CN104694568B - 动物细胞用表达载体、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及领域,具体涉及一种动物细胞用表达载体,由上游起依次含有强表达诱导性启动子、基因整合用多克隆位点、核糖体进入位点序列、二氢叶酸还原酶基因、不含增强子的SV40早期启动子基因、neo基因和抗药性基因。本发明还提供了上述表达载体的制备方法、重组载体及应用。本发明的表达载体中用不含增强子的启动子弱化neo基因的表达,dhfr基因作为共扩增基因位于核糖体进入位点IRES的下游,降低dhfr基因的翻译效率,结合G418加压筛选和二氢叶酸还原酶基因压力筛选,增加目的蛋白的表达量。
Description
【技术领域】
本发明涉及基因工程技术领域,具体涉及一种动物细胞用表达载体、其制备方法及上述表达载体在真核细胞中高水平表达目标蛋白的应用。
【背景技术】
蛋白质在合成过程中要经过翻译后的加工和修饰,才能成为有活性的蛋白质,其中,翻译后加工过程包括:磷酸化、糖基化、二硫键形成、酰基化和蛋白酶加工等。原核细胞不具备翻译后加工的能力,因此,原核细胞在表达真核生物蛋白时效果。酵母,植物,昆虫细胞虽然能对重组蛋白进行糖基化修饰,但其糖基化方式与哺乳动物细胞不同,有可能产生免疫原性。因此,开发以哺乳动物细胞、尤其是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)为宿主,获得高水平生产性细胞株的载体成为本领域的当务之急。
采用CHO细胞表达既能保证重组蛋白质的正确糖基化和磷酸化,又能保证重组蛋白二硫键的正确配对和蛋白质的正确折叠,从而使由CHO细胞表达的重组蛋白与天然蛋白质具有相似的理化性质和生物学功能。但是在一般情况下,外源基因在CHO细胞中的表达量很低,很难用于实际工业化生产。为了使外源基因在CHO细胞中获得高水平的表达,有必要探索构建新的表达载体或优化已有的表达载体系统。
在确定宿主细胞后,目的基因的表达产量主要由其表达载体的各表达调控元件及组织方式决定。影响外源基因在哺乳动物细胞中的表达因素有整合位点、转录效率、mRNA的加工、mRNA的稳定性及翻译效率、目的基因拷贝数和外源蛋白翻译后的加工、分泌和稳定性,基于以上因素,一个高效率的哺乳动物细胞表达载体至少具备以下几个特征:选择性标记、强启动子和增强子、多聚腺苷酸加尾信号(polyA)、终止子等。由于现有技术中的表达载体未能有效整合调控元件,难以获得表达量较高的细胞株,因此,在表达载体中替换或加入有助于提高表达量的调控元件是必须的。
在CHO细胞表达载体中有两类选择标记,其中之一为非扩增基因,如neo基因,该选择标志基因对目的基因的拷贝数没有影响,用于构建瞬时表达载体。现有技术中出现了用neo基因设计载体筛选CHO细胞染色体上的热点的技术,以提高目的基因的表达量。上述表达载体通过弱化neo基因表达,在含有G418的培养基里,只有当人工组建的neo基因整合在染色体DNA的热点部位时,neo基因的表达量足够高,才能保证细胞存活。由于目的蛋白的编码基因和neo基因在同一个表达载体上,该编码基因随neo基因整合在neo抗性的克隆细胞基因组的热点上,重组蛋白的表达量增加。现有技术中主要有两种弱化neo基因表达的方法:第一,在上游进行突变,弱化neo基因的表达翻译起始效率;第二,在neo基因的内部插入一个人工合成的内含子。这两种方法均使neo基因的表达受到了极大的弱化,但是操作繁琐复杂,而且费时费力。采用弱启动子弱化neo的表达,虽然弱化程度可能不如前者,但是操作简便,容易掌握,无疑是一种很好的替代方案。
另一类选择标志具有扩增基因的功能,也称共扩增基因,如二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶(GS)等。当携带共扩增基因的表达载体转染CHO细胞后,随着培养基中选择性药物浓度的逐渐增加,使共扩增基因的拷贝数不断增加;同时其侧翼的DNA片段也会相应得到扩增,使目的基因的拷贝数增加几百倍到几千倍,从而达到外源基因的高效表达。表达外源蛋白最成功的这类载体受体系统主要有CHO/DHFR和CHO/GS。dhfr基因编码的DHFR是细胞代谢途径中的一个重要的酶,当细胞缺乏此酶或酶失活时必须依靠在培养基中添加次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷才能存活。氨甲蝶呤(MTX)是DHFR的类似底物,可竞争抑制DHFR的活性。当环境存在高浓度的MTX时,dhfr基因可自发地在染色体上扩增其拷贝数,以产生更多的DHFR来维持细胞的正常代谢,当其扩增时,可以与连在它两侧的序列一起扩增,与dhfr基因共扩增的序列的大小通常比dhfr基因要大许多,可达上千个kb,足以包含其两翼的基因序列。这种共扩增实现了目的基因剂量扩增,从而提高表达产量。但是,当采用DHFR共扩增系统时,细胞需在递增MTX浓度的培养基中逐渐适应,操作繁琐而且需要耗费大量时间,并需在高浓度MTX下才能达到最高表达水平。高浓度的MTX对细胞具有毒性,使细胞生长速度变慢,不利于蛋白生产,也不利于基因扩增筛选,同时遗传稳定性也有所下降。
近年来,发展了两种弱化dhfr基因表达的方法,对于减轻筛选强度、缩短筛选时间、降低MTX浓度和获得高水平的表达有很好的效果。第一种弱化手段是采用弱启动子降低dhfr基因的表达,在相同的MTX浓度下,细胞需要更多的dhfr基因拷贝才能适应。因而这种弱化dhfr基因表达的扩增载体可在较低MTX浓度下获得较高的基因扩增。第二种弱化手段是通过在载体中插入IRES(internal ribosome entry site,内部核糖体进入位点),将目的基因位于IRES上游,而dhfr基因位于IRES下游。IRES上游的可读框的翻译采用常规的依赖于帽子结构的扫描翻译起始模式;IRES下游的可读框的翻译采用不依赖于帽子结构的直接翻译起始,这样的翻译效率是很低的,所以dhfr基因的表达量将比较少。
哺乳动物细胞表达系统由于能保证重组蛋白正确的糖基化、磷酸化和折叠,能表达与天然蛋白质具有相似理化性质和生物学功能的重组蛋白,因此常常被用来生产治疗性重组蛋白质药物。但是在一般情况下,外源性基因在哺乳动物细胞中的表达量很低,常常在1mg/L以下,很难用于实际制药生产。
基因的表达产量主要由其表达载体的各表达调控元件及组织方式决定。现有技术中大多数CHO细胞的表达载体均为随机整合载体,其在宿主细胞染色体上的整合位点是完全随机的,目的基因整合位点两侧的序列可影响基因的表达程度,如果整合在恰当的染色体上,仅需数十个目的基因拷贝就可以达到基因的高表达。
【发明内容】
本发明的目的在于克服上述不足之处,提供一种动物细胞用表达载体,解决现有技术中目的蛋白在宿主细胞CHO中表达量低的技术问题。
本发明为解决上述技术问题所采用的方案如下:
一种动物细胞用表达载体,由上游起依次含有强表达诱导性启动子、基因整合用多克隆位点、核糖体进入位点序列、二氢叶酸还原酶基因、不含增强子的SV40早期启动子基因、neo基因和抗药性基因。
优选地,在经PvuII和BamHI双酶切的pIRES载体中分别插入了dhfr基因和SV40-neo片段,所述SV40-neo片段为SV40早期启动子基因与neo基因连接形成,所述dhfr基因位于相邻的Xma I和Not I酶切位点之间;所述SV40-neo片段位于PvuII和BamHI酶切位点之间。
优选地,所述dhfr基因的序列为SEQ ID No:1所示。
优选地,所述dhfr基因通过以下步骤获得:
以pSV2-dhfr质粒为模板、序列表中的SEQ ID No:2和SEQ ID No:3为引物进行PCR扩增。
优选地,所述SV40-neo片段通过以下步骤获得:
以pIRES载体为模板、序列表中的SEQ ID No:4和SEQ ID No:5为引物进行PCR扩增。
本发明还提供过了一种由上述表达载体转染的细胞,其中,所述细胞为缺失二氢叶酸还原酶的CHO细胞。
本发明还提供了一种制备上述表达载体的方法,包括如下步骤:
步骤1:以pSV2-dhfr质粒为模板、序列表中的SEQ ID No:2和SEQ ID No:3为引物进行PCR扩增;
步骤2:步骤1所得PCR产物用Xma I和Not I双酶切后插入pIRES载体的Xma I/NotI之间,得到pIRES-dhfr载体;
步骤3:以pSV2-dhfr质粒为模板、序列表中的SEQ ID No:4和SEQ ID No:5为引物进行PCR扩增;
步骤4:步骤3所得PCR产物用用PvuII和BamHI双酶切后插入步骤2所得pIRES-dhfr载体的PvuII/BamHI之间,得到pIRES-dhfr-Ps载体。
本发明另外提供了一种重组表达载体,通过向上述的表达载体的基因整合用多克隆位点导入目标基因而得到。
优选地,所述多克隆位点包括Nhe I、Xho I、EcoR1、Mlu1和Xho I酶切位点。
本发明还提供了上述表达载体在真核细胞中高水平表达目的蛋白中的应用。
优选地,所述目的蛋白为免疫球蛋白、免疫球蛋白融合蛋白、生长因子、可溶性受体或血液凝集因子之一。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于,本发明的表达载体中用不含增强子的启动子弱化neo基因的表达,在一定的G418浓度下使neo基因连同目的基因整合到染色体DNA的热点部位,增加目的基因表达量;本发明的表达载体中dhfr基因作为共扩增基因位于核糖体进入位点IRES的下游,降低dhfr基因的翻译效率,弱化dhfr基因的表达,在较低浓度MTX下通过基因扩增使dhfr基因连同目的基因获得足够的拷贝数,进一步提高目的蛋白的产量。
【附图说明】
图1是本发明实施例1的动物细胞用表达载体的结构图;
图2是本发明实施例1的pIRES-dhfr载体的结构图。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本文所用“目的蛋白”,即为“外源蛋白”;术语“外源蛋白的编码序列”、“异源编码序列”、“异源基因序列”、“异源基因”、“重组基因”、“感兴趣的基因”、“目的基因”和“转基因”可互换使用。这些术语用于DNA序列时指编码重组或异源基因产物的DNA序列。所述异源基因序列在宿主细胞中天然不存在而且来自不同种的生物。可使本发明的重组或异源基因产物在哺乳动物细胞中表达和大量收集。所述基因产物可以是肽或多肽,可以是任何感兴趣的蛋白质,如治疗蛋白质或酶或多聚蛋白质的亚单元。所述重组产物的基因可包含信号序列,其编码的信号肽可使宿主生产细胞表达的多肽分泌出来的。在本发明的进一步优选的实施方式中,产物蛋白是为分泌蛋白质。
代表性的外源蛋白包括(但并不限于):促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、粒-巨噬细胞集落刺激因子、垂体肽激素、绝经期促性腺激素、胰岛素样生长因子(如生长调节素-C)、角化细胞生长因子、神经胶质细胞系产生的神经营养因子、血栓调节蛋白、碱性纤维母细胞生长因子、胰岛素、因子VII、因子VIII、生长激素、骨形态形成蛋白-2、血小板产生的生长因子、水蛭素、及它们突变蛋白、片段、可溶性形式、功能性衍生物、融合蛋白。
本发明的动物细胞用表达载体由上游起依次含有强表达诱导性启动子、基因整合用多克隆位点、核糖体进入位点序列、二氢叶酸还原酶基因、不含增强子的SV40早期启动子基因、neo基因和抗药性基因。
本发明的表达载体结合G418加压筛选和二氢叶酸还原酶基因压力筛选,增加目的蛋白的表达量。
G418是一种氨基糖苷类抗生素,在分子遗传试验中,是稳定转染最常用的抗性筛选试剂,G418通过抑制转座子Tn601,Tn5的基因,干扰核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞产生毒素,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。当neo基因被整合进真核细胞DNA后,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。
本发明的表达载体使用缺失二氢叶酸还原酶的CHO细胞作为宿主细胞,该载体DNA的基因向宿主细胞进行转染后,可以因氨甲喋呤使该载体DNA中所含的基因高效扩增。当dhfr基因的表达被弱化时,在较低浓度MTX下通过几轮的加压筛选(基因扩增)可使dhfr基因获得足够的拷贝数,目的基因同时也获得足够的拷贝数,提高目的蛋白的表达量。
作为本发明的一个较佳方案,以pIRES载体为模板进行改造,由于pIRES载体中启动neo基因的启动子为带有增强子的SV40早期启动子,该启动子与neo基因位于PvuII和BamHI酶切位点之间,用PvuII和BamHI对pIRES载体进行双酶切,将neo基因和带有增强子的SV40早期启动子基因同时切除,再将PvuII和BamHI酶切位点之间的片段替换为SV40早期启动子基因与neo基因连接形成的SV40-neo片段,于是,启动neo基因的即为不含增强子的SV40早期启动子;另外,将dhfr基因插入相邻的Xma I和Not I酶切位点之间,即完成pIRES载体的改造,具体制备方法如下:
步骤1:以pSV2-dhfr质粒为模板、序列表中的SEQ ID No:2和SEQ ID No:3为引物进行PCR扩增;
步骤2:步骤1所得PCR产物用Xma I和Not I双酶切后插入pIRES载体的Xma I/NotI之间,得到pIRES-dhfr载体;
步骤3:以pSV2-dhfr质粒为模板、序列表中的SEQ ID No:4和SEQ ID No:5为引物进行PCR扩增;
步骤4:步骤3所得PCR产物用用PvuII和BamHI双酶切后插入步骤2所得pIRES-dhfr载体的PvuII/BamHI之间,得到pIRES-dhfr-Ps载体。
通过向上述表达载体的基因整合用多克隆位点导入目标基因得到重组载体,将重组载体转染到动物细胞中进行表达,其中,多克隆位点包括Nhe I、Xho I、EcoR1、Mlu1和XhoI酶切位点。
本发明的表达载体去转染缺失二氢叶酸还原酶的CHO细胞时,由于本发明的表达载体中用不含增强子的启动子弱化neo基因的表达,在一定的G418浓度下使neo基因连同目的基因整合到染色体DNA的热点部位,增加目的基因表达量;另外,由于本发明的表达载体中dhfr基因作为共扩增基因位于核糖体进入位点IRES的下游,降低dhfr基因的翻译效率,弱化dhfr基因的表达,在较低浓度MTX下通过基因扩增使dhfr基因连同目的基因获得足够的拷贝数,进一步提高目的蛋白的产量。
实施例1
本发明实施例1提供了一种动物细胞用表达载体,如图1所示,该表达载体在经PvuII和BamHI双酶切的pIRES载体中分别插入了dhfr基因和SV40-neo片段,其中,SV40-neo片段为SV40早期启动子基因与neo基因连接形成,dhfr基因位于相邻的Xma I和Not I酶切位点之间;SV40-neo片段位于PvuII和BamHI酶切位点之间。
上述表达载体可通过以下步骤获得:
步骤S101:以pSV2-dhfr质粒为模板、序列表中的SEQ ID No:2和SEQ ID No:3为引物进行PCR扩增,其中SEQ ID No:2所示引物含有Xma I酶切位点,SEQ ID No:3所示引物含有Not I酶切位点,pSV2-dhfr质粒来自ATCC37146;
步骤S102:步骤S101所得PCR产物用Xma I和Not I双酶切后插入pIRES载体的XmaI/Not I之间,得到pIRES-dhfr载体,其中,pIRES-dhfr载体结构如图2所示;
步骤S103:以pSV2-dhfr质粒为模板、序列表中的SEQ ID No:4和SEQ ID No:5为引物进行PCR扩增,其中SEQ ID No:4所示引物含有PvuII酶切位点,SEQ ID No:5所示引物含有BamHI酶切位点,重组质粒可转化到大肠杆菌中保存备用;
步骤S104:步骤S103所得PCR产物用用PvuII和BamHI双酶切后插入步骤S102所得pIRES-dhfr载体的PvuII/BamHI之间,得到pIRES-dhfr-Ps载体。
实施例2
本发明实施例2提供了一种实施例1的表达载体的应用,包括如下步骤:
步骤S201:将目的基因插入实施例1所得表达载体的多克隆位点,得到重组载体;
步骤S202:以dhfr缺陷型的CHO细胞为宿主进行表达载体的转染;
转染前一天,在60mm的培养皿中接种1X106个dhfr缺陷型的CHO细胞,加入5ml含血清、不含抗生素的DMEM培养基,37℃,5%CO2培养,至转染时要求细胞40%-80%汇合。用OPTI-MEM1的培养基稀释5μg的重组质粒至总体积250μl,稀释后应颠倒几次离心管以混匀混合物。向混合物中加入10μl转染试剂LIPOFECTAMINE2000,用加样器吹打数次。在室温下孵育混合物5-10分钟。在孵育的同时,吸出培养皿中的培养基,用PBS洗涤一次,加入3ml的培养基。往混合物中加入1ml含血清的培养基,用加样器吹打2次,将产物全部加入培养皿中,轻轻摇动以混匀。于37℃,5%CO2培养4-5个小时后更换DMEM培养基培养24小时。
步骤S203:抗性筛选和基因扩增
将步骤S202所得细胞加入200mg/ml G418的DMEM培养基,37℃,5%CO2,静置培养三周后出现分散的细胞抗性克隆。将抗性克隆消化,改用含10nmol/L氨甲喋呤(MTX)的DMEM培养基进行加压筛选。于37℃,5%CO2培养两个星期,换液再培养24小时后ELISA检测表达量。接着将获得的转化细胞接种入30nM氨甲喋呤(MTX)的DMEM培养基中,37℃,5%CO2培养两个星期,换液培养24小时后ELISA检测表达量。同样方法进行50nmol/L和70nmol/L的氨甲喋呤(MTX)递增加压筛选。
步骤S204:单克隆筛选
步骤S203所得抗性细胞用胰酶洗下进行计数,各在十板96孔板上进行单克隆筛选。24小时后用ELISA检测各克隆细胞株的表达量。选取表达量高的细胞移入24孔板扩增传代,24小时后用ELISA检测各克隆细胞株的表达量,筛选表达量最高的克隆细胞并液氮保存。
以上所述本发明的具体实施方式,并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形,均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种动物细胞用表达载体,其特征在于,所述表达载体由上游起依次含有强表达诱导性启动子、基因整合用多克隆位点、核糖体进入位点序列、二氢叶酸还原酶基因、不含增强子的SV40早期启动子基因、neo基因和抗药性基因;
在经PvuII和BamHI双酶切的pIRES载体中分别插入了dhfr基因和SV40-neo片段,所述SV40-neo片段为SV40早期启动子基因与neo基因连接形成,所述dhfr基因位于相邻的Xma I和Not I酶切位点之间;所述SV40-neo片段位于PvuII和BamHI酶切位点之间。
2.根据权利要求1所述的表达载体,其特征在于,所述dhfr基因的序列为SEQ ID No:1所示。
3.根据权利要求1所述的表达载体,其特征在于,所述dhfr基因通过以下步骤获得:
以pSV2-dhfr质粒为模板、序列表中的SEQ ID No:2和SEQ ID No:3为引物进行PCR扩增。
4.根据权利要求1所述的表达载体,其特征在于,所述SV40-neo片段通过以下步骤获得:
以pIRES载体为模板、序列表中的SEQ ID No:4和SEQ ID No:5为引物进行PCR扩增。
5.权利要求1至4任一项所述的表达载体转染的细胞,其特征在于,所述细胞为缺失二氢叶酸还原酶的CHO细胞。
6.一种制备权利要求1所述的表达载体的方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤1:以pSV2-dhfr质粒为模板、序列表中的SEQ ID No:2和SEQ ID No:3为引物进行PCR扩增;
步骤2:步骤1所得PCR产物用Xma I和Not I双酶切后插入pIRES载体的Xma I/Not I之间,得到pIRES-dhfr载体;
步骤3:以pSV2-dhfr质粒为模板、序列表中的SEQ ID No:4和SEQ ID No:5为引物进行PCR扩增;
步骤4:步骤3所得PCR产物用用PvuII和BamHI双酶切后插入步骤2所得pIRES-dhfr载体的PvuII/BamHI之间,得到pIRES-dhfr-Ps载体。
7.一种重组表达载体,其特征在于,所述重组表达载体通过向权利要求1至4中任一项所述的表达载体的基因整合用多克隆位点导入目标基因而得到。
8.根据权利要求7所述的重组表达载体,其特征在于,所述多克隆位点包括Nhe I、XhoI、EcoR 1、Mlu1和Xho I酶切位点。
9.权利要求1至4任一项所述的表达载体在真核细胞中高水平表达目的蛋白中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述目的蛋白为免疫球蛋白、免疫球蛋白融合蛋白、生长因子、可溶性受体或血液凝集因子之一。
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Legal Events
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---|---|---|---|
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
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