ES2410783T3 - Exotoxinas de pseudomonas mutadas con antigenicidad reducida - Google Patents

Abstract

Una exotoxina A de Pseudomonas ("PE") aislada, en que dicha PE tiene una sustitución con alanina,glicina, serina o glutamina en lugar del resto aminoacídico R513, en que el resto aminoacídico R513 se define enreferencia a la secuencia de aminoácidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1).

Description

Exotoxinas de pseudomonas mutadas con antigenicidad reducida 5 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0001] Los inmunoconjugados se han desarrollado en los ultimos aros como un enfoque terapeutico alternativo para el tratamiento del cancer. Originalmente, los inmunoconjugados estaban compuestos de un anticuerpo conjugado quimicamente con una toxina vegetal o bacteriana, una forma conocida como inmunotoxina. El

10 anticuerpo se une al antigeno expresado en la celula diana y la toxina se interioriza y causa la muerte celular al detener la sintesis de proteinas e inducir la apoptosis (Brinkmann, U., Mol. Med. Today 2: 439-446 (1996)). Mas recientemente, se han fusionado los genes que codifican el anticuerpo y la toxina y la inmunotoxina se expresa como una proteina de fusion.

15 [0002] Se han realizado numerosos estudios sobre inmunotoxinas que usan como fraccion toxica una toxina bacteriana conocida como la exotoxina A de Pseudomonas ("PE"). Tipicamente, la PE se ha truncado o mutado para reducir su toxicidad inespecifica sin destruir su toxicidad para las celulas a las que reconoce como diana por medio de la porcion de reconocimiento de la inmunotoxina. Actualmente hay estudios clinicos en curso que evaluan el uso de las inmunotoxinas a base de PE como tratamientos para diversos tipos de cancer.

20 [0003] Las inmunotoxinas a base de PE actuales son muy inmunogenas. Esto no ha resultado ser un problema en el tratamiento de canceres hematologicos, en los que la capacidad del sistema inmunitario de desencadenar una respuesta esta frecuentemente alterada. Tipicamente, las inmunotoxinas pueden administrarse varias veces a los pacientes con canceres hematologicos. Sin embargo, los pacientes con tumores solidos

25 desarrollan normalmente anticuerpos neutralizantes contra las inmunotoxinas a base de PE en el espacio de semanas despues de la primera administracion. Dado que muchos protocolos proponen un periodo de tres semanas entre la administracion de las inmunotoxinas, el desarrollo de los anticuerpos durante este periodo significa efectivamente que, para tumores solidos, normalmente solo puede realizarse una administracion de una inmunotoxina a base de PE antes de que los anticuerpos del paciente la hagan inefectiva. Incluso una unica

30 administracion de una inmunotoxina a base de PE puede ser de gran utilidad para reducir la carga tumoral del paciente, eliminar pequeras metastasis y aliviar los sintomas. No obstante, seria deseable disponer de formas menos antigenicas de las inmunotoxinas a base de PE que reducirian las respuestas inmunogenas de los pacientes. [0004] El documento US2002119492 se refiere al uso de diversos procedimientos computacionales para

35 modular la inmunogenicidad de proteinas mediante la identificacion y subsiguiente alteracion de secuencias aminoacidicas potenciales que provocan una respuesta inmunitaria en un organismo hospedador. [0005] El documento WO02069886 se refiere a procedimientos para reducir la antigenicidad de un compuesto proteinico mientras se mantiene la actividad biologica del compuesto, asi como a composiciones proteinicas con

40 actividad biologica, pero con antigenicidad reducida. [0006] La publicacion de Roscoe y col., European Journal of Immunology, vol. 27, n° 6, junio de 1997 (199706), paginas 1459-1468, se refiere a la identificacion de epitopos en una forma mutante de la exotoxina de Pseudomonas mediante el uso de suero de humanos tratados con inmunotoxinas que contenian la exotoxina de

45 Pseudomonas. [0007] La publicacion de Roscoe y col., Infection and Immunity, vol. 62, n° 11, noviembre de 1994 (1994-11), paginas 5055-5065, se refiere a una respuesta de anticuerpos de primate a una inmunotoxina: un analisis serologico y por ordenador de epitopos en una forma truncada de la exotoxina de Pseudomonas.

50 [0008] La publicacion de Frankel y col., Clinical Cancer Research, vol. 10, n° 11, 1 de enero de 2004 (200401-01), paginas 13-15, se refiere a la reduccion de la respuesta inmunitaria a una inmunotoxina. [0009] La publicacion de Cunningham y col., Science, vol. 244, n° 4908, 2 de junio de 1989 (1989-06-02),

55 paginas 1081-1085, se refiere al mapeo epitopico de alta resolucion de las interacciones del receptor de hGH por mutagenesis de barrido con alanina.

[0010] La publicacion de Masanori y col., Journal of Immunology, vol. 177, n° 12, diciembre de 2006 (200612), paginas 8822-8834, se refiere a la caracterizacion de los epitopos de las celulas B asociados con una forma truncada de la exotoxina de Pseudomonas (PE38) usada para preparar inmunotoxinas para el tratamiento de pacientes de cancer.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

5 [0011] La presente invencion proporciona una exotoxina A de Pseudomonas ("PE") aislada, en que dicha PE tiene una sustitucion con alanina, glicina, serina o glutamina en lugar del resto aminoacidico R513, en que el resto aminoacidico R513 se define en referencia a la secuencia de aminoacidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1).

10 [0012] En una realizacion, dicha PE tiene ademas una sustitucion con alanina, valina, glicina, leucina, isoleucina o glutamina en lugar de la arginina en el resto 490, en que dicha numeracion de aminoacidos se define en referencia a la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:1. El sustituto de dicho resto aminoacidico 490 de SEQ ID NO:1 puede ser alanina.

15 [0013] La PE puede seleccionarse del grupo que consta de PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR.

[0014] La PE puede comprender ademas una o mas de las sustituciones R313A, Q332S, R432G, R467A, R490A, E548S y K590S. Un ejemplo de dicha PE es aquella con las sustituciones R313A, Q332S, R432G, R467A,

20 R490A, R513A, E548S y K590S.

[0015] En otra realizacion, la invencion proporciona una molecula quimerica que comprende (a) una fraccion de reconocimiento conjugada o fusionada con (b) una exotoxina A de Pseudomonas ("PE"), en que dicha PE tiene una sustitucion con alanina, glicina, serina o glutamina en lugar del resto aminoacidico R513, en que el resto

25 aminoacidico R513 se define en referencia a la secuencia de aminoacidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1).

[0016] La molecula quimerica puede comprender una PE tal como se define anteriormente.

[0017] La fraccion de reconocimiento de la molecula quimerica puede ser un anticuerpo, por ejemplo, 30 seleccionado del grupo que consta de un scFv, un dsFv, un Fab y un F(ab')2.

[0018] En una alternativa, la fraccion de reconocimiento de la molecula quimerica puede ser una citocina.

[0019] La invencion proporciona ademas una composicion que comprende (a) una molecula quimerica tal 35 como se describe anteriormente y (b) un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

[0020] En otro aspecto, la invencion proporciona un acido nucleico aislado que codifica una exotoxina A de Pseudomonas ("PE") modificada tal como se define anteriormente y que opcionalmente codifica ademas una fraccion de reconocimiento, como una fraccion de reconocimiento tal como se define anteriormente.

40 [0021] Opcionalmente, el acido nucleico aislado de la invencion puede estar ligado operativamente a un promotor.

[0022] En otro aspecto, se proporciona un procedimiento in vitro para inhibir el crecimiento de una celula que

45 porta una molecula diana, en que dicho procedimiento comprende la puesta en contacto de dicha celula con una molecula quimerica de la invencion, en que la puesta en contacto de dicha celula con dicha molecula quimerica inhibe el crecimiento de dicha celula.

[0023] La invencion proporciona ademas una molecula quimerica de acuerdo con la invencion para el uso en

50 un procedimiento de tratamiento, en que dicho tratamiento es destruir las celulas reconocidas como diana por dicha molecula. En algunas realizaciones, la molecula diana es un receptor de citocina y dicha fraccion de reconocimiento es una citocina que se une a dicho receptor. En algunas realizaciones, la molecula diana es un receptor de IL-13 y dicha molecula de reconocimiento es una IL-13, una IL-13 mutada o una IL-13 permutada circularmente. En algunas realizaciones, la molecula diana es un antigeno y dicha molecula de reconocimiento es un anticuerpo que se une

55 especificamente a dicho antigeno. En algunas realizaciones, el antigeno es un antigeno de cancer.

[0024] La invencion proporciona tambien una composicion farmaceutica que comprende la PE de la invencion tal como se describe anteriormente o la molecula quimerica de la invencion tal como se describe anteriormente, junto con un vehiculo farmaceuticamente aceptable, para el uso en un procedimiento de tratamiento.

[0025] En este documento tambien se describen a continuacion PE aisladas que tienen una sustitucion con alanina, glicina, serina o glutamina en lugar de un resto aminoacidico que corresponde a un resto aminoacidico de SEQ ID NO:1 seleccionado del grupo que consta de E282, E285, P290, R313, N314, P319, D324, E327, E331, 5 Q332, D4Q3, R412, R427, E431, R432, R458, D461, R467, R505, R513, E522, R538, E548, R551, R576, K590 y L597, siempre que cuando el resto que se sustituye es Q332, el resto sustituto no es glutamina. En algunas realizaciones, la PE tiene una sustitucion con alanina, glicina, serina o glutamina en lugar de un resto aminoacidico que corresponde a un resto aminoacidico de SEQ ID NO:1 seleccionado del grupo que consta de P290, R313, N314, D324, E327, E331, Q332, D403, E431, R432, R458, R467, R505, R513, R538, E548, R576, K590 y L597. En 10 algunas realizaciones, la PE tiene una sustitucion con alanina, glicina, serina o glutamina en lugar de un resto aminoacidico que corresponde a un resto aminoacidico de SEQ ID NO:1 seleccionado del grupo que consta de R313, N314, D324, E327, E331, Q332, R432, R467, R538 y K590. En algunas realizaciones, se sustituyen dos o mas de dichos restos aminoacidicos que corresponden a restos aminoacidicos de SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, la PE tiene ademas una sustitucion con alanina, valina, glicina, leucina, isoleucina o glutamina en la 15 posicion correspondiente al resto aminoacidico 490 de SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, alanina es el sustituto de dicho resto aminoacidico 490 de SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, la PE se selecciona del grupo que consta de PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR. Tambien se describen aquellas PE que comprenden mutaciones de alanina, valina, glicina, leucina o isoleucina en los restos correspondientes a los restos aminoacidicos Q332, R490, R467 y K590 de SEQ ID NO:1. Una PE tal puede comprender ademas una mutacion de

20 alanina, valina, glicina, leucina, isoleucina o glutamina en un resto aminoacidico que corresponde al resto aminoacidico R313 de SEQ ID NO:1. La PE puede comprender ademas una sustitucion de un resto aminoacidico que corresponde al resto aminoacidico R432 de SEQ ID NO:1. La PE puede comprender ademas una sustitucion de un resto aminoacidico que corresponde al resto aminoacidico R513 de SEQ ID NO:1.

25 [0026] En este documento se desvelan tambien moleculas quimericas que comprenden (a) una fraccion de reconocimiento conjugada o fusionada con (b) tales PE tambien descritas. A continuacion tambien se exponen composiciones que comprenden las moleculas quimericas desveladas anteriormente y un vehiculo farmaceuticamente aceptable, asi como acidos nucleicos que codifican tales PE, asi como el uso de tales PE en procedimientos para la inhibicion del crecimiento de una celula que porta una molecula diana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0027] La figura 1 muestra datos representativos de respuestas de anticuerpos en pacientes tratados con tres inmunotoxinas diferentes, BL22, SS1P y LMB9. Cada una de las inmunotoxinas contiene una porcion de anticuerpo 35 que es diferente para cada inmunotoxina; todas usan PE38 como fraccion toxica. Se recogieron muestras de suero de los pacientes y se evaluo su actividad neutralizante en un ensayo de muerte celular (graficos de barras) y su reactividad con inmunotoxinas en diferentes ensayos ELISA (graficos de lineas). La inmunotoxina con la que se trato al paciente y, en la mayoria de los casos, el cancer padecido por el paciente se indican en la parte superior de cada panel. El numero de ciclos de tratamiento recibidos por el paciente antes de la recogida de suero y los dias despues

40 del ultimo tratamiento se muestran en los paneles de graficos de lineas. Los graficos de lineas muestran los anticuerpos en las muestras de suero determinados mediante dos ensayos ELISA diferentes. El ensayo ICC-ELISA puede medir los anticuerpos que reaccionan con la PE nativa.

[0028] Figura 2. La figura 2 muestra los resultados del mapeo de epitopos topograficos basado en la

45 competencia mutua de todos los pares posibles de los anticuerpos producidos en el transcurso de los estudios descritos en este documento. Cuanto mas oscura es la sombra, mas fuerte es la competencia. Por lo tanto, una sombra muy oscura indica una competencia muy fuerte, mientras que sombreados muy ligeros indican que no hay competencia.

50 [0029] Figura 3. La figura 3 es un sensograma Biacore que muestra la union aditiva de anticuerpos monoclonales ("MAb") asignados a distintos grupos epitopicos.

[0030] Figura 4. La figura 4 es una tabla que muestra el efecto de 45 mutaciones puntuales diferentes en la PE. El eje Y lista los epitopos y subepitopos de la PE, con excepcion del subepitopo 2a. La columna siguiente en el

55 eje Y proporciona el numero de un anticuerpo para el que, en los estudios de competencia, se encontro que se unia al epitopo o subepitopo indicado. La fila en la parte superior del eje X muestra cada mutacion. "WT" representa el tipo natural ("wild type") y se refiere a la PE38 sin mutaciones. En el extremo derecho, bajo la palabra Dominios se observan los dominios II y III. PE38 no contiene el dominio I de la PE.

[0031] Figura 5. La figura 5 muestra que la CI50 para una inmunotoxina en la que la fraccion toxica es una PE mutante en la que se han llevado a cabo siete mutaciones (denominada mutante "7X") para destruir epitopos concretos y la CI50 para la misma inmunotoxina en la que la fraccion toxica es el mutante 7X con una mutacion adicional (denominada mutante "8X") estan proximas a la CI50 de la inmunotoxina de partida HA22.

5 [0032] Figura 6. La figura 6 muestra los resultados de un estudio in vivo de xenoinjerto de tumores humanos en ratones scid. "CA46" es un linfoma que crece subcutaneamente como tumor solido en ratones. Las celulas tumorales se introdujeron en los ratones en el dia 0 y a los ratones se les administro la inmunotoxina en los dias 8, 10 y 12, como indican las flechas en el eje X. El tamaro de los tumores se muestra en el eje Y. Leyenda: los

10 cuadrados representan el control (vehiculo). Los rombos representan la inmunotoxina HA22, una inmunotoxina dirigida contra CD22 que usa PE38 como fraccion toxica. Triangulos: HA22-8M. HA22-8M es la inmunotoxina HA22 en la que se han llevado a cabo ocho mutaciones en la molecula de PE38 para reducir la inmunogenicidad. Las ocho mutaciones son R313A, Q332S, R432G, R467A, R490A, R513A, E548S y K590S, en que los numeros designan el resto en esa posicion en SEQ ID NO:1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

INTRODUCCIÓN

20 [0033] Durante mas de quince aros se ha investigado la exotoxina A de Pseudomonas ("PE") para su uso como la porcion toxica de moleculas quimericas como las inmunotoxinas. Este trabajo se plasma en el desarrollo de una serie de formas mutadas de la PE en las que se ha mantenido la actividad citotoxica, mientras que se ha reducido o eliminado la toxicidad inespecifica de la molecula. La mayoria de estos mutantes se ha truncado para mejorar su penetracion en los tumores. Algunos tambien han sufrido modificaciones adicionales al truncamiento,

25 como la modificacion de los restos del extremo carboxilo o la eliminacion del requerimiento de escision entre los restos 279 y 280 por la proteasa furina para aumentar su citotoxicidad. Las inmunotoxinas que usan formas mutadas de la PE han demostrado ser considerablemente prometedoras en estudios clinicos en humanos.

[0034] Sin embargo, el uso de inmunotoxinas a base de PE para el tratamiento de tumores solidos en

30 particular se ha visto limitado por el desarrollo de anticuerpos neutralizantes de la inmunotoxina despues de la primera administracion. Estos anticuerpos se desarrollan antes de que muchos protocolos recomienden una segunda administracion de la inmunotoxina y, por lo tanto, hacen que el uso posterior de las inmunotoxinas sea ineficaz contra tumores solidos en los pacientes previamente expuestos.

35 [0035] Los estudios en que se basa la presente invencion desvelan que la respuesta inmunitaria predominante de los pacientes a las inmunotoxinas a base de PE corresponde a la porcion de PE de la inmunotoxina. Este conocimiento indica que la reduccion de la antigenicidad de las moleculas de PE usadas para las inmunotoxinas reduciria la antigenicidad global de la inmunotoxina y aumentaria su utilidad. Los estudios en que se basa la presente invencion desvelan ademas que la PE tiene siete epitopos principales que pueden dividirse adicionalmente

40 en un total de trece subepitopos.

[0036] Sorprendentemente, se ha descubierto que para diez de los trece subepitopos de la PE, la antigenicidad del epitopo o subepitopo puede reducirse o eliminarse mediante la mutacion de un solo resto aminoacidico de la PE. Por supuesto, dado que la PE contiene multiples epitopos antigenicos, ninguna mutacion

45 unica elimina la antigenicidad de toda la molecula de PE. Sin embargo, cada mutacion individual de la presente invencion reduce la antigenicidad de un epitopo o subepitopo individual. Por lo tanto, las mutaciones individuales reducen la antigenicidad de la molecula PE global y de cualquier inmunotoxina preparada con la PE mutada.

[0037] Los estudios en que se basa la invencion han demostrado ademas que es posible combinar varias de

50 las mutaciones para reducir la antigenicidad global de la molecula mientras se retiene la citotoxicidad de la molecula de PE. Se prepararon moleculas de PE en las que se mutaron tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho restos de distintos epitopos o subepitopos. Las PE con las mutaciones se transformaron en inmunotoxinas y se ensayo su citotoxicidad. Para facilitar la comparacion, las PE se convirtieron en inmunotoxinas cada una de las cuales usaba la misma fraccion de reconocimiento (un anticuerpo de gran afinidad dirigido contra CD22). Ademas, para facilitar la

55 comparacion, se uso la forma PE38 de la PE como la PE en la que se realizaron las sustituciones. Considerando nuestra experiencia con numerosas inmunotoxinas a base de PE en los ultimos quince aros, el hecho de que todas las formas citotoxicas de la PE presentan el mismo mecanismo de citotoxicidad para las celulas diana (ADPribosilacion del factor de elongacion 2) y el hecho de que las otras variantes de la PE en uso son simplemente la misma secuencia de aminoacidos con truncamientos concretos (o, en el caso de PE4E, cuatro mutaciones en el dominio Ia, mas que un truncamiento), se espera que los resultados obtenidos con PE38 sean directamente aplicables a otras formas de la PE (como las formas de ejemplo conocidas respectivamente como PE40, PE38, PE37, PE35, PE4E, PE38QQR y PE38KDEL, descritas con mas detalle a continuacion).

5 [0038] Se espera que, como inmunotoxinas, las PE ya preparadas y otras modificadas de acuerdo con lo expuesto en la presente invencion, al convertirlas en inmunotoxinas provoquen una menor respuesta inmunitaria in vivo y que esta respuesta inmunitaria disminuida se refleje en menores titulos de anticuerpos neutralizantes. El desarrollo de anticuerpos neutralizantes se analiza rutinariamente en la evaluacion preclinica de las inmunotoxinas y en los protocolos de estudios clinicos de las inmunotoxinas y los titulos de los anticuerpos inducidos por las

10 inmunotoxinas preparadas con las PE de la invencion pueden medirse mediante estos ensayos estandar.

[0039] Los expertos apreciaran que las PE de la invencion seran tan utiles como las PE mutadas conocidas con anterioridad que se han convertido en inmunotoxinas y evaluado en estudios clinicos. Sin embargo, tal como se serala, se espera que las inmunotoxinas preparadas con las PE de la invencion manifiesten menos antigenicidad

15 que las inmunotoxinas preparadas con las moleculas de PE disponibles actualmente y, por lo tanto, provoquen una respuesta inmunitaria menor en los pacientes que las inmunotoxinas a base de las PE disponibles actualmente.

[0040] Las mutaciones de la presente invencion pueden incorporarse facilmente en PE ya modificadas (como las formas de ejemplo conocidas respectivamente como PE40, PE38, PE37, PE35, PE4E, PE38QQR y PE38KDEL,

20 descritas con mas detalle a continuacion) para reducir su antigenicidad y, por lo tanto, reducir las respuestas inmunogenas de los pacientes a las inmunotoxinas que las contienen. Por consiguiente, la invencion proporciona una nueva e importante manera de aumentar la utilidad terapeutica de los inmunoconjugados a base de PE, como las diversas inmunotoxinas a base de PE actualmente en estudios clinicos.

25 [0041] Tal como se serala, las PE mejoradas de la invencion comprenden mutaciones de la molecula en posiciones especificas de la molecula de PE. Por convencion, las posiciones en la PE y sus variantes se designan en la tecnica en referencia a la posicion correspondiente en la secuencia de 613 aminoacidos de la molecula de PE nativa (SEQ ID NO:1). En este documento se sigue esta convencion para permitir una facil comparacion entre las variantes de la PE y para la comprension de que restos estan mutados en las PE de la invencion. Por ejemplo, tal

30 como se discute con mas detalle a continuacion, en la mayoria de las formas de utilidad clinica de la PE se ha eliminado el dominio Ia de la molecula (aminoacidos 1-252) para reducir la union inespecifica. Una PE sin el dominio Ia tiene solo 361 restos. Sin embargo, una referencia en este documento a Q332 se refiere a la glutamina que se encuentra en la posicion 332 de la secuencia de la PE nativa, independientemente del numero de este resto si se cuenta desde el extremo amino de la PE concreta en la que se encuentra, mientras que R590 se refiere a la lisina

35 que se encuentra en la posicion 590 de la PE nativa y asi sucesivamente. La secuencia de aminoacidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1) es bien conocida en la tecnica y se expone, por ejemplo, en la patente de los EE. UU. n°

5.602.095.

[0042] Tal como se indica a continuacion en las realizaciones preferidas, en las composiciones y

40 procedimientos de la invencion, el resto aminoacidico presente en la secuencia nativa de la PE en las posiciones identificadas en este documento se sustituye por un aminoacido seleccionado del grupo formado por alanina, glicina, serina o glutamina. Alanina, glicina y serina se prefieren especialmente como restos sustitutos, mientras que alanina y serina se prefieren especialmente.

45 [0043] Para ser de utilidad, la PE debe retener actividad citotoxica despues de la sustitucion de los restos. Con el fin de evaluar la retencion de citotoxicidad por las PE alteradas para reducir su antigenicidad, se han preparado una serie de inmunotoxinas de ejemplo. En una primera serie de estudios, se prepararon 19 inmunotoxinas. Para permitir la comparacion, todas estas inmunotoxinas usaban la misma fraccion de reconocimiento y todas partian de la misma forma truncada de la PE conocida como PE38. En cada una de las 19

50 inmunotoxinas se sustituyo un resto diferente de PE38 por una mutacion identificada como reductora de la antigenicidad de un epitopo o subepitopo concreto de la PE. Despues se comparo la actividad citotoxica de cada una de estas 19 PE38 mutadas con la de una inmunotoxina preparada con la misma fraccion de reconocimiento y con una PE38 inalterada (que, por conveniencia, se llamara la inmunotoxina "natural").

55 [0044] Tal como se muestra en la tabla 3 a continuacion, los ensayos de citotoxicidad de las inmunotoxinas demostraron que doce de las inmunotoxinas experimentales de ejemplo mostraban en realidad una mayor citotoxicidad que la inmunotoxina preparada con la secuencia de PE38 natural, mientras que dos tenian aproximadamente la toxicidad de la inmunotoxina natural. Notablemente, varias de las inmunotoxinas preparadas con las PE experimentales de ejemplo mostraron en realidad una citotoxicidad superior en el 50% o mas que la de la inmunotoxina preparada con la secuencia de PE38 natural. Por lo tanto, esta serie de estudios no solo demuestra que fue posible realizar una serie de mutaciones de la invencion sin ninguna perdida de citotoxicidad para la inmunotoxina resultante, sino que varias de ellas produjeron en realidad un aumento.

5 [0045] Cinco de las inmunotoxinas en los estudios iniciales mostraron menos citotoxicidad que la inmunotoxina preparada con la secuencia de PE38 usada normalmente en la tecnica, pero todavia retuvieron una actividad citotoxica considerable. Mientras que normalmente se prefiere mas citotoxicidad a menos, en la practica, se espera que la reducida citotoxicidad de estas formas mutadas de la PE quede compensada, al menos en cierta medida, por la reducida antigenicidad de las inmunotoxinas preparadas con ellas. Por lo tanto, incluso estas PE con

10 citotoxicidad reducida pueden ser utiles para algunas aplicaciones. Ademas, acoplada con una mutacion de la PE que muestre un aumento de citotoxicidad al convertirla en inmunotoxina, la citotoxicidad de la PE puede aproximarse a la de la PE natural. Y, dado que la PE es una citotoxina muy potente, incluso formas mutadas de la PE con toxicidad considerablemente reducida respecto a la de la toxina nativa retienen un poder considerable como fracciones toxicas.

15 [0046] Los estudios en que se basa la invencion desvelaron aminoacidos cuya sustitucion disminuyo al menos cinco veces, con mayor preferencia al menos diez veces y, con la mayor preferencia, al menos 20 veces, la union de mas de dos anticuerpos monoclonales (MAb) asignados al mismo epitopo. Se espera que la reduccion de la union de los MAb al epitopo se correlacione con una perdida de antigenicidad del epitopo y, por lo tanto, de las moleculas

20 de PE que contengan la mutacion.

[0047] Las posiciones de la PE en las que se encontro que las mutaciones reducian al menos cinco veces la union de varios MAb al mismo epitopo fueron E282, E285, P290, R313, N314, P319, D324, E327, E331, Q332, D403, R412, R427, E431, R432, R458, D461, R467, R490, R505, R513, E522, R538, E548, R551, R576, K590 y

25 L597. Las posiciones de la PE en las que se encontro que las mutaciones reducian al menos diez veces la union de varios MAb al mismo epitopo fueron E282, E285, P290, R313, N314, D324, E327, E331, Q332, D403, R412, E431, R427, R432, R458, D461, R467, R490, R505, R513, E522, R538, E548, R576 y R590. Las posiciones de la PE en las que se encontro que las mutaciones reducian al menos 20 veces la union de varios MAb al mismo epitopo fueron N314, D324, E327, E331, Q332, D403, R432, R467, R490, R505, R513, R538, Ras51, K590 y L597.

30 [0048] Todas estas mutaciones reducen la union de los MAb a un epitopo o subepitopo concreto de la PE, tal como puede determinarse en referencia a la figura 4. Se espera que la combinacion de la sustitucion de una cualquiera de estas mutaciones (que puede denominarse convenientemente como mutacion "A") con una mutacion de uno o mas restos que reduzca la union a uno de los epitopos o subepitopos de la PE distinto del epitopo o

35 subepitopo para el que la mutacion A reduce la union, reduzca adicionalmente la antigenicidad de la molecula y el desarrollo de anticuerpos dirigidos contra la porcion de la PE de una inmunotoxina preparada con la PE resultante. A la inversa, tipicamente no es necesaria la mutacion de mas de un resto de los que la figura 4 muestra que eliminan la antigenicidad de un epitopo completo. Donde la figura 4 muestra que no existe una mutacion unica que elimine la union de todos los anticuerpos a un epitopo, puede ser deseable combinar mutaciones para eliminar la union a ese

40 epitopo. Por ejemplo, para eliminar toda union al epitopo 6a, puede ser deseable combinar en una sola PE de la invencion E548A y R513A y, para reducir la union al epitopo 6b, combinar ademas con estas mutaciones la mutacion R576A.

[0049] En estudios previos del laboratorio de los presentes inventores, descritos en la solicitud PCT

45 PCT/US2004/039617 (publicacion internacional WO 2005/052006), se descubrio que la mutacion del resto R490 de la PE a alanina duplicaba la citotoxicidad de la molecula de PE resultante al usarla como la fraccion de toxina de una inmunotoxina. Sorprendentemente, los estudios en los que se basa la presente invencion demuestran que la mutacion de la arginina en la posicion 490 de la PE elimina tambien la union de anticuerpos al epitopo 5 de la PE. Por lo tanto, se espera que la sustitucion de la arginina en la posicion 490 de la PE con uno de los restos discutidos

50 anteriormente disminuya la antigenicidad de la molecula de PE. Se espera ademas que la combinacion de la sustitucion de la arginina en la posicion 490 de la PE con una sustitucion de uno o mas restos que reduzca la union a uno de los epitopos o subepitopos de la PE distintos del epitopo 5, reduzca adicionalmente la antigenicidad de la molecula y el desarrollo de anticuerpos dirigidos contra la porcion de la PE de una inmunotoxina preparada con la PE resultante. Se serala que no se encontraron mutaciones que redujeran la union al subepitopo 2a; por

55 consiguiente, este subepitopo no se muestra en la figura 4.

[0050] El documento WO 2005/052006 indica ademas que la arginina en la posicion 490 de la PE puede mutarse a glicina, alanina, valina, leucina o isoleucina. El aumento de la actividad citotoxica y la disminucion de la inmunogenicidad son fenomenos independientes. Por lo tanto, no de todas las mutaciones de las que se espera que resulten en un aumento de la actividad citotoxica se espera que resulten tambien en la disminucion de inmunogenicidad. Las mutaciones que consiguen ambos efectos, como las mutaciones de R490 a glicina o, con mayor preferencia, a alanina, son especialmente deseables.

5 [0051] Sorprendentemente, se ha descubierto ahora que es posible mutar algunos otros restos que tambien resultan en moleculas de PE que pueden convertirse en inmunotoxinas con una citotoxicidad al menos igual y en algunos casos significativamente superior a la de PE38. Tal como se muestra en la tabla 3, expuesta despues de los ejemplos, a continuacion, la mutacion de R313, E327, E331, Q332, E431, R432, R505, R516, R538 y K590 tambien resulto en inmunotoxinas con una citotoxicidad superior a la de la inmunotoxina similar preparada con PE38. Dado

10 que es probable que las inmunotoxinas con una citotoxicidad aumentada muestren un aumento de la capacidad de destruir celulas diana o permitan dosificar al paciente una cantidad menor de la inmunotoxina para conseguir el mismo efecto terapeutico, estas mutaciones serian ventajosas incluso en el caso de que ninguna de ellas tambien redujera la antigenicidad de la molecula de PE. Sin embargo, dado que cada una de estas mutaciones y la de R490 tambien reducen la antigenicidad de la PE, es deseable combinar una o mas de estas mutaciones en una sola PE.

15 Como con otras combinaciones de mutaciones de la invencion, es especialmente deseable combinar mutaciones que reduzcan o eliminen la antigenicidad de diferentes epitopos o subepitopos. Por ejemplo, una combinacion de mutaciones deseable es la mutacion de Q332 (que reduce la antigenicidad de los subepitopos 1a y b) y R467 (que reduce la antigenicidad del subepitopo 2c), ademas de R490 (que, tal como se ha seralado, elimina la antigenicidad del epitopo 5).

20 [0052] En otro grupo de experimentos se llevaron a cabo estudios para confirmar la posibilidad de realizar combinaciones de mutaciones de las que se esperaba que redujeran la inmunogenicidad de toda la molecula de PE, manteniendo a la vez una fuerte citotoxicidad. Dado que PE38 es la forma de la PE que se ha sometido a mas ensayos clinicos, es la que se uso en los estudios descritos en este documento. Dado que todas las variantes de la

25 PE son versiones truncadas o mutadas de la misma proteina y todas presentan la misma actividad enzimatica, se espera que los resultados obtenidos con PE38 sean validos para las otras variantes de la PE, como PE35, PE37, PE38QQR, PE40, PE4E y variaciones de estas con mutaciones concretas en el extremo carboxilo, tal como se describe con mas detalle a continuacion.

30 [0053] La tabla 4, a continuacion, expone los resultados de estudios sobre una serie de mutaciones unicas y multiples de la PE. Por ejemplo, se realizo una serie de combinaciones de mutaciones para reducir la inmunogenicidad de varios epitopos de la PE. A medida que se evaluo la citotoxicidad de cada combinacion de mutaciones, se aradio una mutacion adicional para reducir la inmunogenicidad de un epitopo o subepitopo adicional de la PE.

35 [0054] Por ejemplo, la tabla 4 expone los resultados de estudios sobre la citotoxicidad de un mutante de la PE con cuatro mutaciones en el que se hicieron las siguientes mutaciones: Q332S R490A R467A K590S, para reducir la inmunogenicidad de los epitopos 1, 2c, 5 y 7. Se preparo un mutante con cinco mutaciones aradiendo una mutacion en la posicion R313 para reducir la inmunogenicidad del epitopo 3, como sigue: R313A Q332S R467A R490A

40 K590S; este mutante se evaluo en dos ensayos de citotoxicidad. Despues se preparo un mutante con seis mutaciones aradiendo a este mutante una mutacion R432G para reducir la inmunogenicidad del epitopo 4a, mientras que se realizo una septima mutacion por adicion de R513A para reducir la inmunogenicidad de un epitopo adicional. Finalmente se preparo un mutante con ocho mutaciones con las mutaciones siguientes: R313A Q332S R432G R467A R490A R513A E548S K590S, para reducir la inmunogenicidad de un subepitopo del epitopo 6; se

45 evaluo la citotoxicidad del mutante con ocho mutaciones y se encontro que estaba proxima a la de la inmunotoxina de partida (la inmunotoxina de partida se conoce como HA22). Los resultados de citotoxicidad de estas mutaciones se muestran en la tabla 4. Considerando los resultados con estas combinaciones de mutaciones de ejemplo, se espera que puedan realizarse otras combinaciones de las mutaciones mostradas en la figura 4 para reducir la inmunogenicidad de los diversos epitopos y subepitopos de la PE, que retengan la citotoxicidad adecuada para ser

50 de utilidad como la porcion toxica de inmunotoxinas.

[0055] En el curso de estos estudios, se encontro que algunas mutaciones a alanina que resultaron en inmunotoxinas altamente citotoxicas por si mismas parecieron resultar en cierta perdida de actividad al combinarlas con mutaciones multiples en las que los otros restos tambien se mutaron a alanina. Se especulo que esto era debido 55 a la presencia de demasiadas mutaciones a alanina, haciendo la molecula en su totalidad demasiado hidrofoba. Para hacer frente a esto, algunos de los restos se mutaron a serina en lugar de alanina; y la citotoxicidad se recupero. En tales circunstancias tambien puede usarse glicina y otros restos pueden mutarse a serina aparte de los dos seleccionados en estos estudios. Se espera que la seleccion de otros restos para su mutacion a serina en lugar de alanina sea tambien eficaz, ya que lo importante es evitar crear demasiada hidrobicidad; este objetivo puede

conseguirse, por ejemplo, mediante la mutacion de R313 a serina, mientras se mantiene la mutacion de Q332 a A, y asi sucesivamente. El profesional puede evaluar facilmente cualquier combinacion deseada en particular de las mutaciones deseables expuestas en este documento para confirmar si la combinacion retiene o no la capacidad citotoxica.

5 [0056] La tabla 4 muestra tambien que algunas mutaciones especificas resultaron en alguna perdida de citotoxicidad. Por ejemplo, la mutacion N314A resulto en la perdida de mas del 50% de la citotoxicidad. Dado que la PE es una citotoxina tan activa, esta mutacion todavia seria util. Sin embargo, la tabla 4 muestra tambien que mientras que el mutante R490A retiene al menos la actividad de la molecula PE38 de partida, el mutante R490S

10 tiene poca actividad y no se prefiere. La mutacion de R538 a alanina resulta en alguna, aunque aceptable, perdida de actividad, mientras que la mutacion del mismo resto a serina resulta en una acusada perdida de actividad y no se prefiere. Una vez mas, el profesional puede evaluar facilmente cualquier combinacion deseada en particular de las mutaciones deseables expuestas en este documento para confirmar si la combinacion retiene o no la capacidad citotoxica.

15 [0057] Los expertos son conscientes de que varios tipos de moleculas pueden servir como base para hacer que las PE que contienen las mutaciones de la invencion reconozcan como diana a las celulas que el profesional desea destruir o inhibir. Como resulta evidente de la discusion anterior, los anticuerpos son un tipo de agente de reconocimiento preferido especialmente.

20 [0058] En otra realizacion preferida, la porcion o fraccion de reconocimiento de la molecula quimerica es una citocina, que puede usarse para hacer que las toxinas reconozcan como diana a celulas que expresan en exceso un receptor para la citocina. Por ejemplo, se sabe que los receptores de IL-13 se expresan con gran exceso en el exterior de las celulas de ciertos canceres, como gliomas, y actuan como un factor de crecimiento autocrino en

25 canceres tales como el carcinoma renal, el sarcoma de Kaposi y la enfermedad de Hodgkin. Veanse, p. ej., los documentos WO01/34645, WO03/039600 yla patente de los EE. UU. n°6.518.061. IL-13 o diversos mutantes y formas permutadas circularmente de IL-13 pueden usarse para hacer que citotoxinas, como las moleculas de PE que contienen una o mas mutaciones de la invencion, reconozcan como diana a las celulas que expresan el receptor IL-13. Ademas, las diversas formas de IL-13, incluidas las formas permutadas circularmente, pueden usarse para

30 hacer que moleculas de PE con las mutaciones reconozcan como diana a las celulas de los pulmones que expresan el receptor de IL-13 para reducir o eliminar los sintomas en afecciones como el asma y la rinitis alergica y a celulas en cualquier otra parte del cuerpo para reducir o eliminar los sintomas de la dermatitis atopica y la fibrosis hepatica en la esquistosomiasis, tal como se discute en la publicacion internacional WO 01/34645.

35 [0059] Ademas de las citocinas se conocen numerosos otros ligandos en la tecnica que pueden usarse para hacer que las moleculas de PE de la invencion reconozcan a las celulas diana. Por ejemplo, la transferrina se ha usado para hacer que las toxinas reconozcan como diana a celulas que expresan receptores de transferrina. De manera similar, las celulas implicadas en una enfermedad o afeccion pueden ser reconocidas como diana si hay un antigeno en la superficie celular que se exprese especificamente o preferentemente en las celulas relacionadas con

40 la enfermedad o afeccion, como gp120 en las celulas infectadas por el VIH, CD25 en las celulas T que estan implicadas en la enfermedad del injerto contra el huesped o diversas moleculas de superficie que se expresan en las celulas cancerosas, como CEA, CD30 o CD33.

DEFINICIONES

45 [0060] Las unidades, prefijos y simbolos se indican en la forma aceptada en el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numericos incluyen los numeros que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, los acidos nucleicos estan escritos de izquierda a derecha en la orientacion 5' a 3'; las secuencias de aminoacidos estan escritas de izquierda a derecha en la orientacion de extremo amino a extremo carboxilo. Los

50 encabezamientos proporcionados en este documento no son limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de la invencion que pueda haber en referencia a la memoria descriptiva en su conjunto. Por consiguiente, los terminos definidos inmediatamente a continuacion se definen mas detalladamente en referencia a la memoria descriptiva en su totalidad.

55 [0061] La exotoxina A de Pseudomonas ("PE") es una proteina monomerica (peso molecular de 66 kDa) extremadamente activa segregada por Pseudomonas aeruginosa que inhibe la sintesis de proteinas en las celulas eucariotas. La secuencia de la PE nativa (SEQ ID NO:1) se expone en la patente de los EE. UU. n°5.602.095, incorporada por referencia en este documento. El modo de accion y la estructura de la PE, asi como las modificaciones que resultan en una serie de variantes de la PE se discuten con cierto detalle en una seccion dedicada a este proposito en el documento.

[0062] En este documento, las mutaciones de la PE se describen en referencia al resto aminoacidico presente en una posicion concreta de la secuencia de 613 aminoacidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1), seguido del

5 aminoacido con el que se ha sustituido dicho resto en la mutacion concreta que se discute. Asi por ejemplo, el termino "R490A" indica que el resto "R" (arginina, en el codigo estandar de una sola letra) en la posicion 490 de la molecula de referencia se sustituye por un resto "A" (alanina, en el codigo estandar de una letra), mientras que K590Q" indica que la lisina presente normalmente en la posicion 590 ha sido sustituida con una glutamina. El codigo estandar de una sola letra para los aminoacidos comunes se expone a continuacion.

10 [0063] "BL22" (o "RFB-4(dsFv)-PE38") es una inmunotoxina que emplea como fraccion de reconocimiento una region Fv estabilizada por disulfuro del anticuerpo dirigido contra C22 conocido en la tecnica como "RFB-4". La secuencia del anticuerpo RFB-4 es bien conocida en la tecnica. BL22 se describe en Kreitman y col., New Eng. J. Med. 345(4): 241-7 (2001). La inmunotoxina BL22 usa PE38 como la porcion toxica de la inmunotoxina.

15 [0064] "HA22" es una inmunotoxina que emplea como fraccion de reconocimiento una forma mutada de RFB4 en la que los restos SSY de CDR3 en la cadena pesada variable han sido mutados a THW. Esta mutacion de RFB4 y su efecto en las inmunotoxinas que la emplean como la fraccion de reconocimiento se describen en la publicacion internacional WO 03/027135 y en Salvatore y col., Clin. Cancer Res. 8(4): 995-1002 (2002). La

20 inmunotoxina HA22 usa PE38 como la porcion toxica de la inmunotoxina.

[0065] Para facilitar la referencia, el termino "anticuerpo" tal como se usa en este documento incluye anticuerpos completos (a veces denominados "intactos" en este documento), fragmentos de anticuerpos que retienen el reconocimiento antigenico y la capacidad de union, ya sean producidos por la modificacion de

25 anticuerpos completos o sintetizados de nuevo mediante metodologias de ADN recombinante, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales e imitadores de anticuerpos, a menos el contexto lo requiera de otra manera. El anticuerpo puede ser una IgM, IgG (p. ej., IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), IgD, IgA o IgE.

[0066] El termino "fragmentos de anticuerpo" significa moleculas que comprenden una porcion de un

30 anticuerpo intacto, generalmente la region de union al antigeno o region variable del anticuerpo intacto. Algunos ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; anticuerpos estabilizados por helices (vease, p. ej., Arndt y col., J. Mol. Biol. 312: 221-228 (2001); diacuerpos (vease a continuacion); moleculas de anticuerpos de cadena sencilla ("scFv", vease, p. ej. la patente de los EE. UU. n° 5.888.773); anticuerpos estabilizados por disulfuro ("dsFv", vease, p. ej., las patentes de los EE. UU. nos 5.747.654 y 6.558.672)

35 y anticuerpos de dominio unico ("dAb", vease p. ej., Holt y col., Trends Biotech. 21(11): 484-490 (2003), Ghahroudi y col, FEBS Lett. 414: 521-526 (1997), Lauwereys y col., EMBO J. 17: 3512-3520 (1998), Reiter y col., J. Mol. Biol.

290: 685-698 (1999), Davies y Riechmann, Biotechnology 13: 475-479 (2001)).

[0067] El termino "diacuerpos" se refiere a pequeros fragmentos de anticuerpo con dos sitios de union a

40 antigeno, en que los fragmentos comprenden un dominio pesado variable ("VH" o "VH") conectado a un dominio ligero variable ("VL", "VL") en la misma cadena polipeptidica (VH-VL). Mediante el uso de un enlazante demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena, los dominios se ven forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de union a antigeno. Los diacuerpos y su produccion se describen mas detalladamente, por ejemplo, en los documentos EP 404.097 yWO 93/11161 y en

45 Hollinger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).

[0068] El termino "anticuerpo parental" significa cualquier anticuerpo de interes que se muta o modifica para obtener anticuerpos o fragmentos de estos que se unen al mismo epitopo que el anticuerpo parental, pero con mayor afinidad.

50 [0069] Una "fraccion de reconocimiento" es la porcion de un inmunoconjugado destinada a hacer que los inmunoconjugados reconozcan una celula de interes como diana. Tipicamente, la fraccion de reconocimiento es un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo que retiene la capacidad de reconocimiento del antigeno, como un scFv, un dsFv, un Fab o un F(ab')2.

55 [0070] Una "fraccion toxica" es la porcion de una inmunotoxina que hace que la inmunotoxina sea citotoxica para las celulas de interes. Con respecto a las inmunotoxinas que son el objeto de la presente invencion, la fraccion toxica es una exotoxina A de Pseudomonas que se ha mutado para reducir su citotoxicidad inespecifica, tal como se describe con cierto detalle a continuacion.

[0071] Tipicamente, una inmunoglobulina tiene una cadena pesada y una cadena ligera. Cada una de las cadenas pesada y ligera contiene una region constante y una region variable (las regiones se conocen tambien como "dominios"). Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada contienen una region "estructural"

5 interrumpida por tres regiones hipervariables, denominadas tambien "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR"). La extension de la region estructural y de las CDR han sido definidas. Las secuencias de las regiones estructurales de diferentes cadenas ligeras o pesadas estan relativamente conservadas dentro de una especie. La region estructural de un anticuerpo que es la combinacion de las regiones estructurales de las cadenas ligera y pesada constituyentes sirve para colocar y alinear las CDR en el espacio tridimensional.

10 [0072] Las CDR son responsables principalmente de la union a un epitopo de un antigeno. Tipicamente, las CDR de cada cadena se denominan CDR1, CDR2 y CDR3, numeradas secuencialmente a partir del extremo N y tipicamente, tambien se identifican por la cadena en la que la CDR concreta esta localizada. Por lo tanto, una VH CDR3 de esta localizada en el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo en el que se encuentra,

15 mientras que una VL CDR1 es la CDR1 del dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo en que se encuentra.

[0073] Las referencias a "VH" o a "VH" se refieren a la region variable de la cadena pesada de una inmunoglobulina, incluyendo un Fv, scFv, dsFv o Fab. Las referencias a "VL" o a "VL" se refieren a la region variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina, incluyendo un Fv, scFv, dsFv o Fab.

20 [0074] La expresion "Fv de cadena sencilla" o "scFv" se refiere a un anticuerpo en el que los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de un anticuerpo tradicional de dos cadenas se han empalmado para formar una cadena. Tipicamente, entre las dos cadenas se inserta un peptido enlazante para permitir un plegamiento adecuado y la creacion de un sitio de union activo.

25 [0075] La expresion "puente disulfuro" o "puente disulfuro cisteina-cisteina" se refiere a una interaccion covalente entre dos cisteinas en la que los atomos de azufre de las cisteinas se oxidan para formar un enlace disulfuro. La energia de enlace media de un puente disulfuro es de aproximadamente 60 kcal/mol, en comparacion con 1-2 kcal/mol de un enlace de hidrogeno.

30 [0076] La expresion "Fv estabilizado por disulfuro" o "dsFv" se refiere a la region variable de una inmunoglobulina en la que hay un puente disulfuro entre la cadena ligera y la cadena pesada. En el contexto de esta invencion, las cisteinas que forman el puente disulfuro se encuentran dentro de las regiones estructurales de las cadenas del anticuerpo y sirven para estabilizar la conformacion del anticuerpo. Tipicamente, el anticuerpo se

35 modifica para introducir cisteinas en la region estructural en posiciones en las que su sustitucion no interfiera con la union al antigeno.

[0077] El termino "peptido enlazante" se refiere a un peptido dentro de un fragmento de union de un anticuerpo (p. ej., un fragmento Fv) que sirve para enlazar indirectamente el dominio variable de la cadena pesada 40 con el dominio variable de la cadena ligera.

[0078] Un anticuerpo inmunologicamente reactivo con un antigeno concreto puede generarse por procedimientos recombinantes como la seleccion de colecciones de anticuerpos recombinantes en fagos o en vectores similares (vease, p. ej., Huse y col., Science 246: 1275-1281 (1989); Ward y col., Nature 341: 544-546

45 (1989); Vaughan y col., Nature Biotech., 14: 309-314 (1996)) o mediante la inmunizacion de un animal con el antigeno o con ADN que codifica el antigeno.

[0079] El termino "fraccion efectora" significa la porcion de un inmunoconjugado destinada a tener un efecto sobre una celula reconocida como diana por la fraccion de reconocimiento o a identificar la presencia del 50 inmunoconjugado. En el contexto de la presente invencion, la fraccion efectora es una exotoxina A de Pseudomonas mutada.

[0080] El termino "inmunoconjugado" se refiere a un enlazamiento covalente de una molecula efectora con un anticuerpo.

55 [0081] Los terminos "cantidad eficaz" o "cantidad eficaz para" o "cantidad terapeuticamente eficaz" se refieren a una dosis de un agente terapeutico suficiente para producir un resultado deseado, como la inhibicion de la sintesis de proteinas celular en al menos el 50% o la destruccion celular.

[0082] El termino "toxina" incluye tipicamente la referencia a abrina, ricina, la exotoxina de Pseudomonas (PE), la toxina de la difteria (DT), la toxina botulinica o toxinas modificadas a partir de estas. Por ejemplo, PE y DT son compuestos muy toxicos que tipicamente ocasionan la muerte por toxicidad hepatica. Sin embargo, las toxinas PE y DT pueden modificarse a una forma para uso como inmunotoxina mediante la eliminacion del componente

5 nativo de reconocimiento de la toxina (p. ej., el dominio Ia de la PE o la cadena B de la DT) y su sustitucion por una fraccion de reconocimiento diferente, como un anticuerpo. En el contexto de la presente invencion, la toxina es una exotoxina A de Pseudomonas mutada.

[0083] El termino "puesta en contacto" se refiere a la colocacion en asociacion fisica directa.

10 [0084] Un "plasmido de expresion" comprende una secuencia nucleotidica que codifica una molecula de interes, ligada operativamente a un promotor.

[0085] Tal como se usa en este documento, "polipeptido", peptido" y "proteina" se usan de manera

15 intercambiable y se refieren a un polimero de restos aminoacidicos. Los terminos se aplican a polimeros de aminoacidos en los que uno o mas restos aminoacidicos es un analogo quimico artificial de un aminoacido correspondiente de origen natural, asi como a polimeros de aminoacidos de origen natural. Los terminos se aplican tambien a polimeros que contienen sustituciones conservadoras de aminoacidos, de modo que la proteina permanezca funcional.

20 [0086] Los terminos "resto" o "resto aminoacidico" o "aminoacido" se refieren a un aminoacido que se incorpora en una proteina, polipeptido o peptido (colectivamente "peptido"). El aminoacido puede ser un aminoacido de origen natural y, a menos que se limite de otra manera, puede abarcar analogos conocidos de los aminoacidos naturales que pueden funcionar de manera similar a los aminoacidos de origen natural.

25 [0087] Los aminoacidos y analogos a los que se hace referencia en este documento se describen mediante las designaciones abreviadas indicadas a continuacion en la tabla A:

[0088]30 Tabla A: nomenclatura de aminoácidos Nombre tres letras una letra

Alanina

Ala A

Arginina

Arg R

Asparragina Acido aspartico

Asn Asp N D

Cisteina Acido glutamico

Cys Glu C E

Glutamina

Gln Q

Glicina

Gly G

Histidina

His H

Homoserina

Hse -

Isoleucina

Ile I

Leucina

Leu L

Lisina

Lys K

Metionina

Met M

Sulfoxido de metionina

Met (O) -

Metilsulfonio de metionina

Met (S-Me) -

Norleucina

Nle -

Fenilalanina

Phe F

Prolina

Pro P

Serina

Ser S

Treonina

Thr T

Triptofano

Trp W

Tirosina

Tyr Y

Valina

Val V

[0089] Una "sustitucion conservadora" al describir una proteina se refiere a un cambio en la composicion de aminoacidos de la proteina que no altera sustancialmente la actividad de la proteina. Por lo tanto, "variaciones modificadas de manera conservadora" de una secuencia de aminoacidos concreta se refieren a sustituciones de aquellos aminoacidos que no son criticos para la actividad de la proteina o a la sustitucion de aminoacidos con otros

aminoacidos de propiedades similares (p. ej., acidos, basicos, cargados positiva o negativamente, polares o no

polares, etc.), de modo que incluso las sustituciones de aminoacidos criticos no alteran sustancialmente la actividad.

Las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoacidos de funcionalidad similar son bien 5 conocidas en la tecnica. Cada uno de los siguientes seis grupos en la tabla B contiene aminoacidos que son

sustituciones mutuamente conservadoras:

[0090]

Tabla B

1)

alanina (A), serina (S), treonina (T);

2)

acido aspartico (D), acido glutamico (E);

3)

asparragina (N), glutamina (Q);

4)

arginina (R), lisina (K);

5)

isoleucina (I), leucina (L), metionina (M), valina (V);

6)

fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W).

10

Vease tambien Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties, W. H. Freeman and Company, Nueva York, EE. UU. (2a edicion, 1992).

[0091] El termino "sustancialmente similar" en el contexto de un peptido indica que un peptido comprende una

15 secuencia con al menos el 90%, preferentemente al menos el 95% de identidad de secuencia respecto a la secuencia de referencia en una ventana de comparacion de 10-20 aminoacidos.. El porcentaje de identidad de secuencia se determina por comparacion de dos secuencias alineadas optimamente en una ventana de comparacion, en que la porcion de la secuencia polinucleotidica en la ventana de comparacion puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparacion con la secuencia de referencia (que no comprende

20 adiciones ni deleciones) para el alineamiento optimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula mediante la determinacion del numero de posiciones en las que se encuentra una base de acido nucleico o un resto aminoacidico identicos en las dos secuencias para obtener el numero de posiciones que muestran correspondencia, la division del numero de posiciones que muestran correspondencia entre el numero total de posiciones en la ventana de comparacion y la multiplicacion del resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de

25 secuencia.

[0092] Los terminos "conjugacion", "empalme" o "enlace" se refieren a la obtencion de una molecula

polipeptidica contigua a partir de dos polipeptidos. En el contexto de la presente invencion, los terminos se refieren

al empalme de una fraccion de anticuerpo a una molecula efectora (EM). El enlazamiento puede realizarse por

30 procedimientos quimicos o recombinantes. Procedimientos quimicos se refieren a una reaccion entre la fraccion de anticuerpo y la molecula efectora de modo que se forme un enlace covalente entre las dos moleculas para formar una molecula.

[0093] Tal como se usa en este documento, "recombinante" se refiere a una proteina producida mediante

35 celulas que, en su estado nativo, no contienen una copia endogena del ADN capaz de expresar la proteina. Las celulas producen la proteina recombinante porque se han alterado geneticamente por la introduccion de la secuencia aislada de acido nucleico apropiada. El termino se refiere tambien a una celula o acido nucleico o vector que han sido modificados por la introduccion de un acido nucleico heterologo o a la alteracion de un acido nucleico nativo a una forma no nativa para dicha celula o a que la celula deriva de una celula modificada de esta manera. Asi

40 por ejemplo, las celulas recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la celula, expresan genes mutantes que se encuentran dentro de la forma nativa o expresan genes nativos que de otra manera se expresan anormalmente, presentan una expresion reducida o no se expresan en absoluto.

45 [0094] Tal como se usa en este documento, "acido nucleico" o "secuencia de acido nucleico" se refiere a un polimero de desoxirribonucleotidos o de ribonucleotidos que, bien en forma mono o bicatenaria y, a menos que se limite de otro modo, abarca analogos conocidos de los nucleotidos naturales que hibridan con los acidos nucleicos de manera similar a los nucleotidos de origen natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de acido nucleico concreta incluye la secuencia complementaria de esta, asi como variantes conservadoras, es decir, acidos

50 nucleicos presentes en las posiciones de titubeo de los codones y variantes que al traducirse en proteina, resultan en una sustitucion conservadora de un aminoacido.

[0095] Tal como se usa en este documento, "codificante", con respecto a un acido nucleico especificado, se refiere a acidos nucleicos que comprenden la informacion para la traduccion de la proteina especificada. La informacion se especifica por el uso de codones. Tipicamente, el acido nucleico codifica la secuencia de aminoacidos mediante el codigo genetico "universal". Sin embargo, es posible usar variantes del codigo universal, como las presentes en las mitocondrias de algunas plantas, animales y hongos, la bacteria Mycoplasma capricolum

5 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 2306-2309 (1985) o el ciliado Macronucleus, cuando el acido nucleico se expresa por medio de la maquinaria traduccional de estos organismos.

[0096] La expresion "fusion en la misma fase de lectura" se refiere al empalme de dos o mas secuencias de acido nucleico que codifican polipeptidos, de modo que la secuencia de acido nucleico empalmada traduce una sola

10 cadena de proteina que comprende las cadenas polipeptidicas originales.

[0097] Tal como se usa en este documento, "expresado" se refiere a la traduccion de un acido nucleico para dar una proteina. Las proteinas pueden expresarse y permanecer intracelulares, pasar a ser un componente de la membrana de la superficie celular o segregarse a la matriz extracelular o al medio.

15 [0098] Con "celula hospedadora" se indica una celula que puede permitir la replicacion o expresion del vector de expresion. Las celulas hospedadoras pueden ser celulas procariotas como E. coli o celulas eucariotas como celulas de levaduras, insectos, anfibios o mamiferos.

20 [0099] Los terminos "identico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o mas secuencias de acido nucleico o polipeptidos, se refiere a dos o mas secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de restos aminoacidicos o nucleotidos que son iguales al compararlas y alinearlas para obtener la maxima correspondencia, tal como se determina mediante uno de los algoritmos de comparacion siguientes o por inspeccion visual.

25 [0100] La expresion "sustancialmente identico", en el contexto de dos acidos nucleicos o polipeptidos, se refiere a dos o mas secuencias o subsecuencias que tiene al menos el 60%, con mayor preferencia el 65%, incluso con mayor preferencia el 70%, todavia con mayor preferencia el 75%, incluso con mayor preferencia el 80% y con la maxima preferencia el 90-95% de identidad de restos nucleotidicos o aminoacidicos, al compararlas y alinearlas

30 para obtener la maxima correspondencia, tal como se determina mediante uno de los algoritmos de comparacion siguientes o por inspeccion visual. Preferentemente, la identidad sustancial tiene lugar en una region de las secuencias con una longitud de al menos 50 restos, con mayor preferencia en una region de al menos 100 restos y, con la maxima preferencia, las secuencias son sustancialmente identicas al menos a lo largo de 150 restos. En una realizacion maximamente preferida, las secuencias son sustancialmente identicas a lo largo de toda la longitud de

35 las regiones codificantes.

[0101] Para la comparacion de las secuencias, tipicamente una de las secuencias hace de secuencia de referencia, con la que se comparan las secuencias de evaluacion. Al usar un algoritmo de comparacion de secuencias, las secuencias de evaluacion y la secuencia de referencia se introducen en un ordenador, en caso

40 necesario, se designan las coordenadas de subsecuencias y se designan los parametros del programa del algoritmo de secuencias. El algoritmo de comparacion de secuencias calcula entonces el porcentaje de identidad de secuencia para la(s) secuencia(s) de evaluacion en relacion a la secuencia de referencia, basado en los parametros del programa designados.

45 [0102] El alineamiento optimo de las secuencias para su comparacion puede realizarse, por ejemplo, mediante el algoritmo de homologia local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), el algoritmo de alineamiento de homologia de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), el metodo de busqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), aplicaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer

50 Group, 575 Science Dr., Madison, WI, EE. UU.) o mediante inspeccion visual (vease en general Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel y col., eds. Current Protocols, una edicion conjunta de Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc., (suplemento de 1995) (Ausubel)).

[0103] Algunos ejemplos de algoritmos adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y

55 de similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, que se describen en Altschul y col., (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-405 y Altschul y col. (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402, respectivamente. El software para llevar a cabo analisis mediante BLAST esta disponible publicamente a traves del Centro Nacional de Informacion Biotecnologica (NCBI, http://www.ncbi.nhn.nih.gov/). Este algoritmo implica en primer lugar la identificacion de pares de secuencias de alta puntuacion (HSP) mediante la identificacion de palabras cortas de longitud W en la secuencia

problema que muestran correspondencia o satisfacen alguna puntuacion umbral T de valor positivo al alinearse con una palabra de la misma longitud en una secuencia del banco de datos. T se denomina el umbral de puntuacion de palabras proximas (Altschul y col., cita anterior). Estas palabras proximas identificadas inicialmente actuan como semillas para iniciar la busqueda para encontrar HSP de mayor longitud que las contengan. Las palabras 5 identificadas se extienden entonces en las dos direcciones a lo largo de cada secuencia mientras pueda incrementarse la puntuacion de alineamiento acumulada. Para las secuencias de nucleotidos, las puntuaciones acumuladas mediante los parametros M (puntuacion de recompensa por un par de restos que muestra correspondencia; siempre > 0) y N (puntuacion de penalizacion por restos que no muestran correspondencia; siempre < 0). Para las secuencias de aminoacidos se usa una matriz de puntuacion para calcular la puntuacion 10 acumulada. La extension de las palabras identificadas en cada direccion se detiene cuando: la puntuacion de alineamiento acumulada difiere en la cantidad X del maximo valor alcanzado; la puntuacion acumulada llega a cero o por debajo de cero debido a la acumulacion de uno o mas alineamientos de restos de puntuacion negativa, o se alcanza el final de cualquiera de las secuencias. Los parametros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la rapidez del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleotidos) usa como valores

15 estandar una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparacion de las dos hebras. El programa BLASTP, para las secuencias de aminoacidos, usa como valores estandar una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10 y la matriz de puntuacion BLOSUM62 (vease Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).

20 [0104] Ademas de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST tambien lleva a cabo un analisis estadistico de la similitud entre dos secuencias (vease p. ej., Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

90: 5873-5787 (1993)). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma minima (P(N)), que proporciona una indicacion de la probabilidad con la que una correspondencia entre dos secuencias de nucleotidos o aminoacidos ocurriria por casualidad. Por ejemplo, un acido nucleico se considera

25 similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de la suma minima en una comparacion del acido nucleico de evaluacion con el acido nucleico de referencia es inferior a aproximadamente 0,1, con mayor preferencia inferior a aproximadamente 0,01 y con la maxima preferencia inferior a aproximadamente 0,001.

[0105] Otra indicacion de que dos secuencias de acido nucleico o polipeptidos son sustancialmente identicas

30 es que el polipeptido codificado por el primer acido nucleico presenta una reaccion inmunologica cruzada con el polipeptido codificado por el segundo acido nucleico, tal como se describe a continuacion. Por lo tanto, tipicamente un polipeptido es sustancialmente identico a un segundo polipeptido, por ejemplo, cuando los dos peptidos difieren solamente en sustituciones conservadoras. Otra indicacion de que dos secuencias de acido nucleico son sustancialmente identicas es que las dos moleculas hibridan entre si en condiciones restrictivas, tal como se

35 describe a continuacion.

[0106] El termino "in vivo" se refiere al interior del cuerpo del organismo del que se ha obtenido la celula. "Ex vivo" e "in vitro" significan fuera del cuerpo del organismo del que se ha obtenido la celula.

40 [0107] La expresion "celula maligna" o "cancer" se refiere a tumores o celulas tumorales que son invasivas y/o capaces de experimentar metastasis, es decir, una celula cancerosa.

[0108] Tal como se usa en este documento, las "celulas de mamiferos" se refieren a celulas derivadas de mamiferos, como humanos, ratas, ratones, cobayas, chimpances o macacos. Las celulas pueden cultivarse in vivo o

45 in vitro.

[0109] El termino "selectivamente reactivo", respecto a un antigeno, se refiere a la asociacion preferente de un anticuerpo, en su totalidad o en parte, con una celula o un tejido que porta el antigeno y no con celulas que carecen del antigeno. Por supuesto, se admite que es posible un cierto grado de interaccion inespecifica entre una molecula 50 y una celula o tejido que no sea su diana. Sin embargo, la reactividad selectiva puede distinguirse como ocasionada a traves del reconocimiento especifico del antigeno. Aunque los anticuerpos selectivamente reactivos se unan al antigeno, pueden hacerlo con baja afinidad. Por otro lado, la union especifica resulta en una asociacion mucho mas fuerte entre el anticuerpo y las celulas que portan el antigeno que entre el anticuerpo unido y las celulas que carecen del antigeno. Tipicamente, la union especifica resulta en un aumento de mas de dos veces, preferentemente de mas 55 de 5 veces, con mayor preferencia de mas de 10 veces y con la maxima preferencia de mas de 100 veces, de la cantidad de anticuerpo unido (por unidad de tiempo) a una celula o tejido que porta CD22, en comparacion con una celula o tejido que carece de CD22. La union especifica a una proteina en estas condiciones requiere un anticuerpo que se seleccione por su especificidad para una proteina concreta. Diversos formatos de inmunoanalisis son apropiados para seleccionar los anticuerpos especificamente inmunorreactivos con una proteina concreta. Por

ejemplo, los inmunoanalisis ELISA en fase solida se usan rutinariamente para seleccionar anticuerpos monoclonales especificamente inmunorreactivos con una proteina. Vease Harlow y Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York (1988), para una descripcion de los formatos de inmunoanalisis que pueden usarse para determinar la inmunorreactividad especifica.

5 [0110] La expresion "condiciones inmunologicamente reactivas" se refiere a las condiciones que permiten a un anticuerpo generado contra un epitopo concreto unirse a tal epitopo en un grado detectablemente superior que, y/o con la exclusion sustancial de la union a sustancialmente todos los demas epitopos. Las condiciones inmunologicamente reactivas dependen del formato de la reaccion de union del anticuerpo y, tipicamente, son

10 aquellas utilizadas en protocolos de inmunoanalisis o aquellas condiciones que se encuentran in vivo. Vease Harlow y Lane, cita anterior, para una descripcion de los formatos y condiciones de los inmunoanalisis. Preferentemente, las condiciones inmunologicamente reactivas empleadas en los procedimientos de la presente invencion son "condiciones fisiologicas", lo que se refiere a las condiciones (p. ej., temperatura, osmolaridad, pH) que son tipicas dentro de un mamifero vivo o una celula de mamifero. Mientras que se admite que algunos organos estan sometidos

15 a condiciones extremas, el entorno en el interior de los organismos y las celulas presenta normalmente un pH de aproximadamente 7 (es decir, de pH 6,0 a pH 8,0, mas tipicamente un pH de 6,5 a 7,5), contiene agua como disolvente principal y se encuentra a una temperatura por encima de 0°C y por debajo de 50°C. La osmol aridad esta dentro del intervalo que permite la viabilidad y la proliferacion celular.

20 EXOTOXINA DE PSEUDOMONAS

[0111] La exotoxina A de Pseudomonas ("PE") nativa es una proteina monomerica (peso molecular de 66 kDa) extremadamente activa segregada por Pseudomonas aeruginosa que inhibe la sintesis de proteinas en las celulas eucariotas. La secuencia de la PE nativa se expone en la SEQ ID NO:1 de la patente de los EE. UU. n° 25 5.602.095, incorporada por referencia en este documento. El modo de accion es la inactivacion de la ADPribosilacion del factor de elongacion 2 (EF-2). La exotoxina contiene tres dominios estructurales que actuan concertadamente para causar toxicidad. El dominio Ia (aminoacidos 1-252) ocasiona la union a la celula. El dominio II (aminoacidos 253-364) es responsable de la translocacion al citosol y el dominio III (aminoacidos 400-613) ocasiona la ADP-ribosilacion del factor de elongacion 2. La funcion del dominio Ib (aminoacidos 365-399) permanece

30 sin definir, aunque una gran parte de este, los aminoacidos 365-380, pueden eliminarse sin perdida de citotoxicidad. Vease Siegall y col., J. Biol. Chem. 264: 14256-61 (1989).

[0112] Los terminos "exotoxina de Pseudomonas" y "PE" se usan tipicamente en este documento para referirse a una PE que ha sido modificada a partir de la proteina nativa para reducir o eliminar la toxicidad 35 inespecifica. En la tecnica se conocen numerosas de estas modificaciones, que incluyen, pero no se limitan a la eliminacion del dominio Ia, diversas deleciones de aminoacidos en los dominios Ib, II y III, sustituciones de un solo aminoacido y la adicion de una o mas secuencias al extremo carboxilo, como KDEL (SEQ ID NO:2) y REDL (SEQ ID NO:3). Vease Siegall y col., J. Biol. Chem. 264: 14256-14261 (1989). Los fragmentos citotoxicos de la PE incluyen aquellos que son citotoxicos con o sin un posterior procesamiento proteolitico o de otro tipo en la celula diana (p. ej., 40 como proteina o preproteina). Los fragmentos citotoxicos de la PE incluyen PE40, PE38 y sus variantes PE38QQR y PE38KDEL (en la que PE38 tiene la secuencia KDEL, SEQ ID NO:2, aradida al extremo C) y PE35, tal como se discute a continuacion. En una realizacion preferida, el fragmento citotoxico de la PE retiene al menos el 20%, preferentemente al menos el 40%, con mayor preferencia al menos el 50%, incluso con mayor preferencia el 75%, con mayor preferencia al menos el 90% y aun con mayor preferencia el 95% de la citotoxicidad de la PE nativa. En

45 las realizaciones preferidas especialmente, el fragmento citotoxico tiene al menos la citotoxicidad de la PE nativa y preferentemente mas.

[0113] En las realizaciones preferidas, la PE se ha modificado para reducir o eliminar la union celular inespecifica, frecuentemente por delecion del dominio Ia, como se expone en la patente de los EE. UU. 4.892.827,

50 aunque esto tambien puede lograrse, por ejemplo, mediante la mutacion de ciertos restos del dominio Ia. La patente de los EE. UU. 5.512.658, por ejemplo, desvela que una PE mutada en la que el dominio Ia esta presente, pero en la que los restos basicos del dominio Ia en las posiciones 57, 246, 247 y 249 se han sustituido por restos acidos (acido glutamico o "E") muestran una citotoxicidad inespecifica muy disminuida. Esta forma mutante de la PE se denomina a veces "PE4E".

55 [0114] PE40 es un derivado truncado de la PE descrito previamente en la tecnica. Vease Pai y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3358-62 (1991); Kondo y col., J. Biol. Chem. 263: 9470-9475 (1988). PE35 es un fragmento de 35 kDa del extremo carboxilo de la PE en el que se han eliminado los restos aminoacidicos 1-279 y la molecula comienza con una metionina en la posicion 280 seguida de los aminoacidos 281-364 y 381-613 de la PE nativa.

PE35 y PE40 se desvelan, por ejemplo, en las patentes de los EE. UU. 5.602.095 y 4.892.827.

[0115] En algunas realizaciones preferidas se emplea el fragmento citotoxico PE38. PE38 contiene los dominios de translocacion y ADP-ribosilacion de la PE, pero no la porcion de union a la celula (Hwang, J. y col., Cell

5 48: 129-136 (1987)). PE38 es una preproteina truncada de la PE, compuesta de los aminoacidos 253-364 y 381-613 que se activa a su forma citotoxica por procesamiento dentro de una celula (vease, p. ej., la patente de los EE. UU. n°5.608.039 y Pastan y col., Biochim. Biophys. Acta 1333: C1-C6 (1997)). Por lo tanto, la secuencia de PE38 se conoce en la tecnica, pero tambien podria determinarse facilmente por el profesional substrayendo los restos indicados de la secuencia conocida de la PE. Los expertos seran conscientes de que, debido a la degeneracion del

10 codigo genetico, la secuencia de aminoacidos de PE38, de sus variantes, como PE38KDEL y de los otros derivados de la PE discutidos en este documento pueden ser codificadas por una gran diversidad de secuencias de acido nucleico, cualquiera de las cuales puede expresarse para dar lugar al polipeptido deseado.

[0116] Tal como se serala anteriormente, parte o todo el dominio Ib puede eliminarse y las porciones

15 restantes unirse mediante un enlazante o directamente por un enlace peptidico. Parte de la porcion amino del dominio II puede eliminarse. Y el extremo C-terminal puede contener la secuencia nativa de los restos 609-613 (REDLK (SEQ ID NO:4)) o puede contener una variacion para la que se ha encontrado que mantiene la capacidad de translocacion de la construccion al citosol, como KDEL (SEQ ID NO:2) o REDL (SEQ ID NO:3) y repeticiones de estas secuencias. Vease, p. ej., las patentes de los EE. UU. 5.854.044, 5.821.238 y 5.602.095 y el documento WO

20 99/51643. Mientras que en las realizaciones preferidas, la PE es PE4E, PE40 o PE38, cualquier forma de la PE de la que se haya eliminado la citotoxicidad inespecifica o reducido a niveles en las que no se produce una toxicidad significativa para las celulas que no son reconocidas como diana puede usarse en las inmunotoxinas de la presente invencion, siempre y cuando siga siendo capaz de translocacion y de ribosilacion de EF-2 en una celula reconocida como diana.

25 [0117] En las realizaciones preferidas, las moleculas de PE se modifican adicionalmente para tener una sustitucion con alanina, glicina, serina o glutamina en lugar del resto aminoacidico presente normalmente en una o mas de las posiciones de la molecula de PE expuestas en la Introduccion anteriormente. Alanina es la sustitucion mas preferida.

A. Variantes modificadas de manera conservadora de la PE

[0118] Queda entendido que la secuencia de la PE nativa y las variantes discutidas anteriormente pueden tener sustituciones conservadoras y retener la capacidad citotoxica y, deseablemente, una reducida antigenicidad en

35 comparacion con la secuencia nativa de la PE. En las realizaciones preferidas, las variantes modificadas de la PE o fragmentos citotoxicos de estas tienen al menos el 80% de similitud de secuencia, preferentemente al menos el 85% de similitud de secuencia, con mayor preferencia al menos el 90% de similitud de secuencia y con la maxima preferencia al menos el 95% de similitud de secuencia en cuanto a aminoacidos, con la PE de interes, como PE38.

40 [0119] El termino "variantes modificadas de manera conservadora" se aplica a secuencias tanto de aminoacidos como de acido nucleico. Con respecto a secuencias de acido nucleico concretas, las variantes modificadas de manera conservadora se refieren a aquellas secuencias de acido nucleico que codifican secuencias de aminoacidos identicas o esencialmente identicas, o si el acido nucleico no codifica una secuencia de aminoacidos, a secuencias de acido nucleico esencialmente identicas. Debido a la degeneracion del codigo

45 genetico, un gran numero de acidos nucleicos funcionalmente identicos codifican cualquier polipeptido dado. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos ellos el aminoacido alanina. Por lo tanto, en cualquier posicion en la que un codon especifique una alanina, el codon puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipeptido codificado. Tales variaciones del acido nucleico son "variaciones silenciosas", que son un tipo de variaciones modificadas de manera conservadora. Cualquier secuencia de acido

50 nucleico en este documento que codifique un polipeptido describe tambien cualquier posible variacion silenciosa del acido nucleico. El experto reconocera que todo codon de un acido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el unico codon para metionina) puede modificarse para dar una molecula funcionalmente identica. Por consiguiente, toda variacion silenciosa de un acido nucleico que codifica un polipeptido esta implicita en cada secuencia descrita.

55 [0120] En cuanto a las secuencias de aminoacidos, el experto reconocera que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales a una secuencia de acido nucleico, peptido, polipeptido o proteina que alteren, aradan o eliminen un solo aminoacido o un pequero porcentaje de aminoacidos de la secuencia codificada seran "variantes modificadas de manera conservadora" cuando la alteracion resulte en la sustitucion de un aminoacido con un aminoacido quimicamente similar.

B. Análisis de la citotoxicidad o la antigenicidad de la PE

[0121] Las exotoxinas de Pseudomonas empleadas en la invencion pueden analizarse en cuanto al nivel

5 deseado de citotoxicidad mediante ensayos bien conocidos por los expertos en la tecnica. Por lo tanto, la citotoxicidad de los fragmentos citotoxicos de la PE y las variantes modificadas de manera conservadora de tales fragmentos puede analizarse facilmente. La citotoxicidad de un gran numero de moleculas de PE candidatas puede analizarse simultaneamente por procedimientos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la citotoxicidad de las moleculas candidatas puede analizarse en subgrupos. Los subgrupos de las moleculas candidatas que reaccionen

10 positivamente pueden subdividirse continuamente y volver a analizarse hasta identificar el(los) fragmento(s) citotoxicos deseados. Estos procedimientos permiten el cribado rapido de numerosos fragmentos citotoxicos o variantes conservadoras de la PE. La antigenicidad puede analizarse, por ejemplo, por los procedimientos expuestos en los ejemplos de este documento.

15 Conjugación con el anticuerpo

[0122] En una realizacion no recombinante de la invencion, una molecula de reconocimiento, como un anticuerpo, se enlaza a una molecula de PE de la presente invencion mediante cualquier serie de procedimientos conocidos por el experto en la tecnica. Con las moleculas de PE de la presente invencion pueden usarse

20 procedimientos de union tanto covalentes como no covalentes.

[0123] El procedimiento para unir una molecula de PE a un anticuerpo u otra molecula de reconocimiento ("MR") variara en funcion de la estructura quimica de la MR. Tipicamente, los polipeptidos contienen diversos grupos funcionales; p. ej. acido carboxilico (COOH), grupos amino (-NH2) o sulfhidrilo (-SH) libres, que estan disponibles

25 para la reaccion con un grupo funcional adecuado de un anticuerpo, por ejemplo, para dar lugar a la union de la molecula de PE.

[0124] Alternativamente, el anticuerpo u otra MR se modifican para exponer o unirse a grupos funcionales reactivos adicionales. La modificacion puede suponer la union de cualquiera de una serie de moleculas enlazantes

30 como las disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, EE. UU.

[0125] Un "enlazante", tal como se usa en este documento, es una molecula que se usa para empalmar la MR a la molecula de PE. El enlazante es capaz de formar enlaces covalentes tanto con el anticuerpo como con la molecula efectora. Los enlazantes adecuados son bien conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen, pero no

35 se limitan a enlazantes carbonados de cadena lineal o ramificada, enlazantes carbonados heterociclicos o enlazantes peptidicos. Cuando el anticuerpo y la molecula efectora son polipeptidos, los enlazantes pueden unirse a los aminoacidos constituyentes a traves de sus grupos laterales (p. ej., a traves de un enlace disulfuro con cisteina). Sin embargo, en una realizacion preferida, los enlazantes se uniran a los grupos amino y carboxilo del carbono � de los aminoacidos terminales.

40 [0126] En algunas circunstancias, es deseable liberar la molecula de PE de la MR cuando el inmunoconjugado ha alcanzado el sitio diana. Por lo tanto, es estas circunstancias, los inmunoconjugados comprenderan enlaces escindibles en la proximidad del sitio diana. La escision del enlazante para liberar la molecula de PE de la MR puede provocarse por actividad enzimatica o por condiciones a las que se somete al

45 inmunoconjugado bien dentro de la celula diana o en la proximidad del sitio diana. Cuando el sitio diana es un tumor, puede usarse un enlazante que sea escindible en las condiciones presentes en el sitio del tumor (p. ej., al quedar expuesto a enzimas asociadas al tumor o a pH acido).

PRODUCCIÓN DE INMUNOCONJUGADOS

50 [0127] Los inmunoconjugados de la invencion incluyen, pero no se limitan a moleculas en las que hay un enlazamiento covalente de una molecula de PE con un anticuerpo u otro agente de reconocimiento. La eleccion de un agente de reconocimiento concreto depende de la celula concreta que ha de reconocerse como diana. Con las moleculas de PE proporcionadas en este documento, un experto puede construir facilmente diversos clones que

55 contengan acidos nucleicos funcionalmente equivalentes, como acidos nucleicos que difieren en su secuencia pero que codifican la misma secuencia de PE y anticuerpo. Por lo tanto, la presente invencion proporciona acidos nucleicos que codifican conjugados de anticuerpos y PE y proteinas de fusion de estos.

A. Procedimientos recombinantes

[0128] Las secuencias de acido nucleico de la presente invencion pueden prepararse por cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, la clonacion de las secuencias apropiadas por sintesis quimica directa por procedimientos como el metodo del fosfotriester de Narang y col., Meth. Enzimol. 68: 90-99 (1979); el metodo del 5 fosfodiester de Brown y col., Meth. Enzimol. 68:109-151 (1979); el metodo de la dietilfosforamidita de Beaucage y col., Tetra. Lett. 22: 1859-1862 (1981); el metodo del triester de fosforamidita en fase solida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetra. Lett. 22(20): 1859-1862 (1981), p. ej. mediante un sintetizador automatico tal como se describe, por ejemplo en Needham-VanDevanter y col., Nucl. Acids. Res. 12: 6159-6168 (1984), y el procedimiento del soporte solido de la patente de los EE. UU. n° 4.458.066. La sintesis quimica produce un oligonucleotido

10 monocatenario. Este puede convertirse en ADN bicatenario por hibridacion con una secuencia complementaria o por polimerizacion con una polimerasa de ADN con la hebra sencilla como molde. El experto reconocera que mientras que la sintesis quimica de ADN esta limitada a secuencias de aproximadamente 100 bases, es posible obtener secuencias de mayor longitud mediante la ligacion de secuencias mas cortas.

15 [0129] En una realizacion preferida, las secuencias de acido nucleico de esta invencion se preparan por tecnicas de clonacion. Algunos ejemplos de tecnicas apropiadas de clonacion y secuenciacion, asi como instrucciones suficientes para dirigir a los expertos a traves de numerosos ejercicios de clonacion, se encuentran en Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2a edicion), vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Berger y Kimmel (eds.), GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, Academic Press,

20 Inc., San Diego, CA, EE. UU. (1987) o Ausubel y col., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing y Wiley-Interscience, NY, EE. UU. (1987). La informacion de los productos de los fabricantes de reactivos biologicos y equipo experimental proporciona tambien informacion util. Tales fabricantes incluyen SIGMA Chemical Company (Saint Louis, MO, EE. UU.), R&D Systems (Minneapolis, MN, EE. UU.), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ, EE. UU.), CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA, EE. UU.), Chem Genes

25 Corp., Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI, EE. UU.), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, MD, EE. UU.), Fluka Chemica-Biochemika Analitika (Fluka Chemie AG, Buchs, Suiza), Invitrogen, San Diego, CA, EE. UU. y Applied Biosystems (Foster City, CA, EE. UU.), asi como numerosas otras fuentes conocidas por el experto.

30 [0130] Los acidos nucleicos que codifican la PE nativa pueden modificarse tambien para formar los inmunoconjugados de la presente invencion. La modificacion por mutacion dirigida es bien conocida en la tecnica. Los acidos nucleicos que codifican la PE pueden amplificarse por procedimientos "in vitro". Los procedimientos de amplificacion incluyen la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), la reaccion en cadena de la ligasa (LCR), el sistema de amplificacion basado en transcripcion (TAS), el sistema autosostenido de replicacion de secuencias

35 (3SR). Los expertos conocen tambien una amplia variedad de procedimientos de clonacion, celulas hospedadoras y metodologias para la amplificacion in vitro.

[0131] En una realizacion preferida, los inmunoconjugados se preparan por insercion del ADNc que codifica un anticuerpo u otra MR elegidos en un vector que comprende el ADNc que codifica una PE deseada de la 40 invencion. La insercion se realiza de modo que el agente de reconocimiento (para facilitar la discusion, la discusion en este documento asumira que el agente de reconocimiento es un Fv, aunque podria sustituirse por otros agentes de reconocimiento con el mismo efecto) y la PE se leen en fase, es decir, dando lugar a un polipeptido continuo que contiene una region Fv funcional y una region PE funcional. En una realizacion preferida especialmente, el ADNc que codifica una PE de la invencion se liga a un scFv, de tal modo que la toxina se localiza en el extremo carboxilo

45 del scFv. En otras realizaciones preferidas, el ADNc que codifica una PE de la invencion se liga a un scFv de tal modo que la toxina se localiza en el extremo amino del scFv.

[0132] Una vez que los acidos nucleicos que codifican una PE, un anticuerpo o un inmunoconjugado de la presente invencion se han aislado y clonado, es posible expresar la proteina deseada en una celula modificada de 50 manera recombinante, como celulas de bacterias, plantas, levaduras, insectos y mamiferos. Se espera que los expertos en la tecnica tengan conocimiento de los numerosos sistemas de expresion disponibles para la expresion de proteinas, como E. coli, otros hospedadores bacterianos, levaduras y diversas celula de eucariotas superiores como las lineas celulares COS, CHO, HeLa y de mieloma. No se intentaran describir en detalle los diversos procedimientos conocidos para la expresion de proteinas en procariotas ni eucariotas. Brevemente, la expresion de 55 acidos nucleicos naturales o sinteticos que codifican las proteinas aisladas de la invencion se conseguira tipicamente mediante la ligacion operativa del ADN o el ADNc a un promotor (constitutivo o inducible), seguida de su incorporacion en una casete de expresion. Las casetes pueden adecuadas para la replicacion e integracion en procariotas o en eucariotas. Las casetes de expresion tipicas contienen terminadores de transcripcion y de traduccion, secuencias de iniciacion y promotores utiles para la regulacion de la expresion del ADN que codifica la proteina. Para obtener un alto nivel de expresion de un gen clonado, es deseable construir casetes de expresion que contengan, como minimo, un promotor fuerte para dirigir la transcripcion, un sitio de union a ribosomas para la iniciacion de la traduccion y un terminador de la transcripcion/traduccion. Para E. coli, esto incluye un promotor como los promotores T7, trp, lac o �, un sitio de union a ribosomas y preferentemente una seral de terminacion de la 5 transcripcion. Para celulas eucariotas, las secuencias de control pueden incluir un promotor y preferentemente un potenciador derivado de genes de inmunoglobulinas, SV40, citomegalovirus y una seral de poliadenilacion y pueden incluir secuencias donadoras y aceptoras de corte y empalme. Las casetes de la invencion pueden transferirse a la celula hospedadora elegida por procedimientos bien conocidos como la transformacion por cloruro de calcio o la electroporacion para E. coli y el tratamiento con fosfato de calcio, la electroporacion o la lipofeccion para celulas de

10 mamiferos. Las celulas transformadas con las casetes pueden seleccionarse por la resistencia a antibioticos conferida por genes contenidos en las casetes, como los genes amp, gpt, neo e hyg.

[0133] El experto reconocera que es posible hacer modificaciones en un acido nucleico que codifica un polipeptido de la presente invencion (es decir, PE o un inmunoconjugado formado a partir de una PE de la invencion) 15 sin disminuir su actividad biologica. Algunas modificaciones pueden hacerse para facilitar la clonacion, la expresion,

o la incorporacion de la molecula de reconocimiento en una proteina de fusion. Tales modificaciones son bien conocidas para los expertos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, codones de terminacion, una metionina aradida al extremo amino para proporcionar un sitio de iniciacion, aminoacidos adicionales colocados en cualquiera de los extremos para crear sitios de restriccion localizados convenientemente o aminoacidos adicionales (como poli-His)

20 para facilitar las etapas de purificacion.

[0134] Ademas de mediante procedimientos recombinantes, los inmunoconjugados y las PE de la presente invencion pueden construirse tambien en parte o en su totalidad mediante sintesis peptidica estandar. La sintesis en fase solida de los polipeptidos de la presente invencion de menos de 50 aminoacidos de longitud puede realizarse 25 mediante la union del aminoacido C-terminal de la secuencia a un soporte insoluble, seguida de la adicion secuencial de los aminoacidos restantes de la secuencia. Las tecnicas para la sintesis en fase solida se describen en Barany y Merrifield, THE PEPTIDES: ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY. Vol. 2: SPECIAL METHODS IN PEPTIDE SYNTHESIS, parte A, pags. 3-284; Merrifield y col., J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156 (1963) y Stewart y col., SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2a edicion, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, EE. UU. (1984). Es posible

30 sintetizar proteinas de mayor longitud por condensacion de los extremos amino y carboxilo de fragmentos mas cortos. Los procedimientos para formar enlaces peptidicos por activacion de un extremo carboxilo terminal (p. ej., mediante el agente de acoplamiento N, N’-diciclohexilcarbodiimida) son conocidos para los expertos.

B. Purificación

35 [0135] Una vez expresados, los inmunoconjugados y PE recombinantes de la presente invencion pueden purificarse de acuerdo con procedimientos estandar de la tecnica, como precipitacion con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografia en columna y similares (vease generalmente R. Scopes, PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, NY, EE. UU. (1982). Se prefieren composiciones sustancialmente puras con una

40 homogeneidad de al menos aproximadamente el 90-95% y una homogeneidad del 98 al 99% es la mas preferida para usos farmaceuticos. Una vez purificados, parcialmente o hasta homogeneidad, segun se desee, si han de usarse terapeuticamente, los polipeptidos no deberan contener sustancialmente ninguna endotoxina.

[0136] Los procedimientos para la expresion de anticuerpos de una sola cadena y/o su plegamiento para

45 obtener una forma activa apropiada, incluidos los anticuerpos de una sola cadena de bacterias como E. coli , han sido descritos y son bien conocidos y aplicables a los anticuerpos de esta invencion. Vease Buchner y col., Anal. Biochem. 205: 263-270 (1992); Pluckthun, Biotechniology 9: 545 (1991); Huse y col., Science 246: 1275 (1989) y Ward y col., Nature 341: 544 (1989), todos ellos incorporados por referencia en este documento.

50 [0137] Frecuentemente, las proteinas heterologas funcionales de E. coli o de otras bacterias se aislan de cuerpos de inclusion y requieren la solubilizacion mediante desnaturalizantes fuertes y un subsiguiente plegamiento. Durante la etapa de solubilizacion, tal como es bien conocido en la tecnica, debe haber presente un agente reductor para separar los puentes disulfuro. Un tampon de ejemplo con un agente reductor es: Tris 0,1 M pH 8, guanidina 6 M, EDTA 2 mM, DTE (ditioeritritol) 0,3 M. La reoxidacion de los puentes disulfuro puede tener lugar en presencia de

55 reactivos tiolicos de bajo peso molecular en forma reducida y oxidada, tal como se describe en la publicacion de Saxena y col., Biochemistry 9: 5015-5021 (1970), incorporada por referencia en este documento, y especialmente tal como describen Buchner y col., cita anterior.

[0138] Tipicamente la renaturalizacion se consigue por dilucion (p. ej., 100 veces) de la proteina desnaturalizada y reducida en el tampon de plegamiento. Un tampon de ejemplo es Tris 0,1 M pH 8,0, L-arginina 0,5 M, glutation oxidado 8 mM y EDTA 2 mM.

[0139] Como modificacion del protocolo de purificacion de anticuerpos de dos cadenas, las regiones de las

5 cadenas pesada y ligera se solubilizan y se reducen por separado y despues se combinan en la disolucion de plegamiento. Se obtiene un rendimiento preferido cuando estas dos proteinas se mezclan en una razon molar tal que no se sobrepasa un exceso molar de cinco veces una proteina respecto a la otra. Es deseable la adicion de un exceso de glutation oxidado o de otros compuestos oxidantes de bajo peso molecular a la disolucion de plegamiento despues de haber finalizado la reorganizacion redox.

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y ADMINISTRACIÓN

[0140] Las composiciones de inmunoconjugados de esta invencion (es decir, la PE enlazada a un anticuerpo) son especialmente utiles para la administracion por via parenteral, como la administracion por via intravenosa o la

15 administracion en una cavidad corporal.

[0141] Normalmente, las composiciones para administracion comprenderan una disolucion del anticuerpo y/o inmunoconjugado disuelto en un vehiculo farmaceuticamente aceptable, preferentemente un vehiculo acuoso. Pueden usarse diversos vehiculos acuosos, p. ej., disolucion salina tamponada y similares. Estas disoluciones son 20 esteriles y generalmente no contienen materia indeseable. Estas composiciones pueden esterilizarse por tecnicas convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmaceuticamente aceptables, segun se requiera para aproximarse a las condiciones fisiologicas, como agentes de ajuste y tamponamiento del pH, agentes de ajuste de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentracion de la proteina de fusion en estas

25 formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionara principalmente en funcion de los volumenes de liquido, viscosidades, peso corporal y similares, de acuerdo con el modo de administracion concreto seleccionado y las necesidades del paciente.

[0142] Por lo tanto, una dosis tipica de una composicion de inmunotoxina de la presente invencion para la

30 administracion por via intravenosa sera de aproximadamente 0,1 a 10 mg por paciente y dia. Tambien pueden usarse dosis de 0,1 hasta aproximadamente 100 mg por paciente y dia. Los procedimientos exactos para la preparacion de composiciones administrables seran conocidos o evidentes para los expertos en la tecnica y se describen mas detalladamente en publicaciones como REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE, 19a edicion, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania. EE. UU (1995).

35 [0143] Las composiciones de la presente invencion pueden administrarse para tratamiento terapeutico. En las aplicaciones terapeuticas, las composiciones se administran a un paciente que sufre una enfermedad en una cantidad suficiente para curar o, al menos, detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para satisfacer esto se define como una "dosis terapeuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para

40 este uso dependeran de la gravedad de la enfermedad y del estado de salud general del paciente. Una cantidad eficaz del compuesto es la que proporciona el alivio subjetivo de un sintoma(s) o una mejora identificable objetivamente, seralada por el medico o cualquier otro observador cualificado.

[0144] Se realizan administraciones individuales o multiples de las composiciones en funcion de la dosis y la

45 frecuencia, tal como requiera y tolere el paciente. En cualquier caso, la composicion debera proporcionar una cantidad suficiente de las proteinas de esta invencion para tratar eficazmente al paciente. Preferentemente, la dosis se administra una vez, pero puede aplicarse periodicamente hasta obtener un resultado terapeutico o hasta que los efectos secundarios justifiquen la interrupcion del tratamiento. Generalmente, la dosis es suficiente para tratar o mejorar los sintomas o signos de la enfermedad sin producir sin producir una toxicidad inaceptable para el paciente.

50 [0145] Las formulaciones parenterales de liberacion controlada de las composiciones de inmunoconjugados de la presente invencion pueden prepararse como implantes, inyecciones oleosas o como sistemas particulados. Para una amplia vision de conjunto de los sistemas de administracion de proteinas vease la publicacion de Banga,

A. J., THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS: FORMULATION, PROCESSING, AND DELIVERY SYSTEMS,

55 Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA, EE. UU. (1995), incorporada por referencia en este documento. Los sistemas particulados incluyen microesferas, microparticulas, microcapsulas, nanocapsulas, nanoesferas y nanoparticulas. Las microcapsulas contienen la proteina terapeutica como un nucleo central. En las microesferas, el agente terapeutico se halla dispersado en toda la particula. Las particulas, microesferas y microcapsulas de tamaro inferior a 1 �m se denominan generalmente nanoparticulas, nanosferas y nanocapsulas, respectivamente. Los capilares tienen un diametro de aproximadamente 5 �m, de modo que solamente las nanoparticulas se administran por via intravenosa. Tipicamente, las microparticulas tienen un diametro aproximado de 100 �m y se administran por via subcutanea o intramuscular. Veanse, p. ej., las publicaciones de Kreuter, J., COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, J. Kreuter, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, EE. UU., pags.

5 219-342 (1994) y Tice y Tabibi, TREATISE ON CONTROLLED DRUG DELIVERY, A. Kydonieus, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, EE. UU., pags. 315-339 (1992), ambas incorporadas por referencia en este documento.

[0146] Es posible usar polimeros para la liberacion controlada por iones de las composiciones de

10 inmunoconjugados de la presente invencion. En la tecnica se conocen diversas matrices polimericas degradables y no degradables para uso en la administracion controlada de farmacos (Langer, R., Accounts Chem. Res. 26: 537542 (1993)). Por ejemplo, el copolimero de bloques poloxamero 407 es un liquido movil pero viscoso a bajas temperaturas, que forma un gel semisolido a la temperatura corporal. Se ha demostrado que es un vehiculo eficaz para la formulacion y administracion sostenida de interleucina 2 y ureasa recombinantes (Johnston y col., Pharm.

15 Res. 9: 425-434 (1992); Pec. y col., J. Parent. Sci. Tech. 44(2): 58-65 (1990)). Alternativamente, se ha usado hidroxiapatito como microvehiculo para la liberacion controlada de proteinas (Ijntema y col., Int. J. Pharm. 112: 215224 (1994)). En otro aspecto adicional se usan liposomas para la liberacion controlada asi como para la localizacion especifica del farmaco encapsulado en lipidos (Betageri y col., LIPOSOME DRUG DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA, EE. UU. (1993)). Se conocen numerosos sistemas adicionales para

20 la administracion controlada de proteinas terapeuticas. Veanse, p.ej., las patentes de los EE. UU. nos 5.055.303, 5.188.837, 4.235.871, 4.501.728, 4.837.028, 4.957.735 y 5.019.369, 5.055.303, 5.514.670, 5.413.797, 5.268.164, 5.004.697, 4.902.505, 5.506.206, 5.271.961, 5.254.342 y 5.534.496, cada una de las cuales esta incorporada por referencia en este documento.

25 [0147] Entre los diversos usos de las inmunotoxinas de la presente invencion se cuentan una diversidad de estados de enfermedad causados por celulas humanas especificas que pueden eliminarse por la accion toxica de la proteina de fusion.

USOS IN VITRO

30 [0148] En otra realizacion, esta invencion proporciona kits para la eliminacion de celulas diana in vitro o ex vivo mediante las PE de la invencion. Por ejemplo, pueden usarse inmunotoxinas que comprenden una PE de la invencion para eliminar celulas reconocidas como diana de una poblacion de celulas en un cultivo. Asi por ejemplo, las celulas cultivadas de un paciente con un cancer que expresa CD22 pueden depurarse de las celulas cancerosas

35 poniendo en contacto el cultivo con inmunotoxinas que usan anticuerpos dirigidos contra CD22 como fraccion de reconocimiento.

[0149] En algunos casos, las celulas diana pueden estar contenidas dentro de una muestra biologica. Una "muestra biologica", tal como se usa en este documento, es una muestra de tejido o fluido biologico que contiene

40 celulas diana y celulas que no son diana. Tales muestras incluyen, pero no se limitan a tejidos de biopsia, sangre y celulas sanguineas (p. ej., leucocitos). Tipicamente, una muestra biologica se obtiene de un eucariota pluricelular, preferentemente un mamifero como una rata, un raton, una vaca, un perro, una cobaya o un conejo y con mayor preferencia, un primate como un macaco, un chimpance o un humano. Con la maxima preferencia, la muestra es de un humano.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

50 [0150] Este ejemplo expone los procedimientos experimentales usados en los estudios reflejados en la figura 1 y los resultados de estos.

Procedimiento experimental

55 [0151] ELISA con captura de inmunocomplejos (“ICC”-ELISA). El ensayo ICC-ELISA detecta reacciones Ag-Ab en disolucion. Se recubrieron placas de microtitulacion con 2 �g/ml de CD25-Fc de conejo (el dominio extracelular � de la CD25 humana fusionado con el Fc de la IgG1 de conejo) o con CD22-hFc (el dominio extracelular de la CD22 humana fusionado con el Fc de la IgG1 humana) en tampon de fosfato salino (PBS) durante la noche a 4°C. En un tubo aparte se prepararon diluciones seriadas de muestras del Ab en tampon de bloqueo y se mezclaron con 2 �g/ml de inmunotoxina dirigida contra CD22 o contra CD25. Las placas se lavaron y despues las mezclas inmunotoxina-Ab se transfirieron a pocillos individuales. Las placas se incubaron mas de 1 h a temperatura ambiente ("TA"). Los inmunocomplejos capturados en pocillos se detectaron mediante con anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de raton conjugado con peroxidasa de rabano ("HRP"). Despues de una incubacion de 1 h a TA,

5 las placas se lavaron y se aradio el sustrato tetrametilbenzidina ("TMB"). Despues de 10 min se aradio acido sulfurico 1M. La absorbancia se midio a 450 nm con 600 nm como referencia.

[0152] ELISA con recubrimiento directo (“DC”-ELISA). El ensayo DC-ELISA no detecta anticuerpos dirigidos contra epitopos conformacionales que se destruyen por la adsorcion a la placa, pero puede detectar

10 anticuerpos no conformacionales. Se recubrieron placas de microtitulacion con 2 �g/ml de inmunotoxina en PBS durante la noche a 4°C. Despues del lavado, se aradieron diluciones seriadas del Ab en tampon de bloqueo yse incubo durante la noche a 4°C. La etapa de deteccion uso los mismos anticuerpos secundarios que el ICC-ELISA.

[0153] Muestras de suero. Los pacientes con canceres de celulas B (BL1, BL2 y BL3) recibieron BL22 por

15 via intravenosa en los dias 1, 3 y 5, como parte de un estudio clinico de fase I realizado en el Instituto Nacional del Cancer. Despues de tres ciclos de tratamiento se obtuvieron muestras de suero. Los titulos de anticuerpos dirigidos contra PE38 se determinaron mediante ICC y DC-ELISA. Estos tres sueros de pacientes presentaron mas del 75% de actividad de neutralizacion, basada en los criterios de neutralizacion para el estudio clinico de fase I. Los pacientes con mesotelioma ("Meso 1" y "Meso 2") recibieron la inmunotoxina SS1P. El suero se obtuvo despues de

20 un ciclo de tratamiento. Se realizaron ensayos ICC y DC ELISA y ensayos de neutralizacion. El paciente con cancer epitelial recibio LMB-9. El suero se obtuvo despues de un ciclo de tratamiento. Se realizaron ensayos ICC y DC ELISA y ensayos de neutralizacion.

[0154] Los datos representativos de las respuestas de anticuerpos en pacientes tratados con tres

25 inmunotoxinas diferentes, BL22, SS1P y LMB9, se muestran en la figura 1. BL22, SS1P, LMB9 y LMB2 son los nombres de inmunotoxinas especificas conocidas en la tecnica, cada una de las cuales usa PE38 como la porcion toxica y que usan como porcion de reconocimiento una region Fv de un anticuerpo, como sigue: (i) para BL22, una Fv de un anticuerpo contra CD22, (ii) para SS1P, una Fv de un anticuerpo contra mesotelina, (iii) para LMB9, una Fv de un anticuerpo contra el antigeno Y de Lewis y (iv) para LMB2, una Fv de un anticuerpo contra CD25. Cada una

30 de estas inmunotoxinas es o ha sido objeto de un estudio clinico. Se recogieron muestras de suero de cada paciente y se evaluo su actividad de neutralizacion (basada en los criterios de los estudios clinicos) en un ensayo de muerte celular (figura 1, graficos de barras) y su reactividad con inmunotoxinas en diferentes ensayos ELISA (figura 1, graficos de lineas). La inmunotoxina usada para el tratamiento y el tipo de paciente se indican en la parte superior de los paneles de la figura 1. El numero de ciclos de tratamiento administrados al paciente antes de la recogida del

35 suero y los dias despues del ultimo ciclo de tratamiento se muestran en los paneles de los graficos de lineas de la figura 1. Las muestras se tomaron de pacientes que generaron anticuerpos neutralizantes, de modo que no pudieron continuar el tratamiento (> 75% de neutralizacion de inmunotoxinas). La neutralizacion se evaluo no solamente con la inmunotoxina usada para el tratamiento sino tambien con diferentes inmunotoxinas con distintas regiones Fv. La inmunotoxina usada para el ensayo de neutralizacion se indica en cada barra.

40 [0155] Las actividades de neutralizacion observadas al usar dos inmunotoxinas diferentes fueron muy similares (en los casos de BL1 y BL2), lo que indica que la actividad de neutralizacion se debe fundamentalmente al anticuerpo que reconoce PE38.

45 [0156] Los graficos de lineas de la figura 1 muestran los anticuerpos en las muestras de suero determinados por dos ensayos ELISA diferentes. Los rombos muestran las serales del ensayo ICC-ELISA. El ensayo ICC-ELISA puede medir los anticuerpos que reaccionan con la forma nativa de PE38. Los circulos muestran los resultados de los ensayos DC-ELISA. En todos los casos, el ICC-ELISA dio serales mas intensas que el DC-ELISA, lo que indica que los anticuerpos dirigidos contra PE38 fueron el tipo dominante generado en los pacientes. Los pacientes

50 tratados con diferentes inmunotoxinas y con diferentes canceres mostraron respuestas de anticuerpos similares en estos ensayos.

Ejemplo 2

55 Procedimiento experimental

[0157] Se produjeron MAb contra PE38 por un protocolo de fusion estandar. Se inmunizaron las cepas de ratones BaIb/c, A/J y C3H, cuatro a cinco veces por inyeccion de 4-10 �g de diversas inmunotoxinas ("IT") a intervalos de dos semanas. Cuatro semanas despues de la inyeccion final, los ratones recibieron una inyeccion de refuerzo de 4 �g de IT y cuatro dias despues se llevo a cabo la fusion. Se aislaron celulas del bazo y se fusionaron con celulas de mieloma SP2/0. Despues de la seleccion en un medio con hipoxantina, aminopterina y timidina, se analizo la produccion de anticuerpos especificos en los sobrenadantes mediante ICC-ELISA y/o un ensayo de neutralizacion y/o ELISA con placas de microtitulacion recubiertas con una disolucion de 1 mg/ml de IT en PBS. Las

5 inmunoglobulinas unidas se detectaron con anticuerpo de raton dirigido contra IgG � o con anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de raton conjugados con peroxidasa de rabano (Jackson). Los clones positivos se usaron para la produccion de anticuerpos en los sobrenadantes de los cultivos.

Estrategia de inmunización

10 [0158] Para obtener anticuerpos monoclonales que reaccionaran con epitopos conformacionales en la estructura nativa de la inmunotoxina, inmunizamos ratones con diversas inmunotoxinas que contenian PE38 y guardamos aquellos hibridomas que solamente reaccionaron con PE38 en el ensayo ELISA indirecto. Para obtener un juego difuso de anticuerpos, inmunizamos tres cepas de ratones (BaIb/c, A/J y CeH Hej) con varias

15 inmunotoxinas diferentes. Comenzamos las inmunizaciones con anti-Tac(dsFv)-PE38 y encontramos que la produccion de hibridomas fue baja, aunque los titulos de suero eran altos. Asumimos que la inmunotoxina estaba darando de algun modo las celulas del bazo y produciendo un bajo rendimiento de hibridomas. Para evitar la posible destruccion de las celulas B especificas por medio de las IgG de superficie, tambien inmunizamos ratones con formas mutantes de la inmunotoxina que tenian una actividad citotoxica muy baja debido a mutaciones puntuales en

20 las posiciones 553 (E a D) o 276 (R a G). Estas mutaciones se localizan en distintos sitios en la superficie de PE38. Por lo tanto, todos los posibles epitopos de PE38 deberian estar presentes en al menos uno de los mutantes.

[0159] Se realizaron un total de 16 fusiones, con 22 ratones inmunizados. Mantuvimos 60 hibridomas que mostraron titulos altos en el ICC-ELISA. La tabla 2, a continuacion, muestra una comparacion de los titulos de estos

25 MAb en ensayos DC-ELISA e ICC-ELISA. Todos los MAb mostraron un titulo mayor en el ICC-ELISA que en el DC-ELISA, lo que indica que el panel de MAb representa predominantemente la respuesta de anticuerpos de los pacientes detectada en el ICC-ELISA.

[0160] Todos los anticuerpos fueron del isotipo IgG1, excepto un IgG2a (IP16) y tres IgG2b (IP36, IP37 e

30 IP49). La afinidad de cada MAb se determino mediante el sistema Biacore, en que el MAb se capturo en un chip por un anticuerpo de conejo dirigido contra IgG de raton y la inmunotoxina BL22 se dejo fluir sobre el chip (Canziani y col., "Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore", Anal. Biochem. 325: 301-307 (2004)). Se muestran las Kd, que fueron de 0,0004 a 81 nM.

35 Ejemplo 3

[0161] Este ejemplo expone los procedimientos experimentales usados en los estudios reflejados en la figura 2 y los resultados obtenidos en estos.

40 Procedimiento experimental

[0162] Se examino la competencia mutua de todos los pares posibles de MAb dirigidos contra PE38 tal como se ha descrito previamente (Nagata y col., "Rapid grouping of monoclonal antibodies based on their topographical epitopes by a label-free competitive immunoassay", J. Immunol. Methods 292: 141-155 (2004)). Se recubrieron 45 placas de microtitulacion (MaxiSoap, Nalge Nunc, Rochester, NY, EE. UU.) con 200 ng/50 �g por pocillo de anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de raton (Jackson Immuno Research, Grove, PA, EE. UU.) en PBS durante la noche a 4°C. Despues del lavado se aradieron 2 �g/ml del MAb indicador, n°1, (sobrenadante del cultivo de hibridoma) a cada pocillo y se incubo durante la noche a 4°C. En un tubo separado se diluyo el MAb competidor, n° 2, (6 �g/ml) en tampon de bloqueo y se mezclo con 10 ng/ml de la IT dirigida contra CD30, T6 y se incubo durante la 50 nochea4°C. Las placas se lavaron dos vecesydespueslamezcla de ITyMAb n°2 se transfirio a cada pocillo (50

�g/ml). Como estandares, se pusieron diluciones de los antigenos en tampon de bloqueo (1-10 ng/ml por IT) en la misma placa. Las placas se incubaron durante 1 h a TA y se lavaron dos veces. Los inmunocomplejos capturados en las placas se hicieron reaccionar con 50 �l por pocillo de anticuerpo de cabra dirigido contra IgG humana conjugado con HRP (Jackson). Despues de una incubacion durante 2 h a TA, las placas se lavaron y se aradio el

55 sustrato tetrametilbenzidina (kit del sustrato TMB, Pierce, 100 �l por pocillo). La reaccion enzimatica se detuvo despues de 10-20 min mediante la adicion de 50 �l de acido sulfurico 2 N por pocillo. La absorbancia se midio a 450 nm, con 600 nm como referencia.

Ejemplo 4 Mapeo de epítopos topográficos

[0163] Mediante el procedimiento anterior llevamos a cabo el mapeo de epitopos topograficos basado en la

5 competencia mutua de todos los pares de epitopos posibles. Este procedimiento no solo identifica los anticuerpos que se unen al mismo epitopo, sino que tambien proporciona datos cuantitativos sobre la fuerza de las interacciones. Estos datos se muestran en la figura 2, con un codigo de colores en el que rojo representa una competencia muy fuerte y azul claro ausencia de competencia.

10 [0164] Los datos demuestran que hay siete grupos epitopicos principales que pueden dividirse ademas en trece subgrupos mediante un indice de estabilidad del agrupamiento. Los grupos epitopicos son claramente discretos, con relativamente poco solapamiento, lo que indica que hay un numero limitado de epitopos en la molecula de PE38 que son muy inmunogenos.

15 [0165] Este ejemplo expone los procedimientos usados en los estudios cuyos resultados se indican en la figura 3 y los resultados de estos.

[0166] Para confirmar que hay un numero limitado de epitopos en PE38, usamos el sistema Biacore. La inmunotoxina M1 se diluyo a 50 �g/ml en un tampon de acoplamiento de aminas y se inmovilizo sobre un chip 20 sensor BIAcore CM5 (Laricchia y col., "Epitope mapping analysis of apolipoprotein B-100 using a surface plasmon resonance-based biosensor", Biosens. Bioelectron. 16: 963-969 (2001)). Cada uno de los MAb se purifico con SepharoseTM con proteina G, se diluyo a 50 �g/ml en PBS y se inyecto sobre la superficie del chip a 10 �l/min. Los MAb que reaccionaron con diferentes epitopos se unieron aditivamente a la PE38 en el chip, pero los MAb asignados al mismo grupo epitopico no aumentaron la seral porque el epitopo ya estaba ocupado por el MAb unido

25 previamente. En experimentos diferentes se demostro que los MAb a 50 �g/ml (�= 500 nM) eran suficientes para saturar los sitios de union. Ademas, el nivel de union de una mezcla de IP36, IP4, IP21 e IP69 es practicamente el mismo que el nivel de union acumulado que se consigue con las inyecciones secuenciales.

[0167] Estos datos confirman que los epitopos identificados en la figura 2 son epitopos no solapantes. Al 30 menos cuatro anticuerpos diferentes pueden unirse simultaneamente a la molecula de PE38.

Ejemplo 5

[0168] Este ejemplo expone el procedimiento usado en los estudios de identificacion de la localizacion de los 35 epitopos de PE38. Los resultados de los estudios se exponen en la figura 4.

Procedimiento experimental

ELISA competitivo para determinar la unión de MAb a una serie de mutantes de PE38

40 [0169] El efecto competitivo de cada inmunotoxina mutante sobre la union de cada MAb a la inmunotoxina que contiene PE38 natural se determino en un ensayo ELISA. Se recubrieron placas de microtitulacion con 3 �g/ml de mesotelina-rFc (el fragmento Fc de la IgG1 de conejo fusionado con el dominio extracelular de la mesotelina humana) en PBS durante la noche a 4°C. Despues del lavado, se aradieron 2 �g/ml de SS1P en tampon de bloqueo

45 a cada pocillo y se incubo durante la noche a 4°C. Una serie de diluciones con un factor de dilucion de 4 de cada mutante (0,04-10.000 ng/ml) se mezclo con cada MAb en tubos separados a 4°C durante la noche para alcanzar el equilibrio. La concentracion de cada MAb en las mezclas se habia determinado previamente en ensayos ELISA independientes sin los competidores como los valores que daban las serales semimaximas en el ELISA. El MAb no complejado en las mezclas fue capturado entonces por la inmunotoxina SS1P (un fragmento dsFv de un anticuerpo

50 dirigido contra mesotelina fusionado con la PE38 natural) con la que se habia recubierto la placa a traves de la proteina de fusion mesotelina-Fc. Una inmunotoxina mutante tiene un Fv diferente y no puede ser atrapada por la proteina de fusion mesotelina-Fc en las placas. El nivel de MAb libres atrapados por la SS1P dependio de la reactividad cruzada del MAb con el mutante y de la concentracion del mutante. Finalmente, la cantidad de MAb asociado con la SS1P se determino mediante la incubacion con anticuerpo de cabra dirigido contra IgG de raton

55 (H�L) marcado con HRP y a continuacion con el sustrato TMB.

Localización de epítopos

[0170] Previamente habiamos realizado una serie de mutaciones en PE38 para obtener informacion sobre la

funcion de estos restos y demostrado que era posible modificar numerosos restos sin una perdida de funcion. Usamos estos mutantes y otros nuevos en los que intencionadamente mutamos restos superficiales con largas cadenas laterales hidrofilas a alanina, glicina o glutamina y los usamos para localizar la posicion de los epitopos mediante un ensayo de union competitiva. El resultado se evaluo como reactividad cruzada con la inmunotoxina 5 natural, la cual se definio como el cociente de concentraciones de cada mutante y del tipo natural requeridas para unirse a la misma cantidad de cada MAb (Miller, JJ, Valdes, R., "Methods for calculating cross-reactivity in immunoassays", J. Clin. Immunoassay 15: 97-107 (1992)). Este ensayo no solo mide la union, sino tambien cuanto disminuye la union por la mutacion. Los datos en la figura 4 muestran los resultados con 45 mutaciones puntuales diferentes. Aproximadamente la mitad de las mutaciones resultaron en una disminucion de la union de algunos de

10 los anticuerpos. Hay varias caracteristicas interesantes. Una es que, con frecuencia, las mutaciones puntuales individuales disminuyen la union de todos los anticuerpos en ese grupo epitopico. Otra es que mas de una mutacion puede disminuir la union de los anticuerpos en un grupo epitopico concreto.

Ejemplo 6

15 [0171] Este ejemplo discute los resultados de los estudios discutidos anteriormente.

[0172] Definimos un aminoacido relacionado con un epitopo como aquel cuya sustitucion con alanina o glicina disminuia al menos 20 veces la union a mas de dos MAb asignados al mismo epitopo. Basandonos en este criterio,

20 identificamos N314, E327, E331 y Q332 como aminoacidos relacionados con Ep1. De la misma manera se identificaron P290, R467 y R538, D313, N314 y D324, R432, E431 y R505, R490 y R576, R513 y E548 y K590, respectivamente, como aminoacidos relacionados con Ep2b, 2c, 3, 4a, 5, 6a y 7. Encontramos que pudieron establecerse mutaciones que afectaban a la union de MAb para diez de los trece subgrupos epitopicos. Tres subgrupos no pudieron identificarse. Esto se debio a no tener suficientes MAb para estudiar o a que ningun mutante

25 mostro una perdida de union.

[0173] Estos datos indican que podemos cambiar la antigenicidad de PE38 mediante la introduccion de mutaciones que destruyen el epitopo. Se espera que las inmunotoxinas con estas mutaciones sean menos inmunogenas.

Ejemplo 7

[0174] Este ejemplo expone los procedimientos usados para la construccion. produccion y purificacion de las inmunotoxinas usadas en los estudios descritos en este documento.

35 [0175] Las inmunotoxinas mutadas indicadas en la tabla 3 se prepararon por protocolos estandar, tal como se ha descrito previamente (Pastan y col., "Recombinant immunotoxins in the treatment of cancer", Methods Mol. Biol.,

248: 503-518 (2004)). La mayoria de las mutaciones se realizaron en la inmunotoxina HA22 (Salvatore y col., "Improved cytotoxic activity towards cell lines and fresh leukemia cells of a mutant anti-CD22 immunotoxin obtained 40 by antibody phage display", Clin. Cancer Res. 8: 995-1002 (2002)), pero algunas se hicieron en la inmunotoxina M1(dsFv)-PE38. Las mutaciones se realizaron por el metodo de Kunkel con modificaciones de menor importancia. Los componentes de las IT se expresaron en Escherichia coli BL21 (�DE3) y se acumularon en cuerpos de inclusion. Los cuerpos de inclusion se solubilizaron y plegaron por dilucion en un tampon de plegamiento. La proteina monomerica activa se purifico practicamente hasta homogeneidad a partir de la disolucion de plegamiento por

45 cromatografia de intercambio ionico y de exclusion por tamaros, tal como se ha descrito previamente. La concentracion de las proteinas se determino por el ensayo de Bradford (Coomassie Plus, Pierce, Rockford, IL, EE. UU.).

Ensayo de citotoxicidad

50 [0176] La actividad de las IT se evaluo con celulas de Daudi mediante un ensayo de inhibicion de la sintesis de proteinas (inhibicion de la incorporacion de leucina marcada con tritio en la proteina celular) en placas de 96 pocillos, tal como se ha descrito previamente (Kreitman y col., "Complete regression of human B-cell lymphoma xenografts in mice treated with recombinant anti-CD22 immunotoxin RFB4(dsFv)PE38 at doses tolerated by

55 cynomolgus monkeys", Int. J. Cancer 81: 148 (1999)). La actividad de la molecula se define como la CI50, la concentracion de la toxina que reduce la incorporacion de radioactividad en el 50% en comparacion con las celulas no tratadas con la toxina. La actividad relativa se calculo con inmunotoxinas PE38 naturales como estandar. La mayoria de los mutantes retuvo una buena actividad destructora de celulas. (Salvatore G. y col., "Improved cytotoxic activity towards cell lines and fresh leukemia cells of a mutant anti-CD22 immunotoxin obtained by antibody phage display", Clin. Cancer Res. 8: 995-1002 (2002)).

Ejemplo 8

5 [0177] Este ejemplo discute las localizaciones de las mutaciones relacionadas con epitopos en la estructura de PE38.

[0178] Se construyo un modelo de PE38 mediante la extraccion de los restos correspondientes a PE38 de una estructura cristalina de la exotoxina A de Pseudomonas. (Wedekind, JE y col., "Refined crystallographic structure of

10 Pseudomonas aeruginosa exotoxin A and its implications for the molecular mechanism of toxicity", J. Mol. Biol. 314: 823-837 (2001)). Se localizaron todos los aminoacidos mutados. Cuando mas de dos MAb asignados al mismo epitopo mostraron una disminucion de la union a un mutante, el resto mutado se identifico como un aminoacido relacionado con un epitopo (los experimentos de union mostrados en la figura 4).

15 Ejemplo 9

[0179] Se realizo una serie de ensayos de cytotoxicidad con las inmunotoxinas preparadas con PE38, en la que se hicieron mutaciones unicas o multiples de diversos restos en la secuencia de la PE. Para facilitar la comparacion, todas las inmunotoxinas usaron la misma fraccion de reconocimiento. Los resultados de los estudios 20 se exponen en la tabla 4. La primera columna comienza con "HA22" que es una inmunotoxina construida a partir de un anticuerpo dirigido contra CD22 fusionado con PE38 (vease, p. ej., Salvatore y col., Clin. Cancer Res. 8(4): 9951002 (2002)). Cada designacion en la columna 1 por debajo de "HA22" identifica una inmunotoxina que es identica a HA22 excepto por la sustitucion de uno o mas restos de la fraccion de PE38. Los restos o los restos que se han mutado se identifican indicando el resto presente normalmente en la posicion identificada por el numero en el codigo 25 de una sola letra, el numero de la posicion y a la derecha del numero, el resto introducido en la posicion indicada (asi por ejemplo, "Q332A" indica que la glutamina que normalmente se encuentra en la posicion 332 de la secuencia de 613 aminoacidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1) se ha mutado a alanina, mientras que R467A indica que la arginina que normalmente se encuentra en la posicion correspondiente a la posicion 467 de SEQ ID NO:1 se ha mutado a alanina, y asi sucesivamente). La segunda columna identifica el epitopo o los epitopos de la PE cuya 30 mutacion o combinacion de mutaciones tiene el efecto de reducir la inmunogenicidad. La tercera columna, titulada "n°de MAb en este grupo epitopico" identifica cuantos anticuerpos monoclonales ("MAb") se han identificado que se unen a ese epitopo. La siguientes catorce columnas muestran los resultados de los ensayos de citotoxicidad llevados a cabo con las diversas inmunotoxinas. Dado que los ensayos se realizaron en momentos diferentes, con varios tipos de celulas diferentes, las comparaciones entre la citotoxicidad de las diversas inmunotoxinas solamente

35 pueden hacerse entre las cifras de la misma columna. Los numeros mostrados en estas columnas son los valores de la CI50 de las inmunotoxinas, indicados en ng/ml.

[0180] La tabla 4 muestra ademas una serie de combinaciones de mutaciones sucesivas en las que se mutaron primeramente cuatro, despues cinco, luego seis, siete y finalmente ocho restos. Los restos concretos se 40 seleccionaron para su mutacion porque cada uno de ellos destruye un epitopo diferente de la PE. La figura 5 muestra que la CI50 del mutante en el que se combinaron siete mutaciones (el mutante "7X") y la CI50 del mutante en el que se combinaron ocho mutaciones (el mutante "8X") estuvieron proximas a la de la inmunotoxina de partida, HA22. El mutante 7X tiene las siguientes sustituciones de los restos aminoacidicos correspondientes a los restos designados de SEQ ID NO:1: R313A, Q332S, R432G, R467A, R490A, R513A y K590S, mientras que el mutante 8X

45 tiene todas estas mutaciones mas una mutacion E548S. Dado que previamente se observo que las mutaciones seleccionadas destruian la capacidad de los anticuerpos correspondientes a epitopos concretos de reconocer dichos epitopos, se espera que la combinacion de mutantes exhiba una inmunogenicidad notablemente reducida en comparacion con PE38 y otras variantes de la PE usadas actualmente.

50 Ejemplo 10

[0181] La figura 6 muestra los resultados de la evaluacion in vivo de los efectos del mutante 8X en un tumor humano en un modelo de xenoinjerto en raton. "CA46" es un linfoma que crece de manera subcutanea como un tumor solido en ratones. Las celulas tumorales se introdujeron en los ratones en el dia 0. Los ratones se dividieron 55 en grupos que recibieron el vehiculo (control) o una de las dos inmunotoxinas en los dias 8, 10 y 12. Las inmunotoxinas fueron HA22, una inmunotoxina dirigida contra CD22 que usa PE38 como fraccion toxica, y el mutante 8X, que es el mismo anticuerpo dirigido contra CD22 fusionado con una PE38 que tiene las siguientes sustituciones de los restos aminoacidicos correspondientes a los restos designados de SEQ ID NO:1: R313A, Q332S, R432G, R467A, R490A, R513A, E548S y K590S. La figura 6 muestra que el mutante 8X presento una

citotoxicidad para el tumor CA46 similar a la de la inmunotoxina de partida. Por lo tanto, las PE de la invencion pueden emplearse como fraccion citotoxica de inmunotoxinas. Considerando el mapeo de epitopos mostrado en la figura 4, se espera ademas que estas inmunotoxinas tengan notablemente menos inmunogenicidad que las inmunotoxinas preparadas con las PE disponibles actualmente.

Tabla 1. Resumen de la producción de MAb dirigidos contra PE38

Numero de Refuerzo Procedimiento

Fusion Inmunizacion Raton Titulo clones

final de cribado

finales (c) ELISA

ICC-ELISArecubierto con CD30 con M1

1

M1-iv x 2 � M1-ip x 3 M1-ip Balb/c, mezcla de dos ratones 105 recubierto con M1 recubierto con M1 2

2

M1-iv x 2 � M1-ip x 3 M1-iv Balb/c, mezcla de dos ratones 105 recubierto con M1 0

3

M1-iv x 2 � M1-ip x 3 M1-ip Balb/c, mezcla de dos ratones 105 recubierto con M1 � M1biotina 0

4

M1-iv x 2 � M1-ip x 3 M1-ip Balb/c, mezcla de dos ratones 105 recubierto con M1 � M1biotina � ICC con CD30 5

5

M1-iv x 2 � M1-ip x 3 M1-ip Balb/c, mezcla de dos ratones 105 recubierto con M1 � M1biotina 0

6

M1-ip x 3 M1-ip Balb/c, mezcla de dos 5 x 104 recubierto con M1 � M1biotina � ICC 0

ratones

con CD30

7

M1-ip x 6 D553E-ip Balb/c 105 recubierto con M1 � ICC con CD30 3

8

M1-ip x 4 D553E-ip Balb/c 5 x 104 recubierto con M1 � ICC con CD30 21

recubierto con

9

D553E-ip x 4 D553E-ip A/J 3 x 103 105 M1 � ICC con CD30 � 31

neutralizacion

recubierto con

10

R276G-ip x 4 R276G-ip A/J 104 105 M1 � ICC con CD30 � 7

neutralizacion

recubierto con

11

R276G-ip x 5 R276G-ip A/J 104 M1 � ICC con CD30 � 1

neutralizacion

recubierto con

12

R276G-ip x 6 R276G-ip Balb/c 104 M1 � ICC con CD30 � 16

neutralizacion

13

D553E-ip x 7 D553E-ip Balb/c 105 ICC con 7

CD30 (continuacion) Fusion Inmunizacion Refuerzo Raton Titulo Procedimiento Numero de final de cribado clones finales (c) 14 M1-ip x 4 D553E-ip C3H Hej 3 x 104 ICC con 0 CD30 15 M1-ip x 3 � III-ip A/J 3 x105 ICCcon 30 3 D553E x 2 16 M1-ip x 3 � D553E-ip A/J 3 x 105 ICC con 13 D553E x 2 CD30

(c) Los clones se seleccionan por su alta afinidad relativa en ICC-ELISA con M40-3 como estandar. M1: M1(dsFv)-PE38, D553E: mutante de LMB-2 con D553E, R276G: mutante de M1(scFv)PE38 con R276G, III: dominio III

Tabla 2. Lista de MAb estudiados

Nombre

Epítopo Isotipo Título (log µl/µg) Afinidad (nM)

IP43

1a �/I 2,6 0,10

IP62

1a �/I 2,5 0,2

IP57

1a �/I 1,9 0,00039

IP11

1b �/I 2,6 6�

IP39

1b �/I 2,8 0,93�

IP47

1b �/I 2,8 0,47�

IP70

1b �/I 2,5 58�

IP48

1b �/I 2,7 3,3�

IP1

1b �/I 2,6 5,80

IP35

1b �/I 2,8 3,70

IP36

1b �/I 2,6 3,60

IP42

1b �/I 2,5 43

IP34

2a �/I 2,7 0,11�

IP29

2b �/I 2,8 20

IP63

2b �/I 2,7 5

IP2

2b �/I 2,7 0,30

IP15

2c �/I 2,6 5,3

IP22

2c �/I 2,6 3,4�

IP51

2c �/I 2,2 3,10

IP76

2c �/I 3,0 0,19

IP83

2c �/I 2,5 0,43

IP9

3a �/I 2,4 4,80

IP18

3a �/I 2,5 0,09�

IP16

3a �/I 2,5 0,24�

IP32

3a �/I 2,7 33

IP44

3b �/I 2,5 0,14

IP45

3b �/I 2,9 0,47

IP58

3b �/I 2,4 0,24

IP7

4a �/I 2,7 0,04

IP10

4a �/I 2,1 0,04

IP31

4a �/I 2,9 0,27�

IP37

4a �/I 2,7 1,40

IP49

4a �/I 1,7 2,60

IP3

4a �/I 2,6 0,00038

IP27

4a �/I 2,7 16�

IP72

4a �/I 2,8 4,4�

IP14

4b �/I 2,6 81

IP82

4b �/I 2,7 11�

IP86

4b �/I 2,9 0,41�

IP13

5 �/I 2,6 1,2

(continuacion)

Nombre

Epítopo Isotipo Título (log µl/µg) Afinidad (nM)

IP21

5 �/I 2,8 1,50

IP28

5 �/I 2,2 1,70

IP8

5 �/I 2,4 0,93

IP25

5 �/I 2,7 1,90

IP55

5 �/I 2,8 1,10

IP4

6a �/I 2,5 0,13�

IP19

6a �/I 2,6 3,70

IP24

6a �/I 2,3 5,4�

IP40

6a �/I 2,7 2,9

IP87

6a �/I 2,8 2,3�

IP6

6b �/I 2,4 0,13�

IP30

6b �/I 2,8 0,044�

IP12

6b �/I 2,4 0,82

IP54

7 �/I 2,9 2,0�

IP73

7 �/I 2,9 4,8

IP46

7 �/I 2,7 2,2�

IP52

7 �/I 2,8 6,8�

IP69

7 �/I 2,5 0,12�

IP74

7 �/I 2,8 6,5�

� analisis de union de complejos

Tabla 3. Actividades de mutantes de PE38 con cambios de aminoácidos únicos (Nota: todos son muy activos)

IT HA22 Actividad relativa (%)

Natural 100

P290A 58

R313A 133

N314A 42

D324A 133

E327A 117

E331A 144

Q332A 176

D403A 19

E431A 140

R432A 194

R458A 63

R467A 93

R490A 150

R505A 144

R513A 106

L516A 140

R538A 188

E548A 23

R576A 100

K590Q 120

Tabla 4. CI50 de las inmunotoxinas preparadas por mutación de la PE en restos que afectan a la unión a diferentes epítopos

Ensayo n° 14

0,7

Ensayo n° 13

0,44

Ensayo n° 12

1,8

Ensayo n° 11

1,0

Ensayo n° 10

0,9 0,7 0,7

Ensayo n° 9

0,7 0,55 30 >100 0,4

Ensayo n° 8

2,0 1,9(�) 4,4 5,0/6,2

Ensayo n° 7

0,2 0,45

Ensayo n° 6

4 6 5 10

Ensayo n° 5

3,3 3,7 4,2 6,5

Ensayo n° 4

3,4 4,5

Ensayo n° 3

1,0 1,0

Ensayo n° 2

1,0 2,0 1,1 3,0

Ensayo n° 1

1,2ng/ml 3,0 0,72 0,72 1,5 2,1

N° de MAb bloqueados al mutar este resto

8 8 8 3 3 3 3 3/3 8 3 3 3

N° de MAb en este grupo epitopico

37 8 3 3 3 3/3 8 3 3 3

Epitopo

1 1 1 2c 5 2c 1/5/7 7 5/7 5/1 5/2/7 1 5 2 7

IT con los restos designados mutados en la secuencia de la PE

Inmunotoxina HA22 (control) N314A� N314S Q332A R467A R490A R538A� Q332A R490A K590A/K606A/613del� K590A R490A K590A� Q332A R490A� K606A� R490A R538A K590A� Q332S R490S� R538S� K590S

31 32

(continuacion) La mutacion redujo la citotoxicidad en mas del 50% �/

Ensayo n° 14

0,9 0,8

Ensayo n° 13

0,7

Ensayo n° 12

1,0 0,8

Ensayo n° 11

0,75 0,6

Ensayo n° 10

0,8

Ensayo n° 9

Ensayo n° 8

Ensayo n° 7

Ensayo n° 6

Ensayo n° 5

Ensayo n° 4

Ensayo n° 3

Ensayo n° 2

Ensayo n° 1

N° de MAb bloqueados al mutar este resto

17 22 5

N° de MAb en este grupo epitopico

(5) 6

Epitopo

1/2c/5/7 3/1/2c/5/7 3/1/4a/2c/5/7 3/1/4a/2c/5/6/7 3/1/4a/2c/5/6/6/7

IT con los restos designados mutados en la secuencia de la PE

Q332S R467A R490A K590S R313A Q332S R467A R490A K590S R313A Q332S R432G R467A R490A K590S R313A Q332S R432G R467A R490A R513A K590S R313A Q332S R432G R467A R490A R513A E548S K590S

[0182] Aunque se han proporcionado ejemplos especificos, la descripcion anterior es ilustrativa y no restrictiva. Numerosas variaciones de la invencion seran evidentes para los expertos en la tecnica al revisar esta memoria descriptiva. Por lo tanto, el alcance de la invencion no se determinara con referencia a la descripcion anterior, sino que debera determinarse con referencia a las reivindicaciones adjuntas junto con el alcance completo

5 de equivalentes.

[0183] SECUENCIA SEQ ID NO:1

LISTADO DE SECUENCIAS 5 [0184]

<110> El Gobierno de los Estados Unidos de America representado por el Secretario de Salud y Servicios Humanos del Instituto Nacional de la Salud

10 <120> Exotoxinas de Pseudomonas mutadas con antigenicidad reducida

<130> AHB/FP

<140> 15 <141> 2006-07-25

<151> EP06788523.6

<151> 2006-07-25 20 <150> WOPCT/US06/28986

<151> 2006-07-25

<150> US 60/703,798 <151> 2005-07-29

<160> 4 5 <170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 613

<212> PRT 10 <213> Pseudomonas aeruginosa

<220>

<223> Exotoxina A de Pseudomonas exotoxin A (PE) nativa 15 <400> 1

<210> 2 20 <211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

25 <223> Descripcion de secuencia artificial: secuencia adicional en carboxilo terminal, secuencia de translocacion al citosol

<400> 2

<210> 3

<211> 4 35 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripcion de secuencia artificial: secuencia adicional en carboxilo terminal, secuencia de translocacion al 40 citosol

<400> 3

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> Secuencia artificial 50

<220>

<223> Descripcion de secuencia artificial: secuencia C-terminal de PE nativa, residuos 609-613

55 <400> 4

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una exotoxina A de Pseudomonas ("PE") aislada, en que dicha PE tiene una sustitucion con alanina,

   glicina, serina o glutamina en lugar del resto aminoacidico R513, en que el resto aminoacidico R513 se define en 5 referencia a la secuencia de aminoacidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1).
2. 2. Una PE de acuerdo con la reivindicacion 1, en que dicha PE tiene ademas una sustitucion con alanina, valina, glicina, leucina, isoleucina o glutamina en lugar de la arginina en el resto 490, en que dicho resto aminoacidico se define en referencia a la secuencia de aminoacidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1).
3. 3. Una PE de la reivindicacion 2, en que ademas dicho sustituto de dicho resto aminoacidico 490 de SEQ ID NO:1 es alanina.
4. 4. Una PE de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que dicha PE se 15 selecciona del grupo que consta de PE35, PE38, PE38KDEL, PE40, PE4E y PE38QQR.
5. 5. Una PE de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en que dicha PE comprende ademas una o mas de las sustituciones R313A, Q332S, R432G, R467A, R490A, E548S y K590S.

   20 6. Una molecula quimerica que comprende (a) una fraccion de reconocimiento conjugada o fusionada con (b) una exotoxina A de Pseudomonas ("PE"), en que dicha PE tiene una sustitucion con alanina, glicina, serina o glutamina en lugar del resto aminoacidico R513, en que dicho resto aminoacidico R513 se define en referencia a la secuencia de aminoacidos de la PE nativa (SEQ ID NO:1).

   25 7. Una molecula quimerica de la reivindicacion 6, en que dicha PE es tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.

6. 8. Una molecula quimerica de las reivindicaciones 6 o 7, en que dicha fraccion de reconocimiento es un

   anticuerpo. 30
7. 9. Una molecula quimerica de la reivindicacion 8, en que dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consta de un scFv, un dsFv, un Fab y un F(ab')2.
8. 10. Una molecula quimerica de las reivindicaciones 6 o 7, en que dicha fraccion de reconocimiento es una 35 citocina.
9. 11. Una composicion que comprende (a) una molecula quimerica de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 y (b) un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

   40 12. Un acido nucleico aislado que codifica una exotoxina A de Pseudomonas ("PE") modificada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y que opcionalmente codifica ademas una fraccion de reconocimiento.
10. 13. Un acido nucleico aislado de la reivindicacion 12, en que dicha fraccion de reconocimiento es tal como

    se define en las reivindicaciones 8, 9 o 10. 45

11. 14.

    Un acido nucleico aislado de las reivindicaciones 12 o 13, en que dicho acido nucleico esta ligado operativamente a un promotor.

12. 15.

    Un procedimiento in vitro para la inhibicion del crecimiento de una celula que porta una molecula

    50 diana, en que dicho procedimiento comprende la puesta en contacto de dicha celula con una molecula quimerica de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en que la puesta en contacto de dicha celula con dicha molecula quimerica inhibe el crecimiento de dicha celula.
13. 16. Una molecula quimerica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 para el uso en

    55 un procedimiento de tratamiento, en que dicho tratamiento es destruir las celulas reconocidas como diana por dicha molecula.
14. 17. Una composicion farmaceutica que comprende la PE de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o la molecula quimerica de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 junto con un vehiculo farmaceuticamente

    aceptable para el uso en un procedimiento de tratamiento.