CN110438138A

CN110438138A - 质粒载体

Info

Publication number: CN110438138A
Application number: CN201910600065.2A
Authority: CN
Inventors: 薛博夫; 杨银辉; 单骁越; 刘杰; 马墨
Original assignee: Shenzhen Shen Yan Biological Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Shen Yan Biological Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2019-07-04
Filing date: 2019-07-04
Publication date: 2019-11-12

Abstract

本文中提供一种基础质粒载体，所述基础质粒载体的功能元件按5’端到3’端顺序由多克隆位点序列、用于原核细胞的抗性基因序列及其启动子和Ori序列组成，所述多克隆位点序列包含多个哺乳动物细胞稀有的限制性内切酶位点，所述多克隆位点序列按5’端到3’端顺序至少包括SpeI位点和AvrII位点或至少包括MluI位点和AscI位点，在至少包括SpeI位点和AvrII位点的情况下，AvrII位点不是所述多克隆位点序列中的最后一个限制性内切酶位点，在至少包括MluI位点和AscI位点的情况下，AscI位点不是所述多克隆位点序列中的最后一个限制性内切酶位点，并且在所述基础质粒载体中，除了Ori序列和用于原核细胞的抗性基因序列及其启动子以外，不存在来自原核生物的调控序列。

Description

质粒载体

发明领域

本发明涉及质粒载体，具体地涉及用于构建用于将目的基因转入真核细胞(特别地，哺乳动物细胞，更特别地，人细胞)的质粒载体的基础质粒载体(backbone)以及自其衍生的一系列质粒载体。

背景技术

质粒是分子生物学的基础元件，广泛应用于绝大多数分子生物学实验室。质粒是可以在细菌(例如大肠杆菌)内复制的基本元件，是构建和生产用于科研或临床使用基因元件的基础。在科研上，与DNA序列、基因功能相关的研究都需要构建和生产质粒。在临床上，DNA质粒可应用于遗传疾病治疗，分子诊断，重组蛋白药物开发及生产，干细胞治疗，癌症诊断及治疗，基因治疗，如老年痴呆、糖尿病、癌症等。在工业上，DNA质粒可应用于转基因动/植物的构建，酶工程，如构建应用于造纸业的酶，育种，工业化工原料如氨基酸的生产，污水处理，病虫害控制等。

现在应用于哺乳动物的质粒系统存在一系列缺陷。目前本领域中常用的商业质粒骨架(backbone)年代久远，设计时并没有基于哺乳动物进行优化，其中存在大量无用的序列或意在用于原核生物的调控序列。大量无用序列或意在用于原核生物的调控序列的存在导致上述质粒具有过大的尺寸。质粒的过大尺寸有以下缺点：影响质粒产量，质粒越大，生产效率越低；影响有效基因摩尔浓度，因为骨架越大、目的基因占比越小，单位质量下的DNA质粒的有效序列越少；影响转染效率；大的质粒骨架增加了质粒构建的难度。

目前质粒作为分子生物学元件有如下缺点：酶切位点没有优化，质粒上各基因元件上下游没有限制性内切酶位点，各基因元件不容易更换；质粒骨架上存在大量常用限制性内切酶，影响目的基因插入；各质粒系统之间的限制性内切酶位点不能通用，构建在质粒上的基因不能方便转移到其它质粒上；质粒的多克隆位点没有优化，在构建多片段复杂质粒时困难重重。

因此，在本领域内，对于能够提升分子生物学操作效率，降低构建难度并且在真核细胞(特别是哺乳动物细胞)中具有增强的表现的质粒骨架(基础质粒)及其衍生质粒存在强烈的需求。

发明内容

哺乳动物细胞中存在抑制细菌DNA序列的机制，质粒骨架中存在的细菌序列在哺乳动物细胞中会被甲基化，从而影响目标基因(geneofinterest，GOI)的表达。本发明通过缩小质粒骨架的大小从而降低基因抑制的概率，提高了目标基因的表达量及表达时间。

细菌序列在哺乳动物体内可能会引起免疫反应。本发明的质粒通过减少质粒骨架中的细菌序列从而提高了质粒在人体中应用的安全性。

本发明通过去除现有质粒系统中存在的特定原核调控元件并且对质粒多克隆位点中的限制性内切酶的种类和位置进行特定选择和安排从而获得了能够解决上述技术问题的基础质粒(质粒骨架)。通过本发明的方法构建的质粒载体具有以下优点：本发明的质粒仅保留Ori和抗性基因，移除了除此之外的其它原核序列；提高了质粒的生产效率；提高了单位DNA量中的有效基因序列比例；提高了转染效率；降低了骨架中的细菌序列所导致的基因抑制；降低了骨架中的细菌序列所导致的免疫反应；本发明的重新设计的骨架及其多克隆位点，大大提高了分子生物学操作和质粒构建的便利性；本发明的质粒骨架中移除了大部分的限制性内切酶位点，降低了骨架在克隆时对插入目标基因的影响；本发明的质粒的优化的多克隆位点(MCS)大大提高了装载各种用于哺乳动物细胞的基因元件的便捷性；基于本发明的MCS构建的不同质粒载体上的相同或不同的基因元件可以方便地互相转移；本发明质粒的MCS的特别设计大大提高了多表达盒(expression cassette)复杂质粒系统构建的便捷性。

在一个方面，本发明提供以下各项：

1.基础质粒载体，特征在于，所述基础质粒载体的功能元件按5’端到3’端顺序由多克隆位点序列、用于原核细胞的抗性基因序列及其启动子和Ori序列组成，所述多克隆位点序列中包含多个限制性内切酶位点，所述多个限制性内切酶位点是哺乳动物细胞稀有的限制性内切酶位点，例如选自：NotI、PstI、SbfI、SpeI、ZraI、PacI、NgoMIV、MluI、BstBI、ClaI、EcorI、MscI、BamHI、NheI、XbaI、SalI、Acc65I、KpnI、HindIII、XhoI、NcoI、BglII、SphI、AvrII、BspEI、AgeI、AscI、BssHII、AsiSI和PvuI，所述多克隆位点序列按5’端到3’端顺序至少包括SpeI位点和AvrII位点或至少包括MluI位点和AscI位点，在至少包括SpeI位点和AvrII位点的情况下，AvrII位点不是所述多克隆位点序列中的最后一个限制性内切酶位点，在至少包括MluI位点和AscI位点的情况下，AscI位点不是所述多克隆位点序列中的最后一个限制性内切酶位点，并且在所述基础质粒载体中，除了Ori序列和用于原核细胞的抗性基因序列及其启动子以外，不存在来自原核生物的调控序列。

2.第1项的基础质粒载体，其中所述Ori序列选自：pMB1、pBR322、ColE1、R6K、P15A、pSC101、F1和pUC，优选为PUC。

3.第1项的基础质粒载体，其中所述用于原核细胞的抗性基因序列选自：氨苄青霉素、博来霉素、羧苄青霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素、多粘菌素B、奇霉素、链霉素和四环素抗性基因，优选为氨苄青霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因，所述用于原核细胞的抗性基因的启动子例如是AmpR启动子。

4.第1项的基础质粒载体，其中所述多克隆位点序列按5’端到3’端顺序包含以下限制性内切酶位点：NotI、SbfI、SpeI、PacI、MluI、BstBI、ClaI、EcorI、BamHI、XbaI、HindIII、XhoI、BglII、SphI、AvrII、BspE1、AgeI、AscI和AsiSI，优选地，所述多克隆位点序列按5’端到3’端顺序包含以下限制性内切酶位点：NotI、PstI/SbfI、SpeI、ZraI、PacI、NgoMIV、MluI、BstBI、ClaI、EcorI、MscI、BamHI、NheI、XbaI、SalI、Acc65I、KpnI、HindIII、XhoI、NcoI、BglII、SphI、AvrII、BspEI、AgeI、AscI/BssHII和AsiSI/PvuI，更优选地，所述多克隆位点序列如SEQIDNO.1所示。

5.第1项的基础质粒载体，其中所述用于原核细胞的抗性基因序列和Ori序列之间存在限制性内切酶位点，例如，BsiWI位点。

6.第1项的基础质粒载体，其中所述Ori序列和所述多克隆位点序列之间存在限制性内切酶位点，例如，BglI位点。

7.第1项的基础质粒载体，其具有SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示的序列。

8.质粒载体，所述质粒载体通过在第1-7项中任一项的基础质粒载体的多克隆位点序列中插入用于真核细胞的抗性基因序列及其调控元件获得，所述用于真核细胞的抗性基因序列例如选自以下：潮霉素、嘌呤霉素、G418、Bla、博莱霉素、二氢叶酸还原酶和谷氨酰胺合成酶抗性基因序列，所述调控元件例如选自用于调控所述用于真核细胞的抗性基因序列的启动子(例如SV40启动子)、IRES序列和P2A序列。

9.质粒载体，所述质粒载体通过在第1-7项中任一项的基础质粒载体的多克隆位点序列中插入标签序列获得，所述标签序列例如是选择标签或纯化标签。

10.质粒载体，所述质粒载体通过在第1-9项中任一项的质粒载体的多克隆位点序列中插入一个或多个真核表达盒获得，在至少包括SpeI位点和AvrII位点的情况下，所述真核表达盒被插入在SpeI位点之后并且在AvrII位点之前，在至少包括MluI位点和AscI位点的情况下，所述真核表达盒被插入在MluI位点之后并且在AscI位点之前，所述真核表达盒包含真核启动子序列、目的基因序列和polyA序列，优选地，所述真核表达盒还包含用于增强真核表达的内含子序列，所述启动子序列例如选自：CMV、EF1α、SV40、PGK1、Ubc、β肌动蛋白、CAG、CaMKIIa、UAS、TRE、Ac5、多角体蛋白、GAL1、GAL 10、TEF1、GDS、ADH1、CaMV35S、Ubi、H1和U6启动子，所述polyA序列例如选自：β球蛋白polyA、hGHpolyA、bGHpolyA、SV40polyA、HSVTKpolyA，所述内含子序列例如选自：兔β-球蛋白内含子、源自人β-球蛋白和免疫球蛋白重链内含子的杂合内含子、EF-1α内含子A、SV40内含子、源自腺病毒和免疫球蛋白重链内含子的杂合内含子、修饰的人巨细胞病毒内含子、源自鸡β-肌动蛋白(CBA)和小鼠微小病毒(MMV)内含子的杂合内含子、源自鸡β-肌动蛋白和兔β-球蛋白内含子的嵌合物和mP1内含子。

11.第10项的质粒载体，其中所述多克隆位点序列按5’端到3’端顺序包含以下限制性内切酶位点：NotI、SbfI、SpeI、PacI、MluI、BstBI、ClaI、EcorI、BamHI、XbaI、HindIII、XhoI、BglII、SphI、AvrII、BspE1、AgeI、AscI和AsiSI，所述真核表达盒被插入在MluI位点之后并且在AvrII位点之前，所述启动子优选地在MluI位点和BstBI位点之间被插入，所述内含子序列优选地在BstBI、CalI或EcorI位点被插入，所述polyA序列优选地在XhoI、BglII或SphI位点被插入，所述目的基因序列优选地在ClaI、EcorI、BamHI、XbaI、HindIII或XhoI位点被插入。

12.质粒载体，其序列如SEQIDNO.11、SEQIDNO.12或SEQIDNO.16所示。

13.第1-12项中任一项的质粒载体在构建用于将目的基因转入哺乳动物细胞的质粒载体中的用途。

附图简述

图1显示根据本发明的一个实例的包含氨苄青霉素抗性基因的基础质粒(pma-MCS)的图谱。

图2显示根据本发明的一个实例的包含卡那霉素抗性基因的基础质粒(pmk-MCS)的图谱。

图3显示根据本发明的一个实例的通过在基础质粒pma-MCS的多克隆位点(MCS)中插入启动子(CMV启动子)，内含子和polyA序列获得的质粒(pmaCMV-MCS)的图谱。

图4显示根据本发明的一个实例的通过将从pmaCMV-MCS质粒获得的含有CMV-BGI-hGHpolyA的片段直接插入在基础质粒pmk-MCS的多克隆位点(MCS)中获得的质粒(pmkCMV-MCS)的图谱。

图5显示根据本发明的一个实例的通过在基础质粒pma-MCS的多克隆位点(MCS)中插入CAG启动子，内含子和polyA序列获得的质粒(pmaCAGGS-MCS)的图谱。

图6显示根据本发明的一个实例的具有三个表达盒的质粒构建体pmaCMV-EGFP-ECFP-d's'Red的质粒图谱。

图7显示根据本发明的一个实例的具有转录方向不同的两个表达盒的质粒构建体pmaCMV-rECFP-EGFP的质粒图谱。

图8显示根据本发明的一个实例的质粒转染效率的比较测定结果。

图9显示根据本发明的一个实例的质粒转染后目的基因表达量的比较测定结果。

图10显示根据本发明的一个实例的质粒产量的比较测定结果。

图11显示根据本发明的一个实例的质粒转染后目的基因的表达稳定性的比较测定结果。

具体实施方式

提供以下实施例用以对本发明的技术方案进行说明，以下实施例不应被认为是对本发明的范围和精神的限制。

以下实施例中使用的所有限制性内切酶均来自NEB(New England Biolabs)，并且根据生产商推荐的方案对所述酶进行使用。

以下实施例中涉及到的序列合成均在南京金斯瑞生物科技有限公司进行。

实施例1、制备基础质粒骨架pma-MCS和pmk-MCS

1.1.制备基础质粒骨架pma-MCS

通过序列合成的方法(序列合成在南京金斯瑞生物科技有限公司进行)制备包含多克隆位点序列、抗性基因序列及其启动子和Ori序列的基础质粒骨架pma-MCS，其中多克隆位点序列包含以下限制性内切酶位点：NotI、PstI/SbfI、SpeI、ZraI、PacI、NgoMIV、MluI、BstBI、ClaI、EcorI、MscI、BamHI、NheI、XbaI、SalI、Acc65I、KpnI、HindIII、XhoI、NcoI、BglII、SphI、AvrII、BspEI、AgeI、AscI/BssHII和AsiSI/PvuI并且其序列如SEQIDNO.1所示，Ori序列选用PUC(序列如SEQIDNO.2所示)，抗性基因序列选用氨苄青霉素(Amp)抗性基因序列(序列如SEQIDNO.3所示)，抗性基因的启动子选用AmpR启动子(序列如SEQIDNO.5所示)。合成的基础质粒骨架pma-MCS的序列经测序验证，并且如SEQIDNO.6所示。基础质粒骨架pma-MCS的质粒图谱如图1所示。

1.2.制备基础质粒骨架pmk-MCS

通过序列合成的方法(序列合成在南京金斯瑞生物科技有限公司进行)制备包含多克隆位点序列、抗性基因序列及其启动子和Ori序列的基础质粒骨架pmk-MCS，其中多克隆位点序列包含以下限制性内切酶位点：NotI、PstI/SbfI、SpeI、ZraI、PacI、NgoMIV、MluI、BstBI、ClaI、EcorI、MscI、BamHI、NheI、XbaI、SalI、Acc65I、KpnI、HindIII、XhoI、NcoI、BglII、SphI、AvrII、BspEI、AgeI、AscI/BssHII和AsiSI/PvuI并且其序列如SEQIDNO.1所示，Ori序列选用PUC(序列如SEQIDNO.2所示)，抗性基因序列选用卡那霉素(Kana)抗性基因序列(序列如SEQIDNO.4所示)，抗性基因的启动子选用AmpR启动子(序列如SEQIDNO.5所示)。合成的基础质粒骨架pmk-MCS的序列经测序验证，并且如SEQIDNO.7所示。基础质粒骨架pmk-MCS的质粒图谱如图2所示。

本实施例中使用的氨苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因仅是作为示例。本领域技术人员完全能够理解可以使用其他本领域中常用的抗性基因序列用于构建本发明的基础质粒骨架。

实施例2、通过在基础质粒骨架中插入启动子、内含子和polyA序列制备进一步的质粒载体

2.1.通过在基础质粒pma-MCS的多克隆位点(MCS)中插入启动子，内含子和polyA序列获得进一步的质粒，插入的启动子选用CMV启动子(序列如SEQIDNO.8所示)，插入的内含子选用BGI(序列如SEQIDNO.9所示)，插入的polyA序列选用hGHpolyA(序列如SEQIDNO.10所示)。所述CMV启动子被插入在多克隆位点中的MluI和BstBI酶切位点之间，所述BGI内含子序列被单酶插入在多克隆位点中的BstBI酶切位点，所述hGHpolyA被插入在多克隆位点中的BglII和SphI酶切位点之间。上述被插入的序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并经过测序验证。合成的序列两端带有相应的酶切位点序列，其可在用相应的限制性内切酶处理后直接与经相同的酶处理的质粒载体连接。所得的进一步质粒被命名为pmaCMV-MCS，其序列经测序验证，并且如SEQIDNO.11所示。pmaCMV-MCS的质粒图谱如图3所示。

2.2.用NotI和AsiSI酶切以上2.1中制备的pmaCMV-MCS质粒，回收含有CMV-BGI-hGHpolyA的片段(1821bp)，并将所述片段连入以上1.2中制备的pmk-MCS质粒的AsiSI和NotI位点，所得的质粒被命名为pmkCMV-MCS，其序列经测序验证，并且如SEQIDNO.12所示。pmkCMV-MCS的质粒图谱如图4所示。

实施例3、进一步质粒载体pmaCAGGS-MCS的构建

通过在基础质粒pma-MCS的多克隆位点(MCS)中插入CAG启动子(序列如SEQIDNO.13所示)，嵌合内含子(序列如SEQIDNO.14所示)和β球蛋白polyA序列(序列如SEQIDNO.15所示)获得进一步的质粒载体。所述CMV增强子和鸡β肌动蛋白启动子被插入在多克隆位点中的MluI和BstBI酶切位点之间(鸡β肌动蛋白启动子位于CMV增强子的紧接的下游)，所述嵌合内含子序列被单酶插入在多克隆位点中的BstBI酶切位点，所述β球蛋白polyA被插入在多克隆位点中的BglII和SphI酶切位点之间。上述被插入的序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并经过测序验证。合成的序列两端带有相应的酶切位点序列，其可在用相应的限制性内切酶处理后直接与经相同的酶处理的质粒载体连接。所得的质粒命名为pmaCAGGS-MCS，其序列如SEQIDNO.16所示，其质粒图谱如图5所示。

实施例4、基于基础质粒载体制备多表达盒质粒

在本实施例中，为了体现本发明的基础质粒所具有的易于构建具有多个表达盒的质粒的优点，基于由基础质粒骨架pma-MCS产生的pmaCMV-MCS质粒载体制备具有多个表达盒的质粒构建体。作为示例，在本实施例中制备具有三个表达盒的质粒构建体。作为示例，所述三个表达盒表达不同的目的基因(GOI)，本领域技术人员完全能够理解本发明的基础质粒也可以有助于具有多个表达相同目的基因的表达盒的质粒的构建。作为示例，所述三个表达盒分别表达EGFP、ECFP和d's'Red编码序列作为目的基因(GOI)。本领域技术人员完全能够理解本发明的基础质粒也可以用于其他目的基因的表达。

通过下述方法构建具有三表达盒的质粒构建体(pmaCMV-EGFP-ECFP-d's'Red)：

1)对合成的EGFP编码序列进行BamHI和KpnI双酶切处理(序列合成在南京金斯瑞生物科技有限公司进行，合成的序列两端分别带有BamHI和KpnI酶切位点)，将经BamHI和KpnI双酶切处理的EGFP编码序列与经过BamHI和KpnI双酶切处理的pmaCMV-MCS质粒载体进行连接，得到具有一个表达盒(EGFP表达盒)的质粒pmaCMV-EGFP。

2)对合成的ECFP编码序列进行BamHI和KpnI双酶切处理(序列合成在南京金斯瑞生物科技有限公司进行，合成的序列两端分别带有BamHI和KpnI酶切位点)，将经BamHI和KpnI双酶切处理的ECFP编码序列与经过BamHI和KpnI双酶切处理的pmaCMV-MCS质粒载体进行连接，得到具有一个表达盒(ECFP表达盒)的质粒pmaCMV-ECFP。

3)对合成的d's'Red编码序列进行BamHI和KpnI双酶切处理(序列合成在南京金斯瑞生物科技有限公司进行，合成的序列两端分别带有BamHI和KpnI酶切位点)，将经BamHI和KpnI双酶切处理的d's'Red编码序列与经过BamHI和KpnI双酶切处理的pmaCMV-MCS质粒载体进行连接，得到具有一个表达盒(d's'Red表达盒)的质粒pmaCMV-d's'Red。

4)对pmaCMV-ECFP进行SpeI和AgeI双酶切处理，回收所得的含ECFP表达盒(CMV启动子-BGI内含子-ECFP-hGHpolyA)的片段，将该含ECFP表达盒的片段与经AvrII和AgeI双酶切处理的pmaCMV-EGFP载体连接(SpeI和AvrII能够产生相同的粘性末端，并且两者的粘性末端在连接后将不会再产生SpeI或AvrII酶切位点)，从而得到具有两个表达盒(EGFP和ECFP)的质粒pmaCMV-EGFP-ECFP。

5)对pmaCMV-d's'Red进行SpeI和AgeI双酶切处理，回收所得的含d's'Red表达盒(CMV启动子-BGI内含子-d's'Red-hGHpolyA)的片段，将该含d's'Red表达盒的片段与经AvrII和AgeI双酶切处理的pmaCMV-EGFP-ECFP载体连接(机理同上)，从而得到具有三个表达盒(EGFP、ECFP和d's'Red)的质粒pmaCMV-EGFP-ECFP-d's'Red，其质粒图谱如图6所示。

由以上构建过程可见，通过以下方式可以非常容易地实现具有多个表达盒的质粒的构建：利用本发明的基础质粒构建具有一个或多个表达盒(可以相同也可以不相同)的中间质粒，利用SpeI和AgeI双酶切将所述中间质粒上的所述一个或多个表达盒切下，然后将切下的所述一个或多个表达盒与经AvrII和AgeI双酶切处理的已经具有另外的一个或多个表达盒(可以相同也可以不相同)的利用本发明的基础质粒构建的另一中间质粒连接，即可以得到带有上述所有表达盒的质粒构建体，并且还可以重复上述过程从而在所得的多表达盒质粒构建体上插入进一步的表达盒。利用本发明的基础质粒(特别是利用其中多克隆位点的独特设计)所实现的多表达盒质粒构建的简便性是现有技术中的质粒系统所无法达到的。此外，在本发明的基础质粒的多克隆位点中还可以存在另一对酶切位点，MluI和AscI，其也可以被利用以实现与SpeI和AvrII这对酶切位点同样的效果(MluI和AscI能够产生相同的粘性末端，并且两者的粘性末端在连接后将不会再产生MluI或AscI酶切位点)。

实施例5、制备具有转录方向不同的多个表达盒的质粒构建体

在本实施例中，为了体现本发明的基础质粒所具有的易于构建具有多个表达盒的质粒的优点，基于由基础质粒骨架pma-MCS产生的pmaCMV-MCS质粒载体制备具有转录方向不同的多个表达盒的质粒构建体。作为示例，在本实施例中制备具有转录方向相反的两个表达盒的质粒构建体。作为示例，所述两个表达盒表达不同的目的基因(GOI)，本领域技术人员完全能够理解本发明的基础质粒也可以有助于具有多个表达相同目的基因的表达盒的质粒的构建。作为示例，所述两个表达盒分别表达EGFP和ECFP编码序列作为目的基因(GOI)。本领域技术人员完全能够理解本发明的基础质粒也可以用于其他目的基因的表达。

通过下述方法构建具有转录方向相反的两个表达盒的质粒构建体(pmaCMV-rECFP-EGFP)：

3)对pmaCMV-ECFP进行MluI和AvrII双酶切处理，回收所得的含ECFP表达盒(CMV启动子-BGI内含子-ECFP-hGHpolyA)的片段，将该含ECFP表达盒的片段与经SpeI和MluI双酶切处理的pmaCMV-EGFP载体连接，从而得到具有转录方向相反的两个表达盒(EGFP和ECFP)的质粒构建体pmaCMV-rECFP-EGFP，其质粒图谱如图7所示。

实施例6、质粒构建体的性能测定

(1)质粒转染效率测定

质粒构建方法

使用磷酸钙转染方法，分别将总质粒量为0.4ug、0.8ug和1.6ug的质粒pmaCMV-EGFP(如以上实施例4中构建的)或对照质粒(通过将从pmaCMV-EGFP获得的片段CMV-EGFP插入到商业质粒pCDNA3.1+(Invitrogen)中的MluI和XhoI酶切位点之间而获得，命名为pCDNA3.1-EGFP)转染293T细胞(北纳生物)。每个转染质粒量设置两个复孔。转染24h后使用流式细胞仪(艾森生物，Novocyte3130)检测具有EGFP荧光的细胞比例，以及对应的中值荧光强度(MFI)。三次独立实验结果如图8-9所示。

结果显示，与基于商业质粒pCDNA3.1+构建的对照质粒pCDNA3.1-EGFP相比，基于本发明的基础质粒构建的质粒pmaCMV-EGFP具有明显更高的转染效率(在0.4ug、0.8ug和1.6ug浓度，转染效率分别提高了25.1％、27.1％和41.5％)和更高的基因表达量(在0.4ug、0.8ug和1.6ug浓度，MFI分别提高了12.5％、27.3％和69.2％)。

(2)质粒产量测定

分别将30ng的pCDNA3.1-EGFP和pmaCMV-EGFP质粒转化DH-5α感受态细胞(丰辉生物)，之后涂布于含100ug/ml氨苄西林的LB琼脂平板上，37℃过夜培养后，分别随机挑取4个克隆接种于20ml含100ug/ml氨苄西林的LB液体培养基中，置于37℃，250rpm摇床培养。取样时间点设置为6h，8h，10h，12h，14h。取样体积为1ml，收集菌体。使用快速质粒小提试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，#DP105-03)提取质粒。使用BioTek酶标仪(EPOCH2C)检测并计算摩尔浓度。三次独立实验结果如图10所示。

结果显示，与基于商业质粒pCDNA3.1+构建的对照质粒pCDNA3.1-EGFP相比，在用同样量的质粒转化细胞的情况下，基于本发明的基础质粒构建的质粒pmaCMV-EGFP具有明显更高的质粒产量(12h后质粒产量明显提高，14h培养后，质粒产量提高36.5％)。

(3)质粒稳定性测定

通过检测具有EGFP荧光的细胞相应的MFI随时间的下降来比较质粒在转染后的基因表达的稳定性。

使用PEI转染法将总质粒量为2.5ug的pCDNA3.1-EGFP和pmaCMV-EGFP分别转染至悬浮驯化后的293T细胞(北纳生物)中，每天取样，利用流式细胞仪(艾森生物，Novocyte3130)检测记录具有EGFP信号的细胞的MFI(Median Fluorescence Intensity)值，从而检测目的基因转染到细胞中的基因表达水平。三次独立实验结果如图11所示。

结果显示，与基于商业质粒pCDNA3.1+构建的对照质粒pCDNA3.1-EGFP相比，在用同样量的质粒转化细胞的情况下，基于本发明的基础质粒构建的质粒pmaCMV-EGFP具有明显更高的目的基因表达量，并且目的基因表达的衰减明显更慢(在第1天、第2天、第3天、第4天和第5天，相较于对照，目的基因表达量分别高38.7％、37.4％、18.1％、67.9％和71.2％)。

序列表

<110> 深圳市深研生物科技有限公司

<120> 质粒载体

<130> P20190001BCN

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 191

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcggccgccc tgcaggtcaa ctagtgacgt cttaattaat tgccggctgg aacgcgtttc 60

gaacatcgat tgaattctgg ccaagtggat ccgctagctc tagagtcgac ggtaccaagc 120

ttgcctcgag ccatggagat ctgcatgccc taggtccgga accggttggc gcgccatctg 180

gcagcgatcg c 191

<210> 2

<211> 713

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaagttagag aaaaggcata agtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 60

ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 120

ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 180

ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 240

ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 300

tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 360

tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 420

tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 480

tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 540

gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 600

tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 660

ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcat ctcatgaaaa ttatgcaaat tga 713

<210> 3

<211> 966

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 60

caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat 120

ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca 180

gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc 240

gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca 300

atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg 360

caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca 420

gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata 480

accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag 540

ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg 600

gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca 660

acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta 720

atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct 780

ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca 840

gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag 900

gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat 960

tggtaa 966

<210> 4

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 60

caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgat tgaacaagat 120

ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca 180

caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg 240

gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt gccctgaatg aactgcaaga cgaggcagcg 300

cggctatcgt ggctggcgac gacgggcgtt ccttgcgccg ctgtgctcga cgttgtcact 360

gaagcgggaa gggactggct gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct 420

caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg 480

cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt 540

actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc 600

gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag gcgtctatgc ccgacggcga ggatctcgtc 660

gtgacccatg gcgatgcctg cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga 720

ttcatcgact gtggtcggct gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc 780

cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt 840

atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga 900

<210> 5

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 60

caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagt 105

<210> 6

<211> 1893

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

actgcggccg ccctgcaggt caactagtga cgtcttaatt aattgccggc tggaacgcgt 60

ttcgaacatc gattgaattc tggccaagtg gatccgctag ctctagagtc gacggtacca 120

agcttgcctc gagccatgga gatctgcatg ccctaggtcc ggaaccggtt ggcgcgccat 180

ctggcagcga tcgccgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 240

atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 300

tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 360

tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 420

gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 480

aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 540

gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 600

ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 660

gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 720

gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 780

atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 840

ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 900

cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 960

cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 1020

gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 1080

cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 1140

cactgattaa gcattggtaa cgtacggaag ttagagaaaa ggcataagta gaaaagatca 1200

aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 1260

caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 1320

taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag 1380

gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 1440

cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 1500

taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 1560

agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 1620

ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 1680

gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 1740

acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 1800

acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcatctca 1860

tgaaaattat gcaaattgag ccagtcaggc agt 1893

<210> 7

<211> 1833

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agtactgcgg ccgccctgca ggtcaactag tgacgtctta attaattgcc ggctggaacg 60

cgtttcgaac atcgattgaa ttctggccaa gtggatccgc tagctctaga gtcgacggta 120

ccaagcttgc ctcgagccat ggagatctgc atgccctagg tccggaaccg gttggcgcgc 180

catctggcag cgatcgccgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata 240

tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga 300

gtatgattga acaagatgga ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg gagaggctat 360

tcggctatga ctgggcacaa cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg ttccggctgt 420

cagcgcaggg gcgcccggtt ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc ctgaatgaac 480

tgcaagacga ggcagcgcgg ctatcgtggc tggcgacgac gggcgttcct tgcgccgctg 540

tgctcgacgt tgtcactgaa gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa gtgccggggc 600

aggatctcct gtcatctcac cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg gctgatgcaa 660

tgcggcggct gcatacgctt gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa gcgaaacatc 720

gcatcgagcg agcacgtact cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat gatctggacg 780

aagagcatca ggggctcgcg ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg tctatgcccg 840

acggcgagga tctcgtcgtg acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc atggtggaaa 900

atggccgctt ttctggattc atcgactgtg gtcggctggg tgtggcggac cgctatcagg 960

acatagcgtt ggctacccgt gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg gctgaccgct 1020

tcctcgtgct ttacggtatc gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc tatcgccttc 1080

ttgacgagtt cttctgacga tcgcgtacgg aagttagaga aaaggcataa gtagaaaaga 1140

tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 1200

aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 1260

aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt 1320

taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 1380

taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 1440

agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 1500

tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 1560

cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 1620

agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 1680

gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 1740

aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcatc 1800

tcatgaaaat tatgcaaatt gagccagtca ggc 1833

<210> 8

<211> 658

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgcgtctagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 60

gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 120

cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 180

acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 240

tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 300

ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 360

tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc 420

acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa 480

tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag 540

gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg 600

gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctc 658

<210> 9

<211> 493

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcgaatcccg gccgggaacg gtgcattgga acgcggattc cccgtgccaa gagtgacgta 60

agtaccgcct atagagtcta taggcccaca aaaaatgctt tcttctttta atatactttt 120

ttgtttatct tatttctaat actttcccta atctctttct ttcagggcaa taatgataca 180

atgtatcatg cctctttgca ccattctaaa gaataacagt gataatttct gggttaaggc 240

aatagcaata tttctgcata taaatatttc tgcatataaa ttgtaactga tgtaagaggt 300

ttcatattgc taatagcagc tacaatccag ctaccattct gcttttattt tatggttggg 360

ataaggctgg attattctga gtccaagcta ggcccttttg ctaatcatgt tcatacctct 420

tatcttcctc ccacagctcc tgggcaacgt gctggtctgt gtgctggccc atcactttgg 480

caaagaattg gga 493

<210> 10

<211> 479

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc 60

cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt 120

ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga 180

caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt 240

ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt 300

tgttgggatt ccaggcaagc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac 360

ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac 420

cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtcctt 479

<210> 11

<211> 3528

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

actgcggccg ccctgcaggt caactagtga cgtcttaatt aattgccggc tggaacgcgt 60

ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc 120

gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat 180

tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 240

aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 300

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt 360

acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 420

ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg 480

gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac 540

gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg 600

tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc gcctggagac 660

gccatccacg ctgttttgac ctccatagaa gacaccggga ccgatccagc ctccgcggat 720

tcgaatcccg gccgggaacg gtgcattgga acgcggattc cccgtgccaa gagtgacgta 780

agtaccgcct atagagtcta taggcccaca aaaaatgctt tcttctttta atatactttt 840

ttgtttatct tatttctaat actttcccta atctctttct ttcagggcaa taatgataca 900

atgtatcatg cctctttgca ccattctaaa gaataacagt gataatttct gggttaaggc 960

aatagcaata tttctgcata taaatatttc tgcatataaa ttgtaactga tgtaagaggt 1020

ttcatattgc taatagcagc tacaatccag ctaccattct gcttttattt tatggttggg 1080

ataaggctgg attattctga gtccaagcta ggcccttttg ctaatcatgt tcatacctct 1140

tatcttcctc ccacagctcc tgggcaacgt gctggtctgt gtgctggccc atcactttgg 1200

caaagaattg ggattcgaac atcgattgaa ttctggccag gatccgctag ctctagagtc 1260

gacggtacca gtactaagct tgcctcgagc catggagatc tacgggtggc atccctgtga 1320

cccctcccca gtgcctctcc tggccctgga agttgccact ccagtgccca ccagccttgt 1380

cctaataaaa ttaagttgca tcattttgtc tgactaggtg tccttctata atattatggg 1440

gtggaggggg gtggtatgga gcaaggggca agttgggaag acaacctgta gggcctgcgg 1500

ggtctattgg gaaccaagct ggagtgcagt ggcacaatct tggctcactg caatctccgc 1560

ctcctgggtt caagcgattc tcctgcctca gcctcccgag ttgttgggat tccaggcaag 1620

catgaccagg ctcagctaat ttttgttttt ttggtagaga cggggtttca ccatattggc 1680

caggctggtc tccaactcct aatctcaggt gatctaccca ccttggcctc ccaaattgct 1740

gggattacag gcgtgaacca ctgctccctt ccctgtcctt gcatgcccta ggtccggaac 1800

cggttggcgc gccatctggc agcgatcgcc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa 1860

tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt 1920

gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg 1980

cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag 2040

atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg 2100

agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg 2160

gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt 2220

ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga 2280

cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac 2340

ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc 2400

atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc 2460

gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac 2520

tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag 2580

gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg 2640

gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta 2700

tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg 2760

ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaacgtac ggaagttaga gaaaaggcat 2820

aagtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct 2880

tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa 2940

ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag 3000

tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc 3060

tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg 3120

actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca 3180

cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat 3240

gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg 3300

tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc 3360

ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc 3420

ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc 3480

cttttgctca tctcatgaaa attatgcaaa ttgagccagt caggcagt 3528

<210> 12

<211> 3468

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agtactgcgg ccgccctgca ggtcaactag tgacgtctta attaattgcc ggctggaacg 60

cgtctagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt 120

tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc 180

cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 240

gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 300

tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc 360

agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 420

ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac 480

ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc 540

aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc 600

gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga 660

gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgcg 720

gattcgaatc ccggccggga acggtgcatt ggaacgcgga ttccccgtgc caagagtgac 780

gtaagtaccg cctatagagt ctataggccc acaaaaaatg ctttcttctt ttaatatact 840

tttttgttta tcttatttct aatactttcc ctaatctctt tctttcaggg caataatgat 900

acaatgtatc atgcctcttt gcaccattct aaagaataac agtgataatt tctgggttaa 960

ggcaatagca atatttctgc atataaatat ttctgcatat aaattgtaac tgatgtaaga 1020

ggtttcatat tgctaatagc agctacaatc cagctaccat tctgctttta ttttatggtt 1080

gggataaggc tggattattc tgagtccaag ctaggccctt ttgctaatca tgttcatacc 1140

tcttatcttc ctcccacagc tcctgggcaa cgtgctggtc tgtgtgctgg cccatcactt 1200

tggcaaagaa ttgggattcg aacatcgatt gaattctggc caggatccgc tagctctaga 1260

gtcgacggta ccagtactaa gcttgcctcg agccatggag atctacgggt ggcatccctg 1320

tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct 1380

tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct ataatattat 1440

ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcaagttggg aagacaacct gtagggcctg 1500

cggggtctat tgggaaccaa gctggagtgc agtggcacaa tcttggctca ctgcaatctc 1560

cgcctcctgg gttcaagcga ttctcctgcc tcagcctccc gagttgttgg gattccaggc 1620

aagcatgacc aggctcagct aatttttgtt tttttggtag agacggggtt tcaccatatt 1680

ggccaggctg gtctccaact cctaatctca ggtgatctac ccaccttggc ctcccaaatt 1740

gctgggatta caggcgtgaa ccactgctcc cttccctgtc cttgcatgcc ctaggtccgg 1800

aaccggttgg cgcgccatct ggcagcgatc gccgcggaac ccctatttgt ttatttttct 1860

aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 1920

attgaaaaag gaagagtatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt 1980

gggtggagag gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg 2040

ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg 2100

gtgccctgaa tgaactgcaa gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcg acgacgggcg 2160

ttccttgcgc cgctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg 2220

gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca 2280

tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc 2340

accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc 2400

aggatgatct ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca 2460

aggcgtctat gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga 2520

atatcatggt ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggtcgg ctgggtgtgg 2580

cggaccgcta tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg 2640

aatgggctga ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg 2700

ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gacgatcgcg tacggaagtt agagaaaagg 2760

cataagtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 2820

gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 2880

caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc 2940

tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 3000

ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 3060

tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 3120

gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 3180

tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 3240

gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 3300

gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 3360

ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 3420

ggccttttgc tcatctcatg aaaattatgc aaattgagcc agtcaggc 3468

<210> 13

<211> 659

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gacattgatt attgacatgt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct 420

cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga 480

tgggggcggg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg 540

gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc 600

cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcg 659

<210> 14

<211> 1018

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ggagtcgctg cgacgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc 60

gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc 120

tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt tcttttctgt ggctgcgtga 180

aagccttgag gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg agcggctcgg ggggtgcgtg 240

cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggctccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg 300

ctgcgggcgc ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcagtgtg cgcgagggga gcgcggccgg 360

gggcggtgcc ccgcggtgcg gggggggctg cgaggggaac aaaggctgcg tgcggggtgt 420

gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg cgcgtcggtc gggctgcaac cccccctgca 480

cccccctccc cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtacggggcg 540

tggcgcgggg ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc 600

ggggccgcct cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccc ggagcgccgg 660

cggctgtcga ggcgcggcga gccgcagcca ttgcctttta tggtaatcgt gcgagagggc 720

gcagggactt cctttgtccc aaatctgtgc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac 780

cccctctagc gggcgcgggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga 840

gggccttcgt gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccct ctccagcctc ggggctgtcc 900

gcggggggac ggctgccttc gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt 960

gaccggcggc tcttgagcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacag 1018

<210> 15

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aataaaggaa atttattttc attgcaatag tgtgttggaa ttttttgtgt ctctca 56

<210> 16

<211> 3751

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

actgcggccg ccctgcaggt caactagtga cgtcttaatt aattgccggc tggaacgcgt 60

gacattgatt attgacatgt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 120

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 180

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 240

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 300

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 360

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 420

tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct 480

cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga 540

tgggggcggg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg 600

gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc 660

cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgt 720

tcgaaggagt cgctgcgacg ctgccttcgc cccgtgcccc gctccgccgc cgcctcgcgc 780

cgcccgcccc ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct 840

tctcctccgg gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc ttgtttcttt tctgtggctg 900

cgtgaaagcc ttgaggggct ccgggagggc cctttgtgcg gggggagcgg ctcggggggt 960

gcgtgcgtgt gtgtgtgcgt ggggagcgcc gcgtgcggct ccgcgctgcc cggcggctgt 1020

gagcgctgcg ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgca gtgtgcgcga ggggagcgcg 1080

gccgggggcg gtgccccgcg gtgcgggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg 1140

ggtgtgtgcg tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgt cggtcgggct gcaacccccc 1200

ctgcaccccc ctccccgagt tgctgagcac ggcccggctt cgggtgcggg gctccgtacg 1260

gggcgtggcg cggggctcgc cgtgccgggc ggggggtggc ggcaggtggg ggtgccgggc 1320

ggggcggggc cgcctcgggc cggggagggc tcgggggagg ggcgcggcgg cccccggagc 1380

gccggcggct gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag 1440

agggcgcagg gacttccttt gtcccaaatc tgtgcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc 1500

cgcaccccct ctagcgggcg cggggcgaag cggtgcggcg ccggcaggaa ggaaatgggc 1560

ggggagggcc ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc tccctctcca gcctcggggc 1620

tgtccgcggg gggacggctg ccttcggggg ggacggggca gggcggggtt cggcttctgg 1680

cgtgtgaccg gcggctcttg agcctctgct aaccatgttc atgccttctt ctttttccta 1740

cagcttcgaa cctgggcaac gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaaatcg 1800

attgaattct ggccaagtgg atccgctagc tctagagtcg acggtaccag tactaagctt 1860

gcctcgagga tatcccatgg agatctatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac 1920

ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct 1980

ctcactcgga aggacatatg ggagcatgcc ctaggtccgg aaccggttgg cgcgccatct 2040

ggcagcgatc gccgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat 2100

ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg 2160

agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt 2220

tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga 2280

gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa 2340

gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt 2400

attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 2460

gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 2520

agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 2580

ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 2640

cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 2700

gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 2760

cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 2820

gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc 2880

ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 2940

acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 3000

ctgattaagc attggtaacg tacggaagtt agagaaaagg cataagtaga aaagatcaaa 3060

ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 3120

ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 3180

actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc 3240

caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 3300

gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 3360

ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 3420

cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt 3480

cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 3540

acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 3600

ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 3660

gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcatctcatg 3720

aaaattatgc aaattgagcc agtcaggcag t 3751

Claims

1.基础质粒载体，特征在于，所述基础质粒载体的功能元件按5’端到3’端顺序由多克隆位点序列、用于原核细胞的抗性基因序列及其启动子和Ori序列组成，所述多克隆位点序列中包含多个限制性内切酶位点，所述多个限制性内切酶位点是哺乳动物细胞稀有的限制性内切酶位点，所述多克隆位点序列按5’端到3’端顺序至少包括SpeI位点和AvrII位点或至少包括MluI位点和AscI位点，在至少包括SpeI位点和AvrII位点的情况下，AvrII位点不是所述多克隆位点序列中的最后一个限制性内切酶位点，在至少包括MluI位点和AscI位点的情况下，AscI位点不是所述多克隆位点序列中的最后一个限制性内切酶位点，并且在所述基础质粒载体中，除了Ori序列和用于原核细胞的抗性基因序列及其启动子以外，不存在来自原核生物的调控序列。

2.权利要求1的基础质粒载体，其中所述Ori序列选自：pMB1、pBR322、ColE1、R6K、P15A、pSC101、F1和pUC，优选为PUC。

3.权利要求1的基础质粒载体，其中所述用于原核细胞的抗性基因序列选自：氨苄青霉素、博来霉素、羧苄青霉素、氯霉素、红霉素、卡那霉素、多粘菌素B、奇霉素、链霉素和四环素抗性基因，优选为氨苄青霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因，所述用于原核细胞的抗性基因的启动子例如是AmpR启动子。

4.权利要求1的基础质粒载体，其中所述多克隆位点序列按5’端到3’端顺序包含以下限制性内切酶位点：NotI、SbfI、SpeI、PacI、MluI、BstBI、ClaI、EcorI、BamHI、XbaI、HindIII、XhoI、BglII、SphI、AvrII、BspE1、AgeI、AscI和AsiSI，优选地，所述多克隆位点序列按5’端到3’端顺序包含以下限制性内切酶位点：NotI、PstI/SbfI、SpeI、ZraI、PacI、NgoMIV、MluI、BstBI、ClaI、EcorI、MscI、BamHI、NheI、XbaI、SalI、Acc65I、KpnI、HindIII、XhoI、NcoI、BglII、SphI、AvrII、BspEI、AgeI、AscI/BssHII和AsiSI/PvuI，更优选地，所述多克隆位点序列如SEQIDNO.1所示。

5.权利要求1的基础质粒载体，其中所述用于原核细胞的抗性基因序列和Ori序列之间存在限制性内切酶位点，例如，BsiWI位点。

6.权利要求1的基础质粒载体，其中所述Ori序列和所述多克隆位点序列之间存在限制性内切酶位点，例如，BglI位点。

7.权利要求1的基础质粒载体，其具有SEQIDNO.6或SEQIDNO.7所示的序列。

8.质粒载体，所述质粒载体通过在权利要求1-7中任一项的基础质粒载体的多克隆位点序列中插入用于真核细胞的抗性基因序列及其调控元件获得，所述用于真核细胞的抗性基因序列例如选自以下：潮霉素、嘌呤霉素、G418、Bla、博莱霉素、二氢叶酸还原酶和谷氨酰胺合成酶抗性基因序列，所述调控元件例如选自用于调控所述用于真核细胞的抗性基因序列的启动子(例如SV40启动子)、IRES序列和P2A序列。

9.质粒载体，所述质粒载体通过在权利要求1-7中任一项的基础质粒载体的多克隆位点序列中插入标签序列获得，所述标签序列例如是选择标签或纯化标签。

10.质粒载体，所述质粒载体通过在权利要求1-9中任一项的质粒载体的多克隆位点序列中插入一个或多个真核表达盒获得，在至少包括SpeI位点和AvrII位点的情况下，所述真核表达盒被插入在SpeI位点之后并且在AvrII位点之前，在至少包括MluI位点和AscI位点的情况下，所述真核表达盒被插入在MluI位点之后并且在AscI位点之前，所述真核表达盒包含真核启动子序列、目的基因序列和polyA序列，优选地，所述真核表达盒还包含用于增强真核表达的内含子序列。

11.权利要求10的质粒载体，其中所述多克隆位点序列按5’端到3’端顺序包含以下限制性内切酶位点：NotI、SbfI、SpeI、PacI、MluI、BstBI、ClaI、EcorI、BamHI、XbaI、HindIII、XhoI、BglII、SphI、AvrII、BspE1、AgeI、AscI和AsiSI，所述真核表达盒被插入在MluI位点之后并且在AvrII位点之前，所述启动子优选地在MluI位点和BstBI位点之间被插入，所述内含子序列优选地在BstBI、CalI或EcorI位点被插入，所述polyA序列优选地在XhoI、BglII或SphI位点被插入，所述目的基因序列优选地在ClaI、EcorI、BamHI、XbaI、HindIII或XhoI位点被插入。

12.质粒载体，其序列如SEQIDNO.11、SEQIDNO.12或SEQIDNO.16所示。

13.权利要求1-12中任一项的质粒载体在构建用于将目的基因转入哺乳动物细胞的质粒载体中的用途。