CN103068850A

CN103068850A - 单链可变片段抗-cd133抗体及其用途

Info

Publication number: CN103068850A
Application number: CN2010800682551A
Authority: CN
Inventors: J.R.奥尔菲斯特; J.潘亚姆; S.K.斯瓦米纳桑; D.A.瓦勒马
Original assignee: UNVIVERSITY OF MINNESOTA
Current assignee: UNVIVERSITY OF MINNESOTA
Priority date: 2010-05-26
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2013-04-24
Also published as: US20160215058A1; WO2011149493A1; US20170240627A1; US9624303B2; AU2010354084A1; MX2012013702A; EP2576620A1; US20130224202A1; US11098109B2; CA2800488A1; US9249225B2; JP2013534813A

Abstract

本文公开了特异性地结合人CD133的单克隆抗体和其单链可变片段。本文也公开了生产特异性地结合人CD133的单克隆抗体的杂交瘤。

Description

单链可变片段抗-CD133抗体及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年5月26日提交的美国临时专利申请系列号61/348,348和2010年10月5日提交的美国临时专利申请系列号61/390,011的优先权，它们各自通过引用整体并入本文。

背景技术

癌细胞象正常细胞一样分化。肿瘤细胞群包括：更低分化的、自我更新的、肿瘤起源干细胞的相对小组群，和更高分化的肿瘤细胞的相对更大的组群。更高分化的细胞对化学疗法更敏感，更低分化的癌症干细胞中的小部分具有更高的抗药性，因而促成药物难以治疗的复发。CD133是一种确定的癌症干细胞标志物。

人CD133是一种细胞表面糖蛋白，其已经被用作造血干细胞、神经干细胞的标志物，并用于富集许多癌症中的肿瘤起源细胞群，所述癌症包括结肠癌和胶质母细胞瘤（Kemper等人; Weigmann等人, 1997; Yin等人, 1997）。抗-CD133抗体是可用于鉴别、分离和靶向这些干细胞群体的重要工具。尽管许多CD133抗体是商购可得的，它们具有几个限制。首先，最广泛地使用的抗-CD133单克隆抗体识别这样的对象：所述对象最初被认为是很不明确的糖基化表位（Bidlingmaier等人, 2008），但是最近被报道为在分化过程中丢失的未糖基化的表位，所述丢失可能是由于表位掩蔽（Kemper等人）。在任一种情况下，这些抗体都不会检测出表达某些翻译后修饰的CD133表位的细胞，因此不能用于确定总的CD133表达。其次，商购可得的靶向未修饰的CD133表位的抗-CD133抗体经常是多克隆的。第三，大多数目前可得到的抗体仅适用于有限的生物学测定中。为了克服这些缺点，需要制备新的抗-CD133单克隆抗体，所述抗体会特异性地识别CD133的未糖基化的表位，且可用于多种生物学测定中。

癌是转化的上皮细胞的侵袭性恶性肿瘤。一些最致命的癌症是癌，包括药物难以治疗的胰腺、头颈、前列腺、乳房、结肠和其它器官的癌症。例如，在胰腺癌中，发现仅10-15%的患者在确诊时是可切除的，这是因为它的侵袭性生长和向淋巴结和肝脏的快速转移。当考虑所有阶段时，生存中值是3-6个月，5年存活率为1-4%，仅在美国，每年有超过32,000位患者死于该病。乳腺癌具有很好的存活率，但是根据美国癌症学会（American Cancer Society）估测，在2007年仍然有178,000例新病例，预期40,000例死亡。在头颈癌的情况下，在美国，在2006年报道了40,000例病例，约11,000例死于该病。主要难点（culprit）是药物难以治疗的疾病的转移性复发，所以迫切需要替代性药物。

发明内容

在一个方面，本发明提供了一种特异性地结合人CD133的单克隆抗体。在有些实施方案中，所述单克隆抗体是由本文所述的杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体。

在另一个方面，本发明提供了在本文中鉴别为杂交瘤克隆7的杂交瘤。

在另一个方面，本发明提供了由杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体的单链可变片段（scFv）。在有些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列。

在另一个方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码下述氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:55。在有些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含编码SEQ ID NO:53的氨基酸序列的核苷酸序列。在一个具体实施方案中，所述分离的多核苷酸包含SEQ ID NO:56的核酸序列。

在另一个方面，本发明提供了融合多肽。通常，融合多肽包括靶向部分和毒素部分。所述靶向部分可以包括本文所述的单克隆抗体或其scFv，它们会特异性地结合癌症干细胞差别地表达的标志物。在有些实施方案中，所述毒素部分可以包括细胞裂解毒素的去免疫的治疗活性部分。

在另一个方面，本发明提供了组合物，所述组合物包括刚刚描述的多种融合多肽。在有些实施方案中，所述组合物可以包括第一种融合多肽和第二种融合多肽，其中所述第一种融合多肽特异性地结合癌症干细胞差别地表达的第一种标志物，且所述第二种融合多肽特异性地结合癌症干细胞差别地表达的第二种标志物。在一个实施方案中，一种融合多肽可以特异性地结合CD133，且另一种融合多肽可以特异性地结合EGFR。

在另一个方面，本发明提供了组合物，其中所述单克隆抗体或其scFv可以与纳米颗粒偶联。在某些实施方案中，所述纳米颗粒可以是可生物降解的。在某些实施方案中，所述纳米颗粒可以含有细胞裂解毒素。

在另一个方面，本发明提供了治疗方法，所述治疗方法包括：给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包括本文所述的单克隆抗体或其scFv。在有些实施方案中，所述单克隆抗体或其scFv可以与治疗部分融合，或与含有治疗性化合物的纳米颗粒偶联。

在另一个方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括与可检测的标志物偶联的本文所述的单克隆抗体或其scFv。

在另一个方面，本发明提供了一种检测表达癌症干细胞标志物的细胞的方法。通常，所述方法包括：使至少一个表达CD133的细胞和组合物接触，所述组合物包括与可检测的标志物偶联的本文所述的单克隆抗体或其scFv，并检测特异性地结合所述细胞的组合物的部分。在有些实施方案中，所述组合物可以施用给受试者。

上述发明内容无意描述每个公开的实施方案或本发明的每种实现。下面的描述更具体地例证了示例性的实施方案。在遍布本申请的几个地方，通过实施例列表提供了引导，所述实施例可以各种组合进行使用。在每种情况下，列举的列表仅仅用作代表性的集合，不应解释为排它性列表。

附图说明

图1: 用于疫苗接种的CD133抗原。CD133蛋白的拓扑图（图A）和氨基酸序列（图B, SEQ ID NO:1）。制备了重组的嵌合的CD133抗原（SEQ ID NO:2），其由SEQ ID NO:1的氨基酸残基180-380和612-765（在图B中标有下划线）组成。用细菌表达该重组的嵌合的CD133抗原（SEQ ID NO:2），进行纯化，并通过SDS-PAGE证实，其具有45 kDa的分子量（图C）。

图2: 新制备的CD133杂交瘤的分析。测试了杂交瘤克隆的上清液，作为在蛋白质印迹（图A）和免疫荧光（图B）测定中的第一抗体。免疫前的血清（-ve）或免疫后的抗血清（a.s.）用作对照。就蛋白质印迹而言，将关于蛋白浓度标准化的Caco-2裂解物加载上SDS-PAGE凝胶，分离，印迹到硝酸纤维素膜上，并切成条带。用得自鉴别的杂交瘤的上清液探测每个条带。用商购可得的抗体（ab 19898, Abcam）探测在泳道1中的膜，并用作额外阳性对照。就免疫荧光而言，固定Caco-2细胞，并用杂交瘤上清液进行免疫染色。使用商购可得的抗体（293C3, Militenyi）作为额外阳性对照。在该图中的比例条代表200微米。在原发性胶质母细胞瘤和肾组织的免疫组织化学分析中，使用杂交瘤克隆7的上清液（图C）。

图3: 由杂交瘤克隆7生产的抗体的特异性。（A）流式细胞计量术。用得自杂交瘤克隆7的第一抗体或293C3（Militenyi）温育细胞，随后用标记的第二抗体温育，然后通过流式细胞计量术进行分析。得自新开发的抗-CD133杂交瘤克隆7的抗体（空心黑色直方图）将下述过表达CD133的细胞非常特异性地染色：Caco-2（iii）、GBM6（iv）、和用CD133转染的U87细胞（ii），但是没有将CD133阴性的U87细胞（i）染色。将使用由杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体的免疫染色与克隆293C3（空心灰色直方图）进行了对比。用实心灰色直方图代表同种型对照。（B）衣霉素介导的糖基化抑制。用递增剂量的衣霉素（2.5、5、10、20µg/ml）处理Caco-2细胞3天。DMSO处理过的细胞或未处理过的细胞用作对照。裂解细胞，然后使用由杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体或GAPDH抗体通过蛋白质印迹法进行分析。

图4: CD133scFV识别CD133标志物。用FITC标记CD133scFv。从已知的CD133的GenBank序列，制备寡核苷酸，然后使用聚乙烯亚胺（PEI）-DNA复合物转染进HEK293-TLR2细胞中。用抗-CD133scFv-FITC复合物温育细胞，洗涤，然后通过流式细胞计量术进行分析。以标准直方图形式表示数据，其中将阳性细胞百分比相对于荧光强度绘图。仅CD133-转染的细胞与FITC-标记的CD133scFv反应。对照包括：与空载体反应的转染细胞，与同种型对照反应的转染细胞，或不与CD133-FITC反应的未转染细胞。

图5: 去免疫的CD133KDEL基因包括抗-CD133 scFV，所述scFV与具有末端KDEL序列的下游PE38拼接。

图6: 锥虫蓝活力测定，其中每天在培养的细胞中测量活力。用dCD133KDEL（CD133KDEL）或对照抗-B细胞靶向的毒素CD22KDEL处理UMSCC-11B头颈癌细胞。

图7: dCD133KDEL融合蛋白会阻止肿瘤干细胞特有的肿瘤起始。在肿瘤起始测定中，将分选的细胞注射进裸鼠胁腹中。该图显示了生长的那些肿瘤的肿瘤生长速率。P值指示分选的和未分选的（对照）组之间的差异的显著性。

图8: 锥虫蓝活力测定，其测量dCD133KDEL随时间对培养的MDA-MB-231细胞的影响。NTR - 未处理。

图9: dCD133KDEL对具有全身性MDA-MB-231肿瘤的小鼠中的肿瘤进展的影响。通过脾内注射来施用200万细胞，在裸鼠中诱导全身性肿瘤。在肿瘤接种后第6天，开始用dCD133KDEL治疗小鼠。单个疗程由每隔一天（星期一、星期三、星期五）注射的20µg药物组成，给小鼠施用6个疗程。每周获取动物的图像。将生物发光强度测量为光子/秒/sr/cm²的函数。未治疗对照。

图10: 用dCD133KDEL、dEGF4KDEL或二者的混合物治疗的小鼠中的肿瘤进展的生物发光分析。

图11: ³H-胸苷摄取测定，其表明，当将突变形式（2219ARLKDEL 7mut, 批次1, 批次2,和批次3）和未突变形式（2219ARLKDEL（亲本））与Daudi细胞进行对比时，没有活性损失。在施用所有3批突变的药物和1批未突变的药物48小时以后，细胞杀死是相同的。

图12: 每周用突变的或未突变的药物免疫正常小鼠组。给动物抽血，并每周使用ELISA测定血清的抗-毒素抗体。取各值的平均值，然后通过Student T检验进行分析。曲线是显著不同的（p<0.05）。

图13: 得自图12的小鼠的血清样品的中和固定量的2219KDEL的杀死的能力。从4只2219KDEL7mut-免疫的小鼠和2只用未突变的2219KDEL免疫的小鼠采集血清，然后与0.2 nM 2219KDEL一起温育。得自2219KDELmut7小鼠的血清没有阻断2219KDEL的细胞杀死。

图14: 用突变的2219KDEL7mut治疗具有全身性B细胞疾病的小鼠。它们中的80% 是没有疾病的存活者。对照都死亡。

图15: 每周用EGF4KDEL 7mut和未去免疫的EGF4KDEL对免疫感受态B6小鼠（n=5/组）进行免疫。每周取出血清，并在灵敏的ELISA测定中确定抗-毒素（PE）水平。应答受到显著抑制。

图16: dCD133KDEL对MiaPaCa-2胰腺癌细胞的影响。使用³H-亮氨酸掺入蛋白合成测定，在所述细胞系上测试dCD133KDEL。包括CD3CD3KDEL作为阴性对照。包括dEGF4KDEL作为阳性对照，因为在该细胞系上的高EGFR表达。将数据表示为³H-亮氨酸掺入相对于在单独培养基中温育的对照细胞的百分比。

图17: dCD133KDEL对NA头颈癌细胞的影响。使用³H-亮氨酸掺入蛋白合成测定，在NA细胞系上测试dCD133KDEL。包括CD3CD3KDEL作为阴性对照。包括dEpCAM23作为阳性对照，因为在该细胞系上的高EpCAM表达。将数据表示为³H-亮氨酸掺入相对于在单独培养基中温育的对照细胞的百分比。

图18: 蛋白质印迹，其表明抗-小鼠IgG与CD133抗体-缀合的纳米颗粒结合（泳道3），但是不与未缀合的纳米颗粒结合（泳道2）。

图19: PLGA颗粒的流式细胞计量术数据，所述PLGA颗粒负载了6-香豆素，且与CD133抗体缀合（c）或未缀合（b）。

图20: 使用CD133-免疫颗粒的Caco-2细胞的荧光免疫染色。

图21: Caco-2细胞裂解物的CD133-缀合的纳米颗粒（CD133-NP）和未缀合的纳米颗粒（NP）含量。Caco-2细胞表现出对CD133-缀合的纳米颗粒的更大摄取。

图22: dCD133KDEL对具有人头颈胁腹肿瘤的裸鼠中的体内肿瘤进展的影响。A）用测径器测量肿瘤体积。B）治疗的（dCD133KDEL治疗的）和未治疗的（PBS治疗的）小鼠随时间的生物发光图像。

图23: dCD133KDEL对具有人头颈胁腹肿瘤的裸鼠中的体内肿瘤进展的影响。治疗的（CD133KDEL）、未治疗的（未处理）和对照（CD19KDEL）小鼠随时间的生物发光图像。

图24: 照片显示了用scFvCD133-KDEL治疗的、具有人胶质母细胞瘤异种移植物的nu/nu小鼠中的肿瘤消退。A）治疗前的肿瘤信号，在腹膜内注射人胶质母细胞瘤细胞以后7天；B）在用scFvCD133-KDEL治疗14天以后的肿瘤信号。

具体实施方式

本发明提供了组合物和方法，它们利用特异性地结合癌症干细胞差别地表达的某些标志物的单克隆抗体及其片段的发现。本文所述的组合物和方法可以提供某些癌症形式的检测和治疗的额外选择，因为所述单克隆抗体（及其片段）靶向癌症干细胞群体。通过靶向小量的、但是增生性的肿瘤细胞亚群，这可以实现某些癌症形式的更早检测，和/或提供有效治疗。

在下面的公开内容中，下述术语应当具有指示的含义：

“差别地表达的”表示这样的标志物特性：与其它细胞类型对标志物的表达相比，癌症干细胞以不同的程度表达所述标志物。在某些情况下，所述差别表达可以是，与其它细胞类型相比，癌症干细胞以更大的程度表达该标志物。在某些情况下，所述标志物可以由癌症干细胞表达，但是不会在除了癌症干细胞以外的细胞类型中以可检测的水平表达。

“部分”及其变化描述表示这样的化学化合物部分：其表现出特定特性，例如，特定生物学或化学功能（例如，靶标特异性或细胞裂解活性）。

“多肽”表示，通过肽键相连的氨基酸的聚合物。因而，例如，术语肽、寡肽、蛋白和酶都被包括在多肽的定义内。该术语也包括多肽的表达后修饰，诸如糖基化、乙酰化、磷酸化等等。术语多肽并不暗示氨基酸聚合物的任何特定最小长度或最大长度。多肽可以是可从天然来源直接分离的，或可以借助于重组技术、酶技术或化学技术进行制备。

“特异性的”及其变化描述表示，对特定靶标具有任何程度的差别的或非一般的（即，非特异性的）亲和力。

“治疗性的”及其变化描述表示，改善与病症有关的一种或更多种现有征状或临床征象的治疗或部分。“改善”表示，特定病症特有的征状或临床征象的程度、严重性、频率和/或可能性的任何减轻。“征象”或“临床征象”表示，与特定病症有关的客观物理征，其能够被患者以外的人发现。“征状”表示疾病或患者状况的任何主观证据。

术语“和/或”是指，一个或所有列出的要素，或任意2个或更多个列出的要素的组合。

在这些术语出现在说明书和权利要求书中时，术语“包含”及其变化描述不具有限制含义。

除非另外指出，“一个”、“一种”、“所述”和“至少一个”可互换地使用，并表示一个或超过一个。

用端点表示的数值范围在本文中也包括在该范围内包括的所有数字（例如，1-5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等）。

目前可得到的CD133抗体的一个显著缺点是，每种抗体仅适用于特定类型的免疫测定法，宽范围的技术需要使用多种抗体。在这里，我们报道了一种新颖的抗-CD133单克隆抗体，其可以在蛋白质印迹法、免疫荧光、免疫组织化学和流式细胞计量术应用中识别CD133抗原。在我们的研究中，通过ELISA进行了杂交瘤的初步筛选，这提示，杂交瘤克隆7也可以潜在地用于ELISA用途中。另外，我们已经克隆了杂交瘤克隆7抗体的单链可变片段（scFv）。

现有的CD133抗体的第二个有关限制是，最常用的抗-CD133抗体（例如，AC133和293C3）识别已经报道为糖基化的CD133表位的对象（综述参见：Bidlingmaier等人, 2008）。可替换地，其他人提出，这些不是糖基化的表位，而是由糖基化造成被掩蔽（由于蛋白折叠的变化）的表位。可能不足令人惊奇的是，关于使用这些糖基化依赖性的CD133抗体分选的细胞用于富集具有增加的肿瘤起始和自我更新能力的细胞的能力，存在巨大争论。众多报道已经载明了具有特殊肿瘤起始潜力的CD133⁺细胞，但是许多相反的研究已经证实，CD133^-细胞也会在异种移植测定中引发肿瘤（Bidlingmaier等人, 2008）。在某些情况下，所谓的“CD133^-细胞”是已经丧失AC133/293C3表位的CD133⁺细胞。实际上，结肠肿瘤起始细胞的分化，可以伴有AC133表位丧失、致肿瘤性和集落生成，尽管具有稳定的CD133 mRNA水平。

糖基化依赖性的（例如，AC133, 293C3）和糖基化非依赖性的（例如，杂交瘤克隆7）CD133抗体的组合使用，可以是将CD133糖基化的变化与CD133表达的变化区分开的非常有用的工具。这种区分可用于测试癌症干细胞假说的工作中，其中使用基于表面标志物（诸如CD133）分选的细胞。经证实的杂交瘤克隆7与糖基化的和未糖基化的表位的反应性提示，它可用于将治疗剂靶向CD133⁺ 癌细胞，不论分化状态如何。

基于报道的CD133的结构（Shmelkov等人, 2005），设计了由CD133蛋白的氨基酸残基180-380和612-765组成的重组的嵌合的抗原（图1A, 图1B）。使用Hopp-Woods抗原分析图、Kyte-Doolittle亲水性表征和Emini Surface概率分析，来鉴别和避免疏水的、非特异性的和弱免疫原性的区域。在大肠杆菌中表达了重组抗原，进行纯化，并通过SDS-PAGE进行分析（图1C）。纯化的蛋白具有45 kDa的分子量，这与预测的分子量相一致。

使用标准的杂交瘤技术，将纯化的抗原注射进BALB/c小鼠中，用于制备单克隆抗-CD133抗体。通过ELISA，筛选来自得到的杂交瘤克隆的细胞培养上清液中针对重组CD133的抗体的生产。在2轮筛选以后，得到11个分泌抗-CD133抗体的阳性稳定杂交瘤克隆。

使用单独的杂交瘤克隆7和杂交瘤克隆17的上清液，我们通过蛋白质印迹和免疫荧光测定（使用CD133⁺ Caco-2细胞）验证了筛选的杂交瘤，从而揭示了与CD133的预测分子量相对应的清晰带（图2A）。但是，在免疫荧光测定中，得自杂交瘤克隆7、杂交瘤克隆15和杂交瘤克隆16的上清液较强地将Caco-2细胞膜染色，而得自杂交瘤克隆9和杂交瘤克隆13的上清液提供弱染色（图2B）。

由于杂交瘤克隆7在两种测定中有效地识别CD133表位，我们选择它用于进一步表征，并测试它在其它用途中的应用。在人神经胶质瘤和肾组织切片的免疫组织化学分析中，杂交瘤克隆7导致膜-特异性的染色（图2C）。所述染色在肾切片中是清晰的且均匀的，在神经胶质瘤组织中是更不均匀的。

我们接着确定了杂交瘤克隆7对CD133的特异性。用编码人CD133 cDNA的表达质粒转染了CD133^低 ^/- U87细胞，用杂交瘤克隆7或商购可得的CD133抗体（293C3）染色，并通过流式细胞计量术进行分析。适当的同种型抗体和模拟转染的U87细胞用作对照。杂交瘤克隆7和293C3抗体没有可察觉地将未转染的U87细胞染色（图3A（i）和图3A（ii））。相比而言，两种抗体标记的CD133-转染的细胞证实了杂交瘤克隆7对CD133的特异性。接着，杂交瘤克隆7能够象293C3抗体一样将内源地表达CD133的Caco-2和GBM6细胞免疫染色（图3A（iii）和图3A（iv））。

接着，我们确定了杂交瘤克隆7是否识别糖基化的表位。在蛋白质印迹分析之前，用衣霉素处理Caco-2细胞，所述衣霉素是一种确定地记载的蛋白糖基化抑制剂（Tkacz和Lampen, 1975; Lehle和Tanner, 1976）。在衣霉素处理的样品中，观察到与糖基化的CD133蛋白相对应的130 kDa带和可能来自未糖基化蛋白的95 kDa带。相比而言，在对照样品中仅看到糖基化的CD133带。130 kDa带甚至存在于用高剂量衣霉素处理且在长期处理以后的样品中，这指示，这些细胞中CD133糖基化的不完全抑制。更高剂量衣霉素导致明显的细胞毒性，正如下降的GAPDH带所示。这些结果强烈地提示，杂交瘤克隆7特异性地结合未糖基化的表位。

接着，使用杂交瘤克隆7来克隆由杂交瘤克隆7生产的CD133-特异性的单克隆抗体的scFv。首先，使用源自杂交瘤克隆7的RNA，构建小鼠scFv文库。在总RNA纯化和第一链cDNA合成以后，扩增编码scFv的基因库（实施例10）。从合成的cDNA，分别扩增VH和VL基因库。通过使用重叠PCR融合VH和VL片段，随机装配scFv基因。用单一很少切割的限制性内切核酸酶SfiI，消化scFv cDNA和载体。连接以后，将重组构建体转化进电感受态的大肠杆菌XLI-BLUE中。过夜温育以后，从宿主细菌中提取扩增的重组噬粒。所述文库构建通过仅一次转化实现，且具有1.0 x 10⁷的理论尺寸。

进行标准淘选3个循环，此后，使用噬菌体ELISA，测定30个随机选择的克隆针对CD133的反应性。鉴别出9个阳性克隆，每个生产一种scFv：SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54和SEQ ID NO:55。DNA测序表明，9个CD133-特异性的克隆中的5个是相同的，这强烈地提示，它们都源自单个杂交瘤克隆7。

选择重组克隆11（编码SEQ ID NO:53），用于转化进大肠杆菌Top 10F’中进行表达。在该过程中，在5’末端和3’末端处截短重组克隆11，使得由该克隆编码的scFv多肽具有N-端氨基酸和C-端氨基酸缺失。克隆的编码序列反映在SEQ ID NO:57中，编码的scFv多肽反映在SEQ ID NO:58中。与SEQ ID NO:53相比，SEQ ID NO:58在N-端处被截短了6个氨基酸，在C-端处被截短了16个氨基酸。SEQ ID NO:58也具有在N-端处的甲硫氨酸，它是克隆过程的人工制品。

使用大肠杆菌分泌机制，实现了scFv（SEQ ID NO:58）的可溶表达，并在低温（30℃）诱导。表达的scFv（SEQ ID NO:58）主要存在于培养基和大肠杆菌周质空间中。

进行可溶性scFv ELISA，以确认与CD133的结合特异性。存在于培养基和周质空间中的重组克隆11 scFv（SEQ ID NO:58）对人CD133是特异性的。

因而，在一个方面，本发明提供了由本文所述的杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体的scFv。本文使用的“由杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体的scFv”可以包括这样的多肽：所述多肽包括SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:58中的任一个，或在结构上与参照多肽类似的多肽，所述参照多肽包括SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:58中的任一个。

在一个实施方案中，所述scFv包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述scFv是在结构上与参照多肽类似的多肽，其中所述参照多肽包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列。

在另一个实施方案中，所述scFv包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述scFv是在结构上与参照多肽类似的多肽，其中所述参照多肽包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列。

如本文使用的，如果多肽的氨基酸序列与参照多肽相比具有指定量的同一性，那么该多肽“在结构上类似于”参照多肽。可以如下沿着更长多肽的整个长度确定2种多肽的结构相似性：对齐2种多肽（例如，候选多肽和例如SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SED ID NO:58的多肽）的残基，以优化沿着它们的序列长度的相同氨基酸的数目；在对齐中允许在任一个或两个序列中的间隙，以便优化相同氨基酸的数目，尽管如此，在每个序列中的氨基酸必须保持它们的适当次序。候选多肽是与参照多肽进行对比的多肽。候选多肽可以分离自例如动物，或可以使用重组技术来生产，或化学地或酶促地合成。

使用在GCG包（10.2版, Madison WI）中的BESTFIT算法，可以进行氨基酸序列的逐对对比分析。可替换地，使用BLAST 2搜索算法的Blastp程序，可以对比多肽，所述BLAST 2搜索算法由Tatiana等人描述（FEMS Microbiol Lett, 174, 247-250（1999）），且在在国家生物技术信息中心（NCBI）网站上得到。可以使用所有BLAST 2搜索参数的默认值，包括：matrix = BLOSUM62; open gap penalty = 11, extension gap penalty = 1, gap x_dropoff = 50, expect = 10, wordsize = 3, 和开启过滤器。

在2个氨基酸序列的对比中，可以用“同一性”百分比表示结构相似性，或可以用“相似性”百分比表示结构相似性。“同一性”表示，相同氨基酸沿着更长多肽的整个长度的存在。“相似性”表示，沿着更长多肽的整个长度，不仅存在相同氨基酸，而且存在保守置换。一个氨基酸的保守置换可以选自该氨基酸所属的类别的其它成员。例如，蛋白生物化学领域众所周知，属于具有特定大小或特性（诸如电荷、疏水性和亲水性）的氨基酸群体的一个氨基酸，可以置换另一个氨基酸，而不改变蛋白的活性，特别是在与生物活性没有直接关系的蛋白区域中。例如，非极性的（疏水的）氨基酸包括：丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性的中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的（碱性的）氨基酸包括：精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的（酸性的）氨基酸包括：天冬氨酸和谷氨酸。保守置换包括，例如，Lys置换Arg，反之亦然，以维持正电荷；Glu置换Asp，反之亦然，以维持负电荷；Ser置换Thr，以维持游离-OH；和Gln置换Asn，以维持游离-NH₂。同样地，也预见到多肽的生物活性类似物，其含有一个或更多个邻接或非邻接氨基酸的缺失或添加，所述缺失或添加不会消除所述多肽的功能活性。

本发明的多肽可以包括，与参照氨基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相似性的多肽。

本发明的多肽可以包括，与参照氨基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的多肽。

无论评估氨基酸相似性还是氨基酸同一性，参照氨基酸序列可以是SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SED ID NO:58中的任一个。因而，在有些实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID NO:47的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID NO:48的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID NO:49的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID NO:52的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID NO:54的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在其它实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SED ID NO:58的氨基酸序列。

在一个具体实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID NO:53。在另一个具体实施方案中，所述参照氨基酸序列包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列。

例如，如上所述，SEQ ID NO:58是代表SEQ ID NO:53的稍微截短形式的scFv多肽。SEQ ID NO:58具有243个氨基酸，其中的242个与SEQ ID NO:53中的对应氨基酸相同，所述SEQ ID NO:53具有263个氨基酸。因此，SEQ ID NO:58与SEQ ID NO:53相比具有92%序列同一性。SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:55的氨基酸序列的类似截短可以类似地提供适当的功能多肽。

也可以设计本发明的多肽，以提供额外序列，例如，添加额外的C-端或N-端氨基酸的编码序列，所述氨基酸会便利通过捕集在柱上或使用抗体的纯化。这样的标签包括，例如，富含组氨酸的标签，其允许将多肽纯化到镍柱上。这样的基因修饰技术和合适的额外序列是分子生物学领域众所周知的。

在另一个方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸分子，其编码由本文所述的杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体的scFv。示例性的分离的多核苷酸包括这样的分离的多核苷酸：其编码SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SED ID NO:58中的任一个的氨基酸序列或在结构上与参照多肽类似的多肽，所述参照多肽包括SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SED ID NO:58中的任一个。示例性的多核苷酸也包括这样的多核苷酸序列的互补体。在本发明中也包括，在标准杂交条件下与下述多核苷酸杂交的多核苷酸：所述多核苷酸编码SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SED ID NO:58中的任一个的氨基酸序列或在结构上与参照多肽类似的多肽，所述参照多肽包括SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SED ID NO:58中的任一个，和这样的多核苷酸序列的互补体。

在本发明中也包括，与参照核苷酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的多核苷酸，所述参照核苷酸序列编码SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SED ID NO:58中的任一个的氨基酸序列。

在有些实施方案中，所述参照核苷酸序列可以编码SEQ ID NO:53的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述参照核苷酸序列可以包括SEQ ID NO:56的核苷酸序列。

在其它实施方案中，所述参照核苷酸序列可以编码SEQ ID NO:58的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述参照核苷酸序列可以包括SEQ ID NO:57的核苷酸序列。

本文使用的“序列同一性”表示2个多核苷酸序列之间的同一性。通常如下确定序列同一性：对齐2个多核苷酸的残基，以优化沿着它们的序列长度的相同核苷酸的数目；在对齐中允许在任一个或两个序列中的间隙，以便优化共有的核苷酸的数目，尽管如此，在每个序列中的核苷酸必须保持它们的适当次序。候选序列是与已知序列进行对比的序列。例如，使用BLAST 2搜索算法的Blastn程序，可以对比2个多核苷酸序列，所述BLAST 2搜索算法由Tatiana等人, FEMS Microbiol Lett., 1999;174: 247-250描述，且可在环球网上在ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/得到。可以使用所有BLAST 2搜索参数的默认值，包括：reward for match = 1, penalty for mismatch = -2, open gap penalty = 5, extension gap penalty = 2, gap x_dropoff = 50, expect = 10, wordsize = 11, 和开启过滤器。

在本发明中也包括多核苷酸片段。多核苷酸片段是本文所述的分离的多核苷酸的一部分。这样的部分可以具有几百核苷酸的长度，例如约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700或约800个核苷酸的长度。可替换地，这样的部分可以具有约10个核苷酸至约100个核苷酸的长度。

本发明的单克隆抗体、scFv或多核苷酸可以用于鉴别，得自受试者的样品是否具有表达CD133的细胞。人CD133是一种细胞表面糖蛋白，其已经被用作造血干细胞、神经干细胞的标志物，并用于富集许多癌症中的肿瘤起源细胞群，所述癌症包括结肠癌和胶质母细胞瘤。因而，表达CD133的细胞的鉴别、定位和/或定量，可以给医学从业人员提供关于下述方面的信息：获取该样品的受试者是否具有至少部分地以表达CD133的细胞为特征的病症，或处于发展所述病症的风险中。在有些实施方案中，在得自受试者的生物样品中鉴别出表达CD133的细胞，可以指示所述受试者具有结肠癌和/或胶质母细胞瘤，或处于发展所述病症的风险中。

通常，可以使本发明的单克隆抗体、scFv或多核苷酸与得自受试者的生物样品的至少一部分接触。在单克隆抗体或scFv的情况下，所述生物样品可以包括表达CD133的细胞、表达CD133的细胞的片段、和/或从生物样品中的细胞至少部分地分离的CD133。在多核苷酸的情况下，所述生物样品可以包括，例如，裂解的细胞、基因组DNA、mRNA和/或cDNA（或mRNA扩增的其它产物，例如，通过PCR）。

可以检测所述单克隆抗体、scFv或多核苷酸是否以下述方式特异性地结合生物样品中的组分：所述方式指示样品中的细胞的CD133表达。例如，可以检测单克隆抗体或scFv与CD133的至少一部分的特异性结合。类似地，本发明的多核苷酸（如果必要的话，经过变性）与得自样品的多核苷酸（如果必要的话，也经过变性）的至少一部分的特异性结合（例如，杂交），指示CD133表达。

癌症干细胞区室（compartment）含有超过一个干细胞群体，CD133KDEL对这些表达CD133的群体中的至少一个是非常有效的。在我们检查的各种癌中，我们检测到约5% CD133细胞/95% CD133-细胞。例如，表1显示了几个系。用FITC标记抗-CD133 scFV，然后进行标准的流式细胞计量术。CD133表达水平（4-7.1%）与报告的值相一致。CaCo-2结肠直肠癌是已知表达高水平的CD133+细胞的细胞系，所以我们包括它作为阳性对照。抗-CD45-FITC和抗-CD19 FITC是优先识别造血细胞的阴性对照。

表1. 在不同癌系上的CD133+表达。

因而，所述单克隆抗体和/或所述scFv可以用于这样的诊断方法中，所述诊断方法设计成检测癌症干细胞在受试者中的存在，所述存在可以指示，所述受试者具有肿瘤病症（例如，癌），或处于该风险中。这样的诊断方法可以包括：从受试者获得适当的生物样品，使所述单克隆抗体和/或scFv在体外与所述生物样品的一部分接触，和检测所述单克隆抗体和/或scFv与所述生物样品中的细胞的特异性结合。在其它情况下，诊断方法可以包括：给受试者施用组合物，所述组合物包括与适当的可检测的标志物偶联的单克隆抗体和/或scFv，然后检测所述组合物的至少一部分在体内与所述受试者的细胞的特异性结合。

治疗用途

尽管最初开发抗-CD133抗体作为诊断工具，研究指示，在与配体（例如，本文所述的抗-CD133抗体）结合以后，CD133会被迅速地内化。因为具有被迅速内化的标志物的细胞是靶向毒素的非常好的靶标，我们通过装配scFv融合分子，合成了CD133靶向毒素：靶向毒素dCD133KDEL，所述scFv融合分子包括与我们的抗-CD133 scFv一起克隆到同一分子上的毒素。

化学疗法治疗的癌患者中的癌症复发的一种来源是癌症干细胞。现在认识到，癌症干细胞象正常细胞一样分化。因而，存在更低分化的、自我更新的、肿瘤起源干细胞的小组群。也存在更高分化的癌症干细胞的更大组群。不幸的是，更高分化的细胞对化学疗法更敏感，更低分化的癌症干细胞中的小部分具有更高的抗药性。此外，这些更低分化的癌症干细胞具有自我更新它们的数目和引发肿瘤的能力，从而促成转移性疾病。现在这在多种癌中得到确认，其中使用确定的干细胞标志物（诸如CD133或CD44）来分选癌症干细胞。将分选的细胞异种移植进小鼠中，在肿瘤起始测定中，肿瘤引发和自我更新的速率显著提高。因为与不是干细胞的肿瘤细胞相比，干细胞可以具有更高的化学疗法抗性，对于预防复发和转移而言，可以选择性地破坏这些癌症干细胞的药物是非常有价值的。靶向毒素是蛋白合成的有效催化抑制剂，众多报告表明，它们会通过与常规化疗药物完全不同的机理杀死药物抗性细胞。因而，我们使用基因工程来设计会消除癌症干细胞的靶向毒素（TT）。

CD133是多种癌症的干细胞标志物。就脑、前列腺和结肠癌而言，以及最近在乳腺癌中，确定地记录了CD133在癌症起始细胞中的表达。CD133也称作prominin-1，是一种细胞表面糖蛋白，其具有5个跨膜结构域和2个大型糖基化的细胞外环，所述环定位在膜突出处。尚未确立CD133在癌症干细胞中的功能，但是一种交替拼接形式会结合胆固醇，并因而可以参与Hedgehog信号传递，后者是原始细胞分化和上皮-间质相互作用所需的。

一些关于CD133的研究已经受到批判，因为可得到的商业的抗-CD133单克隆抗体会识别糖基化的CD133，因而不是合乎需要的，因为它们不会检测表达翻译后修饰的CD133表位的细胞，且不会准确地测定总CD133表达。作为一种解决方案，开发出了本文鉴别的由杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体，以及本文所述的源自它的scFv。

在分子/细胞基础上，靶向毒素（TT）是癌症靶细胞的有效杀伤物。它们是蛋白合成的酶抑制剂。因为它们是催化延伸因子-2的ADP-核糖基化的酶，它们会移动穿过胞质溶胶，从而结束一个化学反应，然后启动下一个化学反应。化学治疗剂不具有该机制，且在单个分子基础上，有效性更低。重要的是，患者肿瘤经常变得对化学疗法具有抗性，且在许多情况下，化学疗法的施用不能成为选择，因为它已经变得太有毒性，特别是对于造血系统。因为催化毒素具有不同的抗癌机理，靶向毒素代表常规疗法的引人注目的替代方案，特别是因为它们与化学疗法协同作用，甚至在胰腺癌中。关于靶向毒素和化学治疗剂的协同作用，存在许多公开的报告。因此，我们装配了抗-CD133靶向毒素，其由抗-CD133 scFV和下游假单胞菌外毒素组成。将内质网保留序列KDEL添加在c-端，因为已知它会促进毒素进入细胞溶质隔室中和增强杀死。我们称作分子dCD133KDEL。

因而，我们已经生产了能够杀死肿瘤干细胞的第一类抗-干细胞生物学dCD133KDEL。尽管CD133+干细胞仅占肿瘤细胞群的少数（4-7%），我们惊奇地发现，在培养物中，几乎所有细胞都随着时间被dCD133KDEL处理所杀死。我们已经生产了一种新颖的抗-CD133单克隆抗体，其识别CD133细胞外结构域的未糖基化的主链。所述scFv-TT融合体令人惊讶地具有高体外抗癌活性和当在体内全身注射时的高抗肿瘤效力。这是它的识别确定的干细胞标志物CD133的类型中的第一种药物。

另外，与单独的CD133KDEL或EGF4KDEL的单一施用相比，将dCD133KDEL与EGF4KDEL相组合会显著增强体内的全身性癌杀死（EGF4KDEL是一种靶向EGFR的双特异性TT）。我们的组合的体外和体内发现的解释是，存在超过一种干细胞级分。

一种候选物是CD44+癌症干细胞群体，据信其在结肠癌中独立于CD133+干细胞。但是，CD44是透明质酸的受体，且在正常细胞中到处表达。因而，与本文所述的基于CD133的治疗剂相比，基于CD44的治疗剂可能表现出与非靶器官的大量交叉反应性。另一种候选物是表皮生长因子（EGF）。再一种是上皮细胞粘附分子（EpCAM），其也在癌上广泛地表达，且在癌症干细胞上表达。抗体微阵列分析可以最终鉴别出其它靶标。

因而，在另一个方面，本发明包括本发明的单克隆抗体、scFv或多核苷酸的治疗用途。在一个实施方案中，使用所述scFv来克隆靶向毒素（TT），后者包括与截短的假单胞菌外毒素融合的scFv，所述外毒素被有效地去免疫，使得可以重复治疗，且具有减少的产生抗-毒素抗体的后果。尽管通过流式细胞计量术测得仅小部分CD133+癌症干细胞的存在，所述scFv-TT融合体（dCD133KDEL）会非常有效地减少使用乳腺癌和头颈癌细胞系在体外培养的癌细胞的繁殖。当在体内测试时，所述药物在高百分比的动物中有效地诱导完全缓解。单独的CD133具有令人惊叹的作用，但是所述scFv-TT融合体具有甚至更好的作用。

所述scFv-TT融合体代表用于识别和消除CD133+癌症干细胞的新工具。本文使用的“消除”及其变化描述表示，与适当的对照细胞群体相比，在任何程度上减少要“消除”的群体中的活细胞的增殖。因而，在有些情况下，“消除”某些细胞可以包括，要“消除的”细胞的实际群体的增加，但是该增加小于在适当的对照群体中观察到的对应群体增加。因而，在有些实施方案中，“消除”细胞可以包括，与适当的对照群体相比，使要消除的细胞群体减少了至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。在其它实施方案中，“消除”细胞可以表示，群体中的细胞数目的实际减少。在这些实施方案中，“消除”细胞可以包括，使要消除的细胞的实际数目减少了至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%。

例如，可以使用scFv-TT融合体从细胞培养物中消除CD133+干细胞，然后研究剩下哪些干细胞群体。使用例如2色和3色荧光，可以检测剩余的细胞群。这样的策略能够鉴别第二个表达显著的癌标志物的癌症干细胞群体。例如，我们已经证实，在使用dCD133KDEL消除CD133+细胞以后，剩下表达EGFR/EpCAM的细胞。

作为另一个实例，可以在体内消除CD133+干细胞，以给需要这种治疗的受试者提供抗癌疗法。包括抗-CD133 scFv的scFv-TT融合体可以提供靶向毒素向CD133+癌症干细胞的靶向递送。已经在许多不同的癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤和肉瘤中鉴别出CD133+癌症干细胞。结果，含有抗-CD133+ scFv的scFv-TT融合体可以提供能够治疗不同起源的一种或多种肿瘤的单一治疗选择。示例性的肿瘤包括：脑肿瘤（例如，胶质母细胞瘤、星形细胞瘤等）、肌肉肿瘤（例如，肉瘤）和/或各种癌，例如，乳腺癌、胰腺癌、头颈癌、前列腺癌、结肠癌，在表2中列出的任一种癌，或癌的任意组合。

表2. 示例性的癌

分类名称（ NOS = 不另行说明）

（8010-8040）上皮肿瘤，NOS

（8050-8080）鳞状细胞瘤

（M8070/3）鳞状细胞癌，NOS

（8090-8110）基底细胞瘤

（M8090/3）基底细胞癌，NOS

（8120-8130）移行细胞乳头状瘤和癌

（8140-8380）腺瘤和腺癌（腺）

（M8140/0）腺瘤，NOS

（M8140/3）腺癌，NOS

（M8142/3）皮革胃

（M8151/0）胰岛素瘤，NOS

（M8152/0）胰高血糖素瘤，NOS

（M8153/1）胃泌素瘤，NOS

（M8155/3）胰腺瘤

（M8160/3）胆管上皮癌

（M8170/3）肝细胞癌，NOS

（M8200/3）腺样囊性癌

（M8240/1）盲肠的类癌瘤，NOS

（M8271/0）催乳素瘤

（M8290/0）嗜酸粒细胞腺瘤

（M8290/0） Hurthle细胞腺瘤

（M8312/3）肾细胞癌

（M8312/3） Grawitz肿瘤

（M8360/1）多发性内分泌腺瘤

（M8380/0）子宫内膜样腺瘤，NOS

（8390-8420）附件和皮肤附件肿瘤

（8430-8439）粘液表皮样肿瘤

（8440-8490）囊、粘液和血清的肿瘤

（M8440/0）囊腺瘤，NOS

（M8480/6）腹膜假粘液瘤

（8500-8540）管、叶和髓的肿瘤

（8550-8559）腺泡细胞瘤

（8560-8580）复杂的上皮肿瘤

（M8561/0） Warthin氏肿瘤

（M8580/0）胸腺瘤，NOS

（8590-8670）特殊的性腺肿瘤

（M8590/1）性索-间质瘤

（M8600/0）泡膜细胞瘤，NOS

（M8620/1）粒层细胞瘤，NOS

（M8630/1）卵巢雄性细胞瘤，NOS

（M8631/0） Sertoli-Leydig细胞瘤

（8680-8710）副神经节瘤s和血管球瘤

（M8680/1）副神经节瘤，NOS。

得自相关癌的癌细胞系包括，例如，MDA-MB-231/luc和MDA-MB-468/luc（乳腺癌）、MiaPaCa-2/luc和SW1990/luc（胰腺癌）、PC-3/luc（前列腺癌）、UMSCC-11B/luc和NA/luc（头颈癌）和HT-29/luc（结肠癌）。干细胞占各种癌的总细胞群的4-11%。

一旦通过分选和肿瘤起始测定鉴别出干细胞群体，可以确定高度选择性的配体-指导的毒素中的其它靶向毒素是否可用于杀死这些癌症干细胞。例如，可以将CD133KDEL与在裸鼠模型中识别其它癌症干细胞的靶向毒素相组合。大体而言，我们已经证实，该方案具有价值，因为与EGF4KDEL相组合的、识别CD133+癌症干细胞的dCD133KDEL在体内具有优良的抗癌作用。并且，因为癌症干细胞与更高分化的癌细胞相比经常具有对化学治疗剂的更高抗药性，可以测试联合疗法，其包括：与针对不同癌症干细胞的一种或更多种化学治疗剂相组合地施用scFv-TT融合体。

作为对第二个癌症干细胞群体的鉴别的补充，可以使用一般的scFv-TT模型（用dCD133KDEL的构建来确立），以生产针对其它癌症干细胞群体的靶向毒素。例如，体内数据提示，联合治疗表现出比单独的dCD133KDEL更好的抗癌作用，所述联合治疗使用上述的dCD133KDEL和靶向EGFR的对应scFv-TT融合体（dEGF4KDEL），所述EGFR由消除CD133+癌症干细胞以后剩下的癌症干细胞组群表达。

因而，scFv-TT融合体可以包括任意合适的靶向scFv，所述scFv特异性地结合由靶细胞群体表达的标志物。干细胞群体的合适标志物包括，例如，CD133、CD44、EpCAM（上皮细胞粘附分子）、EGFR（表皮生长因子受体，例如，HER1、HER2、HER3或HER4）、uPAR（尿激酶受体）、PSCA（前列腺干细胞抗原）、间皮素和MUC1（粘蛋白1）。

并且，所述融合体的靶向毒素（TT）部分可以包括任意合适的治疗部分。合适的治疗部分可以包括：发挥直接或间接细胞毒性活性的化合物，例如，小分子、放射性试剂和/或有毒的多肽。有毒的多肽可以包括，例如，白喉毒素、假单胞菌外毒素A、假单胞菌外毒素（PE）、异株腹泻毒蛋白、白树毒素、帚曲霉素（α-sarcin）、曲霉菌素、局限曲菌素、血管生成素、皂草素、相思豆毒蛋白、原核核糖核酸酶、真核核糖核酸酶、蓖麻蛋白、美洲商陆抗病毒蛋白（PAP）、促细胞凋亡多肽、核糖体抑制蛋白或前述任一种的生物活性片段。促细胞凋亡多肽可以是，例如，Bax、Fas、Bad、Bak、Bim、Bik、Bok、Hrk、FasL、TRAIL或TNF-α。

合适的治疗部分也可以包括，例如，可生物降解的纳米颗粒，所述纳米颗粒含有一种或更多种治疗材料（例如，细胞毒性的化合物）。实施例21证实，CD133单克隆抗体可以与携带功能分子（6-香豆素）的纳米颗粒偶联，并且在所述纳米颗粒与单克隆抗体缀合以后，所述功能分子可以保留它的功能。此外，图21证实，靶向部分（在该情况下，CD133）可以造成靶标指导的细胞对抗体-纳米颗粒的摄取，从而证实所述抗体-纳米颗粒用于靶向诊断和/或靶向治疗用途的效用。例如，将纳米颗粒设计成可生物降解的，与抗体偶联，并设计成含有治疗性化合物。所述抗体-纳米颗粒组合物可以全身性地施用给受试者，并仍然提供向表达抗体配体的细胞的靶标特异性的递送。一旦被靶细胞摄入，所述纳米颗粒可以降解，从而在靶细胞内释放出治疗性化合物。这可以使治疗性化合物的全身性暴露最小化，并因此限制治疗性化合物和非靶细胞之间的接触。当然，象任意其它治疗部分一样，纳米颗粒可以与适合目标靶细胞群体的单克隆抗体或其scFv偶联。

去免疫的毒素

尽管它们的酶性质使得靶向毒素成为最有效的单细胞杀伤物，但是它们是免疫原性的，所以给患者施用靶向毒素可以产生抗-毒素抗体，后者会限制靶向毒素的有效性。在实体瘤研究的情况下，当患者免疫系统是完整的时，这已经成为一个具体问题。在一项癌研究中，在所有治疗的患者中发生抗-毒素应答。为了解决该问题，我们使用毒素合成了我们的抗肿瘤干细胞药物，在所述毒素中，使用位点特异性的诱变来突变免疫原性的氨基酸。

我们使用Onda等人的表位作图策略（“An Immunotoxin with Greatly Reduced Immunogencity by Identification and Removal of B Cell Epitopes,”PNAS, 2008年8月12日; 105（32):11311-11316. 2008年8月4日电子出版），将在EGF4KDEL上的毒素去免疫，所述EGF4KDEL是一种双特异性的配体-指导的毒素（BLT），其由与截短的假单胞菌外毒素拼接的人细胞因子EGF和IL-4组成。将末端内质保留序列KDEL置于c-端上，以增强药物效能。我们的dEGF4KDEL是对乳房、肺、前列腺、胰腺和结直肠癌有效的药物。因而，我们获得这样的药物：其可以重复给药，而不产生抵消药物效力的抗-毒素免疫应答。该相同的毒素盒用于合成dCD133KDEL（图5）。

我们继续在有dCD133KDEL存在下培养癌细胞。最初，我们使用放射性标记的胸苷摄取测定或亮氨酸掺入蛋白合成测定来测量活性，但是这仅在一天测出活性。因而，我们设计了一种测定，其允许在有药物存在下连续培养癌细胞。我们在有药物存在下培养dCD133KDEL数天，我们每天天更换培养基，并通过锥虫蓝染料排除来计数活细胞。令人惊奇地，图6表明，dCD133KDEL可非常有效地抑制UMSCC-11B头颈癌细胞生长，这通过活体染料排除测得。在0.3 nM浓度的dCD133KDEL杀死所述细胞。

图7显示了一种肿瘤起始测定，其中使用我们的附着于磁珠上的CD133 scFv来分选CD133+ 头颈癌细胞UMSCC-11B细胞，然后使用MAGS磁珠试剂盒（STEMCELL Technologies, Inc., Vancouver, British Columbia, Canada)进行纯化。

将假定的干细胞注射进裸鼠胁腹中。如果它们富含干细胞，那么它们将以加快的速率生长，具有比非干细胞更高的肿瘤水平。图7表明，分选的细胞具有最高的肿瘤起始发生率（75%），且这些肿瘤的平均肿瘤生长显著高于用未分选的肿瘤细胞得到的生长（p<0.04）。这证实，CD133scFv实际上确实识别肿瘤干细胞。令人感兴趣地，当用在注射之前用dCD133KDEL处理细胞样品时，这些细胞具有最慢的生长速率，仅1/4的肿瘤生长。这证实，我们的CD133scFv实际上正在富集癌症干细胞。

dCD133KDEL治疗会影响其它癌。已经在乳腺癌中鉴别出CD133+癌症干细胞，我们的流式细胞计量术研究指示癌症干细胞在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中的存在。因此，正如图6所示，我们在有dCD133KDEL存在下培养了MDA-MB-231细胞，并每天用锥虫蓝测量活力。图8表明，dCD133KDEL显著地抑制乳腺癌细胞，但是对照CD3CD3KDEL没有。CD3CD3KDEL会识别CD3εT细胞受体。因而，杀死是特异性的。

可以鉴别其它癌症干细胞标志物，因而刚才结合CD133描述的相同策略可以用于制备对其它癌症干细胞组群特异性的靶向毒素药物。我们已经将EGFR和EpCAM鉴别为其它的相关的癌症干细胞标志物。使用标准的常规技术，可以鉴别其它的癌症干细胞标志物。合适的技术包括，例如，使用抗体阵列500（Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA）的分析。这样的抗体阵列会提供样品之间的相对蛋白丰度的量度。

因而，在某些实施方案中，所述scFv-TT融合体可以包括去免疫的靶向毒素部分。本文使用的“去免疫的”及其变化描述表示，携带一个或更多个氨基酸置换的氨基酸序列，所述氨基酸置换会：（a）减轻给其施用所述毒素的受试者的抗-毒素免疫应答，和（b）保留治疗和/或预防有效量的毒素活性。

使用上述的去免疫策略，我们已经观察到下述3种不同的scFv-TT融合体（也称作双特异性的配体指导的毒素）的显著的抗-毒素抗体减少和显著的体内抗癌应答：用于白血病治疗的去免疫的2219KDEL7mut，用于癌治疗的去免疫的EGF4KDEL7mut，和用于神经胶质瘤治疗的去免疫的EGFATFKDEL。例如，为了确定使用去免疫的2219KDEL（在本文中称作2219KDEL 7mut、d2219KDEL或2219ARLKDEL 7mut（例如，在图11中））减少抗-毒素免疫应答的程度，使用免疫感受态小鼠作为人免疫原性模型，因为从接受基于假单胞菌外毒素（PE）的药物的人患者得到的血清会识别与小鼠相同的PE显著免疫原性区域。

从使用装配PCR合成的融合基因，表达去免疫的2219KDEL7mut融合多肽。在它的最终构型中，所述2219ARLKDEL融合基因（从5’末端至3’末端）由EcoRI限制位点和随后的抗-CD22 scFv基因组成。该抗-CD22 scFv基因定向为，V_L结构域在V_H结构域前面，并通过编码ARL接头（GSTSGSGKPGSGEGSTKG, SEQ ID NO:69）的片段连接。接着，克隆G₄S接头（GGGGS）和随后的抗-CD19 scFv（以相同的V_L/V_H定向和相同的ARL接头），然后克隆下游7个氨基酸EASGGPE的接头。该接头之后是PE38（360个氨基酸），它的C-端REDLK被ER保留序列KDEL替代，最后是在3’末端处的NotI限制位点。将得到的2650碱基对EcoRI/NotI片段基因剪接进pET21d细菌表达载体中，所述载体在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）可诱导的T7启动子控制下。使用DNA测序分析（Biomedical Genomics Center, 明尼苏达大学）验证，该基因具有正确的序列，并已经克隆在框架内。为了制备具有降低的免疫原性的突变的2219ARLKDEL分子（2219ARLKDEL7mut），使用QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene. La Jolla CA, 美国），突变了分布在PE₃₈ KDEL的7个重要表位中的8个氨基酸，并通过DNA测序进行确认。改变了下述免疫原性的、亲水的氨基酸：R490A、R513A、R467A、E548S、K590S、R432G、Q332S、R313A，并通过DNA测序进行确认。

从使用DNA改组和DNA克隆技术合成的融合基因，表达去免疫的EGFATFKDEL融合多肽。在它的最终构型中，所述EGFATFKDEL融合基因（从5’末端至3’末端）由下述元件组成：NcoI限制位点、ATG起始密码子、人EGF的基因、与人肌肉醛缩酶（HMA）的20氨基酸区段相连的得自uPA的下游135-氨基末端片段（ATF）、7氨基酸EASGGPE接头、假单胞菌外毒素（PE）分子的前362个氨基酸（其中用KDEL替代在C末端处的REDLK）和在构建体的3’末端处的NotII限制位点。将HMA区段掺入所述分子中，作为柔性的、非免疫原性的接头。我们实验室以前描述了ATF基因片段的使用。将得到的1748碱基对NcoI/NotII片段基因剪接进pET28c细菌表达载体中，所述载体在丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷可诱导的T7启动子控制下。使用DNA测序分析（Biomedical Genomics Center, 明尼苏达大学）验证，该基因具有正确的序列，并已经克隆在框架内。为了制备具有降低的免疫原性的EGFATFKDEL分子，使用QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene. La Jolla CA)，突变了代表PE38上的7个重要表位中的8个氨基酸。改变了下述氨基酸：R490A、R513A、R467A、E548S、K590S、R432G、Q332S、R313A，并通过DNA测序进行确认。

图11表明，与未突变的亲本药物相比，突变没有影响药物活性。在图12中，进行了使用免疫感受态BALB/c小鼠的免疫接种研究，以相对于亲本2219ARLKDEL分子对比2219ARLKDEL7mut的免疫原性。免疫小鼠（n=6/组），并每周抽血，持续共9周（10次注射）。使用ELISA分析得自每只动物的血清样品，以检测抗-PE38（KDEL）IgG。图12表明，在9次（第69天）或10次注射（第76天）临床量（10µg/kg药物）以后，针对去免疫的突变体（2219ARLKDEL8mut）产生的抗-毒素IgG的水平是针对未突变的亲本（2219ARLKDEL）产生的抗-毒素IgG的20%-25%。因而，与注射等量的亲本形式的药物的那些小鼠相比，施用去免疫药物的多次注射的小鼠产生了显著更低的抗-毒素水平（p<0.05）。因而，在已经确认为人免疫原性模型的鼠模型中，可以多次注射去免疫形式的药物，并产生有限的抗-毒素免疫应答。图13表明，得自用未去免疫的药物免疫的小鼠的血清会在体外中和2219KDEL杀死。得自用去免疫的药物免疫的小鼠的血清没有在体外中和2219KDEL杀死。因而，与未去免疫的亲本形式的多次定量给药相比，2219KDEL7mut的多次定量给药会产生更少的中和性的抗-毒素抗体。最后，图14表明，突变的药物会引起针对全身性B细胞恶性肿瘤的有效抗癌作用，其中使用静脉内地注射肿瘤的系统Raji-luc/scid小鼠模型。如Vallera等人（“Bioengineering a unique deimmunized bispecific targeted toxin that simultaneously recognizes human CD22 and CD19 receptors in a mouse model of B-cell metastases,”Mol Cancer Ther. 2010年6月;9(6):1872-83. 2010年6月8日电子出版）所述，验证存活者为没有疾病的。

如下产生上面刚刚讨论的数据：使用去免疫的PE毒素，通过表位作图进行8个氨基酸置换，所述置换位于与毒素免疫原性有关的7个主要亚组中。突变是：在表位1中的Q332S，在表位2a中的R467A，在表位3中的R313A，在表位4a中的R432G，在表位5中的R490A，在表位6a中的R513A和E548S，和在表位7中的K590S。使用相互竞争测定（其采用针对毒素的不同决定簇的60种单克隆抗体集合），制备PE38的分区绘图表位图。利用我们的最近的药物，在12或14次每周1次的免疫接种以后，免疫应答下降了80%（图15）。

可以采用相同的方案来制备去免疫形式的CD133KDEL（dCD133KDEL），其在体内已经表现出效力。

使用本文所述的锥虫蓝活力测定，可以筛选去免疫的变体的活性。可以将去免疫的scFv-TT构建体的细胞裂解活性与未去免疫的亲本形式进行对比。从这些测定产生的细胞裂解曲线是高度可再现的。使用去免疫形式的d2219KDEL、dEGF4KDEL和dEGFATFKDEL，没有观察到统计上显著的活性损失。因而，本文所述的去免疫方案似乎是普遍适用的。

在具有2种不同MHC单元型的2种不同小鼠品系中，去免疫会造成血清抗体水平的下降。这是相关的，因为不同的MHC分子的差别在于它们在MHC槽中对肽片段的呈现，一种单元型可能呈现与另一种单元型不同的肽。因而，突变B细胞识别区的一个潜在问题是，不同的MHC多态性可能不同地识别抗原。但是，去免疫会在BALB/c（H-2d）和C57BL/6（H-2b）品系中导致显著的抗-毒素降低。因此，这指示，突变所有7个区域的强度足以克服这些可能的MHC差异。此外，得自用PE超免疫的BALB/c小鼠的抗-PE抗体会与人类中的类似表位反应，这提示，在不同的T细胞支持下识别相同的B细胞表位。

用靶向 毒素靶向干细胞

一个消除癌症干细胞的策略包括靶标特异性的清除。我们的体内模型允许通过生物发光成像在体内实时测量靶向毒素对全身性癌的作用。我们的研究所选择的所有癌都已经用萤光素酶基因转染，并在裸鼠中特别良好地生长。在图9中，我们使用我们的确立的MBA-MB-231乳腺癌模型（裸鼠中的全身性肿瘤生长）。在第0天，通过外科手术将400万细胞注射进裸鼠脾中。在第6天，开始dCD133KDEL治疗。每周的星期一、星期三、星期五给药（20µg/注射），持续5周。研究表明，体内注射的dCD133KDEL在35天的时程内在60%的小鼠中产生抗肿瘤效应。施用抗-T细胞药物（CD3CD3KDEL）的对照小鼠没有表现出效应（未显示）。总之，这些数据证实，dCD133KDEL能够识别和杀死肿瘤干细胞。此外，尽管事实上CD133+癌症干细胞占肿瘤细胞群的低百分比，但是dCD133KDEL的一般抗肿瘤效应是显著的。

因而，癌症干细胞是scFv-TT治疗的特别有效的靶标，所述scFv-TT治疗可扩展至其它癌症干细胞亚群，其中使用指向那些其它亚群特有的其它标志物的scFv来递送靶向毒素。图10显示了使用下述组合治疗癌的结果：使用dCD133KDEL来破坏CD133+癌症干细胞，然后使用dEGF4KDEL来消除第二种干细胞群体，即表达EGFR的癌症干细胞。作为实验设计的一部分，用次优剂量的dCD133KDEL、次优剂量的EGF4KDEL或两种次优剂量的组合，治疗在图9中所示的组。当单独测试两种药剂时，下面的成像数据仅表现出轻微的作用。当两种药剂以完全相同的剂量和计划相组合时，4/5的动物表现出完全应答，长期没有疾病的存活者指示联合治疗的优良作用，这支持了除了CD133+癌症干细胞以外的另一种干细胞群体的存在。

第二种消除癌症干细胞的策略包括：用与确立的化学治疗剂相组合的scFv-TT融合体进行治疗。众多研究表明，当与化学疗法相组合时，靶向毒素远远更有效。这样的联合疗法可以使用任意合适的化学治疗剂来进行。合适的化学治疗剂包括，例如，烷化剂例如，顺铂卡铂、奥沙利铂、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥或异环磷酰胺；抗代谢物例如，硫唑嘌呤或巯基嘌呤；植物生物碱或萜类化合物例如，长春花生物碱（例如，长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛等）、鬼臼毒素（例如，依托泊苷或替尼泊苷）或紫杉烷（例如，紫杉酚）；拓扑异构酶抑制剂例如1型拓扑异构酶抑制剂（例如，伊立替康或托泊替康）或2型拓扑异构酶抑制剂（例如，安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷或替尼泊苷）；或抗肿瘤药例如，更生霉素、多柔比星、表柔比星或博来霉素。

制剂

本发明的单克隆抗体、scFv、多核苷酸、mAb-融合体或scFv-融合体可以提供在组合物中，所述组合物可以另外包括药学上可接受的载体。“药学上可接受的”表示，与所述组合物的其它成分相容、且对其受体无害的稀释剂、载体、赋形剂、盐等。通常，当所述组合物如本文所述使用时，所述组合物包括药学上可接受的载体。本发明的组合物可以配制在药物制剂中，所述药物制剂采取适合选择的给药途径的多种形式，所述给药途径包括适用于刺激对抗原的免疫应答的途径。因而，本发明的组合物可以通过已知的途径来施用，所述途径包括，例如，口服；肠胃外地，包括真皮内的、经皮的、皮下的、肌肉内的；静脉内的；腹膜内的，等；和局部地，例如，鼻内的、肺内的、乳房内的、阴道内的、子宫内的、真皮内的、经皮的和直肠地等。预见到，可以将组合物施用于粘膜表面，诸如通过施用于鼻或呼吸道粘膜层（例如，通过喷雾剂或气雾剂），以便刺激动物体内的粘膜免疫，诸如分泌型IgA抗体的生产。

本发明的示例性的实施方案包括：

1. 在本文中鉴别为杂交瘤克隆7的杂交瘤。

2. 由杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体。

3. 由杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体的单链可变片段（scFv）。

4. 根据实施方案3所述的scFv，所述scFv包含SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58的氨基酸序列。

5. 根据实施方案4所述的scFv，其中所述scFv包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。

6. 一种分离的多核苷酸，其包含编码下述氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58。

7. 根据实施方案6所述的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸包含编码SEQ ID NO:58的氨基酸序列的核苷酸序列。

8. 根据实施方案7所述的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸包含SEQ ID NO:57的核酸序列。

9. 一种组合物，其包含实施方案1或实施方案2的单克隆抗体。

10. 一种组合物，其包含实施方案3-5中的任一个的scFv。

11. 一种融合多肽，其包含：

靶向部分，其包含：

实施方案2的单克隆抗体；或

实施方案3-5中的任一个的scFv；和

毒素部分，其包含细胞裂解毒素的治疗活性部分。

12. 根据实施方案11所述的多肽，其中所述毒素部分是去免疫的。

13. 一种组合物，其包含：

根据实施方案11所述的第一种融合多肽；和

第二种融合多肽，其包含：

根据实施方案11所述的第二种融合多肽；或

融合多肽，其包含特异性地结合癌症干细胞差别地表达的第二种标志物的单克隆抗体或其scFv。

14. 根据实施方案13所述的组合物，其中癌症干细胞差别地表达的至少一种标志物包括CD133。

15. 根据实施方案13或实施方案14所述的组合物，其中癌症干细胞差别地表达的至少一种标志物包括EGFR。

16. 一种方法，其包括：

给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的：

实施方案2的单克隆抗体；

实施方案3-5中的任一个的scFv；

根据实施方案11或实施方案12所述的融合多肽；或

实施方案9、10或13-15中的任一个的组合物。

17. 根据实施方案9所述的组合物，所述组合物另外包括与单克隆抗体偶联的纳米颗粒。

18. 根据实施方案10所述的组合物，所述组合物另外包括与scFv偶联的纳米颗粒。

19. 一种组合物，其包含与下述物质偶联的可检测的标志物：

实施方案2的单克隆抗体，或

实施方案3-5中的任一个的scFv。

20. 一种方法，其包括：

使实施方案19所述的组合物与至少一个表达CD133的细胞接触；和

检测包含与至少一个表达CD133的细胞特异性地结合的至少一部分组合物的复合物。

21. 根据实施方案20所述的方法，其中所述接触包括：给受试者施用所述组合物，所述受试者包含表达CD133的癌症干细胞。

22. 根据实施方案20所述的方法，其中检测包含与至少一个表达CD133的细胞特异性地结合的至少一部分组合物的复合物指示，所述受试者具有肿瘤病症或处于该风险中。

就本文公开的包括分散步骤的任意方法而言，所述步骤可以以任意可行的次序执行。并且，在适当时，可以同时进行2个或更多个步骤的任意组合。

下述实施例例证了本发明。应当理解，具体实施例、材料、量和操作应当根据本文阐述的本发明的范围和精神广阔地解释。

实施例

实施例1 -细胞培养

在含有20% FBS、1% 非必需氨基酸（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、1% 丙酮酸钠（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）和1% 青霉素-链霉素的最低基础培养基（MEM）中，培养Caco-2细胞。通过外科手术，从分离的神经胶质瘤样本衍生出GBM6细胞；在补充了B27、N2和20 ng/ml EGF和FGF的无血清的DMEM/F12培养基中，培养这些细胞。在含有10% FBS和1% 青霉素-链霉素的Dulbecco氏MEM中，培养U87细胞。所有试剂都购自Invitrogen（Carlsbad, CA），除非另外指出。

实施例2 - CD133抗原设计和制备

人CD133（NCBI参照序列NM_006017.1）编码865个氨基酸残基的蛋白。在理论上预测其中的约355个是高度免疫原性的。在掺入密码子优化来提高细菌表达以后，合成了与该选择的氨基酸段相对应的1065碱基对寡核苷酸。对该寡核苷酸序列进行PCR扩增，克隆进具有N-端His-标签的PET30a载体中，进行序列验证，然后转化进BL-21（DE3）大肠杆菌菌株中。为了蛋白表达，在LB培养基中培养0.5升转化的细菌，用0.4 mM IPTG诱导2小时。通过离心沉淀出细胞，重新悬浮于Tris-HCl裂解缓冲液中，并通过在冰浴上的声处理来破碎。如下分析在上清液和沉淀物中的蛋白表达：在12% SDS-PAGE凝胶中分离它们，然后用考马斯蓝染色。使用镍-NTA珠子，从沉淀物中纯化重组蛋白。

实施例3 - 免疫接种和单克隆抗体生产

在研究中使用的所有动物方案都得到明尼苏达大学的IACUC的批准。给Balb/c小鼠注射重组CD133肽片段。定期用抗原强化动物3-4次，直到得到足够的针对CD133的血清滴度，这通过ELISA分析获知。将免疫的动物安乐死，取出它们的脾。使用PEG，使得到的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，并在HAT培养基中培养。使用ELISA，筛选培养物上清液中抗CD133抗体的生产。

实施例4 - 通过蛋白质印迹筛选杂交瘤上清液

在RIPA缓冲液（Thermo Scientific, Waltham, MA）中裂解Caco-2细胞，并在10,000 rpm和4℃离心，以除去碎片。使用BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Scientific, Waltham, MA），测量细胞裂解物的蛋白浓度，加入牛血清白蛋白作为标准品。通过10% SDS-PAGE凝胶（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA）分离细胞裂解物，并使用标准印迹装置（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA）转移至硝酸纤维素膜（Whatman Inc., Piscataway, NJ）上。用在TBST中的5% 脱脂奶粉封闭膜1小时，然后用杂交瘤上清液或对照（阴性对照：免疫前血清；阳性对照：抗-CD133抗体、得自Abcam的ab 19898和免疫后抗血清）在4℃温育过夜。然后用TBST洗涤膜3次，再用在5% 脱脂奶粉/TBST中的与HRP（CalBiochem, San Diego, CA）缀合的抗-小鼠IgG在室温温育1小时。然后用TBST洗涤膜3次，并使用SuperSignal West Pico化学发光底物（Thermo Scientific, Waltham, MA）显影。

实施例5 - 免疫荧光

将Caco-2细胞铺板在16-孔室载玻片中。在培养4天以后，用4% 低聚甲醛固定细胞，在DPBS中洗涤，然后在200 mM甘氨酸中温育10分钟。然后用0.5% BSA和0.2% 明胶在PBS中的溶液封闭细胞10分钟。此后，用杂交瘤上清液或相关对照（阴性对照：免疫前血清；阳性对照：抗-CD133抗体、得自Miltenyi Biotec（Auburn, CA）的AC141和免疫后抗血清）在4℃温育过夜。用PBS洗涤细胞5次，然后用Alexa 594偶联的抗-小鼠IgG在室温温育1小时。用PBS进一步洗涤细胞，然后在荧光显微镜下显影。使用ProgRes C3^®软件获取图像，然后使用Adobe Photoshop^®进行处理。

实施例6 - CD133 cDNA转染

根据生产商的说明书，使用FuGENE HD转染试剂，将CD133-IRES GFP或CMV GFP构建体转染进U87细胞中。简而言之，将细胞铺板在10 cm培养皿中。12小时以后，在无血清的生长DMEM中稀释10µg pDNA，并与40µl转染试剂混合。在温育15分钟以后，将转染混合物加给细胞。48小时以后，使用非酶促的细胞解离缓冲液（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）收获细胞，用于流式细胞计量术。

实施例7–FACS染色

将原代人胶质母细胞瘤GBM6细胞、U87或Caco-2细胞洗涤3次，并悬浮于100µl PBS中。用CD133/2（293C3）（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）或100µl杂交瘤克隆7上清液将细胞染色，在4℃温育30分钟，洗涤3次，然后悬浮于100µl PBS中。进一步用10µl抗-小鼠hylite 647（1:40稀释度；American Qualex, San Clemente, CA）在4℃温育细胞30分钟，洗涤3次，并通过流式细胞计量术进行分析。

实施例8 - 免疫组织化学

将人肾或胶质母细胞瘤组织的5µm石蜡切片固定在带电荷的载玻片上。使用标准的方法，将切片去石蜡，并再水合，在流动的自来水中冲洗，置于PBS浴中5分钟。然后使用含有EDTA缓冲液（pH 8.0）的染色皿，在预热的蒸汽浴中温育载玻片30分钟，然后冷却20分钟。用PBS（pH 7.4）洗涤载玻片最少5分钟，然后进行下述温育步骤：用无血清的背景Sniper（Biocare Medical, Concord, CA）、第一抗体（在1:200稀释度的杂交瘤上清液）在4℃封闭过夜，并使用Leica Bond post primary、Leica Bond聚合物和DAB发色团显影剂。均匀地冲洗切片，用苏木精复染色，脱水，用盖玻片密封，并成像。

实施例9 - 衣霉素处理和分析

将Caco-2细胞接种进6-孔平板中，并用2.5µg/ml - 20µg/ml衣霉素或媒介物（含有0.1% DMSO的培养基）处理3天。每天如下收集样品：从一组孔中取出培养基，并在RIPA缓冲液中裂解细胞。将裂解物离心以除去细胞碎片，然后使用杂交瘤克隆7或抗-GAPDH（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）作为第一抗体，通过蛋白质印迹法进行分析。

实施例10 - scFv的克隆和表达

概述

制备人prominin-1-特异性的小鼠MAb的克隆scFv基因。首先，使用源自杂交瘤细胞系的RNA，构建小鼠scFv文库。简而言之，在总RNA纯化和第一链cDNA合成以后，使用独特的两步PCR方案来扩增编码scFv的基因库。从合成的cDNA分别扩增VH和VL基因库。通过使用重叠PCR融合VH和VL片段，随机地装配scFv基因。用单一很少切割的限制性酶SfiI，消化scFv cDNA和pCDisplay-4载体。连接以后，将重组构建体转化进电感受态的大肠杆菌XLI-BLUE中。在37℃培养过夜以后，从细菌中提取扩增的重组噬粒，并在-20℃保藏。所述文库构建通过仅一次转化实现，且具有1.0 x 10⁷的理论尺寸。

此后，进行标准淘选过程。在用人prominin-1预包被的96-孔板中，在37℃温育重新扩增的文库1-2小时。多次洗涤以后，用低pH缓冲液洗脱结合的噬菌体抗体。在大肠杆菌中扩增得到的重组噬菌体，用于下一个淘选循环。在3个淘选循环以后，挑选30个随机挑取的克隆，通过噬菌体ELISA测定它们对prominin-1的反应性，鉴别出9个阳性克隆。DNA测序结果证实，它们中的5个是相同的，这提示，它们都源自单个杂交瘤克隆：分泌抗-prominin-1 MAb的杂交瘤细胞系。

将它们中的一个（NO. 11克隆）转化进大肠杆菌Top10F’中用于表达。通过使用大肠杆菌分泌机制，实现scFv的可溶表达，并在低温（30℃）诱导。表达的scFv主要存在于培养基和大肠杆菌的周质空间中。

进行可溶性scFv ELISA，以确认与靶蛋白的结合特异性。存在于培养基和周质空间中的重组的No.11 scFv对人prominin-1蛋白是特异性的，尽管结合信号低于阳性对照，即完整的亲本二价抗体。

综上所述，我们能够从选择的杂交瘤克隆成功地克隆scFv基因/cDNA。

材料和试剂

抗原: 在大肠杆菌中表达为6*HIS融合蛋白的人prominin-1。

杂交瘤细胞系: 抗-人C-prominin-1鼠单克隆抗体（No.7）。

EIA/RIA stripwell 96-孔平板: Corning（New York, NY）。

酶：

RT: SuperScript II逆转录酶, Invitrogen（Carlsbad, CA）

ExTaq: Takara Co. （Shiga, 日本）

T4连接酶: Invitrogen（Carlsbad, CA）

限制性酶: SfiI, Roche（Basel, 瑞士）

大肠杆菌XLI-Blue宿主菌株：得自Stratagene（La Jolla, CA）。XLI-Blue是抑制基因菌株，其中琥珀终止密码子不能被识别，且小鼠ScFv抗体与噬菌体外壳蛋白III融合，并展示在噬菌体病毒粒子的表面上。

大肠杆菌Top10F’宿主菌株：得自Invitrogen（Carlsbad, CA）。Top10F’是非抑制基因菌株，其中琥珀终止密码子会被识别，并生成可溶性scFv抗体。

VCSM13辅助噬菌体：得自Stratagene（La Jolla, CA）。

LB培养基：每升：10 g细菌用胰蛋白胨，5 g酵母浸出物，5 g NaCl。

LB-A平板：将15 g琼脂加入1 L LB培养基中，高压灭菌，冷却后，加入氨苄西林（AMP）至100µg/mL。

SB培养基：每升：10 g MOPS，30 g胰蛋白胨，20 g酵母浸出物。搅拌进行溶解，滴定至pH 7.0。在121℃高压灭菌20分钟。

顶层琼脂：将0.35g细菌用琼脂加入50 mL LB培养基中。高压灭菌。

PBS：每升：8 g NaCl，0.2 g KCl，1.7 g Na₂HPO₄，0.163 g KH₂PO₄，用HCl调节pH至7.4。

包被缓冲液：0.1M NaHCO₃（pH 8.6）。

TBS缓冲液：50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl。

底物：得自Pierce（Rockford，IL）的TMB和H₂O₂。

封闭缓冲液1：TBS（pH 7.4），1 mg/mLBSA，0.02% NaN₃。过滤器除菌，并在4℃保藏。

封闭缓冲液2：PBS（pH 7.4），5 mg/mL脱脂奶粉，0.02% NaN₃，在4℃保藏。

HOURP-缀合的抗-M13抗体：得自GE healthcare（Fairfield, CT）

HOURP-缀合的抗-HA标签抗体：得自GenScript Co. （Piscataway, NJ）

HOURP缀合的山羊抗-小鼠第二抗体：得自Golden Bridge Int., Inc. （Mukilteo, WA）。

酸性洗脱缓冲液：0.1M甘氨酸-HCl（pH 2.2）。

噬菌体沉淀剂（PEG/NaCl）：20% （w/v）聚乙二醇-6000，2.5 M NaCl。高压灭菌，在室温保存。

总RNA提取试剂盒：QIAGEN Co. （Valencia, CA）。

质粒纯化试剂盒：QIAGEN Co. （Valencia, CA）。

载体：pCDisplay-4载体。

琼脂糖凝胶DNA片段回收试剂盒：Takara Co. （Shiga, 日本）。

硝酸纤维素膜: Bio-Rad Laboratories, Inc. （Hercules, CA）。

表3. 小鼠VΚ5’引物.

引物名称	引物序列（5’→3’）	SEQ ID NO
			MSCVK-1	GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TCC AGC TGA CTC AGC C	3
MSCVK-2	GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TTC TCW CCC AGT C	4
			MSCVK-3	GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGM TMA CTC AGT C	5
MSCVK-4	GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGY TRA CAC AGT C	6
			MSCVK-5	GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TRA TGA CMC AGT C	7
MSCVK-6	GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTM AGA TRA MCC AGT C	8
			MSCVK-7	GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTC AGA TGA YDC AGT C	9
MSCVK-8	GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TYC AGA TGA CAC AGA C	10
			MSCVK-9	GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TTC TCA WCC AGT C	11
MSCVK-10	GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG WGC TSA CCC AAT C	12
			MSCVK-11	GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTS TRA TGA CCC ART C	13
MSCVK-12	GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYR TTK TGA TGA CCC ARA C	14
			MSCVK-13	GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CBC AGK C	15
MSCVK-14	GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TAA CYC AGG A	16
			MSCVK-15	GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CCC AGW T	17
MSCVK-16	GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CAC AAC C	18
			MSCVK-17	GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTT TGC TGA CTC AGT C	19

表4. VΚ3’反义引物

引物名称	引物序列（5’→3’）	SEQ ID NO
			MSCJK12-BL	GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC AGA GGA TTT KAT TTC CAG YTT GGT CCC	20
MSCJK4-BL	GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC AGA GGA TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC	21
			MSCJK5-BL	GGA AGA TCT AGA GGA ACC ACC CCC ACC ACC GCC CGA GCC ACC GCC ACC AGA GGA TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC	22

表5. VH 5’同义引物

引物名称	引物序列（5’→3’）	SEQ ID NO
			MSCVH-1	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTR MAG CTT CAG GAG TC	23
MSCVH-2	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTB CAG CTB CAG CAG TC	24
			MSCVH-3	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTG CAG CTG AAG SAS TC	25
MSCVH-4	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTC CAR CTG CAA CAR TC	26
			MSCVH-5	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTY CAG CTB CAG CAR TC	27
MSCVH-6	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTY CAR CTG CAG CAG TC	28
			MSCVH-7	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTC CAC GTG AAG CAG TC	29
MSCVH-8	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTG AAS STG GTG GAA TC	30
			MSCVH-9	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTG AWG YTG GTG GAG TC	31
MSCVH-10	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTG CAG SKG GTG GAG TC	32
			MSCVH-11	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTG CAM CTG GTG GAG TC	33
MSCVH-12	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTG AAG CTG ATG GAR TC	34
			MSCVH-13	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTG CAR CTT GTT GAG TC	35
MSCVH-14	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTR AAG CTT CTC GAG TC	36
			MSCVH-15	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTG AAR STT GAG GAG TC	37
MSCVH-16	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTT ACT CTR AAA GWG TST G	38
			MSCVH-17	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTC CAA CTV CAG CAR CC	39
MSCVH-18	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTG AAC TTG GAA GTG TC	40
			MSCVH-19	GGT GGT TCC TCT AGA TCT TCC CTC GAG GTG AAG GTC ATC GAG TC	41

表6. VH 3’反义引物

引物名称	引物序列（5’→3’）	SEQ ID NO
			MSCGlab-B	CCT GGC CGG CCT GGC CAC TAG TGA CAG ATG GGG STG TYG TTT TGG C	42

表7. 重叠延伸引物

引物名称	引物序列（5’→3’）	SEQ ID NO
			RSC-F	GAG GAG GAG GAG GAG GAG GCG GGG CCC AGG CGG CCG AGC TC	43
RSC-B	GAG GAG GAG GAG GAG GAG CCT GGC CGG CCT GGC CAC TAG TG	44

实验规程

抗原-抗体反应的确认

在含有10% FBS的DMEM中，培养杂交瘤细胞。当细胞汇合时，将它们培养另外2-3天。收获上清液，用于ELISA。以1:1000稀释度，将重组的C-prominin-1蛋白包被在96-孔板中，并4℃温育过夜。抛弃包被缓冲液，洗涤蛋白1次，加入300µl/孔的5% 奶缓冲液，并在4℃温育过夜。

ELISA. 以1:1、1:10、1:100、1:500用5% 奶缓冲液稀释杂交瘤上清液，并加入50 μL/孔，在37℃温育1小时。洗涤孔4次，并以1:2000稀释度加入50 μL/孔山羊抗-小鼠第二抗体-HOURP缀合物，在37℃温育1小时。洗涤4次，并加入50 μL/孔底物。

XLI-BLUE电感受态细胞和VCSM13辅助噬菌体的制备

电感受态的大肠杆菌 -XLI-Blue 的制备。

将15 mL预温热的SB接种进含有单个大肠杆菌菌落的50-mL烧瓶中，所述菌落得自在琼脂平板上新鲜划线的甘油储备物。加入四环素至30µg/mL，并在250 rpm和37℃培养细胞过夜。将2.5 mL培养物稀释进6个2升烧瓶中的每一个中，每个烧瓶装有500 mL SB、10 mL 20% 葡萄糖和5 mL 1 M MgCl₂。不加入抗生素。以250 rpm在37℃振荡烧瓶，直到在2.5小时以后在600nm的光密度（OD）是约0.7。将6烧瓶培养物和12个500-mL离心瓶在冰上冷冻15分钟。将每个物体保持在冰上，并尽可能快地进行。

将烧瓶培养物倒入6个预冷的500-mL离心瓶中，并在3,000 g在4℃离心20分钟。倒出上清液，使用25-mL预冷的塑料移液器，将每份沉淀物重新悬浮于25 mL预冷的10% 甘油中。将2份重新悬浮的沉淀物组合在一个预冷的500-mL离心瓶中，并加入预冷的10% 甘油至约500 mL。类似地组合其它沉淀物，并如前所述离心。将每份沉淀物重新悬浮于500 mL 10% 预冷的甘油中，并如前所述离心。倒出上清液，将每份沉淀物重新悬浮于25 mL预冷的10% 甘油中，直到达到完全均一。将悬浮液转移进预冷的50-mL试管中，并在2,500 g在4℃离心15分钟。同时，在干冰/乙醇浴中在支架中放置约50个1.5 mL微量离心管。

从每个试管小心地倒出上清液，直到沉淀物开始滑出。抛弃上清液。使用25-mL预冷的塑料移液管，将每份沉淀物重新悬浮于剩余体积中，并组合3份悬浮液。使用剪掉了末端的1-mL移液尖立即取300-µL体积等分试样到置于干冰/乙醇浴内的微量离心管中。给该试管盖上盖，并在-80℃保藏。

辅助噬菌体 -VCSM13 的制备。

在37℃水浴中，用10µL VCSM13辅助噬菌体的100倍系列稀释物，感染OD600为0.4的200µg/mL XLI-Blue 30分钟。加入3 mL融化的H-top琼脂（42℃），并倒在温LB平板上。使平板静置，并在37℃温育过夜。将小噬斑挑入5 mL新鲜的SB（OD600为0.4）中，并在37℃振荡培养约2小时。将培养物加入在2升烧瓶内的500 mL SB中，并在37℃振荡培养1小时。加入卡那霉素至50µg/mL的终浓度，并在37℃振荡培养烧瓶过夜。

将过夜培养物在10,800 g离心15分钟。将100 mL PEG/NaCl（20% 聚乙二醇6000, 2.5M NaCl）加入400 mL上清液中，并在冰上放置1小时。将该培养物在10,800 g离心30分钟，倒掉PEG/NaCl。将沉淀物重新悬浮于8 mL PBS中，并在11,600 g离心10分钟，以除去任何残余的细菌碎片。将上清液转移至新鲜的50-mL瓶子，并在4℃保藏。

小鼠scFv文库的构建

合成了用于小鼠scFv扩增的引物。提取总RNA，并反转录成cDNA。按照QIAGEN RNeasy Micro Handbook，进行抗-人prominin-1杂交瘤细胞总RNA的提取和纯化。

将下述组分加入无核酸酶的微量离心管中:

将该混合物加热至65℃持续5分钟，然后在冰上快速冷冻。通过简单离心，收集试管的内含物。然后将下述物质加入试管中：

混合所述内含物，并在4℃温育50分钟。通过在70℃加热15分钟，灭活反应。

进行PCR，以扩增编码小鼠scFv的基因库。独立地扩增编码轻链（VL）和重链（VH）可变区片段的DNA序列，通过重叠延伸PCR进行融合，并使用稀有切割物SfiI的2个不对称位点进行定向克隆。使用的引物序列如在材料和试剂部分中所示。将scFv（VL-接头-VH）转录为在一个LacZ启动子控制下的单个转录物。在抗体基因和噬菌体基因III之间的琥珀终止密码子允许在大肠杆菌的非抑制子菌株中生产可溶性scFv片段。

PCR反应和条件

用于扩增 VL 和 VH 的第一轮 PCR :

第一轮PCR条件：

94℃保持5分钟

30个下述循环：

94℃保持30秒

56℃保持30秒

72℃保持1分钟

随后72℃保持10分钟。

第一轮PCR产物的分离

将PCR产物在1% 琼脂糖凝胶上泳动，切出正确大小的带（VH和VL小鼠抗体的大小是约400碱基对）。通过树脂结合试剂盒（Takara Co., Shiga, 日本），纯化所述DNA。

第二轮 PCR （重叠延伸）

在第二轮PCR中，以等摩尔比混合适当的第一轮产物，以制备scFv产物。

在下述条件下，进行scFv的PCR：

94℃保持5分钟

20个下述循环：

94℃保持30秒

56℃保持30秒

72℃保持2分钟

随后72℃保持10分钟。

第二轮PCR产物的分离

将PCR产物在1% 琼脂糖凝胶上泳动，切出正确大小的带（小鼠抗体的scFv的大小是约800碱基对）。通过树脂结合试剂盒，纯化所述DNA。

scFv PCR产物和pCDisplay-4载体的限制性消化

PCR产物的消化反应含有：

10µg纯化的scFv产物

160单位的SfiI（16单位/µg DNA）

20µL 10×缓冲液M

加入水至200µL体积。

pCDisplay-4载体的消化反应应当含有：

20µg pCDisplay-4载体

120单位的SfiI（6单位/µg DNA）

20µL 10×缓冲液M

加入水至200µL体积。

将两种消化物在50℃温育5小时。在1% 琼脂糖凝胶上纯化消化的scFv和载体（双重切割的载体的正确大小是约3400碱基对，而线性化的载体DNA是5000碱基对）。

消化的scFv与消化的载体DNA的连接

在16℃温育下述连接混合物过夜：

pCDisplay-4载体2µg

scFv 3µg

5×缓冲液40µL

T4连接酶15µL

加入水至200µL。

将连接产物转化进感受态大肠杆菌XLI-BLUE细胞中

通过加入1µL糖原、1µL酵母tRNA和20µL 3 M醋酸钠和400µL乙醇，沉淀出连接产物，并在-20℃保藏混合物过夜。

在微量离心机中在4℃全速离心连接产物混合物15分钟。取出上清液，并抛弃。用1 mL 70% 乙醇冲洗沉淀物2次，并倒置在纸巾上排液。将沉淀物溶解于30µL水中，随后轻轻涡旋。

在冰上融化300µL电感受态大肠杆菌。将感受态细胞加入连接的文库样品中，并通过上下抽吸1次进行混合，转移至容器。将该容器在冰上保存1分钟，然后在2.5KV电穿孔。立即用1 mL冲洗容器，然后用2 mL预温热的SB冲洗2次。在50-mL烧瓶中，组合用于冲洗容器的5µL SB。将该烧瓶在37℃在250rpm振荡1小时。

将10 mL预温热的SB加入烧瓶中，并加入3µL 100 mg/mL amp^R。将15-mL培养物在37℃在250 rpm振荡1小时。为了滴定转化的细菌，在200µL SB培养基中稀释2µL该培养物，并将100µL和10µL该1:100稀释液铺板在LB + amp^R平板上。将所述平板在37℃温育过夜。

将80 mL预温热的SB、5 mL 20% 葡萄糖和97µL amp^R加入所述培养物中。将100-mL培养物在37℃在250 rpm振荡过夜。

通过离心过夜培养物，收获细菌细胞，并使用QIAGEN试剂盒，纯化噬粒。在-20℃保藏噬粒。

针对人prominin-1的文库淘选(panning)

文库重新扩增

将10µg小鼠ScFv文库噬粒电转化进300µL电感受态的XLI-BLUE细胞中。立即用1 mL预温热的SB冲洗容器，然后用2 mL预温热的SB冲洗2次，并在50-mL烧瓶中组合所述5 mL。将该烧瓶在37℃在250rpm振荡1小时。

加入10 mL预温热的SB、3µL amp^R和30µL tet^R。将15-mL培养物在37℃在250 rpm振荡1小时。加入4.5µL amp^R，并将烧瓶在250 rpm和37℃振荡另外1小时。

加入4 mL VCSM13辅助噬菌体，并将培养物转移至500-mL烧瓶。加入180 mL预温热的SB培养基、92.5µL amp^R和370µL tet^R。将200-mL培养物在37℃在300 rpm振荡1.5小时。

加入200µL 50 mg/mL Kan^R，并继续在37℃在250 rpm振荡4-5小时。将该培养物在4℃在3,000 g离心15分钟。加入50 mL 5*PEG/NaCl，并培养物在冰上保存30分钟。将它在4℃在15,000 g离心15分钟。抛弃上清液。通过倒置在纸巾上，排空瓶子，用纸巾从离心瓶的上部擦掉剩余的液体。

通过沿着离心瓶的侧面上下抽吸，将噬菌体沉淀物重新悬浮于2 mL 1% BSA的TBS溶液中。将悬浮液转移至1.5 mL试管，将其涡旋，并在微量离心机中在4℃全速离心5分钟。在4℃保存上清液。

针对人 prominin-1 的文库淘选

用在50µL 0.1M NaHCO₃（pH8.6）中的2µg人prominin-1，包被96-孔ELISA平板的孔，并在4℃温育过夜。将包被溶液摇出孔，通过加入300µL在TBS中的1% BSA（w/v），封闭孔。密封平板，并在4℃温育过夜。

将封闭缓冲液摇出孔，将50µL新鲜制备的噬菌体文库加入每个孔（4个孔）中。密封平板，并在37℃温育2小时。

将噬菌体溶液摇出孔，并用ELISA平板洗涤机洗涤孔5次（在第二轮中洗涤10次，在第三轮中洗涤15次）。

摇出最后的洗涤溶液以后，加入50µL 0.1M甘氨酸-HCl（pH 2.2），在37℃温育平板10分钟。用移液器剧烈地上下抽吸溶液10次，将洗脱物转移至含有6µL中和溶液（1M Tris）的微量离心管。将洗脱物转移至2-mL XLI-BLUE细胞，并在37℃温育30分钟。

将6 mL预温热的SB培养基和1.6µL 100mg/mL amp^R和12µL 5mg/mL tet^R加至细胞。将8-mL培养物在37℃以250 rpm振荡1小时。加入2.4µL amp^R，将培养物以250 rpm在37℃振荡另外1小时。

将2 mL VCSM13辅助噬菌体加入8-mL培养物中，并将培养物转移至烧瓶。加入90 mL SB培养基和46µL amp^R和184µL tet^R。将100-mL培养物在37℃以250 rpm振荡1.5小时。

加入100µL 50 mg/mL kan^R，并继续在37℃以250 rpm振荡过夜。

在4℃以3,000 g离心培养物15分钟。加入25 mL 5*PEG/NaCl，将培养物在冰上保存30分钟。

在4℃以15,000 g离心培养物15分钟。抛弃上清液。通过倒置在纸巾上，排空瓶子，用纸巾从离心瓶的上部擦掉剩余的液体。

通过沿着离心瓶的侧面上下抽吸，将噬菌体沉淀物重新悬浮于2 mL 1% BSA（在TBS中）中。将悬浮液转移至1.5 mL试管，将其涡旋，并在微量离心机中在4℃全速离心5分钟。在4℃保存上清液，用于下一轮淘选。

已经进行了3轮淘选。

噬菌体 ELISA

从第三个洗脱物滴定平板的文库淘选中，随机挑选30个单个菌落，并接种进2 mL含有100µg/mL amp^R的LB培养基中。将2-mL试管在37℃以250 rpm振荡5-8小时。

将40µL辅助噬菌体VCSM13加入每份培养物中，并在37℃振荡另外2小时。

将2µL kan^R加入每份培养物中，并将所述培养物在250 rpm和30℃振荡过夜。

在12,000 rpm离心培养物15分钟，取出上清液。用等体积的5%奶稀释含有噬菌体的上清液，并在室温温育10分钟。

将100µL稀释的噬菌体加入每个孔中，并在37℃温育2小时。

洗涤平板5次。

向每个孔中加入50µL在1:3,000稀释的第二抗体缀合物（HOURP-缀合的抗-M13抗体，在5%奶中稀释），并在37℃温育1小时。

洗涤平板5次。加入50µL/孔的TMB底物用于检测，并在室温温育30分钟。

DNA 测序和生物信息学分析

通过噬菌体ELISA，发现9个克隆与人prominin-1特异性地反应，它们是No. 4、5、6、7、8、10、11、22、23。提取质粒，用于测序的引物是：P1: 5’-AAGACAGCTATCGCGATTGCAG-3’（SEQ ID NO:45）,和P2: 5’-GCCCCCTTATTAGCGTTTGCCATC-3’（SEQ ID NO:46）。

用专业软件（DNA Star）翻译得到的序列，并比对蛋白序列。

scFv 原核表达

根据测序结果，将NO. 11克隆转化进大肠杆菌宿主Top10F’中，用于表达。挑取单个菌落，在含有100µg/mL Amp^R的LB培养基中在37℃培养过夜。加入IPTG至1mM的终浓度，并在30℃诱导过夜。

收集过夜培养物，并以10,000 rpm离心5分钟。收集上清液和沉淀物，用于表达检测。通过在100℃煮沸10分钟，用2×SDS样品缓冲液使蛋白变性。通过10% SDS-PAGE，分离蛋白样品，并转移到硝酸纤维素膜（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA）上。用奶封闭缓冲液在室温封闭膜1小时，并用在1:200稀释度的HOURP-缀合的抗-HA标签抗体在室温温育1.5小时，在洗涤缓冲液中洗涤4次，按照生产商（Pierce, Rockford, IL）的推荐，通过化学发光测定来检测蛋白。

可溶性 scFv ELISA

从No.11 DNA转化的Top10F’大肠杆菌LB-Amp平板，挑取单个菌落，并用于接种25 mL含有100µg/mL Amp的LB培养基。将该培养物在37℃在250 rpm振荡过夜。

在500 mL含有Amp的LB中，稀释25 mL过夜培养物，并在37℃以250 rpm振荡约2小时，直到OD600达到0.5 -0.7。加入IPTG，至1 mM终浓度。将该培养物在30℃振荡过夜。

在4℃以5,000 g离心培养物20分钟。保留上清液用于ELISA。

用50 mL冰冷的含有蛋白酶抑制剂（1 mM PMSF）的PBS，完全悬浮细胞沉淀物，并在冰上以短脉冲进行声处理。功率设置为：7 min，40% 动力循环5（HD2200 W/MS 73）。将Triton X-100加入细胞裂解物中，至1%的终浓度，并在室温轻轻混合30分钟，以辅助融合蛋白的增溶。

在4℃以15,000 rpm（Heraeus #3334转子）离心混合物30分钟，取出上清液用于ELISA。

用等体积的5%奶稀释2份含有可溶性小鼠scFv的上清液（1份得自过夜培养物上清液，另一份得自过夜培养物沉淀物），并在室温温育10分钟。

将100µL稀释的scFv加入每个孔（用人prominin-1包被）中，并在37℃温育1小时。

洗涤平板5次。

向每个孔中加入50µL以1:2,000稀释的第二抗体缀合物（HOURP-缀合的抗-HA，在5%奶中稀释），并在37℃温育1小时。

洗涤平板5次。

加入50µL/孔的TMB底物用于检测，并在室温温育30分钟。

抗原 - 抗体反应的确认

在阴性和空白对照下，以1:1、1:10、1:100、1:500稀释度的含有MAb的上清液可以与人prominin-1特异性地反应，这证实抗-人C-prominin-1鼠单克隆抗体（No.7）会以高特异性和亲和力结合它的抗原，且它的可变区的克隆和表达是可行的。

用 scFv 形式构建微型小鼠抗体文库

在2步中构建微型小鼠scFv文库。用它们的对应反向引物和正向引物，扩增VL和VH的可变区基因库，以维持最大多样性。在VH的19种组合（19 X 1）和VL的51种组合（17 X 3）中，仅4种VH组合和7种VL组合具有扩增的阳性带（约400碱基对）。在纯化以后，将VH和VL基因彼此组合，以通过重叠延伸开发scFv基因（约800碱基对）。使用SfiI，消化重叠scFv PCR产物和pCDisplay-4载体。连接以后，将连接产物转化进XLI-BLUE中，并在-20℃保存得到的重组噬粒。通过单次电穿孔，构建含有1.0 X 10⁷个成员的噬菌体抗体文库。

针对人 prominin-1 的生物淘选

针对人prominin-1，淘选小鼠scFv文库。如表8所示，在3轮淘选以后，有效地富集了特异性的scFv克隆，从而使相对产率从第一轮淘选至第三轮淘选增加了394倍（6.3 x 10^-5/1.6 x 10^-7）。

表8. 针对人prominin-1的小鼠scFv文库的淘选

噬菌体 ELISA

在3轮淘选以后，筛选30个随机挑取的噬菌体克隆，通过噬菌体ELISA发现，9个与人prominin-1蛋白特异性地反应（表9）。具有结合特征的A450值将阳性克隆视作prominin-1。

表9. 第三轮洗脱物的噬菌体-ELISA的结果

测序结果

对所述9个阳性克隆成功地测序，它们的推论氨基酸序列列出在下面（表10）。用DNA Star软件分析它们的序列，揭示No.5、8、11、22、23的重链和轻链可变区是相同的。并且所有序列彼此非常接近，这提示，它们都源自单个杂交瘤克隆，即分泌抗-prominin-1 MAb的杂交瘤细胞系。变异可能是由于PCR或测序。

表10. 通过噬菌体ELISA选择的、针对人prominin-1的9个阳性scFv克隆的重链和轻链可变区的推论氨基酸序列

标有下划线的文字= 轻链（VL）；斜体文字- 重链（VH）；普通文字= 接头。

将No.11转化进大肠杆菌Top 10F’中，用于表达。它的DNA序列列出在下面。

表11. scFv No. 11 DNA序列

标有下划线的文字= SfiI位点；斜体文字= 接头；粗体文字= 6HIS标签；突显文字= HA标签；和

= 琥珀终止密码子。

以可溶形式表达的 scFv 的检测

通过转化进大肠杆菌Top10F’中，生产可溶的重组No.11 scFv抗体。由于Top10F’是非抑制基因菌株，会翻译琥珀终止密码子，并生成可溶性scFv抗体。利用大肠杆菌分泌机制，实现scFv的可溶表达，并在低温（30℃）诱导。

表达的scFv主要存在于培养基和大肠杆菌周质空间中。对培养物上清液和沉淀物中的表达的可溶性scFv进行蛋白质印迹检测。检测抗体是HOURP-缀合的抗-HA标签抗体，因为scFv被表达为HA-融合蛋白，其大小为34 kDa。

基于可溶性 scFv 的 ELISA

进行可溶性scFv ELISA，以证实与靶蛋白的结合特异性。在这里，通过人prominin-1预包被的平板，捕获表达的scFv，并用抗-HA Ab-HOURP缀合物，检测与HA标签融合的可溶性scFv的结合。如表12所示，在培养基和周质空间中表达的NO. 11 scFv被证实为人prominin-1蛋白特异性的，尽管结合信号低于阳性对照，即完整的亲本二价抗体。上清液和沉淀物是试验样品，PC是指阳性对照，使用杂交瘤分泌的抗体（在1:2000稀释），BLK是指空白。

表12. 针对人prominin-1的可溶性ELISA

通过使用噬菌体展示技术，我们已经成功地克隆和选择了针对人prominin-1的鼠MAb的VL和VH基因，并在大肠杆菌宿主中表达了它的scFv片段。

在用新构建的小鼠scFv文库（其源自人prominin-1特异性的MAb [克隆7]）针对人prominin-1进行3轮淘选以后，用阳性噬菌体ELISA信号检测到9个克隆，即NO. 4、5、6、7、8、10、11、22、23。DNA测序揭示，它们所有的重链和轻链可变区是类似的。具体地，NO. 5、8、11、22和23是相同的，这提示，它们都源自分泌抗-prominin-1 MAb的单个杂交瘤细胞系。

使用No.11克隆，在Top10F’大肠杆菌宿主中表达可溶性scFv蛋白。在30℃过夜诱导以后，表达的scFv主要存在于培养基和大肠杆菌周质空间中。

最后，基于可溶性scFv的ELISA证实了No.11 scFv抗体与靶蛋白的特异性结合，这证实，该scFv基因源自它的对应抗体，即人prominin-1-特异性的MAb。

该No. 11克隆的DNA序列是原始杂交瘤的VH和VL片段的真实cDNA序列。其它scFv克隆的序列中的微小变化可能源自PCR和DNA测序。

一般而言，通过使得自免疫小鼠的B细胞与得自相同物种的骨髓瘤细胞融合，制备MAb。在该永生的杂交瘤细胞系中，B细胞分泌针对它的表位的MAb，骨髓瘤细胞系使它们永生，这意味着，它们可以无限地生长和分裂。当要从杂交瘤总RNA克隆编码MAb的scFv基因时，可以想象，我们是指抗原特异性的重排的免疫球蛋白重链和轻链基因，但是骨髓瘤是B细胞起源，且具有抗体分泌所必需的所有细胞机制，并且许多甚至转录所述基因和分泌这些蛋白。所以，杂交瘤的2个配偶体细胞可能编码彼此可以错配的抗体VH和VL基因，并导致scFv克隆的失败。

基于几种不同的分析，据估测，存在超过100个小鼠重链种系序列（归入5个或更多个家族）和类似数目的k轻链种系序列。所以，难以用一对引物扩增抗原特异性的抗体VH和VL基因。尽管可以使用退火引物，但是该方案不可避免地修饰重排的基因区段的5’和3’末端，从而导致低蛋白表达，或甚至导致重组scFv的不表达。

为了防止上述的这些问题，已经采用噬菌体展示技术来克隆人prominin-1特异性的MAb scFv构建体，并获得原核表达。设计了2组小鼠特异性的VH和VL引物，与所有引物组合一起使用的PCR在理论上允许扩增所有重排的可变区。然后通过重叠PCR，连接扩增的VH、VL库，以得到用于克隆的最终scFv基因。因而，扩增了在两个末端处具有真正残基的VH、VL基因库，并且ScFv基因库得到VH和VL之间的最大组合，其确定地含有prominin-1-特异性的MAb’s scFv克隆。

在针对prominin-1的3轮淘选以后，用阳性噬菌体ELISA信号检测到9个克隆。DNA测序揭示，它们中的5个是相同的，这提示，它们都源自分泌抗-prominin-1 MAb的单个杂交瘤细胞系，且该克隆策略良好地工作。

接头的长度似乎会影响scFv分子的结合状态。长接头（约20个氨基酸）似乎有利于单体分子，而短接头（例如，5个氨基酸）有利于二聚体，其中一个scFv分子的VH与其它scFv分子的VL配对，反之亦然。在该研究中，使用18-氨基酸长的接头（SSGGGGSGGGGGGSSRSS; SEQ ID NO:74）来连接VH和VL片段。

实施例11

根据生产商（Polyplus Transfection）的说明书，使用JetPEI转染试剂，将Ult-Luc或CMV-CD133 pDNA构建体转染进HEK293-TLR2细胞中。简而言之，将7.5 x 10⁵细胞/孔接种进6-孔板中。12小时以后，在5µl 5% 葡萄糖中稀释2.5µg每种pDNA，并与也在5µl 5% 葡萄糖中的0.35µL JetPEI混合。温育15分钟以后，将转染混合物加给所述细胞。48小时以后，使用非酶促的细胞解离缓冲液（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）收获细胞，用于流式细胞计量术。

在24:1的FITC:scFv比（Invitrogen, Carlsbad, CA），用FITC标记CD133scFv，并进行透析，以除去任何游离的未结合的FITC。从CD133的已知GeneBank序列，制备寡核苷酸，然后使用聚乙烯亚胺（PEI）-DNA复合物转染进HEK293-TLR2细胞中。与抗-CD133scFv-FITC复合物一起温育细胞，洗涤，然后在BD FACScanto II流式细胞计上研究。以标准直方图形式表示数据，其中相对于荧光强度绘制阳性细胞百分比。仅CD133转染的细胞与FITC-标记的CD133scFv反应。对照包括：与空载体反应的转染细胞，与同种型对照反应的转染细胞，或不与CD133-FITC反应的未转染细胞。结果显示在图4中。

实施例12 - dCD133KDEL的构建

使用DNA改组和DNA克隆技术，合成和装配编码单链CD133KDEL的杂合基因。完全装配的融合基因（从5’末端至3’末端）由下述元件组成：NcoI限制位点、ATG起始密码子、243氨基酸人dCD133的基因、在重链和轻链sFv之间的甘氨酸丝氨酸（G4S）3接头、7氨基酸EASGGPE接头、假单胞菌外毒素（PE）分子的前362个氨基酸（用KDEL替代在C-端处的REDLK）和在构建体的3’末端处的NotI限制位点。将得到的1846碱基对NcoI/NotI片段基因剪接进pET28c细菌表达载体中，后者在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷可诱导的T7启动子控制下。使用DNA测序分析（Biomedical Genomics Center, 明尼苏达大学）验证，该基因具有正确的序列，并已经克隆在框架内。为了制备具有降低的免疫原性的去免疫的CD133KDEL（dCD133KDEL），使用QuickChange定位诱变试剂盒（Stratagene, La Jolla, CA），突变了代表PE38上的7个重要表位中的8个氨基酸。改变了下述氨基酸：R490A、R513A、R467A、E548S、K590S、R432G、Q332S、R313A，并通过DNA测序进行确认。

实施例13 - dCD133KDEL融合蛋白在体外杀死鳞状癌细胞

在24-孔组织培养板中培养头颈癌细胞系UMSCC-11B。简而言之，给每个孔铺板10,000个细胞。每天更换含有融合蛋白的培养基。每隔一天，使用胰蛋白酶/盐水溶液收获孔，用锥虫蓝活体染料染色，并在显微镜下用血球计数器计数。未处理的孔通常在第8天之前汇合。与未处理的孔中的细胞相比，在含有0.5 nM dCD133KDEL的孔中，细胞生长受到抑制。在含有类似浓度的对照抗-B细胞靶向的毒素CD22KDEL的孔中，生长不受抑制。结果显示在图6中。

实施例14

就肿瘤起始研究而言，以300,000细胞/小鼠的浓度，将UMSCC-11B鳞状癌细胞注射进裸鼠右胁腹中。每周使用数字测径器测量肿瘤尺寸2次，并计算肿瘤体积。研究了3个实验细胞组。施用UMSCC-11B细胞（经过CD133表达富集，使用Stem Cell Technologies FITC选择磁珠试剂盒，纯度大于80%）的动物表现出最高生长发生率（75%），并以最快的速率生长，这与富集的癌症干细胞群体相一致。未分选的细胞（对照）具有38%的肿瘤发生率，并明显更慢地生长（p<0.04）。给第三组小鼠施用用dCD133KDEL培养6天的细胞。这些小鼠具有最低的肿瘤发生水平，仅1/4，且该肿瘤以最慢的速率生长。数据指示，dCD133KDEL会抑制肿瘤起始。结果显示在图7中。

实施例15

在24-孔组织培养板中培养MDA-MB-231细胞。简而言之，给每个孔铺板10,000个细胞。每天更换含有融合蛋白的培养基。每隔一天，使用胰蛋白酶/盐水溶液收获孔，用锥虫蓝活体染料染色，并在显微镜下用血球计数器计数。与未处理的孔中的细胞相比，在含有1 nM或10 nM dCD133KDEL的孔中，细胞生长受到抑制。在含有类似浓度的对照抗-T细胞靶向毒素CD3CD3KDEL的孔中，生长减慢，但是没有完全抑制。NTR - 未处理。结果显示在图8中。

实施例16

为了确定与CD22CD19靶向配体连接的去免疫的毒素对CD22⁺CD19⁺ Daudi细胞的影响，在增殖测定中，将递增浓度的用去免疫的毒素制备的2219KDEL7mut与用未去免疫的毒素制备的未突变的2219KDEL进行了对比。数据呈现在图11中，作为对照应答百分比。

为了检测抗-毒素抗体，用去免疫的药物或未去免疫的药物对免疫感受态C57BL/6小鼠进行免疫。每周免疫小鼠，持续数周。在测量µg/ml抗-毒素IgG的改进ELISA中，分析得自各个小鼠的血清。将数据表示为平均µg IgG/ml。两组明显不同（p<0.05），去免疫的药物在几次免疫接种以后表现出抗-毒素的约80%下降。结果显示在图12中。

为了确定是否存在中和抗体，测试了得自免疫过的小鼠的血清的中和恒定抑制浓度的2219KDEL的能力。将数据描绘为对照应答百分比。SAL=血清抗-毒素水平。得自用未去免疫的药物免疫的小鼠的血清中和了高血清抗-毒素水平，但是得自用去免疫的药物免疫的小鼠的血清却不然。结果显示在图13中。

为了确定去免疫的2219KDEL7mut是否有效，在第3天开始，用药物或对照CD3CD3KDEL治疗scid小鼠（施用了Raji-luc细胞的致命注射）3个疗程。将混合的数据（实验1和2）显示为Kaplan-Meier图。药物是非常有活性的，且能够预防癌症的发作。结果显示在图14中。

实施例17

小鼠模型

我们的小鼠模型包括下述特征。1）可以全身性地施用在乳腺癌和胰腺模型中的细胞，并且癌症转移至几个关键器官，包括肝脏。2）我们用药物全身性地腹膜内地治疗。3）我们可以实时跟踪肿瘤的发展。我们如下实现：用荧火虫萤光素酶和绿荧光蛋白（GFP）报道基因遗传地工程改造我们的所有癌系，使得我们可以通过生物发光成像来跟踪药物治疗随时间的效应，并在每个时间点在不杀死小鼠的情况下观察内部正在发生的情况。选择所有肿瘤系的稳定转染子，且在致肿瘤性或抗原表达方面没有变化。进行组织学研究，以证实生物发光数据。用于最初转染的基因编码双重报告物萤光素酶和GFP，它会添加额外信息。例如，在最近的研究中，我们使用萤光素酶报告物来监测肿瘤进展，并使用GFP报告物来定位相同动物中肿瘤靶向的特定器官。优点是，我们可以实时观察体内转移，并更多地获知转移进展性质。就乳腺癌和头颈癌而言，通过外科手术将细胞植入脾中。正位地施用胰腺癌细胞。所述细胞在我们的模型中是致命的，肿瘤最常见地转移至肝脏。4）通过组织学研究，证实长期存活者没有肿瘤。组织学发现总是与我们的生物发光成像结果相关联。已经在几个最近的出版物中证实了这些模型的价值。

dCD133KDEL对具有全身性MDA-MB-231肿瘤的小鼠的肿瘤进展的影响

通过注射肿瘤细胞（经由脾内注射），在裸鼠中诱导全身性肿瘤。就脾内注射而言，制作小切口，使用镊子固定脾。使用27号针，将150-200万细胞缓慢地注射进脾中，以避免返流。在肿瘤接种后第6天，开始用dCD133KDEL腹膜内治疗小鼠。单个疗程由每隔一天（星期一、星期三、星期五）注射的20µg药物组成，给小鼠施用6个疗程。每周获取动物的图像。将生物发光强度测量为光子/秒/sr/cm²的函数。未治疗对照。实时获取小鼠的图像，并用Xenogen Ivis成像系统（Xenogen Corporation, Hopkington, MA）捕获图像，用IGOR Pro 4.09a软件（WaveMetrics, Inc., Portland, OR）分析。在成像之前，使用异氟烷气体麻醉小鼠。在成像以前10分钟，所有小鼠接受100 μl 30 mg/ml D-萤光素水溶液（Gold Biotechnology, St. Louis MO）作为萤光素酶的底物。所有图像代表5分钟暴露时间，且以光子/秒/sr/cm²为单位表达所有目标区域（ROI）。结果显示在图9中。

联合治疗

通过施用细胞（经由脾内注射），在裸鼠中诱导全身性MDA-MB-231肿瘤。在肿瘤接种后第6天，开始用次优剂量的dCD133KDEL、次优剂量的dEGF4KDEL或两种次优剂量的混合物治疗小鼠。单个疗程由每隔一天（星期一、星期三、星期五）施用的4µg dCD133KDEL或3µg EGF4KDEL注射组成，给小鼠施用4个疗程。用组合的两种药物治疗最后一组。每周获取动物的图像。将生物发光强度测量为光子/秒/sr/cm²的函数。未治疗对照。结果显示在图10中。

实施例18 - dCD133KDEL在体外抑制人胰腺腺癌MiaPaCa-2

使用蛋白合成抑制，作为抗癌活性的量度。为了测量蛋白合成，我们使用测量³H-亮氨酸掺入的标准测定。将细胞（10⁴/孔）铺板在96-孔平底板中，并在37℃在5% CO₂中温育过夜。将不同浓度的dCD133KDEL一式三份地加入孔中。继续温育72小时，并加入[甲基-³H]-亮氨酸（GE Healthcare, UK）（1 μCi /孔），温育最后24小时。冷冻平板以脱离细胞，然后收获在玻璃纤维滤器上，洗涤，干燥，并使用标准的闪烁方法计数。结果显示在图16中。

实施例19–在UMSCC-11B细胞上的CD133表达

在头颈癌细胞的UMSCC-11B细胞上的CD133表达。使用流式细胞计，测量在UMSCC-11B细胞系上的CD133表达。使细胞与抗-CD133scFV-FITC在暗处在冰上反应30分钟。然后使用盐水洗涤细胞3次，并使用流式细胞计（FACScanto™II, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ）进行研究。使用空白（未处理过的细胞）来建立非阳性细胞活性的门控。在头颈癌细胞系NA和UMSC-11B中分别以5.9%和6%表达CD133（表13）。包括Caco-2结肠直肠癌作为阳性对照细胞系，因为已知它过表达CD133。对照包括与抗-EpCam-FITC、抗-CD45-FITC和抗-CD19-FITC反应的细胞。CD45和CD19的表达主要限于标准的恶性造血细胞。

表13.

细胞系	CD133⁺	EpCam⁺	CD45⁺	CD119⁺
					NA	5.9	-	-	1.1
UMSCC-11B	6.0	98.0	0.5	0.3
					Caco-2	80.0	-	-	0.8

实施例20 - dCD133KDEL在体外抑制人头颈癌细胞系NA

将NA细胞（10⁴/孔）铺板在96-孔平底板中，并在37℃在5% CO₂中温育过夜。将不同浓度的dCD133KDEL一式三份地加入孔中。继续温育72小时，并加入[甲基-³H]-亮氨酸（GE Healthcare, UK）（1 μCi /孔），温育最后24小时。冷冻平板以脱离细胞，然后收获。将数据表示为，与在单独培养基中温育的对照细胞相比，³H-亮氨酸掺入的百分比。dCD133KDEL抑制蛋白合成活性。对照抗-T细胞不与NA细胞反应，且不会抑制活性。包括dEpCAM23KDEL作为阳性对照，因为在该细胞系上的高EpCAM表达。结果显示在图17中。

实施例21 - CD133-免疫颗粒

细胞培养

从ATCC得到Caco-2细胞，在保湿培养箱中，在含有20% FBS（Invitrogen, Carlsbad, CA）、1% 非必需氨基酸（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、1% 丙酮酸钠（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）和1% 青霉素-链霉素（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）的最低基础培养基（MEM）中在37℃/5% CO₂中培养。

装载了6-香豆素的马来酰亚胺官能化的PLGA纳米颗粒的制备

将PLGA（30 mg）和6-香豆素（250 μg）溶解于1 ml氯仿中。如下形成水包油乳剂：通过在冰浴上用探头声处理（18-24W, Sonicator XL, Misonix, Inc., Farmingdale, NY）5分钟，乳化在8 ml 2.5% w/v的PVA水溶液中的聚合物溶液。将二嵌段共聚物PLA-PEG-MAL（8 mg）溶解于氯仿（200µl）中，并在搅拌下逐滴加入上述乳剂中。将该乳剂在环境条件搅拌18小时，随后在真空下搅拌2小时，以除去残余的氯仿。通过超速离心（在4℃在35,000 rpm 35分钟，Optima LE-80K, Beckman Coulter, Inc., Brea, CA），取出纳米颗粒，并用去离子水洗涤3次。然后低压冻干（FreeZone 4.5, Labconco Corp., Kansas City, MO）纳米颗粒悬浮液，得到干粉。

CD133抗体与装载了6-香豆素的马来酰亚胺官能化的聚(乳酸-共聚-羟乙酸)（PLGA）纳米颗粒的缀合

CD133 抗体的亚氨基硫醇化：用含有150 mM氯化钠的磷酸钠缓冲液（pH 8），稀释20µg CD133抗体（AC 141, Miltenyi Biotec, Auburn, CA）至1 ml的终体积。向其中加入4µl新鲜制备的2-亚氨基四氢噻吩在磷酸钠/氯化钠缓冲液中的1 mM溶液，并在旋转器中在4℃温育2小时。使用Zeba脱盐柱（Pierce, Rockford, IL），按照生产商的方案，将亚氨基硫醇化的抗体溶液脱盐，并与Hepes缓冲液混合物（50 mM Hepes, pH 7.4, 150 mM氯化钠, 2 mM EDTA）进行缓冲液更换。使用ultra-4离心过滤机单元（AMICON, Millipore Corp., Billerica, MA），通过在4000 rpm、4℃离心30分钟，进一步浓缩脱盐的抗体溶液。

抗体与马来酰亚胺官能化的 PLGA 纳米颗粒的缀合：将在前一步骤中得到的浓缩的抗体溶液（大约200µl）加入15 mg马来酰亚胺官能化的PLGA纳米颗粒中，加载荧光6-香豆素染料，分散在750µl Hepes缓冲液混合物中，并在旋转器中在室温温育约4.5小时。通过离心（在台式离心机中在14000 rpm离心30分钟，或在超速离心中在30000 rpm离心30分钟），沉淀出颗粒，并用高压灭菌的去离子水洗涤2次。然后低压冻干（FreeZone 4.5, Labconco Corp., Kansas City, MO）纳米颗粒悬浮液，得到干粉。

CD133-纳米颗粒的蛋白质印迹

将1 mg PLGA颗粒（原样或与CD133抗体缀合）分散在25µl 2x凝胶加载缓冲液（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA）中，所述缓冲液补充了2-巯基乙醇，并在旋转振荡器中在室温温育30分钟。将试管放入水浴中，加热至82℃保持5分钟，然后离心以沉淀出纳米颗粒。通过12.5% SDS-PAGE凝胶，分离约20µl上清液，并使用标准印迹装置（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA）转移到硝酸纤维素膜（Whatman Inc., Piscataway, NJ）上。用在TBST中的5% 脱脂奶粉在4℃封闭膜夜，然后用在5% 脱脂奶粉/TBST中的与辣根过氧化物酶（HRP, EMD Chemicals, Gibbstown, NJ）缀合的抗-小鼠IgG在室温温育1.5小时。然后用TBST洗涤膜3次，并使用SuperSignal West Pico化学发光底物（Pierce, Rockford, IL）显影。结果显示在图18中。

使用CD133-免疫颗粒对Caco-2细胞进行免疫染色

将Caco-2细胞铺板在16-孔室载玻片中。在培养4天以后，用4% 低聚甲醛固定细胞，在DPBS中洗涤，然后在200 mM甘氨酸中温育10分钟。然后用0.5% BSA和0.2% 明胶在PBS中的溶液封闭细胞10分钟。此后，用在封闭溶液中制备的CD133抗体缀合的PLGA颗粒（装载了6-香豆素）的悬浮液或相关对照（阴性对照：未缀合的加载了6-香豆素的PLGA颗粒和第二抗体对照；阳性对照：抗-CD133抗体AC141, Miltenyi Biotec, Auburn, CA）在4℃温育2小时。用PBS洗涤细胞3次，然后用ALEXA 594偶联的抗-小鼠IgG（Invitrogen, Carlsbad, CA）在室温染色1小时。用PBS进一步洗涤细胞，然后在荧光显微镜下显影。使用ProgRes C3^®软件（Jenoptik AG, Jena, 德国）获取图像，然后使用Photoshop（Adobe Systems, Inc., San Jose, CA）进行处理。结果显示在图20中。

流式细胞计量术

将加载了6-香豆素的PLGA颗粒（原样或与CD133抗体缀合）分散在PBS中，至1 mg/ml的终浓度，并与ALEXA 647偶联的抗-小鼠IgG（Invitrogen, Carlsbad, CA）一起在旋转器中在室温温育2小时。通过在12000 rpm离心5分钟，沉淀出颗粒，并用PBS洗涤1次，然后通过流式细胞计量术进行分析。结果显示在图19中。

CD133抗体缀合的PLGA颗粒在Caco-2细胞中的摄入

将Caco-2细胞接种进24-孔平板中，并在5% CO₂培养箱中培养。当汇合时，对细胞进行下述系列步骤：首先，用减少血清培养基（含有2% FCS）替代完全生长培养基，并温育45分钟。此后，用分散在减少血清培养基中的CD133抗体缀合的PLGA颗粒或PLGA颗粒（40µg/孔）在4℃温育1小时。接着，除去纳米颗粒处理，用PBS洗涤一次，然后给细胞饲喂完全生长培养基，并在37℃温育1小时。然后用PBS洗涤细胞，并使用在8 mM磷酸钾缓冲液中的1% w/v Triton X-100裂解。低压冻干一部分细胞裂解物，并用甲醇萃取。通过HPLC分析，确定甲醇提取物中的6-香豆素浓度。相对于使用BCA蛋白测定试剂盒（Pierce, Rockford, IL）测得的总细胞蛋白，将细胞裂解物中的纳米颗粒浓度标准化。结果显示在图21中。

实施例22

小鼠非常好地耐受dCD133KDEL的全身性治疗，给小鼠腹膜内注射20µg、50µg或100µg dCD133KDEL，休息1天，然后进行第2次腹膜内注射。存活显示在表14中。所有动物以最小的重量减轻存活，这指示，药物被较好地耐受，且在体内具有最低毒性。

表14.

剂量水平	幸存者 / 总小鼠	% 存活
			20µg	3/3	100
50µg	3/3	100
			100µg	1/1	100

实施例23

dCD133KDEL对具有人头颈胁腹肿瘤的裸鼠的体内肿瘤进展的影响。胁腹肿瘤进展是被接受的用于研究头颈癌的体内模型，所以给小鼠（n=5/组）施用300万UMSCC-11B细胞的胁腹注射。在肿瘤接种后第6天，开始用dCD133KDEL进行小鼠的瘤内治疗。单个疗程由每隔一天（星期一、星期三、星期五）注射20µg药物组成，给小鼠注射8次。在A中，随时间用测径器测量肿瘤体积。箭头指示开始和结束治疗（Tx）的地方。在B中，每周获取动物的图像。将生物发光强度测量为光子/秒/sr/cm²的函数。用PBS治疗对照。实时获取小鼠的图像，并使用Xenogen Ivis成像系统（Xenogen Corporation, Hopkington MA）捕获图像，用IGOR Pro 4.09a软件（WaveMetrics, Inc., Portland, OR）进行分析。在成像之前，用异氟烷气体麻醉小鼠。在成像以前10分钟，所有小鼠接受100 μl 30 mg/ml D-萤光素水溶液（Gold Biotechnology, St. Louis, MO）作为萤光素酶的底物。所有图像代表5分钟暴露时间，且以光子/秒/sr/cm²为单位表达所有目标区域（ROI）。显示了来自两组的代表性动物。用dCD133KDEL治疗的M4-M6完全应答，且在50天以后没有肿瘤，而对照没有应答。结果显示在图22中（ND - 没有数据）。

实施例24

dCD133KDEL对具有人头颈胁腹肿瘤的裸鼠中的体内肿瘤进展的影响。本实施例与实施例23几乎相同地进行，但是通过瘤内注射更多的细胞（600万）来在裸鼠中诱导肿瘤，并在肿瘤接种后第10天开始，用dCD133KDEL治疗小鼠。给裸鼠（n=5/组）施用UMSCC-11B细胞的胁腹注射。在肿瘤接种后第10天，开始用dCD133KDEL进行小鼠的瘤内治疗。单个疗程由每隔一天（星期一、星期三、星期五）注射20µg药物组成，给小鼠注射8次。用阴性对照抗-B细胞CD19KDEL治疗对照，或根本不治疗。将生物发光强度测量为光子/秒/sr/cm²的函数。用PBS治疗对照。实时获取小鼠的图像，并使用Xenogen Ivis成像系统捕获图像。且以光子/秒/sr/cm²为单位表达所有目标区域（ROI）。60%的动物（3/5）对dCD133KDEL治疗完全应答，没有可检测的肿瘤生长，而对照都没有应答。结果显示在图23中。（ND - 没有数据）

实施例25

细胞培养

最近已经从诊断出GBM的人患者建立了患者9（P9-F）细胞系，并使其在2µg/ml嘌呤霉素选择下表达萤光素酶报道基因。维持细胞，作为悬浮于无血清的DMEM/F12培养基中的神经球，所述培养基补充了1% 非必需氨基酸（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、1% 青霉素-链霉素（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）、B27、N2、杀稻瘟素（Invivogen, Carlsbad, CA）和20 ng/ml EGF和FGF。在含有5% CO₂的增湿37℃气氛中温育细胞。在颅内注射之前，将P9-F神经球离心，在非酶细胞解离缓冲液（Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO）中离解，以形成单细胞悬浮液。通过在Countess自动化细胞计数器（Invitrogen, Carlsbad, CA）上的锥虫蓝排除，确定细胞数目和活力。

P9-F颅内（IC）注射

通过腹膜内注射54 mg/ml氯胺酮和9.2 mg/ml赛拉嗪的混合液，麻醉无胸腺的nu/nu小鼠，并放入Kopf头部立体定位架中。用聚维酮碘擦拭头皮，用解剖刀切出中线切口。从位于前囟点处的矢向中线（sagittal midline）向侧2.5 mm且向前0.5 mm处钻孔。使用Hamilton注射器（26号）递送P9-F细胞，达到离头盖骨表面3.3 mm的深度至大约尾状壳核中央。通过生物发光成像，评价肿瘤生长。

scFvCD133-KDEL腹膜内（IP）注射

在IC注射P9-F细胞以后1周，给小鼠（n=6）IP注射10µg scFvCD133-KDEL。在注射scFvCD133-KDEL以前20分钟，给一组（n=7）IP施用2 mg/kg 25% 甘露醇，以促进渗透性的血脑屏障（BBB）破坏。给药方案包括：连续治疗5天，休息2天，随后用20µg scFvCD133-KDEL连续治疗5天。

给小鼠腹膜内地注射D-萤光素，并用异氟烷麻醉。15分钟以后，将小鼠放入Xenogen IVIS成像系统中，并成像5分钟。结果显示在图24中。红色圆圈代表量化光子通量的目标区域（ROI）。

本文引用的所有专利、专利申请和出版物和电子地可获得的材料（包括、例如，核苷酸序列提交（例如，在GenBank和RefSeq中），和氨基酸序列提交（例如，在SwissProt、PIR、PRF、PDB中），和来自GenBank和RefSeq中的注解编码区的翻译）的完整公开内容，都通过引用整体并入。在本申请的公开内容和通过引用并入本文中的任何文件的公开内容存在任何不一致的情况下，以本申请的公开内容为准。前述的详细描述和实施例仅仅为了理解清楚而给出。从它们不可理解出无益的限制。本发明不限于显示的和描述的确切细节，本领域技术人员显而易见的变体被包括在权利要求限定的本发明内。

除非另有说明，在说明书和权利要求书中使用的表示组分、分子量等的数量的所有数字，应当理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非另外相反指出，在说明书和权利要求书阐述的数字参数是近似值，其可以随本发明力图获得的目标性质而变化。在最低程度上，且无意限制权利要求范围的等同方案的学说，每个数字参数应当至少如下解释：参考报告的有效数字的数目，并应用常见的舍入技术。

尽管描述本发明的宽范围的数值范围和参数是近似值，尽可能精确地报告在具体实施例中阐述的数字值。但是，所有数字值固有地含有在它们各自的试验测量中发现的标准差所必然导致的范围。

所有标题是为了读者方便，不应当用于限制在标题下面的文本的含义，除非如此指明。

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<211> 865

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

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Ser Phe Ser Gly Gly Gln Pro Ser Ser Thr Asp Ala Pro Lys Ala Trp

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Cys Val Leu Gly Leu Leu Phe Ile Ile Leu Met Pro Leu Val Gly Tyr

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Ser Leu Leu Val Ile Cys Ile Ile Ile Ser Ile Gly Ile Phe Tyr Gly

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Lys Ala Phe Thr Asp Leu Asn Ser Ile Asn Ser Val Leu Gly Gly Gly

225 230 235 240

Ile Leu Asp Arg Leu Arg Pro Asn Ile Ile Pro Val Leu Asp Glu Ile

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Lys Ser Met Ala Thr Ala Ile Lys Glu Thr Lys Glu Ala Leu Glu Asn

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Leu Ser Leu Ser Gln Leu Asn Ser Asn Pro Glu Leu Arg Gln Leu Pro

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Leu Asp Gly Leu Val Gln Gln Gly Tyr Gln Ser Leu Asn Asp Ile Pro

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Val Leu Asn Ser Ile Gly Ser Asp Ile Asp Asn Val Thr Gln Arg Leu

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Pro Ile Gln Asp Ile Leu Ser Ala Phe Ser Val Tyr Val Asn Asn Thr

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Ser Ile Ser Ser Glu Leu Glu Ser Leu Lys Val Asn Leu Asn Ile Phe

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<220>

<223> 合成的寡核苷酸引物

<400> 28

ggtggttcct ctagatcttc cctcgaggty carctgcagc agtc 44

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<212> DNA

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<223> 合成的寡核苷酸引物

<400> 29

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ggtggttcct ctagatcttc cctcgaggtt actctraaag wgtstg 46

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Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg

115 120 125

Ser Ser Leu Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys

130 135 140

Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

145 150 155 160

Thr Asp Tyr Ser Met His Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

165 170 175

Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala

180 185 190

Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser

195 200 205

Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr

210 215 220

Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val

245 250 255

Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln

260

<210> 56

<211> 846

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 单克隆抗体克隆的单链可变片段(scFv)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(13)

<223> SfiI限制酶切位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (337)..(390)

<223> 接头

<220>

<221> misc_feature

<222> (775)..(787)

<223> SfiI限制酶切位点

<220>

<221> misc_feature

<222> (790)..(807)

<223> 6HIS标签

<220>

<221> misc_feature

<222> (814)..(843)

<223> HA标签

<220>

<221> 终止子

<222> (844)..(846)

<400> 56

ggcccaggcg gccgagctcg acattgttct ctcccagtct ccagcaatca tgtctgcatc 60

tccaggggag aaggtcacca tatcctgcag tgccagctca agtgtaagtt atatgtactg 120

gtaccagcag aaccaggatc ctcccccaaa ccctggattt atcgcacatc caacctggct 180

tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc 240

agcagcatgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtatca tagttaccca 300

cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaatcct ctggtggcgg tggctcgggc 360

ggtggtgggg gtggttcctc tagatcttcc ctcgaggtga agctggtgga gtctggacct 420

gagctgaaga agcctggaga gacagtcaag atctcctgca aggcttctgg ttataccttc 480

acagactatt caatgcactg ggtgaatcag gctccaggaa agggtttaaa gtggatgggc 540

tggataaaca ctgagactgg tgagccatca tatgcagatg acttcaaggg acggtttgcc 600

ttctctttgg aaacctctgc cagcactgcc tatttgcaga tcaacaacct caaaaatgag 660

gacacggcta catatttctg tgctaccgat tacggggact actttgacta ctggggccaa 720

ggcaccactc tcacagtctc ctcagccaaa acgacacccc catctgtcac tagtggccag 780

gccggccagc accatcacca tcaccatggc gcatacccgt acgacgttcc ggactacgct 840

tcttag 846

<210> 57

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv多肽编码序列

<400> 57

atggacattg ttctctccca gtctccagca atcatgtctg catctccagg ggagaaggtc 60

accatatcct gcagtgccag ctcaagtgta agttatatgt actggtacca gcagaagcca 120

ggatcctccc ccaaaccctg gatttatcgc acatccaacc tggcttctgg agtccctgct 180

cgcttcagtg gcagtgggtc tgggacctct tactctctca caatcagcag catggaggct 240

gaagatgctg ccacttatta ctgccagcag tatcatagtt acccacccac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagctgaa atcctctggt ggcggtggct cgggcggtgg tgggggtggt 360

tcctctagat cttccctcga ggtgaagctg gtggagtctg gacctgagct gaagaagcct 420

ggagagacag tcaagatctc ctgcaaggct tctggttata ccttcacaga ctattcaatg 480

cactgggtga atcaggctcc aggaaagggt ttaaagtgga tgggctggat aaacactgag 540

actggtgagc catcatatgc agatgacttc aagggacggt ttgccttctc tttggaaacc 600

tctgccagca ctgcctattt gcagatcaac aacctcaaaa atgaggacac ggctacatat 660

ttctgtgcta ccgattacgg ggactacttt gactactggg gccaaggcac cactctcaca 720

gtctcctca 729

<210> 58

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv多肽

<400> 58

Met Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro

1 5 10 15

Gly Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr

20 25 30

Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile

35 40 45

Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ser Ser Gly Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Leu Glu Val

115 120 125

Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val

130 135 140

Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Met

145 150 155 160

His Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp

165 170 175

Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly

180 185 190

Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln

195 200 205

Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Thr

210 215 220

Asp Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

225 230 235 240

Val Ser Ser

<210> 59

<211> 159

<212> DNA

<213> 智人

<400> 59

aacagcgaca gcgaatgtcc gctgagccac gacggttact gtctgcacga cggtgtttgt 60

atgtacatcg aagctctaga caaatacgct tgtaactgtg ttgttggtta catcggtgaa 120

cgctgtcagt accgcgacct gaaatggtgg gaactgcgc 159

<210> 60

<211> 53

<212> PRT

<213> 智人

<400> 60

Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His

1 5 10 15

Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn

20 25 30

Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys

35 40 45

Trp Trp Glu Leu Arg

50

<210> 61

<211> 1170

<212> DNA

<213> 智人

<400> 61

atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60

taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120

tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagggt tttatagtac cgacaataaa 180

tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240

gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300

gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360

acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420

ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta 480

agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540

gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg 600

tcatgcataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa gatagagtct 660

ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa aacagtatct 720

gaggaaaaag ctaaacaata cctagaagaa tttcatcaaa cggcattaga gcatcctgaa 780

ttgtcagaac ttaaaaccgt tactgggacc aatcctgtat tcgctggggc taactatgcg 840

gcgtgggcag taaacgttgc gcaagttatc gatagcgaaa cagctgataa tttggaaaag 900

acaactgctg ctctttcgat acttcctggt atcggtagcg taatgggcat tgcagacggt 960

gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc gtctttaatg 1020

gttgctcaag ctattccatt ggtaggagag ctagttgata ttggtttcgc tgcatataat 1080

tttgtagaga gtattatcaa tttatttcaa gtagttcata attcgtataa tcgtcccgcg 1140

tattctccgg ggcataaaac gcaaccattt 1170

<210> 62

<211> 390

<212> PRT

<213> 智人

<400> 62

Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu

1 5 10 15

Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile

20 25 30

Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp

35 40 45

Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala

50 55 60

Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly

65 70 75 80

Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys

85 90 95

Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr

100 105 110

Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe

115 120 125

Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly

130 135 140

Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu

145 150 155 160

Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln

165 170 175

Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val

180 185 190

Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp

195 200 205

Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His

210 215 220

Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser

225 230 235 240

Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu

245 250 255

Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro

260 265 270

Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln

275 280 285

Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala

290 295 300

Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly

305 310 315 320

Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu

325 330 335

Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val

340 345 350

Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu

355 360 365

Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly

370 375 380

His Lys Thr Gln Pro Phe

385 390

<210> 63

<211> 336

<212> DNA

<213> 智人

<400> 63

ggccctgtgc ctccctctac agccctcagg gagctcattg aggagctggt caacatcacc 60

cagaaccaga aggctccgct ctgcaatggc agcatggtat ggagcatcaa cctgacagct 120

ggcatgtact gtgcagccct ggaatccctg atcaacgtgt caggctgcag tgccatcgag 180

aagacccaga ggatgctgag cggattctgc ccgcacaagg tctcagctgg gcagttttcc 240

agcttgcatg tccgagacac caaaatcgag gtggcccagt ttgtaaagga cctgctctta 300

catttaaaga aactttttcg cgagggacgg ttcaac 336

<210> 64

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人

<400> 64

Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu

1 5 10 15

Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met

20 25 30

Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu

35 40 45

Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg

50 55 60

Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser

65 70 75 80

Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys

85 90 95

Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn

100 105 110

<210> 65

<211> 1086

<212> DNA

<213> 智人

<400> 65

cccgagggcg gcagcctggc cgcgctgacc gcgcaccagg cttgccacct gccgctggag 60

actttcaccc gtcatcgcca gccgcgcggc tgggaacaac tggagcagtg cggctatccg 120

gtgcagcggc tggtcgccct ctacctggcg gcgcggctgt cgtggaacca ggtcgaccag 180

gtgatccgca acgccctggc cagccccggc agcggcggcg acctgggcga agcgatccgc 240

gagcagccgg agcaggcccg tctggccctg accctggccg ccgccgagag cgagcgcttc 300

gtccggcagg gcaccggcaa cgacgaggcc ggcgcggcca acgccgacgt ggtgagcctg 360

acctgcccgg tcgccgccgg tgaatgcgcg ggcccggcgg acagcggcga cgccctgctg 420

gagcgcaact atcccactgg cgcggagttc ctcggcgacg gcggcgacgt cagcttcagc 480

acccgcggca cgcagaactg gacggtggag cggctgctcc aggcgcaccg ccaactggag 540

gagcgcggct atgtgttcgt cggctaccac ggcaccttcc tcgaagcggc gcaaagcatc 600

gtcttcggcg gggtgcgcgc gcgcagccag gacctcgacg cgatctggcg cggtttctat 660

atcgccggcg atccggcgct ggcctacggc tacgcccagg accaggaacc cgacgcacgc 720

ggccggatcc gcaacggtgc cctgctgcgg gtctatgtgc cgcgctcgag cctgccgggc 780

ttctaccgca ccagcctgac cctggccgcg ccggaggcgg cgggcgaggt cgaacggctg 840

atcggccatc cgctgccgct gcgcctggac gccatcaccg gccccgagga ggaaggcggg 900

cgcctggaga ccattctcgg ctggccgctg gccgagcgca ccgtggtgat tccctcggcg 960

atccccaccg acccgcgcaa cgtcggcggc gacctcgacc cgtccagcat ccccgacaag 1020

gaacaggcga tcagcgccct gccggactac gccagccagc ccggcaaacc gccgaaggac 1080

gagcta 1086

<210> 66

<211> 362

<212> PRT

<213> 智人

<400> 66

Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His

1 5 10 15

Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu

20 25 30

Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr

35 40 45

Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn

50 55 60

Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg

65 70 75 80

Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu

85 90 95

Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala

100 105 110

Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu

115 120 125

Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr

130 135 140

Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser

145 150 155 160

Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His

165 170 175

Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr

180 185 190

Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg

195 200 205

Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp

210 215 220

Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg

225 230 235 240

Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser

245 250 255

Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu

260 265 270

Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg

275 280 285

Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr

290 295 300

Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala

305 310 315 320

Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser

325 330 335

Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser

340 345 350

Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu

355 360

<210> 67

<211> 1107

<212> DNA

<213> 智人

<400> 67

cccgagggcg gcagcctggc cgcgctgacc gcgcaccagg cttgccacct gccgctggag 60

actttcaccc gtcatcgcca gccgcgcggc tgggaacaac tggagcagtg cggctatccg 120

gtgcagcggc tggtcgccct ctacctggcg gcgcggctgt cgtggaacca ggtcgaccag 180

gtgatcgcca acgccctggc cagccccggc agcggcggcg acctgggcga agcgatccgc 240

gagtcgccgg agcaggcccg tctggccctg accctggccg ccgccgagag cgagcgcttc 300

gtccggcagg gcaccggcaa cgacgaggcc ggcgcggcca acgccgacgt ggtgagcctg 360

acctgcccgg tcgccgccgg tgaatgcgcg ggcccggcgg acagcggcga cgccctgctg 420

gagcgcaact atcccactgg cgcggagttc ctcggcgacg gcggcgacgt cagcttcagc 480

acccgcggca cgcagaactg gacggtggag cggctgctcc aggcgcaccg ccaactggag 540

gagggaggct atgtgttcgt cggctaccac ggcaccttcc tcgaagcggc gcaaagcatc 600

gtcttcggcg gggtgcgcgc gcgcagccag gacctcgacg cgatctgggc cggtttctat 660

atcgccggcg atccggcgct ggcctacggc tacgcccagg accaggaacc cgacgcagcc 720

ggccggatcc gcaacggtgc cctgctgcgg gtctatgtgc cgcgctcgag cctgccgggc 780

ttctacgcca ccagcctgac cctggccgcg ccggaggcgg cgggcgaggt cgaacggctg 840

atcggccatc cgctgccgct gcgcctggac gccatcaccg gccccgagga gtcaggcggg 900

cgcctggaga ccattctcgg ctggccgctg gccgagcgca ccgtggtgat tccctcggcg 960

atccccaccg acccgcgcaa cgtcggcggc gacctcgacc cgtccagcat ccccgactcg 1020

gaacaggcga tcagcgccct gccggactac gccagccagc ccggcaaacc gccgaaggac 1080

gagctagaag cttccggagg tcccgag 1107

<210> 68

<211> 369

<212> PRT

<213> 智人

<400> 68

Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His

1 5 10 15

Leu Pro Leu Glu Thr Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu

20 25 30

Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr

35 40 45

Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Ala Asn

50 55 60

Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg

65 70 75 80

Glu Ser Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu

85 90 95

Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala

100 105 110

Ala Asn Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Ala Gly Glu

115 120 125

Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr

130 135 140

Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser

145 150 155 160

Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His

165 170 175

Arg Gln Leu Glu Glu Gly Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Gly Thr

180 185 190

Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg

195 200 205

Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Ala Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp

210 215 220

Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Ala

225 230 235 240

Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser

245 250 255

Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu

260 265 270

Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg

275 280 285

Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Glu Thr

290 295 300

Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Ile Pro Ser Ala

305 310 315 320

Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser

325 330 335

Ile Pro Asp Ser Glu Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser

340 345 350

Gln Pro Gly Lys Pro Pro Lys Asp Glu Leu Glu Ala Ser Gly Gly Pro

355 360 365

Glu

<210> 69

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ARL接头

<400> 69

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 70

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 内质网保留序列

<400> 70

Lys Asp Glu Leu

1

<210> 71

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> G4S接头

<400> 71

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 72

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 7氨基酸接头

<400> 72

Glu Ala Ser Gly Gly Pro Glu

1 5

<210> 73

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PE38的C-末端

<400> 73

Arg Glu Asp Leu Lys

1 5

<210> 74

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头肽

<400> 74

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg

1 5 10 15

Ser Ser

Claims

1.在本文中鉴别为杂交瘤克隆7的杂交瘤。

2.由杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体。

3.由杂交瘤克隆7生产的单克隆抗体的单链可变片段（scFv）。

4.根据权利要求3所述的scFv，所述scFv包含SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58的氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的scFv，其中所述scFv包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。

6.一种分离的多核苷酸，其包含编码下述氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55或SEQ ID NO:58。

7.根据权利要求6所述的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸包含编码SEQ ID NO:58的氨基酸序列的核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸包含SEQ ID NO:57的核酸序列。

9.一种组合物，其包含权利要求2的单克隆抗体。

10.一种组合物，其包含权利要求3-5中的任一项的scFv。

11.一种融合多肽，其包含：

靶向部分，其包含：

权利要求2的单克隆抗体；或

权利要求3-5中的任一项的scFv；和

毒素部分，其包含细胞裂解毒素的治疗活性部分。

12.根据权利要求11所述的多肽，其中所述毒素部分是去免疫的。

13.一种组合物，其包含：

根据权利要求11所述的第一种融合多肽；和

第二种融合多肽，其包含：

根据权利要求11所述的第二种融合多肽；或

14.根据权利要求13所述的组合物，其中癌症干细胞差别地表达的至少一种标志物包括CD133。

15.根据权利要求13或权利要求14所述的组合物，其中癌症干细胞差别地表达的至少一种标志物包括EGFR。

16.一种方法，其包括：

给需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的：

权利要求2的单克隆抗体；

权利要求3-5中的任一项的scFv；

根据权利要求11或权利要求12所述的融合多肽；或

权利要求9、10或13-15中的任一项的组合物。

17.根据权利要求9所述的组合物，所述组合物另外包括与单克隆抗体偶联的纳米颗粒。

18.根据权利要求10所述的组合物，所述组合物另外包括与scFv偶联的纳米颗粒。

19.一种组合物，其包含与下述物质偶联的可检测的标志物：

权利要求2的单克隆抗体，或

权利要求3-5中的任一项的scFv。

20.一种方法，其包括：

使权利要求19所述的组合物与至少一个表达CD133的细胞接触；和

21.根据权利要求21所述的方法，其中所述接触包括：给受试者施用所述组合物，所述受试者包含表达CD133的癌症干细胞。

22.根据权利要求21所述的方法，其中检测包含与至少一个表达CD133的细胞特异性地结合的至少一部分组合物的复合物指示所述受试者具有肿瘤病症或处于该风险中。