CN105331604A - 一种dna构建物以及dna体外拼接方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种DNA构建物含有结构如式“Ha-C-Hb”所示的核酸序列，式中，Ha为第一归位内切酶酶切位点；C为待拼接的核酸序列；Hb为第二归位内切酶酶切位点；其中，第一归位内切酶和第二归位内切酶为不同种类的同尾归位内切酶。本发明还提供了上述DNA构建物的应用和使用该DNA构建物的一种DNA体外拼接方法。使用本发明的构建物和方法能够对DNA进行工程化、标准化、模块化的改造或组装。

Description

一种DNA构建物以及DNA体外拼接方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于遗传改造的构建物以及DNA体外拼接方法。

背景技术

DNA合成和组装技术的突破极大地推动了合成生物学领域的进展，而随着合成生物学的深入发展，对DNA合成和组装技术也提出了更多的挑战和要求。生物砖块标准化组装技术的出现，受到了合成生物学界的广泛应用和欢迎，极大简化了遗传回路构建过程中的思路设计和工作量。

合成生物学的核心概念“工程化、标准化、模块化”在生物砖块(BioBricks^TM)这个拼接标准上得到了很好的体现和传播。尤其是建立在生物砖块库基础上的IGEM国际竞赛不仅传播了合成生物学的思想，而且促进了合成生物学的开源共享，激发了青年学生对合成生物学的想象力。将DNA的生物功能元件进行表征后并建立标准化的接口形成的生物砖块，在构建基因回路的时候不仅技术操作上非常简便，更重要的是这种设计具备指数增长的组合潜能，不仅大大简化了基因回路构建中的设计和工作量，而且使得从简到繁构建越来越复杂的基因回路成为可能。相比于传统的克隆构建过程，生物砖块的组合潜能和层级组装策略受到了合成生物学界的广泛欢迎，降低了基因回路构建的技术门槛，使得越来越多的复杂设计不断涌现。

鉴于生物砖块组装技术的重要性，很多生物砖块组装技术的变种也陆续开发出来了，满足不同组装标准要求的文库构建工作也在开展。这些技术各有特点，最常用的生物砖块组装技术因为具有最长的开发时间和广泛的影响力，积累了最丰富的生物砖块文库(Shetty,Endyetal.2008；Kelly,Rubinetal.2009)。例如，BglBrick生物砖块组装技术因为接口选择的疤痕更合理，在融合蛋白的组装上更有优势(Lee,Krupaetal.2011)。最近，随着复杂基因回路构建的兴起，更多组装技术被开发出来。基于typeIIS限制性内切酶的生物砖块组装技术在开发和推广的过程中(Sarrion-Perdigones,Falconietal.2011；Weber,Engleretal.2011)。基于末端同源片段来进行组装的In-Fusion技术，Gibson技术也运用到生物砖块的组装中了(Sleight,Bartleyetal.2010；Siuti,Yazbeketal.2013；SleightandSauro2013)。针对复杂基因回路经常需要进行调试，能够进行拼接后修饰的Bioscaffold和迭代组装技术也被开发出来(Norville,Derdaetal.2010；Litcofsky,Afeyanetal.2012)。

目前，生物砖块的组装技术还有一些不足之处和很大的改进空间。例如，生物砖块组装过程中需要循环利用选定好的II型同尾限制性内切酶，这就要求在构建生物砖块标准化接口的时候去除生物砖块内部的酶切位点。目前主要是通过从头合成DNA的时候通过密码子替换去除末端用来拼接的酶切位点或者通过PCR同义突变的方式来去除生物砖块内部的酶切位点。从头合成，不仅价格昂贵，速度慢，而且部分DNA序列经过改变之后有可能会影响该段DNA序列的功能；而通过PCR同义突变时，不仅工作量巨大(特别是针对一些较大的生物砖块)，而且也会对该段DNA的功能带来不确定的影响。同时，这种要求限制了生物砖块组装技术的通用性，使得一些实验室自有的生物功能元件在没有去除内部酶切位点之前，不能通过标准化的接口技术来进行层级组装。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA构建物及其应用。

本发明的另一目的是提供一种体外拼接DNA的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种DNA构建物，所述DNA构建物含有结构如式I所示的核酸序列：

Ha-C-HbI

式中，Ha为第一归位内切酶酶切位点；C为待拼接的核酸序列；Hb为第二归位内切酶酶切位点；

其中，所述第一归位内切酶和所述第二归位内切酶为不同种类的同尾归位内切酶。

在另一优选例中，所述归位内切酶(Homingendonuclease)选自：I-SceI和PI-PspI。

在另一优选例中，所述式I中所述Ha为I-SceI酶切位点；所述Hb为PI-PspI酶切位点。

在另一优选例中，所述式I中所述Ha为PI-PspI酶切位点；所述Hb为I-SceI酶切位点。

在另一优选例中，所述的待拼接的核酸序列包括CDS序列、编码基因序列、抗生素生物合成基因簇、负责接合转移转移的元件或有特定功能的DNA序列。

在另一优选例中，所述待拼接的核酸序列长度≥100bp，较佳地≥500bp，更佳地≥1kb，如1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb、50kb、100kb。

在另一优选例中，所述C中不含有所述第一归位内切酶和/或所述第二归位内切酶的酶切位点。

在另一优选例中，所述C中包含核糖体结合位点(RibosomeBindingSite,RBS)。

在另一优选例中，所述，所述I-SceI酶切位点包含选自下组的核酸序列：

(a)5’-ATTACCCTGTTATCCCTA-3’和/或其反向互补序列；

(b)将(a)中的核酸序列经过一个或多个核苷酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且能够被I-SceI酶识别的由(a)衍生的核酸序列。

在另一优选例中，所述PI-PspI酶切位点包含选自下组的核酸序列：

(a)5’-GGCAAACAGCTATTATGGGTATTATGGGT-3’和/或其反向互补序列；

(b)将(a)中的核酸序列经过一个或多个核苷酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且能够被PI-PspI酶识别的由(a)衍生的核酸序列。

在另一优选例中，所述的构建物还含有位于式I所示的核酸序列上游或下游的选自下组的元件：

选择性标记基因、复制元件、启动子、终止子、poly(A)元件、转运元件、基因靶向元件、筛选标记基因、增强子和转座酶编码基因。

在另一优选例中，所述选择性标记基因选自抗性标记。

本发明的第二方面，提供了一种载体，所述载体包含本发明第一方面所述的构建物。

本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞的基因组的一个或多个位点整合有本发明的第一方面所述的构建物，或者所述宿主细胞中含有本发明的第二方面所述的载体。

本发明的第四方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包含的试剂选自下组中的一种或多种：

(a)本发明的第一方面所述的构建物；

(b)本发明的第二方面所述的载体；

(c)本发明的第三方面所述的细胞；

(d)I-SceI内切酶或I-SceI内切酶表达载体；和

(e)PI-PspI内切酶或PI-PspI内切酶表达载体。

本发明的第五方面，提供了如本发明的第一方面所述的构建物、本发明的第二方面所述的载体、本发明的第三方面所述的细胞或本发明的第四方面所述试剂盒的用途，用于细胞基因组的遗传改造和/或用于基因回路的构建。

本发明的第六方面，提供了一种DNA体外拼接方法，包括步骤：

(1)提供含有第一构建物的第一载体，所述第一构建物含有结构如式Ia所示的第一核酸序列，

Ha-Ca-HbIa

式中Ha、Hb的定义如本发明的第一方面中所述，Ca为第一待拼接的核酸序列；

(2)使用第二归位内切酶酶切所述载体的第二归位内切酶酶切位点，形成线性化的第一酶切产物；

(3)提供第二构建物，所述第二构建物含有结构如式Ib所示的第二核酸序列，

Ha-Cb-HbIb

式中Ha、Hb的定义如上所述，Cb为第二待拼接的核酸序列；

并对所述第二构建物用第一归位内切酶和第二归位内切酶进行双酶切，形成经酶切的第二酶切产物；

(4)将第二酶切产物与所述的第一酶切产物进行连接反应，从而形成含有式II所示的拼接序列的载体：

Ha-Ca-Scar-Cb-HbII

式中，Ha、Hb、Ca、和Cb的定义如上所述，而Scar为拼接过程中所形成的拼接接头序列。

在另一优选例中，所述的Scar的长度是3的倍数。

在另一优选例中，所述Scar的长度为21bp。

在另一优选例中，所述的第二构建物被整合或连接入第一载体的第二归位内切酶酶切缺口。

在另一优选例中，所述的方法还包括任选地重复以下步骤一次或多次：

(5)对于上一步骤获得的载体，用第二归位内切酶进行酶切，获得线性化的酶切产物，并将所述酶切产物与经第一归位内切酶和第二归位内切酶双酶切的酶切产物进行连接反应，从而形成含多级拼接序列的连接产物。

在另一优选例中，所述的Ca和Cb中不含有所述第一归位内切酶和所述第二归位内切酶的酶切位点。

在另一优选例中，所述归位内切酶(Homingendonuclease)选自：I-SceI、PI-PspI。

在另一优选例中，所述Ha为I-SceI酶切位点；所述Hb为PI-PspI酶切位点。

在另一优选例中，所述Ha为PI-PspI酶切位点；所述Hb为I-SceI酶切位点。

在另一优选例中，所述的待拼接的核酸序列包括CDS序列、编码基因序列、抗生素生物合成基因簇。

在另一优选例中，所述待拼接的核酸序列长度≥100bp，较佳地≥500bp，更佳地≥1kb，如1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb、50kb、100kb。

在另一优选例中，所述I-SceI酶切位点包含选自下组的核酸序列：

(a)5’-ATTACCCTGTTATCCCTA-3’和/或其反向互补序列；

(b)将(a)中的核酸序列经过一个或多个核苷酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且能够被I-SceI酶识别的由(a)衍生的核酸序列。

在另一优选例中，所述PI-PspI酶切位点包含选自下组的核酸序列：

(a)5’-GGCAAACAGCTATTATGGGTATTATGGGT-3’和/或其反向互补序列；

(b)将(a)中的核酸序列经过一个或多个核苷酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且能够被PI-PspI酶识别的由(a)衍生的核酸序列。

在另一优选例中，所述的构建物还含有位于式Ia或Ib所示的核酸序列上游或下游的选自下组的元件：

选择性标记基因、复制元件、启动子、终止子、poly(A)元件、转运元件、基因靶向元件、筛选标记基因、增强子和转座酶编码基因。

在另一优选例中，所述选择性标记基因选自：营养缺陷型标记、抗性标记、报告基因标记等。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明的一个优选地iBrick工作流程图。图A中为本发明DNA构建物中所含有的核酸序列结构图。图B为iBrick工作流程图。

图2显示I-SceI和PI-PspI的识别位点及Scar序列。I-SceI和PI-PspI是同尾酶，由于它们识别的DNA序列不是回文序列，而且切割之后的粘性末端也不是回文序列，因此只需要两个酶即可以完成定向组装，具体的组装流程见图2。两个DNA序列(PartA，PartB)连接之后将产生一个21bp的scar，其中没有终止密码子，因此，可以应用于融合蛋白的表达，等等。

图3A-3D显示利用本发明的一个较佳的iBrick系统拼接了番茄红素生物合成基因簇并成功进行了异源表达。图3A显示了拼接的番茄红素生物合成基因簇异源表达的质粒图谱；图3B显示了在大肠杆菌DH5α中的表达结果，白色为转了空质粒pJK5的菌株，红色为转了表达质粒pIB1A1_0-X000003的菌株；图3C、图3D显示了番茄红素使用LC/MS的检测结果，表达的番茄红素的特征与标准品相同。

图4显示利用本发明的一个较佳的iBrick系统成功克隆了近30kb的天蓝色链霉菌中的放线紫红素生物合成基因簇(actinorhodin,act)并在嗜热链霉菌中成功地进行了异源表达。该载体采用了F因子的ori2复制子和高拷贝的oriV复制子以及ParA，ParB和ParC等元件构成，方便克隆大片段DNA序列。(A)拼接的用于act异源表达的质粒图谱；(B)构建的质粒用XcmI进行酶切验证；pIB2Am1_0-X000005为连入act生物合成基因簇的质粒，pIB2Am1_0-X000004为对照质粒；图中标“-”的泳道为pIB2Am1_0-X000004；“+”泳道为pIB2Am1_0-X000005，M为Thermo公司GeneRuler1kbDNAladder，条带大小已经标出。从电泳图谱中可以看出相比于pIB2Am1_0-X000004，pIB2Am1_0-X000005的酶切产物中多出了很多条带，证明了pIB2Am1_0-X000005中成功地连接了act生物合成基因簇。(C)为图4B中两个质粒的电子酶切图谱，其中pIB2Am1_0-X000004的理论大小为：8.32kb和1.88kb；pIB2Am1_0-X000005的理论大小为：9.93,5.28,4.18,3.38,2.67,2.08,1.88,1.08和0.78kb。图上可以看出，图4B的实验结果和图4C的理论分析结果一致，证明了所获得的克隆正确。(D)克隆的act生物合成基因簇在Streptomyces4F菌中成功进行异源表达。

图5A、图5B、图5C、图5D、图5E显示了本发明实施例中所制备质粒的图谱。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，意外地获得了一种体外DNA拼接的技术方案。采用在基因组中极为稀少的归位内切酶I-SceI和PI-PspI作为末端拼接的接口，对DNA进行工程化、标准化、模块化的改造或组装。实验结果表明，采用上述技术方案成功地进行了番茄红素生物合成基因簇和放线紫红素生物合成基因簇的异源表达。再此基础上申请人开发了第二代的生物砖块组装标准，并完成了本发明。

术语

术语“生物砖块(BioBricks^TM)”指由TomKnight等人在2003年提出的一种DNA标准化组装标准(IdempotentVectorDesignforStandardAssemblyofBiobricks.DSpace2003http://hdl.handle.net/1721.1/21168.)。

Biobricks^TM标准内容中的每一个part都必须带有4个II型限制性内切酶的酶切位点，他们分别是EcoRI、XbaI、SpeI和PstI。其中XbaI和SpeI是同尾酶，作为不同part之间的连接的接口。用作载体的part用EcoRI和PstI进行酶切，上游part用EcoRI和SpeI切，下游part用Xba和PstI切，然后把三个片段连接起来就得到想要的新元件，并且这个新元件可以进行下一轮的拼接，从而实现了迭代拼接的理念。

术语“归位内切酶(Homingendonuclease)”、“归位限制性内切酶”具有相同的含义，是指一种双链DNA限制性内切酶，能够识别较大的非回文序列(12bp以上)，并产生非回文的粘性末端。

本发明中，iBrick是指利用两个归位内切酶进行生物元件(part)间迭代拼接的一种DNA标准化组装技术。在iBrick中，每一个生物元件的5’端带有第一归位内切酶酶切位点，而3’端则带有第二归位内切酶酶切位点。所述第一归位内切酶和所述第二归位内切酶为不同种类的同尾归位内切酶。

本发明中术语“同尾归位内切酶”是指，酶切DNA后能够产生相同的粘性末端的酶。由同尾归位内切酶产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用彼此连接起来的。

本发明中术语“待拼接的核酸序列”是指任一感兴趣的核酸序列，包括(但不限于)CDS序列、抗性基因编码序列、抗生素生物合成基因簇、启动子序列、终止子序列、复制子序列。

优选地在本发明中，iBrick是指利用I-SceI和PI-PspI两个归位内切酶进行生物元件(part)间迭代拼接的一种DNA标准化组装标准。在iBrick标准中，每一个part的5’端带有I-SceI酶切位点，而3’端则带有PI-PspI酶切位点。

术语“part”、“生物元件”具有相同的含义，是指一段DNA序列，按照iBrick标准分别在序列的5’端加入了I-SceI位点和3’端加入了PI-PspI位点。

术语“归位内切酶PI-PspI”、“内切酶PI-PspI”、“PI-PspI酶”具有相同的含义，指归位限制性内切酶PI-PspI(Homingendonuclease)，其识别和酶切的DNA核心序列包含下列序列(或其反向互补序列)：

5’-GGCAAACAGCTATTATGGGTATTATGGGT-3’(SEQIDNO.:1)

术语“内切酶I-SceI”、“I-SceI酶”具有相同的含义。I-SceI酶是一种核酸内切酶，可特异地在I-SceI识别位点进行双链切割。I-SceI识别和酶切的DNA核心序列包含下列序列(或其反向互补序列)：

5’-ATTACCCTGTTATCCCTA-3’(SEQIDNO.:2)

术语“scar”是指DNA序列经过I-SceI和PI-PspI酶切后，产生的粘性末端进行拼接后产生的21bp的DNA片段，其序列(或其反向互补序列)为：

5’-GGCAAACAGCTATTATCCCTA-3’(SEQIDNO.:3)

根据本发明的iBrick工作原理

本发明的所述DNA构建物含有结构如式I所示的核酸序列：

Ha-C-HbI

式中，Ha为第一归位内切酶酶切位点；C为待拼接的核酸序列；Hb为第二归位内切酶酶切位点；

其中，所述第一归位内切酶和所述第二归位内切酶为不同种类的同尾归位内切酶。

在另一优选例中，所述式I中所述Ha为I-SceI酶切位点；所述Hb为PI-PspI酶切位点。根据该构建物的iBrick工作原理如图1所示，将每个生物元件两端都加上稀有酶切位点：I-SceI和PI-PspI，其中，I-SceI位于5’末端，PI-PspI位于3’末端。生物元件连接在载体上，形成质粒以用于保存。如图所示，当组装A和B两个元件时，含A元件(PartA)的质粒用PI-PspI酶切后作为载体；作为外源的B元件(PartB)用I-SceI和PI-PspI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收，然后把外源和载体按一定的摩尔比混合连接，并转化大肠杆菌(或其它合适的宿主)得到新的A-B元件。两个元件之间会产生21bp的scar，由于该序列中不含有in-frame的终止密码子，因此，该方法适用于融合蛋白的表达。在进行拼接时，为了防止载体自连，载体酶切完后进行琼脂糖凝胶电泳，并使用DNA凝胶回收试剂盒回收后用CIP(calfintestinalphosphatase)去磷，然后再次用DNA凝胶回收试剂盒进行回收。

在其他实施方式中，所述式I中所述Ha为PI-PspI酶切位点；所述Hb为I-SceI酶切位点。使用该种形式的DNA构建物，经iBrick后形成的核酸序列Scar中含有终止密码子，因此能够实现在核酸序列中引入终止密码子的功能。而且，如果引入终止密码子后不影响DNA序列的功能，该方法也同样适用。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

DNA构建物

本发明提供了一种DNA构建物，所述DNA构建物含有结构如式I所示的核酸序列：

Ha-C-HbI

式中，Ha为第一归位内切酶酶切位点；C为待拼接的核酸序列；Hb为第二归位内切酶酶切位点；

其中，所述第一归位内切酶和所述第二归位内切酶为不同种类的同尾归位内切酶。

在另一优选例中，所述的构建物还包括选自下组的元件或其组合：启动子、终止子、poly(A)元件、转运元件、基因靶向元件、筛选标记基因、增强子、抗性基因、转座酶编码基因。

多种选择性标志基因均可应用于本发明，包括但不限于：营养缺陷型标记，抗性标记，报告基因标记。选择性标志的应用对于重组细胞(重组子)的筛选起到作用，使得受体细胞能够与未转化的细胞进行显著区分。营养缺陷型标记是通过转入的标记基因与受体细胞突变基因互补，从而使受体细胞表现野生型生长。抗性标记是指将抗性基因转入受体细胞中，转入的基因使受体细胞在一定的药物浓度下表现抗药性。作为本发明的优选方式，应用抗性标记来实现重组细胞的便捷筛选。

载体，宿主细胞

本发明还提供了一种载体，所述载体含有本发明的DNA构建物。优选地，所述载体选自：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、或动物细胞载体、穿梭载体；所述的载体为转座子载体。用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。

本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的启动子和/或目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

本发明还提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有所述的构建物或载体，或所述的宿主细胞染色体整合有所述的构建物或载体。在另一优选例中，所述的宿主细胞还包括含有编码转座酶基因的载体或其染色体上整合有转座酶基因。

优选地，所述的宿主细胞为大肠杆菌、链霉菌或真核细胞。

在另一优选例中，所述原核细胞，包括(但不限于)：大肠杆菌等。

在另一优选例中，所述真核细胞，包括(但不限于)：嗜热连接酶4F等。

本发明的构建物或载体，可以用于转化适当的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等动物细胞，如昆虫细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。

本发明的主要优点在于：

(1)由于归位内切酶识别的序列远长于常规的内切酶，多达12-40个碱基对，其识别位点在天然DNA序列中非常稀少。因此，在构建iBrick标准化元件时，基本上不需要进行DNA内部酶切位点的去除，这使得这个技术能够不需要改造原始的序列就能够容纳更大的生物元件，能够直接利用有更好表征的天然序列，极大地减少了标准化生物元件的工作量，增加了这个组装技术中循环组装策略使用的普适性；

(2)长的识别序列也为长片段的克隆和拼接提供了单一酶切位点，使得单个生物元件的容量可以大大增加。因此，该技术在长片段DNA序列的标准化、组装和表征等方面具有显著的优点。

(3)使用两个酶代替之前标准的四个酶，使组装过程更简化。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明中所涉及的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。

材料

1.质粒pUC18和大肠杆菌DH5α菌株购自Takara公司；pCC2FOS购自Epicenter公司；番茄红素标准品，各种生化试剂(如未注明)均购自Sigma-Aldrich公司；DNA限制性内切酶，T4DNA连接酶，T4PolynucleotideKinase，calfintestinalphosphatase等购自NewEnglandBiolabs公司；电击转化仪GenePulserII购自Bio-Rad公司；SVGelandPCRClean-UpSystem购自Promega公司；pET28a质粒购自Novagen公司；培养基(如，Tryptone，YeastExtract等，如没有特别注明的话)均购自OXOID公司。

2.含有天蓝色链霉菌放线紫红素生物合成基因簇的cosmidN07_85其制备方法可参考文献(夏海洋，2009)；BBa_274100购自iGEM(http://igem.org/Main_Page)；嗜热链霉菌Streptomyces4F.请见中国专利ZL201010200332.6。

3.培养基配方：液体LB(1％Tryptone，0.5％Yeastextract,1％NaCl)，配置固体LB时，只需要在液体LB中添加1％的琼脂即可；MS平板(2％mannitol；2％soyaflour；2％agar)；R2YE培养基(每1LR2YE包含：Traceelementsolution，2mL；TESbuffer(5.73％,w/v)，100mL；KH₂PO₄(0.5％,w/v)，10mL；CaCl₂.2H₂O(3.68％,w/v)，80mL；L-proline(20％,w/v)，15mL；1MNaOH，5mL。Traceelementsolution(1L)的配方是：ZnCl₂，40mg；FeCl₃.6H₂O，200mg；CuCl₂.2H₂O，10mg；MnCl₂.4H₂O，10mg；Na₂B₄O₇.10H₂O，10mg；(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O，10mg。)

实施例1番茄红素生物合成基因簇的异源表达

1.以pUC18为模板，PCR扩增出bla基因和复制子，bla基因两端带有PacI和NotI酶切位点，复制子两端带有NotI及SwaI-AscI位点。用NotI酶切(37℃/1h)两个片段，将两个片段以等摩尔比混合连接，连接时体系中加入T4PNK(T4PolynucleotideKinase)，16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α，在LB加氨苄抗生素的平板筛选阳性克隆，并进行测序验证。将正确的质粒命名为pJK5。

2.以BBa_274100为模板扩增crtEBI(crtE、crtB、crtI)基因；以pKD46为模板，扩增pBAD启动子。上述几个parts中，crtE的5’末端带有SwaI和I-SceI位点，3’末端带有AscI和PI-PspI位点；其余parts的5’末端只带有I-SceI位点，3’末端只带有PI-PspI位点。

3.用SwaI和AscI双酶切pJK5并用CIP(calfintestinalphosphatase)去磷并经过琼脂糖凝胶电泳回收作为载体；同时用这两个酶酶切上述crtE的PCR产物，并回收作为外源。然后，以酶切处理后的pJK5作为载体，crtE作为外源，将外源和载体以摩尔比3：1混合，加入1μl10*T4Ligasebuffer和1μlT4DNALigase连接转化DH5α(以下克隆方法同此)，通过测序鉴定得到正确的质粒命名为pIB1A1_0-C000001。使用普通的限制性内切酶时，直接按照制造商提供的反应条件进行即可。

4.用I-SceI和PI-PspI酶切pIB1A1_0-C000001并去磷作为载体，同时用I-SceI和PI-PspI酶切crtB，crtI和pBAD并连接，分别得到克隆pIB1A1_0-C000002，pIB1A1_0-C000003和pIB1A1_0-P000001。利用I-SceI和PI-PspI进行双酶切时(下同)，使用PI-PspI的酶切缓冲液，先加入I-SceI酶后在37℃酶切1h，然后直接加入PI-PspI，并将反应体系转移至65℃继续酶切1h。

5.用I-SceI和PI-PspI酶切pIB1A1_0-C000001和pIB1A1_0-C000003，回收crtE和crtI作外源；同时用PI-PspI酶切pIB1A1_0-P000001和pIB1A1_0-C000002并去磷，然后回收作为载体。将crtE和pIB1A1_0-P000001酶切产物连接，得到pIB1A1_0-X000002；将crtI和pIB1A1_0-C000002载体连接，得到pIB1A1_0-X000001。

6.用I-SceI和PI-PspI酶切pIB1A1_0-X000001，回收小片段作外源；同时用PI-PspI酶切pIB1A1_0-X000002并去磷，回收后作为载体。将上述DNA片段以3:1的摩尔比连接并转化到DH5α，验证正确的质粒命名为pIB1A1_0-X000003。经过测试，上述连接反应中，每一步的准确率都不低于75％(见表1)。

7.含有质粒pIB1A1_0-X000003的大肠杆菌，在有阿拉伯糖诱导培养条件下，可以产生红色代谢物，并且菌落会变为红色。将菌株在液体LB中进行培养，然后离心收集菌体。菌体使用等体积的丙酮进行处理，然后使用AgilentLC1200/AccurateMass6520AQTOF(AgilentTechnologies)液质联用仪器检测发酵产物，柱子的规格和型号为AgilentZorbaxXDB-C184.6*50mm,1.8μm。以从Sigma-Aldrich购买的lycopene标准品为正对照，以只转化了pJK5的大肠杆菌的发酵液为负对照。分析结果表明，转化了pIB1A1_0-X000003的大肠杆菌可以成功地表达lycopene；这也证明了iBrick拼接方法的可行性。

实施例2放线紫红素生物合成基因簇的异源表达

1.以pET28a为模板扩增卡纳霉素抗性基因，然后用PacI和NotI双酶切并去磷后回收；同时用这两个酶将pIB1A1_0-C000001中的氨苄抗性基因切除，然后连入卡纳抗性基因，得到的质粒命名为pIB1K1_0-C000001。利用同样的方法，以pSET152质粒为模板扩增阿伯拉霉素抗性基因，然后将pIB1A1_0-C000001中的氨苄抗性基因替换成阿伯拉抗性基因，得到质粒pIB1Am1_0-C000001。

2.用SwaI和NotI酶切pIB1A1_0-C000001并去磷处理后作为载体，再用这两个酶切pCC2FOS的复制子(复制子的制备见实施案例1)，连接后得到质粒pIB2A1_0-C000001。PacI和NotI酶切pIB1K1_0-C000001，回收卡纳抗性基因，然后用同样的酶对pIB2A1_0-C000001进行酶切处理并去磷制作载体，连接后得到pIB2K1_0-C000001.3.以pIB2K1_0-C000001为模板，用引物ibrick-act-f和ibrick-act-r进行PCR扩增，得到的扩增产物两端便带上与act生物合成基因簇的上下游序列一致的同源臂，同源臂长度为52bp。该克隆大片段DNA的方法也被称为gaprepair方法(MarsischkyandLaBaer2004)。

4.把含有act生物合成基因簇的CosmidN07_85转化到大肠杆菌BW25113/pIJ790(Gust,Chandraetal.2004)中，于30℃培养。挑选克隆接种到含有氨苄青霉素和氯霉素的5ml液体LB培养基中30℃培养～8h，然后转接到含有50mlLB培养基的三角瓶中并添加氨苄青霉素和氯霉素抗生素以及终浓度为10mM的新鲜阿拉伯糖，继续于30℃培养到OD值在0.4-0.8之间。把培养物置于冰上10min预冷，然后于4℃下，4000rpm离心15min，弃去上清，用10％预冷的甘油重悬菌体再离心(重复2次)，最后用500μl10％的甘油重悬。5.将上述制备的PCR产物电转进入上述感受态细胞中，电转化参数为2.5kV，200Ω和25μF。电转化之后立即加入800μl新鲜的LB液体培养基并于37℃复壮1h。将菌体涂布到加有卡纳霉素的LB固体平板上，于37℃培养17-20h至菌落可见后挑取菌落进行大小鉴定和PCR验证。正确的质粒命名为pIB2K1_0-K000001。

6.以pSET152(Bierman,Loganetal.1992)为模板，扩增整合酶基因phiC31integrase以及结合转移的oriT片段，用I-SceI和PI-PspI双酶切处理后，将PCR产物连入同样处理的pIB1A1_0-C000001后，得到质粒pIB1A1_0-X000004。

用I-SceI和PI-PspI双酶切pIB2K1_0-C000001并去磷作为载体；同时用I-SceI和PI-PspI双酶切pIB1A1_0-X000004制备int/oriTPCR片段作为外源，将两个片段连接转化得到克隆pIB2K1_0-X000004。

然后再从pIB1Am1_0-C000001用PacI和NotI切下阿伯拉霉素抗性基因，作为外源；同样的酶处理pIB2K1_0-X000004以切除上面的卡纳抗性基因，作为载体；最后将载体与外源连接，得到质粒pIB2Am1_0-X000004。

7.用I-SceI和PI-PspI双酶切pIB2K1_0-K000001，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收act生物合成基因簇大片段；同时用这两个酶酶切pIB2Am1_0-X000004并进行去磷酸化处理来制备载体。将载体和外源连接后，转化到DH5α得到克隆pIB2Am1_0-X000005。该步连接反应的效率为25％(见表1)。

8.转化质粒pIB2Am1_0-X000005到大肠杆菌ET12567/pUZ8002(Gust,Chandraetal.2004)中。接种单克隆到5mlLB液体培养基中(添加阿伯拉霉素，卡纳霉素和氯霉素)37℃过夜培养，然后4000rpm离心5min收集菌体，并用新鲜的液体LB洗涤2次。同时，取一定量Streptomyces4F孢子加入500μl新鲜LB液体培养基于50℃热激10min，然后让孢子降至室温。再把热激后的孢子和大肠杆菌混合均匀，并涂布到添加了10mM镁离子的MS平板上于30℃培养20h后，铺1ml含有抗生素的无菌水，然后继续培养3天，获得链霉菌的转化子。使用的抗生素的终浓度为：阿伯拉霉素50μg/ml,萘啶酮酸50μg/ml。

9.将得到的孢子转涂到R2YE平板上，于30℃培养2-3天后并观察表型。以接合转移了pIB2Am1_0-X000004的链霉菌孢子为负对照。结果表明，转化了pIB2Am1_0-X000005的链霉菌成功地表达了蓝色的放线紫红素。这也同时证明了iBrick方法在拼接大片段DNA方面的可行性。

表1.番茄红素和放线紫红素生物砖块拼接的效率和准确率

表2引物列表

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Bierman,M.,R.Logan,etal.(1992)."PlasmidcloningvectorsfortheconjugaltransferofDNAfromEscherichiacolitoStreptomycesspp."Gene116(1):43-49.

Gust,B.,G.Chandra,etal.(2004)."Lambdared-mediatedgeneticmanipulationofantibiotic-producingStreptomyces."AdvApplMicrobiol54:107-128.

Kelly,J.R.,A.J.Rubin,etal.(2009)."MeasuringtheactivityofBioBrickpromotersusinganinvivoreferencestandard."JBiolEng3:4.

Lee,T.S.,R.A.Krupa,etal.(2011)."BglBrickvectorsanddatasheets:Asyntheticbiologyplatformforgeneexpression."JBiolEng5:12.

Litcofsky,K.D.,R.B.Afeyan,etal.(2012)."Iterativeplug-and-playmethodologyforconstructingandmodifyingsyntheticgenenetworks."NatMethods9(11):1077-1080.

Marsischky,G.andJ.LaBaer(2004)."Manypathstomanyclones:acomparativelookathigh-throughputcloningmethods."GenomeRes14(10B):2020-2028.

Norville,J.E.,R.Derda,etal.(2010)."Introductionofcustomizedinsertsfors-treamlinedassemblyandoptimizationofBioBricksyntheticgeneticcircuits."JBiolEng4:17.

Sarrion-Perdigones,A.,E.E.Falconi,etal.(2011)."GoldenBraid:aniterativecloningsystemforstandardizedassemblyofreusablegeneticmodules."PLoSOne6(7):e21622.

Shetty,R.P.,D.Endy,etal.(2008)."EngineeringBioBrickvectorsfromBioBrickparts."JBiolEng2:5.

Siuti,P.,J.Yazbek,etal.(2013)."Syntheticcircuitsintegratinglogicandmemoryinlivingcells."NatBiotechnol31(5):448-452.

Sleight,S.C.,B.A.Bartley,etal.(2010)."In-FusionBioBrickassemblyandre-engineering."NucleicAcidsRes38(8):2624-2636.

Sleight,S.C.andH.M.Sauro(2013)."BioBrickassemblyusingtheIn-FusionPCRCloningKit."MethodsMolBiol1073:19-30.

Weber,E.,C.Engler,etal.(2011)."Amodularcloningsystemforstandardizedassemblyofmultigeneconstructs."PLoSOne6(2):e16765.

夏海洋，黄隽，胡敏杰，沈美娟，谢鹏飞，张亮，王海彬，覃重军(2009).“构建有序排列的除虫链霉菌基因组的柯斯文库用于工业生产菌株的遗传改造”《中国抗生素杂志》7：403-405页。

Claims (10)

1.一种DNA构建物，其特征在于，所述DNA构建物含有结构如式I所示的核酸序列：

Ha-C-HbI

式中，Ha为第一归位内切酶酶切位点；C为待拼接的核酸序列；Hb为第二归位内切酶酶切位点；

其中，所述第一归位内切酶和所述第二归位内切酶为不同种类的同尾归位内切酶。

2.如权利要求1所述的构建物，其中，所述归位内切酶选自：I-SceI和PI-PspI。

3.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述I-SceI酶切位点包含选自下组的核酸序列：

(a)5’-ATTACCCTGTTATCCCTA-3’和/或其反向互补序列；

(b)将(a)中的核酸序列经过一个或多个核苷酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且能够被I-SceI酶识别的由(a)衍生的核酸序列。

4.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述PI-PspI酶切位点包含选自下组的核酸序列：

(a)5’-GGCAAACAGCTATTATGGGTATTATGGGT-3’和/或其反向互补序列；

(b)将(a)中的核酸序列经过一个或多个核苷酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且能够被PI-PspI酶识别的由(a)衍生的核酸序列。

5.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1所述的构建物。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞的基因组的一个或多个位点整合有权利要求1所述的构建物，或者所述宿主细胞中含有权利要求5所述的载体。

7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包含的试剂选自下组中的一种或多种：

(a)权利要求1所述的构建物；

(b)权利要求5所述的载体；

(c)权利要求6所述的细胞；

(d)I-SceI内切酶或I-SceI内切酶表达载体；和

(e)PI-PspI内切酶或PI-PspI内切酶表达载体。

8.如权利要求1所述的构建物、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的细胞或权利要求7所述试剂盒的用途，其特征在于，用于细胞基因组的遗传改造和/或用于基因回路的构建。

9.一种DNA体外拼接方法，其特征在于，包括步骤：

(1)提供含有第一构建物的第一载体，所述第一构建物含有结构如式Ia所示的第一核酸序列，

Ha-Ca-HbIa

式中Ha、Hb的定义如权利要求1中所述，Ca为第一待拼接的核酸序列；

(2)使用第二归位内切酶酶切所述载体的第二归位内切酶酶切位点，形成线性化的第一酶切产物；

(3)提供第二构建物，所述第二构建物含有结构如式Ib所示的第二核酸序列，

Ha-Cb-HbIb

式中Ha、Hb的定义如上所述，Cb为第二待拼接的核酸序列；

并对所述第二构建物用第一归位内切酶和第二归位内切酶进行双酶切，形成经酶切的第二酶切产物；

(4)将第二酶切产物与所述的第一酶切产物进行连接反应，从而形成含有式II所示的拼接序列的载体：

Ha-Ca-Scar-Cb-HbII

式中，Ha、Hb、Ca、和Cb的定义如上所述，而Scar为拼接过程中所形成的拼接接头序列。

10.如权利要求9所述的方法，其中，所述的待拼接的核酸序列包括CDS序列、编码基因序列、抗生素生物合成基因簇、负责接合转移转移的元件或有特定功能的DNA序列。