CN104561069A - 含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环dna重组母质粒、含该表达盒的微环dna及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒及其制备方法，该微环DNA重组母质粒能在宿主菌内完成位点特异性重组，消除原核质粒元件，形成含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA；本发明还提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA及其制备方法和应用，该微环DNA可在宿主细胞内稳定、持久地表达重组嵌合抗原受体基因，是一种高效、安全的基因治疗载体；其次，本发明还提供了一种含有该微环DNA的宿主细胞及其制备方法和应用；此外，本发明还提供了一种重组嵌合抗原受体及其制备方法和应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒及其构建方法和应用，和一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA及其构建方法和应用，一种具有含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的宿主细胞及其应用，以及一种重组嵌合抗原受体及其表达方法和应用。
背景技术
临床上，重组嵌合抗原受体已被用来治疗各种疾病，包括癌症和自身免疫性疾病等。但是目前重组嵌合抗原受体一般是在体外生产后再注射到体内进行治疗，这种方式有多种缺点，比如：（1）生产、包装、运输、保存等环节花费大、成本高；（2）蛋白抗体药物纯度不高，污染物存在副作用，有安全隐患；（3）抗体的半衰期短，需反复注射，有时还需要用微泵给药法维持体内抗体的有效浓度，加大了抗体临床应用的难度，且治疗费用高昂。
基因治疗采用基因转染的方式将治疗性基因转染到人体靶细胞，是避免直接注射蛋白抗体药物存在的问题的有效途径之一。在基因治疗中，采用有效的载体高效、安全地将目的基因转移至宿主细胞内表达非常重要，基因治疗载体有重组腺病毒载体、逆转录病毒载体和质粒载体。其中，病毒载体在体内的转染率高，但制备病毒载体的费用高昂，且病毒载体存在插入突变的风险和免疫原性，会带来诱癌风险并可能引发患者致命的免疫反应。传统的质粒载体比病毒载体安全，但比病毒载体的转染率低，且外源基因只能瞬时表达，如要稳定 持久地表达，载体必须整合到宿主细胞染色体上，而载体的随机整合会引起插入突变或导致外源基因的沉默，此外，传统质粒载体中含有细菌复制序列、抗性基因、未甲基化的CpG基序和一些可能隐藏的表达信号，这些序列在质粒复制时是必需的，但在基因治疗中可能引起严重的生物安全性问题。
发明内容
鉴于此，本发明实施例第一方面提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，该微环DNA重组母质粒能在宿主菌内完成微环DNA的重组过程，消除原核质粒元件。
本发明实施例第二方面提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒的构建方法。
本发明实施例第三方面提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，该微环DNA可游离于宿主细胞基因组DNA之外稳定持久的表达重组嵌合抗原受体基因。
本发明实施例第四方面提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的构建方法。
本发明实施例第五方面提供了一种具有含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的宿主细胞。
本发明实施例第六方面提供了一种重组嵌合抗原受体。
本发明实施例第七方面提供了一种重组嵌合抗原受体的表达方法。
本发明实施例第八方面提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒、含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA、具有含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的宿主细胞和重组嵌合抗原受体的应用。
第一方面，本发明提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，所述微环DNA重组母质粒是在微环DNA空质粒的多克隆位点（MCS）中插入重组嵌合抗原受体基因表达盒的基因序列组合而成，其中，所述微环DNA空质粒为p2ФC31质粒或pMC.BESPX质粒，所述重组嵌合抗原受 体基因表达盒包括依次连接的启动子、重组嵌合抗原受体基因、终止密码子和polyA加尾信号。
优选地，所述重组嵌合抗原受体基因具有编码重组嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述重组嵌合抗原受体包括胞外抗原识别亚单位、穿膜连接亚单位和胞内信号转导亚单位，其中，所述胞外抗原识别亚单位具有肿瘤细胞抗原表位的结合位点和铰链区，所述穿膜连接亚单位为胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区，所述胞内信号转导亚单位具有活化免疫效应细胞的胞内信号转导区；
所述重组嵌合抗原受体的氨基酸序列连接形式依次为：
肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区。
其中，所述重组嵌合抗原受体为膜受体分子，其肿瘤细胞抗原表位的结合位点通过铰链区、跨膜区与胞内信号转导区依次相连；所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点具有结合肿瘤细胞抗原表位的能力，所述铰链区能让该膜受体分子的胞外区，即肿瘤细胞抗原表位的结合位点充分伸展，保持其肽段的功能完整性，从而充分行使识别、结合肿瘤抗原的功能；所述跨膜区为连接膜受体分子的胞外抗原识别亚单位和胞内信号转导亚单位的肽段；所述胞内信号转导亚单位的肽段具有信号转导激活基序。
进一步优选地，所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点为单克隆抗体的单链可变区scFv，所述铰链区为CD8α链的铰链区，所述I型跨膜蛋白的跨膜区为CD4、CD28或CD8的α链，所述胞内信号转导蛋白的跨膜区为IgG的重链，所述活化免疫效应细胞的胞内信号转导区依次包括第二转导信号和第一转导信号。
更进一步优选地，所述单克隆抗体的单链可变区scFv为抗CD19分子单链抗体，所述第一转导信号为免疫球蛋白FcεRI受体的γ链和CD3的ζ链中的至少一种，所述第二转导信号为CD27、CD28、4-IBB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1和1COS中的两种。
CD19是B淋巴细胞表面的一种分化抗原，在B淋巴系统恶性肿瘤如急性淋 巴细胞白血病、非何杰金淋巴瘤中广泛表达。而在造血干细胞、浆细胞、T细胞及其他组织中则没有表达，因此CD19是一种理想的肿瘤治疗靶点。本发明采用的单克隆抗体的单链可变区scFv包括抗CD19单克隆抗体轻链可变区及重链可变区，该scFv可以直接识别抗原，不需要以MHC/抗原肽复合物的形式识别抗原，因此不受MHCI类分子的限制。
本发明采用的胞内信号转导亚单位包括CD3ζ链的胞内免疫受体激活基序（ITAM）和共刺激分子CD28、CD137（4-1BB）胞内信号转导部分，其中，CD28在促进T细胞产生IL-2方面优于其他分子，CD137是记忆性T细胞体外扩增的一个重要的共刺激分子。
含本发明提供的重组嵌合抗原受体的T细胞中，含CD3ζ-CD28-CD137胞内转导信号的T细胞，在活化的过程中，CD3ζ链的胞内免疫受体激活基序首先进行磷酸化，然后激活下游的信号转导分子如CD28、CD137，从而使T细胞充分活化。
特别优选地，所述抗CD19分子单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二转导信号依次包括CD28和4-IBB，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述4-IBB的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第一转导信号为CD3的ζ链，所述CD3的ζ链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。其中，所述抗CD19分子单链抗体的包括抗CD19分子的轻链和重链，所述轻链和重链之间由连接肽Linker连接，所述Linker的氨基酸序列为GSTSGSGKPGSGEGSTKG。
更进一步优选地，所述CD8α链的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述CD8的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体（肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区）的氨基酸序列为
SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4。
优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体（肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区）基因的核苷酸序列为
SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:14。
其中，所述核苷酸序列皆为基因（DNA片段）两条单链之一的核苷酸序列，横杠“-”代表各核苷酸序列顺序连接。
本发明各核苷酸、氨基酸序列或各多肽之间的横杆“–”代表各核苷酸、氨基酸序列或各多肽之间顺序连接，以下同。
进一步优选地，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞中的一种。
进一步优选地，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和甲状腺癌细胞中的一种。
以上所述免疫效应细胞和所述肿瘤细胞为优选的种类，实际应用中不限于本发明所例举的具体的上述免疫效应细胞和肿瘤细胞。
进一步优选地，所述胞外抗原识别亚单位靶向结合所述肿瘤细胞的至少一个抗原表位。
进一步优选地，所述启动子和所述重组嵌合抗原受体基因之间连接有编码CD8信号肽的核苷酸序列，所述编码CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
进一步优选地，所述编码CD8信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
优选地，所述p2ФC31质粒构建方法参照Chen ZY et al.,Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo,Molecular Therapy,2003,Volume8,Number3,495-500、Chen ZY et al.,Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo,Human Gene Therapy,2005,Volume16,Number1,126-131和美国专利US7897380B2。
优选地，所述pMC.BESPX质粒的全基因序列如Chen ZY et al.,A robust system for production of minicircle DNA vectros,Nature Biotechnology,2010,Volume28,Number12,1289-1291所述。
优选地，所述启动子为巨细胞病毒CMV启动子、劳斯肉瘤病毒RSV启动子、泛素UBC启动子和延长因子EF1α启动子。
进一步优选地，所述启动子为延伸因子启动子（EF1α启动子）。
该EF1α启动子能使得目的蛋白在NK、T细胞等免疫效应细胞中更高效的表达。
优选地，所述EF1α启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明采用的启动子可以为巨细胞病毒CMV、RSV、UBC和EF1α等真核表达启动子之一，EF1α启动子只是本发明构建的微环DNA母质粒的更优选启动子，本发明可以根据表达宿主细胞的不同等条件选择不同的启动子构建微环DNA母质粒。
优选地，所述终止密码子的核苷酸序列为TAG。
优选地，所述polyA加尾信号为牛生长激素多聚核苷酸bpA或SV40加尾信号。
进一步优选地，所述polyA加尾信号为牛生长激素多聚核苷酸bpA。
优选地，所述牛生长激素多聚核苷酸bpA加尾信号的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体基因表达盒的完整核苷酸序列为：
SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:14-TAG-SEQ ID NO:15。
本发明采用的polyA加尾信号可以为SV40等polyA加尾信号之一，bpA加尾信号只是本发明构建的微环DNA母质粒的更优选的加尾信号，本发明可以根据表达宿主细胞的不同等条件选择不同的加尾信号构建微环DNA母质粒。
优选地，所述重组嵌合抗原受体基因由全基因合成或PCR克隆的方式获得。
本发明提供的重组嵌合抗原受体中，穿膜连接亚单位能保证受体蛋白分子表达后锚定在细胞膜上，且穿膜连接亚单位两端的胞外抗原识别亚单位和胞内信号转导亚单位分别位于细胞膜外、内两侧，从而构成横穿细胞膜的穿膜蛋白；其中，穿膜蛋白的N端为胞外抗原识别亚单位，C端为胞内信号转导亚单位；从功能上来说，本发明提供的重组嵌合抗原受体中，其胞外抗原识别亚单位具有结合人肿瘤细胞或病毒感染细胞等细胞表面抗原的功能域，其胞内信号转导亚单位能促进效应细胞如T淋巴细胞、NK细胞等的激活，且该激活过程不受MHC I类分子的限制。此外，T淋巴细胞的传统激活途径一般还需要共刺激分子的参与，因为本发明提供的重组嵌合抗原受体中带有的胞内信号转导亚单位具有第一转导信号和第二转导信号，该两种信号共刺激分子具有胞内激活基序，能协同使得T细胞分泌的Th1型细胞因子产生更强、更持久的抗肿瘤效应。
优选地，本发明提供的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒具有编码重组嵌合抗原受体的基因，其中，该重组嵌合抗原受体具有单克隆抗体的单链可变区scFv为抗CD19scFv抗体，其在激活细胞、产生细胞因子、靶细胞杀伤等方面的作用与双链TCR相似；连接肽为CD8的铰链区，该区富含脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸，不形成α螺旋，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合；穿膜连接亚单位为CD8的α链，其负责将scFv连接在细胞膜上；胞内信号转导亚单位包括第一转导信号和第二转导信号，其中，第一转导信号为CD3的ζ链，第二转导信号为CD28和4-IBB依次连接的肽段，该第一转导信号和第二转导信号可以协同激活T细胞，产生强大的靶细胞杀伤效应。
第二方面，本发明提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提供或制备DNA片段，所述DNA片段具有依次连接的重组嵌合抗原受体基因和终止密码子；
（2）将步骤（1）所得的DNA片段插入表达载体的多克隆位点，得到含重 组嵌合抗原受体基因表达盒的重组表达载体，其中，所述表达载体的多克隆位点两端分别具有启动子和polyA加尾信号；
（3）将步骤（2）所得的重组表达载体进行双酶切，得到含重组嵌合抗原受体基因表达盒的DNA片段，然后将所述含重组嵌合抗原受体基因表达盒的DNA片段插入p2ФC31质粒或pMC.BESPX质粒即得含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其中，所述重组嵌合抗原受体基因表达盒包括依次连接的启动子、重组嵌合抗原受体基因、终止密码子和polyA加尾信号。
优选地，所述重组嵌合抗原受体基因具有编码重组嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述重组嵌合抗原受体包括胞外抗原识别亚单位、穿膜连接亚单位和胞内信号转导亚单位，其中，所述胞外抗原识别亚单位具有肿瘤细胞抗原表位的结合位点和铰链区，所述穿膜连接亚单位为胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区，所述胞内信号转导亚单位具有活化免疫效应细胞的胞内信号转导区；
所述重组嵌合抗原受体的氨基酸序列连接形式依次为：
肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区。
进一步优选地，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞中的一种。
进一步优选地，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和甲状腺癌细胞中的一种。
进一步优选地，所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点为单克隆抗体的单链可变区scFv，所述铰链区为CD8α链的铰链区，所述I型跨膜蛋白的跨膜区为CD4、CD28或CD8的α链，所述胞内信号转导蛋白的跨膜区为IgG的重链，所述活化免疫效应细胞的胞内信号转导区依次包括第二转导信号和第一转导信号。
更进一步优选地，所述单克隆抗体的单链可变区scFv为抗CD19分子单链抗体，所述第一转导信号为免疫球蛋白FcεRI受体的γ链和CD3的ζ链中的 至少一种，所述第二转导信号为CD27、CD28、4-IBB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1和1COS中的两种。
特别优选地，所述抗CD19分子单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二转导信号依次包括CD28和4-IBB，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述4-IBB的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第一转导信号为CD3的ζ链，所述CD3的ζ链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
更进一步优选地，所述CD8α链的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述CD8的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体（肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区）的氨基酸序列为
SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4。
优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体（肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区）基因的核苷酸序列为
SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:14。
其中，所述核苷酸序列皆为基因（DNA片段）两条单链之一的核苷酸序列，横杠“-”代表各核苷酸序列顺序连接。
本发明各核苷酸、氨基酸序列或各多肽之间的横杆“–”代表各核苷酸、氨基酸序列或各多肽之间顺序连接，以下同。
进一步优选地，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞中的一种。
进一步优选地，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和甲状腺癌细胞中的一种。
以上所述免疫效应细胞和所述肿瘤细胞为优选的种类，实际应用中不限于本发明所例举的具体的上述免疫效应细胞和肿瘤细胞。
进一步优选地，所述胞外抗原识别亚单位靶向结合所述肿瘤细胞的至少一个抗原表位。
进一步优选地，所述启动子和所述重组嵌合抗原受体基因之间连接有编码CD8信号肽的核苷酸序列，所述编码CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
进一步优选地，所述编码CD8信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
优选地，所述p2ФC31质粒构建方法参照Chen ZY et al.,Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo,Molecular Therapy,2003,Volume8,Number3,495-500、Chen ZY et al.,Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo,Human Gene Therapy,2005,Volume16,Number1,126-131和美国专利US7897380B2。
优选地，所述pMC.BESPX质粒的全基因序列如Chen ZY et al.,A robust system for production of minicircle DNA vectros,Nature Biotechnology,2010,Volume28,Number12,1289-1291所述。
优选地，所述步骤（2）中，所述启动子为巨细胞病毒CMV启动子、劳斯肉瘤病毒RSV启动子、泛素UBC启动子和延长因子EF1α启动子。
进一步优选地，所述启动子为延伸因子启动子（EF1α启动子）。
该EF1α启动子能使得目的蛋白在NK、T细胞等免疫效应细胞中更高效的表达。
优选地，所述EF1α启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明采用的启动子可以为巨细胞病毒CMV、RSV、UBC和EF1α等真核表达启动子之一，EF1α启动子只是本发明构建的微环DNA母质粒的更优选启动子，本发明可以根据表达宿主细胞的不同等条件选择不同的启动子构建微环DNA母质粒。
优选地，所述终止密码子的核苷酸序列为TAG。
优选地，所述步骤（2）中，所述polyA加尾信号为牛生长激素多聚核苷酸bpA或SV40加尾信号。
进一步优选地，所述polyA加尾信号为牛生长激素多聚核苷酸bpA。
优选地，所述牛生长激素多聚核苷酸bpA加尾信号的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
本发明采用的polyA加尾信号可以为SV40等polyA加尾信号之一，bpA加尾信号只是本发明构建的微环DNA母质粒的更优选的加尾信号，本发明可以根据表达宿主细胞的不同等条件选择不同的加尾信号构建微环DNA母质粒。
优选地，所述重组嵌合抗原受体基因由全基因合成或PCR克隆的方式获得。
优选地，所述步骤（2）中，所述表达载体为带有EF1α启动子和牛生长激素多聚核苷酸bpA加尾信号的表达载体，该表达载体的EF1α启动子和bpA之间含有多克隆位点，该多克隆位点可插入感兴趣的基因片段。
优选地，所述步骤（2）中，所述表达载体为pEF1a.bpA表达载体。
优选地，所述pEF1a.bpA表达载体在EF1α启动子上游和bpA加尾信号下游分别带有SpeI和Psp OMI内切酶的酶切位点（如图1-b所示），该SpeI和PspOMI内切酶的酶切位点为本发明按分子克隆实验指南（第四版）构建。
优选地，所述步骤（1）中提供或制备DNA片段的步骤包括：
（1-1）采用全基因序列或PCR克隆的方式合成DNA片段，该DNA片段包括依次连接的HindⅢ酶切位点、重组嵌合抗原受体基因、终止密码子和EcoRⅠ酶切位点；
（1-2）将步骤（1-1）所得的DNA片段插入到pUC57载体（质粒图谱见图1-a）的HindⅢ和EcoRⅠ位点进行扩增，然后双酶切目的片段并回收所述DNA片段。
优选地，所述步骤（2）中将步骤（1）所得的DNA片段插入pEF1a.bpA载体的HindⅢ和EcoRⅠ位点，得到pEF1a.bpA.CAR重组表达载体。
优选地，所述步骤（3）中将步骤（2）所得的重组表达载体进行双酶切，得 到含重组嵌合抗原受体基因表达盒的DNA片段，然后将所述含重组嵌合抗原受体基因表达盒的DNA片段插入p2ФC31质粒或pMC.BESPX质粒的步骤包括：
（1-4）取p2ФC31质粒或pMC.BESPX质粒；
（1-5）采用SpeI和Psp OMI内切酶对p2ФC31质粒或pMC.BESPX质粒进行双酶切，并回收酶切后的线性质粒；
（1-6）采用SpeI和Psp OMI内切酶对pEF1a.bpA.CAR重组表达载体进行双酶切，并回收酶切后的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的DNA片段；
（1-7）采用DNA连接酶连接步骤（1-5）双酶切后回收的线性质粒和步骤（1-6）双酶切后回收的DNA片段，获得含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒p2ΦC31.CAR或pMC.CAR，其中，所述重组嵌合抗原受体基因表达盒包括依次连接的巨细胞病毒CMV启动子、重组嵌合抗原受体基因、终止密码子和牛生长激素多聚核苷酸bpA加尾信号。
优选地，所述步骤（1-7）中，所述DNA连接酶为T4DNA连接酶。
本发明提供的p2ФC31质粒或pMC.BESPX质粒，区别在于：pMC.BESPX无p2ФC31载体上编码ФC31重组酶和I-Sce1内切酶的核苷酸序列，其制备的微环DNA母质粒更加优质，少了重组酶内切酶的核苷酸序列的污染；但是需配套使用了ZYCY10P3S2T工程菌，因为无编码ФC31重组酶和I-Sce1内切酶核苷酸序列的pMC.BESPX需要具有编码ФC31重组酶和I-Sce1内切酶功能的ZYCY10P3S2T工程菌才能产生体内位点特异性重组（而TOP10无此功能）并最终生产出微环DNA，即MC.CAR；相应的，p2ФC31载体可配套使用TOP10即可产生体内位点特异性重组（而TOP10无此功能）并最终生产出微环DNA。
优选地，本发明提供的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒可用于制备预防或治疗癌症的药物。
进一步优选地，本发明提供的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒可用于制备预防或治疗CD19阳性癌细胞的药物。
第三方面，本发明提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，所述微环DNA为具有attR位点和重组嵌合抗原受体基因表达盒的环状DNA， 其中，所述基因表达盒包括依次连接的启动子、重组嵌合抗原受体基因、终止密码子和polyA加尾信号。
优选地，所述重组嵌合抗原受体基因具有编码重组嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述重组嵌合抗原受体包括胞外抗原识别亚单位、穿膜连接亚单位和胞内信号转导亚单位，其中，所述胞外抗原识别亚单位具有肿瘤细胞抗原表位的结合位点和铰链区，所述穿膜连接亚单位为胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区，所述胞内信号转导亚单位具有活化免疫效应细胞的胞内信号转导区；
所述重组嵌合抗原受体的氨基酸序列连接形式依次为：
肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区。
进一步优选地，所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点为单克隆抗体的单链可变区scFv，所述铰链区为CD8α链的铰链区，所述I型跨膜蛋白的跨膜区为CD4、CD28或CD8的α链，所述胞内信号转导蛋白的跨膜区为IgG的重链，所述活化免疫效应细胞的胞内信号转导区依次包括第二转导信号和第一转导信号。
更进一步优选地，所述单克隆抗体的单链可变区scFv为抗CD19分子单链抗体，所述第一转导信号为免疫球蛋白FcεRI受体的γ链和CD3的ζ链中的至少一种，所述第二转导信号为CD27、CD28、4-IBB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1和1COS中的两种。
特别优选地，所述抗CD19分子单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二转导信号依次包括CD28和4-IBB，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述4-IBB的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第一转导信号为CD3的ζ链，所述CD3的ζ链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
更进一步优选地，所述CD8α链的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述CD8的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体（肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应 细胞的胞内信号转导区）的氨基酸序列为
SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4。
优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体（肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区）基因的核苷酸序列为
SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:14。
其中，所述核苷酸序列皆为基因（DNA片段）两条单链之一的核苷酸序列，横杠“-”代表各核苷酸序列顺序连接。
进一步优选地，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞中的一种。
进一步优选地，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和甲状腺癌细胞中的一种。
以上所述免疫效应细胞和所述肿瘤细胞为优选的种类，实际应用中不限于本发明所例举的具体的上述免疫效应细胞和肿瘤细胞。
进一步优选地，所述胞外抗原识别亚单位靶向结合所述肿瘤细胞的至少一个抗原表位。
优选地，所述含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA由含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒在宿主菌内发生位点特异性重组产生。
优选地，所述attR位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示。
本发明提供的含重组嵌合抗原受体的微环DNA缺乏抗性标记基因、复制原点等细菌序列，相比传统质粒载体，其提高了在临床上的安全性，且能提高重组嵌合抗原受体基因表达的稳定性和持久性；相比病毒载体，该微环DNA无插入突变的风险和免疫原性，且制备成本低；因此，本发明提供的含重组嵌合抗 原受体的微环DNA是一种安全、高效、经济的治疗载体。
第四方面，本发明提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提供或制备含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，所述微环DNA重组母质粒是在微环DNA空质粒的多克隆位点中插入重组嵌合抗原受体基因表达盒的基因序列组合而成，其中，所述微环DNA空质粒为p2ФC31质粒或pMC.BESPX质粒，所述重组嵌合抗原受体基因表达盒包括依次连接的启动子、重组嵌合抗原受体基因、终止密码子和polyA加尾信号；
（2）将步骤（1）所得的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒转化宿主菌，在ФC31重组酶的作用下非可逆地产生含有attL位点的细菌质粒DNA环和含有attR位点的微环DNA；
（3）步骤（2）所得的含有attL位点的细菌质粒DNA被I-Sce内切酶酶切后成线性DNA片段后，继而在宿主菌内降解，然后采用常规质粒提纯试剂盒提纯所述含有attR位点的微环DNA，所述微环DNA为具有attR位点和重组嵌合抗原受体基因表达盒的环状DNA，其中，所述重组嵌合抗原受体基因表达盒包括依次连接的启动子、重组嵌合抗原受体基因、终止密码子和polyA加尾信号。
优选地，所述重组嵌合抗原受体基因具有编码重组嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述重组嵌合抗原受体包括胞外抗原识别亚单位、穿膜连接亚单位和胞内信号转导亚单位，其中，所述胞外抗原识别亚单位具有肿瘤细胞抗原表位的结合位点和铰链区，所述穿膜连接亚单位为胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区，所述胞内信号转导亚单位具有活化免疫效应细胞的胞内信号转导区；
所述重组嵌合抗原受体的氨基酸序列连接形式依次为：
肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区。
其中，所述重组嵌合抗原受体为膜受体分子，其肿瘤细胞抗原表位的结合位点通过铰链区、跨膜区与胞内信号转导区依次相连；所述肿瘤细胞抗原表位的 结合位点具有结合肿瘤细胞抗原表位的能力，所述铰链区能让该膜受体分子的胞外区，即肿瘤细胞抗原表位的结合位点充分伸展，保持其肽段的功能完整性，从而充分行使识别、结合肿瘤抗原的功能；所述跨膜区为连接膜受体分子的胞外抗原识别亚单位和胞内信号转导亚单位的肽段；所述胞内信号转导亚单位的肽段具有信号转导激活基序。
进一步优选地，所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点为单克隆抗体的单链可变区scFv，所述铰链区为CD8α链的铰链区，所述I型跨膜蛋白的跨膜区为CD4、CD28或CD8的α链，所述胞内信号转导蛋白的跨膜区为IgG的重链，所述活化免疫效应细胞的胞内信号转导区依次包括第二转导信号和第一转导信号。
更进一步优选地，所述单克隆抗体的单链可变区scFv为抗CD19分子单链抗体，所述第一转导信号为免疫球蛋白FcεRI受体的γ链和CD3的ζ链中的至少一种，所述第二转导信号为CD27、CD28、4-IBB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1和1COS中的两种。
特别优选地，所述抗CD19分子单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二转导信号依次包括CD28和4-IBB，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述4-IBB的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第一转导信号为CD3的ζ链，所述CD3的ζ链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
更进一步优选地，所述CD8α链的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述CD8的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体（肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区）的氨基酸序列为
SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4。
优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体（肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区）基因的核苷酸序列为
SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:14。
其中，所述核苷酸序列皆为基因（DNA片段）两条单链之一的核苷酸序列，横杠“-”代表各核苷酸序列顺序连接。
进一步优选地，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞中的一种。
进一步优选地，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和甲状腺癌细胞中的一种。
以上所述免疫效应细胞和所述肿瘤细胞为优选的种类，实际应用中不限于本发明所例举的具体的上述免疫效应细胞和肿瘤细胞。
进一步优选地，所述胞外抗原识别亚单位靶向结合所述肿瘤细胞的至少一个抗原表位。
进一步优选地，所述启动子和所述重组嵌合抗原受体基因之间连接有编码CD8信号肽的核苷酸序列，所述编码CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
优选地，所述p2ФC31质粒构建方法参照Chen ZY et al.,Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo,Molecular Therapy,2003,Volume8,Number3,495-500、Chen ZY et al.,Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo,Human Gene Therapy,2005,Volume16,Number1,126-131和美国专利US7897380B2。
优选地，所述pMC.BESPX质粒的全基因序列如Chen ZY et al.,A robust system for production of minicircle DNA vectros,Nature Biotechnology,2010,Volume28,Number12,1289-1291所述。
优选地，所述启动子为巨细胞病毒CMV启动子、劳斯肉瘤病毒RSV启动子、泛素UBC启动子和延长因子EF1α启动子。
进一步优选地，所述启动子为延伸因子启动子（EF1α启动子）。
该EF1α启动子能使得目的蛋白在NK、T细胞等免疫效应细胞中更高效的表达。
优选地，所述EF1α启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明采用的启动子可以为巨细胞病毒CMV、RSV、UBC和EF1α等真核表达启动子之一，EF1α启动子只是本发明构建的微环DNA母质粒的更优选启动子，本发明可以根据表达宿主细胞的不同等条件选择不同的启动子构建微环DNA母质粒。
优选地，所述终止密码子的核苷酸序列为TAG。
优选地，所述polyA加尾信号为牛生长激素多聚核苷酸bpA或SV40加尾信号。
进一步优选地，所述polyA加尾信号为牛生长激素多聚核苷酸bpA。
优选地，所述牛生长激素多聚核苷酸bpA加尾信号的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
本发明采用的polyA加尾信号可以为SV40等polyA加尾信号之一，bpA加尾信号只是本发明构建的微环DNA母质粒的更优选的加尾信号，本发明可以根据表达宿主细胞的不同等条件选择不同的加尾信号构建微环DNA母质粒。
优选地，所述重组嵌合抗原受体基因由全基因合成或PCR克隆的方式获得。
优选地，所述重组酶为ФC31重组酶。
优选地，所述宿主菌为Top10。
优选地，所述宿主菌为ZYCY10P3S2T工程菌。
优选地，所述含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒在宿主菌内发生位点特异性重组的过程为：含重组嵌合抗原受体基因表达盒的重组表达载体具有attB位点和attP位点，该attB位点和attP位点能在ΦC31重组酶的作用下进行重组，使得微环母质粒非可逆地产生含有attL位点的细菌质粒DNA环和含attR位点的微环DNA，所述含attR位点的微环DNA不含原核质粒序列，且能游离于人及哺乳动物细胞染色体DNA外稳定持久表达重组嵌合抗原 受体，所述含有attL位点的细菌质粒DNA环则被I-Sce1酶切为线性DNA，继而被宿主菌降解，有利于微环DNA的分离提纯。
优选地，本发明提供的如第三方面或第四方面所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA按下述一种或多种方法进行应用：
（1）将所述微环DNA单独进行应用；
（2）将所述微环DNA与化疗、放疗、手术、生物治疗、免疫治疗中的一种或几种联合应用；
（3）采用体内靶向投递的方式将所述微环DNA直接投递到患者体内进行治疗；
（4）先通过体外转染技术将所述微环DNA转染免疫效应细胞，然后将所述转染有微环DNA的免疫效应细胞输回患者体内实施治疗。
本发明提供的微环DNA不含原核质粒序列，且能游离于人及哺乳动物细胞染色体DNA外稳定持久表达重组嵌合抗原受体，可单独使用进行靶向治疗，比如投递到患者体内表达重组嵌合抗原受体，引导T细胞特异性杀伤肿瘤细胞。
本发明提供的微环DNA还可以在体外转染患者的免疫效应细胞，再将该转染后的免疫效应细胞回输患者体内，以细胞的形式进行治疗。
本发明提供的微环DNA还可以通过联合化疗、放疗、手术、生物治疗、免疫治疗等技术进行治疗。
第五方面，本发明提供了一种宿主，所述宿主包含如第三方面或第四方面所述的微环DNA。
优选地，所述宿主为人或哺乳动物。
优选地，所述宿主为人或哺乳动物细胞。
进一步优选地，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
第六方面，本发明提供了一种重组嵌合抗原受体，所述重组嵌合抗原受体包括胞外抗原识别亚单位、穿膜连接亚单位和胞内信号转导亚单位，其中，所述胞外抗原识别亚单位具有肿瘤细胞抗原表位的结合位点和铰链区，所述穿膜连接亚单位为胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区，所述胞内信号 转导亚单位具有活化免疫效应细胞的胞内信号转导区；
所述重组嵌合抗原受体的氨基酸序列连接形式依次为：
肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区。
优选地，所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点为单克隆抗体的单链可变区scFv，所述铰链区为CD8α链的铰链区，所述I型跨膜蛋白的跨膜区为CD4、CD28或CD8的α链，所述胞内信号转导蛋白的跨膜区为IgG的重链，所述活化免疫效应细胞的胞内信号转导区依次包括第二转导信号和第一转导信号。
进一步优选地，所述单克隆抗体的单链可变区scFv为抗CD19分子单链抗体，所述第一转导信号为免疫球蛋白FcεRI受体的γ链和CD3的ζ链中的至少一种，所述第二转导信号为CD27、CD28、4-IBB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1和1COS中的两种。
特别优选地，所述抗CD19分子单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二转导信号依次包括CD28和4-IBB，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述4-IBB的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第一转导信号为CD3的ζ链，所述CD3的ζ链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
进一步优选地，所述CD8α链的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述CD8的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体（肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区）的氨基酸序列为
SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4。
优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体（肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区）基因的核苷酸序列为
SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12- SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:14。
其中，所述核苷酸序列皆为基因（DNA片段）两条单链之一的核苷酸序列，横杠“-”代表各核苷酸序列顺序连接。
进一步优选地，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞中的一种。
进一步优选地，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和甲状腺癌细胞中的一种。
以上所述免疫效应细胞和所述肿瘤细胞为优选的种类，实际应用中不限于本发明所例举的具体的上述免疫效应细胞和肿瘤细胞。
进一步优选地，所述胞外抗原识别亚单位靶向结合所述肿瘤细胞的至少一个抗原表位。
优选地，所述重组嵌合抗原受体由含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA在宿主细胞内表达。
进一步优选地，所述重组嵌合抗原受体锚定在宿主细胞膜的表面。
第七方面，本发明提供了一种重组嵌合抗原受体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提供或制备含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，所述微环DNA为具有attR位点和重组嵌合抗原受体基因表达盒的环状DNA，其中，所述重组嵌合抗原受体基因表达盒包括依次连接的启动子、重组嵌合抗原受体基因、终止密码子和polyA加尾信号；
（2）将步骤（1）所得的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA转染宿主细胞，并在宿主细胞内表达产生重组嵌合抗原受体。
优选地，所述重组嵌合抗原受体基因具有编码重组嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述重组嵌合抗原受体包括胞外抗原识别亚单位、穿膜连接亚单位和胞内信号转导亚单位，其中，所述胞外抗原识别亚单位具有肿瘤细胞抗原表位的结合位点和铰链区，所述穿膜连接亚单位为胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜 蛋白的跨膜区，所述胞内信号转导亚单位具有活化免疫效应细胞的胞内信号转导区；
所述重组嵌合抗原受体的氨基酸序列连接形式依次为：
肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区。
进一步优选地，所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点为单克隆抗体的单链可变区scFv，所述铰链区为CD8α链的铰链区，所述I型跨膜蛋白的跨膜区为CD4、CD28或CD8的α链，所述胞内信号转导蛋白的跨膜区为IgG的重链，所述活化免疫效应细胞的胞内信号转导区依次包括第二转导信号和第一转导信号。
更进一步优选地，所述单克隆抗体的单链可变区scFv为抗CD19分子单链抗体，所述第一转导信号为免疫球蛋白FcεRI受体的γ链和CD3的ζ链中的至少一种，所述第二转导信号为CD27、CD28、4-IBB（CD137）、OX40、CD30、CD40、PD-1和1COS中的两种。
特别优选地，所述抗CD19分子单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二转导信号依次包括CD28和4-IBB，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述4-IBB的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第一转导信号为CD3的ζ链，所述CD3的ζ链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
更进一步优选地，所述CD8α链的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述CD8的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体（肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区）的氨基酸序列为
SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:3-SEQ ID NO:4。
优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体（肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区）基因的核苷酸序列为
SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:14。
其中，所述核苷酸序列皆为基因（DNA片段）两条单链之一的核苷酸序列，横杠“-”代表各核苷酸序列顺序连接。
进一步优选地，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞中的一种。
进一步优选地，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和甲状腺癌细胞中的一种。
以上所述免疫效应细胞和所述肿瘤细胞为优选的种类，实际应用中不限于本发明所例举的具体的上述免疫效应细胞和肿瘤细胞。
进一步优选地，所述胞外抗原识别亚单位靶向结合所述肿瘤细胞的至少一个抗原表位。
进一步优选地，所述启动子和所述重组嵌合抗原受体基因之间连接有编码CD8信号肽的核苷酸序列，所述编码CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
优选地，所述启动子为巨细胞病毒CMV启动子、劳斯肉瘤病毒RSV启动子、泛素UBC启动子和延长因子EF1α启动子。
进一步优选地，所述启动子为延伸因子启动子（EF1α启动子）。
该EF1α启动子能使得目的蛋白在NK、T细胞等免疫效应细胞中更高效的表达。
优选地，所述EF1α启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明采用的启动子可以为巨细胞病毒CMV、RSV、UBC和EF1α等真核表达启动子之一，EF1α启动子只是本发明构建的微环DNA母质粒的更优选启动子，本发明可以根据表达宿主细胞的不同等条件选择不同的启动子构建微环DNA母质粒。
优选地，所述终止密码子的核苷酸序列为TAG。
优选地，所述polyA加尾信号为牛生长激素多聚核苷酸bpA或SV40加尾信号。
进一步优选地，所述polyA加尾信号为牛生长激素多聚核苷酸bpA。
优选地，所述牛生长激素多聚核苷酸bpA加尾信号的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
本发明采用的polyA加尾信号可以为SV40等polyA加尾信号之一，bpA加尾信号只是本发明构建的微环DNA母质粒的更优选的加尾信号，本发明可以根据表达宿主细胞的不同等条件选择不同的加尾信号构建微环DNA母质粒。
本发明提供的重组嵌合抗原受体的优选形式中，抗CD19scFv抗体构成与人CD19抗原结合的功能域，该重组嵌合抗原受体中含有能激活T细胞的胞内信号转导亚单位，即第一转导信号CD28和4-IBB、及第二转导信号CD3的ζ链，因此，当含本发明提供的重组嵌合抗原受体在T细胞中表达后，能有效促进T细胞靶向识别CD19阳性癌细胞，进而激活T淋巴细胞释放细胞因子、穿孔素、颗粒酶及Fas/FasL等杀伤肿瘤细胞，且具有不受MHC I类分子的约束的优点。
第八方面，本发明提供了如第三方面或第四方面所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA母质粒、如第五方面所述的宿主、第六方面或第七方面所述的重组嵌合抗原受体的应用。
优选地，本发明提供的如第三方面或第四方面所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA母质粒、如第五方面所述的宿主、第六方面或第七方面所述的重组嵌合抗原受体用于制备预防或治疗癌症的药物中的应用。
进一步优选地，本发明提供的如第三方面或第四方面所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA母质粒、如第五方面所述的宿主、第六方面或第七方面所述的重组嵌合抗原受体用于制备预防或治疗CD19阳性癌细胞疾病的药物中的应用。
本发明提供的具有如下有益效果：
（1）本发明提供的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒能在宿主菌内完成重组过程，消除原核质粒元件，形成含重组嵌合抗原受体 的微环DNA；
（2）本发明提供的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA可在宿主细胞内稳定、持久地表达重组嵌合抗原受体基因，该微环DNA比病毒载体安全、经济，比普通质粒载体高效，是一种高效、安全、经济的基因治疗载体；
（3）本发明提供的重组嵌合抗原受体，能介导T淋巴细胞靶向结合肿瘤细胞，进而引导T细胞对肿瘤细胞的杀伤；
（4）本发明提供的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA、含该微环DNA的宿主以及由该微环DNA表达的重组嵌合抗原受体可单独进行应用，或与化疗、放疗、手术、生物治疗、免疫治疗中的一种或几种联合应用对癌症患者实施治疗。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的pUC57、pEF1a.bpA载体的物理图谱。
图2为本发明实施例1提供的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒p2ФC31.CAR的构建流程图。
图3为本发明实施例1构建的微环DNA重组母质粒pUC57.CAR的物理图谱。
图4为本发明实施例1构建的重组表达载体pEF1a.bpA.CAR的物理图谱。
图5为本发明实施例1构建的微环DNA重组母质粒p2ФC31.CAR的物理图谱。
图6为本发明实施例2构建的微环DNA重组母质粒p2ФC31.CAR制备MC.CAR微环DNA的流程图。
图7为本发明实施例2制备的MC.CAR微环DNA的物理图谱。
图8为本发明实施例6提供的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒pMC.CAR的构建流程图。
图9为本发明实施例6制备的微环DNA重组母质粒pMC.CAR的物理图谱。
图10为本发明实施例6构建的微环DNA重组母质粒pMC.CAR制备MC.CAR 微环DNA的流程图。
具体实施方式
以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。
本发明实施例所使用的质粒载体pUC57(质粒图谱如图1-a所示)、所使用的质粒载体pEF1a.bpA(质粒图谱如图1-b所示)、所使用的菌株DH5α、E.coli TOP10均购自invitrogen公司，ZYCY10P3S2T工程菌（大肠杆菌E.coli）购自SBI公司，空质粒p2ФC31构建方法参照Chen ZY et al.,Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo,Molecular Therapy,2003,Volume8,Number3,495-500、Chen ZY et al.,Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo,Human Gene Therapy,2005,Volume16,Number1,126-131和美国专利US7897380B2，空质粒pMC.BESPX全基因序列参照Chen ZY et al.,A robust system for production of minicircle DNA vectros,Nature Biotechnology,2010,Volume28,Number12,1289-1291，所使用的试剂均为市售商品。
实施例1
本实施例提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒p2ФC31.CAR的构建方法，包括如下步骤：
（1）本实施例提供了一种含重组嵌合抗原受体（CAR）基因的pUC57.CAR重组载体的构建方法
（1a）采用全基因序列合成的方式合成依次连接的HindⅢ酶切位点-CAR的基因序列（SEQ ID NO:16-SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:14）-终止密码子（TAG）-EcoR Ⅰ酶切位点核苷酸序列，其中，SEQ ID NO:8-SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12-SEQ ID NO:13-SEQ ID NO:14分别对应编码CAR的CD8信号肽–肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区：
所述SEQ ID NO:16编码CD8信号肽；所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点对应SEQ ID NO:9，所述SEQ ID NO:9编码抗CD19分子单链抗体；所述铰链区对应SEQ ID NO:10，所述SEQ ID NO:10编码CD8α链的铰链区；所述I型跨膜蛋白的跨膜区对应SEQ ID NO:11，所述SEQ ID NO:11编码CD8的α链；所述活化免疫效应细胞的胞内信号转导区依次对应SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14，所述SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13分别编码第二转导信号CD28和4-IBB，所述SEQ ID NO:14编码第一转导信号CD3ζ链；
本实施例所述依次连接的各核苷酸序列仅为全基因合成的基因（即DNA片段）双链中的一条，另一条链与依次连接的各核苷酸序列互补；
（1b）用HindⅢ和EcoRⅠ对pUC57载体和步骤（1a）合成的核苷酸序列进行双酶切，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，并分别回收线性pUC57载体和酶切后的核苷酸片段；
（1c）采用T4DNA连接酶将步骤（1b）所得酶切后的核苷酸片段和线性pUC57载体按3:1的摩尔比在16℃下进行连接过夜或者室温下连接2小时，然后将连接产物加入E.coli DH5α菌株感受态细胞悬液中，进行转化，并接种在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养过夜，挑取单菌落进行重组质粒载体的双酶切(HindⅢ和EcoRⅠ)验证；选取酶切结果验证的阳性克隆，进行测序验证，将插入核苷酸片段和步骤（1a）合成的所述核苷酸序列完全一致的载体命名为pUC57.CAR（4240bp），该pUC57.CAR（4240bp）的质粒图谱如图3所示。
（2）如图2-a所示，本实施例提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的pEF1a.bpA.CAR重组表达载体的构建方法
（2a）用HindⅢ和EcoRⅠ对pEF1a.bpA载体和pUC57.CAR进行双酶切，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，并分别回收线性pEF1a.bpA载体和酶切后 的核苷酸片段；
（2b）采用T4DNA连接酶将步骤（2a）所得酶切后的核苷酸片段和线性pEF1a.bpA载体按3:1的摩尔比在16℃下进行连接过夜或者室温下连接2小时，然后将连接产物加入E.coli DH5α菌株感受态细胞悬液中，进行转化，并接种在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养过夜，挑取单菌落进行重组质粒载体的双酶切(HindⅢ和EcoRⅠ)验证；选取酶切结果验证的阳性克隆，进行测序验证，将插入核苷酸片段和步骤（1a）合成的所述核苷酸序列完全一致的载体命名为pEF1a.bpA.CAR（5297bp），该pEF1a.bpA.CAR重组表达载体的质粒图谱如图4所示。
（3）如图2-b所示，本实施例提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的p2ФC31.CAR微环DNA重组母质粒的构建方法
（3a）将步骤（1c）挑选的阳性克隆进行培养，采用质粒提纯试剂盒（OMEGA公司）纯化pEF1a.bpA.CAR重组表达载体。
（3b）采用SpeI和Psp OMI内切酶分别对p2ФC31载体和步骤（2a）所得的pEF1a.bpA.CAR重组表达载体进行双酶切，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，并分别回收线性p2ФC31载体和酶切后的核苷酸片段（含有重组嵌合抗原受体基因表达盒的DNA片段）；
（3c）采用T4DNA连接酶将步骤（2）所得酶切后的核苷酸片段和线性p2ФC31质粒按3:1的摩尔比在16℃下进行连接过夜或者室温下连接2小时，然后将连接产物加入E.coli DH5α菌株感受态细胞悬液中，进行转化，并接种在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃培养过夜，挑取单菌落进行重组质粒载体的双酶切验证；选取酶切结果验证的阳性克隆，进行测序验证，制得p2ФC31.CAR（12773bp），所述p2ФC31.CAR即为所述含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，该p2ФC31.CAR的质粒图谱如图5所示。
实施例2
本实施例结合如图6所示的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的 构建流程图，提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的制备方法，包括如下步骤：
（1a）将实施例1所得的p2ФC31.CAR质粒转化TOP10，并培养过夜；
（1b）将步骤（1a）所得的培养液中的细菌悬浮于含有1％阿拉伯糖的新鲜诱导液中，32℃孵育加摇晃（250次／分钟）2小时，诱导表达重组酶ΦC31，介导形成含有attL位点的细菌质粒（pBackbone）DNA环和含有attR位点的微环DNA；
（1c）随后将孵育温度升到37℃,诱导内切酶I-Sce1切开pBackbone上的内置的I-Sce1酶切点，链状的pBackbone DNA迅速被细菌的外切酶降解，微环DNA成为唯一的染色体外环状DNA，由亲和柱提取，得到含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，即MC.CAR（3122bp），该MC.CAR的质粒图谱如图7所示。
实施例3
本实施例提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒pMC.CAR的构建方法，包括如下步骤：
（1）参照实施例1步骤（1）构建含重组嵌合抗原受体（CAR）基因的pUC57.CAR重组载体
（2）参照实施例1步骤（2）构建含重组嵌合抗原受体基因表达盒的pEF1a.bpA.CAR重组表达载体
（3）如图8所示，本实施例提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的pMC.CAR微环DNA重组母质粒的构建方法
（3a）将步骤（1c）挑选的阳性克隆进行培养，采用质粒提纯试剂盒（OMEGA公司）纯化pEF1a.bpA.CAR重组表达载体。
（3b）采用SpeI和Psp OMI内切酶分别对pMC.BESPX载体和步骤（2a）所得的pEF1a.bpA.CAR重组表达载体进行双酶切，采用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，并分别回收线性pMC.BESPX载体和酶切后的核苷酸片段；
（3c）采用T4DNA连接酶将步骤（2）所得酶切后的核苷酸片段和线性pMC.BESPX质粒按3:1的摩尔比在16℃下进行连接过夜或者室温下连接2小时，然后将连接产物加入E.coli DH5α菌株感受态细胞悬液中，进行转化，并接种在含有卡那霉素的LB平板上37℃培养过夜，挑取单菌落进行重组质粒载体的双酶切验证；选取酶切结果验证的阳性克隆，进行测序验证，制得pMC.CAR（7122bp），所述pMC.CAR即为所述含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，该pMC.CAR的质粒图谱如图9所示。
实施例4
本实施例结合如图10所示的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的构建流程图，提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的制备方法，包括如下步骤：
（1a）将实施例3所得的pMC.CAR质粒转化ZYCY10P3S2T工程菌，并培养过夜；
（1b）将步骤（1a）所得的培养液中的细菌悬浮于含有1％阿拉伯糖的新鲜诱导液中，32℃孵育加摇晃（250次／分钟）2小时，诱导表达重组酶ΦC31，介导形成含有attL位点的细菌质粒（pBackbone）DNA环和含有attR位点的微环DNA；
（1c）随后将孵育温度升到37℃,诱导内切酶I-Sce1切开pBackbone上的内置的I-Sce1酶切点，链状的pBackbone DNA迅速被细菌的外切酶降解，微环DNA成为唯一的染色体外环状DNA，由亲和柱提取，得到含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，即MC.CAR（3122bp），该MC.CAR的质粒图谱如图7所示。
由于pMC.BESPX无p2ФC31载体上编码ФC31重组酶和I-Sce1内切酶的核苷酸序列，其制备的微环DNA母质粒即pMC.CAR比p2ФC31.CAR更加优质，因为前者无编码ФC31重组酶和I-Sce1内切酶核苷酸序列，可以减少重组酶和内切酶的核苷酸序列对微环DNA的污染；但是采用实施例3制备的微环DNA 母质粒即pMC.CAR来生产微环DNA时，本发明配套使用了ZYCY10P3S2T工程菌代替TOP10，因为无编码ФC31重组酶和I-Sce1内切酶核苷酸序列的pMC.CAR需要具有编码ФC31重组酶和I-Sce1内切酶功能的ZYCY10P3S2T工程菌才能发生体内位点特异性重组，并最终生产出微环DNA，即MC.CAR。
实施例5
本实施例提供了一种转染含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的T细胞（CAR-T）有杀伤Raji细胞的方法，包括如下步骤：
（1）在96孔细胞培养板内接种Raji细胞（1×104/孔，200μl），待细胞贴壁后，按照CAR-T细胞（效应细胞，E）与Raji细胞（靶细胞，T）10:1、20:1和40:1的比例(E:T)，将CAR-T细胞分别用含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA（MC.CAR）和空载体（p2ΦC31）通过BIO-RAD电转仪转染后加入到细胞培养孔内，同时设置仅有效应细胞（E）和仅有靶细胞的对照孔（T）；
（2）继续培养细胞96小时后，每孔加20μl浓度为5mg/ml的MTT噻唑蓝溶液，再继续孵育4小时，然后再1000rpm/min下离心10min，吸弃细胞培养孔内的上清液，每孔加200μl二甲基亚砜（DMSO），振摇10min，使结晶物充分溶解；
（3）用酶联免疫检测仪测定各孔在570nm波长的吸收值，绘制细胞杀伤实验，根据公式（T组OD值-（E:T组OD值-E组OD值）/T组OD值×100%计算杀伤效率。结果显示，本发明MC.CAR能够增强CAR-T细胞对Raji细胞杀伤活性。
Claims (63)
1.一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述微环DNA重组母质粒是在微环DNA空质粒的多克隆位点中插入重组嵌合抗原受体基因表达盒的基因序列组合而成，其中，所述微环DNA空质粒为p2ФC31质粒或pMC.BESPX质粒，所述重组嵌合抗原受体基因表达盒包括依次连接的启动子、重组嵌合抗原受体基因、终止密码子和polyA加尾信号。
2.如权利要求1所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述重组嵌合抗原受体基因具有编码重组嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述重组嵌合抗原受体包括胞外抗原识别亚单位、穿膜连接亚单位和胞内信号转导亚单位，其中，所述胞外抗原识别亚单位具有肿瘤细胞抗原表位的结合位点和铰链区，所述穿膜连接亚单位为胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区，所述胞内信号转导亚单位具有活化免疫效应细胞的胞内信号转导区；
所述重组嵌合抗原受体的氨基酸序列连接形式依次为：
肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区。
3.如权利要求2所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点为单克隆抗体的单链可变区scFv，所述铰链区为CD8α链的铰链区，所述I型跨膜蛋白的跨膜区为CD4、CD28或CD8的α链，所述胞内信号转导蛋白的跨膜区为IgG的重链，所述活化免疫效应细胞的胞内信号转导区依次包括第二转导信号和第一转导信号。
4.如权利要求3所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述单克隆抗体的单链可变区scFv为抗CD19分子单链抗体，所述第一转导信号为免疫球蛋白FcεRI受体的γ链和CD3的ζ链中的至少一种，所述第二转导信号为CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1和1COS中的两种。
5.如权利要求4所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述抗CD19分子单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二转导信号依次包括CD28和4-IBB，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述4-IBB的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第一转导信号为CD3的ζ链，所述CD3的ζ链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
6.如权利要求3所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述CD8α链的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述CD8的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
7.如权利要求2所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞中的一种。
8.如权利要求2所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和甲状腺癌细胞中的一种。
9.如权利要求2所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述胞外抗原识别亚单位靶向结合所述肿瘤细胞的至少一个抗原表位。
10.如权利要求1所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其特征在于，所述启动子和所述重组嵌合抗原受体基因之间连接有编码CD8信号肽的核苷酸序列，所述编码CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示。
11.一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提供或制备DNA片段，所述DNA片段具有依次连接的重组嵌合抗原受体基因和终止密码子；
（2）将步骤（1）所得的DNA片段插入表达载体的多克隆位点，得到含重组嵌合抗原受体基因表达盒的重组表达载体，其中，所述表达载体的多克隆位点两端分别具有启动子和polyA加尾信号；
（3）将步骤（2）所得的重组表达载体进行双酶切，得到含重组嵌合抗原受体基因表达盒的DNA片段，然后将所述含重组嵌合抗原受体基因表达盒的DNA片段插入p2ФC31质粒或pMC.BESPX质粒即得含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，其中，所述重组嵌合抗原受体基因表达盒包括依次连接的启动子、重组嵌合抗原受体基因、终止密码子和polyA加尾信号。
12.如权利要求11所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒的制备方法，其特征在于，所述重组嵌合抗原受体基因具有编码重组嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述重组嵌合抗原受体包括胞外抗原识别亚单位、穿膜连接亚单位和胞内信号转导亚单位，其中，所述胞外抗原识别亚单位具有肿瘤细胞抗原表位的结合位点和铰链区，所述穿膜连接亚单位为胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区，所述胞内信号转导亚单位具有活化免疫效应细胞的胞内信号转导区；
所述重组嵌合抗原受体的氨基酸序列连接形式依次为：
肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区。
13.如权利要求12所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒的制备方法，其特征在于，所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点为单克隆抗体的单链可变区scFv，所述铰链区为CD8α链的铰链区，所述I型跨膜蛋白的跨膜区为CD4、CD28或CD8的α链，所述胞内信号转导蛋白的跨膜区为IgG的重链，所述活化免疫效应细胞的胞内信号转导区依次包括第二转导信号和第一转导信号。
14.如权利要求13所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒的制备方法，其特征在于，所述单克隆抗体的单链可变区scFv为抗CD19分子单链抗体，所述第一转导信号为免疫球蛋白FcεRI受体的γ链和CD3的ζ链中的至少一种，所述第二转导信号为CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1和1COS中的两种。
15.如权利要求14所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒的制备方法，其特征在于，所述抗CD19分子单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二转导信号依次包括CD28和4-IBB，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述4-IBB的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第一转导信号为CD3的ζ链，所述CD3的ζ链的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。
16.如权利要求13所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒的制备方法，其特征在于，所述CD8α链的铰链区的氨基酸序列如SEQID NO:5所示；所述CD8的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
17.如权利要求12所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒的制备方法，其特征在于，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞中的一种。
18.如权利要求12所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒的制备方法，其特征在于，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和甲状腺癌细胞中的一种。
19.如权利要求12所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒的制备方法，其特征在于，所述胞外抗原识别亚单位靶向结合所述肿瘤细胞的至少一个抗原表位。
20.如权利要求11所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒的制备方法，其特征在于，所述启动子和所述重组嵌合抗原受体基因之间连接有编码CD8信号肽的核苷酸序列，所述编码CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
21.一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，其特征在于，所述微环DNA为具有attR位点和重组嵌合抗原受体基因表达盒的环状DNA，其中，所述基因表达盒包括依次连接的启动子、重组嵌合抗原受体基因、终止密码子和polyA加尾信号。
22.如权利要求21所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，其特征在于，所述重组嵌合抗原受体基因具有编码重组嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述重组嵌合抗原受体包括胞外抗原识别亚单位、穿膜连接亚单位和胞内信号转导亚单位，其中，所述胞外抗原识别亚单位具有肿瘤细胞抗原表位的结合位点和铰链区，所述穿膜连接亚单位为胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区，所述胞内信号转导亚单位具有活化免疫效应细胞的胞内信号转导区；
所述重组嵌合抗原受体的氨基酸序列连接形式依次为：
肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区。
23.如权利要求22所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，其特征在于，所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点为单克隆抗体的单链可变区scFv，所述铰链区为CD8α链的铰链区，所述I型跨膜蛋白的跨膜区为CD4、CD28或CD8的α链，所述胞内信号转导蛋白的跨膜区为IgG的重链，所述活化免疫效应细胞的胞内信号转导区依次包括第二转导信号和第一转导信号。
24.如权利要求23所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，其特征在于，所述单克隆抗体的单链可变区scFv为抗CD19分子单链抗体，所述第一转导信号为免疫球蛋白FcεRI受体的γ链和CD3的ζ链中的至少一种，所述第二转导信号为CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1和1COS中的两种。
25.如权利要求24所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，其特征在于，所述抗CD19分子单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二转导信号依次包括CD28和4-IBB，所述CD28的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，所述4-IBB的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第一转导信号为CD3的ζ链，所述CD3的ζ链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
26.如权利要求23所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，其特征在于，所述CD8α链的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述CD8的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
27.如权利要求22所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，其特征在于，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞中的一种。
28.如权利要求22所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，其特征在于，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和甲状腺癌细胞中的一种。
29.如权利要求22所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，其特征在于，所述胞外抗原识别亚单位靶向结合所述肿瘤细胞的至少一个抗原表位。
30.如权利要求21所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，其特征在于，所述启动子和所述重组嵌合抗原受体基因之间连接有编码CD8信号肽的核苷酸序列，所述编码CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
31.如权利要求22所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，其特征在于，所述含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA由含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA母质粒在宿主菌内发生位点特异性重组产生。
32.一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提供或制备含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，所述微环DNA重组母质粒是在微环DNA空质粒的多克隆位点中插入重组嵌合抗原受体基因表达盒的基因序列组合而成，其中，所述微环DNA空质粒为p2ФC31质粒或pMC.BESPX质粒，所述重组嵌合抗原受体基因表达盒包括依次连接的启动子、重组嵌合抗原受体基因、终止密码子和polyA加尾信号；
（2）将步骤（1）所得的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒转化宿主菌，在ФC31重组酶的作用下非可逆地产生含有attL位点的细菌质粒DNA环和含有attR位点的微环DNA；
（3）步骤（2）所得的含有attL位点的细菌质粒DNA被I-Sce内切酶酶切后成线性DNA片段后，继而在宿主菌内降解，然后采用常规质粒提纯试剂盒提纯所述含有attR位点的微环DNA，所述微环DNA为具有attR位点和重组嵌合抗原受体基因表达盒的环状DNA，其中，所述重组嵌合抗原受体基因表达盒包括依次连接的启动子、重组嵌合抗原受体基因、终止密码子和polyA加尾信号。
33.如权利要求32所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述重组嵌合抗原受体基因具有编码重组嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述重组嵌合抗原受体包括胞外抗原识别亚单位、穿膜连接亚单位和胞内信号转导亚单位，其中，所述胞外抗原识别亚单位具有肿瘤细胞抗原表位的结合位点和铰链区，所述穿膜连接亚单位为胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区，所述胞内信号转导亚单位具有活化免疫效应细胞的胞内信号转导区；
所述重组嵌合抗原受体的氨基酸序列连接形式依次为：
肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区。
34.如权利要求33所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点为单克隆抗体的单链可变区scFv，所述铰链区为CD8α链的铰链区，所述I型跨膜蛋白的跨膜区为CD4、CD28或CD8的α链，所述胞内信号转导蛋白的跨膜区为IgG的重链，所述活化免疫效应细胞的胞内信号转导区依次包括第二转导信号和第一转导信号。
35.如权利要求34所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述单克隆抗体的单链可变区scFv为抗CD19分子单链抗体，所述第一转导信号为免疫球蛋白FcεRI受体的γ链和CD3的ζ链中的至少一种，所述第二转导信号为CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1和1COS中的两种。
36.如权利要求35所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述抗CD19分子单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示；所述第二转导信号依次包括CD28和4-IBB，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述4-IBB的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第一转导信号为CD3的ζ链，所述CD3的ζ链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
37.如权利要求34所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述CD8α链的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述CD8的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
38.如权利要求33所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞中的一种。
39.如权利要求33所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和甲状腺癌细胞中的一种。
40.如权利要求33所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述胞外抗原识别亚单位靶向结合所述肿瘤细胞的至少一个抗原表位。
41.如权利要求32所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的制备方法，其特征在于，所述启动子和所述重组嵌合抗原受体基因之间连接有编码CD8信号肽的核苷酸序列，所述编码CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示。
42.如权利要求21～31任一所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA按下述一种或多种方法进行应用：
（1）将所述微环DNA单独进行应用；
（2）将所述微环DNA与化疗、放疗、手术、生物治疗、免疫治疗中的一种或几种联合应用；
（3）采用体内靶向投递的方式将所述微环DNA直接投递到患者体内进行治疗；
（4）先通过体外转染技术将所述微环DNA转染免疫效应细胞，然后将所述转染有微环DNA的免疫效应细胞输回患者体内实施治疗。
43.一种宿主，其特征在于，所述宿主包含如权利要求21～31任一所述的微环DNA。
44.一种重组嵌合抗原受体，其特征在于，所述重组嵌合抗原受体包括胞外抗原识别亚单位、穿膜连接亚单位和胞内信号转导亚单位，其中，所述胞外抗原识别亚单位具有肿瘤细胞抗原表位的结合位点和铰链区，所述穿膜连接亚单位为胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区，所述胞内信号转导亚单位具有活化免疫效应细胞的胞内信号转导区；
所述重组嵌合抗原受体的氨基酸序列连接形式依次为：
肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区。
45.如权利要求44所述的重组嵌合抗原受体，其特征在于，所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点为单克隆抗体的单链可变区scFv，所述铰链区为CD8α链的铰链区，所述I型跨膜蛋白的跨膜区为CD4、CD28或CD8的α链，所述胞内信号转导蛋白的跨膜区为IgG的重链，所述活化免疫效应细胞的胞内信号转导区依次包括第二转导信号和第一转导信号。
46.如权利要求45所述的重组嵌合抗原受体，其特征在于，所述单克隆抗体的单链可变区scFv为抗CD19分子单链抗体，所述第一转导信号为免疫球蛋白FcεRI受体的γ链和CD3的ζ链中的至少一种，所述第二转导信号为CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1和1COS中的两种。
47.如权利要求46所述的重组嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗CD19分子单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二转导信号依次包括CD28和4-IBB，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述4-IBB的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第一转导信号为CD3的ζ链，所述CD3的ζ链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
48.如权利要求45所述的重组嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD8α链的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述CD8的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
49.如权利要求44所述的重组嵌合抗原受体，其特征在于，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞中的一种。
50.如权利要求44所述的重组嵌合抗原受体，其特征在于，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和甲状腺癌细胞中的一种。
51.如权利要求44所述的重组嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外抗原识别亚单位靶向结合所述肿瘤细胞的至少一个抗原表位。
52.如权利要求44所述的重组嵌合抗原受体，其特征在于，所述重组嵌合抗原受体由含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA在宿主细胞内表达。
53.一种重组嵌合抗原受体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）提供或制备含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，所述微环DNA为具有attR位点和重组嵌合抗原受体基因表达盒的环状DNA，其中，所述重组嵌合抗原受体基因表达盒包括依次连接的启动子、重组嵌合抗原受体基因、终止密码子和polyA加尾信号；
（2）将步骤（1）所得的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA转染宿主细胞，并在宿主细胞内表达产生重组嵌合抗原受体。
54.如权利要求53所述的重组嵌合抗原受体的制备方法，其特征在于，所述重组嵌合抗原受体包括胞外抗原识别亚单位、穿膜连接亚单位和胞内信号转导亚单位，其中，所述胞外抗原识别亚单位具有肿瘤细胞抗原表位的结合位点和铰链区，所述穿膜连接亚单位为胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区，所述胞内信号转导亚单位具有活化免疫效应细胞的胞内信号转导区；
所述重组嵌合抗原受体的氨基酸序列连接形式依次为：
肿瘤细胞抗原表位的结合位点–铰链区–胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区–活化免疫效应细胞的胞内信号转导区。
55.如权利要求54所述的重组嵌合抗原受体的制备方法，其特征在于，所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点为单克隆抗体的单链可变区scFv，所述铰链区为CD8α链的铰链区，所述I型跨膜蛋白的跨膜区为CD4、CD28或CD8的α链，所述胞内信号转导蛋白的跨膜区为IgG的重链，所述活化免疫效应细胞的胞内信号转导区依次包括第二转导信号和第一转导信号。
56.如权利要求55所述的重组嵌合抗原受体的制备方法，其特征在于，所述单克隆抗体的单链可变区scFv为抗CD19分子单链抗体，所述第一转导信号为免疫球蛋白FcεRI受体的γ链和CD3的ζ链中的至少一种，所述第二转导信号为CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1和1COS中的两种。
57.如权利要求56所述的重组嵌合抗原受体的制备方法，其特征在于，所述抗CD19分子单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述第二转导信号依次包括CD28和4-IBB，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述4-IBB的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第一转导信号为CD3的ζ链，所述CD3的ζ链的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
58.如权利要求55所述的重组嵌合抗原受体的制备方法，其特征在于，所述CD8α链的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述CD8的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
59.如权利要求54所述的重组嵌合抗原受体的制备方法，其特征在于，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞中的一种。
60.如权利要求54所述的重组嵌合抗原受体的制备方法，其特征在于，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和甲状腺癌细胞中的一种。
61.如权利要求54所述的重组嵌合抗原受体的制备方法，其特征在于，所述胞外抗原识别亚单位靶向结合所述肿瘤细胞的至少一个抗原表位。
62.如权利要求53所述的重组嵌合抗原受体的制备方法，其特征在于，所述启动子和所述重组嵌合抗原受体基因之间连接有编码CD8信号肽的核苷酸序列，所述编码CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
63.如权利要求21～31任一所述的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA在制备预防或治疗癌症的药物中的应用。
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