CN109913484A

CN109913484A - 一种双向表达t载体以及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109913484A
Application number: CN201910031424.7A
Authority: CN
Inventors: 王珊珊
Original assignee: Shaanxi University of Technology
Current assignee: Shaanxi University of Technology
Priority date: 2019-01-14
Filing date: 2019-01-14
Publication date: 2019-06-21

Abstract

本发明涉及一种双向表达T载体，为两个末端的3’端均具有突出的T的线性质粒，所述双向表达T载体的第一末端设置有第一强启动子和第二终止子，所述第一强启动子的方向朝向所述第一末端的方向，所述第二终止子位于所述第一强启动子的上游；所述双向表达T载体的第二末端设置有第二强启动子和第一终止子，所述第二强启动子的方向朝向所述第二末端的方向，所述第一终止子位于所述第二强启动子的上游。该双向表达T载体同时具有易于TA克隆和高效表达的功能；并且使正、反向连接的外源基因都得到表达；质粒具有基因容量大、转化率高等特点，提高基因的转化效率，适用于高通量基因文库的构建。

Description

一种双向表达T载体以及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分子克隆工具领域，更特别的，涉及一种双向表达T载体，以及其制备方法和应用。

背景技术

随着生物信息学的快速发展，基因组资源日益丰富，越来越多的潜在基因需要利用体外扩增和克隆技术，深入挖掘其相关结构和功能信息。聚合酶链式反应(PCR)是体外快速高效获得目的基因的方法，为了直接克隆PCR 产物，T载体被广泛使用，特别当面对大量基因库的克隆工作时，TA克隆是目前克隆PCR产物最经济、简便的方法。

TA克隆技术采用粘性末端连接的原理，Taq DNA聚合酶扩增时能够在PCR 产物的3’末端加上一个非模板依赖的腺苷酸(dA)，同时T载体带有3’胸腺核苷酸(dT)突出末端，在T4 DNA连接酶的作用下，可一步快速把PCR 产物插入至载体的多克隆位点中。该方法通过TA黏性末端将载体与基因片段连接一起，相比平末端连接，连接效率大大提高。

然而，利用传统T载体进行克隆表达时，由于插入DNA片段的方向具有随机性，无法保证定向克隆；同时经过鉴定获得阳性克隆后，还需要利用特定的限制性内切酶，经酶切和回收后，亚克隆至相同酶切处理的表达载体中，再次鉴定获得阳性克隆后，才能用于基因的表达和功能分析，导致克隆过程繁琐复杂、耗时耗力；此外，目前商业化的T载体多是先使用平端限制性内切酶(EcoRV)进行线性化后，再利用核酸末端转移酶，以dTTP为底物在3’ 末端各加上一个胸腺嘧啶残基(dT)，经纯化后获得T载体，这种载体的价格较为昂贵，质量批次不稳定，自身环化率较高，制约了T载体的广泛使用。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种双向表达T载体，为两个末端的3’ 端均具有突出的T的线性质粒，所述双向表达T载体的第一末端设置有第一强启动子和第二终止子，所述第一强启动子的方向朝向所述第一末端的方向，所述第二终止子位于所述第一强启动子的上游；

所述双向表达T载体的第二末端设置有第二强启动子和第一终止子，所述第二强启动子的方向朝向所述第二末端的方向，所述第一终止子位于所述第二强启动子的上游。

该双向表达T载体具有以下特征：(1)同时具有易于TA克隆和高效表达的功能；(2)具有双向基因表达元件，使正、反向连接的外源基因都得到表达；(3)质粒具有基因容量大、转化率高等特点，提高基因的转化效率，适用于高通量基因文库的构建。

在一个优选实施方案中，所述第一强启动子为T7启动子，所说第一终止子为T7终止子。T7启动子是IPTG可诱导的强启动子，可在IPTG诱导诱导下大量表达目的蛋白。

在一个优选实施方案中，所述第二强启动子为热激启动子，所说第二终止子为热激终止子。热激启动子是热激可诱导的强启动子，可在热激诱导下大量表达目的蛋白。

通过设置两个可诱导启动子，可根据目的片段的插入方向选择诱导条件，从而诱导目的基因的大量表达。

在一个优选实施方案中，所述双向表达T载体还包括筛选标记。筛选标记有助于筛选出接受了该质粒载体的转化子。

在一个优选实施方案中，所述筛选标记为抗性筛选标记。优选为氨苄抗性基因表达框。

本发明还提供了一种制备上述的双向表达T载体的方法，包括以下步骤：

S1：使用pET20b为起始质粒，改造pET20b质粒，保留pET20b上的复制起始子、氨苄抗性基因表达框、T7启动子和T7终止子；

S2：在T7启动子与T7终止子之间插入热激启动子，热激启动子的方向与T7启动子相反，并在T7启动子的上游插入T7终止子；

S3：在T7启动子与热激启动子之间切开，并使产生的两个末端带有突出的3’T。

在一个优选实施方案中，S1中移除了pET20b中的BciV I位点；

S3中，在两个启动子之前插入两个方向相反的BciV I位点，然后通过 BciV I酶切，得到具有突出的3’T的两个末端。

在另一个实施方案中，可通过在两个启动子之间切出平端切口，然后在仅含有dTTP(不含其它dNTP)的Taq酶PCR扩增体系中72℃处理5-10分钟，使线性质粒的平端带有突出的3’T。

本发明还提供了上述双向表达T载体在分子克隆中的应用。本发明的双向表达T载体可用于目的片段的克隆与表达，还可用于基因文库的构建与筛选。

相比传统商业化T载体，本发明构建的新型双向表达T载体是一个多功能载体，在使用方法、作用功能和应用效果等方面具有多方面的优势。不仅能用于目的基因的高效TA克隆，还能直接用于目的基因的高效表达，并且正、反向插入的基因均可有效表达。本发明的主要有益效果总结如下：

(1)商业化T载体多是高拷贝的克隆载体，内部无基因表达的特定元件，基因表达功能较弱，必须鉴定重组子后再亚克隆到特定的表达型的载体中，才能获得基因产物的高水平表达，而pET20-T同时具有TA克隆和高效表达的功能，仅需1次克隆操作即可实现基因产物的有效表达，避免了繁琐的构建过程，克隆效率高。

(2)pET20-T携带有正向T7和反向Hsh启动子的双向表达元件，使正反向插入的目的基因都能有效表达。因此，在高通量构建基因文库上更具优势。

(3)pET20-T分子量小、基因容量大、转化率高，且在基因克隆过程中仅需1种限制性内切酶BciV I的参与即可完成。

附图说明

图1为前体载体关键元件结构图；

图2为双向T载体的一个实例的结构示意图；

图3为葡聚糖内切酶基因通过TA克隆正向或反向插入双向T载体后进行相应诱导表达得到的产物的SDS-PAGE分析。其中，泳道M：蛋白分子质量标准；泳道1：正向插入EG12B未诱导；泳道2：反向插入EG12B未诱导；泳道3：正向插入EG12B IPTG诱导；泳道4：反向插入EG12B热激诱导。

具体实施方式

以下以pET20b改造为例，结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.材料与方法

限制大肠杆菌E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)菌株、质粒pET 20b 均为本实验室保存。Q5超保真DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶、T4 多聚核苷酸激酶购自NEB公司。PCR产物纯化试剂盒、胶回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自BIOER公司。Taq DNA聚合酶、DNA Marker购自 Novoprotein公司。预染蛋白Marker购自Thermo公司。羧甲基纤维素钠CMC-Na购自Sigma公司。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、氨苄青霉素购于生工生物工程有限公司。其他试剂为分析纯。

大肠杆菌培养基为LB，配制平板时加入2％琼脂。将大肠杆菌接入LB培养基中于37℃、220rpm培养过夜，用于质粒提取或菌体培养。基因序列的测定由上海生工生物工程公司完成。

利用反向PCR技术对载体进行改造，通过设计一对与质粒上拟改造的位点两端序列互补、方向相背的引物，在引物的5’端加上拟插入序列、减去拟删除序列或修改拟突变序列；以环状质粒为模板，用高保真性且产生平末端的DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR产物经Dpn I消化去除模板，以及T4 多聚核苷酸激酶5’端磷酸化后，再用T4 DNA连接酶将其环化，转化至感受态细胞中，获得序列改造的质粒。

2.实验步骤 1)去除原质粒pET 20b上的两个BciV I酶切位点

将BciV I的识别位点GTATCC突变为Sma Ⅰ的识别位点CCCGGG。引物1/2 用于反向PCR突变质粒pET 20b的第1647-1652位处的BciV I位点，引物 3/4用于反向PCR突变质粒pET 20b的第3174-3179处的BciV I位点。

引物1：5’-GGGTAAGCGGCAGGGTCG-3’(SEQ ID NO:1)；

引物2：5’-CCGGGCTGTCCGCCTTTCTCCCTTC-3’(SEQ ID NO:2)；

引物3：5’-GGCTCATGAGACAATAAC-3’(SEQ ID NO:3)；

引物4：5’-CCGGGATATTTGAATGTATTTAG-3’(SEQ ID NO:4)。

2)切除多克隆位点和引入相背的两个BciV I识别位点

利用引物5/6在诱变完成后的载体的Nde I-Xho I之间引入两个方向相反的BciVI识别位点。

引物5：5’-CGCTATGTATCCTCTAGATTCTCGAGCACCACCACCACCAC-3’(SEQ ID NO:5)；

引物6：5’-CGCTATGTATCCGAAGAATCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG-3’(SEQ ID NO:6)。

3)引入反向启动子和表达元件

在两个BciV I识别位点和T7终止子之间引入反向Hsh启动子、核糖体结合位点、起始密码子；随后在T7启动子上游引入反向Hsh终止子、组氨酸标签、终止密码子。通过测序筛选获得阳性克隆，作为前体质粒。关键区域的结构为：Hsh ter-T7 pro-BciV I-BciVI-Hsh pro-T7 ter(图1)。

4)制备新型双向启动表达的T载体。

将上述前T载体导入大肠杆菌感受态细胞，扩大培养后提取制备大量质粒，用BciV I酶切线性化后，琼脂糖凝胶电泳分离和回收3.7kb的DNA片段，即为具有双向基因表达元件、3’末端带悬挂T的载体pET20-T(图2)。用TE溶液溶解，-20℃保存。最终得到的线性T载体序列如SEQ ID NO:7所示。

3.PCR产物的TA克隆试验：

用具有3’末端转移酶活性的Taq DNA聚合酶扩增目标基因，对需要表达的目标基因必须扩增完整的开放阅读框，扩增得到的片段与pET20-T进行连接后，转化感受态细胞，将转化菌液涂布于带有氨苄抗性的LB平板上。 37℃培养过液，挑选平板上的转化子，即可以用于后续测序和基因表达。

1)耐热葡聚糖内切酶的PCR扩增

海栖热袍菌作为极端嗜热厌氧细菌，是获得有应用价值耐热酶的重要来源。根据NCBI数据库公布的海栖热袍菌Thermotoga maritima全基因组序列(GenBank ID：AE000512.1)，分析发现其基因组中含有8段编码葡聚糖内切酶的开放阅读框。经氨基酸序列的分析和比较，发现其中一段属于糖苷水解酶第12家族的潜在耐热葡聚糖内切酶序列，命名为EG12B(NCBI登录号：NP_229325)。通过SignalP 4.1预测信号肽位点，结果显示EG12B自身含有信号肽，位于N端1～23位氨基酸残基，成熟肽为24～274。设计一对引物扩增EG12B的成熟肽区域，引物序列为：

F_EG12B：5’-AGCGTTGGCGCCACCGATATTAGC-3’(SEQ ID NO:8)，

R_EG12B：5’-TTTA ACAACTTCAA CGCTAAAATC-3’(SEQ ID NO:9)。

以海栖热袍菌基因组为模板，利用Taq DNA聚合酶扩增目的基因，得到的3’端带有A的EG12B基因片段。

2)连接与克隆

将3’端带有A的EG12B基因片段与3’端带有T的线性化载体片段以适当比例混合，T4 DNA连接酶16℃连接过夜，转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布氨苄(100μg/mL)平板。置于37℃恒温培养箱中培养过夜后，挑选转化子进行菌落PCR和酶切验证，并且用通用引物T7进行测序。

本次克隆得到约200个转化子，选取20个克隆进行序列测定，结果表明这些克隆都插入了EG12B目的基因，且核苷酸序列与预期一致，其中55％的基因为正向插入，其表达受T7 pro启动子的调控，45％的基因为反向插入，其表达受Hsh pro的调控。

3.外源基因的正、反向表达试验

选择正向插入目的基因的重组质粒转化至表达宿主E.coli BL21(DE3) 中。挑取单菌落接种于氨苄抗性LB培养液中，37℃下振荡培养至OD₆₀₀值达到0.6-0.8时，添加0.5mmol/L IPTG，20℃诱导表达8h。

选择反向插入目的基因的重组质粒转化至表达宿主E.coli BL21(DE3) 中。挑取单菌落接种于氨苄抗性LB培养液中，30℃下振荡培养至OD₆₀₀值达到0.6-0.8时，放入42℃水浴摇床进行热激诱导8h。

离心收集菌体，经生理盐水洗涤3次后，加入磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液悬浮细胞，超声破碎后离心收集上清液，SDS-PAGE检测目标蛋白分析基因表达情况(图3)。结果表明，通过TA连接克隆到pET20-T中的EG12B基因在 T7pro和Hsh pro的调控下都实现了在大肠杆菌系统中的胞内高效表达，正向调控的表达量约占全细胞总蛋白的36％，反向调控的表达量约占全细胞总蛋白的20％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 陕西理工大学

<120> 一种双向表达T载体以及其制备方法和应用

<141> 2019-01-14

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gggtaagcgg cagggtcg 18

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgggctgtc cgcctttctc ccttc 25

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggctcatgag acaataac 18

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgggatatt tgaatgtatt tag 23

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgctatgtat cctctagatt ctcgagcacc accaccacca c 41

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgctatgtat ccgaagaatc catatgtata tctccttctt aaag 44

<210> 7

<211> 3735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttctcgagca ccaccaccac caccactgag atccggctca tgggtatatc tccttcttgt 60

cgacggttaa caggtcattg gatcatgggg atgtttcccc cacattcaag gggggctaac 120

aaagcccgaa aggaagctga gttggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc 180

cttggggcct ctaaacgggt cttgaggggt tttttgctga aaggaggaac tatatccgga 240

ttggcgaatg ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc 300

gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt 360

cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag 420

ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt 480

cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt 540

tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt 600

cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt 660

aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttca ggtggcactt 720

ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgg 780

gcccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 840

tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 900

tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 960

gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 1020

aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 1080

gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 1140

ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 1200

gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 1260

gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 1320

atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 1380

ctgcagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 1440

cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 1500

cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 1560

gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 1620

cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 1680

cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt 1740

taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 1800

ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 1860

aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 1920

caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 1980

taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag 2040

gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 2100

cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 2160

taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 2220

agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 2280

ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggggcc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 2340

gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 2400

acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 2460

acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 2520

tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg 2580

ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag 2640

agcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatatg 2700

gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta 2760

tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc 2820

tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc 2880

tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagct gcggtaaagc 2940

tcatcagcgt ggtcgtgaag cgattcacag atgtctgcct gttcatccgc gtccagctcg 3000

ttgagtttct ccagaagcgt taatgtctgg cttctgataa agcgggccat gttaagggcg 3060

gttttttcct gtttggtcac tgatgcctcc gtgtaagggg gatttctgtt catgggggta 3120

atgataccga tgaaacgaga gaggatgctc acgatacggg ttactgatga tgaacatgcc 3180

cggttactgg aacgttgtga gggtaaacaa ctggcggtat ggatgcggcg ggaccagaga 3240

aaaatcactc agggtcaatg ccagcgcttc gttaatacag atgtaggtgt tccacagggt 3300

agccagcagc atcctgcgat gcagatccgg aacataatgg tgcagggcgc tgacttccgc 3360

gtttccagac tttacgaaac acggaaaccg aagaccattc atgttgttgc tcaggtcgca 3420

gacgttttgc agcagcagtc gcttcacgtt cgctcgcgta tcggtgattc attctgctaa 3480

ccagtaaggc aaccccgcca gcctagccgg gtcctcaacg acaggagcac gatcatgcgc 3540

acccgtggcc aggacccaac gctgcccgag atctcgatcc cgcgaaatca aaaaagccgc 3600

ttcctttcgg aagcggcctt caagcttatt agtggtggtg gtggtggtga taatacgact 3660

cactataggg agaccacaac ggtttccctc tagaaataat tttgtttaac tttaagaagg 3720

agatatacat atgga 3735

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agcgttggcg ccaccgatat tagc 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tttaacaact tcaacgctaa aatc 24

Claims

1.一种双向表达T载体，为两个末端的3’端均具有突出的T的线性质粒，其特征在于，

所述双向表达T载体的第一末端设置有第一强启动子和第二终止子，所述第一强启动子的方向朝向所述第一末端的方向，所述第二终止子位于所述第一强启动子的上游；

2.根据权利要求1所述的双向表达T载体，其特征在于，所述第一强启动子为T7启动子，所说第一终止子为T7终止子。

3.根据权利要求1所述的双向表达T载体，其特征在于，所述第二强启动子为热激启动子，所说第二终止子为热激终止子。

4.根据权利要求1所述的双向表达T载体，其特征在于，还包括筛选标记。

5.根据权利要求4所述的双向表达T载体，其特征在于，所述筛选标记为抗性筛选标记。

6.根据权利要求5所述的双向表达T载体，其特征在于，所述筛选标记为氨苄抗性基因表达框。

7.一种制备权利要求1-6中任一项所述的双向表达T载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，S1中移除pET20b中的原有BciV I位点；

S3中，在两个启动子之前插入两个方向相反的BciV I位点，然后通过BciV I酶切，得到具有突出的3’T的两个末端。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，通过在两个启动子之间切出平末端切口，然后在仅含有dTTP的Taq酶PCR扩增体系中72℃处理5-10分钟，使所述平末端带有突出的3’T。

10.权利要求1-6中任一项所述的双向表达T载体在分子克隆中的应用。