시약으로서 유리 이중특이성 항체 및 유리 BIO-pTau 모두의 분액을 제조하였다. 복합체 및 대조용 시약을 분석시까지 -80 ℃에서 보관하였다.
상기 생성된 복합체에 SEC-MALLS 분석을 수행하여 유리 이중특이성 항체, 유리 BIO-pTau 및 이 둘의 복합체를 확인하고 특성화하였다. SEC-MALLS 분석을 와이어트 미니던TREOS/QELS 및 옵티랩 rEX 검출기가 구비된 다이오넥스 얼티메이트 3000 HPLC상에서 수행하였다. 분석물을 PBS 완충제 pH 7.4 중에 1 내지 2 ㎎/㎖로 용해시키고, 슈퍼덱스6 10/300GL 컬럼에 0.5 ㎖/분의 유량으로 적용하고 PBS 완충제 pH 7.4로 60 분 동안 용리시켰다.
이들 분석의 결과(도 59에 도시됨)는 BIO-pTau가 상기 이중특이성 항체와 한정된 복합체를 형성함을 암시한다. 이들 복합체는 상기 컬럼으로부터 501 kDa의 MW로 용리되며(도 59A) 8.0 ㎚의 유체역학적 반경(도 59B)을 나타낸다. 이와 비교하여, 유리 이중특이성 항체는 205 kDa의 MW에서 검출되었으며 그의 유체역학적 반경은 6.2 ㎚에서 측정되었다. 유리 BIO-pTau는 150 kDa의 MW에서 검출되었고 그의 유체역학적 반경은 5.5 ㎚에서 측정되었다.
상기 복합체들은 비오틴과 상기 이중특이성 항체의 비오틴-결합 부분간의 상호작용에 의해 특이적으로 형성되는데, 그 이유는 상기 디곡시제닌-결합 이중특이성 항체가 BIO-pTau와 복합체를 형성하지 않기 때문이다(도 59C).
실시예 36
비오틴-표지된 항-pTau 항체의 트랜스사이토시스
상기 항-TfR/비오틴 이중특이성 항체가 전장 항체 페이로드의 트랜스사이토시스를 촉진하는 지의 여부 및 촉진 정도를 분석하기 위해서, 항-TfR/비오틴 이중특이성 항체(항-TfR/비오틴 bsAb-1 및 항-TfR/비오틴 bsAb-2) 및 BIO-pTau의 복합체를 실시예 35에 개시된 바와 같이 형성시키고 상기에, 예를 들어 실시예 31에 개시된 바와 같이 트랜스사이토시스 분석을 수행하였다. 비-특이적인 트랜스사이토시스에 대한 대조용으로서, 항-CD33/비오틴 이중특이성 항체 및 BIO-pTau뿐만 아니라 유리 BIO-pTau의 복합체를 나란히 시험하였다. 정상 및 측저 구획, 및 세포 용해물의 샘플들을 상기 세포의 로딩 후 0, 1, 2, 3, 4 및 5 시간째에 취하였다. 로딩 농도는 항상 3.8 ㎍/㎖이었다.
비오틴-표지된 항-pTau 항체의 양을 ELISA에 의해 측정하였다. 따라서 pTau 단백질을 NUNC 맵시솝 화이트 384-웰 플레이트상에 500 ng/㎖로, 2 내지 8 ℃에서 밤새 또는 실온에서 1 시간 코팅하였다. 플레이트를 2% BSA 및 0.05% 트윈20을 함유하는 PBS로 적어도 1 시간 동안 차단하였다. 0.5% BSA 및 0.05% 트윈20을 함유하는 PBS에서의 1/729까지의 샘플 희석을 1.5 내지 2 시간 동안 적용한 다음, 30 분 동안 폴리-HRP40-스트렙트아비딘(피츠제랄드(Fitzgerald)) 및 10 분 동안 슈퍼 시그널 ELISA 피코(Pico) 기질(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))을 적용하였다(모두 실온). BIO-pTau 항체(100 ng/㎖ 내지 0.5 pg/㎖)의 표준 희석물을 동일한 플레이트상에서 분석하였다. 플레이트를 연속적인 배양 단계들 사이에서 0.1% 트윈20을 함유하는 PBS로 세척하였다.
이들 트랜스사이토시스 분석의 결과(도 60)는 항-TfR/비오틴 bsAb-1 또는 항-TfR/비오틴 bsAb-2에의 BIO-pTau의 복합체화가 BIO-pTau의 측저뿐만 아니라 다시 정상 구획내로의 유효한 엔도사이토시스 및 후속적인 수송을 매개함을 보인다. 대조적으로, 항-CD33/비오틴 이중특이성 항체에 대한 BIO-pTau의 복합체 및 유리 BIO-pTau 중 어느 것도 유효하게 엔도사이토시스 또는 트랜스사이토시스되지 않으며, 이는 관찰된 트랜스사이토시스가 상기 세포 표면상의 TfR에 대한 항-TfR/비오틴 이중특이성 항체의 특이적인 결합에 의해 야기됨을 암시한다.
실시예 37
합텐-결합 혈액뇌장벽-셔틀은 짧은 올리고뉴클레오타이드의 트랜스사이토시스 및 방출을 가능하게 한다
본 실시예에서 혈액뇌장벽을 형성하는 내피세포를 가로지르는 핵산의 트랜스사이토시스가 작은 핵산, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 변형된 핵산 유도체, 예를 들어 "잠금" 핵산에 대해 성취될 수 있음을 입증한다. 실시예 30 및 31에 개시된 DNA 단편보다 작은 단일가닥 핵산 페이로드를 생성시켰다. 합텐-커플링된 형태로 생성된 이들 페이로드는 치료학적 안티센스 올리고뉴클레오타이드 또는 잠금 핵산을 가깝게 닮았으며 이에 의해 상기 존재에 대한 대용물로서 작용할 수 있다. 합텐화된(예를 들어 모노-비오틴화된 또는 모노-디곡시제닌화된) 단일가닥 34머 또는 28머 올리고뉴클레오타이드(각각 서열 S1 또는 S2)의 정확한 검출을 실시예 30에 개시된 바와 유사한 qPCR 분석에 의해 성취하였다. 특이적인 검출은 PCR 프라이머 PrFor(서열번호 200) 및 PrRev(서열번호 201)를 사용하여 hCMEC/D3 배지 및 세포 추출물 중의 S1 및 S2 DNA의 일련의 희석물을 분석함으로써 확인되었다. 정상 또는 측저 세포 상등액 구획 또는 세포 추출물 중의 올리고뉴클레오타이드 S1 또는 S2의 존재를 검출하기 위한 상기 qPCR 분석 조건은 하기와 같다: 95 ℃에서 10 분 동안 변성; 45 주기의 95 ℃ 10초, 54 ℃ 15초, 72 ℃ 10초; 이어서 고기능 용융 및 냉각. 상기 분석을 롯슈 라이트 사이클러(Roche Light Cycler) 480II상에서 수행하였다.
뇌 내피세포(hCMEC/D3)를 사용하여, 실시예 30 및 31에 개시된 바와 유사한 방식으로 합텐-결합 혈액뇌장벽-셔틀 모듈과 비-공유 복합체를 형성할 수 있는 합텐화된 페이로드의 세포 결합 및 트랜스사이토시스를 조사하였다. 트랜스-웰 시스템에서 HCMEC/D3 세포를 1 시간 동안 혈액뇌장벽-셔틀 모듈(이중특이성 항체)에 의해 복합체화된 합텐화된 페이로드에 노출시켜 TfR 결합, 내면화 및 세포내 분류, 및 트랜스사이토시스를 허용하였다. 상기 페이로드는 모노-합텐화된 올리고뉴클레오타이드 S1 또는 S2이었으며, 이는 도 51A에 나타낸 바와 같이, 2:1(몰)비로 비-공유 복합체화된 이중특이성 항체와 배양시 된다. 모노-비오틴화된 또는 모노-디곡시제닌화된 올리고뉴클레오타이드 S1 또는 S2의 존재를 선행 실시예 30 및 31에 개시된 바와 같이 세포 추출물, 정상 및 측저 구획에서 qPCR에 의해 정량분석하였다. 동일한 추출물, 정상 및 측저 구획에서의 혈액뇌장벽-셔틀 모듈(이중특이성 항체)의 존재를 실시예 29에 개시된 바와 같이 인간 IgG에 특이적인 ELISA에 의해 정량분석하였다.
이들 분석의 결과(도 61 내지 63)는 상기 비-공유 부착된 합텐화된 페이로드 S1 및 S2가 정상 및 측저 구획내로 내면화되고 후속으로 방출되게 됨을 입증한다. 실시예 31에서 50머 DNA 페이로드에 대한 경우와 같이, 상기 세포로부터 단독으로 방출되지 않는 2가의 높은 친화성 셔틀 모듈은 그럼에도 불구하고 페이로드 S1 및 S2 모두의 트랜스사이토시스를 촉진하는 것으로 관찰되었다. 결합 및 후속의 방출은, 세포에 대한 결합이나 방출이 모두 CD33-결합 대조용 이중특이성 항체가 적용되는 경우 검출되지 않기 때문에 상기 TfR-결합 혈액뇌장벽-셔틀 모듈에 의해 매개된다. 비-공유 복합체화된 페이로드 S1 및 S2의 트랜스사이토시스는 이중특이성 항체 및 상응하는 합텐화된 페이로드를 포함하는 디곡시제닌 결합 셔틀에 대해서 뿐만 아니라 비오틴 결합 셔틀에 대해서 관찰되었다. 반대로, 세포에 대한 현저한 특이적인 결합이나 현저한 방출은 어느 것도, 이중특이성 항체 없이 합텐화된 페이로드가 적용된 경우 또는 합텐화된 페이로드가 상응하지 않은 합텐을 인식하는 이중특이성 항체와 함께 적용되는 경우에 검출되지 않는다. 이는 짧은 올리고뉴클레오타이드-유래된 페이로드가 비-공유 이중특이성 항체 혈액뇌장벽-셔틀 모듈에 의해 뇌 내피세포를 가로질러 전달됨을 나타낸다. 따라서, 짧은 핵산, 예를 들어 안티센스-올리고뉴클레오타이드 또는 "잠금" 핵산의 상기 혈액뇌장벽을 형성하는 세포를 가로지르는 트랜스사이토시스는 혈액뇌장벽-셔틀 모듈(이중특이성 항체)에 의해 비-공유 복합체화된 합텐화된 페이로드를 통해 성취될 수 있다. 실시예 31에 개시된 바와 동일한 방식으로, 짧은 핵산 유도체의 트랜스사이토시스는, 상기 페이로드가 방출되지 않은 셔틀 모듈의 적용시에조차 상기 셔틀 존재로부터 방출되게 되므로, 상기 셔틀 비히클 자체의 방출에 의존하지 않는다.
실시예 38
혈액뇌장벽을 가로지르는 페이로드 전달을 위한 합텐- 및 트랜스페린-수용체 결합 셔틀 비히클의 생체내 기능성의 평가
동물 실험을 적용하여 상기 이중특이성 합텐- 및 트랜스페린-수용체 결합 셔틀 비히클이 생체내에서 혈액뇌장벽(BBB)을 가로질러 페이로드를 전달할 수 있는 정도를 평가한다. 상기 뇌에서 수송되고 검출되는 페이로드는 모노-비오틴화된 포스포-tau 결합 항체 유도체이다. 상기 항체(tau 단백질)의 표적은 뇌 중에 위치한다. 이로 인해, 상기 항체는 그의 표적에 접근하기 위해서는 상기 혈액뇌장벽을 통과할 필요가 있다. 따라서 상기 항체를 상기 생체내 실험을 위한 페이로드로서 적용한다. 상기 페이로드와 조합된 셔틀 비히클은, 상기에 제공된 실시예에서 시험관내 실험에 대해 개시되고 적용된 바와 동일하거나 유사한 방식으로 구성되지만, 인간 구획 대신에 쥐 트랜스페린 수용체에 결합하는 결합 영역들을 갖는다. 특이성 변환의 이유는 상기 배양된 BBB-트랜스사이토시스 분석 시스템(트랜스웰 분석, 상기 참조)이 인간 TfR을 갖는 인간 세포에 적용되는 반면, 상기 동물 실험은 상기 BBB에 쥐 TfR을 갖는 마우스에서 수행되기 때문이다.
상기 쥐 TfR-인식 합텐(예를 들어 비오틴)-결합 셔틀 비히클을 비오틴화된 pTau-결합 항체와 복합체화하고 후속으로 TauPS2APP 마우스에 적용시킨다. 한편으로, 쥐 TfR-인식 합텐(예를 들어 비오틴)-결합 셔틀 비히클을 또한 TauPS2APP 마우스에 주입한 다음 후속으로 나중의 시점들(=사전-표적화 세팅)에서 비오틴화된 pTau-결합 항체를 주입할 수 있다.
마우스의 군을 -1일에 단일 용량의 항-CD4로 처리하여 면역관용을 유도한 다음, 후속적으로 10 내지 12주 동안 시험 물질을 매주 i.v. 주입한다:
군 A: 처리 없음
군 B: (비오틴화된) p-Tau 결합 항체만
군 C: 이중특이성 항-TfR/비오틴 항체(셔틀 비히클)와 복합체화된 비 오틴화된 p-Tau 결합 항체
군 D: 항-TfR 항체에 공유 결합된 p-Tau 결합 항체
군 A 마우스를 0일째에 죽여 기준선 군을 제공한다. 나머지 군에게는 총 12주 동안 매주 각각의 화합물을 i.v. 투여하고 최종 투여 후 1주째에 죽인다.
상기 BBB를 가로지르는 페이로드 항체의 전달을 측정하기 위해서, 각 마우스의 뇌를 2개의 반구로 비슷하게 분할하여 하기와 같이 사용한다:
(1) 우측 반구: pTau-함유 응집체의 면역조직화학
(2) 좌측 반구: 특이적인 알파LISA에 의한 포스포-tau 단백질 및 전체 tau 단백질의 측정을 위한 뇌 균질물의 제조
<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Bispecific anti-hapten/anti-blood brain barrier receptor antibodies, complexes thereof and their use as blood brain barrier shuttles <130> P31919-WO <140> PCT/EP2014/079351 <141> 2014-12-29 <150> EP 14150092.6 <151> 2014-01-03 <150> EP 14174045.6 <151> 2014-06-26 <160> 292 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Asp Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Pro Gly Ser Pro Tyr Glu Tyr Asp Lys Ala Tyr Tyr Ser Met Ala Tyr 1 5 10 15 <210> 4 <211> 125 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Glu Asn Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Asn Ile Gly Ala Thr Tyr Ala Tyr Tyr Pro Asp Ser 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Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Leu Tyr Ser Asp Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 292 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> VL <400> 292 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Ser Ser Phe Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110

Claims (20)

  1. 혈액뇌장벽을 가로질러 합텐화된 페이로드의 표적화된 전달을 위한,
    i) 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 및 혈액뇌장벽 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이성 항체, 및
    ii) 합텐화된 페이로드
    를 포함하는 공유 접합체의 용도로,
    상기 합텐화된 페이로드가 상기 제1 결합 특이성에 의해 특이적으로 결합되고,
    상기 공유 접합체가 상기 합텐화된 페이로드와 상기 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 사이에 공유 결합을 가지고,
    상기 합텐화된 페이로드가 비오틴화된 페이로드, 테오필린화된 페이로드, 디곡시제닌화된 페이로드, 카보란화된 페이로드, 플루오레세인화된 페이로드, 헬리카화된 페이로드 및 브로모데옥시유리딘화딘 페이로드로 이루어진 군 중에서 선택되는,
    용도.
  2. 제 1 항에 있어서,
    혈액뇌장벽을 가로질러 유리(즉 단리된) 합텐화된 페이로드의 표적화된 전달을 위한 용도.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    혈액뇌장벽 수용체가 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장인자 수용체(IGF 수용체), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(LRP8), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1(LRP1), 및 헤파린-결합 상피성장인자-유사 성장인자(HB-EGF)로 이루어진 군 중에서 선택되는 용도.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    혈액뇌장벽 수용체가 트랜스페린 수용체 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8인 용도.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중특이성 항체가 효과기 기능이 없는 용도.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중특이성 항체가
    a) 합텐화된 페이로드에 대한 하나의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 하나의 결합 부위, 또는
    b) 합텐화된 페이로드에 대한 2개의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 하나의 결합 부위, 또는
    c) 합텐화된 페이로드에 대한 하나의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 2개의 결합 부위, 또는
    d) 합텐화된 페이로드에 대한 2개의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 2개의 결합 부위
    를 포함하는 용도.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중특이성 항체가 상기 항체의 CDR2 중의 아미노산 잔기에 시스테인 잔기를 포함하고, 이때 상기 CDR2가 카밧(Kabat)에 따라 결정되는 용도.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    공유 결합이 항체의 CDR2 중의 시스테인 잔기와 합텐화된 페이로드 중의 티올기 사이에 존재하는 용도.
  9. i) 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 및 혈액뇌장벽 수용체에 특이적으로 결합하는 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이성 항체, 및
    ii) 합텐화된 페이로드
    를 포함하는 공유 접합체로,
    상기 합텐화된 페이로드가 상기 제1 결합 특이성에 의해 특이적으로 결합되고,
    상기 합텐화된 페이로드와 상기 합텐화된 페이로드에 특이적으로 결합하는 제1 결합 특이성 사이에 공유 결합을 가지고,
    상기 합텐화된 페이로드가 비오틴화된 페이로드, 테오필린화된 페이로드, 디곡시제닌화된 페이로드, 카보란화된 페이로드, 플루오레세인화된 페이로드, 헬리카화된 페이로드 및 브로모데옥시유리딘화딘 페이로드로 이루어진 군 중에서 선택되는,
    접합체.
  10. 제 9 항에 있어서,
    혈액뇌장벽 수용체가 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 인슐린-유사 성장인자 수용체(IGF 수용체), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8(LRP8), 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1(LRP1), 및 헤파린-결합 상피성장인자-유사 성장인자(HB-EGF)로 이루어진 군 중에서 선택되는 접합체.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    혈액뇌장벽 수용체가 트랜스페린 수용체 또는 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 8인 접합체.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중특이성 항체가 효과기 기능이 없는 접합체.
  13. 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중특이성 항체가
    a) 합텐화된 페이로드에 대한 하나의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 하나의 결합 부위, 또는
    b) 합텐화된 페이로드에 대한 2개의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 하나의 결합 부위, 또는
    c) 합텐화된 페이로드에 대한 하나의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 2개의 결합 부위, 또는
    d) 합텐화된 페이로드에 대한 2개의 결합 부위 및 혈액뇌장벽 수용체에 대한 2개의 결합 부위
    를 포함하는 접합체.
  14. 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    이중특이성 항체가 상기 항체의 CDR2 중의 아미노산 잔기에 시스테인 잔기를 포함하고, 이때 상기 CDR2가 카밧에 따라 결정되는 접합체.
  15. 제 9 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    공유 결합이 항체의 CDR2 중의 시스테인 잔기와 합텐화된 페이로드 중의 티올기 사이에 존재하는 접합체.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    CDR2가 중쇄 CDR2이고 시스테인이 카밧 넘버링에 따른 52b번 또는 53번 위치에 있는 접합체.
  17. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    CDR2가 경쇄 CDR2이고 시스테인이 카밧 넘버링에 따른 55번 또는 51번 위치에 있는 접합체.
  18. 제 9 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 따른 접합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 제형.
  19. 제 9 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로서 사용하기 위한 접합체.
  20. 제 9 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    암 또는 신경학적 질환의 치료를 위한 접합체.
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