CN102655882B

CN102655882B - 具有降低的免疫原性的改进的假单胞菌外毒素a

Info

Publication number: CN102655882B
Application number: CN201080049559.3A
Authority: CN
Inventors: 艾拉·H·帕斯坦; 理查德·比尔斯; 恩田正德
Original assignee: Goverment Of United States, AS REPRESENTED BY SECRETARY D
Current assignee: Goverment Of United States, AS REPRESENTED BY SECRETARY D; US Department of Health and Human Services
Priority date: 2009-09-11
Filing date: 2010-09-10
Publication date: 2014-11-19
Anticipated expiration: 2030-09-10
Also published as: US8936792B2; RU2012114005A; AU2010292069A1; CN102655882A; WO2011032022A1; CA2773665A1; US20120263674A1; JP5795765B2; CA2773665C; ES2544805T3; EP2475398B1; EP2475398A1; AU2010292069B2; JP2013504328A

Abstract

本发明提供具有高的细胞毒性和降低的免疫原性的改进的假单胞菌外毒素A(PE)分子、含有所述改进的假单胞菌外毒素A的组合物以及使用方法。

Description

具有降低的免疫原性的改进的假单胞菌外毒素A

优先权

本申请要求于2009年9月11日提交的美国临时申请第61/241,620号的权益，通过引用将其全部内容并入本文。

发明领域

本发明提供具有高细胞毒性和降低的免疫原性的改进的假单胞菌(pseudomonas)外毒素A(PE)分子、含有所述改进的假单胞菌外毒素A的组合物以及使用方法。

发明背景

在过去的数年中，免疫偶联物已被开发为治疗恶性肿瘤的备选治疗方法。免疫偶联物最初由抗体与植物或细菌毒素通过化学偶联组成，该免疫偶联物为一种被称为免疫毒素的形式。抗体与靶细胞上表达的抗原结合，并且毒素被内化，从而通过阻止蛋白合成和诱导凋亡引起细胞死亡(Brinkmann，U.，Mol.Med.Today，2：439-446(1996))。最近，已经将编码抗体和毒素的基因融合，并将免疫毒素表达为融合蛋白。

已有很多研究在利用称为假单胞菌外毒素A(“PE”)的细菌毒素作为毒性部分的免疫毒素上进行。通常，将PE截短或突变，从而降低其非特异性毒性，但又不会破坏其对于被免疫毒素的靶向部分所靶向的细胞的毒性。目前，对利用基于PE的免疫毒素作为多种癌症的治疗手段的测试正进行临床试验。

目前的基于PE的免疫毒素的免疫原性很强。经证实，这一点在血液学恶性肿瘤的治疗中不是问题，因为在血液学恶性肿瘤中，免疫系统产生应答的能力通常遭受破坏。通常可以将免疫毒素多次给予血液学恶性肿瘤患者。然而，实体瘤患者通常在首次给药后的数周内产生对基于PE的免疫毒素的中和抗体。因为很多方案要求在免疫毒素给药之间具有3周的时间，所以该时间段内抗体的产生实际上意味着，对于实体瘤而言，在患者的抗体致使基于PE的免疫毒素失效之前，通常仅可以对其进行一次给药。尽管如此，基于PE的免疫毒素的单次给药也能非常有助于减小患者的肿瘤负荷、消灭较小的转移灶和缓解症状。但是，仍希望能拥有可降低患者的免疫原性应答的抗原性较低形式的基于PE的免疫毒素。

本发明满足这些需要，并且还满足其它需要。

发明概述

本发明提供具有降低的免疫原性的改进的假单胞菌外毒素A(“PE”)。在结构上，本发明的改进的PE中去除了结构域I和大部分的结构域II，并且结构域III中的氨基酸残基位置D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代为甘氨酸，丙氨酸或丝氨酸。在功能上，本发明的改进的PE分子保留高的细胞毒性活性，同时去除了B细胞表位。接受了5次注射本发明的改进PE的小鼠不会产生针对所述毒素的免疫应答。用本文中称为LR-8M(之前称为LR-8X)的本发明具体实施方案对所述改进的PE分子进行举例说明。

因此，一方面，本发明提供了分离的假单胞菌外毒素A(“PE”)，其中对应SEQ ID NO：1的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素A中去除了残基1-273和285-394，并且氨基酸残基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。

在相关方面中，本发明提供了嵌合分子，其包含与(b)假单胞菌外毒素A(“PE”)偶联或融合的(a)靶向部分，其中对应SEQ ID NO：1的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素A中去除了残基1-273和285-394，并且氨基酸残基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。

另一方面，本发明提供了组合物，其包含

(a)嵌合分子，所述嵌合分子包含与假单胞菌外毒素A(“PE”)偶联或融合的靶向部分，其中对应SEQ ID NO：1的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素A中去除了残基1-273和285-394，并且氨基酸残基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸；和

(b)药学可接受的载体。

在相关方面中，本发明提供编码修饰的假单胞菌外毒素A(“PE”)的分离的核酸，其中对应SEQ ID NO：1的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素A中去除了残基1-273和285-394，并且氨基酸残基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。在一些实施方案中，所述核酸还编码靶向部分。

另一方面，本发明提供抑制携带靶分子的细胞的生长的方法，所述方法包括将所述细胞与嵌合分子接触，所述嵌合分子包含

(a)特异性地结合所述靶分子的靶向部分，和

(b)假单胞菌外毒素A(“PE”)，其中对应SEQ ID NO：1的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素A中去除了残基1-273和285-394，并且氨基酸残基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，

其中将所述细胞与所述嵌合分子接触能抑制所述细胞的生长。

关于所述实施方案，在一些实施方案中，对应SEQ ID NO：1的氨基酸残基，所述假单胞菌外毒素A中任选地至少一个选自D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597的氨基酸残基被取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。

在一些实施方案中，所述假单胞菌外毒素A具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述假单胞菌外毒素A具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述靶向部分是抗体。在一些实施方案中，所述抗体选自scFv、dsFv、Fab、单结构域抗体和F(ab’)₂。

在一些实施方案中，所述抗体针对选自以下的细胞表面抗原：CD19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD79b、转铁蛋白受体、EGF受体、间皮蛋白(mesothelin)、钙粘蛋白和Lewis Y。

在一些实施方案中，所述抗体选自B3、RFB4、SS1、HN1、HN2、MN和HB21。

在一些实施方案中，所述抗体具有包含3个互补决定区(CDR)的可变轻链(VL)和包含3个CDR的可变重链(VH)，其中

(i)所述VL CDR1具有序列QDIXXY(SEQ ID NOS：4-8)，其中XX选自SN、HG、GR、RG和AR；

(ii)所述VL CDR2具有序列YTS；

(iii)所述VL CDR3具有序列QQGNTLPWT(SEQ ID NO：9)；

(iv)所述VH CDR1具有序列GFAFSIYD(SEQ ID NO：10)；

(v)所述VH CDR2具有序列ISSGGGTT(SEQ ID NO：11)；

(vi)所述VH CDR3具有序列ARHSGYGXXXGVLFAY(SEQ IDNOS：12-16)，其中XXX选自SSY、THW、YNW、TTW和STY。

(i)所述VL CDR1具有序列QDISNY(SEQ ID NO：4)；

(ii)所述VL CDR2具有序列YTS；

(iii)所述VL CDR3具有序列QQGNTLPWT(SEQ ID NO：9)；

(iv)所述VH CDR1具有序列GFAFSIYD(SEQ ID NO：10)；

(v)所述VH CDR2具有序列ISSGGGTT(SEQ ID NO：11)；

(vi)所述VH CDR3具有序列ARHSGYGTHWGVLFAY(SEQ IDNO：13)。

(i)所述VL CDR1具有序列QDIHGY(SEQ ID NO：5)；

(ii)所述VL CDR2具有序列YTS；

(iii)所述VL CDR3具有序列QQGNTLPWT(SEQ ID NO：9)；

(iv)所述VH CDR1具有序列GFAFSIYD(SEQ ID NO：10)；

(v)所述VH CDR2具有序列ISSGGGTT(SEQ ID NO：11)；

(vi)所述VH CDR3具有序列ARHSGYGTHWGVLFAY(SEQ IDNO：13)。

在一些实施方案中，所述抗体包含HA22的Fv部分。在一些实施方案中，所述抗体是人的或人源化的。

在一些实施方案中，所述靶向部分是细胞因子、淋巴因子或生长因子。

其它实施方案对于本领域技术人员是显而易见的，并且在本文中进行了描述。

定义

按照国际单位制(SI)可接受的形式表示单位、前缀以及符号。数值范围包括限定范围的数值。除非另外指明，核酸按照5′至3′的方向从左至右书写；氨基酸序列按照从氨基至羧基的方向从左至右书写。本文提供的标题不是限制本发明的的各个方面或实施方案，应参考整个说明书理解本发明的各个方面或实施方案。因此，下文紧接着定义的术语的应当参考整个说明书进行进行更充分的定义。

假单胞菌外毒素A(“PE”)是由铜绿假单胞菌(Psedomonas aerugmosa)分泌的活性极高的单体蛋白(分子量66kD)，其抑制真核细胞中的蛋白合成。美国专利第5,602,095号中提供了天然PE序列(SEQ ID NO：1)，通过引用将其并入本文。PE的作用方法和结构以及能导致多种PE变体的修饰在文中为此目的的节段中进行了较详细的讨论。

本文所述的PE突变参考天然PE的613个氨基酸的序列(SEQ ID NO：1)的具体位置处存在的氨基酸残基，其后面为在讨论的具体突变中取代了所述残基的氨基酸。因此，例如，术语“R490A”表示参考分子中第490位的“R”(精氨酸的标准单字母代码)被替换为“A”(丙氨酸的标准单字母代码)，而“K590Q”表示第590位上通常存在的赖氨酸被替换为谷氨酰胺。常见氨基酸的标准单字母代码如下文所示。

“CD22”是指谱系限制性B细胞抗原，其属于Ig超家族。60-70％的B细胞淋巴瘤和白血病中表达CD22，并且在B细胞发育早期中的细胞表面上或在干细胞上不存在CD22。参见，例如Vaickus et al.，Crit.Rev.Oncol/Hematol.11：267-297(1991)。

本文所用的术语“抗CD22”是指特异性地结合CD22的抗体，并且包括针对CD22产生的抗体。在优选实施方案中，CD22是灵长类CD22，例如，人CD22。在一个优选实施方案中，所述抗体是针对人CD22产生的，所述人CD22是将编码人CD22的cDNA引入非灵长类哺乳动物后由所述动物合成的。

“CD25”或“Tac”是指IL-2受体(IL2R)的α链。CD25是存在于活化的T细胞、活化的B细胞、部分胸腺细胞、骨髓前体细胞以及少突细胞上的I型跨膜蛋白，其与CD122缔合形成异二聚体，该异二聚体能作为IL-2的高亲和力受体。大部分B细胞瘤、部分急性非淋巴细胞白血病以及成神经细胞瘤表达CD25。

本文所用的术语“抗CD25”是指特异性地结合CD25的抗体，并且包括针对CD25产生的抗体。在优选实施方案中，CD25是灵长类CD25，例如，人CD25。在一个优选实施方案中，所述抗体是针对人CD25产生的，所述人CD25是将编码人CD25的cDNA引入非灵长类哺乳动物后由所述动物合成的。

术语“间皮蛋白”是指存在于部分人类细胞的表面上并被例如K1抗体结合的蛋白及其片段。间皮蛋白的核酸和氨基酸序列公开于，例如，PCT公开申请WO 97/25,068以及美国专利第6,083,502号和第6,153,430号。也可以参见Chang，K.& Pastan，I.，Int.J.Cancer 57：90(1994)；Chang，K.&Pastan，I.，Proc.Nat′l Acad.Sci USA 93：136(1996)；Brinkmann U.，et al，Int.J.Cancer 71：638(1997)；Chowdhury，P.S.，et al，Mol Immunol.34：9(1997)以及美国专利第6,809,184号。间皮蛋白被表达为约69kDa的前体蛋白，然后被加工而释放30kDa的蛋白，同时留下背景部分中所述的40kDa的甘油磷酸肌醇连接的细胞表面糖蛋白与细胞表面连接。40kDa的糖蛋白是本文中术语“间皮蛋白”所指的蛋白。数个物种的间皮蛋白的核酸和氨基酸序列已有记录，例如，人(NM_005823.4→NP_005814.2和NM_013404.3→NP_037536.2)、小鼠(NM_018857.1→NP_061345.1)、大鼠(NM_031658.1→NP_113846.1)、牛(NM_001100374.1→NP_001093844)。

“RFB4”是指特异性地结合人CD22的小鼠IgGl单克隆抗体。可以从多个供货商购得产品名为RFB4的RFB4，例如Southern BiotechnologyAssociates，Inc.(Birmingham AL；目录号9360-01)、Autogen Bioclear UKLtd.(Calne，Wilts，UK；目录号AB147)、Axxora LLC.(San Diego，CA)。RFB4对于B谱系细胞是高度特异性的，并且与其它正常细胞类型没有可检测的交叉反应(Li et al.，Cell.Immunol.118：85-99(1989))。RFB4的重链和轻链已被克隆出。参见，Mansfield et al.，Blood 90：2020-2026(1997)，通过引用将其并入本文。

“BL22”(或“RFB-4(dsFv)-PE38”)是一种免疫毒素，其利用本领域称为“RFB-4″的抗C22抗体的二硫键稳定的Fv区作为靶向部分。RFB-4抗体的序列是本领域公知的。BL22描述于Kreitman et al.，New Eng J Med345(4)：241-7(2001)。BL22免疫毒素利用PE38作为免疫毒素的毒性部分。

“HA22”是一种免疫毒素，其利用RFB-4的突变形式作为靶向部分，其中，RFB4的可变重链CDR3的残基SSY被突变为THW。RFB-4的这种突变及它对免疫毒素利用其作为靶向部分的影响描述于国际公布WO03/027135和Salvatore et al.，Clin Cancer Res 8(4)：995-1002(2002)。HA22免疫毒素利用PE38作为免疫毒素的毒性部分。

为了便于引用，本文所用的术语“抗体”包括全抗体(本文中有时称为“完整抗体”)、保留抗原识别和结合能力的抗体片段(包括通过对全抗体的修饰而产生的或利用重组DNA方法重头合成的)、单克隆抗体、多克隆抗体以及抗体模拟物，除非文中另作要求。抗体可以是IgM、IgG(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄)、IgD、IgA或IgE。

IgG亚类的恒定区序列是本领域多年来已经公知的(例如，Honjo et al.，Cell，18：559-68(1979)；Tucker et al.，Science，206：1303-6(1979)；Yamawakiet al.，Nature 283：786-9(1980)；Ellison et al.，Nucl Acids Res 10：4071-9(1982)；Ellison et al.，DNA 1：11-8(1981)；Ellison and Hood，Proc Natl AcadSci USA 79：1984-8(1982))。因为可变区CDR决定抗体特异性，所以可以将针对靶细胞表面抗原的抗体CDR或Fv移植或工程化到选定抗体中，从而为该抗体赋予对于所述靶细胞表面抗原的特异性。例如，可以将针对靶细胞表面抗原的抗体CDR移植到已知三维结构的人抗体框架上(参见，例如，WO98/45322；WO87/02671；美国专利第5,859,205号；第5,585,089号和第4,816,567号；EP专利申请0173494；Jones，et al.Nature321：522(1986)；Verhoeyen，et al，Science 239：1534(1988)；Riechmann，et al.Nature 332：323(1988)；以及Winter & Milstein，Nature 349：293(1991))，从而形成当给予人时仅会引起很小的免疫原性应答或不会引起免疫原性应答的抗体。或者，可以通过将非人动物(例如小鼠)中发现的残基替换为通常在人中发现的残基将抗体恒定区工程化。按照此方式工程化的抗体被称为“人源化的抗体”并且是优选的，因为它们诱导副作用的风险较低，并且可以在循环中保持更长的时间。抗体的人源化方法是本领域已知的，并且描述于，例如，美国专利第6,180,377号、第6,407,213号、第5,693,762号、第5,585,089号和第5,530,101号。

术语“抗体片段”表示包含完整抗体的一部分的分子，通常是完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)₂以及Fv片段；单结构域抗体(参见，例如，Wesolowski，Med Microbiol Immunol.(2009)198(3)：157-74；Saerens，et al.，Curr Opin Pharmacol.(2008)8(5)：600-8；Harmsen and de Haard，Appl Microbiol Biotechnol.(2007)77(1)：13-22)；螺旋稳定抗体(参见，例如，Amdt et al.，J Mol Biol 312：221-228(2001)；双链抗体(参见下文)；单链抗体分子(“scFvs”，参见，例如，美国专利第5,888,773号)；二硫键稳定抗体(“dsFvs”，参见，例如，美国专利第5,747,654号和第6,558,672号)以及结构域抗体(“dAbs”，参见，例如，Holt et al.，Trends Biotech 21(11)：484-490(2003)，Ghahroudiet al.，FEBS Lett.414：521-526(1997)，Lauwereys et al.，EMBO J 17：3512-3520(1998)，Reiter et al.，J.Mol.Biol.290：685-698(1999)，Daviesand Riechmann，Biotechnology，13：475-479(2001))。

术语“双链抗体”是指具有两个抗原结合位点的小的抗体片段，所述片段包含在同一多肽链中与可变轻结构域(“V_L”或“VL”)连接的可变重结构域(“V_H”或“VH”)(V_H-V_L)。通过使用由于太短而不允许同一链上的两个结构域之间配对的连接物，所述结构域被迫与另一链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合位点。双链抗体及其制备更详细地描述于，例如，EP 404,097；WO 93/11161；以及Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)。

术语“母体抗体”表示希望进行突变或改变而获得与母体抗体结合同一表位但具有较高亲和力的抗体或其片段的任何目的抗体。

“靶向部分”是免疫偶联物中预期使免疫偶联物靶向于目的细胞的部分。通常，靶向部分是抗体或保留抗原识别能力的抗体片段，例如scFv、dsFv、Fab或F(ab′)₂。

“毒性部分”是免疫毒素中使免疫毒素对目的细胞产生细胞毒性的部分。对于作为本发明一个主题的免疫毒素，正如下文详细描述的，毒性部分是假单胞菌外毒素A，已对所述假单胞菌外毒素A进行突变来降低其非特异性的细胞毒性。

通常，免疫球蛋白具有重链和轻链。每条重链和轻链都含有恒定区和可变区(所述区也称为“结构域”)。轻链和重链可变区含有″框架″区，所述框架区被3个高度可变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)隔开。框架区和CDR的范围已被界定。不同轻链或重链的框架区序列在一个物种内是相对保守的。抗体的框架区，即组成型轻链和重链的组合框架区，用于三维空间中CDR的定位和排列。

CDR主要负责与抗原的表位结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2以及CDR3(从N末端开始依次编号)，并且还通常由具体CDR所位于的链来标识。因此，V_HCDR3位于其所在的抗体重链的可变结构域中，而V_LCDR1是其所在的抗体轻链的可变结构域的CDR1。

“V_H”或“VH”是指免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab。“V_L”或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab。

词组“单链Fv”或“scFv”是指这样的抗体：其中常规的两条链的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域已被连接从而形成一条链。通常，在两条链之间插入连接肽，以允许正确折叠和活性结合位点的产生。

词组“二硫键”或“半胱氨酸-半胱氨酸二硫键”是指两个半胱氨酸之间的共价相互作用，其中半胱氨酸的硫原子被氧化从而形成二硫键。二硫键的平均键能为约60kcal/mol，而氢键为1-2kcal/mol。

词组“二硫键稳定Fv”或“dsFv”是指轻链和重链之间具有二硫键的免疫球蛋白可变区。在本发明的背景下，形成二硫键的半胱氨酸位于抗体链的框架区内，并且用于稳定抗体的构象。通常，将抗体进行工程化，从而在框架区中取代不会干扰抗原结合的位置处引入半胱氨酸。

术语“连接肽”包括抗体结合片段(例如，Fv片段)中的肽，其用于使重链可变结构域与轻链可变结构域间接结合。

可以通过重组方法(例如，通过噬菌体或相似载体中重组抗体文库的选择(参见，例如，Huse，et al.，Science 246：1275-1281(1989)；Ward，et al.，Nature 341：544-546(1989)；和Vaughan，et al.，Nature Biotech.14：309-314(1996)))或通过用抗原或编码抗原的DNA免疫动物来产生与具体抗原能发生免疫反应的抗体。

术语“效应部分”表示免疫偶联物中预期对靶向部分所靶向的细胞具有作用或预期能鉴定免疫偶联物的存在的部分。在本发明的背景下，效应部分是突变的假单胞菌外毒素A。

术语“免疫偶联物”包括效应分子与抗体的共价连接。

术语“有效量”或“对…有效的量”或“治疗有效量”包括足以产生所需结果的治疗剂剂量，所述结果例如将细胞蛋白合成抑制至少50％或杀死细胞。

术语“毒素”通常包括相思豆毒素、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、肉毒杆菌毒素或它们的经过修饰的毒素。例如，PE和DT是高毒性化合物，它们通常通过肝毒性而导致死亡。然而，可以通过去除PE和DT的天然靶向组分(例如，PE的结构域Ia或DT的B链)并将其替换为不同的靶向部分(例如抗体)而将PE和DT修饰为能用作免疫毒素的形式。在本发明的背景下，毒素是突变的假单胞菌外毒素A。

术语“接触”包括置于直接的物理关联中。

“表达质粒”包含编码目的分子的核苷酸序列，其与启动子可操作地连接。

本文所用的“多肽”、“肽”和“蛋白”可交换使用，并且包括氨基酸残基的聚合物。上述术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，并且适用于天然存在的氨基酸聚合物。上述术语还适用于含有保守型氨基酸取代而使得蛋白仍具有功能的聚合物。

术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”包括被合并入蛋白、多肽或肽(统称“肽”)中的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另外限定，氨基酸可以包括以与天然存在的氨基酸相似的方式发挥作用的天然氨基酸的已知类似物。

本文涉及的氨基酸和类似物以下文表A中的缩写名称进行描述：

表A：氨基酸命名

当描述蛋白时，“保守型取代”是指不会显著改变蛋白活性的蛋白氨基酸组成的改变。因此，具体氨基酸序列的“保守型修饰的变异”是指对于蛋白活性不是关键性的氨基酸的氨基酸取代或将氨基酸取代为具有相似性质(例如，酸性、碱性、带正电的或带负电的、极性的或非极性的等)的其它氨基酸，从而即使是关键氨基酸的取代也不会显著改变活性。提供功能相似氨基酸的保守型取代表是本领域公知的。表B中的以下六组中的每一组都包括能彼此进行保守型取代的氨基酸：

表B

1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；

2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；以及

6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。

也可以参见Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties，W.H.Freeman and Company，New York(第二版，1992)。

对于肽而言，术语“基本上相似”表示肽包含与参考序列在10-20个氨基酸的比较窗上具有至少90％、优选至少95％的序列同一性的序列。通过在比较窗上比较两个最佳比对的序列来确定序列同一性百分比，其中为了两个序列的最佳比对，与参考序列(不包含插入或缺失)相比，比较窗中的多核苷酸序列部分可以包含插入或缺失(即，空位)。按照下述计算百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数，从而得到匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗中的总位置数并将结果乘以100，从而得到序列同一性百分比。

术语“偶联”、“连接(joining)”、“结合”或“连接(linking)”是指使两个多肽成为一个连续的多肽分子。在本发明的背景下，该术语包括将抗体部分与效应分子(EM)连接。所述连接可以通过化学手段或重组手段。化学手段是指抗体部分和效应分子之间发生反应，使得在两个分子之间形成共价键，从而形成一个分子。

本文所用的“重组”包括涉及如下述产生的蛋白：利用在天然状态下不具有能表达所述蛋白的内源DNA拷贝的的细胞来产生蛋白。细胞产生重组蛋白是由于已经通过引入合适的分离的核酸序列而将所述细胞进行了基因改造。该术语还包括通过引入异源核酸或将天然核酸改变为对于细胞而言是非天然的形式而进行修饰的细胞或核酸或载体，或细胞是来源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然(非重组)形式中不存在的基因、表达天然形式中存在的基因的突变体或表达异常表达、低表达或不表达的天然基因。

本文所用的“核酸”或“核酸序列”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，还包括以与天然存在的核苷酸相似的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。除非另外指明，具体的核酸序列包括其互补序列以及保守型变体(即，密码子的摆动位置中存在的核酸和当翻译为蛋白时产生氨基酸保守型取代的变体)。

对于指定核酸而言，本文所用的“编码”包括涉及含有翻译为所述指定蛋白的信息的核酸。由密码子的使用指定所述信息。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遗传密码所编码。然而，通用密码的变异存在于，例如某些植物、动物以及真菌线粒体，细菌山羊支原体(Mycoplasmacapricolum)(Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82：2306-2309(1985)或纤毛虫大核，因此当利用这些生物的翻译机制来表达核酸时，可以使用通用密码的变异。

词组“框内融合”是指连接两个或更多个编码多肽的核酸序列，使得所连接的核酸序列能翻译为包含原始多肽链的单链蛋白。

本文所用的“表达”包括核酸翻译为蛋白。蛋白可以被表达，并保持在细胞内、成为细胞表面膜的组分或被分泌到细胞外基质或培养基中。

“宿主细胞”表示能支持表达载体的复制或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如酵母、昆虫、两栖动物或哺乳动物细胞)。

对于两个或更多个核酸或多肽序列而言，术语“同一的”或“同一性”百分比是指当为最大对应性进行比较和比对，如利用下述序列比较算法之一或通过肉眼检查进行测定时，相同的或具有指定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸的两个或更多个序列或子序列。

对于两个核酸或多肽而言，词组“基本上同一的”是指当为最大对应性进行比较和比对，如利用下述序列比较算法之一或通过肉眼检查进行测定时，具有至少60％、更优选65％、更优选70％、更优选75％、更优选80％以及最优选90-95％的核苷酸或氨基酸残基同一性的两个或更多个序列或子序列。优选地，基本上的同一性存在于长度为至少约50个残基的序列的区上，更优选在至少约100个残基的区上，并且最优选地，序列在至少约150个残基上是基本上同一的。在最优选的实施方案中，序列在编码区的全长上是基本上同一的。

对于序列比较，通常，一个序列作为参考序列，测试序列与其进行比较。当利用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入电脑，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法会基于指定的程序参数而计算出测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

可以通过以下进行用于比较的序列最佳比对，例如，Smith &Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，Needleman &Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，Pearson & Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性方法检索，这些算法的计算机化实施程序(Wisconsin Genetics Software Package，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者肉眼检查(可大体上参见Current Protocols inMolecular Biology，F.M.Ausubel et al，eds.，Current Protocols，a joint venturebetween Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley & Sons，Inc.，(1995增补)(Ausubel))。

适于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述于Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschuel et al.(1977)Nucleic Acids Res.25：3389-3402。用于执行BLAST分析的软件可在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获取(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。该算法涉及首先通过鉴定问询序列中的长度W的短字符来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字符比对时，所述问询序列中的长度W的短字符能匹配或满足一定的正值阈值得分T。T被称为邻近字符得分阈值(Altschul et al.，同上)。这些最初的邻近字符命中作为种子，用于起始搜索含有它们的较长HSP。然后，沿着每个序列在两个方向延伸字符命中，直到能增加累积比对得分。对于核苷酸序列，利用参数M(匹配残基对的奖励得分；总是大于0)和N(错配残基的罚分；总是小于0)计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积得分。当出现以下情形时，终止每个方向上字符命中的延伸：累积比对得分从其最大实现值掉落X的量；由于累积一个或多个负评分的残基比对而使累积得分达到0或低于0；或者到达序列的任一末端。BLAST算法参数W、T以及X决定比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)默认使用：字长(W)为11、预期值(E)为10、M＝5、N＝-4以及两条链比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用：字长(W)为3、预期值(E)为10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff & Henikoff，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))。

除了计算序列同一性百分比之外，BLAST算法还执行两个序列之间的相似性的统计学分析(参见，例如，Karlin & Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。BLAST算法提供的相似性的一个度量是最小和概率(P(N))，其能提供两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配偶然出现的概率的指示。例如，如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小和概率小于约0.1、更优选小于约0.01以及最优选小于约0.001，则认为测试核酸与参考序列相似。

两个核酸序列或多肽是基本上同一的另一指示是第一核酸所编码的多肽与第二核酸所编码的多肽能发生免疫交叉反应，如下文所述。因此，例如，当两个肽的区别仅为保守型取代时，通常一个多肽与第二多肽是基本上同一的。两个核酸序列是基本上同一的另一指示是两个分子在严紧条件下彼此杂交，如下文所述。

术语“体内”包括位于获取细胞的生物体的体内。“离体”和“体外”表示位于获取细胞的生物体的外部。

词组“恶性细胞”或“恶性肿瘤”是指具有侵袭性的和/或能进行转移的肿瘤或肿瘤细胞，即，癌性细胞。

本文所用的“哺乳动物细胞”包括来源于哺乳动物的细胞，所述哺乳动物包括人、大鼠、小鼠、豚鼠、猩猩或猕猴。可以在体内或体外培养细胞。

对于抗原，术语“选择性反应”是指抗体的整体或一部分与携带该抗原的细胞或组织的优先结合，而不与缺少该抗原的细胞或组织结合。当然，已经证实在分子和非靶细胞或组织之间可以发生一定程度的非特异性相互作用。尽管如此，可以由是否通过抗原的特异性识别来区分选择性反应。尽管选择性反应抗体结合抗原，但它们可以以低亲和力进行结合。另一方面，特异性结合导致抗体和携带抗原的细胞之间的结合会大大强于抗体和缺少抗原的细胞之间的结合。特异性结合通常导致抗体(每单位时间)与携带靶抗原的细胞或组织的结合的量比与缺少靶抗原的细胞或组织的结合的量增加大于2倍、优选大于5倍、更优选大于10倍以及最优选大于100倍。在这些条件下与蛋白的特异性结合需要针对对具体蛋白的特异性来选择抗体。多种免疫测定形式适于选择与具体蛋白发生特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定被常规用于选择与蛋白发生特异性免疫反应的单克隆抗体。关于可用于测定特异性免疫反应的免疫测定形式和条件的描述，可参见Harlow & Lane，ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Publications，New York(1988)。

术语“免疫反应性条件”包括允许针对具体表位产生的抗体与该表位结合的程度可检测地高于与基本上所有其它表位的结合和/或基本上不与基本上所有其它表位结合的条件。免疫反应性条件取决于抗体结合反应的形式，并且通常是免疫测定过程中所用的条件或体内遇到的那些条件。关于免疫测定形式和条件的描述，可参见Harlow & Lane，同上。优选地，本发明方法中所用的免疫反应性条件是“生理条件”，其包括通常处于活的哺乳动物或哺乳动物细胞中的条件(例如，温度、同渗容摩、pH)。尽管已经认识到某些器官处于极端条件下，但是生物内和细胞内环境通常为约pH7(即，pH6.0-pH8.0，更通常为pH6.5-7.5)，含有水作为主要溶剂，以及处于高于0℃且低于50℃的温度。同渗容摩位于能支持细胞活力和增殖的范围内。

术语“患者”、“个体(subject)”、“个体(individual)”可互换使用，是指哺乳动物，例如，人或非人灵长类，驯养哺乳动物(例如，犬或猫)，农业哺乳动物(例如，牛、猪、羊、马)，实验室哺乳动物(小鼠、大鼠、仓鼠、兔)。

术语“共同给予”是指个体血液中同时存在两种活性剂。可以同时或依次递送共同给予的活性剂。

本文所用的术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指延迟发生、阻止或逆转该术语所应用于的疾病或疾病状态或该疾病或疾病状态的一种或多种症状的进展，或缓解或预防该术语所应用于的疾病或疾病状态或该疾病或疾病状态的一种或多种症状。

对于肿瘤或癌症生长或进展，术语“抑制”、“降低”、“减少”是指将个体中肿瘤或癌症的生长、扩散、转移抑制利用本领域已知的任何方法可检测到的量。如果肿瘤负荷比共同给予本发明的PE(例如，作为嵌合分子的一部分)之前的肿瘤负荷减少至少约10％、20％、30％、50％、80％或100％，则肿瘤或癌症的生长、发展或扩散被抑制、降低或减少。在一些实施方案中，与给予PE之前的肿瘤负荷相比，肿瘤或癌症的生长、发展或扩散被抑制、降低或减少至少约1倍、2倍、3倍、4倍或更多倍。

附图简要描述

图1表明HA22-LR-8M对来自CLL患者的慢性淋巴性白血病(CLL)细胞具有很好的细胞杀伤活性。

图2表明HA22-LR-8M对SCID小鼠中的CA46肿瘤具有很好的抗肿瘤活性。用HA22或HA22-LR-8M静脉内(i.v.)注射3次治疗具有CA46肿瘤的小鼠，并在23天中测量肿瘤大小。

图3显示了在接受免疫毒素静脉内给药的小鼠中，HA22-LR-8M的免疫原性低于LMB-9。

图4显示了在接受免疫毒素静脉内(i.v.)给药的小鼠中，HA22-LR-8M的免疫原性低于HA22。

图5显示了HA22(闭合圆圈)和HA22-LR-8M(闭合方块)对CA46细胞的特异性细胞毒性活性(图5A)；HA22和HA22-LR-8M的抗肿瘤活性(图5B)。

图6显示了对HA22、HA22-8X和HA22-LR-8M的免疫应答的比较。小鼠中针对免疫毒素的IgG抗体产生如图6A所示。小鼠中免疫毒素所诱导的IgM应答如图6B所示。免疫血清的滴定如图6C所示。HA22免疫的小鼠血清中针对每种突变体分子的抗体的量如图6D所示。对HA22或HA22-LR-8M免疫毒素的继发性免疫应答如图6E所示。先前存在的产抗体的B细胞对HA22或HA22-LR-8M免疫毒素的免疫应答如图6F所示。

发明详述

1.引言

假单胞菌外毒素A(“PE”)被研究用作嵌合分子(例如免疫毒素)的毒性部分已经超过15年。该研究体现在多种PE突变形式的开发中，这些PE突变形式保留细胞毒性活性，同时降低或去除该分子的非特异性毒性。这些突变体中的大部分是被截短的，从而提高其肿瘤透性。某些突变体在截短之外还进行了修饰，例如修饰羧基末端残基或消除由弗林蛋白酶切割残基279和280的需要，从而增加其细胞毒性。利用PE突变形式的免疫毒素已经在人类临床试验中展示出相当大的治疗希望。

然而，利用基于PE的免疫毒素治疗实体瘤特别受限，这是因为在首次给药后会产生针对免疫毒素的中和抗体。对于大多数方案，在需要第二次免疫毒素给药之前就会产生这些抗体，并因此使进一步使用免疫毒素对之前暴露过的患者中的实体瘤没有效果。

本发明所基于的研究证实，患者对基于PE的免疫毒素的主要免疫应答是对于免疫毒素的PE部分的免疫应答。这种理解表明，降低用于免疫毒素的PE分子的抗原性会降低免疫毒素的总体抗原性并增加其效力。本发明所基于的研究还证实，PE具有7个主要表位，其可被再分为总共13个亚表位。

令人意想不到的是，我们发现，对于PE的13个亚表位中的10个，可以通过突变PE的单个氨基酸残基来降低或消除表位或亚表位的抗原性。当然，由于PE含有多个抗原表位，所以单个突变无法消除整个PE分子的抗原性。然而，本发明的每个个体突变都能降低个体表位或亚表位的抗原性。因此，所述个体突变能降低总体PE分子和用突变的PE制备的任何免疫毒素的抗原性。

本发明所基于的研究还证实，可将不同的突变组合来降低分子的总体抗原性，同时保留PE分子的细胞毒性。在制备的PE分子中，突变了不同表位或亚表位的8个氨基酸残基，包括残基D406和Q592。用具有突变的PE制备免疫毒素，并测定它们的细胞毒性。为了便于比较，在用PE制备的每个免疫毒素中都使用相同的靶向部分(高亲和力的抗CD22抗体)。此外，为了便于比较，PE的PE38形式被用作进行了取代的PE。根据在过去的15年中我们对于很多基于PE的免疫毒素的经验，即，PE的所有细胞毒性形式共享相同的对靶细胞的细胞毒性机制(延长因子2的ADP核糖化)以及所用的PE其它变体仅为具有特定截短的相同氨基酸序列(或者，对于PE4E，是结构域Ia中的4处突变，而不是截短)，用PE38获得的结果预期能直接应用于PE的其它形式(例如，分别称为PE25、PE40、PE38、PE37、PE35、PE4E、PE38QQR以及PE38KDEL的示例性形式)。

预期的是，作为免疫毒素，当用已经制备的突变的PE以及根据本发明的教导进行修饰的其它突变的PE制备免疫毒素时，会在体内引起较小的免疫应答，并且还预期的是，较低的中和抗体滴度会反映出这种减小的免疫应答。中和抗体的产生在免疫毒素的临床前测试和免疫毒素临床试验过程中常规进行测定，并且可以通过这些标准测定来测量利用本发明的PE制备的免疫毒素所诱导的抗体滴度。

本领域技术人员应当理解，本发明的PE将与之前已知的已用于制备免疫毒素并在临床试验中测试的突变的PE一样有用。然而，应当注意到，利用本发明的PE制备的免疫毒素预期表现出的抗原性低于利用目前已有的PE分子制备的免疫毒素，并且因此预期在患者中引起的免疫应答小于目前已有的基于PE的免疫毒素。

可以将本发明的突变方便地引入已进行过修饰的PE(例如，分别称为PE25、PE40、PE38、PE37、PE35、PE4E、PE38QQR以及PE38KDEL的示例性形式)，从而降低其抗原性以及降低患者对含有它们的免疫毒素的免疫原性应答。因此，本发明提供增加基于PE的免疫偶联物(例如，目前处于临床试验中的多种基于PE的免疫毒素)的治疗功效的重要的新手段。

应当注意到，本发明的改进的PE在PE分子的具体位置处包含分子突变。根据惯例，在本领域中，PE及其变体中的位置是参考天然PE分子的613个氨基酸序列(SEQ ID NO：1)中的对应位置进行编号。本文遵照该惯例，从而允许迅速在PE变体之间进行比较并且便于理解本发明的PE中突变了哪些残基。例如，在大部分临床上有用的PE形式中，分子的结构域Ia(氨基酸1-252)是缺失的，从而降低非特异性结合，这在下文中会更详细地讨论。结构域Ia缺失的PE仅具有361个残基。尽管如此，本文中涉及的D406是指存在于天然PE序列的第406位的天冬氨酸，无论从该残基所在的特定PE的氨基末端计数时，该残基的编号是什么；同时，R590是指存在于天然PE的第590位的赖氨酸，以此类推。天然PE的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)是本领域公知的，并且描述于，例如，美国专利第5,602,095号中。

如下文所示，在优选实施方案中，在本发明的组合物和方法中，天然PE序列中在本文所指出的位置处存在的氨基酸残基被取代为选自丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸的氨基酸。丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸特别优选作为取代残基，其中丙氨酸和丝氨酸是特别优选的。

为了发挥作用，残基取代后的PE必须保留细胞毒性活性。为了测试进过改变来降低抗原性的PE对细胞毒性的保留，制备了多种示例性免疫毒素。在第一系列研究中，制备了19种免疫毒素。为了允许进行比较，这些免疫毒素中的每一种都使用相同的靶向部分并且以称为PE38的相同的PE截短形式作为起点。在19种免疫毒素的每一种中，PE38中的不同残基被替换为鉴定为能降低具体PE表位或亚表位的抗原性的突变。然后，将这19种突变的PE38的细胞毒性活性与用相同靶向部分和未改变的PE38制备的免疫毒素(为了简便将其称为“野生型”免疫毒素)进行比较。具有降低的抗原性的PE变体描述于，例如，PCT申请第PCT/US06/28986号(公开号为WO 2007/016150)中。

本发明所基于的研究揭示出哪些氨基酸的取代能将所指定的多于两种单克隆抗体(“MAb”)与同一表位的结合降低至少5倍，更优选至少10倍以及最优选至少20倍。预期的是，MAb与表位结合的降低与该表位的抗原性丢失相关，并因此与含有该突变的PE分子的抗原性丢失相关。

在WO 2007/016150中，发现能将MAb与相同表位的结合降低至少5倍的突变是E282、E285、P290、R313、N314、P319、D324、E327、E331、Q332、D403、R412、R427、E431、R432、R458、D461、R467、R490、R505、R513、E522、R538、E548、R551、R576、K590以及L597。发现能将MAb与相同表位的结合降低至少10倍的PE突变位置为E282、E285、P290、R313、N314、D324、E327、E331、Q332、D403、R412、E431、R427、R432、R458、D461、R467、R490、R505、R513、E522、R538、E548、R576以及R590。发现能将MAb与相同表位的结合降低至少20倍的PE突变位置为N314、D324、E327、E331、Q332、D403、R432、R467、R490、R505、R513、R538、R551、K590以及L597。

在本发明人的实验室之前进行的研究中(报道于PCT申请PCT/US2004/039617(国际公布号WO 2005/052006))，我们发现，将PE残基R490突变为丙氨酸能使所获得的PE分子作为免疫毒素的毒素部分时的细胞毒性翻倍。令人意想不到的是，本发明所基于的研究表明，PE第490位的精氨酸的突变也能消除与PE表位5的抗体结合。因此，将PE第490位的精氨酸取代为上文讨论的残基之一预期能降低PE分子的抗原性。还预期的是，将PE第490位的精氨酸的取代与能降低与PE的除表位5之外的表位或亚表位之一的结合的一个或多个残基取代进行组合会进一步降低分子的抗原性和针对用所得PE制备的免疫毒素的PE部分的抗体的产生。还注意到，未发现能降低与亚表位2a的结合的突变。

WO 2005/052006还证实，可以将PE第490位的精氨酸突变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。增加的细胞毒性活性和降低的免疫原性是单独的现象。因此，并非所有预期能导致细胞毒性活性增加的突变也预期能导致免疫原性降低。既能增加细胞毒性活性又能降低免疫原性的突变(例如R490突变为甘氨酸或更优选突变为丙氨酸)是特别理想的。

令人意想不到的是，我们发现，可以将某些其它残基，即D406和Q592，进行突变，并也可以产生能用于制备具有高的细胞毒性和降低的抗原性的免疫毒素的PE。

本领域技术人员应当明白，多种类型的分子可作为将含有本发明的突变的PE靶向于本领域技术人员希望杀伤或抑制的细胞的基础。从上文讨论中可明显看出，抗体是一种特别优选的靶向剂类型。

在另一优选实施方案中，嵌合分子的靶向部分(portion)或部分(moiety)是细胞因子，其可用于使毒素靶向于过表达该细胞因子受体的细胞。例如，已知IL-13受体在某些癌症(例如神经胶质瘤)的细胞外部大量过表达，并且已知IL-13受体能作为某些癌症(例如肾细胞癌、卡波济氏肉瘤以及霍奇金病)上的自分泌生长因子。参见，例如，WO 01/34645、WO 03/039600和美国专利第6,518,061号。IL-13或IL-13的不同突变体以及环状排列形式可用于使细胞毒素(例如含有一个或多个本发明突变的PE分子)靶向于表达IL-13受体的细胞。此外，包括环状排列形式在内的不同IL-13形式可用于使具有突变的PE分子靶向于肺中表达IL-13受体的细胞，从而降低或消除疾病状态(例如哮喘和过敏性鼻炎)的症状，以及靶向于体内其它位置的细胞，从而降低或消除特应性皮炎和血吸虫病中肝纤维化的症状，正如国际公布WO 01/34645中所讨论的。

除细胞因子之外，很多其它配体是本领域已知的并可用于使本发明的PE分子靶向于靶细胞。例如，转铁蛋白已被用作使毒素靶向于表达转铁蛋白受体的细胞的手段。相似地，可以靶向于疾病或疾病状态中所涉及的细胞，只要在与疾病或疾病状态相关的细胞中存在特异性表达或优先表达的细胞表面抗原，例如HIV感染的细胞中的gp120，参与移植物抗宿主病的T细胞上的CD25或在癌症细胞上表达的各种表面分子，例如CEA、CD30或CD33。

2.具有降低的抗原性的改进的PE分子

天然假单胞菌外毒素A(“PE”)是由铜绿假单胞菌分泌的活性极高的单体蛋白(分子量66kD)，其能抑制真核细胞中的蛋白合成。天然PE序列如美国专利第5,602,095号中的SEQ ID NO：1所示，通过引用将该专利并入本文。其作用机制是延长因子2(EF-2)的ADP核糖化失活。该外毒素含有3个共同作用导致细胞毒性的结构域。结构域Ia(氨基酸1-252)介导细胞结合。结构域II(氨基酸253-364)负责转移至细胞溶质中，结构域III(氨基酸400-613)介导延长因子2的ADP核糖化。结构域Ib(氨基酸365-399)的功能仍不明确，但是结构域Ib中的一大部分(即氨基酸365-380)可以缺失而不会丧失细胞毒性。参见Siegall，et al.，J Biol Chem264：14256-61(1989)。

本文所用的术语“假单胞菌外毒素”和“PE”通常是指已从天然蛋白经过修饰从而降低或消除非特异性毒性的PE。很多这样的修饰是本领域已知的，并且包括，但不限于，去除结构域Ia、结构域Ib、II和III中的不同氨基酸缺失，单氨基酸取代以及羧基末端处添加一个或多个序列，例如KDEL(SEQ ID NO：17)和REDL(SEQ ID NO：18)。参见，Siegall，et al.，J.Biol.Chem.264：14256-14261(1989)。PE的细胞毒性片段包括需要或不需要靶细胞中的后续蛋白水解或其它加工而具有细胞毒性的片段(例如，作为蛋白或蛋白前体)。PE的细胞毒性片段包括PE40、PE38及其变体PE38QQR和PE38KDEL(其中在PE38的C末端添加了序列KDEL(SEQ ID NO：17))以及PE35，正如下文所述。在优选实施方案中，PE的细胞毒性片段保留天然PE的至少约20％、优选至少约40％、更优选约50％、更优选75％、更优选至少约90％以及更优选95％的细胞毒性。在特别优选的实施方案中，细胞毒性片段至少具有天然PE的细胞毒性，以及优选具有更高的细胞毒性。

在优选实施方案中，已对PE进行修饰来降低或消除非特异性细胞结合，通常是通过将结构域Ia缺失，正如美国专利4,892,827中的教导，但是也可以例如通过突变结构域Ia的某些残基来实现这点。例如，美国专利5,512,658公开了表现出大大减弱的非特异性细胞毒性的突变的PE，其中结构域Ia是存在的，但结构域Ia中第57位、第246位、第247位以及第249位的碱性残基被取代为酸性残基(谷氨酸或“E”))。这种PE突变形式有时被称为“PE4E”。

PE40是本领域之前已有描述的PE的截短衍生物。参见，Pai，et al.，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 88：3358-62(1991)；和Kondo，et al.，Biol.Chem.263：9470-9475(1988)。PE35是PE的35kD的羧基末端片段，其中氨基酸残基1-279是缺失的，并且分子的起始为第280位的met，然后是天然PE的氨基酸281-364和381-613。PE35和PE40公开于，例如，美国专利5,602,095和4,892,827。另一衍生物是PE25，其含有来自结构域II的11个残基的片段和全部的结构域III。在一些实施方案中，PE的衍生物仅含有结构域III。

在一些优选的实施方案中，利用细胞毒性片段PE38。PE38含有PE的迁移和ADP核糖化结构域，但不含有细胞结合部分(Hwang，J.et al.，Cell，48：129-136(1987))。PE38是截短的PE前体蛋白，其由氨基酸253-364和381-613组成，PE38通过细胞内的加工而被活化为细胞毒性形式(参见例如，美国专利第5,608,039号以及Pastan et al.，Biochim.Biophys.Acta 1333：C1-C6(1997))。因此，PE38的序列是本领域已知的，技术人员也可以通过从已知的PE序列减去所述残基来确定PE38的序列。本领域技术人员应当明白，由于遗传密码的简并性，PE38、其变体(例如PE38KDEL)以及本文讨论的其它PE衍生物的氨基酸序列可以由多种核酸序列编码，可以将所述多种核酸序列中的任意一种进行表达来得到所需的多肽。

如上文所述，可以将部分或全部的结构域Ib缺失，并将剩余部分通过连接物或直接通过肽键连接起来。可以将结构域II的氨基部分的一部分缺失。并且，C末端可以含有天然序列的残基609-613(REDLK；SEQ IDNO：19)，或可以含有发现能保持构建体转移至细胞溶质中的能力的变异，例如KDEL(SEQ ID NO：17)或REDL(SEQ ID NO：18)以及这些序列的重复。参见，例如，美国专利5,854,044、5,821,238和5,602,095以及WO99/51643。虽然在优选实施方案中，PE是PE4E、PE40或PE38，但是在本发明的免疫毒素中可以使用非特异性细胞毒性被消除或降低至对非靶标细胞不会产生显著毒性的水平的任何PE形式，只要其仍能在靶细胞中进行迁移和EF-2核糖化。

在优选实施方案中，将PE分子进行修饰，使通常存在于结构域III中D406和Q592位置的氨基酸残基被取代为丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或谷氨酰胺。D406和Q592位置处的取代可以与结构域III中R432、R467、R490、R513、E548和K590位置处的丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或谷氨酰胺取代组合。在一些实施方案中，此外，至少一个选自D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597位置处的氨基酸残基被取代为丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸或谷氨酰胺。结构域III中的氨基酸残基位置D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592的取代优选与全部结构域Ia(例如，残基1-252)的去除和大部分结构域II(例如残基251-273和285-394)的去除组合。在一些实施方案中，PE具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在一些实施方案中，PE具有SEQID NO：3的氨基酸序列。

A.保守型修饰的PE变体

应当理解，天然PE和上文讨论的变体的序列可以具有保守型取代并保留细胞毒性能力，以及理想地，具有低于天然PE序列的抗原性。在优选实施方案中，PE的修饰的变体或其细胞毒性片段与目的PE(例如PE38)在氨基酸水平上具有至少80％序列相似性、优选至少85％序列相似性、更优选至少90％序列相似性以及最优选至少95％序列相似性。

术语“保守型修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于具体核酸序列，保守型修饰的变体是指编码相同的或本质上相同的氨基酸序列的核酸序列，或如果核酸不编码氨基酸序列，保守型修饰的变体是指本质上相同的核酸序列。由于遗传密码的简并性，多种功能相同的核酸能编码任意给定的多肽。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸。因此，在每个由密码子指定为丙氨酸的位置，可以将密码子改变为任意所述对应的密码子，而不会改变所编码的多肽。此类核酸变异为“沉默变异”，其是保守型修饰变异中的一类。本文中的每个编码多肽的核酸序列也描述了所述核酸的每种可能的沉默变异。本领域技术人员应当认识到，可以改动核酸中的每个密码子(除了AUG之外，AUG通常是蛋氨酸的唯一密码子)而得到功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异隐含在每个所述序列中。

对于氨基酸序列，本领域技术人员应当认识到，如果对核酸、肽、多肽或蛋白序列的个体取代、缺失或添加改变、添加或缺失了所编码的序列中的单个氨基酸或少部分的氨基酸，导致一个氨基酸被化学上相似的另一个氨基酸所取代，则这种改变为“保守型修饰的变体”。

B.PE的细胞毒性或抗原性的测定

可以通过本领域技术人员公知的测定来检测本发明所用的假单胞菌外毒素是否有所需的细胞毒性水平。因此，可以容易地测定PE的细胞毒性片段和所述片段的保守型修饰的变体的细胞毒性。可以通过本领域公知的方法同时测定多种候选PE分子的细胞毒性。例如，可以测定候选分子亚组的细胞毒性。阳性反应的候选分子亚组可以被继续细分，并重新测定，直至鉴定出所需的细胞毒性片段。该方法允许快速筛选大量的PE细胞毒性片段或保守型变体。可以通过本领域已知的任何方法测定抗原性，包括WO 2007/016150中所教导的测定。

例如，与未取代的PE(例如PE38)相比，优选的PE变体表现出等同的或更强的细胞毒性。虽然较强的细胞毒性通常比较弱的细胞毒性更优选，但是在实践中，这些PE突变形式的降低的细胞毒性预期至少在一定程度上能被PE和用其制备的免疫毒素的降低的抗原性所弥补。因此，即使这些PE具有降低的细胞毒性，它们也是有用的。此外，与当制成免疫毒素时能表现出增加的细胞毒性的PE突变相结合时，PE的细胞毒性可以更接近于野生型PE的细胞毒性。此外，由于PE是非常强的细胞毒素，所以即使PE的突变形式具有的毒性明显低于天然毒素，其作为毒性部分时仍保留相当强的效力。

3.嵌合分子

本发明的免疫偶联物包括但不限于，PE分子与抗体或其它靶向剂为共价连接的分子。具体靶向剂的选择取决于所要靶向的具体细胞。在拥有本文提供的PE分子的情况下，本领域技术人员能容易地构建多种含有功能等同核酸的克隆，例如序列不同但编码相同PE和抗体序列的核酸。因此，本发明提供编码抗体和PE偶联物的核酸及其融合蛋白的核酸。

a.免疫偶联物的制备

i.非重组方法

在本发明的非重组实施方案中，利用本领域技术人员任何已知的手段，将靶向分子(例如抗体)与本发明的PE分子连接。共价和非共价连接手段都可以用于本发明的PE分子。

连接PE分子与抗体或其它靶向分子(“TM”)的步骤会根据TM的化学结构而不同。多肽通常含有多个官能团，例如，羧酸(COOH)、自由胺基(-NH2)或巯基(-SH)，这些官能团都可用于与抗体上的合适的官能团进行反应，例如，从而实现PE分子的结合。

或者，将抗体或其它TM衍生化，从而暴露或连接其它反应性官能团。衍生化可以包括连接多种连接分子中的任意一种，例如可购自PierceChemical Company，Rockford Illinois的连接分子。

本文所用的“连接物”是用于连接TM与PE分子的分子。连接物能与抗体和效应分子都形成共价键。合适的连接物是本领域技术人员公知的，并且包括，但不限于，直链或支链碳连接物、杂环碳连接物或肽连接物。当抗体和效应分子是多肽时，连接物可以通过组成型氨基酸的侧基与组成型氨基酸连接(例如，通过与半胱氨酸的二硫键)。然而，在优选实施方案中，连接物与末端氨基酸的α碳氨基和羧基连接。

在某些情况下，希望当免疫偶联物到达其靶点时，PE分子能够与TM分离。因此，在这些情况下，免疫偶联物会包含能够在靶点的附近断裂的连接。免疫偶联物在靶细胞内部或靶点的附近所遇到的酶促活性或条件可以促进连接物的断裂，从而将PE分子从TM释放出来。当靶点是肿瘤时，可以使用在肿瘤部位存在的条件下(例如当暴露于肿瘤相关的酶或酸性pH时)能断裂的连接物。

ii.重组方法

可以通过任何合适的方法制备本发明的核酸序列，包括，例如合适的序列的克隆或直接化学合成，例如以下的方法：Narang，et al.，Meth.Enzymol 68：90-99(1979)的磷酸三酯法；Brown，et al.，Meth.Enzymol.68：109-151(1979)的磷酸二酯法；Beaucage，et al.，Tetra.Lett.22：1859-1862(1981)的二乙基亚磷酰胺法；Beaucage & Caruthers，Tetra.Letts.22(20)：1859-1862(1981)所描述的固相亚磷酰胺三酯法，例如，利用Needham-VanDevanter，et al.，Nucl.Acids Res.12：6159-6168(1984)中所述的自动化合成仪；以及美国专利第号4,458,066的固相载体法。化学合成产生单链寡核苷酸。可以通过与互补序列的杂交或通过利用DNA聚合酶并使用单链作为模板的聚合而将单链转变为双链DNA。本领域技术人员应当认识到，尽管DNA的化学合成限于约100个碱基的序列，但是可以通过将较短的序列连接起来而获得较长的序列。

在优选实施方案中，通过克隆技术制备本发明的核酸序列。合适的克隆和测序技术的实例以及能指导本领域技术人员完成多种克隆实践的说明可见于Sambrook，et al，MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL(分子克隆：实验手册)(第二版)，Vols.1-3，Cold Spring HarborLaboratory(1989))，Berger and Kimmel(eds.)，GUIDE TO MOLECULARCLONING TECHNIQUES(分子克隆技术指南)，Academic Press，Inc.，SanDiego CA(1987))，或Ausubel，et al.(eds.)，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY(现代分子生物学技术)，Greene Publishing andWiley-Interscience，NY(1987)。从生物试剂和实验设备的制造商获得的产品信息也能提供有用的信息。所述制造商包括SIGMA chemical company(Saint Louis，MO)，R&D systems(Minneapolis，MN)，Pharmacia LKBBiotechnology(Piscataway，NJ)，CLONTECH Laboratories，Inc.(Palo Alto，CA)，Chem Genes Corp.，Aldrich Chemical Company(Milwaukee，WI)，GlenResearch，Inc.，GIBCO BRL Life Technologies，Inc.(Gaithersberg，MD)，Fluka Chemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)，Invitrogen，San Diego，CA，and Applied Biosystems(FosterCity，CA)，以及本领域技术人员已知的很多其它商业来源。

也可以修饰编码天然PE的核酸来形成本发明的免疫偶联物。利用定点诱变的修饰是本领域公知的。可以通过体外方法扩增编码PE的核酸。扩增方法包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、自给式序列复制系统(3SR)。多种克隆方法、宿主细胞以及体外扩增方法是本领域技术人员公知的。

在优选实施方案中，通过将编码选定抗体或其它TM的cDNA插入包含编码本发明的所需PE的cDNA的载体中来制备免疫偶联物。所进行的插入使得靶向剂(为了便于讨论，本文中的讨论假设靶向剂是Fv，但也可以替换为其它具有相同效果的靶向剂)和PE是框内读码，即形成含有功能性Fv区和功能性PE区的一条连续多肽。在特别优选的实施方案中，编码本发明的PE的cDNA与scFv连接，使得毒素位于scFv的羧基末端。在其它优选的实施方案中，编码本发明的PE的cDNA与scFv连接，使得毒素位于scFv的氨基末端。

当编码本发明的PE、抗体或免疫偶联物的核酸被分离和克隆后，技术人员可以在重组工程化细胞中表达所需蛋白，所述细胞例如细菌、植物、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。预期的是，本领域技术人员能够了解多种可用于表达蛋白的表达系统，包括大肠杆菌、其它细菌宿主、酵母以及各种高等真核生物细胞，例如COS、CHO、HeLa和骨髓瘤细胞系。对于已知能用于在原核细胞或真核细胞中表达蛋白的各种方法将不再详细描述。简而言之，通常，通过将DNA或cDNA与启动子(可以是组成型或诱导型)可操作地连接然后合并入表达盒，能实现编码本发明的分离的蛋白的天然核酸或合成核酸的表达。盒可以适于在原核细胞或真核细胞中复制和整合。典型的表达盒含有转录和翻译终止子、起始序列以及可用于调节编码蛋白的DNA的表达的启动子。为了获得克隆基因的高水平表达，构建至少含有用于指导转录的强启动子、用于翻译起始的核糖体结合位点以及转录/翻译终止子的表达盒是可取的。对于大肠杆菌，表达盒包括启动子(例如T7、trp、lac或λ启动子)、核糖体结合位点并优选包括转录终止信号。对于真核细胞，控制序列可以包括启动子并优选包括来源于免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒的增强子以及聚腺苷酸化序列，以及可以包括剪接供体和受体序列。可以通过公知方法将本发明的盒转移到选定的宿主细胞中，例如对于大肠杆菌可使用氯化钙转化或电穿孔，对于哺乳动物细胞可使用磷酸钙处理、电穿孔或脂质体转染。可以通过盒中所含基因(例如amp、gpt、neo和hyg基因)赋予的抗生素抗性来选择被盒转化的细胞。

本领域技术人员应当认识到，可以对编码本发明多肽(即，PE或用本发明的PE制备的免疫偶联物)的核酸进行修饰，而不会降低其生物活性。可以进行某些修饰来便于靶向分子克隆、表达或并入融合蛋白。这些修饰是本领域技术人员公知的，并且包括，例如，终止密码子、添加于氨基末端用来提供起始位点的蛋氨酸、置于任一末端用来产生便于定位的限制性位点的其它氨基酸或有助于纯化步骤的其它氨基酸(例如聚组氨酸)。

除重组方法之外，还可以利用标准肽合成法来构建全部的或部分的本发明免疫偶联物和PE。可以通过以下过程实现长度少于约50个氨基酸的本发明多肽的固相合成：将序列的C末端氨基酸连接于不溶性载体，然后依次添加序列中剩余氨基酸。固相合成技术描述于Barany &Merrifield，THE PEPTIDES：ANALYSIS，SYNTHESIS，BIOLOGY.VOL.2：SPECIAL METHODS IN PEPTIDE SYNTHESIS，PART A.pp.3-284；Merrifield，et al.J.Am.Chem.Soc.85：2149-2156(1963)，和Stewart，et al，SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS，第二版，Pierce Chem.Co.，Rockford，III.(1984)。可以通过较短片段的氨基和羧基末端的缩合来合成较长长度的蛋白。通过活化羧基末端(例如，通过利用偶联剂N，N′-二环己基碳二亚胺)来形成肽键的方法是本领域技术人员已知的。

iii.纯化

表达后，可以按照本领域的标准方法纯化本发明的重组免疫偶联物和PE，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析等(通常可参见，R.Scopes，PROTEIN PURIFICATION，Springer-Verlag，N.Y.(1982))。具有至少约90-95％同质性的基本上纯的组合物是优选的，并且对于制药用途，98-99％或更高的同质性是最优选的。当部分纯化或纯化至所需同质性后，如果要用于治疗，多肽应当基本上不含内毒素。

从诸如大肠杆菌的细菌表达单链抗体和/或再折叠为合适的活性形式(包括单链抗体)的方法已有描述并且是公知的，并且可用于本发明的抗体。参见，Buchner，et al.，Anal.Biochem.205：263-270(1992)；Pluckthun，Biotechnology 9：545(1991)；Huse，et al.，Science 246：1275(1989)和Ward，et al.，Nature 341：544(1989)，通过引用将它们全部并入本文。

通常，将来自大肠杆菌或其它细菌的功能性异源蛋白从包含体分离，并需要利用强的变性剂进行增溶，以及需要后续的再折叠。在增溶步骤中，正如本领域所公知的，必须存在还原剂来分开二硫键。示例性的还原剂缓冲液是：0.1M Tris pH8、6M胍、2mM EDTA、0.3M DTE(二硫赤藓糖醇)。二硫键的再氧化可以在还原和氧化形式的低分子量硫醇试剂的存在下发生，其描述于Saxena，et al.，Biochemistry 9：5015-5021(1970)(通过引用并入本文)，并且特别描述于Buchner，et al.，同上。

通常通过将变性和还原的蛋白稀释到(例如，100倍)再折叠缓冲液中实现复性。示例性的缓冲液是0.1M Tris pH8.0、0.5M L-精氨酸、8mM氧化型谷胱甘肽以及2mM EDTA。

作为双链抗体纯化过程的改动，分别溶解和还原重链和轻链区，然后在再折叠溶液中组合。按照下述摩尔比混合所述两种蛋白可获得优选的产率：一种蛋白超过另一种蛋白不大于5倍摩尔数。氧化还原往返完成后，向再折叠溶液中添加过量的氧化型谷胱甘肽或其它氧化低分子量化合物是可取的。

b.靶向部分

i.靶细胞表面标志物

嵌合分子的靶向组分可以针对细胞表面标志物。细胞表面标志物可以是蛋白或糖类。细胞表面抗原可以是肿瘤相关抗原。优选地，细胞表面标志物是在癌症细胞或其它异常增殖细胞上专有表达、优先表达或以较高的临床相关水平表达。作为嵌合分子靶标的细胞表面抗原是本领域公知的，并且总结于，例如Mufson，Front Biosci(2006)11：337-43；Frankel，Clin Cancer Res(2000)6：326-334和Kreitman，AAPS Journal(2006)8(3)：E532-E551。

示例性细胞表面标志物靶标包括细胞表面受体。可利用本发明的毒素靶向的细胞表面受体包括，但不限于，转铁蛋白受体、EGF受体、CD19、CD22、CD25、CD21、CD79、间皮蛋白和钙粘蛋白。可进行靶向免疫毒素治疗的其它细胞表面抗原包括，但不限于，MUC1、MAGE、PRAME、CEA、PSA、PSMA、GM-CSFR、CD56、HER2/neu、erbB-2、CD5、CD7。其它细胞表面肿瘤相关抗原是已知的，并且可用作靶标。

在多种不同类型的癌症细胞上可见的抗原靶标，包括，但不限于，成神经细胞瘤、肠癌、直肠癌、结肠癌、家族性腺瘤性息肉病癌、遗传性非息肉性结直肠癌、食道癌、唇癌、喉癌、下咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡癌、甲状腺未分化癌、肾癌、肾实质癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、脑瘤、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、成神经管细胞瘤、外周神经外胚层肿瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性淋巴性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、成体T细胞白血病淋巴瘤、肝细胞癌、胆囊癌、支气管癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、多发性骨髓瘤、基底细胞癌、畸胎瘤、成视网膜细胞瘤、脉络膜黑色素瘤、精原细胞瘤、横纹肌肉瘤、颅咽管瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、尤文肉瘤以及浆细胞瘤。

在一些实施方案中，细胞表面标志物是间皮蛋白。可以通过靶向间皮蛋白来降低或抑制生长、扩散和/或进展的示例性癌症包括卵巢癌、间皮瘤、非小细胞肺癌、肺腺癌、输卵管癌、头颈癌、宫颈癌和胰腺癌。

在一些实施方案中，细胞表面标志物是CD22。可以通过靶向CD22来降低或抑制生长、扩散和/或进展的示例性癌症包括毛细胞白血病、慢性淋巴性白血病(CLL)、前淋巴细胞白血病(PLL)、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)和急性淋巴性白血病(ALL)。

在一些实施方案中，细胞表面标志物是CD25。可以通过靶向CD25来降低或抑制生长、扩散和/或进展的示例性癌症包括白血病和淋巴瘤、包括毛细胞白血病以及霍奇金淋巴瘤。

在一些实施方案中，细胞表面标志物是糖类，例如Lewis Y抗原。可以通过靶向Lewis Y抗原来降低或抑制生长、扩散和/或进展的示例性癌症包括膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、肺癌和胰腺癌。

在一些实施方案中，细胞表面标志物是CD33。可以通过靶向CD33来降低或抑制生长、扩散和/或进展的示例性癌症包括急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CML)以及骨髓增生性疾病。

ii.抗体靶向部分

在优选实施方案中，靶向部分是抗体，优选特异性地结合细胞上的表面标志物的抗体。因此，在一些实施方案中，嵌合分子是免疫毒素。

在另一优选实施方案中，靶向部分是抗体片段，优选特异性地结合细胞上的表面标志物的抗体片段。优选抗体片段是单链Fv。在本文中，描述了基于细胞毒素的免疫毒素的构建和表征，其中细胞毒素与scFv融合。毒素或细胞毒性片段可以融合的其它优选抗体片段包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、螺旋稳定抗体、双链抗体、二硫键稳定抗体以及单结构域抗体(例如，骆驼抗体)。

细胞毒素与抗体或抗体片段的融合可以是与抗体或抗体片段的N末端或C末端的融合。通常利用重组DNA技术完成所述融合。

可用于免疫毒素的多种抗体是本领域已知的，并且可用于本发明的组合物和方法。针对肿瘤抗原的示例性抗体包括，但不限于，针对转铁蛋白受体的抗体(例如，HB21及其变体)、针对CD22的抗体(例如，RFB4及其变体)、针对CD25的抗体(例如，抗Tac及其变体)、针对间皮蛋白的抗体(例如，SS1、SSP1、HN1、HN2、MN及它们的变体)和针对Lewis Y抗原的抗体(例如，B3及其变体)。

可包含在免疫毒素中以及可用于本发明的抗体描述于，例如，美国专利第5,242,824号(抗转铁蛋白受体)、第5,846,535号(抗CD25)、第5,889,157号(抗Lewis Y)、第5,981,726号(抗Lewis Y)、第5,990,296号(抗Lewis Y)、第7,081,518号(抗间皮蛋白)、第7,355,012号(抗CD22和抗CD25)、第7,368,110号(抗间皮蛋白)、第7,470,775号(抗CD30)、第7,521,054号(抗CD25)、第7,541,034号(抗CD22)、美国专利公布第2007/0189962号(抗CD22)，并且总结于，例如Frankel，Clin Cancer Res(2000)6：326-334和Kreitman，AAPS Journal(2006)8(3)：E532-E551。

可成功用于对抗癌症和急性移植物抗宿主病的多种免疫毒素也是本领域已知的，并且可用于本发明的组合物和方法，即，通过将细胞毒素替换为本发明的改进的PE。示例性的免疫毒素可见于，例如，www.clinicaltrials.gov，并且包括，但不限于，LMB-2(抗Tac(Fv)-PE38)、BL22和HA22(RFB4(dsFv)-PE38)、SS1P(SS1(dsFv)-PE38)、HB21-PE40。可用的其它免疫毒素描述于上文列出的专利和本文中，并且总结于，例如，Frankel，Clin Cancer Res(2000)6：326-334和Kreitman，AAPS Journal(2006)8(3)：E532-E551。

在一些实施方案中，抗体是HA22的Fv部分。HA22是最近开发的改进形式的BL22。在HA22中，抗体可变区重链(“VH”)的CDR3中的残基SSY被突变为THW。与其母体抗体RFB4相比，HA22对不同CD22阳性细胞系的细胞毒性活性增加5-10倍，并且对来自CLL和HCL患者的细胞的细胞毒性强于其母体抗体RFB4高达50倍(Salvatore，G.，et al.，Clin Cancer Res，8(4)：995-1002(2002)；也可以参见共有申请PCT/US02/30316(国际公布WO 03/027135)。

SS1P已被证实能特异性地杀伤表达间皮蛋白的细胞系，并且能使小鼠中表达间皮蛋白的肿瘤消退(Hassan，R.et al.，Clin Cancer Res 8：3520-6(2002)；Onda.，et al.，Cancer Res 61：5070-7(2001))。基于这些研究和适度的安全性数据，2个针对SS1P的I期试验正在国家癌症研究院在表达间皮蛋白的癌症患者中进行(Chowdhury，P.S.et al.，Proc Natl Acad SciUSA 95：669-74(1998)；Hassan，R.et al.，Proc Am Soc Clin Oncol 21：29a(2002))。此外，靶向于间皮蛋白的其它治疗处于临床前开发中(Thomas，A.M.et al.，J Exp Med 200：297-306(2004))。HN1和HN2是人抗间皮蛋白抗体，其描述于，例如，Feng，et al.，Mol Cancer Ther(2009)8(5)：1113-8。

HA22-LR和SS1P-LR是HA22和SS1P免疫毒素的溶酶体抗性变体，其中去除了溶酶体蛋白酶的断裂簇。这些变体描述于，例如，Weldon，et al.，Blood，(2009)113(16)：3792-800和WO 2009/032954。

iii.非抗体靶向部分

在另一优选实施方案中，靶向部分是特异性地结合细胞表面上的受体的配体。所述配体可以是能结合细胞表面标志物的任何配体。优选配体是VEGF、Fas、TRAIL、细胞因子(例如，IL-2、IL-15、IL-4、IL-13)、淋巴因子、激素、生长因子(例如，TGFa、神经生长因子、表皮生长因子)。

4.药物组合物和给药

一方面，本发明提供药物组合物或药物，其包含至少一种本发明的嵌合蛋白，优选靶向毒素，以及任选地包含药学可接受的载体。可以将所述药物组合物或药物给予患者来治疗疾病状态，包括，但不限于，恶性疾病或癌症。

a.制剂

可通过标准技术、利用一种或多种生理学可接受的载体或赋形剂来配制可用于本发明的药物组合物或药物。合适的药物载体在本文中描述，并且描述于Remington：The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿：制药科学和实践)，第21版，University of the Sciences in Philadelphia，Lippencott Williams & Wilkins(2005)。本发明的嵌合蛋白可配制用于任何合适的途径的给药，包括吸入给药、局部给药、经鼻给药、口服给药、胃肠外给药或直肠给药。因此，可以通过下述方式给予药物组合物：利用注射器或其它装置进行皮内、皮下(subdermal)、静脉内、肌肉内、鼻内、吸入、脑内、气管内、动脉内、腹膜内、膀胱内、胸膜内、冠脉内、皮下(subcutaneously)或肿瘤内注射。也可考虑经皮给药，如吸入或气溶胶给药。片剂和胶囊可以口服给药、直肠给药或阴道给药。

用于给药的组合物通常包含溶解于药学可接受的载体、优选水性载体中的嵌合蛋白、优选靶向毒素的溶液。可以使用多种水性载体，例如，缓冲盐溶液等。这些溶液是无菌的，并通常不含不希望的物质。可以通过常规公知的灭菌技术将这些组合物灭菌。组合物可以含有接近生理条件所需的药学可接受的辅助物质，例如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中融合蛋白的浓度可以变化很大，并且可以主要基于液体量、粘性、体重等、根据选定的具体给药模式和患者需要进行选择。

本发明的靶向毒素组合物适于胃肠外给药，包括静脉内给药或体腔内给药。

本发明的嵌合蛋白、优选靶向毒素可以配制用于通过注射的胃肠外给药，例如通过弹丸注射或连续输注。可以以单位剂量形式提供注射用制剂，例如，提供在安瓿或多剂量容器中，并添加防腐剂。注射用组合物优选为水性等渗溶液或悬液，并且优选用脂肪乳剂或悬液制备的栓剂。组合物可以是经过灭菌的和/或含有佐剂，例如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲液。或者，活性成分可以是粉末形式，用于在使用前用合适的介质(例如，无菌、无热原的水)复原。此外，它们还可以含有其它有治疗价值的物质。按照分别的常规混合、制粒或包被方法制备组合物，并且含有约0.1-75％、优选约1-50％的活性成分。

可以将本发明的靶向毒素组合物的控释胃肠外制剂制为植入物、油性注射液或颗粒体系。关于蛋白递送体系的广泛总结，可参见，Banga，A.J.，THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS：FORMULATION，PROCESSING，AND DELIVERY SYSTEMS，Technomic PublishingCompany，Inc.，Lancaster，PA，(1995)，通过引用将其并入本文。颗粒体系包括微球、微粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球以及纳米颗粒。微胶囊含有治疗性蛋白作为中央核。在微球中，治疗剂分散于整个颗粒。小于约1μm的颗粒、微球以及微胶囊通常分别称为纳米颗粒，纳米球以及纳米胶囊。毛细血管的直径为约5μm，因此只有纳米颗粒能进行静脉内给药。微粒的直径通常为约100μm，并用于皮下或肌肉内给药。参见，例如，Kreuter J.，COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS，J.Kreuter，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY，pp.219-342(1994)；和Tice & Tabibi，TREATISE ON CONTROLLED DRUG DELIVERY，A.Kydonieus，ed.，Marcel Dekker，Inc.New York，NY，pp.315-339(1992)，通过引用将它们并入本文。

聚合物可用于本发明靶向毒素组合物的离子控释。各种用于受控药物递送的可降解的和不可降解的聚合基质是本领域已知的(Langer R.，Accounts Chem.Res.，26：537-542(1993))。例如，嵌段共聚物泊洛沙姆407在低温下为粘性但可流动的液体，但是在体温下形成半固体凝胶。已经证实其可作为重组白介素-2和脲酶的配制和持续递送的有效介质(Johnston et al.，Pharm.Res.，9：425-434(1992)；和Pec et al.，J.Parent.Sci.Tech.，44(2)：58-65(1990))。或者，羟磷灰石已被用作蛋白控释的微载体(Ijntema et al.，Iht.J.Pharm.，112：215-224(1994))。另一方面，脂质体用于脂质封装药物的控释和药物靶向(Betageri et al.，LIPOSOME DRUGDELIVERY SYSTEMS，Technomic Publishing Co.，Inc.，Lancaster，PA(1993))。用于治疗性蛋白的受控递送的多种其它体系是已知的。参见，例如，美国专利第5,055,303号、第5,188,837号、第4,235,871号、第4,501,728号、第4,837,028号、第4,957,735号、第5,019,369号、第5,055,303号、第5,514,670号、第5,413,797号、第5,268,164号、第5,004,697号、第4,902,505号、第5,506,206号、第5,271,961号、第5,254,342号、第5,534,496号，通过引用将每篇专利文献并入本文。

适于经皮施用的制剂包括有效量的本发明组合物以及载体。优选的载体包括可吸收的药理学可接受的溶剂，以辅助透过宿主皮肤。例如，经皮装置为绷带的形式，其包括背衬元件、容纳组合物并任选地容纳载体的贮器、任选地用于将组合物以受控的和预定的速率在长的时间段递送至宿主皮肤的速率控制屏障、以及将装置固定于皮肤的结构。也可以使用基质经皮制剂。

适于局部施用于例如皮肤和眼部的制剂优选为本领域公知的水性溶液、软膏、霜或凝胶。这些制剂可以含有增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲液和防腐剂。

对于口服给药，药物组合物或药物可以采取的形式，例如，通过常规手段用药学可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊。优选为片剂和明胶胶囊，其包含活性成分(即，本发明组合物)，以及(a)稀释剂或填充剂，例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素(例如乙基纤维素、微晶纤维素)、甘氨酸、果胶、聚丙烯酸酯和/或磷酸氢钙、硫酸钙；(b)润滑剂，例如二氧化硅、滑石、硬脂酸、硬脂酸的镁盐或钙盐、金属硬脂酸盐、胶体二氧化硅、氢化植物油、玉米淀粉、苯甲酸钠、乙酸钠和/或聚乙二醇；对于片剂还可以包含(c)粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或羟丙基甲基纤维素；如果需要还可以包含(d)崩解剂，例如淀粉(例如马铃薯淀粉或淀粉钠)、乙醇酸盐、琼脂、藻酸或其钠盐、或泡腾混合物；(e)润湿剂，例如月桂基硫酸钠；和/或(f)吸收剂、着色剂、调味剂和甜味剂。

可以按照本领域已知的方法将片剂包薄膜衣或肠溶衣。用于口服给药的液体制剂可以采取的形式，例如溶液、糖浆或悬液，或可以将它们制为干燥产品，用于在使用前用水或其它合适的介质复原。可以通过常规手段用药学可接受的添加剂制备这些液体制剂，所述添加剂，例如，悬浮剂，例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪；乳化剂，例如卵磷脂或阿拉伯胶；非水性介质，例如杏仁油、油性酯、乙醇或分馏植物油；以及防腐剂，例如，对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯或山梨酸。所述制剂还可以视情况含有缓冲盐、调味剂、着色剂和/或甜味剂。如果需要，可以合适地配制用于口服给药的制剂，用来提供活性组合物的控释。

对于吸入给药，可以以气溶胶喷雾呈现形式、利用合适的推进剂从加压包或雾化器方便地递送嵌合蛋白、优选抗体和/或靶向毒素，所述推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、1，1，1，2-四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。对于加压气溶胶，可以提供阀来递送规定量从而确定剂量单位。例如，用于吸入器或吹入器的明胶胶囊和芯可以配制为含有嵌合蛋白、优选抗体和/或靶向毒素和合适的粉末基料(例如，乳糖或淀粉)的粉末混合物。

还可以将组合物配制于直肠组合物中(例如，栓剂或保留灌肠剂)，所述直肠组合物例如含有常规栓剂基料，例如，可可油或其它甘油酯。

此外，可以将组合物配制为贮存制剂。此类长效制剂可以通过植入进行给药(例如，皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射进行给药。因此，例如，组合物可以用合适的聚合材料或疏水材料(例如，作为可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制或作为微溶衍生物，例如，作为微溶性盐。

如果需要，可以将组合物提供在包装或分配装置中，所述包装或分配装置可以含有一个或多个含有活性成分的单位剂量形式。例如，所述包装可以包括金属或塑料薄膜，例如，泡罩包装。所述包装或分配装置可以配有给药说明。

b.剂量

在本发明一个实施方案中，将药物组合物或药物以治疗有效剂量给予患者，用来预防、治疗或控制疾病或恶性疾病状态，例如癌症。给予患者的药物组合物或药物的量足以在患者中引起有效的治疗或诊断反应。有效的治疗或诊断反应是至少部分地阻止或延缓疾病或恶性疾病状态的症状或并发症的反应。足够实现这一点的量被定义为“治疗有效剂量”。

所给予的嵌合蛋白、优选靶向毒素或组合物的剂量取决于温血动物(哺乳动物)的种类、体重、年龄、个体状态、待治疗的区域的表面积和给药形式。剂量的大小也由具体化合物在具体个体中的给药所伴随的任何副反应的存在、性质以及程度来决定。用于给予约50-70kg的哺乳动物的单位剂量可以含有约5-500mg的活性成分。通常，本发明化合物的剂量是足以实现所需效应的剂量。

可以从测量嵌合蛋白、优选靶向毒素在个体机体中的积累计算出最佳给药安排。通常，剂量为1ng-1000mg/公斤体重，并且可以每天、每周、每月或每年给药一次或多次。本领域技术人员能容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。根据本领域已知的制定方案和本文的公开内容，本领域技术人员能确定将嵌合蛋白、优选靶向毒素给予人类的最佳给药方案。

组合物的最佳剂量、毒性以及治疗功效可以根据个体组合物的相对效力而不同，并且可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定，例如，通过测定LD50(致50％的群体死亡的剂量)和ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果的剂量比为治疗指数，并且可以表示为LD₅₀/ED₅₀的比值。表现出大的治疗指数的组合物是优选的。虽然可以使用表现出毒性副作用的组合物，但是应当注意设计出能将这些组合物靶向于受累组织部位的递送系统，从而将对正常细胞的可能损伤最小化，并从而降低副作用。

从例如动物研究(例如啮齿动物和猴)获得的数据可用于建立用于人的剂量范围。本发明化合物的剂量优选位于包括ED₅₀同时具有很小毒性或没有毒性的循环浓度的范围内。剂量可以根据所用剂量形式和给药途径在该范围内变化。对于在本发明方法中使用的任何组合物，可以最初从细胞培养物测定估计治疗有效剂量。可以在动物模型中建立能达到包括在细胞培养物中测定的IC₅₀(能实现症状的最大抑制的50％的受试化合物浓度)的血浆循环浓度范围的剂量。这些信息可用于更准确地确定人中的可用剂量。可以例如通过高效液相色谱(HPLC)来测量血浆水平。通常，对于一般个体来说，嵌合蛋白、优选靶向毒素的剂量当量为约1ng/kg-100mg/kg。

用于静脉内给药的本发明的典型靶向毒素组合物为约0.1-10mg/患者/天。可以使用从0.1直至约100mg/患者/天的剂量。制备可给予的组合物的实际方法对于本领域技术人员是已知的或显而易见的，并且详细描述于出版物中，例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿：制药科学与实践)，第21版，University of the Sciences inPhiladelphia，Lippencott Williams & Wilkins(2005)。

本文所述的组合物的示例性剂量，包括每千克个体或样品重量为毫克或微克级别量的组合物，例如，约1微克/千克-约500毫克/千克、约100微克/千克-约5毫克/千克或约1微克/千克-约50微克/千克。还应当理解，组合物的合适剂量取决于组合物在待实现的所需效应中的功效。当需要将这些组合物中的一种或多种给予哺乳动物时，医师、兽医或研究人员可以，例如，首先开立相对低的剂量，然后增加剂量直至获得合适的反应。此外，应当理解，任何具体哺乳动物个体的具体剂量水平取决于很多因素，包括所用具体组合物的活性，个体的年龄、体重、一般健康状况、性别以及饮食，给药时间，给药途径，排泄率，任何药物联用以及待调节的表达或活性的程度。

在本发明的一个实施方案中，包含本发明嵌合蛋白、优选靶向毒素的药物组合物或药物的给药为，例如，日剂量为约1mg化合物/kg个体体重(1mg/kg)至约1g/kg。在另一实施方案中，剂量为约5mg/kg-约500mg/kg。在另一实施方案中，剂量为约10mg/kg-约250mg/kg。在另一实施方案中，剂量为约25mg/kg-约150mg/kg。优选剂量为约10mg/kg。日剂量可以每天给药一次或分成亚剂量并分多次给药，例如，每天2次、3次或4次。然而，本领域技术人员应当理解，可以以不同量和以不同次数给予本文所述的组合物。本领域技术人员还应当理解，某些因素可以影响有效治疗个体所需的剂量和时间安排，包括但不限于疾病或恶性疾病状态的严重程度、先前的治疗、个体的一般健康状况和/或年龄以及所存在的其它疾病。此外，用治疗有效量的组合物治疗个体可以包括单次治疗，或优选地，可以包括一系列治疗。

ABT-263的示例性剂量为按照需要每天剂量100-500mg。ABT-263可以给予的浓度为约25mg/mL-约50mg/mL。ABT-737的示例性剂量为每天剂量约50-200mg/kg，例如，约100mg/kg。

在成功治疗后，使个体进行保持性治疗来防止所治疗的疾病或恶性疾病状态的复发是可取的。

c.给药

可以给予本发明的组合物用于治疗性处理。在治疗性应用中，给予疾病或恶性疾病状态(例如癌症)患者的组合物的量足以治愈或至少部分地阻止疾病及其并发症。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效剂量”。该用途的有效量取决于疾病的严重程度和患者健康的一般状态。化合物的有效量是能提供症状的主观缓解或提供由医师或其它有资质的观察员观察到的客观可鉴定的改善的量。

有效量的确定是本领域技术人员容易做到的，特别是借鉴了本文提供的详细公开内容。通常，通过以下方式确定免疫偶联物的有效量(efficacious amount)或有效量(effective amount)：首先给予低剂量或少量的免疫偶联物，然后逐步增加给药剂量(dose)或剂量(dosage)，并且视需要添加第二药物或第三药物直至在所治疗的个体中观察到理想的效果，同时毒性副作用最小或没有毒性副作用。

组合物的单次或多次给药取决于所需的以及患者能耐受的剂量和频率。在任何情况下，组合物应当能提供足够量的本发明蛋白，从而有效治疗患者。优选地，一次给予剂量，但是也可以周期性施用，直至达到治疗效果或副作用警告需要中断治疗。通常，剂量能足以治疗或改善疾病的症状或指征，而不会对患者产生不可接受的毒性。

为了达到理想的治疗效果，可以以治疗有效的日剂量在多天中给予组合物。因此，为了治疗个体中本文所述的疾病或恶性疾病状态，组合物的治疗有效给药可能需要周期性给药(例如，每天)，持续3天至两周或更长。通常，至少连续3天给予组合物，通常至少5天连续给药，更通常至少10天连续给药，并且有时20、30、40或更多天连续给药。尽管连续日剂量是达到治疗有效剂量的优选途径，但是，即使化合物或组合物不是每天给药，也能实现治疗有益效果，只要给药的重复足够频繁而能在个体中保持组合物的治疗有效浓度。例如，可以隔一天、每三天给予组合物，或者如果采用更高的剂量范围并且能被个体耐受，可以每周给予组合物。

在本发明靶向毒素的各种使用中，包括可以通过融合蛋白的毒性作来消除由特定人类细胞引起的多种疾病状态。例如，目标细胞可能表达细胞表面标志物，例如间皮蛋白、CD22或CD25。

5.抑制肿瘤生长的方法

本发明组合物可以以多种方式发挥作用。例如，本发明的PE分子(例如，作为嵌合分子的一部分)可用于(i)在携带一种或多种表面标志物的细胞中诱导凋亡；(ii)抑制携带一种或多种细胞表面标志物的细胞的不希望的生长、过度增殖或存活；(iii)治疗疾病状态，例如癌症；以及(iv)为患有由存在的携带一种或多种细胞表面标志物的细胞引起的疾病的哺乳动物提供治疗。

表达一种或多种细胞表面标志物、优选细胞表面受体(例如，本文所述的)的任何细胞或肿瘤细胞可用于实施本发明的方法。表达表面标志物的优选的细胞或肿瘤细胞选自成神经细胞瘤、肠癌、直肠癌、结肠癌、家族性腺瘤性息肉病癌、遗传性非息肉性结直肠癌、食道癌、唇癌、喉癌、下咽癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡癌、甲状腺未分化癌、肾癌、肾实质癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫体癌、子宫内膜癌、绒毛膜癌、胰腺癌、前列腺癌、睾丸癌、乳腺癌、膀胱癌、黑色素瘤、脑瘤、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤、成神经管细胞瘤、外周神经外胚层肿瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性淋巴性白血病(CLL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、成体T细胞白血病淋巴瘤、肝细胞癌、胆囊癌、支气管癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、多发性骨髓瘤、基底细胞癌、畸胎瘤、成视网膜细胞瘤、脉络膜黑色素瘤、精原细胞瘤、横纹肌肉瘤、颅咽管瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、尤文肉瘤以及浆细胞瘤。

可以体外或体内实施本发明的方法。当涉及细胞时，应当理解，该术语还包括细胞群体，即，多于一个细胞。

利用组合物在携带一种或多种细胞表面标志物的细胞中诱导凋亡

凋亡在多细胞器官的发育和平衡中起到关键作用。“凋亡”是指程序性细胞死亡，并且其表现为某些细胞学特征，例如膜起泡、染色质浓缩和片段化、凋亡小体形成和阳性“TUNEL”(末端脱氧核糖核酸转移酶介导的UTP缺口末端标记法)染色模式。凋亡过程中的后续步骤是质膜降解，从而使凋亡细胞能暴露于各种染料(例如，碘化丙啶)。

凋亡可以由多个独立信号通路诱导，所述多个独立信号通路汇聚于由数个死亡受体及其配体之间的多种相互作用组成的最终效应机制，所述死亡受体及其配体属于肿瘤坏死因子(TNF)受体/配体超家族。表征最清楚的死亡受体是CD95(“Fas”)、TNFR1(p55)、死亡受体3(DR3或Apo3/TRAMO)、DR4和DR5(apo2-TRAIL-R2)。凋亡的最终效应机制是一系列指定为半胱天冬酶的蛋白酶的活化。这些半胱天冬酶的活化导致一系列重要细胞蛋白的切割和细胞死亡。

本发明提供在表达一种或多种细胞表面标志物的细胞中诱导凋亡的方法。一方面，在细胞中诱导凋亡的方法包括以下步骤：使表达一种或多种细胞表面标志物(例如细胞表面受体)的细胞暴露于本发明的PE(例如，作为本文所述的嵌合分子的一部分)或与本发明的PE接触。通常，将细胞暴露于有效量的免疫偶联物或使细胞与有效量的免疫偶联物接触，其中所述接触导致诱导凋亡。

在本发明的另一方面中，提供了诱导表达一种或多种细胞表面标志物的肿瘤细胞经历凋亡的方法，其包括以下步骤：给予个体本发明的PE(例如，作为嵌合分子的一部分)。

利用组合物来抑制携带一种或多种细胞表面标志物的细胞的生长、过度增殖或存活

本发明的一个目的是提供利用本发明组合物治疗癌症的改进的治疗策略。在本发明的一方面中，提供抑制细胞的不希望的生长、过度增殖或存活中至少之一的方法。该方法包括以下步骤：使表达表面标志物的细胞与有效量的本发明的PE(例如，作为本文所述的嵌合分子的一部分)接触，其中接触步骤导致抑制细胞的不希望的生长、过度增殖或存活中的至少一种。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤：确定细胞是否表达一种或多种细胞表面标志物，例如，细胞表面受体。通常，使细胞暴露于有效量的免疫偶联物或使细胞与有效量的免疫偶联物接触，其中所述接触导致抑制细胞的不希望的生长、过度增殖或存活中的至少一种。

因此，在本发明的一方面中，提供抑制携带一种或多种细胞表面标志物的细胞群体的生长的方法。在优选实施方案中，该方法包括以下步骤：(a)使细胞群体与嵌合蛋白接触，所述嵌合蛋白包含(i)特异性地结合至少一种细胞表面标志物的靶向部分和(ii)本发明的PE，例如，D406和Q592被取代为Gly、Ala或Ser。从而使细胞群体的生长受到抑制。

很多肿瘤形成转移。因此，在本发明的另一方面中，本发明组合物被用于预防转移形成。该方法包括以下步骤：将本发明组合物给予肿瘤细胞，其中所述给药实现转移的预防。在优选实施方案中，所述组合物包含靶向毒素，所述靶向毒素包含针对细胞表面抗原的抗体和本发明的PE。通常，使细胞暴露于有效量的免疫偶联物或使细胞与有效量的免疫偶联物接触，其中所述接触实现转移的预防。

利用组合物治疗癌症

可以在体外和体内实施本发明的方法。因此，在本发明的另一方面中，提供治疗患有癌症的个体的方法。该方法包括以下步骤：给予被诊断患有癌症的个体治疗有效量的本文所述的改进的PE分子，其中癌症的特征为表达一种或多种细胞表面标志物的细胞的不希望的生长或增殖，并且其中所述给药步骤实现对个体的治疗。

在优选实施方案中，组合物包含具有本发明的改进的PE或其变体的免疫毒素。通常，使细胞暴露于有效量的免疫毒素或使细胞与有效量的免疫毒素接触，其中所述接触实现对个体的治疗。

本发明组合物可用于治疗本文所述的任何癌症，例如，进行免疫毒素治疗的那些癌症。在本发明的一个实施方案中，包含本发明的PE的免疫毒素被用于治疗患有表达一种或多种细胞表面标志物的肺恶性肿瘤的个体。肺恶性肿瘤包括，但不限于，支气管癌[鳞状细胞癌、未分化小细胞癌、未分化大细胞癌、腺癌]、肺泡[细支气管]癌、支气管腺癌、肉瘤、淋巴瘤、软骨错构瘤、间皮瘤、SCLC以及NSCLC。

在本发明的另一实施方案中，本发明组合物被用于治疗患有表达一种或多种细胞表面标志物的肉瘤的个体。肉瘤包括，但不限于，恶性肿瘤，例如血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤。

在本发明的另一实施方案中，包含本发明的PE的免疫毒素被用于治疗患有表达一种或多种细胞表面标志物的胃肠恶性肿瘤的个体。胃肠恶性肿瘤包括，但不限于，食道的恶性肿瘤[鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤]、胃的恶性肿瘤[癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤]、胰腺的恶性肿瘤[胰管腺癌、胰岛瘤、胰高血糖素瘤、促胃液素瘤、类癌瘤、血管活性肠肽瘤]、小肠的恶性肿瘤[腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波济氏肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、纤维神经瘤、纤维瘤]以及大肠的恶性肿瘤[腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤]。

在本发明的一个实施方案中，包含本发明的PE的免疫毒素被用于治疗患有表达一种或多种细胞表面标志物的泌尿生殖道恶性肿瘤的个体。泌尿生殖道恶性肿瘤包括，但不限于，肾的恶性肿瘤[腺癌、维耳姆斯氏瘤(肾母细胞瘤)、淋巴瘤、白血病、肾细胞癌]、膀胱和尿道的恶性肿瘤[鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌]、前列腺的恶性肿瘤[腺癌、肉瘤]以及睾丸的恶性肿瘤[精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、莱氏细胞瘤、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤]。

在本发明的另一实施方案中，包含本发明的PE的免疫毒素被用于治疗患有表达一种或多种细胞表面标志物的肝恶性肿瘤的个体。肝恶性肿瘤包括，但不限于，肝细胞癌、胆管细胞型肝癌、肝母细胞癌、血管肉瘤、肝细胞腺瘤以及血管瘤。

在本发明的一个实施方案中，包含本发明的PE的免疫毒素被用于治疗患有表达一种或多种细胞表面标志物的皮肤恶性肿瘤的个体。皮肤恶性肿瘤包括，但不限于，恶性黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波济氏肉瘤、痣、发育不良的痣、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤以及银屑病。

在本发明的一个实施方案中，包含本发明的PE的免疫毒素被用于治疗患有表达一种或多种细胞表面标志物的妇科恶性肿瘤的个体。妇科恶性肿瘤包括，但不限于，子宫的恶性肿瘤[子宫内膜癌]、宫颈的恶性肿瘤[宫颈癌、侵入前宫颈非典型增生]、卵巢的恶性肿瘤[卵巢癌(浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、子宫内膜样癌、透明细胞腺癌、未分类癌)、卵泡膜细胞瘤、支持间质细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤和其它生殖细胞肿瘤]、外阴的恶性肿瘤[鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑色素瘤]、阴道的恶性肿瘤[透明细胞腺癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤(胚胎性横纹肌肉瘤肉瘤)以及输卵管的恶性肿瘤[癌]。

在本发明的另一实施方案中，包含本发明的PE的免疫毒素被用于治疗患有表达一种或多种细胞表面标志物的骨恶性肿瘤的个体。骨恶性肿瘤包括，但不限于，成骨肉瘤[骨肉瘤]、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤文肉瘤、恶性淋巴瘤[网状细胞肉瘤]、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤、脊索瘤、骨软骨瘤[骨软骨性外生骨疣]、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨样骨瘤以及巨细胞瘤。

在本发明的一个实施方案中，包含本发明的PE的免疫毒素被用于治疗患有表达一种或多种细胞表面标志物的神经系统恶性肿瘤的个体。神经系统恶性肿瘤包括、但不限于，颅骨的恶性肿瘤[骨瘤、血管瘤、肉芽肿瘤、黄瘤、骨佩吉特病]、脑膜的恶性肿瘤[脑膜瘤、脑膜肉瘤、神经胶质瘤病]、脑的恶性肿瘤[星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、胚组织瘤(松果体瘤)、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤、许旺氏细胞瘤、成视网膜细胞瘤、先天性肿瘤]以及脊髓的恶性肿瘤[纤维神经瘤、脑膜瘤、神经胶质瘤、肉瘤]。

在本发明的一个实施方案中，包含本发明的PE的免疫毒素被用于治疗患有表达一种或多种细胞表面标志物的血液学恶性肿瘤的个体。血液学恶性肿瘤包括，但不限于，血液恶性肿瘤[骨髓性白血病(急性和慢性)、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓化生不良综合症]、霍奇金病以及非霍奇金淋巴瘤(恶性淋巴瘤)。

在本发明的一个实施方案中，包含本发明的PE的免疫毒素被用于治疗患有间皮蛋白-CA125结合相互作用所介导的恶性肿瘤的个体。生长、扩散和/或发展至少部分地由CA125/间皮蛋白结合介导的示例性恶性肿瘤包括卵巢癌、间皮瘤、非小细胞肺癌、肺腺癌和胰腺癌。

在本发明的一个实施方案中，包含本发明的PE的免疫毒素被用于治疗患有表达一种或多种细胞表面标志物的肾上腺的恶性肿瘤的个体。肾上腺的恶性肿瘤包括，但不限于，成神经细胞瘤。

治疗恶性肿瘤的方法可以任选地包括以下步骤中的一个或多个：从个体获得组织或液体的生物样品；筛选生物样品是否表达一种或多种细胞表面标志物、优选细胞表面受体，例如通过使生物样品与针对表面标志物、优选细胞表面受体的抗体接触；或者筛选生物样品是否表达表面标志物多核苷酸、优选细胞表面受体多核苷酸，例如通过检测表面标志物mRNA、优选细胞表面受体mRNA。可以使用本领域已知的标准技术来实现这点，例如，Western印迹、Northern印迹或PCR。

利用组合物来治疗发展出由携带一种或多种细胞表面标志物的细胞引起的疾病的个体

还提供了发展出由优先携带或过表达一种或多种细胞表面标志物的细胞的存在或异常增殖引起的疾病的哺乳动物的治疗方法。在优选实施方案中，该方法包括以下步骤：将嵌合蛋白给予所述哺乳动物，所述嵌合蛋白包含(i)特异性地结合所述细胞上的至少一种表面标志物的靶向部分和(ii)本发明的PE，例如，D406和Q592A取代为Gly、Ala或Ser。

在优选实施方案中，嵌合蛋白包含具有本发明的PE或其变体的免疫毒素。通常，将细胞暴露于有效量的免疫毒素或使细胞与有效量的免疫毒素接触，其中所述接触实现对个体的治疗。

在另一实施方案中，本发明提供利用本发明PE分子来体外或离体清除靶细胞。例如，包含本发明PE分子的嵌合分子可被用于从培养物的细胞群体中清除目标细胞。因此，例如，可以通过使培养物与本文所述的针对目的细胞表面标志物的嵌合分子接触来从患有表达目标细胞表面标志物(例如，CD22、CD25、间皮蛋白、Lewis Y)的癌症的患者培养的细胞中清除癌症细胞。

在某些情况下，靶细胞可以包含在生物样品中。本文所用的“生物样品”是含有靶细胞和非靶细胞的生物组织或液体的样品。所述样品包括，但不限于，来自活组织检查、血液以及血细胞(例如，白细胞)的组织。生物样品通常获自多细胞真核生物，优选哺乳动物，例如大鼠、小鼠、牛、狗、豚鼠或兔，以及更优选灵长类，例如猕猴、黑猩猩或人。最优选地，样品来自于人。

6.监测疾病的方法

本发明提供检测患有或易患可用靶向毒素治疗的癌症(例如，具有细胞表面标志物的癌症)的患者中肿瘤生长的抑制的方法。所述方法尤其可用于监测利用本发明的PE分子(例如，作为本文所述的嵌合分子的一部分)给予患者治疗的过程。所述方法可用于监测对有症状患者的治疗性处理和对无症状患者的预防性处理。

所述监测方法需要在给予本发明PE分子(例如，作为嵌合分子的一部分)的剂量之前确定患者中肿瘤负荷的基线值，以及将其与治疗后的肿瘤负荷的值或未接受治疗的患者中的肿瘤负荷的值进行比较。

肿瘤负荷值的显著降低(即，大于相同样品的重复测量中实验误差的通常界限(表示为这些测量的平均值的一倍标准差))指示阳性治疗结果(即，本发明PE分子的给药(例如，作为嵌合分子的一部分)阻断肿瘤生长和/或转移的发展)。

在其它方法中，测定对照群体或正常群体的肿瘤负荷的对照值(即，平均值和标准差)(例如，负荷＝0)。通常，对照群体的个体未接受事先治疗。然后，将给予本发明PE分子(例如，作为嵌合分子的一部分)之后的患者中肿瘤负荷的测量值与对照值进行比较。相对于对照值，肿瘤负荷的显著降低(例如，大于平均值的一倍标准差)指示阳性治疗结果。缺乏显著降低或增加增加指示阴性治疗结果。

在其它方法中，测定已经历接受本发明PE分子(例如，作为本文所述的嵌合分子的一部分)的方案治疗的个体的对照群体中肿瘤负荷的对照值(例如，平均值和标准差)。将患者中肿瘤负荷的测量值与对照值进行比较。如果患者的测量值与对照值不是显著不同(例如，大于一倍标准差)，则可以中断治疗。如果患者的肿瘤负荷水平显著高于对照值，则试剂的继续给药是合理的。

在其它方法中，监测目前未接受治疗、但已经历事先治疗过程的患者的肿瘤负荷来确定是否需要恢复治疗。可以将患者中肿瘤负荷的测量值与之前获得的事先治疗过程后的患者中的肿瘤负荷值进行比较。相对于之前的测量，肿瘤负荷的显著增加(即，大于相同样品的重复测量中误差的通常界限)指示可以恢复治疗。或者，可以将患者中的测量值与经历治疗过程后的患者群体中测定的对照值(平均值+标准差)进行比较。或者，可以将患者中的测量值与仍无疾病症状的预防性处理的患者群体或表现出疾病特征减轻的治疗性处理的患者群体中的对照值进行比较。在所有这些情况下，相对于对照水平，肿瘤负荷的增加(即，大于一倍标准差)指示患者应当恢复治疗。

用于分析的组织样品通常为来自患者的血液、血浆、血清、粘液、生物活检组织、肿瘤、腹水或脑脊液。可以分析样品的瘤形成迹象。可以利用本领域已知的任何方法来检测瘤形成或肿瘤负荷，例如，由有资质的病理学专家对生物活检进行肉眼观察或通过其它可视化技术，例如放射线照相术、超声、磁共振成象(MRI)。

7.试剂盒、容器、装置以及系统

为了在上文所述的诊断、研究和治疗应用中使用，本发明还提供了试剂盒和系统。本发明的试剂盒包含嵌合分子，所述嵌合分子包含本发明的PE(例如，作为嵌合分子的一部分)。本发明的PE和嵌合分子的实施方案如本文所述。

此外，试剂盒和系统可以包括说明性材料，其包括实施本发明方法的指导(即，操作流程)。说明可以以多种形式提供在主题试剂盒中，其中的一种或多种可以提供在试剂盒中。尽管说明性材料通常包括书写材料或印刷材料，但是它们不限于此。本发明考虑到能存储这些说明和能将它们传递给最终使用者的任何媒介。所述媒介包括，但不限于电子存储媒介(例如，磁盘、录音带、磁片盒、芯片)、光学媒介(例如，CDROM)等。所述媒介可以包括提供该说明书材料的网址。

可以根据本发明制备多种试剂盒、系统以及组合物，这取决于试剂盒和系统的预期使用者以及使用者的具体需求。

提供了具有单位剂量的活性组合物(例如口服、阴道、直肠、经皮或注射用剂量(例如，用于肌肉内、静脉内或皮下注射))的试剂盒。在所述试剂盒中，除了装有所述单位剂量的容器之外，还有描述组合物在治疗疾病或恶性疾病状态中的用途和伴随益处的信息说明书。合适的活性组合物和单位剂量如本文上文所述。

尽管已经通过为了清楚和理解而进行说明和举例的方式较详细地描述了前述本发明，但对本领域技术人员显而易见的是，在本发明的教导下，可以在不必脱离本发明实质和范围的情况下对其进行某些等同的变化、改变、修改和取代。因此，本文所述的实施方案可进行各种改动、改变等，而本发明的范围仅可参照后附权利要求来确定。本领域技术人员能容易地意识到，可以改变、变化或改动多种非关键参数而得到本质上相似的结果。还应当理解，本文所用的术语仅是为了描述具体实施方案，而不是意图进行限制，因为本发明的范围仅受后附权利要求的限定。

尽管本发明的每个元件在本文中描述为含有多个实施方案，但应当理解，除非另外指出，本发明给定元件的每个实施方案能用于本发明其它元件的每个实施方案，并且每种所述应用意图形成本发明的不同实施方案。

在此，将本文引用的参考专利、专利申请和科学文献(包括GenBank数据库序列的登录号)通过引用的方式整体并入本文，如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入本文一样。本文引用的任何参考文献和本说明书中的具体教导之间的任何矛盾应当以利于后者的方式解释。同样，词语或短语的本领域理解的定义和本说明书中具体教导的该词语或短语的定义之间的任何矛盾应当以利于后者的方式解释。

从上文的公开内容中可以理解，本发明具有多种应用。

通过下述实施例进一步说明本发明，所述实施例仅是说明性的而不是意图以任何方式限制本发明的定义和范围。

实施例

提供以下实施例是为了说明本发明，而不是限制本发明。

实施例1：现有PE分子中移除的表位：PE-LR-8M

表1

移除的表位	突变
		1	LR(Δ251-273/Δ285-394)
2	LR，R467A
		3	LR
4	R432G，D406A
		5	R490A
6	E548A，R513A
		7	K590S，Q592A

^*表位描述于，例如，Onda，et al.，Proc Natl Acad Sci USA.2008 105(32)：11311-6和WO 2007/016150中。

实施例2：HA22-LR-8M对细胞的细胞毒性活性

HA22-LR-8M对Raji和CA46细胞具有与HA22和HA22-LR-6X相当的细胞毒性。将细胞与不同免疫毒素(例如，HA22、HA22-LR、HA22-LR-6X、HA22-LR-8M)孵育2天或3天，并且通过WST测定评估细胞活力(即，利用四唑盐WST-1(试剂和试剂盒可获自Roche AppliedSciences)测定细胞增殖)。结果总结在表2中。

表2

HA22-非突变形式的PE38

HA22 LR-(Δ251-273/Δ285-394)

HA22 LR 6X-(Δ251-273/Δ285-394/R432G，R467A，R490A，R513A，E548S，K590S)

HA22 LR 8X-(Δ251-273/Δ285-394/D406A，R432G，R467A，R490A，R513A，E548S，K590S，Q592A)

测试HA22-LR-8M对来自CLL患者的慢性淋巴性白血病(CLL)细胞的细胞杀伤活性。将来自CLL患者的细胞与HA22(非突变形式的PE38)、HA22-LR或HA22-LR-8M孵育，并测定细胞活力降低50％时的浓度(IC₅₀)。HA22-LR-8M的IC₅₀与HA22-LR相当，并且比HA22有大幅提高。结果显示在图1中。

实施例3：HA22-LR-8M的抗肿瘤活性和降低的免疫原性

在SCID小鼠中测试HA22-LR-8M对CA46肿瘤的抗肿瘤活性。用HA22或HA22-LR-8M的3次静脉内(i.v.)注射来治疗具有CA46肿瘤的小鼠，并且在23天中测量肿瘤的大小。结果显示在图2中。

按照标准技术，在接受免疫毒素静脉内给药的小鼠中测试HA22-LR-8M相比于LMB-9的免疫原性。用非突变形式的PE38的免疫毒素LMB9或HA22-LR-8M对小鼠静脉内注射4次，间隔7天。每次注射后6天，从动物取血，并通过ELISA测定其与LMB9或HA22-LR-8M的反应性。收集血液样品，并将其保存在-80℃，直至测定。即使在28天中4次HA22-LR-8M静脉内给药后测定时，也未引起免疫原性应答(图3)。

按照标准技术，在接受免疫毒素静脉内(i.v.)给药的小鼠中测试HA22-LR-8M相比于HA22的免疫原性。每2周用5μg免疫毒素对小鼠进行静脉内注射，并在10天后取血。通过ELISA分析血清中与注射的免疫毒素发生反应的抗体。即使在66天中5次HA22-LR-8M静脉内给药后测定时，也未引起免疫原性应答(图4)。

实施例4：HA22-LR-8M的生物活性的其它研究

按照上文所述测试HA22和HA22-LR-8M对CA46细胞的特异性细胞毒性活性。结果提供在图5A中，HA22(闭合圆圈)和HA22-LR-8M(闭合方块)。

HA22和HA22-LR-8M对SCID小鼠的抗肿瘤活性(图5B)。用PBS/0.2％MSA(黑方块)或0.4mg/kg(三角)、2.5mg/kg(圆圈)或5.0mg/kg(灰色方块)这3个剂量的HA22-LR-8M对8只携带CA46肿瘤的SCID小鼠的各个组进行每隔一天、共三次(如箭头所示)的治疗。每隔一天测量肿瘤大小，并使用公式(0.4×a b^2)来计算。数据被表示为平均值+标准差。第24天和第27天的抗肿瘤活化存在显著差异(p＜0.05)。

比较对HA22、HA22-8X和HA22-LR-8M的免疫应答。小鼠中针对免疫毒素的IgG抗体产生显示于图6A中。Balb/c小鼠(n＝9)的各组每14天(箭头)静脉内接受HA22(250μg/kg，圆圈)、HA22-8X(250μg/kg，方块)或HA22-LR-8M(500μg/kg，三角)，并在每次注射后10天取血。按照标准技术，利用ICC-ELISA测定分别的免疫毒素的抗体水平。

还测试了小鼠中由免疫毒素诱导的IgM应答(图6B)。用配制于PBS/0.2％MSA中的HA22(250μg/kg，圆圈)、HA22-LR-8M(500μg/kg，方块)或作为对照的单独的PBS/0.2％MSA(三角)对Balb/c小鼠(10只/组)每14天进行静脉内注射。每次注射后10天从小鼠取血，并且利用ICC-ELISA测定稀释50倍的血清中针对分别的免疫毒素的IgM。免疫后的血清滴定显示在图6C中。也将来自用HA22(圆圈)免疫的小鼠的第38天的血清连续稀释，并与用单独的PBS/0.2％MSA(三角)免疫的对照血清比较针对HA22的IgM。利用ICC-ELISA和每种免疫毒素测定IgM水平。

测试HA22免疫的小鼠血清中针对每种突变分子的抗体的量(图6D)。10只Balb/c小鼠每14天(共4次注射)静脉内接受HA22(250μg/kg)，并在第4次注射后10天取血。利用ICC-ELISA和HA22测定针对HA22的抗体水平。还利用ICC-ELISA和分别的免疫毒素测定HA处理的血清对突变免疫毒素的交叉反应。

研究了对HA22或HA22-LR-8M免疫毒素的次级免疫应答(图6E)。在用HA22初次免疫(5μg，2次免疫，间隔2周)后的4周，用HA22(方块)或HA22-LR-8M(圆圈)将小鼠再次免疫。显示了每种免疫毒素的特异性IgG水平。

先前存在的产抗体B细胞对HA22或HA22-LR-8M免疫毒素的免疫应答(图6F)。在用HA22(5μg/小鼠)3次或4次静脉内免疫后15周，选择了具有低滴度(约103)的抗HA22特异性IgG的8只小鼠用于进一步的再免疫研究。用HA22(方块)或HA22-LR-8M(圆圈)将小鼠再次免疫。显示了每种免疫毒素的特异性IgG滴度。相对于针对PE38的mAb(IP30)表示抗体的量。数据表示为平均值+标准差。HA，HA22；LR，HA22-LR；LR8M，HA22-LR-8M；ns，不显著；^*，p＜0.05

应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且根据所述实施例和实施方案进行的各种改动或变化对于本领域技术人员是显而易见的，并且将包括在本申请的实质和范围以及后附权利要求的范围内。通过引用的方式将本文引用的所有登录号、出版物、专利以及专利申请出于所有目的整体并入本文。

Claims

1.分离的假单胞菌(pseudomonas)外毒素A(“PE”)，包含PE氨基酸序列，在所述PE氨基酸序列中去除了SEQ ID NO:1所限定的氨基酸残基1-273和285-394，并且SEQ ID NO:1所限定的氨基酸残基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被独立地取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。

2.如权利要求1所述的假单胞菌外毒素A，其中SEQ ID NO:1所限定的氨基酸残基D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597中的一个或多个还被独立地取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。

3.如权利要求1所述的假单胞菌外毒素A，其中所述假单胞菌外毒素A包含SEQ ID NO:2。

4.如权利要求1或3所述的假单胞菌外毒素A，其中所述假单胞菌外毒素A包含SEQ ID NO:3。

5.嵌合分子，包含与(b)假单胞菌外毒素A(“PE”)偶联或融合的(a)靶向部分，所述假单胞菌外毒素A包含PE氨基酸序列，在所述PE氨基酸序列中去除了SEQ ID NO:1所限定的氨基酸残基1-273和285-394，并且SEQ ID NO:1所限定的氨基酸残基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被独立地取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。

6.如权利要求5所述的嵌合分子，其中SEQ ID NO:1所限定的氨基酸残基D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597中的一个或多个还被独立地取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。

7.如权利要求5所述的嵌合分子，其中所述假单胞菌外毒素A包含SEQ ID NO:2。

8.如权利要求5所述的嵌合分子，其中所述假单胞菌外毒素A包含SEQ ID NO:3。

9.如权利要求5至8中任一项所述的嵌合分子，其中所述靶向部分是HA22的Fv部分。

10.如权利要求5至8中任一项所述的嵌合分子，其中所述靶向部分是抗体。

11.如权利要求10所述的嵌合分子，其中所述抗体选自scFv、dsFv、Fab、单结构域抗体和F(ab’)₂。

12.如权利要求10所述的嵌合分子，其中所述抗体能特异性结合选自以下的细胞表面抗原：CD19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD79b、转铁蛋白受体、EGF受体、间皮蛋白、钙粘蛋白和Lewis Y。

13.如权利要求10所述的嵌合分子，其中所述抗体选自B3、RFB4、SS1、MN、HN1、HN2和HB21。

14.如权利要求10所述的嵌合分子，其中所述抗体包含含有3个互补决定区(CDR)的可变轻链(VL)和含有3个CDR的可变重链(VH)，其中

(i)所述VL CDR1包含QDIXXY(SEQ ID NOS:4-8)，其中XX选自SN、HG、GR、RG和AR；

(ii)所述VL CDR2包含YTS；

(iii)所述VL CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ ID NO:9)；

(iv)所述VH CDR1包含GFAFSIYD(SEQ ID NO:10)；

(v)所述VH CDR2包含ISSGGGTT(SEQ ID NO:11)；

(vi)所述VH CDR3包含ARHSGYGXXXGVLFAY(SEQ ID NOS:12-16)，其中XXX选自SSY、THW、YNW、TTW和STY。

15.如权利要求10所述的嵌合分子，其中所述抗体包含含有3个互补决定区(CDR)的可变轻链(VL)和含有3个CDR的可变重链(VH)，其中

(i)所述VL CDR1包含QDIHGY(SEQ ID NO:5)；

(ii)所述VL CDR2包含YTS；

(iii)所述VL CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ ID NO:9)；

(iv)所述VH CDR1包含GFAFSIYD(SEQ ID NO:10)；

(v)所述VH CDR2包含ISSGGGTT(SEQ ID NO:11)；

(vi)所述VH CDR3包含ARHSGYGTHWGVLFAY(SEQ ID NO:13)。

16.如权利要求5至8中任一项所述的嵌合分子，其中所述靶向部分是细胞因子。

17.如权利要求5至8中任一项所述的嵌合分子，其中所述靶向部分是淋巴因子或生长因子。

18.组合物，包含

(a)嵌合分子，所述嵌合分子包含与(b)假单胞菌外毒素A(“PE”)偶联或融合的(a)靶向部分，所述假单胞菌外毒素A包含PE氨基酸序列，在所述PE氨基酸序列中去除了SEQ ID NO:1所限定的氨基酸残基1-273和285-394，并且SEQ ID NO:1所限定的氨基酸残基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被独立地取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸；以及

(b)药学可接受的载体。

19.如权利要求18所述的组合物，其中SEQ ID NO:1所限定的氨基酸残基D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597中的一个或多个还被独立地取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。

20.如权利要求18所述的组合物，其中所述假单胞菌外毒素A包含SEQ ID NO:2。

21.如权利要求18所述的组合物，其中所述假单胞菌外毒素A包含SEQ ID NO:3。

22.如权利要求18至21中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分是HA22的Fv部分。

23.如权利要求18至21中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分是抗体。

24.如权利要求23所述的组合物，其中所述抗体选自scFv、dsFv、Fab、单结构域抗体和F(ab’)₂。

25.如权利要求23所述的组合物，其中所述抗体能特异性结合选自以下的细胞表面抗原：CD19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD79b、转铁蛋白受体、EGF受体、间皮蛋白、钙粘蛋白和Lewis Y。

26.如权利要求23所述的组合物，其中所述抗体选自B3、RFB4、SS1、HN1、HN2、MN和HB21。

27.如权利要求23所述的组合物，其中所述抗体包含含有3个互补决定区(CDR)的可变轻链(VL)和含有3个CDR的可变重链(VH)，其中

(ii)所述VL CDR2包含YTS；

(iii)所述VL CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ ID NO:9)；

(iv)所述VH CDR1包含GFAFSIYD(SEQ ID NO:10)；

(v)所述VH CDR2包含ISSGGGTT(SEQ ID NO:11)；

28.如权利要求23所述的组合物，其中所述抗体包含含有3个互补决定区(CDR)的可变轻链(VL)和含有3个CDR的可变重链(VH)，其中

(i)所述VL CDR1包含QDIHGY(SEQ ID NO:5)；

(ii)所述VL CDR2包含YTS；

(iii)所述VL CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ ID NO:9)；

(iv)所述VH CDR1包含GFAFSIYD(SEQ ID NO:10)；

(v)所述VH CDR2包含ISSGGGTT(SEQ ID NO:11)；

(vi)所述VH CDR3包含ARHSGYGTHWGVLFAY(SEQ ID NO:13)。

29.如权利要求18至21中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分是细胞因子。

30.如权利要求18至21中任一项所述的组合物，其中所述靶向部分是淋巴因子或生长因子。

31.分离的核酸，其编码修饰的假单胞菌外毒素A(“PE”)，所述假单胞菌外毒素A包含PE氨基酸序列，在所述PE氨基酸序列中去除了SEQID NO:1所限定的氨基酸残基1-273和285-394，并且SEQ ID NO:1所限定的氨基酸残基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被独立地取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。

32.如权利要求31所述的分离的核酸，其中SEQ ID NO:1所限定的氨基酸残基D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597中的一个或多个还被独立地取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。

33.如权利要求31所述的分离的核酸，其中所述假单胞菌外毒素A包含SEQ ID NO:2。

34.如权利要求31所述的分离的核酸，其中所述假单胞菌外毒素A包含SEQ ID NO:3。

35.如权利要求31至34中任一项所述的分离的核酸，其中所述核酸还编码靶向部分。

36.如权利要求35所述的分离的核酸，其中所述靶向部分是HA22的Fv部分。

37.如权利要求35所述的分离的核酸，其中所述靶向部分是抗体。

38.如权利要求37所述的分离的核酸，其中所述抗体选自scFv、dsFv、Fab、单结构域抗体和F(ab’)₂。

39.如权利要求37所述的分离的核酸，其中所述抗体能特异性结合选自以下的细胞表面抗原：CD19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD79b、转铁蛋白受体、EGF受体、间皮蛋白、钙粘蛋白和Lewis Y。

40.如权利要求37所述的分离的核酸，其中所述抗体选自B3、RFB4、SS1、HN1、HN2、MN和HB21。

41.如权利要求37所述的分离的核酸，其中所述抗体包含含有3个互补决定区(CDR)的可变轻链(VL)和含有3个CDR的可变重链(VH)，其中

(ii)所述VL CDR2包含YTS；

(iii)所述VL CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ ID NO:9)；

(iv)所述VH CDR1包含GFAFSIYD(SEQ ID NO:10)；

(v)所述VH CDR2包含ISSGGGTT(SEQ ID NO:11)；

42.如权利要求37所述的分离的核酸，其中所述抗体包含含有3个互补决定区(CDR)的可变轻链(VL)和含有3个CDR的可变重链(VH)，其中

(i)所述VL CDR1包含QDIHGY(SEQ ID NO:5)；

(ii)所述VL CDR2包含YTS；

(iii)所述VL CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ ID NO:9)；

(iv)所述VH CDR1包含GFAFSIYD(SEQ ID NO:10)；

(v)所述VH CDR2包含ISSGGGTT(SEQ ID NO:11)；

(vi)所述VH CDR3包含ARHSGYGTHWGVLFAY(SEQ ID NO:13)。

43.如权利要求35所述的分离的核酸，其中所述靶向部分是细胞因子。

44.如权利要求35所述的分离的核酸，其中所述靶向部分是淋巴因子或生长因子。

45.抑制携带靶分子的细胞的生长的方法，所述方法包括将所述细胞与嵌合分子接触，所述嵌合分子包含

(a)能特异性结合所述靶分子的靶向部分，和

(b)假单胞菌外毒素A(“PE”)，其包含PE氨基酸序列，在所述PE氨基酸序列中去除了SEQ ID NO:1所限定的氨基酸残基1-273和285-394，并且SEQ ID NO:1所限定的氨基酸残基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被独立地取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，

其中将所述细胞与所述嵌合分子接触能抑制所述细胞的生长，并且所述方法是非治疗目的的。

46.如权利要求45所述的方法，其中SEQ ID NO:1所限定的氨基酸残基D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597中的一个或多个还被独立地取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。

47.如权利要求45所述的方法，其中所述假单胞菌外毒素A包含SEQ ID NO:2。

48.如权利要求45所述的方法，其中所述假单胞菌外毒素A包含SEQ ID NO:3。

49.如权利要求45至48中任一项所述的方法，其中所述靶向部分是HA22的Fv部分。

50.如权利要求45至48中任一项所述的方法，其中所述靶向部分是抗体。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述抗体选自scFv、dsFv、Fab、单结构域抗体和F(ab’)₂。

52.如权利要求50所述的方法，其中所述抗体能特异性结合选自以下的细胞表面抗原：CD19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD79b、转铁蛋白受体、EGF受体、间皮蛋白、钙粘蛋白和Lewis Y。

53.如权利要求50所述的方法，其中所述抗体选自B3、RFB4、SS1、HN1、HN2、MN和HB21。

54.如权利要求50所述的方法，其中所述抗体包含含有3个互补决定区(CDR)的可变轻链(VL)和含有3个CDR的可变重链(VH)，其中

(ii)所述VL CDR2包含YTS；

(iii)所述VL CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ ID NO:9)；

(iv)所述VH CDR1包含GFAFSIYD(SEQ ID NO:10)；

(v)所述VH CDR2包含ISSGGGTT(SEQ ID NO:11)；

55.如权利要求50所述的方法，其中所述抗体包含含有3个互补决定区(CDR)的可变轻链(VL)和含有3个CDR的可变重链(VH)，其中

(i)所述VL CDR1包含QDIHGY(SEQ ID NO:5)；

(ii)所述VL CDR2包含YTS；

(iii)所述VL CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ ID NO:9)；

(iv)所述VH CDR1包含GFAFSIYD(SEQ ID NO:10)；

(v)所述VH CDR2包含ISSGGGTT(SEQ ID NO:11)；

(vi)所述VH CDR3包含ARHSGYGTHWGVLFAY(SEQ ID NO:13)。

56.如权利要求45至48中任一项所述的方法，其中所述靶向部分是细胞因子。

57.如权利要求45至48中任一项所述的方法，其中所述靶向部分是淋巴因子或生长因子。

58.嵌合分子在制备用于抑制携带靶分子的细胞的生长的药物中的用途，所述嵌合分子包含

(a)能特异性结合所述靶分子的靶向部分，和

(b)假单胞菌外毒素A(“PE”)，其包含PE氨基酸序列，在所述PE氨基酸序列中去除了SEQ ID NO:1所限定的氨基酸残基1-273和285-394，并且SEQ ID NO:1所限定的氨基酸残基D406、R432、R467、R490、R513、E548、K590和Q592被独立地取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。

59.如权利要求58所述的用途，其中SEQ ID NO:1所限定的氨基酸残基D403、R412、R427、E431、R458、D461、R505、E522、R538、R551、R576和L597中的一个或多个还被独立地取代为丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸。

60.如权利要求58所述的用途，其中所述假单胞菌外毒素A包含SEQ ID NO:2。

61.如权利要求58所述的用途，其中所述假单胞菌外毒素A包含SEQ ID NO:3。

62.如权利要求58至61中任一项所述的用途，其中所述靶向部分是HA22的Fv部分。

63.如权利要求58至61中任一项所述的用途，其中所述靶向部分是抗体。

64.如权利要求63所述的用途，其中所述抗体选自scFv、dsFv、Fab、单结构域抗体和F(ab’)₂。

65.如权利要求63所述的用途，其中所述抗体能特异性结合选自以下的细胞表面抗原：CD19、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD79b、转铁蛋白受体、EGF受体、间皮蛋白、钙粘蛋白和Lewis Y。

66.如权利要求63所述的用途，其中所述抗体选自B3、RFB4、SS1、HN1、HN2、MN和HB21。

67.如权利要求63所述的用途，其中所述抗体包含含有3个互补决定区(CDR)的可变轻链(VL)和含有3个CDR的可变重链(VH)，其中

(ii)所述VL CDR2包含YTS；

(iii)所述VL CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ ID NO:9)；

(iv)所述VH CDR1包含GFAFSIYD(SEQ ID NO:10)；

(v)所述VH CDR2包含ISSGGGTT(SEQ ID NO:11)；

68.如权利要求63所述的用途，其中所述抗体包含含有3个互补决定区(CDR)的可变轻链(VL)和含有3个CDR的可变重链(VH)，其中

(i)所述VL CDR1包含QDIHGY(SEQ ID NO:5)；

(ii)所述VL CDR2包含YTS；

(iii)所述VL CDR3包含QQGNTLPWT(SEQ ID NO:9)；

(iv)所述VH CDR1包含GFAFSIYD(SEQ ID NO:10)；

(v)所述VH CDR2包含ISSGGGTT(SEQ ID NO:11)；

(vi)所述VH CDR3包含ARHSGYGTHWGVLFAY(SEQ ID NO:13)。

69.如权利要求58至61中任一项所述的用途，其中所述靶向部分是细胞因子。

70.如权利要求58至61中任一项所述的用途，其中所述靶向部分是淋巴因子或生长因子。