CN111718932A - 一种新型的基因编辑动物生物反应器制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型的基因编辑动物生物反应器制备方法,同时还涉及利用此新反应器制备单克隆抗体、药用蛋白、疫苗和工业酶的应用。本方法首次利用基因编辑技术结合“安全位点”将单克隆抗体基因定点整合到“安全位点“上，并且与传统的动物生物反应器不同，本发明用全身持续表达型启动子替换之前用的组织特异型启动子。本发明技术与传统的转基因动物生物反应器相比有明显优势，传统的血液、唾液和乳腺生物反应器F0代的阳性转基因动物中仅仅特定的血液，奶或者唾液中表达目的蛋白，而且只有雌性阳性动物和特定的泌乳时期才能表达目的蛋白，这样造成阳性转基因动物的利用率大大降低。

Description

一种新型的基因编辑动物生物反应器制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种新型的基因编辑动物生物反应器制备方法,同时还涉及利用此新反应器制备单克隆抗体、药用蛋白、疫苗和工业酶的应用。

背景技术

转基因动物生物反应器是指从转基因动物体液或血液中收获目标产物的生命系统，其原理是利用转基因技术，将外源基因整合到动物基因组中，使外源基因在动物体内(乳汁、血液或者唾液等)进行高效表达，然后提取目的产物。转基因动物生物反应器的优越性主要体现在：第一，表达产物能充分进行翻译后修饰，具有稳定的生物活性。第二，产品成本低，转基因动物饲养技术简单、可以快速的，大规模的生产。第三，产品质量高，易提纯，因此利用此技术来生产重要的人类医药品越来越引人注目。目前根据目的蛋白表达部位的不同，转基因动物生物反应器主要包括血液生物反应器、乳腺生物反应器和唾液腺生物反应器等。利用上述三种反应器技术已经成功制备了多种功能蛋白例如：重组人α-1抗胰蛋白酶、单克隆抗体、人血红蛋白、重组人神经生长因子蛋白、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、重组人抗凝血酶(ATRyn)、重组人α-乳清白蛋白、重组人溶菌酶、重组人胆汁盐刺激脂肪酶等等。其中重组人抗凝血酶(ATRyn)已经通过美国FDA批准，最近中国农业大学戴蕴平教授团队首次利用此技术成功制备了乳腺特异表达抗CD20的单克隆抗体的转基因牛。

这些研究都证明利用转基因动物生物反应器可以规模化制备人类所需的药用蛋白，但是目前此技术依然有重要的技术缺陷，第一，使用传统的转基因技术，造成外源基因不能持续稳定的表达；第二，常用的三种转基因动物生物反应器技术(乳腺、血液和唾液腺)都存在各自的优点和缺陷，并未有将三种技术的优势集中一起。这些缺陷限制了利用转基因动物生物反应器快速的、规模化的制备军用抗体。传统的转基因动物生物反应器技术都是外源基因随机的，多拷贝插入，这样通常造成位置效应和基因沉默，使外源基因不能持续稳定的表达。同时由于多拷贝的插入，很难确定外源基因具体的插入位置，也容易造成动物受体基因组的插入突变，对受体动物本身造成潜在危害。这些都大大限制转基因动物生物反应器的发展和应用。因此，科研工作者提出新的“安全位点”定点转基因技术，此技术是指外源目的基因以单拷贝的形式，定点插入到动物受体的基因组的“安全位点”，此位点既可以保证外源目的基因持续稳定的表达，同时对动物受体自身的基因组没有影响，保证受体动物的安全。

动物基因组内的第一个ROSA26“安全位点”发现，最早于1991年G Friedrich和PSoriano在ROSAβ-geo26小鼠中发现。随后1997年，作者针对ROSAβ-geo26这个品系进行详细研究，发现β-gal基因在个体水平也是全身持续表达，同时杂合和纯和的小鼠个体也正常存活，随后对插入的基因进行研究发现，此基因有三个外显子，同时是非编码RNA，不翻译蛋白，命名此基因为ROSA26基因。由于基因区域具有及支持外源基因全身持续稳定的表达，同时破坏此基因又不影响小鼠自身健康，因此命名此位点为ROSA26“安全位点”。继小鼠ROSA26安全位点发现后，科研工作者分别于2007年和2012年发现了人和大鼠的ROSA26安全位点，并且与小鼠ROSA26安全位点一样可以支持外源基因持续稳定的表达。随着人造核酸酶技术和Cas9技术的发展,大大提高了基因敲除及敲入的效率。2014年,Li等在猪的13号染色体上成功定位到Rosa26位点,利用TALENs技术对pRosa26位点进行定点修饰,制备的转基因猪个体全身各组织都有高效的外源基因的表达,首次证实大动物Rosa26是一个适于外源基因良性插入并友好表达的位点。随后羊、兔和牛的Rosa26位点相继被定位,利用与猪相似的基因编辑技术介导的基因敲入技术,证实在这些物种中Rosa26位点能够支持外源基因稳定表达。最近美国MIT的张锋团队和国内的广州健康研究院的赖良学团队分别利用小鼠和猪的ROSA26安全位点全身持续性表达Cas9基因，成功制备了诱导癌症模型的工具小鼠和工具猪，重要的是此位点全身持续性表达Cas9蛋白对动物本身并没有不良影响。

葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal entero-toxin B,SEB)是一种外源性超抗原(Super antigen,sAg)，是由金黄色葡萄球菌产生的毒素，可以引起一系列的中毒反应乃至毒性休克综合征，临床表现为高热、低血压、红疹、体重减轻、多器官功能衰竭甚至死亡1,2。由SEB引起的毒性休克综合征病死率可达50％；同时，SEB的热稳定性也很强，100℃煮沸30min处理也不能使其失活，并且SEB容易雾化，因此可以被用来制造生物武器，是联合国《禁止生物武器公约》核查清单所列举的十一种毒素之一；此外，在日常生活中，SEB也是引起食物中毒的主要毒素之一。鉴于此，SEB引起了外国军方的广泛关注，SEB被美国特殊作战处列为常规储存的“标准”生物战剂。美军一直在努力寻求有效的预警与防治方法，以期取得理论、技术和装备性成果。最近我课题组成功研制出抗SEB的单克隆抗体，因此建立快速的、规模化的抗体制备技术意义重大。

因此针对上述技术缺陷和最新的技术研究进展，我们发明了一种新型的基因编辑小鼠生物反应器，广谱表达抗肠毒素B(SEB)单克隆抗体的方法,同时此方法还可以用于表达其他功能性单克隆抗体，药用蛋白、疫苗和工业酶的应用。

发明内容

本发明的目的是建立一种新型的基因编辑动物生物反应器广谱表达外源目的蛋白的方法。

本方法首次利用基因编辑技术(ZFN、TALEN或者Cas蛋白)结合“安全位点“例如ROSA26、H11、HPRT等将单克隆抗体基因定点整合到“安全位点“上，并且与传统的动物生物反应器不同，本发明用全身持续表达型启动子例如：CAG、EF-1a、PGK等替换之前用的组织特异型启动子。构建安全位点定点整合的、全身持续表达的单克隆表达载体，然后通过常用的原核注射或者细胞筛选及体细胞克隆技术制备基因编辑阳性动物，从而全身持续表达单克隆抗体。我们技术与传统的转基因动物生物反应器相比有明显优势：传统的血液、唾液和乳腺生物反应器F0代的阳性转基因动物中仅仅特定的血液，奶或者唾液中表达目的蛋白，而且只有雌性阳性动物和特定的泌乳时期才能表达目的蛋白，这样造成阳性转基因动物的利用率大大降低。

利用此技术制备基因编辑动物例如小鼠、羊和牛等去全身持续性表达外源目的基因例如抗肠毒素的单克隆抗体基因。这样既解决了传统转基因动物生物反应器利用转基因技术造成的多种缺陷；同时也将血液、唾液和乳腺三种反应器集中一起，这样出生的阳性基因编辑动物无论雌雄，无论何时，无论是血液、唾液还是奶中都可以表达目的蛋白例如抗肠毒素单克隆抗体。

本发明核心两个步骤：第一构建全身持续性表达抗肠毒素单克隆抗体基因的基因敲入载体和针对安全位点的Cas9敲除载体；第二通过胞质注射技术或者细胞筛选和克隆技术制备或者ES细胞筛选及囊胚注射技术制备转基因小鼠或猪、牛和羊。

为实现上述目的，本发明采用以下技术措施:

一种新型的基因编辑动物生物反应器，其制备方法包括如下步骤：

(1)选择动物基因组内的“安全位点”作为目的基因精确敲入的位置，完成此目的需要通过构建针对上述安全位点的基因编辑敲除载体；

(2)构建含有两个同源臂5-ARM和3-ARM的目的基因供体载体，所述目的基因由全身性的广泛表达启动子启动；

(3)通过原核注射或细胞筛选或体细胞克隆方法将基因编辑敲除载体，gRNA和含有目的基因的供体载体注射基因编辑动物受精卵制备基因敲入基因编辑动物；

(4)通过PCR方法鉴定阳性动物；

(5)利用ELISA方法检测阳性动物的奶、唾液及血液中目的蛋白的表达情况，即获得高表达动物生物反应器。

优选的，所述“安全位点”包括ROSA26、H11、HPRT等。

优选的，所述基因编辑方法包括ZFN,TALEN或者Cas蛋白等。其中Cas蛋白包括Cas9、Cas12a、Cas13、Cas14等。

优选的，所述启动子包括CAG、EF-1a、PGK等。

优选的，所述基因编辑动物包括小鼠、羊或牛等。

优选的，所述的目的蛋白为抗肠毒素B单克隆抗体。

本发明以小鼠这个模式动物为例子，同时以抗SEB单克隆抗体作为目的基因进行步骤描述：

1：针对小鼠ROSA26这个安全位点设计2个gRNA,序列如下：ACTCCAGTCTTTCTAGAAGATGG，如SEQ ID NO.1所示，和CGCCCATCTTCTAGAAAGACTGG,如SEQ IDNO.2所示，下划线标注为PAM序列，通过传统的分子克隆方法构建pCas9-1和pCas9-2敲除载体，然后通过T7E1实验检测敲除效率，选出高效的敲除载体。

2：构建含有目的基因的供体载体，主要原件包括：5'端和3'端的同源臂，全身持续性表达的CAG启动子，抗SEB单克隆抗体的目的基因。如果用于细胞筛选和体细胞克隆，供体载体还需要正负筛选原价例如neo和DTA。

3:利用体外转录试剂盒转录gRNA和Cas9 mRNA用于受精卵的注射，如果用于细胞筛选和体细胞克隆，则不用体外转录直接转染载体即可。

4:基因编辑小鼠制备：利用常用的受精卵注射方法制备，将gRNA,Cas9 mRNA和供体载体注射小鼠受精卵的细胞质中，然后移植到代孕母鼠，常规养育。

5：阳性基因敲入小鼠鉴定，小鼠鼠尾基因组提取，PCR及测序鉴定。

6：ELISA方法阳性动物的奶、唾液及血液中目的蛋白的表达情况。

进一步地，本发明还提供了所述基因编辑动物生物反应器在制备药用蛋白质中的应用。

更进一步地，本发明还提供了所述基因编辑动物生物反应器在制备药用工业酶中的应用。

更进一步地，本发明还提供了所述的基因编辑动物生物反应器在制备药用疫苗中的应用。

更进一步地，本发明还提供了所述的基因编辑动物生物反应器在制备药用单克隆抗体、药用蛋白中的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果

1：首次利用基因编辑技术应用于生物反应器制备，将安全位点的定点敲入目的基因技术替代之前传统的转基因技术，解决其随即插入，多拷贝，位置效应，基因沉默及遗传稳定性差等缺点；

2：首次利用全身持续性表达的启动子代替之前组织特异性启动子表达目的基因。解决了之前动物反应器利用率低，成本高及产量低等缺点，本发明的基因编辑动物的血液，奶和唾液中都可以作为目的蛋白的来源。

附图说明

图1为针对ROSA26安全位点的Cas9载体、gRNA靶点序列及T7E1检测图。

图2为用于ROSA26安全位点的全身持续性表达抗肠毒素单克隆抗体的基因敲入载体。

图3为本发明pROSA26-donor质粒图。

图4为本发明PCR鉴定阳性基因敲入小鼠图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明以小鼠为模型进行研究

实施例1针对小鼠ROSA26安全位点的Cas9载体构建及体外转录制备mRNA

根据小鼠ROSA26基因(图1)的序列(NC_000072.6)信息，设计gRNA，构建sgRNA载体。具体如图1所示,前边部分序列是gRNA序列(例如ACTCCAGTCTTTCTAGAAGATGG，如SEQ IDNO.1所示)，划线部分是PAM序列。设计2个gRNA,如SEQ ID NO.1和2所示，以MIT张锋实验室的px330载体为骨架载体构建pCas9-1和pCas9-2载体。载体进行小鼠MEF细胞转染及T7E1检测效率如图1所示pCas9-1具有高效率的敲出效率，后期用这个gRNA。具体步骤如下：

1、小鼠MEF的电转染：

(1)于转染前2d，用胰蛋白酶溶液(15090046,GIBCO产品)消化种公牛成纤维细胞系。将1×10⁶个细胞转接于100ml培养瓶内，加4ml含10％小牛血清的DMEM培养液(16000-044，GIBCO产品)。置37℃、5％CO₂培养箱中培养。

(2)转染前，在倒置显微镜下观察培养的细胞，挑选生长旺盛、形态好的细胞用于转染。

(3)用胰蛋白酶溶液消化细胞。以400g离心5min沉淀细胞。将细胞沉淀用pH7.4的PBS洗1次。将细胞重新悬浮于1mlPBS中(QVC0508，GIBCO产品)。

(4)在含有5×10⁵细胞的细胞悬液中加入1-10ug纯化的转染用质粒DNA。混合后转入电击杯中。

(5)以1.2KV/cm的电场强度和1ms的脉冲时间，电击细胞。

(6)将电击后的细胞转入100ml的培养瓶中。加入4ml含10％小牛血清的DMEM培养液。于CO₂培养箱中培养1-2d后，进行T7E1检测实验。

2、T7E1实验步骤：

(1)提取基因组：细胞转染后48-72h后，收集细胞抽提基因组(69506，QIAGEN公司产品)，并用微量紫外分光光度计定量。

(2)PCR扩增靶基因片段：将纯化得到的基因组DNA稀释至合适的浓度范围，吸取100ng-500ng基因组DNA用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增(M0491L，NEG公司产品)。

(3)DNA片段退火：DNA片段按照表4退火体系进行混合，95℃加热5min，然后自然冷却至室温。

(4)T7EI酶切：退火完成后，每管加入0.5μL T7EI Enzyme(10U/μL)(M0302L，NEB产品)，37℃温育30min。(5)以1.2KV/cm的电场强度和1ms的脉冲时间，电击细胞。

(6)电泳检测：T7E1酶切后，产物进行纯化，然后使用2％-3％琼脂糖凝胶电泳或Agilent 2200Tape Station检测酶切条带和编辑效率。

3、Cas9和gRNA体外转录制备mRNA

首先，改造px330载体，AgeI单切px330载体，然后与T7-1:ccggttaatacgactcactatagga，SEQ ID NO.3所示，和T7-2：ccggtcctatagtgagtcgtattaa，SEQ ID NO.4所示，引物退火后的产物连接构建成px330-T7载体然后以此载体做为模板进行体外转录，转录试剂盒为Ambion公司(AM1340)的mMESSAGE_mMACHINE试剂盒，具体步骤如下：

3.1体外转录mRNA

1)室温配制体外转录mRNA体系：

线性化质粒DNA 1μL(0.1-1μg)

2×NTP/CAP 10μL

10×Buffer 2μL

RNA合成酶2μL

ddH₂O Up to 20μL

2)混合完全，37℃孵育1hr；

3)加入1μL TURBO DNA酶，消化质粒模板，37℃孵育15min

3.2体外转录mRNA加polyA(Ambion试剂盒法)

1)室温配制体外转录mRNA加polyA体系：

上步反应产物20μL

无核酸酶ddH₂O 36μL

5×E-PAP Buffer 20μL

MnCL₂(25mM)10μL

ATP(10mM)10μ

E-PAP 4μL

Total 100μL

2)混合完全，37℃孵育1hr。

3.3体外转录mRNA回收(Ambion试剂盒法)

1)向2.3.2.3步骤中反应产物加入350μL结合液(binding buffer)，吹吸混匀；

2)加入250μL无水乙醇，混合均匀；

3)将样品转移到柱子中，10000g室温离心1min；

4)弃掉滤液，重新装好柱子，500μL洗脱液漂洗柱子，10000g室温离心1min；

5)重复漂洗一次；弃掉滤液，空柱离心15sec；

6)将柱子放入一个新的离心管中，加入50μL洗脱液到柱子中央位置，盖好盖子60℃孵育10min，10000g室温离心1min；

7)检测RNA质量及浓度。

gRNA的体外转录，首先BbsI酶切Px330-T7载体，然后与

ROSA26-1:CACCGACTCCAGTCTTTCTAGAAGA，SEQ ID NO.5所示，

ROSA26-2：AAACTCTTCTAGAAAGACTGGAGTC，SEQ ID NO.6所示，

引物退火后的产物连接构建成px330-T7-ROSA26(图2)载体然后以此载体做为模板进行PCR扩增获得的产物做为模板进行体外转录，转录方法与上步类似，只是不需要加polyA。转录成功的Cas9 mRNA和sgRNA分装，-80保存用于后期注射。4、构建同源重组供体载体pROSA26-donor

4.1同源重组供体载体pROSA26-donor的构建

分别以EcoRI和SalI双酶切质粒pCAG-STOP2(中国农业大学吴森教授馈赠，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)和质粒p2018Gene-1(上海生工基因合成)，将质粒p2018Gene-1中2.7kb的抗肠毒素的单克隆抗体的重链和轻链基因(中间用IRES元件连接)构建到pCAG-STOP2载体中，构建正确的克隆命名为panti-SEB，然后用AscI(RO558S，NEB产品)单酶切质粒panti-SEB和质粒p2018Gene-2(上海生工基因合成)，将p2018Gene-2中1kb的ROSA26-5端的同源臂连接到panti-SEB构建成panti-SEB-5HR，

PacI(R0547L,NEB产品)单酶切panti-SEB-5HR载体和p2018Gene-3(上海生工基因合成)，将p2018Gene-3中1kb的ROSA26-3端的同源臂连接到panti-SEB-5HR构建成最终的同源重组供体载体pROSA26-anti-SEB(图2)。此载体主要包括CAG启动子，抗SEB的单克隆抗体基因，ROSA26基因的5HR和3HR。。

4.2pROSA26-donor供体载体用于注射纯化制备

用天根去内毒素试剂盒小提pROSA26-donor质粒(图3)。然后稀释到浓度10ng/ul，准备用于后期注射。

实施例2小鼠受精卵注射Cas9 mRNA、gRNA和供体载体制备ROSA26安全位点的基因敲入小鼠。

1：从交配后3.5天的供体母鼠子宫内获取受精卵；

2：安装显微注射设备，准备所需试剂及物品；

3：挑选形态良好、发育状态适中的受精卵，转移至注射皿的培养基内；

4：将待注射RNA进行稀释；

5：将RNA及供体载体吸入注射针，将其逐个注射入受精卵的细胞核和细胞质中；

6：注射后的受精卵体外培育的囊胚；

7：选取适龄的母鼠与结扎公鼠合笼，获取代孕母鼠；

8:将注射RNA和供体载体的受精卵移植入代孕母鼠的子宫内；

9:将代孕母鼠放在干净的笼盒中，并保温待其清醒后放回笼架饲养；

10:受精卵移植完成，待小鼠出生；

11:待1周龄左右剪小鼠脚趾送检PCR,编号，3周后进行分笼；

12:基因组DNA提取，Triton X-100和蛋白酶混合物裂解液，裂解样品过夜；

13:次日，高温灭活蛋白酶，离心收集上清，作为PCR模板；

14:PCR扩增及电泳检测；

15：胶回收PCR片段及测序鉴定；

16：分析测序结果，把阳性鼠标号记下。

如图4所示，利用PCR检测和TA克隆测序，我们共获得阳性基因敲入小鼠2只(13和36号)。

实施例3阳性小鼠的抗肠毒素单克隆抗体表达检测

利用ELISA方法对阳性小鼠的抗肠毒素单克隆抗体表达情况进行检测。选取基因型阳性小鼠两只，分别取血清、唾液和奶液，实验结果见表1。在转基因小鼠的三种体液中均检测到SEB抗体的表达。上述结果表明，新型的基因编辑介导的“安全位点”定点整合的全身持续性表达生物反应器可以高效，高利用率的表达人类所需的目的蛋白。

表1转基因小鼠抗体表达检测结果

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种新型的基因编辑动物生物反应器制备方法及应用

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tcaggttcag ggggaggtgt gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg 2580

tatggctgat tatgatcctc tagagtcgca gatccagaca tgataagata cattgatgag 2640

tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat 2700

gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc 2760

attcatttta tgtttcaggt tcagggggag gtgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac 2820

ctctacaaat gtggtatggc tgattatgat cctctagagt cgcagatcct ctagagtcgc 2880

agatctgcaa gcttctgatg gaattagaac ttggcaaaac aatactgaga atgaagtgta 2940

tgtggaacag aggctgctga tctcgttctt caggctatga aactgacaca tttggaaacc 3000

acagtactta gaaccacaaa gtgggaatca agagaaaaac aatgatccca cgagagatct 3060

atagatctat agatcatgag tgggaggaat gagctggccc ttaatttggt tttgcttgtt 3120

taaattatga tatccaacta tgaaacatta tcataaagca atagtaaaga gccttcagta 3180

aagagcaggc atttatctaa tcccacccca cccccacccc cgtagctcca atccttccat 3240

tcaaaatgta ggtactctgt tctcaccctt cttaacaaag tatgacagga aaaacttcca 3300

ttttagtgga catctttatt gtttaataga tcatcagttg nggaaactta cagcggatcc 3360

cctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg 3420

ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca 3480

cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg 3540

aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc 3600

acgacgagat catcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc 3660

gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga 3720

gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca 3780

agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg 3840

tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct 3900

tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc 3960

cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga 4020

accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt 4080

tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat 4140

ccatcttgtt caatggccga tcccatattg gctgcaggtc gaaaggcccg gagatgagga 4200

agaggagaac agcgcggcag acgtgcgctt ttgaagcgtg cagaatgccg ggcctccgga 4260

ggaccttcgg gcgcccgccc cgcccctgag cccgcccctg agcccgcccc cggacccacc 4320

ccttcccagc ctctgagccc agaaagcgaa ggagcaaagc tgctattggc cgctgcccca 4380

aaggcctacc cgcttccatt gctcagcggt gctgtccatc tgcacgagac tagtgagacg 4440

tgctacttcc atttgtcacg tcctgcacga cgcgagctgc ggggcggggg ggaacttcct 4500

gactagggga ggagtagaag gtggcgcgaa ggggccacca aagaacggag ccggttggcg 4560

cctaccggtg gatgtggaat gtgtgcgagg ccagaggcca cttgtgtagc gccaagtgcc 4620

cagcggggct gctaaagcgc atgctccaga ctgccttggg aaaagcgcct cccctacccg 4680

gtagaattat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atatcgatag ctagcctgca 4740

ggtcgacgtt taaacgcgat cgcgcggccg cgagctcgct gatcagcctc gactgtgcct 4800

tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt 4860

gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg 4920

tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac 4980

aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagc 5040

tggggctcga tcctctagtt ggcgcgttta attaaggccc aattcgccct atagtgagtc 5100

gtattacgcg cgctcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt 5160

tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga 5220

ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat gggacgcgcc 5280

ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact 5340

tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc 5400

cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt 5460

acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc 5520

ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt 5580

gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat 5640

tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa 5700

ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga 5760

acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 5820

ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt 5880

gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg 5940

ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg 6000

gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg 6060

agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag 6120

caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca 6180

gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg 6240

agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc 6300

gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg 6360

aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg 6420

ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac 6480

tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg 6540

tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg 6600

gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact 6660

atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa 6720

ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 6780

aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 6840

ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 6900

ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 6960

tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 7020

cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 7080

gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc 7140

gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 7200

tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 7260

ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 7320

gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 7380

ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 7440

tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 7500

ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct 7560

gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga 7620

acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag a 7661

Claims (10)

1.一种新型的基因编辑动物生物反应器，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：

(1)选择动物基因组内的“安全位点”作为目的基因精确敲入的位置，完成此目的需要通过构建针对上述安全位点的基因编辑敲除载体；

(2)构建含有两个同源臂5-ARM和3-ARM的目的基因供体载体，所述目的基因由全身性的广泛表达启动子启动；

(3)通过原核注射或细胞筛选或体细胞克隆方法将基因编辑敲除载体，gRNA和含有目的基因的供体载体注射基因编辑动物受精卵制备基因敲入基因编辑动物；

(4)通过PCR方法鉴定阳性动物；

(5)利用ELISA方法检测阳性动物的奶、唾液及血液中目的蛋白的表达情况，即获得高表达动物生物反应器。

2.根据权利要求1所述的基因编辑动物生物反应器，其特征在于，所述“安全位点”包括ROSA26、H11、HPRT。

3.根据权利要求1所述的基因编辑动物生物反应器，其特征在于，所述基因编辑方法包括ZFN,TALEN或者Cas蛋白。

4.根据权利要求1所述的基因编辑动物生物反应器，其特征在于，所述启动子包括CAG,EF-1a,PGK。

5.根据权利要求1所述的基因编辑动物生物反应器，其特征在于，所述基因编辑动物包括小鼠、羊或牛。

6.根据权利要求1所述的基因编辑动物生物反应器，其特征在于，所述的目的蛋白为抗肠毒素B单克隆抗体。

7.权利要求1～6任意一项所述的基因编辑动物生物反应器在制备药用蛋白质中的应用。

8.权利要求1～6任意一项所述的基因编辑动物生物反应器在制备药用工业酶中的应用。

9.权利要求1～6任意一项所述的基因编辑动物生物反应器在制备药用疫苗中的应用。

10.权利要求1～6任意一项所述的基因编辑动物生物反应器在制备药用单克隆抗体、药用蛋白中的应用。

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