ES2641877T3 - Inmunotoxina recombinante dirigida a mesotelina - Google Patents

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John Weldon
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Description

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Figura 5. La adición de un enlazador flexible potencia la citotoxicidad de SS1-LR. Las líneas celulares (A) KB31 y
(8) NCI-H322M se incubaron con concentraciones crecientes de SS1P (círculos blancos, línea continua), SS1-LR (cuadrados blancos, línea discontinua), SS1-LR/GGS (rombos blancos, línea continua) o SS1-LR/GGS R279G (hexágonos rellenos, sin línea). Después de 3 días, se evaluó la viabilidad celular con un ensayo colorimétrico WST-8, y se normalizó entre los controles tratados y no tratados con ciclohexamida. Se representan gráficamente los valores medios y los errores típicos de seis repeticiones.
Figura 6. Citotoxicidad de SS1-LR/GGS/8M en células de pacientes. Células cultivadas de líquido pleural o ascitis de pacientes con mesotelioma se sembraron en placa con concentraciones crecientes de las ITR SS1P (barra blanca) o SS1-LR/GGS/8M (barra gris). Después de 4 días, las células se fijaron y tiñeron con violeta de cristal para detectar las células intactas. La absorbancia resultante a 595 nm se normalizó frente a un control no tratado. Se representan gráficamente los valores medios y los errores típicos de tres repeticiones. Sin asterisco = p> 0,05; * = p < 0,05; ** = p < 0,01; ***= p < 0,001.
Figura 7. Comportamiento in vivo de SS1-LR/GGS/8M. A) Actividad antitumoral de SS1-LR/GGS/8M. Ratones lampiños con tumores de xenoinjerto L55 se trataron por vía intravenosa los días 7, 9 y 12 después de la implantación con tampón RIT (HSA al 0,2 % en D-PBS; cruces, línea continua), 0,4 mg/kg de SS1P (círculos blancos, línea continua) o SS1-LR/GGS/8M a dosis de 0,4 (cuadrados blancos, línea discontinua) o 2,5 (cuadrados negros, línea discontinua) mg/kg. Las flechas indican días en los que se administró el tratamiento. El tamaño del tumor se midió durante un ciclo de 30 días. Los puntos representan el tamaño medio del tumor de todos los ratones en el grupo de tratamiento (n = 7). Las barras de error indican el error típico de cada valor medio. B) Modelo de rata de síndrome de filtración capilar. Las ratas se trataron por vía intravenosa con PBS, SS1P o SS1-LR/GGS/8M, se observaron después de 24 horas y posteriormente se sacrificaron. El líquido torácico de los animales a los que se realizó la eutanasia se recogió y se midió. Los pulmones de diversas ratas se fijaron, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina. C) Se muestran gráficos representativos a 200X de aumento. D) Parámetros farmacocinéticos de SS1-LR/GGS/8M. A ratones BalbC se les inyectó por vía intravenosa 10 μg de SS1P o SS1-LR/GGS/8M y se extrajo la sangre a diversos intervalos entre 2 y 60 minutos desde el tiempo de inyección. La concentración de inmunotoxina en el suero a los diversos intervalos se determinó por ELISA y se ajustó a una sola función de degradación exponencial. Se indica la semivida (t1/2) correspondiente. Cada punto es la concentración de inmunotoxina en el suero de un ratón, y se determinó concentración a cada intervalo de tiempo de al menos dos ratones diferentes.
Figura 8. Antigenicidad humana de SS1-LR/GGS/8M. La reactividad de SS1P y SS1-LR/GGS/8M con anticuerpos preexistentes en sueros humanos se comparó utilizando un ensayo de desplazamiento para determinar la concentración a la cual las dos ITR reducían la señal de un ELISA para detectar anticuerpos en suero al 50 % (CI50). En esta figura, los valores de CI50 relativos de SS1P con respecto a SS1-LR/GGS/8M se representan gráficamente. La antigenicidad de SS1-LR/GGS/8M se reduce drásticamente con respecto a SS1P en todos los sueros.
Figura 9. Resumen de citotoxicidad de SS1-LR/GGS/8M en células de pacientes. Viabilidad relativa frente a tratamiento. Células cultivadas de líquido pleural o ascitis de pacientes con mesotelioma se sembraron en placas con concentraciones crecientes de SS1P (barra blanca) o de SS 1-LR/GGS/8M (barra gris). Después de 4 días, las células se fijaron y se tiñeron con violeta de cristal para detectar las células intactas. La absorbancia resultante a 595 nm se normalizó frente a un control no tratado. Se representan gráficamente los valores medios y los errores típicos de tres repeticiones. Los asteriscos indican diferencias significativas de p < 0,01 (**) o p < 0,001 (***).
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación proporciona una variante menos tóxica y menos inmunogénica de las ITR antimesotelina basada en la ITR SS1P antimesotelina basada en PE. Nuestra evaluación inicial de SS1-LR, generada basándose en un trabajo previo con la ITR HA22-LR anti-CD22 basada en PE (Weldon y col., Blood 113 (6): 3792-3800) (2009)), mostró actividad muy variable en una selección de líneas celulares que expresaban mesotelina in vitro En un ensayo de tumor de xenoinjerto de ratón A431/K5, la SS1-LR (SEQ ID NO: 6 y 7) era menos activa que la SS1P, pero la SS1-LR podría administrarse a dosis mucho más altas para lograr una regresión tumoral significativa. Mientras se exploraban las razones de su actividad altamente variable en relación con SS1P, se estudió la internalización y el procesamiento de SS1-LR y se encontró que la proporción de SS1-LR escindida por furina fue mucho menor que la de SS1P. Esto sugirió que la disminución de la escisión de furina podría limitar la actividad de SS1-LR, y hemos diseñado y producido varios mutantes para probar esta hipótesis. La adición de un enlazador corto de Gly-Gly-Ser después del sitio de escisión de furina potenció la actividad de SS1-LR en líneas celulares, pero sorprendentemente la citotoxicidad potenciada no correspondía a una escisión de furina potenciada. La presente divulgación se refiere a este descubrimiento sorprendente de la importancia de un enlazador corto, flexible para la citotoxicidad de una construcción de ITR antimesotelina independiente de cualquier efecto sobre la escisión de PE por furina. En otros trabajos, se incorporaron 8 mutaciones puntuales que se ha demostrado que reducen la inmunogenicidad de PE en SS1-LR/GGS y después se ensayó la molécula en células malignas primarias de pacientes con mesotelioma. La molécula final, SS1-LR / GGS / 8M (SEQ ID NO: 6 y 8) demostró una citotoxicidad similar a SS1P. Además, la ITR de acuerdo con la divulgación puede proporcionar una toxicidad inespecífica
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similarmente reducida.
La citotoxicidad de SS1-LR/GGS/8M se comparó con la de SS1P en células malignas primarias de pacientes con mesotelioma, y los resultados mostraron que SS1-LR/GGS/8M tenía citotoxicidad comparable a, o mejor que, la de SS1P. Además de una buena actividad, SS1-LR/GGS/8M tiene posibles ventajas sobre SS1P que incluyen disminución de la toxicidad inespecífica y baja inmunogenicidad. Los experimentos descritos en el presente documento sugieren que SS1-LR/GGS/8M sería un excelente candidato para la clínica debido a su baja inmunogenicidad, baja toxicidad inespecífica y buena citotoxicidad.
Definiciones
Las unidades, prefijos y símbolos se indican en su forma aceptada por el Sistema de Unidades Internacional (SI) Los intervalos numéricos se incluyen en los números que definen el intervalo. A menos que se indique otra cosa, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación 5’ a 3’; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amino a carboxilo. Los encabezamientos proporcionados en el presente documento no son limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de la divulgación, que pueden hacerse por referencia a la memoria descriptiva en su conjunto. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva en su totalidad.
La exotoxina A de Pseudomonas (“PE”) natural es una proteína monomérica extremadamente activa (peso molecular 66 kD), secretada por Pseudomonas aeruginosa, que inhibe la síntesis de proteínas en células eucariotas. La secuencia de PE natural se expone en la SEQ ID NO: 1 de la patente de Estados Unidos n.º 5.602.095. El procedimiento de acción es la inactivación del factor 2 de elongación (EF-2) por ADP ribosilación. La exotoxina contiene tres dominios estructurales que actúan al unísono causando citotoxicidad. El dominio Ia (aminoácidos 1252) actúa como mediador en la unión celular. El dominio II (aminoácidos 253-364) es responsable de la translocación en el citosol y el dominio III (aminoácidos 400-613) actúa como mediador en la ADP ribosilación del factor 2 de elongación. La estructura original de PE clasifica el dominio III como los restos 405-613, no 400-613. Allured VS, Collier RJ, Carroll SF & McKay DB, Proc Natl Acad Sci USA 83, 1320-1324 (1986). La función del dominio Ib (aminoácidos 365-399) sigue siendo indefinida, aunque una gran parte del mismo, aminoácidos 365-380, puede deleccionarse sin pérdida de citotoxicidad. Véase Siegall, y col., J Biol Chem 264: 14256-61 (1989). En la técnica se conocen numerosas modificaciones de este tipo e incluyen, pero sin limitación, la eliminación del dominio Ia, diversas deleciones de aminoácidos en los dominios Ib, II y III, sustituciones de aminoácidos sencillos y la adición de una o más secuencias en el extremo carboxilo, tales como KDEL (SEQ ID NO: 16) y REDL (SEQ ID NO: 26). Véase Siegall, y col., J. Biol. Chem. 264: 14256-14261 (1989). Las inmunotoxinas de la presente divulgación tienen la capacidad de efectuar la translocación y ribosilación del factor 2 de elongación, EF-2, en una célula diana.
En el presente documento, las mutaciones de PE se describen por referencia al resto de aminoácido presente en una posición particular de la secuencia de PE natural (SEQ ID NO: 1) de 613 aminoácidos, seguido del aminoácido por el cual se ha reemplazado ese resto en la mutación particular en cuestión. Por tanto, por ejemplo, el término “R490A” indica que la “R” (arginina, según el código convencional de una sola letra) en la posición 490 de la molécula a la que se hace referencia, se reemplaza por una “A” (alanina, según el código convencional de una sola letra), mientras que “K590Q” indica que la lisina, normalmente presente en la posición 590, se ha reemplazado por una glutamina. El código convencional de una sola letra para los aminoácidos habituales se expone más adelante.
Las expresiones “dominio III funcional de PE” o “Dominio III de PE funcional” se refieren a los restos 395-613 de la PE natural (la secuencia natural es SEQ ID NO: 1). Aunque los límites estructurales del dominio III se han establecido en los restos 405-613, análisis funcionales han mostrado que el dominio III requiere un segmento del dominio Ib para conservar la actividad de ADP ribosilación (Hwang, J. y col., Cell, 48: 129-136 (1987); Siegall, C. B. y col., J Biol Chem, 264: 14256-14261 (1989)). El dominio III funcional de PE se define por tanto por los restos 395613 de PE (Kihara, A. y Pastan, I., Bioconjug Chem, 5: 532-538 (1994)). En el presente documento, la secuencia del dominio III funcional de PE incluye las modificaciones opcionales para reducir la antigenicidad y secuencias de retención del retículo endoplasmático alternativas opcionales.
Los restos terminales del dominio III de PE, REDLK (SEQ ID NO: 15) pueden modificarse de modo que aumente la citotoxicidad de las ITR resultantes de acuerdo con la presente divulgación. Por ejemplo, las inmunotoxinas creadas con las PE mutadas que acaban en las secuencias KDEL (SEQ ID NO: 16), REEL (SEQ ID NO: 27) o RDEL (SEQ ID NO: 28) pueden ser mucho más citotóxicas contra células diana que las inmunotoxinas creadas con PE38 que lleva la secuencia terminal natural. Véase, Kreitman y Pastan, Biochem J, 307 (Pt 1): 29-37 (1995). Las repeticiones de estas secuencias también pueden utilizarse en las ITR presentes. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 5.854.044; 5.821.238 y 5.602.095 y la publicación internacional WO 99/51643. Aunque las PE que terminan en KDEL (SEQ ID NO: 16) son útiles para fines in vitro, estas pueden tener más toxicidad inespecífica en animales y ser menos preferidas para uso in vivo.
El término “mesotelina” se refiere a una proteína y a fragmentos de la misma, presentes en la superficie de algunas células humanas y unidas, por ejemplo, mediante el anticuerpo K1. Las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de la mesotelina se exponen, por ejemplo, en la solicitud PCT publicada WO 97/25.068 y en las
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patentes de Estados Unidos n.º 6.083.502 y 6.153.430. Véase también, Chang, K. y Pastan, I., Int. J. Cancer 57: 90 (1994); Chang, K. y Pastan, I., Proc. Natl Acad. Sci. USA 93: 136 (1996); Brinkmann U., y col., Int. J. Cancer 71: 638 (1997); Chowdhury, P.S., y col., Mol. Immunol. 34: 9 (1997) y la patente de Estados Unidos n.º 6.809.184. La mesotelina se expresa como una proteína precursora de aproximadamente 69 kDa, que después se procesa para liberar una proteína de 30 kDa, mientras que queda unida a la superficie celular la glucoproteína de superficie celular unida a glucosilfosfatidilinositol de 40 kDa descrita en los Antecedentes. En el presente documento, el término “mesotelina” se refiere a la glucoproteína de 40 kDa. Se han registrado las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos de la mesotelina de diferentes especies, por ejemplo, de ser humano (NM_005823.4→NP_005814.2; y NM_013404.3→NP_037536.2), de ratón (NM_018857.1→NP_061345.1), de rata (NM_031658.1→NP_113846.1), de bovino (NM_001100374.1→NP_001093844).
Por conveniencia de referencia, como se utiliza en el presente documento, el término “anticuerpo” incluye anticuerpos completos (algunas veces denominados “intactos” en el presente documento), fragmentos de anticuerpos que conservan el reconocimiento antigénico y la capacidad de unión, producidos tanto por la modificación de anticuerpos completos como sintetizados de nuevo utilizando metodologías de ADN recombinante, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y miméticos de anticuerpos, salvo que por contexto se requiera de otra manera. El anticuerpo puede ser una IgM, IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgD, IgA o IgE.
Las secuencias de las regiones constantes de las subclases de IgG se conocen bien en la técnica desde hace tiempo (por ejemplo, Honjo y col., Cell, 18: 559-68 (1979); Tucker y col., Science, 206: 1303-6 (1979); Yamawaki y col., Nature 283: 786-9 (1980); Ellison y col., Nucl Acids Res 10: 4071-9 (1982); Ellison y col., DNA 1: 11-8 (1981); Ellison y Hood, Proc Natl Acad Sci USA 79: 1984-8 (1982)). Dado que las CDR de las regiones variables determinan la especificidad del anticuerpo, las CDR o los fragmentos Fv de los anticuerpos contra un antígeno de superficie celular diana pueden injertarse o modificarse por ingeniería genética en un anticuerpo de elección para conferir especificidad para el antígeno de superficie celular diana sobre ese anticuerpo. Por ejemplo, las CDR de un anticuerpo contra un antígeno de superficie celular diana puede injertarse sobre un armazón (framework) de anticuerpo humano de estructura tridimensional conocida (véanse, por ejemplo, los documentos WO98/45322; WO 87/02671; las patentes de Estados Unidos n.º 5.859.205; 5.585.089 y 4.816.567; la solicitud de patente EP 0173494; Jones, y col. Nature 321: 522 (1986); Verhoeyen, y col., Science 239: 1534 (1988), Riechmann, y col. Nature 332: 323 (1988) y Winter y Milstein, Nature 349: 293 (1991)) para formar un anticuerpo que suscitará una respuesta escasa o no inmunogénica cuando se administra a un ser humano. Como alternativa, las regiones constantes de los anticuerpos pueden modificarse por ingeniería genética reemplazando restos encontrados en animales no humanos, tales como ratones, con restos normalmente encontrados en seres humanos. Los anticuerpos modificados por ingeniería genética de este modo se denominan “anticuerpos humanizados” y son preferidos, dado que tienen un menor riesgo de inducir efectos secundarios y pueden permanecer en la circulación más tiempo. En la técnica se conocen procedimientos de humanización de anticuerpos y se exponen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos n.º 6.180.377; 6.407.213; 5.693.762; 5.585.089 y 5.530.101.
La expresión “fragmentos de anticuerpo” significa moléculas que comprenden una porción de un anticuerpo intacto, generalmente la unión antigénica o región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2 y Fv; anticuerpos de dominio sencillo (véanse, por ejemplo, Wesolowski, Med Microbiol Immunol. (2009) 198(3): 157-74; Saerens, y col., Curr Opin Pharmacol. (2008) 8(5): 6008; Harmsen y de Haard, Appl Microbiol Biotechnol. (2007) 77(1): 13-22); anticuerpos estabilizados con hélice (véase, por ejemplo, Arndt y col., J Mol Biol 312: 221-228 (2001); diacuerpos (véase más adelante); moléculas de anticuerpo monocatenario (“scFvs,” véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.º 5.888.773); anticuerpos estabilizados con disulfuro (“dsFvs”, véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.º 5.747.654 y 6.558.672) y anticuerpos de dominio (“dAbs,” véanse, por ejemplo, Holt y col., Trends Biotech 21(11): 484-490 (2003), Ghahroudi y col., FEBS Lett. 414: 521-526 (1997), Lauwereys y col., EMBO J 17: 3512-3520 (1998), Reiter y col., J. Mol. Biol.
290: 685-698 (1999), Davies y Riechmann, Biotechnology, 13: 475-479 (2001)).
El término “diacuerpos” se refiere a fragmentos pequeños de anticuerpo con dos sitios de unión antigénica, cuyos fragmentos comprenden un dominio pesado (Heavy) variable (“VH” o “VH”) conectado a un dominio ligero (Light) variable (“VL” o “VL”) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Utilizando un enlazador que sea muy corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven obligados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión antigénica. Los diacuerpos y su posición se describen más detalladamente, por ejemplo, en los documentos EP 404.097; WO 93/11161; y en Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).
La expresión “anticuerpo parental” significa cualquier anticuerpo de interés en el que se ha efectuado una mutación
o modificación para obtener anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unan al mismo epítopo que el anticuerpo parental, pero con mayor afinidad.
Un “residuo de direccionamiento” es la porción de un inmunoconjugado destinada a dirigir el inmunoconjugado a una célula de interés. Normalmente, el residuo de direccionamiento es un anticuerpo, o un fragmento de un anticuerpo que conserva la capacidad de reconocimiento por el antígeno, tal como un scFv, un dsFv, un Fab o un F(ab’)2
Un “residuo tóxico” es la porción de una inmunotoxina que hace que la inmunotoxina sea citotóxica a células de
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de proteína celular al menos un 50 %, o destruir la célula.
En el contexto de la presente divulgación, la toxina es una exotoxina A de Pseudomonas mutada.
La expresión “poner en contacto” incluye la referencia a la colocación en asociación física directa.
Un “plásmido de expresión” comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una molécula de interés, que está unida operativamente a un promotor.
Como se utiliza en el presente documento, “polipéptido”, “péptido” y “proteína”, se utilizan indistintamente e incluyen referencia a un polímero de restos de aminoácido. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural. Los términos también se aplican a polímeros que contienen sustituciones de aminoácidos conservativas de tal manera que la proteína permanezca funcional.
Las expresiones “resto” o “resto de aminoácido” o “aminoácido” incluyen referencia a un aminoácido que está incorporado en una proteína, un polipéptido o péptido (en su conjunto “péptido”). El aminoácido puede ser un aminoácido de origen natural y, a menos que se limite de otra manera, puede incluir análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden funcionar de una manera similar a la de los aminoácidos de origen natural.
Los aminoácidos y análogos indicados en el presente documento se describen mediante abreviaturas como se indica en la Tabla A:
Tabla A: Nomenclatura de los aminoácidos
Nombre 3 letras 1 letra
Alanina
Ala A
Arginina
Arg R
Asparagina Ácido aspártico
Asn Asp N D
Cisteína Ácido glutámico
Cys Glu C E
Glutamina
Gln Q
Glicina
Gly G
Histidina
His H
Homoserina
Hse -
Isoleucina
Ile I
Leucina
Leu L
Lisina
Lys K
Metionina
Met M
Metionina sulfóxido
Met (O) -
Metionina metilsulfonio
Met (S-Me)-
Norleucina
Nle -
Fenilalanina
Phe F
Prolina
Pro P
Serina
Ser S
Treonina
Thr T
Triptófano
Trp W
Tirosina
Tyr Y
Valina
Val V
Una “sustitución conservativa”, cuando se describe una proteína, se refiere a un cambio en la composición de aminoácidos de la proteína que no altera sustancialmente la actividad de la proteína. Por tanto, las “variaciones conservativamente modificadas” de un secuencia de aminoácidos particular, se refieren a sustituciones de aminoácidos de aquellos aminoácidos que no son críticos para la actividad de la proteína o la sustitución de aminoácidos por otros aminoácidos que tienen propiedades similares (por ejemplo, ácidos, básicos, cargados positiva o negativamente, polares o no polares, etc.) de tal manera que las sustituciones de aminoácidos incluso críticos no alteren sustancialmente la actividad. En la técnica se conocen tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares. Cada uno de los siguientes seis grupos de la Tabla B contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí:
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Tabla B
1)
Alanina (A), Serina (S), Treonina (T);
2)
Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);
3)
Asparagina (N), Glutamina (Q);
4)
Arginina (R), Lisina (K);
5)
Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y
6)
Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W).
Véase también, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties, W. H. Freeman and Company, Nueva York (2ª Ed., 1992).
Los términos “conjugación”, “unión”, “enlace” o “ligamiento” se refieren a la creación de dos polipéptidos en una molécula polipeptídica contigua. En el contexto de la presente divulgación, los términos incluyen referencia a la unión de un residuo de anticuerpo con una molécula efectora (ME). El ligamiento puede ser por medios químicos o recombinantes. Los medios químicos significa que se refiere a una reacción entre la fracción del anticuerpo y la molécula efectora de tal manera que se forma un enlace covalente entre las dos moléculas para formar una molécula.
Como se utiliza en el presente documento, “recombinante” incluye referencia a una proteína producida utilizando células que no tienen, en su estado natural, una copia endógena del ADN capaz de expresar la proteína. Las células producen la proteína recombinante porque se han modificado genéticamente por la introducción de la secuencia de ácidos nucleicos aislada apropiada. El término también incluye referencia a una célula, o a un ácido nucleico, o a un vector, que se ha modificado por la introducción de un ácido nucleico heterólogo o la modificación de un ácido nucleico natural en una forma no natural para esa célula, o que la célula que procede de una célula así modificada. Por tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no han encontrado en la forma natural (no recombinante) de las células, expresan mutantes de genes que se encuentran en la forma natural, o expresan genes naturales que, de otra manera, se expresan de forma anómala, se infraexpresan o no se expresan del todo.
Como se utiliza en el presente documento, “ácido nucleico” o “secuencia de ácidos nucleicos” incluye referencia a un polímero desoxirribonucleotídico o ribonucleotídico en forma monocatenaria o bicatenaria, y a menos que se limite de otra manera, incluye análogos conocidos de nucleótidos naturales que hibridan con ácidos nucleicos de una manera similar a la de los nucleótidos de origen natural. A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácidos nucleicos particular incluye su secuencia complementaria, así como variantes conservativas, es decir, ácidos nucleicos presentes en posiciones fluctuantes de codones y variantes que, cuando se traducen en una proteína, dan como resultado una sustitución conservativa de un aminoácido.
Como se utiliza en el presente documento, “codificar”, con respecto a un ácido nucleico especificado, incluye referencia a ácidos nucleicos que comprenden la información para la traducción en la proteína especificada. La información se especifica mediante el uso de codones. Normalmente, la secuencia de aminoácidos está codificada por el ácido nucleico, utilizando el código genético “universal”. Sin embargo, pueden utilizarse variantes del código universal, tales como las presentes en algunas mitocondrias de plantas, animales y hongos, la bacteria Mycoplasma capricolum (Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82: 2306-2309 (1985), o el ciliado Macronucleus, cuando el ácido nucleico se expresa utilizando la maquinaria traduccional de estos organismos.
La frase “fusión en fase” se refiere a la unión de dos o más secuencias de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de tal manera que la secuencia de ácidos nucleicos unida se traduce en una proteína monocatenaria (“proteína de fusión”) que comprende las cadenas polipeptídicas originales.
Como se utiliza en el presente documento, “expresado” incluye referencia a la traducción de un ácido nucleico en una proteína. Las proteínas pueden expresarse y permanecer intracelulares, llegar a ser un componente de la membrana de la superficie celular o secretarse en la matriz o medio extracelular.
Por “célula hospedadora” se entiende una célula que puede soportar la replicación o expresión del vector de expresión. Las células hospedadoras pueden ser células procariotas, tales como E. coli, o células eucariotas tales como células de levadura, insecto, anfibio o mamífero.
Los términos “idénticas” o porcentaje de “identidad”, en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje específico de restos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales, cuando se comparan y se alinean para una máxima correspondencia, medida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o por inspección visual.
La frase “sustancialmente idénticas”, en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen una identidad de nucleótidos o de restos de aminoácidos al menos 60 %,
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más preferentemente 65 %, incluso más preferentemente 70 %, aún más preferentemente 75 %, incluso más preferentemente 80 % y lo más preferentemente 90-95 %, cuando se comparan y se alinean para una correspondencia máxima, medida utilizando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias o por inspección visual. Preferentemente, existe una identidad sustancial sobre una región de las secuencias que tiene una longitud de al menos aproximadamente 50 restos, más preferentemente sobre una región de una longitud de al menos aproximadamente 100 restos, y lo más preferentemente las secuencias son sustancialmente idénticas sobre al menos aproximadamente 150 restos. En una realización más preferida, las secuencias son sustancialmente idénticas en toda la longitud de un péptido de comparación o de regiones codificantes.
Para la comparación de secuencias, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen secuencias de ensayo y de referencia en un ordenador, y posteriormente se diseñan coordenadas de secuencias, si fuera necesario, y se diseñan los parámetros del programa del algoritmo de secuencias. Después, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia, basándose en los parámetros del programa diseñados.
El alineamiento óptimo de secuencias para la comparación puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat’l. Acad Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante implementaciones informatizada de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete informático Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o por inspección visual (véase, en líneas generales, Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel y col., eds., Current Protocols, una sociedad conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel)).
Los ejemplos de algoritmos que son adecuados para la determinación del porcentaje de identidad de secuencia y similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 y en Altschuel y col. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. El programa informático para realizar análisis BLAST se encuentra disponible al público en el National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias de alta puntuación (HSP, del inglés high scoring sequence pairs) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia a investigar, que se emparejan o cumplen algunas puntuaciones de umbral T (threshold) de valor positivo, cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de bases de datos. El valor de T hace referencia al umbral de puntuación de la palabra vecina (Altschul y col, citado anteriormente). Este acierto de palabra vecina inicial actúa como semilla iniciando búsquedas para encontrar los HSP más largos que la contiene. Los aciertos de palabras se extienden después en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta donde pueda aumentarse la puntuación de alineamiento acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos emparejados; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para restos no emparejados; siempre < 0). Para las secuencias de aminoácidos, se utiliza una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión del acierto de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación del alineamiento acumulativa disminuye por la cantidad X de su valor máximo conseguido; la puntuación acumulativa va de cero o por debajo de cero, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación negativa; o cuando se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programan BLASTN (para secuencias de nucleótidos) utiliza como ajustes por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP utiliza como ajustes por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).
Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Una medición de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad mediante la cual se produciría un emparejamiento fortuito entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con respecto al ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0,1, más preferentemente menor que aproximadamente 0,01 y los más preferentemente menor que aproximadamente 0,001.
Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo en cruzado con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico, como se describe más adelante. Por tanto, en general, un polipéptido es sustancialmente idéntico a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren únicamente por las sustituciones conservativas. Otra indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que las dos secuencias se hibridan entre sí en condiciones rigurosas, como se describe a continuación.
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La expresión "in vivo" incluye referencia al interior del cuerpo del organismo del cual se obtuvo la célula. "Ex vivo" e "in vitro" significa fuera del cuerpo del organismo del cual se obtuvo la célula.
La frase “célula maligna” o “neoplasia” se refiere a tumores o a células tumorales que son invasivas y/o capaces de experimentar metástasis, es decir, una célula cancerosa.
Como se utiliza en el presente documento, las “células de mamífero” incluyen referencia a células procedentes de mamífero, entre los que se incluyen, seres humanos, ratas, ratones, cobayas, chimpancés o macacos. Las células pueden cultivarse in vivo o in vitro.
Con respecto a un antígeno, la expresión “selectivamente reactivo”, se refiere a la asociación preferencial de un anticuerpo, en su totalidad o en parte, con una célula o un tejido que lleva ese antígeno y no con células o tejidos que carecen de ese antígeno. Por supuesto, se reconoce que puede producirse un cierto grado de interacción inespecífica entre una molécula y una célula o un tejido no diana. Sin embargo, la reactividad selectiva puede distinguirse como mediada a través del reconocimiento específico del antígeno. Aunque los anticuerpos selectivamente reactivos se unen al antígeno, estos pueden hacerlo con baja afinidad. Por otra parte, la unión específica produce una asociación mucho más fuerte entre el anticuerpo y las células que llevan el antígeno que entre el anticuerpo unido y las células que carecen del antígeno. En general, la unión específica produce un aumento de más de 5 veces, más preferentemente de más de diez veces y lo más preferentemente de más de 100 veces, la cantidad de anticuerpo unido (por unidad de tiempo) a una célula o tejido que lleva el antígeno diana en comparación con una célula o un tejido que carece del antígeno diana. La unión específica a una proteína en dichas condiciones requiere un anticuerpo que se seleccione por su especificidad por una proteína particular. Una variedad de formatos de inmunoensayo son apropiados para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos de tipo ELISA en fase sólida se utilizan habitualmente para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína. Para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayos que pueden utilizarse para determinar la inmunorreactividad específica véase Harlow & Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York (1988).
La expresión “condiciones inmunológicamente reactivas” incluye la referencia a condiciones que permiten que un anticuerpo generado contra un epítopo particular se una a ese epítopo a un grado detectablemente mayor que, y/o con la exclusión sustancial de, unión a sustancialmente los restantes epítopos. Las condiciones inmunológicamente reactivas dependen del formato de la reacción de unión a anticuerpo y normalmente son las utilizadas en protocolos de inmunoensayo o aquellas condiciones encontradas in vivo. Véase Harlow & Lane, citado anteriormente, para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayo. Preferentemente, las condiciones inmunológicamente reactivas empleadas en los procedimientos en la presente divulgación son “condiciones fisiológicas” que incluyen referencia a condiciones (por ejemplo, temperatura, osmolalidad, pH) que son típicas dentro de un mamífero vivo o de una célula de mamífero viva. Aunque se reconoce que algunos órganos están sometidos a condiciones extremas, el medio dentro del organismo e intracelular normalmente se encuentra a un pH de aproximadamente 7 (es decir, un pH de 6,0 a 8,0, más normalmente un pH de 6,5 a 7,5), contiene agua como disolvente predominante, y está a una temperatura por encima de 0 ºC y por debajo de 50 ºC. La osmolalidad está dentro del intervalo que da soporte a la viabilidad y proliferación celular.
Los términos “paciente”, “sujeto”, “individuo” se refieren indistintamente a un mamífero, por ejemplo, un ser humano
o un primate no humano, un animal doméstico (por ejemplo, un canino o felino), un mamífero agrícola (por ejemplo, un bovino, porcino, ovino, equino), un animal de laboratorio (un ratón, una rata, un hámster, un conejo).
El término “coadministrar” se refiere a la presencia simultánea de dos agentes activos en la sangre de un individuo. Los agentes activos que se coadministran pueden suministrarse de manera simultánea o secuencial.
Como se utiliza en el presente documento, los términos “tratando” y “tratamiento”, se refieren a retrasar la aparición de, retardar o invertir el progreso de, o aliviar o prevenir la enfermedad o la afección a la que se aplica el término, o uno o más síntomas de dicha enfermedad o afección.
Los términos “inhibición”, “reducción”; “disminución” con respecto al crecimiento o progresión de un tumor o cáncer, se refieren a la inhibición del crecimiento, propagación, metástasis de un tumor o cáncer en un sujeto mediante una cantidad medible utilizando cualquier método conocido en la técnica. El crecimiento, la progresión o la propagación de un tumor o cáncer se inhibe, reduce o disminuye si la carga tumoral se reduce al menos en un 10 %, 20 %, 30 %, 50 %, 80 %, o 100 % en comparación con la carga tumoral antes de la coadministración de una PE, descrita en el presente documento, por ejemplo, como parte de una molécula quimérica. En algunas realizaciones, el crecimiento, la progresión o propagación de un tumor o cáncer se inhibe, reduce o disminuye al menos aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces o más en comparación con la carga tumoral antes de la administración de la PE.
Componentes de las inmunotoxinas recombinantes.
A. Sitios de escisión de furina (FCS, Furin Cleavage Sites)
El sitio de escisión de furina puede ser cualquier sitio polipeptídico escindible por furina. Como informan Duckert y
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siempre que contenga la secuencia de escisión mínima de furina y sea escindible por furina. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la secuencia escindible de furina puede ser R-Q-P-R (SEQ ID NO:39), R-H-R-Q-P-R-G-W (SEQ ID NO:40), R-H-R-Q-P-R-G-W-E (SEQ ID NO:41), H-R-Q-P-R-G-W-E-Q (SEQ ID NO:42), o R-Q-P-R-G-WE (SEQ ID NO:43). En algunas realizaciones, la secuencia es R-H-R-S-K-R-G-W-E-Q-L (SEQ ID NO:29) o una versión truncada de esta secuencia, siempre que contenga la secuencia de escisión mínima de furina y sea escindible por furina. Por tanto, en algunas realizaciones, la secuencia escindible de furina puede ser R-S-K-R (SEQ ID NO:44), R-H-R-S-K-R-G-W (SEQ ID NO:45), H-R-S-K-R-G-W-E (SEQ ID NO:46), R-S-K-R-G-W-E-Q-L (SEQ ID NO:47), H-R-S-K-R-G-W-E-Q-L (SEQ ID NO:48), o R-H-R-S-K-R (SEQ ID NO:49). Cualquier secuencia particular escindible de furina puede ensayarse fácilmente haciéndolo en una inmunotoxina con el anticuerpo utilizado en SS1-LR y ensayando la inmunotoxina resultante in vitro en una línea celular de mesotelina+.
El que una secuencia particular sea escindible o no por furina puede determinarse por procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el que una secuencia sea escindible o no por furina puede ensayarse incubando la secuencia con furina en tampón de furina (NaOAc 0,2 M (pH 5,5), CaCl2 5 mM) a 1:10 proporción molar de enzima: sustrato de 1:10 a 25 ºC durante 16 horas. Estas condiciones se han establecido previamente como óptimas para la escisión por furina de PE. Preferentemente, la furina que se utiliza es furina humana. La furina humana truncada recombinante está disponible en el comercio, por ejemplo, en New England Biolabs (Beverly, MA). Véase también, Bravo y col., J Biol Chem, 269(14):25830-25837 (1994). Los sitios de escisión de furina adecuados se enseñan también en una publicación de patente PCT número WO 2009/032954, publicada el 12 de marzo de 2009).
B. Dominio III funcional
Estructuralmente, se entiende que el dominio Ib comprende los restos 365-399. Por otro lado, como se indica en el presente documento, aunque se considera que el límite estructural del dominio de III de PE comienza en el resto 405, análisis funcionales han mostrado que el dominio III requiere un segmento de dominio Ib estructural para conservar la actividad de ADP-ribosilación. Por consiguiente, el dominio III funcional se define como los restos 395613 de PE, y por tanto se prefiere que las toxinas de la divulgación comprendan los restos 395-613 de PE, con determinadas variaciones permitidas descritas más adelante. La deleción de los restos 365-394 distintos de los de la secuencia de escisión de furina, es deseable, ya que las deleciones eliminan cualquiera de los epítopos inmunogénicos presentes en estas porciones de la molécula de PE. En las PE de la divulgación, una secuencia de escisión de furina, (o variantes truncadas o modificadas de la misma), se une en su extremo carboxilo con el dominio III, que tiene intercalado entre los dos un enlazador flexible de 3 a 8 aminoácidos independientemente seleccionados de glicina y serina.
En realizaciones preferidas, el dominio funcional de las moléculas de PE se modifica para tener una sustitución de alanina, glicina, serina o glutamina en lugar de los restos de aminoácidos normalmente presentes en las posiciones D406 y Q592 dentro del dominio III. Las sustituciones en las posiciones D406 y Q592 pueden combinarse con sustituciones de alanina, glicinia, serina o glutamina en las posiciones R432, R467, R490, R513, E548 y K590 dentro del dominio III. En algunas realizaciones, además, al menos un resto de aminoácido correspondiente a un resto de aminoácido en una posición seleccionada de D403, R412, R427, E431, R458, D461, R505, E522, R538, R551, R576 y L597 se sustituye con una alanina, glicina, serina o glutamina. Las sustituciones en los restos en sustituciones de posiciones dentro del dominio III de las posiciones de restos de aminoácidos D406, R432, R467, R490, R513, E548, K590 y Q592 del dominio III. En algunas realizaciones, el dominio III funcional de PE es sustancialmente idéntico a,
o es idéntico, a la secuencia de aminoácidos del dominio funcional de SS1-LR/GGS/8M de PE. En algunas realizaciones, el dominio III funcional de PE es sustancialmente idéntico a, o es idéntico, a la secuencia de aminoácidos del dominio funcional de SS1-LR/GGS/8X de PE.
Se entiende que la secuencia natural de PE y las variantes analizadas anteriormente pueden tener sustituciones conservativas y conservar la capacidad citotóxica y, deseablemente, antigenicidad reducida en comparación con la secuencia natural de PE. En realizaciones preferidas, variantes modificadas de PE o sus fragmentos citotóxicos tienen una similitud de secuencia de al menos 80 %, preferentemente una similitud de secuencia de al menos 85 %, más preferentemente una similitud de secuencia de al menos 90 %, y lo más preferentemente una similitud de secuencia de al menos 95 % al nivel de aminoácidos, con el dominio III funcional de PE de interés, el de SS1LR/GGS/8M o SS1-LR/GGS/8M. La publicación PCT No WO/2011/032022 publicada el 17 de marzo de 2011 desvela mutaciones adecuadas que reducen la antigenicidad del dominio II funcional de PE.
La expresión “variantes modificadas de manera conservativa” se aplica a secuencias tanto de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes modificadas de manera conservativa se refieren a aquellas secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o si el ácido nucleico no codifica ninguna secuencia de aminoácidos, a secuencias de ácidos nucleicos esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier polipéptido determinado. Por ejemplo, todos los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican el aminoácido alanina. Por tanto, en cada posición en la que una alanina está especificada por un codón, el codón puede cambiarse por cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones del ácido nucleico son “variaciones silenciosas”, que son una especie de variaciones modificadas de manera conservativa. En el presente documento cada secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido también describe cualquier posible
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variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto reconocerá que en un ácido nucleico cada codón (salvo AUG, que normalmente es el único codón para la metionina) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.
En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales en una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que alteren, añadan o delecionen un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada, es una “variante modificada de manera conservativa” en la que la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido por un aminoácido similar desde el punto de vista químico.
Ensayo de citotoxicidad o antigenicidad de PE
Las exotoxinas de Pseudomonas empleadas en la divulgación pueden someterse a ensayo para determinar el nivel de citotoxicidad deseado mediante ensayos bien conocidos por los expertos en la técnica. Por lo tanto, los fragmentos citotóxicos de PE y las variantes de dichos fragmentos modificadas de manera conservativa pueden someterse fácilmente a ensayos para determinar su citotoxicidad. Un gran número de moléculas de PE candidatas pueden someterse a ensayo simultáneamente para determinar su citotoxicidad por procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, subgrupos de las moléculas candidatas pueden someterse a ensayo para determinar su citotoxicidad. Los subgrupos de las moléculas candidatas que reaccionan positivamente pueden subdividirse continuamente y volverlos a someter a ensayo hasta identificar el fragmento (o fragmentos) citotóxico deseado. Dichos procedimientos permiten explorar rápidamente un gran número de fragmentos citotóxicos o variantes conservativas de PE. La antigenicidad se puede someter a ensayo mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo los ensayos enseñados en el documento WO 2007/016150.
C. Anticuerpos antimesotelina
El componente de direccionamiento de la molécula quimérica se une específicamente al marcador de superficie celular, la mesotelina. Los antígenos de superficie celular, que son dianas para moléculas quiméricas, son muy conocidos en la técnica, y se resumen, por ejemplo, en Mufson, Front Biosci (2006) 11: 337-43; Frankel, Clin Cancer Res (2000) 6: 326-334 y Kreitman, AAPS Journal (2006) 8(3): E532-E551. Como ejemplos de cánceres cuyo crecimiento, propagación y/o progresión puede reducirse o inhibirse por direccionamiento a mesotelina se incluye cáncer de ovario, mesotelioma, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de trompas de Falopio, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cuello uterino y cáncer pancreático. En otra realización preferida, el residuo de direccionamiento es un fragmento de anticuerpo, preferentemente un fragmento de anticuerpo que se une específicamente a un marcador de superficie en una célula. Un fragmento de anticuerpo preferido es un Fv monocatenario. En el presente documento se describe la construcción y caracterización de inmunotoxinas basadas en citotoxina, en las que la citotoxina se fusiona a un scFv (sc del inglés single chain que significa monocatenario). Otros fragmentos de anticuerpo preferidos con los que puede fusionarse una toxina o un fragmento citotóxico incluyen los fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, un anticuerpo estabilizado con hélice, un diacuerpo, un anticuerpo estabilizado con disulfuro y un anticuerpo de un solo dominio (por ejemplo, un anticuerpo de camélido). Los anticuerpos contra mesotelina incluyen SS1, SSP1, HN1, HN2, MN, K1 y variantes de los mismos. MORAb-009 (una versión humanizada de SS1) es un anticuerpo particularmente adecuado.
Se ha demostrado que el anticuerpo SS1P destruye específicamente líneas celulares que expresan mesotelina y produce regresiones de tumores que expresan mesotelina en ratones (Hassan, R. y col., Clin Cancer Res 8: 3520-6 (2002); Onda, M. y col., Cancer Res 61: 5070-7 (2001)). Basándose en estos estudios y en datos de seguridad apropiados, se están realizando 2 ensayos clínicos de fase I con SS1P en el Instituto Nacional del Cáncer en pacientes con cánceres que expresan mesotelina (Chowdhury, P. S. y col., Proc Natl Acad Sci USA 95: 669-74 (1998); Hassan, R y col., Proc Am Soc Clin Oncol 21: 29a (2002)).
Además, otras terapias dirigidas a la mesotelina están en desarrollo preclínico (Thomas, A. M. y col., J Exp Med 200: 297-306 (2004)). HN1 y HN2 son anticuerpos antimesotelina humanos, descritos, por ejemplo, en Feng y col., Mol Cancer Ther (2009) 8(5): 1113-8. Las inmunotoxinas de SS1P donde se han eliminado grupos de escisión para proteasas lisosómicas. Estas variantes se describen, por ejemplo, en Weldon, y col., Blood, (2009) 113(16): 3792800 y en el documento WO 2009/032954.
Las ITR de la divulgación incluyen, pero sin limitación, moléculas en las que hay un enlace covalente de una molécula de PE con un anticuerpo u otro agente de direccionamiento. La fusión de una citotoxina con un anticuerpo
o fragmento de anticuerpo se produce normalmente en un extremo C del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Dicha fusión se realiza normalmente empleando tecnologías de ADN recombinante. La elección de un agente de direccionamiento particular depende de la célula particular a la que se dirige. Los anticuerpos que dirigen la inmunotoxina pueden ser anticuerpos policlonales, monoclonales o recombinantes, tales como quimeras o fragmentos de región variable. Si el anticuerpo no es recombinante, la inmunotoxina debe formarse por conjugación química del anticuerpo con el residuo citotóxico. Si el anticuerpo se produce de manera recombinante, el anticuerpo puede unirse a la toxina a través de enlace químico o a través de fusión recombinante. En la fusión recombinante, el ADNc que codifica el anticuerpo se inserta, en fase, en un plásmido que ya contiene el ADNc que codifica la toxina.
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Por supuesto, puede realizarse a la inversa también; el ADNc de la toxina puede insertarse en un plásmido que lleva el ADNc que codifica el anticuerpo. Debido al posible gran tamaño de la inmunotoxina, a veces se desea unir solo un fragmento de un anticuerpo al residuo tóxico. Los fragmentos Fab, Fab’ y F(ab)2 se pueden crear a partir de anticuerpos policlonales, monoclonales y quiméricos y después unirse a la toxina a través de un enlace químico. Como alternativa, puede producirse un ADNc en el que las regiones variables de un anticuerpo están conectadas con regiones marco conservadas esenciales. Estos anticuerpos más pequeños se secretan después como anticuerpos Fv bicatenarios o, si las regiones de cadena pesada y ligera se unen, ya sea directamente o a través de un enlazador peptídico, como anticuerpos Fv monocatenarios (scFv). En la publicación de patente PCT n.º WO/2000/073346, publicada el 7 de diciembre de 2000, se desvelan anticuerpos y fragmentos de mesotelina particularmente preferidos, en los que se eliminan grupos de escisión para proteasas lisosómicas.
Un procedimiento para crear un scFv es a través de bibliotecas de presentación en fagos creadas a partir de ARNm esplénico de ratones inmunizados con un inmunógeno (Chowdhury y col., Mol. Immunol. 34: 9-20 (1997)). Sin embargo, si un inmunógeno proteico se encuentra de manera natural en mamíferos pero se expresa de manera recombinante en procariotas, la proteína no tendrá el patrón de glucosilación correcto y puede que no tenga la conformación correcta. Los anticuerpos desarrollados por el ratón en respuesta a este inmunógeno no pueden reconocer la proteína en su estado natural. Una solución a este problema es inmunizar a los animales con la proteína natural creada en células de mamífero, pero puede no ser posible la purificación de células de mamífero en cantidades suficientes de algunas proteínas, en particular proteínas de la superficie celular. Otra solución, aunque no tan común, es inmunizar a los animales con el ADNc que codifica al inmunógeno. El ADNc, bajo el control de un promotor apropiado, se introduce en el animal. Después de inyecciones de refuerzo y cuando el título de anticuerpos alcanza un máximo, los animales se sacrifican y se extirpan los bazos para crear la biblioteca de presentación en fagos. Inmunizando a los ratones con plásmidos que contienen el ADN que codifica la mesotelina, es posible suscitar altos títulos de anticuerpos antimesotelina. Utilizando el ARN esplénico y la tecnología de presentación en fagos, se puede aislar un Fv monocatenario ("scFv"), que denominamos SS scFv, que se une con alta afinidad a la mesotelina.
Los anticuerpos antimesotelina para su uso en la presente divulgación pueden unirse al FCS (sitio de escisión de furina) a través del extremo amino de FCS. De manera similar, el FCS puede unirse directamente a las regiones pesada, ligera, Fc (región constante) o marco conservadas del anticuerpo. La unión puede producirse a través del extremo amino o carboxilo del anticuerpo, o a través de un resto interior de aminoácido. Los anticuerpos que se utilizan en una composición de inmunoconjugado multivalente de la presente divulgación pueden dirigirse a los mismos, o a diferentes, epítopos de mesotelina.
En realizaciones preferidas de la presente divulgación, el anticuerpo antimesotelina es un anticuerpo recombinante tal como un scFv o un anticuerpo Fv estabilizado con disulfuro. Los anticuerpos Fv tienen aproximadamente 25 kDa y contienen un sitio de unión a antígeno completo con 3 CDR por cadena pesada y ligera. Si la cadena VH y la cadena VL se expresan de manera no contigua, las cadenas del anticuerpo Fv se sujetan normalmente entre sí por interacciones no covalentes. Sin embargo, estas cadenas tienden a disociarse tras la dilución, por lo que se han desarrollado procedimientos para reticular las cadenas a través de glutaraldehído, disulfuros intermoleculares, o un enlazador peptídico.
En una realización particularmente preferida, el anticuerpo es un Fv monocatenario (scFv). Las regiones VH y VL de un anticuerpo scFv comprenden una sola cadena que se pliega para crear un sitio de unión a antígeno similar al encontrado en anticuerpos bicatenarios. Una vez plegadas, las interacciones no covalentes estabilizan el anticuerpo monocatenario. En una realización más preferida, el scFv se produce de forma recombinante. Un experto se dará cuenta de que pueden crearse variantes conservativas de los anticuerpos de la presente divulgación. Dichas variantes conservativas empleadas en fragmentos scFv conservarán restos de aminoácidos críticos necesarios para plegar y estabilizar correctamente entre las regiones VH y VL. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el anticuerpo scFv está directamente unido al FCS a través de la cadena ligera.
Aunque las regiones VH y VL de algunas realizaciones de anticuerpos pueden unirse directamente entre sí, un experto apreciará que las regiones pueden separarse con un enlazador peptídico que consiste en uno o más aminoácidos. Los enlazadores peptídicos y su uso son muy conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Huston, y col., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 8: 5879 (1988); Bird, y col., Science 242: 4236 (1988); Glockshuber, y col., Biochemistry 29: 1362 (1990); patente de Estados Unidos n.º 4.946.778; la patente de Estados Unidos 5.132.405 y Stemmer y col., Biotechniques 14: 256-265 (1993).
Generalmente, el enlazador peptídico tendrá actividad biológica inespecífica aparte de unirse a las regiones o preservar alguna distancia mínima u otra relación espacial entre ellas. Sin embargo, pueden seleccionarse aminoácidos constituyentes del enlazador peptídico para ejercer influencia sobre alguna propiedad de la molécula tal como el plegamiento, la carga neta o la hidrofobicidad. Los anticuerpos Fv monocatenarios (scFv) incluyen opcionalmente un enlazador peptídico de no más de 50 aminoácidos, generalmente de no más de 40 aminoácidos, preferentemente de no más de 30 aminoácidos y más preferentemente de no más de 20 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, el enlazador peptídico es un concatámero de la secuencia Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 50), preferentemente 2, 3, 4, 5 o 6 de dichas secuencias. Sin embargo, debe apreciarse que se pueden hacer algunas sustituciones de aminoácidos dentro del enlazador. Por ejemplo, una valina puede sustituirse por una
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glicina.
Preferentemente, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera del anticuerpo mutado, teniendo el polipéptido una afinidad de unión al menos 5 veces más alta por un antígeno que un anticuerpo parental, teniendo el polipéptido una secuencia que difiere de la del anticuerpo parental mediante una sustitución de aminoácidos de al menos un aminoácido en una región determinante de complementariedad (CDR), estando el aminoácido codificado por un codón que comprende un nucleótido que pertenece a un motivo de punto caliente seleccionado de AGY o RGYW, en el que R es A o G, Y es C o T y W es A o T. La sustitución puede ocurrir en la CDR3 de una región variable de cadena ligera o pesada. La sustitución puede ocurrir en la CDR1 o CDR2 de una región variable de cadena ligera o pesada. En algunas realizaciones, el anticuerpo antimesotelina es un material de anticuerpo desvelado en la patente de Estados Unidos n.º 7.081.518 expedida el 25 de julio de 2006.
El anticuerpo antimesotelina puede comprender una cadena pesada variable ("VH") y una cadena ligera variable ("VL"), teniendo cada una de las cadenas VH y VL una primera, una segunda y una tercera región determinante de complementariedad ("CDR"), en la que la primera CDR ("CDR1"), la segunda CDR ("CDR2") y la tercera CDR ("CDR3"), respectivamente, de dicha cadena pesada, tiene la secuencia de restos de aminoácidos mostrada para la CDR1 (GYTMN; SEQ ID NO: 51), la CDR2 (LITPYNGASSYNQKFRG; SEQ ID NO: 52) y la CDR3 (GGYDGRGFDY; SEQ ID NO: 53) y en la que las CDR 1, 2 y 3 respectivamente, de dicha cadena VL, tiene la secuencia de restos de aminoácidos mostrada para la CDR1 (SASSSVSYMH; SEQ ID NO: 54), la CDR2 (DTSKLAS; SEQ ID NO: 55) y CDR3 (QQWSGYPLT; SEQ ID NO: 56). En algunas realizaciones, la CDR3 de la cadena ligera se modifica y tiene la secuencia QQWSKHPLT (SEQ ID NO: 57), QQWSGHPLT (SEQ ID NO: 58), QQWSAHPLT (SEQ ID NO: 59), QQWS-QIPLT (SEQ ID NO: 60), QQWGFNPLT (SEQ ID NO: 61), QQWGTNPLT (SEQ ID NO: 62), QQWGSHPLT (SEQ ID NO: 63), QQWGDFPLT (SEQ ID NO: 64), QQWGDHPLT (SEQ ID NO: 65), QQWSAHPLT (SEQ ID NO: 66)
o QQWS-GYPTT (SEQ ID NO: 67). En algunas realizaciones, la VH está conectada a la VL mediante un péptido enlazador, GVGGSG4SG4S (SEQ ID NO: 25). En algunas realizaciones adicionales, el anticuerpo antimesotelina es un scFv, dsFv, a Fab o un F(ab’)2. En algunas otras realizaciones adicionales, el anticuerpo antimesotelina a utilizar en la ITR comprende una sustitución de aminoácido de al menos un aminoácido en una CDR seleccionada del grupo que consiste en CDR1 VL, CDR2 VL, CDR1 VH y CDR2 VH, estando dicho aminoácido codificado por un codón que comprende un nucleótido que pertenece a un motivo de punto caliente seleccionado de AGY o RGYW, en el que R es A o G, Y es C o T y W es A o T.
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El anticuerpo está unido al FCS por un enlazador adicional que es preferentemente un enlace o un polipéptido de 1 a 10 aminoácidos contiguos de longitud. En algunas realizaciones, este enlazador tiene una longitud de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 aminoácidos. En algunas realizaciones preferidas, el enlazador consiste en restos de glicina y serina. En algunas realizaciones adicionales el enlazador es ASGG (SEQ ID NO: 19) o ASGGSGGG (SEQ ID NO: 68). En realizaciones preferidas, el enlazador forma una cadena polipeptídica continua que une directamente un extremo carboxilo del anticuerpo al extremo N del FCS.
E. El enlazador flexible
El enlazador flexible acopla directamente el FCS al dominio III funcional de PE. El enlazador flexible es un péptido continuo de fórmula (Xaa1)n en la que cada Xaa1 se selecciona independientemente de glicina y serina y n varía de 3 a 8. En realizaciones preferidas, n es 3. En una realización más preferida, el enlazador es GGS. En otras realizaciones, n es 4, 5, 6 o 7. En otras realizaciones, el enlazador flexible es GGGS (SEQ ID NO: 50), GGGSG (SEQ ID NO: 69), GGGGSG (SEQ ID NO: 70) o GGSGGS (SEQ ID NO: 18).
El enlazador flexible se fusiona en secuencia al extremo C del FCS y se fusiona directamente en secuencia al dominio funcional III de PE y, por consiguiente, forma una cadena peptídica continua con el FCS y el dominio III funcional.
Producción de inmunoconjugados
i. Procedimientos no recombinantes
En una realización no recombinante de la divulgación, una molécula de direccionamiento, tal como un anticuerpo, se une a una molécula de PE de la presente divulgación usando cualquier número de medios conocidos por los expertos en la técnica. Con las moléculas de PE de la presente divulgación pueden utilizarse medios de unión tanto covalentes como no covalentes.
El procedimiento para unir una molécula de PE con un anticuerpo o con otra molécula de direccionamiento ("TM", targeting molecule) variará de acuerdo con la estructura química de la TM. Los polipéptidos contienen normalmente una diversidad de grupos funcionales, por ejemplo, grupos de ácido carboxílico (COOH), amina libre (-NH2) o sulfhidrilo (-SH), que están disponibles para la reacción con un grupo funcional adecuado en un anticuerpo, por ejemplo, para dar como resultado la unión de la molécula de PE.
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Una vez que los ácidos nucleicos que codifican una PE, un anticuerpo, o un inmunoconjugado de la presente invención, se aíslan y clonan, se puede expresar la proteína deseada en una célula modificada por ingeniería genética de manera recombinante, tal como una célula de bacteria, planta, levadura, insecto y mamífero. Se espera que los expertos en la técnica sean conocedores de los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de proteínas, incluyendo E. coli, otros hospedadores bacterianos, células de levadura y diversas células eucariotas superiores, tales como las líneas de células COS, CHO, HeLa y de mieloma. No se intentará describir con detalle los diversos procedimientos conocidos para la expresión de proteínas en procariotas o eucariotas. En resumen, la expresión de ácidos nucleicos naturales o sintéticos que codifican las proteínas aisladas de la divulgación se realizará normalmente uniendo operativamente el ADN o el ADNc con un promotor (que es constitutivo o inducible), seguido de la incorporación en un casete de expresión. Los casetes pueden ser adecuados para la replicación e integración en procariotas o en eucariotas. Los casetes de expresión típicos contienen terminadores de la transcripción y de la traducción, secuencias iniciadoras y promotores útiles para la regulación de la expresión del ADN que codifica la proteína. Para obtener un alto nivel de expresión de un gen clonado, es deseable construir casetes de expresión que contengan, como mínimo, un promotor fuerte que dirija la transcripción, un sitio de unión a ribosoma para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción/traducción. Para E. coli esto incluye un promotor, tal como los promotores T7, trp, lac o lambda, un sitio de unión a ribosoma y preferentemente una señal de terminación de la transcripción. Para las células eucariotas, las secuencias de control pueden incluir un promotor y preferentemente un potenciador procedente de genes de inmunoglobulina, SV40, citomegalovirus y una secuencia de poliadenilación, y puede incluir secuencias donadoras y aceptoras de corte y empalme. Los casetes de la divulgación pueden transferirse al interior de la célula hospedadora seleccionada por procedimientos muy conocidos, tales como transformación con cloruro de calcio o electroporación para E. coli y tratamiento con fosfato de calcio, electroporación o lipofección para células de mamífero. Las células transformadas por los casetes pueden seleccionarse por resistencia a antibióticos conferida por genes contenidos en los casetes, tales como los genes amp, gpt, neo e hyg.
Un experto reconocerá que en un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente divulgación (es decir, una PE o un inmunoconjugado formado a partir de una PE de la divulgación) podrán realizarse modificaciones sin disminuir su actividad biológica. Para facilitar la clonación, la expresión o la incorporación de la molécula de direccionamiento en una proteína de fusión, pueden realizarse algunas modificaciones. Dichas modificaciones son muy conocidas por los expertos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, codones de terminación, una metionina añadida en el extremo amino para proporcionar un sitio de iniciación, aminoácidos adicionales colocados en cualquier extremo para crear sitios de restricción convenientemente localizados, o aminoácidos adicionales (tales como poli His) para ayudar en las etapas de purificación.
Además de con procedimientos recombinantes, los inmunoconjugados y las PE de la presente divulgación también pueden construirse en su totalidad o en parte utilizando síntesis peptídica convencional. La síntesis en fase sólida de los polipéptidos de la presente divulgación, de menos de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, puede realizarse uniendo el aminoácido C terminal de la secuencia a un soporte insoluble seguido de adición secuencial de los aminoácidos restantes en la secuencia. Se describen técnicas de síntesis en fase sólida en Barany & Merrifield, THE PEPTIDES: ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY. VOL. 2: SPECIAL METHODS IN PEPTIDE SYNTHESIS, PART A. págs. 3-284; Merrifield, y col. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963), y en Stewart, y col., SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2ª ED., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984). Las proteínas de mayor longitud pueden sintetizarse por condensación de los extremos amino y carboxilo de fragmentos más cortos. Los expertos en la técnica conocen procedimientos de formación de enlaces peptídicos por activación de un extremo terminal carboxilo (por ejemplo, utilizando el reactivo de acoplamiento N, N’-diciciclohexilcarbodiimida).
iii. Purificación
Una vez expresados, los inmunoconjugados recombinantes y las PE de la presente divulgación, pueden purificarse de acuerdo con procedimientos convencionales de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna y similar (véase, en general, R. Scopes, PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, N.Y. (1982)). Se prefieren composiciones sustancialmente puras de al menos una homogeneidad de aproximadamente 90 a 95%, prefiriéndose más las que tienen una homogeneidad de 98 a 95% o más, para los usos farmacéuticos. Una vez purificadas, parcialmente o, si se desea, hasta la homogeneidad, si van a utilizarse terapéuticamente, los polipéptidos deben carecer sustancialmente de endotoxina.
Se han descrito procedimientos para la expresión de anticuerpos monocatenarios y/o replegamiento en una forma activa apropiada, incluyendo anticuerpos monocatenarios, de bacterias tales como E. coli y se conocen bien y son aplicables a los anticuerpos de esta divulgación. Véase, Buchner, y col., Anal. Biochem. 205:263-270 (1992); Pluckthun, Biotechnology 9:545 (1991); Huse, y col., Science 246:1275 (1989) and Ward, y col., Nature 341:544 (1989).
A menudo, las proteínas heterólogas funcionales de E. coli, o de otras bacterias, se aíslan de cuerpos de inclusión y requieren solubilización utilizando desnaturalizantes fuertes y posterior replegamiento. Durante la etapa de solubilización, como se sabe bien en la técnica, debe haber un agente reductor para separar los enlaces disulfuro. Un tampón ejemplar con un agente reductor es: Tris 0,1 M pH 8, guanidina 6 M, EDTA 2mM, DTE (ditioeritritol) 0,3
M. La reoxidación de los enlaces disulfuro puede producirse en presencia de reactivos de tiol de bajo peso molecular
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Ensayo de filtración capilar en ratas
Para evaluar la toxicidad inespecífica de SS1-LR/GGS/8M, se utilizó un modelo de rata previamente descrito de síndrome de filtración capilar inducido por ITR (Siegall CB, y col., Proc Natl Acad Sci USA 1994; 91: 9514-8.). En resumen, ratas hembra nu/nu (atímicas) Wistar Furthand Rowett de seis a ocho semanas de vida (Harlan-Sprague-Dawley) recibieron una inyección intravenosa de D-PBS, SS1P (0,2 o 0,3 mg/kg) o SS1-LR/GGS/8M (6 o 12 mg/kg). Después de 24 horas, las ratas se sacrificaron mediante exposición a CO2. Se recogió fluido hidrotorácico de los animales sacrificados colocando el cuerpo posición recostada dorsal, retirando la pared torácica ventral y aspirando el fluido utilizando una jeringa de 3 ml y una aguja de calibre 27,5. Los pulmones de diversas ratas se extirparon, se fijaron durante 3 días en formalina al 10 %, se seccionaron y se tiñeron.
Se realizaron ensayos de internalización de ITR esencialmente como se ha descrito anteriormente, analizándose las muestras mediante transferencia de western no reductora utilizando un anticuerpo policlonal anti-PE38 de conejo.
Ensayo de antigenicidad.
La unión de SS1P o SS1-LR/GGS/8M a anticuerpos en los sueros de los pacientes se analizó esencialmente como se describe (Onda M, y col., Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108: 5742-7), excepto que para la detección de anticuerpos específicos de PE por ELISA, se utilizaron CD22-rFc y HA22.
Resultados
Actividad de SS1-LR in vitro.
La inmunotoxina SS1P (Fig. 1) es el Fv de SS1 antimesotelina de dos cadenas estabilizado con disulfuro unido a PE38. Se introdujo la mutación LR ((Weldon JE, y col. Blood 2009; 113: 3792-800); PE Δ251-273 y Δ285-394) en SS1P para crear SS1-LR y se evaluó su actividad en siete líneas celulares que expresaban mesotelina in vitro. La Tabla 2 resume datos de al menos 3 experimentos de citotoxicidad distintos como los valores CE50 promedio y error típico de la media. En comparación con SS1P, SS1-LR era más activa en la línea celular HAY, pero menos activa en el resto de las líneas. La actividad de SS1-LR varió en gran medida entre las diferentes líneas celulares, pero era menos activa en las líneas de cáncer de ovario.
Tabla 2
CE50 ± ETM (ng/ml)
Línea celular
Cáncer de origen SS1P SS1-LR SS1-LR/GGS SS1-LR/GGS/8M SS1-LR/GGS R279G
HAY
Mesotelioma 2,24 ± 0,21 0,52 ± 0,07 0,10 ± 0,04 0,22 ± 0,02 >1000
M30
Mesotelioma 0,57 ± 0,07 3,70 ± 0,85 0,93 ± 0,18 1,46 ± 0,20 >1000
NCI-H322M
Adenocarcinoma pulmonar 0,30 ± 0,07 1,65 ± 0,23 0,18 ± 0,05 0,42 ± 0,09 >1000
L55
Adenocarcinoma pulmonar 2,89 ± 0,43 6,67 ± 1,27 1,08 ± 0,17 1,73 ± 0,31 >1000
OVCAR-8
Carcinoma de ovario 0,84 ± 0,21 49,1 ± 37,9 2,84 ± 1,43 14,4 ± 8,78 >1000
A1847
Carcinoma de ovario 1,01 ± 0,21 27,0 ± 8,70 2,73 ± 0,79 17,7 ± 7,13 >1000
A431/K5
Carcinoma epidermoide 0,044 ± 0,005 0,561 ± 0,198 0,199 ± 0,033 0,194 ± 0,038 15,12 ± 3,625
SS1-LR/GGS/8M
La inmunogenicidad sigue siendo un problema significativo para las ITR basadas en PE (Weldon JE, y col., FEBS J. 2011 Dec; 278(23): 4683-700). Aunque trabajos que comparan HA22-LR con HA22 (Hansen JK, y col., J Immunother 2010; 33: 297-304)) nos conducen a anticipar que SS1-LR será menos inmunogénica que SS1P, los elementos restantes de PE sin embargo no suscitarán rápidamente anticuerpos neutralizantes. Para retirar epítopos de linfocitos B inmunogénicos en PE, se diseñó una serie de ocho mutaciones puntuales en el dominio III recientemente (Onda M, y col., Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108: 5742-7.). Estas mutaciones (D406A, R432G, R467A, R490A, R513A, E548S, Q592A y K590S) reducen drásticamente la inmunogenicidad de HA22-LR en ratones, pero no disminuyen enormemente su citotoxicidad. Se incorporaron las mutaciones en SS1-LR/GGS,
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