PT2385115E - Vetor de expressão para produção de proteína derivada de gene exógeno em grandes quantidades usando células animais e seu uso - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "Vetor de expressão para produção de proteína derivada de gene exógeno em grandes quantidades usando células animais e seu uso"

Campo técnico A presente invenção refere-se a vetores de expressão de células de mamífero que conferem às células hospedeiras de mamífero a capacidade de produzir níveis elevados de proteínas derivadas de genes exógenos. Os vetores de expressão da presente invenção são especialmente adequados para a produção de proteínas de mamífero que necessitam de glicosilação e apresentam um enrolamento que é único dos mamíferos e dificilmente têm atividade suficiente quando produzidos por recombinação genética usando E. coli ou levedura como hospedeiros.

Antecedentes da técnica

Tem-se desenvolvido um grande número de vetores para produzir proteínas recombinantes e os níveis de expressão de proteína são elevados em sistemas de expressão que usam bactérias tal como E. coli, microrganismos eucarióticos tal como levedura e células de inseto como hospedeiros. Contudo, quando expressam proteínas específicas de mamíferos, podem não formar uma estrutura tridimensional normal e na maior parte das vezes há um problema com as modificações pós-tradução tal como a glicosilação. Assim, é necessário estabelecer sistemas de expressão que usam células de mamífero como hospedeiro, mas de um modo geral, o nível de expressão é baixo na maioria dos casos. Além disso, em sistemas de expressão que usam vetores víricos recombinantes também se usam células animais, que são melhores do que células de inseto, mas remover os vetores víricos recombinantes das proteínas expressas é um processo muito complexo e o risco dos próprios vetores víricos não pode ser omitido.

Os casos de produção de proteínas recombinantes usando uma célula de mamífero como hospedeira incluem o ativador de plasminogénio dos tecidos (documento de patente 1), eritropoietina (documento de patente 2 e documentos de não patentes 1-3), IFN- (documento de ão patente 4) e IFN- (documento de patente 3 e documento de não patente 5) . Além disso, há muitos relatos sobre produção recombinante de anticorpos monoclonais (documentos de patentes 4 a 6 e documentos de não patentes 6 a 8) . Além disso, um exemplo de um vetor de expressão elevada para células de mamífero é pNOW/CMV-AA (documento de patente 7) . 0 nível de produção de conglutinina usando este vetor foi de até 11,8 pg/mL após quatro dias de cultura. Contudo, é pouco provável que o nível de produção de proteínas recombinantes seja suficiente nestes casos.

Apresentam-se seguidamente documentos da técnica anterior relacionados com a invenção deste pedido.

[Documentos da técnica anterior] [Documentos de patente] [Documento de patente 1] pedido de patente japonesa Kokai publicação n2 (JP-A) S59-183693 (não analisada, pedido de patente japonesa publicada) [Documento de patente 2] JP-A {Kokai) 2002-45191 [Documento de patente 3] JP-A (Kokai) H07-265084 [Documento de patente 4] JP-A (Kokai) H07-67648 [Documento de patente 5] JP-A (Kokai) H06-30788 [Documento de patente 6] JP-A (Kokai) H06-217786 [Documento de patente 7] JP-A (Kokai) H10-179169 [Documento de patente 8] WO 2006/048459 A2

[Documento de patente 9] WO 01/32901 AI

[Documento de patente 10] WO 2004/024915 AI

[Documentos de não patente] [Documento de não patente 1] Fermentation Bioengineering, (1989) 4: p.257 [Documento de não patente 2] Proc. Natl. Acad. Sei. USA, (1986) 83: p.6465 [Documento de não patente 3] Biotechnology, (1988) 6: p.67 [Documento de não patente 4] Proc. Natl. Acad. Sei. USA, (1983) 80: p.4564 [Documento de não patente 5] Cytotechnology, (1990) 4: p. 173 [Documento de não patente 6] Biotechnology, (1992) 10: p. 169 [Documento de não patente 7] J. Immunol. Methods, (1989) 125: p.191 [Documento de não patente 8] Biotechnology, (1992) 10: p.1455

Divulgação da invenção [Problemas a resolver pela invenção] O uso de células de mamífero, nomeadamente células de ovário de hamster chinês (doravante, células CHO) na produção de agentes farmacêuticos, tem sido confirmado como seguro e tem-se tornado uma técnica comum na atualidade. Na produção de proteínas recombinantes usando células de mamífero, o aumento da produtividade é muito importante dos pontos de vista de redução de custos, contenção de custos do sistema de saúde e semelhantes. Assim, é necessário o desenvolvimento de vetores de expressão para produzir produtos de transformação com uma capacidade de produção a nível elevado através da transferência génica eficaz. A transferência génica eficaz é necessária para a produção fácil de niveis elevados de proteína recombinante em células de mamífero. A transferência génica eficaz significa que a probabilidade de obter clones com elevado nível de produtividade é elevada independentemente da seleção de clones ser fácil ou não. Especificamente, isto significa que o número de clones de células viáveis após seleção de fármacos para todas as células transformadas é relativamente pequeno e consequentemente é fácil selecionar clones com elevados níveis de produtividade. Também significa que a probabilidade de ocorrência de clones com elevados níveis de produtividade é elevada mesmo que o número de células que produz a proteína de interesse seja pequena. À medida que aumenta o número de células disponíveis, mais tempo e esforço são necessários para seleção, levando à ineficiência e à elevada probabilidade de não se detetarem clones que tenham potencialmente uma capacidade de produção a níveis elevados. A capacidade de produção a níveis elevados refere-se ao nível de expressão elevado da proteína recombinante nos clones de células transformadas obtidos por transferência génica e tal considera-se com sendo principalmente devido às características e ao desempenho dos vetores de expressão. Verificou-se que o nível de expressão génica é nitidamente diferente dependendo da posição cromossómica (Annu. Rev. Cell Biol., 6, página 679, 1990) e é provável que a introdução de um gene de interesse numa região com elevada atividade de transcrição no cromossoma (aqui doravante, ponto crítico da transcrição) aumente o nível de produção de proteína recombinante.

Obteve-se a presente invenção tendo em conta as circunstâncias anteriores. Um objetivo da presente invenção é o de proporcionar vetores de expressão para células de mamífero que conferem a células hospedeiras de mamífero a capacidade de produzir proteínas derivadas de genes exógenos a níveis elevados. Outro objetivo da presente invenção é o de proporcionar métodos para produzir produtos de transformação utilizando vetores e métodos anteriormente mencionados para produzir proteínas derivadas de genes exógenos utilizando os vetores anteriormente mencionados.

[Meios para resolver os problemas]

Após investigação dedicada para resolver os problemas anteriormente mencionados, os presentes inventores desenvolveram com sucesso vetores de expressão que têm o mecanismo para incorporar um ADN plasmídico no ponto critico de transcrição do cromossoma de uma célula hospedeira deficiente no gene da di-hidrofolato redutase e selecionaram estirpes que crescem num meio isento de hipoxantina-timidina (aqui doravante denominada como HT). Dado que a di-hidrofolato redutase (DHFR) é necessária para a biossintese de bases nucleicas, é uma enzima essencial para todos os organismos que usam ADN como o material para informação genética. Assim, as células hospedeiras deficientes no gene da di-hidrofolato redutase não podem crescer num meio que não contém HT que é uma componente dos ácidos nucleicos. As células que expressam uma proteína de interesse podem ser selecionadas por introdução de uma construção que incorpora o gene de uma proteína de interesse e o gene de DHFR em células hospedeiras deficientes no gene da di-hidrofolato redutase e seguidamente cultura das células em condições isentas de HT.

Comparativamente com um método de introduzir uma construção que incorpore o gene de uma proteína de interesse e o gene da neomicina fosfotransferase e seguidamente efetuar seleção com G418, este método permite amplificação génica por MTX que é um inibidor de DHFR e é consequentemente mais adequado para obter estirpes que produzam a proteína de interesse a níveis elevados. Em consequência, construiu-se um vetor de expressão que permite produção de proteína estável e a níveis elevados e completou-se a presente invenção. A presente invenção refere-se à matéria objeto tal como definida nas reivindicações anexas. Mais especificamente, a presente invenção ou descrição, respetivamente, proporciona o seguinte: [1] um vetor de expressão para permitir produção a níveis elevados de uma proteína derivada de gene exógeno numa célula hospedeira de mamífero, que compreende: (a) uma cassete génica com tradução deficiente de di- hidrofolato redutase (cassete génica com tradução deficiente de DHFR), cuja expressão é atenuada pela alteração de codões para os codões menos frequentemente usados num mamífero, nomeadamente tal como definido adicionalmente nas reivindicações; e (b) uma cassete génica compreendendo um local de clonagem para integração de um gene exógeno entre um promotor muito ativo do ponto de vista de transcrição e um sinal de poliadenilação altamente estável; [2] o vetor de expressão de [1], em que os codões da cassete génica com tradução deficiente de DHFR de [1](a) foram alterados para os codões menos frequentemente usados em humanos; [3] o vetor de expressão de [1], em que os codões da

cassete génica com tradução deficiente de DHFR de [1](a) foram alterados para GCA para alanina, CGA para arginina, AAU para asparagina, GAU para ácido aspártico, UGU para cisteína, CAA para glutamina, GAA para ácido glutâmico, GGU para glicina, CAU para histidina, UUA para leucina, AAA para lisina, CCA para prolina, UUU para fenilalanina, UCA para serina, ACU para treonina, UAU para tirosina e/ou GUA para valina; [4] o vetor de expressão de [1], em que a cassete génica com tradução deficiente de DHFR de [1] (a) usa um promotor com reduzida atividade de indução de expressão como promotor; [5] o vetor de expressão de [4], em que o promotor com reduzida atividade usado é um promotor derivado de um gene que é dificilmente expresso numa célula de mamífero ou num promotor cuja parte de facilitador foi removida; [6] o vetor de expressão de [1], em que a região com alteração de codão na cassete génica com tradução deficiente de DHFR de [1] (a) é 30% ou mais do comprimento total da cassete génica; [7] um método para produzir um produto de transformação que tem a capacidade de produzir níveis elevados de uma proteína derivada de gene exógeno, que compreende as etapas de inserir um gene exógeno no vetor de expressão de qualquer um de [1] a [6] e transformar uma célula hospedeira deficiente em gene de di-hidrofolato redutase com o vetor de expressão; [8] um método para produzir uma proteína derivada de gene exógeno, que compreende as etapas de: (a) inserir um gene exógeno no vetor de expressão de qualquer um de [1] a [6]; (b) transformar umas célula hospedeira deficiente em gene de di-hidrofolato redutase com o vetor de expressão; (c) cultivar o produto de transformação num meio isento de hipoxantina-timidina; e (d) recolher a proteína derivada de gene exógeno do produto de transformação cultivado; [9] o método de [8], em que se usa um meio definido quimicamente (meio CD) ou um meio CD suplementado com um aditivo de base não animal, para cultura na etapa (c) de [8]; e [10] um método para rastrear um produto de transformação que tem a capacidade de produzir um nível elevado de uma proteína derivada de gene exógeno, que compreende as etapas de: (a) inserir um gene exógeno no vetor de expressão de qualquer uma de [1] a [6]; (b) transformar uma célula hospedeira deficiente em gene de di-hidrofolato redutase com o vetor de expressão e (c) cultivar o produto de transformação num meio isento de hipoxantina-timidina.

Descrição sucinta dos esquemas A figura 1 apresenta a construção pDCl com as respetivas abreviaturas apresentadas seguidamente. PCMV: promotor de citomegalovírus; INRBG: intrão da hormona de crescimento de coelho; PABGH: sinal de adição poliA do gene da hormona de crescimento de bovino; PdSV: promotor do virus 40 de simio com deleção de facilitador; DHFR: ADNc da di-hidrofolato redutase; PASV: sinal de adição de poliA do virus 40 de simio; e Ampr: marcador de seleção (resistência à ampicilina) em E. coli. A figura 2 apresenta a construção pDC2 com as respetivas abreviaturas apresentadas seguidamente. PCMV: promotor de citomegalovírus; INRBG: intrão da hormona de crescimento de coelho; PABGH: sinal de adição de poliA do gene da hormona de crescimento de bovino; PdSV: promotor do vírus 40 de simio com deleção de facilitador; cdDHFR: gene de DHFR com tradução deficiente produzido por alteração dos codões da sequência de nucleótidos de DHFR completa para os codões usados com menor frequência em mamíferos; PASV: sinal de adição de poliA do vírus 40 de simio; e Ampr: marcador de seleção (resistência à ampicilina) em E. coli. A figura 3 apresenta a construção pDC5 com as respetivas abreviaturas apresentadas seguidamente. PCMV: promotor de citomegalovírus; INRBG: intrão da hormona de crescimento de coelho; PABGH: sinal de adição poliA do gene da hormona de crescimento de bovino; PdSV: promotor do vírus 40 de simio com deleção de facilitador; cd90DHFR: gene de NPT com tradução deficiente produzido por alteração dos codões na gama de 90 bases a partir da extremidade 5' da sequência de nucleótidos de DHFR para os codões usados com menor frequência em mamíferos; PASV: sinal de adição de poliA do vírus 40 de simio; e Ampr: marcador de seleção (resistência à ampicilina) em E. coli. A figura 4 apresenta a construção pDC6 com as respetivas abreviaturas apresentadas seguidamente. PCMV: promotor de citomegalovírus; INRBG: intrão da hormona de crescimento de coelho; PABGH: sinal de adição de poliA do gene da hormona de crescimento de bovino; PdSV: promotor do vírus 40 de simio com deleção de facilitador; cdl80DHFR: gene de DHFR com tradução deficiente produzido por alteração dos codões na gama de 180 bases a partir da extremidade 5' da sequência de nucleótidos de DHFR para os codões usados com menor frequência em mamíferos; PASV: sinal de adição de poliA do vírus 40 de símio; e Ampr: marcador de seleção (resistência à ampicilina) em E. coli. A figura 5 apresenta a construção pDC7 com as respetivas abreviaturas apresentadas seguidamente. PCMV: promotor de citomegalovírus; INRBG: intrão da hormona de crescimento de coelho; PABGH: sinal de adição de poliA do gene da hormona de crescimento de bovino; PdSV: promotor do vírus 40 de símio com deleção de facilitador; cd270DHFR: gene de DHFR com tradução deficiente produzido por alteração dos codões na gama de 270 bases a partir da extremidade 5' da sequência de nucleótidos de DHFR para os codões usados com menor frequência em mamíferos; PASV: sinal de adição de poliA do vírus 40 de símio; e Ampr: marcador de seleção (resistência à ampicilina) em E. coli. A figura 6 apresenta a construção pDCl/hMBL com as respetivas abreviaturas apresentadas seguidamente. PCMV: promotor de citomegalovírus; INRBG: intrão da hormona de crescimento de coelho; hMBL: ADNc de lectina de ligação de manose humana; PABGH: sinal de adição de poliA do gene da hormona de crescimento de bovino; PdSV: promotor do vírus 40 de símio com deleção de facilitador; DHFR: ADNc da di- hidrofolato redutase; PASV: sinal de adição de poliA do vírus 40 de símio; e Ampr: marcador de seleção (resistência à ampicilina) em E. coli. A figura 7 apresenta a construção pDC2/hMBL com as respetivas abreviaturas apresentadas seguidamente. PCMV: promotor de citomegalovírus; INRBG: intrão da hormona de crescimento de coelho; hMBL: ADNc de lectina de ligação de manose humana; PABGH: sinal de adição de poliA do gene da hormona de crescimento de bovino; PdSV: promotor do vírus 40 de símio com deleção de facilitador; cdDHFR: gene de DHFR com tradução deficiente produzido por alteração dos codões da sequência de nucleótidos de DHFR completa para os codões usados com menor frequência em mamíferos; PASV: sinal de adição de poliA do vírus 40 de símio; e Ampr: marcador de seleção (resistência à ampicilina) em E. coli. A figura 8 apresenta a construção pDC5/hMBL com as respetivas abreviaturas apresentadas seguidamente. PCMV: promotor de citomegalovírus; INRBG: intrão da hormona de crescimento de coelho; hMBL: ADNc de lectina de ligação de manose humana; PABGH: sinal de adição de poliA do gene da hormona de crescimento de bovino; PdSV: promotor do virus 40

de simio com deleção de facilitador; cd90DHFR: gene de DHFR com tradução deficiente produzido por alteração dos codões na gama de 90 bases a partir da extremidade 5' da sequência de nucleótidos de DHFR para os codões usados com menor frequência em mamíferos; PASV: sinal de adição de poliA do vírus 40 de simio; e Ampr: marcador de seleção (resistência à ampicilina) em E. coli. A figura 9 apresenta a construção pDC6/hMBL com as respetivas abreviaturas apresentadas seguidamente. PCMV: promotor de citomegalovírus; INRBG: intrão da hormona de crescimento de coelho; hMBL: ADNc de lectina de ligação de manose humana; PABGH: sinal de adição de poliA do gene da hormona de crescimento de bovino; PdSV: promotor do vírus 40

de simio com deleção de facilitador; cdl80DHFR: gene de DHFR com tradução deficiente produzido por alteração dos codões na gama de 180 bases a partir da extremidade 5' da sequência de nucleótidos de DHFR para os codões usados com menor frequência em mamíferos; PASV: sinal de adição de poliA do vírus 40 de simio; e Ampr: marcador de seleção (resistência à ampicilina) em E. coli. A figura 10 apresenta a construção pDC7/hMBL com as respetivas abreviaturas apresentadas seguidamente. PCMV: promotor de citomegalovírus; INRBG: intrão da hormona de crescimento de coelho; hMBL: ADNc de lectina de ligação de

manose humana; PABGH: sinal de adição de poliA do gene da hormona de crescimento de bovino; PdSV: promotor do vírus 40 de simio com deleção de facilitador; cd270DHFR: gene de DHFR com tradução deficiente produzido por alteração dos codões na gama de 270 bases a partir da extremidade 5' da sequência de nucleótidos de DHFR para os codões usados com menor frequência em mamíferos; PASV: sinal de adição de poliA do vírus 40 de simio; e Ampr: marcador de seleção (resistência à ampicilina) em E. coli. A figura 11 apresenta a construção pDC6/EPO com as respetivas abreviaturas apresentadas seguidamente. PCMV: promotor de citomegalovírus; INRBG: intrão da hormona de crescimento de coelho; hEPO: ADNc de eritropoietina humana; PABGH: sinal de adição de poliA do gene da hormona de crescimento de bovino; PdSV: promotor do virus 40 de simio com deleção de facilitador; cdl80DHFR: gene de DHFR com tradução deficiente produzido por alteração dos codões na gama de 180 bases a partir da extremidade 5' da sequência de nucleótidos de DHFR para os codões usados com menor frequência em mamíferos; PASV: sinal de adição de poliA do vírus 40 de simio; e Ampr: marcador de seleção (resistência à ampicilina) em E. coli.

A figura 12 apresenta num gráfico e numa fotografia exemplos da deteção de hEPO expressa por células CHO transfetadas com o vetor de expressão pDC6/hEPO da presente invenção pelo método de transferência "dot". A figura 13 apresenta numa fotografia exemplos da deteção de hEPO expressa por células CHO transfetadas com o vetor de expressão pDC6/hEPO da presente invenção por transferência "Western", pista 1: marcador de peso molecular; pista 2: preparação padrão de EPO (R&D systems, 100 ng) ; pista 3: sobrenadante de cultura de três dias da linha celular n2 27; pista 4: sobrenadante de cultura de três dias da linha celular n2 36; pista 5: sobrenadante de cultura de três dias da linha celular n2 50; pista 6: sobrenadante de cultura de três dias da linha celular n2 60; pista 7: sobrenadante de cultura de três dias da linha celular n2 62; pista 8: sobrenadante de cultura de três dias da linha celular n2 67; pista 9: sobrenadante de cultura de três dias da linha celular n2 72; pista 10: sobrenadante de cultura de três dias da linha celular n2 77; pista 11: sobrenadante de cultura de três dias da linha celular n2 78; e pista 12: sobrenadante de cultura de três dias da linha celular n2 82. A figura 14 apresenta a construção pDC6/D-EPO com as respetivas abreviaturas apresentadas seguidamente. PCMV: promotor de citomegalovírus; INRBG: intrão da hormona de crescimento de coelho; D-EPO: ADNc da darbepoetina alfa; PABGH: sinal de adição de poliA do gene da hormona de crescimento de bovino; PdSV: promotor do vírus 40 de simio com deleção de facilitador; cdl80DHFR: gene de DHFR com tradução deficiente produzido por alteração dos codões na gama de 180 bases a partir da extremidade 5' da sequência de nucleótidos de DHFR para os codões usados com menor frequência em mamíferos; PASV: sinal de adição de poliA do vírus 40 de símio; e Ampr: marcador de seleção (resistência à ampicilina) em E. coli. A figura 15 apresenta num gráfico e numa fotografia exemplos da deteção de D-EPO expressa por células CHO transfetadas com o vetor de expressão pDC6/D-EPO da presente invenção pelo método de transferência "dot". A figura 16 apresenta numa fotografia exemplos da deteção de D-EPO expressa por células CHO transfetadas com o vetor de expressão pDC6/D-EPO da presente invenção por transferência "Western", pista 1: marcador de peso molecular; pista 2: darbepoetina alfa (injeção Nesp 120 pg/0,6 mL em seringa plástica, Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd., 100 ng); pista 3: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 12; pista 4: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 12; pista 5: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 12; pista 6: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 23; pista 7: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 23; pista 8: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 23; pista 9: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 24; pista 10: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 24; pista 11: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 24; pista 12: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 30; pista 13: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 30; pista 14: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 33; pista 15: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 36; pista 16: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 36; e pista 17: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 36. A figura 17 apresenta a construção pDC6/hG-CSF com as respetivas indicações apresentadas seguidamente. PCMV: promotor de citomegalovírus; INRBG: intrão da hormona de crescimento de coelho; hG-CSF: ADNc do fator de estimulação das colónias de granulócitos humanos (G-CSF); PABGH: sinal de adição de poliA do gene da hormona de crescimento de bovino;

PdSV: promotor do vírus 40 de símio com deleção de facilitador; cdl80DHFR: gene de DHFR com tradução deficiente produzido por alteração dos codões na gama de 180 bases a partir da extremidade 5' da sequência de nucleótidos de DHFR para os codões usados com menor frequência em mamíferos; PASV: sinal de adição de poliA do vírus 40 de símio; e Ampr: marcador de seleção (resistência à ampicilina) em E. coli. A figura 18 apresenta um gráfico e uma fotografia indicando exemplos de deteção de hG-CSF expressa por células CHO transfetadas com o vetor de expressão pDC6/hG-CSF da presente invenção pelo método de transferência "dot". A figura 19 apresenta numa fotografia exemplos da deteção de hG-CSF expressa por células CHO transfetadas com o vetor de expressão pDC6/hG-CSF da presente invenção por transferência "Western". Pista 1: marcador de peso molecular; pista 2: preparação padrão de G-CSF humano (Humanzyme, 50 yg/pista); pista 3: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 6; pista 4: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 6; pista 5: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 6; pista 6: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 13; pista 7: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 13; pista 8: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 13; pista 9: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 14; pista 10: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 14; pista 11: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 14; pista 12: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 16; pista 13: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 16; pista 14: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 16; pista 15: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 17; pista 16: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 17; e pista 17: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 17. A figura 20 apresenta a construção pDC6/hGM-CSF com as respetivas indicações apresentadas seguidamente. PCMV: promotor de citomegalovírus; INRBG: intrão da hormona de crescimento de coelho; hGM-CSF: ADNc do fator de estimulação das colónias de macrófagos granulócitos humanos (GM-CSF); PABGH: sinal de adição de poliA do gene da hormona de crescimento de bovino; PdSV: promotor do vírus 40 de símio com deleção de facilitador; cdl80DHFR: gene de DHFR com tradução deficiente produzido por alteração dos codões na gama de 180 bases a partir da extremidade 5' da sequência de nucleótidos de DHFR para os codões usados com menor frequência em mamíferos; PASV: sinal de adição de poliA do vírus 40 de símio; e Ampr: marcador de seleção (resistência à ampicilina) em E. coli. A figura 21 apresenta num gráfico e numa fotografia exemplos de deteção de hGM-CSF expressa por células CHO transfetadas com o vetor de expressão pDC6/hGM-CSF da presente invenção pelo método de transferência "dot". A figura 22 apresenta numa fotografia exemplos de deteção de hGM-CSF expresso por células CHO transfetadas com o vetor de expressão pDC6/hGM-CSF da presente invenção por transferência "Western". Pista 1: marcador de peso molecular; pista 2: preparação padrão de GM-CSF humano (Humanzyme, 50 pg/pista); pista 3: sobrenadante de cultura de 14 dias de células CHO DG44; pista 4: tampão de amostra; pista 5: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 3; pista 6: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 3; pista 7: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 3; pista 8: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 6; pista 9: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 6; pista 10: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 6; pista 11: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 11; pista 12: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 11; pista 13: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 11; pista 14: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 17; pista 15: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 17; pista 16: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 17; pista 17: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 36; pista 18: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 36; pista 19: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 36; pista 20: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 48; pista 21: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 48; e pista 22: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 48. A figura 23 apresenta a construção pDC6/hIFN com as respetivas abreviaturas apresentadas seguidamente. PCMV: promotor de citomegalovírus; INRBG: intrão da hormona de crescimento de coelho; hlFN : ADNc de interfê® 2b humano; PABG2: sinal de adição de poliA do gene da hormona de crescimento de bovino; PdSV: promotor do virus 40 de simio com deleção de facilitador; cdl80DHFR: gene de DHFR com tradução deficiente produzido por alteração dos codões na gama de 180 bases a partir da extremidade 5' da sequência de nucleótidos de DHFR para os codões usados com menor frequência em mamíferos; PASV: sinal de adição de poliA do vírus 40 de simio; e Ampr: marcador de seleção (resistência à ampicilina) em E. coli.

A figura 24 apresenta num gráfico e numa fotografia exemplos da deteção de hlFN expresso por células CHO transfetadas com o vetor de expressão pDC6/hIFN da presente invenção pelo método de transferência "dot". A figura 25 apresenta numa fotografia exemplos da deteção de hlFN expresso poréèulas CHO transfetadas com o vetor de expressão pDC6/hIFN da presente invenção por transferência "Western". Indicam-se cada um dos seguintes: pista 1: marcador de peso molecular; pista 2: preparação padrão de IFN humana (expressão de IFN 2B em células humançs n2 de catálogo HZ-1072, Human Zyme, IFN- 2b); pista 3: prepação padrão de IFN humana (solução mãe de IFN iLite™ Alphabeta (200 IU/ml), biomonitor); pista 4: sobrenadante de cultura de 14 dias de células CHO DG44; pista 5: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 3a-8; pista 6: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 3a-8; pista 7: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 3a-8; pista 8: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 3a-14; pista 9: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 3a-14; pista 10: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 3a-14; pista 11: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 2a-12; pista 12: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 2a-12; pista 13: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 2a-12. A figura 26 apresenta a construção pDC6/hOPN com as respetivas abreviaturas apresentadas seguidamente. PCMV: promotor de citomegalovírus; INRBG: intrão da hormona de crescimento de coelho; hOPN: ADNc de osteopontina humana; PABGH: sinal de adição de poliA do gene da hormona de crescimento de bovino; PdSV: promotor do virus 40 de simio com deleção de facilitador; cdl80DHFR: gene de DHFR com tradução deficiente produzido por alteração dos codões na gama de 180 bases a partir da extremidade 5' da sequência de nucleótidos de DHFR para os codões usados com menor frequência em mamíferos; PASV: sinal de adição de poliA do vírus 40 de simio; e Ampr: marcador de seleção (resistência à ampicilina) em E. coli. A figura 27 apresenta numa fotografia exemplos da deteção de hOPN expressa por células CHO transfetadas com o vetor de expressão pDC6/hOPN da presente invenção por transferência "Western". Pista 1: marcador de peso molecular; pista 2: sobrenadante de cultura de 14 dias de células CHO DG44; pista 3: sobrenadante de cultura de 3 dias da linha celular n2 32; pista 4: sobrenadante de cultura de 7 dias da linha celular n2 32; e pista 5: sobrenadante de cultura de 14 dias da linha celular n2 32.

Modos para levar a invenção à prática

Por alteração dos codões do gene de DHFR para os codões usados com menor frequência em mamíferos para atenuar acentuadamente a expressão de DHFR, os presentes inventores dificultaram a sobrevivência sob seleção em meio não contendo HT mesmo para produtos de transformação exceto se o gene de plasmídeo incorporado estiver integrado numa posição com propriedades de expressão muito elevada no cromossoma do gene de células hospedeiras deficientes em di-hidrofolato redutase.

Mais especificamente, a presente invenção proporciona vetores de expressão para induzir produção a níveis elevados de proteínas recombinantes em células hospedeiras de mamíferos.

Constrói-se um vetor de expressão da presente invenção e.g. por inclusão do seguinte num vetor de esqueleto: (a) uma cassete com gene da di-hidrofolato redutase com tradução deficiente (uma cassete génica de DHFR com tradução deficiente), cuja expressão é enfraquecida pela alteração de codões para os codões usados com menor frequência num mamífero, tal como definido adicionalmente nas reivindicações; e (b) uma cassete génica compreendendo um local de clonagem para integração de um gene exógeno entre um promotor com elevada atividade de transcrição e um sinal de poliadenilação altamente estável. A presente invenção impede fortemente o mecanismo de expressão de DHFR na célula hospedeira transformada através de transferência génica por alteração dos codões do gene de DHFR para os codões usados com menor frequência em mamíferos e usando promotores com a propriedade de indução de expressão de DHFR diminuída para a construção da cassete génica de DHFR (cistrão). Na presente invenção, "cassete génica" refere-se a uma unidade com a composição básica de promotor, gene estrutural e sinal de poliadenilação (poliA) que expressam proteína através de transcrição/tradução e pode também incluir sequências de ADN como sequências de inserção associadas com qualquer uma destas sequências ou quaisquer sequências de ADN opcionais. As cassetes génicas de DHFR da presente invenção definem-se como "cassete génica com tradução deficiente de DHFR" porque são diferentes daquelas que têm simplesmente um promotor atenuado e permitem especificamente a aquisição de estirpes que crescem em meio isento de HT e têm os genes de plasmídeo integrados num ponto crítico de transcrição.

Na presente invenção "os codões usados com menor frequência em mamíferos" refere-se a preferentemente, por exemplo, os codões usados com menor frequência em humanos. Os codões usados com menor frequência em humanos incluem os codões divulgados no documento por Kim et al. (Gene, 199, p.293, 1997) . Os exemplos específicos de codões são GCA para alanina, CGA para arginina, AAU para asparagina, GAU para ácido aspártico, UGU para cisteína, CAA para glutamina, GAA para ácido glutâmico, GGU para glicina, CAU para histidina, UUA para leucina, AAA para lisina, CCA para prolina, UUU para f enilalanina, UCA para serina, ACU para treonina, UAU para tirosina e/ou GUA para valina, não se lhes limitando.

Na presente invenção, "para atenuar expressão" indica redução da expressão génica aos níveis de transcrição e/ou tradução e especificamente tal pode conseguir-se por alteração dos codões para os "codões usados com menor frequência em mamíferos" anteriormente mencionados.

Na "cassete génica com tradução deficiente de DHFR" anteriormente mencionada, as regiões cujos codões são alterados não estão especialmente limitadas, mas são preferentemente alterados os codões numa região correspondente a 30% ou mais (por exemplo, 40% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, 90% ou mais, 95% ou mais ou 100%) do comprimento total da cassete génica. No vetor de expressão aqui reivindicado, uma região com codões alterados na cassete génica com tradução deficiente de DHFR é 30% ou mais do comprimento total da cassete génica. A gama das regiões com codões alterados pode ser determinada arbitrariamente considerando outras condições do vetor.

Como promotor para a "cassete génica com tradução deficiente de DHFR" anteriormente mencionada, podem usar-se promotores derivados do promotor de um gene de uma proteína que é normalmente difícil de expressar numa célula de mamífero ou promotores produzidos por deleção do facilitador de um promotor normal. Mais especificamente, usam-se preferentemente um promotor produzido pela deleção da região de facilitador do promotor do antigénio do vírus SV40 (Mol. Cell Biol., 6, p. 2593, 1986) ou promotores com uma propriedade de expressão equivalente muito reduzida. A integração de ADN plasmídico num ponto crítico de transcrição no cromossoma da célula hospedeira deficiente no gene da di-hidrofolato redutase pode ser conseguida em resultado da seleção com um meio que não contenha HT de acordo com as propriedades da cassete génica de DHFR, mas a expressão da própria proteína derivada de gene exógeno no ponto crítico de transcrição do cromossoma deve ser fortemente induzida. Assim, os promotores e sinal de poliadenilação (doravante aqui denominado poliA) no local de multiclonagem (doravante aqui referido como MCS) em que os genes da proteína estão inseridos serão selecionados de entre os que apresentam as propriedades de indução de expressão mais fortes. Os exemplos de promotores incluem o promotor precoce imediato de citomegalovírus humano (hCMV MIE: Cell, 41, p.521, 1985), o promotor de CMV5 que é um promotor de fusão do promotor de citomegalovírus humano e do promotor de adenovirus (Nucleic Acid Research, 30, p.2, 2002) e o promotor de -actina (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84, p.4831, 1987); e os exemplos de poliA incluem a sequência de poliA derivada da hormona de crescimento bovina (DNA, 5, p.115, 1986). Aqui, um fragmento de ADN que apresenta um local de mult iclonagem para inserção do gene de uma proteína de interesse denomina-se uma "cassete de expressão génica".

Os vetores de expressão da presente invenção podem ser exemplificados por vetores de expressão descritos especificamente nos Exemplos, mas não se lhes limitando.

Além disso, a presente invenção proporciona um método para produzir produtos de transformação com uma capacidade de produzir proteínas derivadas de genes exógenos a níveis elevados e uma capacidade de crescer num meio que não contém HT, que compreende as etapas de inserir um gene exógeno nos vetores de expressão anteriormente mencionados e transformar células hospedeiras deficientes no gene da di-hidrofolato redutase usando os vetores de expressão.

Os exemplos específicos incluem um método de obter produtos de transformação com elevada capacidade de produzir proteína, o que envolve inserir um gene exógeno que codifica uma proteína a ser expressa num local de multiclonagem (doravante aqui referido como MCS) de um vetor de expressão da presente invenção e seguidamente transformar células hospedeiras deficientes no gene da di-hidrofolato redutase com o vetor de expressão por utilização de um método de transfeção (os exemplos de método de transfeção aqui referidos incluem métodos bem conhecidos dos peritos na especialidade tal como método da lipofectina, método de eletroporação, método do fosfato de cálcio e método da microinjeção) e seguidamente selecionar por resistência num meio não contendo HT.

Na presente invenção, as células hospedeiras não estão especialmente limitadas desde que sejam células adequadas para expressar proteínas derivadas de genes exógenos, mas incluem de preferência, por exemplo, células de mamífero deficientes no gene da di-hidrofolato redutase e com maior preferência células de ovário de hamster chinês (células CHO) deficientes no gene da di-hidrofolato redutase.

Muitas das células transformadas que sobreviveram à seleção num meio isento de HT já atingiram um nivel de expressão de proteína relativamente elevado, mas para selecionar dessas células as células transformadas que têm um nivel ainda mais elevado de capacidade de produção, pode determinar-se o nível de expressão de proteína.

Além disso, a presente invenção proporciona métodos para produzir uma proteína derivada de gene exógeno, que compreende as etapas de: (a) inserir um gene exógeno num vetor de expressão da presente invenção; (b) transformar um gene da célula hospedeira deficiente em di-hidrofolato redutase com o vetor de expressão; (c) cultivar o produto de transformação num meio isento de HT; e (d) recolher a proteína derivada do gene exógeno dos produtos de transformação cultivados.

Na presente invenção, na etapa (c) anteriormente mencionada, podem selecionar-se os produtos de transformação (colónias) que apresentem uma alta eficiência de expressão de proteína por cultura num meio isento de HT. Os produtos de transformação selecionados podem ser cultivados continuamente no mesmo meio ou podem ser cultivados após transferência para outro meio tal como um meio para expressão em larga escala.

Na presente invenção, os meios para cultivar os produtos de transformação ou para tornar os produtos de transformação naturais, não são especialmente limitados mas são, por exemplo, de preferência um meio isento de soro e com a maior preferência um meio CD ou um meio CD suplementado com aditivos de base não animal.

Na presente invenção, quando se recolhem proteínas derivadas de genes exógenos a partir de produtos de transformação cultivados, as proteínas podem ser purificadas por métodos conhecidos dos peritos na especialidade (filtração, centrifugação, purificação em coluna e semelhantes). As proteínas derivadas de genes exógenos podem ser expressas como proteínas de fusão com outras proteínas para facilitar a purificação e semelhantes.

Além disso, a presente invenção proporciona um método de rastrear para produtos de transformação com elevada capacidade para produzir uma proteína derivada de gene exógeno, que compreende as etapas de: (a) inserir um gene exógeno num vetor de expressão da presente invenção; (b) transformar uma célula hospedeira deficiente em gene de di-hidrofolato redutase com o vetor de expressão; e (c) cultivar o produto de transformação num meio isento de HT.

Exemplos [Exemplo 1] Construção de pDCl, pDC2, pDC5, pDC6 e pDC7

Usando métodos bem conhecidos dos peritos na especialidade construíram-se os vetores da presente invenção, pDCl, pDC2, pDC5, pDC6 e pDC7. Apresenta-se a sequência de nucleótidos completa do vetor de esqueleto pDCl na SEQ ID NO: 1. 0 pDCl transporta o ADNc de DHFR de tipo selvagem entre os nucleótidos n2 1784 e n2 2347 (figura 1). Constrói-se pDC2 por substituição dos nucleótidos n2 1784 a n2 2347 na sequência de pDCl com a sequência de SEQ ID NO: 2. Introduz-se a região substituída de pDC2 com um gene de DHFR com tradução deficiente no qual os codões da sequência completa de nucleótidos de DHFR foram alterados para os codões usados com menor frequência em mamíferos (figura 2).

Constrói-se pDC5 por substituição dos nucleótidos n2 1784 a n2 2347 na sequência de pDCl pela sequência de SEQ ID NO: 3. Introduz-se a região substituída de pDC5 com um gene de DHFR com tradução deficiente no qual se alteraram codões na gama de 90 bases desde a extremidade 5' na sequência de nucleótidos de DHFR para os codões usados com menor frequência em mamíferos (figura 3).

Constrói-se pDC6 por substituição dos nucleótidos n2 1784 a n2 2347 na sequência de pDCl pela sequência de SEQ ID NO: 4. Introduz-se a região substituída de pDC6 com um gene de DHFR com tradução deficiente no qual se alteraram codões na gama de 180 bases desde a extremidade 5' na sequência de nucleótidos de DHFR para os codões usados com menor frequência em mamíferos (figura 4).

Constrói-se pDC7 por substituição dos nucleótidos n2 1784 a n2 2347 na sequência de pDCl pela sequência de SEQ ID NO: 5. Introduz-se a região substituída de pDC7 com um gene de DHFR com tradução deficiente no qual se alteraram codões na gama de 270 bases desde a extremidade 5' na sequência de nucleótidos de DHFR para os codões usados com menor frequência em mamíferos (figura 5).

[Exemplo 2] Construção de pDCl/hMBL, pDC2/hMBL, pDC5/hMBL, pDC6/hMBL e pDC7/hMBL

Usando métodos bem conhecidos dos peritos na especialidade, substituíram-se os nucleótidos n2 1267 a n2 1275 nos vetores da presente invenção, pDCl, pDC2, pDC5, pDC6, e pDC7, por um ADNc que codifica a lectina de ligação de manano (MBL) humana de SEQ ID NO: 6 (doravante aqui referida como hMBL), para a construção de pDCl/hMBL (figura 6), pDC2/hMBL (figura 7), pDC5/hMBL (figura 8), pDC6/hMBL (figura 9) e pDC7/hMBL (figura 10).

[Exemplo 3] Transfeção de pDCl/hMBL; pDC2/hMBL, pDC5/hMBL, pDC6/hMBL e pDC7/hMBL para células CHO e seleção em meio isento de HT usando um meio CD ou meio CD suplementado com aditivos de base não animal

Transfetaram-se 10 yg de pDCl/hMBL, pDC2/hMBL, pDC5/hMBL, pDC6/hMBL e pDC7/hMBL para 500 000 células CHO (células CHO

DG44) em frascos de cultura de 25 cm2 usando o método de lipofectina (usando Lipofectamine™ LTX; Invitrogen). Efetuou-se transfeção génica de acordo com as instruções do fabricante. 48 horas após a transfeção génica, contou-se o número de células e seguidamente diluiram-se as células em IS CHO-CD com meio Hydrolysate (IS Japão) suplementado com Gluta MAX™-1 (Invitrogen) 4 mM. Plaquearam-se as células em cinco placas de microtitulação de 96 poços cada uma a concentrações de 1 000 células/poço e 100 células/poço, num total de 10 placas (960 poços) e após cultura na presença de dióxido de carbono gasoso a 5% a 37 °C durante aproximadamente três semanas, observaram-se células viáveis (linhas celulares que crescem em meio isento de HT) . Das células viáveis, selecionaram-se aleatoriamente 50 linhas a partir de linhas celulares que crescem em meio isento de HT, transferiram-se para placas de 24 poços conjuntamente com IS CHO-CD com meio Hydrolysate (IS Japão) suplementado com Gluta MAX™-I

(Invitrogen) 4 mM e cultivaram-se até as células ocuparem 1/3 ou mais de cada poço. Colocaram-se 0,4 mL de cada linha num tubo estéril e centrifugaram-se a 200 x g durante dois minutos. Rejeitou-se o sobrenadante e suspenderam-se as células em 0,1 mL de meio fresco (IS CHO-CD com meio Hydrolysate (IS Japão) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM). Após contar o número de células, diluiram-se as células com o meio até 5 x 105 células/mL e seguidamente transferiram-se 0,2 mL destas para novas placas de 24 poços e cultivaram-se as células na presença de dióxido de carbono gasoso a 5% a 37 °C durante aproximadamente 72 horas.

Seguidamente, centrifugaram-se as células a 9 300 x g durante dois minutos e recolheu-se o sobrenadante. Seguidamente, determinou-se o nivel de produção de MBL nos sobrenadantes da cultura.

[Exemplo 4] Determinação dos níveis de produção de MBL pelas linhas celulares transfetadas com pDCl/hMBL, pDC5/hMBL, pDC6/hMBL e pDC7/hMBL

Ensaiou-se o nível de produção por ELISA. Revestiram-se placas de 96 poços (F96 MAXI SORP Nunc-Immunoplate, n2 de catálogo 442404, Nunc) com um anticorpo MBL anti-humano (oferta do Dr. Ohtani da Universidade de Medicina de

Asahikawa, Japão) a 1 pg/mL diluído com um tampão de revestimento (Na2CC>3 15 mM, NaHCCh 35 mM, NaN3 a 0,05%, pH 9,6) a 4 °C durante 16 horas. Após bloqueamento com Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% aplicou-se às placas o sobrenadante de cultura de 72 horas (diluição 1/1 000 a 1/100 000), diluições em série de duas vezes (20 a 0,3125 ng/mL) de MBL humana purificada (oferta do Dr. Ohtani da Universidade de Medicina de Asahikawa, Japão) em IS CHO-CD com meio Hydrolysate (IS Japão) que é um meio isento de soro para células CHO ou IS CHO com meio Hydrolysate (IS Japão) a 100 pL/poço e incubaram-se as placas a 37 °C durante uma hora. Tal foi incubado adicionalmente com anticorpo monoclonal anti-MBL humano biotinilado a 0,1 pg/mL (oferta do Dr. Ohtani da Universidade de Medicina de Asahikawa, Japão) a 37 °C durante uma hora. Aplicou-se VECTASTAION Elite ABC Kit STANDARD (2 gotas de reagente A, 2 gotas de reagente B / 5 mL, Vector) , que tinha sido incubado a 37 °C durante 30 minutos, a 100 pL/poço e permitiu-se que reagisse a 37 °C durante 45 minutos. Aplicou-se adicionalmente KIT TMB DE SUBSTRATO DE PEROXIDASE (2 gotas de tampão, 3 gotas de TMB, 2 gotas de PERÓXIDO DE HIDROGÉNIO / 5 mL, Vector), que tinha sido incubado à temperatura ambiente durante 30 minutos, a 100 pL/poço e após reação à temperatura ambiente durante 15 minutos, adicionou-se ácido fosfórico 1 M a 100 pL/poço para parar a reação. Determinou-se a concentração de proteína usando um leitor de microplacas (modelo 680, fabricado por BioRad). Apresentam-se na tabela 1 os resultados obtidos pelo método de ELISA e as três melhores amostras apresentando níveis de produção de MBL elevados. A linha celular com o maior nível de produção apresentou uma produtividade significativamente elevada comparativamente com o vetor com os codões sem alterações.

[Tabela 1]

NÍVEL DE PRODUÇÃO DE hMBL DE LINHAS CELULARES CULTIVADAS EM MEIO ISENTO DE HT

[Exemplo 5] Níveis de produção de hMBL pelas linhas celulares transfetadas com pDCl/hMBL, pDC5/hMBL, pDC6/hMBL e pDC7/hMBL A distribuição de hMBL expressa pelos vetores de expressão pDCl, pDC5, pDC6 e pDC7 da presente invenção em cada linha celular é apresentada na tabela 2.

Para pDCl, de entre as cinquenta linhas celulares que crescem em meio isento de HT, 28,0% produziram hMBL a 0 pg/mL ou mais até menos de 5 pg/mL. 36 das cinquenta linhas celulares (72,0%) apresentaram níveis de produção de 5 pg/mL ou mais. 19 das cinquenta linhas celulares (38,0%) apresentaram níveis de produção de 10 pg/mL ou mais. 12 das cinquenta linhas celulares (24,0%) apresentaram níveis de produção de 15 pg/mL ou mais. Duas das cinquenta linhas celulares (4,0%) apresentaram níveis de produção de 20 pg/mL ou mais. A linha que apresentou o nível de produção mais elevado produziu 20,5 pg/mL em 3 dias.

Para pDC5, entre as cinquenta linhas celulares que cresceram em meio isento de HT, 70,0% produziram hMBL a 0 pg/mL ou mais a menos de 5 pg/mL. Quinze das cinquenta linhas (30,0%) apresentaram níveis de produção de 5 pg/mL ou mais. Três das cinquenta linhas (6,0%) apresentaram níveis de produção de 10 pg/mL ou mais. A linha que apresentou o nível de produção mais elevado produziu 11,8 pg/mL em 3 dias.

Para pDC6, entre as cinquenta linhas celulares que cresceram em meio isento de HT, 34,0% produziram hMBL a 0 pg/mL ou mais a menos de 5 pg/mL. 33 das cinquenta linhas (66,0%) apresentaram níveis de produção de 5 pg/mL ou mais. 22 das cinquenta linhas (44,0%) apresentaram níveis de produção de 10 pg/mL ou mais. 15 das cinquenta linhas (30,0%) apresentaram níveis de produção de 15 pg/mL ou mais. Sete das cinquenta linhas (14,0%) apresentaram níveis de produção de 20 pg/mL ou mais. Cinco das cinquenta linhas (10,0%) apresentaram níveis de produção de 25 pg/mL ou mais. Surpreendentemente, uma das cinquenta linhas (2,0%) apresentou um nível de produção de 50 pg/mL ou mais. A linha que apresentou o nível de produção mais elevado produziu 51,6 pg/mL em 3 dias.

Para pDC7, entre as cinquenta linhas celulares que cresceram em meio isento de HT, 56,0% produziram hMBL a 0 pg/mL ou mais a menos de 5 pg/mL. Vinte e duas das cinquenta linhas (44,0%) apresentaram níveis de produção de 5 pg/mL ou mais. Dezasseis das cinquenta linhas (32,0%) apresentaram níveis de produção de 10 pg/mL ou mais. Treze das cinquenta linhas (26,0%) apresentaram níveis de produção de 15 pg/mL ou mais. Oito das cinquenta linhas (16,0%) apresentaram níveis de produção de 20 pg/mL ou mais. Seis das cinquenta linhas (12,0%) apresentaram níveis de produção de 25 pg/mL ou mais. Três das cinquenta linhas (6,0%) apresentaram níveis de produção de 30 pg/mL ou mais. Duas das cinquenta linhas (4,0%) apresentaram níveis de produção de 35 pg/mL ou mais. Surpreendentemente, uma das cinquenta linhas (2,0%) apresentou um nível de produção de 45 pg/mL ou mais. A linha que apresentou o nível de produção mais elevado produziu 33,2 pg/mL em 3 dias.

Este fui um dos níveis mais elevados comparativamente com dados de clones iniciais antes da amplificação génica por vetores de expressão representativos relatados na literatura (DNA, 7, p.651, 1988; Biotechnology, 10, p.1455, 1992;

Biotechnology, 8, p.662, 1990; Gene 76, p.19, 1989; e

Biotechnology, 9, p.64, 1991). O rastreio de células recombinantes por amplificação génica necessita geralmente de entre seis meses a um ano. Devido a existirem grandes variações devido às condições de cultura e às concentrações de agente de estimulação de amplificação, considera-se apropriado comparar a eficácia primária dos vetores de expressão usando o nível de expressão na pré-amplificação dos clones iniciais. Tal revelou que a eficácia dos vetores de expressão da presente invenção é muito elevada. Os resultados confirmaram que enquanto os vetores da presente invenção proporcionaram muito poucas linhas que crescem em meio isento de HT, também permitem o estabelecimento de linhas celulares que são capazes de produzir níveis elevados de proteínas de interesse com eficácia muito elevada. Tal provou que os vetores de expressão da presente invenção permitem expressão de proteína a níveis muito elevados.

[Tabela 2]

LINHA DE PRODUÇÃO DE hMBL DE LINHAS CELULARES CULTIVADAS EM MEIO ISENTO DE HT

[Exemplo 6] Construção de pDC6/hEP0

Usando métodos bem conhecidos dos peritos na especialidade, os nucleótidos n2 1267 a n2 1275 no vetor da presente invenção, pDC6, foram substituídos por um ADNc que codifica para eritropoietina (EPO) humana com SEQ ID NO: 7 (doravante referida como hEPO), para a construção pDC6/hEP0 (figura 11).

[Exemplo 7] Transfeção de pDC6/hEP0 para células CHO e seleção em meio isento de HT usando um meio CD ou um meio CD suplementado com aditivos de base não animal

Transf etaram-se 2,5 pg de pDC6/hEP0 para 4 000 000 de células CHO (células CHO DG44) em frascos de cultura de 25 cm2 usando o método de lipofectina (usando Lipofectamine™ LTX; Invitrogen). Efetuou-se transfeção de acordo com as instruções do fabricante. 48 horas após transfeção génica, contou-se o número de células e seguidamente diluíram-se as células em IS CHO-CD com meio Hydrolysate (IS Japão) suplementado com Gluta MAX™-1 (Invitrogen) 4 mM. Plaquearam-se as células em cinco placas de microtitulação de 96 poços a uma concentração de 4 000 células/poço (480 poços) e após cultura na presença de dióxido de carbono gasoso a 5% e a 37 °C durante aproximadamente três semanas, observaram-se as células viáveis (linhas celulares crescendo em meio isento de HT). A partir das células viáveis, selecionaram-se arbitrariamente 82 linhas celulares que crescem em meio isento de HT e confirmou-se expressão por transferência "dot". Aplicou-se numa membrana Nytran N, N2 de item 10416196, SCHLEICHER & SCHUELL) 1 pL de cada uma das diluições em série de duas vezes (10 a 0,16 ng/mL) de uma preparação padrão de EPO recombinante humana (EPO recombinante humana, n2 de catálogo 287-TC, R & D systems) e os sobrenadantes de culturas das 82 linhas selecionadas arbitrariamente. Após incubação à temperatura ambiente durante 30 minutos, bloqueou-se com Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionalmente, adicionou-se 0,2 pg/mL de um anticorpo anti-EPO policlonal de coelho (EPO (H-162), IgG policlonal de coelho, n2 de catálogo sc-7956, Santa

Cruz Biotechnology) diluído com PBST (D-PBS, Tween 20 a 0,05%) e agitou-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionou-se 0,2 pg/mL de um anticorpo IgG anti-coelho marcado com peroxidase (IgG F8c anti-COELHO purificado por afinidade e conjugado com peroxidase, n2 de catálogo 611-1303, Rock Land) diluído com PBST (D-PBS, Tween 20 a 0,05%) e agitou-se durante 30 minutos. Fez-se reagir substrato HRP quimioluminescente para "Western" Immobilon™ (2 mL de reagente de luminol, 2 mL de solução de peróxido, MILLIPORE, n2 de catálogo WBKLS0050, MILLIPORE) à temperatura ambiente durante cinco minutos e adicionou-se. Incubou-se à temperatura ambiente durante cinco minutos e capturou-se a quimioluminescência usando um detetor (ATTO Light-Capture, AE-6981FC, ATTO). A imagem obtida por transferência "dot" apresenta-se na figura 12.

Transferiram-se as dez linhas com maior intensidade de luminescência nas transferências "dot" para placas de 24 poços conjuntamente com IS CHO-CD em meio Hydrolysate (IS Japão) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM e cultivou-se até as células ocuparem 1/3 ou mais de cada poço. Colocou-se 0,4 mL de cada linha num tubo estéril e centrifugou-se a 200 x g durante dois minutos. Rejeitou-se o sobrenadante e suspenderam-se as células em 0,1 mL de meio fresco (IS CHO-CD com meio Hydrolysate (IS Japão) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM). Após contagem do número de células, diluíram-se as células com o meio até 5 x 105 células/mL e seguidamente transferiram-se 0,2 mL destas para placas de 24 poços novas e cultivaram-se as células na presença de dióxido de carbono gasoso a 5% a 37 °C durante 72 horas. Seguidamente, centrifugaram-se as células a 9 300 x g durante dois minutos e recolheu-se o sobrenadante. Seguidamente, determinou-se o nível de produção.

[Exemplo 8] Medição do nível de hEPO produzido nas linhas celulares transfetadas com pDC6/hEPO

Determinou-se o nível de produção por ELISA. Revestiram-se placas de 96 poços (placa F96 MAXI SORP Nunc-Immuno, n2 de catálogo 442404, Nunc) a 4°C durante 16 horas com um anticorpo anti-EPO humana (rhEPO MAb R6K, Fuso Pharmaceutical Industries) a 1 pg/mL diluído com uma solução de anticorpo de fase sólida (D-PBS (tampão de fosfato da Dulbecco, Sigma-

Aldrich)). Após bloqueamento com uma solução de bloqueamento (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturada numa razão 1:3 com D-PBS (tampão de fosfato da Dulbecco, Sigma Aldrich)), aplicaram-se 100 yL cada de sobrenadantes de cultura de 72 horas (diluição 1/1000 a 1/100 000), séries de diluição de duas vezes (500 a 15,6 mIU/mL) de EPO humana purificada (Fuso Pharmaceutical Industries) em diluente de antigénio anticorpo (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturado numa razão 1:9 com D-PBS (tampão de fosfato da Dulbecco, Sigma Aldrich)) e diluente de antigénio anticorpo (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturado numa razão 1:9 com D-PBS (tampão de fosfato da Dulbecco, Sigma Aldrich)) e efetuou-se incubação a 25 °C durante duas horas. Incubou-se adicionalmente com anticorpo monoclonal anti-EPO humano marcado com peroxidase (POD-rhEPO MAb R2C, Fuso Pharmaceutical Industries) a 0,1 pg/mL a 25 °C durante duas horas. Aplicou-se substrato de peroxidase Sure Blue TMB Microwell (KPL) a 100 pL/poço e seguidamente reagiu a 25 °C durante 30 minutos e adicionou-se ácido fosfórico 1 M a 100 pL/poço para parar a reação. Determinou-se a concentração de proteína usando um leitor de microplacas (modelo 680, fabricado por BioRad) e no leitor de microplacas mediu-se a absorvância ao comprimento de onda de 450 nm com o comprimento de onda de 655 nm como controlo. A tabela 3 apresenta as dez amostras com nível de produção de EPO humana mais elevado de acordo com os resultados obtidos por ELISA. A linha celular que apresenta o nível de produção mais elevado produziu 3 727 ± 109 IU/mL em 3 dias. Este valor deriva de uma linha celular de fase inicial não clonada, i.e., num estado que ainda não sofreu amplificação génica, indicando um nível de produção muito elevado comparativamente com níveis de produção de eritropoietina representativos relatados na literatura (JP-A (Kokai) 2002-45191; J. Microbiol. Biotechnol. julho de 2008; 18(7) :1342-1351; Biotechnol. Appl. Biochem. dezembro de 2000; 32 (Pt 3) :167-172; Proc. Natl. Acad. Sei. U S A., setembro de 1986; 83(17) :6465-6469) . Tal provou que os vetores de expressão da presente invenção permitem expressão de proteína a níveis muito elevados. Seguidamente, efetuou-se transferência "Western" de hEPO em sobrenadantes de cultura para confirmar expressão de proteína.

[Tabela 3]

[Exemplo 9] Transferência "Western" de sobrenadantes de cultura de células transfetadas com pDC6/hEP0

Analisaram-se por transferência "Western" sobrenadantes de cultura de três dias de dez amostras com a produção de EPO humana mais elevada obtidas no exemplo 8 descrito anteriormente. Misturou-se 10 pL de cada um dos sobrenadantes de cultura com 10 pL de tampão de amostra de Laemmli (BIO-RAD) contendo 2-mercaptoetanol (Wako) a 5% para redução por aquecimento a 98 °C durante cinco minutos (termociclador de PCR PERSONAL TaKaRa, TaKaRa BIOMEDICALS) . Além disso, misturou-se uma preparação padrão de rhEPO a 100 ng/10 pL (EPO recombinante humana, n2 de catálogo 287-TC, R&D systems) com 10 pL de tampão de amostra de Laemmli (BIO-RAD) contendo 2-mercaptoetanol (Wako) a 5% para redução por aquecimento a 98 °C durante cinco minutos (termociclador de PCR PERSONAL TaKaRa, TaKaRa BIOMEDICALS). Colocou-se tampão de eletroforese (Tris/glicina/SDS, BIO-RAD) e Super Sep™ de 10% a 20% de 17 poços (Wako) numa tina de eletroforese (DPE-1020, DAIICHI PURE CHEMICALS CO., LTD) e aplicaram-se 20 pL das soluções de amostra e preparações padrão tratadas por calor ao Super Sep™ de 10% a 20% de 17 poços (Wako) e efetuou-se eletroforese a 40 mA durante 55 minutos (usou-se uma fonte de tensão: My

Run, COSMO BIO CO., LTD) . Seguidamente, removeu-se o gel das placas de vidro e embebeu-se num tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a

30%) com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries) durante cinco minutos. Ativou-se uma membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE) embebendo sequencialmente em 8 mL de metanol (Wako) durante 15 segundos, 8 mL de água MilliQ (MILLIPORE) durante dois minutos e 8 mL de tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%) durante cinco minutos com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries). Num aparelho de transferência (TRANS-BLO, CÉLULA DE TRANSFERÊNCIA SEMISSECA SD, BIO-RAD) colocaram-se por ordem a partir do cátodo, papéis de filtro (papel de transferência extra espesso tamanho

Criterion™, BIO-RAD) embebido em tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%) , membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE) ativada, o gel após eletroforese embebido em tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%) e papéis de filtro (papel de transferência extra espesso tamanho Criterion™, BIO-RAD) embebido em tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%), colocou-se uma tampa e efetuou-se eletroforese a 80 mA (PowerPac ™ HC, BIO-RAD) durante uma hora e meia para transferir as proteínas separadas para a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE). Após transferência, embebeu-se a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE) em 8 mL de ImmunoBlock (marca comercial registada, divisão de produtos de laboratório de Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) e bloqueou-se a 4 °C durante 18 horas; e fez-se reagir 10 mL de IgG de coelho policlonal anti-Epo (H-162) (Santa Cruz Biotechnology) diluído 1000 vezes com D-PBS (Wako) contendo Tween 20 (polioxietileno (20) sorbitano monolaurato, Wako) a 0,05% com as proteínas na membrana durante uma hora à temperatura ambiente com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries). Após remoção dos anticorpos não ligados, adicionou-se 10 mL de um anti-IgG F(c) de coelho [cabra] purificado por afinidade e conjugado com peroxidase (Rock Land) diluído 5000 vezes com D-PBS (Wako) contendo Tween 20 (polioxietileno (20) sorbitano monolaurato, Wako) a 0,05% e fez-se reagir durante uma hora à temperatura ambiente com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific

Industries). Após remoção dos anticorpos não ligados, adicionou-se 2 mL de substrato HRP quimioluminescente para "Western" Immobilon™ (MILLIPORE) para quimioluminescência e tiraram-se fotografias de 30 segundos usando um sistema de câmara CCD arrefecida Light-Capture ATTO (ATTO) com as regulações normais. A imagem obtida por transferência "Western" apresenta-se na figura 13. Detetaram-se bandas semelhantes às da preparação padrão.

[Exemplo 10] Medição dos niveis de produção de hEPO em culturas de 7 dias e em culturas de 14 dias

Selecionaram-se linhas celulares apresentando niveis elevados de produção de EPO assim como crescimento rápido (números 27, 36, 50, 78 e 82) e cultivaram-se adicionalmente durante 7 e 14 dias e mediram-se as concentrações de hEPO nos sobrenadantes de cultura. O método de cultura envolveu a medição inicial do número de células, diluição das células com um meio para obter 0,5 x 105 células/mL, seguido de transferência de 7,5 mL para um novo frasco T75, cultura na presença de dióxido de carbono a 5% a 37 °C durante 7 e 14 dias e recolha do sobrenadante após centrifugação a 9300 g durante dois minutos. Determinaram-se os niveis de produção por ELISA. Revestiram-se placas de 96 poços (placa F96 MAXI SORP Nunc-Immuno, n2 de catálogo 442404, Nunc) a 4 °C durante 16 horas com um anticorpo anti-EPO humana (rhEPO MAb R6K, Fuso Pharmaceutical Industries) a 1 pg/mL diluído com uma solução de anticorpo de fase sólida (D-PBS (tampão de fosfato da Dulbecco, Sigma-Aldrich)). Após bloqueamento com uma solução de bloqueamento (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co.,

Ltd.) a 4% misturada numa razão 1:3 com D-PBS (tampão de fosfato da Dulbecco, Sigma Aldrich)), aplicaram-se 100 pL de cada dos sobrenadantes de cultura de 7 dias e de 14 dias (diluição 1/1 000 a 1/100 000), diluições em série de duas

vezes (500 a 15,6 mIU/mL) de EPO humana (Fuso Pharmaceutical Industries) purificada em diluente de antigénio anticorpo (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturado numa razão 1:9 com D-PBS (tampão de fosfato da Dulbecco, Sigma Aldrich)) e diluente de antigénio anticorpo (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturado numa razão 1:9 com D-PBS (tampão de fosfato da Dulbecco, Sigma Aldrich)) e efetuou-se incubação a 25 °C durante duas horas. Tal foi incubado adicionalmente com um anticorpo monoclonal anti-EPO humana marcado com peroxidase a 0,1 pg/mL (POD-rhEPO MAb R2C, Fuso Pharmaceutical Industries) a 25°C durante duas horas.

Aplicou-se substrato de peroxidase Sure Blue TMB Microwell (KPL) a 100 pL/poço e seguidamente reagiu a 25 °C durante 30 minutos e adicionou-se ácido fosfórico 1 M a 100 pL/poço para parar a reação. Determinou-se a concentração de proteína usando um leitor de microplacas (modelo 680, fabricado por BioRad) e no leitor de microplacas mediu-se a absorvância ao comprimento de onda de 450 nm com o comprimento de onda de 655 nm como controlo. A tabela 4 apresenta os níveis de produção das culturas de 7 dias e de 14 dias numa tabela de acordo com os resultados obtidos por ELISA. A linha celular que apresenta o nível de produção mais elevado produziu 31 590 ± 444 IU/mL em 14 dias.

Este valor, que deriva de uma linha celular de fase inicial não clonada, i.e., num estado que ainda não sofreu amplificação génica, indicou um nível de produção muito elevado comparativamente com níveis de produção de eritropoietina representativos relatados na literatura (JP-A (Kokai) 2002-45191; J. Microbiol. Biotechnol. julho de 2008; 18 (7):1342-1351; Biotechnol. Appl. Biochem. dezembro de 2000; 32 (Pt 3) :167-172; Proc. Natl. Acad. Sei. U S A., setembro de 1986; 83(17) :6465-6469) . Habitualmente, a amplificação génica por MTX é efetuada após clonagem para tentar aumentar o nível de produção; contudo, o nível de produção dos clones com amplificação génica não é muitas vezes estável. Além disso, o rastreio de células recombinantes de amplificação genética necessita de seis meses a um ano. A este respeito, as células obtidas por transfeção do vetor anterior apresentaram um nível de produção elevado na medida em que não é necessária amplificação génica e obtiveram-se facilmente e com sucesso num curto espaço de tempo células com níveis de produção elevados. Assim, o vetor da presente invenção revelou ter um desempenho muito elevado.

[Tabela 4]

[Exemplo 11] Geração de linhas celulares produtoras de hEPO com alto rendimento

Para gerar células com uma capacidade de produção ainda maior, o número de células rastreadas foi aumentado numa tentativa de gerar linhas celulares produtoras de hEPO com alto rendimento.

Transf etaram-se 2,5 pg de pDC6/hEP0 para 16 000 000 de células CHO (células CHO DG44) em frascos de cultura de 25 cm2 usando o método de lipofectina (usando Lipofectamine™ LTX; Invitrogen). Efetuou-se transfeção de acordo com as instruções do fabricante. 48 horas após transfeção génica, contou-se o número de células e seguidamente diluíram-se as células num meio CD Opti CHO AGT (Invitrogen) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM. Plaquearam-se as células para 45 placas de 96 poços a uma concentração de 16 000 células/poço (4320 poços) e após cultura na presença de dióxido de carbono gasoso a 5% a 37 °C durante aproximadamente três semanas, observaram-se células viáveis (linhas celulares crescendo em meio isento de HT).

Usou-se transferência "dot" para confirmar expressão de todas as linhas a partir das placas nas quais se plaquearam as células. Aplicaram-se a uma membrana (Nytran N, item n2 10416196, SCHLEICHER & SCHUELL) 2 pL de cada um dos sobrenadantes de cultura de todas as linhas e após incubação à temperatura ambiente durante 30 minutos, bloqueou-se com Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionalmente, adicionou-se 0,2 pg/mL de um anticorpo anti-EPO policlonal de coelho (EPO (H-162), IgG policlonal de coelho, n2 de catálogo sc-7956, Santa Cruz Biotechnology) diluído com PBST (D-PBS, Tween 20 a 0,05%) e agitou-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionou-se 0,2 pg/mL de um anticorpo anti-IgG de coelho marcado com peroxidase (anti-IgG F8c de COELHO purificado por afinidade e conjugado com peroxidase, n2 de catálogo 611-1303, Rock Land) diluído com PBST (D-PBS, Tween 20 a 0,05%) e agitou-se durante 30 minutos. Fez-se reagir substrato HRP quimioluminescente para "Western" Immobilon™ (2 mL de reagente de luminol, 2 mL de solução de peróxido, MILLIPORE, n2 de catálogo WBKLS0050, MILLIPORE) à temperatura ambiente durante cinco minutos e adicionou-se. Incubou-se à temperatura ambiente durante cinco minutos e capturou-se a quimioluminescência usando um detetor (ATTO Light-Capture, AE-6981FC, ATTO). As imagens capturadas foram analisadas usando Image J (NIH) e compararam-se as intensidades de luminescência. Transferiram-se as 450 linhas com a maior intensidade de luminescência para placas de 24 poços conjuntamente com meio CD Opti CHO AGT (Invitrogen) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM e cultivaram-se como culturas estacionárias na presença de dióxido de carbono gasoso a 5% a 37 2C até as células ocuparem 1/3 ou mais de cada poço.

Confirmou-se expressão por transferência "dot" para as 450 linhas mais fortes. Aplicaram-se numa membrana (Nytran N, item n2 10416196, SCHLEICHER & SCHUELL) 2 pL de cada um dos sobrenadantes de cultura de todas as linhas e após incubação à temperatura ambiente durante 30 minutos, bloqueou-se com Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionalmente, adicionou-se 0,2 pg/mL de um anticorpo anti-EPO policlonal de coelho (EPO (H-162), IgG policlonal de coelho, n2 de catálogo sc-7956, Santa Cruz Biotechnology) diluído com PBST (D-PBS, Tween 20 a 0,05%) e agitou-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionou-se 0,2 pg/mL de um anticorpo anti-IgG de coelho marcado com peroxidase (anti-IgG F8c de COELHO purificado por afinidade e conjugado com peroxidase, n2 de catálogo 611-1303, Rock Land) diluído com PBST (D-PBS, Tween 20 a 0,05%) e agitou-se durante 30 minutos. Fez-se reagir substrato HRP quimioluminescente para "Western" Immobilon™ (2 mL de reagente de luminol, 2 mL de solução de peróxido, MILLIPORE, n2 de catálogo WBKLSO05 0, MILLIPORE) à temperatura ambiente durante cinco minutos e adicionou-se. Incubou-se à temperatura ambiente durante cinco minutos e capturou-se a quimioluminescência usando um detetor (ATTO Light-Capture, AE-6981FC, ATTO). As imagens capturadas foram analisadas usando Image J (NIH) e compararam-se as intensidades de luminescência. Transferiram-se as 200 linhas com a maior intensidade de luminescência para placas de 6 poços conjuntamente com meio CD Opti CHO AGT (Invitrogen) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM e cultivaram-se com agitação a 90 min-1 na presença de dióxido de carbono gasoso a 5% a 37 2C até as células ocuparem 1/3 ou mais de cada poço.

Confirmou-se expressão por transferência "dot" para as 200 linhas melhores. Aplicaram-se numa membrana (Nytran N, item n2 10416196, SCHLEICHER & SCHUELL) 2 pL de cada um dos sobrenadantes de cultura de todas as linhas e após incubação à temperatura ambiente durante 30 minutos, bloqueou-se com Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionalmente, adicionou-se 0,2 pg/mL de um anticorpo anti-EPO policlonal de coelho (EPO (H-162), IgG policlonal de coelho, n2 de catálogo sc-7956, Santa Cruz Biotechnology) diluído com PBST (D-PBS, Tween 20 a 0,05%) e agitou-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionou-se 0,2 pg/mL de um anticorpo anti-IgG de coelho marcado com peroxidase (anti-IgG F8c de COELHO purificado por afinidade e conjugado com peroxidase, n2 de catálogo 611-1303, Rock Land) diluído com PBST (D-PBS, Tween 20 a 0,05%) e agitou-se durante 30 minutos. Fez-se reagir substrato HRP quimioluminescente para "Western" Immobilon™ (2 mL de reagente de luminol, 2 mL de solução de peróxido, MILLIPORE, n2 de catálogo WBKLS0050, MILLIPORE) à temperatura ambiente durante cinco minutos e adicionou-se. Incubou-se à temperatura ambiente durante cinco minutos e capturou-se a quimioluminescência usando um detetor (ATTO Light-Capture, AE-6981FC, ATTO). As imagens capturadas foram analisadas usando Image J (NIH) e compararam-se as intensidades de luminescência. Transferiram-se as 80 linhas com a maior intensidade de luminescência para placas de 6 poços conjuntamente com meio CD Opti CHO AGT (Invitrogen) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM e cultivaram-se com agitação a 90 min-1 a 37 2C, CO2 a 5% até as células ocuparem 1/3 ou mais de cada poço. Adicionalmente, transferiram-se as 80 linhas com a maior intensidade de luminescência para seis poços de placas de 6 poços conjuntamente com meio CD Opti CHO AGT (Invitrogen) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM e cultivaram-se com agitação a 90 min-1 na presença de dióxido de carbono gasoso a 5% a 37 2C até as células ocuparem 1/3 ou mais de cada poço.

Confirmou-se expressão por transferência "dot" para as 80 linhas melhores. Aplicaram-se numa membrana (Nytran N, item n2 10416196, SCHLEICHER & SCHUELL) 2 pL de cada um dos sobrenadantes de cultura de todas as linhas e após incubação à temperatura ambiente durante 30 minutos, bloqueou-se com Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionalmente, adicionou-se 0,2 pg/mL de um anticorpo anti-EPO policlonal de coelho (EPO (H-162), IgG policlonal de coelho, n2 de catálogo sc-7956, Santa Cruz Biotechnology) diluído com PBST (D-PBS, Tween 20 a 0,05%) e agitou-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionou-se 0,2 pg/mL de um anticorpo anti-IgG de coelho marcado com peroxidase (anti-IgG F8c de COELHO purificado por afinidade e conjugado com peroxidase, n2 de catálogo 611-1303, Rock Land) diluído com PBST (D-PBS, Tween 20 a 0,05%) e agitou-se durante 30 minutos. Fez-se reagir substrato HRP quimioluminescente para "Western" Immobilon™ (2 mL de reagente de luminol, 2 mL de solução de peróxido, MILLIPORE, n2 de catálogo WBKLS0050, MILLIPORE) à temperatura ambiente durante cinco minutos e adicionou-se. Incubou-se à temperatura ambiente durante cinco minutos e capturou-se a quimioluminescência usando um detetor (ATTO Light-Capture, AE-6981FC, ATTO). As imagens capturadas foram analisadas usando Image J (NIH) e compararam-se as intensidades de luminescência. Para as 40 linhas com maior intensidade de luminescência, colocou-se 0,4 mL de cada linha num tubo estéril e centrifugou-se a 200 x g durante dois minutos. Rejeitou-se o sobrenadante e suspenderam-se as células em 0,1 mL de meio fresco (IS CHO-CD com meio Hydrolysate (IS Japão) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen)) 4 mM. Após contar o número de células, diluíram-se as células com o meio até 5 x 105 células/mL e seguidamente transferiram-se 0,2 mL destas para placas de 24 poços novas e cultivaram-se as células na presença de dióxido de carbono gasoso a 5% a 37 °C durante aproximadamente 72 horas. Seguidamente, centrifugaram-se as células a 9 300 x g durante dois minutos e recolheu-se o sobrenadante. Determinaram-se os níveis de produção.

[Exemplo 12] Medição do nível de hEPO produzido por linhas celulares produtoras de EPO com elevado rendimento

Determinou-se o nível de produção por ELISA. Revestiram-se placas de 96 poços (placa F96 MAXI SORP Nunc-Immuno, n2 de catálogo 442404, Nunc) a 4°C durante 16 horas com um anticorpo anti-EPO humana a 1 pg/mL (rhEPO MAb R6K, Fuso Pharmaceutical Industries) diluído com uma solução de anticorpo de fase sólida (D-PBS (tampão de fosfato da Dulbecco, Sigma-Aldrich)). Após bloqueamento com uma solução de bloqueamento (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturada numa razão 1:3 com D-PBS (tampão de fosfato da Dulbecco, Sigma Aldrich)), aplicaram-se 100 pL de cada um dos sobrenadantes de cultura de 72 horas (diluição 1/40 000 a 1/160 000), séries de diluição de duas vezes (500 a 15, 6 mIU/mL) de EPO humana purificada (Fuso Pharmaceutical Industries) em diluente de antigénio anticorpo (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturado numa razão 1:9 com D-PBS (tampão de fosfato da Dulbecco, Sigma Aldrich)) e diluente de antigénio anticorpo (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturado numa razão 1:9 com D-PBS (tampão de fosfato da Dulbecco, Sigma Aldrich)) e efetuou-se incubação a 25 °C durante duas horas. Incubou-se adicionalmente com anticorpo monoclonal anti-EPO humano marcado com peroxidase (POD-rhEPO MAb R2C, Fuso Pharmaceutical Industries) a 0,1 pg/mL a 25 °C durante duas horas. Aplicou-se substrato de peroxidase Sure Blue TMB Microwell (KPL) a 100 pL/poço e seguidamente reagiu a 25 °C durante 30 minutos e adicionou-se ácido fosfórico 1 M a 100 pL/poço para parar a reação. Determinou-se a concentração de proteína usando um leitor de microplacas (modelo 680, fabricado por BioRad) e no leitor de microplacas mediu-se a absorvância ao comprimento de onda de 450 nm com o comprimento de onda de 655 nm como controlo. A tabela 5 apresenta as 40 amostras com nível de produção de EPO humana mais elevado de acordo com os resultados obtidos por ELISA.

[Tabela 5]

Das 40 linhas cultivadas em meio isento de HT geradas pela repetição dos rastreios anteriores, 15% produziram hEPO a 0 IU/mL/3 dias ou mais a menos de 2 000 IU/mL/3 dias. Das 40 linhas, 34 linhas (85%) produziram 2 000 IU/mL/3 dias ou mais. Das 40 linhas, 19 linhas (47,5%) produziram 4 000 IU/mL/3 dias ou mais. Das 40 linhas, 11 linhas (27,5 %) produziram 6 000 IU/mL/3 dias ou mais. Das 40 linhas, quatro linhas (10%) produziram 8 000 IU/mL/3 dias ou mais. Das 40 linhas, três linhas (7,5%) produziram 10 000 IU/mL/3 dias ou mais.

Surpreendentemente, das 40 linhas, duas linhas (5,0%) produziram 12 000 IU/mL/3 dias ou mais. A linha que apresentou o nível de produção mais elevado produziu 13 744 ± 123 IU/mL em 3 dias. Este valor deriva de uma linha celular de fase inicial não clonada, i.e., num estado que ainda não sofreu amplificação génica, indicando um nível de produção muito elevado comparativamente com níveis de produção de eritropietina representativos relatados na literatura (JP-A (Kokai) 2002-45191; J. Microbiol. Biotechnol. julho de 2008; 18(7):1342-1351; Biotechnol. Appl. Biochem. dezembro de 2000; 32 (Pt 3) :167-172; Proc. Natl. Acad. Sei. U S A., setembro de 1986; 83(17) :6465-6469) . Tal provou que os vetores de expressão da presente invenção permitem expressão de proteína a níveis muito elevados.

[Exemplo 13] Construção de pDC6/D-EP0

Usando métodos bem conhecidos dos peritos na especialidade, os nucleótidos n2 1267 a n2 1275 no vetor da presente invenção, pDC6, foram substituídos por um ADNc que codifica para darbepoiet ina alfa (D-EPO) com SEQ ID NO: 8 (doravante referida como D-EPO), para a construção pDC6/D-EP0 (figura 14).

[Exemplo 14] Transfeção de pDC6/D-EP0 para células CHO e seleção em meio isento de HT usando um meio CD ou um meio CD suplementado com aditivos de base não animal

Transf etaram-se 2,5 pg de pDC6/D-EP0 para 4 000 000 de células CHO (células CHO DG44) em frascos de cultura de 25 cm2 usando o método de lipofectina (usando Lipofectamine™ LTX; Invitrogen). Efetuou-se transfeção de acordo com as instruções do fabricante. 48 horas após transfeção génica, contou-se o número de células e seguidamente diluíram-se as células em IS CHO-CD com meio Hydrolysate (IS Japão) suplementado com Gluta MAX™-1 (Invitrogen) 4 mM. Plaquearam-se as células em cinco placas de microtitulação de 96 poços a uma concentração de 4 000 células/poço (480 poços) e após cultura na presença de dióxido de carbono gasoso a 5% e a 37 °C durante aproximadamente três semanas, observaram-se as células viáveis (linhas celulares crescendo em meio isento de HT). A partir das células viáveis, selecionaram-se arbitrariamente 84 linhas celulares que crescem em meio isento de HT e confirmou-se expressão por transferência "dot". Aplicou-se numa membrana Nytran N, item n2 10416196, SCHLEICHER & SCHUELL) 1 pL de cada uma das diluições em série de duas vezes (10 a 0,16 ng/mL) de uma preparação padrão de EPO recombinante humana (EPO recombinante humana, n2 de catálogo 287-TC, R & D systems) e os sobrenadantes de culturas das 84 linhas selecionadas arbitrariamente e após incubação à temperatura ambiente durante 30 minutos, bloqueou-se com Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionalmente, adicionou-se 0,2 pg/mL de um anticorpo anti-EPO policlonal de coelho (EPO (H-162), IgG policlonal de coelho, n2 de catálogo sc-7956, Santa Cruz Biotechnology) diluído com PBST (D-PBS, Tween 20 a 0,05%) e agitou-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionou-se 0,2 pg/mL de um anticorpo anti-IgG de coelho marcado com peroxidase (anti-IgG F8c de COELHO purificado por afinidade e conjugado com peroxidase, n2 de catálogo 611-1303, Rock Land) diluído com PBST (D-PBS, Tween 20 a 0,05%) e agitou-se durante 30 minutos. Fez-se reagir substrato HRP quimioluminescente para "Western" Immobilon™ (2 mL de reagente de luminol, 2 mL de solução de peróxido, MILLIPORE, n2 de catálogo WBKLS0050, MILLIPORE) à temperatura ambiente durante cinco minutos e adicionou-se. Incubou-se à temperatura ambiente durante cinco minutos e capturou-se a quimioluminescência usando um detetor (ATTO Light-Capture, AE-6981FC, ATTO). A imagem obtida por transferência "dot" apresenta-se na figura 15.

Transferiram-se as linhas para as quais se observou luminescência nas transferências "dot" para placas de 24 poços conjuntamente com IS CHO-CD em meio Hydrolysate (IS Japão) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM e cultivou-se até as células ocuparem 1/3 ou mais de cada poço. As linhas para as quais se observou crescimento adicional foram transferidas para placas de 6 poços conjuntamente com IS CHO-CD com meio Hydrolysate (IS Japão) suplementados com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM e cultivou-se até as células ocuparem 1/3 ou mais de cada poço. As linhas para as quais se observou crescimento adicional foram transferidas para frascos T75 (BD) conjuntamente com IS CHO-CD em meio Hydrolysate (IS Japão) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM e cultivou-se até as células atingirem 1,0 x 105 células/mL ou mais em cada poço.

Colocou-se 15 mL de cada linha num tubo de 15 mL e centrifugou-se a 1 100 rpm durante sete minutos. Rejeitou-se o sobrenadante e suspenderam-se as células em 15 mL de meio fresco (IS CHO-CD com meio Hydrolysate (IS Japão) suplementado com Gluta MAX“-I (Invitrogen) 4 mM) . Após contagem do número de células, diluíram-se as células com o meio até 5 x 105 células/mL e seguidamente transferiram-se 7,5 mL destas para frascos T75 novos e cultivaram-se as células na presença de dióxido de carbono gasoso a 5% a 37 °C durante 14 dias. No dia 3, dia 7 e dia 14 de cultura, recolheu-se 1 mL de cada solução de cultura e centrifugou-se a 9 300 x g durante dois minutos e recolheu-se o sobrenadante. Seguidamente, determinou-se o nivel de produção.

[Exemplo 15] Medição do nivel de D-EPO produzido nas linhas celulares transfetadas com pDC6/D-EPO

Determinou-se o nivel de produção por ELISA. Revestiram-se placas de 96 poços (placa F96 MAXI SORP Nunc-Immuno, n2 de catálogo 442404, Nunc) a 4°C durante 16 horas com um anticorpo anti-EPO humana a 1 pg/mL (rhEPO MAb R6K, Fuso Pharmaceutical Industries) diluído com uma solução de anticorpo de fase sólida (D-PBS (tampão de fosfato da Dulbecco, Sigma-Aldrich)) . Após bloqueamento com uma solução de bloqueamento (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturada numa razão 1:3 com D-PBS (tampão de fosfato da Dulbecco, Sigma Aldrich)), aplicaram-se 100 pL de cada um dos sobrenadantes de cultura de 3 dias, 7 dias ou 14 dias (diluição 1/1000 a 1/100 000), séries de diluição de duas vezes (10 a 0,156 ng/mL) de darbepoetina alfa (injeção de Nesp 120 pg/0,6 mL em seringa de plástico, Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd.) em diluente de antigénio anticorpo (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturado numa razão 1:9 com D-PBS (tampão de fosfato da Dulbecco, Sigma Aldrich)) e diluente de antigénio anticorpo (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturado numa razão 1:9 com D-PBS (tampão de fosfato da Dulbecco, Sigma Aldrich)) e efetuou-se incubação a 25 °C durante duas horas. Incubou-se adicionalmente com anticorpo monoclonal anti-EPO humana marcado com peroxidase (POD-rhEPO MAb R2C, Fuso Pharmaceutical Industries) a 0,1 pg/mL a 25 °C durante duas horas. Aplicou-se substrato de peroxidase Sure Blue TMB Microwell (KPL) a 100 pL/poço e seguidamente reagiu a 25 °C durante 30 minutos e adicionou-se ácido fosfórico 1 M a 100 pL/poço para parar a reação. Determinou-se a concentração de proteína usando um leitor de microplacas (modelo 680, fabricado por BioRad) e no leitor de microplacas mediu-se a absorvância ao comprimento de onda de 450 nm com o comprimento de onda de 655 nm como controlo. A tabela 6 apresenta as cinco amostras com nível de produção de D-EPO mais elevado de acordo com os resultados obtidos por ELISA. A linha celular que apresenta o nível de produção mais elevado produziu 22 ± 0,3 pg/mL em 3 dias, 135 ± 3,3 pg/mL em 7 dias e 170 ± 3,7 pg/mL em 14 dias. Seguidamente, efetuou-se transferência "Western" de D-EPO em sobrenadantes de cultura para confirmar expressão de proteína.

[Tabela 6]

[Exemplo 16] Transferência "Western" de sobrenadantes de cultura de células transfetadas com pDC6/D-EPO

Analisaram-se por transferência "Western" sobrenadantes de cultura de 3 dias, 7 dias e 14 dias de cinco amostras com a produção de D-EPO mais elevada obtidas no exemplo 15 descrito anteriormente. Misturou-se 10 pL de cada um dos sobrenadantes de cultura com 10 pL de tampão de amostra de Laemmli (BIO-RAD) contendo 2-mercaptoetanol (Wako) a 5% para redução por aquecimento a 98 °C durante cinco minutos (termociclador de PCR PERSONAL TaKaRa, TaKaRa BIOMEDICALS) . Além disso, misturou-se uma preparação padrão de darbepoetina alfa (injeção de Nesp 120 pg/0,6 mL em seringa de plástico, Kyowa Hakko Kirin Co. Ltd.) a 100 ng/10 pi com 10 pL de tampão de amostra de Laemmli (BIO-RAD) contendo 2-mercaptoetanol (Wako) a 5% para redução por aquecimento a 98 °C durante cinco minutos (termociclador de PCR PERSONAL TaKaRa, TaKaRa BIOMEDICALS). Colocou-se tampão de eletroforese (Tris/glicina/SDS, BIO-RAD) e Super Sep™ de 10% a 20% de 17 poços (Wako) numa tina de eletroforese (DPE-1020, DAIICHI PURE CHEMICALS CO., LTD) e aplicaram-se 20 pL das soluções de amostra e preparações padrão tratadas por calor ao Super™ de 10% a 20% de 17 poços (Wako) e efetuou-se eletroforese a 40 mA durante 55 minutos (usou-se uma fonte de tensão: My Run, COSMO BIO CO., LTD) . Seguidamente, removeu-se o gel das placas de vidro e embebeu-se num tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%) com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries) durante cinco minutos. Ativou-se uma membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE) embebendo-se sequencialmente em 8 mL de metanol (Wako) durante 15 segundos, 8 mL de água MilliQ (MILLIPORE) durante dois minutos e 8 mL de tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%) durante cinco minutos com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries). Num aparelho de transferência (TRANS-BLO, CÉLULA DE TRANSFERÊNCIA SEMISSECA SD, BIO-RAD) colocaram-se por ordem a partir do cátodo, papéis de filtro (papel de transferência extra espesso tamanho Criterion™, BIO-RAD) embebido em tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%) , a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE) ativada, o gel após eletroforese embebido em tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%) e papéis de filtro (papel de transferência extra espesso tamanho Criterion™, BIO-RAD) embebidos em tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%), colocou-se uma tampa e efetuou-se eletroforese a 80 mA (PowerPac ™ HC, BIO-RAD) durante uma hora e meia para transferir as proteínas separadas para a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE). Após transferência, embebeu-se a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE) em 8 mL de ImmunoBlock (marca comercial registada, divisão de produtos de laboratório de Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) e bloqueou-se a 4 °C durante 18 horas; e fez-se reagir 10 mL de IgG de coelho policlonal anti-Epo (H-162) (Santa Cruz Biotechnology) diluído 1000 vezes com D-PBS (Wako) contendo Tween 20 (polioxietileno (20) sorbitano monolaurato (20), Wako) a 0,05% com as proteínas na membrana durante uma hora à temperatura ambiente com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries). Após remoção dos anticorpos não ligados, adicionou-se 10 mL de um anti-IgG F (c) [cabra] de coelho purificado por afinidade e conjugado com peroxidase (Rock Land) diluído 5000 vezes com D-PBS (Wako) contendo Tween 20 (polioxietileno (20) sorbitano monolaurato) a 0,05% Wako) e fez-se reagir durante uma hora à temperatura ambiente com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries). Após remoção dos anticorpos não ligados, adicionou-se 2 mL de substrato HRP quimioluminescente para "Western" Immobilon™ (MILLIPORE) para quimioluminescência e tiraram-se fotografias de 5 segundos usando um sistema de câmara CCD arrefecida Light-Capture ATTO (ATTO) com as regulações normais. A imagem obtida por transferência "Western" apresenta-se na figura 16. Detetaram-se bandas semelhantes às da preparação padrão.

[Exemplo 17] Construção de pDC6/hG-CSF

Usando métodos bem conhecidos dos peritos na especialidade, os nucleótidos n2 1267 a n2 1275 no vetor da presente invenção, pDC6, foram substituídos por um ADNc que codifica para o fator de estimulação do crescimento de colónias de granulócitos humano (G-CSF) com SEQ ID NO: 9 (doravante referida como hG-CSF), para a construção pDC6/hG-CSF (figura 17).

[Exemplo 18] Transfeção de pDC6/hG-CSF para células CHO e seleção em meio isento de HT usando um meio CD ou um meio CD suplementado com aditivos de base não animal

Transf etaram-se 2,5 pg de pDC6/hG-CSF para 4 000 000 de células CHO (células CHO DG44) em frascos de cultura de 25 cm2 usando o método de lipofectina (usando Lipofectamine™ LTX; Invitrogen). Efetuou-se transfeção de acordo com as instruções do fabricante. 48 horas após transfeção génica, contou-se o número de células e seguidamente diluíram-se as células em meio CD Opti CHO AGT (Invitrogen) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM. Plaquearam-se as células em cinco placas de microtitulação de 96 poços a uma concentração de 4 000 células/poço (480 poços) e após cultura na presença de dióxido de carbono gasoso a 5% e a 37 °C durante aproximadamente três semanas, observaram-se as células viáveis (linhas celulares crescendo em meio isento de HT). A partir das células viáveis, selecionaram-se arbitrariamente 50 linhas celulares que crescem em meio isento de HT e confirmou-se expressão por transferência "dot".

Aplicou-se numa membrana Nytran N, item n2 10416196, SCHLEICHER & SCHUELL) 2 pL de cada uma das diluições em série de duas vezes (10 a 0,0390625 pg/mL) de uma preparação padrão de G-CSF recombinante humana (G-CSF recombinante humana, n2 de catálogo 1001C, APOLLO) e aplicaram-se os sobrenadantes de culturas das 50 linhas selecionadas arbitrariamente. Após incubação à temperatura ambiente durante 30 minutos, bloqueou-se com Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionalmente, adicionou-se 0,5 mg/mL de um anticorpo monoclonal de ratinho anti-G-CSF humano (anticorpo monoclonal anti-G-CSF humano, n2 de catálogo MAB214, R & D) diluído com PBST (D-PBS, Tween 20 a 0,05%) e agitou-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionou-se 0,2 pg/mL de um anticorpo anti-IgG de ratinho marcado com peroxidase (anti-IgG (H + L) de ratinho de cabra, n2 de catálogo 115-036-062, Jackson) diluído com PBST (D-PBS, Tween 20 a 0,05%) e agitou-se durante 30 minutos. Fez-se reagir substrato HRP quimioluminescente para "Western" Immobilon™ (2 mL de reagente de luminol, 2 mL de solução de peróxido, MILLIPORE, n2 de catálogo WBKLS 0 05 0, MILLIPORE) à temperatura ambiente durante cinco minutos e adicionou-se. Incubou-se à temperatura ambiente durante cinco minutos e capturou-se a quimioluminescência usando um detetor (ATTO Light-Capture, AE-6981FC, ATTO). A imagem obtida por transferência "dot" apresenta-se na figura 18.

Transferiram-se as linhas para as quais se observou luminescência nas transferências "dot" para placas de 24 poços conjuntamente com meio CD Opti CHO AGT (Invitrogen) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM e cultivou-se até as células ocuparem 1/3 ou mais de cada poço. As linhas para as quais se observou crescimento adicional foram transferidas para placas de 6 poços conjuntamente com meio CD Opti CHO AGT (Invitrogen) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM e cultivou-se até as células ocuparem 1/3 ou mais de cada poço. As linhas para as quais se observou crescimento adicional foram transferidas para frascos T75 (BD) conjuntamente com meio CD Opti CHO AGT (Invitrogen) suplementado com Gluta MAX“-I (Invitrogen) 4 mM e cultivou-se até as células atingirem 1,0 x 106 células/mL ou mais em cada poço.

Colocou-se 15 mL de cada linha num tubo de 15 mL e centrifugou-se a 1 100 rpm durante sete minutos. Rejeitou-se o sobrenadante e suspenderam-se as células em 15 mL de meio fresco (meio CD Opti CHO AGT (Invitrogen) suplementado com Gluta MAX™-1 (Invitrogen) 4 mM) . Após contagem do número de células, diluíram-se as células com o meio até 5 x 105 células/mL e seguidamente transferiram-se 7,5 mL destas para frascos T75 novos e cultivaram-se as células na presença de dióxido de carbono gasoso a 5% a 37 °C durante 14 dias. No dia 3, dia 7 e dia 14 de cultura, recolheu-se 1 mL de cada solução de cultura e centrifugou-se a 9 300 x g durante dois minutos e recolheu-se o sobrenadante. Determinou-se o nível de produção.

[Exemplo 19] Medição do nível de hG-CSF produzido por linhas celulares transfetadas com pDC6/hG-CSF

Determinou-se o nível de produção por ELISA. Revestiram-se placas de 96 poços (placa F96 MAXI SORP Nunc-Immuno, número de catálogo 442404, Nunc) a 4 °C durante 16 horas com um anticorpo anti-G-CSF humano a 0,5 pg/mL (anticorpo monoclonal anti-G-CSF humano, número de catálogo MAB214, R&D system) diluído com um tampão de revestimento (Na2CC>3, 15 mM, NaHCCb, 35 mM, NaN3 a 0,05%, pH 9,6) . Após bloqueamento com uma solução de bloqueamento (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturada numa razão de 1:3 com D-PBS (tampão de fosfato da Dulbecco, Sigma Aldrich)), aplicou-se 100 pL de cada um dos sobrenadantes de cultura de 3 dias, 7 dias e 14 dias (diluição de 1/10 000 a 1/200 000), diluições em série de duas vezes (5 a 0,078125 ng/mL) de uma preparação padrão de G-CSF humano recombinante (G-CSF humano recombinante, número de catálogo 1001C, APOLLO) em diluente de antigénio anticorpo (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturado numa razão 1:9 com D-PBS (tampão de fosfato de

Dulbecco, Sigma Aldrich)) e diluente de antigénio anticorpo (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturado numa razão de 1:9 com D-PBS (tampão fosfato de

Dulbecco, Sigma Aldrich)) e incubou-se a 25 °C durante uma

hora. Incubou-se adicionalmente com um anticorpo biotinilado contra G-CSF humano (anticorpo biotinilado contra G-CSF

humano, número de catálogo BAF214, R&D system) a 0,25 pg/mL a 25 °C durante uma hora. Aplicou-se kit de coloração ABC ultrassensível padrão (Reagente A 2 gotas, Reagente B 2 gotas / 10 mL, Pro#32050, PIERCE) incubado a 25 °C durante 30 minutos a 100 pL/poço e efetuou-se a reação a 25 °C durante 30 minutos. Aplicou-se substrato de peroxidase de micropoço TMB Sure Blue 100 pL/poço e seguidamente deixou-se reagir a 25 °C durante 30 minutos, adicionou-se ácido fosfórico 1 M a 100 pL/poço para parar a reação. Determinou-se a concentração de proteína usando um leitor de microplacas (modelo 680, fabricado por BioRad) e mediu-se a absorvância na microplaca ao comprimento de onda de 450 nm com o comprimento de onda de 655 nm como controlo. A tabela 7 apresenta as 10 melhores amostras com nível de produção elevado de G-CSF humano de acordo com os resultados obtidos por ELISA. Na linha que apresentou o maior nível de produção obteve-se 34,7 ± 1,1 pg/mL em 3 dias, 193,6 ± 0,6 pg/mL em 7 dias e 235,5 ± 14,8 pg/mL em 14 dias. Este valor, que é de uma linha celular de estágio inicial não clonado, i.e., também num estado em que não sofreu amplificação génica, indicou um nível muito elevado comparativamente a níveis de produção de G-CSF representativos reportados na literatura (J Biosci Bioeng. 2000, 89(6) : 5 3 4 — 538; Gene 1996, 21 de novembro, 180(1-2) :145-150; Mol

Biotechnol. junho de 1997, 7(3) :231-240; pedido de patente japonesa Kohyo n2 de publicação (JP-A) H01-500483 (publicação japonesa em fase nacional não analisada correspondente a uma publicação internacional não japonesa)).

Tal provou que os vetores de expressão da presente invenção permitem expressão de proteína a níveis muito elevados. Seguidamente efetuou-se transferência "Western" de hG-CSF em sobrenadantes de cultura para confirmar a expressão de proteína.

[Tabela 7]

[Exemplo 20] Transferência "Western" de sobrenadantes de cultura de células transfetadas com pDC6/hG-CSF

Analisaram-se por transferência "Western" sobrenadantes de cultura de 3 dias, 7 dias e 14 dias de cinco amostras com o nível de produção de G-CSF humano mais elevado obtidas no exemplo 19 descrito anteriormente. Misturou-se 10 pL de cada um dos sobrenadantes de cultura com 10 pL de tampão de amostra Laemmli (BIO-RAD) contendo 2-mercaptoetanol (Wako) a 5% para redução por aquecimento a 98 °C durante cinco minutos (Termociclador de PCR TaKaRa PERSONAL, TaKaRa BIOMEDICALS). Adicionalmente, misturou-se 10 pg/10 pL de preparação padrão de G-CSF humano recombinante, n2 de catálogo 1001C, APOLLO) com 10 pL de tampão de amostras Laemmli (BIO-RAD) contendo 2-mercaptoetanol (Wako) a 5% para redução por aquecimento a 98 °C durante cinco minutos (Termociclador de PCR TaKaRa PERSONAL, TaKaRa BIOMEDICALS). Colocou-se um tampão de electroforese (Tris/glicina/SDS, BIO-RAD) e Super Sep™ de 10% a 20% de 17 poços (Wako) numa tina de electroforese (DPE-1020, DAIICHI PURE CHEMICALS CO., LTD) e aplicou-se 20 pL das soluções de amostra e da preparação padrão tratadas com calor ao Super™ de 10% a 20% de 17 poços (Wako) e efetuou-se electroforese a 40 mA durante 55 minutos (usou-se uma fonte de tensão: My Run, COSMO BIO CO., LTD) . Seguidamente, removeu-se o gel para as placas de vidro e embebeu-se num tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako)) a 30% com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries) durante cinco minutos. Ativou-se a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE) por embebendo sequencialmente em 8 mL de metanol (Wako) durante 15 segundos, 8 mL de água MilliQ (MILLIPORE) durante dois minutos e 8 mL de tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%) durante cinco minutos com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries). Num dispositivo de transferência (TRANS-BLO, CÉLULA DE TRANSFERÊNCIA SEMISSECA SD, BIO-RAD), colocaram-se por ordem a partir do cátodo, papéis de filtro (papel de transferência Criterion™ tamanho extra espesso, BIO-RAD) embebido em tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%), a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE) ativada, o gel após electroforese embebido em tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%) e papéis de filtro (papel de transferência Criterion™ tamanho extra espesso, BIO-RAD) embebido em tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%), colocou-se uma tampa e efetuou-se electroforese a 80 mA (PowerPac HC™, BIO-RAD) durante uma hora e meia para transferir as proteínas separadas para a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE). Após transferência, embebeu-se a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE) em 8 mL de ImmunoBlock (marca comercial registada, divisão de produtos de laboratório de Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) e bloqueou-se a 4 °C durante 18 horas e deixou-se reagir 10 mL de um anticorpo monoclonal de ratinho anti-G-CSF humano (anticorpo monoclonal de anti-G-CSF humano, Catálogo MAB214, R & D) diluído 2000 vezes com D-PBS (Wako) contendo Tween 20 (Polioxietileno (20) sorbitano monolaurato, Wako) a 0,05% com as proteínas na membrana durante uma hora à temperatura ambiente com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries) . Após remoção dos anticorpos não ligados, adicionou-se 10 mL de um anticorpo anti-IgG de ratinho marcado com peroxidase (de cabra anti-IgG (H + L) de ratinho, Catálogo 115-036-062, Jackson) diluído 5000 vezes com D-PBS (Wako) contendo Tween 20 (Polioxietileno (20) sorbitano monolaurato, Wako) a 0,05% e deixou-se reagir durante uma hora à temperatura ambiente com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries) . Após remoção dos anticorpos não ligados, adicionou-se 2 mL de substrato de HRP quimioluminescente para "western" Immobilon™ (MILLIPORE) e obtiveram-se fotografias de 30 segundos usando um sistema de câmara CCD arrefecida Light-Capture ATTO (ATTO) regulada com os valores normais. A imagem obtida por transferência "Western" apresenta-se na figura 19. Detetaram-se bandas semelhantes às da preparação padrão.

[Exemplo 21] Construção de pDC6/hGM-CSF

Usando métodos bem conhecidos dos peritos na especialidade, substituiram-se os nucleótidos n2 1267 a n2 1275 no vetor da presente invenção, pDC6, por um ADNc que codifica para o fator de estimulação de colónias de macrófago granulócitos (GM-CSF) humanos de SEQ ID NO: 10 (doravante denominado hGM-CSF) para construir pDC6/hGM-CSF (figura 20) .

[Exemplo 22] Transfeção de pDC6/hGM-CSF para células CHO e seleção num meio isento de HT, usando um meio CD ou um meio CD suplementado com aditivos com base não animal

Transf etou-se 2,5 pg de pDC6/hGM-CSF para 4 000 000 de células CHO (células CHO DG44) em frascos de cultura de 25 cm2 usando o método de lipofectina (usando Lipofectamine™ LTX; Invitrogen). Efetuou-se a transfeção de acordo com as instruções do fabricante. 48 horas após transfeção génica, contou-se o número de células e seguidamente diluiram-se as células num meio IS CHO-CD com meio Hydrolysate (IS Japan) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM. As células foram plaqueadas em cinco placas de microtitulação de 96 poços a uma concentração de 4000 células/poço (480 poços) e após cultura na presença de dióxido de carbono gasoso a 5%, a 37 °C, durante aproximadamente três semanas, observaram-se células viáveis (linhas celulares a crescer em meio isento de HT) .

Das células viáveis, selecionaram-se arbitrariamente 48 linhas celulares em cultura em meio isento de HT e confirmou-se a expressão por transferência "Dot". Aplicaram-se 2 pL de cada uma das diluições em série de duas vezes (100 a 0,16 ng/mL) de uma preparação padrão de GM-CSF humano recombinante (GM-CSF humano recombinante, N2 de catálogo 071-04111, Wako) e os sobrenadantes de cultura das 48 linhas selecionadas arbitrariamente foram aplicados a uma membrana (Nytran N, ITEM N2 10416196, SCHLEICHER & SCHUELL) e após incubação à temperatura ambiente durante 30 minutos, bloqueou-se com Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionalmente, adicionou-se 1 yg/mL de um anticorpo policlonal de cabra anti-GM-CSF humano (anticorpo neutralizante anti-GMCSF humano, N2 de catálogo AB-215-NA, R & D systems) diluído com PBST (D-PBS, Tween 20 a 0,05%) e agitou-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionou-se 0,2 pg/mL de um anticorpo anti-IgG de cabra marcado com peroxidase ( [coelho] anti-IgG de cabra conjugado a peroxidase e purificado por afinidade) diluído com PBST (D-PBS, Tween 20 a 0,05%) e agitou-se durante 30 minutos. Fez-se reagir substrato de HRP quimioluminescente para Western Immobilon™ (2 mL de reagente Luminol, 2 mL de solução de peróxido, MILLIPORE, N2 de catálogo WBKLS 0 0 5 0, MILLIPORE) à temperatura ambiente durante cinco minutos e adicionou-se. Incubou-se à temperatura ambiente durante cinco minutos e capturou-se a quimioluminescência usando um detetor (ATTO Light-Capture, AE-6981FC, ATTO). A imagem obtida por transferência "Dot" apresenta-se na figura 21.

As linhas que apresentaram luminescência nas hibridações Dot foram transferidas para placas de 24 poços conjuntamente com meio IS CHO-CD com Hydrolysate (IS Japan) suplementado com Gluta MAX™-1 (Invitrogen) 4 mM e cultivaram-se até as células ocuparem 1/3 ou mais de cada poço. As linhas para as quais se observou crescimento adicional foram transferidas para placas de 6 poços conjuntamente com meio IS CHO-CD com Hydrolysate (IS Japan) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM e cultivadas até as células ocuparem 1/3 ou mais de cada poço. As linhas para as quais se observou crescimento adicional foram transferidas para frascos T75 (BD) conjuntamente com meio IS CHO-CD com Hydrolysate (IS Japan) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM e cultivaram-se até as células atingirem 1,0 x 106 células/mL ou mais em cada poço.

Colocou-se 15 mL de cada linha num tubo de 15 mL e centrifugou-se a 1100 rpm durante sete minutos. Rejeitou-se o sobrenadante e suspenderam-se as células em 15 mL de meio fresco (Meio IS CHO-CD com Hydrolysate (IS Japan) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM) . Após contagem do número de células, diluíram-se as células com o meio a 5 x 105 células/mL, seguidamente transferiram-se 7,5 mL destas para novos frascos T75 e cultivaram-se as células na presença de dióxido de carbono gasoso a 5%, a 37 °C, durante 14 dias. No dia 3, dia 7 e dia 14 de cultura, recolheu-se 1 mL de cada solução de cultura, centrifugou-se a 9300 x g durante dois minutos e recolheu-se o sobrenadante. Determinou-se o nível de produção.

[Exemplo 23] Medição do nível de hGM-CSF produzido pelas linhas celulares transfetadas com pDC6/hGM-CSF

Determinou-se o nível de produção por ELISA. Revestiram-se placas de 96 poços (placa F96 MAXI SORP Nunc-Immuno, N2 de catálogo 442404, Nunc) a 4 °C durante 16 horas com 0,5 pg/mL de um anticorpo anti-GM-CSF humano (mAb de ratinho de captura anti-hGM-CSF, N2 de catálogo 404CE14G12, Invitrogen) diluído com um tampão de revestimento (Na2CC>3 15 mM, NaHCCb 35 mM, NaN3 a 0,05%, pH 9,6). Após bloqueamento com uma solução de bloqueamento (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturada numa razão de 1:3 com D-PBS (tampão fosfato da Dulbecco, Sigma Aldrich)), aplicou-se 100 pL de cada um dos sobrenadantes de cultura de 72 horas (diluição de 1/1000 a 1/25000), diluições em série de duas vezes (10 a 0,15625 ng/mL) de GM-CSF humano recombinante (GM-CSF humano recombinante expresso em células humanas, N2 de catálogo HZ-1001, HumanZyme Inc.) num diluente de antigénio anticorpo (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturado numa razão de 1:9 com D-PBS (tampão de fosfato de Dulbecco, Sigma Aldrich)) e diluente de antigénio anticorpo (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturado numa razão de 1:9 com D-PBS (Tampão fosfato de Dulbecco, Sigma Aldrich)) e incubou-se a 25 °C durante uma hora. Incubou-se adicionalmente com 0,25 pg/mL de um anticorpo biotinilado contra GM-CSF humano (de ratinho anti-hGM-CSF conjugado com biotina, N2 de catálogo 404CE10A8, Invitrogen) a 25 °C durante uma hora. Aplicou-se kit de coloração ABC ultrassensível padrão (reagente A 2 gotas, reagente B 2 gotas/10 mL, Pro#32050, PIERCE) incubado a 25 °C durante 30 minutos a 100 pL/poço e deixou-se reagir a 25 °C durante 30 minutos. Aplicou-se substrato de peroxidase Sure Blue TMB Microwell (KPL) a 100 pL/poço e seguidamente deixou-se reagir a 25 °C durante 30 minutos, adicionou-se ácido fosfórico 1 M a 100 pL/poço para parar a reação. Determinou-se a concentração de proteína usando um leitor de microplatas (modelo 680, fabricado por BioRad) e mediu-se a absorvância no leitor de microplacas ao comprimento de onda de 450 nm, com o comprimento de onda de 655 nm como controlo. A tabela 8 apresenta a seis melhores amostras com elevado nível de produção de GM-CSF humano de acordo com os resultados obtidos por ELISA. Na linha com o nível de produção mais elevado obteve-se 33,1 ± 0,8 pg/mL em 3 dias, 171,7 ± 3,0 pg/mL em 7 dias e 321,7 ± 2,1 pg/mL em 14 dias. Este valor que é proveniente de uma linha celular não clonada num estado inicial, i.e., também num estado em que não sofreu amplificação génica, apresentou um nível muito elevado

comparativamente a níveis de produção de GM-CSF representativos relatados na literatura (Journal of Biotechnology 109 (2004) 179-191; Biotechnol. Prog. 2005, 21, 17-21; Eur. J. Biochem. 271, 907-919 (2004); J Biosci Bioeng. 2002, 94 (3) :271-274) .

Tal provou que os vetores de expressão da presente invenção permitem expressão de proteína a níveis muito elevados. Seguidamente, efetuou-se transferência "Western" de hGM-CSF em sobrenadantes de cultura para confirmar a expressão de proteína.

[Tabela 8]

[Exemplo 24] Transferência "Western" de sobrenadantes de cultura de células transfetadas com pDC6/hGM-CSF

Analisaram-se por transferência "Western" sobrenadantes de cultura de 3 dias, 7 dias e 14 dias das seis amostras com os níveis de produção de GM-CSF humano mais elevados obtidas no exemplo 23, descrito anteriormente. Misturou-se 10 yL de cada um dos sobrenadantes de cultura com 10 pL de tampão de amostra Laemmli (BIO-RAD) contendo 2-mercaptoetanol (Wako) a 5% para redução por aquecimento a 98 °C, durante cinco minutos (Termociclador de PCR TaKaRa PERSONAL, TaKaRa BIOMEDICALS). Adicionalmente, misturou-se 10 pg/10 pL de preparação padrão de GM-CSF humano (GM-CSF humano recombinante expresso em células humanas, N2 de catálogo HZ-1001, HumanZyme Inc.) com 10 pL de tampão de amostra de Laemmli (BIO-RAD) contendo 2-mercaptoetanol (Wako) a 5% para redução por aquecimento a 98 °C, durante cinco minutos (Termociclador de PCR TaKaRa PERSONAL, TaKaRa BIOMEDICALS). Colocou-se tampão de electroforese (Tris/glicina/SDS, BIO-RAD) e Super Sep™ de 10% a 20% de 17 poços (Wako) numa tina de electroforese (DPE-1020, DAIICIII PURE CHEMICALS CO. , LTD) e aplicou-se 20 pL das soluções de amostras e preparação padrão tratadas com calor a Super™ de 10% a 20% de 17 poços (Wako) e efetuou-se electrof orese a 40 mA, durante 55 minutos (usou-se uma fonte de tensão: My Run, COSMO BIO CO., LTD) . Seguidamente, removeu-se o gel das placas de vidro e embebeu-se num tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%) com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries) durante cinco minutos. Ativou-se a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE) embebendo sequencialmente em 8 mL de metanol (Wako) durante 15 segundos, 8 mL de água MilliQ (MILLIPORE) durante dois minutos e 8 mL de tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%) durante cinco minutos, com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries). Num dispositivo de transferência (TRANS-BLO, CÉLULA DE TRANSFERÊNCIA SEMISSECA SD, BIO-RAD) colocaram-se por ordem a partir do cátodo, papéis de filtro (papel de transferência de tamanho extra espesso Criterion™, BIO-RAD) embebido em tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%), a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE) ativada, o gel após electroforese embebido em tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%) e papéis de filtro (papel de transferência de tamanho extra espesso Criterion™, BIO-RAD) embebidos em tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%), colocou-se uma tampa e efetuou-se electroforese a 80 mA (PowerPac HC™, BIO-RAD) durante uma hora e meia para transferir as proteínas separadas para a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE). Após transferência, embebeu-se a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE) em 8 mL de ImmunoBlock (marca comercial registada, divisão de produtos de laboratório de Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) e bloqueou-se a 4 °C , durante 18 horas; fez-se reagir 10 mL de um anticorpo anti-GM-CSF humano (anticorpo neutralizante anti-GM-CSF humano, N2 de catálogo AB-215-NA, R & D systems) diluído 2000 vezes com D-PBS (Wako) contendo Tween 20 (Polioxietileno (20) sorbitano monolaurato, Wako) a 0,05% com as proteínas na membrana durante uma hora, à temperatura ambiente, com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries) . Após remoção dos anticorpos não ligados, adicionou-se 10 mL de um anticorpo de coelho anti-IgG de cabra marcado com peroxidase (anti-IgG de cabra conjugado a peroxidase e purificado por afinidade, N2 de catálogo 605-4302, Rock Land) diluído 5000 vezes com D-PBS (Wako) contendo Tween 20 (Polioxietileno (20) sorbitano

monolaurato, Wako) a 0,05% e fez-se reagir durante uma hora, à temperatura ambiente, com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries) . Após remoção dos anticorpos não ligados, adicionou-se 2 mL de substrato de HRP quimioluminescente para "Western" Immobilon™ (MILLIPORE) para quimioluminescência e obtiveram-se fotografias de 5 segundos usando um sistema de câmara CCD arrefecido Light-Capture ATTO (ATTO) regulada com os valores normais. A imagem obtida por transferência "Western" apresenta-se na figura 22. Detetaram-se bandas semelhantes às da preparação padrão e as intensidades das bandas sugeriram ser mais escuras proporcionalmente ao número de dias de cultura.

[Exemplo 25] Construção de pDC6/hIFN

Usando métodos bem conhecidos dos peritos na especialidade, substituíram-se os nucleótidos N2 1267 a N2 1275 no vetor da presente invenção, pDC6, com um ADNc que codifica o interferão 2b humano (hlFN ) de SEQ ID NO: 11 (doravante denominado hlFN ) para construir pDC6/hIFN (figura 23) .

[Exemplo 26] Transfeção de pDC6/hIFN para células CHO e seleção num meio isento de HT, usando um meio CD ou um meio CD suplementado com aditivos de base não animal

Transfetou-se 2,5 pg de pDC6/hIFN para 4000000 de células CHO (células CHO DG44) em frascos de cultura de 25 cm2 usando o método de lipofectina (usando Lipofectamine™ LTX;

Invitrogen). Efetuou-se a transfeção de acordo com as instruções do fabricante. 48 horas após transfeção do gene, contou-se o número de células e seguidamente diluíram-se as células num meio IS CHO-CD com Hydrolysate (IS Japan) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM. Plaquearam-se as células para cinco placas de microtitulação de 96 poços a uma concentração de 4000 células/poço (480 poços) e, após cultura na presença de dióxido de carbono gasoso a 5%, a 37 °C, durante aproximadamente três semanas, observaram-se células viáveis (linhas celulares cultivadas em meio isento de HT). A partir das células viáveis, selecionaram-se arbitrariamente 66 linhas celulares cultivadas em meio isento de HT e confirmou-se a expressão por transferência "Dot". Aplicou-se a uma membrana (Nytran N, ITEM N2 10416196, SCHLEICHER & SCHUELL) 2 pL de cada uma das diluições em série de duas vezes (10 a 0,16 ng/mL) de uma preparação padrão de IFN 2b humano recombinante (IFN- 2b (hBA-165), N2 de catálogo sc-4624, Santa Cruz Biotechnology) e IFN 2B expresso em células humanas, n2 de catálogo HZ-1072, Human Zyme, IFN- 2b, n2 de catálogo 5002C, APOLLO) e os sobrenadantes de cultura das 66 linhas selecionadas arbitrariamente e após incubação à temperatura ambiente durante 30 minutos, bloqueou-se com Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4%, à temperatura ambiente, durante 30 minutos. Adicionalmente, adicionou-se 1 pg/mL de um anticorpo monoclonal de coelho anti-IFN humano ( (anticorpo policlonal de coelho contra interferão alfa humano (PBL, n2 de catálogo 31130-1) diluído em PBST (D-PBS, Tween 20 a 0,05%) e agitou-se à temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionou-se 0,2 pg/mL de um anticorpo anti-IgG de coelho marcado com peroxidase (anti-IgG F8c de coelho conjugado com peroxidase e purificado por afinidade, N2 de catálogo 611-1303, Rock Land) diluído em PBST (D-PBS, Tween 20 a 0,05%) e agitou-se durante 30 minutos. Fez-se reagir substrato de HRP quimioluminescente para "Western" Immobilon™ (2 mL de reagente de luminol, 2 mL de solução de perdxido, MILLIPORE, N2 de catálogo WBKLS0 05 0, MILLIPORE) à temperatura ambiente durante cinco minutos e adicionou-se. Incubou-se à temperatura ambiente durante cinco minutos e capturou-se a quimioluminescência usando um detetor (ATTO Light-Capture, AE-6981FC, ATTO). A imagem obtida por transferência "Dot" apresenta-se na figura 24.

As linhas para as quais se observou luminescência nas transferências "Dot" foram transferidas para placas de 24 poços conjuntamente com meio IS CHO-CD com Hydrolysate (IS Japan) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM e cultivaram-se até as células ocuparem 1/3 ou mais de cada poço. As linhas para as quais se verificou crescimento adicional foram transferidas para placas de 6 poços conjuntamente com meio IS CHO-CD com Hydrolysate (IS Japan) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM e cultivaram-se até as células ocuparem 1/3 ou mais de cada poço. As linhas para as quais se verificou crescimento adicional foram transferidas para frascos T75 (BD) conjuntamente com meio IS CHO-CD com Hydrolysate (IS Japan) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM e cultivaram-se até as células atingirem 1,0 x 106 células/mL ou mais em cada poço.

Colocou-se 15 mL de cada linha num tubo de 15 mL e centrifugou-se a 1100 rpm durante sete minutos. Rejeitou-se o sobrenadante e suspenderam-se as células em 15 mL de meio fresco (meio IS CHO-CD com Hydrolysate (IS Japan) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM) . Após contagem do número de células, diluíram-se as células com o meio a 5 x 105 células/mL, seguidamente transferiu-se 7,5 mL destas para novos frascos T75 e cultivaram-se as células na presença de dióxido de carbono gasoso a 5%, a 37 °C, durante 14 dias. No dia 3, dia 7 e dia 14 de cultura, recolheu-se 1 mL de cada solução de cultura, centrifugou-se a 9300 x g durante dois minutos e recolheu-se o sobrenadante. Determinou-se o nível de produção.

[Exemplo 27] Medição do nível de hlFN produzido pelas

linhas celulares transfetadas com pDC6/hIFN 0 nível de produção foi determinado por ELISA. Revestiram-se placas de 96 poços (placas F96 MAXI SORP Nunc-Immuno, N2 de catálogo 442404, Nunc) a 4 °C durante 16 horas com 0,5 pg/mL de um anticorpo anti-IFN humano (anticorpo monoclonal contra interferão humano, Pro. 3423-3, MABTECH) diluído num tampão de revestimento (Na2CC>3 15 mM, NaHCCh 35 mM, NaN3 a 0,05%, pH 9,6). Após bloqueamento com uma solução de bloqueamento (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturada numa razão de 1:3 com D-PBS (tampão fosfato de Dulbecco, Sigma Aldrich) ) , aplicou-se 100 pL de cada um dos sobrenadantes de cultura de 72 horas (diluição de 1/40 000 a 1/640 000), séries de diluição de duas vezes (80 a 1,25 IU/mL) de interferão -2b recombinante (Intrão A para injeção 1000, Schering Plough) em diluente de antigénio anticorpo (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturado numa razão de 1:9 com D-PBS (tampão fosfato de Dulbecco, Sigma Aldrich)) e diluente de antigénio anticorpo (Block Ace (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) a 4% misturado numa razão de 1:9 com D-PBS (tampão fosfato de Dulbecco, Sigma Aldrich)) e efetuou-se incubação a 25 °C, durante uma hora. Incubou-se adicionalmente com 0,5 pg/mL de um anticorpo monoclonal biotinilado contra IFN humano (anticorpo monoclonal biotinilado contra interferão humano conjugado com biotina, Pro. 3423-6, MABTECH) a 25 °C, durante uma hora. Aplicou-se kit de coloração ABC ultrassensível padrão (reagente A 2 gotas, reagente B 2 gotas / 10 mL, Pro#32050, PIERCE) incubado a 25 °C durante 30 minutos a 100 pL/poço e efetuou-se a reação a 25 °C durante 30 minutos. Aplicou-se substrato de peroxidase Sure Blue TMB Microwell (KPL) a 100 pL/poço e seguidamente deixou-se reagir a 25 °C durante 30 minutos, adicionou-se ácido fosfórico 1 M a 100 pL/poço para parar a reação. Determinou-se a concentração de proteína usando um leitor de microplacas (modelo 680, fabricado por BioRad) e no leitor de microplacas mediu-se a absorvância ao comprimento de onda de 450 nm, com o comprimento de onda de 655 nm como controlo. A tabela 9 apresenta as três melhores amostras com elevada produção de IFN humano de acordo com os resultados obtidos por ELISA. Na linha que apresenta o maior nível de produção obteve-se (56,3 ± 5,0) x 104 IU/mL em 3 dias, (219,3 ± 11,1) x 104 IU/mL em 7 dias e (436,5 ± 17,1) x 104 IU/mL em 14 dias. Este valor que é proveniente de uma linha celular não clonada em estado inicial, i.e., também num estado que não sofreu amplificação génica, indicou um nivel muito elevado comparativamente a niveis de produção de IFN representativos relatados na literatura (J Gen Virol, abril de 1985; 66 (Pt 4): 685-691; Nucleic Acids Res. 11 de fevereiro de 1983; 11(3): 555-573; Phil. Trans. R. Soc. Lond. B299, 7-28 (1982); JP-A (Kohyo) 2003-530070).

Tal provou que os vetores de expressão da presente invenção permitem expressão de proteína a níveis muito elevados. Seguidamente efetuou-se transferência "Western" de hlFN em sobrenadantes de cultura para confirmar a expressão de proteína.

[Tabela 9]

[Exemplo 28] Transferência "Western" de sobrenadantes de cultura de células transfetadas com pDC6/hIFN

Analisaram-se por transferência "Western" sobrenadantes de culturas de 3 dias, 7 dias e 14 dias de dez amostras com os níveis de produção mais elevados de hlFN humano obtidas no exemplo 27, descrito anteriormente. Misturou-se 10 pL de cada um dos sobrenadantes de cultura com 10 pL de tampão de amostra de Laemmli (BIO-RAD) contendo 2-mercaptoetanol (Wako) a 5% para redução por aquecimento a 98 °C, durante cinco minutos (termociclador de PCR TaKaRa PERSONAL, TaKaRa BIOMEDICALS). Adicionalmente, misturou-se 10 pg/10 pL de preparação padrão de IFN humano (IFN 2B expresso em células humanas, n2 de catálogo HZ-1072, Human Zyme, IFN- 2b) e 200 IU/mL/10 pL de preparação padrão de IFN humano (solução mãe de IFN iLite

Alphabeta (200 IU/mL) , biomonitor) com 10 pL de tampão de amostra de Laemmli (BIO-RAD) contendo 2-mercaptoetanol (Wako) a 5% para redução por aquecimento a 98 °C durante cinco minutos (termociclador de PCR TaKaRa PERSONAL, TaKaRa BIOMEDICALS). Colocou-se um tampão de electroforese (Tris/glicina/SDS, BIO-RAD) e Super Sep™ de 10% a 20% de 17 poços (Wako) numa tina de electroforese (DPE-1020, DAIICHI PURE CHEMICALS CO., LTD) e aplicou-se 20 pL das soluções de amostra e preparação padrão tratadas com calor a Super™ de 10% a 20% de 17 poços (Wako) e efetuou-se electrof orese a 40 mA durante 55 minutos (usou-se uma fonte de tensão: My Run, COSMO BIO CO., LTD) . Seguidamente, removeu-se o gel das placas de vidro e embebeu-se num tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%) com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries) durante cinco minutos. Ativou-se a membrana de transferência

Immobilon-P (MILLIPORE) embebendo sequencialmente em 8 mL de metanol (Wako) durante 15 segundos, 8 mL de água MilliQ (MILLIPORE) durante dois minutos e 8 mL de tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%) durante cinco minutos com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries). Num dispositivo de transferência (TRANS-BLO, CÉLULA DE TRANSFERÊNCIA SEMISSECA SD, BIO-RAD) colocaram-se por ordem a partir do cátodo, papéis de filtro (papel de transferência de tamanho extra espesso Criterion™, BIO-RAD) embebidos em tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%), a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE) ativada, o gel após electroforese embebido em tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%) e papéis de filtro (papel de transferência de tamanho extra espesso Criterion™, BIO-RAD) embebidos em tampão de transferência (Tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%), colocou-se uma pampa e efetuou-se electroforese a 80 mA (PowerPac HC™, BIO-RAD) durante uma hora e meia para transferir as proteínas separadas para a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE). Após transferência, a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE) foi embebida em 8 mL de ImmunoBlock (marca comercial registada, divisão de produtos de laboratório de Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) e bloqueou-se a 4 2C durante 18 horas e fez-se reagir 10 mL de um anticorpo policlonal de coelho contra interferão alfa humano (N2 de catálogo 31130-1, PBL) diluído 2000 vezes em D-PBS (Wako) contendo Tween 20 (polioxietileno (20) sorbitano monolaurato, Wako) a 0,05% com as proteínas na membrana durante uma hora à temperatura ambiente com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries). Após remoção dos anticorpos não ligados, adicionou-se 10 mL de anti-IgG F(c) de coelho (cabra) conjugado a peroxidase e purificado por afinidade (Rock Land) diluído 5000 vezes em D-PBS (Wako) contendo Tween 20 (Polioxietileno (20) sorbitano monolaurato, Wako) a 0,05% e fez-se reagir durante uma hora à temperatura ambiente com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries). Após remoção dos anticorpos não ligados, adicionou-se 2 mL de substrato de HRP quimioluminescente para "Western" Immobilon™ (MILLIPORE) para quimioluminescência e obtiveram-se fotografias de 3 segundos usando um sistema de câmara CCD arrefecida Light-Capture ATTO (ATTO) regulada com os valores normais. A imagem obtida por transferência "Western" apresenta-se na figura 25. Detetaram-se bandas semelhantes às da preparação padrão.

[Exemplo 29] Construção de pDC6/hOPN

Usando métodos bem conhecidos dos peritos na especialidade, substituíram-se os nucleótidos N2 1267 a No. 1275 no vetor da presente invenção, pDC6, com um ADNc que codifica para osteopontina humana (OPN) de SEQ ID NO: 12 (doravante aqui denominada hOPN) para construir pDC6/hOPN (figura 26).

[Exemplo 30] Transfeção de pDC6/hOPN para células CHO e seleção num meio isento de HT usando um meio CD ou um meio CD suplementado com aditivos de base não animal

Transfetou-se 2,5 pg de pDC6/hOPN para 4000000 de células CHO (células CHO DG44) em frascos de cultura de 25 cm2 usando o método de lipofectina (usando Lipofectamine™ LTX; Invitrogen). Efetuou-se transfeção de acordo com as instruções do fabricante. 48 horas após transfeção génica, contou-se o número de células e seguidamente as células foram diluídas em IS CHO CD com H (IS Japan) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM. As células foram plaqueadas para cinco placas de microtitulação de 96 poços a uma concentração de 4000 células/poço (480 poços) e após cultura na presença de dióxido de carbono gasoso a 5%, a 37 °C, durante aproximadamente três semanas, observaram-se células viáveis (linhas celulares em cultura em meio isento de HT).

Verificou-se expressão por transferência "Western" para todas as células para as quais se verificou crescimento. As linhas para as quais se observou luminescência em transferências "Western" foram transferidas para placas de 24 poços conjuntamente com IS CHO CD com H (IS Japan) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM e cultivaram-se até as células ocuparem 1/3 ou mais de cada poço. As linhas para as quais se verificou crescimento adicional foram transferidas para placas de 6 poços conjuntamente com IS CHO CD com H (IS Japan) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM e cultivaram-se até as células ocuparem 1/3 ou mais de cada poço. As linhas para as quais se verificou crescimento adicional foram transferidas para frascos T75 (BD) conjuntamente com IS CHO CD com H(IS Japan) suplementado com Gluta MAX™-I (Invitrogen) 4 mM e cultivaram-se até as células atingirem 1,0 x 106 células/mL ou mais em cada poço.

Colocou-se 15 mL de cada linha num tubo de 15 mL e centrifugou-se a 1100 rpm durante sete minutos. Rejeitou-se o sobrenadante e suspenderam-se as células em 15 mL de meio fresco (IS CHO CD com H (IS Japan) suplementado com Gluta MAX™—I (Invitrogen) 4 mM). Após contagem do número de células, diluíram-se as células com o meio a 5 x 105 células/mL, seguidamente transferiram-se 7,5 mL destas para novos frascos T75 e as células foram cultivadas na presença de dióxido de carbono gasoso a 5%, a 37 °C, durante 14 dias. No dia 3, dia 7 e dia 14 de cultura, recolheu-se 1 mL de cada solução de cultura, centrifugou-se a 9300 x g durante dois minutos e recolheu-se o sobrenadante. Determinou-se o nível de produção.

[Exemplo 31] Medição do nível de hOPN produzida pelas linhas celulares transfetadas com pDC6/hOPN A determinação do nível de produção foi efetuada usando um kit de ELISA (kit de ensaio de osteopontina humana, Código

27158, IBL) . Para placas de anticorpo (IgG de coelho anti-OPN humana (0-17) A.P. fase sólida), aplicou-se 100 pL de cada um dos sobrenadantes de cultura de 3 dias, 7 dias e 14 dias (diluição de 1/10 a 1/8000) e diluições em série de duas vezes (5 a 320 ng/mL) de uma preparação padrão de OPN humana recombinante num tampão de diluição (PBS contendo BSA a 1% e Tween 20 a 0,05%) e efetuou-se incubação a 37 °C, durante uma hora. Incubou-se adicionalmente com um anticorpo marcado (IgG MoAb Fab A.P de ratinho marcado com HRP anti-OPN humana (10A16)) a 4 °C durante uma hora. Aplicou-se solução de substrato TMB a 100 pL/poço e seguidamente deixou-se reagir a 25 °C durante 30 minutos, adicionou-se uma solução de paragem (H2SO4 1 N) a 100 pL/poço para parar a reação. Determinou-se a concentração de proteína usando um leitor de microplacas (modelo 680, fabricado por BioRad) e no leitor de microplacas mediu-se a absorvância ao comprimento de onda de 450 nm, com o comprimento de onda de 655 nm como controlo. Na linha 32 obteve-se 1,12 ± 0,07 pg/mL em 3 dias, 7,40 ± 0,24 pg/mL em 7 dias e 13,75 ± 0,03 pg/mL em 14 dias. Seguidamente efetuou-se transferência "Western" para hOPN no sobrenadante de cultura para confirmar a expressão de proteína.

[Exemplo 32] Transferência "Western" de sobrenadantes de cultura de células transfetadas com pDC6/hOPN

Analisaram-se por transferência "Western" sobrenadantes de cultura de 3 dias, 7 dias e 14 dias da linha 32 obtida no exemplo 31 descrito anteriormente. Misturou-se 10 pL de cada um dos sobrenadantes de cultura com 10 pL de tampão de amostra de Laemmli (BIO-RAD) contendo 2-mercaptoetanol (Wako) a 5% para redução por aquecimento a 98 °C, durante cinco minutos (termociclador de PCR TaKaRa PERSONAL, TaKaRa BIOMEDICALS). Colocou-se tampão de electroforese (Tris/glicina/SDS, BIO-RAD) e Super Sep™ de 10% a 20% de 17 poços (Wako) numa tina de electroforese (DPE-1020,DAIICI II PURE CHEMICALS CO. , LTD) e aplicou-se 20 pL das soluções de amostra e de preparação padrão tratadas com calor à Super™ de 10% a 20% de 17 poços (Wako) e efetuou-se electroforese a 40 mA durante 55 minutos (usou-se uma fonte de tensão: My Run, COSMO BIO CO., LTD) . Seguidamente, removeu-se o gel das placas de vidro e embebeu-se num tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%) com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries) durante cinco minutos. Ativou-se a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE) embebendo sequencialmente em 8 mL de metanol (Wako) durante 15 segundos, 8 mL de água MilliQ (MILLIPORE) durante dois minutos e 8 mL de tampão de transferência (Tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%) durante cinco minutos com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries). Num dispositivo de transferência (TRANS-BLO, CÉLULA DE TRANSFERÊNCIA SEMISSECA SD, BIO-RAD) colocaram-se por ordem a partir do cátodo, papéis de filtro (papel de transferência de tamanho extra espesso Criterion™, BIO-RAD) embebido em tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%), a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE) ativada, o gel após electroforese embebido em tampão de transferência (tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%) e papéis de filtro (papel de transferência de tamanho extra espesso Criterion™, BIO-RAD) embebido em tampão de transferência (Tampão de Tris/glicina (BIO-RAD) contendo metanol (Wako) a 30%), colocou-se uma tampa e efetuou-se electroforese a 80 mA (PowerPac HC™, BIO-RAD) durante uma hora e meia para transferir as proteínas separadas para a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE). Após transferência, a membrana de transferência Immobilon-P (MILLIPORE) foi embebida em 8 mL de ImmunoBlock (marca comercial registada, divisão de produtos de laboratório de Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) e bloqueou-se a 4 2C, durante 18 horas e fez-se reagir 10 mL de um anticorpo monoclonal de ratinho anti-OPN humana (IgG MoAb de ratinho anti-osteopontina humana (10A16), n2 de catálogo 10011, IBL) diluído 2000 vezes em D-PBS (Wako) contendo Tween 20 (polioxietileno (20) sorbitano monolaurato, Wako) a 0,05% com as proteínas na membrana durante uma hora à temperatura ambiente com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries). Após remoção dos anticorpos não ligados, adicionou-se 10 mL de um anticorpo anti-IgG de ratinho marcado com peroxidase (IgG (H + L) de cabra anti-ratinho, n2 de catálogo 115-036-062, Jackson) diluído 5000 vezes em D-PBS (Wako) contendo Tween 20 (polioxietileno (20) sorbitano monolaurato, Wako) a 0,05% e fez-se reagir durante uma hora à temperatura ambiente com agitação (ROTO-SHAKE GENIE, Scientific Industries). Após remoção dos anticorpos não ligados, adicionou-se 2 mL de substrato de HRP quimioluminescente para "Western" Immobilon™ (MILLIPORE) para quimioluminescência e obtiveram-se fotografias de 30 segundos usando um sistema de câmara CCD arrefecida Light-Capture ATTO (ATTO) regulada com os valores normais. A imagem obtida por transferência "Western" apresenta-se na figura 27.

Aplicabilidade industrial A presente invenção pode proporcionar vetores de expressão que permitem produção a niveis elevados de proteínas derivadas de genes exógenos usando como hospedeiro células de mamífero deficientes no gene de di-hidrofolato redutase. Além disso, podem produzir proteínas que têm modificações postradução inerentes a mamíferos e elevada atividade biológica. Assim, o custo de produção de substâncias proteicas úteis, tais como biofármacos, pode ser reduzido significativamente.

Além disso, dado que os métodos para produção de proteína de acordo com a presente invenção não usam vírus ou microrganismos, é possível uma produção de proteína altamente segura.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> FUSO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES, LTD. NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION HOKKAIDO UNIVERSITY <120> Vetor de expressão para produção de proteína derivada de gene exógeno em grandes quantidades usando células animais e seu uso

<130> S67789PCEP <140> EP 09834881.6 <141> 2009-12-22 <150> JP 2008-325690 <151> 2008-12-22 <160> 12 <170> Patentln versão 3.4 <210> 1 <211> 5848 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de vetor sintetizada artificialmente <4 Ο 0> 1 cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc 60 aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt 120 aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgt.caa taatgacgta 180 tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg 240 gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 300 cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt 360 tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg 420 gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc 480 cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg 540 taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat 600 aagcagagct ctctggctaa ctagagaaec eactgttaac tggcttatcg aaattgtcga 660 ggagaacttc agggtgagct tggggaccct tgattgttct ttctttttcg ctattgtaaa 720 attuatgtta tatggagggg gcaaagtttt cagggtgttg tttagaatgg gaagatgtcc 780 cttgtatcac catggacccL catgaLaaLL ttgtttcttt cactttctac tctgttgaca 340 accattgtct cctcttattt tct.ttt.catt ttctgtaact ttttcgttaa actttagctt. 900 gcatttgtaa cgaattttca aattcacttt tgtttatttg tcagattgts agtactttct 960 ctaatcactt ttttttcaag gcaatcaggg tatattatat tgtacttcag cacagtttta 1020 gagaacaatt gtteLaatta aatgataagg tagaatattt. ctgcatataa attctggctg 1080 gcgtggaaat attcttattg gtagaaacaa ctacatcctg gtcatcatcc tgcctttctc 1140 tttatggt'a caatgatata cactgtttga gatgaggata aaatactctg agtccaaacc 1ΞΟΟ gggcccctct gctaaccat.g ttcatgcctt cttcttttte ctacagctcc fcgggcaacgt 1260 gctggcggcc gccttctaga gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 1320 gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc stttcctaat 1380 aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca Ltctattctg gggggtgggg 1440 tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggaggatc 1500 gccgcggtgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgrggaaagt coccaggctc occagcaggc 1560 agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc ;ctaactccg 1620 cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt 1680 ttttt.tat.~t atgcagagge egaggecgcc tcggcctctg agctattcca gaagtagtga 1740 ggaggctt“t ttggaggcct aggcttttgc aaaaaagctg cagatggttc gaccattgsa 1800 ctgcatcgtc gccgtgtccc aaaatatggg gattggcaag aacggagacc taccctggcc 1860 cccgctcagg aacgagttca agtacttcca aagaatgacc acaacctctt aagtggaagg 1920 taaacagaat ctggtgatta tgggtaggaa aacctggttc tccattcctg agaagaatcg 1980 acctttaaag gacagaatta atatagttct cagtagagaa ctcaaagaac caccacgagg 2040 agctcatttt cttgccaaaa gtttggatga tgcctzaaga cttattgaac aaccggaatt 2100 fjgcaagtaaa gtagacatgg tttggatagt tggaggcagt tctgt. 1:.tar:c aggaagccat. 2160 gaatcaacca ggccacctca gactctttgt gacaaggatc atgcaggaat ttgaaagtga 2220 cacgtttt-c ccagaaattg atttggggaa atataaactt ctcccagaat acccaggcgt 2280 cctctctgag gtccaggagg aaaaaggcat caagtataag tttgaagtct acgagaagaa 2340 agactaaaga tccgtgacat aattggacaa actacctaca gagatttaaa gctctaaggt 2400 aaatataaaa tttttaagtg tataatgtgt taaacaactg attctaattg tttgtgtatt 2460 atagattcca acctatggaa ctgatgastg ggagcagtgg tggaatgcct ttaatgagga 2520 aaacctgtat tgctcagaag aaatgctatc tagtgatgat gaggctactg ctgactctca 2 580 acattctact cctccaaaaa agaagagaaa ggtagaagac cccaaggact ttccttcaqa 2640 attgctaagt tttttgagtc atgctgtgtt tagtaataga actcttgctt gctttgctat 2700 tt.acaccaca aaggaaaaag ctgcactgct atacaagaaa attatggaaa aatattctgt 2760 aacctttata agtaggcata acagttataa tcataacata ctgatttttc ttactccaca 2820 caggcataga gtgtctgcta ttaataacta tgctcaaaaa ttg-gtacct ttagcttttt 2880 aatttgtaaa ggggttaata aggaatattt gatgtatagt gccatgacta gagatcataa 2940 tcagccatac cacatttgta gaggatttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc 3000 tgaacctgaa acataaaaLg aatgcaattg ttgttgttaa ctt.gtttatt gcagcttata 3060 atggttacaa ataaagcaat agcarcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 3120 attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 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564 <210> 3 <211> 564 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de nucleótidos sintetizada artificialmente <400> 3 atggtacgac cattaaattg tattgtagca gtatcacaaa atatgggtat tggtaaaaat 60 ggtgatttac catggccacc attacgaaat gagttcaagt acttccaaag aatgaccaca 1Ξ0 acctcttcag tggaaggtaa acagaatctg gtgattatgg gtaggaaaac ctggttctcc 180 attcctgaga agaatcgacc tttaaaggac agaattaata tagttcteag tagagaactc 240 aaagaaccac cacgaggagc tcattttctt gccaaaagtt tggatgatgc cttaagactt 300 attgaacaac cggaattggc aagtaaagta gacatggttt ggatagtcgg aggcagttct 360 gtttaccagg aagccatgaa tcaaccaggc cacctcagac tctttgtgac aaggatcatg 420 caggaatttg aaagtgacac gtttttccca gaaattgatt tggggaaata taaact.tctc 480 ccagaat.acc caggcgtcct ctctgaggtc caggaggaaa aaggcatcaa gtataagttt 540 gaagtctacg agaagaaaga ctaa 564 <210> 4 <211> 564 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de nucleótidos sintetizada artificialmente <400> 4 atggtacgac cattaaattg tattguagca gtatcacaaa atatgggtat tggtaaaaat 60 ggtgatttac catggccacc attacgaaat gaatttaaat atrttcaacg aatgactacc 120 acttcatcag tagaaggtaa acaaaattta gtaattatgg gtcgaaaaac ttggttttca 180 at.tcctgaga agaatcgacc tttaaaggac agaattaata tagttctcag tagagaactc 240 aaagaaccac cacgaggagc tca'tt.tctt gccaaaagtt tggatgatgc cttaagactt 300 att.gaacaac cggaattggc aagtaaagta gacatggttt ggatagtcgg aggcagttct 360 gtttaccagg aagccatgaa tcaaccaggc cacctcagac tctttgtgac aaggatcatg 420 caggaatttg aaagtgacac gttattccca gaaattgatt tggggaaata taaacttctc 480 ccagaatacc caggcgtcct ctctgaggtc caggaggaaa aaggcatcaa gtataagttt 540 gaagtctacg agaagaaaga ctaa 564 <210> 5 <211> 564 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Uma sequência de nucleótidos sintetizada artificialmente <4Ο0> 5 atggtacgac aattaaattg tattgtagca gtatcacaaa atatgggtat tggtaaaaat 60 ggtgatttac catggccacc attacgaaat gaatttaaat attttcaacg aatgactact 120 acttcatcag tagaaggtaa acaaaattta gtaattatgg gtcgaaaaac ttggttttca 180 attccagaaa aaaatcgacc attaaaagat cgaattaata ttgtattatc acgagaatta 240 aaagsaccac 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<210> 6 <211> 759 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6 ggccgccacc atgagcctgt tccccagcct gcccctgctg ctgctgagca tggtggccgc 60 cagctacagc gagaccgtga cctgcgagga cgcccagaag acctgccccg ccgtgattgu 120 ctgcagcagc cccggcatca acggcttccc cggcaaggac ggccgccacg gcaccaaggg 180 cgagaagggc gagcccggcc agggcctgcg cggcctgcag ggcccccccg gcaagctggg 240 cccccccggc aaccccggcc ccagcggcag ccccggcccc aagggccaga agggcgaccc 300 cggcaagage cccgacggcg acagcagcct ggccgccagc gagcgcaagg ccctgcagac 360 cgagatggcc cgcatcaaga agtggctgac cttcagcctg ggcaagcagg igggcaacaa 420 gttctac.ctg accaacggcg agataatgac nttcgagaag gtgaaggccc tgtgcgtgaa 480 gttccaggcc agcgtggcca ccccccgcaa cgccgccgag aacggcgcca ttcagaacct 540 gatcaaggag gaggccttcc tgggcatcac egacgagaag accgagggce. agttcgtgga 600 cctgaccggc aaccgcctga cctacaccaa ctggaacgag ggcgagccca acaacgccgg 660 cagcgacgag gactgcgtgc tgcLgctgaa gaacggccag tggaacgacg tgccctgeag 720 caccagccac ctggccgtgt gcgagttccc catctgaat 759 <210> 7

<211> 594 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 ggccgccacc atgggtgttc atgaatgtcc agcttggtta tggttattat tatctttatt 60 atctttacca ttaggtttac cagttttagg tgcccccccc cgcctgatct gcgacageeg 120 cgtgctggag cgctacctgc tggaggccaa ggaggccgag aacatcaeca ccggctgegc 180 cgagcactgc agcctgaacg agaacatcac cgtgcccgac accaaggtga acttctacgc 240 ctggaagcgc atggaggtgg gccagcaggc cgtggaggtg tggcagggcc tggccctgct 300 gagegaggee gtgctgcgcg gccaggccct gctggtgaac agcagccagc cctgggagcc 36 0 cctgcagctg cacgtggaca aggeegtgag cggcctgcgc agcctgacca ccctgctgcg 420 cgccctgggc gcccagaagg aggccat.cag cccccccgac gccgccagcg ccgcccccct 480 gcgcaccatc accgccgaca ccttccgcaa gctgttccgc gtgtacagca acttcctgcg 540 cggcaagctg aagctgtaea ccggcgaggc ctgccgcacc ggcgaccgct gaat 594

<210> 8 <211> 594 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 8 ggccgccacc atgggtgttc atgaatgtcc agcttggtta tggttattat tatctttatt 60 atctttacca ttaggtttac cagttttagg tgcccccccc cgcctgatct gcgacagccg 120 cgtgctggag cgctacctgc tggaggccaa ggaggccgag aacatcacca ccggctgcaa 180 cgagacctgc agcctgaacg agaacatcac cgtgcccgac accaaggtga aettetaege 240 ctggaagcgc atggaggtgg gccagcaggc cgtggaggtg tggcagggcc tggccctgct 300 gagegaggee gtgctgcgcg gccaggccct gctggtgaac agcagccagg tgaaegagae 360 cctgcagctg cacgtggaca aggeegtgag cggcctgcgc agcctgacca ccctgctgcg 420 cgccctgggc gcccagaagg aggccatcag cccccccgac gccqccaqcg ccgcccccct 480 gcgcaccatc accgccgaca ccttccgcaa gctgttccgc gtgtacagca acttcctgcg 540 cggcaagctg aagctgtaea ccggcgaggc ctgccgcacc ggcgaccgct gaat 594 <210> 9

<211> 626 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 ggccgccacc atggctggtc cagctactca atctccaacg aaattaatgg ctttacaatt 60 attattatgg cattctgctt tatggactgt tcaagaagct. acr.cccctgg gccc.cgccag 120 cagcctgccc cagagcttcc tgctgaagtg cctggagcag gtgcgcaaga tccagggcga 180 cggcgccgcc ctgcaggaga agctgtgcgc cacctacaag ctgtgccacc cggaggagct 240 ggtgctgctg ggccacagcc tgggcatccc ctgggccccc ctgagcagct gccccagcca 300 ggccctgcag ctggccggct gcctgagcca gctgcacagc ggcctgttcc tgtaccaggg 360 cctgctgcag gccctcgagg gcatcagccc cgagctgggc cccaccctgg acaccotgca 420 gctggacgtg gccgacttcg ccaccaccat ctggcagcag atggaggagc tgggcatggc 480 ccccgccctg cagcccaccc agggcgccat gcccgccttc gccagcgcct tccagcgccg 540 cgccggcggc gtgctggtgg ccagccacct gcagagctcc ctggaggtga gctaccgcgt 600 gctgcgccac ctggcccagc cctagt 626

<210> 10 <211> 446 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 10 ggccgccacc atgtggttac aatctttatt attattaggt actgttgctt gttctatctc 60 tgcccccgcc cgcagcccca gccccagcac ccagccctgg gagcacgtga acgccatcca 120 ggaggcccgc cgcctgctga acctgagccg cgacaccgcc gccgaqatga acgagaccgt 180 ggaggtgatc agcgagatgt tcgacctgca ggagcccacc tgcctgcaga cccgcctgga 240 gctgtacaag cagggcctgc gcggcagcct gaccaagctg aagggccccc tgaccatgat 300 ggccagccac tacaagcagc actgcccccc cacccccgag accagctgcg ccacccagac 360 catcaccttc gagagcttca aggagaacct gaaggacttc ctgctggtga tccccttcga 420 ctqcugggag cccgtgcagg agtagt 446 <210> 11 <211> 578

<212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 11 ggccgccacc atggctttaa cttttgcttt attagttgct ttattagttt totcttgtaa 60 atcttcttgt tctgttggtt gcgacctgcc ccagacccac agcctggyca gccgccgcac 120 cctgatgctg ctggcccaga tgcgccgcat cagcctgttc agctgcctga aggaccgcca 180 cgacttcggc ttcccccagg aggagttcgg caaccagttc cagaaggccg agaccatccc 240 cgtgctgcac gagatgatcc agcagatctt caacctgttc agcaccaagg acagcagcgc 300 cgcctgggac gagaccctgc tggacaagtt ctacaccgag ctgtaccagc agctgaacga 360 cctggaggcc tgcgtgatcc agggcgtggg cgtgaccgag acccccctga tgaaggagga 420 cagcatcctg gccgtgcgca agtacttcca gcgcatcacc ctgtacctga aggagaagaa 480 gtacagcccc tgcgcctggg aggtggtgcg cgccgagatc atgcgcagct tcagcctgag 540 caecaaectg eaggagagcc tgcgcagcaa ggagtagt 578

<210> 12 <211> 952 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 12 ggccgccacc atgagaatcg ctgttatctg tttttgttta ttaggtatca cttgtgctat 60 çcccgtgaag caggccgaca gcggcagcag cgaggagaag cagct.gtaca acaagtaccc 120 cgacgccgtg gccacctggc cgaaccccga ccccagccag aagcaqaacc tgctggcccc 180 ccagaacgcc gtgagcagcg aggagaccaa cgacttcaag caggagaccc tgcccagcaa 240 gagcaacgag agccacgacc acatggacga catggacgac gaggacgacg acgaccacgt 300 ggacagccag gacagcatcg acagcaacga cagcgacgac gtggacgaca ccgacgacag 360 ccaccagagc gacgagagcc accacagcga cgagagcgac gagctggtga ccgacttccc 420 caccgacctg cccgccaccg aggtgtncac ccccgtggtg cccaccgtgg acacctacga 480 cggccgcggc gacagcgtgg tgtacggcct gcqcagcaag agcaagaagt tccgccgccc 540 cgacatccag taccccgacg ccaccgacga ggacatcacc agccacatgg agagcgagga 600 gctgaacggc gcctacaagg ccatccccgt ggcccaggac ctgaacgccc ccagcgactg 660 ggacagccgc ggcaaggaca gctacgagac cagccagctg gacgaccaga gcgccgagac 720 ccacagccac aagcagagcc gcctgtacaa gcgcaaggcc aacgacgaga gcaacgagca 700 cagcgacgtg atcgacagcc aggagctgag caaggtgagc cgcgagttcc acagccacga 840 gttccacage cacgaggaca tgctggtggt ggaccccaag agcaaggagg aggacaagca 900 cctgaagttc cgcatcagcc acgagctgga cagcgccagc agcgaggtga ac 952

Lisboa, 2015-11-09

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Vetor de expressão para permitir a produção a níveis elevados de uma proteína derivada de gene exógeno numa célula hospedeira de mamífero, que compreende: (a) uma cassete génica de di-hidrofolato redutase com tradução deficiente (cassete génica de DHFR com tradução deficiente), cuja expressão é atenuada por alteração de codões para os codões menos frequentemente usados num mamífero, em que os codões foram alterados para GCA para alanina, CGA para arginina, AAU para asparagina, GAU para ácido aspártico, UGU para cisteína, CAA para glutamina, GAA para ácido glutâmico, GGU para glicina, CAU para histidina, UUA para leucina, AAA para lisina, CCA para prolina, UUU para fenilalanina, UCA para serina, ACU para treonina, UAU para tirosina e/ou GUA para valina e em que uma região com codão alterado na cassete génica de DHFR com tradução deficiente é 30% ou mais do comprimento completo da cassete génica; e (b) uma cassete génica compreendendo um local de clonagem para integração de um gene exógeno entre um promotor altamente ativo para transcrição e um sinal de poliadenilação altamente estável.
2. 2. Vetor de expressão da reivindicação 1, em que a cassete génica de DHFR com tradução deficiente da reivindicação 1 (a) usa um promotor com atividade baixa de indução de expressão como o promotor.
3. 3. Vetor de expressão da reivindicação 2, em que o promotor de atividade baixa usado é um promotor derivado de um gene que é fracamente expresso numa célula de mamífero ou um promotor cuja parte de facilitador foi removida.
4. 4. Método para produzir um produto de transformação que tem a capacidade de produzir um elevado nível de uma proteína derivada de gene exógeno, que compreende as etapas de inserir um gene exógeno no vetor de expressão de qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e transformar uma célula hospedeira deficiente no gene de di-hidrofolato redutase com o vetor de expressão.
5. 5. Método para produzir uma proteína derivada de gene exógeno, que compreende as etapas de: (a) inserir um gene exógeno no vetor de expressão de qualquer uma das reivindicações 1 a 3; (b) transformar uma célula hospedeira deficiente em gene de di-hidrofolato redutase com o vetor de expressão; (c) cultivar o produto de transformação num meio isento de hipoxantina-timidina; e (d) recolher a proteína derivada de gene exógeno do produto de transformação cultivado.
6. 6. Método da reivindicação 5, em que se usa um meio definido quimicamente (meio CD) ou um meio CD suplementado com um aditivo de base não animal para cultura na etapa (c) da reivindicação 5.
7. 7. Método para rastrear um produto de transformação que tem capacidade de produzir um nível elevado de uma proteína derivada de gene exógeno, que compreende as etapas de: (a) inserir um gene exógeno no vetor de expressão de qualquer uma das reivindicações 1 a 3; (b) transformar uma célula hospedeira deficiente em gene de di-hidrofolato redutase com o vetor de expressão; e (c) cultivar o produto de transformação num meio isento de hipoxantina-timidina. Lisboa, 2015-11-09