BR112020016005A2 - Método de administração de uma proteína terapêutica ao sistema nervoso central, proteína terapêutica multidomínio, polinucleotídeo, vetor de terapia gênica, e, uso de um nucleotídeo que codifica a proteína terapêutica multidomínio - Google Patents

Método de administração de uma proteína terapêutica ao sistema nervoso central, proteína terapêutica multidomínio, polinucleotídeo, vetor de terapia gênica, e, uso de um nucleotídeo que codifica a proteína terapêutica multidomínio Download PDF

Info

Publication number
BR112020016005A2
BR112020016005A2 BR112020016005-9A BR112020016005A BR112020016005A2 BR 112020016005 A2 BR112020016005 A2 BR 112020016005A2 BR 112020016005 A BR112020016005 A BR 112020016005A BR 112020016005 A2 BR112020016005 A2 BR 112020016005A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
receptor
domain
protein
therapeutic protein
scfv
Prior art date
Application number
BR112020016005-9A
Other languages
English (en)
Inventor
Andrew Baik
Katherine CYGNAR
Maria Praggastis
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals, Inc. filed Critical Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Publication of BR112020016005A2 publication Critical patent/BR112020016005A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6815—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6879—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the immunoglobulin having two or more different antigen-binding sites, e.g. bispecific or multispecific immunoglobulin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6881—Cluster-antibody conjugates, i.e. the modifying agent consists of a plurality of antibodies covalently linked to each other or of different antigen-binding fragments covalently linked to each other
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2881—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD71
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/0102—Alpha-glucosidase (3.2.1.20)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

são divulgadas composições e métodos para a administração de uma proteína terapêutica ao sistema nervoso central (snc), a fim de tratar doenças e distúrbios que comprometem o snc, tais como o tratamento de doenças de armazenamento lisossômico. são fornecidas proteínas terapêuticas liberadas através de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição nucleotídica que codifica a proteína terapêutica conjugada a uma proteína de ligação a um receptor de superfície celular que atravessa a barreira hematoencefálica (bhe).

Description

1 / 136
MÉTODO DE ADMINISTRAÇÃO DE UMA PROTEÍNA TERAPÊUTICA AO SISTEMA NERVOSO CENTRAL DE UM SUJEITO, PROTEÍNA TERAPÊUTICA MULTIDOMÍNIO, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR DE TERAPIA GÊNICA, E, USO DE UM NUCLEOTÍDEO QUE CODIFICA A PROTEÍNA TERAPÊUTICA MULTIDOMÍNIO, O POLINUCLEOTÍDEO OU O VETOR DE TERAPIA GÊNICA REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA ENVIADA COMO UM ARQUIVO DE TEXTO VIA REDE DE EFS
[001] A Listagem de Sequência escrita no arquivo 10457WO01_ST25.txt tem 33,5 kilobytes, foi criada em 29 de janeiro de 2019 e está incorporada por meio deste documento por referência.
CAMPO
[002] Este pedido refere-se, de modo geral, a composições e métodos para a administração de uma proteína terapêutica ao sistema nervoso central (SNC), a fim de tratar doenças e distúrbios que comprometem o SNC, tais como o tratamento de doenças de armazenamento lisossômico. Esta aplicação é direcionada para fornecer uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de nucleotídeo que codifica uma proteína terapêutica conjugada a um ou mais domínios de liberação que atravessa a barreira hematoencefálica (BHE).
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[003] Abordagens de administração de drogas foram desenvolvidas para superar a barreira hematoencefálica (BHE), como nanocarreadores, no entanto, elas têm deficiências. Carreadores demonstraram instabilidade na circulação sanguínea e perfil de biodistribuição indesejável (Gelperina S, et al., 2005, Am J Respir Crit Care Med. 172(12):1487-90; que é incorporada neste documento em sua totalidade por referência). As eficiências de direcionamento também foram comprometidas dependendo dos mecanismos de tráfego na BHE e de um estado da doença do SNC ter alterado a
2 / 136 integridade da barreira. A seleção adequada da fração ou do carreador de direcionamento deve levar em conta as condições neuroinflamatórias que afetam esses mecanismos de tráfego.
[004] A liberação de proteínas terapêuticas através da expressão de DNA no fígado ou em outros tecidos forneceu uma abordagem conveniente, eliminando a necessidade de injeção em bolus de proteína e, portanto, diminuindo as preocupações de imunogenicidade. Proteína terapêutica conjugada a uma proteína de ligação a receptor, especialmente um receptor específico de célula, resolve o problema das terapêuticas de direcionamento para tecidos específicos. No entanto, ainda existe uma necessidade de fornecer métodos que de forma eficiente proporcionem terapêuticas para o SNC.
SUMÁRIO
[005] Os requerentes descobriram que proteínas terapêuticas, especialmente enzimas de reposição, podem ser efetivamente distribuídas ao sistema nervoso central quando associadas a uma proteína de ligação ao receptor e desde que os níveis de sangue circulantes atinjam níveis consistentes ao longo do tempo. A proteína terapêutica multidomínio pode ser distribuída ao fígado através de um vetor de terapia gênica que aloja a sequência codificante da proteína terapêutica e do complexo da proteína de ligação.
[006] Em um aspecto, a invenção fornece um método de liberação de uma proteína terapêutica ao sistema nervoso central (SNC) de um sujeito, compreendendo a administração ao sujeito de uma composição de nucleotídeo que codifica a proteína terapêutica conjugada a uma proteína de ligação a receptor de superfície celular (CSR) (CSR-BP) (tpCSR-BP) por meio de um método de liberação direcionada ao fígado que seja suficiente para fornecer uma quantidade terapeuticamente eficaz de tpCSR-BP ao SNC.
[007] Em uma modalidade, o CSR-BP é um anticorpo ou fragmento
3 / 136 de ligação a antígeno respectivo que se liga especificamente ao SNC. Em outra modalidade, a proteína terapêutica é uma enzima lisossômica.
[008] Em uma modalidade, a enzima tem atividade de hidrolase, tal como uma glicosilase, tal como uma glicosidase, tal como uma alfa- glicosidase ou alfa-galacosidase A. Em uma modalidade, a proteína de ligação a receptor de superfície celular (CSR) (CSR-BP) é uma proteína de ligação a antígeno que se liga a um receptor de internalização. Em uma modalidade, o receptor de internalização é uma molécula de superfície celular que é endocitada e trafegada para o lisossoma. Em uma modalidade específica, o receptor de internalização é uma molécula CD63. Em uma modalidade, o receptor de internalização é uma molécula ITGA7. Em uma modalidade específica, o CSR-BP é um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou um fragmento variável de cadeia única (scFv), tal como um scFv que se liga a CD63 ou ITGA7.
[009] Em algumas modalidades, a proteína terapêutica multidomínio descrita neste documento compreende um ou mais domínios de liberação e um domínio enzimático, em que os um ou mais domínios de liberação se ligam ao receptor de transferrina humano (hTfR). Em algumas modalidades, a proteína terapêutica multidomínio compreende ainda um segundo domínio de liberação que se liga a um efetor de internalização. Em algumas modalidades, o segundo domínio de liberação se liga a (i) um efetor de internalização selecionado do grupo que consiste em CD63, Integrina alfa-7 (ITGA7), MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, receptor de transferrina, receptor de LDL, receptor de proteína 1 relacionada a LDL, ASGR1, ASGR2, proteína 2 semelhante a proteína precursora amiloide (APLP2), receptor de apelina (APLNR), mielina e proteína linfocitária (MAL), IGF2R, H+ ATPase tipo vacuolar, receptor da toxina diftérica, receptor de folato, receptores de glutamato, receptor de glutationa, receptores de leptina, receptor scavenger A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3 e CD36; (ii) um efetor de internalização
4 / 136 expresso em vários tipos de tecido, opcionalmente selecionado do grupo que consiste em CD63, MHC-I, H+ ATPase tipo vacuolar, IGF2R, integrina alfa- 7 (ITGA7), LRP5, LRP6, LRP8, Kremen-2, receptor de LDL, receptor de proteína 1 relacionada a LDL, proteína 2 semelhante à proteína precursora amiloide (APLP2), receptor de apelina (APLNR), PRLR, MAL (mielina e proteína linfocitária (MAL), receptores da toxina diftérica, HBEGF (fator de crescimento semelhante a EGF de ligação a heparina), receptores de glutationa, receptores de glutamato, receptores de leptina e receptores de folato; (iii) um efetor de internalização expresso preferencialmente por osso e/ou cartilagem, opcionalmente selecionado do grupo que consiste em Colágeno X, Integrina alfa 10 (ITGA10 ), Receptor 3 do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR3), isoforma C do receptor do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR3C), hialuronano e proteína de ligação de proteoglicano 1 (CRTL1), agrecano, colágeno II e Kremen-1; (iv) um efetor de internalização expresso preferencialmente por monócitos, macrófagos ou microglia, opcionalmente selecionada a partir do grupo que consiste em receptor scavenger A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3, CD36, MSR1 (receptor scavenger de macrófago 1), MRC1 (receptor 1 de macrose de macrófago), VSIG4 (conjunto V e proteína 4 que contém domínio de imunoglobulina), CD68 (macrossialina) e CSF1R (receptor do fator 1 estimulador de colônias de macrófagos); (v) um efetor de internalização expresso preferencialmente por células renais, opcionalmente selecionado a partir do grupo que consiste em CDH16 (Caderina-16), CLDN16 (Claudina-16), KL (Klotho), PTH1R (receptor de hormônio da paratireoide), SLC22A13 (membro 13 da família 22 de carreadores de soluto), SLC5A2 (cotransportador 2 de sódio/glicose) e UMOD (Uromodulina). Em outras modalidades, o efetor de internalização é um internalizador específico do músculo, como BMPR1A (receptor de proteína morfogenética óssea 1A), m-caderina, CD9, MuSK (quinase específica do músculo), LGR4 / GPR48 (receptor acoplado à proteína G 48) ,
5 / 136 receptor colinérgico (nicotínico) alfa 1, CDH15 (Caderina-15), ITGA7 (Integrina alfa-7), CACNG1 (subunidade gama-1 do canal de cálcio do tipo L), CACNAlS (subunidade alfa-15 do canal de cálcio do tipo L), CACNG6 (subunidade gama-6 do canal de cálcio do tipo L), SCN1B (subunidade beta-1 do canal de sódio), CHRNA1 (subunidade alfa do receptor ACh), CHRND (subunidade delta do receptor ACh), LRRC14B (proteína 14B que contém repetição rica em leucina), distroglicano (DAG1) e POPDC3 (proteína 3 contendo o domínio de Popeye); (vi) um efetor de internalização expresso preferencialmente por células do fígado, opcionalmente ASGR1 ou ASGR2; (vii) um efetor de internalização expresso preferencialmente por células musculares, opcionalmente selecionado do grupo que consiste em BMPR1A (receptor de proteína morfogenética óssea 1A), m-caderina, CD9, MuSK (quinase muscular específica), LGR4/GPR48 (receptor 48 acoplado à proteína G), receptor colinérgico (nicotínico) alfa 1, CDH15 (Caderina-15), ITGA7 (integrina alfa-7), CACNG1 (subunidade gama-1 do canal de cálcio do tipo L), CACNAlS (subunidade alfa-15 do canal de cálcio do tipo L), CACNG6 (Subunidade gama-6 do canal de cálcio do tipo L), SCN1B (subunidade beta- 1 do canal de sódio), CHRNA1 (subunidade alfa do receptor ACh), CHRND (subunidade delta do receptor ACh), LRRC14B (proteína 14B contendo repetição rica em leucina), distroglicano (DAG1) e POPDC3 (proteína 3 contendo o domínio Popeye) e/ou (viii) uma proteína efetora de internalização selecionada do grupo que consiste em ITGA7, CD9, CD63, ALPL2, MSR1, ASGR1, ASGR2 ou PRLR.
Em algumas modalidades, o segundo domínio de liberação se liga ao efetor de internalização CD63. Em algumas modalidades, pelo menos um dentre um ou mais domínios de liberação compreende uma proteína de ligação a antígeno.
Em algumas modalidades, cada um dentre um ou mais domínios de liberação compreende uma proteína de ligação a antígeno.
Em algumas modalidades, pelo menos um dentre um ou mais domínios de liberação compreende um fragmento variável de cadeia única
6 / 136 (scFv). Em algumas modalidades, pelo menos um dentre um ou mais domínios de liberação compreende um half-body. Em algumas modalidades, o domínio de liberação que se liga ao hTfR é um scFv, em que o half-body se liga a CD63, em que o domínio enzimático é GAA, e em que GAA é conjugado ao terminal carbóxi do half-body que se liga a CD63. Em algumas modalidades, cada um dentre um ou mais domínios de liberação compreende um scFv. Em algumas modalidades, pelo menos um scFv é fundido a um Fc. Em algumas modalidades, o Fc compreende um isotipo IgG4 humano do tipo selvagem, ou derivado dele. Em algumas modalidades, GAA é conjugado ao terminal carbóxi do Fc. Em algumas modalidades, a proteína terapêutica multidomínio compreende um anti-hTfR scFv e um anti-hCD63 scFv. Em algumas modalidades, o scFv anti-hTfR e o scFv anti-hCD63 são ambos ligados, em seu terminal carbóxi, a uma única enzima GAA. Em algumas modalidades, o domínio de liberação é um anti-hTfR scFv e o domínio de enzima está ligado ao terminal carbóxi do domínio VL do scFv. Em algumas modalidades, o multidomínio compreende ainda um segundo domínio de liberação ligado ao terminal N do domínio VH do scFv anti-hTfR. Em algumas modalidades, o segundo domínio de liberação é um scFV anti- hCD63. Em algumas modalidades, o domínio enzimático compreende a sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:1.
[0010] Também são proporcionadas proteínas terapêuticas que compreendem pelo menos dois domínios de liberação e pelo menos um domínio enzimático, em que cada um dos dois domínios de liberação é selecionado independentemente do grupo consistindo em um anticorpo, um half-body e um scFv, e em que pelo menos um ou mais dos domínios de liberação estão associados ao pelo menos um domínio enzimático, preferencialmente em que os um ou mais domínios de liberação estão covalentemente ligados ao pelo menos um domínio enzimático. Em algumas modalidades, a proteína terapêutica multidomínio compreende não mais do
7 / 136 que dois domínios de liberação.
Em algumas modalidades, apenas um dos domínios de liberação está associado a pelo menos um domínio de enzima.
Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois domínios de liberação é ligado covalentemente a um domínio enzimático.
Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois domínios de liberação é ligado covalentemente ao mesmo domínio enzimático.
Em algumas modalidades, cada um dos pelo menos dois domínios de liberação é ligado covalentemente a um domínio de enzima diferente.
Em algumas modalidades, a proteína terapêutica multidomínio compreende não mais que dois domínios de liberação, em que o primeiro domínio de liberação compreende um half-body, e em que o segundo domínio de liberação compreende um scFv.
Em algumas modalidades, o scFv é fundido a um Fc.
Em algumas modalidades, o half- body está covalentemente ligado, em seu terminal carbóxi, a um primeiro domínio enzimático e/ou em que o scFv está covalentemente ligado, em seu terminal carbóxi, a um Fc e, opcionalmente, a um segundo domínio enzimático.
Em algumas modalidades, a proteína terapêutica multidomínio compreende não mais que dois domínios de liberação, em que o primeiro e o segundo domínio de liberação compreendem, cada um, um scFv.
Em algumas modalidades, tanto o primeiro quanto o segundo scFv são ligados covalentemente a um domínio enzimático.
Em algumas modalidades, a proteína terapêutica multidomínio compreende, de N-terminal para C- terminal: o primeiro scFv, o segundo scFv e o domínio enzimático.
Em algumas modalidades, pelo menos um domínio de liberação se liga a uma molécula de tráfego lisossômico e pelo menos um domínio de liberação se liga a um efetor de transcitose.
Em algumas modalidades, a molécula de tráfego lisossômico é selecionada do grupo consistindo em CD63, ITGA7, CD9, CD63, CD81, CD82, ou CD151, e em que o efetor de transcitose é selecionado do grupo consistindo em um receptor de LDL, um receptor de IgA, um receptor de transferrina, um receptor de Fc neonatal, receptor de
8 / 136 insulina, CD98 e Basigina. Em algumas modalidades, a proteína terapêutica multidomínio compreende uma estrutura conforme retratada na Figura 1C, Figura 1D, Figura 1E ou Figura 1F.
[0011] Também são fornecidos neste documento polinucleotídeos que codificam as proteínas terapêuticas multidomínio descritas neste documento. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo compreende ainda uma sequência de ácido nucleico de vírus e uma sequência de ácido nucleico direcionada a um locus. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo compreende ainda uma sequência de ácido nucleico de vírus e uma sequência de ácido nucleico direcionada a um locus, em que a sequência de ácido nucleico de vírus é uma sequência de ácido nucleico de vírus adeno-associado (AAV). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende ainda uma sequência de ácido nucleico de vírus e uma sequência de ácido nucleico direcionada a um locus, em que a sequência de ácido nucleico de vírus é uma sequência de ácido nucleico de vírus adeno-associado (AAV), e em que a sequência de ácido nucleico de AAV compreende uma sequência de repetição terminal interna e, opcionalmente, um elemento regulador tecido-específico, tal como um promotor específico de fígado ou um promotor específico neuronal. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende ainda uma sequência de ácido nucleico de vírus e uma sequência de ácido nucleico direcionada a um locus, em que a sequência de ácido nucleico de vírus é uma sequência de ácido nucleico de vírus adeno-associado (AAV) que compreende uma sequência de repetição terminal interna que compreende a SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, ou ambas, e, opcionalmente, um elemento regulador tecido-específico, tal como um promotor específico de fígado ou um promotor específico neuronal. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende ainda um elemento regulador tecido-específico que compreende a sequência indicada como SEQ ID NO:8 e/ou SEQ ID NO:9.
9 / 136
[0012] Em um aspecto, a invenção fornece um vetor de terapia de gene, tal como um vetor AAV, que contém uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína terapêutica conjugada ou fundida a um CSR-BP, por exemplo, um polinucleotídeo como descrito neste documento. Em algumas modalidades, o vetor de terapia de gene é selecionado do grupo consistindo em um vetor viral, opcionalmente em que o vetor viral é um vírus natural, um vírus manipulado, ou um vírus quimérico, e um polinucleotídeo nu que compreende um polinucleotídeo descrito neste documento, um complexo polinucleotídico, opcionalmente em que o complexo polinucleotídico é uma nanopartícula lipídica que compreende o polinucleotídeo de qualquer uma das modalidades 20-25 e lipídios e qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, o vetor de terapia gênica é um vetor viral selecionado do grupo consistindo em um retrovírus, adenovírus, vírus herpes simplex, poxvírus, vírus vaccinia, lentivírus ou um vírus adeno- associado. Em algumas modalidades, o vetor de terapia gênica é AAV9, Anc80, uma quimera AAV2/8 e/ou um AAV pseudotipado em um tecido específico, por exemplo, o fígado ou tecido neuronal.
[0013] Em uma modalidade, uma proteína terapêutica, nucleotídeo que a codifica e/ou vetores de terapia gênica que compreendem o nucleotídeo que a codifica são usados para tratar um sujeito com necessidade da terapia de reposição enzimática, por exemplo, num método de liberação da proteína terapêutica ao sistema nervoso central (SNC) de um sujeito, que compreende a administração, ao sujeito, de uma composição nucleotídica que codifica uma proteína terapêutica multidomínio através de um método de liberação direcionado ao fígado suficiente para fornecer uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína terapêutica multidomínio no SNC, em que a proteína terapêutica multidomínio compreende um domínio de liberação e um domínio enzimático. Em algumas modalidades, o sujeito é um animal. Em determinadas modalidades, o sujeito é um humano.
10 / 136
[0014] Em um aspecto, um vetor AAV contendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína de fusão de scFv-hidrolase é administrado a um sujeito humano ou não humano. O polinucleotídeo subsequentemente se integra em um locus genômico no fígado e a proteína de fusão codificada é produzida. Em outra modalidade, o polinucleotídeo é transcrito de forma epissomal no fígado e a proteína de fusão codificada é produzida. Em uma modalidade específica, a proteína de fusão é uma proteína de fusão anti- CD63scFv-GAA ou uma proteína de fusão anti-ITGA7scFv-GAA, o sujeito humano ou não humano carece de atividade endógena de GAA e a atividade de GAA é efetivamente restaurada no sujeito.
[0015] Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratar um sujeito (humano ou não humano) com uma deficiência de enzima através da administração ao paciente de um vetor de terapia gênica contendo um gene que codifica uma proteína terapêutica conjugada ou fundida ao CSR-BP.
[0016] São descritos neste documento métodos de liberação de uma proteína terapêutica ao sistema nervoso central (SNC) de um sujeito, compreendendo a administração, ao sujeito, de uma composição nucleotídica que codifica uma proteína terapêutica multidomínio através de um método de liberação direcionada ao fígado suficiente para fornecer uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína terapêutica multidomínio no SNC, em que a proteína terapêutica multidomínio compreende um domínio de liberação e um domínio enzimático. Em algumas modalidades, o domínio de liberação é um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um efetor de internalização. Em algumas modalidades, a proteína terapêutica é uma enzima lisossômica. Em algumas modalidades, a enzima lisossômica é GAA. Em algumas modalidades, a composição de nucleotídeo é administrada através de um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor viral é um vetor AAV. Em algumas modalidades, a composição de nucleotídeo é administrada em uma dose de pelo menos 2 x
11 / 136
1012 genomas virais por quilograma (vg/kg). Em algumas modalidades, o efetor de internalização é expresso na superfície das células selecionadas do grupo consistindo em: células no SNC, células epiteliais e células que atravessam a barreira hematoencefálica.
Em algumas modalidades, o domínio de liberação se liga a um efetor de internalização.
Em algumas modalidades, o efetor de internalização é (i) selecionado do grupo que consiste em CD63, Integrina alfa-7 (ITGA7), MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, receptor de transferrina, receptor de LDL, receptor de proteína 1 relacionada a LDL, ASGR1, ASGR2, proteína 2 semelhante a proteína precursora amiloide (APLP2), receptor de apelina (APLNR), mielina e proteína linfocitária (MAL), IGF2R, H+ ATPase do tipo vacuolar, receptor da toxina diftérica, receptor de folato, receptores de glutamato, receptor de glutationa, receptores de leptina, receptor scavenger A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3 e CD36; (ii) expresso em vários tipos de tecido, por exemplo, CD63, MHC-I, H ATPase do tipo vacuolar, IGF2R, Integrina alfa-7 (ITGA7), LRP5, LRP6, LRP8, Kremen-2, receptor de LDL, relacionado ao LDL receptor de proteína 1, proteína 2 semelhante a proteína precursora amiloide (APLP2), receptor de apelina (APLNR), PRLR, MAL (mielina e proteína linfocitária (MAL), receptores da toxina diftérica, HBEGF (fator de crescimento semelhante a EGF de ligação à heparina), receptores de glutationa, receptores de glutamato, receptores de leptina e receptores de folato, opcionalmente em que o sujeito apresenta um ou mais sintomas de uma doença selecionada do grupo que consiste em doença de Fabry, doença de Gaucher, MPS I, MPS II, MPS IIIA, MPS IIIB, MPS IIID, MPS IVB, MPS VI, MPS VII, MPS IX, doença de Pompe, deficiência de lipase ácida lisossomal, Leucodistrofia metacromática, doenças de Niemann-Pick tipos A, B e C2, Alfa manosidose, deficiência de Neuraminidase, Sialidose, Aspartilglicosaminúria, Deficiência de saposina combinada, Doença de Gaucher atípica, lipogranulomatose de Farber, Fucosidose e Beta manosidose; (iii) preferencialmente expressa por osso/ou
12 / 136 cartilagem, por exemplo, colágeno X, integrina alfa 10 (ITGA10), receptor 3 do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR3), isoforma C do receptor do fator de crescimento de fibroblastos (FGFR3C), hialuronano e proteína de ligação de proteoglicano 1 (CRTL1 ), Agrecano, Colágeno II e Kremen-1, opcionalmente em que o sujeito apresenta um ou mais sintomas de uma doença selecionada do grupo que consiste em MPS I, MPS II, MPS IIIA, MPS IIIB, MPS IIID, MPS IVA, MPS IVB , MPS VI, MPS VII, MPS IX, Beta manosidose, doença de Gaucher, doença de Gaucher atípica, deficiência de saposina combinada, Aspartilglicosaminúria, lipogranulomatose de Farber, Sialidose, Deficiência de Neuraminidase e Alfa manosidose; (iv) preferencialmente expresso por monócitos, macrófagos ou microglia, por exemplo, receptor scavenger A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3, CD36, MSR1 (receptor scavenger de macrófago 1), MRC1 (receptor de macrófago manose 1), VSIG4 (conjunto V e proteína 4 contendo domínio de imunoglobulina), CD68 (macrossialina) e CSF1R (receptor de fator 1 estimulador de colônias de macrófagos), opcionalmente em que o sujeito apresenta um ou mais sintomas de uma doença selecionada a partir do grupo que consiste em deficiência de lipase de ácido lisossomal, doença de Gaucher, doença de Gaucher atípica, deficiência combinada de saposina e lipogranulomatose de Farber; (v) preferencialmente expresso por células renais, por exemplo, CDH16 (Caderina-16), CLDN16 (Claudina-16), KL (Klotho), PTH1R (receptor de hormônio da paratireoide), SLC22A13 (membro 13 da família 22 de carreadores de soluto), SLC5A2 (cotransportador 2 de sódio/glicose) e UMOD (Uromodulina), opcionalmente em que o sujeito apresenta um ou mais sintomas ou é diagnosticado com uma doença selecionada do grupo que consiste em doença de Fabry, síndrome de Alport, doença renal policística e púrpura trombocitopênica trombótica; (vi) preferencialmente expressa por células hepáticas, por exemplo, ASGR1 ou ASGR2, opcionalmente em que o sujeito apresenta um ou mais sintomas ou é diagnosticado com uma doença
13 / 136 selecionada do grupo que consiste em deficiência de lipase ácida lisossomal, doença de Gaucher, MPS VI, MPS VII , MPS II, doenças de Niemann-Pick tipos A, B e C2, sialidose, deficiência de neuraminidase, doença de Gaucher atípica, deficiência combinada de saposina, lipogranulomatose de Farber; (vii) preferencialmente expresso por células musculares, por exemplo, BMPR1A (receptor de proteína morfogenética óssea 1A), m-caderina, CD9, MuSK (quinase muscular específica), LGR4/GPR48 (receptor acoplado à proteína G 48), receptor colinérgico (nicotínico) alfa 1, CDH15 (Caderina-15), ITGA7 (Integrina alfa-7), CACNG1 (subunidade do canal de cálcio do tipo L gama- 1), CACNAlS (subunidade do canal de cálcio do tipo L alfa-15), CACNG6 (Subunidade gama-6 do canal de cálcio tipo L), SCN1B (subunidade beta-1 do canal de sódio), CHRNA1 (subunidade alfa do receptor ACh), CHRND (subunidade delta do receptor ACh), LRRC14B (proteína 14B contendo repetição rica em leucina), distroglicano (DAG1) e POPDC3 (proteína 3 contendo o domínio Popeye), opcionalmente em que o sujeito apresenta um ou mais sintomas ou é diagnosticado com doença de Pompe; (viii) selecionado do grupo que consiste em ITGA7, CD9, CD63, ALPL2, MSR1, ASGR1, ASGR2 ou PRLR; e/ou (ix) é CD63. Em algumas modalidades, o domínio de liberação é um fragmento variável de cadeia única (scFv). Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao receptor de superfície celular (CSR) (CSR-BP) compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, a proteína terapêutica compreende uma hidrolase.
Em algumas modalidades, a proteína terapêutica compreende uma glicosilação.
Em algumas modalidades, a proteína terapêutica compreende uma glicosidase.
Em algumas modalidades, a proteína terapêutica compreende uma alfa-glicosidade.
Em algumas modalidades, a proteína terapêutica compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:13, ou um fragmento desta.
Em algumas modalidades, a proteína terapêutica compreende um anti-ABeta, ou um anticorpo anti-Tau.
Em
14 / 136 algumas modalidades, o polinucleotídeo compreende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:11. Em algumas modalidades, o domínio enzimático compreende uma alfa-glicosidade, e em que os níveis de glicogênio em qualquer tecido do SNC no sujeito são reduzidos por pelo menos nove meses após o tratamento. Em algumas modalidades, o sujeito tem doença de Pompe. Em algumas modalidades, a composição de nucleotídeo administrada fornece um nível de soro de proteína terapêutico multidomínio de pelo menos 1 μg/mL. Em algumas modalidades, o domínio enzimático compreende uma glicosidase, tal como GAA (por exemplo, SEQ ID NO:1) ou GLA (por exemplo, UniProtKB N.º P06280, aa32-429, SEQ ID NO:13), e o paciente tem doença de Pompe ou doença de Fabry. Em algumas modalidades, o CSR- BP é uma proteína de ligação a antígeno que se liga a um receptor de internalização, tal como CD63 ou ITGA7. Em algumas modalidades, o CSR- BP é uma molécula de scFv que se liga a CD63. Em algumas modalidades, o CSR-BP é uma molécula de scFv que se liga a ITGA7. Em outra modalidade, o vetor de terapia gênica é um vetor AAV contendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína terapêutica multidomínio de fusão anti-CD63-GAA. Em outra modalidade, o vetor de terapia gênica é um vetor AAV contendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína terapêutica multidomínio de fusão anti-ITGA7-GAA.
[0017] Em algumas modalidades, a proteína terapêutica multidomínio compreende um domínio da enzima GAA, e altos níveis séricos de GAA são mantidos no soro do paciente por pelo menos 12 semanas após a administração do vetor de terapia gênica. Em algumas modalidades, a proteína terapêutica compreende uma enzima GAA, e os níveis de glicogênio no tecido do SNC no paciente são significativamente reduzidos. Em algumas incorporações, a proteína terapêutica compreende uma enzima de GAA, e os níveis de glicogênio são mantidos em níveis do tipo selvagem por 3 meses, 6 meses, ou 9 meses após a administração do vetor da terapia gênica. Em uma
15 / 136 modalidade, a proteína terapêutica multidomínio compreende um domínio da enzima GAA, e a força muscular do paciente após o tratamento é restaurada aos níveis do tipo selvagem.
[0018] Em um aspecto, a invenção fornece um método para reduzir o acúmulo de glicogênio em um tecido em um sujeito humano ou não humano através da administração de um vetor de terapia gênica contendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína terapêutica fundida a um CSR-BP. Em algumas modalidades, o vetor de terapia gênica é administrado a uma dose suficiente para fornece um nível de soro limite da proteína terapêutica fundido a um CSR-BP. Em algumas modalidades, o nível de limite é pelo menos 1 μg/mL. Em algumas modalidades, o nível de limite é pelo menos 2 μg/mL. Em algumas modalidades, o nível de limite é pelo menos 3 μg/mL. Em algumas modalidades, o nível de limite é pelo menos 4 μg/mL. Em algumas modalidades, o nível de limite é pelo menos 5 μg/mL. Em algumas modalidades, o nível de limite é pelo menos 6 μg/mL. Em algumas modalidades, o nível de limite é pelo menos 7 μg/mL. Em algumas modalidades, o nível de limite é pelo menos 8 μg/mL. Em algumas modalidades, o nível de limite é pelo menos 9 μg/mL. Em algumas modalidades, o nível de limite é pelo menos 10 μg/mL. Em algumas modalidades, o nível de limite é pelo menos 11 μg/mL. Em algumas modalidades, o nível de limite é pelo menos 12 μg/mL. Em algumas modalidades, o nível de limite é pelo menos 13 μg/mL. Em algumas modalidades, o nível de limite é pelo menos 14 μg/mL. Em algumas modalidades, o nível de limite é pelo menos 15 μg/mL. Em uma modalidade, o tecido é cerebelo, medula espinhal ou hipocampo. Em uma modalidade, o sujeito humano ou não humano tem doença de Pompe. Em uma modalidade, a proteína terapêutica multidomínio compreende uma proteína de fusão scFv anti-CD63-GAA. Em outra modalidade, a proteína terapêutica multidomínio compreende uma proteína de fusão scFv anti-ITGA7-GAA.
16 / 136
DESENHOS
[0019] A Figura 1A representa esquematicamente proteínas terapêuticas multidomínio. O painel A representa uma proteína terapêutica multidomínio que compreende um anticorpo biespecífico (ii) e uma enzima de reposição (i). O painel B representa um polipeptídeo de fusão de enzima-Fc (i) associando-se com um half-body específico ao efetor de internalização (ii) para formar a proteína terapêutica multidomínio. O painel C representa uma enzima de reposição (hexágono) ligada covalentemente ao terminal C da cadeia pesada de um anticorpo anti-efetor de internalização. O painel D representa uma enzima de reposição (hexágono) ligada covalentemente ao terminal N da cadeia pesada de um anticorpo anti-efetor de internalização. O painel E representa uma enzima de reposição (hexágono) covalentemente ligada ao terminal C da cadeia leve de um anticorpo anti-efetor de internalização. O painel F representa uma enzima de reposição (hexágono) ligada covalentemente ao terminal N da cadeia leve de um anticorpo anti- efetor de internalização. O painel G representa uma enzima de reposição (hexágono) ligada covalentemente ao terminal C de um fragmento variável de cadeia única (scFv) contendo uma região VH (barra sombreada) e uma região VL (barra aberta). O painel H representa uma enzima de reposição (hexágono) ligada covalentemente a dois domínios de scFv, o primeiro scFv (i) que serve como um primeiro domínio de liberação e o segundo scFv (ii) que serve como um segundo domínio de liberação. Proteínas terapêuticas multidomínio adicionais não representadas na Figura 1A incluem, mas não estão limitadas a, proteínas terapêuticas multidomínio compreendendo dois ou mais domínios de liberação e pelo menos um domínio enzimático. Como exemplos não limitantes, os anticorpos, half-bodies e domínios scFv representados nos painéis A-H desta figura podem representar qualquer tipo de domínio de liberação, e domínios de liberação adicionais ou enzimas de reposição podem também ser associadas a produzir uma proteína terapêutica
17 / 136 multidomínio. Exemplos não limitantes de proteínas terapêuticas multidomínio que compreendem dois ou mais domínios de liberação são representados ainda nas Figuras 1C, 1D e 1F, que incluem uma enzima de reposição (retratada como, mas não limitada a, GAA) ligada covalentemente a um primeiro half-body específico ao efetor de internalização, que se associa com uma segunda fusão de um ligante específico ao efetor de internalização, que pode ou não estar covalentemente ligada a uma enzima de reposição (representada como, mas não limitada a, GAA), para formar a proteína terapêutica de múltiplos domínios (Figuras 1C e 1D), uma enzima de reposição (representada como, mas não limitada a, GAA) covalentemente ligado ao C-terminal de cada half-body específico ao anti-efetor de internalização, que serve como um primeiro domínio de liberação, e uma fusão scFv-Fc específica ao efetor de internalização, que serve como um segundo domínio de liberação, onde o half-body específico ao anti-efetor de internalização e associados, juntos, formam a proteína terapêutica multidomínio (Figura 1D), e uma enzima de reposição covalentemente ligada a um primeiro scFv, que está ligado, por exemplo, através de um ligante, a um segundo scFv (Figura 1F).
[0020] A Figura 1B proporciona ilustrações exemplares não limitantes de vetores de terapia gênica AAV que codificam uma proteína terapêutica multidomínio representada no painel G da Figura 1A, em que o scFv é um scFv anti-CD63 humano e a enzima de reposição é GAA (por exemplo, anti-hCD63scFv::hGAA; ver, por exemplo, a sequência de aminoácidos estabelecida como SEQ ID NO:10). Aminoácidos 1-117 da SEQ ID NO:10 fornecem a sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo H4H12450N; aminoácidos 118-132 da SEQ ID NO:10 fornecem uma sequência de ligante de aminoácido entre os domínios variáveis de cadeia pesada e leve de H4H12450N; aminoácidos 133-240 de SEQ ID NO:364 fornecem a sequência de aminoácidos do
18 / 136 domínio variável de cadeia leve (VL) do anticorpo H4H12450N; os aminoácidos 241-245 da SEQ ID NO:10 fornecem uma sequência de ligante de aminoácido entre o anti-hCD63scFv e GAA; e os aminoácidos 246-1128 da SEQ ID NO:10 fornecem a sequência de aminoácidos de enzima de reposição GAA, ou parte biologicamente ativa dela. As sequências exemplares 5'ITR e 3'ITR são respectivamente estabelecidas como SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7. O painel A desta Figura fornece um vetor exemplar para expressão específica do fígado compreendendo um potenciador específico do fígado exemplar (por exemplo, mas não limitado a, Serpina1; estabelecido como SEQ ID NO:9), um promotor específico do fígado exemplar (por exemplo, mas não limitado a, TTR; definido como SEQ ID NO:8), um peptídeo de sinal exemplar: uma sequência de ácido nucleico que codifica o domínio multiterapêutico anti-hCD63scFv::hGAA (SEQ ID NO:10) e uma cauda poli-A. O painel B dessa figura fornece um vetor exemplar semelhante ao mostrado no Painel A com um promotor ubíquo exemplar no lugar do potenciador específico do fígado e sequências promotoras específicas do fígado. O painel C dessa figura fornece um vetor exemplar semelhante ao mostrado no Painel A com um promotor específico do neurônio exemplar no lugar do potenciador específico do fígado (por exemplo, SerpIna1) e promotor (por exemplo, TTR). O painel D dessa figura fornece um vetor exemplar semelhante ao mostrado no Painel A com um promotor específico do neurônio exemplar em combinação com um potenciador específico do fígado (por exemplo, SerpIna1) e promotor (por exemplo, TTR).
[0021] A Figura 1C fornece ilustrações exemplares não limitantes de vetores de expressão que codificam, cada um, uma proteína terapêutica multidomínio como retratada, em que o half-body é um anticorpo anti-CD63, o scFv é um scFv anti-receptor de transferrina humano e em que a enzima de reposição é GAA (por exemplo, anti-hTfRscFv::hGAA).
19 / 136
[0022] A Figura 1D fornece ilustrações exemplares não limitantes de vetores de expressão que codificam, cada um, uma proteína terapêutica multidomínio como retratada, em que o half-body é um anticorpo anti-CD63, em que o scFv é um scFv anti-receptor de transferrina humano (TfR) e o domínio Fc é um Fc de IgG4 humano, e em que a enzima de reposição é GAA (por exemplo, anti-hTfRscFv::hGAA).
[0023] A Figura 1E fornece ilustrações exemplares não limitantes de vetores de expressão que codificam, cada um, uma proteína terapêutica multidomínio representada no Painel H da Figura 1A, em que um dos dois scFv é um scFv anti-CD63 humano, o outro dos dois scFv é um scFv anti- receptor de transferrina humano (TfR) e a enzima de reposição é GAA (por exemplo, anti-hCD63scFv::hGAA::anti-TfRscFV), A Figura 1F fornece ilustrações exemplares não limitantes de vetores de expressão que codificam, cada um, uma proteína terapêutica multidomínio como retratada, em que um dos dois scFv é um scFv anti-CD63 humano, o outro dos dois scFv é um scFv anti-receptor de transferrina humano (TfR) e a enzima de reposição é GAA (por exemplo, anti- hCD63scFv::anti-TfRscFV::GAA ou anti-TfRscFV::anti-hCD63scFv::GAA).
[0024] A Figura 1G fornece ilustrações exemplares não limitantes de vetores de expressão que codificam, cada um, uma proteína terapêutica multidomínio, conforme representado no painel G da Figura 1A, em que o scFv é um scFv anti-receptor de transferrina humano (TfR) e a enzima de reposição é GAA (por exemplo, anti-TfRscFV::GAA).
[0025] A Figura 2 é um gráfico de barras representando a quantidade de glicogênio armazenado em microgramas por miligrama do tecido em função da enzima distribuída. O eixo X representa os tecidos de um camundongo CD63hu/hu; GAA-/- da esquerda para a direita: coração, quadríceps, gastrocnêmio, diafragma, sóleo e músculo extensor longo extensor (EDL). Caixas da faixa 1 representam a quantidade de glicogênio
20 / 136 armazenado em um modelo de doença de Pompe de camundongo não tratado. Caixas da faixa 6 representam a quantidade de glicogênio armazenado em um modelo de camundongo do tipo selvagem não tratado. Caixas da faixa 2 representam a quantidade de glicogênio armazenado em um modelo de doença de Pompe de camundongo tratado com AAV-hGAA (vetor de vírus adeno-associado contendo gene que codifica a GAA humana) em uma dose de 1010 vg. Caixas da faixa 3 representam a quantidade de glicogênio armazenado em um modelo de doença de Pompe de camundongo tratado com AAV-hGAA na dose de 1011 vg. Caixas da faixa 4 representam a quantidade de glicogênio armazenado em um modelo de doença de Pompe de camundongo tratado com AAV-anti-hCD63scFv::hGAA (vetor de vírus adeno-associado contendo gene que codifica um domínio de scFv anti-CD63 humano ligado à GAA humana) na dose de 1010 vg. Caixas da faixa 5 representam a quantidade de glicogênio armazenado em um modelo de doença de Pompe de camundongo tratado com AAV-anti-hCD63scFv::hGAA na dose de 1011 vg.
[0026] A Figura 3 é um gráfico de barras representando o glicogênio médio medido (μg/mg) no tecido muscular esquelético em cada camundongo em 3 meses após a injeção de AAV. Cada medição é representada graficamente em função da exposição à GAA (ou seja, níveis séricos) por camundongo tratado com um construto de enzima específico em uma dosagem particular. Os quadrados cheios representam AAV-hGAA na dose de 1010 vg. As pirâmides preenchidas representam AAV-hGAA na dose de 1011 vg. Pirâmides inversas preenchidas representam AAV-anti- hCD63scFv::hGAA em uma dose de 1010 vg. Os diamantes cheios representam AAV-anti-hCD63scFv::hGAA na dose de 1011 vg.
[0027] A Figura 4 é um gráfico de pontos representando o glicogênio muscular cardíaco médio medido (μg/mg) no tecido cardíaco em 3 meses após a injeção de AAV em função da exposição à GAA (ou seja, níveis
21 / 136 séricos), por camundongo tratado com um construto de enzima específico em uma dosagem particular. Os quadrados cheios representam AAV-hGAA na dose de 1010 vg. As pirâmides preenchidas representam AAV-hGAA na dose de 1011 vg. Pirâmides inversas preenchidas representam AAV-anti- hCD63scFv::hGAA em uma dose de 1010 vg. Os diamantes cheios representam AAV-anti-hCD63scFv::hGAA na dose de 1011 vg.
[0028] A Figura 5 é um gráfico de pontos que descreve títulos de anticorpos anti-GAA em 3 meses após a injeção de AAV em função da exposição à GAA (ou seja, níveis séricos), por camundongo tratado com um construto de enzima específico em uma dosagem particular. Os quadrados abertos representam AAV-hGAA na dose de 1010 vg. Círculos abertos representam AAV-hGAA na dose de 1011 vg. Diamantes abertos representam AAV-anti-hCD63scFv::hGAA na dose de 1010 vg. Hexágonos representam AAV-anti-hCD63scFv::hGAA na dose de 1011 vg.
[0029] A Figura 6 é um gráfico de pontos que descreve títulos de anticorpos anti-GAA em 3 meses após a injeção de AAV em função do construto de enzima e dose. Círculos representam camundongos de controle recebendo vetor AAV vazio. Os quadrados representam AAV-hGAA na dose de 1010 vg. As pirâmides representam AAV-hGAA na dose de 1011 vg. Pirâmides inversa representam AAV-anti-hCD63scFv::hGAA em uma dose de 1010 vg. Os diamantes representam AAV-anti-hCD63scFv::hGAA na dose de 1011 vg.
[0030] A Figura 7A é um gráfico de linha que representa os níveis séricos de GAA (unidades arbitrárias "a.u."; eixo y) em função do tempo em semanas após a injeção do vetor de terapia gênica. Os quadrados (linha inferior) representam AAV-hGAA na dose de 1010 vg. Pirâmides (segundo a partir da linha superior) representam AAV-hGAA na dose de 1011 vg. Pirâmides inversa (terceiro a partir da linha superior) representam AAV-anti- hCD63scFv::hGAA na dose de 1010 vg. Os diamantes (linha superior)
22 / 136 representam AAV-anti-hCD63scFv::hGAA na dose de 1011 vg.
[0031] A Figura 7B é um gráfico de barras que representa razões de mRNA (mRNA de hGAA em relação ao mRNA de mGADPH) após a administração de construtos de AAV em camundongos KO CD63 HumIn GAA (camundongos GAA-/-,CD63hu/hu) ou camundongos GAA+/+,CD63hu/hu, como tal: (1) controle não tratado, (2) promotor específico para o fígado de AAV-hGAA (1e10vg), (3) promotor específico para o fígado de AAV-hGAA (1e11vg), (4) promotor específico para o fígado de AAV-anti-hCD63::hGAA (1e10vg), (5) promotor de AAV específico para o fígado anti-hCD63::hGAA (1e11vg) ou (6) controle não tratado (GAA +/+, CD63hu/hu). A expressão do fígado de GAA foi detectada para todas as injeções de construto AAV.
[0032] A Figura 7C é um gráfico comparando o nível de GAA sérica ao nível de expressão de RNA de GAA para camundongos recebendo o AAV que codifica a proteína de fusão (quadrados) e camundongos recebendo o AAV que codifica GAA (ambos os construtos forneceram um promotor específico ao fígado (LSP) para conduzir a expressão).
[0033] A Figura 7D é um gráfico de barras que mostra hepatócitos humanos Huh-7 transfectados transitoriamente com construtos orientados pelo promotor específicos ao fígado que codificam para hGAA, anti-hCD63 scFv::GAA (construto de fusão) ou um construto de fusão sem ligação scFv::controle de GAA. Ambos construtos de fusão de scFv::GAA tiveram uma razão mais elevada de proteína no sobrenadante secretado do que hGAA sozinha 3 dias após a transfecção. A adição de M6P no sobrenadante durante o período experimental para mitigar a absorção mediada por CI-MPR não afetou a razão. (* = p<0,05, n=3).
[0034] A Figura 7E é um gráfico de barras representando a quantidade de título de soro de GAA em função do vetor entregue. O eixo X representa soro de camundongos KO humanizados para CD63 (GAA-/-
23 / 136 ;CD63hu/hu) que receberam plasmídeos que codificam a fusão GAA ou ScFv-GAA da esquerda para a direita: 1) Controle (sem tratamento); 2) Tratamento com AAV-LSP-hGAA (1e10vg/camundongo); 3) Tratamento com AAV-LSP-hGAA (1e11vg/camundongo); 4) AAV-LSP-anti-CD63:: tratamento com hGAA (1e10vg/camundongo); e 5) AAV-LSP-anti-CD63:: tratamento com hGAA (1e11vg/camundongo).
[0035] A Figura 8 são micrografias fluorescentes representando os lisossomos marcados com lamp1 em fibras do músculo de camundongo contraídas com DAPI para revelar núcleos. Os painéis A e A1 representam células quadríceps derivadas de um camundongo do tipo selvagem não tratado (GAA+/+) e corado para lamp1 (painel A) e núcleos (painel A1). Os painéis B e B1 representam células quadríceps derivadas de um camundongo nulo para GAA (GAA-/-) e corado para lamp1 (painel B) e núcleos (painel B1). Os painéis C e C1 representam células quadríceps derivadas de um camundongo GAA-/- tratado com um construto AAV-hGAA e corado para lamp1 (painel C) e núcleos (painel C1). Os painéis D e D1 representam células quadríceps derivadas de um camundongo GAA-/- tratado com um construto AAV- hCD63scFv::hGAA e corado para lamp1 (painel D) e núcleos (painel D1).
[0036] A Figura 9 retrata gráficos de linha mostrando força de preensão e desempenho de teste Rotarod de camundongos tratados com hGAA de AAV-LSP ou anti-hCD63 AAV-LSP::hGAA. Acelerando as medições de Rotarod (A) e medições de força de preensão do membro anterior (B) de camundongos com GAA tipo selvagem (triângulo invertido), controle não tratado (quadrado), tratamento AAV-LSP-hGAA (1e11vg/camundongo) (triângulo) ou AAV-LSP-anti-hCD63::tratamento com hGAA (1e11vg/camundongo) (círculo) foram tomados em intervalos mensais por 6 meses. As barras de erro são +/- DP. N=8-10 para todos os grupos.
[0037] As Figura 10A e Figura 10B retratam o uso de outras proteínas de membrana como guias, tais como proteínas de fusão de scFv
24 / 136 anti-ITGA7 (Integrina alfa-7) para guiar GAA. A Figura 10A mostra a atividade de GAA (eixo y) de mioblastos de camundongo C2C12 incubados durante a noite com anti-CD63-GAA de camundongo ou anti-ITGA7-GAA de camundongo com ou sem a presença de 5 mM de M6P. A Figura 10B mostra camundongos KO GAA humanizados para CD63 (GAA-/- ;CD63hu/hu) que receberam plasmídeos que codificam um formato scFv::GAA de anti-hCD63::GAA (2) ou um formato IgG4::GAA de comprimento total de anti-integrina alfa-7 de camundongo (3) por liberação hidrodinâmica (HDD), em seguida os níveis de glicogênio de tecido foram medidos 3 semanas após HDD. Camundongos de controle não tratados, GAA- /-;CD63hu/hu (1) e camundongos de controle com GAA tipo selvagem não tratados, GAA+/+;CD63hu/hu (4), também foram testados para níveis de glicogênio nos mesmos tecidos.
[0038] A Figura 11 ilustra a depuração do soro de um anticorpo anti- CD63 de comprimento total fundido para GAA (ou seja, anticorpo IgG4 de comprimento total) em camundongos CD63hu/hu em comparação com camundongos WT CD63+/+. Os plasmídeos que expressam a cadeia pesada e leve de um anticorpo anti-CD63 fundido ao GAA foram injetados através da veia da cauda de cada camundongo. Observou-se que a PK sérica de anti- CD63 (IgG4 de comprimento total)::GAA se depura do soro dentro de 24 horas.
[0039] A Figura 12 é um gráfico de pontos que descreve os níveis séricos de GAA (unidades arbitrárias "a.u."; eixo y) em uma injeção de um mês pós-AAV em função de como uma função do construto enzimático e dose. Os quadrados representam AAV-LSP-∆8GAA. As pirâmides representam AAV-anti-hCD63scFv::GAA. Ambos os construtos forneceram um promotor específico ao fígado (LSP) para conduzir a expressão). A dose é fornecida como genoma viral (vg) por quilograma (kg) do camundongo.
[0040] A Figura 12B fornece dot blots representando os níveis de
25 / 136 glicogênio em microgramas por miligrama de tecido (coração, quadríceps, diafragma ou tricloreto) em função dos níveis séricos de GAA. Os quadrados representam AAV-LSP-∆8GAA. As pirâmides representam AAV-anti- hCD63scFv::GAA. Ambos os construtos forneceram um promotor específico ao fígado (LSP) para conduzir a expressão).
[0041] A Figura 13 é um gráfico de barras representando a quantidade de glicogênio armazenado em microgramas por miligrama do tecido em função da enzima distribuída (estudo de 9 meses). O eixo X representa cada tecido do SNC (medula espinhal, cerebelo ou hipocampo) amostrado a partir de comparadores do tipo selvagem de camundongos (cada Faixa 4) ou camundongos KO (GAA-/-) que não foram tratados (cada Faixa 1), ou plasmídeos que codificam GAA (cada Faixa 2) ou fusão de ScFv-GAA (cada Faixa 3). Foi uma constatação inesperada que os camundongos tratados com proteína de fusão apresentaram uma diminuição mais robusta em armazenamentos de glicogênio no tecido do SNC em comparação com a liberação do vetor que codifica GAA sem qualquer domínio de ligação fundido.
[0042] A Figura 14A é um gráfico que representa a quantidade de glicogênio armazenado por mg de tecido da medula espinhal (ug glicogênio/mg tecido; eixo y) 3 meses após a liberação de AAV de GAA em um construto de vetor específico em uma dose específica (vg= genomas virais). Níveis de glicogênio são fornecidos para camundongos do tipo selvagem (Faixa 1; eixo x) em comparação com os camundongos KO (GAA- /-) que não foram tratados (Faixa 2; eixo x), ou receberam plasmídeos que codificam GAA (cada Faixa 3; eixo x), ou doses variáveis de fusão de anti- CD63ScFv-GAA (Faixas 4-6; eixo x). Níveis de glicogênio armazenados na diminuição da medula espinhal com aumento da dose de fusão de ScFv-GAA, com a dose de 1e11vg proporcionando maior benefício ao sujeito do que uma dose equivalente de GAA sozinho (sem fusão).
26 / 136
[0043] A Figura 14B é um gráfico que representa a quantidade de glicogênio armazenado por mg de tecido cérebro (ug glicogênio/mg tecido; eixo y) 3 meses após a liberação de AAV de GAA em um construto de vetor específico em uma dose específica (vg= genomas virais). Níveis de glicogênio são fornecidos para camundongos do tipo selvagem (Faixa 1; eixo x) em comparação com camundongos KO (GAA-/-) que não foram tratados (Faixa 2; eixo x), ou receberam plasmídeos que codificam GAA (cada Faixa 3; eixo x), ou doses variáveis de fusão anti-CD63ScFv-GAA (Faixas 4-6; eixo x). Níveis de glicogênio armazenados na diminuição cerebral com dose crescente de fusão de ScFv-GAA, com a dose de 1e11vg proporcionando maior benefício ao sujeito do que uma dose equivalente de GAA sozinho (sem fusão).
DESCRIÇÃO
[0044] Esta invenção não está limitada a modalidades, composições, métodos e condições experimentais específicos descritos neste documento, visto que tais modalidades, composições, métodos e condições podem variar. Entende-se também que a terminologia usada neste documento tem o propósito apenas de descrever modalidades específicas, e não se destina a limitar, uma vez que o escopo da presente invenção estará limitado apenas pelas reivindicações anexas.
[0045] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste documento possam ser usados na prática ou no teste da presente invenção, alguns métodos e materiais preferenciais são agora descritos. Todas as publicações citadas neste documento são incorporadas neste documento por referência em sua integralidade. Salvo definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence.
[0046] "Barreira Hematoencefálica" refere-se à barreira da membrana
27 / 136 semipermeável que separa o sangue do cérebro e do fluido extracelular no sistema nervoso central. A barreira bloqueando a passagem de, ou seletivamente transportando, certas substâncias para o cérebro e a medula espinhal. A barreira hematoencefálica é formada por células endoteliais cerebrais.
[0047] "Quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade ou dosagem do vetor entregue a um sujeito de modo que o sujeito atinja um nível sanguíneo consistente (nível soro/plasma) da proteína terapêutica codificada. Geralmente, concentrações de cerca de 1x109 a cerca de 1x1016 vetores de genomas pode ser utilizado no método. A dosagem para distribuição ao fígado pode ser de cerca de 1x1010 a 5x1013 genomas AAV por 1 kg. A dosagem será ajustada para equilibrar o benefício terapêutico de cruzar a barreira hematoencefálica para alcançar o efeito desejado da molécula contra quaisquer efeitos colaterais e tais dosagens podem variar dependendo do vetor recombinante que é empregado. Os níveis de expressão do transgene podem ser monitorados na circulação sanguínea pela extração de soro ou plasma para determinar a frequência de dosagem de vetores que alcançarão um estado estacionário de proteína circulante. Um versado na técnica pode determinar valores específicos para uma quantidade eficaz através de, por exemplo, realizar experimentos para determinar os níveis sanguíneos consistentes de proteína terapêutica ao longo de dias consecutivos, semanas ou meses após a administração do vetor. Experimentos adequados para testar a proteína terapêutica circulante são conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitados a western blot, ELISA, LC-MS, etc. Em um exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de proteína de fusão scFv- GAA no SNC é uma quantidade de vetor viral que produz quantidades suficientes de proteína de fusão scFv-GAA para reduzir o glicogênio armazenado no tecido do SNC, por exemplo, no tecido da medula espinhal, do cerebelo ou do hipocampo.
28 / 136 Distúrbios do Sistema Nervoso Central
[0048] Vários distúrbios cerebrais podem se beneficiar do modo de administração de proteínas terapêuticas descritas neste documento. Distúrbios e distúrbios do sistema nervoso central com sintomas neurológicos que podem ser tratados com terapias de proteína incluem, entre outros: Alzheimer, câncer do cérebro, doença de Behcet, lúpus cerebral, doença de Creutzfeldt-Jakob, demência, epilepsia, encefalite, Ataxia de Friedreich, Síndrome de Guillain- Barre, Doença de Gaucher, dor de cabeça, hidrocefalia, doença de Huntington, hipertensão intracraniana, leucodistrofia, enxaqueca, miastenia gravis, distrofia muscular, esclerose múltipla, narcolepsia, neuropatia, síndrome de Prader-Willi, doença de Parkinson, Síndrome de Rett, síndrome das pernas inquietas, distúrbios do sono, hemorragia subaracnoidea, acidente cerebrovascular, lesão traumática do cérebro, neuralgia do trigêmeo, ataque isquêmico transitório e Síndrome de Von Hippel-Lindau (angiomatose).
[0049] A administração da fusão de anti-CD63 de uma proteína terapêutica ao SNC pode ser particularmente benéfica devido à sua expressão ubíqua, sua função como uma proteína membranar de vesículas extracelulares (EVs; por exemplo, exossomas) e associação com integrinas. Outros receptores de superfície celular com propriedades semelhantes como efetores de internalização incluem: ITGA7, CD9, CD63, CD81, CD82 e CD151, e podem ser específicos a tipo de tecido ou célula para melhorar a localização desejada da absorção, conforme discutido em todo o relatório descritivo.
[0050] A administração da fusão de anti-transferrina de uma proteína terapêutica ao SNC também mostrou ser particularmente benéfica. O tráfego e a distribuição de proteínas terapêuticas, portanto, serão intensificados pelo uso de mecanismos de distribuição, tais como a fusão do anti-receptor a alvos específicos de barreira hematoencefálica (BHE). Alguns alvos na BHE foram mostrados como benéficos para a absorção do SNC (Zuchero, et al., 6 de janeiro de 2016, Neuron, 89(1): 70-82; Boado, RJ et al, Mol Pharm. 2014 Aug
29 / 136 4; 11(8): 2928–2934; cada um dos quais referência é incorporado neste documento em sua totalidade por referência). Outros receptores de superfície celular com propriedades de absorção pela BHE similares aos receptores de transferrina incluem, mas não estão limitados a: receptor de insulina, CD98 e Basigina (Bsg).
[0051] Em algumas modalidades, a distribuição direcionada da proteína terapêutica ao tecido do SNC (por exemplo, cérebro) é empregada pelo uso de um anti-receptor de transferrina ou anti-receptor de insulina, ou anti-CD98 ou anti-Bsg. A proteína terapêutica também pode ser fundida a um anticorpo efetor de internalização, conforme discutido neste documento em toda a especificação. Em algumas modalidades, a distribuição direcionada da proteína terapêutica ao SNC e aos tecidos periféricos é empregada pelo uso de um domínio de liberação anti-receptor de insulina, por exemplo, para melhorar tanto a absorção cerebral quanto a absorção periférica (Boado, RJ et al, 2014, supra; Yu et al., 25 Maio 2011, Science Transl Med. 3:84ra44, cada uma das quais referência é incorporada neste documento em sua totalidade por referência).
[0052] Exemplos de anticorpos anti-receptor de transferrina, anti- receptor de insulina, anti-CD98 e anti-Bsg, e suas porções que podem ser úteis como parte de uma proteína terapêutica multidomínio, conforme descrito neste documento, são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, US20170174778; US20150196663; US9629801; US20180002433; WO2016081643; US20180134797; WO2014189973; US20150110791; US9708406; US20170260292; WO2016081640; US20180057604; US9611323; WO2012075037; WO2018210898, US20180344869, US20180282408, US20170051071, WO2016207240, WO2015101588, US20160324984; US20180222993; WO2017055542; US20180222992; WO2017055540; Cabezon, I., et al. Mol Pharm. 2015 Nov 2;12(11):4137-45; Yu YJ, et al. Sci Transl Med (2014) 6:261ra154; Couch, et al. Sci Transl
30 / 136 Med. 2013 May 1;5(183):183ra57, 1-12; e Yu et al., 2011, supra, para anticorpos anti-receptor não limitantes exemplares, ver por exemplo, WO2017214456, WO2017214458, WO2017214462; WO2008017828; WO2015146132; WO2016094566; WO2013078377; WO2017026497; Hayes GM et al. Int. J. Cancer (2015) 137:710-20; e Bixby, et al. American Society Hematology 2015 Meeting, Abstract# 3809, para anticorpos anti-CD98 não limitantes exemplares; ver, por exemplo, WO2011112566; US20110223176; US20140079711; WO2010036460; US8618264; WO2005092381; WO2018165619; e WO2017186182 para anticorpos anti-BSG não imitantes exemplares; ver, por exemplo, US8974791; WO2013081706; US20160152719; US20160208006; US20170114152; Pardridge, WM et al. BioDrugs. 2018 Apr;32(2):169-176; Boado RJ et al. Mol. Pharm.(2016) 13:3241-6; Cieniewicz AM, et al. Diabetes (2017) 66:206-217; Bexwada, P. et al. J Pharmacol Exp Ther. 2016 Feb;356(2):466-73; e Bedinger, DH, et al. J Pharmacol Exp Ther. 2015 Apr;353(1):35-43 para anticorpos anti-receptor de insulina não limitantes exemplares; cada um das referências são incorporadas neste documento em sua totalidade por referência). Um versado na técnica poderia ligar prontamente esses anticorpos bem conhecidos, ou porções de ligação a antígeno dos mesmos (por exemplo, scFv derivadas da mesma) a uma proteína terapêutica conforme descrito neste documento para fazer e usar uma proteína terapêutica multidomínio, conforme descrito neste documento. Doenças de Armazenamento Lisossômico
[0053] “Doenças de deficiência enzimática” incluem doença do armazenamento não lisossômico, como a doença de Krabbe (galactoilceramidase), fenilcetonúria, galactosemia, doença da urina do xarope de bordo, distúrbios mitocondriais, ataxia de Friedreich, síndrome de Zellweger, adrenoleucodistrofia, doença de Wilson, hemocromatose, deficiência de ornitina transcarbamilase, acidemia metilmalônica, acidemia propiônica e doenças do armazenamento lisossômico. "Doenças de
31 / 136 armazenamento lisossômico" incluem qualquer distúrbio resultante de um defeito na função do lisossoma. Atualmente, aproximadamente 50 distúrbios do armazenamento lisossômico foram identificados, dentre os quais os mais conhecido incluem doenças de Tay-Sachs, Gaucher, e Niemann-Pick. As patogenias das doenças são atribuídas ao acúmulo de produtos incompletos da degradação no lisossoma, geralmente devido à perda da função da proteína. As doenças do armazenamento lisossômico são causadas pela perda de função ou por variantes atenuadas nas proteínas cuja a função normal é degradar ou coordenar a degradação de conteúdos lisossomais. As proteínas afiliadas com doenças de armazenamento lisossômico incluem as enzimas, os receptores e outras proteínas da transmembrana (por exemplo, NPC1), proteínas modificadoras pós-translacional (por exemplo, sulfatase), proteínas do transporte de membrana, e cofatores não-enzimáticos e outras proteínas solúveis (por exemplo, ativador de gangliosídeo GM2). Assim, as doenças do armazenamento lisossômico abrangem mais do que aqueles distúrbios causados pelas enzimas defeituosas per se, e incluem todo o distúrbio causado por qualquer defeito molecular. Assim, como usado neste documento, o termo “enzima” deve abranger aquelas outras proteínas associadas com as doenças do armazenamento lisossômico.
[0054] A natureza da lesão molecular afeta a gravidade da doença em muitos casos, isto é, a perda de função completa tende a ser associada com início pré-natal ou neonatal, e envolve sintomas graves; a perda de função parcial é associada com a doença mais suave (relativamente) e início mais tardio. De forma geral, somente uma porcentagem pequena da atividade necessita ser restaurada para corrigir defeitos metabólicos em células deficientes. Tabela 1 lista algumas das doenças de armazenamento lisossômico mais comuns e suas proteínas de perda de função associadas. As doenças do armazenamento de Lisossomal são descritas geralmente em Desnick e Schuchman, 2012.
32 / 136
[0055] As doenças do armazenamento lisossômico são uma classe de doenças raras que afetam a degradação de uma miríade de substratos no lisossoma. Estes substratos incluem esfingolipídios, mucopolissacarídeos, glicoproteínas, glicogênio e oligossacarídeos, que podem se acumular nas células daqueles que sofrem da doença, levando à morte celular. Os órgãos afetados por doenças do armazenamento lisossômico incluem o sistema nervoso central (SNC), o sistema nervoso periférico (SNP), os pulmões, o fígado, os ossos, os músculos esquelético e cardíaco, e o sistema reticuloendotelial.
[0056] As opções para o tratamento de doenças do armazenamento lisossômico incluem terapia de reposição enzimática (ERT), terapia de redução do substrato, terapia mediada por acompanhante farmacológico, terapia de transplante de células-tronco hematopoiéticas, e terapia gênica. Um exemplo de terapia de redução do substrato inclui o uso de Miglustat ou Eliglustat para tratar doença de Gaucher Tipo 1. Estas drogas agem bloqueando a atividade de sintase, que reduz a produção subsequente de substrato. A terapia de células-tronco hematopoiéticas (HSCT), por exemplo, é usada para melhorar e desacelerar o fenótipo negativo do sistema nervoso central em pacientes com algumas formas de MPS. Vide R.M. Boustany, “Lysosomal storage diseases--the horizon expands,” 9(10) Nat. Rev. Neurol. 583-98, Oct. 2013; cada uma das quais é incorporada neste documento por referência em sua totalidade. A Tabela 1 lista algumas doenças do armazenamento lisossômico e suas enzimas ou outras proteínas associadas. Tabela 1: Doenças de Armazenamento Lisossômico Classe Doença Enzima/Proteína Envolvida Doença de Fabry α-Galactosidase A Lipogranulomatose de Farber Ceramidase Doença de Gaucher tipo I β-Glicosidase Doença de Gaucher tipos II e III Ativador de Saposina-C Doenças de Niemann-Pick tipos A e B Esfingomielinase Esfingolipidoses GM1-gangliosidose β-Galactosidase GM2-gangliosidose (Sandhoff) β-Hexosaminidase A e B GM2-gangliosidose (Tay-Sachs) β-Hexosaminidase A GM2-gangliosidose (deficiência do ativador de Proteína Ativadora de GM2 GM2)
33 / 136 Classe Doença Enzima/Proteína Envolvida GM3-gangliosidose GM3 sintase Leucodistrofia metacromática Arilsulfatase A Deficiência de ativador esfingolipídico Ativador esfingolipídico Mucopolissacaridos MPS I (doença de Scheie, de Hurler-Scheie, e de α-Iduronidase es Hurler) MPS II (Hunter) Iduronidase-2-sulfatase MPS IIIA (Sanfilippo A) Heparan N-sulfatase MPS IIIB (Sanfilippo B) N-acetil-α-glicosaminidase MPS IIIC (Sanfilippo C) Acetil-CoA; α-glicosamida N- acetiltransferase MPS IIID (Sanfilippo D) N-acetilglicosamina-6- sulfatase MPS IVA (Síndrome de Morquio A) N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatase MPS IVB (Síndrome de Morquio B) β-Galactosidase MPS VI (Maroteaux-Lamy) N-acetilgalactosamina-4-sulfatase (arilsulfatase B) MPS VII (doença de Sly) β -Glucuronidase MPS IX Hilauronidase Doença do Pompe (doença do armazenamento de glicogênio α-glicosidase 2 armazenamento de tipo II) glicogênio Metabolismo Deficiência de lipase ácida lisossômica (LAL-D; Lipase ácida lisossômica lipídico doença de Wolman)
[0057] Duas das LSDs mais comuns são a doença de Pompe e a doença de Fabry. A doença de Pompe, cuja incidência estimada é de 1 em
10.000, é causada pela enzima alfa-glicosidase (GAA) lisossômica defeituosa, o que resulta em processamento deficiente do glicogênio lisossômico. O acúmulo do glicogênio lisossômico ocorre predominantemente em tecidos esqueléticos, cardíacos, e hepáticos. O início da doença de Pompe na infância causa cardiomegalia, hipotonia, hepatomegalia e morte devido a falha respiratória, em geral antes dos 2 anos de idade. O início da doença de Pompe na idade adulta pode ocorrer da segunda à sexta década de vida e envolve geralmente somente o músculo esquelético. Os tratamentos disponíveis atualmente incluem MYOZYME®/LUMIZYME® (alglucosidase alfa) da Genzyme, que é uma alfa-glicosidade humana recombinante produzida em células CHO e administrada por infusão intravenosa.
[0058] A doença de Fabry, que tem, inclusos casos de início tardio leves, uma incidência estimada de 1 a cada 3.000, é causada pela enzima alfa- galactosidase A (GLA) lisossômica defeituosa, o que resulta no acúmulo de globotriaosilceramida dentro dos vasos sanguíneos e outros tecidos e órgãos.
34 / 136 Os sintomas associados à doença de Fabry incluem dor proveniente de danos nos nervos e/ou pequenas obstruções vasculares, insuficiência renal e eventualmente falência renal, complicações cardíacas tais como pressão sanguínea alta e cardiomiopatia, sintomas dermatológicos tais como formação de angioqueratomas, anidrose ou hiperidrose, e problemas oculares tais como córnea verticilata, catarata do tipo cortical, e abnormidades do tipo conjuntival e retiniana vascular. Os tratamentos atualmente disponíveis incluem FABRAZYME® (agalsidase beta) da Genzyme, que é uma alfa- galactosidase A humana recombinante produzida em células CHO e administrada por infusão intravenosa; REPLAGAL™ (agalsidase alfa) da Shire, que é uma alfa-galactosidase A humana recombinante produzida em células de fibroblasto humano e administrada por infusão intravenosa; e GALAFOLD™ (migalastat ou 1-desoxgalactonojirimicina), uma pequena molécula administrada oralmente que altera o enovelamento de alfa- galactosidase A anormal para uma conformação funcional.
[0059] Os tratamentos atuais para doenças do armazenamento lisossômico não são ideais. Por exemplo, a ERT geralmente deve ser administrada em alta frequência e em uma dose elevada, tal como bissemanal e até 40 mg/kg. Além disso, algumas enzimas repostas podem ser imunologicamente reativas de forma cruzada (CRIM), estimulando a produção de IgG no sujeito e assim prejudicando a entrega da enzima ao lisossoma através do receptor de manose-6-fosfato (M6P). As IgGs podem blindar os resíduos de M6P contra a enzima de reposição, e o complexo do antígeno-IgG-anticorpo pode ser conduzido aos lisossomas celulares por meio do receptor Fc, desviando assim a enzima de reposição preferencialmente a macrófagos.
[0060] A administração de enzimas de reposição aos tecidos afetados adequados também é ineficiente (vide Tabela 2 e Desnick & Schuchman, “Enzyme replacement therapy for lysosomal diseases: lessons from 20 years
35 / 136 of experience and remaining challenges,” 13 Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 307-35, 2012), cuja referência é incorporada neste documento em sua totalidade por referência. Por exemplo, os pacientes que submetem-se a longo prazo à terapia de reposição enzimática para Pompe infantil podem ainda sofrer de fala hipernasal, fraqueza muscular residual, ptose, osteopenia, perda de audição, risco de aspiração, disfagia, arritmia cardíaca e dificuldade de deglutição. As doses de enzima de reposição frequentemente precisam ser aumentadas ao longo do tempo para 40 mg/kg semanalmente ou duas vezes por semana. Tabela 2: Direcionamento a tecido ineficiente por parte da ERT Doença Subtipo(s) Fácil alcance do tecido Difícil alcance do tecido Tipo 1 Baço, fígado, medula óssea Osso Doença de Gaucher Tipos 2 e 3 Baço, fígado, medula óssea Osso, cérebro Início clássico e Endotélio vascular Rim, coração Doença de Fabry tardio Mucopolisacaridoses Todos Baço, fígado, medula óssea Osso, cérebro, cartilagem α-Manosidose --- Baço, fígado, medula óssea Osso, cérebro Doença de Niemann-Pick Tipo B Baço, fígado, medula óssea Macrófagos Alveolares Infantil --- Coração, músculo liso e esquelético Doença de Pompe Início tardio --- Músculo liso e músculo esquelético respiratório
[0061] O receptor de manose-6 fosfato (MPR) endógeno media o transporte da maior parte das enzimas recombinantes para o lisossoma. Duas formas complementares de MPR existem: uma independente de cátion (CI- MPR), e uma dependente de cátion (CD-MPR). Os nocautes de ambas as formas ordenaram enzimas lisossomais de maneira errônea. As hidrolases lisossomais são sintetizadas na retícula endoplasmática e movem-se para a rede cis-Golgi, onde são covalentemente modificadas pela adição de grupos manose-6-fosfato (M6P). A formação deste marcador depende do efeito sequencial de duas enzimas lisossomais: UDP-N-acetilglicosamina-l- fosfotransferase (G1cNac-fosfotransferase) e N-acetilglicosamina-l- fosfodiester-α-N-acetil-glicosaminidase (enzima de detecção). A GlcNac- fosfotransferase catalisa a transferência de um resíduo de G1cNAc-1-fosfato de UDP-G1cNAc a posições C6 de manoses selecionadas em
36 / 136 oligossacarídeos de teor elevado de manose das hidrolases. A enzima de detecção remove então o G1cNAc terminal, expondo o sinal de reconhecimento de M6P. Na rede trans-Golgi, o sinal de M6P permite a segregação de hidrolases lisossomais de todos os outros tipos de proteínas através da ligação seletiva aos receptores de M6P. As vesículas revestidas com clatrina produzidas brotam da rede trans-Golgi e se fundem com endossomas tardios. No pH baixo do endossoma tardio, as hidrolases de dissociam dos receptores de M6P e os receptores vazios são reciclados ao aparelho de Golgi para turnos adicionais de transporte.
[0062] À exceção da β-glicocerebrosidase, que é entregue através do receptor de manose, enzimas lisossomais recombinantes compreendem glicosilação de M6P e são entregues ao lisossoma primeiramente via CI- MPR/IGF2R. A entrega da reposição de enzima mediada por glicosilação/CI- MPR entretanto não alcança todos os tecidos clinicamente relevantes (Tabela 2). As melhorias à terapia de reposição enzimática centraram-se em melhorar a distribuição de CI-MPR por meio de (i) aumento da expressão de superfície de CI-MPR usando o agonista de β2 clembuterol (Koeberl et al., “Enhanced efficacy of enzyme replacement therapy in Pompe disease through mannose- 6-phosphate receptor expression in skeletal muscle,” 103(2) Mol. Genet. Metab. 107-12, 2011), (ii) aumento da quantidade de resíduos de M6P na enzima (Zhu et al., “Conjugation of mannose-6-phosphate-containing oligosaccharides to acid alpha-glicosidase improves the clearance of glycogen in Pompe mice,” 279(48) J. Biol. Chem. 50336-41, 2004), ou (iii) fusão de um domínio IGF-II à enzima (Maga et al., “Glycosylation-independent lysosomal targeting of acid alpha-glicosidase enhances muscle glycogen clearance in Pompe mice,” 288(3) J. Biol. Chem. 1428-38, 2013), que está incorporado integralmente neste documento por referência).
[0063] Um grande número doenças do armazenamento lisossômico são tratadas inadequadamente por terapia da reposição enzimática ou terapia
37 / 136 gênica, principalmente devido a mau direcionamento da enzima de reposição ao órgão ou tecido relevante, reações imunológicas negativas no hospedeiro recebedor, e meia-vida sérica baixa. Há uma necessidade de terapias de reposição enzimática aprimoradas, que melhorem e promovam melhor biodistribuição de tecidos e absorção lisossômica da enzima, particularmente no cérebro e medula espinhal sem injeções intratecais indesejáveis. Os depositantes desenvolveram uma terapia de reposição enzimática aprimorada utilizando liberação guiada por proteína independente de CI-MPR de enzimas e expressão do fígado para fornecer enzima ao lisossoma de tecidos afetados, particularmente tecidos do SNC.
[0064] As doenças do armazenamento lisossômico podem ser categorizadas de acordo com o tipo de produto que acumula dentro do lisossoma defeituoso. Esfingolipidoses é uma classe das doenças que afetam o metabolismo dos esfingolipídios, que são lipídios que contêm os ácidos graxos ligados aos amino álcoois alifáticos (revistos em S. Hakomori,“Glycosphingolipids in Cellular Interaction, Differentiation, and Oncogenesis,” 50 Annual Review of Biochemistry 733-764, Julho 1981, cuja referência é incorporada neste documento em sua totalidade por referência). Os produtos acumulados de esfingolipidoses incluem gangliosídeos (por exemplo, doença de Tay-Sachs), glicolipídios (por exemplo, doença de Fabry) e glicocerebrosídeos (por exemplo, doença de Gaucher).
[0065] Mucopolissacaridoses são um grupo das doenças que afetam o metabolismo de glicosaminoglicanos (GAGS ou mucopolissacarídeos), que são cadeias não ramificadas longas de dissacarídeos repetidos que ajudam na construção de osso, cartilagem, tendões, córneas, pele e tecido conectivo (revisados em J. Muenzer, “Early initiation of enzyme replacement therapy for the mucopolysaccharidoses,”111(2) Mol. Genet. Metab. 63-72 (Feb. 2014); Sasisekharan et al., “Glycomics approach to structure-function relationships of glycosaminoglycans,” 8(1) Ann. Rev. Biomed. Eng. 181-231
38 / 136 (Dec. 2014); cada um dos quais é incorporado neste documento em sua totalidade por referência). Os produtos acumulados dos mucopolissacaridoses incluem o sulfato de heparano, o sulfato dermatano, o sulfato de queratina, várias formas de sulfato do condroitina e o ácido hialurônico. Por exemplo, a síndrome de Morquio A ocorre devido a um defeito na enzima lisossômica galactose-6-sulfato sulfatase, que resulta no acúmulo lisossômico do sulfato de queratina e do sulfato de condroitina 6.
[0066] As doenças de armazenamento de glicogênio (também conhecida como glicogenose) resultam da inabilidade de uma célula em metabolizar (fazer ou quebrar) o glicogênio. Metabolismo do glicogênio é moderado por várias enzimas ou outras proteínas, incluindo a glicose-6- fosfatase, ácido Alfa-glicosidade, enzima de ramificação de glicogênio, enzima de desramificação de glicogênio, glicogênio fosforilase muscular, glicogênio fosforilase hepática, fosfofrutoquinase muscular, fosforilase quinase, transportador de glicose, aldolase A, beta-enolase e glicogênio sintase. Uma doença do armazenamento lisossômico / do armazenamento de glicogênio é a doença de Pompe, em que o ácido alfa-glicosidade defeituoso faz com que o glicogênio acumule nos lisossomas. Sintomas incluem o hepatomegalia, fraqueza muscular, falha de coração, e no cada da variante infantil, morte na idade de 2 anos (ver DiMauro e Spiegel, “Progressand problems in muscle glycogenosis,” 30(2) Acta Myol. 96-102 (Outubro de 2011), cuja referência é incorporada neste documento em sua totalidade por referência).
[0067] "Proteína terapêutica multidomínio" inclui (i) uma única proteína que contém mais de um domínio funcional, (ii) uma proteína que contenha mais de uma cadeia de polipeptídeo e (iii) uma mistura de mais de uma proteína ou de mais de um polipeptídeo. O termo "polipeptídeo" refere- se a uma molécula que compreende um polímero de aminoácidos ligados entre si mediante ligações peptídicas. A proteína do termo abrange o termo
39 / 136 polipeptídeo, mas inclui também estruturas mais complexas. Isto é, um único polipeptídeo é uma proteína, e uma proteína pode conter um ou mais polipeptídeos associados em uma estrutura de uma ordem mais elevada. Por exemplo, a hemoglobina é uma proteína que contém quatro polipeptídeos: dois polipeptídeos alfa-globina e dois polipeptídeos beta-globina. A Mioglobina é também uma proteína, mas contém somente um único polipeptídeo de mioglobina.
[0068] A proteína terapêutica multidomínio compreende um ou mais polipeptídeos e pelo menos dois domínios que fornecem duas funções. Um desses domínios é o "domínio enzimático" que fornece a substituição de uma atividade de proteína defeituosa associada a uma doença de deficiência enzimática. O outro desses domínios é o "domínio de liberação" que fornece ligação a um efetor de internalização. Assim, um único polipeptídeo que fornece uma atividade de reposição enzimática e a capacidade de se ligar a um efetor de internalização (também conhecido como proteína de ligação a efetor de internalização (atividade de domínio de liberação)) é uma proteína terapêutica multidomínio. Também, uma mistura das proteínas, em que uma proteína proporciona a função da enzima e uma outra proteína proporciona a atividade de ligação ao efetor de internalização, é uma proteína terapêutica multidomínio. A Figura 1A representa vários exemplos de proteínas terapêuticas multidomínio. Em um exemplo (Figura 1, Painel A), a proteína terapêutica multidomínio contém uma enzima (representada pelo hexágono) e um anticorpo biespecífico (o IE-BP) que liga a enzima (linhas tracejadas) e um efetor de internalização (linhas contínuas). Aqui, um braço do anticorpo biespecífico se liga de forma não covalente à enzima, e o outro braço se lida de forma não covalente ao efetor de internalização, permitindo desse modo a internalização da enzima de reposição na célula ou no compartimento subcelular. Em um outro exemplo (painel B), a proteína terapêutica multidomínio compreende uma única proteína que contém dois polipeptídeos,
40 / 136 um polipeptídeo que tem a função de enzima e outro que tem a função de domínio de liberação. Aqui, a enzima é fundida a um domínio de Fc do imunoglobulina ou a uma região constante de cadeia pesada, que se associa com o domínio Fc do semi-anticorpo de enzima para dar forma à proteína terapêutica multidomínio. A modalidade descrita no painel B é similar àquela no painel A, exceto que a enzima está unida de forma covalente a um dos semi-anticorpos, e não por interação do antígeno-anticorpo no domínio variável da imunoglobulina do semi-anticorpo.
[0069] Em outros exemplos, a proteína terapêutica multidomínio consiste na enzima covalentemente ligada (direta ou indiretamente através de um ligante) ao domínio de liberação. Em uma modalidade, a enzima é unida ao terminal C de uma molécula de imunoglobulina (por exemplo, a cadeia pesada ou, alternativamente, cadeia leve). Em uma outra modalidade, a enzima é unida ao terminal N da molécula de imunoglobulina (por exemplo, a cadeia pesada ou, alternativamente, cadeia leve). Nestes exemplos, a molécula do imunoglobulina é o domínio de liberação. Em ainda outra modalidade, a enzima é anexada ao terminal C de uma molécula de scFv que se liga ao efetor de internalização.
[0070] Em uma modalidade, a proteína terapêutica multidomínio compreende pelo menos dois e, em algumas modalidades, não mais que dois domínios de liberação, cada um dos quais é direcionado para um epítopo distinto, seja no mesmo antígeno ou em dois antígenos diferentes. Em uma modalidade, o primeiro domínio de liberação se liga a uma molécula de tráfego lisossômico ou outro efetor de internalização (por exemplo, CD63) ou outro receptor de superfície celular similar, tal como ITGA7, CD9, CD63, CD81, CD82 ou CD151. Em outra modalidade, o segundo domínio de liberação se liga a um efetor de transcitose para facilitar o transporte transcelular da proteína terapêutica multidomínio. Em uma modalidade, o efetor de transcitose é inter alia um receptor de LDL, um receptor de IgA, um
41 / 136 receptor de transferrina ou um receptor de Fc neonatal (FcRn). Em uma modalidade específica, o domínio de liberação de transcitose compreende uma molécula que se liga a um receptor de transferrina, tal como, por exemplo, um anticorpo anti-receptor de transferrina ou uma molécula de scFv anti-receptor de transferrina. Tuma e Hubbard, “Transcytosis: Crossing Cellular Barriers,” Physiological Reviews, 83(3): 871-935 (1º de julho de 2003) é incorporado neste documento por referência para receptores de superfície celular que mediam a transcitose que são úteis na prática da invenção exposta. Em uma modalidade, um segundo domínio de liberação se liga a um receptor de transferrina, ou outra proteína de superfície celular similar, tal como um receptor de insulina, CD98, ou Basigina (Bsg). Cada proteína terapêutica multidomínio compreendendo pelo menos dois domínios de liberação também compreende pelo menos um domínio de enzima, por exemplo, cada um dos pelo menos dois domínios de liberação podem ou não estar independentemente associados um domínio de enzima de uma forma descrita neste documento (por exemplo, através de uma interação de antígeno- anticorpo, através de uma ligação covalente indireta, por meio de uma ligação covalente indireta etc.), em que pelo menos um dos pelo menos dois domínios de liberação é associado ao domínio enzimático. Além disso, cada um dos pelo menos dois domínios de liberação pode compreender independentemente um anticorpo, um half-body ou um scFv (por exemplo, um scFv fundido com um Fc).
[0071] "Domínio enzimático" ou "enzima" denota qualquer proteína associada à etiologia ou efeito fisiológico de uma doença de deficiência enzimática. Uma enzima inclui a enzima real, a proteína do transporte, o receptor ou a outra proteína que é defeituosa e que é atribuída como lesão molecular que causou a doença. Uma enzima inclui também toda a proteína que puder fornecer uma atividade bioquímica ou fisiológica similar ou suficiente que reponha ou evite a lesão molecular da doença. Por exemplo,
42 / 136 uma “isozima” pode ser usada como enzima. Exemplos de proteínas relacionadas à doença do armazenamento lisossômico incluem aqueles alistados na Tabela 1 como “Enzima/Proteína Envolvida” e qualquer proteína conhecida ou posteriormente descoberta ou outra molécula que evite o defeito molecular da doença de deficiência enzimática.
[0072] Em algumas modalidades, a enzima é uma hidrolase, incluindo esterases, glicosilases, hidrolases que atuam em ligações éter, peptidases, amidases lineares, difosfatases, hidrolases cetona, halogenases, fosfoamidases, sulfo-hidrolases, sulfinases, desulfinases, e similares. Em algumas modalidades, a enzima é uma glicosilase, incluindo glicosidases e N- glicosilases. Em algumas modalidades, a enzima é uma glicosidade, incluindo alfa-amilase, beta-amilase, glicano 1,4-alfa-glucosidase, celulose, endo-1,3 (4) beta-glicanase, inulinase, endo-1,4-beta-xilanase, endo-1,4-b -xilanase, dextranase, quitinase, poligalacturonidase, lisozima, exo-alfa-sialidase, alfa- glicosidase, beta-glicosidase, alfa-galactosidase, beta-manosidase, beta- manosidase, beta-frutofuranosidase, beta-frutofuridasidase endo-1,3-beta- xilosidase de xilano, amilo-alfa-1,6-glicosidase, hialuronoglicosaminidase, hialuronoglicuronidase e similares.
[0073] No caso da doença de Pompe, em que o defeito molecular é um defeito na atividade de α-glicosidase, as enzimas incluem a alfa- glicosidade humana e as “isozimas” como o outras alfa-glicosidases, alfa- glicosidase recombinante modificada, outros glicosidases, glicosidases recombinantes, toda a proteína modificada para hidrolisar um resíduo de alfa- glicose ligada em 1-4 sem redução terminal para liberar uma única molécula de alfa-glicose, qualquer enzima EC 3.2.1.20, hidrolases de carboidrato de pH baixo naturais ou recombinantes para glicogênio ou os amidos, e glicosil hidrolases, tais como o isomaltase de sacarase, glicoamilase de maltase, glicosidade II e alfa-glicosidade neutra.
[0074] Uma "efetora de internalização" inclui uma proteína, em
43 / 136 alguns casos, uma proteína receptora, que é capaz de ser internalizada em uma célula ou que, de outra forma, participa ou contribui para o tráfego retrógrado de membrana. Efetora de internalização, efetor de internalização, receptor de internalização e receptor de internalização são usados permutavelmente neste documento. Em alguns casos, a proteína efetora de internalização é uma proteína que sofre transcitose; ou seja, a proteína é internalizada em um lado de uma célula e transportada para o outro lado da célula (por exemplo, do ápice para a base). Em muitas modalidades, a proteína efetora de internalização é uma proteína expressa na superfície celular ou uma proteína extracelular solúvel. No entanto, a presente invenção também contempla modalidades nas quais a proteína efetora de internalização é expressa dentro de um compartimento intracelular, tal como o endossomo, retículo endoplasmático, Golgi, lisossomo etc. Por exemplo, as proteínas envolvidas no tráfego retrógrado de membrana (por exemplo, vias a partir de endossomos precoce/de reciclagem até a rede trans-Golgi) podem servir como proteínas efetoras de internalização em várias modalidades da presente invenção. Em qualquer caso, a ligação de domínio de liberação a uma proteína efetora de internalização faz com que toda a proteína terapêutica multidomínio e quaisquer moléculas associadas a ela (por exemplo, enzima) também se tornem internalizadas na célula. Conforme explicado abaixo, as proteínas efetoras de internalização incluem proteínas que são diretamente internalizadas em uma célula, bem como proteínas que são indiretamente internalizadas em uma célula.
[0075] As proteínas efetoras de internalização que são diretamente internalizadas em uma célula incluem moléculas associadas à membrana com pelo menos um domínio extracelular (por exemplo, proteínas transmembrana, proteínas ancoradas por GPI, etc.), que sofrem internalização celular, e são preferencialmente processadas através de uma via de degradação e/ou de reciclagem intracelular. Exemplos não limitantes específicos de proteínas
44 / 136 efetoras de internalização que são diretamente internalizadas em uma célula incluem, por exemplo, CD63, MHC-I (por exemplo, HLA-B27), Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, receptor de transferrina, receptor de LDL, receptor da proteína 1 relacionada a LDL, ASGR1, ASGR2, proteína 2 semelhante à proteína precursora amiloide (APLP2), receptor de apelina (APLNR), MAL (mielina e proteína linfocitária, também conhecida como VIP17), IGF2R, ATPase H+ tipo vacuolar, receptor da toxina diftérica, receptor de folato, receptores de glutamato, receptor de glutationa, receptores de leptina, receptores scavenger (por exemplo, SCARA1-5, SCARB1-3, CD36) e semelhantes.
[0076] Em uma modalidade, o efetor de internalização é expresso em vários tipos de tecido e é útil no tratamento onde o direcionamento de ambos o SNC e um tipo de célula periférica é desejado. Efetores de internalizações úteis para o tráfego de ambos os tipos celulares periféricos e de SNC incluem, sem limitação, CD63, MHC-I, H+ ATPase tipo vacuolar, IGF2R, Integrina alfa-7 (ITGA7), LRP5, LRP6, LRP8, Kremen-2, receptor de LDL, receptor de proteína 1 relacionada a LDL, proteína 2 similar à proteína precursora amiloide (APLP2), receptor de apelina (APLNR), PRLR, MAL (mielina e proteína linfocitária (MAL), receptores da toxina diftérica, HBEGF (fator de crescimento semelhante ao EGF ligado à heparina), receptores de glutationa, receptores de glutamato, receptores de leptina e receptores de folato. Em certas modalidades, o efetor de internalização é o receptor de prolactina (PRLR). Foi descoberto que o PRLR é não apenas um alvo para certas aplicações terapêuticas, mas também uma proteína efetora de internalização eficaz na base de sua alta taxa de internalização e regeneração ("turn-over"). O potencial para PRLR como uma proteína efetora de internalização, por exemplo, é ilustrado em W02015/026907, onde é demonstrado, inter alia, que os anticorpos anti-PRLR são internalizados de forma eficaz por células que expressam PRLR in vitro.
45 / 136
[0077] Efetores de internalizações direcionados expressos por diversos tipos celulares podem ser úteis quando do direcionamento de ambos os tipos celulares periféricos e de SNC, por exemplo, no tratamento de uma doença como doença de Fabry, doença de Gaucher, MPS I, MPS II, MPS IIIA, MPS IIIB, MPS IIID, MPS IVB, MPS VI, MPS VII, MPS IX, doença de Pompe, deficiência de lipase ácida lisossômica, leucodistrofia metacromática, doenças de Niemann-Pick tipos A, B e C2, alfa-manosidose, deficiência da neuraminidase, sialidose, aspartilglicosaminúria, deficiência combinada de saposina, doença de Gaucher atípica, lipogranulomatose de Farber, fucosidose e beta-manosidose.
[0078] Em outra modalidade, o efetor de internalização é expresso em alguns tipos de tecido. Em um exemplo, o efetor de internalização pode direcionar preferencialmente o osso e cartilagem. Efetores úteis no tráfego ao SNC, e ao osso ou cartilagem, incluem, sem limitação, Colágeno X, Integrina alfa 10 (ITGA10), receptor 3 do fator de crescimento de fibroblasto (FGFR3), isoforma C do receptor do fator de crescimento de fibroblasto (FGFR3C), proteína 1 de ligação de hialuronano e proteoglicano (CRTL1), Agrecano, Colágeno II e Kremen-1. Tais efetores são úteis no tratamento onde se deseja direcionar o SNC e o esqueleto e cartilagem.
[0079] O direcionamento de efetores de internalização preferencialmente expressos por ossos e cartilagem pode ser útil onde se deseja que o SNC e o esqueleto e cartilagem sejam, por exemplo, no tratamento da doença, tal como MPS I, MPS II, MPS IIIA, MPS IIIB, MPS IIID, MPS IVA, MPS IVB, MPS VI, MPS VII, MPS IX, beta manidose, doença de Gaucher, doença atípica de Gaucher, deficiência de saposina combinada, aspartilglicosaminúria, lipogranulomatose de Farber, Sialidose, deficiência de Neuraminidase, mucopolissacaridoses e alfa-manosidose.
[0080] Em ainda outra modalidade, o efetor de internalização é expresso preferencialmente em um tecido ou tipo de célula particular, como
46 / 136 macrófagos, monócitos e microglia. Efetores úteis para o tráfego a SNC e a macrófagos incluem, sem limitação, receptor scavenger A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3, CD36, MSR1 (receptor scavenger de macrófagos 1), MRC1 (receptor 1 de manose de macrófagos), VSIG4 (proteína 4 contendo domínio de imunoglobulina e conjunto V), CD68 (macrosialina), e CSF1R (receptor do fator estimulador de colônias de macrófagos 1). Tais efetores são úteis ao tratamento onde se deseja direcionar o SNC e macrófagos. Macrófagos do SNC podem ser referidos como microglia.
[0081] O direcionamento de efetores de internalização expressados preferencialmente por macrófagos (monócitos ou microglia) pode ser útil onde o direcionamento de SNC e macrófagos (ou microglia) é desejado, por exemplo, no tratamento da doença, tal como deficiência de lipase ácida lisossômica, doença de Gaucher, doença de Gaucher atípica, deficiência combinada de Saposina e lipogranulomatose de Farber.
[0082] Em determinadas modalidades, o efetor de internalização é um efetor de internalização específico do rim, tal como CDH16 (Caderina-16), CLDN16 (Claudina-16), KL (Klotho), PTH1R (receptor de hormônio da paratireoide), SLC22A13 (membro 13 da família 22 de carreadores de soluto), SLC5A2 (cotransportador 2 de sódio/glicose), e UMOD (Uromodulina).
[0083] Direcionar os efetores de internalização preferencialmente expressos no rim pode ser útil quando se deseja que o SNC e o rim sejam, por exemplo, no tratamento de doenças, tais como doença de Fabry, síndrome de Alport, doença do rim policístico e púrpura trombocitopênica trombótica.
[0084] Em ainda outra modalidade, o efetor de internalização é expresso preferencialmente em um tecido ou tipo de célula específico, tal como o fígado. Efetores úteis no tráfego para o SNC e para o fígado incluem, mas não estão limitados a, ASGR1 e ASGR2. Tais efetores são úteis no tratamento onde se deseja direcionar o SNC e o fígado.
[0085] O direcionamento de efetores de internalização expressados
47 / 136 preferencialmente no fígado pode ser útil onde se deseja direcionar tanto o SNC quanto o fígado, por exemplo, no tratamento de doenças, tais como deficiência de lipase ácida lisossômica, doença de Gaucher, MPS VI, MPS VII, MPS II, doenças de Niemann-Pick tipos A, B e C2, sialidose, deficiência de neuraminidase, doença atípica de Gaucher, deficiência combinada de Saposina, lipogranulomatose de Farber.
[0086] Em algumas modalidades, o efetor de internalização é um internalizador específico do músculo, tal como BMPR1A (receptor de proteína morfogenética óssea 1A), m-caderina, CD9, MuSK (quinase específica de músculo), LGR4/GPR48 (receptor 48 acoplado à proteína G), receptor colinérgico (nicotiníco) alfa 1, CDH15 (Caderina-15), ITGA7 (Integrina alfa-7), CACNG1 (canal de cálcio tipo L subunidade gama-1), CACNAlS (canal de cálcio tipo L subunidade alfa-15), CACNG6 (canal de cálcio tipo L subunidade gama-6), SCN1B (canal de sódio subunidade beta- 1), CHRNA1 (receptor de ACh subunidade alfa), CHRND (receptor de ACh subunidade delta), LRRC14B (proteína 14B contendo repetição rica em leucina), distroglicano (DAG1) e POPDC3 (proteína 3 contendo domínio Popeye).
[0087] Direcionar os efetores de internalização expressados preferencialmente pelo músculo pode ser útil onde se deseja que o tecido nervoso central e o tecido muscular sejam, por exemplo, no tratamento de doenças, tais como doença de Pompe.
[0088] Em algumas modalidades, o efetor de internalização é ITGA7, ITGA10, CD9, CD63, ALPL2, MSR1, ASGR1, ASGR2 ou PRLR. Anticorpos contra ITGA7, ITGA10, CD9, CD63, APLP2, MSR1, ASGR1, ASGR2 ou PRLR são bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, R & D Systems “Integrin alpha 7: Products” para anticorpos anti-IGTA7 exemplares não limitantes; vide, por exemplo, US8048991, US20120034625, US8563255, US20140099716, US20160319023, WO2018138322 e
48 / 136
US10087253 para exemplos não limitantes de anticorpos anti-ITGA10; vide, por exemplo, WO201102982; WO2014185908; US20160115229; WO2017134197; US9738717; e de Goeij BE et al.
Mol.
Cancer Ther. (2016) Nov;15(11):2688-2697 para anticorpos anti-CD63 exemplares não limitantes; vide, por exemplo, US543153A; US5441931A; US5677146A; e US5935854A para anticorpos anti-APLP2 exemplares não limitantes; vide, por exemplo, ficha técnica de R&D Systems para MAB27081; ficha técnica de R&D Systems para AF2708; ficha técnica de AbCam ab1515707; Yu X, et al., J.
Biol.
Chem., 2011;286(21):18795-806; e N Nishijima, et al., Front Immunol, 2017;8(0):379 para exemplos não limitantes de anticorpos anti- MSR1; vide, por exemplo, WO2017058944 para exemplos não limitantes de anticorpo anti-ASGR1; vide, por exemplo, Origene Antibodies for ASGR2 disponível em www.origene.com/category/antibodies?q=ASGR2&sub_category=Primary+A ntibodies&reactivities=Human para anticorpos anti-ASGR2 exemplares não limitantes; vide, por exemplo, US9649374; US9302015; US20130171147; US10106616; WO2015026907; US9777063; WO2011069795; US20130272968; US20140141003; WO2011069799; US20120315276; WO2012163932; US9241989; WO2012136519; WO2011069798; WO2019011719; US8883979; US20140065158; WO2015187596; US9353186; WO2018102304; US20130022606; US9688764; US20130129739; US20160002342; US20150056222; US20150056221; US20170008965; US20150093393; WO2011069797; US20160251442; US20180094066; WO2014036076; US20180185504; US20140271659; WO2011069794; WO2014143909; US20160319029; US9545451; US9023357; US20150252116; WO2011069796 Kelly MP, et al., Mol.
Cancer Ther. (2017) Jul;16(7):1299-1311; Otto C. et al.
Endocrinology (2015) 156:4365-73 2017-01-20; e Andreev J et al., Mol.
Cancer Ther. (2017) Apr;16(4):681-693 para anticorpos anti-PRLR exemplares não limitantes;
49 / 136 cada uma destas referências está incorporada integralmente neste documento por referência). Um versado na técnica poderia ligar prontamente esses anticorpos bem conhecidos, ou porções de ligação a antígeno dos mesmos (por exemplo, scFv derivadas da mesma) a uma proteína terapêutica conforme descrito neste documento para fazer e usar uma proteína terapêutica multidomínio, conforme descrito neste documento.
[0089] Nestas modalidades em que o efetor de internalização (IE) é diretamente internalizado na célula, o domínio de liberação pode ser, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo que se liga especificamente ao IE, ou um ligante ou porção de um ligante que interage especificamente com IE. Por exemplo, se IE for Kremen-1 ou Kremen-2, o domínio de liberação pode compreender ou consistir em um ligante Kremen (por exemplo, DKK1) ou numa porção de ligação a Kremen dele. Como outro exemplo, se IE for uma molécula receptora, tal como ASGR1, o domínio de liberação pode compreender ou consistir em um ligante específico para o receptor (por exemplo, asialo-orosomucoide [ASOR] ou Beta-Ga1NAc) ou numa porção de ligação a receptor dele.
[0090] As proteínas efetoras de internalização que são indiretamente internalizadas em uma célula incluem proteínas e polipeptídeos que não internalizam a si próprios, mas que se tornam internalizados em uma célula após a ligação ou, de outra forma, associação a uma segunda proteína ou polipeptídeo que seja diretamente internalizado na célula. As proteínas que são indiretamente internalizadas em uma célula incluem, por exemplo, ligantes solúveis que são capazes de se ligar a uma molécula receptora de internalização expressa na superfície celular. Um exemplo não limitante de um ligante solúvel que seja (indiretamente) internalizado em uma célula através de sua interação com uma molécula receptora de internalização expressa na superfície celular é a transferrina. Em modalidades em que IE é transferrina (ou outra proteína indiretamente internalizada), a ligação do
50 / 136 domínio de liberação a IE, e a interação de IE com o receptor de transferrina (ou outra molécula receptora de internalização expressa na superfície celular), faz com que todo o domínio de liberação e quaisquer moléculas associadas a este (por exemplo, a enzima), se torne internalizada na célula concomitantemente com a internalização de IE e seu parceiro de ligação.
[0091] Nestas modalidades, nas quais IE é indiretamente internalizado em uma célula, o domínio de liberação pode ser, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, ou um scFv que se liga especificamente a IE, ou um receptor ou porção de um receptor que interage especificamente com a proteína efetora solúvel. Por exemplo, se IE for uma citocina, o domínio de liberação pode compreender ou consistir no receptor de citocina correspondente ou em sua porção de ligação a ligante.
[0092] Um IE exemplar é CD63, que é uma membrana da superfamília de tetraspanina de proteínas de superfície celular que estendem a membrana celular quatro vezes. CD63 é expressa em praticamente todos os tecidos e considera-se que seja envolvida na formação e estabilização de complexos de sinalização. CD63 localiza a membrana celular, a membrana lisossômica e membrana endossômica tardia. Sabe- se que CD63 se associa às integrinas e pode ser envolvida na transição epitelial-mesenquimal. Vide H. Maecker et al., “The tetraspanin superfamily: molecular facilitators,” 11(6) FASEB J. 428-42, Maio de 1997; e M. Metzelaar et al., “CD63 antigen. A novel lysosomal membrane glycoprotein, cloned by a screening procedure for intracellular antigens in eukaryotic cells,” 266 J. Biol. Chem. 3239-3245, 1991; cada uma das quais é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.
[0093] Outro IE exemplar é proteína 2 similar ao precursor de beta amiloide (A4) ("APLP2"), um membro expresso de forma ubíqua da família de APP (proteína precursora amiloide). APLP2 é uma proteína ligada à membrana conhecida por interagir com moléculas do complexo principal de
51 / 136 histocompatibilidade (MHC) de classe I (por exemplo, Kd). Ela liga Kd na superfície da célula e é internalizada de forma dependente da clatrina com Kd a tiracolo. Vide Tuli et al., “Mechanism for amyloid precursor-like protein 2 enhancement of major histocompatibility complex class I molecule degradation,” 284 The Journal of Biological Chemistry 34296 -34307 (2009); cuja referência é incorporada neste documento em sua totalidade por referência.
[0094] Outra IE exemplar é o receptor da prolactina (PRLR). O receptor da prolactina é um membro da família do receptor da citocina tipo I e após a ligação do ligante e a subsequente dimerização ativa "as tirosina quinases Jak2, Fyn e Tec, fosfatase SHP-2, fator de troca de nucleotídeo da guanina Vav e supressor de sinalização SOCS" (vide Clevenger and Kline, “Prolactin receptor signal transduction,” 10(10) Lupus 706-18 (2001), resumo; cujas referências são incorporadas neste documento em sua totalidade por referência.). O receptor da prolactina sofre reciclagem endocitótica e pode ser encontrado em frações lisossomais. Vide Genty et al., “Endocytosis and degradation of prolactin and its receptor in Chinese hamster ovary cells stably transfected with prolactin receptor cDNA,” 99(2) Mol. Cell Endocrinol. 221-8 (1994); e Ferland et al., “The effect of chloroquine on lysosomal prolactin receptors in rat liver,” 115(5) Endocrinology 1842-9 (1984), que é incorporado neste documento em sua totalidade por referência.
[0095] Neste documento, "reação imunológica" geralmente se refere à resposta imunológica do paciente a uma proteína externa ou "não própria". Esta resposta imunológica inclui uma reação alérgica e o desenvolvimento de anticorpos que interferem com a eficácia da enzima de reposição. Alguns pacientes podem não produzir nenhuma proteína não funcional, tornando, assim, a enzima de reposição em uma proteína "estrangeira". Por exemplo, injeção repetida de GLA recombinante (rGLA) para aqueles pacientes com Fabry que carecem de GLA resulta em uma reação alérgica. Em outros
52 / 136 pacientes, a produção de anticorpos contra rGLA mostrou diminuir a eficácia da enzima de reposição no tratamento da doença. Vide, por exemplo, Tajima et al. (“Use of a Modified α-N-Acetylgalactosaminidase (NAGA) in the Development of Enzyme Replacement Therapy for Fabry Disease,” 85(5) Am. J. Hum. Genet. 569-580 (2009)), cuja referência é incorporada neste documento em sua totalidade por referência, que discute o uso de NAGA modificada como "isozima" para repor GLA. A NAGA modificada não tem nenhuma reatividade cruzada imunológica com GLA e "não reage com o soro de um paciente com doença de Fabry tratado com recorrência com GLA recombinante". Id, abstract.
[0096] Um "agente imunossupressor" inclui drogas e/ou proteínas que resultam em imunossupressão geral e podem ser usadas para prevenir materiais imunológicos reativos (CRIM) contra enzimas de reposição, por exemplo, GAA ou GLA, respectivamente, em um paciente com doença de Pompe ou de Fabry. Exemplos não limitantes de um agente imunossupressor incluem metotrexato, micofenolato mofetil, ciclofosfamida, agentes alquilantes de DNA rapamicina, anticorpo anti-CD20, anticorpo anti-BAFF, anticorpo anti-CD3, anticorpo anti-CD4, e qualquer combinação destes.
[0097] Elementos reguladores, por exemplo, promotores, que são específicos a um tecido, por exemplo, fígado, melhoram a expressão de sequências de ácidos nucleicos, por exemplo, genes, sob o controle de tal elemento regulador no tecido para o qual o elemento regulador é específico. Exemplos não limitantes de um elemento regulador específico do fígado, por exemplo, promotores específicos ao fígado, podem ser encontrados em Chuah et al. (2014) Mol. Ther.22:1605-13, cuja referência é incorporada neste documento em sua totalidade por referência.
[0098] O termo "proteína" se refere a qualquer polímero de aminoácido com mais de cerca de 20 aminoácidos covalentemente ligados via ligações amida. As proteínas contêm uma ou mais cadeias poliméricas de
53 / 136 aminoácido, geralmente conhecidas na técnica como "polipeptídeos". Assim, um polipeptídeo pode ser uma proteína e uma proteína pode conter múltiplos peptídeos para formar biomolécula funcional simples. As pontes de dissulfeto (isto é, entre resíduos de cisteína para formar cisteína) podem estar presentes em algumas proteínas. Essas ligações covalentes podem estar dentro de uma única cadeia de polipeptídeo ou entre duas cadeias de polipeptídeo individual. Por exemplo, as pontes de dissulfeto são essenciais para estrutura apropriada e função da insulina, imunoglobulinas, protamina e similares. Para uma revisão recente da formação da ligação de dissulfeto, vide Oka e Bulleid, “Forming disulfides in the endoplasmic reticulum,” 1833(11) Biochim Biophys Acta 2425-9(2013), cuja referência é incorporada neste documento em sua totalidade por referência.
[0099] Neste documento, "proteína" inclui proteínas bioterapêuticas, proteínas recombinantes usadas na pesquisa ou terapia, proteínas trap e outras proteínas de fusão Fc, proteínas quimérica, anticorpos, anticorpos monoclonais, anticorpos humanos, anticorpos biespecíficos, fragmentos de anticorpo, nanobodies, quimeras de anticorpo recombinante, proteínas de fusão scFv, citocinas, quimiocinas, hormônios peptídicos e similares. As proteínas podem ser produzidas usando sistemas de produção à base de célula recombinante, tais como o sistema de baculovírus de inseto, sistemas de levedura (por exemplo, Pichia sp.), sistemas de mamíferos (por exemplo, células CHO e derivados de CHO tipo células CHO-K1). Para uma revisão recente que discute proteínas bioterapêuticas e sua produção vide Ghaderi et al., “Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation,” 28 Biotechnol Genet Eng Rev. 147-75 (2012), que é incorporada neste documento na sua totalidade por referência.
[00100] Neste documento, o termo "anticorpo" inclui moléculas de imunoglobulina que compreendem quatro cadeias polipeptídicas, duas cadeias
54 / 136 pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada compreende uma região variável da cadeia pesada (abreviada neste documento como HCVR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve (abreviada neste documento como LCVR ou VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino ao terminal carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (CDRs de cadeia pesada podem ser abreviadas como HCDR1, HCDR2 e HCDR3; CDRs de cadeia leve podem ser observadas como LCDR1, LCDR2 e LCDR3. O termo anticorpo de "alta afinidade" se refere àqueles anticorpos com uma afinidade de ligação com seu alvo pelo menos 10-9 M, pelo menos 10-10 M; pelo menos 10-11 M; ou pelo menos 10-12 M, como medido por ressonância plasmônica de superfície, por exemplo, BIACORETM ou ELISA de afinidade de solução. O termo "anticorpo" pode abranger qualquer tipo de anticorpo, tal como, por exemplo, monoclonal ou policlonal. Além disso, o anticorpo pode ser ou qualquer origem, como por exemplo, mamífero ou não mamífero. Em uma modalidade, o anticorpo pode ser mamífero ou aviário. Em outra modalidade, o anticorpo pode ser de origem humana e pode ser ainda um anticorpo monoclonal humano.
[00101] A expressão "anticorpo biespecífico" inclui um anticorpo capaz de ligar seletivamente dois ou mais epítopos. Os anticorpos biespecíficos compreendem, geralmente, duas cadeias pesadas diferentes, com cada cadeia pesada ligando especificamente um epítopo diferente - em duas
55 / 136 moléculas diferentes (por exemplo, antígenos) ou na mesma molécula (por exemplo, no mesmo antígeno). Se o anticorpo biespecífico for capaz de ligar seletivamente dois epítopos diferentes (um primeiro epítopo e um segundo epítopo), a afinidade da primeira cadeia pesada com o primeiro epítopo será, geralmente, pelo menos uma a duas ou três ou quatro ordens de magnitude inferiores à afinidade da primeira cadeia com o segundo epítopo e vice-versa. Os epítopos reconhecidos pelo anticorpo biespecífico podem estar no mesmo alvo ou em alvo diferente (por exemplo, na mesma proteína ou em proteínas diferentes). Os anticorpos podem ser feitos, por exemplo, pela combinação de cadeias pesadas que reconhecem epítopos diferentes da mesma região. Por exemplo, as sequências de ácido nucleico que codificam sequências variáveis de cadeia pesada que reconhecem diferentes epítopos do mesmo antígeno podem ser fundidas às sequências de ácido nucleico que codificam regiões constantes de cadeia pesada e tais sequências podem ser expressas em uma célula que expressa uma cadeia leve de imunoglobulina. Um anticorpo biespecífico típico tem duas cadeias pesadas, cada uma com três CDRs de cadeia pesada, seguido por um domínio CH1 (terminal N ao terminal C), uma dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3 e uma cadeia leve de imunoglobulina que não confere especificidade de ligação ao antígeno, mas pode se associar a cada cadeia pesada ou que pode associar a cada cadeia pesada e que possa ligar um ou mais dos epítopos ligados pelas regiões de ligação de antígeno de cadeia pesada ou que pode associar a cada cadeia pesada e possibilitar a ligação de uma ou de ambas as cadeias pesadas a um ou ambos epítopos.
[00102] A frase "cadeia pesada" ou "cadeia pesada de imunoglobulina" inclui uma sequência de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de qualquer organismo e, salvo especificado em contrário, inclui um domínio variável de cadeia pesada. Os domínios variáveis de cadeia pesada incluem três CDRs de cadeia pesada e quatro regiões FR, salvo se especificado em
56 / 136 contrário. Os fragmentos de cadeias pesadas incluem CDRs, CDRs e FRs e suas combinações. Uma cadeia pesada típica tem, seguindo o domínio variável (de N-terminal a C-terminal), um domínio CH1, uma dobradiça, um domínio CH2 e um domínio CH3. Um fragmento funcional de uma cadeia pesada inclui um fragmento que é capaz de reconhecer especificamente um antígeno (por exemplo, reconhecendo o antígeno com um KD em intervalo micromolar, nanomolar ou picomolar), que é capaz de expressar e secretar a partir de uma célula e que compreende pelo menos uma CDR.
[00103] A frase "cadeia leve" inclui uma sequência de região constante de cadeia leve de imunoglobulina de qualquer organismo e, salvo especificado de outro modo, inclui cadeias leves kappa e lambda humanas. Os domínios variáveis de cadeia leve (VL) normalmente incluem três CDRs de cadeia leve e quatro regiões de framework (FR), salvo se especificado de outro modo. Geralmente, uma cadeia leve de comprimento total inclui, do terminal amino ao terminal carboxila, um domínio VL que inclui FR1-CDR1- FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 e um domínio constante de cadeia leve. As cadeias leves que podem ser usadas com esta invenção incluem, por exemplo, aquelas que não se ligam seletivamente ao primeiro ou segundo antígeno seletivamente ligado pela proteína de ligação ao antígeno. As cadeias leves adequadas incluem aquelas que podem ser identificadas pela triagem pelas cadeias leves mais comumente empregadas nas bibliotecas de anticorpos existentes (bibliotecas úmidas ou in silico), onde as cadeias leves não interferem substancialmente na afinidade e/ou seletividade dos domínios de ligação ao antígeno das proteínas de ligação ao antígeno. As cadeias leves adequadas incluem aquelas que podem se ligar a um ou ambos os epítopos que são ligados pelas regiões de ligação ao antígeno da proteína de ligação ao antígeno.
[00104] A frase "domínio variável" inclui uma sequência de aminoácidos de uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina (modificada
57 / 136 conforme desejado) que compreende as seguintes regiões de aminoácidos, na sequência do terminal N para o terminal C (a menos que indicado em contrário): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Um "domínio variável" inclui uma sequência de aminoácido capaz de se dobrar em um domínio canônico (VH ou VL) com uma estrutura de folha beta dupla em que as folhas betas são conectadas pela ligação dissulfeto entre um resíduo de uma primeira folha beta e uma segunda folha beta.
[00105] A frase "região determinante de complementariedade", ou o termo "CDR", inclui uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácido nucleico de genes de imunoglobulina de um organismo que normalmente (isto é, em um animal do tipo selvagem) aparecem entre duas regiões de framework em uma região variável de uma cadeia leve ou pesada de uma molécula de imunoglobulina (por exemplo, um anticorpo ou um receptor de célula T). Uma CDR pode ser codificada, por exemplo, por uma sequência de linhagem germinativa ou por uma sequência rearranjada ou não rearranjada, e, por exemplo, por uma célula B ou célula T madura ou não exposta. Em algumas circunstâncias (por exemplo, para uma CDR3), as CDRs podem ser codificadas por duas ou mais sequências (por exemplo, sequências de linhagem germinativa) que não são contíguas (por exemplo, em uma sequência de ácido nucleico não rearranjada) mas são contíguas em uma sequência de ácido nucleico de célula B, por exemplo, como o resultado de splicing ou ligação das sequências (por exemplo, recombinação V-D-J para formar uma CDR3 de cadeia pesada).
[00106] O termo "fragmento do antígeno" se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno. Exemplos de fragmentos de ligação englobados pelo termo "fragmento do anticorpo" incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios de VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente que compreende
58 / 136 dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd consistindo em domínios de VH e CH1; (iv) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (v) um fragmento dAB (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546, cuja referência é incorporada neste documento em sua totalidade por referência), que consiste em um domínio VH, (vi) CDR isolada e (vii) um scFV, que consiste em dois domínios do fragmento Fv, CL e VH, unido por um ligante sintético para formar uma cadeia de proteína única em que o par de regiões VL e VH forma moléculas monovalentes. Outras formas de anticorpos de cadeia única, tais como diabodies, também são englobadas pelo termo "anticorpo" (vide por exemplo, Holliger et al. (1993) PNAS USA 90:6444-6448; Poljak et al. (1994) Structure 2:1121-1123, cuja referência é incorporada neste documento em sua totalidade por referência).
[00107] A expressão "proteína contendo Fc" inclui anticorpos, anticorpos biespecíficos, imunoadesinas e outras proteínas de ligação que compreendem pelo menos uma porção funcional de uma região CH2 e CH3 da imunoglobulina. “Uma porção funcional” consulta a uma região CH2 e CH3 que pode ligar um receptor de Fc (por exemplo, um FcyR; ou um FcRn, isto é, um receptor neonatal de Fc), e/ou que pode participar na ativação do complemento. Se a região CH2 e CH3 contiver deleções, substituições, e/ou inserções ou outras modificações que rendem incapaz de ligar todo o receptor de Fc e também incapaz de ativar o complemento, a região CH2 e CH3 não é funcional.
[00108] As proteínas que contém Fc podem incluir modificações em domínios de imunoglobulina, incluindo onde as modificações afetam uma ou mais funções efetoras da proteína de ligação (por exemplo, modificações que afetam a ligação de FcyR, ligação de FcRn e, portanto, a meia-vida, e/ou atividade de CDC). Tais modificações incluem, mas não estão limitadas a, as seguintes modificações e combinações dos mesmos, com referência à
59 / 136 numeração da UE de uma região constante de imunoglobulina: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438 e 439.
[00109] Por exemplo, e sem limitação, a proteína de limitação é uma proteína que contém Fc e apresenta meia-vida sérica melhorada (em comparação à mesma proteína que contém Fc sem a(s) modificação(ões) citada(s)) e tem uma modificação na posição 250 (por exemplo, E ou Q); 250 e 428 (por exemplo, L ou F); 252 (por exemplo, L/Y/F/W ou T), 254 (por exemplo, S ou T), e 256 (por exemplo, S/R/Q/E/D ou T); ou uma modificação em 428 e/ou 433 (por exemplo, L/R/SI/P/Q ou K) e/ou 434 (por exemplo, H/F ou Y); ou uma modificação em 250 e/ou 428; ou uma modificação em 307 ou 308 (por exemplo, 308F, V308F), e 434. Em um outro exemplo, a modificação pode compreender uma modificação em 428L (por exemplo, M428L) e 434S (por exemplo, modificação de N434S); uma modificação em 428L, 2591 (por exemplo, V259I), e 308F (por exemplo, modificação de V308F); modificação em 433K (por exemplo, H433K) e modificação em 434 (por exemplo, 434Y); modificação em 252, 254, e 256 (por exemplo, 252Y, 254T, e 256E); uma modificação em 250Q e 428L (por exemplo, T250Q e M428L); uma modificação em 307 e/ou 308 (por exemplo, 308F ou 308P).
[00110] O termo “proteína de ligação ao antígeno,” como usado neste documento, refere-se a um polipeptídeo ou a uma proteína (um ou mais polipeptídeo em complexo em uma unidade funcional) que reconheçam especificamente um epítopo em um antígeno, tal como um antígeno específico a uma célula e/ou um antígeno do alvo da invenção atual. Uma proteína de ligação ao antígeno pode ser multiespecífica. O termo
60 / 136 "multiespecífica", com referência a uma proteína de ligação ao antígeno significa que a proteína reconhece epítopos diferentes, no mesmo antígeno ou em antígenos diferentes. Uma proteína de ligação a antígeno multiespecífica pode ser um polipeptídeo multifuncional único, ou pode ser um complexo multimérico de dois ou mais polipeptídeos que sejam covalente ou não covalentemente associados um com o outro. O termo "proteína de ligação do antígeno" inclui anticorpos ou fragmentos destes da presente invenção que podem ser ligados ou co-expressos com outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento deste pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, pelo acoplamento químico, fusão genética, associação não-covalente ou de outra forma) para uma ou mais outras entidades moleculares, como uma proteína ou fragmento para produzir uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica ou multiespecífica com uma segunda especificidade de ligação.
[00111] Como usado neste documento, o termo "epítopo" refere-se à parte do antígeno que é reconhecido pelo polipeptídeo multiespecífico de ligação ao antígeno. Um único antígeno (por exemplo, um polipeptídeo antigênico) pode ter mais de um epítopo. Os epítopos podem ser definidos como estrutural ou funcional. Epítopos funcionais geralmente são um subconjunto de epítopos estruturais e são definidos como aqueles resíduos que contribuem diretamente para a afinidade da interação entre o polipeptídeo de ligação ao antígeno e o antígeno. Epítopos podem também ser conformacionais, isto é, composto de aminoácidos não lineares. Em determinadas modalidades, os epítopos podem incluir determinantes que são agrupamentos de superfície quimicamente ativos das moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforil ou grupos sulfonil e, em determinadas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características específicas da carga. Epitopos formados de aminoácidos contíguos são retidos tipicamente na exposição para
61 / 136 desnaturalizar solventes, visto que os epítopos formados pelo dobramento terciário são tipicamente perdidos no tratamento com desnaturalização solventes.
[00112] O termo "domínio" refere-se a qualquer parte de uma proteína ou polipeptídeo tendo uma função específica ou estrutura. Preferencialmente, os domínios da presente invenção se ligam a antígenos alvo específicos à célula. Os domínios de ligação específicos à célula ou ao antígeno alvo e similares, como usado neste documento, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, obtenível enzimaticamente, modificado sinteticamente ou geneticamente que se ligam especificamente um antígeno.
[00113] O termo “half-body” ou “semi-anticorpo”, que são usados de forma intercambiável, referem-se à metade de um anticorpo, que contenha essencialmente uma cadeia pesada e uma cadeia leve. As cadeias pesadas de anticorpo podem formar dímeros, assim a cadeia pesada de um half-body pode se associar com a cadeia pesada associada com uma molécula diferente (por exemplo, um outro half-body) ou um outro polipeptídeo que contém Fc. Dois domínios Fc ligeiramente diferentes podem “heterodimerizar” como na formação de anticorpos biespecíficos ou de outros heterodímeros, - trímeros, - tetrâmeros e semelhantes. Ver Vincent e Murini, “Current strategies in antibody engineering: Fc engineering and pH-dependent antigen binding, bispecific antibodies and antibody drug conjugates,” 7 Biotechnol. J. 1444- 1450 (20912); e Shimamoto et al., “Peptibodies: A flexible alternative format to antibodies,” 4(5) MAbs 586-91 (2012), cujas referências são incorporadas neste documento em sua totalidade por referência.
[00114] Em uma modalidade, o domínio variável do half-body reconhece especificamente o efetor de internalização e o domínio de Fc do half-body dimeriza com uma proteína da fusão de Fc que compreende uma enzima de reposição (por exemplo, pepticorpo) Id, 586.
[00115] O termo "fragmento variável de cadeia única" ou "scFv" inclui
62 / 136 um polipeptídeo de fusão de cadeia única contendo uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL). Em algumas modalidades, a VH e VL são conectadas por uma sequência ligante de 10 a 25 aminoácidos. Polipeptídeos de ScFv também podem incluir outras sequências de aminoácidos, tais como regiões CL ou CH1. Moléculas de ScFv podem ser fabricadas por expressão em fagos (“phage display”) ou feitas pela subclonagem direta das cadeias pesadas e leves de um hibridoma ou células B. Ahmad et al., Clinical and Developmental Immunology, volume 2012, artigo ID 98025, é incorporado neste documento por referência para métodos de produção de fragmentos de scFv por expressão em fagos e clonagem de domínio de anticorpo.
[00116] “Alfa-glicosidade” (ou “α-glicosidade”), do “atividade de α- glicosidade”, “GAA”, e “atividade de GAA” são usados de forma intercambiável e referem-se a toda a proteína que facilitar a hidrólise de ligações 1,4-alfa do glicogênio e do amido na glicose. GAA também é conhecida inter alia como EC 3.2.1.20, maltase, glicoinvertase, glicosidosacarase, maltase-glicoamilase, alfa-glicopiranosidase, glicosidoinvertase, alfa-D-glicosidade, alfa-glicosídeo hidrolase, alfa-1,4- glicosidade, e glico-hidrolase de alfa-D-glicosídeo. GAA pode ser encontrada no lisossoma e na borda em escova do intestino delgado. Os doentes que sofrem de doença de Pompe possuem deficiência de α-glicosidade lisossômica funcional. Ver S. Chiba, “Molecular mechanism in alpha- glicosidade and glucoamylase,” 61(8) Biosci. Biotechnol. Biochem. 1233-9 (1997); e Hesselink et al, “Lysosomal dysfunction in muscle with special reference to glycogen storage disease type II,” 1637(2) Biochim. Biophys. Acta. 164-70 (2003), cada uma das quais é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.
[00117] “Alfa-galactosidase A” (ou o “α-galactosidase A”), “ atividade de α-galactosidase A”, “α-galactosidase”, do “atividade de α-galactosidase”,
63 / 136 “GLA”, e “atividade de GLA” são usados de forma intercambiável e referem- se a toda a proteína que facilitar a hidrólise de porções terminais de α- galactosil dos glicolipídeos e das glicoproteínas e também hidrolisa também α-D-fucosídeos. GLA também é conhecida inter alia como EC 3.2.1.22, melibiase, α-D-galactosidase, α-galactosidase A, galacto-hidrolase de α- galactosídeo, galacto-hidrolase do α-D-galactosídeo. GLA é um enzima lisossomal codificada pelo gene GLA ligado a X. Os defeitos em GLA podem conduzir à doença de Fabry, em que o glicolipídeo conhecido como globotriaosilceramida (também conhecido como Gb3, GL-3, ou tri-hexosídeo de ceramida) se acumula dentro dos vasos sanguíneos (isto é, vasculopatia proeminente), tendo por resultado dor e o comprometimento no funcionamento do rim, do coração, da pele, e/ou de tecidos cerebrovasculares, e outros tecidos e órgãos. Ver, por exemplo, Prabakaran et al. “Mannose 6- phosphate receptor and sortilin mediated endocytosis of α-galactosidase A in kidney endothelial cells,” 7(6) PLoS One e39975 pp. 1-9 (2012), cuja referência é incorporada neste documento em sua totalidade por referência.
[00118] Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratar um paciente (ou sujeito) que sofre de uma doença de armazenamento lisossômico através da administração, ao paciente, de “uma proteína terapêutica multidomínio”. A proteína terapêutica multidomínio adentra as células do paciente e distribui aos lisossomas uma enzima ou uma atividade enzimática (isto é, “enzima de reposição”) que repõe a enzima (isto é, “enzima endógena”) ou a atividade enzimática que é associada com LSD. Em uma modalidade, a proteína terapêutica multidomínio é distribuída ao paciente através de um vetor de terapia gênica que contém um polinucleotídeo que codifica a proteína terapêutica multidomínio.
[00119] LSDs incluem esfingolipidoses, uma mucopolisacaridose, e doenças do armazenamento de glicogênio. Em algumas modalidades, a LSD é qualquer uma ou mais dentre doença de Fabry, doença de Gaucher tipo I,
64 / 136 doença de Gaucher tipo II, doença de Gaucher tipo III, doença de Niemann- Pick tipo A, doença de Niemann-Pick tipo B, GM1-gangliosidose, doença de Sandhoff, doença de Tay-Sachs, deficiência do ativador de GM2, GM3- gangliosidose, leucodistrofia metacromática, deficiência do ativador esfingolipídico, doença de Scheie, doença de Hurler-Sceie, doença de Hurler, doença de Hunter, Sanfilippo A, Sanfilippo B, Sanfilippo C, Sanfilippo D, síndrome de Morquio A, síndrome de Morquio B, doença de Maroteaux- Lamy, síndrome de Sly, MPS IX e doença de Pompe. Numa modalidade específica, LSD é doença de Fabry. Noutra modalidade, LSD é doença de Pompe.
[00120] Em algumas modalidades, a proteína terapêutica multidomínio compreende (a) a enzima de reposição, e (b) uma entidade molecular que se liga a um efetor de internalização (domínio de liberação). Em alguns casos, a enzima de reposição é qualquer uma ou mais dentre α-galactosidase, β- galactosidase, α-glicosidase, β-glicosidase, ativador de saposina-C, ceramidase, esfingomielinase, β-hexosaminidase, ativador de GM2, GM3 sintase, arilsulfatase, ativador esfingolipídico, α-iduronidase, iduronidase-2- sulfatase, heparina N-sulfatase, N-acetil-α-glicosaminidase, α-glicosamida N- acetiltransferase, N-acetilglicosamina-6-sulfatase, N-acetilgalactosamina-6- sulfato sulfatase, N-acetilgalactosamina-4-sulfatase, β-glicuronidase e hialuronidase.
[00121] Em alguns casos, o paciente pode não produzir proteína suficiente, de forma que uma enzima de reposição é reconhecida pelo paciente como "não própria" e uma reação imunológica se segue após a administração de uma enzima de reposição. Isto não é desejável. Portanto, em algumas modalidades, a enzima de reposição é projetada ou produzida de forma a evitar a indução de uma reação imunológica no sujeito. Uma tal solução é utilizar uma "isoenzima" como enzima de reposição. Uma isozima é suficientemente parecida com uma proteína "própria" do paciente, mas tem a
65 / 136 atividade de enzima de reposição suficiente para amenizar os sintomas de LSD.
[00122] Em uma modalidade em particular, em que a LSD é a doença de Pompe e a enzima endógena é α-glicosidade (GAA), a isozima pode ser qualquer um entre ácido α-glicosidade, sacarase-isomaltase (SI), maltase- glicoamilase (MGAM), glicosidase II (GANAB) e Α-glicosidade neutra (C GNAC). Em uma outra modalidade em particular, em que a LSD é doença de Fabry e a enzima endógena é α-galactosidase A (GLA), a isozima pode ser uma α-N-acetilgalactosaminidase projetada para ter a atividade de GLA.
[00123] São fornecidos neste documento métodos que não sejam o uso de uma isoenzima, para reduzir os materiais imunológicos reativos (CRIM) contra a enzima de reposição. Conforme demonstrado nas Figuras 5 e 6, a administração de uma proteína terapêutica multidomínio (por exemplo, através de um vetor de terapia gênica) compreendendo um domínio de ligação a efetor de internalização e o domínio de enzima reduz o nível de CRIM contra a enzima de reposição composta pela administração de uma proteína terapêutica de controle (sem o domínio efetor de internalização e compreendendo um domínio enzimático). Como tal, em uma modalidade ou redução de CRIM contra uma enzima em um paciente com uma deficiência na enzima compreende administrar ao paciente uma proteína terapêutica multidomínio (ou ácido nucleico que a codifica, por exemplo, um vetor de terapia gênica contendo um gene que codifica a proteína terapêutica multidomínio, em que a proteína terapêutica multidomínio compreende um domínio de liberação (por exemplo, proteína de ligação a efetor de internalização) e um domínio enzimático.
[00124] A proteína terapêutica multidomínio tem um componente de proteína de ligação ao efetor de internalização que permite a captação da enzima de reposição na célula. Assim, em algumas modalidades, o efetor de internalização pode ser CD63, MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6,
66 / 136 LRP8, receptor de transferrina, receptor de LDL, receptor da proteína 1 relacionada a LDL, ASGR1, ASGR2, proteína 2 semelhante à proteína precursora amiloide (APLP2), receptor de apelina (APLNR), PRLR (receptor de prolactina), MAL (mielina e proteína linfocitária, também conhecida como VIP17), IGF2R, ATPase H+ tipo vacuolar, receptor da toxina diftérica, receptor de folato, receptores de glutamato, receptor de glutationa, receptor de leptina, receptor scavenger, SCARA1-5, SCARB1-3, e CD36. Em determinadas modalidades, o efetor de internalização é um internalizador específico do rim, tal como CDH16 (Caderina-16), CLDN16 (Claudina-16), KL (Klotho), PTH1R (receptor de hormônio da paratireoide), SLC22A13 (membro 13 da família 22 de carreadores de soluto), SLC5A2 (cotransportador 2 de sódio/glicose), e UMOD (Uromodulina). Em outras determinadas modalidades, o efetor de internalização é um internalizador específico do músculo, tal como BMPR1A (receptor de proteína morfogenética óssea 1A), m-caderina, CD9, MuSK (quinase específica de músculo), LGR4/GPR48 (receptor 48 acoplado à proteína G), receptor colinérgico (nicotiníco) alfa 1, CDH15 (Caderina-15), ITGA7 (Integrina alfa- 7), CACNG1 (canal de cálcio tipo L subunidade gama-1), CACNAlS (canal de cálcio tipo L subunidade alfa-15), CACNG6 (canal de cálcio tipo L subunidade gama-6), SCN1B (canal de sódio subunidade beta-1), CHRNA1 (receptor de ACh subunidade alfa), CHRND (receptor de ACh subunidade delta), LRRC14B (proteína 14B contendo repetição rica em leucina), distroglicano (DAG1) e POPDC3 (proteína 3 contendo domínio Popeye). Em algumas modalidades específicas, o efetor de internalização é ITGA7, CD9, CD63, APLP2, ASGR1, ASGR2 ou PRLR.
[00125] Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao efetor de internalização compreende uma proteína de ligação ao antígeno, que inclui, por exemplo, uma molécula de fusão do receptor, uma molécula de aprisionamento, uma molécula de fusão do receptor-Fc, um anticorpo, um
67 / 136 fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fd, um fragmento Fv, uma molécula Fv de cadeia única (scFv), um fragmento dAb, uma região de determinação de complementaridade (CDR) isolada, um peptídeo CDR3, um peptídeo FR3-CDR3-FR4 limitado, um anticorpo específico ao domínio, um anticorpo de domínio único, um anticorpo deletado do domínio, um anticorpo quimérico, um anticorpo enxertado de CDR, um diabody, um triabody, um tetrabody, um minibody, um nanobody, um nanobody monovalente, um nanobody bivalente, um imunofarmacêutico pequeno modular (SMIP), um anticorpo de camelídeo (VHH anticorpo homodimérico de cadeia pesada) e um domínio IgNAR variável de tubarão.
[00126] Em uma modalidade, a entidade molecular que se liga ao efetor de internalização é um anticorpo, um fragmento de anticorpo ou outra proteína de ligação a antígeno. Por exemplo, a entidade molecular pode ser um anticorpo biespecífico, em que um braço se liga ao efetor de internalização (por exemplo, ITGA7, CD9, CD63, PRLR, APLP2, ASGR1, ASGR2), e o outro braço vincula a enzima de reposição. Aqui, a proteína terapêutica multidomínio compreende o anticorpo biespecífico e a enzima de reposição (Fig. 1A). Em uma modalidade específica, a doença tratada é doença de Fabry e a proteína terapêutica multidomínio compreende GLA e um anticorpo biespecífico que liga GLA e CD63. Em uma modalidade específica, a doença tratada é doença de Fabry e a proteína terapêutica multidomínio compreende GLA e um anticorpo biespecífico que liga GLA e ITGA7. Em uma outra modalidade específica, a doença tratada é doença de Pompe e a proteína terapêutica multidomínio compreende GAA e um anticorpo biespecífico que liga GAA e CD63. Em uma outra modalidade específica, a doença tratada é doença de Pompe e a proteína terapêutica multidomínio compreende GAA e um anticorpo biespecífico que liga GAA e ITGA7.
[00127] Em uma outra modalidade, a entidade molecular que liga o
68 / 136 efetor de internalização compreende um semi-anticorpo e a enzima de reposição contém um domínio de Fc (polipeptídeo de fusão de enzima-Fc). Em uma modalidade, o domínio de Fc do polipeptídeo de fusão da enzima Fc se associa com o domínio de Fc do half-body específico de efetor de internalização para dar forma à proteína terapêutica multidomínio (Fig. 1B).
[00128] Em outras modalidades, a enzima de reposição é ligada covalentemente à proteína de ligação ao efetor de internalização. A modalidade de fusão enzima-Fc:half-body descrita no parágrafo precedente (veja também Fig. 1B) cai nesta classe, desde que o dímero de Fc possa ser fixado através de uma ou mais pontes do bissulfeto. A ligação covalente entre o domínio da atividade de enzima ou o polipeptídeo e o domínio de ligação de internalização ou polipeptídeo pode ser qualquer tipo de ligação covalente, isto é, alguma ligação que envolva compartilhar elétrons. Em alguns casos, a ligação covalente é uma ligação peptídica entre dois aminoácidos, tais que a enzima de reposição e a proteína de ligação de efetor de internalização em inteiro ou em parte formam uma cadeia de polipeptídeo contínua, como em uma proteína da fusão. Em alguns casos, a porção da enzima de reposição e a proteína de ligação de efetor de internalização são ligadas diretamente. Em outros casos, um ligando é usado para unir as duas porções. Ver Chen et al., “Fusion protein linkers: property, design and functionality,” 65(10) Adv Drug Deliv Rev. 1357-69 (2013).
[00129] O termo "ligante" ou "espaçador" refere-se a um polipeptídeo curto (por exemplo, 2 a 25 aminoácidos) que normalmente permite o dobramento adequado de um ou mais componentes ligados da proteína de fusão, por exemplo, uma VH ligada a uma VL de um scFv, uma proteína terapêutica (por exemplo, enzima de reposição) ligada a um domínio de liberação (por exemplo, um anticorpo anti-efetor de internalização) de uma proteína terapêutica multidomínio, como descrito neste documento. O ligante fornece uma região de junção flexível do componente da proteína de fusão,
69 / 136 permitindo que as duas extremidades da molécula se movam de forma independente e possam desempenhar um papel importante na retenção de cada uma das funções apropriadas de duas porções. Portanto, a região de junção atua em alguns casos como ligante, que combina as duas partes juntas e como um espaçador, o que permite que cada uma das duas partes forme sua própria estrutura biológica e não interfira com a outra parte. Além disso, a região de junção deve criar um epítopo que não será reconhecido pelo sistema imunológico do sujeito como estranho, em outras palavras, não será considerado imunogênico. A seleção de ligante também pode ter um efeito na atividade de ligação da molécula de fusão. (Ver Huston, et al, 1988, PNAS, 85:16:5879-83; Robinson & Bates, 1998, PNAS 95(11):5929-34; Arai, et al. 2001, PEDS, 14(8):529-32; e Chen, X. et al., 2013, Advanced Drug Delivery Reviews 65:1357–1369.) Em uma modalidade, o domínio de liberação é conectado ao polipeptídeo terapêutico, ou fragmento seu, através de um ou mais ligantes de peptídeo. Em outra modalidade, as regiões variáveis de um anticorpo scFv são ligadas umas às outras, ou um fragmento seu, através de um ou mais ligantes de peptídeo.
[00130] O comprimento da cadeia de ligante pode ser 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais resíduos de aminoácido, mas normalmente está entre 5 e 25 resíduos. Exemplos de protetores incluem ligantes de poliglicina, como Gly-Gly, Gly-Gly-Gly (3Gly), 4Gly, 5Gly, 6Gly, 7Gly, 8Gly ou 9Gly. Exemplos de ligante também incluem ligante de peptídeo Gly- Ser como Ser-Gly, Gly-Ser, Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Ser, Ser- Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, Ser-Gly-Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly- Gly-Ser, Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, Ser-Gly- Gly-Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n, e (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n, em que n = 1 a 10. (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n e (Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n também são conhecidos como (G4S)n e (S4G)n, respectivamente.
[00131] Em algumas modalidades, a proteína terapêutica, por exemplo,
70 / 136 a enzima de reposição é ligada de forma covalente ao C terminal da cadeia pesada de um anticorpo anti-efetor de internalização (Ver Fig. 1C) ou ao C terminal da cadeia leve ( Fig. 1E). Em algumas modalidades, a enzima de reposição é ligada de forma covalente ao N terminal da cadeia pesada de um anticorpo anti-efetor de internalização (Ver Fig. 1D) ou ao N terminal da cadeia leve ( Fig. 1F). Em algumas modalidades, a enzima é ligada ao terminal C de um domínio de scFv anti-efetor de internalização (Fig. 1G).
[00132] Em alguns casos, especialmente onde a proteína terapêutica, por exemplo, enzima de reposição, normalmente não é processada proteoliticamente no lisossoma, um ligante clivável é adicionado àquelas modalidades da proteína terapêutica multidomínio que compreendem uma fusão do anticorpo-enzima. Em algumas modalidades, um ligante clivável catespina é introduzido entre o anticorpo e a enzima de reposição para facilitar a remoção do anticorpo no lisossoma de forma a a) possivelmente ajudar a preservar a atividade enzimática removendo o anticorpo estericamente grande e b) possivelmente aumentar a meia-vida lisossômica da enzima.
[00133] Em uma modalidade particular, a proteína terapêutica multidomínio é distribuída ao paciente ou célula em um vetor de terapia gênica que contém um polinucleotídeo que codifica a proteína terapêutica multidomínio. Em uma modalidade, a proteína terapêutica multidomínio compreende um domínio de liberação e um domínio enzimático. Em uma modalidade específica, o domínio de liberação se liga ao efetor de internalização, tal como CD63, MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, receptor de transferrina, receptor de LDL, receptor da proteína 1 relacionada a LDL, ASGR1, ASGR2, proteína 2 semelhante à proteína precursora amiloide (APLP2), receptor de apelina (APLNR), MAL (mielina e proteína linfocitária (MAL), IGF2R, ATPase H+ tipo vacuolar, receptor da toxina diftérica, receptor de folato, receptores de glutamato, receptor de
71 / 136 glutationa, receptores de leptina, receptor scavenger A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3 ou CD36. Em uma modalidade, o domínio de liberação é um fragmento variável de cadeia única (scFv) que se liga a CD63 (isto é, scFv anti-CD63). Em outra modalidade, o domínio de liberação é um fragmento variável de cadeia única (scFv) que se liga a ITGA7 (isto é, scFv anti- ITGA7).
[00134] Em uma modalidade particular, o domínio enzimático da proteína terapêutica multidomínio compreende uma hidrolase. Em uma modalidade específica, o domínio enzimático compreende uma hidrolase que é uma glicosilase. Em uma modalidade mais específica, o domínio enzimático compreende uma glicosilase que é uma glicosidase. Em uma modalidade mais específica, o domínio enzimático é uma glicosidase que é alfa-glicosidase.
[00135] Geralmente, são divulgadas neste documento composições compreendendo e uso de polinucleotídeos, por exemplo, (m)RNA, DNA e formas modificadas destes, que codificam uma proteína terapêutica multidomínio compreendendo um domínio efetor de internalização e um domínio enzimático no tratamento de doenças do armazenamento lisossômico, por exemplo, para a redução do glicogênio e/ou aumento da tolerância imune para GAA em um paciente com doença de Pompe.
[00136] O termo "polinucleotídeo" inclui um polímero de nucleotídeos (por exemplo, RNA ou DNA) que codifica pelo menos um polipeptídeo, incluindo polipeptídeos de fusão, por exemplo, um polipeptídeo terapêutico multidomínio compreendendo um domínio efetor de internalização e um domínio enzimático. O polinucleotídeo como usado neste documento engloba polímeros que compreendem nucleotídeos modificados e não modificados. Um polinucleotídeo pode conter uma ou mais regiões codificantes e não codificantes. Um polinucleotídeo pode ser purificado a partir de fontes naturais, produzido usando sistemas de expressão recombinante e opcionalmente purificado, quimicamente sintetizado, etc. Quando apropriado,
72 / 136 por exemplo, no caso de moléculas quimicamente sintetizadas, um polinucleotídeo pode compreender análogos de nucleosídeos como análogos tendo bases quimicamente modificadas ou açúcares, modificações de estrutura etc. Uma sequência polinucleotídica é apresentada na direção 5' a 3', a menos que indicado de outra forma. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo é ou compreende nucleosídeos naturais (por exemplo, adenosina, guanosina, citidina, uridina); análogos de nucleosídeos (por exemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3- metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2- aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5 -iodouridina, C5- propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7- desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)- metilguanina e 2-tiocitina ); bases quimicamente modificadas; bases biologicamente modificadas (por exemplo, bases metiladas); bases intercaladas; açúcares modificados (por exemplo, 2'-fluororibose, ribose, 2'- desoxirribose, arabinose e hexose); e/ou grupos fosfato modificados (por exemplo, ligações fosforotioatos e ligações 5'-N-fosforamidita).
[00137] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo compreende um ou mais resíduos de nucleotídeos não padrão. Os resíduos de nucleotídeos não padrão podem incluir, por exemplo, 5-metil-cianidina ("5Mc"), pseudouridina ("ψU") e/ou 2-tio-uridina ("2Su"). Ver, por exemplo, Patente U.S. N. 8,278,036 ou WO2011012316, cada uma das quais é incorporada na sua totalidade por referência para uma discussão de tais resíduos e sua incorporação em um polinucleotídeo. A presença de resíduos de nucleotídeos não padrão pode tornar um polinucleotídeo mais estável e/ou menos imunogênico do que um controle de um polinucleotídeo com a mesma sequência, mas contendo apenas resíduos padrão. Em outras modalidades, um polinucleotídeo pode compreender um ou mais resíduos de nucleotídeos não padrão escolhidos dentre isocitosina, pseudoisocitosina, 5-bromouracil, 5-
73 / 136 propiniluracil, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inosina, diaminopurina e 2- cloro-6-aminopurina citosina, bem como combinações dessas modificações e outras modificações de nucleobase. Certas modalidades podem incluir ainda modificações adicionais ao anel de furanose ou nucleobase. Modificações adicionais podem incluir, por exemplo, modificações ou substituições de açúcar (por exemplo, uma ou mais de uma modificação de 2'-O-alquil, um ácido nucleico bloqueado (LNA)). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo pode ser complexado ou hibridizado com polinucleotídeos adicionais e/ou polinucleotídeos de peptídeo (PNA). Em modalidades em que a modificação de açúcar é uma modificação de 2'-O-alquil, tal modificação pode incluir, mas não está limitada a uma modificação de 2'-desoxi-2'-flúor, uma modificação de 2'-O-metil, uma modificação de 2'-O-metoxietil e uma modificação de 2'-desoxi. Em certas modalidades, qualquer uma dessas modificações pode estar presente em 0-100% dos nucleotídeos - por exemplo, mais de 0%, 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95% ou 100% dos nucleotídeos constituintes individualmente ou em combinação. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo compreende moléculas de RNA mensageiro (mRNA), que podem ou não ser modificadas, por exemplo, que podem ou não compreender um nucleotídeo modificado, por métodos bem conhecidos para aumentar sua estabilidade e/ou diminuir sua imunogenicidade. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo compreende moléculas de DNA, que podem ou não ser modificadas, por exemplo, que podem ou não compreender um nucleotídeo modificado, por métodos bem conhecidos para aumentar sua estabilidade e/ou diminuir sua imunogenicidade.
[00138] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo também inclui uma "sequência de ácido nucleico direcionada ao locus". A sequência de direcionamento de locus permite a integração do polinucleotídeo codificante de proteína terapêutica multidomínio no genoma da célula hospedeira do recebedor. Em algumas modalidades, a sequência direcionada ao locus inclui
74 / 136 os braços de homologia flanqueadora para permitir a recombinação homóloga. Em algumas modalidades, a sequência direcionada ao locus inclui sequências de RNA guia e uma enzima Cas tipo II para facilitar a integração (ou seja, o método CRISPR-Cas9). Em algumas modalidades, a sequência de direcionamento de locus inclui sequências de reconhecimento de nuclease dedo de zinco guia (ZFN) para facilitar a integração. Em algumas modalidades, a sequência de direcionamento de locus inclui sequências de reconhecimento de nuclease de efetor do tipo ativador de transcrição (TALEN) para facilitar a integração. Em ainda outras modalidades, a sequência de direcionamento de locus inclui um único código de resíduo- nucleotídeo usado por nucleases derivadas de BuD para facilitar a integração.
[00139] Em algumas modalidades, o locus genômico no qual o polinucleotídeo codificante de proteína terapêutica multidomínio está integrado é um "locus safe harbor". Em uma modalidade, um "locus safe harbor" permite alta expressão da proteína terapêutica multidomínio, embora não interfira na expressão de genes essenciais ou promova a expressão de oncogenes ou outros genes deletérios. Em uma modalidade, o locus genômico está no, ou próximo ao, locus de albumina expressa no fígado (Alb), um locus EESYR, um locus SARS, posição 188.083.272 do cromossomo humano 1 ou seu ortólogo de mamífero não humano, posição 3.046.320 do cromossomo humano 10 ou seu ortólogo de mamífero não humano, posição 67, 328.980 do cromossomo humano 17 ou seu mamífero não humano ortólogo, um local de vírus adenoassociado 1 (AAVS1) no cromossomo, um local de integração natural do vírus AAV no cromossomo humano 19 ou em seu ortólogo de mamífero não humano, um gene do receptor de quimiocina 5 (CCR5), um gene do receptor de quimiocina que codifica um co-receptor de HIV-1 ou um locus Rosa26 de camundongo ou seu ortólogo de mamífero não murino. Em uma modalidade, o locus genômico é um sítio de vírus adeno-associado. Em uma modalidade, o locus genômico para a integração é selecionado de acordo
75 / 136 com o método de Papapetrou e Schambach, J. Molecular Therapy, vol. 24 (4):678-684, abril de 2016, que é incorporado neste documento por referência para a seleção em etapas de um locus genômico safe harbor para integração do vetor de terapia gênica; ver também Barzel et al. Nature, vol. 517:360-364, incorporada neste documento por referência em sua totalidade, para o gene sem promotor direcionado para a albumina expressa no locus do fígado (Alb).
[00140] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo, por exemplo, DNA, também contém um promotor operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico que codifica proteína terapêutica multidomínio. Em uma modalidade específica, o promotor é um promotor tecido-específico que impulsiona a expressão de gene em um tecido particular. Em uma modalidade, o promotor específico de tecido é um potenciador/promotor específico ao fígado derivado de serpina1 (por exemplo, SEQ ID NO:9) e/ou é um promotor de TTR (SEQ ID NO:8). Em outras modalidades, o promotor é um promotor de CMV. Em outras modalidades, o promotor é um promotor de ubiquitina C
[00141] Em uma modalidade, o “vetor de terapia gênica” que codifica a proteína terapêutica multidomínio é qualquer vetor capaz de distribuir o polinucleotídeo que codifica a proteína terapêutica multidomínio a um hospedeiro, por exemplo, um paciente. Em algumas modalidades, o vetor de terapia gênica se direciona a uma célula ou órgão hospedeiro específico, por exemplo, para distribuição local, por exemplo, distribuição específica ao tecido. Normalmente, a liberação local requer uma proteína (por exemplo, uma proteína terapêutica multidomínio) codificada por mRNA e expressa principalmente em e/ou por um órgão, por exemplo, um fígado, por meio do qual, portanto, formando um depósito, por exemplo, um depósito de fígado para produção (e secreção) da proteína. Em algumas modalidades, um vetor de terapia gênica fornece um polinucleotídeo de proteína terapêutica multidomínio ao fígado em um paciente para formar um depósito de fígado.
76 / 136 Ver, por exemplo, Derosa et al. Gene Therapy, vol. 10:699-707, incorporado neste documento por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, um vetor de terapia gênica fornece um polinucleotídeo que codifica uma proteína terapêutica multidomínio ao tecido muscular em um paciente. Em algumas modalidades, um vetor de terapia gênica fornece um polinucleotídeo que codifica uma proteína terapêutica multidomínio para o cérebro de um paciente.
[00142] Qualquer vetor de distribuição de terapia gênica conhecido no futuro ou conhecido agora, natural ou manipulado, pode ser usado na prática desta invenção. Em algumas modalidades, o vetor de terapia gênica é um vetor viral, por exemplo, compreende um vírus, capsídeo viral, genoma viral etc. Em algumas modalidades, o vetor de terapia gênica é um polinucleotídeo nu, por exemplo, um epissomo. Em algumas modalidades, o vetor de terapia gênica compreende um complexo polinucleotídico. Exemplos de complexos polinucleotídicos não limitantes para uso como um vetor de terapia gênica incluem lipoplexos, polimerósicos, polipexos, dendrímeros, nanopartículas inorgânicas (por exemplo, ouro revestido com polinucleotídeo, sílica, óxido de ferro, fosfato de cálcio, etc.). Em algumas modalidades, um vetor de terapia gênica, conforme descrito neste documento, compreende uma combinação de um vetor viral, polinucleotídeos nus e complexos polinucleotídicos.
[00143] Em uma modalidade, o vetor de terapia gênica é um vírus, incluindo um retrovírus, adenovírus, vírus herpes simplex, poxvírus, vírus vaccinia, lentivírus ou vírus adeno-associado. Em uma modalidade, o vetor de terapia gênica é um vírus adeno-associado (AAV), incluindo os sorotipos AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 e AAV11, ou variantes manipuladas ou naturalmente selecionadas deles.
[00144] Em uma modalidade, o polinucleotídeo também contém
77 / 136 sequência de ácido nucleico adeno-associado (AAV). Em uma modalidade, o vetor de terapia gênica é um vírus adeno-associado quimérico contendo elementos genéticos de dois ou mais sorotipos. Por exemplo, um vetor AAV com genes rep de AAV1 e genes cap de AAV2 (designados como AAV1/2 ou AAV RC1/2) pode ser usado como um vetor de terapia gênica para distribuir o polinucleotídeo de proteína terapêutica multidomínio a uma célula ou uma célula de um paciente em necessidade. Em uma modalidade, o vetor de terapia gênicas é um AAV1/2, AAV1/3, AAV1/4, AAV1/5, AAV1/6, AAV1/7, AAV1/8, AAV1/9, AAV1/10, AAV1/11, AAV2/1, AAV2/3, AAV2/4, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/7, AAV2/8, AAV2/9, AAV2/10, AAV2/11, AAV3/1, AAV3/2, AAV3/4, AAV3/5, AAV3/6, AAV3/7, AAV3/8, AAV3/9, AAV3/10, AAV3/10, AAV4/1, AAV4/2, AAV4/3, AAV4/5, AAV4/6, AAV4/7, AAV4/8, AAV4/9, AAV4/10, AAV4/11, AAV5/1, AAV5/2, AAV5/3, AAV5/4, AAV5/6, AAV5/7, AAV5/8, AAV5/9, AAV5/10, AAV5/11, AAV6/1, AAV6/2, AAV6/3, AAV6/4, AAV6/5, AAV6/7, AAV6/8, AAV6/9, AAV6/10, AAV6/10, AAV7/1, AAV7/2, AAV7/3, AAV7/4, AAV7/5, AAV7/6, AAV7/8, AAV7/9, AAV7/10, AAV7/11, AAV8/1, AAV8/2, AAV8/3, AAV8/4, AAV8/5, AAV8/6, AAV8/7, AAV8/9, AAV8/10, AAV8/11, AAV9/1, AAV9/2, AAV9/3, AAV9/4, AAV9/5, AAV9/6, AAV9/7, AAV9/8, AAV9/10, AAV9/11, AAV10/1, AAV10/2, AAV10/3, AAV10/4, AAV10/5, AAV10/6, AAV10/7, AAV10/8, AAV10/9, AAV10/11, AAV11/1, AAV11/2, AAV11/3, AAV11/4, AAV11/5, AAV11/6, AAV11/7, AAV11/8, AAV11/9, AAV11/10, vetor viral quimérico ou derivativos respectivos. Gao et al., “Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy,” PNAS 99(18): 11854–11859, 3 de setembro de 2002, é incorporado neste documento por referência para vetores AAV e vetores virais quiméricos úteis como vetores de terapia gênica e sua construção e uso.
[00145] Em uma modalidade mais específica, o vetor de terapia gênica
78 / 136 é um vetor de AAV quimérico com uma sequência de gene rep 2 e uma sequência de cap de sorotipo 8 (“AAV2/8” ou “AAV RC2/8).
[00146] Em algumas modalidades, o vetor de terapia gênica é um vetor viral que foi pseudotipado (por exemplo, manipulado) para direcionar uma célula específica, por exemplo, um hepatócito. Muitos dos avanços na terapia de gene direcionada usando vetores virais podem ser resumidos como modificação não recombinatória (não genética) ou recombinatória (genética) do vetor viral, o que resulta na pseudotipagem, expansão e/ou redirecionamento do tropismo natural do vetor viral. (Revisado em Nicklin e Baker (2002) Gene Curr. Ther. 2:273-93; Verheiji e Rottier (2012) Advances Virol 2012:1-15; cujas referências são incorporadas neste documento em sua totalidade por referência). Abordagens não genéticas normalmente utilizam um adaptador, que reconhece tanto uma proteína de superfície do vírus do tipo selvagem (não modificada) quanto uma célula alvo. Pseudorreceptores solúveis (para o vírus do tipo selvagem), polímeros como polietilenoglicol e anticorpos ou porções deles, foram usados como o domínio de ligação a vírus dos adaptadores, enquanto peptídeo natural ou ligantes de vitamina, e anticorpos e porções deles foram usados para o domínio de ligação celular dos adaptadores descritos acima. Por exemplo, o redirecionamento do vetor viral a uma célula alvo pode ser realizado mediante ligação do complexo vetor:adaptador a uma proteína expressa na superfície da célula alvo, por exemplo, uma proteína de superfície celular. Tal abordagem foi usada para AAV (Bartlett et al. (1999)Nat. Biotechnol. 74: 2777-2785), adenovírus (Hemminki et al. (2001)Cancer Res. 61: 6377–81; van Beusechem et al. (2003)Gene Therapy 10:1982–1991; Einfeld, et al. (2001)J. Virol. 75:11284– 91; Glasgow et al. (2009)PLOS One 4:e8355), herpesvírus (Nakano et al. (2005)Mol. Ther. 11:617-24), e paramixovírus (Bian et al. (2005)Cancer Gene Ther. 12:295-303; Bian et al. (2005)Int. J. Oncol. 29:1359-69), coronavírus (Haijema et al. (2003) J. Virol. 77:4528–4538; Wurdinger et al.
79 / 136 (2005)Gene Therapy 12:1394–1404; cujas referências são incorporadas neste documento em sua totalidade por referência).
[00147] Uma abordagem mais popular tem sido a modificação genética recombinatória das proteínas de capsídeo virais e, assim, a superfície do capsídeo viral. Em abordagens recombinantes indiretas, um capsídeo viral é modificado com um "andaime" heterólogo, que então se liga a um adaptador. O adaptador se liga ao andaime e à célula alvo. (Arnold et al. (2006)Mol. Ther. 5:125-132; Ponnazhagen et al. (2002)J. Virol. 76:12900–907;ver também WO 97/05266, cujas referências são incorporadas neste documento em sua totalidade por referência) Andaimes, tais como (1) moléculas de ligação Fc (por exemplo, receptores Fc, Proteína A, etc.), que se ligam ao Fc de adaptadores de anticorpo, (2) (estrept)avidina, que se liga a adaptadores biotinilados, (3) biotina, que se liga a adaptadores fundidos com (estrept)avidina, e (4) pares de ligação a proteína:proteína que formam ligações peptídicas isométricas, tais como o SpyCatcher, que se liga a um adaptador de SpyTag, que se liga a ligações peptídicas isométricas, tais como o SpyCatcher, que se liga a um adaptador de SpyTag, que se liga a um adaptador de SpyTag (Pereboeva et al. (2007) Gene Therapy 14: 627–637; Park et al. (2008) Biochemical and Biophysical Research Communications 366: 769–774; Henning et al. (2002) Human Gene Therapy 13:1427–1439; Banerjee et al. (2011) Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 21:4985– 4988), AAV (Gigout et al. (2005)Molecular Therapy 11:856–865; Stachler et al. (2008)Molecular Therapy 16:1467–1473), e togavírus (Quetglas et al. (2010)Virus Research 153:179–196; Ohno et al. (1997)Nature Biotechnology 15:763–767; Klimstra et al. (2005)Virology 338:9–21; cujas referências são incorporadas neste documento em sua totalidade por referência).
[00148] Em uma abordagem direcionadora recombinatória direta, um ligante de direcionamento é inserido diretamente em, ou acoplado a, um capsídeo viral, isto é, capsídeos virais de proteína são modificados para
80 / 136 expressar um ligante heterólogo. O ligante então redireciona, por exemplo, se liga, um receptor ou marcador preferencialmente ou exclusivamente expresso em uma célula alvo. (Stachler et al. (2006) Gene Ther. 13:926–931; White et al. (2004) Circulation 109:513–519; cada uma das referências está integralmente incorporada neste documento por referência). Abordagens recombinantes diretas foram usadas em AAV (Park et al., (2007) Frontiers in Bioscience 13:2653–59; Girod et al. (1999) Nature Medicine 5:1052–56; Grifman et al. (2001) Molecular Therapy 3:964–75; Shi et al. (2001)Human Gene Therapy 12:1697–1711; Shi e Bartlett (2003)Molecular Therapy 7:515– 525, cujas referências são incorporadas neste documento em sua totalidade por referência), retrovírus (Dalba et al. Current Gene Therapy 5:655–667; Tai e Kasahara (2008) Frontiers in Bioscience 13:3083-3095; Russell e Cosset (1999)Journal of Gene Medicine 1:300–311; Erlwein et al. (2002)Virology 302:333–341; Chadwick et al. (1999) Journal of Molecular Biology 285:485– 494; Pizzato et al. (2001)Gene Therapy 8:1088–1096), poxvírus (Guse et al. (2011)Expert Opinion on Biological Therapy 11:595–608; Galmiche et al. (1997) Journal of General Virology 78:3019–3027; Paul et al. (2007) Viral Immunology 20:664–671), paramixovírus (Nakamura e Russell (2004)Expert Opinion on Biological Therapy 4:1685–1692; Hammond et al. (2001) Journal of Virology 75:2087–2096; Galanis (2010) Clinical Pharmacology and Therapeutics 88:620–625; Blechacz e Russell (2008)Current Gene Therapy 8:162–175; Russell e Peng (2009)Current Topics in Microbiology and Immunology 330:213–241), e herpesvírus (Shah e Breakefield (2006)Current Gene Therapy 6:361-370; Campadelli-Fiume et al. (2011) Reviews in Medical Virology 21:213–226; cujas referências são incorporadas neste documento em sua totalidade por referência).
[00149] Em algumas modalidades, um vetor de terapia gênica, conforme descrito neste documento, é pseudotipado para aqueles tecidos que são particularmente adequados para gerar uma resposta reguladora, por
81 / 136 exemplo, tolerância para, por exemplo, a enzima de reposição. Tais tecidos incluem, mas não estão limitados a tecido da mucosa, por exemplo, tecido linfoide associado ao intestino (GALT), células-tronco hematopoiéticas e fígado. Em algumas modalidades, o vetor de terapia gênica, ou gene que codifica uma proteína terapêutica multidomínio, conforme descrito neste documento, é expresso sob o controle de promotores específicos para aqueles tecidos, por exemplo, um promotor específico do fígado.
[00150] Em algumas modalidades, um vetor de terapia gênica conforme descrito neste documento compreende um polinucleotídeo nu. Por exemplo, em algumas modalidades, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo terapêutico multidomínio pode ser injetado, por exemplo, por via intramuscular, diretamente em um órgão para a formação de um depósito, por via intravenosa, etc. Métodos adicionais bem conhecidos para a liberação aumentada de polinucleotídeos nu incluem, mas não estão limitados a eletroporação, sonoporação, uso de uma pistola de gene para injetar as partículas de ouro revestidas com polinucleotídeos, magnetofecção e liberação hidrodinâmica.
[00151] Em algumas modalidades, um vetor de terapia gênica, conforme descrito neste documento, compreende complexos polinucleotídicos, tais como, mas não limitados a nanopartículas (por exemplo, nanopartículas automontadas de polinucleotídeo, nanopartículas automontadas à base de polímero, nanopartículas inorgânicas, nanopartículas lipídicas, nanopartículas semicondutivas/metálicas), géis e hidrogéis, complexos polinucleotídicos com cátions e ânions, micropartículas e qualquer combinação destes.
[00152] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos divulgados neste documento podem ser formulados como nanopartículas automontadas. Como um exemplo não limitativo, os polinucleotídeos podem ser usados para produzir nanopartículas que podem ser usadas em um sistema de liberação
82 / 136 para os polinucleotídeos (Vide, por exemplo, Pub Internacional N. WO2012125987; incorporada neste documento por referência em sua totalidade). Em algumas modalidades, as nanopartículas automontadas de polinucleotídeo podem compreender um núcleo dos polinucleotídeos divulgados neste documento e uma cobertura polimérica. A cobertura polimérica pode ser qualquer um dos polímeros descritos neste documento e são conhecidos na técnica. Em uma modalidade adicional, a cobertura polimérica pode ser usada para proteger os polinucleotídeos no núcleo.
[00153] Em algumas modalidades, estas nanopartículas automontadas podem ser microesponjas formadas de polímeros longos de hairpins de polinucleotídeos que se formam em folhas cristalinas 'plissadas' antes de se automontar em microesponjas. Essas microesponjas são micropartículas densamente embaladas como um transportador eficiente e podem ser capazes de entregar carga a uma célula. As microesponjas podem ter de 1 μm a 300 nm de diâmetro. As microesponjas podem ser complexadas com outros agentes conhecidos na técnica para formar microesponjas maiores. Como um exemplo não limitante, a microesponja pode ser complexada com um agente para formar uma camada externa para promover a absorção celular, tal como o policátion polietilenoimina (PEI). Este complexo pode formar uma partícula de diâmetro de 250 nm que pode permanecer estável a altas temperaturas (150 ºC) (Grabow e Jaegar, Nature Materials 2012, 11:269-269; incorporada neste documento por referência em sua totalidade). Além disso, essas microesponjas podem ser capazes de apresentar um grau extraordinário de proteção contra a degradação por ribonucleases. Em outra modalidade, as nanopartículas automontadas baseadas em polímero tais como, mas não limitadas a, microesponjas, podem ser nanopartículas totalmente programáveis. A geometria, o tamanho e a estequiometria da nanopartícula podem ser controlados precisamente para criar a nanopartícula ideal para a liberação de carga, tal como, mas não se limitando a polinucleotídeos.
83 / 136
[00154] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos podem ser formulados em nanopartículas inorgânicas (Pat. U.S. N. 8.257.745, incorporado neste documento por referência em sua totalidade). As nanopartículas inorgânicas podem incluir, mas não estão limitadas a substâncias de argila que são expansíveis em água. Como um exemplo não limitante, a nanopartícula inorgânica pode incluir argilas esmectitas sintéticas que são feitas a partir de silicatos simples (ver por exemplo, Patente U.S. N. 5,585,108 e 8,257,745 cada uma das quais são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade).
[00155] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo pode ser formulado em nanopartícula dispersível em água compreendendo um material semicondutor ou metálico (Pub U.S. N. 20120228565; incorporado neste documento por referência em sua totalidade) ou formado em uma nanopartícula magnética (Pub U.S. N. 20120265001 e 20120283503; cada um dos quais é incorporado neste documento por referência em sua totalidade). As nanopartículas dispersíveis em água podem ser nanopartículas hidrofóbicas ou nanopartículas hidrofílicas.
[00156] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos divulgados neste documento podem ser encapsulados em qualquer hidrogel conhecido na técnica que pode formar um gel quando injetado em um sujeito. Os hidrogéis são uma rede de cadeias poliméricas que são hidrofílicas e às vezes são encontradas como um gel coloidal em que a água é o meio de dispersão. Os hidrogéis são altamente absorventes (eles podem conter mais de 99% de água) ou polímeros sintéticos. Os hidrogéis também possuem um grau de flexibilidade muito semelhante ao tecido natural, devido ao seu teor de água significativo. O hidrogel descrito neste documento pode ser usado para encapsular nanopartículas lipídicas que são biocompatíveis, biodegradáveis e/ou porosas.
[00157] Como um exemplo não limitativo, o hidrogel pode ser um
84 / 136 hidrogel funcionalizado por aptâmero. O hidrogel funcionalizado por aptâmero pode ser programado para liberar um ou mais polinucleotídeos usando hibridização de polinucleotídeo. (Battig et al., J. Am. Chem. Society. 2012 134:12410-12413; incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Em algumas modalidades, o polinucleotídeo pode ser encapsulado em uma nanopartícula lipídica e, em seguida, a nanopartícula lipídica pode ser encapsulada em um hidrogel.
[00158] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos divulgados neste documento podem ser encapsulados em um gel de fibrina, hidrogel de fibrina ou cola de fibrina. Em outra modalidade, os polinucleotídeos podem ser formulados em uma nanopartícula lipídica ou uma nanopartícula lipídica rapidamente eliminada antes de serem encapsulados em um gel de fibrina, hidrogel de fibrina ou uma cola de fibrina. Em ainda outra modalidade, os polinucleotídeos podem ser formulados como um lipoplex antes de serem encapsulados em um gel de fibrina, hidrogel ou cola de fibrina. Géis de fibrina, hidrogéis e colas compreendem dois componentes, uma solução de fibrinogênio e uma solução de trombina que é rica em cálcio (ver por exemplo, Spicer e Mikos, Journal of Controlled Release 2010. 148: 49-55; Kidd et al. Journal of Controlled Release 2012. 157:80-85; cada um dos quais é incorporado neste documento por referência em sua totalidade). A concentração dos componentes do gel de fibrina, hidrogel e/ou cola pode ser alterada para mudar as características, o tamanho da malha de rede e/ou as características de degradação do gel, hidrogel e/ou cola, tal como, mas não se limitando a, alterar as características de liberação do gel de fibrina, hidrogel e/ou cola. (Vide por exemplo, Spicer e Mikos, Journal of Controlled Release
2010. 148: 49-55; Kidd et al. Journal of Controlled Release 2012. 157:80-85; Catelas et al. Tissue Engineering 2008. 14:119-128; cada um dos quais é incorporado neste documento por referência em sua totalidade). Este recurso pode ser vantajoso quando usado para administrar o
85 / 136 polinucleotídeo divulgado neste documento. (Vide, por exemplo, Kidd et al. Journal of Controlled Release 2012. 157:80-85; Catelas et al. Tissue Engineering 2008. 14:119-128; cada um dos quais é incorporado neste documento por referência em sua totalidade).
[00159] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo divulgado neste documento pode incluir cátions ou ânions. Em uma modalidade, as formulações incluem cátions metálicos, tais como, mas não limitados a, Zn2+, Ca2+, Cu2+, Mg+ e suas combinações. Como um exemplo não limitativo, as formulações podem incluir polímeros e um polinucleotídeo complexado com um cátion metálico (ver, por exemplo, Patente U.S. N. 6.265.389 e 6.555.525, cada uma das quais é incorporada neste documento por referência em sua totalidade).
[00160] Em algumas modalidades, um polinucleotídeo pode ser formulado em nanopartículas e/ou micropartículas. Estas nanopartículas e/ou micropartículas podem ser moldadas em qualquer forma de tamanho e química. Como exemplo, as nanopartículas e/ou micropartículas podem ser feitas usando a tecnologia PRINT® por LIQUIDA TECHNOLOGIES.RTM. (Morrisville, New Jersey) (Vide por exemplo, Pub Internacional N. WO2007024323; incorporado neste documento por referência em sua totalidade).
[00161] Em algumas modalidades, os polinucleotídeos divulgados neste documento podem ser formulados em NanoJackets e NanoLiposomes por Keystone Nano (State College, Pa.). NanoJackets são feitos de compostos que são naturalmente encontrados no corpo, incluindo cálcio, fosfato e também podem incluir uma pequena quantidade de silicatos. Nanojackets podem variar em tamanho de 5 a 50 nm e podem ser usados para distribuir compostos hidrofílicos e hidrofóbicos, tais como, mas não limitados a, polinucleotídeos, construtos primários e/ou polinucleotídeos. NanoLiposomes são feitos de lipídios, tais como, mas não limitados a, lipídios que ocorrem
86 / 136 naturalmente no corpo. NanoLiposomes pode variar em tamanho de 60-80 nm e pode ser usado para administrar compostos hidrofílicos e hidrofóbicos tais como, mas não limitados a, polinucleotídeos, construtos primários e/ou polinucleotídeo. Em um aspecto, os polinucleotídeos divulgados neste documento são formulados em um NanoLiposomes, tal como, mas não limitado a, Ceramide NanoLiposomes.
[00162] Em uma modalidade, a proteína terapêutica multidomínio é uma proteína de fusão scFv anti-CD63-GAA ou uma proteína de fusão scFv anti-ITGA7-GAA. A administração da proteína de fusão de scFv antiCD63- GAA ou a proteína de fusão de scFv-anti-ITGA7-GAA através de administração de AAV fornece produção estável de longo prazo de GAA no soro do paciente após a administração do vetor de terapia gênica contendo proteína terapêutica multidomínio. Em uma modalidade, o nível de GAA no soro do paciente destinatário é ≥ 1,5 vezes a 100 vezes, ≥ 1,5 vezes a 10 vezes, ≥ 2,5 vezes, 2,5 vezes - 3 vezes, 2,5 vezes, 2,6 vezes, 2,7 vezes, 2,8 vezes, 2,9 vezes, 3,0 vezes, 3,1 vezes, 3,2 vezes, 3,3 vezes , 3,4 vezes, 3,5 vezes, 3,6 vezes, 3,7 vezes, 3,8 vezes, 3,9 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes ou 10 vezes maior que os níveis séricos de um paciente recebendo GAA não ligada a um domínio de liberação após 1 mês, 3 meses, 4 meses, 5 meses ou 6 meses após a administração do vetor de terapia do gene portador de proteína terapêutico multidomínio.
[00163] Em uma modalidade, a administração da proteína de fusão scFv-anti-CD63-GAA ou a proteína de fusão de scFv-anti-ITGA7-GAA através de administração de AAV fornece a redução estável de longo prazo nos níveis de glicogênio armazenados em pacientes com doença de Pompe. Em uma modalidade, os níveis de glicogênio no coração, músculo esquelético e tecido hepático no paciente são reduzidos aos níveis do tipo selvagem (não doença). Em uma modalidade, os níveis de glicogênio no coração, músculo esquelético e tecido hepático no paciente são mantidos em níveis do tipo
87 / 136 selvagem 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, ou 6 meses após a administração do vetor de terapia do gene portador de proteína terapêutica multidomínio.
[00164] Em uma modalidade, a administração da proteína de fusão scFv-anti-CD63-GAA ou a proteína de fusão scFv-anti-ITGA7-GAA através de administração de AAV fornece restauração de longo prazo da força muscular em pacientes com doença de Pompe. Em uma modalidade, a resistência do paciente conforme medida pela força de preensão é restaurada ao normal (ou seja, níveis não relacionados à doença) 1 mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, ou 6 meses após a administração do vetor de terapia do gene portador de proteína terapêutica multidomínio.
[00165] Em um outro aspecto, a invenção proporciona uma composição que compreende uma atividade de enzima e uma proteína de ligação a antígeno, em que a enzima é associada a uma doença de deficiência enzimática (LSD) e proteína de ligação ao efetor de internalização. As Enzimas (que incluem as proteínas que não são per se mesmas catalíticas) associadas com as doenças de armazenamento lisossômico incluem, por exemplo, α-galactosidase, β-galactosidase, α-glicosidade, β-glicosidade, ativador da saposina-C, o ceramidase, o esfingomielinase, β-hexosaminidase, o ativador de GM2, sintase de GM3, arilsulfatase, ativador esfingolipídico, α- iduronidase, iduronidase-2-sulfatase, heparina N-sulfatase, N-acetil-α- glicosaminidase, α-glicosamida N-acetiltransferase, N-acetilglicosamina-6- sulfatase, N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatase, N-acetilgalactosamina-4- sulfatase, β-glicuronidase, hialuronidase e semelhantes.
[00166] Proteínas de ligação ao efetor de internalização, por exemplo, incluem uma molécula de fusão do receptor, uma molécula de aprisionamento, uma molécula de fusão do receptor-Fc, um anticorpo, um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2, um fragmento Fd, um fragmento Fv, uma molécula Fv de cadeia única (scFv), um fragmento dAb, uma região de
88 / 136 determinação de complementaridade (CDR) isolada, um peptídeo CDR3, um peptídeo FR3-CDR3-FR4 limitado, um anticorpo específico ao domínio, um anticorpo de domínio único, um anticorpo deletado do domínio, um anticorpo quimérico, um anticorpo enxertado de CDR, um diabody, um triabody, um tetrabody, um minibody, um nanobody, um nanobody monovalente, um nanobody bivalente, um imunofarmacêutico pequeno modular (SMIP), um anticorpo de camelídeo (VHH anticorpo homodimérico de cadeia pesada) e um domínio IgNAR variável de tubarão, outras proteínas de ligação ao antígeno e similares.
[00167] Efetores de internalização incluem, por exemplo, CD63, MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, receptor de transferrina, receptor de LDL, receptor da proteína 1 relacionada a LDL, ASGR1, ASGR2, proteína 2 semelhante à proteína precursora amiloide (APLP2), receptor de apelina (APLNR), PRLR (receptor de prolactina), MAL (mielina e proteína linfocitária, também conhecida como VIP17), IGF2R, ATPase H+ tipo vacuolar, receptor da toxina diftérica, receptor de folato, receptores de glutamato, receptor de glutationa, receptor de leptina, receptor scavenger, SCARA1-5, SCARB1-3 e CD36. Em determinadas modalidades, o efetor de internalização é um internalizador específico do rim, tal como CDH16 (Caderina-16), CLDN16 (Claudina-16), KL (Klotho), PTH1R (receptor de hormônio da paratireoide), SLC22A13 (membro 13 da família 22 de carreadores de soluto), SLC5A2 (cotransportador 2 de sódio/glicose), e UMOD (Uromodulina). Em outras determinadas modalidades, o efetor de internalização é um internalizador específico do músculo, tal como BMPR1A (receptor de proteína morfogenética óssea 1A), m-caderina, CD9, MuSK (quinase específica de músculo), LGR4/GPR48 (receptor 48 acoplado à proteína G), receptor colinérgico (nicotiníco) alfa 1, CDH15 (Caderina-15), ITGA7 (Integrina alfa-7), CACNG1 (canal de cálcio tipo L subunidade gama- 1), CACNAlS (canal de cálcio tipo L subunidade alfa-15), CACNG6 (canal
89 / 136 de cálcio tipo L subunidade gama-6), SCN1B (canal de sódio subunidade beta-1), CHRNA1 (receptor de ACh subunidade alfa), CHRND (receptor de ACh subunidade delta), LRRC14B (proteína 14B contendo repetição rica em leucina), distroglicano (DAG1) e POPDC3 (proteína 3 contendo domínio Popeye). Em algumas modalidades específicas, o efetor de internalização é ITGA7, CD9, CD63, ALPL2, ASGR1, ASGR2 ou PRLR.
[00168] Em algumas modalidades, a enzima é ligada covalentemente (isto é, elétrons compartilhados através dos átomos) à proteína de ligação ao antígeno. Em uma modalidade em particular, a proteína de ligação ao efetor de internalização consiste ou contém um half-body; a enzima é fundida a um domínio de fusão a Fc (por exemplo, no C terminal); e domínio Fc que é ligado covalentemente aos associados de enzimáticos com o domínio Fc da proteína de ligação ao antígeno, tal que a associação contém uma ou mais pontes de bissulfeto. Esta modalidade em particular é descrita esquematicamente na Figura 1A, painel B.
[00169] Em uma outra modalidade em particular, a proteína de ligação ao efetor de internalização (domínio de liberação) consiste ou contém um anticorpo ou um fragmento de anticorpo e a enzima é ligada covalentemente ao anticorpo ou ao fragmento do anticorpo. Em uma modalidade específica, o domínio de liberação é um anticorpo e a enzima é ligada covalentemente (diretamente através de uma ligação peptídica ou indiretamente através de um ligando) ao C terminal da cadeia pesada ou da cadeia leve do anticorpo (Figura 1A, painéis C ou E, respectivamente). Em outra modalidade específica, o domínio de liberação é um anticorpo e a enzima é ligada covalentemente (diretamente através de uma ligação peptídica ou indiretamente através de um ligando) ao N terminal da cadeia pesada ou da cadeia leve do anticorpo (Figura 1A, painéis D ou F, respectivamente).
[00170] Em algumas modalidades, os domínios enzimático e de liberação não são ligados covalentemente, mas são combinados em uma
90 / 136 mistura. O domínio de liberação e a enzima podem se associar através de forças não covalentes para formar um complexo. Por exemplo, em uma modalidade em particular, o domínio de liberação é um anticorpo biespecífico em que um braço do anticorpo se liga ao efetor de internalização e o outro braça se liga à enzima. Esta modalidade é descrita esquematicamente na Figura 1A, painel A.
[00171] Em algumas modalidades, a enzima é GAA ou compreende atividade de GAA (por exemplo, uma isozima com atividade de GAA) e o efetor de internalização é ITGA7, CDH15, CD9, CD63, APLP2, ASGR1, ASGR2 ou PRLR. Em uma modalidade particular, a enzima é GAA ou compreende atividade de GAA, o domínio de internalização é CD63, e o domínio de liberação é um anticorpo biespecífico com especificidade para CD63 e GAA. Em uma modalidade particular, a enzima é GAA ou compreende atividade de GAA, o domínio de internalização é ITGA7 e o domínio de liberação é um anticorpo biespecífico com especificidade para ITGA7 e GAA.
[00172] Em algumas modalidades, a enzima é GLA ou compreende atividade de GLA (por exemplo, uma isozima com atividade de GAA) e o efetor de internalização é ITGA7, CD9, CD63, APLP2, ASGR1, ASGR2, ou PRLR. Em uma modalidade particular, a enzima é GLA ou compreende atividade de GLA, o domínio de internalização é CD63 e o domínio de liberação é um anticorpo biespecífico com especificidade para CD63 e GLA. Em uma modalidade particular, a enzima é GLA ou compreende atividade de GLA, o domínio de internalização é ITGA7 e o domínio de liberação é um anticorpo biespecífico com especificidade para ITGA7 e GLA. Composições Farmacêuticas e Administração Respectiva
[00173] As formulações farmacêuticas podem compreender ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável que, conforme usado neste documento, inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, diluentes
91 / 136 ou outros veículos líquidos, auxiliares de dispersão ou suspensão, agentes ativos de superfície, agentes isotônicos, agentes espessantes ou emulsificantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubrificantes e similares, conforme adequado à forma de dosagem específica desejada. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21.sup.st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, Md., 2006; incorporado a este documento por referência em sua totalidade) divulga vários excipientes usados na formulação de composições farmacêuticas e técnicas conhecidas para a preparação delas. Exceto na medida em que qualquer meio de excipiente convencional seja incompatível com uma substância ou seus derivados, tal como pela produção de qualquer efeito biológico indesejável ou, de outro nodo, pela interação de maneira deletéria com quaisquer outros componentes da composição farmacêutica, seu uso é contemplado como estando dentro do escopo desta invenção.
[00174] Em algumas modalidades, um excipiente farmaceuticamente aceitável é pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% puro. Em algumas modalidades, um excipiente é aprovado para uso em seres humanos e para uso veterinário. Em algumas modalidades, um excipiente é aprovado pela Agência de Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos. Em algumas modalidades, um excipiente é de grau farmacêutico. Em algumas modalidades, um excipiente atende aos padrões da Farmacopeia dos Estados Unidos (USP), da Farmacopeia Europeia (EP), da Farmacopeia Britânica e/ou da Farmacopeia Internacional.
[00175] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis usados na fabricação de composições farmacêuticas incluem, sem limitação, diluentes inertes, agentes dispersantes e/ou granulantes, agentes ativos de superfície e/ou emulsificantes, agentes desintegrantes, agentes de ligação, conservantes, agentes tamponantes, agentes lubrificantes e/ou óleos. Tais excipientes podem
92 / 136 ser opcionalmente incluídos em composições farmacêuticas.
[00176] Os diluentes exemplificativos incluem, sem limitação, carbonato de cálcio, carbonato de sódio, fosfato de cálcio, fosfato dicálcico, sulfato de cálcio, hidrogenofosfato de cálcio, lactose de fosfato de sódio, sacarose, celulose, celulose microcristalina, caulim, manitol, sorbitol, inositol, cloreto de sódio, amido seco, amido de milho, açúcar de confeiteiro, etc., e/ou suas combinações.
[00177] Os agentes granulantes e/ou dispersantes exemplificativos incluem, sem limitação, amido de batata, amido de milho, amido de tapioca, glicolato de amido de sódio, argilas, ácido algínico, goma guar, polpa cítrica, ágar, bentonita, produtos de celulose e madeira, esponja natural, resinas de troca catiônica, carbonato de cálcio, silicatos, carbonato de sódio, poli(vinil- pirrolidona) (cropspovidona) reticulada, amido de carboximetil de sódio (glicolato de amido de sódio), carboximetil celulose, carboximetil celulose sódica reticulada (croscarmelose) metilcelulose, amido pré-gelatinizado (amido 1500), amido microcristalino, amido insolúvel em água, carboximetil celulose cálcica, silicato de magnésio e alumínio (VEEGUM®), lauril sulfato de sódio, compostos de amônio quaternário, etc. e/ou suas combinações.
[00178] Os agentes ativos de superfície e/ou emulsificantes exemplificativos incluem, sem limitação, emulsificantes naturais (por exemplo, acácia, ágar, ácido algínico, alginato de sódio, tragacanto, chondrux, colesterol, xantana, pectina, gelatina, gema de ovo, caseína, gordura de lã, colesterol, cera e lecitina), argilas coloidais (por exemplo, bentonita [silicato de alumínio] e VEEGUM® [silicato de alumínio e magnésio]), derivados de aminoácidos de cadeia longa, álcoois de peso molecular elevado (por exemplo, álcool estearílico, álcool cetílico, álcool oleílico, monoesterato de gliceril e monoesterato de propilenoglicol, álcool polivinílico), carbômeros (por exemplo, carboxipolimetileno, ácido poliacrílico, polímero do ácido acrílico e polímero de carboxivinil), carragenina, derivados celulósicos (por
93 / 136 exemplo, carboximetilcelulose sódica, celulose em pó, hidroximetilcelulose, metilcelulose), ésteres de ácido graxo de sorbitano (por exemplo, monolaurato de polioxietileno sorbitano [TWEEN® 20], polioxietileno sorbitano [TWEEN® 60], mono-oleato de polioxietileno sorbitano [TWEEN® 80], monopalmitato de sorbitano [SPAN® 40], monoestearato de sorbitano [SPAN® 60], triestearato de sorbitano [SPAN® 65], mono-oleato de glicerila, mono-oleato de sorbitano [SPAN® 80]), ésteres de polioxietileno (por exemplo, monoestearato de polioxietileno [MYRJ® 45], óleo de rícino hidrogenado de polioxietileno, óleo de rícino polietoxilado, estearato de polioximetileno e SOLUTOL®), ésteres de ácido graxo de sacarose, ésteres de ácido graxo de polietileno (por exemplo, CREMOPHOR®), ésteres de polioxietileno (por exemplo, polioxietileno lauril éter [BRIJ® 30]) poli(vinil- pirrolidona), monolaurato de dietilenoglicol, oleato de trietanolamina, oleato de sódio, oleato de potássio, oleato de etila, ácido oleico, laurato de etila, lauril sulfato de sódio, PLUORINC® F 68, POLOXAMER® 188, brometo de cetrimônio, cloreto de cetilpiridínio, cloreto de benzalcônio, docusato sódico, etc. e/ou suas combinações.
[00179] Os agentes de ligação exemplificativos incluem, sem limitação, amido (por exemplo, pasta de amido e amido de milho); gelatina; açúcares (por exemplo, sacarose, glicose, dextrose, dextrina, melaço, lactose, lactitol, manitol); gomas naturais e sintéticas (por exemplo, acácia, alginato de sódio, extrato de musgo irlandês, goma panwar, goma ghatti, mucilagem de casca de isapol, carboximetilcelulose, metilcelulose, etilcelulose, hidroximetilcelulose, hidroxipropilcelulose, hidroxipropil metilcelulose, celulose microcristalina, acetato de celulose, poli(vinil-pirrolidona), silicato de alumínio e magnésio (Veegum®) e arabogalactana de larício); alginatos; óxido de polietileno; polietilenoglicol; sais de cálcio inorgânico; ácido silícico; polimetacrilatos; ceras; água; álcool, etc. e suas combinações.
[00180] Os conservantes exemplificativos podem incluir, sem
94 / 136 limitação, antioxidantes, agentes quelantes, conservantes antimicrobianos, conservantes antifúngicos, conservantes de álcool, conservantes ácidos e/ou outros conservantes.
Os antioxidantes exemplificativos incluem, sem limitação, alfa tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de acorbila, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabissulfito de potássio, ácido propiônico, galato de propila, ascorbato de sódio, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio e/ou sulfito de sódio.
Os agentes quelantes exemplificativos incluem ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido cítrico mono-hidratado, edetato dissódico, edetato dipotássico, ácido edético, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edetato de sódio, ácido tartárico e/ou edetato trissódico.
Os conservantes antimicrobianos exemplares incluem, sem limitação, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, álcool benzílico, bronopol, cetrimida, cloreto de cetilpiridínio, clorexidina, clorobutanol, clorocresol, cloroxilenol, cresol, álcool etílico, glicerina, hexetidina, imidureia, fenol, fenoxietanol, álcool feniletílico, nitrato fenilmercúrico, propilenoglicol e/ou timerosal.
Os conservantes antifúngicos exemplificativos incluem, sem limitação, butil parabeno, metil parabeno, etil parabeno, propil parabeno, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, benzoato de potássio, sorbato de potássio, benzoato de sódio, propionato de sódio e/ou ácido sórbico.
Os conservantes de álcool exemplificativos incluem, sem limitação, etanol, polietilenoglicol, fenol, compostos fenólicos, bisfenol, clorobutanol, hidroxibenzoato e/ou álcool feniletílico.
Os conservantes ácidos exemplificativos incluem, sem limitação, vitamina A, vitamina C, vitamina E, beta-caroteno, ácido cítrico, acético ácido, ácido dihidroacético, ácido ascórbico, ácido sórbico e/ou ácido fítico.
Outros conservantes incluem, sem limitação, tocoferol, acetato de tocoferol, mesilato de detergoxima, cetrimida, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), etilenodiamina, lauril sulfato de sódio (SLS), lauriléter sulfato de sódio (SLES), bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de potássio, metabissulfito de potássio,
95 / 136 GLYDANT PLUS®, PHENONIP®, metilparabeno, GERMALL® 115, GERMABEN® II, NEOLONE.TM., KATHON.TM. e/ou EUXYL®.
[00181] Os agentes tamponantes exemplificativos incluem, sem limitação, soluções tampão de citrato, soluções tampão de acetato, soluções tampão de fosfato, cloreto de amônio, carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, citrato de cálcio, glubionato de cálcio, gluceptato de cálcio, gluconato de cálcio, ácido D-glucônico, glicerofosfato de cálcio, lactato de cálcio, ácido propanoico, levulinato de cálcio, ácido pentanoico, fosfato de cálcio dibásico, ácido fosfórico, fosfato de cálcio tribásico, fosfato de hidróxido de cálcio, acetato de potássio, cloreto de potássio, gluconato de potássio, misturas de potássio, fosfato de potássio dibásico, fosfato de potássio monobásico, misturas de fosfato de potássio, acetato de sódio, bicarbonato de sódio, cloreto de sódio, citrato de sódio, lactato de sódio, fosfato de sódio dibásico, fosfato de sódio monobásico, misturas de fosfato de sódio, trometamina, hidróxido de magnésio, hidróxido de alumínio, ácido algínico, área sem pirogogênio, solução salina isotônica, solução de Ringer, álcool etílico, etc. e/ou suas combinações.
[00182] Os agentes lubrificantes exemplificativos incluem, sem limitação, estearato de magnésio, estearato de cálcio, ácido esteárico, sílica, talco, malte, behanato de glicerila, óleos vegetais hidrogenados, polietilenoglicol, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio, leucina, lauril sulfato de magnésio, lauril sulfato de sódio, etc. e suas combinações.
[00183] Os óleos exemplificativos incluem, sem limitação, amêndoa, semente de damasco, abacate, babaçu, bergamota, semente de groselha preta, borragem, cade, camomila, canola, alcaravia, carnaúba, mamona, canela, manteiga de cacau, coco, fígado de bacalhau, café, milho, semente de algodão, emu, eucalipto, prímula, peixe, linhaça, geraniol, cabaça, semente de uva, avelã, hissopo, miristato de isopropil, jojoba, noz kukui, lavandin,
96 / 136 lavanda, limão, litsea cubeba, noz de macadâmia, malva, semente de manga, semente de prado, vison, noz-moscada, oliva, laranja, peixe-relógio, palmeira, palmiste, semente de pêssego, amendoim, semente de papoula, semente de abóbora, colza, farelo de arroz, alecrim, cártamo, sândalo, sasanqua, segurelha-das-montanhas, espinheiro, gergelim, manteiga de karité, silicone, soja, girassol, árvore do chá, cardo, tsubaki, vetiver, noz e óleos do gérmen de trigo. Os óleos exemplificativos incluem, sem limitação, estearato de butila, triglicerídeos caprílicos, triglicerídeos cápricos, ciclometicona, sebacato de dietila, dimeticona 360, miristato de isopropila, óleo mineral, octildodecanol, álcool oleílico, óleo de silicone e/ou suas combinações.
[00184] Os excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras supositórias, agentes de coloração, agentes de revestimento, edulcorantes, aromatizantes e/ou agentes perfumadores, podem estar presentes na composição, de acordo com o critério do formulador. Distribuição
[00185] A presente divulgação engloba a administração do vetor de terapia gênica (por exemplo, polinucleotídeos) por qualquer via apropriada levando em consideração prováveis avanços nas ciências da administração da droga. A administração pode ser nua ou formulada. Administração Nua
[00186] Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser administrados a uma célula nua. Como usado neste documento, "nu" refere-se à administração de polinucleotídeos sem agentes que promovem transfecção. Por exemplo, os polinucleotídeos administrados à célula não podem conter nenhuma modificação. Os polinucleotídeos nus podem ser administrados à célula usando vias de administração conhecidas na técnica e descritas neste documento. Administração Formulada
[00187] Os polinucleotídeos podem ser formulados, usando os métodos
97 / 136 descritos neste documento. As formulações podem conter polinucleotídeos e podem incluir ainda, sem limitação, agentes de penetração de células, um carreador farmaceuticamente aceitável, um agente de administração, um polímero bioerodível ou biocompatível, um solvente e um depósito de administração de liberação sustentada. O mRNA dos polinucleotídeos formulados pode ser distribuído à célula usando vias de administração conhecidas na técnica e descritas neste documento. Administração
[00188] Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser administrados por qualquer via que resulte em um resultado terapeuticamente eficaz. Estas incluem, sem limitação, enteral, gastroenteral, epidural, oral, transdérmica, epidural (peridural), intracerebral (no cérebro), intracerebroventricular (nos ventrículos cerebrais), epicutânea (aplicação sobre a pele), intradérmica (na pele em si), subcutânea (sob a pele), administração nasal (pelo nariz), intravenosa (em uma veia), intra-arterial (em uma artéria), intramuscular (em um músculo), intracardíaca (no coração), infusão intraóssea (na medula óssea), intratecal (na medula espinhal), intraperitoneal (infusão ou injeção no peritôneo), infusão intravesical, intravítrea (pelos olhos), injeção intracavernosa (na base do pênis), administração intravaginal, intrauterina, administração extra-amniótica, transdérmica (difusão através da pele intacta para distribuição sistêmica), transmucosa (difusão através de uma membrana mucosa), insuflação (aspiração), sublingual, sublabial, enema, colírio para olhos (na conjuntiva), ou em gotas para os ouvidos. Em modalidades específicas, as composições podem ser administradas de uma maneira que permita que elas atravessem a barreira hematoencefálica, barreira vascular ou outra barreira epitelial. As vias não limitantes de administração para os polinucleotídeos, construtos primários ou mRNA da presente invenção são descritas abaixo. Administração Parenteral e Injetável
98 / 136
[00189] As formas de dosagem líquida para administração parenteral incluem, sem limitação, emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e/ou elixires farmaceuticamente aceitáveis. Além dos ingredientes ativos, as formas de dosagem líquida podem compreender diluentes inertes comumente usados na técnica, tais como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsificantes, tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de benzila, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol, dimetilformamida, óleos (em particular, de algodão, amendoim, milho, germe, oliva, mamona e gergelim), glicerol, álcool tetrahidrofurfurílico, polietilenoglicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitano e suas misturas. Além dos diluentes inertes, as composições orais podem incluir adjuvantes, tais como agentes umectantes, agentes emulsificantes e de suspensão, edulcorantes, aromatizantes e/ou agentes perfumadores. Em certas modalidades para administração parenteral, as composições são misturadas com agentes solubilizante, tais como CREMOPHOR® , álcoois, óleos, óleos modificados, glicóis, polissorbatos, ciclodextrinas, polímeros e/ou suas combinações.
[00190] As preparações injetáveis, por exemplo, suspensões aquosas ou oleaginosas injetáveis estéreis podem ser formuladas de acordo com a técnica conhecida usando agentes dispersantes, agentes umectantes e/ou agentes de suspensão adequados. As preparações injetáveis estéreis podem ser soluções estéreis injetáveis, suspensões e/ou emulsões em diluentes e/ou solventes parentericamente aceitáveis não tóxicos, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão água, solução de Ringer, U.S.P. e solução de cloreto de sódio isotônico. Os óleos estéreis e fixos são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para esta finalidade, qualquer óleo fixo brando pode ser empregado incluindo mono ou diglicerídeos sintéticos. Os ácidos graxos como ácido oleico podem ser
99 / 136 usados na preparação de injetáveis.
[00191] As formulações injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro de retenção de bactérias e/ou pela incorporação de agentes esterilizantes na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outro meio injetável estéril antes do uso.
[00192] A fim de prolongar o efeito de um ingrediente ativo, muitas vezes é desejável retardar a absorção do ingrediente ativo da injeção subcutânea ou intramuscular. Isto pode ser realizado pelo uso de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com baixa solubilidade em água. A taxa de absorção da droga, então, depende da sua taxa de dissolução que, por sua vez, pode depender do tamanho do cristal e forma cristalina. Alternativamente, a absorção retardada de uma forma de droga administrada por via parentérica é realizada dissolvendo ou suspendendo a droga em um veículo de óleo. As formas de depósito injetável são feitas pela formação de matrizes microencapsuladas da droga em polímeros biodegradáveis, tais como polilactida-poliglicolídeo. Dependendo da razão entre a droga e o polímero e a natureza do polímero particular empregado, a taxa de liberação da droga pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). Formulações injetáveis em depósito são preparadas aprisionando a droga em lipossomos ou microemulsões que são compatíveis com os tecidos corporais. Administração do Depósito
[00193] Conforme descrito neste documento, em algumas modalidades, a composição é formulada em depósitos para liberação prolongada. Geralmente, um órgão ou tecido específico (um "tecido alvo") é direcionado para administração.
[00194] Em alguns aspectos da invenção, os polinucleotídeos são espacialmente retidos dentro ou próximos a um tecido alvo. São fornecidos
100 / 136 métodos para fornecer uma composição a um tecido alvo de um sujeito mamífero ao colocar o tecido alvo (que contém uma ou mais células alvo) em contato com a composição em condições de modo que a composição, em particular, os componentes de ácido nucleico da composição, seja substancialmente retida no tecido alvo, o que significa que pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 ou mais de 99,99% da composição são retidos no tecido alvo. Vantajosamente, a retenção é determinada pela medição da quantidade de ácido nucleico presente na composição que adentra uma ou mais células alvo. Por exemplo, pelo menos 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,9, 99,99 ou mais de 99,99% dos ácidos nucleicos administrados ao sujeito estão presentes intracelularmente em um período de tempo após a administração. Por exemplo, a injeção intramuscular a um sujeito mamífero é realizada usando uma composição aquosa contendo um polinucleotídeo e um reagente de transfecção e a retenção da composição é determinada pela medição da quantidade de ácido ribonucleico presente nas células musculares.
[00195] Os aspectos da invenção são direcionados a métodos de fornecimento de uma composição a um tecido alvo de um sujeito mamífero, ao colocar o tecido alvo (contendo uma ou mais células lavo) em contato com a composição em condições de modo que a composição seja substancialmente retida no tecido alvo. A composição contém uma quantidade eficaz de um polinucleotídeo de modo que o polipeptídeo de interesse é produzido em pelo menos uma célula alvo. As composições contêm, geralmente, um agente de penetração celular, embora o ácido nucleico "nu" (tal como ácidos nucleicos sem um agente de penetração celular ou outro agente) também seja contemplado e um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00196] Em algumas circunstâncias, a quantidade de uma proteína produzida pelas células em um tecido é desejavelmente aumentada. Preferencialmente, este aumento na produção de proteína é espacialmente
101 / 136 restrito às células dentro do tecido alvo. Assim, são fornecidos métodos para aumentar a produção de uma proteína de interesse em um tecido de um sujeito mamífero. É fornecida uma composição que contém polinucleotídeos caracterizados pelo fato de que uma quantidade unitária de composição foi determinada para produzir o polipeptídeo de interesse em uma porcentagem substancial de células contidas em um volume predeterminado do tecido alvo.
[00197] Em algumas modalidades, a composição inclui uma pluralidade de polinucleotídeos diferentes, onde um ou mais dos polinucleotídeos codificam um polipeptídeo de interesse. Opcionalmente, a composição também contém um agente de penetração celular para auxiliar na administração intracelular da composição. É feita uma determinação da dose da composição necessária para produzir o polipeptídeo de interesse em uma porcentagem substancial de células contidas no volume predeterminado do tecido alvo (geralmente, sem induzir produção significativa do polipeptídeo de interesse no tecido adjacente ao volume predeterminado, ou distalmente ao tecido alvo). Após esta determinação, a dose determinada é introduzida diretamente no tecido do sujeito mamífero.
[00198] Em uma modalidade, a invenção fornece os polinucleotídeos a serem distribuídos em mais de uma injeção ou por injeções de dose dividida.
[00199] Em uma modalidade, a invenção pode ser retida em um tecido próximo ao alvo usando um reservatório de droga descartável, bomba de emplastro ou bomba osmótica pequena. Exemplos não-limitantes de bombas de emplastro incluem aquelas fabricadas e/ou vendidas por BD® (Franklin Lakes, N.J.), Insulet Corporation (Bedford, Mass.), SteadyMed Therapeutics (San Francisco, Calif.), Medtronic (Minneapolis, Minn.) (por exemplo, MiniMed), UniLife (York, Pa.), Valeritas (Bridgewater, N.J.) e SpringLeaf Therapeutics (Boston, Mass.). Um exemplo não limitante de uma bomba osmótica inclui aquelas fabricadas por DURECT® (Cupertino, Calif.) (por exemplo, DUROS® e ALZET®).
102 / 136 Dosagem
[00200] A presente invenção fornece métodos que compreendem a administração de um vetor de terapia gênica que compreende polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo terapêutico multidomínio e, opcionalmente, o polipeptídeo terapêutico multidomínio a um sujeito em necessidade disso. Em algumas modalidades, um método compreende a administração de um vetor de terapia gênica que compreende polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo terapêutico multidomínio em uma quantidade terapeuticamente eficaz a um paciente em necessidade, em que a quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para anular a administração subsequente do polipeptídeo terapêutico multidomínio. Consequentemente, em algumas modalidades, um método de tratamento de um paciente em necessidade que carece de uma enzima, por exemplo, reduzindo os níveis de glicogênio e/ou reduzindo CRIM em GAA em um paciente com doença de Pompe, compreende a administração, ao paciente, de um vetor de terapia gênica que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína terapêutica multidomínio que compreende a enzima de reposição, por exemplo, uma proteína de fusão scFv anti-CD63::GAA, por exemplo, uma proteína terapêutica multidomínio compreendendo a sequência indicada como SEQ ID NO:11, em uma quantidade terapeuticamente eficaz, em que a quantidade terapeuticamente eficaz nega a necessidade de administração subsequente, ao paciente, da enzima de reposição, por exemplo, GAA ou derivados da mesma. Em algumas modalidades, um método de tratamento de um paciente que carece de uma enzima e em necessidade da mesma, por exemplo, reduzindo os níveis de glicogênio e/ou reduzindo CRIM em GAA em um paciente com doença de Pompe, compreende a administração, ao paciente, de um vetor de terapia gênica que compreende um polinucleotídeo que codifica uma proteína terapêutica multidomínio que compreende uma enzima de reposição, por exemplo, uma proteína de fusão scFv anti-CD63::GAA, por exemplo, uma
103 / 136 proteína terapêutica multidomínio compreendendo a sequência indicada como SEQ ID NO:11, em uma quantidade terapeuticamente eficaz, e compreende ainda a administração, ao paciente, de uma quantidade terapeuticamente eficaz da enzima de reposição. Os ácidos nucleicos, proteínas ou complexos, ou composições farmacêuticas, de imagem, diagnósticas ou profiláticas destes, podem ser administradas a um sujeito usando qualquer quantidade e qualquer via de administração eficaz para prevenir, tratar, diagnosticar ou gerar imagens de uma doença, distúrbio e/ou condição (por exemplo, uma doença, distúrbio e/ou condição relacionada a déficits de memória operacional).
[00201] A quantidade exata necessária variará de sujeito para sujeito, dependendo da espécie, idade e condição geral do sujeito, da gravidade da doença, da composição particular, do seu modo de administração, do modo de atividade e similares.
[00202] A dose de vetores virais AAV, por exemplo, as unidades de dose em genomas de vetor/por quilograma de peso corporal (vg/kg), necessária para alcançar um efeito desejado ou "efeito terapêutico" (por exemplo, uma certa concentração sérica de uma enzima de reposição) irá variar com base em vários fatores, incluindo, mas não se limitando a: a via de administração de AAV, o nível de expressão necessário para alcançar um efeito terapêutico, a doença ou distúrbio específico sendo tratado e a estabilidade da proteína terapêutica multidomínio de expressão. Um versado na técnica pode determinar prontamente uma faixa de dose de vírion de AAV para tratar um sujeito tendo uma doença ou distúrbio específico com base nos fatores acima mencionados, bem como outros fatores que são bem conhecidos na técnica, ver, por exemplo, CDER “Guidance for Industry Estimate the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Volunteers for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers,” Julho de 2005, incorporado neste documento em sua totalidade por referência. Uma quantidade eficaz de AAV está
104 / 136 geralmente na faixa de cerca de 10 μl a cerca de 100 ml de solução contendo cerca de 109 a 1016 cópias do genoma por sujeito.
Outros volumes de solução podem ser usados.
O volume usado normalmente dependerá, entre outras coisas, do tamanho do sujeito, da dose do AAV e da via de administração.
Em algumas modalidades, uma dosagem entre cerca de 1010 a 1012 O genoma viral AAV por sujeito é apropriado.
Em algumas modalidades, o AAV é administrado em uma dose de 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, ou 1015 cópias do genoma por sujeito.
Em algumas modalidades, o AAV é administrado em uma dose de 1010, 1011, 1012, 1013ou 1014 genomas virais por kg.
Em algumas modalidades, pelo menos 2 x 1012 os genomas virais por quilograma (vg/kg) são administrados.
Em algumas modalidades, a dose administrada fornece um nível de soro de proteína terapêutica multidomínio limiar.
Em algumas modalidades, o nível de soro de proteína terapêutica limite é pelo menos 1 μg/mL.
Em algumas modalidades, a dose administrada fornece um nível de soro de proteína terapêutico multidomínio superior a 2 μg/mL.
Em algumas modalidades, a dose administrada fornece um nível de soro de proteína terapêutico multidomínio superior a 3 μg/mL.
Em algumas modalidades, a dose administrada fornece um nível de soro de proteína terapêutico multidomínio superior a 4 μg/mL.
Em algumas modalidades, a dose administrada fornece um nível de soro de proteína terapêutico multidomínio superior a 5 μg/mL.
Em algumas modalidades, a dose administrada fornece um nível de soro de proteína terapêutico multidomínio superior a 6 μg/mL.
Em algumas modalidades, a dose administrada fornece um nível de soro de proteína terapêutico multidomínio superior a 7 μg/mL.
Em algumas modalidades, a dose administrada fornece um nível de soro de proteína terapêutico multidomínio superior a 8 μg/mL.
Em algumas modalidades, a dose administrada fornece um nível de soro de proteína terapêutico multidomínio superior a 9 μg/mL.
Em algumas modalidades, a dose administrada fornece um nível de soro de proteína terapêutico multidomínio
105 / 136 superior a 10 μg/mL. Em algumas modalidades, a dose administrada fornece um nível de soro de proteína terapêutico multidomínio superior a 11 μg/mL. Em algumas modalidades, a dose administrada fornece um nível de soro de proteína terapêutico multidomínio superior a 12 μg/mL. Em algumas modalidades, a dose administrada fornece um nível de soro de proteína terapêutico multidomínio superior a 13 μg/mL. Em algumas modalidades, a dose administrada fornece um nível de soro de proteína terapêutico multidomínio superior a 14 μg/mL. Em algumas modalidades, a dose administrada fornece um nível de soro de proteína terapêutico multidomínio superior a 15 μg/mL.
[00203] As composições de acordo com a invenção são tipicamente formuladas em forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e uniformidade de dosagem. Será entendido, no entanto, que o uso diário total das composições da presente invenção pode ser decidido pelo médico assistente dentro do escopo do julgamento médico consolidado. O nível de dose terapeuticamente eficaz, profilaticamente eficaz ou de imagem apropriado específico para qualquer paciente em particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo o distúrbio que está sendo tratado e a gravidade do distúrbio; a atividade do composto específico empregado; a composição específica empregada; idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do paciente; tempo de administração, via de administração e taxa de excreção do composto específico empregado; duração do tratamento; drogas usadas em combinação ou simultaneamente ao composto específico empregado; e fatores similares bem conhecido nas técnicas médicas.
[00204] Modalidades não limitantes e exemplares estão listadas abaixo.
[00205] Modalidade 1. Método de administração de uma proteína terapêutica ao sistema nervoso central (SNC) de um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao sujeito, de uma composição nucleotídica que codifica uma proteína terapêutica multidomínio através de
106 / 136 um método de liberação direcionado ao fígado suficiente para fornecer uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína terapêutica multidomínio no SNC, em que a proteína terapêutica multidomínio compreende um domínio de liberação e um domínio enzimático.
[00206] Modalidade 2. Método, de acordo com a modalidade 1, em que o domínio de liberação é um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um efetor de internalização.
[00207] Modalidade 3. Método, de acordo com a modalidade 1 ou a modalidade 2, em que de que a proteína terapêutica é uma enzima lisossômica.
[00208] Modalidade 4. Método, de acordo com a modalidade 3, em que a enzima lisossômica é GAA.
[00209] Modalidade 5. Método, de acordo com as modalidades 1-4, em que o vetor viral é um vetor AAV, opcionalmente em que a composição nucleotídica é administrada em uma dose de pelo menos 2 x 1012 genomas virais por quilograma (vg/kg).
[00210] Modalidade 6. Método, de acordo com a modalidade 5, em que o vetor viral é um vetor AAV.
[00211] Modalidade 7. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-6, em que o efetor de internalização é expresso na superfície das células selecionadas do grupo consistindo em: células no SNC, células epiteliais e células que atravessam a barreira hematoencefálica.
[00212] Modalidade 8. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-7, em que o domínio de liberação se liga a um efetor de internalização (i) selecionado do grupo consistindo em CD63, Integrina alfa- 7 (ITGA7), MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, receptor de transferrina, receptor de LDL, receptor da proteína 1 relacionada a LDL, ASGR1, ASGR2, proteína 2 similar à proteína precursora amiloide (APLP2),
107 / 136 receptor de apelina (APLNR), mielina e proteína linfocitária (MAL), IGF2R, H+ ATPase tipo vacuolar, receptor da toxina diftérica, receptor de folato, receptores de glutamato, receptor de glutationa, receptores de leptina, receptor scavenger A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3 e CD36; (ii) expresso em vários tipos de tecido selecionado opcionalmente do grupo consistindo em CD63, MHC-I, H+ ATPase tipo vacuolar, IGF2R, Integrina alfa-7 (ITGA7), LRP5, LRP6, LRP8, Kremen-2, receptor de LDL, receptor da proteína 1 relacionado a LDL, proteína 2 similar à proteína precursora amiloide (APLP2), receptor de apelina (APLNR), PRLR, MAL (mielina e proteína linfocitária (MAL), receptores de toxina diftérica, HBEGF (fator de crescimento semelhante ao EGF ligado à heparina), receptores de glutationa, receptores de glutamato, receptores de leptina e receptores de folato, opcionalmente, em que o sujeito apresenta um ou mais sintomas de uma doença selecionada do grupo consistindo em doença de Fabry, doença de Gaucher, MPS I, MPS II, MPS IIIA, MPS IIIB, MPS IIID, MPS IVB, MPS VI, MPS VII, MPS IX, doença de Pompe, deficiência de lipase ácida lisossômica, leucodistrofia metacromática, doenças de Niemann- Pick tipos A, B e C2, alfa-manosidose, deficiência da neuraminidase, sialidose, aspartilglicosaminúria, deficiência combinada de saposina, doença de Gaucher atípica, lipogranulomatose de Farber, fucosidose e beta- manosidose; (iii) preferencialmente expresso por osso e/ou cartilagem, selecionado opcionalmente do grupo consistindo em Colágeno X, Integrina alfa 10 (ITGA10), receptor 3 do fator de crescimento de fibroblasto (FGFR3), isoforma C do receptor do fator de crescimento de fibroblasto (FGFR3C), proteína 1 de ligação de hialuronano e proteoglicano (CRTL1), Agrecano, Colágeno II e Kremen-1, opcionalmente, em que o sujeito apresenta um ou mais
108 / 136 sintomas de uma doença selecionada do grupo consistindo em MPS I, MPS II, MPS IIIA, MPS IIIB, MPS IIID, MPS IVA, MPS IVB, MPS VI, MPS VII, MPS IX, beta-manosidose, doença de Gaucher, doença de Gaucher atípica, deficiência combinada de saposina, aspartilglicosaminúria, lipogranulomatose de Farber, sialidose, deficiência da neuraminidase e alfa-manosidose; (iv) expresso preferencialmente por monócitos, macrófagos ou microglia, selecionado opcionalmente do grupo consistindo em receptor scavenger A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3, CD36, MSR1 (receptor 1 scavenger de macrófagos), MRC1 (receptor 1 de manose de macrófagos), VSIG4 (proteína 4 contendo domínio de imunoglobulina e conjunto V), CD68 (macrosialina) e CSF1R (receptor de fator estimulador de colônias de macrófagos 1), opcionalmente em que o sujeito apresenta um ou mais sintomas de uma doença selecionada do grupo consistindo em deficiência de lipase ácida lisossômica, doença de Gaucher, doença de Gaucher atípica, deficiência combinada de saposina e lipogranulomatose de Farber; (v) expresso preferencialmente por células renais, opcionalmente selecionado do grupo consistindo em CDH16 (Caderina-16), CLDN16 (Claudina-16), KL (Klotho), PTH1R (receptor de hormônio da paratireoide), SLC22A13 (membro 13 da família 22 de carreadores de soluto), SLC5A2 (cotransportador 2 de sódio/glicose) e UMOD (uromodulina), opcionalmente em que o sujeito apresenta um ou mais sintomas ou é diagnosticado com uma doença selecionada do grupo consistindo em doença de Fabry, síndrome de Alport, doença renal policística e púrpura trombocitopênica trombótica; (vi) expresso preferencialmente por células hepáticas, opcionalmente, ASGR1 ou ASGR2, opcionalmente, em que o sujeito apresenta um ou mais sintomas ou é diagnosticado com uma doença selecionada do grupo
109 / 136 consistindo em uma deficiência de lipase ácida lisossômica, doença de Gaucher, MPS VI, MPS VII, MPS II, doença de Niemann-Pick tipos A, B e C2, sialidose, deficiência de neuraminidase, doença atípica de Gaucher, deficiência combinada de saposina, lipogranulomatose de Farber; (vii) expresso preferencialmente por células musculares, opcionalmente selecionado do grupo consistindo em BMPR1A (receptor 1A da proteína morfogenética óssea), m-caderina, CD9, MuSK (quinase músculo-específica), LGR4/GPR48 (receptor 48 acoplado à proteína G), receptor colinérgico (nicotiníco) alfa 1, CDH15 (Caderina-15), ITGA7 (Integrina alfa-7), CACNG1 (canal de cálcio tipo L subunidade gama-1), CACNAlS (canal de cálcio tipo L subunidade alfa-15), CACNG6 (canal de cálcio tipo L subunidade gama-6), SCN1B (canal de sódio subunidade beta- 1), CHRNA1 (receptor de ACh subunidade alfa), CHRND (receptor de ACh subunidade delta), LRRC14B (proteína 14B contendo repetições ricas em leucina), distroglicano (DAG1) e POPDC3 (proteína 3 contendo domínio Popeye), opcionalmente, em que o sujeito apresenta um ou mais sintomas ou é diagnosticado com doença de Pompe; (viii) selecionado do grupo consistindo em ITGA7, CD9, CD63, ALPL2, MSR1, ASGR1, ASGR2 ou PRLR; ou (ix) que é CD63.
[00213] Modalidade 9. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-8, em que o domínio de liberação é um fragmento variável de cadeia única (scFv).
[00214] Modalidade 10. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-9, em que a proteína de ligação ao receptor de superfície celular (CSR) (CSR-BP) compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2.
[00215] Modalidade 11. Método, de acordo com qualquer uma das
110 / 136 modalidades 1-10, em que a proteína terapêutica compreende uma hidrolase.
[00216] Modalidade 12. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-11, em que a proteína terapêutica compreende uma glicosilase.
[00217] Modalidade 13. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-12, em que a proteína terapêutica compreende uma glicosidase.
[00218] Modalidade 14. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-13, em que a proteína terapêutica compreende uma alfa- glicosidase.
[00219] Modalidade 15. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-14, em que a proteína terapêutica compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:13, ou um fragmento desta.
[00220] Modalidade 16. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-15, em que a proteína terapêutica compreende um anticorpo anti-ABeta ou anti-Tau.
[00221] Modalidade 17. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-16, em que o polinucleotídeo compreende uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:11.
[00222] Modalidade 18. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-17, em que o domínio enzimático compreende uma alfa- glicosidade, e em que os níveis de glicogênio em qualquer tecido do SNC no sujeito são reduzidos por pelo menos nove meses após o tratamento.
[00223] Modalidade 19. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-18, em que o sujeito tem a doença de Pompe.
[00224] Modalidade 20. Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-19, em que a composição nucleotídica administrada fornece um nível sérico de proteína terapêutica multidomínio de pelo menos 1 μg/mL.
[00225] Modalidade 21. Proteína terapêutica multidomínio caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais domínios de liberação
111 / 136 e um domínio enzimático, em que o um ou mais domínios de liberação se ligam ao receptor de transferrina humano (hTfR).
[00226] Modalidade 22. Proteína terapêutica de múltiplos domínios, de acordo com a modalidade 21, em que compreende ainda um segundo domínio de liberação que se liga a um efetor de internalização.
[00227] Modalidade 23. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com a modalidade 22, em que o segundo domínio de liberação se liga a (i) um efetor de internalização selecionado do grupo consistindo em CD63, Integrina alfa-7 (ITGA7), MHC-I, Kremen-1, Kremen- 2, LRP5, LRP6, LRP8, receptor de transferrina, receptor de LDL, receptor da proteína 1 relacionada a LDL, ASGR1, ASGR2, proteína 2 similar à proteína precursora amiloide (APLP2), receptor de apelina (APLNR), mielina e proteína linfocitária (MAL), IGF2R, H+ ATPase tipo vacuolar, receptor da toxina diftérica, receptor de folato, receptores de glutamato, receptor de glutationa, receptores de leptina, receptor scavenger A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3 e CD36; (ii) um efetor de internalização expresso em vários tipos de tecido selecionado opcionalmente do grupo consistindo em CD63, MHC-I, H+ ATPase tipo vacuolar, IGF2R, Integrina alfa-7 (ITGA7), LRP5, LRP6, LRP8, Kremen-2, receptor de LDL, receptor da proteína 1 relacionado a LDL, proteína 2 similar à proteína precursora amiloide (APLP2), receptor de apelina (APLNR), PRLR, MAL (mielina e proteína linfocitária (MAL), receptores de toxina diftérica, HBEGF (fator de crescimento semelhante ao EGF ligado à heparina), receptores de glutationa, receptores de glutamato, receptores de leptina e receptores de folato; (iii) um efetor de internalização preferencialmente expresso por osso e/ou cartilagem, selecionado opcionalmente do grupo consistindo em Colágeno X, Integrina alfa 10 (ITGA10), receptor 3 do fator de crescimento de fibroblasto (FGFR3), isoforma C do receptor do fator de crescimento de
112 / 136 fibroblasto (FGFR3C), proteína 1 de ligação de hialuronano e proteoglicano (CRTL1), Agrecano, Colágeno II e Kremen-1; (iv) um efetor de internalização expresso preferencialmente por monócitos, macrófagos ou microglia, selecionado opcionalmente do grupo consistindo em receptor scavenger A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3, CD36, MSR1 (receptor 1 scavenger de macrófagos), MRC1 (receptor 1 de manose de macrófagos), VSIG4 (proteína 4 contendo domínio de imunoglobulina e conjunto V), CD68 (macrosialina) e CSF1R (receptor de fator estimulador de colônias de macrófagos 1); (v) um efetor de internalização expresso preferencialmente por células renais, opcionalmente selecionado do grupo consistindo em CDH16 (Caderina-16), CLDN16 (Claudina-16), KL (Klotho), PTH1R (receptor de hormônio da paratireoide), SLC22A13 (membro 13 da família 22 de carreadores de soluto), SLC5A2 (cotransportador 2 de sódio/glicose) e UMOD (uromodulina). Em outras determinadas modalidades, o efetor de internalização é um internalizador músculo-específico, tal como BMPR1A (receptor 1A de proteína morfogenética óssea), m-caderina, CD9, MuSK (quinase músculo-específica), LGR4/GPR48 (receptor 48 acoplado à proteína G), receptor colinérgico (nicotiníco) alfa 1, CDH15 (Caderina-15), ITGA7 (Integrina alfa-7), CACNG1 (canal de cálcio tipo L subunidade gama-1), CACNAlS (canal de cálcio tipo L subunidade alfa-15), CACNG6 (canal de cálcio tipo L subunidade gama-6), SCN1B (canal de sódio subunidade beta- 1), CHRNA1 (receptor de ACh subunidade alfa), CHRND (receptor de ACh subunidade delta), LRRC14B (proteína 14B contendo repetições ricas em leucina), distroglicano (DAG1) e POPDC3 (proteína 3 contendo domínio Popeye); (vi) um efetor de internalização expresso preferencialmente por células hepáticas, opcionalmente, ASGR1 ou ASGR2; (vii) um efetor de internalização expresso preferencialmente
113 / 136 por células musculares, opcionalmente selecionado do grupo consistindo em BMPR1A (receptor 1A da proteína morfogenética óssea), m-caderina, CD9, MuSK (quinase músculo-específica), LGR4/GPR48 (receptor 48 acoplado à proteína G), receptor colinérgico (nicotiníco) alfa 1, CDH15 (Caderina-15), ITGA7 (Integrina alfa-7), CACNG1 (canal de cálcio tipo L subunidade gama- 1), CACNAlS (canal de cálcio tipo L subunidade alfa-15), CACNG6 (canal de cálcio tipo L subunidade gama-6), SCN1B (canal de sódio subunidade beta-1), CHRNA1 (receptor de ACh subunidade alfa), CHRND (receptor de ACh subunidade delta), LRRC14B (proteína 14B contendo repetições ricas em leucina), distroglicano (DAG1) e POPDC3 (proteína 3 contendo domínio Popeye), ou (viii) uma proteína efetora de internalização selecionada do grupo consistindo em ITGA7, CD9, CD63, ALPL2, MSR1, ASGR1, ASGR2 ou PRLR.
[00228] Modalidade 24. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com qualquer uma das modalidades 21-23, em que o segundo domínio de liberação se liga ao efetor de internalização CD63.
[00229] Modalidade 25. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com qualquer uma das modalidades 21-24, em que pelo menos um dos um ou mais domínios de liberação compreende uma proteína de ligação ao antígeno.
[00230] Modalidade 26. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com a modalidade 25, em que cada um dos um ou mais domínios de liberação compreende uma proteína de ligação ao antígeno.
[00231] Modalidade 27. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com qualquer uma das modalidades 21-26, em que pelo menos um dos um ou mais domínios de liberação compreende um fragmento variável de cadeia única (scFv).
[00232] Modalidade 28. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com qualquer uma das modalidades 21-27, em que pelo menos um dos um ou
114 / 136 mais domínios de liberação compreende um half-body.
[00233] Modalidade 29. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com a modalidade 28, em que o domínio de liberação que se liga ao hTfR é um scFv, em que o half-body se liga a CD63, em que o domínio enzimático é GAA, e em que GAA é conjugado ao terminal carbóxi do half-body que se liga a CD63.
[00234] Modalidade 30. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com a modalidade 27, em que cada um dos um ou mais domínios de liberação compreende um scFv.
[00235] Modalidade 31. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com qualquer uma das modalidades 27-30, em que pelo menos um scFv é fundido a um Fc.
[00236] Modalidade 32. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com a modalidade 31, em que o Fc compreende um isotipo IgG4 humano do tipo selvagem, ou derivado do mesmo.
[00237] Modalidade 33. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com qualquer uma das modalidades 31-32, em que GAA é conjugado ao terminal carbóxi do Fc.
[00238] Modalidade 34. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com a modalidade 30, que compreende um scFv anti-hTfR, um scFv anti- hCD63.
[00239] Modalidade 35. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com a modalidade 34, em que o scFv anti-hTfR e o scFv anti-hCD63 estão ambos ligados, em seu terminal carbóxi, a uma única enzima GAA.
[00240] Modalidade 36. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com qualquer uma das modalidades 21-27, em que o domínio de liberação é um scFv anti-hTfR e o domínio enzimático está ligado ao terminal carbóxi do domínio VL do scFv.
[00241] Modalidade 37. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo
115 / 136 com a modalidade 36, que compreende ainda um segundo domínio de liberação ligado ao terminal N do domínio VH do scFv anti-hTfR.
[00242] Modalidade 38. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com a modalidade 37, em que o segundo domínio de liberação é um scFV anti-hCD63.
[00243] Modalidade 39. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o domínio enzimático compreende a sequência de aminoácidos indicada como SEQ ID NO:1.
[00244] Modalidade 40. Polinucleotídeo em que codifica a proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer uma das modalidades 21- 39 ou modalidades 50-64.
[00245] Modalidade 41. Polinucleotídeo, de acordo com a modalidade 40, que compreende ainda uma sequência de ácido nucleico de vírus e uma sequência de ácido nucleico direcionada a um locus.
[00246] Modalidade 42. Polinucleotídeo, de acordo com a modalidade 40 ou modalidade 41, que compreende ainda uma sequência de ácido nucleico de vírus e uma sequência de ácido nucleico direcionada a um locus, em que a sequência de ácido nucleico de vírus é uma sequência de ácido nucleico de vírus adeno-associado (AAV).
[00247] Modalidade 43. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 40-42, em que compreende ainda uma sequência de ácido nucleico de vírus e uma sequência de ácido nucleico direcionada a um locus, em que a sequência de ácido nucleico de vírus é uma sequência de ácido nucleico de vírus adeno-associado (AAV), e em que a sequência de ácido nucleico de AAV compreende uma sequência de repetição terminal interna e, opcionalmente, um elemento regulador tecido-específico, tal como um promotor específico de fígado ou um promotor específico neuronal.
[00248] Modalidade 44. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 40-43, em que compreende ainda uma sequência de ácido
116 / 136 nucleico de vírus e uma sequência de ácido nucleico direcionada a um locus, em que a sequência de ácido nucleico de vírus é uma sequência de ácido nucleico de vírus adeno-associado (AAV) que compreende uma sequência de repetição terminal interna que compreende a SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, ou ambas, e, opcionalmente, um elemento regulador tecido-específico, tal como um promotor específico de fígado ou um promotor específico neuronal.
[00249] Modalidade 45. Polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 40-44, em que compreende ainda um elemento regulador tecido-específico que compreende a sequência indicada como SEQ ID NO:8 e/ou SEQ ID NO:9.
[00250] Modalidade 46. Vetor de terapia gênica em que compreende um polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 40-45.
[00251] Modalidade 47. Vetor de terapia gênica, de acordo com a modalidade 46, em que o vetor de terapia gênica é selecionado do grupo consistindo em um vetor viral, opcionalmente em que o vetor viral é um vírus natural, um vírus manipulado ou um vírus quimérico, um polinucleotídeo nu que compreende o polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 20-25, um complexo polinucleotídico, opcionalmente em que o complexo polinucleotídico é uma nanopartícula lipídica que compreende o polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das modalidades 20-25, e lipídios, e qualquer combinação destes.
[00252] Modalidade 48. Vetor de terapia gênica, de acordo com a modalidade 46 ou modalidade 47, em que o vetor de terapia gênica é um vetor viral selecionado do grupo consistindo em um retrovírus, adenovírus, vírus herpes simplex, poxvírus, vírus vaccinia, lentivírus ou um vírus adeno- associado.
117 / 136
[00253] Modalidade 49. Vetor de terapia gênica, de acordo com a modalidade 47 ou modalidade 48, em que o vetor de terapia gênica é AAV9, Anc80, uma quimera AAV2/8 e/ou um AAV pseudotipado em um tecido específico, por exemplo, o fígado ou tecido neuronal.
[00254] Modalidade 50. Proteína terapêutica multidomínio caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos dois domínios de liberação e pelo menos um domínio enzimático, em que cada um dos dois domínios de liberação é selecionado independentemente do grupo consistindo em um anticorpo, um half-body e um scFv, e em que pelo menos um ou mais dos domínios de liberação estão associados ao pelo menos um domínio enzimático, preferencialmente em que o um ou mais domínios de liberação estão covalentemente ligados ao pelo menos um domínio enzimático.
[00255] Modalidade 51. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com a modalidade 50, em que compreende não mais que dois domínios de liberação.
[00256] Modalidade 52. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com a modalidade 50 ou modalidade 51, em que apenas um dos domínios de liberação está associado ao pelo menos um domínio enzimático.
[00257] Modalidade 53. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com qualquer uma das modalidades 50-52, em que cada um dos pelo menos dois domínios de liberação é covalentemente ligado a um domínio enzimático.
[00258] Modalidade 54. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com a modalidade 53, em que cada um dos pelo menos dois domínios de liberação é covalentemente ligado ao mesmo domínio enzimático.
[00259] Modalidade 55. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com a modalidade 53, em que cada um dos pelo menos dois domínios de liberação é covalentemente ligado a um domínio enzimático diferente.
[00260] Modalidade 56. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo
118 / 136 com qualquer uma das modalidades 50-55, em que a proteína terapêutica multidomínio compreende não mais que dois domínios de liberação, em que o primeiro domínio de liberação compreende um half-body, e em que o segundo domínio de liberação compreende um scFv.
[00261] Modalidade 57. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com a modalidade 56, em que o scFv é fundido a um Fc.
[00262] Modalidade 58. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com a modalidade 56 ou modalidade 57, em que o half-body está covalentemente ligado, em seu terminal carbóxi, a um primeiro domínio enzimático e/ou em que o scFv está covalentemente ligado, em seu terminal carbóxi, a um Fc e, opcionalmente, a um segundo domínio enzimático.
[00263] Modalidade 59. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com qualquer uma das modalidades 50-55, em que a proteína terapêutica multidomínio compreende não mais que dois domínios de liberação, em que o primeiro e o segundo domínio de liberação compreendem, cada um, um scFv.
[00264] Modalidade 60. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com a modalidade 59, em que tanto o primeiro quanto o segundo scFv estão covalentemente ligados a um domínio enzimático.
[00265] Modalidade 61. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com a modalidade 59, em que compreende, de terminal N para terminal C: o primeiro scFv, o segundo scFv e o domínio enzimático.
[00266] Modalidade 62. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com qualquer uma das modalidades 50-61, em que pelo menos um domínio de liberação se liga a uma molécula de tráfego lisossômico e pelo menos um domínio de liberação se liga a um efetor de transcitose.
[00267] Modalidade 63. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com a modalidade 62, em que a molécula de tráfego lisossômico é selecionada do grupo consistindo em CD63, ITGA7, CD9, CD63, CD81, CD82, ou CD151, e em que o efetor de transcitose é selecionado do grupo
119 / 136 consistindo em um receptor de LDL, um receptor de IgA, um receptor de transferrina, um receptor de Fc neonatal, receptor de insulina, CD98 e Basigina.
[00268] Modalidade 64. Proteína terapêutica multidomínio, de acordo com qualquer uma das modalidades 50-63, em que compreende uma estrutura conforme retratada na Figura 1C, Figura 1D, Figura 1E ou Figura 1F.
[00269] Modalidade 65. Uso de um nucleotídeo que codifica a proteína terapêutica multidomínio, de acordo com qualquer uma das modalidades 21- 39 e 50-64, o polinucleotídeo, de acordo com qualquer uma das modalidades 40-45, ou o vetor de terapia gênica, de acordo com qualquer uma das modalidades 46-49, em que se aplica no método de acordo com qualquer uma das modalidades 1-20.
[00270] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar em maior detalhe os métodos da presente invenção. Os exemplos a seguir são fornecidos para fins ilustrativos apenas e não se destinam a limitar o escopo da invenção de nenhuma forma.
EXEMPLOS Exemplo 1: Construção de Polinucleotídeo Anti-hCD63 ScFv::GAA e Vetor de Terapia Gênica
[00271] Os vírus AAV2/8 que codificam para a expressão de GAA humana (hGAA; SEQ ID NO:1; sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID NO:12) ou um fragmento variável de cadeia única (ScFv) anti-CD63 humano fundido em seu terminal C à GAA humana (anti-hCD63 ScFv- hGAA; SEQ ID NO:10; ácido nucleico representado por SEQ ID NO:11) foram gerados usando um protocolo de transfecção triplo padrão (Gray et al. 2011; vide também “Production of recombinant adeno-associated viral vectors and use in vitro and in vivo administration”, Current Protocols in Neuroscience, John Wiley & Sons, New York (1999), pp. 4.17.1–4.17.25, Vol 1). Para a produção, 1×107 de células HEK293 foram plaqueadas em placas
120 / 136 de 15 cm. No dia seguinte, as células foram transfectadas com (A) ou 8 μg de um vetor pAAV de controle compreendendo um potenciador de serpina 1 específico do fígado (SEQ ID NO:9) e codificando GAA humana conduzido por TTR ou pAAV de teste compreendendo um potenciador de serpina 1 específico do fígado (SEQ ID NO:9) e codificando um hCD63-hGAA conduzido por TTR (vide Figura 1B) e (B) vetor derivado de pAAV RC2/8 (Gao, 2002) e 16 μg de pHelper (Agilent, Cat #240074) usando a transfecção mediada por PEIpro (transfection Polyplus, Nova York, NY catálogo# 115- 100) na razão de 1:1 (1ul PEIpro: 1µg DNA). Setenta e duas horas após a transfecção, as células foram coletadas e lisadas em um tampão composto de 20mM de Tris-HCl, 1mM de MgCl2, 2,5 mM de KCl, 100 mM de NaCl usando um método padrão de congelamento-descongelamento. Em seguida, benzonase (Sigma, Cat# E1014-25KU) foi adicionada às amostras em uma concentração final de 0,5 U/μL e foi então incubada a 37°C por 60 minutos. Os vírus foram então purificados usando ultracentrifugação de gradiente de iodixanol conforme descrito em (Zolotukhin et al., 1999, Gene Ther 1999;6:973–985) e, posteriormente foram titulados por qPCR.
[00272] As amostras de AAV foram tratadas com DNasel (Thermofisher Scientific, Cat #EN0525) a 37°C por uma hora e lisadas usando extrato de DNA All Reagents (Thermofisher Scientific Cat# 4403319). Os genomas virais encapsidados foram quantificados usando um Sistema de PCR em Tempo Real QuantStudio 3 (Thermofisher Scientific) usando primers direcionados a ITRs de AAV2. As sequências dos primers de ITRs de AAV2 são 5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′ (ITR fwd; SEQ ID NO:3) e 5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′ (ITR rev; SEQ ID NO:4) (Aurnhammer et al., 2012), derivou a sequência de repetição invertida interna esquerda (ITR) de AAV (SEQ ID NO:6) e a sequência de repetição invertida interna direita (ITR) de AAV (SEQ ID NO:7), respectivamente. A sequência da sonda de ITRs de AAV2 é 5′-6-FAM-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-
121 / 136 TAMRA-3′ (SEQ ID NO:5) (Aurnhammer C., Haase M., Muether N., et al., 2012, Hum. Gene Ther. Methods 23, 18–28). Após uma etapa de ativação a 95°C por 10 min, um ciclo de PCR de duas etapas foi realizado a 95°C por 15 segundos e 60°C por 30 segundos por 40 ciclos. A TaqMan Universal PCR Master Mix (Thermofisher Scientific, Cat #4304437) foi usada na qPCR. O plasmídeo de DNA (Agilent, Cat #240074) foi usado como padrão para determinar títulos absolutos.
[00273] Os anticorpos anti-CD63 humano e suas fusões usaram os domínios variáveis anti-CD63 humano de camundongo H5C6 (aminoácidos 1-119 da SEQ ID NO:10 fornece a sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo H5C6 e aminoácidos 135-245 da SEQ ID NO:10 fornece a sequência de aminoácidos do domínio variável de cadeia leve (VL) do anticorpo H5C6). O ScFv anti-hCD63 usado neste documento (SEQ ID NO:2) derivou do clone H5C6, que é IgG1 monoclonal de anti-hCD63 de camundongo, anticorpo de cadeia leve capa (H5C6 foi depositado no Banco de Hibridoma de Estudos de Desenvolvimento na Universidade de Iowa até agosto, J.T./Hildreth, J.E.K. (Produto do Hibridoma de DSHB H5C6; DSHB Cat# h5c6, RRID:AB_528158). As versões de ScFv dos anticorpos foram clonadas com domínios variáveis em ordem pesada-leve com um ligante peptídico glicina-serina entre (5'-VH-Gly-Ser-VL-3') Exemplo 2: Teor de glicogênio no Modelo de Pompe Murina após AAV
[00274] Para determinar o feito de fusão ScFv anti-hCD63-GAA distribuída por AAV versus GAA distribuída por AAV, em um modelo in vivo de armazenamento de glicogênio relevante, ambas as terapias foram distribuídas a um modelo de camundongo com doença de Pompe em que os camundongos eram homozigotos para a deleção do gene de GAA de camundongo e eram homozigotos para a expressão de CD63 humano no lugar de CD63 de camundongo com um uma cepa basal de 75% C57BL/6; 25% 129SvJ. Esses camundongos são referidos neste documento como
122 / 136 camundongos KO para GAA humanizados para CD63 ou alternativamente como camundongos CD63hu/hu; GAA-/-.
[00275] Para o experimento, camundongos KO para GAA humanizados para CD63 de 2 meses de idade receberam uma injeção na veia da cauda com vírus AAV2/8 contendo um genoma com o promotor específico do fígado TTR direcionando GAA humana (AAV-hGAA; descrito no Exemplo 1) ou promotor específico do fígado TTR direcionando o ScFv anti- CD63 humano fundido em seu terminal C com GAA humana (AAV-anti- hCD63 ScFv-hGAA; descrito no Exemplo 1). Ambos os vírus AAV2/8 foram distribuídos em qualquer uma das duas doses, 1e10 vg/camundongo ou 1e11 vg/camundongo. Como controles, camundongos KO para GAA humanizados para CD63 não tratados e humanizados para CD63 não tratado com o gene de GAA de camundongo intacto foram incluídos no ensaio. Os camundongos foram alojados por 3 meses após o tratamento e sangue foi coletado incrementalmente (mensalmente) durante esse período para medições séricas de níveis de GAA e anticorpos anti-GAA. Após 3 meses, todos os camundongos foram sacrificados e tecidos individuais foram coletados para medições de glicogênio, coloração de PAS-H, quantificação de núcleos centrais, medição da proliferação lisossômica e medição da expressão de LC3b. Protocolos de dosagem e tratamento experimentais para grupos de camundongos são mostrados na Tabela 3. Tabela 3: Protocolo de dosagem e tratamento experimentais para grupos de camundongos Número de Grupo Camundongos Tratamento Dosagem Camundongos 1 CD63 HumIn GAA KO 4 nenhum N/A 1e10 2 CD63 HumIn GAA KO 4 AAV-hGAA vg/camundongo 1e11 3 CD63 HumIn GAA KO 4 AAV-hGAA vg/camundongo AAV-anti-hCD63 ScFv- 1e10 4 CD63 HumIn GAA KO 5 hGAA vg/camundongo AAV-anti-hCD63 ScFv- 1e11 5 CD63 HumIn GAA KO 4 hGAA vg/camundongo 6 CD63 HumIn GAA WT 2 nenhum N/A
123 / 136
[00276] Os resultados também são representados na Figura 2, que mostra que anti-hCD63scFv::GAA reduz glicogênio até níveis do tipo selvagem no músculo esquelético, ao contrário de GAA sozinha. O tratamento com a proteína terapêutica multidomínio anti-hCD63scFv::GAA de dois domínios resultou em uma redução muito maior no glicogênio armazenado em comparação com a enzima de reposição de GAA de domínio único. Ao representar os níveis de glicogênio do quadríceps (Figura 3) ou níveis de glicogênio do coração (Figura 4) em relação à expressão sérica total de GAA ou scfv-GAA ao longo de três meses para camundongos individuais, observou-se que a proteína de fusão de anti-hCD63scFv::GAA remove mais glicogênio do que a enzima de GAA sozinha, mesmo em níveis séricos semelhantes (Figuras 3 e 4). Exemplo 3: Resposta Imunológica à GAA
[00277] Para medir os níveis séricos do anticorpo anti-GAA humano, o soro de todos os grupos de tratamento foi separado do sangue coletado durante a sangria terminal usando tubos separador de soro (BD Biosciences, Cat# 365967) conforme as especificações do fabricante. Separadamente, placas de ligação elevada de proteínas de 96 poços (ThermoFisher, Cat#15041) foram revestidas com 20µg de hGAA (R&D Systems, Cat#8329- GH-025) diluído em PBS durante a noite. As placas foram lavadas com PBS + 0,05% Tween (PBS-T) 3 vezes. As placas foram bloqueadas com 0,5% de BSA em PBS-T e diluições em série de soro de camundongo variando de 1:300 a 1:5,1e7 foram adicionadas à placa durante a noite. A IgG anti- camundongo total (subclasses 1 + 2a + 2b + 3) foi medida usando um anticorpo anti-IgG de camundongo de cabra conjugado com HRP (Jackson Immuno Research, Cat# 115-035-164) e o kit de substrato BD Opt EIA. As reações colorimétricas foram interrompidas usando 1 N de fosfórico ácido. A absorbância foi então lida a 450nm em um leitor de placa Spectramax i3 (Molecular Devices). As curvas de diluição foram ajustadas às curvas
124 / 136 sigmoidais e os títulos foram calculados a partir das curvas. Os títulos expressos como a média dos títulos de IgG total +/- DP são mostrados na Tabela 4.
[00278] Como mostrado na Tabela 4, os camundongos que não receberam tratamento mostraram um título basal com níveis médios de 1,1E+03. Os camundongos tratados com baixa dose de vírus (1e10 vg/camundongo) de AAV-anti-hCD63 ScFv-hGAA ou AAV-hGAA demonstraram altos títulos, enquanto que os camundongos tratados com a dose alta (1e11 vg/camundongo) apresentaram títulos menores. Os camundongos tratados com 1e11vg de AAV-anti-hCD63 ScFv-hGAA que tinham os níveis mais elevados de GAA no soro tinham títulos dentro do intervalo de camundongos não tratados. Tabela 4: Níveis de anticorpos anti-GAA séricos Título de IgG anti-GAA total CD63 HumIn CD63 HumIn CD63 HumIn CD63 HumIn GAA KO + GAA KO + CD63 HumIn GAA KO + GAA KO + GAA KO + AAV-anti- AAV-anti- sem tratamento AAV-hGAA AAV-hGAA hCD63 ScFv- hCD63 ScFv- (1e10vg) (1e11vg) hGAA (1e10vg) hGAA (1e11vg) Média 1,1E+03 7,6E+06 2,4E+04 5,5E+04 4,0E+03 DP 1,3E+03 1,0E+07 2,5E+04 1,9E+04 4,9E+03
[00279] Os níveis mais elevados de GAA ou anti-hCD63scFv::GAA após administração de AAV correspondem a títulos anti-GAA mais baixos. O soro de camundongos sem GAA tratados com títulos altos ou baixos de AAV- anti-hCD63scFv::GAA ou AAV-GAA foi avaliado quanto aos anticorpos anti-GAA ao longo dos três meses após a injeção. A Figura 5 representa títulos de anticorpos anti-GAA séricos vs exposição à GAA (ou seja, a expressão sérica total ao longo de 3 meses de GAA ou scfv-GAA) para camundongos individuais, que demonstra uma correlação negativa entre o título do anticorpo e a exposição sérica à GAA, demonstrando que camundongos com alta exposição à GAA passaram a ter tolerância à GAA. Da mesma forma, a Figura 6, que representa os títulos do anticorpos anti- GAA para vários grupos infectados com AAV que codifica GAA ou uma
125 / 136 proteína anti-hCD63scFv::GAA, demonstra que doses mais elevadas de construto acarretaram em títulos inferiores de anti-GAAs. Exemplo 4: GAA sérica
[00280] Para medir os níveis séricos de GAA humanos ao longo do experimento, amostras foram coletadas em pontos de tempo mensais por sangria da cauda. O soro foi separado do sangue usando tubos separadores de soro (BD Biosciences, Cat# 365967) conforme as especificações do fabricante. 1µl de soro isolado foi então carregado em um gel pré-moldado de wedgewell de 4-20% de Novex, executado a 220V por 45 minutos e transferido para a membrana de nitrocelulose a 200mA por 1 hora usando procedimentos padrão. A membrana de nitrocelulose foi então sondada com um anticorpo primário anti-GAA (Abcam, #ab137068) usado a em uma diluição de 1:2000 e um anticorpo anti-GAPDH (Abcam, #AB9484) usado a uma diluição de 1:1000 em 12mL e incubado durante a noite a 4 °C. Após incubação de anticorpo primário, a membrana foi lavada três vezes com 1 x TBST por 5 minutos por lavagem. Os anticorpos secundários anti-IgG de coelho (LiCor, 926-32211) e anti-IgG de camundongo (LiCor, 925-68070) (LiCor,, Lincoln, NE) a uma diluição de 1:15000 em 12mL foram então adicionados à membrana e incubados por 1 hora em temperatura ambiente. Após incubação do anticorpo secundário, a membrana foi lavada duas vezes com 1 x TBST por 5 minutos por lavagem e uma vez com 1 x TBS por 5 minutos. A membrana foi então fotografada e quantificada usando um instrumento Odyssey LiCor (LI-COR Biotechnology). Os níveis séricos de GAA expressos como média +/- desvio padrão (DP) em unidades arbitrárias são mostrados na Tabela 5.
[00281] Como mostrado na Tabela 5, os camundongos KO para GAA humanizados para CD63 tratados com dose alta (1011 vg/camundongo) de AAV-anti-hCD63 ScFv-hGAA ou AAV-hGAA testada demonstraram níveis sustentados de GAA no soro ao longo do experimento, com níveis séricos de
126 / 136 GAA um pouco maiores em camundongos tratados com ScFv-hGAA anti- hCD63 do que nos camundongos tratados com AAV-hGAA. Em camundongos tratados com dose baixa (1010 vg/camundongo) de AAV-anti- hCD63 ScFv-hGAA ou AAV-hGAA, os níveis de GAA caíram durante o experimento, se aproximando dos níveis insignificantes em alguns camundongos no ponto de tempo de 12 semanas. Tabela 5: Níveis de GAA séricos AAV-anti-hCD63 AAV-anti-hCD63 AAV-hGAA ScFv-hGAA ScFv-hGAA AAV-hGAA (1011vg) (1010vg) (1010vg) (1011vg) Semana Média DP Média DP Média DP Média DP 1 0,21 0,17 0,04 0,03 2,36 1,78 0,77 0,53 2 0,19 0,16 0,07 0,07 2,02 1,18 1,15 0,56 4 0,17 0,15 0,01 0,02 2,80 1,16 1,22 0,75 8 0,29 0,33 0,03 0,05 2,58 1,18 0,62 0,60 12 0,12 0,19 0,00 0,01 2,61 1,53 0,77 0,86 Área sob a 2,27 2,23 0,27 0,36 28,13 13,73 9,80 7,22 curva
[00282] A expressão de GAA ou anti-hCD63scfv::GAA foi mantida ao longo do tempo em camundongos recebendo alta dose de AAV (1011 vg/camundongo), mas caiu em camundongos recebendo dose menor (1010 vg/camundongo). A Figura 7A representa um gráfico que descreve os níveis séricos de GAA, sondados por western blot, ao longo do tempo para vários grupos infectados com AAV codificando GAA ou uma fusão de scFv anti- hCD63 à GAA. A proteína de fusão (scFv::GAA) demonstrou níveis consistentemente maiores (por exemplo, 2,5 a 3 vezes) de GAA sérica do que a enzima GAA sem o domínio de liberação (Figura 7A).
[00283] As quantificações de PCR em tempo real da expressão em lisados do fígado, coração e quadríceps, 3 meses após a injeção, são mostradas na Figura 7B. A expressão hepática foi detectada para todas as injeções de construto de AAV, com níveis mais elevados para as injeções de 1e11vg/camundongo para AAV-hGAA e AAV-anti-hCD63::hGAA (ambos conduzidos pelo promotor específico do fígado, LSP). Uma comparação do nível de GAA sérico ao nível de expressão de RNA de GAA também foi feita (Figura 7C) e os resultados mostram que os camundongos recebendo AAV
127 / 136 codificando a proteína de fusão apresentaram uma expressão de RNA de GAA menor localizada no fígado aos 3 meses, no entanto, os níveis séricos de GAA foram altos nesse camundongo em particular. As injeções de AAV- LSP-hGAA não apresentaram altos níveis séricos de GAA quando os níveis de RNA eram baixos no fígado. Ver a Figura 7C. Estes dados sugerem que o AAV codificando a proteína de fusão (e a expressão é conduzida por um promotor específico do fígado) obtém um perfil de secreção aprimorado para GAA.
[00284] Uma razão mais elevada entre secretado e intracelular de anticorpo::hGAA versus hGAA sozinha em hepatócitos Huh-7 também foi observada. Em um experimento, hepatócitos humanos Huh-7 transfectados transitoriamente com construtos orientados pelo promotor específicos ao fígado que codificam para hGAA, fusão anti-hCD63 scFv::GAA ou um controle de fusão sem ligação scFv::GAA. Ambos construtos de fusão de scFv::GAA tiveram uma razão mais elevada de proteína no sobrenadante secretado do que hGAA sozinho 3 dias após a transfecção (estatisticamente significante para p< 0,05, n=3). A adição de M6P no sobrenadante durante o período experimental para mitigar a absorção mediada por CI-MPR não afetou a razão. Exemplo 5: Medição de Glicogênio no Tecido e Caracterização Histológica do Tecido Muscular
[00285] Medições de glicogênio no tecido: Para medir o teor de glicogênio em tecidos individuais, tecidos do coração, quadríceps, gastrocnêmio, diafragma, sóleo e EDL foram dissecados de camundongos de todos os grupos imediatamente após asfixia com CO2 e, em seguida, foram congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -80ºC. ~50mg de cada tecido foram lisadas em um homogeneizador de bancada com grânulos de aço inoxidável em água destilada em uma razão de 1mg para 25µl de água para medições de glicogênio. Os lisados da análise de glicogênio foram aquecidos
128 / 136 a 105° por 15 minutos e centrifugados a 21000 x g para limpar detritos. As medições de glicogênio foram realizadas usando um Kit de Ensaio de Glicogênio (Sigma-Aldrich, #MAK016) de acordo com as instruções do fabricante para ensaios fluorométricos. A fluorescência de cada amostra foi medida em excitação de 535nm e emissão de 587nm em um leitor de placa de fluorescência (Molecular Devices, Spectramax i3). A quantidade calculada de glicogênio foi calculada usando a seguinte fórmula fornecida pelo fabricante. A quantidade calculada de glicogênio de cada tecido em cada grupo de tratamento foi então calculada e é expressa como média +/- desvio padrão (DP) na Tabela 6.
[00286] Como mostrado na Tabela 6, a perda de Gaa provoca um grande aumento nos níveis médios de glicogênio em todos os tecidos medidos, em comparação com camundongos GAA WT. O tratamento com AAV-anti-hCD63 ScFv-hGAA a 1011 vg/camundongo reduziu o glicogênio para níveis WT ou próximos a WT em todos os tecidos testados, diferentemente do tratamento com AAV-GAA, que apenas reduziu parcialmente o glicogênio armazenado. As doses baixas de ambos os vírus também reduziram o glicogênio, mas em menor grau que as doses elevadas. A dose de 1010 vg/camundongo de AAV-anti-hCD63 ScFv-hGAA reduziu os níveis de glicogênio de uma maneira semelhante à dose de 1011 vg/camundongo de AAV-GAA. Tabela 6: Média +/- DP do nível de glicogênio medido no coração, quadríceps, gastrocnêmio, diafragma, sóleo e EDL AAV-hGAA (1010 AAV-hGAA (1011 Nenhum tratamento vg) vg) Média DP Média DP Média DP Coração 27,798 3,013 17,246 4,375 1,770 2,279 Quadríceps 14,650 1,783 11,012 0,528 5,878 3,504 Gastrocnêmio 14,295 0,480 10,990 0,868 6,073 3,080 Diafragma 15,463 1,173 11,446 1,237 3,995 3,395 Sóleo 17,260 2,262 13,684 2,506 6,533 5,201 EDL 13,588 0,498 11,178 1,760 6,275 3,159 AAV-anti-hCD63 Camundongos WT AAV-anti-hCD63 10 ScFv-hGAA (1011 CD63 HumIn GAA ScFv-hGAA (10 vg) vg) (controle)
129 / 136 Média DP Média DP Média DP Coração 2,190 2,678 0,058 0,010 0,085 0,007 Quadríceps 4,485 3,147 0,798 0,251 0,440 0,042 Gastrocnêmio 5,198 2,516 0,825 0,461 0,790 0,014 Diafragma 3,083 2,968 0,388 0,121 0,385 0,007 Sóleo 5,268 2,786 1,040 0,896 0,545 0,049 EDL 2,495 1,750 0,313 0,099 0,260 0,141
[00287] Coleta de quadríceps para histopatologia e quantificação: As amostras de tecido de quadríceps de camundongos de cada grupo, além do grupo de tratamento com dose baixa (1e10 vg/camundongo), foram congeladas imediatamente após dissecação em nitrogênio líquido e armazenadas a -80ºc para quantificação da expressão de LC3b ou foram colocadas em blocos contendo meio O.C.T (Tissue-Tek, #4583).
[00288] As amostras de tecido em meio O.C.T foram enviadas para Histoserv, Inc (Germantown, MD) para seccionamento e coloração com ácido periódico Schiff (PAS) para detectar polissacarídeos. As seções adicionais foram preparadas e devolvidas para coloração de núcleos centrais e proliferação lisossômica.
[00289] Coloração com PAS: As seções de coloração com PAS foram fotografadas usando um scanner de lâmina Leica com ampliação de 20x. As imagens resultantes de camundongos representativos para cada grupo de tratamento são mostradas na Figura 8.
[00290] Como mostrado na Figura 8, KO para GAA humanizados para CD63 que foram tratados com AAV-anti-hCD63 ScFv-hGAA aos 3 meses demonstrou uma diminuição acentuada na coloração em comparação com ambos os camundongos KO para GAA humanizados para CD63 sem tratamento e os camundongos KO para GAA humanizados para CD63 tratados com AAV-hGAA, que exibiram altos níveis de coloração com PAS. Isso indica ainda que o tratamento com AAV-anti-hCD63 ScFv-hGAA pode reduzir o acúmulo de polissacarídeos em camundongos KO para GAA humanizados para CD63 e pode fazê-lo de uma maneira uniforme através das fibras musculares.
[00291] Quantificação dos núcleos centrais e proliferação
130 / 136 lisossômica: As seções não coradas da Histoserv foram removidas do congelador e, em seguida, foram fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS por 15 minutos em uma câmara de coloração.
As lâminas fixas foram então lavadas duas vezes por 5 minutos em PBS e, posteriormente, foram incubadas com tampão de bloqueio (eBiosciences, 00-4953-54) por 1 hora em temperatura ambiente.
As lâminas foram então coradas com um anticorpo anti-Lamp-1 de rato (Abcam, #AB25245) a uma diluição de 1:50 no tampão de bloqueio, um anticorpo anti-laminina de coelho (Sigma, #L9393) a uma diluição de 1:1000 em tampão de bloqueio ou tampão de bloqueio sem anticorpo adicionado, enquanto em uma câmara de coloração umidificada e, em seguida, foram transferidas para 4ºC para incubação durante a noite.
No dia seguinte, as lâminas foram então lavadas duas vezes por 5 minutos em PBS e, posteriormente, foram coradas com anticorpo secundário superclonal IgG (H+L) anti-coelho de cabra conjugado com Alexa Fluor 647 (Life Tech Thermo, #A27040) ou anticorpo secundário de IgG (H+L) anti-rato de cabra conjugado com Alexa Fluor 555 (Life Tech Thermo, #A21434) em uma câmara de coloração e, em seguida, foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente.
As lâminas coradas foram então lavadas duas vezes por 5 minutos em PBS antes de serem montadas com Fluoromount-G com DAPI (Life Tech Thermo, #00-4959-52) e fotografadas em um instrumento Zeiss LSM710 (Carl Zeiss Microscopy GmbH). O número de núcleos centralizados foi quantificado usando software Halo (Indica Labs, NM) e é expresso como porcentagem de fibras que mostram desvio padrão +/- de núcleos centrais na Tabela 7. A proliferação lisossômica é representada na Figura 8. Tabela 7: Quantificação de núcleos centrais Camundongos AAV-anti-hCD63 Nenhum AAV-hGAA WT CD63 ScFv-hGAA tratamento (1e11vg) HumIn GAA (1e11vg) (controle) Média DP Média DP Média DP Média DP
131 / 136 % de Fibra com núcleos 22,00 10,10 33,00 4,36 12,75 6,29 8,50 7,78 centrais
[00292] Quantificação da expressão de LC3b: Para quantificação da expressão de LC3b, amostras congeladas foram descongeladas, homogeneizadas e então lisadas em tampão RIPA em uma razão de 1mg de tecido para 25µl de tampão RIPA (150 mM de NaCl, 1,0% IGEPAL® CA- 630, desoxicolato de sódio a 0,5%, SDS a 0,1%, 50 mM de Tris, pH 8,0, Sigma Aldrich, R0278) por impactação por grânulos por 45 segundos (MP Biomedical). Os lisados foram depurados de material insolúvel por centrifugação a 21.000 x g e, em seguida, 300µg de lisado em tampão RIPA foi carregado em um gel pré-moldado de 4-20% de Novex wedgewell, transferidos para uma membrana de nitrocelulose e analisados por western blot usando um protocolo semelhante ao descrito anteriormente para a análise dos níveis de GAA séricos, substituindo o uso de anticorpo primário que reconhece LC3b-I e LC3b-II de camundongo (Sigma, #L7543) no lugar do anticorpo primário contra GAA. A membrana foi então fotografada e quantificada usando um instrumento Odyssey LiCor (LI-COR Biotechnology). Os níveis de LC3b-I e LC3b-II expressos como (média +/- desvio padrão) em unidades arbitrárias são mostrados na Tabela 8.
[00293] Como mostrado na Tabela 8, houve um aumento significativo nos níveis médios de LC3b-I e LC3b-II em camundongos sem GAA em comparação com camundongos WT CD63 HumIn GAA. O tratamento com AAV-anti-hCD63 ScFv-hGAA reduziu os níveis médios de LC3b-I e LC3b-II em KO CD63 HumIn GAA para níveis iguais ou próximos ao WT. O KO para GAA humanizados para CD63 tratado com AAV-hGAA demonstrou níveis médios ligeiramente reduzidos de LC3b-I e LC3b-II em comparação com camundongos KO para GAA humanizados para CD63, mas esta diminuição não foi tão pronunciada como com o tratamento com AAV-anti- hCD63 ScFv-hGAA. Tabela 8: Níveis de LC3b-I e LC3b-II em quadríceps de camundongos
132 / 136 Níveis de LC3b-I (unidades arbitrárias) AAV-anti-hCD63 CD63 HumIn GAA tratamento não tratado AAV-hGAA ScFv-hGAA WT (controle) média 833 628 403 282 DP 109 139 33 49 Níveis de LC3b-II (unidades arbitrárias) AAV-anti-hCD63 CD63 HumIn GAA tratamento não tratado AAV-hGAA ScFv-hGAA WT (controle) média 3308 2888 445 369 DP 582 1282 398 33 Exemplo 6: O tratamento com AAV anti-hCD63::GAA resulta em ganhos significativos em testes de força e coordenação muscular
[00294] A força de preensão e desempenho do teste Rotarod de camundongos tratados (vide acima) com AAV-LSP hGAA ou AAV-LSP anti-hCD63::hGAA. As medições de Rotarod de aceleração (Figura 9A) e medições da força de preensão das patas dianteiras (Figura 9B) de camundongos GAA tipo selvagem, controle não tratado, tratamento com AAV-LSP-hGAA (1e11vg/camundongo) ou AAV-LSP-anti-hCD63::hGAA (1e11vg/camundongo) foram tomadas em intervalos mensais por 6 meses. As barras de erro são +/- DP. N=8-10 para todos os grupos. Exemplo 7: Outras proteínas de membrana como "guias" direcionando GAA para tecidos
[00295] Outras proteínas de membrana foram testadas, tais como proteínas de fusão anti-ITGA7 (Integrina alfa-7), para guiar GAA para tecidos para repor GAA em camundongos deficientes em enzima. Os mioblastos de camundongo C2C12 foram incubados durante a noite com anti-mCD63-GAA ou anti-ITGA7-GAA com ou sem a presença de 5mM de M6P. A enzima GAA ativa foi detectada em lisados de mioblasto ao longo do tempo para ambas as proteínas de fusão (Figura 10A). Em outros experimentos, camundongos KO para GAA humanizados para CD63 (GAA-/-;CD63hu/hu) que receberam plasmídeos que codificam um formato scFv::GAA de anti- hCD63::GAA ou um formato IgG4::GAA de comprimento total de anti- integrina alfa-7 por liberação hidrodinâmica (HDD) e os camundongos foram sacrificados 3 semanas após HDD. Os níveis de glicogênio do tecido foram
133 / 136 medidos no coração, quadríceps, gastrocnêmio e diafragma. Camundongos controle não tratados, GAA -/-xCD63hu/hu e camundongos controle GAA tipo selvagem não tratados, GAA+/+;CD63hu/hu (4), também foram testados para nas mesmas condições. Os níveis de glicogênio estavam em níveis muito baixos em ambos os grupos de camundongos tratados com anti-hCD63::GAA e camundongos tratados com anti-ITGA7::GAA, como nos camundongos tipo selvagem. Ver a Figura 10B. Exemplo 8: Em níveis séricos comparáveis, o tratamento com AAV anti- CD63::GAA é mais eficaz do que AAV com construto de GAA otimizado
[00296] Camundongos KO GAA de HumIn CD63 (GAA-/- x CD63hu/hu) infectados com AAVs contendo um potenciador específico do fígado (serpina 1; SEQ ID NO:9) e um promotor específico do fígado (LSP; TTR; SEQ ID NO:8) conduzindo a expressão de um anti-hCD63::GAA multidomínio terapêutico (SEQ ID NO:10), que usa um peptídeo de sinal B2 de quimotriptógeno (SP7) e contém os aminoácidos 36-952 de GAA humana (∆8GAA) apresentaram ganhos significativos em testes de força muscular e coordenação. Três doses diferentes foram dadas para cada vírus: 5e11vg/kg, 2e12vg/kg e 4e12vg/kg. O soro foi coletado por sangramentos submandibulares regularmente. Um mês após a infecção por AAV, os camundongos foram sacrificados. As amostras de tecido cardíaco e de músculo esquelético foram coletadas e congeladas em nitrogênio líquido e mantidas a -80º C para armazenamento. O glicogênio nos tecidos foi medido pela homogeneização de tecidos por impactação de grânulos em água destilada. As amostras foram fervidas e centrifugadas, e os sobrenadantes foram usados em um kit de ensaio de glicogênio comercial. O soro foi quantificado usando western blot com um anticorpo contra GAA humana, conforme descrito em exemplos anteriores. Para cada camundongo, o nível de glicogênio em cada tecido foi representado em relação ao nível sérico do construto em 1 mês. Os ajustes de curva de 4 parâmetros foram usados para
134 / 136 determinar EC50 dos dois tratamentos em cada tecido.
[00297] A infecção com AAVs contendo um promotor específico do fígado (LSP) que codifica anti-hCD63::GAA ou sp7-Δ8GAA forneceu níveis séricos comparáveis de GAA em cada dose de infecção. Figura 11. No entanto, em cada tecido muscular analisado, uma redução de ~2,2 vezes em EC50 foi observada ao usar anti-hCD63::GAA vs. sp7-Δ8GAA, demonstrando que em níveis séricos equivalentes, anti-CD63::GAA depura o glicogênio de forma mais eficiente do que um construto de expressão de GAA modificado que não é fundido a um anticorpo. Ver a Figura 12. Exemplo 9: Teor de glicogênio no SNC do Modelo de Pompe Murino após Tratamento com AAV com Diversos Construtos de GAA e Doses
[00298] Camundongos KO para GAA HumIn CD63 de dois meses de idade receberam uma injeção na veia da cauda com vírus AAV2/8 contendo um genoma com o promotor específico do fígado TTR direcionando GAA humana (AAV-hGAA; descrito no Exemplo 1) ou promotor específico do fígado TTR direcionando o ScFv anti-CD63 humano fundido em seu terminal C com GAA humana (AAV-anti-hCD63 ScFv-hGAA; descrito no Exemplo 1). Ambos os vírus AAV2/8 foram distribuídos a 1e11 vg/camundongo. Como controles, camundongos KO para GAA HumIn CD63 (Gaa-/-) e não tratados HumIn CD63 com o gene de GAA de camundongo intacto (camundongos do tipo selvagem) foram incluídos no ensaio. Os camundongos foram alojados por 9 meses após o tratamento, após o qual todos os camundongos foram sacrificados e tecidos individuais foram coletados para medições de glicogênio. Tecidos de SNC foram dissecados em gelo e rapidamente congelados 9 meses após a transdução de AAV. Os tecidos da medula espinhal, do cerebelo e do hipocampo foram homogeneizados em água destilada usando impactação de grânulos, e o glicogênio foi medido nos sobrenadantes lisados de tecido usando um kit de ensaio de glicogênio fluorométrico comercial (FIGURA 13).
135 / 136
[00299] Em outro experimento análogo, camundongos knockout foram tratados com construtos AAV que codificam fusão de GAA (1e11 vg) ou anti- CD63ScFv-GAA (doses 1e10 vg, 5e10 vg, ou 1e11 vg). Camundongos do tipo selvagem e a quantidade de glicogênio armazenado por mg de tecido do SNC (medula espinhal: Figura 14A cérebro: Figura 14B) foram examinados 3 meses após a administração do AAV. Camundongos do tipo selvagem e camundongos KO (GAA-/-) que não foram tratados foram usados como comparadores para seus níveis de glicogênio armazenados no tecido do SNC pela mesma duração (3 meses).
[00300] Construtos de fusão de ScFv-GAA foram mais eficazes do que GAA sozinho na redução dos níveis de glicogênio armazenados em camundongos doentes a uma dose de 1e11 vg/camundongo (Figuras 13-14). Uma dose de fusão de ScFv-GAA de 5e10 vg forneceu níveis reduzidos de armazenamento de glicogênio equivalente ao construto sozinho de GAA dosado mais alto (Figuras 14A-14B). Estes níveis de armazenamento de glicogênio reduzido mostraram-se eficazes por Hordeaux et al 2017 (por exemplo, uma diminuição no glicogênio e força muscular melhorada em camundongos injetados intratecalmente com AAV GAA). O nível de soro correlativo da proteína de fusão ScFv-GAA é detectável em 5e10 vg e mais de 15 ug/mL nos camundongos recebendo 1e11 vg (Tabela 9). Tabela 9: Correlação da dose por peso e nível de anti-CD63::GAA no soro. Dose experimental (genomas Dose aproximada em peso Nível de anti-CD63::GAA no soro virais/camundongo) (genomas virais/kg) (microgramas/mL) 1e10 4e11 indetectável 5e10 2e12 1,97 +/- 1,18 1e11 4e12 15,84 +/- 13,37
[00301] Sem se vincular a qualquer teoria, os níveis séricos detectáveis, por exemplo, níveis séricos superiores a 1 ug/mL de GAA ligados a um domínio de liberação que cruza a barreira hematoencefálica, são considerados terapêuticos. Exemplo 10: Expressão de proteínas terapêuticas multidomínio
136 / 136 compreendendo pelo menos dois domínios de liberação Células CHO foram transfectadas com construtos de expressão retratados nas Figuras 1C-1G e a expressão de cada um dos construtos foi confirmada (dados não mostrados). Além disso, a ligação de algumas das proteínas terapêuticas multidomínio codificadas por 4W1 e 4M1 (Figura 1F) a CD63 foi confirmada por ELISA (dados não mostrados).

Claims (65)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de administração de uma proteína terapêutica ao sistema nervoso central (SNC) de um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de uma composição nucleotídica que codifica uma proteína terapêutica multidomínio ao fígado no paciente para formar um depósito no fígado para a produção e secreção do terapêutico multidomínio em um nível sérico consistente de pelo menos 1 μg/mL ao longo de dias, semanas ou meses consecutivos após a administração para fornecer uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína terapêutica multidomínio no SNC, em que a proteína terapêutica multidomínio compreende um anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno que se liga a CD63 ou ITGA7 e um domínio enzimático.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é uma enzima lisossômica.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a enzima lisossômica é GAA.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a composição nucleotídica é administrada através de um vetor viral.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um vetor AAV, opcionalmente em que a composição nucleotídica é administrada em uma dose de pelo menos 2 x 1012 genomas virais por quilograma (vg/kg).
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua proteína de ligação ao antígeno compreende um fragmento variável de cadeia única (scFv).
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua proteína de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica compreende uma hidrolase.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica compreende uma glicosilase.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica compreende uma glicosidase.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica compreende uma alfa-glicosidase.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:13, ou um fragmento desta.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:11.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o domínio enzimático compreende uma alfa-glicosidade, e em que os níveis de glicogênio em qualquer tecido do SNC no sujeito são reduzidos por pelo menos nove meses após o tratamento.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem a doença de Pompe.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o nível sérico é de pelo menos 2 μg/mL.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno se liga a um domínio extracelular de CD63 ou ITGA7.
18. Proteína terapêutica multidomínio, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais domínios de liberação e um domínio enzimático, em que um do um ou mais domínios de liberação se liga ao receptor de transferrina humano (hTfR), e em que o outro do um ou mais domínios de liberação compreende um anticorpo ou sua proteína de ligação ao antígeno que se liga a CD63 ou ITGA7.
19. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que cada um do um ou mais domínios de liberação compreende uma proteína de ligação ao antígeno.
20. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada pelo fato de que pelo menos um do um ou mais domínios de liberação compreende um fragmento variável de cadeia única (scFv).
21. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizada pelo fato de que pelo menos um do um ou mais domínios de liberação compreende um “half-body”.
22. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o domínio de liberação que se liga ao hTfR é um scFv, em que o half-body se liga a CD63, em que o domínio enzimático é GAA, e em que GAA é conjugado ao terminal carbóxi do half-body que se liga a CD63.
23. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que cada um do um ou mais domínios de liberação compreende um scFv.
24. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizada pelo fato de que pelo menos um scFv é fundido a um Fc.
25. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o Fc compreende um isotipo IgG4 humano do tipo selvagem, ou derivado do mesmo.
26. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 25, caracterizada pelo fato de que GAA é conjugado ao terminal carbóxi do Fc.
27. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que compreende um scFv anti- hTfR, um scFv anti-hCD63.
28. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-hTfR e o scFv anti-hCD63 estão ambos ligados, em seu terminal carbóxi, a uma única enzima GAA.
29. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 28, caracterizada pelo fato de que o domínio de liberação é um scFv anti-hTfR e o domínio enzimático está ligado ao terminal carbóxi do domínio VL do scFv.
30. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que compreende o outro domínio de liberação ligado ao terminal N do domínio VH do scFv anti-hTfR.
31. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o segundo domínio de liberação é um scFV anti-hCD63.
32. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 31, caracterizada pelo fato de que o domínio enzimático compreende a sequência de aminoácidos indicada como SEQ ID NO:1.
33. Proteína terapêutica multidomínio, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos dois domínios de liberação e pelo menos um domínio enzimático, em que cada um dos dois domínios de liberação é selecionado independentemente do grupo consistindo em um anticorpo, um half-body e um scFv, e em que pelo menos um ou mais dos domínios de liberação estão associados ao pelo menos um domínio enzimático, preferencialmente em que o um ou mais domínios de liberação estão covalentemente ligados ao pelo menos um domínio enzimático.
34. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que compreende uma estrutura conforme retratada na Figura 1C, Figura 1D, Figura 1E ou Figura 1F.
35. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica a proteína terapêutica multidomínio como definida em qualquer uma das reivindicações 18 a 34.
36. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de ácido nucleico de vírus e uma sequência de ácido nucleico direcionada a um locus.
37. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 35 ou 36, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de ácido nucleico de vírus e uma sequência de ácido nucleico direcionada a um locus, em que a sequência de ácido nucleico de vírus é uma sequência de ácido nucleico de vírus adeno-associado (AAV).
38. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 37, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de ácido nucleico de vírus e uma sequência de ácido nucleico direcionada a um locus, em que a sequência de ácido nucleico de vírus é uma sequência de ácido nucleico de vírus adeno-associado (AAV), e em que a sequência de ácido nucleico de AAV compreende uma sequência de repetição terminal interna e, opcionalmente, um elemento regulador tecido-específico, tal como um promotor específico de fígado ou um promotor específico neuronal.
39. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 38, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de ácido nucleico de vírus e uma sequência de ácido nucleico direcionada a um locus, em que a sequência de ácido nucleico de vírus é uma sequência de ácido nucleico de vírus adeno-associado (AAV) que compreende uma sequência de repetição terminal interna que compreende a SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, ou ambas, e, opcionalmente, um elemento regulador tecido-específico, tal como um promotor específico de fígado ou um promotor específico neuronal.
40. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 39, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um elemento regulador tecido-específico que compreende a sequência indicada como SEQ ID NO:8 e/ou SEQ ID NO:9.
41. Vetor de terapia gênica, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo como definida em qualquer uma das reivindicações 35 a 40.
42. Vetor de terapia gênica de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o vetor de terapia gênica é selecionado do grupo consistindo em um vetor viral, opcionalmente em que o vetor viral é um vírus natural, um vírus manipulado ou um vírus quimérico, um polinucleotídeo nu que compreende o polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 a 40, um complexo polinucleotídico, opcionalmente em que o complexo polinucleotídico é uma nanopartícula lipídica que compreende o polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 34-39, e lipídios, e qualquer combinação destes.
43. Vetor de terapia gênica de acordo com a reivindicação 41 ou 42, caracterizado pelo fato de que o vetor de terapia gênica é um vetor viral selecionado do grupo consistindo em um retrovírus, adenovírus, vírus herpes simplex, poxvírus, vírus vaccinia, lentivírus ou um vírus adeno- associado.
44. Vetor de terapia gênica de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracterizado pelo fato de que o vetor de terapia gênica é AAV9, Anc80, uma quimera AAV2/8 e/ou um AAV pseudotipado em um tecido específico, por exemplo, o fígado ou tecido neuronal.
45. Uso de um nucleotídeo que codifica a proteína terapêutica multidomínio como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 34, o polinucleotídeo como definida em qualquer uma das reivindicações 35 a 40, ou o vetor de terapia gênica como definida em qualquer uma das reivindicações 41 a 44, caracterizado pelo fato de que se aplica no método como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.
1 / 15
REIVINDICAÇÕES
1. Método de administração de uma proteína terapêutica ao sistema nervoso central (SNC) de um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende a administração, ao sujeito, de uma composição nucleotídica que codifica uma proteína terapêutica multidomínio através de um método de liberação direcionado ao fígado suficiente para fornecer uma quantidade terapeuticamente eficaz da proteína terapêutica multidomínio no SNC, em que a proteína terapêutica multidomínio compreende um domínio de liberação e um domínio enzimático.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio de liberação é um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um efetor de internalização.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica é uma enzima lisossômica.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a enzima lisossômica é GAA.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a composição nucleotídica é administrada através de um vetor viral.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um vetor AAV, opcionalmente em que a composição nucleotídica é administrada em uma dose de pelo menos 2 x 1012 genomas virais por quilograma (vg/kg).
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o efetor de internalização é expresso na superfície das células selecionadas do grupo consistindo em: células no SNC, células epiteliais e células que atravessam a barreira hematoencefálica.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o domínio de liberação se liga a um efetor de
2 / 15 internalização (i) selecionado do grupo consistindo em CD63, Integrina alfa- 7 (ITGA7), MHC-I, Kremen-1, Kremen-2, LRP5, LRP6, LRP8, receptor de transferrina, receptor de LDL, receptor da proteína 1 relacionada a LDL, ASGR1, ASGR2, proteína 2 similar à proteína precursora amiloide (APLP2), receptor de apelina (APLNR), mielina e proteína linfocitária (MAL), IGF2R, H+ ATPase tipo vacuolar, receptor da toxina diftérica, receptor de folato, receptores de glutamato, receptor de glutationa, receptores de leptina, receptor scavenger A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3 e CD36; (ii) é expresso em vários tipos de tecidos, selecionado opcionalmente do grupo consistindo em CD63, MHC-I, H+ ATPase tipo vacuolar, IGF2R, Integrina alfa-7 (ITGA7), LRP5, LRP6, LRP8, Kremen-2, receptor de LDL, receptor de proteína 1 relacionada a LDL, proteína 2 similar à proteína precursora amiloide (APLP2), receptor de apelina (APLNR), PRLR, MAL (mielina e proteína linfocitária (MAL), receptores da toxina diftérica, HBEGF (fator de crescimento semelhante ao EGF ligado à heparina), receptores de glutationa, receptores de glutamato, receptores de leptina e receptores de folato, opcionalmente, em que o sujeito apresenta um ou mais sintomas de uma doença selecionada do grupo consistindo em doença de Fabry, doença de Gaucher, MPS I, MPS II, MPS IIIA, MPS IIIB, MPS IIID, MPS IVB, MPS VI, MPS VII, MPS IX, doença de Pompe, deficiência de lipase ácida lisossômica, leucodistrofia metacromática, doenças de Niemann- Pick tipos A, B e C2, alfa-manosidose, deficiência da neuraminidase, sialidose, aspartilglicosaminúria, deficiência combinada de saposina, doença de Gaucher atípica, lipogranulomatose de Farber, fucosidose e beta- manosidose; (iii) é preferencialmente expresso por osso e/ou cartilagem, selecionado opcionalmente do grupo consistindo em Colágeno
3 / 15
X, Integrina alfa 10 (ITGA10), receptor 3 do fator de crescimento de fibroblasto (FGFR3), isoforma C do receptor do fator de crescimento de fibroblasto (FGFR3C), proteína 1 de ligação de hialuronano e proteoglicano (CRTL1), Agrecano, Colágeno II e Kremen-1, opcionalmente, em que o sujeito apresenta um ou mais sintomas de uma doença selecionada do grupo consistindo em MPS I, MPS II, MPS IIIA, MPS IIIB, MPS IIID, MPS IVA, MPS IVB, MPS VI, MPS VII, MPS IX, beta-manosidose, doença de Gaucher, doença de Gaucher atípica, deficiência combinada de saposina, aspartilglicosaminúria, lipogranulomatose de Farber, sialidose, deficiência da neuraminidase e alfa-manosidose; (iv) é preferencialmente expresso por monócitos, macrófagos ou microglia, selecionado opcionalmente do grupo consistindo em receptor scavenger A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3, CD36, MSR1 (receptor scavenger de macrófagos 1), MRC1 (receptor 1 de manose de macrófagos), VSIG4 (proteína 4 contendo domínio de imunoglobulina e conjunto V), CD68 (macrosialina), e CSF1R (receptor do fator estimulador de colônias de macrófagos 1), opcionalmente em que o sujeito apresenta um ou mais sintomas de uma doença selecionada do grupo consistindo em deficiência de lipase ácida lisossômica, doença de Gaucher, doença de Gaucher atípica, deficiência combinada de saposina e lipogranulomatose de Farber; (v) é preferencialmente expresso por células renais, opcionalmente selecionado do grupo consistindo em CDH16 (Caderina-16), CLDN16 (Claudina-16), KL (Klotho), PTH1R (receptor de hormônio da paratireoide), SLC22A13 (membro 13 da família 22 de carreadores de soluto), SLC5A2 (cotransportador 2 de sódio/glicose) e UMOD (uromodulina), opcionalmente em que o sujeito apresenta um ou mais
4 / 15 sintomas ou é diagnosticado com uma doença selecionada do grupo consistindo em doença de Fabry, síndrome de Alport, doença renal policística e púrpura trombocitopênica trombótica; (vi) é preferencialmente expresso por células hepáticas, opcionalmente ASGR1 ou ASGR2, opcionalmente, em que o sujeito apresenta um ou mais sintomas ou é diagnosticado com uma doença selecionada do grupo consistindo em uma deficiência de lipase ácida lisossômica, doença de Gaucher, MPS VI, MPS VII, MPS II, doença de Niemann-Pick tipos A, B e C2, sialidose, deficiência de neuraminidase, doença atípica de Gaucher, deficiência combinada de saposina, lipogranulomatose de Farber; (vii) é preferencialmente expresso por células musculares, opcionalmente selecionado do grupo consistindo em BMPR1A (receptor 1A de proteína morfogenética óssea), m-caderina, CD9, MuSK (quinase músculo-específica), LGR4/GPR48 (receptor 48 acoplado à proteína G), receptor colinérgico (nicotiníco) alfa 1, CDH15 (Caderina-15), ITGA7 (Integrina alfa-7), CACNG1 (canal de cálcio tipo L subunidade gama-1), CACNAlS (canal de cálcio tipo L subunidade alfa-15), CACNG6 (canal de cálcio tipo L subunidade gama-6), SCN1B (canal de sódio subunidade beta- 1), CHRNA1 (receptor de ACh subunidade alfa), CHRND (receptor de ACh subunidade delta), LRRC14B (proteína 14B contendo repetições ricas em leucina), distroglicano (DAG1) e POPDC3 (proteína 3 contendo domínio Popeye), opcionalmente, em que o sujeito apresenta um ou mais sintomas ou é diagnosticado com doença de Pompe; (viii) é selecionado do grupo consistindo em ITGA7, CD9, CD63, ALPL2, MSR1, ASGR1, ASGR2 ou PRLR; ou (ix) é CD63.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
5 / 15 8, caracterizado pelo fato de que o domínio de liberação é um fragmento variável de cadeia única (scFv).
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação ao receptor de superfície celular (CSR) (CSR-BP) compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica compreende uma hidrolase.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica compreende uma glicosilase.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica compreende uma glicosidase.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica compreende uma alfa-glicosidase.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:13, ou um fragmento desta.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a proteína terapêutica compreende um anticorpo anti-ABeta ou anti-Tau.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende uma sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO:11.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1
6 / 15 a 17, caracterizado pelo fato de que o domínio enzimático compreende uma alfa-glicosidade, e em que os níveis de glicogênio em qualquer tecido do SNC no sujeito são reduzidos por pelo menos nove meses após o tratamento.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem a doença de Pompe.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a composição nucleotídica administrada fornece um nível sérico de proteína terapêutica multidomínio de pelo menos 1 μg/mL.
21. Proteína terapêutica multidomínio, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais domínios de liberação e um domínio enzimático, em que o um ou mais domínios de liberação se ligam ao receptor de transferrina humano (hTfR).
22. Proteína terapêutica de múltiplos domínios de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um segundo domínio de liberação que se liga a um efetor de internalização.
23. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o segundo domínio de liberação se liga a (i) um efetor de internalização selecionado do grupo consistindo em CD63, Integrina alfa-7 (ITGA7), MHC-I, Kremen-1, Kremen- 2, LRP5, LRP6, LRP8, receptor de transferrina, receptor de LDL, receptor da proteína 1 relacionada a LDL, ASGR1, ASGR2, proteína 2 similar à proteína precursora amiloide (APLP2), receptor de apelina (APLNR), mielina e proteína linfocitária (MAL), IGF2R, H+ ATPase tipo vacuolar, receptor da toxina diftérica, receptor de folato, receptores de glutamato, receptor de glutationa, receptores de leptina, receptor scavenger A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3 e CD36; (ii) um efetor de internalização expresso em vários tipos de
7 / 15 tecido selecionado opcionalmente do grupo consistindo em CD63, MHC-I, H+ ATPase tipo vacuolar, IGF2R, Integrina alfa-7 (ITGA7), LRP5, LRP6, LRP8, Kremen-2, receptor de LDL, receptor da proteína 1 relacionado a LDL, proteína 2 similar à proteína precursora amiloide (APLP2), receptor de apelina (APLNR), PRLR, MAL (mielina e proteína linfocitária (MAL), receptores de toxina diftérica, HBEGF (fator de crescimento semelhante ao EGF ligado à heparina), receptores de glutationa, receptores de glutamato, receptores de leptina e receptores de folato; (iii) um efetor de internalização preferencialmente expresso por osso e/ou cartilagem, selecionado opcionalmente do grupo consistindo em Colágeno X, Integrina alfa 10 (ITGA10), receptor 3 do fator de crescimento de fibroblasto (FGFR3), isoforma C do receptor do fator de crescimento de fibroblasto (FGFR3C), proteína 1 de ligação de hialuronano e proteoglicano (CRTL1), Agrecano, Colágeno II e Kremen-1; (iv) um efetor de internalização expresso preferencialmente por monócitos, macrófagos ou microglia, selecionado opcionalmente do grupo consistindo em receptor scavenger A1-5 (SCARA1-5), SCARB1-3, CD36, MSR1 (receptor 1 scavenger de macrófagos), MRC1 (receptor 1 de manose de macrófagos), VSIG4 (proteína 4 contendo domínio de imunoglobulina e conjunto V), CD68 (macrosialina) e CSF1R (receptor de fator estimulador de colônias de macrófagos 1); (v) um efetor de internalização expresso preferencialmente por células renais, opcionalmente selecionado do grupo consistindo em CDH16 (Caderina-16), CLDN16 (Claudina-16), KL (Klotho), PTH1R (receptor de hormônio da paratireoide), SLC22A13 (membro 13 da família 22 de carreadores de soluto), SLC5A2 (cotransportador 2 de sódio/glicose) e UMOD (uromodulina). Em outras determinadas modalidades, o efetor de internalização é um internalizador músculo-específico, tal como BMPR1A (receptor 1A de proteína morfogenética óssea), m-caderina, CD9, MuSK
8 / 15 (quinase músculo-específica), LGR4/GPR48 (receptor 48 acoplado à proteína G), receptor colinérgico (nicotiníco) alfa 1, CDH15 (Caderina-15), ITGA7 (Integrina alfa-7), CACNG1 (canal de cálcio tipo L subunidade gama-1), CACNAlS (canal de cálcio tipo L subunidade alfa-15), CACNG6 (canal de cálcio tipo L subunidade gama-6), SCN1B (canal de sódio subunidade beta- 1), CHRNA1 (receptor de ACh subunidade alfa), CHRND (receptor de ACh subunidade delta), LRRC14B (proteína 14B contendo repetições ricas em leucina), distroglicano (DAG1) e POPDC3 (proteína 3 contendo domínio Popeye); (vi) um efetor de internalização expresso preferencialmente por células hepáticas, opcionalmente, ASGR1 ou ASGR2; (vii) um efetor de internalização expresso preferencialmente por células musculares, opcionalmente selecionado do grupo consistindo em BMPR1A (receptor 1A da proteína morfogenética óssea), m-caderina, CD9, MuSK (quinase músculo-específica), LGR4/GPR48 (receptor 48 acoplado à proteína G), receptor colinérgico (nicotiníco) alfa 1, CDH15 (Caderina-15), ITGA7 (Integrina alfa-7), CACNG1 (canal de cálcio tipo L subunidade gama- 1), CACNAlS (canal de cálcio tipo L subunidade alfa-15), CACNG6 (canal de cálcio tipo L subunidade gama-6), SCN1B (canal de sódio subunidade beta-1), CHRNA1 (receptor de ACh subunidade alfa), CHRND (receptor de ACh subunidade delta), LRRC14B (proteína 14B contendo repetições ricas em leucina), distroglicano (DAG1) e POPDC3 (proteína 3 contendo domínio Popeye), ou (viii) uma proteína efetora de internalização selecionada do grupo consistindo em ITGA7, CD9, CD63, ALPL2, MSR1, ASGR1, ASGR2 ou PRLR.
24. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizada pelo fato de que o segundo domínio de liberação se liga ao efetor de internalização CD63.
9 / 15
25. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24, caracterizada pelo fato de que pelo menos um do um ou mais domínios de liberação compreende uma proteína de ligação ao antígeno.
26. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que cada um do um ou mais domínios de liberação compreende uma proteína de ligação ao antígeno.
27. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, caracterizada pelo fato de que pelo menos um do um ou mais domínios de liberação compreende um fragmento variável de cadeia única (scFv).
28. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 27, caracterizada pelo fato de que pelo menos um do um ou mais domínios de liberação compreende um “half-body”.
29. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que o domínio de liberação que se liga ao hTfR é um scFv, em que o half-body se liga a CD63, em que o domínio enzimático é GAA, e em que GAA é conjugado ao terminal carbóxi do half-body que se liga a CD63.
30. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que cada um do um ou mais domínios de liberação compreende um scFv.
31. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 30, caracterizada pelo fato de que pelo menos um scFv é fundido a um Fc.
32. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o Fc compreende um isotipo IgG4 humano do tipo selvagem, ou derivado do mesmo.
33. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer
10 / 15 uma das reivindicações 31 a 32, caracterizada pelo fato de que GAA é conjugado ao terminal carbóxi do Fc.
34. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que compreende um scFv anti- hTfR, um scFv anti-hCD63.
35. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que o scFv anti-hTfR e o scFv anti-hCD63 estão ambos ligados, em seu terminal carbóxi, a uma única enzima GAA.
36. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 27, caracterizada pelo fato de que o domínio de liberação é um scFv anti-hTfR e o domínio enzimático está ligado ao terminal carbóxi do domínio VL do scFv.
37. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um segundo domínio de liberação ligado ao terminal N do domínio VH do scFv anti-hTfR.
38. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo fato de que o segundo domínio de liberação é um scFV anti-hCD63.
39. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o domínio enzimático compreende a sequência de aminoácidos indicada como SEQ ID NO:1.
40. Proteína terapêutica multidomínio, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos dois domínios de liberação e pelo menos um domínio enzimático, em que cada um dos dois domínios de liberação é selecionado independentemente do grupo consistindo em um anticorpo, um half-body e um scFv, e em que pelo menos um ou mais dos domínios de
11 / 15 liberação estão associados ao pelo menos um domínio enzimático, preferencialmente em que o um ou mais domínios de liberação estão covalentemente ligados ao pelo menos um domínio enzimático.
41. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que compreende não mais que dois domínios de liberação.
42. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 40 ou reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que apenas um dos domínios de liberação está associado ao pelo menos um domínio enzimático.
43. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 42, caracterizada pelo fato de que cada um do pelo menos dois domínios de liberação é covalentemente ligado a um domínio enzimático.
44. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que cada um do pelo menos dois domínios de liberação é covalentemente ligado ao mesmo domínio enzimático.
45. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que cada um do pelo menos dois domínios de liberação é covalentemente ligado a um domínio enzimático diferente.
46. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 45, caracterizada pelo fato de que a proteína terapêutica multidomínio compreende não mais que dois domínios de liberação, em que o primeiro domínio de liberação compreende um half-body, e em que o segundo domínio de liberação compreende um scFv.
47. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o scFv é fundido a um Fc.
12 / 15
48. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 46 ou reivindicação 47, caracterizada pelo fato de que o half- body está covalentemente ligado, em seu terminal carbóxi, a um primeiro domínio enzimático e/ou em que o scFv está covalentemente ligado, em seu terminal carbóxi, a um Fc e, opcionalmente, a um segundo domínio enzimático.
49. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 45, caracterizada pelo fato de que a proteína terapêutica multidomínio compreende não mais que dois domínios de liberação, em que o primeiro e o segundo domínio de liberação compreendem, cada um, um scFv.
50. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que tanto o primeiro quanto o segundo scFv estão covalentemente ligados a um domínio enzimático.
51. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que compreende, de N-terminal para C-terminal: o primeiro scFv, o segundo scFv e o domínio enzimático.
52. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer uma das reivindicações 40 a 51, caracterizada pelo fato de que pelo menos um domínio de liberação se liga a uma molécula de tráfego lisossômico e pelo menos um domínio de liberação se liga a um efetor de transcitose.
53. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que a molécula de tráfego lisossômico é selecionada do grupo consistindo em CD63, ITGA7, CD9, CD63, CD81, CD82, ou CD151, e em que o efetor de transcitose é selecionado do grupo consistindo em um receptor de LDL, um receptor de IgA, um receptor de transferrina, um receptor de Fc neonatal, receptor de insulina, CD98 e Basigina.
54. Proteína terapêutica multidomínio de acordo com qualquer
13 / 15 uma das reivindicações 40 a 53, caracterizada pelo fato de que compreende uma estrutura como retratada na Figura 1C, Figura 1D, Figura 1E ou Figura 1F.
55. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica a proteína terapêutica multidomínio como definida em qualquer uma das reivindicações 21 a 54.
56. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de ácido nucleico de vírus e uma sequência de ácido nucleico direcionada a um locus.
57. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 55 ou reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de ácido nucleico de vírus e uma sequência de ácido nucleico direcionada a um locus, em que a sequência de ácido nucleico de vírus é uma sequência de ácido nucleico de vírus adeno-associado (AAV).
58. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 57, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de ácido nucleico de vírus e uma sequência de ácido nucleico direcionada a um locus, em que a sequência de ácido nucleico de vírus é uma sequência de ácido nucleico de vírus adeno-associado (AAV), e em que a sequência de ácido nucleico de AAV compreende uma sequência de repetição terminal interna e, opcionalmente, um elemento regulador tecido-específico, tal como um promotor específico de fígado ou um promotor específico neuronal.
59. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 58, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma sequência de ácido nucleico de vírus e uma sequência de ácido nucleico direcionada a um locus, em que a sequência de ácido nucleico de vírus é uma sequência de ácido nucleico de vírus adeno-associado (AAV) que compreende uma sequência de repetição terminal interna que compreende a
14 / 15 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, ou ambas, e, opcionalmente, um elemento regulador tecido-específico, tal como um promotor específico de fígado ou um promotor específico neuronal.
60. Polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 59, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um elemento regulador tecido-específico que compreende a sequência indicada como SEQ ID NO:8 e/ou SEQ ID NO:9.
61. Vetor de terapia gênica, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo como definida em qualquer uma das reivindicações 55 a 60.
62. Vetor de terapia gênica de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o vetor de terapia gênica é selecionado do grupo consistindo em um vetor viral, opcionalmente em que o vetor viral é um vírus natural, um vírus manipulado ou um vírus quimérico, um polinucleotídeo nu que compreende o polinucleotídeo como definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 25, um complexo polinucleotídico, opcionalmente em que o complexo polinucleotídico é uma nanopartícula lipídica que compreende o polinucleotídeo como definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 25, e lipídios, e qualquer combinação destes.
63. Vetor de terapia gênica de acordo com a reivindicação 61 ou 62, caracterizado pelo fato de que o vetor de terapia gênica é um vetor viral selecionado do grupo consistindo em um retrovírus, adenovírus, vírus herpes simplex, poxvírus, vírus vaccinia, lentivírus ou um vírus adeno- associado.
64. Vetor de terapia gênica de acordo com a reivindicação 62 ou 63, caracterizado pelo fato de que o vetor de terapia gênica é AAV9,
15 / 15 Anc80, uma quimera AAV2/8 e/ou um AAV pseudotipado em um tecido específico, por exemplo, o fígado ou tecido neuronal.
65. Uso de um nucleotídeo que codifica a proteína terapêutica multidomínio como definido em qualquer uma das reivindicações 21 a 54, o polinucleotídeo como definida em qualquer uma das reivindicações 55 a 60, ou o vetor de terapia gênica como definida em qualquer uma das reivindicações 61 a 64, caracterizado pelo fato de que se aplica no método como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 20.
BR112020016005-9A 2018-02-07 2019-02-07 Método de administração de uma proteína terapêutica ao sistema nervoso central, proteína terapêutica multidomínio, polinucleotídeo, vetor de terapia gênica, e, uso de um nucleotídeo que codifica a proteína terapêutica multidomínio BR112020016005A2 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862627721P 2018-02-07 2018-02-07
US62/627,721 2018-02-07
US201862777683P 2018-12-10 2018-12-10
US62/777,683 2018-12-10
PCT/US2019/017116 WO2019157224A1 (en) 2018-02-07 2019-02-07 Methods and compositions for therapeutic protein delivery

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020016005A2 true BR112020016005A2 (pt) 2020-12-15

Family

ID=65576681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020016005-9A BR112020016005A2 (pt) 2018-02-07 2019-02-07 Método de administração de uma proteína terapêutica ao sistema nervoso central, proteína terapêutica multidomínio, polinucleotídeo, vetor de terapia gênica, e, uso de um nucleotídeo que codifica a proteína terapêutica multidomínio

Country Status (17)

Country Link
US (1) US20200399623A1 (pt)
EP (1) EP3749373A1 (pt)
JP (2) JP2021512899A (pt)
KR (1) KR20200118151A (pt)
CN (1) CN112040985A (pt)
AU (1) AU2019218892A1 (pt)
BR (1) BR112020016005A2 (pt)
CA (1) CA3090519A1 (pt)
CL (1) CL2020002043A1 (pt)
CO (1) CO2020011068A2 (pt)
IL (1) IL276464A (pt)
MA (1) MA51796A (pt)
MX (1) MX2020008274A (pt)
PH (1) PH12020551180A1 (pt)
RU (1) RU2020129184A (pt)
SG (1) SG11202007363TA (pt)
WO (1) WO2019157224A1 (pt)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2016365834B2 (en) * 2015-12-08 2023-09-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
CA3066569A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
JP2021510539A (ja) 2018-01-16 2021-04-30 シーエルエス セラピューティクス リミテッドＣＬＳ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素の肝臓発現による疾患の処置
EP3813871A4 (en) * 2018-06-29 2022-10-12 Icahn School of Medicine at Mount Sinai SPHINGOLIPID METABOLIZING PROTEINS ENCODING FOR ANC80
KR20210081322A (ko) 2018-08-02 2021-07-01 다인 세라퓨틱스, 인크. 근육 표적화 복합체 및 디스트로핀병증을 치료하기 위한 그의 용도
US11911484B2 (en) 2018-08-02 2024-02-27 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
JP2021533200A (ja) 2018-08-02 2021-12-02 ダイン セラピューティクス, インコーポレーテッドDyne Therapeutics, Inc. 顔面・肩甲・上腕筋ジストロフィーを処置するための筋標的化複合体およびそれらの使用
JP2023503046A (ja) * 2019-11-19 2023-01-26 アスクレピオス バイオファーマシューティカル， インコーポレイテッド ポンペ病およびリソソーム障害を処置するための肝臓特異的プロモーターを含む治療用アデノ随伴ウイルス
EP4274585A1 (en) * 2021-01-08 2023-11-15 CLS Therapeutics Limited Combination of deoxyribonuclease enzyme and cell therapies for treatment of cancer
WO2022226313A1 (en) * 2021-04-23 2022-10-27 University Of Cincinnati Therapeutics for hyponatremia and polycystic kidney disease
US11672872B2 (en) 2021-07-09 2023-06-13 Dyne Therapeutics, Inc. Anti-transferrin receptor antibody and uses thereof
US11633498B2 (en) 2021-07-09 2023-04-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
WO2023081850A1 (en) * 2021-11-04 2023-05-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Viral particles retargeted to skeletal muscle
TW202346348A (zh) 2022-01-10 2023-12-01 美商再生元醫藥公司 作為基因治療所遞送之bbb靶向的gaa在龐貝氏症小鼠模型中治療cns及肌肉
WO2023150620A1 (en) 2022-02-02 2023-08-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Crispr-mediated transgene insertion in neonatal cells
WO2023187728A1 (en) * 2022-04-01 2023-10-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited Gene therapy for diseases with cns manifestations
US11931421B2 (en) 2022-04-15 2024-03-19 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and formulations for treating myotonic dystrophy
WO2024026488A2 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a modified transferrin receptor locus

Family Cites Families (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US543153A (en) 1895-07-23 kidder
WO1994012637A2 (en) 1992-12-02 1994-06-09 Zymogenetics, Inc. Novel human amyloid protein precursor homologue and kunitz-type inhibitors
US5436153A (en) 1992-12-02 1995-07-25 Sprecher; Cindy A. Human amyloid protein precursor homolog and Kunitz-type inhibitor
US5585108A (en) 1994-12-30 1996-12-17 Nanosystems L.L.C. Formulations of oral gastrointestinal therapeutic agents in combination with pharmaceutically acceptable clays
CA2224907A1 (en) 1995-07-25 1997-02-13 Introgene B.V. Methods and means for targeted gene delivery
US6265389B1 (en) 1995-08-31 2001-07-24 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Microencapsulation and sustained release of oligonucleotides
US7029858B1 (en) 1998-04-02 2006-04-18 Cartela Ab Integrin heterodimer and a subunit thereof
US6649138B2 (en) 2000-10-13 2003-11-18 Quantum Dot Corporation Surface-modified semiconductive and metallic nanoparticles having enhanced dispersibility in aqueous media
CA2467763C (en) 2001-12-21 2011-09-13 Alcon, Inc. Use of synthetic inorganic nanoparticles as carriers for ophthalmic and otic drugs
SE0301087D0 (sv) 2003-04-14 2003-04-14 Cartela Ab New monoclonal antibody
AU2004317548A1 (en) 2004-03-25 2005-10-06 Centocor, Inc. Use of EMMPRIN antagonists for the treatment of diseases associated with excessive angiogenesis
AU2006282042B2 (en) 2005-06-17 2011-12-22 The University Of North Carolina At Chapel Hill Nanoparticle fabrication methods, systems, and materials
EP4174179A3 (en) 2005-08-23 2023-09-27 The Trustees of the University of Pennsylvania Rna containing modified nucleosides and methods of use thereof
GB0615662D0 (en) 2006-08-07 2006-09-13 Affitech As Antibody
US8974791B2 (en) 2007-07-27 2015-03-10 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing α-L-iduronidase activity in the CNS
AU2009296937B2 (en) 2008-09-29 2015-02-12 Centocor Ortho Biotech Inc. Anti-CD147 antibodies, methods, and uses
JP2012532455A (ja) 2009-07-01 2012-12-13 ケメット エレクトロニクス コーポレーション 高電圧能力を有する高静電容量の多層
DK2459231T3 (en) 2009-07-31 2016-09-05 Ethris Gmbh RNA with a combination of unmodified and modified nucleotides for protein expression
EP2332995A1 (en) 2009-12-10 2011-06-15 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Neutralizing prolactin receptor antibodies and their therapeutic use
WO2011112566A2 (en) 2010-03-11 2011-09-15 Abbott Laboratories Basigin binding proteins
US9782342B2 (en) 2010-10-11 2017-10-10 Wichita State University Composite magnetic nanoparticle drug delivery system
NZ724348A (en) 2010-11-30 2019-12-20 Genentech Inc Low affinity blood brain barrier receptor antibodies and uses therefor
WO2012125987A2 (en) 2011-03-17 2012-09-20 Massachusetts Institute Of Technology Delivery system
WO2012136519A1 (en) 2011-04-06 2012-10-11 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Use of neutralizing prolactin receptor antibodies for the treatment and prevention of antiestrogen-resistant breast cancer
US20120283503A1 (en) 2011-04-29 2012-11-08 The Johns Hopkins University Nanoparticle loaded stem cells and their use in mri guided hyperthermia
EP2530089A1 (en) 2011-06-03 2012-12-05 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Neutralising prolactin receptor antibody Mat3 and its therapeutical use
JP2015501639A (ja) 2011-11-23 2015-01-19 アイジェニカ バイオセラピューティクス インコーポレイテッド 抗ｃｄ９８抗体およびその使用方法
CA2857647C (en) 2011-12-02 2022-04-19 Armagen Technologies, Inc. Methods and compositions for increasing arylsulfatase a activity in the cns
US8883979B2 (en) 2012-08-31 2014-11-11 Bayer Healthcare Llc Anti-prolactin receptor antibody formulations
CA2906101A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Bayer Healthcare Llc Anti-prolactin receptor antibody formulations
WO2014185908A2 (en) 2013-05-15 2014-11-20 The Translational Genomics Research Institute Hybridoma clones, monoclonal antibodies, and methods of use
AR096364A1 (es) 2013-05-20 2015-12-23 Genentech Inc Anticuerpos receptores de antitransferina y métodos de uso
US10906981B2 (en) 2013-07-19 2021-02-02 The Regents Of The University Of California Compositions and methods related to structures that cross the blood brain barrier
TWI641620B (zh) 2013-08-21 2018-11-21 再生元醫藥公司 抗－ｐｒｌｒ抗體及其用途
US9545451B2 (en) 2013-08-21 2017-01-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-PRLR antibodies and methods for killing PRLR-expressing cells
WO2015101586A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific anti-hapten/anti-blood brain barrier receptor antibodies, complexes thereof and their use as blood brain barrier shuttles
EP3851452A1 (en) 2014-01-06 2021-07-21 F. Hoffmann-La Roche AG Monovalent blood brain barrier shuttle modules
US9629801B2 (en) 2014-01-10 2017-04-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Blood-brain barrier targeting antibodies
JP2017114763A (ja) 2014-03-26 2017-06-29 第一三共株式会社 抗ｃｄ９８抗体−薬物コンジュゲート
US9951141B2 (en) 2014-06-02 2018-04-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antibody-drug conjugates, their preparation and their therapeutic use
CA2967830A1 (en) * 2014-11-14 2016-05-19 Ossianix, Inc. Tfr selective binding compounds and related methods
JP6779876B2 (ja) 2014-11-19 2020-11-04 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗トランスフェリン受容体抗体及びその使用方法
CN107250158B (zh) 2014-11-19 2022-03-25 基因泰克公司 抗转铁蛋白受体/抗bace1多特异性抗体和使用方法
MA41022A (fr) * 2014-11-24 2017-10-03 Shire Human Genetic Therapies Ciblage lysosomial et utilisations correspondantes
BR112017011234A2 (pt) 2014-12-10 2018-03-27 Genentech Inc anticorpos contra receptor da barreira hematoencefálica e métodos de uso
US10538589B2 (en) 2015-01-14 2020-01-21 Armagen Inc. Methods and compositions for increasing N-acetylglucosaminidase (NAGLU) activity in the CNS using a fusion antibody comprising an anti-human insulin receptor antibody and NAGLU
RS62986B1 (sr) 2015-06-24 2022-03-31 Hoffmann La Roche Antitela na transferinski receptor sa prilagođenim afinitetom
HUE057499T2 (hu) 2015-08-10 2022-06-28 Univ Osaka Antitest
JP2018535655A (ja) 2015-09-29 2018-12-06 アムジエン・インコーポレーテツド Ａｓｇｒ阻害剤
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
TWI747843B (zh) 2015-10-02 2021-12-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 雙特異性抗‐人類cd20/人類轉鐵蛋白受體抗體及使用方法
AU2016365834B2 (en) * 2015-12-08 2023-09-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
US10233252B2 (en) 2015-12-21 2019-03-19 Wisconsin Alumni Research Foundation pH-dependent antibodies targeting the transferrin receptor and methods of use thereof to deliver a therapeutic agent
WO2017134197A1 (en) * 2016-02-05 2017-08-10 Genmab A/S Multispecific antigen-binding molecule with improved internalization characteristics
CN105820250B (zh) 2016-04-29 2019-04-30 中国人民解放军第四军医大学 一种抗basigin人源化抗体及其应用
CN109562169A (zh) 2016-06-08 2019-04-02 艾伯维公司 抗cd98抗体及抗体药物偶联物
US20200147235A1 (en) 2016-06-08 2020-05-14 Abbvie Inc. Anti-cd98 antibodies and antibody drug conjugates
US20200121803A1 (en) 2016-06-08 2020-04-23 Abbvie Inc. Anti-cd98 antibodies and antibody drug conjugates
EP3548514A1 (en) 2016-11-29 2019-10-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating prlr positive breast cancer
KR102580320B1 (ko) 2017-01-27 2023-09-19 신텔라 에이비 골 및 연골 손상 또는 질환의 예방 및 치료
US20180303952A1 (en) 2017-03-09 2018-10-25 Cytomx Therapeutics, Inc. Cd147 antibodies, activatable cd147 antibodies, and methods of making and use thereof
JP2020520909A (ja) 2017-05-18 2020-07-16 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 治療抗体の適用関連副反応の低減
CA3066569A1 (en) * 2017-06-07 2018-12-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for internalizing enzymes
CA3069193A1 (en) 2017-07-10 2019-01-17 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Prolactin receptor antibody for male and female pattern hair loss

Also Published As

Publication number Publication date
CL2020002043A1 (es) 2021-07-23
WO2019157224A1 (en) 2019-08-15
CO2020011068A2 (es) 2020-12-10
EP3749373A1 (en) 2020-12-16
JP2023054256A (ja) 2023-04-13
US20200399623A1 (en) 2020-12-24
JP2021512899A (ja) 2021-05-20
IL276464A (en) 2020-09-30
MA51796A (fr) 2020-12-16
RU2020129184A (ru) 2022-03-09
AU2019218892A1 (en) 2020-10-01
SG11202007363TA (en) 2020-08-28
CN112040985A (zh) 2020-12-04
MX2020008274A (es) 2020-11-11
PH12020551180A1 (en) 2021-06-07
KR20200118151A (ko) 2020-10-14
CA3090519A1 (en) 2019-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BR112020016005A2 (pt) Método de administração de uma proteína terapêutica ao sistema nervoso central, proteína terapêutica multidomínio, polinucleotídeo, vetor de terapia gênica, e, uso de um nucleotídeo que codifica a proteína terapêutica multidomínio
US20220195011A1 (en) Compositions and methods for internalizing enzymes
JP7385723B2 (ja) 血液脳関門を通過する新規な抗ヒトトランスフェリン受容体抗体
ES2926280T3 (es) Composiciones y métodos para internalizar enzimas
TWI769982B (zh) 通過血腦障壁之抗人類運鐵蛋白受體抗體
US20230220100A1 (en) Bbb-targeted gaa delivered as gene therapy treats cns and muscle in pompe disease model mice
RU2806021C2 (ru) Композиции и способы для интернализации ферментов
TW202405021A (zh) 用於使酶內化之組成物及方法
EA041885B1 (ru) Композиции и способы интернализации ферментов

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]