CN107338267A - 双顺反子表达载体及其构建方法与应用 - Google Patents

双顺反子表达载体及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种双顺反子表达载体及其构建方法与应用，具体是一种用来高效、稳定转染二氢叶酸还原酶营养缺陷型突变CHO细胞株(CHO/dhfr‑)的双顺反子表达载体，其是在pIRES质粒上分别插入S100a6启动子、目的基因和dhfr基因构建而成。本发明通过使用低温诱导型启动子和构建双顺反子载体，弱化dhfr基因的表达，使目的基因仅仅通过两或三轮的加压筛选，在低浓度MTX下获得足够的拷贝数，同时利用诱导启动子的性质，在生产过程中降低温度，最大限度增加重组蛋白的产量。

Description

双顺反子表达载体及其构建方法与应用
技术领域
本发明是关于一种双顺反子表达载体及其构建方法与应用，具体而言，本发明是关于一种用来高效、稳定转染二氢叶酸还原酶营养缺陷型突变CHO细胞株(CHO/dhfr-)的双顺反子表达载体，以及该载体的构建方法与相关应用。
背景技术
哺乳动物细胞表达系统制备治疗性重组蛋白质药物已成为当今生物制药领域中的主流技术。采用哺乳动物细胞表达既能保证重组蛋白质的正确糖基化和磷酸化，又能保证重组蛋白二硫键的正确配对和蛋白质的正确折叠，从而使由哺乳动物细胞表达的重组蛋白与天然蛋白质具有相似的理化性质和生物学功能。目前有60％以上的重组蛋白质药物(市场份额已经接近70％)的生产采用哺乳动物细胞表达系统。但是在一般情况下，外源基因在哺乳动物细胞中的表达量很低，常常在1mg/L以下，很难用于实际制药生产，成为制约药物发展的瓶颈。
在确定宿主细胞后，目的基因的表达产量主要由其表达载体的各表达调控元件及组织方式决定。影响外源基因在哺乳动物细胞中的表达因素有转录效率、mRNA的加工、mRNA的稳定性及翻译效率、目的基因拷贝数和外源蛋白翻译后的加工、分泌和稳定性。基于以上因素，一个高效率的哺乳动物细胞表达载体至少具备以下几个特征：强启动子和增强子、多聚腺苷酸加尾信号(polyA)、终止子、选择性标记包括基因扩增标志等。由于商品化的表达载体未能有效整合调控元件，难以获得高表达的细胞株，因而，在表达载体中替换或加入有助于提高表达量的调控元件是必须的。
载体中最关键的元件是驱动基因表达的强启动子，它是获得基因高表达的第一步。目前，商业化的表达载体中主要使用三种启动子：SV40启动子、hCMV启动子和EF-1启动子。SV40启动子和hCMV启动子是外源病毒启动子，而EF-1启动子是CHO细胞的同源启动子，研究发现EF-1启动子的效率比SV40启动子和hCMV启动子都高，而且利用它所建立的生产细胞株的稳定性也优于SV40启动子和hCMV启动子。因此，今后的一个方向是分离宿主细胞的同源强启动子用于表达，这些同源启动子可能比异源启动子更好地在宿主细胞中发挥作用。
在CHO细胞表达载体中有两类选择标记，neo等是非扩增基因，这种选择标志对目的基因的拷贝数没有影响，主要用于构建瞬时表达载体；另一类选择标志具有扩增基因的功能，也称共扩增基因，如DHFR(二氢叶酸还原酶)、GS(谷氨酰胺合成酶)等。当携带共扩增基因的表达载体转染CHO细胞后，随着培养基中选择性药物浓度的逐渐增加，使共扩增基因的拷贝数不断增加；同时其侧翼的DNA片段也会相应得到扩增，使目的基因的拷贝数增加几百倍到几千倍，从而达到外源基因的高效表达。表达外源蛋白最成功的这类载体受体系统主要有CHO/DHFR和CHO/GS。dhfr基因编码的DHFR是细胞代谢途径中的一个重要的酶，当细胞缺乏此酶或酶失活时必须依靠在培养基中添加次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷才能存活。氨甲蝶呤(MTX)是DHFR的类似底物，可竞争抑制DHFR的活性。当环境存在高浓度的MTX时，dhfr基因可自发地在染色体上扩增其拷贝数，以产生更多的DHFR来维持细胞的正常代谢，当其扩增时，可以与连在它两侧的序列一起扩增，与dhfr基因共扩增的序列的大小通常比dhfr基因要大许多，可达上千个kb，足以包含其两翼的基因序列。这种共扩增实现了目的基因剂量扩增，从而提高表达产量。但是，当采用DHFR共扩增系统时，细胞需在递增MTX浓度的培养基中逐渐适应，操作繁琐而且需要耗费大量时间，并需在高浓度MTX下才能达到最高表达水平。高浓度的MTX对细胞具有毒性，使细胞生长速度变慢，不利于蛋白生产，也不利于基因扩增筛选，同时遗传稳定性也有所下降。
近年来发展的弱化dhfr基因表达的方法包括：采用弱启动子降低dhfr基因的表达，在相同的MTX浓度下，细胞需要更多的dhfr基因拷贝才能适应。因而这种弱化dhfr基因表达的扩增载体可在较低MTX浓度下获得较高的基因扩增。目前，这种依靠弱化启动子驱动可扩增标志基因的载体成为设计目的基因高效表达的主流。另外有种弱化手段是通过在载体中插入IRES(internal ribosome entry site，内部核糖体进入位点)，将目的基因位于IRES上游，而dhfr基因位于IRES下游。IRES上游的可读框的翻译采用常规的依赖于帽子结构的扫描翻译起始模式；IRES下游的可读框的翻译采用不依赖于帽子结构的直接翻译起始，这样的翻译效率是很低的，所以dhfr基因的表达量将比较少。
为了使外源基因在哺乳动物细胞中获得高水平的表达，有必要探索构建新的表达载体或优化已有的表达载体系统。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种用来高效、稳定转染二氢叶酸还原酶营养缺陷型突变CHO细胞株(CHO/dhfr-)的双顺反子表达载体。
本发明的另一目的在于提供所述载体的构建方法。
本发明的另一目的在于提供所述载体的应用，特别是在弱化dhfr基因表达中的应用。
一方面，本发明提供了一种双顺反子表达载体，其是在pIRES质粒上分别插入S100a6启动子、目的基因和dhfr基因构建而成。
本发明的载体使用的启动子是CHO细胞内源的S100a6诱导启动子。CHO细胞的同源S100a6启动子在33℃是一个非常强的启动子，效率比SV40启动子高3倍，而在37℃时S100a6启动子是一个较弱的启动子，效率与SV40启动子相当。这个诱导启动子的发现对于弱化dhfr(二氢叶酸还原酶基因)表达、增加目的基因拷贝数和提高目的基因的产量来说是至关重要的。本发明利用该启动子在37℃时效率低的性质弱化dhfr基因的表达。同时，本发明中，dhfr基因是置于IRES的下游，将dhfr基因置于IRES的下游进一步弱化dhfr基因的表达。本发明的载体，能在低浓度的MTX浓度下获得足够多的dhfr基因和目的基因的拷贝数，减轻筛选强度，缩短建立高效表达重组蛋白的细胞系所需要的时间，提高重组蛋白稳定克隆的筛选效率和表达蛋白产量。另外，利用S100a6诱导启动子在33℃时效率提高3倍的性质，在生产重组蛋白的时候，将培养温度降低到33℃，使多拷贝的目的基因在强启动子的驱动下表达，大大增加了重组蛋白的产量。这种仅仅需要调整温度而不必加入化合物的诱导方法不但可以提高产量，而且可以抑制杂蛋白的产生，减轻了纯化的难度。
另一方面，本发明提供了一种双顺反子表达载体的构建方法，该方法包括：
在pIRES质粒相邻的酶切位点Xma I和Not I之间插入共扩增基因dhfr，使dhfr基因置于核糖体进入位点(IRES)的下游；
在pIRES质粒的IRES上游的多克隆位点中插入目的基因；
用限制酶Bgl II和Nhe I双酶切pIRES质粒，切除Pcmv启动子，S100a6启动子(Ps)经同样双酶切后插入pIRES质粒中形成重组的双顺反子表达载体pIRES-Ps-dhfr。
根据本发明的具体实施方案，本发明的方法包括：
以dhfr全长转录本cDNA克隆为模板，用含有Xma I酶切位点的上游引物和含有Not I酶切位点的下游引物，PCR扩增dhfr基因，扩增产物回收纯化后经Xma I和Not I双酶切，插入经同样双酶切的pIRES中，得到含有共扩增基因的重组质粒pIRES-dhfr；将重组质粒转化到大肠杆菌中保存；
提取CHO细胞株的DNA，并以此为模板用含Bgl II酶切位点的上游引物和含有Nhe I酶切位点的下游引物，PCR扩增S100a6的启动子，扩增产物回收纯化后用Nhe I和Bgl II双酶切，与同样双酶切切除了Pcmv启动子的pIRES-dhfr载体相连，得到pIRES-Ps-dhfr；
在多克隆位点MCS A(Nhe I、Xho I、EcoR 1、Mlu1)插入目的基因。
本发明的载体是利用IRES把目的基因和共扩增基因dhfr置于同一个表达载体中并在同一个启动子作用下转录，利用CHO细胞内源的低温诱导型启动子在37℃时效率低的性质和把dhfr基因置于IRES下游降低其翻译效率的手段，弱化dhfr基因的表达，使目的基因仅仅通过两到三轮的加压筛选(基因扩增)就在低浓度MTX下获得足够的拷贝数，短时间内建立了高效、稳定表达细胞系，同时利用低温诱导启动子的性质，在生产过程中降低培养温度，最大限度提高目的蛋白的产量。
另一方面，本发明还提供了所述的双顺反子表达载体在CHO细胞中表达目的蛋白中的应用。其中，是利用低温诱导启动子弱化dhfr表达。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，在CHO细胞中表达目的蛋白的过程包括：接种DHFR缺陷型的CHO细胞，加入含血清、不含抗生素的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养，至转染时要求细胞40％-80％汇合；转染表达载体；继续培养；进行单克隆筛选和基因扩增；降温培养细胞高效生产重组蛋白。
综上所述，本发明通过使用低温诱导型启动子和构建双顺反子载体，弱化dhfr基因的表达，使目的基因仅仅通过两或三轮的加压筛选，在低浓度MTX下获得足够的拷贝数，同时利用诱导启动子的性质，在生产过程中降低温度，最大限度增加重组蛋白的产量。
附图说明
图1为本发明的双顺反子表达载体pIRES-Ps-sDR5-dhfr的结构示意图。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商所建议的条件。
实施例1
本发明公开一种利用低温诱导启动子弱化dhfr表达的双顺反子载体及其应用方法，其中是在pIRES载体中，分别插入CHO细胞内源的S100a6诱导启动子、多克隆位点、IRES和dhfr。该载体利用S100a6启动子在37℃时效率低的性质和把dhfr基因置于IRES下游降低其翻译效率的手段，弱化dhfr的表达，在低浓度的MTX下增加dhfr和目的基因的拷贝数，减轻筛选强度，缩短建立高效、稳定表达重组蛋白的细胞系所需要的时间。同时利用S100a6的启动子在33℃时效率提高3倍的性质，在生产过程中降低培养温度，大大增加目的蛋白的产量和纯度。
本发明的双顺反子表达载体构建方法如下：
以dhfr全长转录本cDNA克隆(购自广州复能基因有限公司，dhfr序列参见SEQ ID No.1)为模板，用含有Xma I酶切位点的上游引物F1：CTACCCGGGATGGTTCGACCATTGAACTGC(SEQ ID No.2)和含有Not I酶切位点的下游引物S1：CGATGCGGCCGCTTAGTCTTTCTTCTCGTAGAC(SEQID No.3)，PCR扩增dhfr基因，扩增产物回收纯化后经Xma I和Not I双酶切，插入经同样双酶切的pIRES中，得到含有共扩增基因的重组质粒pIRES-dhfr。将重组质粒转化到大肠杆菌中保存。
提取CHO细胞株的DNA，并以此为模板用含Bgl II酶切位点的上游引物F2：GTCAGATCTATGCCGGAGTCACGAGTCAC(SEQ ID No.4)和含有NheI酶切位点的下游引物S2：GCCTTTGGAGGATGATAAGCTTAATTGACCACTGG(SEQ ID No.5)，PCR扩增S100a6的启动子，扩增产物回收纯化后用NheI和Bgl II双酶切，与同样双酶切切除了Pcmv启动子的pIRES-dhfr载体相连，命名为pIRES-Ps-dhfr(图1)。
(3)在多克隆位点MCS A(Nhe I、Xho I、EcoR 1、Mlu1)插入目的基因。
本发明的双顺反子表达载体的应用：
(1)表达载体的转染
转染前一天，在60mm的培养皿中接种1X106个DHFR缺陷型的CHO细胞，加入5ml含血清、不含抗生素的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养，至转染时要求细胞40％-80％汇合。用OPTI-MEM1的培养基稀释5μg的重组质粒至总体积250ul，稀释后应颠倒几次离心管以混匀混合物。向混合物中加入10μl转染试剂LIPOFECTAMINE 2000，用加样器吹打数次。在室温下孵育混合物5-10分钟。在孵育的同时，吸出培养皿中的培养基，用PBS洗涤一次，加入3ml的培养基。往混合物中加入1ml含血清的培养基，用加样器吹打2次，将产物全部加入培养皿中，轻轻摇动以混匀。37℃，5％CO2培养4-5个小时后更换DMEM培养基培养24小时。
(2)单克隆筛选和基因扩增
培养24小时后，加入10nM氨甲喋呤(MTX)的DMEM培养基进行加压筛选。37℃，5％CO2，静置培养两周后出现分散的细胞抗性克隆。将抗性克隆消化，计数，用培养基稀释细胞1个/10ul。在96孔板中加入培养基150μl/孔，再加入细胞液10μl/孔，进行单克隆培养，24小时后用ELISA检测各克隆细胞株的表达量。结果发现，筛选得到的单克隆细胞株全部都是阳性克隆。选取表达量高的细胞移入24孔板扩增传代，24小时后用ELISA检测各克隆细胞株的表达量，筛选表达量最高的克隆细胞，液氮保存的同时进行MTX递增加压筛选。
将1X106转化细胞接种于20nM氨甲喋呤(MTX)的DMEM培养基中，37℃，5％CO2培养两个星期，换液再培养24小时后ELISA检测表达量。接着将获得的转化细胞接种入30nM氨甲喋呤(MTX)的DMEM培养基中，37℃，5％CO2培养两个星期，换液培养24小时后ELISA检测表达量。同样方法进行40nM和60nM的氨甲喋呤(MTX)递增加压筛选，直到基因表达量没有显著增加为止。
(3)降温培养细胞高效生产重组蛋白
将重组细胞接种于6cm的培养皿中，37℃，5％CO2培养48小时，待细胞汇合度为100％，将温度调整为33℃，于5％CO2培养箱中继续培养24个小时后测定表达量。S100a6启动子不但能够在37℃弱化dhfr基因的表达，使dhfr基因和目的基因能够在短时间内和低浓度的MTX下获得更多的拷贝数，而且能够在33℃提升自身效率，大大增加目的基因的表达量。

Claims (10)

1.一种双顺反子表达载体，其是在pIRES质粒上分别插入S100a6启动子、目的基因和dhfr基因构建而成。
2.一种双顺反子表达载体的构建方法，该方法包括：
在pIRES质粒相邻的酶切位点Xma I和Not I之间插入共扩增基因dhfr，使dhfr基因置于核糖体进入位点(IRES)的下游；
在pIRES质粒的IRES上游的多克隆位点中插入目的基因；
用限制酶Bgl II和Nhe I双酶切pIRES质粒，切除Pcmv启动子，S100a6启动子(Ps)经同样双酶切后插入pIRES质粒中形成重组的双顺反子表达载体pIRES-Ps-dhfr。
3.根据权利要求2所述的方法，该方法包括：
以dhfr全长转录本cDNA克隆为模板，用含有Xma I酶切位点的上游引物和含有Not I酶切位点的下游引物，PCR扩增dhfr基因，扩增产物回收纯化后经Xma I和Not I双酶切，插入经同样双酶切的pIRES中，得到含有共扩增基因的重组质粒pIRES-dhfr；将重组质粒转化到大肠杆菌中保存；
提取CHO细胞株的DNA，并以此为模板用含Bgl II酶切位点的上游引物和含有Nhe I酶切位点的下游引物，PCR扩增S100a6的启动子，扩增产物回收纯化后用Nhe I和Bgl II双酶切，与同样双酶切切除了Pcmv启动子的pIRES-dhfr载体相连，得到pIRES-Ps-dhfr；
在多克隆位点MCS A(Nhe I、Xho I、EcoR 1、Mlu1)插入目的基因。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，PCR扩增S100a6启动子所需要的含有Bgl II酶切位点的上游引物为F2：GTCAGATCTATGCCGGAGTCACGAGTCAC，含有Nhe I酶切位点的下游引物为S2：GCCTTTGGAGGATGATAAGCTTAATTGACCACTGG。
5.根据权利要求3所述的方法，其中，PCR扩增dhfr基因所需要的含有Xma I酶切位点的上游引物为F1：CTACCCGGGCCACCATGCTTGGACCGCTGAA，含有Not I酶切位点的下游引物为S1：CGATGCGGCCGCTTAGCCTTTCTTCTCATAGACT。
6.PCR扩增S100a6启动子所需要的含有Bgl II酶切位点的上游引物F2：GTCAGATCTATGCCGGAGTCACGAGTCAC和含有Nhe I酶切位点的下游引物S2：GCCTTTGGAGGATGATAAGCTTAATTGACCACTGG。
7.PCR扩增dhfr基因所需要的含有Xma I酶切位点的上游引物F1：CTACCCGGGCCACCATGCTTGGACCGCTGAA和含有Not I酶切位点的下游引物S1：CGATGCGGCCGCTTAGCCTTTCTTCTCATAGACT。
8.权利要求1所述的双顺反子表达载体在CHO细胞中表达目的蛋白中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其中，是利用低温诱导启动子弱化dhfr表达。
10.根据权利要求8所述的应用，其中，在CHO细胞中表达目的蛋白的过程包括：
接种DHFR缺陷型的CHO细胞，加入含血清、不含抗生素的DMEM培养基，37℃，5％CO2培养，至转染时要求细胞40％-80％汇合；转染表达载体；继续培养；
进行单克隆筛选和基因扩增；
降温培养细胞高效生产重组蛋白。
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