CN106715697A

CN106715697A - 通过talen平台技术的甜菜原生质体的转化方法

Info

Publication number: CN106715697A
Application number: CN201580031432.1A
Authority: CN
Inventors: 盖伊·魏恩斯; 马克·勒菲弗; 夏夫高达·塔姆曼纳高达; 米里耶勒·隆梅尔; 罗松
Original assignee: SESVanderHave NV
Current assignee: SESVanderHave NV
Priority date: 2014-06-12
Filing date: 2015-06-12
Publication date: 2017-05-24
Also published as: WO2015189409A1; EP3155001A1; US20170121723A1; EA201692565A1

Abstract

用于转化甜菜原生质体的方法，包括以下步骤：‑从分离自甜菜植物的气孔保卫细胞获得原生质体，‑用包含感兴趣的核苷酸序列和转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)或者包含编码这些转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)序列的序列的一种或多种载体的核酸构建体转化所述原生质体，其中这些TALEN靶向并加工靶序列，并通过同源重组用包含所述感兴趣的核苷酸序列的核酸构建体替换所述靶序列，‑可能地，向这些原生质体的体外培养物应用对所述原生质体的体外培养物有毒的，优选地致死的培养基，和‑从细胞培养物再生甜菜植物，优选地，从整合了包含感兴趣的序列的核酸构建体的存活的原生质体再生甜菜植物，所述感兴趣的序列可能使所述转化的细胞对所应用的培养基的毒性活性具有耐受性。

Description

通过TALEN平台技术的甜菜原生质体的转化方法

技术领域

本发明处于植物生物技术领域，具体地，涉及通过外源序列有效转化甜菜原生质体的方法和方式(或工具)。

背景技术

在植物遗传学领域中，一直需要通过同源重组(基因靶向)修饰染色体的能力，这是因为基因靶向可以靶向特异性序列或核苷酸，从而导致特定植物功能的修饰并开创用于作物改善、用于具有所需碳水化合物谱或具有提高的营养品质的新种子的产量提高，或用于提高对疾病和应激的耐受性的新的可能性。

来源于黄单胞菌属(xanthomonas)的植物病原体细菌的转录激活子样效应子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nucleases)(TALEN)序列在疾病中起重要作用并通过结合宿主DNA和激活效应子-特异性宿主基因来引起防御。TALEN's是特异性转录激活子样效应子核酸酶(人工限制酶)，其可以设计成结合并切割基因组中的特异性DNA序列。一旦将这些TALEN's引入细胞，则它们可以用于基因组编辑。

这些核酸酶序列和它们的衍生蛋白允许有效靶向和/或加工双链核酸序列。

它们的衍生蛋白是由核心骨架组成的特异性嵌合蛋白单体，所述核心骨架包含对靶序列具有结合特异性的重复可变二肽区(Repeat Variable Dipeptide region)(RVD)，所述靶序列在其N末端部分融合了催化结构域。该催化结构域(其可以是核酸酶的单体)，位于可能与融合至另一TAL单体的另一催化结构域相互作用的位置，从而当两个单体结合至其各自靶标DNA序列时，两个催化结构域将形成可能加工该靶序列附近的DNA的催化实体(catalytic entity)。

国际专利申请WO 2011/072246描述了通过使用该转录激活子样效应子核酸酶(也称为DNA酶)核苷酸序列或其衍生蛋白来修饰细胞的遗传物质的方法，其中TAL效应子核酸酶将结合至并且将加工所述靶DNA。

该方法还将包括以下步骤：向细胞提供包含与至少部分靶标DNA序列同源的序列的核酸序列，从而可以在布置在感兴趣的基因序列之间的靶序列部分和其相应的核酸部分之间发生同源重组。

可以通过使用包含编码TALEN蛋白质的序列的一种或多种载体或者通过机械注射、通过细菌分泌系统或者通过电穿孔直接将相应衍生蛋白引入细胞来获得细胞的转化。

通过使用转录激活子样蛋白，具体地II类限制核酸内切酶(如FokI)，该方法已用于多种细胞的转化。

然而，在植物遗传学领域中，转化方法复杂、不总有效且费时。对于一些植物品种，如甜菜细胞和难以遗传转化的植物，这是特别真实的。

因此，明确需要针对转化的遗传方法的改善，特别是甜菜植物的基因靶向。

因此，本发明旨在提供用于甜菜细胞和植物基因靶向的新方法和工具，其允许甜菜原生质体的遗传转化，具体地，其基因靶向和编辑。

发明内容

本发明涉及甜菜原生质体的转化方法，包括以下步骤：

-从分离自甜菜(Beta vulgaris)植物的气孔保卫细胞获得原生质体，

-用包含感兴趣的核苷酸序列和转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)或者包含编码这些转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)序列的序列的一个或多个载体的核酸构建体转化这些原生质体，其中这些转录激活子样效应子核酸酶靶向并处理原生质体的靶(DNA)序列，并通过用包含感兴趣的核苷酸序列的核酸构建体同源重组来替换该靶(DNA)序列，

-可能地，向这些原生质体的体外培养应用对所述原生质体的体外培养有毒的，优选地致死的培养基(如一种或多种除草剂)，和

-从细胞培养再生甜菜植物，优选地，从整合了包含感兴趣的序列的核酸构建体的存活的原生质体再生甜菜植物，所述感兴趣的序列可能使所述转化的细胞对所应用的培养基(如一种或多种除草剂)的毒性，优选地致死活性具有耐受性。

优选地，在根据本发明所述的方法中，所述核酸构建体还包含用于感兴趣的核苷酸序列在甜菜原生质体、细胞、组织(愈伤组织)和/或植物中表达的一种或多种调控序列。

优选地，在根据本发明所述的方法中，应用于原生质体的体外培养的培养基包含一种或多种ALS抑制剂(除草剂)，其选自由以下各项组成的组：磺酰脲除草剂、磺酰氨基羰基三唑啉酮除草剂、咪唑啉酮除草剂、三唑并嘧啶除草剂、嘧啶基(硫代)苯甲酸酯除草剂或它们的混合物。

更优选地，这些磺酰脲除草剂选自由以下各项组成的组：甲酰胺磺隆(foramsulfuron)、碘甲磺隆(iodosulfuron)、酰嘧磺隆(amidosulfuron)、乙氧嘧磺隆(ethoxysulfuron)、氯嘧磺隆(chloramsulfuron)或它们的混合物。更优选地，在根据本发明所述的方法中，对于甲酰胺磺隆，以(约)5×10^-9M至(约)1×10^-6M的浓度，对于乙氧嘧磺隆，以(约)5×10^-11M至(约)1×10^-10M的浓度，应用ALS抑制剂(除草剂)。

在根据本发明所述的方法中，感兴趣的序列编码赋予(或者参与)对一种或多种除草剂的耐受性、对昆虫的耐受性、对线虫的耐受性、对植物疾病的耐受性、对病毒感染的耐受性、对应激(如氢或盐应激)的耐受性的肽或蛋白质，可以编码一种或多种酶和/或可以编码具有抗细菌或抗真菌特性的肽或蛋白质。

在根据本发明所述的方法中使用的核酸构建体还可以使用或存在于包含用于感兴趣的核酸序列在甜菜原生质体、细胞、组织和/或植物中表达的一种或多种调控序列的载体中。这些调控序列优选地选自由以下各项组成的组：启动子或转录终止和/或聚-A信号序列，更优选地，得自根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)的CAMV35S启动子序列和Nos终止子序列。

当感兴趣的核酸序列是与其相应的野生型ALS序列相比，在氨基酸113位携带从L-丙氨酸(Ala)至L-酪氨酸(Tyr)的序列突变的BVALS 113序列时，优选且适合的ALS抑制剂(除草剂)是上述除草剂之一，更优选地，是甲酰胺磺隆和/或乙氧嘧磺隆。

此外，本领域技术人员可以选择与上述ALS序列相互作用的其它合适的除草剂，并且其中上述突变(与其野生型相应的ALS序列相比，在氨基酸113位从L-丙氨酸(Ala)至L-酪氨酸(Tyr)的突变)可以赋予原生质体细胞组织和植物对该ALS抑制剂(除草剂)或ALS抑制剂(除草剂)的混合物的耐受性。

在根据本发明所述的方法中，优选的原生质体是气孔保卫细胞原生质体，当在适合的培养基中生长时，其具有分化(生长)和引起(originate)病毒甜菜愈伤组织的能力。愈伤组织是指未分化的细胞块(mass)，其可以得自外植体，如来自叶或子叶的胚胎或薄壁组织(parenchyma)来源的外植体。根据本发明，当在适合的培养基中生长时，如含有聚合物的培养基(优选地，含有海藻酸盐或琼脂糖的培养基)，愈伤组织优选地是通过良好再生的(气孔(stomatate))保卫细胞原生质体的生长获得的，具有出芽和再生为活的甜菜植物的能力。

本发明还涉及通过根据本发明所述的转化方法获得的原生质体、细胞、组织(愈伤组织)或植物，更具体地，涉及在其基因组中整合了感兴趣的核苷酸序列，优选地上述序列中的一种或多种的甜菜植物。

现将参考作为本发明的非限制性实施方式提供的附图，在以下本发明的具体实施方式中详细描述本发明。

附图说明

图1表示用于根据本发明的重组，使用特异性TALEN序列和含有突变以及侧翼序列的供体基质在甜菜原生质体中引入ALS113突变。

图2表示根据本发明用于甜菜BvALS TALEN活性验证的T7E1测定。

图3表示具有在原生质体中表达的特异性转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)序列的两种植物表达载体。

图4-6表示根据本发明的供体基质序列的序列。

具体实施方式

图1显示了使用TALEN技术在甜菜ALS基因中引入特异性突变以提供针对ALS-抑制剂的耐受性。

CPS发展了基于其酵母筛选平台的TALENs(TALEN序列)并提供了SV，所述SV具有针对ALS序列中3个不同靶位点的3个工程化的TALEN对(靶位点非常接近于ALS113突变位点)。所有3个TALEN对与针对每个TALEN的3个特异性供体基质一起进入植物表达载体。当TALEN对与供体基质一起共转化时，TALEN对在特异性位点进行双链切割，然后基于侧翼序列的同源重组，供体基质接触插入切割位点的特异性突变(ALS113)。

设计并产生了3个TALENS(TALEN序列)以用于将点突变(A113Y，GCA至TAT)引入到甜菜3′ALS基因中。从甜菜(Beta vulgaris)基因组鉴别了2个ALS同源基因座(loci)，并且它们中的任一个可以用作靶位点。

TALEN对	质粒名称	gal37(sd)	gal30(sd)
				BvALS_T01.1	pCLS24852-pCLS24854	0.85(0.02)	0.87(0.06)
BvALS_T02.1	pCLS24856-pCLS24858	0.83(0.03)	0.84(0.06)
				BvALS_T03.1	pCLS24860-pCLS24862	0.91(0.03)	0.90(0.06)

表1：通过酵母测定产生并验证的TALEN的列表

合成了3个TALEN对以用于在ALS基因中的突变位点附近进行双链断裂。目标是通过使用深度测序法测量这三种TALEN的效率来寻找NHEJ(非同源末端连接，(Non-Homologous End Joining))活性并选择具有携带甜菜转化和供体基质的更高效的物质。

TALEN序列：

BvALS_T01：TATTGAAGATTCATCTTTCGTTTCTCGATTTGGCCCTGATGAACCCAGA

BvALS_T02：TCTTGAGCGTGAAGGTGTTACCAATGTGTTTGCTTACCCTGGTGGTGCA

BvALS_T03：TGAACAAGGCGGGGTTTTCGCCGCCGAGGGATATGCTAGAGCTACTGGA

通过使用标准指导性基因转化规程(standard direct gene transformationprotocol)的甜菜原生质体转化，评价每个TALEN对切割双链DNA的效率。转化程序后，将原生质体在约26℃的温度下培育24小时。培育后，将所得原生质体冷冻，并根据相同标准规程进行DNA分离。通过PCR扩增侧翼TALENs识别位点的序列。然后，将纯化的PCR产物进行454深度测序。通过生物信息学分析序列以鉴别由NHEJ(非同源末端连接)事件所造成的目标缺失或插入的存在。

基于有限的454测序结果，鉴别了TALEN BvALS_T03切割活性(～2.2％NHEJ致突变率，参见表2)。将使用PCR片段克隆和进行半定量SANGER测序的另一种方法用于鉴别BvALS_T02和BvALS_T03两者均具有良好的切割活性(～5％，表2)。

表2.从TALEN转化的甜菜原生质体DNA扩增的PCR产物的测序结果。

T7E1是识别错配双链DNA并对错配位点进行切割的核酸内切酶。当PCR产物(扩增序列)变性并再退火时，具有和不具有缺失的单链DNA(序列)可以产生具有错配的双链DNA(序列)。那些DNA(序列)靶向T7E1。与454测序测定相比，T7E1测定简单且廉价，但是技术人员可以检测超过5％的TALEN活力。

图2显示了T7E1测定结果。由于甜菜基因组中两个ALS基因之间存在SNP，因此T7E1测定表明甚至在野生型材料中存在一些默认切割(default cutting)。那些带型图案可以覆盖从BvALS_T01至BvALS_T03切割的切割。从BvALS_T02样品(图2中指出)切下额外部分(extra)，表明BvALS_T02具有明显的切割活力。

基于不同验证分析的结果，BvALS_T02和BvALS_T03均为良好的TALEN序列。考虑到以下事实：BvALS_T02的供体不含3个设计突变之外的任何额外突变，在甜菜中选择BvALST02及其供体的转化从而在甜菜ALS基因中引入ALS113突变。

使用TALEN和供体基质组合的甜菜转化

本发明人已使用TALEN BvALS_T02(pCLS24856-pCLS24858)及其相应供体基质BvALST2(pCLS26201)起始了转化实验以测试携带突变的ALS的靶向插入的效率。一旦确定效率，使用针对所选ALS抑制剂除草剂，优选地甲酰胺磺隆和乙氧嘧磺隆确定的杀灭曲线浓度，起始转化实验以再生携带突变的植物。

序列表

<110> 西斯凡德尔哈维公众公司

<120> 通过TALEN平台技术的甜菜原生质体的转化方法

<130> BPSESS0013PC00

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> TALEN序列

<400> 1

tattgaagat tcatctttcg tttctcgatt tggccctgat gaacccaga 49

<210> 2

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> TALEN序列

<400> 2

tcttgagcgt gaaggtgtta ccaatgtgtt tgcttaccct ggtggtgca 49

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> TALEN序列

<400> 3

tgaacaaggc ggggttttcg ccgccgaggg atatgctaga gctactgga 49

<210> 4

<211> 521

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 基于4D6834_47C_1731C的供体的原始序列

<400> 4

tcttcaaccc tccccttttc cacccctccc aaaaccccaa ctccactctt tcaccgtccc 60

ctccaaatct catcctccca atcccacaaa tcatccgcca ttaaaacaca aactcaagca 120

ccttcttctc cagctattga agattcatct ttcgtttctc gatttggccc tgatgaaccc 180

agaaaagggt ccgatgtcct cgttgaagct cttgagcgtg aaggtgttac caatgtgttt 240

gcttaccctg gtggtgcatc tatggaaatc caccaagctc tcacacgctc taaaaccatc 300

cgcaatgtcc tccctcgcca tgaacaaggc ggggttttcg ccgccgaggg atatgctaga 360

gctactggaa aggttggtgt ctgcattgcg acttctggtc ctggtgctac caacctcgta 420

tcaggtcttg ctgacgctct ccttgattct gtccctcttg ttgccatcac tggccaagtt 480

ccacgccgta tgattggcac tgatgctttt caggagactc c 521

<210> 5

<211> 521

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 基于4D6834_47C_1731C的BVALST1供体

<400> 5

tcttcaaccc tccccttttc cacccctccc aaaaccccaa ctccactctt tcaccgtccc 60

ctccaaatct catcctccca atcccacaaa tcatccgcca ttaaaacaca aactcaagca 120

ccttcttctc cagcgatcga agattcatct ttcgtttctc gatttggccc tgatgaaccc 180

agaaaagggt ccgatgtcct cgttgaagct cttgagcgtg aaggtgttac caatgtgttt 240

gcttaccctg gtggttattc tatggaaatc caccaagctc tcacacgctc taaaaccatc 300

cgcaatgtcc tccctcgcca tgaacaaggc ggggttttcg ccgccgaggg atatgctaga 360

gctactggaa aggttggtgt ctgcattgcg acttctggtc ctggtgctac caacctcgta 420

tcaggtcttg ctgacgctct ccttgattct gtccctcttg ttgccatcac tggccaagtt 480

ccacgccgta tgattggcac tgatgctttt caggagactc c 521

<210> 6

<211> 3105

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 供体基质pCLS26200的完整序列

<400> 6

tgcagctctg gcccgtgtct caaaatctct gatgttacat tgcacaagat aaaaatatat 60

catcatgaac aataaaactg tctgcttaca taaacagtaa tacaaggggt gttatgagcc 120

atattcaacg ggaaacgtcg aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg 180

ggtataaatg ggctcgcgat aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgcttgtatg 240

ggaagcccga tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg 300

ttacagatga gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca 360

agcattttat ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccggaaaaa 420

cagcattcca ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg 480

cagtgttcct gcgccggttg cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc 540

gcgtatttcg tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg 600

attttgatga cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataaac 660

ttttgccatt ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta 720

tttttgacga ggggaaatta ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc 780

gataccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga gttttctcct tcattacaga 840

aacggctttt tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt 900

tgatgctcga tgagtttttc taatcagaat tggttaattg gttgtaacat tattcagatt 960

gggcttgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 1020

aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 1080

gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 1140

acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 1200

tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag 1260

ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 1320

atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 1380

agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 1440

cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 1500

agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 1560

acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 1620

gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 1680

ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 1740

gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 1800

gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 1860

gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 1920

tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat 1980

gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg 2040

ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac 2100

gccaagcttg catgcaggcc tctgcagtcg acgggcccgg gatccgatct tcaaccctcc 2160

ccttttccac ccctcccaaa accccaactc cactctttca ccgtcccctc caaatctcat 2220

cctcccaatc ccacaaatca tccgccatta aaacacaaac tcaagcacct tcttctccag 2280

cgatcgaaga ttcatctttc gtttctcgat ttggccctga tgaacccaga aaagggtccg 2340

atgtcctcgt tgaagctctt gagcgtgaag gtgttaccaa tgtgtttgct taccctggtg 2400

gttattctat ggaaatccac caagctctca cacgctctaa aaccatccgc aatgtcctcc 2460

ctcgccatga acaaggcggg gttttcgccg ccgagggata tgctagagct actggaaagg 2520

ttggtgtctg cattgcgact tctggtcctg gtgctaccaa cctcgtatca ggtcttgctg 2580

acgctctcct tgattctgtc cctcttgttg ccatcactgg ccaagttcca cgccgtatga 2640

ttggcactga tgcttttcag gagactccat tggcatctag atgcattcgc gaggtaccga 2700

gctcgaattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc 2760

aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc 2820

gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc ctgatgcggt 2880

attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact ctcagtacaa 2940

tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc 3000

cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga 3060

gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcga 3105

<210> 7

<211> 521

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> BvALST2供体

<400> 7

tcttcaaccc tccccttttc cacccctccc aaaaccccaa ctccactctt tcaccgtccc 60

ctccaaatct catcctccca atcccacaaa tcatccgcca ttaaaacaca aactcaagca 120

ccttcttctc cagctattga agattcatct ttcgtttctc gatttggccc tgatgaaccc 180

agaaaagggt ccgatgtcct cgttgaagct cttgagcgtg aaggtgttac caatgtgttt 240

gcttaccctg gtggttattc tatggaaatc caccaagctc tcacacgctc taaaaccatc 300

cgcaatgtcc tccctcgcca tgaacaaggc ggggttttcg ccgccgaggg atatgctaga 360

gctactggaa aggttggtgt ctgcattgcg acttctggtc ctggtgctac caacctcgta 420

tcaggtcttg ctgacgctct ccttgattct gtccctcttg ttgccatcac tggccaagtt 480

ccacgccgta tgattggcac tgatgctttt caggagactc c 521

<210> 8

<211> 3111

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 供体基质pCLS26201

<400> 8

tgcagctctg gcccgtgtct caaaatctct gatgttacat tgcacaagat aaaaatatat 60

catcatgaac aataaaactg tctgcttaca taaacagtaa tacaaggggt gttatgagcc 120

atattcaacg ggaaacgtcg aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg 180

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cagcattcca ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg 480

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tttttgacga ggggaaatta ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc 780

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aacggctttt tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt 900

tgatgctcga tgagtttttc taatcagaat tggttaattg gttgtaacat tattcagatt 960

gggcttgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 1020

aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 1080

gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 1140

acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 1200

tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag 1260

ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 1320

atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 1380

agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 1440

cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 1500

agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 1560

acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 1620

gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 1680

ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 1740

gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 1800

gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 1860

gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 1920

tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat 1980

gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg 2040

ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac 2100

gccaagcttg catgcaggcc tctgcagtcg acgggcccgg gatccgatcc aattcttcaa 2160

ccctcccctt ttccacccct cccaaaaccc caactccact ctttcaccgt cccctccaaa 2220

tctcatcctc ccaatcccac aaatcatccg ccattaaaac acaaactcaa gcaccttctt 2280

ctccagctat tgaagattca tctttcgttt ctcgatttgg ccctgatgaa cccagaaaag 2340

ggtccgatgt cctcgttgaa gctcttgagc gtgaaggtgt taccaatgtg tttgcttacc 2400

ctggtggtta ttctatggaa atccaccaag ctctcacacg ctctaaaacc atccgcaatg 2460

tcctccctcg ccatgaacaa ggcggggttt tcgccgccga gggatatgct agagctactg 2520

gaaaggttgg tgtctgcatt gcgacttctg gtcctggtgc taccaacctc gtatcaggtc 2580

ttgctgacgc tctccttgat tctgtccctc ttgttgccat cactggccaa gttccacgcc 2640

gtatgattgg cactgatgct tttcaggaga ctccattggc atctagatgc attcgcgagg 2700

taccgagctc gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 2760

ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 2820

aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga 2880

tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca 2940

gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg 3000

acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct 3060

ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg a 3111

<210> 9

<211> 521

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> BvALST3供体

<400> 9

tcttcaaccc tccccttttc cacccctccc aaaaccccaa ctccactctt tcaccgtccc 60

ctccaaatct catcctccca atcccacaaa tcatccgcca ttaaaacaca aactcaagca 120

ccttcttctc cagctattga agattcatct ttcgtttctc gatttggccc tgatgaaccc 180

agaaaagggt ccgatgtcct cgttgaagct cttgagcgtg aaggtgttac caatgtgttt 240

gcttaccctg gtggttattc tatggaaatc caccaagctc tcacacgctc taaaaccatc 300

cgcaatgtcc tccctcgcca tgaacaaggc ggggttttcg ccgccgaggg atatgctaga 360

gctaccggta aggttggtgt ctgcattgcg acttctggtc ctggtgctac caacctcgta 420

tcaggtcttg ctgacgctct ccttgattct gtccctcttg ttgccatcac tggccaagtt 480

ccacgccgta tgattggcac tgatgctttt caggagactc c 521

<210> 10

<211> 3111

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 供体基质pCLS26202的完整序列

<400> 10

tgcagctctg gcccgtgtct caaaatctct gatgttacat tgcacaagat aaaaatatat 60

catcatgaac aataaaactg tctgcttaca taaacagtaa tacaaggggt gttatgagcc 120

atattcaacg ggaaacgtcg aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg 180

ggtataaatg ggctcgcgat aatgtcgggc aatcaggtgc gacaatctat cgcttgtatg 240

ggaagcccga tgcgccagag ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg 300

ttacagatga gatggtcaga ctaaactggc tgacggaatt tatgcctctt ccgaccatca 360

agcattttat ccgtactcct gatgatgcat ggttactcac cactgcgatc cccggaaaaa 420

cagcattcca ggtattagaa gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg 480

cagtgttcct gcgccggttg cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt aacagcgatc 540

gcgtatttcg tctcgctcag gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg 600

attttgatga cgagcgtaat ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataaac 660

ttttgccatt ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta 720

tttttgacga ggggaaatta ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc 780

gataccagga tcttgccatc ctatggaact gcctcggtga gttttctcct tcattacaga 840

aacggctttt tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt 900

tgatgctcga tgagtttttc taatcagaat tggttaattg gttgtaacat tattcagatt 960

gggcttgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 1020

aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 1080

gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 1140

acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 1200

tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag 1260

ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 1320

atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 1380

agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 1440

cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 1500

agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 1560

acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 1620

gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 1680

ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 1740

gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 1800

gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 1860

gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 1920

tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat 1980

gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg 2040

ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac 2100

gccaagcttg catgcaggcc tctgcagtcg acgggcccgg gatccgatcc aattcttcaa 2160

ccctcccctt ttccacccct cccaaaaccc caactccact ctttcaccgt cccctccaaa 2220

tctcatcctc ccaatcccac aaatcatccg ccattaaaac acaaactcaa gcaccttctt 2280

ctccagctat tgaagattca tctttcgttt ctcgatttgg ccctgatgaa cccagaaaag 2340

ggtccgatgt cctcgttgaa gctcttgagc gtgaaggtgt taccaatgtg tttgcttacc 2400

ctggtggtta ttctatggaa atccaccaag ctctcacacg ctctaaaacc atccgcaatg 2460

tcctccctcg ccatgaacaa ggcggggttt tcgccgccga gggatatgct agagctaccg 2520

gtaaggttgg tgtctgcatt gcgacttctg gtcctggtgc taccaacctc gtatcaggtc 2580

ttgctgacgc tctccttgat tctgtccctc ttgttgccat cactggccaa gttccacgcc 2640

gtatgattgg cactgatgct tttcaggaga ctccattggc atctagatgc attcgcgagg 2700

taccgagctc gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg 2760

ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag 2820

aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggcgcctga 2880

tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatgg tgcactctca 2940

gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagccccg acacccgcca acacccgctg 3000

acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg catccgctta cagacaagct gtgaccgtct 3060

ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac cgtcatcacc gaaacgcgcg a 3111

Claims

1.一种用于转化甜菜原生质体的方法，包括以下步骤：

-从分离自甜菜植物的气孔保卫细胞获得原生质体，

-用包含感兴趣的核苷酸序列和转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)序列或者包含编码所述转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)序列的序列的一种或多种载体的核酸构建体转化所述原生质体，其中所述转录激活子样效应子核酸酶靶向并处理所述原生质体的靶序列，并且通过同源重组用包含感兴趣的所述核苷酸序列的核酸构建体替换所述靶序列，

-可能地，向所述原生质体的体外培养物应用对所述原生质体的体外培养物有毒的培养基，和

-从所述原生质体培养物再生甜菜植物，优选地，从整合了包含感兴趣的序列的核酸构建体的存活的原生质体再生甜菜植物，感兴趣的所述序列可能使转化的所述原生质体对所应用的培养基的毒性活性具有耐受性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中感兴趣的所述序列包含在氨基酸113位携带从L-丙氨酸(Ala)至L-酪氨酸(Tyr)的序列突变的突变BVALS 113序列，或由其组成，并且其中对所述原生质体的体外培养有毒性的培养基包含一种或多种ALS抑制剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种ALS抑制剂选自由以下各项组成的组：磺酰脲除草剂、磺酰氨基羰基三唑啉酮除草剂、咪唑啉酮除草剂、三唑并嘧啶除草剂、嘧啶基(硫代)苯甲酸酯除草剂或它们的混合物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述磺酰脲除草剂选自由以下各项组成的组：甲酰胺磺隆、碘甲磺隆、酰嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、氯嘧磺隆或它们的混合物。

5.根据权利要求4所述的方法，其中对于甲酰胺磺隆，以5×10^-9M至1×10^-6M之间的浓度，对于乙氧嘧磺隆，以5×10^-11M至5×10^-10M之间的浓度应用所述ALS抑制剂。

6.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中感兴趣的所述序列编码赋予对一种或多种除草剂的耐受性、对昆虫的耐受性、对线虫的耐受性、对植物疾病的耐受性、对病毒感染的耐受性、对应激的耐受性的肽或蛋白质，或者编码一种或多种酶和/或编码具有抗细菌或抗真菌特性的肽或蛋白质。

7.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中核酸构建体包含允许感兴趣的所述核苷酸序列在甜菜植物原生质体、细胞、组织和/或植物中表达的一种或多种调控序列。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述一种或多种调控序列选自由以下各项组成的组：启动子、转录终止序列和聚A信号序列。

9.通过根据以上权利要求中任一项所述的转化方法获得的甜菜原生质体、细胞、组织或植物。