CN103764837A - 用于生产具有修饰的o-糖基化的蛋白的酵母菌株 - Google Patents
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Abstract
低等真核生物宿主细胞已经进行重组工程化以产生具有类似于人的O-糖基化的糖蛋白。所述糖蛋白可用于生产在生产人治疗剂方面具有优势的糖蛋白组合物。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,具体地,本发明涉及经过遗传工程化以产生具有人源化O-糖基化的糖蛋白的低等真核生物细胞,例如酵母菌株,以及所述糖蛋白从重组表达系统的生产。
背景技术
低等真核生物(即,酵母和丝状真菌)与哺乳动物(特别是人)的O-糖基化途径和模式之间存在显著的结构差异。因为人免疫系统可将低等真核生物的可变糖基化(alternative
glycosylation)识别为外来物,所以,在真菌系统中产生的任何基于蛋白的治疗性产品在注射进人体时都有可能激发致免疫反应。这种反应可能限制治疗剂在多次施用中的功效,并且,在最严重的病例中,可能导致患者的不良影响。
实际上,真菌糖基化的存在是人先天免疫系统进行清除的常见信号;参见,例如Ballou, C.E.,
1990 Methods Enzymol. 185:440。这引发了对于在酵母(例如,巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))中生产,并注射到人体内的治疗性蛋白质(包括但不限于具有酵母典型的N-和O-聚糖的蛋白质)的快速清除或免疫原性的潜力的担忧。
旨在降低酵母中生产的治疗性蛋白质的免疫原性的此前尝试主要集中在降低N-聚糖的免疫原性(参见,例如Gerngross的美国专利7,029,872)。更为近期的尝试则集中在共同降低或消除真菌的O-糖基化,从而降低或消除这种反应;参见,例如Tanner,美国专利5,714,377;和Bobrowicz等,WO2007/061631。与此相反,本发明人意外地发现,生产具有类似于在天然的人糖蛋白上所见的O-糖基化,或更接近于在哺乳动物细胞中产生的重组糖蛋白上所见的O-糖基化的某些O-糖基化模式的蛋白的预料不到的优点。
发明内容
本发明提供了用于生产重组糖蛋白的方法和材料,其中所述重组糖蛋白具有可用于开发人治疗剂或兽医治疗产品的改进特征。在某些实施方案中,本发明包括低等真核生物宿主细胞(包括酵母和丝状真菌),其经工程化以产生主要具有类似于人的(human-like)
O-聚糖的糖蛋白。在优选的实施方案中,宿主细胞生产主要具有选自O-Man-GlcNAc、O-Man-GlcNAc-Gal或O-Man-GlcNAc-Gal-Sia的类似于人的O-聚糖的糖蛋白。
作为第一方面,本发明提供了用于本发明方法的低等真核生物宿主细胞,其通过敲除和/或失活一种或多种参与O-糖基化的基因而进行修饰,所述基因包括但不限于编码β-甘露糖基转移酶(bmts;参见,例如US 2006/0211085)、磷酸甘露糖转移酶的那些基因,或参与O-糖基化的一种或多种其他基因。
作为第二方面,本发明提供了如上文所述的那些用于本发明方法的低等真核生物宿主细胞,其中,所述低等真核生物宿主细胞通过转染或转化参与O-糖基化的外源基因,且特别是编码蛋白质O-甘露糖β-1,2-N-乙酰葡糖胺基转移酶1 ("PomGnT1")或其催化结构域的基因,以及编码人或哺乳动物O-糖基化途径中的一个或多个步骤的一种或多种其他基因而进行修饰,以表达参与人或哺乳动物O-连接糖基化途径的外源(非天然)基因。在具体的实施方案中,这些一种或多种其他基因非限制性地编码以下酶或其催化结构域:UDP-GlcNAc转运蛋白;α-1,2-甘露糖苷酶;β-1,4-半乳糖转移酶("β1,4GalT");UDP-半乳糖转运蛋白(UGT);UDP-Gal差向异构酶;α-2,6-唾液酸转移酶("α2,6SialT");α-2,3-唾液酸转移酶("α2,3SialT");UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶("GNE");N-乙酰神经氨酸-9-磷酸合酶("SPS");唾液酸化-9-P磷酸酶("SPP");CMP-唾液酸合酶("CSS");和CMP-唾液酸转运蛋白("CST")。
作为第三方面,本发明提供了如上文所述的那些用于本发明方法的低等真核生物宿主细胞,其中,所述宿主细胞通过使用编码糖蛋白的外源基因转染或转化宿主细胞而进行修饰,以表达目标重组糖蛋白。这样,在用于表达的适当条件下培养时,如本文所述的宿主细胞将表达并分泌包含具体的类似于人的O-糖基化的改进的重组糖蛋白。
本发明还包括生产主要具有类似于人的O-聚糖的重组糖蛋白的方法,所述方法包括a) 选择低等真核生物宿主细胞;b) 减弱所述宿主细胞中一种或多种内源糖基化酶(其中步骤(a)的所述宿主细胞还没有如此减弱);c) 使用编码O-连接的甘露糖β1,2-N-乙酰葡糖胺基转移酶1 (POMGnT1)、UDP-GlcNAc转运蛋白、α-1,2-甘露糖苷酶和所述糖蛋白的核酸序列转化所述宿主细胞;和d) 在适合所述核酸序列表达的条件下培养所述细胞以产生主要具有类似于人的O-聚糖的重组糖蛋白。在具体的实施方案中,进一步使用非限制性地编码以下酶或其催化结构域的核酸转化所述宿主细胞:β-1,4-半乳糖转移酶("β1,4GalT");UDP-半乳糖转运蛋白(UGT);UDP-Gal差向异构酶;α-2,6-唾液酸转移酶("α2,6SialT");α-2,3-唾液酸转移酶("α2,3SialT");UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶("GNE");N-乙酰神经氨酸-9-磷酸合酶("SPS");唾液酸化-9-P磷酸酶("SPP");CMP-唾液酸合酶("CSS");和CMP-唾液酸转运蛋白("CST")。
在其他实施方案中,本发明包括由本发明的低等真核生物宿主细胞产生的重组糖蛋白组合物。
可任选地将本发明的低等真核生物宿主细胞工程化,以产生主要具有类似于人的N-聚糖的糖蛋白。在优选的实施方案中,所述宿主细胞产生主要具有选自以下的N-聚糖的糖蛋白:
在具体实施方案中,本文提供的糖蛋白组合物包含具有岩藻糖化和未岩藻糖化的杂合的和复杂的N-聚糖的糖蛋白,所述N-聚糖包括二等分(bisected)和多天线(multiantennary)的种类,包括但不限于N-聚糖,例如
。在具体的方面,所述杂合N-聚糖是所述组合物中的主要N-聚糖种类。在进一步的方面,所述杂合N-聚糖是具体的N-聚糖种类,其包含所述组合物中大约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的杂合N-聚糖。
。在具体的方面,所述复杂N-聚糖是所述组合物中的主要N-聚糖种类。在进一步的方面,所述复杂N-聚糖是具体的N-聚糖种类,其包含所述组合物中大约30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或100%的复杂N-聚糖。
在具体实施方案中,所述N-聚糖是岩藻糖化的。通常,所述岩藻糖与N-聚糖还原端的GlcNAc成α1,3-键合;与N-聚糖还原端的GlcNAc成α1,6-键合;与N-聚糖非还原端的Gal成α1,2-键合;与N-聚糖非还原端的GlcNac成α1,3-键合;或与N-聚糖非还原端的GlcNAc成α1,4-键合。
在以上的进一步方面,所述复杂N-聚糖进一步包括岩藻糖化和未岩藻糖化的二等分和多天线的种类。
在进一步的方面,所述糖蛋白包含高甘露糖N-聚糖,包括但不限于Man5GlcNAc2,或由Man3GlcNAc2 N-聚糖结构组成的N-聚糖。
附图说明
图1说明了用于在巴斯德毕赤酵母中产生唾液酸化O-甘露糖基聚糖的方法的综述。
图2A-B说明了来自菌株GFI SO-1的TNFRII-Fc O-聚糖(参见图1)与来自菌株GFI 2.0的TNFRII-Fc O-聚糖的比较。所示为在不具有POMGnT1的菌株YGLY6428 (A部分)和带有小鼠POMGnT1-ScMNN6-s融合物的菌株YGLY7879
(B部分)中表达的报告蛋白(TNFRII-Fc)上O-聚糖的HPAEC-PAD (方法见下文)的描绘图。结果表明YGLY7879中的POMGnT1-依赖性O-聚糖与阿拉伯糖醇标准品共迁移。向样品中添加的阿拉伯糖醇的浓度在缺少POMGnT1的菌株中通常给出~100纳库伦(nC)的最大读数。然而,由于具有加成作用的阿拉伯糖醇和Man-GlcNAc的共洗脱,此量级在具有POMGnT1的菌株中增加到大约450nC。通过位于Y-轴上的圆圈突出了此量级的增加。
图3A-B说明了在用于除去GlcNAc的氨基己糖苷酶处理后,来自菌株GFI SO-1 (YGLY7879 [小鼠POMGnT1-ScMNN6-s])的TNFRII-Fc O-聚糖。所示为在未经处理(A部分)和经过用于除去末端GlcNAc的氨基己糖苷酶处理(B部分)的情况下,来自菌株YGLY7879的聚糖的HPAEC-PAD描绘图。此处理导致推定的阿拉伯糖醇+Man-GlcNAc峰降低,在T=23.909出现游离GlcNAc的新峰,以及甘露醇(man1)峰的升高。这证实了在包含POMGnT1的GFI SO-1菌株中,与阿拉伯糖醇共迁移的糖是Man-GlcNAc。
图4A-B说明了来自菌株GFI SO-2的TNFRII-Fc O-聚糖与来自菌株GFI
2.0的TNFRII-Fc O-聚糖的比较。所示为来自没有POMGnT1的GFI
2.0菌株YGLY6428 (A部分)和来自具有半乳糖转移基因和人POMGnT1-ScMNN2-s的GFI SO-2菌株YGLY7880 (B部分)的TNFRII-Fc O-聚糖的HPAEC-PAD描绘图。结果表明,YGLY7880中迁移为~T=21.38的新POMGnT1-依赖性O-聚糖是Man-GlcNAc-Gal。注意,仪器将T=21.38的洗脱峰描述为山梨糖醇的峰,因为此峰在山梨糖醇标准峰的范围内(这已经在校准期间被定义)洗脱。由图5可见,由于其随着半乳糖苷酶和氨基己糖苷酶处理而水解,因此,此峰是Man-GlcNAc-Gal。
图5A-B说明了使用半乳糖苷酶和氨基己糖苷酶处理的,来自GFI
SO-2菌株YGLY7880的TNFRII-Fc
O-聚糖。所示为未经处理的(A部分),或使用半乳糖苷酶处理以除去末端半乳糖,且使用氨基己糖苷酶以除去末端GlcNAc (B部分)的来自GFI SO-2菌株YGLY7880的TNFRII-Fc O-聚糖的HPAEC-PAD描绘图。此处理导致推定的Man-GlcNAc-Gal峰消失,在T=23.909出现游离GlcNAc的峰,甘露醇(man1)峰的升高,且在T=38.35出现半乳糖峰。这些结果表明,GFI SO-2菌株中迁移为~T=21.38的POMGnT1-依赖性O-聚糖是Man-GlcNAc-Gal。注意,仪器将T=21.38洗脱的峰标记为山梨糖醇的峰,参见图4。
图6A-B说明了使用神经氨酸酶、半乳糖苷酶和氨基己糖苷酶处理的来自GFI
SO-3菌株YGLY8750 (musPOMGnT1-ScMNN6-s)的TNFRII-Fc O-聚糖。所示为未经处理的(A部分),或使用神经氨酸酶处理以除去末端唾液酸,使用半乳糖苷酶处理以除去末端半乳糖,且使用氨基己糖苷酶以除去末端GlcNAc
(B部分)的来自YGLY8750的TNFRII-Fc O-聚糖的HPAEC-PAD描绘图。加入次优剂量的酶以产生所有可能的种类。处理导致T=45.8的推定的Man-GlcNAc-Gal-唾液酸峰下降,T=21.7的Man-GlcNAc-Gal峰下降,在T=23.5出现游离GlcNAc的峰,甘露醇(man1)峰的升高,且在T=37.9出现半乳糖峰。这些结果表明,GFI SO-3菌株中迁移为~T=45.8的POMGnT1-依赖性O-聚糖是Man-GlcNAc-Gal-唾液酸。
图7说明了使用凝集素SNA-1-AP检测末端唾液酸的Western印迹。所示为显示样品1-12中的TNFRII-Fc蛋白水平的考马斯染色SDS-PAGE凝胶(下图),和使用碱性磷酸酶缀合的凝集素SNA-1进行检测的Western印迹(上图)。1-9道为使用唾液酸化载体pGLY1758转化的GFI SO-2菌株YGLY7880的3个分离菌落的上清(2、6和10 uL/菌株);10-12道是来自未转化的YGLY7880。凝集素SNA-1结合末端唾液酸,并由此可检测带有唾液酸合成和转移的基因的菌株GFI SO-3中的O-聚糖上的末端唾液酸。结果表明,凝集素强力结合来自GFI
SO-3菌株的样品1-9的TNFRII-Fc,但没有结合来自缺失转移唾液酸能力的GFI SO-2菌株的样品10-12的TNFRII-Fc。
图8A-B说明了来自如本文所述进行O-唾液酸化的优化的GFI SO-3菌株YGLY11603
(musPOMGnT1-ScMNN6-s)的TNFRII-Fc O-聚糖。A部分显示了TNFRII-Fc O-聚糖的HPAEC-PAD描绘图;B部分列出了各主要O-聚糖种类的百分比。
图9说明了糖蛋白的O-唾液酸化提高如何导致在B6小鼠中的生物利用度提高。所示为在皮下施用不同剂量的TNFRII-Fc后48小时,小鼠的血清浓度。总唾液酸含量(mol/mol)如下:5-A型:21;5-B型:16;和5-C型:11。
图10A-B说明了糖蛋白的O-唾液酸化提高如何导致大鼠中的血清半衰期延长。所示为以1 mg/kg在静脉内("IV")
[图10A]和皮下("SC")
[图10B]施用后的血清时间-浓度曲线。总唾液酸含量(mol/mol)如下:5-A型:21;5-B型:16;和5-C型:11。
图11说明了TD-POMGnT1表达/整合载体pGLY3136。
序列简述
序列ID NOs: 1-108说明了各种ER和/或高尔基体定位前导序列(leader sequences)。
序列ID NOs: 109-118说明了POMGnT1序列。
序列ID NOs: 119-120、122-123、125-126、133-134、135-136和141-148说明了实施例中使用的PCR引物。
序列ID NOs: 121和124分别说明了PpHI3 ORF和3'-非翻译片段。
序列ID NO: 127说明了包括PpALG3转录终止序列的DNA片段。
序列ID NO: 128说明了PpGAP启动子序列。
序列ID NO: 129说明了ScCYC1转录终止序列。
序列ID NO: 130说明了PpAOX1启动子序列。
序列ID NOs: 131-132和138-140说明了包含TNFR-IgG1序列的序列。
序列ID NO: 137说明了编码HSA前-信号肽的序列。
发明详述
本发明涉及用于天生不具有人O-糖基化合成和转移系统的低等真核生物(例如酵母,包括但不限于巴斯德毕赤酵母)或丝状真菌中产生具有人O-糖基化的糖蛋白的方法和材料。使用本公开的方法和材料生产的重组糖蛋白带有与人或哺乳动物产生的蛋白共同的糖基化模式,因此,能够注射到人体中并极大地降低或消除致免疫反应的可能。
此外,申请人还发现,人源化O-聚糖能够,例如,通过改进药物代谢动力学性质而增强治疗性蛋白,特别是唾液酸化O-聚糖的生物活性(例如生物利用度和血清半衰期),因此,有利于更好地控制体内药物活性。
因此,本发明涉及基于改进的载体、新核酸、宿主细胞系开发用于酵母和丝状真菌(例如巴斯德毕赤酵母)的蛋白表达系统,和使用上述生产具有降低的免疫原性和/或更好的药物代谢动力学性质的重组糖蛋白的方法。
本发明人已发现,可通过修饰存在于低等真核生物细胞中的糖基化系统,在重组的低等真核生物宿主细胞中获得改进的糖蛋白治疗剂。本文所述的细胞是经过遗传修饰的,或已经接受遗传修饰(例如,通过具体的缺失和插入),从而特异性地产生具有某些类似于人的O-糖基化的重组糖蛋白。更具体地,本申请人发现,通过(i) 减弱低等真核生物宿主细胞的内源O-糖基化途径(或,可选地,使用已经如此减弱的宿主细胞);和(ii) 表达编码具体O-糖基化酶的异源基因的步骤,所述宿主细胞能够产生具有具体的类似于人的O-聚糖,而不是天然的、低等真核生物免疫原性O-聚糖的蛋白质。申请人发现,在所述改变和使用目标外源基因转染后,修饰的低等真核生物宿主细胞能够产生具有具体的类似于人的O-糖基化(并且,在具体实施方案中,还有类似于人的N-糖基化)的糖蛋白(包括治疗性糖蛋白)。图9和10说明了如本发明中所公开的糖蛋白的O-唾液酸化提高如何导致B6小鼠中生物利用度的增加,以及大鼠中生物利用度和血清半衰期的提高。此外,所述低等真核生物宿主细胞,例如巴斯德毕赤酵母,能够生产高滴度的治疗性糖蛋白,并且,与在哺乳动物细胞或保留内源糖基化系统的低等真核生物宿主细胞中产生的治疗性糖蛋白相比,具有人O-聚糖(和任选的N-聚糖)的主要种类的糖蛋白显示改进的功效。
尽管Bobrowicz等的在先发明WO2007/061631描述了用于将真菌O-聚糖简化为单O-连接甘露糖的方法,但是,生产具有与见于哺乳动物细胞培养物或人源的某些O-糖型相似或相同的O-糖基化的蛋白是有利的。出于本发明的目的,具有与见于哺乳动物细胞培养物或人源的某些O-糖型相似或相同的O-糖基化(出于本文的目的,称作“类似于人的”O-聚糖)的此类蛋白是以下列聚糖作为主要O-聚糖种类的蛋白质,所述聚糖包括(1) 连接到单个甘露糖残基的末端GlcNAc,其中所述甘露糖残基连接到蛋白上的丝氨酸或苏氨酸残基(即,O-Man-GlcNAc);(2) 连接到单个甘露糖残基的末端GlcNAc-Gal (即,连接到上文所述末端GlcNAc的半乳糖),其中所述甘露糖残基连接到蛋白上的丝氨酸或苏氨酸残基(即,O-Man-GlcNAc-Gal);或(3) 连接到单个甘露糖残基的末端GlcNAc-Gal-Sia (即,连接到(2)中所述末端GlcNAc-Gal的唾液酸),其中所述甘露糖残基连接到蛋白上的丝氨酸或苏氨酸残基(即,O-Man-GlcNAc-Gal-Sia)。这些结构与常见于神经细胞和其他脑相关或神经相关细胞上的O-聚糖结构紧密相关(参见,Zamze等人,Glycobiology; 9:823-831
(1999))。哺乳动物唾液酸化O-甘露糖聚糖的最深入研究的实例是α-肌营养不良蛋白聚糖(alpha-dystroglycan; "Alpha-DG");Chiba等人,1997 J Biol.
Chem 272:2156;Sasaki等人,1998 Biochem. Biophys. Acta 1425:599。α-DG包含在位于成熟α-DG的N-末端的粘蛋白样结构域内的Ser/Thr上的“高丰度”的O-聚糖(唾液酸-α-2,3-Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,2-甘露糖)。Manya等人,2007 J Biol Chem 282:20200鉴定了至少一些O-甘露糖化残基。
本发明提供了可用于在低等真核生物表达系统中生产主要带有类似于人的O-聚糖结构(如本文所限定)的重组糖蛋白的方法和材料。优选例如酵母的低等真核生物用于糖蛋白的表达,这是因为其能够经济地培养,给出高产率,并且在适当修饰时,能够适合的糖基化。优选各种酵母进行细胞培养,例如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces
lactis)、巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)和多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha),这是因为其能够生长至高细胞密度并分泌大量的重组蛋白。在具体实施方案中,所述低等真核生物是芬兰毕赤酵母(Pichia
finlandica)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichia
trehalophila)、Pichia koclamae、膜璞毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、微小毕赤酵母(Pichia minuta) (Ogataea minuta,Pichia lindneri)、仙人掌毕赤酵母(Pichia opuntiae)、耐热毕赤酵母(Pichia
thermotolerans)、柳毕赤酵母(Pichia
salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普毕赤酵母(Pichia pijperi)或树干毕赤酵母(Pichia
stiptis)。同样,丝状真菌,例如黑曲霉(Aspergillus niger)、镰刀菌(Fusarium sp.)、粗糙脉孢霉(Neurospora
crassa)等也可用于本发明糖蛋白的工业规模生产。
作为第一方面,本发明提供了用于本发明方法的低等真核生物宿主细胞,其通过敲除和/或失活一种或多种参与O-糖基化的基因而进行修饰,所述基因包括但不限于编码β-甘露糖基转移酶(bmts;参见,例如US 2006/0211085和Trimble RB等人,2003
Glycobiology 14:265-274)、磷酸甘露糖转移酶(参见,例如Trimble RB等人,2003
Glycobiology 14:265-274)的那些基因,或参与O-糖基化的一种或多种其他基因。在具体实施方案中,被敲除和/或失活的一种或多种参与O-糖基化的基因编码选自以下的酶:β-甘露糖基转移酶(例如,BMT 1 、 2 、 3和4基因;参见,例如Mille等人,2008 J. Biol.
Chem. 283:9724-9736;US 2006/0211085)或磷酸-甘露糖转移酶(例如MNN4A [也称作MNN4]、MNN4B [也称作MNN4L1或MNNS;参见,例如US 7,259,001]和PNO1 [参见,例如US
7,198,921]基因;Li等人,2006 Nat.
Biotechnol. 24:210-215)。在具体实施方案中,编码Ktr和Kre2/Mnt1甘露糖基转移酶(包括Ktr1和Ktr3)的基因(KTR1和KTR3基因)和编码α1,2-甘露糖基转移酶Kre2的基因(KRE2基因,参见,例如美国专利7,217,548)保持完整,或在使其能够产生功能蛋白的状态。在可选的实施方案中,编码Ktr1的基因被缺失或失活,而其他MNT基因则保持在使其能够产生功能蛋白的状态。现已发现KTR1的失活使O-Man1的水平提高2倍。在具体实施方案中,缺失编码Mnn4a、Mnn4b和Pno1的基因中的至少一种。在可选的实施方案中,缺失或失活编码Ktr1、Ktr3和Kre2的基因。
可通过本领域中任何适合的方法完成基因的破坏,以破坏基因和/或基因至编码蛋白的翻译;且包括但不限于破坏基因的开放读码框、破坏开放读码框的表达,或中止编码目标蛋白的RNA的翻译,以及使用干扰RNA、反义RNA等。适合的方法包括,例如Rothstein的方法(Rothstein,
1991 Methods Enzymol. 194:281-301),或PCR介导的方法(Baudin等人,1993 Nucleic
Acids Res. 21:3329-3330)。在具体实施方案中,上述家族中在上文没有具体提到的可选基因保持完整(即,没有被破坏)。
作为第二方面,本发明提供了用于本发明方法的宿主细胞(特别是在上文第一方面中描述的那些),其中,所述宿主细胞经修饰以表达参与人或哺乳动物O-连接糖基化途径的重组外源(非天然)基因。在具体实施方案中,所述宿主细胞表达参与人或哺乳动物O-连接糖基化途径的各个外源基因的额外拷贝。所述细胞可通过使用参与O-糖基化的外源基因转染或转化细胞而获得,所述基因特别是编码蛋白质O-甘露糖β-1,2-N-乙酰葡糖胺基转移酶1
("PomGnT1")或其催化结构域的基因,以及编码负责人或哺乳动物O-糖基化途径中的一个或多个步骤的酶的一种或多种其他基因,所述酶包括但不限于以下酶或其催化结构域:UDP-GlcNAc转运蛋白;α-1,2-甘露糖苷酶(参见,例如WO 2007/061631);β-1,4-半乳糖转移酶("β1,4GalT");UDP-半乳糖转运蛋白(UGT);UDP-Gal差向异构酶;α-2,6-唾液酸转移酶("α2,6SialT");α-2,3-唾液酸转移酶("α2,3SialT");UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶("GNE");N-乙酰神经氨酸-9-磷酸合酶("SPS");唾液酸化-9-P磷酸酶("SPP");CMP-唾液酸合酶("CSS");和CMP-唾液酸转运蛋白("CST")。在其他实施方案中,可添加编码O-岩藻糖化基因的核酸。在具体实施方案中,O-岩藻糖聚糖可以在单糖Fuc-O-Ser/Thr至四糖NeuAcα2, 3/6 Galβ1, 3
Fuc-O-Ser/Thr和二-和三-中间体的范围。在具体实施方案中,使用核酸转化所述宿主细胞,其中,所述核酸编码添加岩藻糖、NeuAcα2, 3/6 Galβ1或Fuc-O-Ser/Thr (GDP-岩藻糖蛋白O-岩藻糖基转移酶;POFUT1)的基因;和/或向Fuc-O-Ser/Thr:Manic,
Radical 和/或Lunatic
Fringe添加GlcNAc-连接的β1,3的一种或多种基因。引入的核酸可以可操作地连接到衍生自真菌的启动子和转录终止子,以及具有信号序列和内质网("ER")-或高尔基体-定位的跨膜结构域的衍生自真菌的前导序列。在具体实施方案中,将编码PomGnT1、β1,4GalT、α2,6SialT和α2,3SialT的基因可操作地连接到衍生自真菌(在具体实施方案中,其衍生自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母)的启动子和转录终止子,以及具有信号序列和内质网("ER")-或高尔基体-定位的跨膜结构域的衍生自真菌的前导序列。所述信号序列用来引导新生蛋白至ER。使用跨膜结构域将蛋白定位并锚定到ER或高尔基体膜。将编码α-1,2-甘露糖苷酶的基因可操作地连接到基于真菌(在具体实施方案中,衍生自毕赤酵母)的启动子和转录终止子,以及衍生自真菌的信号序列(在具体实施方案中,其中,所述信号序列是酵母(Saccharomyces)
αMAT前-信号序列)。将编码UDP-GlcNAc转运蛋白、UDP-半乳糖转运蛋白、UDP-Gal差向异构酶、GNE、SPS、SPP、CSS和CST的基因可操作地连接到基于真菌(在具体实施方案中,衍生自毕赤酵母)的启动子和转录终止子。在具体实施方案中,所使用的启动子是毕赤酵母AOX1启动子或GAP启动子。在其他实施方案中,所使用的启动子是毕赤酵母TEF启动子或PMA启动子;参见,例如Hamilton等人,2006 Science 303:1441-1443。在具体实施方案中,将α2,6SialT基因可操作地连接到毕赤酵母TEF启动子。在具体实施方案中,将CST基因可操作地连接到PMA启动子。
在具体实施方案中,所编码的POMGnT1酶或催化结构域是或衍生自人、小鼠或蛙的POMGnT1酶或催化结构域。
在具体实施方案中,POMGnT1酶包含序列SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 112或SEQ
ID NO: 118。在具体实施方案中,POMGnT序列选自:SEQ
ID NO: 109、SEQ ID NO: 111或SEQ ID NO: 117。SEQ
ID NOs: 109、111和117,编码POMGnT1酶的密码子优化序列形成了本发明的具体实施方案。
在具体实施方案中,UDP-GlcNAc转运蛋白是或衍生自乳酸克鲁维酵母或小鼠UDP-GlcNAc转运蛋白的UDP-GlcNAc转运蛋白。
本发明的细胞系和方法的α1,2-甘露糖苷酶必须对O-连接的α1,2-甘露糖具有活性。在具体实施方案中,α1,2-甘露糖苷酶是真菌的α1,2-甘露糖苷酶,且在具体实施方案中,α1,2-甘露糖苷酶是或衍生自里氏木霉(Trichoderma reesei) α1,2-甘露糖苷酶,酵母、球孢子菌(Coccidiodes)物种(例如,粗球孢子菌(C. immitis),例如登录号No. EAS32290中所述;或C.
posadasii甘露糖苷酶,如登录号No. ABA54911中所述;参见,例如2010年7月30日提交的美国申请序号No. 61/369157 [代理案号No. GF2010.7158L01US])或曲霉菌(Aspergillus
sp.;参见,例如Bobrowicz等人,
WO2007/061631)的α-1,2-甘露糖苷酶。在具体实施方案中,α1,2-甘露糖苷酶在毕赤酵母AOX1启动子的控制之下。因此,在转换甲醇培养基后,表达甘露糖苷酶,产生单甘露糖结构。
本发明的细胞可利用本领域可得、在本文引用的公开文献内,以及如本文所述的方法产生;参见例如Hamilton等人,2006 Science 313: 1441-1443;和WO 07/136752。
外源基因在宿主中的表达需要使用在此宿主中具有功能的调控区,无论是天然的或非天然的,或是引入到或存在于所利用的细胞系中。可使用各种转录、翻译、定位和其他调控序列。在具体实施方案中,所述调控序列是其他酵母或丝状真菌的调控序列。在具体实施方案中,所述调控序列是脊椎动物的,包括但不限于蛙、鼠或人序列。
如上所述,在具体示例中,将外源基因可操作地连接到内质网("ER")或高尔基体定位序列,参见,例如Choi等人,2003 PNAS
100:5022和US 7,449,308。所使用的ER或高尔基体引导/定位序列将与其可操作地连接的序列靶向至内质网或早高尔基体(early Golgi)。在具体实施方案中,所述ER/高尔基体前导序列是来自酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母、或乳酸克鲁维酵母的ER和/或高尔基体驻留膜蛋白的膜靶向区域。在具体实施方案中,所述ER/高尔基体前导序列包括引导新生蛋白至ER的信号序列和基本上由以下组成的定位信号:(i)能够将可操作地连接的蛋白在ER和/或高尔基体保留一段时间以允许发挥所需的功能的胞质尾和跨膜结构域区段;(ii) 部分或全部的完整干区域(stem region);或(iii)
完整干区域和任选部分的催化结构域。在具体实施方案中,ER和/或高尔基体前导序列是ER和/或高尔基体前导序列,或衍生自选自以下的蛋白的ER和/或高尔基体前导序列:ScMNS1-s、ScSEC12-m、ScMNN9-s、ScKRE2-s、ScMNN2-s或ScMNN6-s。在具体实施方案中,ER和/或高尔基体前导序列衍生自选自以下的蛋白的ER和/或高尔基体前导序列:ScMNS1-s、ScMNN9-s、PpKRE2-s、K1GNT1-s、ScMNN2-s、ScMNN2-m、ScMNN5-s、ScMNN6-s、ScPMT5-m、PpPMT1-m或PpBET1-s。落入此类范畴的某些前导序列公开在现有技术中,参见,例如Choi等人,2003
PNAS 100:5022和US 7,449,308。所公开的前导序列,以及包含所述前导序列和本文所述的外源基因,任选地包含转录终止子序列的其组合形成了本发明的具体实施方案。具体实施方案涉及PMT 、 BET1 、 BOS1和SEC22前导序列和本文所述的前导序列组合。具体地,本发明涉及表1中公开的前导序列及其对应的SEQ ID NOs,在具体实施方案中,涉及前导序列#s
33-34、27-32和35-54,以及包含上述前导序列和外源基因的组合。
在具体实施方案中,所述ER和/或高尔基体前导序列是或衍生自蛋白的前导序列,其中,所述蛋白选自:GLS1编码的酿酒酵母α-葡萄糖苷酶I,MNS1编码的酿酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶,由SEC12编码的酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母的核苷酸交换因子,其在ER和高尔基体之间循环;由编码完整ER跨膜结构域的PMT 1 、 2 、 3 、 4 、 5&6编码的酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母蛋白O-甘露糖基转移酶;或由来自酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母的BOS1、BET1和SEC22编码的SNARE蛋白。此区域通常是氨基末端信号序列和随后的跨膜或其他锚定结构域。在具体实施方案中,使用刚刚上面列出的序列作为ER定位序列。
在具体实施方案中,所述ER和/或高尔基体前导序列是或衍生自蛋白的前导序列,其中所述蛋白选自:巴斯德毕赤酵母Och1p、酿酒酵母Mnn9p、Van1p、Anp1p、Hoc1p、Mnn10p或Mnn11p (并且,在具体实施方案中,是其氨基末端片段)。在具体实施方案中,使用刚刚上面列出的序列作为早高尔基体或顺式高尔基体定位序列。
在具体实施方案中,所述ER和/或高尔基体前导序列是或衍生自蛋白的前导序列,其中所述蛋白选自:酿酒酵母Mnn1p或Mnn6p (并且,在具体实施方案中,是其氨基末端片段)。在具体实施方案中,使用刚刚上面列出的序列作为晚高尔基体定位序列。
表1提供了本文预期的ER和/或高尔基体前导序列的具体实施方案。本文还提供了其他序列(和SEQ ID NOs)。本文预期SEQ
ID NOs: 1-108中的任一种的用途。表2提供了将具体公开的前导序列与人"Hs"、鼠"Mm"或蛙"Xen"
POMGnT1催化结构域序列融合,并将其从甲醇诱导型AOX1启动子表达后,所获得的结果。本发明预期人、鼠或蛙POMGnT1序列(包括但不限于催化结构域序列)的用途,和将其从适合的启动子表达,包括但不限于甲醇诱导型AOX1启动子或GAP启动子。
在具体实施方案中,所述ER和/或高尔基体前导序列是选自以下的前导序列:表1或表2,SEQ ID NOs: 1-108,或衍生自ScMNN6-s、ScPMT1-s、ScPMT2-s、ScPMT3-s、ScPMT4-s、ScPMT5-s或ScPMT6-s的前导序列。
在具体实施方案中,人POMGnT1序列或其催化结构域序列与前导序列融合,所述前导序列是或衍生自选自下列的蛋白的前导序列:PpSEC12-s、ScMNN9-s、K1GNT1-s、ScMNN2-s、ScMNN2-m、ScPMT5-m、PpPMT1-m或PpBET1-S。在具体实施方案中,人POMGnT1序列或其催化结构域序列与选自以下的前导序列融合:SEQ ID NO 3 (或编码SEQ ID NO 4的序列);SEQ ID NO 13 (或编码SEQ
ID NO 14的序列);SEQ
ID NO 39 (或编码SEQ ID NO 40的序列);SEQ ID NO 41 (或编码SEQ ID NO 42的序列);SEQ ID NO 43 (或编码SEQ
ID NO 44的序列);SEQ
ID NO 73 (或编码SEQ ID NO 74的序列);SEQ ID NO 87 (或编码SEQ ID NO 88的序列)或SEQ ID NO 105 (或编码SEQ
ID NO 106的序列)。
在具体实施方案中,鼠POMGnT1序列或其催化结构域序列与前导序列融合,所述前导序列是或衍生自选自下列的蛋白的前导序列:ScMNN9-s、PpKRE2-s、ScKTR2-s、K1GNT1-s、ScMNN2-s、ScMNN2-m、ScMNN5-s、ScMNN6-s、ScPMT5-m、ScPMT6-m、PpPMT1-s、PpPMT2-s、PpPMT4-s或PpBET1-s。在具体实施方案中,鼠POMGnT1序列或其催化结构域序列与选自以下的前导序列融合:SEQ ID NO 13 (或编码SEQ ID NO 14的序列);SEQ ID NO 33 (或编码SEQ
ID NO 34的序列);SEQ
ID NO 37 (或编码SEQ ID NO 38的序列);SEQ ID NO 39 (或编码SEQ ID NO 40的序列);SEQ ID NO 41 (或编码SEQ
ID NO 42的序列);SEQ
ID NO 43 (或编码SEQ ID NO 44的序列);SEQ ID NO 45 (或编码SEQ ID NO 46的序列);SEQ ID NO 51 (或编码SEQ
ID NO 52的序列);SEQ
ID NO 73 (或编码SEQ ID NO: 74的序列);SEQ ID NO 75 (或编码SEQ ID NO 76的序列);SEQ ID NO 77 (或编码SEQ
ID NO 78的序列);SEQ
ID NO 79 (或编码SEQ ID NO 80的序列);SEQ ID NO 81 (或编码SEQ ID NO 82的序列);或SEQ ID NO 105 (或编码SEQ
ID NO 106的序列)。
在具体实施方案中,蛙POMGnT1序列或其催化结构域序列与前导序列融合,所述前导序列是或衍生自选自下列的蛋白的前导序列:ScMNS1-s、ScSEC12-m、PpSEC12-s、ScMNN9-s、ScANP1-s、ScHOC1-s、ScMNN10-s、ScMNN11-s、PpKRE2-s、ScKTR2-s、K1GNT1-s、ScMNN2-s、ScMNN2-m、ScMNN1-s、ScMNN6-s、ScPMT5-m、PpPMT1-m或PpBET1-s。在具体实施方案中,蛙POMGnT1序列或其催化结构域序列与选自以下的前导序列融合:SEQ ID NO 3 (或编码SEQ ID NO 4的序列);SEQ ID NO 7 (或编码SEQ
ID NO 8的序列);SEQ
ID NO 9 (或编码SEQ ID NO 10的序列);SEQ ID NO 13 (或编码SEQ ID NO 14的序列);SEQ ID NO 17 (或编码SEQ
ID NO 18的序列);SEQ
ID NO 19 (或编码SEQ ID NO 20的序列);SEQ ID NO 21 (或编码SEQ ID NO 22的序列);SEQ ID NO 23 (或编码SEQ
ID NO 24的序列);SEQ
ID NO 33 (或编码SEQ ID NO 34的序列);SEQ ID NO 37 (或编码SEQ ID NO 38的序列);SEQ ID NO 39 (或编码SEQ
ID NO 40的序列);SEQ
ID NO 41 (或编码SEQ ID NO 42的序列);SEQ ID NO 43 (或编码SEQ ID NO 44的序列);SEQ ID NO 49 (或编码SEQ
ID NO 50的序列);SEQ
ID NO 51 (或编码SEQ ID NO 52的序列);SEQ ID NO 73 (或编码SEQ ID NO 74的序列);SEQ ID NO 87 (或编码SEQ
ID NO 88的序列);或SEQ
ID NO 105 (或编码SEQ ID NO 106的序列)。
在具体实施方案中,所述ER和/或高尔基体前导序列是或衍生自选自下列的蛋白的前导序列:ScMNN1-s、ScMNN9-s、PpKre2-s、K1Gnt1-s、ScMNN2-s、ScMNN2-m、ScMNN5-s、ScMNN6-s、ScPMT5-m、PpPMT1-m或PpBET1-s。在具体实施方案中,所述ER和/或高尔基体前导序列选自:SEQ ID NO 49 (或编码SEQ ID NO 50的序列);SEQ ID NO 13 (或编码SEQ
ID NO 14的序列);SEQ
ID NO 33 (或编码SEQ ID NO 34的序列);SEQ ID NO 39 (或编码SEQ ID NO 40的序列);SEQ ID NO 41 (或编码SEQ
ID NO 42的序列);SEQ
ID NO 43 (或编码SEQ ID NO 44的序列);SEQ ID NO 45 (或编码SEQ ID NO 46的序列);SEQ ID NO 51 (或编码SEQ
ID NO 52的序列);SEQ
ID NO 93 (或编码SEQ ID NO 94的序列);SEQ ID NO 87 (或编码SEQ ID NO 88的序列);或SEQ ID NO 105 (或编码SEQ
ID NO 106的序列)。
在具体实施方案中,所述ER和/或高尔基体前导序列是或衍生自选自下列的蛋白的前导序列:PpSEC12、ScMNN9、PpKRE2、ScKTR2、K1GNT1、ScMNN2、ScMNN6、ScPMT5、PpPMT1或PpBET1。
在具体实施方案中,所述ER和/或高尔基体前导序列是或衍生自选自下列的蛋白的前导序列:ScMNN9、K1GNT1、ScMNN2、ScPMT5或PpBET1。
与所述ER和/或高尔基体前导序列融合的外源基因与启动子可操作地连接。所述启动子可以是驱动与其融合的外源基因表达的任何启动子元件,包括但不限于毕赤酵母AOX1启动子或GAP启动子。在特别优选的实施方案中,在所述前导序列是ScMNN2-s、ScMNN2-m、ScPMT5-m或PpPMT1-m的情况下,所述启动子是AOX1。
具体的实施方案包括以下的启动子-前导序列-POMGnT1序列组合:AOX1-PpKRE2s-小鼠POMGnT1;GAP-K1GNT1s-小鼠POMGnT1;AOX1-K1GNT1s-小鼠POMGnT1;GAP-K1GNT1s-蛙POMGnT1;AOX1-ScMNN2s-小鼠POMGnT1;GAP-ScMNN5s-小鼠POMGnT1;AOX1-ScMNN5s-小鼠POMGnT1;GAP-ScMNN6s-小鼠POMGnT1;或AOX1-ScPMT5m-小鼠POMGnT1。
具体实施方案包括GAP-ScMNN6s-人POMGnT1启动子-前导序列-POMGnT1序列组合。
外源基因还可以与转录终止序列可操作地连接,所述转录终止序列包括但不限于ScCYC1和PpAOX1的转录终止序列。
外源基因可以与其他调控序列可操作地连接,所述调控序列包括但不限于信号序列。
这些前导序列在设计用于测量至O-Man1上的GlcNAc转移的测试中表现良好,例如,通过凝集素染色(凝集素GS-II)和释放的O-聚糖的Dionex-HPLC
(HPAEC-PAD)分析。
作为第三方面,本发明提供了用于本发明方法的宿主细胞(特别是在第一和第二方面中所述的那些),其中,所述宿主细胞通过使用编码糖蛋白的外源基因转染或转化宿主细胞而进行修饰,以表达目标重组糖蛋白。这样,在用于表达的适当条件下培养时,所述宿主细胞将表达并分泌包含具体的类似于人的O-糖基化的改进的重组糖蛋白。
可使用包含编码期望的人糖蛋白(例如人治疗性药物或兽医药物)的核酸的重组载体转化本发明的低等真核生物宿主细胞。所述核酸可以是DNA或RNA,通常为DNA。将编码糖蛋白的核酸与允许表达和分泌所述糖蛋白的调控序列可操作地连接。此类调控序列包括启动子,和任选地,在编码融合蛋白的核酸上游或5'的增强子,和在编码糖蛋白的核酸3'或下游的转录终止位点。对于分泌的糖蛋白,所述核酸通常包括信号肽。所述信号肽负责将所述蛋白质靶向至用于糖基化和分泌的分泌途径,通常为内质网。所述核酸还通常编码具有核糖体结合位点的5'-非翻译区,和3'-非翻译区。所述核酸通常是可以在表达所述糖蛋白的细胞中复制的载体的成分。所述载体还可包含允许识别转化细胞的标记物。然而,一些细胞类型,特别是酵母,能够由缺少外来载体序列的核酸成功转化。
编码期望的糖蛋白的核酸可得自于多种来源。可使用针对保守区域的引物,从已知表达所述糖蛋白的细胞系扩增cDNA序列(参见,例如Marks等人,J. Mol. Biol. 581-596 (1991))。也可以基于科技文献中的序列,从头合成核酸。还可以通过延伸跨越期望序列的重叠寡核苷酸而合成核酸(参见,例如Caldas等人,Protein
Engineering, 13, 353-360 (2000))。可使用已知的技术对用于本发明的核酸序列进行密码子优化,以更好地在本发明的宿主细胞中表达。优选地,使用遗传密码的简并性,通过该密码子-优化不改变由编码治疗性糖蛋白的任何DNA序列编码的一级氨基酸序列。如果需要,可通过改变用于表达重组糖蛋白的一级氨基酸序列的嵌合DNA序列,以添加和/或除去一个或多个N-糖基化位点。在优选的实施方案中,使用包含编码可溶性TNF-受体融合分子(TNFRII-Fc);人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF);人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF);或人红细胞生成素(hEPO)的核酸的载体转化所述宿主细胞。
本发明中产生的重组糖蛋白优选包含人治疗性糖蛋白,包括但不限于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、红细胞生成素(EPO)和TNF-受体;或可溶性TNF-受体融合分子,例如Enbrel (Amgen)。对于人治疗剂,所述重组糖蛋白优选衍生自人或密切相关的物种。还可生产用于兽医适应症的重组糖蛋白,在此情况下,所述重组糖蛋白序列优选衍生自与期望的兽医受试者相同或密切相关的物种。
本发明的具体实施方案基本如图1中所述。
在其他实施方案中,本发明还包括生产主要具有类似于人的O-聚糖的重组糖蛋白的方法,所述方法包括a) 选择低等真核生物宿主细胞;b) 减弱所述宿主细胞中一种或多种内源O-糖基化酶的活性(其中步骤(a)的所述宿主细胞还没有如此减弱);c) 使用编码O-连接的甘露糖β1,2-N-乙酰葡糖胺基转移酶1 (POMGnT1)、UDP-GlcNAc转运蛋白、α-1,2-甘露糖苷酶和所述糖蛋白的核酸序列转化所述宿主细胞;和d) 在适合所述核酸序列表达的条件下培养所述细胞以产生主要具有类似于人的O-聚糖的重组糖蛋白。在具体的实施方案中,使用非限制性地编码以下酶或其催化结构域的核酸进一步转化所述宿主细胞:β-1,4-半乳糖转移酶("β1,4GalT");UDP-半乳糖转运蛋白(UGT);UDP-Gal 差向异构酶;α-2,6-唾液酸转移酶("α2,6SialT");α-2,3-唾液酸转移酶("α2,3SialT");UDP-N-乙酰葡糖胺-2-差向异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶("GNE");N-乙酰神经氨酸-9-磷酸合酶("SPS");唾液酸化-9-P磷酸酶("SPP");CMP-唾液酸合酶("CSS");和CMP-唾液酸转运蛋白("CST")。在具体实施方案中,使用编码以下酶或其催化结构域的核酸进一步转化所述宿主细胞:β1,4GalT、UDP-半乳糖转运蛋白和UDP-Gal差向异构酶。在其他实施方案中,使用编码以下酶或其催化结构域的核酸进一步转化所述宿主细胞:β1,4GalT、UDP-半乳糖转运蛋白、UDP-Gal差向异构酶、α2,6SialT、GNE、SPS、SPP、CSS和CST。在其他实施方案中,使用编码以下酶或其催化结构域的核酸进一步转化所述宿主细胞:β1,4GalT、UDP-半乳糖转运蛋白、UDP-Gal差向异构酶、α2,3SialT、GNE、SPS、SPP、CSS和CST。在具体实施方案中,使用编码唾液酸化所需的以下5个基因中至少一个的核酸的额外拷贝转化所述宿主细胞:α2,3SialT
(或α2,6SialT)、GNE、SPS、SPP、CSS和/或CST。通过将这5个基因并入到基因组中的不同基因座,本申请人发现提供额外的拷贝导致更高百分比的期望的唾液酸化O-聚糖。在进一步的实施方案中,任何的上述细胞进一步不表达KTR1。可分离、纯化所述重组糖蛋白,并使用药学可接受的赋形剂配制,以生产治疗性糖蛋白组合物。在具体实施方案中,主要的O-聚糖是O-Man-GlcNAc;O-Man-GlcNAc-Gal或O-Man-GlcNAc-Gal-Sia。
本发明的具体实施方案涉及用于在低等真核生物宿主细胞中生产具有人或哺乳动物O-连接糖基化的重组糖蛋白的方法,所述方法包括:(1) 提供低等真核生物宿主细胞,其(a) 不表达功能性的:(i) β-甘露糖基转移酶酶BMT 1、2、3和4,和(ii) 磷酸-甘露糖转移酶酶Mnn4a、Mnn4b和Pno1;和(b) 表达功能性(i) POMGnT1;(ii)
UDP-GlcNAc转运蛋白;和(iii) α-1,2-甘露糖苷酶;(2) 使用编码目标糖蛋白的外源核酸转染或转化所述低等真核生物宿主细胞;和(3) 在允许所述外源核酸表达且生产所述重组糖蛋白的条件下培养所述宿主细胞。在具体实施方案中,上述方法的细胞包含编码步骤(1)(b)的酶的外源核酸。在具体实施方案中,所述细胞进一步表达编码β1,4GalT、UDP-半乳糖转运蛋白和UDP-Gal差向异构酶的核酸。这些其他基因允许末端GlcNAc-Gal的生产。在其他具体实施方案中,所述细胞进一步表达编码(i) β1,4GalT、(ii) UDP-半乳糖转运蛋白、(iii) UDP-Gal差向异构酶、(iv) α2,6SialT、(v) GNE、(vi) SPS、(vii) SPP、(viii) CSS和(ix)
CST的核酸。这些其他基因使其能够生产末端GlcNAc-Gal-Sia。在其他具体实施方案中,所述细胞进一步表达编码(i) β1,4GalT、(ii) UDP-半乳糖转运蛋白、(iii) UDP-Gal差向异构酶、(iv) α2,3SialT、(v) GNE、(vi) SPS、(vii) SPP、(viii) CSS和(ix) CST的核酸。在进一步的实施方案中,任何的上述细胞进一步不表达Ktr1。
确定细胞是否表达“功能性”酶是基于所述酶是否在能够影响期望的O-糖基化步骤的水平上执行其预期的功能。在本文中,在活性不可检测的情况下,认为所述细胞不表达功能性酶。在上述步骤(1)(a)的具体实施方案中,所述细胞完全不表达酶或酶促活性。在步骤(1)(b)的具体实施方案中,在所述细胞表达功能性酶的情况下,所述细胞表达所述酶的天然或预期活性。在(1)(b)的具体实施方案中,使用编码完整酶的核酸或编码足以赋予所述活性的酶催化结构域的核酸转染所述细胞。
在具体实施方案中,所述方法采用本文公开的细胞系、核酸和载体。因此,在具体实施方案中,使用编码所述酶的核酸转染步骤(a)的细胞。在这些实施方案中,编码POMGnT1、β1,4GalT、α2,6SialT和α2,3SialT的核酸应可操作地连接到衍生自真菌(在具体实施方案中,衍生自酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母)的启动子和转录终止子,以及具有信号序列和内质网("ER")或高尔基体定位跨膜结构域的衍生自真菌的前导序列。信号序列用来引导新生蛋白至ER。跨膜结构域将蛋白定位并锚定到ER或高尔基体膜。应当将编码α-1,2-甘露糖苷酶的基因可操作地连接到基于真菌(在具体实施方案中,衍生自毕赤酵母)的启动子和转录终止子,和衍生自真菌的信号序列(在具体实施方案中,其中,所述信号序列是酵母αMAT前-信号序列)。编码UDP-Gal差向异构酶、UDP-半乳糖转运蛋白、GNE、SPS、SPP、CSS和CST的核酸应可操作地连接到基于真菌(在具体实施方案中,衍生自毕赤酵母)的启动子和转录终止子。在具体实施方案中,所使用的启动子是毕赤酵母AOX1启动子或GAP启动子。在其他实施方案中,所使用的启动子是毕赤酵母TEF启动子或PMA启动子;参见,例如Hamilton等人,2006 Science 303:1441-1443。在具体实施方案中,将α2,6SialT基因可操作地连接到毕赤酵母TEF启动子。在具体实施方案中,将CST基因可操作地连接到PMA启动子。具体实施方案使用如本公开中描述的细胞系。本文所述的具体细胞系形成本发明的具体实施方案。
在需要的情况下,可通过使用真菌O-糖基化的一种或多种化学抑制剂处理调控(例如,降低或消除)所得细胞系中的糖基化,所述化学抑制剂包括但不限于:5-[[3,4-双(苯基甲氧基)苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸;5-[[3-(l-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸;3-羟基-4-(2-苯基乙氧基)苯甲醛;3-(l-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)-苯甲醛;5-[[3-(l-苯基-2-羟基)乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)]苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫代-3-噻唑烷乙酸(参见WO 2007/061631;全文通过引用并入本文)。在具体实施方案中,所述抑制剂是蛋白O-甘露糖基转移酶("Pmt")的抑制剂;参见Orchard等人,EP 1313471。在具体实施方案中,所述抑制剂是PMTi-3,WO 2007/061631。在具体实施方案中,所述Pmt抑制剂是WO 09/143041或2010年7月30日提交的美国申请序号No. 61/369157 [代理案号No.
GF2010.7158L01US]中描述的那些。在具体实施方案中,Pmt抑制剂用于所公开的方法中并提供给所公开的细胞(例如,在培养基中),以控制唾液酸化O-聚糖的整体水平和/或改变不同O-聚糖种类的百分比,从而有利于唾液酸化O-聚糖的生产。在具体实施方案中,如例如Bobrowicz等人,WO
07/061631中所述在诱导期添加Pmt抑制剂。在具体实施方案中,向正在生长的酵母添加Pmt抑制剂,在甲醇诱导期期间添加最高的剂量。Pmt抑制剂的施用可用于通过导致一定水平的O-唾液酸化而影响糖蛋白组合物的药效动力学性质。如技术人员将理解的,所需的具体水平依赖于具体的糖蛋白。例如,对于某些治疗性糖蛋白,过多的唾液酸化O-聚糖可能干扰活性。在这种情况下,降低唾液酸化O-聚糖的整体数量可改进活性。对于具体的糖蛋白,具有末端GlcNAc或半乳糖的O-聚糖降低蛋白活性和/或血清半衰期。在后一种情况下,可需要实现非常高百分比的唾液酸化O-聚糖。或者,最大数量的唾液酸化O-聚糖可能是最佳半衰期所需要的,因此,本发明人可添加极少或不添加Pmt抑制剂。技术人员可在所需的情况下适合地采用这些教导。
本发明还包括用于制备上述修饰的低等真核生物细胞的方法以及所述修饰的低等真核生物细胞用于制备重组糖蛋白的用途,公开的核酸和载体,以及包含其的宿主细胞。
在其他实施方案中,本发明包括由本发明的低等真核生物宿主细胞生产的重组糖蛋白组合物。这些重组糖蛋白组合物主要包含类似于人的O-聚糖,其可优选选自:O-Man-GlcNAc;O-Man-GlcNAc-Gal或O-Man-GlcNAc-Gal-Sia。在具体实施方案中,本发明生产重组糖蛋白组合物,其包含大于50% (并且,优选地,分别大于60%、70%、80%、85%、90%、95%和97%)的如上所述的类似于人的O-聚糖,和小于15% (且优选小于10%,和小于5%)的O-Man2聚糖,O-Man2聚糖是具有连接到O-糖基化丝氨酸/苏氨酸残基的2个甘露糖残基的聚糖。在具体实施方案中,本发明产生重组糖蛋白组合物,其包含大于30% (并且,优选地,分别大于40%、50%、60%、70%、80%和83%)的O-Man-GlcNAc-Gal。在具体实施方案中,本发明产生重组糖蛋白组合物,其包含大于30% (并且,优选地,分别大于40%、50%或55%)的O-Man-GlcNAc-Gal-Sia。在具体实施方案中,本发明涉及上述组合物,并且,还涉及包含小于30%、20%或15% (且优选小于10%,和小于5%) O-Man2聚糖的那些实施方案,以及制造如本文公开的组合物的方法。O-聚糖测定可使用本领域容易获得的方法进行,包括但不限于使用Dionex-HPLC (HPAEC-PAD)的方法或依赖于目标蛋白的其他适合方法。使用本文公开的方法和材料(载体、宿主细胞等)生产的重组糖蛋白和包含糖蛋白的组合物可与其他药学可接受的活性剂和/或惰性赋形剂一起配制以形成糖蛋白组合物。
本发明进一步涉及如本文所述且如本文公开的方法中使用的细胞系。
本发明还可以与以下最新发展组合使用,所述最新发展允许在低等真核宿主生物,酵母和丝状真菌,例如巴斯德毕赤酵母中,生产具有类似于人的N-糖基化的治疗性糖蛋白;参见,例如Gerngross,美国专利7,029,872,其公开通过引用并入本文。可以对低等真核生物,特别是酵母进行遗传修饰,从而使其表达其中的N-糖基化模式类似于人或人源化的糖蛋白。如Gerngross等的美国专利No.
7,449,308 (其公开通过引用并入本文)所述,这可以通过消除所选择的内源糖基化酶和/或提供外源酶而实现。如果需要,可进行糖基化的进一步遗传工程化,从而可以产生具有或没有核心岩藻糖化的糖蛋白。使用例如酵母的低等真核生物宿主细胞的进一步的优点在于这些细胞能够产生相对同质的糖蛋白组合物,这样糖蛋白的主要糖型可以存在于组合物中大于30摩尔%的糖蛋白。在具体的方面,主要糖型可以存在于组合物中大于40摩尔%、50摩尔%、60摩尔%、70摩尔%的糖蛋白,和最优选地,存在于组合物中大于80摩尔%的糖蛋白。如Gerngross等的美国专利No. 7,029,872和美国专利No.
7,449,308 (其公开通过引用并入本文)所述,这可以通过消除所选择的内源糖基化酶和/或提供外源酶而实现。例如,可选择宿主细胞,并将其工程化以耗竭1,6-甘露糖基转移酶活性,否则,1,6-甘露糖基转移酶活性将向糖蛋白上的N-聚糖添加甘露糖残基。
在具体实施方案中,本文所述的宿主细胞包括与细胞靶向信号肽融合的N-乙酰葡糖胺基转移酶I (GlcNAc转移酶I或GnT I)催化结构域,其中,所述细胞靶向信号肽通常不是与所述催化结构域结合,且经过选择以将GlcNAc转移酶I活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体。重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体的途径产生包含GlcNAcMan5GlcNAc2糖型的重组糖蛋白,例如,主要包含GlcNAcMan5GlcNAc2糖型的重组糖蛋白组合物。美国专利No. 7,029,872、美国专利No. 7,449,308和美国专利申请公开No.
2005/0170452 (其公开均通过引用并入本文),公开了能够产生包含GlcNAcMan5GlcNAc2糖型的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。可在体外使用氨基已糖苷酶处理在上述细胞中产生的糖蛋白,从而产生包含Man5GlcNAc2糖型的重组糖蛋白。
在进一步的实施方案中,刚刚上述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的甘露糖苷酶II催化结构域,其中所述细胞靶向信号肽通常不是与所述催化结构域结合,且经过选择以将甘露糖苷酶II活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体。重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体的途径产生包含GlcNAcMan3GlcNAc2糖型的重组糖蛋白,例如,主要包含GlcNAcMan3GlcNAc2糖型的重组糖蛋白组合物。美国专利No, 7,029,872和美国专利No. 7,625,756 (其公开均通过引用并入本文),公开了表达甘露糖苷酶II酶且能够产生主要具有GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。可在体外使用氨基已糖苷酶处理在上述细胞中产生的糖蛋白,从而产生包含Man3GlcNAc2糖型的重组糖蛋白。
在进一步的实施方案中,刚刚上述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的N-乙酰葡糖胺基转移酶II (GlcNAc转移酶II或GnT II)催化结构域,其中所述细胞靶向信号肽通常不是与所述催化结构域结合,且经过选择以将GlcNAc转移酶II活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体。重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体的途径产生包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型的重组糖蛋白,例如,主要包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型的重组糖蛋白组合物。美国专利No. 7,029,872和No.7,449,308,以及美国专利申请公开No.
2005/0170452 (其公开均通过引用并入本文),公开了能够产生包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。可在体外使用氨基已糖苷酶处理在上述细胞中产生的糖蛋白,从而产生包含Man3GlcNAc2糖型的重组糖蛋白。
在进一步的实施方案中,刚刚上述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的半乳糖基转移酶催化结构域,其中所述细胞靶向信号肽通常不是与所述催化结构域结合,且经过选择以将半乳糖基转移酶活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体。重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体的途径产生包含GalGlcNAc2Man3GlcNAc2或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型的重组糖蛋白或其混合物,例如主要包含GalGlcNAc2Man3GlcNAc2糖型或Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型的重组糖蛋白组合物或其混合物。美国专利No. 7,029,872和美国专利申请公开No. 2006/0040353 (其公开均通过引用并入本文),公开了能够产生包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型的糖蛋白的低等真核生物宿主细胞。可在体外使用半乳糖苷酶处理在上述细胞中产生的糖蛋白,从而产生包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型的重组糖蛋白,例如主要包含GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型的重组糖蛋白组合物。
在进一步的实施方案中,刚刚上述宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的唾液酸转移酶催化结构域,其中所述细胞靶向信号肽通常不是与所述催化结构域结合,且经过选择以将唾液酸转移酶活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体。重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体的途径产生主要包含NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型或NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型的重组糖蛋白或其混合物。对于低等真核生物宿主细胞,例如酵母和丝状真菌,所述宿主细胞进一步包括提供用于转移到N-聚糖的CMP-唾液酸的工具(means)是有用的。美国专利申请公开No. 2005/0260729 (其公开通过引用并入本文),公开了对低等真核生物进行遗传工程化以使其具有CMP-唾液酸合成途径的方法;和美国专利申请公开No.
2006/0286637 (其公开通过引用并入本文),公开了对低等真核生物进行遗传工程化以生产唾液酸化糖蛋白的方法。可在体外使用神经氨酸酶处理在上述细胞中产生的糖蛋白,从而产生主要包含Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖型或GalGlcNAc2Man3GlcNAc2糖型的重组糖蛋白或其混合物。
任一前述宿主细胞可包括一种或多种GlcNAc转移酶,其选自GnT
III、GnT IV、GnT V、GnT VI和GnT IX,以产生具有二等分的(GnT III)和/或多天线(GnT IV、V、VI和IX)的N-聚糖结构的糖蛋白,如在美国专利No. 7,598,055和美国专利申请公开No. 2007/0037248公开的,其公开均通过引用并入本文。
在进一步的实施方案中,产生主要具有GlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白的宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的半乳糖基转移酶催化结构域,其中所述细胞靶向信号肽通常不是与所述催化结构域结合,且经过选择以将半乳糖基转移酶活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体。重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体的途径产生主要包含GalGlcNAcMan5GlcNAc2糖型的重组糖蛋白。
在进一步的实施方案中,刚刚上述产生主要具有GalGlcNAcMan5GlcNAc2 N-聚糖的糖蛋白的宿主细胞进一步包括与细胞靶向信号肽融合的唾液酸转移酶催化结构域,其中所述细胞靶向信号肽通常不是与所述催化结构域结合,且经过选择以将唾液酸转移酶活性靶向至宿主细胞的ER或高尔基体。重组糖蛋白通过宿主细胞的ER或高尔基体的途径产生包含NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2糖型的重组糖蛋白。
在进一步的方面,对于任一种上述宿主细胞,将所述宿主细胞进一步修饰以包括岩藻糖基转移酶和用于生产岩藻糖并将岩藻糖转运到ER或高尔基体中的途径。用于修饰巴斯德毕赤酵母以使其能够产生其上的一个或多个N-聚糖被岩藻糖化的糖蛋白的方法的实例公开在国际申请公开No. WO 2008112092,其公开通过引用并入本文。在本发明的具体方面,将巴斯德毕赤酵母宿主细胞进一步修饰以包含岩藻糖化途径,其包括GDP-甘露糖-4,6-脱水酶、GDP-酮-脱氧-甘露糖-差向异构酶/GDP-酮-脱氧-半乳糖-还原酶、GDP-岩藻糖转运蛋白和岩藻糖基转移酶。在具体的方面,所述岩藻糖基转移酶选自α1,2-岩藻糖基转移酶、α1,3-岩藻糖基转移酶、α1,4-岩藻糖基转移酶和α1,6-岩藻糖基转移酶。
各种前述宿主细胞进一步包括一种或多种糖转运蛋白,例如UDP-GlcNAc转运蛋白(例如,乳酸克鲁维酵母和小鼠(Mus musculus) UDP-GlcNAc转运蛋白)、UDP-半乳糖转运蛋白(例如,黑腹果蝇(Drosophila
melanogaster) UDP-半乳糖转运蛋白)和CMP-唾液酸转运蛋白(例如,人唾液酸转运蛋白)。因为低等真核生物宿主细胞,例如酵母和丝状真菌,缺少上述转运蛋白,优选对低等真核生物宿主细胞,例如酵母和丝状真菌,进行遗传工程化以包括上述转运蛋白。
在具体实施方案中,可选择宿主细胞,或将其工程化以耗竭1,6-甘露糖基转移酶活性,否则,1,6-甘露糖基转移酶活性可向糖蛋白上的N-聚糖添加甘露糖残基。例如,可产生糖工程化的巴斯德毕赤酵母菌株,其中典型酵母型N-糖基化被修饰,代之以产生完全唾液酸化的类似于人的N-聚糖。首先,酵母基因OCH1的缺失消除了负责“外链”糖基化的酶活性(Choi等,Proc
Natl Acad Sci US; 100:5022-7 (2003))。随后,可通过工程化使甘露糖苷酶I
(MNSI)基因和GlcNAc转移酶I
(GnTI)基因进入菌株,并适合地定位到分泌途径以有效地产生哺乳动物杂合型N-聚糖(Choi等,2003)。在进一步的步骤中,可随后通过工程化使甘露糖苷酶II (MNSII)基因和GlcNAc转移酶II (GnTII)基因进入菌株,并适合地定位到分泌途径以有效地产生哺乳动物复杂型N-聚糖(Hamilton等,Science;
301:1244-6. (2003))。此外,通过将酶工程化到此菌株中,以产生UDP-半乳糖、适合的高尔基体膜转运蛋白和编码半乳糖基转移酶(GalT)的基因的组合,可产生能够转移带有末端β-1,4-半乳糖的复杂型人N-聚糖的酵母菌株(Bobrowicz等人,Glycobiology; 14:757-66 (2004))。最后,通过引入唾液酸的体内合成和转移所需的酶(Hamilton等,Science,
313(5792):1441-3 (2006)),可获得唾液酸化的聚糖。上述引用的各文献的公开均通过引用并入本文。在重组蛋白上不存在N-糖基化的情况下,不必通过这种方式对低等真核生物宿主细胞的糖基化系统进行工程化。此外,本领域技术人员能够在编码重组糖蛋白的序列添加和/或消除一个或多个N-糖基化位点。在此类实施方案中,本发明的糖蛋白组合物主要包含类似于哺乳动物的N-聚糖或类似于人的N-聚糖。本发明的低等真核生物宿主细胞可任选地工程化以产生主要具有类似于人的N-聚糖的糖蛋白。在优选的实施方案中,所述宿主细胞产生具有选自以下的主要N-聚糖的糖蛋白:
GalGlcNacMan5GlcNAc2,和NANAGalGlcNacMan5GlcNAc2;
和高甘露糖N-聚糖可选自
如此前所述的在低等真核宿主生物中的N-糖基化那样,本发明可用于重组糖蛋白组合物的商业规模生产。此外,本发明的方法和材料还可用于兽医的应用。
如本文所述,本发明方法和材料的很多特征,为所公开的重组生产的糖蛋白、宿主细胞、核酸、载体和表达方法提供了优于此前已知表达方法的非显而易见的优点。
更显著地,本发明可用于改进重组生产的糖蛋白治疗性产品的技术现状。预期根据本发明生产的糖基化蛋白对人的免疫原性低于从野生型酵母或其他低等真核生物宿主细胞生产的糖蛋白。预期根据本发明生产的重组糖蛋白的糖基化的均匀性比从哺乳动物细胞产生的糖蛋白组合物的糖基化高得多。此外,如上所述,人源化O-聚糖能够通过改进药物代谢动力学性质而提高治疗性蛋白的生物活性,因此,有利于更好地控制体内药物活性。
除非本文另有限定,与本公开相关使用的科学和技术术语和短语应具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。此外,除非上下文需要,否则,单数术语应包括复数形式,且复数术语应包括单数形式。通常,与生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交相关使用的命名,都是本领域公知且常用的那些。除非本文另有指明,本发明的方法和技术通常根据本领域中公知的常规方法,以及本申请说明书全文中引用并讨论的各种通用参考文献以及更专业的参考文献中所述的进行。参见例如,
本文提到的所有公开文件、专利和其他参考文件均通过引用全文并入本文。
除非本文另有指明,以下术语应理解为具有以下含义:
本文使用的术语“O-聚糖”和“O-糖型”可互换地使用,并且是指O-连接的寡糖,例如,通过丝氨酸或苏氨酸残基的羟基基团与肽链连接的聚糖。在真菌细胞中,天然O-糖基化通过在内质网中从长醇单磷酸甘露糖(Dol-P-Man)转移到蛋白的第一甘露糖基残基的连接而发生,并且,其他甘露糖残基可通过在高尔基体中自GDP-Man的转移而连接。高等真核生物细胞,例如人或哺乳动物细胞,通过N-乙酰-半乳糖胺(GalNAc)与丝氨酸或苏氨酸残基的共价连接进行O-糖基化,从而形成粘蛋白型的聚糖。α-肌营养不良蛋白聚糖型聚糖之外,这是上文描述的。
本文使用的术语“N-聚糖”和“N-糖型”可互换地使用,并且是指N-连接的寡糖,例如,通过与多肽的天冬酰胺残基的天冬酰胺-N-乙酰葡糖胺键连接的寡糖。N-连接的糖蛋白包含与蛋白中的天冬酰胺残基的酰胺态氮连接的N-乙酰葡糖胺残基。见于糖蛋白上的主要糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如,N-乙酰-神经氨酸(NANA))。对于N-连接的糖蛋白,糖基团的加工与翻译一起发生在ER腔内并且在高尔基体中继续进行。
N-聚糖具有Man3GlcNAc2 (“Man”是指甘露糖;“Glc”是指葡萄糖;且“NAc”是指N-乙酰基;GlcNAc是指N-乙酰葡糖胺)的共同五糖核心。N-聚糖在分支(天线)的数量方面不同,所述分支包含添加到Man3GlcNAc2 (“Man3”)核心结构(也称作“三甘露糖核心”、“五糖核心”或“少甘露糖核心”)的外周糖(例如,GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)。N-聚糖根据其分支成分(例如,高甘露糖、复杂或杂合)进行分类。“高甘露糖”型N-聚糖具有5个或更多的甘露糖残基。“复杂”型N-聚糖通常具有连接到“三甘露糖核心”的1,3-甘露糖臂的至少一个GlcNAc,和连接到“三甘露糖核心”的1,6-甘露糖臂的至少一个GlcNA。复杂N-聚糖还可具有任选地由唾液酸或衍生物(例如,“NANA”或“NeuAc”,其中“Neu”是指神经氨酸且“Ac”是指乙酰基)修饰的半乳糖(“Gal”)或N-乙酰半乳糖胺(“GalNAc”)残基。复杂N-聚糖还可具有链内取代,其包括“二等分”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)。复杂N-聚糖还可具有在“三甘露糖核心”上的多个天线,通常称作“多天线聚糖”。“杂合”N-聚糖具有在三甘露糖核心的1,3-甘露糖臂末端上的至少一个GlcNAc,和在三甘露糖核心的1,6-甘露糖臂上的0个或多个甘露糖。各种N-聚糖也称作“糖型”。
本文使用的术语“类似于人的O-糖基化”可理解为是指减少或消除了真菌特异性磷酸化和β-连接的甘露糖结构,导致电荷和β-甘露糖结构减少或消除,或存在于糖蛋白上或糖蛋白组合物中的主要O-聚糖种类包含以选自GlcNAc、Gal或Sia的末端残基加帽的聚糖。这样,主要带有类似于人的O-糖基化的重组糖蛋白可如天然产生的糖蛋白那样被人或哺乳动物细胞识别,导致重组糖蛋白的治疗性质的改进。
本文使用的缩写是本领域中的常规用法,例如,参见以上糖的缩写。其他常见的缩写包括“PNGase”或“聚糖酶”或“葡糖苷酶”,其都是指肽N-糖苷酶F (EC
3.2.2.18)。
“分离的”或“基本纯的”核酸或多核苷酸(例如,RNA、DNA、其各种衍生物(例如,cDNA)或混合的聚合物)是基本上与在其天然宿主细胞中天然伴随该天然多核苷酸的其他细胞成分(例如核糖体,聚合酶和与其天然结合的基因组序列)相分离的核酸或多核苷酸。此术语包括(1) 已经从其天然存在环境移出;(2) 没有与所有或部分的多核苷酸结合,其中,在自然中,在所述多核苷酸中发现该“分离的多核苷酸”,(3) 可操作地连接到在自然中没有与其连接的多核苷酸,或(4) 在自然中不存在的核酸或多核苷酸。术语“分离的”或“基本纯的”还可用在关于重组或克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物或通过异源系统生物合成的多核苷酸类似物。
然而,“分离的”不一定需要如此描述的核酸或多核苷酸本身从其天然环境物理地移出。例如,如果将异源序列置于内源核酸序列邻近,从而改变此内源核酸序列的表达,则认为在生物基因组中的所述内源核酸序列是“分离的”。关于这点,异源序列是不天然地邻接于所述内源核酸序列的序列,无论所述异源序列本身是内源的(源自相同的宿主细胞或其后代),还是外源的(源自不同的宿主细胞或其后代)。例如,启动子序列可取代(例如,通过同源重组)在宿主细胞基因组中基因的天然启动子,从而使此基因具有改变的表达模式。这样,此基因将变成“分离的”,因为其至少与一些其天然的旁侧序列相分离。
如果核酸包含在基因组中的对应核酸中没有天然存在的任何修饰,则此核酸也被认为是“分离的”。例如,如果其包含人工(例如通过人为干预)引入的插入、缺失或点突变,则认为该内源编码序列是“分离的”。“分离的核酸”还包括整合到宿主细胞染色体的异源位点的核酸,和作为附加体存在的核酸构建物。此外,在通过重组技术产生时,“分离的核酸”可基本没有其他细胞材料或基本没有培养基,或者在化学合成时,基本没有化学前体或其他化学品。
本文使用的术语“载体”是指能够转运与其相连的另一种核酸的核酸分子。一种载体是“质粒”,其是指可在其中连接其他DNA片段的环形双链DNA环。其他载体包括粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。另一种载体是病毒载体,其中,可将额外的DNA片段连接到病毒基因组中(更详细讨论如下)。某些载体能够在引入其的宿主细胞中自发复制(即,具有在所述宿主细胞中发挥功能的复制起点)。其他载体可在引入到宿主细胞中后整合到所述宿主细胞的基因组中,从而随宿主基因组复制。此外,某些优选的载体能够指导与其可操作地连接的基因表达。此类载体在本文中称作“重组表达载体” (或简称为“表达载体”)。
本文使用的术语“目标序列”或“目标基因”是指核酸序列,该核酸序列通常编码蛋白质,其不是通常在所述宿主细胞中产生的。本文公开的方法允许有效地表达稳定整合到宿主细胞基因组中的一个或多个目标序列或目标基因。目标序列的非限定性实例包括编码具有酶促活性的一种或多种多肽的序列,例如影响宿主中N-聚糖合成的酶,例如甘露糖基转移酶、N-乙酰-葡糖胺基转移酶、UDP-N-乙酰葡糖胺转运蛋白、半乳糖基转移酶、UDP-N-乙酰-半乳糖基转移酶、唾液酸转移酶和岩藻糖基转移酶。如此产生的蛋白称作“重组”蛋白。
术语“衍生自”是指序列或蛋白与衍生出该序列或蛋白的序列或蛋白(“参考序列或蛋白”)相同,或者,与参考序列或蛋白相比,具有对其功能没有负面影响的微小差别。
术语“标记物序列”或“标记物基因”是指能够表达允许对宿主细胞内序列的存在或缺失进行阳性或阴性选择的活性的核酸序列。例如,巴斯德毕赤酵母URA5基因是标记物基因,这是因为可通过包含所述基因的细胞在缺少尿嘧啶的条件下生长的能力而选择该基因的存在。还可以通过包含所述基因的细胞不能在5-FOA的存在下生长而选择除去该基因的存在。标记物序列或基因不一定需要显示阳性和阴性选择性二者。来自巴斯德毕赤酵母的标记物序列或基因的非限定性实例包括ADE1、ARG4、HIS4和URA3。对于抗生素抗性标记物基因,通常使用卡那霉素、新霉素、遗传霉素(或G418)、巴龙霉素和潮霉素抗性基因以允许在这些抗生素的存在下生长。
“可操作地连接的”表达控制序列是指表达控制序列与目标基因相连续以控制所述目标基因的键,以及发挥反式作用或在远处控制目标基因的表达控制序列。
术语“表达控制序列”或“调控序列”可互换地使用,并且在用于本文中时,是指影响与其可操作地连接的编码序列的表达所必需的多核苷酸序列。表达控制序列是控制核酸序列的转录、转录后事件和翻译的序列。表达控制序列包括适合的转录起始、终止、启动子和增强子序列;有效的RNA加工信号,例如剪接和多腺苷酸化信号;稳定胞质mRNA的序列;增强翻译效率的序列(例如,核糖体结合位点);增强蛋白稳定性的序列;和在需要时,增强蛋白分泌的序列。此类控制序列的性质依照宿主生物而不同;在原核生物中,此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括,在最低程度,其存在是表达所必需的所有组分,且还可包括其存在是有利的其他组分,例如前导序列和融合伴侣序列。
本文使用的术语“重组宿主细胞” (“表达宿主细胞”、“表达宿主系统”、“表达系统”或简称为“宿主细胞”)是指已引入重组载体的细胞。应理解,此术语不仅意在指代具体受试者细胞,而且还指代此细胞的后代。由于因突变或环境影响而使随后的世代中可发生某些修饰,因此,此后代实际上可能与亲本细胞不同,但仍包括在本文使用的术语“宿主细胞”的范围之内。重组宿主细胞可以是生长在培养基中的分离细胞或细胞系,或者是存在于活组织或生物中的细胞。
术语“真核生物的”是指有核细胞或生物,且包括昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、动物细胞和低等真核生物细胞。
术语“低等真核生物细胞”包括酵母、真菌、领鞭毛虫、微孢子虫,囊泡虫(例如,腰鞭毛虫(dinoflagellates))、茸鞭生物(stramenopiles;例如,褐藻,原生动物)、红藻(例如,红色藻类)、植物(如绿藻、植物细胞、苔藓)和其它原生生物。酵母和丝状真菌包括但不限于:巴斯德毕赤酵母、芬兰毕赤酵母、喜海藻糖毕赤酵母、Pichia koclamae、膜璞毕赤酵母、微小毕赤酵母(Ogataea minuta , Pichia lindneri)、仙人掌毕赤酵母、耐热毕赤酵母、柳毕赤酵母、Pichia guercuum、皮杰普毕赤酵母、树干毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、毕赤酵母、酿酒酵母、酵母属(Saccharomyces
sp.)、多形汉逊酵母、克鲁维酵母、乳酸克鲁维酵母、白色念珠菌(Candida
albicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma
reesei)、Chrysosporium lucknowense、镰刀菌、禾谷镰孢霉(Fusarium gramineum)、Fusarium venenatum、小立碗藓(Physcomitrella
patens)和粗糙脉孢霉。
本文使用的术语“肽”是指短的多肽,例如,通常长度小于约50个氨基酸且更典型地长度小于约30个氨基酸的多肽。本文使用的该术语包括模拟结构且由此模拟生物功能的类似物和模拟物。
术语“多肽”包括天然存在和非天然存在的蛋白质,及其片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可以是单体或聚合的。此外,多肽可包括多个不同的结构域,每个结构域具有一种或多种不同的活性。
术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是由于其衍生的起源或来源(1) 不与其在天然状态下相伴随的天然结合组分相结合;(2) 以在自然中没有发现的纯度存在,其中,可根据其他细胞材料的存在(例如,没有来自相同物种的其他蛋白)判定纯度;(3) 由来自不同物种的细胞表达;或(4) 不存在于自然中(例如,其为见于自然中的多肽的片段,或其包括未在自然界中发现的氨基酸类似物或衍生物,或标准肽键之外的键)的蛋白或多肽。因此,化学合成的或在不同于其天然来源细胞的细胞系统中合成的多肽可以是从其天然结合组分“分离的”。也可以使用本领域公知的蛋白纯化技术,通过分离,使多肽或蛋白基本不含天然结合的组分。因此,所定义的“分离的”不必需要如此描述的蛋白、多肽、肽或寡肽已从其天然环境物理地移出。
本文使用的术语“主要地”或变式,例如“主要的”或“其是主要的”将依赖于使用的上下文,理解为是指在使用酶处理糖蛋白并通过质谱,例如MALDI-TOF
MS分析释放的聚糖后,具有最高的总O-聚糖或N-聚糖的摩尔百分比(%)的聚糖种类。换而言之,短语“主要地”定义为单个实体,这样,具体的“主要”糖型以高于任何其他单个实体的摩尔百分比存在。例如,如果组合物由40摩尔%的种类A、35摩尔%的种类B和25摩尔%的种类C组成,则所述组合物主要包含种类A。
除非另有定义,本文所用的全部技术和科技术语具有与本发明涉及领域的普通技术人员通常理解相同的含义。下文描述了示例性的方法和材料,尽管与本文所述那些类似或等效的方法和材料也可用于本发明的实施并且对本领域技术人员是显而易见的。本文提到的所有公开和其他参考文献均通过引用全文并入本文。在相冲突的情况下,以本说明书,包括定义为准。所述材料、方法和实施例仅为说明性的,且不用于以任何方式进行限定。
以下实施例说明了关于某些优选实施方案的本发明的操作,且不以任何方式限定说明书和权利要求中所述的本发明的范围。如已阅读本说明书的技术人员将容易地认识到的,可对本文所述方法和材料进行多种改变而不脱离本文描述和要求保护的本发明的范围。
实施例
在以下实施例中,在巴斯德毕赤酵母物种的宿主细胞中表达重组糖蛋白。所述宿主细胞已经过遗传工程化以产生具有类似于人的O-糖基化和类似于人的N-糖基化的糖蛋白。这些实施例展示了关于本发明的具体优选实施方案的发明,且不以任何方式进行限定。
如已阅读本公开和实施例的技术人员将容易地认识到的,可在本领域技术范围内进行多种更改、替换、适应调整和改进而不偏离本说明书和后附权利要求书的范围。因此,所述实施例不是限定性的,并且,通过适当的更改,本文所述的方法和材料可用于在其他低等真核生物中实施本发明。
实施例1
ER
和高尔基体靶向序列的克隆
哺乳动物和酵母的ER和高尔基体中的大部分糖基转移酶是II型膜蛋白(Gleeson, P.A. Targeting of proteins to the Golgi
apparatus. Histochem. Cell. Biol. 109, 517-532 (1998)),其由短氨基末端胞质尾和随后的跨膜结构域[TMD]、短干区域和在ER或高尔基体腔内的羧基末端大催化结构域组成。以Pmt (蛋白O-甘露糖基转移酶;Strahl-Bolsinger等人,Protein
O-mannosylation, Biochim Biophys Acta 1426:297 (1999);Tanner等人,美国专利5,714,377)代表的另一类糖基转移酶包含多个跨膜结构域。因为本发明人希望测试多种靶向序列,所以,扩增了编码酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和乳酸克鲁维酵母的ER和高尔基体驻留膜蛋白的不同长度的膜靶向区域的DNA片段。对于II型膜蛋白,最短的片段(称为‘-s’)仅包含胞质尾和TMD。中等长度的片段(称为‘-m’)还包含部分或全部的干区域。最长的片段(称为‘-l’)包含全部的干区域,并且还包含部分的催化结构域。关于来自II型膜蛋白的靶向结构域(TD)的详细描述可见于Gerngross等人,US 7,449,308 (例如,表5)和Choi等人,2003 PNAS 100:5022。对于其他整合膜蛋白,本发明人采用了最短的跨膜区(称为‘-s’),或者包含多个跨膜结构域的区域(称为‘-m’)。
在本实施例中,所使用的ER靶向结构域是GLS1编码的酿酒酵母α-葡萄糖苷酶I、MNS1编码的酿酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶、在ER和高尔基体之间循环的酿酒酵母核苷酸交换因子SEC12、来自编码完整ER跨膜结构域的酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母PMT 1 、 2 、 3 、 4 、 5和6的片段;和来自酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母的BOS1、BET1和SEC22编码的SNARE蛋白的结构域。
对于早高尔基体或顺式高尔基体的靶向结构域,本发明人选择了巴斯德毕赤酵母Och1p的氨基末端片段,和组成酿酒酵母甘露聚糖聚合酶M-Pol I和M-Pol
II的蛋白(即,Mnn9p、Van1p、Anp1p、Hoc1p、Mnn10p和Mnn11p)的氨基末端片段。中间高尔基体的靶向信号衍生自酿酒酵母Kre2p、Ktr1p、Mnn2p、Mnn5p和Yur1p,衍生自乳酸克鲁维酵母Gnt1p,且衍生自与Ktr1p、Ktr3p和Kre2p具有同源性的巴斯德毕赤酵母蛋白(结果未公开)。
对于晚期高尔基体的靶向结构域,本发明人引入了酿酒酵母Mnn1p和Mnn6p的氨基末端区域。表1中给出了靶向结构域的完整列表,并且提供了DNA和蛋白序列(SEQ IDs)。
表1:与POMGnT1融合的ER/高尔基体前导序列
ER/高尔基体跨膜结构域(前导序列)的序列
DNA之后为氨基酸序列。
实施例2
靶向结构域
("TD")
文库的构建
使用ExTaq (Takara)和作为模板的代表性真菌基因组DNA通过PCR扩增所有TD,克隆至质粒pCR2.1
(Invitrogen)并测序。5’-寡聚物引入NotI位点和紧邻天然ATG上游的CACC Kozak共有序列。在前导序列衍生自PpSEC12或ScSEC12的情况下,TD的首个氨基酸的密码子变为ATG。3’-寡聚物引入AscI位点和额外的C,这产生了编码GlyArgAla的融合接头。在扩增包含靶向结构域的质粒后,使用50单位的AscI消化36 μg的各个质粒4小时。随后,使用乙醇沉淀线性化的DNA,使用60单位NotI消化15小时,并通过连续2轮的琼脂糖凝胶分离纯化所得的插入物。对于范围在87至219个核苷酸的片段,本发明人使用2%的琼脂糖;对于240至426个核苷酸的片段,使用1.5%的琼脂糖;和对于435至1098个核苷酸的片段,使用1.0%的琼脂糖。将1.2 皮摩尔的各片段稀释至100 μl,安置在96孔板中并在-80℃贮存。
实施例3
POMGnT1
表达载体的生成
使用取自下文列出的GenBank保藏物的氨基酸序列,通过GeneArt
AG (德国雷根斯堡)合成编码人、小鼠、鸡、鱼和蛙POMGnT1蛋白的催化结构域的核酸(根据巴斯德毕赤酵母进行密码子优化)。人、小鼠、鸡、斑马鱼和爪蟾(Xenopus) POMGnT1的非密码子优化序列公开在现有技术中;参见,例如Q8WZA1 (人)、NP_080927 (小鼠)、XP_426653 (鸡)、NP_001036152 (斑马鱼)、和AAH84747 (爪蟾)。提供了编码POMGnT1的C-末端催化结构域的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID NOs: 109-118)。所述序列缺少天然N-末端信号序列和跨膜锚定区。对核酸序列进行密码子优化以用于在巴斯德毕赤酵母中的表达。在所有情况下,在5'末端添加符合读码框架(in-frame)的Asc1位点,并且在紧邻终止密码子的3'添加Pac1位点。
实施例4
pGLY579
和
pGLY4863
的生成
接受了TD-POMGnT1融合物的载体是pGLY579
(将TD-POMGnT1融合物置于巴斯德毕赤酵母GAP启动子控制之下(Cereghino和Cregg,
FEMS Microbiol Rev. 24:45-66 (2000)),和pGLY4863
(在巴斯德毕赤酵母AOX1启动子控制之下(Cereghino和Cregg, FEMS Microbiol Rev. 24:45-66 (2000))。pGLY579是双交叉整合载体,其包含PpHIS3 ORF和分别地,位于紧邻PpHIS3 ORF的3'的核苷酸。通过使用引物PpHIS3 1 (SEQ ID
NO:119)和PpHIS3 2 (SEQ ID NO: 120)的PCR生成PpHIS3 ORF
(5'臂);显示了所得的DNA
(SEQ ID NO: 121)。通过使用引物PpHIS3 3 (SEQ ID
NO: 122)和PpHIS3 4 (SEQ ID NO: 123)的PCR生成PpHIS3 3'片段(3'臂);显示了所得的DNA (SEQ ID NO: 124)。模板是来自野生型菌株NRRL-Y11430
(来自Northern Regional Research Center,
Peoria, IL)的巴斯德毕赤酵母基因组DNA。首先,将PCR片段克隆到pCR2.1 (Invitrogen)中并测序。随后,使用酶Fse1和SacI (用于5'臂),和SwaI和SalI (用于3'臂)将PpHIS3整合臂连续地亚克隆到pGLY566中,从而生成pGLY579;参见,例如WO 07/136865。位于紧邻PpHIS3
5'臂下游的是包含PpALG3转录终止子(TT)序列的DNA片段,其通过使用引物PpALG3TT-f (SEQ
ID NO: 125)和PpALG3TT-rev (SEQ ID NO: 126)而产生如下所示的DNA片段(SEQ ID NO: 127)的PCR进行克隆。使用旁侧的Fse1和Pme1限制性位点亚克隆PpALG3TT。位于pGLY579中的PpHIS3片段之间的是URA5标记物(Nett和Gerngross, Yeast 20:1279 (2003)),和由被Not1和Pac1限制性位点分隔的PpGAP启动子和ScCYC1转录终止子组成的表达盒。显示了PpGAP启动子序列(SEQ
ID NO: 128)和ScCYC1转录终止子序列(SEQ
ID NO: 129)。使用XhoI和Not1位点将PpGAP启动子替换为甲醇诱导型PpAOX1启动子,从而生成pGLY4863。显示了PpAOX1启动子序列(SEQ
ID NO: 130)。
实施例5
TD-POMGnT1
文库的生成
TD-POMGnT1表达/整合载体的构建如下所述实施。在使用AscI和PacI消化后,从GeneArt载体分离POMGnT1催化结构域,并克隆到整合质粒pGLY579 (用于GAPp-驱动的表达)和pGLY4863 (用于AOX1p-驱动的表达)。随后,将高通量形式的琼脂糖凝胶纯化的靶向结构域(TD)片段以符合读码框架的方式连接到这些质粒,以产生融合物文库。对30 μg的每种含POMGnT1催化结构域的载体,使用10单位的AscI消化过夜。次日上午,添加另外的10单位,并将培育延续另外1小时。使用乙醇沉淀线性化的DNA,并与50单位的NotI一起培育4小时。随后,添加20单位的小牛肠碱性磷酸酶,并将培育延续另外1小时。通过琼脂糖凝胶提取进行纯化后,将DNA稀释至3 nM,并将2.5 μl上样至96孔PCR板。随后,添加2.5 μl 12 nM分离的靶向结构域NotI/AscI片段(见上)的溶液。在添加5 μl 2x连接缓冲液和0.5 μl Quick连接酶(NEB)后,在室温("RT")下进行连接5分钟,并将2 μl连接混合物添加到根据Hanahan等的方法(Methods Enzymol 204: 63-113 (1991))制成感受态并安置于96孔板的50 μl大肠杆菌(E. coli)菌株DH5α中。将此混合物在冰上培育20分钟,并在42℃热休克1分钟,向96孔板中的每个孔添加200 μl具有分解代谢物抑制的Super Optimal液体培养基("SOC"),并使细胞在37℃恢复1小时。随后,将各转化混合物200 μl平铺到单LB Amp平板并培育过夜。本发明人通常获得10至1000个菌落/平板,与此相比,在无插入物的对照上获得0至10个菌落。为了评估连接反应是否产生了符合读码框架的融合物,分离质粒DNA并进行AscI限制性消化。这是基于以下事实,即只有重新产生AscI位点,才出现真正符合读码框架的融合物。证实在所有情况中,超过99%确实如此。图11中显示了TD-POMGnT1表达/整合载体pGLY3136的实例。
在转化到酵母菌株之前,使用在HIS3序列旁侧的位点进行切割的SfiI消化质粒,这样,释放出包含启动子-TD-POMGnT1-转录终止子和旁侧为HIS3 5'和3'整合序列的URA5标记物的DNA片段。
实施例6
菌株
GFI 2.0
的生成
通过电穿孔(方法如下),将TD-POMGnT1文库转入菌株YGLY7877
(GFI 2.0,图1),该菌株衍生自菌株yGLY14
(och1∆::lacZ,
bmt2∆::lacZ/KlMNN2-2,
mnn4b∆::lacZ/
MmSLC35A3, pno1∆mnn4a∆::lacZ),并使用此前所述的方法构建(Nett和Gerngross,
Yeast 20:1279 (2003);Choi等人,PNAS USA 100:5022 (2003);Hamilton等人,Science 301:1244 (2003);和WO
07/136752)。简要而言,缺失野生型菌株NRRL-Y11430中编码磷酸甘露糖转移酶Pno1、Mnn4a和Mnn4b(Li等人,Nat Biotechnol.
24:210-5 (2006))以及β-甘露糖转移酶BMT2 (Mille等人,J
Biol Chem. 283:9724-36 (2008))的基因,以产生YGLY-14 (菌株GFI 1.0,图1)。为了使本发明的糖工程化方法的下游步骤数量最少,在敲除载体中包含2个UDP-GlcNAc转运蛋白。将乳酸克鲁维酵母UDP-GlcNAc转运蛋白插入到BMT2缺失载体,并将小鼠UDP-GlcNAc转运蛋白插入到MNN4B缺失载体。这样可以将UDP-GlcNAc转运蛋白基因稳定地整合到基因缺失的位点。在初始步骤中,使用5-氟乳清酸(5-FOA)反向选择YGLY14 (Nett和Gerngross, Yeast 20:1279 (2003))以生成尿嘧啶-营养缺陷型菌株YGLY-16,其为里氏木霉α1,2-甘露糖苷酶(Bobrowicz等人,WO 2007/061631)表达载体pGLY1896的受体。再次使用5-FOA反向选择所得菌株YGLY6361,从而生成尿嘧啶-营养缺陷型YGLY2004。随后,使用可回收的URA5标记物(参见Nett和Gerngross, Yeast
20:1279 (2003)缺失编码β甘露糖转移酶BMT1,3,4的基因(Mille等人,J Biol Chem.
283:9724-36 (2008)),从而生成YGLY7827 (GFI
2.0,图1)。随后,使用编码TNFRII-Fc受体蛋白的表达载体pGLY3465转化YGLY7827 (方法如下),从而产生YGLY7877。对于以上转化和还有使用TD-POMGnT1文库的那些转化,在缺少尿嘧啶的极限培养基上选择转化体,以选择URA5标记物的引入。
实施例7
TNFRII-Fc
表达载体
pGLY3465
的生成
表达质粒载体pGLY3465包含在甲醇诱导型巴斯德毕赤酵母AOX1启动子控制下的表达盒,其编码TNFR-IgG1融合蛋白。通过GeneArt,使用5' PvuII和3' FseI克隆位点对TNFR-IgG1片段进行密码子优化(SEQ ID NO: 131),且将GeneArt载体命名为pGLY3431。通过PCR,将来自pGLY3431的TNFR结构域与来自pGLY1477 (也由GeneArt合成)的可选IgG1 Fc结构域融合,从而得到DNA序列(SEQ ID NO: 132)。具体地,使用引物SEQ
ID NOs: 133 & 134扩增来自pGLY3431的TNFR结构域,并使用引物SEQ ID NOs: 135
& 136扩增来自pGLY1477的IgG1
Fc结构域。随后,通过使用引物SEQ ID NOs: 133 & 136的PCR将这两个片段融合在一起。将TNFR-IgG1在N-末端融合到编码人血清白蛋白("HSA")前信号肽的DNA序列(SEQ ID NO: 137)。使用购自Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)的寡核苷酸生产编码HAS信号序列(ss)的DNA。TNFR-IgG1与HSAss的融合产生了具有独特的5' EcoR1和3' Fse1位点的DNA片段(SEQ ID NO: 138,编码蛋白SEQ
ID NO: 139)。使用5' EcoR1和3' Fse1独特位点,将编码HSAss-TNFR-IgG1融合蛋白的核酸片段亚克隆到表达载体pGLY2198中,从而形成质粒pGLY3465,其中,表达载体pGLY2198包含巴斯德毕赤酵母TRP2靶向核酸和博莱霉素抗性标记物,并生成在AOX1启动子和酿酒酵母CYC终止子控制下的表达盒。在将pGLY3465转化入巴斯德毕赤酵母后,通过甲醇诱导产生具有蛋白序列SEQ
ID NO: 140的TNFR-IgG1的分泌。在包含博莱霉素的丰富培养基上选择转化体。
实施例8
酵母转化
所有的酵母转化如下。巴斯德毕赤酵母菌株在50 mL YPD培养基(酵母提取物(1%)、蛋白胨(2%)、葡萄糖(2%))中生长过夜,至约0.2至6之间的光密度("OD")。在冰上培育30分钟后,通过2500-3000 rpm离心5分钟沉淀细胞。弃去培养基,并使用冰冷的无菌1M山梨糖醇将细胞清洗3次,随后,重悬在0.5 ml冰冷的无菌1M山梨糖醇中。将10 μL线性化的DNA (5-20 μg)与100 μL细胞悬液在电穿孔小杯中组合,并在冰上培育5分钟。在Bio-Rad
GenePulser Xcell中根据预设的巴斯德毕赤酵母方案(2 kV,25 μF,200 Ω)进行电穿孔,随后立即添加1 mL YPDS恢复培养基(YPD培养基加1 M山梨糖醇)。允许转化细胞在室温(26℃)恢复4小时至过夜,然后将细胞平铺到选择培养基上。
实施例9
阳性转化体的分离
使用匹配URA5 (SEQ ID NO:
141)、PpALG3TT (SEQ ID NO:
142)、和PpHIS3序列5'
(SEQ ID NO: 143)和3' (SEQ ID
NO:144)至整合臂的PCR引物,通过PCR确认TD-POMGnT1融合物的双交叉整合。PCR条件为:98℃ 2分钟的1个循环;98℃ 10秒,50℃ 30秒和72℃ 1分钟的30个循环;和随后的72℃ 7分钟的1个循环。通过琼脂糖凝胶电泳根据标准方法分析PCR产物。
实施例10
通过凝集素
GS-II
染色筛选
TD-POMGnT1
融合物
使用碱性磷酸酶缀合的GS-II凝集素(来自Griffonia simplicifolia,EY
Labs;其结合聚糖上的末端GlcNAc残基)染色,在96孔模式中筛选TD-POMGnT1融合物。将TD-POMGnT1文库在菌株YGLY
7877 (GFI 2.0)中的转化体在0.6mL BMGY培养基(1%酵母提取物、2%蛋白胨、100 mM磷酸钾缓冲剂pH 6.0、1.34% 酵母氮源、4 x 10-5%生物素,和1%甘油)及强振荡下培养48小时,沉淀并在BMMY培养基(与BMGY相同,除了甘油替换为1%甲醇)中清洗一次,随后在0.2 mL BMMY中生长48小时。随后,通过离心收集上清,并通过ELISA形式的GS-II染色,检测TNFRII-Fc受体蛋白上的末端GlcNAc水平。
实施例11
96-
孔凝集素染色测试
使用100μl/孔的在包被缓冲剂(Virolabs: RE-COAT-7-100 pH7.2)中的1μg/ml单克隆抗体(抗-hs TNF RII,来自R& D Systems: MAB726)包被96孔板。在室温下培育1小时后,使用每孔100μl的清洗缓冲剂(Virolabs:
RE-WASH-T-100)将板清洗3次。使用每孔100μl的1x Tris ELISA稀释剂/封闭缓冲剂(Virolabs:
RE-DILU-T-100)封闭孔,随后在室温下培育1小时,并且,随后如上文所述进行清洗。向每个孔添加100μl以1:10稀释的样品,随后在室温下培育1小时,随后如上文所述进行清洗。以1:1000的稀释度,在1x Tris ELISA稀释剂/封闭缓冲剂中制备GS-II凝集素(来自Griffonia Simplicifolia ,EY Laboratories Inc., LA-2402)溶液。向板的每个孔添加100μl的此凝集素溶液,随后,在室温下培育1小时。如上文所述清洗板。向每个孔添加100μl的SuperPhos™ 4-MUP溶液(Virolabs:
X-PHOS-100),随后在室温下避光培育45分钟。在带有Magellan软件的Tecan (瑞士Mannedorf)
Genius Pro板读数器上,使用360nm激发波长和450nm发射波长读取板。
得自于其中由PpAOX1启动子驱动TD-POMGnT1表达的文库的数据不一定与具有PpGAP启动子驱动表达的文库的数据相关联。给出强GS-II结合的一些AOX1p驱动的TD-POMGnT1融合物在使用PpGAP启动子时给出了微弱结合。此外,大多数活性TD-POMGnT1融合物,在与PpGAP启动子连接时,对细胞具有毒性和/或抑制蛋白分泌。这些包括与ScMNN2-s和-m、ScPMT5-m和PpPMT1-m融合的人、小鼠或蛙POMGnT1。使用其他酶获得了类似的发现,例如MNS1
[Choi等人,PNAS 100:5022 (2003)]。得益于本公开,技术人员能够评估用于所需结果的最佳组合,并如本文所述采用该最佳组合。如本申请所述,待评估的结果是O-连接的GlcNAc的水平(如通过凝集素GS-II染色测定)、具体目标蛋白的表达水平和/或生产细胞的细胞生长。在糖型为O-连接的GlcNAc-Gal或O-连接的GlcNAc-Gal-Sia的情况下,应分别使用ECA或SNA1代替上述基于凝集素测试中的凝集素GS-II。
本发明人使用了由AOX1p-TD-POMGnT1文库获得的数据进行初步分析。本发明人测定了鸡POMGnT1催化结构域是失活的,且斑马鱼POMGnT1显示了非常微弱的活性。表2中显示了AOXp-TD-POMGnT1文库筛选的结果。数据表明,大多数活性POMGnT1催化结构域来自人、小鼠和蛙,且活性最高的TD是ScMNS1-s、ScMNN9-s、PpKre2-s、KlGnt1-s、ScMNN2-s、ScMNN2-m、ScMNN5-s、ScMNN6-s、ScPMT5-m、PpPMT1-m和PpBET1-s。
表2:POMGnT1-前导序列融合物的凝集素染色
实施例12
通过
HPAEC-PAD
的
O-
聚糖分析
本发明人随后分析了表达活性最高的TD-POMGnT1融合物的GFI SO-1菌株(GFI 2.0菌株还表达POMGnT1;参见,例如WO
07/136752)中的O-聚糖。显示强GS-II染色的菌株在包含100mL BMGY的摇瓶中生长48小时,沉淀,并使用BMMY清洗一次,随后在50 mL BMMY中生长额外的48小时,随后通过离心收获。使用蛋白A色谱(Li等,Nat. Biotechnol.
24(2):210-5 (2006))从澄清的上清纯化分泌的TNFRII-Fc,并且,通过碱性消除(β-消除)从蛋白释放并分离O-聚糖(Harvey, Mass Spectrometry Reviews 18: 349- 451 (1999);Stadheim等人,Nat. Protoc.
3:1026-31 (2006))。此方法还将释放的O-聚糖(寡聚甘露糖,或甘露糖)的新形成的还原性末端降低为甘露醇。因此,甘露醇基团充当各种O-聚糖的独特指示剂。β-消除需要包含在100 μL体积的PBS缓冲剂中的0.5 纳摩尔或更多的蛋白。使用25 μL碱性硼氢化物试剂处理样品并在50℃培育16小时。添加大约20 μL阿拉伯糖醇内标,随后添加10 μL冰醋酸。随后,将样品离心通过包含SEPABEADS和AG
50W-X8树脂的Millipore滤器,并用水清洗。将样品,包括清洗物(wash),转移到塑料自动取样管,并在离心蒸发器中蒸发至干。向所述样品添加150 μL 1% AcOH/MeOH,并将所述样品在离心蒸发器中蒸发至干。此最后步骤再重复5次。添加200 μL水,并依照制造商(Dionex, Sunnyvale, CA),通过配有脉冲电化学检测-HPLC的高pH阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)分析100 μL样品。
结果:来自带有PpGAPp驱动的ScMNN6s-小鼠POMGnT1融合物的菌株YGLY7879的TNFRII-Fc聚糖的HPAEC-PAD描绘图显示在图2,B部分。对照是缺少POMGnT1的GFI 2.0菌株YGLY6428 (A部分)。结果显示了YGLY7879中与阿拉伯糖醇标准品共迁移的POMGnT1-依赖性O-聚糖。向样品添加阿拉伯糖醇的浓度在缺少POMGnT1的菌株中通常给出~100纳库仑(nC)的最大读数,但在具有POMGnT1的GFI
SO-1菌株给出高至450nC的读数。图3中显示了在没有进行处理(A部分)或进行除去末端GlcNAc残基的氨基己糖苷酶处理(B部分)的情况下,来自菌株YGLY7879的聚糖的HPAEC-PAD描绘图。氨基己糖苷酶(β-N-乙酰-氨基己糖苷酶,NE Biolabs, Ipswich, MA)处理如制造商所述。简要而言,将通过β-消除释放的O-聚糖缓冲剂交换到50mM柠檬酸钠,pH 6.0,并在37℃培育过夜。所述处理导致推定的阿拉伯糖醇+Man-GlcNAc峰降低,在T=23.909出现游离GlcNAc的新峰,以及甘露醇(man1)峰的升高。这证实了在包含POMGnT1的菌株中,与阿拉伯糖醇共迁移的糖是Man-GlcNAc。
图4和图5显示了有效地将半乳糖转移到O-连接的Man-GlcNAc的菌株的生成。使用与聚糖上的末端半乳糖残基结合的碱性磷酸缀合的ECA凝集素(来自鸡冠刺桐(Erythina cristagalli),EY Labs LA-5901)染色,在96孔模式中筛选活性最高的TD-POMGnT1融合物。此筛选完全按照对凝集素GS-II所述进行,除了将TD-POMGnT1载体转化入包含半乳糖合成和转移所需的酶的菌株YGLY7875。YGLY7875通过按照如上所述使用TNFRII-Fc表达载体pGLY3465转化YGLY5858而构建。YGLY5858的生成如对YGLY1703所述(参见,例如WO 07/136752),除了其为如上改变的尿嘧啶营养缺陷型(参见Bobrowicz等人,2004. Glycobiology14:757-66;Li等人,2006 Nat.
Biotech 24:210-215;Gerngross等人,WO 04/074499和WO
07/136752)。通过凝集素筛选鉴定的活性最高的菌株之一是YGLY7880,其具有GAPp-ScMNN2s-人POMGnT1融合物。将YGLY7880在摇瓶中培养,并对上清进行如图2和图3所述的蛋白A纯化。图4显示了来自没有POMGnT1的GFI 2.0菌株YGLY6428 (A部分)和GFI SO-2菌株YGLY7880 (+ POMGnT1) (B部分)的TNFRII-Fc O-聚糖的HPAEC-PAD描绘图。结果表明,YGLY7880中迁移为~T=21.38的新POMGnT1-依赖性O-聚糖是Man-GlcNAc-Gal。图5显示了未经处理的(A部分),和使用半乳糖苷酶处理以除去末端半乳糖,且使用氨基己糖苷酶以除去末端GlcNAc (B部分)的来自GFI SO-2菌株YGLY7880的TNFRII-Fc O-聚糖的HPAEC-PAD描绘图。氨基己糖苷酶(如上所述)和半乳糖苷酶(β1,4-半乳糖苷酶,Calbiochem/EMD
Biosciences, La Jolla, CA)处理如上文对氨基己糖苷酶所述。此处理导致推定的Man-GlcNAc-Gal峰消失,在T=23.909出现游离GlcNAc的峰,甘露醇(man1)峰的升高,且在T=38.35出现半乳糖峰。这些结果表明,GFI 5.0菌株中迁移为~T=21.38的POMGnT1-依赖性O-聚糖是Man-GlcNAc-Gal。
图6显示了GFI SO-3菌株YGLY8750中的TNFRII-Fc O-聚糖,所述菌株是使用具有产生唾液酸化聚糖所需的5个基因(图1)的载体pGLY1758转化的GFI SO-2菌株YGLY7880
(Hamilton等人,Science 213:1441 (2006))。所示为未经处理的(A部分),或使用神经氨酸酶处理以除去末端唾液酸,使用半乳糖苷酶处理以除去末端半乳糖,且使用氨基己糖苷酶以除去末端GlcNAc
(B部分)的来自YGLY8750的TNFRII-Fc O-聚糖的HPAEC-PAD描绘图。氨基己糖苷酶(如上所述)、半乳糖苷酶(如上所述)和神经氨酸酶(NE Biolabs, Ipswich, MA)处理如上文对氨基己糖苷酶的描述。添加次优剂量的酶以产生所有可能的种类。此处理导致T=45.8的推定的Man-GlcNAc-Gal-唾液酸峰下降,T=21.7的Man-GlcNAc-Gal峰下降,在T=23.5出现游离GlcNAc的峰,甘露醇(man1)峰的升高,且在T=37.9出现半乳糖峰。这些结果表明,GFI SO-3菌株中迁移为~T=45.8的POMGnT1-依赖性O-聚糖是Man-GlcNAc-Gal-唾液酸。
图7显示了使用碱性磷酸酶缀合的凝集素SNA-1使TNFRII-Fc上的高水平末端唾液酸可视化的Western印迹。所示为显示样品1-12中的TNFRII-Fc蛋白水平的考马斯染色SDS-PAGE凝胶(下图),和使用碱性磷酸酶缀合的凝集素SNA-1进行检测的Western印迹(上图)。凝集素SNA-1结合末端唾液酸,并由此将检测带有唾液酸合成和转移的基因的菌株GFI SO-3中的O-聚糖上的末端唾液酸。结果表明,凝集素强力结合来自GFI
SO-3菌株的样品1-9的TNFRII-Fc,但没有结合来自缺失转移唾液酸能力的GFI SO-2菌株的样品10-12的TNFRII-Fc。
实施例13
使用碱性磷酸酶缀合的凝集素
SNA-1
的
Western
印迹
如上文所述,将使用唾液酸化载体pGLY1758转化的YGLY7880的3个分离菌落在BMGY中生长并在BMMY中诱导。根据Laemmli, U. K. (1970) Nature 227, 680-685所述,通过还原性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离2、6和10μL上清,并且随后电印迹到硝酸纤维素膜上(Schleicher
& Schuell,现Whatman, Inc., Florham Park, NJ)。在室温下,将所述膜在TBS (0.05 M Tris-HCl pH 7.5,0.15 M NaCl)中稀释的封闭溶液(Roche
DIG聚糖区分试剂盒1-210-238)中培育30分钟,随后在凝集素结合缓冲剂(50 mM Tris-HCl pH 7.5,0.15
M NaCl,0.1 mM CaCl2,0.1% Tween-20)中清洗3次,每次5分钟。将20 μg/ml的凝集素SNA-1 (来自西洋接骨木(Sambucus Nigra),EY
Labs. LA-6802)在凝集素结合缓冲剂(总计2.5mL体积)中稀释,并在室温下添加到所述膜,处理1小时。在凝集素结合缓冲剂中清洗3次(每次10分钟)后,添加在10 mM Tris pH 9.5中的NBT/BCIP
(Roche DIG聚糖区分试剂盒1-210-238),直到可以见到条带。
图8显示了优化O-唾液酸化聚糖的生成的努力结果。本发明人将本发明活性最高的TD-POMGnT1菌株组转化入包含唾液酸化所需的所有基因但缺少POMGnT1的TNFRII-Fc表达菌株YGLY11731。此外,YGLY11731包含编码唾液酸化所需的5个基因的每一个的额外拷贝的质粒(Hamilton等人,Science
213:1441 (2006))。在如上所述的96-孔凝集素染色测试中,使用凝集素SNA-1筛选POMGnT1转化体。选择产生最强SNA-1染色的菌落进行摇瓶表达研究。培养和甲醇诱导如上所述,除了在如上所述的诱导期(Bobrowicz等人,WO2007/061631)期间添加蛋白O-甘露糖基转移酶(Pmt)的合成抑制物(Orchard等,EP 1 313 471 B1)。简要而言,在诱导期开始时,与BMMY一起添加抑制剂PMTi-3 (Bobrowicz等人,WO2007/061631)至2 μM的终浓度。Pmt抑制剂减少了甘露糖至丝氨酸和苏氨酸的转移,并由此降低了O-连接的甘露糖化的整体水平。对于TNFRII-Fc,Pmt抑制剂将具有O-甘露糖聚糖的丝氨酸和苏氨酸的数量从每个蛋白分子~80个减少至~20个。因此,此药物显著降低了O-连接聚糖的整体水平。重要的是,这导致与较为不需要的O-Man-Man (O-Man2)或无唾液酸化O-man-GlcNAc或O-Man-GlcNAc-Gal相比,所需的唾液酸化O-聚糖的更高的百分比。图8显示了来自优化的GFI SO-3菌株YGLY11603
(GAPp-ScMNN6s-小鼠POMGnT1)的TNFRII-Fc
O-聚糖的HPAEC-PAD描绘图(A部分)。B部分列出了根据制造商(Dionex, Sunnyvale, CA)的描述,由HPAEC-PAD描绘图定量的各主要O-聚糖种类的百分比。结果显示主要O-聚糖是Man-GlcNAc-Gal-唾液酸,其构成56%的TNFRII-Fc O-聚糖。
实施例14
总唾液酸测定
本发明人随后使用了检测糖蛋白上总唾液酸含量(表示为唾液酸摩尔数/蛋白摩尔数的比例)的测试。通过酸水解从糖蛋白样品释放唾液酸,并通过使用以下方法的HPAEC-PAD进行分析:将10-15 μg蛋白样品缓冲剂交换到磷酸盐缓冲盐水中。添加400 μL
0.1M盐酸,并将样品在80℃加热1小时。在SpeedVac中干燥后,使用500 μL水复溶样品。随后,对100 μL进行HPAEC-PAD分析。比较来自GFI SO-3菌株YGLY11603的TNFRII-Fc蛋白的总唾液酸含量与来自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的TNFRII-Fc的总唾液酸含量,以及来自缺少POMGnT1的亲本株YGLY11731的TNFRII-Fc的总唾液酸含量。TNFRII-Fc的总唾液酸来自N-和O-聚糖二者,并且,因此CHO-产生的和菌株YGLY11603的TNFRII-Fc唾液酸来自N-和O-聚糖二者,而来自菌株YGLY11731的TNFRII-Fc唾液酸则完全来自N-聚糖。TNFRII-Fc每个二聚体具有6个潜在的N-聚糖位点。结果显示在表3中。这些数据表明产生的唾液酸O-聚糖水平与CHO细胞中产生的大致相似。
表3:总唾液酸含量
样品 | 唾液酸 (唾液酸摩尔数/蛋白摩尔数) |
来自CHO的MK-TNFR | 29 |
来自巴斯德毕赤酵母YGLY11731的MK-TNFR | 4 |
来自巴斯德毕赤酵母YGLY11603的MK-TNFR | 22 |
实施例15
修饰的糖蛋白的生物利用度
&
血清半衰期
TNFRII-Fc来自菌株YGLY14252。YGLY14252的构建如上文对YGLY11603所述,除了对其选择更高的TNFRII-Fc表达。这通过使用如上所述的96-孔凝集素SNA-1染色测试广泛筛选菌株而完成。通过在50mL摇瓶中生长之后的HPAEC-PAD分析进一步筛选由强SNA-1染色鉴定的菌株。基于根据如上所述测量而具有最高的唾液酸化O-聚糖百分比和最高的总唾液酸水平,而选择YGLY14252。通过羟磷灰石色谱分离来自YGLY14252的部分纯化的TNFRII-Fc。收集清洗液和结合部分(fractions),并测定以唾液酸摩尔数/TNFRII-Fc摩尔数计的总唾液酸含量("TSA")。对于合并的清洗液部分(5-A型),TSA=21;而对于洗脱的结合部分(5-C型),TSA=11。此外,将5-A型与5-C型等比例地混合,以产生具有中间的TSA=16的5-B型。
对于生物利用度的研究,对B6小鼠进行糖变体的皮下给药。在48小时后收集血清样品。使用基于Gyro的免疫测试法(抗-TNFRII捕获和抗-hFc检测)测定TNFRII-Fc浓度。图9说明了糖蛋白的O-唾液酸化提高如何导致在B6小鼠中的生物利用度提高。所示为在皮下施用不同剂量的TNFRII-Fc后48小时,小鼠的血清浓度。总唾液酸含量(mol/mol)如下:5-A型:21;5-B型:16;和5-C型:11。
对于血清半衰期的研究,对大鼠进行糖变体的皮下或静脉内给药。在注射后的时间间隔收集血清样品。使用基于Gyro的免疫测试法(抗-TNFRII捕获和抗-hFc检测)测定TNFRII-Fc浓度。图10A-B说明了糖蛋白的O-唾液酸化提高如何导致大鼠中的血清半衰期延长。所示为以1
mg/kg在静脉内("IV") [图10A]和皮下("SC")
[图10B]施用后的血清时间-浓度曲线。总唾液酸含量(mol/mol)如下:5-A型:21;5-B型:16;和5-C型:11。
通过羟磷灰石(HA)色谱分离TNFRII-Fc而产生A-C型。A型代表使用清洗液从HA柱洗脱的部分,而C型代表结合的部分。B型是A型与C型1:1的混合物。
Claims (20)
1.在低等真核生物宿主细胞中生产具有O-Man-GlcNAc;O-Man-GlcNAc-Gal;或O-Man-GlcNAc-Gal-Sia作为其主要O-聚糖的重组糖蛋白的方法,所述方法包括:
(a) 提供低等真核生物宿主细胞,其
(i) 不表达功能性的β-甘露糖基转移酶Bmt 1、2、3和4,和磷酸-甘露糖转移酶Mnn4a、Mnn4b和Pno1;和
(ii) 表达功能性蛋白O-连接的甘露糖β-1,2-N-连接的乙酰葡糖胺基转移酶1 ("POMGnT1")、UDP-GlcNAc转运蛋白和α-1,2-甘露糖苷酶;
(b) 使用编码目标糖蛋白的核酸转染或转化所述低等真核生物宿主细胞;和
(c) 培养所述宿主细胞,从而产生所述重组糖蛋白。
2.权利要求1所述的方法,其中步骤(a)的所述细胞进一步不表达Ktr1。
3.权利要求1所述的方法,其中步骤(a)(ii)的所述酶进一步包括下列酶组合中的一种:
(a) β1,4GalT、UDP-Gal转运蛋白和UDP-Gal差向异构酶;
(b) β1,4GalT、UDP-Gal转运蛋白、UDP-Gal差向异构酶、α2,6SialT、GNE、SPS、SPP、CSS和CST;或
(c) β1,4GalT、UDP-Gal转运蛋白、UDP-Gal差向异构酶、α2,3SialT、GNE、SPS、SPP、CSS和CST。
4.权利要求1所述的方法,其中步骤(a)(ii)的所述UDP-GlcNAc转运蛋白是乳酸克鲁维酵母UDP-GlcNAc转运蛋白或鼠UDP-GlcNAc转运蛋白。
5.权利要求1所述的方法,其中所述α-1,2-甘露糖苷酶衍生自里氏木霉(Trichoderma
reesei)、酵母(Saccharomyces
sp.)、球孢子菌(Coccidiodes
sp.)或曲霉(Aspergillus
sp.)。
6.权利要求1所述的方法,其中步骤(a)(ii)的所述POMGnT1酶包含SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 112或SEQ ID NO: 118。
7.权利要求1所述的方法,其中来自步骤(a)(ii)的所述POMGnT1酶衍生自人、鼠或蛙POMGnT1序列。
8.权利要求1所述的方法,其中编码来自步骤(a)(ii)的所述POMGnT1酶的核酸经过密码子优化用于在所述低等真核生物宿主细胞中的表达。
9.权利要求1所述的方法,其中步骤(a)(ii)的所述POMGnT1由编码可操作地连接到ER和/或高尔基体前导序列的POMGnT1的核酸序列编码,其中,所述ER和/或高尔基体前导序列是酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母的前导序列或衍生自酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母或乳酸克鲁维酵母的前导序列。
10.权利要求9所述的方法,其中所述ER和/或高尔基体前导序列衍生自下列蛋白之一的序列:ScMNS1-s、ScMNN9-s、PpKre-2s、KlGnt1-s、ScMNN2-s、ScMNN2-m、ScMNN5-s、ScMNN6-s、ScPMT5-m、PpPMT1-m或PpBET1-s。
11.权利要求9所述的方法,其中所述编码POMGnT1的核酸序列可操作地连接到选自SEQ ID NOs: 1-108的序列。
12.权利要求9所述的方法,其中所述编码POMGnT1的核酸序列可操作地连接到选自以下的序列:SEQ ID NO 3 (或编码SEQ ID NO 4的序列);SEQ ID NO 13
(或编码SEQ ID NO
14的序列);SEQ ID NO 33 (或编码SEQ ID NO 34的序列);SEQ ID NO 39 (或编码SEQ ID NO 40的序列);SEQ ID NO 41
(或编码SEQ ID NO
42的序列);SEQ ID NO 43 (或编码SEQ ID NO 44的序列);SEQ ID NO 45 (或编码SEQ ID NO 46的序列);SEQ ID NO 51
(或编码SEQ ID NO
52的序列);SEQ ID NO 93 (或编码SEQ ID NO 94的序列);SEQ ID NO 87 (或编码SEQ ID NO 88的序列)或SEQ ID NO 105
(或编码SEQ ID NO
106的序列)。
13.权利要求9所述的方法,其中所述编码POMGnT1的核酸序列以下列组合之一可操作地连接到ER和/或高尔基体前导序列:
(a) 人POMGnT1序列或其催化结构域序列可操作地连接到前导序列,所述前导序列是选自下列的蛋白的前导序列或衍生自选自下列的蛋白的前导序列:PpSEC12-s、ScMNN9-s、K1GNT1-s、ScMNN2-s、ScMNN2-m、ScPMT5-m、PpPMT1-m或PpBET1-s;
(b) 人POMGnT1序列或其催化结构域序列可操作地连接到选自以下的序列:SEQ ID NO 9 (或编码SEQ ID NO 10的序列);SEQ ID NO 13
(或编码SEQ ID NO
14的序列);SEQ ID NO 39 (或编码SEQ ID NO 40的序列);SEQ ID NO 41 (或编码SEQ ID NO 42的序列);SEQ ID NO 43
(或编码SEQ ID NO
44的序列);SEQ ID NO 73 (或编码SEQ ID NO 74的序列);SEQ ID NO 87 (或编码SEQ ID NO 88的序列)或SEQ ID NO 105
(或编码SEQ ID NO
106的序列);
(c) 鼠POMGnT1序列或其催化结构域序列可操作地连接到前导序列,所述前导序列是选自下列的蛋白的前导序列或衍生自选自下列的蛋白的前导序列:ScMNN9-s;PpKRE2-s;ScKTR2-s;K1GNT1-s;ScMNN2-s;ScMNN2-m;ScMNN5-s;ScMNN6-s;ScPMT5-m;ScPMT6-m;PpPMT1-s;PpPMT 2-s;PpPMT4-s;或PpBET1-s;
(d) 鼠POMGnT1序列或其催化结构域序列可操作地连接到选自以下的序列:SEQ ID NO 13 (或编码SEQ ID NO 14的序列);SEQ ID NO 33
(或编码SEQ ID NO
34的序列);SEQ ID NO 37 (或编码SEQ ID NO 38的序列);SEQ ID NO 39 (或编码SEQ ID NO 40的序列);SEQ ID NO 41
(或编码SEQ ID NO
42的序列);SEQ ID NO 43 (或编码SEQ ID NO 44的序列);SEQ ID NO 45 (或编码SEQ ID NO 46的序列);SEQ ID NO 51
(或编码SEQ ID NO
52的序列);SEQ ID NO 73 (或编码SEQ ID NO: 74的序列);SEQ ID NO 75 (或编码SEQ ID NO 76的序列);SEQ ID NO 77
(或编码SEQ ID NO
78的序列);SEQ ID NO 79 (或编码SEQ ID NO 80的序列);SEQ ID NO 81 (或编码SEQ ID NO 82的序列);或SEQ ID NO
105 (或编码SEQ ID NO
106的序列);
(e) 蛙POMGnT1序列或其催化结构域序列可操作地连接到前导序列,所述前导序列是选自下列的蛋白的前导序列或衍生自选自下列的蛋白的前导序列:ScMNS1-s;ScSEC12-m;PpSEC12-s;ScMNN9-s;ScANP1-s;ScHOC1-s;ScMNN10-s;ScMNN11-s;PpKRE2-s;ScKTR2-s;K1GNT1-s;ScMNN2-s;ScMNN2-m;ScMNN1-s;ScMNN6-s;ScPMT5-m;PpPMT1-m;或PpBET1-s;或
(f) 蛙POMGnT1序列或其催化结构域序列可操作地连接到选自以下的序列:SEQ ID NO 3 (或编码SEQ ID NO 4的序列);SEQ ID NO 7 (或编码SEQ ID NO 8的序列);SEQ ID NO 9 (或编码SEQ ID NO 10的序列);SEQ ID NO 13
(或编码SEQ ID NO
14的序列);SEQ ID NO 17 (或编码SEQ ID NO 18的序列);SEQ ID NO 19 (或编码SEQ ID NO 20的序列);SEQ ID NO 21
(或编码SEQ ID NO
22的序列);SEQ ID NO 23 (或编码SEQ ID NO 24的序列);SEQ ID NO 33 (或编码SEQ ID NO 34的序列);SEQ ID NO 37
(或编码SEQ ID NO
38的序列);SEQ ID NO 39 (或编码SEQ ID NO 40的序列);SEQ ID NO 41 (或编码SEQ ID NO 42的序列);SEQ ID NO 43
(或编码SEQ ID NO
44的序列);SEQ ID NO 49 (或编码SEQ ID NO 50的序列);SEQ ID NO 51 (或编码SEQ ID NO 52的序列);SEQ ID NO 73
(或编码SEQ ID NO
74的序列);SEQ ID NO 87 (或编码SEQ ID NO 88的序列);或SEQ ID NO 105 (或编码SEQ ID NO 106)。
14.权利要求1所述的方法,其中编码来自步骤(a)(ii)的所述POMGnT1酶的核酸序列可操作地连接到毕赤酵母AOX1、GAP、TEF或PMA启动子。
15.权利要求1所述的方法,其中编码来自步骤(a)(ii)的所述POMGnT1酶的核酸序列可操作地连接到ScCYC1转录终止序列。
16.权利要求1所述的方法,其中编码步骤(a)(ii)的所述POMGnT1酶的核酸序列可操作地连接到启动子和前导序列;其中所使用的启动子、前导序列和POMGnT1序列是以下的启动子-前导序列-POMGnT1组合之一:AOX1-PpKRE2s-小鼠POMGnT1;GAP-K1GNT1s-小鼠POMGnT1;AOX1-K1GNT1s-小鼠POMGnT1;GAP-K1GNT1s-蛙POMGnT1;AOX1-ScMNN2s-小鼠POMGnT1;GAP-ScMNN5s-小鼠POMGnT1;AOX1-ScMNN5s-小鼠POMGnT1;GAP-ScMNN6s-小鼠POMGnT1;AOX1-ScPMT5m-小鼠POMGnT1或GAP-ScMNN6s-人POMGNT1。
17.权利要求1所述的方法,其中所述低等真核生物宿主细胞是毕赤酵母。
18.权利要求1所述的方法,其中所述低等真核生物宿主细胞是巴斯德毕赤酵母。
19.权利要求1-18中任一项所述的低等真核生物宿主细胞。
20.能够生产具有O-Man-GlcNAc;O-Man-GlcNAc-Gal;或O-Man-GlcNAc-Gal-Sia作为主要O-聚糖的重组糖蛋白的低等真核生物宿主细胞,其:
(a) 不表达功能性的β-甘露糖基转移酶Bmt 1、2、3和4,和磷酸-甘露糖转移酶Mnn4a、Mnn4b和PNO1;和
(b) 由编码POMGnT1、UDP-GlcNAc转运蛋白、α-1,2-甘露糖苷酶和目标糖蛋白的外源核酸转化或转染;
其中,所述主要O-聚糖以大于50%的水平存在,且O-Man2以小于30%的水平存在。
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