CN102083975A - 小环dna载体制剂及其制备方法和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于给予对象的小环核酸载体制剂，该小环核酸载体包含感兴趣的多核苷酸、单向位点特异性重组酶的产物杂交序列且没有质粒骨架细菌DNA序列。还提供制备所述制剂的方法，以及将所述小环核酸载体制剂给予对象的方法。本发明的方法和组合物可用于各种不同应用，包括研究和治疗应用。

Description

小环DNA载体制剂及其制备方法和使用方法

政府权利

本发明得到国立卫生研究院授予的联邦基金HL64274号资助，在政府支持下获得。美国政府对本发明享有一定权利。

发明背景

将外源性核酸序列引入细胞内称为“转化”的过程在各种生物技术和相关应用中，包括研究、合成和治疗性应用中发挥了重要效益。转化起到关键作用的研究应用包括产生转基因细胞和动物。转化起到关键作用的合成应用包括产生肽和蛋白质、以及治疗性RNA如干扰性RNA或核酶。转化起到重要作用的治疗性应用包括基因治疗应用。由于转化可普遍用于上述应用和其他应用，已开发了各种不同的转化方法。

在转化的许多应用中，引入外源性DNA的方式需要能使该外源DNA长期表达其编码的蛋白质。外源DNA的长期表达主要通过将该外源DNA掺入到靶细胞的基因组中而实现。基因组整合的一种方法是采用同源重组载体。而依赖同源重组的技术缺点在于不可能总是具有这种必须的同源性，及重组过程缓慢等等。因此，基于同源重组的方法不是完全令人满意的方法。

相应地开发了基于病毒的另一种替代转化方法，此法中，采用病毒为载体将外源DNA引入细胞内，然后将引入的DNA整合入靶细胞的基因组中。发现可采用的基于病毒的载体包括逆转录病毒载体，如莫洛尼小鼠白血病病毒载体。发现可采用的其它病毒载体包括：腺病毒衍生载体、HSV衍生载体，辛德比斯病毒衍生载体等等。虽然病毒载体可提供一些优点，但在许多情况下，采用它们不是最优的。病毒载体相关的缺点包括具有免疫原性、病毒并发症以及整合介导产生突变的问题等等。

因此，开发用外源核酸转化细胞以持久、长期表达所编码蛋白质的其它方法仍然令人感兴趣。特别感兴趣的是开发不伴有基因组整合而能持久表达蛋白质的、非病毒的核酸体内转移方法和载体，所述载体应能提供不依赖于其表达盒的序列和取向的持久表达。

相关文献

感兴趣的美国专利包括5,985,847和5,922,687。还感兴趣的有WO/11092和已公开的美国专利申请号20040214329。其它感兴趣的参考文献包括：Wolff等.，“基因体内直接转移到小鼠肌肉中”(Direct Gene Transfer into Mouse Muscle in Vivo)，Science(1990)247：1465-1468；Hickman等，“DNA直接注入肝脏后的基因表达”(Gene Expression Following Direct Injection of DNA into Liver)，Hum.Gen.Ther.(1994)5：1477-1483；Acsadit等.，“体内大鼠心脏中的直接基因转移和表达”(Direct Gene Transfer and Expression into Rat Heart in Vivo)New Biol.(1991年1月)3：71-81和Chen ZY等，Human Gene Therapy16：126，2005。

发明概述

本发明提供用于给予对象的小环核酸载体制剂。这种小环核酸载体包含感兴趣的多核苷酸如要表达的感兴趣序列，和作为单向位点特异性重组酶的重组产物并缺乏质粒骨架细菌DNA序列的序列(质粒BB)。本技术的特征包括含有单一小环群体的小环制剂，所述小环包含转基因表达盒单体，该单体的结构对于体内递送和表达基因已优化，在这种环形DNA中基本上没有不良内切核酸酶和重组酶的编码基因，因此允许更容易地制备临床级的小环DNA载体，所述方法允许大大减少L-阿拉伯糖的用量来诱导DNA编辑酶，显著降低小环的生产成本，以及该载体尺寸较小使得亲代质粒的构建更容易。

含所述小环核酸载体的制剂的特征是：基本上没有污染的核酸序列，更重要的是完全没有污染的编码重组酶如PhiC31的环形核酸序列，和/或污染的编码限制性内切核酸酶如ISce1的核酸序列。这类污染序列不良，因为它们不大可能在转化过程中转运入受者细胞中并表达，其表达产物可能损坏受者细胞的基因组DNA。

本文也提供制备本发明制剂的方法，以及将该小环核酸载体制剂给予对象的方法。发现所述方法和组合物可用于多种不同应用，包括研究和治疗应用。

本领域技术人员通过阅读以下更全面描述的本发明详细内容将会明白本发明的这些和其他目的、优点和特征。

附图简要说明

通过阅读以下详述并结合伴随的附图可以最佳地了解本发明。要强调的是根据常规实践，该附图中的各种特征不成比例。相反，为澄清起见，各特征的维度尺寸可随意扩大或缩小。包括以下附图。

图1A-1G显示各种质粒的结构图。图A显示先前所述的p2C31.hFIX质粒，它是小环产生质粒(Chen等，Human Gene Therapy 16：126，2005)。BAD，araC-BAD调控系统的阿拉伯糖诱导型启动子；araC，阻抑基因；

C31，从链霉菌噬菌体衍生的重组酶基因；attB，重组酶

C31的细菌附着位点；attP，噬菌体附着位点；ISce Ig，编码限制性酶ISce 1的基因；ISce Is，ISce I限制性位点；sApoE，先前详述的人造增强子/启动子(Miao等，Mol Ther 1：522，2000)；hFIX，编码人血凝蛋白IX因子的基因；AmpR，氨苄青霉素抗性基因；UC，质粒复制起点。图B显示质粒p2

C31.hFIX通过

C31-介导的重组所产生的编码sApoE.hFIX盒的小环MC.hFIX。MC，小环；attR，右侧杂交序列。图C显示质粒BB，该细菌质粒的骨架环通过

C312介导的重组衍生自p2

C31.hFIX；attL，左侧杂交序列。图D显示p2

C31.ISce Ig&s质粒，即从图A所示P2

C31.hFIX中删除hFIX盒以及侧接attB和attP所产生的质粒。图E为pKanR.endA质粒，该质粒用于灭活细菌endA基因；KanR，卡那霉素抗性基因；endA，编码细菌内切核酸酶1的基因。图F显示p3BAD.ISce 1g.KanR.UMU质粒，该质粒用于整合3BAD.ISce I盒；UMU，细菌的UMU基因座。图G显示p8ISce 1s质粒，它是含有8个连续的ISce I限制性位点的基于pBlueScript(加利福尼亚州拉霍亚的司查塔基公司(Stratagene，La Jolla，CA))的质粒。

图2A-2B显示除去了杂质但DNA发生降解的BW27783菌株。用质粒p2

C31.hFIX与BW27783或Top 10菌株产生小环(Chen等，Human Gene Therapy 16：126，2005)；用Bgl II加EcoN1酶消化DNA后以琼脂糖凝胶试验检测该小环的质量。在Top 10菌株产生的小环中明显观察到包含有亲代质粒(PP)和质粒BB(PB)的杂质DNA，但在BW27783菌株产生的小环中观察不到，甚至当用低至0.001％浓度的诱导剂L-阿拉伯糖培养时也观察不到。限制性，限制性作用；细菌，细菌菌株；L-arab，L-阿拉伯糖。图B显示DNA降解，在由BW27783制备的质粒、小环及细菌基因组样品中明显有DNA降解，但Top10菌株制备的没有这种现象。

图3A-3C显示通过删除endA基因克服了DNA降解问题。图A为流程图，说明删除endA的过程。我们按照Datsenko和Wanner BL(PNAS 97：6640，2000)的方案，用Pme1消化质粒pKanR.endA制备了包含2个endA-靶向序列的DNA片段(图1E)，用以灭活BW27783的endA基因。简言之，我们用质粒pBAD.RED转化BW27783菌落，30℃在含1％L-阿拉伯糖的LB中培养所得细菌菌落至OD600读数达到约0.5，诱导噬菌体λ的RecBCD重组酶复合体表达；我们用该线性靶向DNA片段转化所得感受态细胞，选择卡那霉素抗性菌落作进一步研究。43℃培养所得BWendA.KanR细胞过夜去除质粒pBAD.RED。为去除基因组中的卡那霉素抗性基因，用质粒p2

C31.ISce Ig&s(图1D)转化该中间菌株BWendA.KanR，然后用含1％L-阿拉伯糖的LB肉汤培养转化细胞菌落诱导C31和ISce 1二酶表达，通过

C31介导的attB与attP之间的重组导致其卡那霉素抗性基因的丢失，同时通过ISce1介导的限制作用纠正质粒p2

C31.ISceIg&s。选择氨苄青霉素和卡那霉素敏感菌落作进一步特征分析。图B显示对DNA整合的证实。采用二对引物，每对含卡那霉素基因的一端(引物448或449)和含endA的另一端(引物1269或1279)作PCR试验证实卡那霉素抗性基因的整合。4个菌落有3个分别检测到大小为0.5-kb和1.0kb的预期PCR产物。BW，BW27783基因组；ZY650，质粒pKanR.endA(图1E)。图C显示对内切核酸酶1活性丧失的证实。用Bgl II加EncoN1酶切所得菌株BWΔendA和Top 10产生小环MC.hFIX，每种酶切割该小环或质粒BB一次，作凝胶电泳分析。

图4A-4C显示BAD.ISce I基因的整合。图A为DNA整合的流程图。通过Pst1消化从质粒p3BAD.ISce I.KanR.UMU(图1F)制备的线性靶向DNA含有串连的三拷贝BDA.ISce I盒和一个卡那霉素盒及二个侧接的UMU靶向序列；我们按照图3所述的Datsenko和Wanner BL(PNAS 97：6640，2000)的相同方案将其整合入BWΔendA菌株的UMU基因座中。最终获得新的菌株BWΔednA.3ISce I。图B显示整合的ISce1基因的PCR说明。同样，采用ISce1-基因特异性引物时，BWΔendA.3ISce 1菌株产生了预期的PCR产物但其前体BWΔendA菌株不产生，证实了该ISce1基因的整合。图C为ISce I活性的说明。用含有8个相连ISceI限制性位点的质粒p8ISce Is(图1G)转化菌株BWΔendA.3ISce I。将转化后的细菌用含或不含1％L-阿拉伯糖的新鲜LB重悬浮培养过夜，37℃再培养4小时，取一等份不作任何处理用作对照。分离得到质粒DNA，用Xba1线性化作琼脂糖凝胶(电泳)分析。用无L-阿拉伯糖的二个培养物得到的DNA条带可明显看出且大约相等，但用表达ISce1酶的培养物几乎得不到此条带，表明该整合的ISce1基因已发挥了功能。

图5A-5C显示采用含灭活endA基因和整合的BAD.ISce 1基因的细菌制备的小环制剂。图A显示用于产生小环载体的亲代质粒构建物。该质粒包含一个拷贝的BDA.C31重组酶基因和多个ISce 1限制性位点(N＝8、32或64个)。图B显示在存在(+)或缺乏(-)1％L-阿拉伯糖培养4小时的三个小环制剂中估计的污染核酸量(MC＝小环，PP＝亲代质粒，PB＝质粒骨架，gDNA＝基因组DNA)。从图A所述质粒产生小环，用Spe 1和Xba 1消化该DNA，它们分别在小环或质粒骨架(BB)上切割一次。图C显示在不同温度下测定的小环制剂的质量。用Xba1切割该DNA，该酶同时切割小环(MC)和质粒BB(PB)一次。

图6A-6E显示亲代质粒的不同实施方式。图A显示能表达重组酶和限制性内切核酸酶的亲代质粒。图B显示能表达重组酶的亲代质粒。图C显示能表达限制性内切核酸酶的亲代质粒。图D显示不含重组酶或内切核酸酶编码序列的亲代质粒。图E显示重组后的最终小环载体。

图7A-7B显示本发明的一种实施方式。图A显示小环亲代质粒构建物。图B显示含有所有遗传改变的相应细菌菌株。Pbla，衍生自司查塔基公司(加利福尼亚州拉霍亚)的质粒pBlueScript的大肠杆菌β-内酰胺酶基因的启动子。

图8A-8D.BAD.

C31基因的基因组整合。

图9A-9D显示第二代L-阿拉伯糖转运蛋白基因的整合。流程图9A显示敲除菌株CC2

C31(D2)的野生型LacY基因。我们用作靶向序列的线性DNA含有四环素抗性基因和侧接LacY基因上下游的LacZ基因的420-bp序列及LacA基因的227-bp。我们用相同的RED-介导的整合方法来整合该线性DNA(图3A)。选择含四环素标记的菌落后，通过对用LacZ基因和四环素抗性基因特异性引物产生的PCR产物作DNA测序，证实该中间菌株已敲除了LacY基因(图9C)。图9B显示突变体LacY A177C(muLacY)整合在LacY的原先位置。野生型LacY蛋白是乳糖转运蛋白而muLacY获得的额外功能是L-阿拉伯糖转运蛋白(Morgan-Kiss RM等，PNAS 99：7373，2002)。利用得自β-乳糖苷酶基因(bla)的组成型启动子驱动该突变蛋白的表达。为了制备这种整合性DNA，我们用含卡那霉素抗性基因侧接attB和attP及bla.muLac盒的DNA序列取代上述线性整合DNA中的四环素基因(图9A)。同样，我们用相同的RED-介导的整合方法来整合突变LacY基因(图3A)。我们选出含卡那霉素抗性标记的菌落，然后用含1％阿拉伯糖的LB培养细菌，诱导

C31-介导的重组而去除卡那霉素抗性基因。通过检测用bla和LacA特异性引物所产生的PCR产物的DNA序列，我们证实了这种整合(图9D)。muLacY，LacY A177C；bla，β-乳糖苷酶基因启动子。

图10A-10D显示4拷贝串连BAD.

C31盒的整合。图10A说明在CCD2

C31.muLacy基因组中制备靶位点。我们用构建物p2

C31.R6KFRT(图8B)成功地整合了2拷贝的BAD.

C31盒，但重复同一方法未能整合入更多拷贝的

C31基因。我们假设事先存在的3个FRT位点阻断了FLP重组酶的功能；原先的菌株BW27783含有2个FRT位点，CC2

C31菌株因整合了2个BAD.

C31而获得了一个额外的位点。为克服此问题，我们采用也处在araC.BAD系统控制下的噬菌体TP901-1的重组酶(TPin)来取代FLP。象

C31一样，TPin可介导单向反应。为了与

C31相区别，我们用缩写9attB和9attP分别代表TPin的细菌和噬菌体附着位点。由于设计细致，这二种酶通过顺序反应每次去除二种杂交序列，即attL/attR和9attL/9attR之一将产生稳定的整合子。为了使可有可无的araD基因靶向插入菌株CC2

C31.muLacY(图9B)的基因组中，我们采用了含四环素抗性基因和attB及9attP位点、并侧接araD基因5’-末端275-bp和3’-末端310-bp序列的线性DNA。选出四环素抗体性菌落后，我们对用araD的5’部分和polB基因的特异性引物对产生的PCR产物进行DNA测序，证实了这种整合；在细菌基因组中polB基因位于araD的下游，因此，我们得到了所需的中间菌株CC2C31.muLacY.ΔaraD(图10A)。预计可能需要更多拷贝的

C31基因，我们制备了另一种含有串连的4拷贝BAD.

C31盒的整合质粒pA101.4

C31；我们采用的另一种温度敏感性质粒DNA复制起点A101也可经43℃培养细菌而纠正(图10B)。为制备含有该额外4BAD.

C31盒的菌株，我们用该质粒转化CC2

C31.muLacY.ΔaraD菌株，30℃在含0.001％L-阿拉伯糖的5-ml LB中培养所选菌落2小时诱导

C31介导的整合。为选择含整合子的菌落，我们选择了对四环素和卡那霉素二者具有抗性的菌落。为去除这二种抗生素的抗性基因，我们用质粒pBAD.TPin转化细菌后43℃用含0.001％L-阿拉伯糖的LB培养所得菌落2小时，以诱导TPin-介导的9attB与9attP之间的整合，然后接种无抗生素平板。43℃培养平板过夜，除细菌生长更快外，此步也纠正了质粒pBAD.TPin。我们先前发现

C31能介导attL与attR之间的逆向反应而导致丧失该整合子，可能是因为细菌表达了这种逆向反应所需的辅因子(资料没显示)。为了最大程度减少这种不良的逆向反应，我们在43℃培养细菌，在此温度时，TPin重组酶能维持基本活性但

C31活性很低或无(Staphenie M等，J bacterial 184：3657，2002)。为了稳定该整合子，我们设计了靶序列和整合性质粒，通过C31和TPin依次介导的重组反应，只留下杂交体attR和9attL，从而使attL与attR之间，或9attL与9attR之间的逆向反应不可能发生。为获得所需的菌落，我们从无抗生素的平板选择菌落，将各菌落转移到含各抗生素的平板培养，证实已丧失抗生素抗性基因。我们通过对PCR产物、基因组和整合子特异性引物所产生的PR1和PR2作DNA测序，进一步证实了这种整合子(图10B和10D)。A101，温度敏感型质粒复制起点；无，非特异性产物；对照，对照模板DNA的PCR产物。

图11A-11B.菌株D6和简化的亲代质粒的基因分型。图11A.菌株D6基因型的小结。除Cp8.araE、endA和araC3xBAD.ISce1基因及2拷贝的BAD.C31外，菌株D6还携带有第2代L-阿拉伯糖转运蛋白bla.muLacY和4个额外的BAD.

C31拷贝，共含6个拷贝的BAD.

C31。图11B，编码RSV.hAAT.bpA盒的简化亲代质粒。

定义

“核酸构建物”指通过构建而含有自然界未发现的一种或多种功能单元的核酸序列。例子包括环形、线形、双链DNA，染色体外DNA分子(质粒)，粘粒(含λ噬菌体COS序列的质粒)，含非天然核酸序列的病毒基因组等等。

“载体”能够将核酸序列转运给靶细胞。例如，载体可包含能在靶细胞中表达的编码序列。对于本发明的目的，“载体构建物”、“表达载体”和“基因转运载体”通指能够指导感兴趣基因表达和用于将感兴趣基因转运入靶细胞内的任何核酸构建物。因此，该术语包括克隆和表达运载体，以及整合性载体。

“表达盒”包括能够指导含有感兴趣的基因/编码序列的任何RNA转录物表达以及非翻译性RNA(如shRNA、微小RNA、siRNA、反义RNA等)的核酸构建物。可将这种盒构建入“载体”、“载体构建物”、“表达载体”和“基因转运载体”中，以将此表达盒转运入靶细胞内。因此，该术语包括克隆和表达运载体，以及病毒载体。

“小环”载体本文用于指一种小的双链环形DNA分子，它能提供该载体中的感兴趣序列的持久、高水平表达，所述感兴趣序列可以是编码多肽的序列、shRNA、反义RNA、siRNA等，至少实质是表达盒序列和取向不依赖的。感兴趣的序列操作性连接于小环载体中的调控序列使调控序列能控制其表达。这类小环载体的描述可参见，例如通过引用专门纳入本文作为参考的已公开的美国专利申请US20040214329。

本发明小环载体的全长足以包含下面所述的所需元件，但其长度不会以不可接受的水平阻碍或显著抑制该载体接触靶细胞时进入靶细胞的能力，如通过全身给予含该细胞的宿主时。因此，该小环载体通常至少长0.3kb，常常至少长约1.0kb，该载体可以长10kb或更长，但在某些实施方式中，不超过此长度。

小环载体不同于细菌质粒载体之处在于它们缺少细菌质粒中常见的复制起点，和缺少药物选择标记，如β-内酰胺酶、tet等。也缺少(例如)质粒骨架中所见的表达沉默序列，如从亲代质粒骨架中切下的这种小环载体。所述小环基本上不含有除重组酶杂交产物序列和感兴趣序列(即被转录序列)及表达所需的调控序列以外的载体序列。

“感兴趣的多核苷酸”或“感兴趣的序列”指适合引入靶细胞内的任何核酸片段。感兴趣多核苷酸的合适例子包括启动子元件、编码序列如治疗性基因(序列)、标记基因等、调控区、特征产生片段、执行基因破坏的核酸元件、以及不编码多肽的核酸，包括编码非翻译性RNA(如shRNA，在依据基因表达调控的RNA干扰中具有作用)的多核苷酸。

此小环载体包含单向位点特异性重组酶的产物杂交序列，此产物杂交序列是单向位点特异性重组酶介导了二种重组酶底物序列(如本领域所知的attB和attP底物序列)重组的结果，它们可以是产生的attR或attL杂交序列。通常这种杂交序列产物的长度范围约为10-500bp。在某些实施方式中，该序列产物是作为整合酶的单向位点特异性重组酶的产物杂交序列，所述感兴趣的整合酶包括但不限于野生型噬菌体整合酶或其突变体，代表性的感兴趣特异性整合酶包括但不限于：ΦC31、R4、TP901-1、ΦBT1、Bxb1、RV-1、AA118、U153、ΦFC1等的整合酶。

在本发明中，“衍生自噬菌体的”重组酶不必明确是噬菌体本身产生的，只是认为噬菌体是该重组酶和其编码序列的最初来源即可。例如，可用本领域已知的方法重组产生或合成制备重组酶，或者，可从培养的感染噬菌体的细菌中纯化获得重组酶。

“基本上纯化的”通常指分离得到的物质(化合物、多核苷酸、蛋白质、多肽、多肽组合物)，这种物质占所在样品的大多数百分比，样品中基本上纯化的成分至少占约50％，如所需成分占约80％-85％，约90-95％以及约99％或更多。纯化感兴趣多核苷酸和多肽的技术是本领域熟知的，例如包括离子交换层析、亲和层析和密度沉降技术。

术语“外源性”本文用于定义DNA，如本文的DNA构建物，将其通过人工方法，如本发明的方法引入细胞内。在通过转染、转化等引入之前，外源性DNA可含有与细胞中存在的内源性DNA相同或不同的序列。

转染细胞的方法是本领域熟知的。“被转染的”指摄入外源核酸(通常为DNA)所导致的细胞改变。采用术语“转染”不意味限制用任何实施方法引入外源核酸。合适的方法包括病毒感染、偶联、纳米微粒递送、电穿孔、基因枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射等。方法的选择通常取决于要转染的细胞类型和进行转染的微环境(即体外、离体或体内)。这些方法的总体叙述可参见Ausubel等，《分子生物学的简明方案》(Short Protocols in Molecular Biology)，第3版，韦利森出版社(Wiley & Sons)，1995。

术语“核酸分子”和“多核苷酸”可互换使用，指任何长度的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合形式或其类似物。多核苷酸可有三维结构，可执行任何已知或未知的功能。多核苷酸的非限制性例子包括基因、基因片段、外显子、内含子，信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、shRNA、短的或长的单链RNA、重组多核苷酸、分枝多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、对照区、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。核酸分子可以是线型或环形。

“编码序列”或“编码”所选多肽的序列，例如，当该核酸存在于活细胞内(体内)置于合适的调控序列(或调控元件)控制下时是可转录(如DNA)和翻译(如mRNA)为多肽的核酸分子。编码序列的边界通常由5′(氨基)末端的起始密码子和3′(羧基)末端的终止密码子确定。编码序列可包括但不限于病毒的DNA、原核或真核的mRNA、病毒的基因组DNA、原核或真核的DNA和合成的DNA序列。转录终止序列位于编码序列的3’端，启动子位于编码序列的5’端，如果需要可连结附加的调控序列，如增强子、内含子、聚腺苷酸化位点等。可采用所选细胞偏爱的密码子呈递所需多肽编码序列的DNA拷贝来优化该多肽的DNA编码序列的表达。

术语“编码”指编码多肽序列的核酸序列。此外，“编码”也指编码非翻译性RNA，如shRNA或反义RNA或其它小RNA的核酸序列。

“操作性连接于”指诸元件的安排使所述各组分的配置能执行它们的通常功能。因此，将某给定的启动子操作性连接于编码序列(如报告表达盒)，当存在合适的酶时就能够影响该编码序列的表达。所述启动子或其它调控元件不需要与编码序列相邻，只要它们发挥功能指导其表达即可。例如，在启动子序列与编码序列之间插入有非翻译性转录序列时，仍认为启动子序列与编码序列“操作性相连”。

“靶细胞”本文用于指需要作遗传修饰的细胞。靶细胞可以是分离(如培养)的细胞或是多细胞生物中(如胚泡，胎儿，出生后的动物等)的细胞。本申请特别感兴趣的细胞包括但不限于培养的哺乳动物细胞，包括CHO细胞、培养的原代细胞如成纤维细胞、内皮细胞等、和干细胞如胚胎干细胞(如具有胚胎干细胞表型的细胞)、成人干细胞、多能干细胞、造血干细胞、间充质干细胞等等。

发明详述

在描述本发明前，应理解本发明不限于所述的具体实施方式，这些方式当然是可改变的。还应理解本文所用的术语目的只是描述具体的实施方式，不意味限制本发明的范围，本发明的范围只受所附权利要求书的限制。

除非另有清楚说明，当提供数值的范围时，应理解为还具体公开了该范围上下限之间以下限单位十分之一为间隔的各个插入数值。本发明包括所述范围内任何所述数值以及插入数值之间或所述范围内的任何其他所述数值和插入数值之间的各个较小范围。这些较小范围的上下限可独立地包括或排除在该范围外，本发明还包括或不包括该较小范围的上下限之一或二者，也可排除所述范围的任一界限。当所述范围包括一个界限或二个界限时，本发明还包括除这二个界限之一或二者外的范围。

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语含义与本发明所属领域普通技术人员共同理解的相同。虽然实施或测试本发明可采用与本文所述相似或相当的任何方法和材料，但现在描述的是一些是有潜力的优选方法和材料。本文提及的和通过引用纳入本文的所有出版物公开和描述了与所引用出版物相关的方法和/或材料。应明白本文公开的内容可替代所引用出版物公开的有矛盾的内容。

必须注意本文和附件权利要求书中所用的单数形式“一个”，“一种”和“这种”包括其复数，除非文中另有说明。因此，“一种细胞”包括多个该种细胞，“这种化合物”包括一个或多个化合物，以及本领域技术人员已知的等价物，如此等等。

本文提供的所述出版物只是由于它们发表于本申请的申请日之前，不要理解为本发明承认晚于这些出版物作出。另外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不符而需要独立地确认。

还要指出起草的权利要求书可能排除了任选的要素。因此，与引用权利要求或采用“否定性”限制相联系时，预计此种陈述的作用是使用排它术语如“只有”、“仅仅”等的先行基础。

小环DNA制剂

本发明提供的小环核酸载体制剂基本上没有污染性核酸，即没有非小环核酸，这种小环核酸载体当引入哺乳动物靶细胞内时可持久高水平表达蛋白质。也提供产生该小环核酸载体制剂的制备方法。不良的污染性核酸序列包括重组酶如PhiC31的编码序列，和/或编码限制性内切核酸酶如ISce1的污染性核酸序列。这种污染性序列之所以不良是由于转入受者细胞内的可能性很小。

这些不良序列可能存在于未重组亲代质粒和质粒骨架环(质粒BB)中，因此需要确保完成了重组和限制性酶消化。在某些实施方式中，通过将重组酶和限制性内切核酸酶的编码序列整合入细菌染色体中来减少污染，而不是在亲代质粒中提供编码序列。

用含有侧接了单向位点特异性重组酶重组位点和非细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶所识别的至少一个限制性位点的感兴趣序列的亲代质粒，转染经遗传修饰能组成型表达araE并且缺乏功能性内切核酸酶1的细菌细胞，产生小环载体。存在于亲代质粒或细菌细胞染色体中的序列编码单向位点特异性重组酶和能切割亲代质粒的非内源性限制性内切核酸酶。可将此重组酶和/或限制性内切核酸酶编码序列操作性连接于对阿拉伯糖起反应的诱导型启动子。培养这种转染的细菌细胞至所需浓度，培养时间应足以激活单向位点特异性重组酶的表达而重组attB与attP之间的重组位点；并且能激活限制性内切核酸酶的表达而在限制性内切酶位点处消化质粒骨架。该培养步骤导致产生包含感兴趣多核苷酸和单向位点特异性重组酶的产物杂交序列的小环载体，其没有亲代质粒骨架序列。然后纯化此小环载体提供基本上没有污染性核酸的小环核酸载体制剂。

一般而言，用本文所述方法产生的小环核酸载体制剂所含的核酸至少约80％为小环核酸载体，至少约90％为小环核酸载体，至少约95％为小环核酸载体，至少约96％为小环核酸载体，至少约97％为小环核酸载体，至少约98％为小环核酸载体，至少约99％为小环核酸载体，至少约99.5％为小环核酸载体，至少约99.9％为小环核酸载体。本领域技术人员知道这种制剂可包含缓冲剂、赋形剂和其它非核酸组分。

在某些实施方式中，可通过，例如筛检制剂中存在的蛋白质活性(如果存在污染性核酸编码序列则存在这种活性)来定量测定该小环载体制剂的纯度。示范性的这类蛋白质包括单向位点特异性重组酶和细菌细胞的非内源性限制性内切核酸酶。因此，该小环载体制剂的纯度可通过筛检重组酶和/或限制性内切核酸酶的活性，与含有已知量污染性核酸的对照品以及缺乏污染性核酸的阴性对照品相比较来定量测定。在这类实施方式中，所述小环载体制剂产生的活性低于对照制剂，即用常规细菌细胞产生的或用本领域已知方法产生的小环对照制剂至少1.5倍，包括活性低于所述对照约2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍或更低。或者，可用例如PCR等方法检测的污染性重组酶和内切核酸酶序列的存在。

本发明的一个特征是本文所述用于制备基本上没有污染性核酸的小环载体制剂的方法和细胞系，所述污染性核酸序列包括但不限于：真核质粒骨架序列、编码单向位点特异性重组酶如PhiC31的核酸序列、和编码限制性内切核酸酶如ISce1的核酸序列。本发明最显著的特征是制备的小环载体完全没有编码单向位点特异性重组酶如PhiC31的环形核酸序列和编码限制性内切核酸酶如ISce1的核酸序列。因为它们在物理性质上类似于小环载体，这些环形污染物比线性污染物更难去除。所述单向位点特异性重组酶和限制性酶可能损害靶细胞的基因组DNA。污染性核酸包括线性核酸片段和环形核酸。

一般而言，用经遗传修饰的细菌制备本发明的小环核酸载体制剂，所述细菌能有效表达(i)单向位点特异性重组酶和(ii)该细菌细胞非内源性的限制性内切核酸酶中的一种或二种。这些DNA修饰组分可由一种表达载体编码和/或由基因组整合表达盒编码，在小环亲代质粒产生该小环载体期间可由基本上所有的细菌细胞表达，这样可确保产生小环载体并完全破坏亲代质粒骨架。

如下文更详细所述，在某些实施方式中，遗传修饰的细菌包含在组成型启动子调控下的L-阿拉伯糖转运蛋白araE基因的一个或多个基因组整合编码序列和缺乏功能性内切核酸酶1表达。在这类实施方式中，细胞组成型表达L-阿拉伯糖转运蛋白使得能够将L-阿拉伯糖(当将其加入到细胞培养液中时)有效转运到所有的细胞内。由于这种有效的底物转运，在对L-阿拉伯糖起反应的诱导型启动子如araC-BAD启动子调控下，编码序列可在基本上所有的培养细胞中连续、均匀和高水平地产生所编码的蛋白质。

本发明方法采用这种遗传修饰的细菌提供了多种优点。(1)可确保含有在诱导型启动子如araC-BAD启动子调控下的编码单向位点特异性重组酶和限制性内切核酸酶染色体外载体和/或基因组整合表达盒的基本上所有的细菌，能够由拷贝数有限的基因充分表达。(2)可确保在所有细胞中完成重组酶介导的attb与attP之间的重组和随后形成小环载体。因此，完成该制备过程时，小环载体制剂将基本上没有由于重组酶在至少一小群培养菌中表达不足而导致的未重组亲代质粒残留。(3)可确保在质粒骨架DNA破坏期，所有培养的细菌中质粒骨架细菌DNA环和残留的未重组亲代质粒被切开，如此保证了小环载体制剂为基本纯形式。(4)最后，可用较低浓度的L-阿拉伯糖来激活在阿拉伯糖诱导型启动子调控下的重组酶和/或限制性内切核酸酶的表达，从而提供了降低试剂费用、促进该方法扩大规模生产出大量小环载体制剂的额外优点。

在某些实施方式中，所述遗传修饰的细菌包含：非该菌内源性的限制性内切核酸酶的基因组整合编码序列，在组成型启动子调控下的L-阿拉伯糖转运蛋白araE基因的基因组整合编码序列，和缺乏功能性内切核酸酶1表达。在其它实施方式中，所述遗传修饰的细菌包含：非该菌内源性的限制性内切核酸酶和单向位点特异性重组酶的基因组整合编码序列，在组成型启动子调控下的L-阿拉伯糖转运蛋白araE基因的基因组整合编码序列，和缺乏功能性内切核酸酶1表达。在包含限制性内切核酸酶和/或单向位点特异性重组酶(总称为“所述酶”)编码序列的这类实施方式中，不将所述酶的编码序列引入细菌中单独存在的环形染色体外表达载体中。由于所述酶的编码序列整合在基因组中，完全防止了所述限制性内切核酸酶和/或单向位点特异性重组酶的编码核酸序列作为污染性环形核酸存在于该小环载体制剂中的机会。

至关重要的是应注意，当编码所述酶的核酸序列整合于基因组中时，由于纯化小环载体期间基因组被剪切它们仍然可能存在于纯化过程中。然而，采用常规纯化方法不难使细菌染色体的线性DNA片段与小环载体分离，相反地环形核酸则更难与小环载体分离。

通过整合编码单向位点特异性重组酶如PhiC31和/或限制性内切核酸酶如ISce1的核酸序列，除组成型表达L-阿拉伯糖转运蛋白外，这种遗传修饰的细菌提供的不仅仅是确保基本上所有的培养菌以有效方式从亲代质粒形成小环载体，而且有利地确保了所述酶的编码序列不会污染最终的小环载体制剂。可将多个拷贝的单向位点特异性重组酶编码核酸序列整合在基因组中。

遗传修饰细菌细胞的应用

在某些实施方式中，用包含在组成型启动子调控下的L-阿拉伯糖转运蛋白araE基因的一个或多个基因组整合编码序列和缺乏功能性内切核酸酶1表达的遗传修饰细菌产生小环载体。如上所述，在这类实施方式中，组成型表达L-阿拉伯糖转运蛋白能有效将L-阿拉伯糖转运给所有细胞。任选地，也可使细菌细胞组成型表达第二代L-阿拉伯糖转运蛋白。第二代L-阿拉伯糖转运蛋白的一个例子是突变LacY蛋白；突变赋予了产生的该LacY A177C具有其野生型蛋白没有的L-阿拉伯糖转运功能(Morgan-Kiss RM等，PNAS 99：7373，2002)。结果，将基因置于对L-阿拉伯糖起反应的诱导型启动子如BAD启动子调控下，就能使基本上所有的培养细胞连续均匀和高水平地有效产生编码的蛋白质。

可用包含至少一个侧接(单向位点特异性重组酶识别的)attB和attP位点的感兴趣多核苷酸、至少一个非该细菌内源性的限制性内切核酸酶(例如罕见切割性的限制性内切核酸酶ISce1)识别的限制性位点、和亲代质粒在宿主菌中增殖维持所需序列(例如复制起点和任选的编码可选择标记的核酸序列)的亲代质粒来产生小环载体(图6A)。此外，所述亲代质粒可包含编码阻抑蛋白araC(在非诱导条件下可阻止受BAD启动子调控的核酸序列表达)的核酸序列。可在亲代质粒中或细菌细胞中提供所述单向位点特异性重组酶的编码序列及所述限制性内切核酸酶的编码序列。

本领域技术人员将会理解，各种限制性内切核酸酶均可用于本文所述的方法和组合物，要求是该限制性内切核酸酶不是所述细菌细胞的内源性酶。在某些实施方式中，所述限制性内切核酸酶是罕见切割性的限制性内切核酸酶，包括但不限于：NotI、SfiI、NruI、MluI、SacII、SdaI、BssHII、I-TliI、I-CeuI、I-PpoI、I-SceI、I-PspI和P1-Sce1。在某些实施方式中，所述限制性内切核酸酶是I-SceI。

为产生小环载体，用亲代质粒转化遗传修饰的细菌细胞并培养该细胞至所需密度。然后提供条件诱导或使重组酶表达。当亲代质粒与重组酶接触时，attB与attP位点发生重组。该重组的二种产物是包含感兴趣序列和杂交重组位点的小环载体；和包含亲代质粒原核骨架序列、至少一个限制性内切核酸酶位点和杂交重组位点如attL位点或attR位点的质粒骨架环(图6E)。例如，在包含attR位点的小环核酸载体的实施方式中，所述质粒骨架环将包含attL位点。在包含attL位点的小环核酸载体的实施方式中，所述质粒骨架环将包含attR位点。当在亲代质粒中提供重组酶和限制性内切核酸酶的编码序列时，这些序列将包含在质粒骨架环中。

在用单向位点特异性重组酶重组attB和attP位点后，改变细菌培养条件以优化限制性内切核酸酶的活性。质粒骨架中的细菌DNA序列环和残留的亲代质粒被限制性内切核酸酶在限制性位点处消化，然后被细菌的内源性外切核酸酶降解。由于所述小环核酸载体均是游离型的环形DNA，如同标准的质粒，可用常规的商品化可得方法，如亲和柱层析法从细菌中分离得到。如此，该小环载体将不会含有可能干扰其用于治疗、诊断、预防或研究应用的质粒骨架环及未重组的亲代质粒。

在其它实施方式中，用细菌细胞产生的小环载体，除包含在组成型启动子调控下的L-阿拉伯糖转运蛋白araE基因编码序列和缺乏功能性内切核酸酶1表达外，将包含非该细菌细胞内源性的基因组整合的限制性内切核酸酶(如罕见切割性的限制性内切核酸酶ISce1)编码序列。在这类实施方式中，亲代质粒如上所述，但不包含非该细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶编码序列。其制备方法如上所述，重组后限制性内切核酸酶的编码序列存在于细菌染色体中而不在质粒骨架环中。

此系统的好处是，细菌细胞中可能污染小环核酸载体制剂的非细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶编码序列不在染色体外环形载体中。相反，当收集小环核酸载体制剂时，限制性内切核酸酶的编码序列作为整合在基因组中的元件仍留在菌体中或为线型片段。如果存在于制剂中的该序列为线型DNA片段，易与小环载体物理区分。因此，即使有污染也不难用常规纯化方法去除这种线性DNA片段。例如可用λ外切核酸酶选择性消化线性DNA片段而不损伤小环载体。

在另一种实施方式中，用于产生小环载体的细菌细胞，除包含在组成型启动子调控下的L-阿拉伯糖转运蛋白araE基因编码序列和缺乏功能性内切核酸酶1表达外，将包含整合在基因组中的单向位点特异性重组酶(如

C31整合酶)和非该细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶(如罕见切割性的限制性内切核酸酶ISce1)的编码序列。其制备方法如上所述，重组后限制性内切核酸酶和重组酶的编码序列存在于细菌染色体中而不在质粒骨架环中。

此系统的好处是，细菌细胞中可能污染小环核酸载体制剂的单向位点特异性重组酶和非细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶编码序列不存在于染色体外载体中。

调节性启动子

在某些实施方式中，将单向位点特异性重组酶和限制性内切核酸酶的编码序列置于诱导型启动子的控制下，只有当诱导该启动子，如L-阿拉伯糖反应性诱导型启动子araC-BAD时才表达编码序列。在这类实施方式中，细菌细胞不组成性表达单向位点特异性重组酶和限制性内切核酸酶。而是只有激活该诱导型启动子时才表达单向位点特异性重组酶和限制性内切核酸酶。可将多个拷贝的单向位点特异性重组酶编码序列整合入基因组中。

在某些实施方式中，将单向位点特异性重组酶和限制性内切核酸酶的编码核酸序列置于二种不同的诱导型启动子控制下。在这类实施方式中，将单向位点特异性重组酶置于第一种诱导型启动子控制下，将限制性内切核酸酶置于第二种诱导型启动子控制下。这二种不同的诱导型启动子可使单向位点特异性重组酶与限制性内切核酸酶顺次表达。例如，可先表达单向位点特异性重组酶以使亲代质粒中的attB和attP位点重组而产生小环核酸载体，然后表达限制性内切核酸酶以消化质粒骨架环。

只在某些可控制的条件下，调节性启动子(即去阻遏型或诱导型)才表达感兴趣的基因。去阻遏型元件是与启动子一起作用结合阻遏蛋白的DNA序列元件(如大肠杆菌中的lacO/lacIq阻遏系统)。诱导型元件是与启动子一起作用结合诱导蛋白的DNA序列元件(如酵母菌中的gal1/gal4诱导系统)。这二个例子中，转录实际上被“关闭”直到通过改变环境条件(如在lacO/lacIq系统中加入IPTG或在gal1/gal4系统中加入半乳糖)来去阻遏或诱导所述启动子才“打开”转录。

另一种类型的调节性启动子是“阻抑型”启动子，可通过改变环境条件关闭起初的基因表达。在阻抑型系统中，进行组成性转录直到阻抑蛋白结合小的调节分子时才“关闭”转录。此型启动子的一个例子是四环素/四环素阻抑蛋白系统。当此系统中四环素与四环素阻抑蛋白结合时，该阻抑蛋白通过结合启动子中的DNA元件而关闭基因表达。

诱导型真核启动子的例子包括：噬菌体的主要右侧和左侧启动子(PL和PR)；大肠杆菌的trp、recA、lacZ、AraC和gal启动子；枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶启动子(Ulmanen Ett等，J.Bacteriol.162：176-182，1985)和σ-28-特异性启动子(Gilman等，Gene sequence 32：11-20(1984))；芽孢杆菌噬菌体的启动子(Gryczan，刊登于“芽孢杆菌的分子生物学”(The Molecular Biology of the Bacilli)Academic Press，Inc，NY(1982))；链霉菌启动子(Ward等，Mol.Gen.Genet.203：468-478，1986)等等。示范性的真核启动子的综述可参见Glick(J.Ind.Microtiot.1：277-282，1987)、Cenatiempo(Biochimie 68：505-516，1986)和Gottesman(Ann.Rev.Genet.18：415-442，1984)。

单向位点特异性重组酶

已报导了噬菌体和单细胞酵母菌的二种重要的单向位点特异性重组酶家族：整合酶或酪氨酸重组酶家族，包括Cre、Flp、R和λ整合酶(Argos等，EMBOJ.5：433-440，(1986))；和解离酶/转化酶或丝氨酸重组酶家族，包括某些噬菌体整合酶，如噬菌体

C31、R4和TP901-1的整合酶(Hallet和Sherratt，FEMSMicrobiol.Rev.21：157-178(1997))。

在某些实施方式中，单向位点特异性重组酶是丝氨酸整合酶。可用于体外和体内重组的丝氨酸整合酶包括但不限于：噬菌体

C31、R4、TP901-1、phiBT1、Bxb1、RV-1、A118、U153和phiFC1的整合酶，以及大丝氨酸整合酶家族中的其它整合酶(Gregory，Till和Smith，J.Bacteriol，185：5320-5323(2003)；Groth和Calos，J.Mol.Biol.335：667-678(2004)；Groth等，PNAS97：5995-6000(2000)；Olivares，Hollis和Calos，Gene 278：167-176(2001)；Smith和Thorpe，Molec.Microbiol.，4：122-129(2002)；Stoll，Ginsberg和Calos，J.Bacteriol.，184：3657-3663(2002))。

一般而言，将细菌基因组中位点特异性重组酶识别的特异性重组位点设计为细菌附着位点(″attB″)，将噬菌体中相应的特异性重组位点设计为噬菌体附着位点(″attP″)。这些位点长度很短约34-40个碱基对(bp)Groth，A.C等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，5995-6000(2000))。这些位点通常如下安排：AttB包含第一DNA序列attB5′、核心区和第二DNA序列attB3′，相对顺序为attB5′-核心区-attB3′；attP包含第一DNA序列(attP5′)、核心区和第二DNA序列(attP3′)，相对顺序为attP5′-核心区-attP3′。

例如，对于噬菌体

C31 attP(噬菌体附着位点)，所述核心区是5′-TTG-3′，其二侧的序列是attP5′和attP3′，因此attP重组位点的结构是attP5′-TTG-attP3′。相应地，对于细菌基因组的天然靶位点，所述核心区是5′-TTG-3′，其二侧的序列是attB5′和attB3′，因此attB重组位点的结构是attB5′-TTG-attB3′。

因为attB与attP位点的序列不同，重组导致产生二个杂交的位点特异性重组位点(左侧和右侧命名为attL或attR)，此attB序列或attP序列在功能上不能被有关的单向位点特异性重组酶识别为特异性重组位点，因此排除了单向位点特异性重组酶催化attL与attR之间的二次重组反应(从而逆转第一次重组反应)的可能性。例如，

C31整合酶介导的单一位点特异性重组发生后，产生了以下重组产物：attB5′-TTG-attP3′{

C31载体序列}attP5′-TTG-attB3′。通常在重组后，重组后的重组位点不再能作为C31重组酶的底物，因为所用的细菌菌株不表达逆向反应所需的解离酶或辅因子。结果，重组反应可继续直到完成，产生小环核酸，更重要的是，产生的小环核酸是包含转基因表达盒单体的单一群体，这是体内基因递送和表达的最优结构。

小环产生细胞

本发明也提供本发明方法所用的细菌细胞。在某些实施方式中，所述细胞包含有基因组整合的多核苷酸盒，此盒包含驱使L-阿拉伯糖转运蛋白araE基因表达的组成型启动子和endA基因中的基因突变，此突变导致修饰的细菌不能表达功能性内切核酸酶1。在这类实施方式中，所述基因突变可以是endA基因中导致基因敲除或产生无功能endA的任何突变。所述遗传修饰可以是endA编码序列中的缺失、倒置或插入，从而导致产生无功能的内切核酸酶1。因而在细菌中存在无功能内切核酸酶1)。

在本发明的其它实施方式中，修饰小环核酸产生细胞以组成性表达LacYA177C突变体。这种乳糖转运蛋白的LacY A177C突变体获得了作为L-阿拉伯糖转运蛋白的额外功能，细菌亚群中表达该突变体的细胞克服了对L-阿拉伯糖的耐受性(即全或无现象)。

在其它实施方式中，所述遗传修饰的细菌包含非该细菌内源性的限制性内切核酸酶(如罕见切割性的限制性内切核酸酶ISce1)的基因组整合编码序列。在还有其它实施方式中，所述遗传修饰的细菌包含单向位点特异性重组酶如

C31整合酶，以及非该细菌内源性的限制性内切核酸酶(如罕见切割性的限制性内切核酸酶ISce1)的基因组整合编码序列。

在某些实施方式中，编码单向位点特异性重组酶和限制性内切核酸酶的核酸序列处在诱导型启动子控制下。在这类实施方式中，细菌细胞不组成性表达单向位点特异性重组酶和限制性内切核酸酶。而是，只有当激活了该诱导型启动子时才表达单向位点特异性重组酶和限制性内切核酸酶。

在某些实施方式中，编码单向位点特异性重组酶和限制性内切核酸酶的核酸序列处在二种不同的诱导型启动子控制下。在这类实施方式中，单向位点特异性重组酶处在第一种诱导型启动子的控制下，限制性内切核酸酶处在第二种诱导型启动子的控制下。这二种不同诱导型启动子得以顺序表达单向位点特异性重组酶和限制性内切核酸酶。

如上所述，此系统的优点是，当与小环核酸载体一起分离时，非细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶和任选的单向位点特异性重组酶的编码序列不是存在于细菌细胞中的染色体外载体而难以去除。相反，只要非细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶和任选的单向位点特异性重组酶的编码序列作为整合在基因组中的元件，当收集小环核酸载体时此编码序列仍留在菌体内，或作为线性DNA片段用常规纯化方法不难与小环核酸载体分离。

含能指导外源蛋白高水平表达的调控序列的细菌表达系统和表达载体是本领域技术人员熟知的。可利用任何一种这样的系统来构建在细菌中表达单向位点特异性重组酶和限制性内切核酸酶的载体。然后通过转化和随后的基因组整合将这些载体引入细菌，以便高水平表达非内源性或外源性酶。

用于转化合适细菌宿主细胞的载体或表达盒是本领域熟知的。通常这种载体或表达盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、可选择性标记和自主复制或染色体整合序列。合适的载体包含控制转录起始的基因5’区和控制转录终止的3’区DNA片段。最优选此二控制区衍生自与被转化宿主细胞同源的基因，但应理解这种控制区不需要衍生自与所选的生产用宿主菌相同的特定种属的天然基因。

将构建物整合入宿主基因组中可实现稳定表达。可将所述构建物整合入宿主菌基因组中的随机位点，或通过利用含有宿主基因组中某基因座同源区的构建物靶向所选择的基因座。当将构建物靶向某内源基因座时，该内源基因座可提供所有的或某些转录调控区。通过利用表达构建物中的选择性标记，然后选择整合后表达该标记的细胞，可实现感兴趣基因的稳定表达。

小环DNA的给药

本发明方法可用于需要制备基本上没有污染性核酸的小环核酸制剂和将这种外源性小环核酸序列引入靶细胞内的各种应用，特别感兴趣的是需要在靶细胞中表达感兴趣的多核苷酸。如上所述，本发明的载体可通过体外或体内方法给予。

所述靶细胞可以是存在于体内或体外环境中，或存在于多细胞生物体中的单个细胞。因此，本发明引入小环核酸载体的方法可以是体内方法，此法意味通过全身或局部途径将外源核酸直接给予多细胞生物体内的特定组织或细胞，如将小环载体局部递送给肝细胞；或者是体外方法，即获取多细胞生物的靶细胞使之接触外源核酸。

如上所述，本发明的载体可用于多种靶细胞，在许多实施方式中，所述靶细胞不是细菌靶细胞，常常是真核靶细胞，包括但不限于植物和动物靶细胞，如昆虫细胞、脊椎动物细胞；特别是禽类细胞如鸡细胞；鱼类、两栖类和爬行类细胞；哺乳动物细胞包括小鼠、猪、羊、马、大鼠、有蹄动物、狗、猫、猴和人细胞等等。

在本发明的方法中，可采用任何常规方法将所述载体引入靶细胞。根据靶细胞所在部位，所述方法应能在体外或体内将所述载体引入靶细胞。例如，当靶细胞是分离的细胞时，可在靶细胞存活条件下用标准的转化技术将所述载体直接引入靶细胞内。这类技术包括但不限于：病毒感染、转化、偶联、原生质融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、病毒载体递送、采用纳米颗粒等等。方法的选择一般取决于要转化细胞的类型和进行转化的环境(即体外、离体或体内)。这些方法的综述可参见Ausubel等，《分子生物学简明方案》(Short Protocols in Molecular Biology)，第3版，韦利森出版社，1995。

或者，当靶细胞是多细胞生物体内的细胞时，将靶向载体给予该生物体或宿主的方式应能使该靶向构建物进入靶细胞内，例如通过体内或离体方式。“体内”指将靶构建物给予动物的活机体。“离体”指在体外修饰细胞或器官，然后将这种细胞或器官返回给活机体。给予核酸构建物的方法是本领域熟知的，包括Bharali等.，“有机修饰的二氧化硅纳米颗粒：一种用于体内基因递送和脑内表达的非病毒载体”(Organically Modified Silica Nanoparticles：ANonviral Vector for In Vivo Gene Delivery and Expression in the Brain)PNAS102(32)：11539-44(2005)所述采用纳米颗粒。采用阳离子脂质(Goddard等，GeneTherapy，4：1231-1236，1997；Gorman等，Gene Therapy 4：983-992，1997；Chadwick等，Gene Therapy 4：937-942，1997；Gokhale等，Gene Therapy4：1289-1299，1997；Gao和Huang，Gene Therapy 2：710-722，1995)；采用病毒载体(Monahan等，Gene Therapy 4：40-49，1997；Onodera等，Blood 91：30-36，1998)；通过摄入“裸DNA”等递送核酸构建物。可用本领域熟知的细胞转化技术(参见以上所述)离体给予核酸构建物。可凭经验选择确切的制剂、给药途径和剂量(参见例如Fingl等，1975，“治疗方法的药理学基础”(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，第1章pl)。

给予多细胞生物所述载体的途径取决于多种参数，包括携带该系统组分的载体的性质、递送运载体的性质、多细胞生物体的性质等，给药方式的一种共同特征是通过全身途径将载体各组分递送给体内靶细胞。特别感兴趣的全身给药途径是血管途径，将所述载体引入宿主的血管途径，如动脉或静脉，许多实施方式特别感兴趣的是静脉给药途径。

可采用合适的递送运载体，这种递送运载体通常是药物制剂，包含有效量的置于药学上可接受运载体、稀释剂和/或佐剂中、或与纳米颗粒共价或非共价结合的所述核酸载体。在某些实施方式中，用水性递送运载体，如盐水给予所述核酸载体。例如，在许多实施方式中，采用水性递送运载体，如盐水，通过血管内，如动脉内或静脉内给予所述核酸载体。

在许多实施方式中，在能充分表达所述载体中的核酸条件下，以体内方式将所述核酸载体给予多细胞生物，引入靶细胞内。如以上所述，本发明方法的特征是与瞬时表达相反，可持久地表达所提供的核酸。持久表达意味着给予所述载体后，核酸的表达水平在长时间内(如果不是无限期的话)可持续检测到。长时间指至少1周，通常2个月，更长至少6个月。可检测水平指细胞和/或哺乳动物样品，如哺乳动物血清中所述核酸表达的编码蛋白质或非翻译性RNA水平与采用pBluescript载体的对照相比，可检测到治疗浓度的水平，或表达了预期的所需生物学效应的水平，与对照相比，采用所述方法表达核酸的持续时间至少多约2倍，通常至少多约5倍，更常多至少约10倍。

所述方法许多实施方式的一种特征是，不将小环核酸载体整合入宿主靶细胞的基因组中而可实现上述的持久表达。例如将小环核酸载体引入靶细胞内而不整合，即不插入靶细胞的基因组，即靶细胞的一个或多个染色体中。如此，所述载体维持于游离形式，它们是能持久表达的游离型载体。

本发明方法给予多细胞生物所述小环载体的具体剂量取决于载体的性质、表达模块和基因的性质、递送运载体的性质等。本领域技术人员不难凭经验确定剂量，例如在许多实施方式中以盐水溶液为运载体静脉注射给予小鼠该核酸载体时，核酸载体给药量范围约为2-100μg、通常约10-50μg。可用所述方法将各种大小的核酸引入靶细胞中。

在体内方法中，采用所述方法将核酸引入各种不同靶细胞中。感兴趣的靶细胞包括但不限于：肌肉、脑、内皮、肝细胞等。许多实施方式特别感兴趣的是用所述方法将核酸至少引入宿主的肝细胞内。

用途

本发明方法可用于制备核酸和将核酸引入所需靶细胞的各种应用。本发明载体和所用方法的应用包括：研究应用、多肽合成应用、RNA干扰应用和治疗应用。以下分别详述这些应用的各种范畴。

研究应用

用本发明方法产生的核酸在研究上的应用例子包括设计用于具体基因的特征鉴定。在这种应用中，采用本发明载体将感兴趣的基因引入靶细胞内并表达，观察插入的基因对细胞表型的作用。以此种方式，可推断基因的活性和其编码产物性质的相关信息。也可用本发明方法制备细胞过度表达和/或错误表达感兴趣基因的模型，观察这种突变体表达模型的效果。

多肽合成应用

除以上所述研究应用外，用本发明方法产生的核酸也可用于多肽，例如感兴趣蛋白质的合成。在这类应用中，将包含编码感兴趣多肽的小质粒载体连接所需和/或理想的表达调控序列如启动子等(即表达模块)，通过体内给予多细胞生物将其引入该生物的靶细胞(作为表达宿主细胞)内而表达该多肽。体内给予多细胞生物的宿主靶细胞后，维持在足以表达靶基因的条件下。然后收获所表达的蛋白质，需要时可用常规方法纯化。

如此，本发明方法至少能提高多细胞生物体的感兴趣蛋白质的表达量。术语“至少能提高”包括所用方法使多细胞生物体的某蛋白质表达量高于体内给予该载体之前该蛋白质起初表达量的情形。术语“至少能提高”还包括给予该载体前该多细胞生物体实际上不表达该蛋白质的情形。术语“至少能提高”指宿主中某具体蛋白质表达量至少提高了约2倍，通常至少约5倍，更常至少约10倍。由于本发明方法至少能提高多细胞生物的蛋白质表达量，故它们可用于各种不同的应用，包括农业应用、药物制备应用等，以及以下更详述的治疗应用。

RNA干扰应用

除上述蛋白质合成应用外，本发明方法制备的小环核酸载体也可用于RNA干扰应用，即小单链或双链RNA，包括shRNA、siRNA、RNA诱杀物、核酶或反义RNA等介导的序列特异性转录后基因表达沉默。在这类实施方式中，提供的感兴趣多核苷酸包含能表达非翻译性RNA产物的编码序列，例如以下文献McCaffery等，“成年小鼠中的RNA干扰”(RNA interference in adult mice)，Nature 418(6893)：38-9(2002)；Paskowitztf等，“快速稳定地敲除视网膜色素上皮中的内源基因”(Rapid and stable knockdown of an endogenous gene in retinal pigment epithelium)Hum Gene Ther.18(10)：871-80(2007)所述的shRNA；Lieber等，“通过腺病毒介导的核酶表达去除被感染的人肝细胞中的丙肝病毒RNA”(Elimination of hepatitis C virus RNA in infected human hepatocytes by adenovirus-mediated expression of ribozymes)J Virol(1996年12月)70(12)：8782-91；Lieber等，“腺病毒介导小鼠表达核酶相关文章”(Related Articles Adenovirus-mediated expression of ribozymes in mice)J Virol.(1996年5月)70(5)：3153-8；Tang等，“静脉注射AAV-载体包含的血管紧张素反义核酸降低了高血压”(Intravenous angiotensinogen antisense in AAV-based vectordecreases hypertension)Am J Physiol.(1999年12月)277(6Pt 2)：H2392-9；Horster等，“包含gfp-反义核酸/核酶融合序列的重组体AAV-2可监控转导、基因表达和显示抗HIV-1效力”(Recombinant AAV-2harboring gfp-antisense/ribozyme fusion sequences monitor transduction，gene expression，and show anti-HIV-1efficacy)Gene Ther.(1999年7月)6(7)：1231-8和Phillips等，“用无致病性腺相关病毒载体体内递送AT1-R mRNA反义核酸长时期降低了高血压”(Prolonged reduction of high blood pressure with an in vivo，nonpathogenic，adeno-associated viral vector delivery of AT 1-R mRNA antisense)Hypertension.(1997年1月)29(1Pt 2)：374-80所述的反义RNA。如此，可用本发明方法将治疗用非翻译性RNA分子，如shRNA、反义RNA等递送给宿主靶细胞。

治疗应用

本发明方法制备的核酸还可用于治疗应用，此时可利用该载体将治疗性核酸，如基因或非翻译性RNA(如shRNA)引入靶细胞中，即基因治疗应用，以提供持久表达该载体中核酸编码的产物。可利用本发明的载体递送各种各样的治疗性核酸，包括编码蛋白质或非翻译性RNA的核酸。感兴趣的治疗性核酸包括宿主靶细胞中缺陷基因(例如负责遗传缺陷疾病的基因)的替代基因，具有治疗癌症治疗用途的基因等。感兴趣的治疗性核酸还包括能介导序列特异性转录后靶细胞基因表达沉默的RNA，如双链RNA或shRNA的编码核酸序列。

用于治疗遗传缺陷疾病的具体治疗基因包括编码以下产物的基因：VIII因子、IX因子、β-球蛋白、低密度脂蛋白受体、腺苷脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、鞘磷脂酶、葡萄糖脑苷脂酶、囊性纤维化跨膜传导调节蛋白、α1抗胰蛋白酶、CD-18、鸟氨酸转氨酶、精氨琥珀酸合成酶、苯丙氨酸羟化酶、支链α-酮酸脱氢酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、葡萄糖6-磷酸酶、α-L-岩藻糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、α-L-艾杜苷酸酶、半乳糖1-磷酸盐尿苷酰转移酶等，采用的上述蛋白质具体编码序列通常是要治病宿主天然所有蛋白质的编码序列，即人的编码序列，用以治疗人类宿主。可用本发明方法递送的癌症治疗基因包括：能增强淋巴细胞抗肿瘤活性的基因、表达的产物能增强肿瘤细胞免疫原性的基因、肿瘤抑制基因、毒素基因、自杀基因、多药耐药基因、反义序列等等。

以上所述本发明方法的一个重要特征是，本发明方法可用于体内基因治疗应用。体内基因治疗应用指不需要从宿主机体取出表达治疗基因用的靶细胞然后使之接触所述载体系统。而是相反，可将本发明的载体直接给予多细胞生物体内让靶细胞摄取，然后由靶细胞表达。另一个重要特征是，无须使所述载体整合入靶细胞基因组中仍能持久表达。

药盒

本发明还提供一种药盒，用于实施本发明将制备的小环核酸递送给靶细胞的方法，以及将所述载体引入靶细胞的方法。

在一些实施方式中，本发明的药盒装有包含在组成型启动子调控下的L-阿拉伯糖转运蛋白araE基因的基因组整合编码序列和缺乏功能性内切核酸酶1表达的细菌细胞。在某些实施方式中，所述药盒装有这类细菌细胞，还装有包含供插入感兴趣多核苷酸的限制性内切核酸酶位点的小环亲代质粒，所述感兴趣的多核苷酸侧接单向位点特异性重组酶识别的attB和attP位点。此种亲代质粒还包含单向位点特异性重组酶的编码序列、非该细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶的编码序列和至少一个所编码限制性内切核酸酶识别的限制位点(以在重组反应后破坏质粒骨架环)。可用水性介质配制所述载体或冻干。

在一些实施方式中，本发明药盒中所装的细菌细胞，除了包含在组成型启动子调控下的L-阿拉伯糖转运蛋白araE基因的编码序列和缺乏功能性内切核酸酶1表达外，还包含非该细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶(例如罕见的切割性限制性内切核酸酶ISce1)的基因组整合编码序列。在某些实施方式中，本发明的药盒装有该细菌细胞和上述小环亲代质粒。

在一些实施方式中，本发明药盒中所装的细菌细胞，如以上详述，除了包含在组成型启动子调控下的L-阿拉伯糖转运蛋白araE基因的基因组整合编码序列和缺乏功能性内切核酸酶1表达外，还能表达单向位点特异性重组酶和非该细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶。在一些实施方式中，本发明药盒中所装的细菌细胞能表达在组成型启动子调控下的额外L-阿拉伯糖转运蛋白LacYA177C。在某些实施方式中，本发明药盒装有该细菌细胞和上述小环亲代质粒。

本发明药盒也可装有水性递送运载体，如缓冲盐水等。此外，药盒还可装有用于将感兴趣核酸转运入小环亲代质粒中的一种或多种限制性内切核酸酶，所述限制性内切酶与小环亲代质粒中的限制性内切酶位点相对应。在本发明的药盒中，可将上述组分组合成单一的水性组合物递送给宿主，或将不同组合物分装在不同容器中。该药盒任选还装有递送水性组合物给宿主的管状递送装置，如针筒等。这种递送装置可以预先或不预先装入所述水性组合物。

除上述组分外，本发明药盒还装有实施本发明方法的说明书。药盒中的这些说明书可有多种形式，其中一种或多种装在该药盒中。这些说明书的一种形式是印制在合适的介质或底材，如纸片上的信息，印制在药盒包装材料上的信息，或插入包装材料中。另一种方式是计算机可读媒体，如记录有信息的磁盘、光盘等。还有一种方式是利用网址通过因特网进入远程地址寻找这种信息。该药盒提供任何一种方便的方式。

实施例

给出以下实施例向本领域普通技术人员提供了完全的公开，并说明如何产生和使用本发明，不意味限制本发明人所认为的本发明范围，也不意味以下实验代表了所进行的所有的或唯一的实验。已努力确保所用数字(如含量，温度等)的准确性，但应理解可能有一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是重均分子量，温度单位是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。

材料和方法

质粒。如先前(Chen ZY等，Human Gene Therapy 16：126，2005)所述构建产生小环的质粒p2C31.hFIX(图1A)；而MC.hFIX(图1B)和质粒BB(图1C)是从该产生小环的质粒p2

C31.hFIX衍生的重组产物。我们通过去除质粒p2

C31.hFIX中的attB-hFIX-attP序列制备了可用于治疗的质粒p2

C31.ISce1g&s(图1D)。为制备质粒pKanR.endA(图1E)，我们用质粒pBK-CMV中的卡那霉素抗性基因取代p2

C31.hFIX中的hFIX盒，将attB-卡那霉素-attP序列重置于pBlueScript(Stratagene，La Jolla，CA)中，产生中间质粒pKanR；然后我们用endA特异性引物和Top10基因组DNA作模板，以PCR法产生上下游靶向序列，将它们分别插入到attB-和attP-位点外侧。通过将衍生自质粒p2

C31.hFIX(图1A)的串联的3拷贝BAD.ISce I盒插入到中间质粒pKanR的attB位点的上游，和用UMU基因特异性引物与ToP10基因组DNA进行PCR产生2个UMU-靶向序列，我们构建了p3BAD.ISce Ig.KanR.UMU质粒(图1F)。

通过将8个相连的ISec 1限制性位点(每个由一对DNA寡聚物编码)插入到pBlueScript的Kpn I位点，我们制备了质粒p8ISce Is(图1G)。质粒pcI857.FLP和-pBAD.RED为耶鲁大学Wanner BL博士(PNAS 97：6640，2000)所赠。

C31，链霉菌噬菌体重组酶基因；hFIX，人血凝蛋白IX因子；attB，细菌附着序列；attP，噬菌体附着序列；attR和attL，分别为右侧和左侧杂交序列；ISce Ig，限制性酶ISce I的编码基因；ISce Is，ISceI限制性位点；sApoE，(Miao等，Mol Ther 1：522，2000)先前详述的人造增强子/启动子；AmpR，氨苄青霉素抗性基因；UC，pUC质粒复制起点；BDA，BAD启动子；araC，araC阻抑基因；L-arab，L-阿拉伯糖。

工程改造细菌。我们从加州大学伯克利分校的Keasling JD博士获得细菌菌株BW27783(Khlebnikov A等，Microbiology 147：3241，2001)。为制备中间菌株BWΔendA.KanR(图3A)，我们通过Pme 1消化由质粒pKanR.endA(图1E)制备endA-靶向DNA片段；我们将其插入到BW27783中的endA基因座中，按照Datsenko KA和Wanner BL(PNAS 97：6640，2000)的方案纠正质粒pBAD.RED。然后我们用基因特异性引物进行二次PCR反应，发现由该新菌株基因组得到的PCR产物具有预计大小，提示已靶向整合了该抗生素抗性基因(图3B)。为去除BWΔendA.KanR中的卡那霉素抗性基因，我们用质粒p2

C31.ISce 1g&s转化菌株BWΔendA.KanR后，取菌落接种含1％L-阿拉伯糖的LB肉汤，30℃培养4小时，然后在加或不加抗生素的琼脂平板上培养细菌菌落，选出氨苄青霉素和卡那霉素敏感菌落(图3A)。

为测定内切核酸酶1是否已灭活，我们用质粒p2

C31.hFIX转化所得菌株BWΔendA，用标准方法产生小环，发现这种小环是完整的，进一步证实已删除了endA基因(图3C)。采用由质粒p3BAD.ISce I.KanR.UMU产生的靶向DNA(图1F)，按同一方法，我们将串联的3拷贝BAD.ISce 1基因插入到菌株BWΔendA的基因组中，产生新菌株BWΔendA.3ISce 1g。

小环产生方法。按照Chen等，Human Gene Therapy 16：126，2005所述，我们制备了小环。简言之，我们用p2

C31.hFIX转化Top 10或其它菌株，在LB中培养细菌菌落。我们离心沉淀培养过夜的细菌，用含1％L-阿拉伯糖的新鲜LB按4∶1(培养过夜的细菌体积与新鲜肉汤之比)重悬，30℃下250rpm摇动培养2小时。然后加入一半体积的含1％L-阿拉伯糖的新鲜LB肉汤(pH8.0)，37℃再培养2小时以诱导表达。用凯杰(Qiagen)质粒纯化试剂盒(加州瓦伦西亚的凯杰公司(Qiagen，Valencia，CA))分离细菌产生的小环MC.FIX。

实施例1

降低来自BW27783的小环制剂中的杂质DNA

在我们的最初方案中，采用小环产生质粒如p2

C31.hFIX(图1A)和Top 10菌株来产生小环(Chen ZY等，Human Gene Therapy 16：126，2005)。然而在我们的小环制剂中，我们检测到小量但可变化的杂质DNA，其包含未重组的亲代质粒和质粒骨架环(质粒BB)。我们觉察到这种杂质DNA主要源自“全或无”现象：即某细菌亚群变得不能表达高负载、低亲和力的L-阿拉伯糖转运蛋白araE，并且不能吸收L-阿拉伯糖和在araC-ABD调控系统控制下表达

C31和ISce I基因。Khlebnikov A及其同事(Microbiology 147：3241，2001)报道可用组成型启动子cp8驱动菌株BW27783表达araE部分克服了此“全或无”现象。为尝试解决此种杂质DNA问题，我们用同样的cp8启动子代替天然启动子驱使Top10菌株表达araE。小环产量或污染没有改变也许是由于未正确插入该DNA序列。

此外，我们用从加州大学伯克利分校的Keasling博士获得的BW27783菌株代替Top10制备小环，发现该菌株产生的小环用琼脂凝胶电泳检测不含可测见的杂质DNA，当培养反应液中的arac-pBAD诱导剂L-阿拉伯糖浓度低至0.001％(比Top10菌株低1,000倍)时实现了这个目标(图2A)。出乎意料的是，我们发现小环DNA有不同程度的降解(图2B)。

实施例2

去除ENDA基因克服了DNA降解问题

由于已知recA会影响质粒的稳定性(Khlebnikov A等，J Bacteriol 182：7029，2000)，我们灭活了BW27783中的recA基因，但发现这没有帮助(资料未显示)，感觉这是内切核酸酶1引起的。我们着手删除编码这种破坏DNA酶的endA基因。为此，我们制备了含有侧接attB和attP位点的卡那霉素抗性基因和两个PCR产生的endA基因靶向序列的质粒pkanR.endA(图1E)；按照Datsenko KA和Wanner BL(PNAS 97：6640，2000)的方案加以修饰，用Pme 1切割该质粒得到线性靶向DNA序列后将其整合于BW27783的endA基因(图3A)。按所提出方案采用2条35-bp靶向序列的第一次尝试失败(资料未显示)；然而后来通过分别延长该靶向序列至329-和754-bp我们获得了成功。采用卡那霉素抗性基因和endA特异性引物作PCR，在4个得到的细菌菌落中有3个检测到整合的DNA(图3B)。我们用质粒p2

C31.ISce 1g&s表达

C31重组酶介导attB与attP之间的重组从而去除卡那霉素抗性基因，获得菌株BWΔendA(图3A).

然后，我们用BWΔendA菌株和p2C31.hFIX(图1A)制备小环，发现该小环完整(图3C)。意外地是，我们发现该小环制剂中有微量杂质DNA，而用亲代菌株BW27783制备的小环制剂未见此种杂质(图2A)。我们假设此微量杂质DNA来源于死亡细菌；或者来源于未完全消除Morgan-Kiss及其同事(PNAS99：7373，2002)提出的“全或无”现象。这些作者发现乳糖转运蛋白突变体LacYA177C获得了作为L-阿拉伯糖转运蛋白的额外功能，表达此突变体能完全消除此“全或无”现象。因此，我们从耶鲁大学Cronan JE博士获得突变体LacYA177C基因，将其置于乳糖苷酶基因(bla)的组成型启动子控制下，用其替代中间菌株基因组中的野生型LacY基因(图7B；图9A-D)。

实施例3

表达细菌基因组中的ISCE I基因

我们假设制备无

C31-和ISce I-编码DNA的小环的最佳方法是由细菌基因组表达重组酶

C31和限制酶ISce 1。我们假设任何培养物中都有死亡细菌因此污染不可避免，这些杂质DNA可引起更多危害，因为它们是环形稳定的、物理上不能与所述小环相区别而难以去除。相反，将C31和ISce I整合入细菌基因组中时，作为细菌基因组线性DNA碎片，这些有危害的基因污染机会少且更易清除，可被宿主菌外切核酸酶降解，对接受治疗者无害或影响很小。因此，我们着手将小环产生质粒中的BAD.ISce I盒重新置于细菌基因组中。

为此，我们制备了质粒p3BAD.ISCe Ig.KanR.UMU，其含有串联的3拷贝BAD.ISce I盒和2个PCR产生的细菌UMU基因座靶向序列，其侧接3BAD.ISce1.attB-kanR-attP盒(图1F)。按照以上所述相同方法灭活endA基因，成功地将ISce 1基因整合入BWΔendA基因组中，获得菌株BWΔendA.3ISce 1(图4A)。同样，用该基因特异性引物作PCR测到ISce 1基因(图4B)。为测定该整合的ISce I基因是否具有功能，我们用含8个相连的ISce I限制位点的质粒p8ISce 1转染新的细菌菌株(图1G)，发现诱导ISce 1酶表达4小时后该质粒几乎完全消失，但不表达ISce I时该质粒保持完整(图4C)。我们发现基因组ISce 1基因在小环生产设施中工作良好，下文将更详细叙述(图5B和C)。

实施例4

基因组ISCE 1基因在小环制备设置中的功能

在以上章节中，我们证明了整合的3拷贝BAD.ISce 1基因功能是破坏含8个ISce 1限制性位点的质粒。在此，我们进一步证明在现行小环制备设置中用新的菌株同样能去除杂质DNA。我们用新菌株进行了二次制备小环的实验。第一次实验，我们采用了含2.3-kb RSV.hAAT.bpA盒和1拷贝BAD.

C31基因，和分别含8个或32个或64个相连ISec1位点的三种亲代质粒(图5A)。用先前Chen等，Hum Gene Ther 16：126，2005所述的常规方法以这些质粒转化菌株BWΔendA.3ISce 1并制备小环。用有限的小环制剂作琼脂糖凝胶电泳估计杂质DNA含量，发现在这三种小环制剂中几乎看不到杂质(图5B)。第二次实验，我们采用相似的小环产生质粒(质粒骨架中编码4.2-kb表达盒和32个ISce1位点)，发现几乎看不见污染的DNA(图5C)。因此，整合的ISce 1基因与多个这种位点协同工作良好。

实施例5

将多个拷贝的

C31基因插入BWΔENDA.3ISCE IG的基因组中

由于小环制剂中的

C31和ISce 1基因有可能危害接受治疗者的基因组，从小环制剂中彻底去除它们是临床级载体DNA的重要安全评判标准。为此，整合3拷贝ISceI基因之后，我们重新将质粒细菌骨架序列中的C31基因安置在细菌基因组中。期望小环制剂中污染的

C31和ISce 1基因只由细菌基因组线性DNA碎片编码，可用物理方法与小环区分开。具体说，采用多种商品化可购得的生物学试剂或物理方法更易去除这种线性DNA。例如，可采用λ外切核酸酶破碎这种线性DNA而不会损伤小环DNA制剂，得到无

C31和ISce基因的小环产品。

将3拷贝的BAD.ISce 1盒整合入细菌基因组中，发现其正确地发挥了功能(图5B和C)。我们进行了实验，将6个拷贝的BAD.

C31整合入菌株BWΔendA.3ISce 1的基因组中。图7B显示包含我们已制备和将要制备的所有遗传改变的最终细菌基因组，可用此菌株来制备无

C31和ISce编码序列的临床级小环载体。

图8A-8C显示BAD.

C31基因的整合。图A显示先前制备的菌株D8(BWΔendA.3ISce 1)ΔendA基因座中靶向attB位点的整合(图3和4)。如前文所述我们用Pme1消化前体质粒制备了含attB序列的线性DNA，通过RED酶介导将其整合入ΔendA基因座(图3A)。然后，通过质粒pcI857.FLP表达的翻转酶(43℃培养细菌8小时诱导翻转酶表达同时破坏该质粒)介导2个FPT序列之间的重组，去除整合子中的卡那霉素抗性(KanR)基因。结果，我们获得了含修饰的ΔendA基因座(其含FRT和attB位点)的菌株D8FRTII。图B显示2拷贝BAD.

C31基因的整合。我们用质粒p2

C31转染菌株D8FRTII并诱导表达

C31酶，通过attB与attP之间的重组介导随后转染的质粒p2C31.R6KFRT整合入endA基因座；通过基因组内切核酸酶基因表达的ISce1限制性消化破坏质粒p2

C31；然后如上所述通过2个FRT位点之间的重组去除整合子中的R6K.KanR序列(图8A)。我们在该整合质粒中使用DNA(复制)起点R6K，因为R6K需要蛋白pi才有功能，并且只有在pi-表达菌株如PIR1(加州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen，Carlsbad CA))中才能支持质粒复制，但在pi-阴性D8FRTII菌株中不能支持质粒复制；此特征可确保只选出含整合而非游离型的质粒p2

C31.R6KFRT中编码的抗生素抗性基因(KanR)的菌落。图C显示该整合子的PCR证据。

采用紧靠engA基因座外侧的一对引物进行PCR反应；泳道1和2是用CC2

C31菌株克隆1和3的基因组DNA作模板产生的PCR反应产物，而泳道3是用菌株D8FRTII产生的PCR反应产物；PCR1(7.5-kb)和2(2.5-KB)是各自反应的预期产物。图D显示CC2C31菌株克隆1和3产生的小环(MC，约2.5-kb)。该亲代质粒pattB.RHB.attP.ISce 1sx32编码与图5A所示亲代质粒相同的RHB转基因和32个ISce 1位点，但不含BAD.

C31基因。用Chen等，Humn Gene Ther 16：126，2005先前所述的标准方法产生小环；用Xba I加BamH1限制性消化该DNA然后电泳。

以上只是阐述了本发明的原理，本领域技术人员应理解，虽然本文没有清楚地描述或显示，但可设计不同的安排使本发明的原理具体化，这些均包括在本发明的思路和范围内。另外，本文引用的所有例子和假定的措词主要目的是帮助读者理解本发明的原理和发明人的概念以促进该技术，不应理解为本发明限制于专门引用的实施例和条件。而且，本发明陈述的所有原理、方面的内容和实施方式以及具体的实施例包括其结构和功能的等同物。此外，这类等同物包括目前已知的和将来开发的等同物，即开发的、不论结构如何，凡能执行相同功能的任何元件。因此，本发明的范围不限于本文所示和描述的典型实施方式，而是由附件权利要求书具体化本发明的范围和思路。

Claims (55)

1.一种小环核酸载体制剂，其包含：

含有感兴趣多核苷酸和单向位点特异性重组酶的产物杂交序列的小环核酸载体，限制性条件是该小环核酸载体没有质粒骨架DNA序列；

和药学上可接受的赋形剂，

该制剂中基本上没有污染性核酸。

2.如权利要求1所述的小环核酸载体制剂，其特征在于，所述污染性核酸包括线性核酸片段。

3.如权利要求1所述的小环核酸载体制剂，其特征在于，所述污染性核酸包括环形核酸序列。

4.如权利要求1所述的小环核酸载体制剂，其特征在于，所述污染性核酸包括单向位点特异性重组酶的编码核酸序列。

5.如权利要求1所述的小环核酸载体制剂，其特征在于，所述污染性核酸包括限制性内切核酸酶的编码核酸序列。

6.如权利要求1所述的小环核酸载体制剂，其特征在于，所述单向位点特异性重组酶的产物杂交序列是attL或attR。

7.如权利要求1所述的小环核酸载体制剂，其特征在于，所述感兴趣的多核苷酸包含表达盒。

8.如权利要求7所述的小环核酸载体制剂，其特征在于，所述表达盒编码多肽。

9.如权利要求7所述的小环核酸载体制剂，其特征在于，所述表达盒编码非翻译性核糖核酸。

10.如权利要求9所述的小环核酸载体制剂，其特征在于，所述非翻译性核糖核酸是短发夹核糖核酸(shRNA)。

11.如权利要求9所述的小环核酸载体制剂，其特征在于，所述非翻译性核糖核酸是双链或单链核糖核酸。

12.如权利要求1所述的小环核酸载体制剂，其特征在于，所述小环核酸载体的长度范围为约100bp-10kb。

13.一种制备基本上没有污染性核酸的小环核酸载体组合物的方法，该方法包括：

用包含(i)侧接单向位点特异性重组酶所识别的attB和attP重组位点的感兴趣多核苷酸；(ii)至少一个非所用细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶识别的限制性内切酶位点的环形亲代质粒，转染经遗传修饰缺乏功能性内切核酸酶1且含有在组成型启动子调控下的araE编码序列的细菌细胞；其中，在所述环形亲代质粒或所述细菌细胞中，存在单向位点特异性重组酶和非所用细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶的编码序列；

在一定条件下培养所述细菌细胞足够时间，以便表达单向位点特异性重组酶使该单向位点特异性重组酶重组attB和attP位点，并表达限制性内切核酸酶使该限制性内切核酸酶消化所述限制性内切酶位点，其中通过培养提供包含感兴趣多核苷酸和所述单向位点特异性重组酶的产物杂交序列的小环核酸载体；

纯化这种小环核酸载体，提供基本上没有污染性核酸的小环核酸载体组合物。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述污染性核酸包括线性核酸片段。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述污染性核酸包括环形核酸序列。

16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述污染性核酸包括所述单向位点特异性重组酶的编码核酸序列。

17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述污染性核酸包括所述限制性内切核酸酶的编码核酸序列。

18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述感兴趣多核苷酸包含表达盒。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述表达盒编码多肽。

20.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述表达盒编码非翻译性核糖核酸。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述非翻译性核糖核酸是短发夹核糖核酸(shRNA)。

22.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述非翻译性核糖核酸是双链核糖核酸。

23.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述小环核酸载体没有质粒骨架细菌DNA序列。

24.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述经遗传修饰的细菌细胞基因组中编码内切核酸酶1的endA基因受到破坏。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述破坏是插入、倒置或缺失。

26.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述单向位点特异性重组酶是噬菌体PhiC31、R4、TP901-1、phiBT1、Bxb1、RV-1、A118、U153或phiFC1的整合酶。

27.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述限制性内切核酸酶是I-SceI、I-Ceu 1、Pl-Psp 1或P1-Sce 1。

28.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述单向位点特异性重组酶处在诱导型启动子的控制下。

29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述启动子可用L-阿拉伯糖诱导。

30.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述单向位点特异性重组酶编码序列存在于亲代质粒中。

31.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述单向位点特异性重组酶编码序列存在于所述细菌细胞的染色体中。

32.如权利要求13所述的方法，其特征在于，非所述细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶处在诱导型启动子控制下。

33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述启动子可用L-阿拉伯糖诱导。

34.如权利要求32所述的方法，其特征在于，非所述细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶的编码序列存在于所述亲代质粒中。

35.如权利要求32所述的方法，其特征在于，非所述细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶的编码序列存在于所述细菌细胞的染色体中。

36.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述单向位点特异性重组酶的产物杂交序列是attL或attR。

37.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述小环核酸载体的长度范围为约100bp-10kb。

38.一种经遗传修饰缺乏功能性内切核酸酶1并包含在组成型启动子调控下的araE编码序列的细菌细胞。

39.如权利要求38所述的细菌细胞，还包含在诱导型启动子调控下的单向位点特异性重组酶的编码序列，该序列整合在基因组中。

40.如权利要求38所述的细菌细胞，还包含在诱导型启动子调控下的非所述细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶的编码序列，该序列整合在基因组中。

41.如权利要求39所述的细菌细胞，还包含非所述细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶的编码序列，该序列整合在基因组中。

42.如权利要求39所述的遗传修饰的细菌细胞，其特征在于，所述单向位点特异性重组酶是噬菌体PhiC31、R4、TP901-1、phiBT1、Bxb1、RV-1、A118、U153或phiFC1的整合酶。

43.如权利要求40所述的遗传修饰的细菌细胞，其特征在于，所述限制性内切核酸酶是I-SceI、I-Ceu 1、Pl-Psp 1或P1-Sce 1。

44.如权利要求38所述的遗传修饰的细菌细胞，其特征在于，所述遗传修饰的细菌细胞基因组中编码内切核酸酶1的endA基因受到破坏。

45.如权利要求44所述的遗传修饰的细菌细胞，其特征在于，所述破坏是插入、倒置或缺失。

46.如权利要求38所述的遗传修饰的细菌细胞，还包含突变蛋白LacYA177C的编码序列。

47.一种将表达盒引入动物细胞内的方法，所述方法包括：

给予所述动物包含没有质粒骨架细菌DNA序列的小环核酸载体的制剂，所述制剂基本上没有污染性核酸，和

所述小环核酸载体包含单向位点特异性重组酶的产物杂交序列和所述表达盒，存在于细胞中时能够持久高水平地表达所述表达盒。

48.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述引入为离体引入。

49.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述引入为体内引入。

50.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述靶细胞存在于有血管的多细胞生物体内。

51.一种药盒，其中装有：

遗传修饰的细菌细胞，该细菌细胞的基因组中含有在组成型启动子调控下的L-阿拉伯糖转运蛋白araE的编码序列，该遗传修饰的细菌细胞不表达功能性内切核酸酶1；和

用该遗传修饰的细菌细胞制备用于给予对象的基本上没有污染性核酸的小环核酸载体制剂的说明书。

52.如权利要求50所述的药盒，其特征在于，所述遗传修饰的细菌细胞的基因组中还包含非所述细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶的编码序列。

53.如权利要求50所述的药盒，其特征在于，所述遗传修饰的细菌细胞的基因组中还包含单向位点特异性重组酶的编码序列。

54.如权利要求50所述的药盒，其特征在于，所述遗传修饰的细菌细胞的基因组中还包含突变蛋白LacY A177C的编码序列。

55.如权利要求50所述的药盒，还装有包含以下组件的环形核酸：

(a)侧接单向位点特异性重组酶识别的attB和attP位点的克隆位点；和

(b)至少一个非所述细菌细胞内源性的限制性内切核酸酶识别的限制性内切酶位点。

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