ES2733298T3 - Cuantificación de TNFR2:Fc plegado erróneamente - Google Patents
Cuantificación de TNFR2:Fc plegado erróneamente Download PDFInfo
- Publication number
- ES2733298T3 ES2733298T3 ES14177696T ES14177696T ES2733298T3 ES 2733298 T3 ES2733298 T3 ES 2733298T3 ES 14177696 T ES14177696 T ES 14177696T ES 14177696 T ES14177696 T ES 14177696T ES 2733298 T3 ES2733298 T3 ES 2733298T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- tnfr2
- cys78
- cys88
- disulfide
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 title claims abstract description 278
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 title claims abstract description 276
- 238000011002 quantification Methods 0.000 title description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 112
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 60
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 36
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 31
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims abstract description 28
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims abstract description 14
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 48
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 35
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 22
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 20
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- -1 2-methyl-2-undecyl-1,3-dioxolan-4-yl Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 10
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 7
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 7
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 6
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 claims description 4
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- JXLHNMVSKXFWAO-UHFFFAOYSA-N azane;7-fluoro-2,1,3-benzoxadiazole-4-sulfonic acid Chemical compound N.OS(=O)(=O)C1=CC=C(F)C2=NON=C12 JXLHNMVSKXFWAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 56
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 32
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 26
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 description 23
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 20
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 20
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 20
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 18
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 13
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 13
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 12
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 12
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 12
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 12
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 10
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 9
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 9
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 7
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 6
- TVPPOWAYYCDJAS-UHFFFAOYSA-M sodium;3-[(2-methyl-2-undecyl-1,3-dioxolan-4-yl)methoxy]propane-1-sulfonate Chemical group [Na+].CCCCCCCCCCCC1(C)OCC(COCCCS([O-])(=O)=O)O1 TVPPOWAYYCDJAS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108010072106 tumstatin (74-98) Proteins 0.000 description 6
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 5
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 5
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 description 5
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 description 5
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 5
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 5
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 208000019069 chronic childhood arthritis Diseases 0.000 description 5
- 229940073621 enbrel Drugs 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 201000002215 juvenile rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 3
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 3
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 3
- 201000009273 Endometriosis Diseases 0.000 description 3
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 3
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 3
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 238000012433 multimodal chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- RIXGSYSJYLZYED-UHFFFAOYSA-N 3-[(2-methyl-2-undecyl-1,3-dioxolan-4-yl)methoxy]propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC1(C)OCC(COCCCS(O)(=O)=O)O1 RIXGSYSJYLZYED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- 101000801232 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 2
- AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 2
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- IHCXPSYCHXFXKT-DCAQKATOSA-N Pro-Arg-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IHCXPSYCHXFXKT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 2
- 101710187743 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- AHIZUOHBPONPMB-UHFFFAOYSA-N [Na].O1C=CC=C1 Chemical compound [Na].O1C=CC=C1 AHIZUOHBPONPMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 108010052670 arginyl-glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000013400 design of experiment Methods 0.000 description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 2
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 2
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012562 protein A resin Substances 0.000 description 2
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQNRVGJCPCNMKT-JLPGSUDCSA-N 2-(4-benzylpiperazin-1-yl)-n-[(2-hydroxy-3-prop-2-enyl-phenyl)methylideneamino]acetamide Chemical compound OC1=C(CC=C)C=CC=C1\C=N/NC(=O)CN1CCN(CC=2C=CC=CC=2)CC1 YQNRVGJCPCNMKT-JLPGSUDCSA-N 0.000 description 1
- 206010048998 Acute phase reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N Ala-Leu-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- OYJCVIGKMXUVKB-GARJFASQSA-N Ala-Leu-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N OYJCVIGKMXUVKB-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- OINVDEKBKBCPLX-JXUBOQSCSA-N Ala-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OINVDEKBKBCPLX-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- WQKAQKZRDIZYNV-VZFHVOOUSA-N Ala-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WQKAQKZRDIZYNV-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- YJHKTAMKPGFJCT-NRPADANISA-N Ala-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YJHKTAMKPGFJCT-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- PNQWAUXQDBIJDY-GUBZILKMSA-N Arg-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PNQWAUXQDBIJDY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ZUVMUOOHJYNJPP-XIRDDKMYSA-N Arg-Trp-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ZUVMUOOHJYNJPP-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- SRUUBQBAVNQZGJ-LAEOZQHASA-N Asn-Gln-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N SRUUBQBAVNQZGJ-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- WONGRTVAMHFGBE-WDSKDSINSA-N Asn-Gly-Gln Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N WONGRTVAMHFGBE-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N Asn-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QUAWOKPCAKCHQL-SRVKXCTJSA-N Asn-His-Lys Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N QUAWOKPCAKCHQL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WQLJRNRLHWJIRW-KKUMJFAQSA-N Asn-His-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O WQLJRNRLHWJIRW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- HNXWVVHIGTZTBO-LKXGYXEUSA-N Asn-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HNXWVVHIGTZTBO-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- PUUPMDXIHCOPJU-HJGDQZAQSA-N Asn-Thr-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O PUUPMDXIHCOPJU-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- QNNBHTFDFFFHGC-KKUMJFAQSA-N Asn-Tyr-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O QNNBHTFDFFFHGC-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- DPNWSMBUYCLEDG-CIUDSAMLSA-N Asp-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DPNWSMBUYCLEDG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YUELDQUPTAYEGM-XIRDDKMYSA-N Asp-Trp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N YUELDQUPTAYEGM-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- SQIARYGNVQWOSB-BZSNNMDCSA-N Asp-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O SQIARYGNVQWOSB-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100035418 Ceramide synthase 4 Human genes 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- NDUSUIGBMZCOIL-ZKWXMUAHSA-N Cys-Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CS)N NDUSUIGBMZCOIL-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- YMBAVNPKBWHDAW-CIUDSAMLSA-N Cys-Asp-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N YMBAVNPKBWHDAW-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- OHLLDUNVMPPUMD-DCAQKATOSA-N Cys-Leu-Val Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N OHLLDUNVMPPUMD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ZXCAQANTQWBICD-DCAQKATOSA-N Cys-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CS)N ZXCAQANTQWBICD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KSMSFCBQBQPFAD-GUBZILKMSA-N Cys-Pro-Pro Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 KSMSFCBQBQPFAD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- NDNZRWUDUMTITL-FXQIFTODSA-N Cys-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NDNZRWUDUMTITL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- XKBASPWPBXNVLQ-WDSKDSINSA-N Gln-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XKBASPWPBXNVLQ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- XKPACHRGOWQHFH-IRIUXVKKSA-N Gln-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O XKPACHRGOWQHFH-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 1
- CKOFNWCLWRYUHK-XHNCKOQMSA-N Glu-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O CKOFNWCLWRYUHK-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- HUFCEIHAFNVSNR-IHRRRGAJSA-N Glu-Gln-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 HUFCEIHAFNVSNR-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- QDMVXRNLOPTPIE-WDCWCFNPSA-N Glu-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QDMVXRNLOPTPIE-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- MFYLRRCYBBJYPI-JYJNAYRXSA-N Glu-Tyr-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O MFYLRRCYBBJYPI-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- ZYRXTRTUCAVNBQ-GVXVVHGQSA-N Glu-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ZYRXTRTUCAVNBQ-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- AFWYPMDMDYCKMD-KBPBESRZSA-N Gly-Leu-Tyr Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 AFWYPMDMDYCKMD-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- SYOJVRNQCXYEOV-XVKPBYJWSA-N Gly-Val-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SYOJVRNQCXYEOV-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- FULZDMOZUZKGQU-ONGXEEELSA-N Gly-Val-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)CN FULZDMOZUZKGQU-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000737544 Homo sapiens Ceramide synthase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001139126 Homo sapiens Krueppel-like factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 101001024391 Homo sapiens Neuromedin-U receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000591385 Homo sapiens Neurotensin receptor type 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001133600 Homo sapiens Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001080401 Homo sapiens Proteasome assembly chaperone 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000653759 Homo sapiens Sphingosine 1-phosphate receptor 5 Proteins 0.000 description 1
- 101100425757 Homo sapiens TNFRSF1B gene Proteins 0.000 description 1
- 101000807859 Homo sapiens Vasopressin V2 receptor Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 102100020679 Krueppel-like factor 6 Human genes 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N L-tryptophan-L-tyrosine Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QJUWBDPGGYVRHY-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N QJUWBDPGGYVRHY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N Leu-Gly-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O VWHGTYCRDRBSFI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- HYMLKESRWLZDBR-WEDXCCLWSA-N Leu-Gly-Thr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HYMLKESRWLZDBR-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- BKTXKJMNTSMJDQ-AVGNSLFASA-N Leu-His-Gln Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N BKTXKJMNTSMJDQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N Leu-Ser-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N Leu-Ser-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ILDSIMPXNFWKLH-KATARQTJSA-N Leu-Thr-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ILDSIMPXNFWKLH-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- YQFZRHYZLARWDY-IHRRRGAJSA-N Leu-Val-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN YQFZRHYZLARWDY-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100026238 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- XNKDCYABMBBEKN-IUCAKERBSA-N Lys-Gly-Gln Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O XNKDCYABMBBEKN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- RFQATBGBLDAKGI-VHSXEESVSA-N Lys-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O RFQATBGBLDAKGI-VHSXEESVSA-N 0.000 description 1
- MIFFFXHMAHFACR-KATARQTJSA-N Lys-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN MIFFFXHMAHFACR-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N Lys-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UGCIQUYEJIEHKX-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- RKIIYGUHIQJCBW-SRVKXCTJSA-N Met-His-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O RKIIYGUHIQJCBW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- IHRFZLQEQVHXFA-RHYQMDGZSA-N Met-Thr-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN IHRFZLQEQVHXFA-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000017921 NTSR1 Human genes 0.000 description 1
- 102100035314 Neuromedin-U receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 229960005552 PAC-1 Drugs 0.000 description 1
- 101150084398 PTAFR gene Proteins 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- JOXIIFVCSATTDH-IHPCNDPISA-N Phe-Asn-Trp Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O)N JOXIIFVCSATTDH-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- MSHZERMPZKCODG-ACRUOGEOSA-N Phe-Leu-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 MSHZERMPZKCODG-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- JDMKQHSHKJHAHR-UHFFFAOYSA-N Phe-Phe-Leu-Tyr Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)CC1=CC=CC=C1 JDMKQHSHKJHAHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SJRQWEDYTKYHHL-SLFFLAALSA-N Phe-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=CC=C3)N)C(=O)O SJRQWEDYTKYHHL-SLFFLAALSA-N 0.000 description 1
- 108700023400 Platelet-activating factor receptors Proteins 0.000 description 1
- UAYHMOIGIQZLFR-NHCYSSNCSA-N Pro-Gln-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UAYHMOIGIQZLFR-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- KIPIKSXPPLABPN-CIUDSAMLSA-N Pro-Glu-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KIPIKSXPPLABPN-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- NXEYSLRNNPWCRN-SRVKXCTJSA-N Pro-Glu-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NXEYSLRNNPWCRN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LGSANCBHSMDFDY-GARJFASQSA-N Pro-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O LGSANCBHSMDFDY-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- VPEVBAUSTBWQHN-NHCYSSNCSA-N Pro-Glu-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O VPEVBAUSTBWQHN-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ZLXKLMHAMDENIO-DCAQKATOSA-N Pro-Lys-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZLXKLMHAMDENIO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- MHHQQZIFLWFZGR-DCAQKATOSA-N Pro-Lys-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MHHQQZIFLWFZGR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PCWLNNZTBJTZRN-AVGNSLFASA-N Pro-Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 PCWLNNZTBJTZRN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- FDMKYQQYJKYCLV-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 FDMKYQQYJKYCLV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- MKGIILKDUGDRRO-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 MKGIILKDUGDRRO-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- PRKWBYCXBBSLSK-GUBZILKMSA-N Pro-Ser-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O PRKWBYCXBBSLSK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KHRLUIPIMIQFGT-AVGNSLFASA-N Pro-Val-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KHRLUIPIMIQFGT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- OYEDZGNMSBZCIM-XGEHTFHBSA-N Ser-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OYEDZGNMSBZCIM-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- VGNYHOBZJKWRGI-CIUDSAMLSA-N Ser-Asn-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO VGNYHOBZJKWRGI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MUJQWSAWLLRJCE-KATARQTJSA-N Ser-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MUJQWSAWLLRJCE-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- GZSZPKSBVAOGIE-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GZSZPKSBVAOGIE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- AXKJPUBALUNJEO-UBHSHLNASA-N Ser-Trp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AXKJPUBALUNJEO-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- HNDMFDBQXYZSRM-IHRRRGAJSA-N Ser-Val-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HNDMFDBQXYZSRM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029802 Sphingosine 1-phosphate receptor 5 Human genes 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N Thr-Ala-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- DSLHSTIUAPKERR-XGEHTFHBSA-N Thr-Cys-Val Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O DSLHSTIUAPKERR-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- LAFLAXHTDVNVEL-WDCWCFNPSA-N Thr-Gln-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O LAFLAXHTDVNVEL-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- SXAGUVRFGJSFKC-ZEILLAHLSA-N Thr-His-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SXAGUVRFGJSFKC-ZEILLAHLSA-N 0.000 description 1
- FIFDDJFLNVAVMS-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Met Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O FIFDDJFLNVAVMS-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- JMBRNXUOLJFURW-BEAPCOKYSA-N Thr-Phe-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N)O JMBRNXUOLJFURW-BEAPCOKYSA-N 0.000 description 1
- ZESGVALRVJIVLZ-VFCFLDTKSA-N Thr-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O ZESGVALRVJIVLZ-VFCFLDTKSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- UDCHKDYNMRJYMI-QEJZJMRPSA-N Trp-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UDCHKDYNMRJYMI-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- QYSBJAUCUKHSLU-JYJNAYRXSA-N Tyr-Arg-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QYSBJAUCUKHSLU-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- NHOVZGFNTGMYMI-KKUMJFAQSA-N Tyr-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NHOVZGFNTGMYMI-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- PWKMJDQXKCENMF-MEYUZBJRSA-N Tyr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PWKMJDQXKCENMF-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- SQUMHUZLJDUROQ-YDHLFZDLSA-N Tyr-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SQUMHUZLJDUROQ-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- BMGOFDMKDVVGJG-NHCYSSNCSA-N Val-Asp-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N BMGOFDMKDVVGJG-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- OACSGBOREVRSME-NHCYSSNCSA-N Val-His-Asn Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O OACSGBOREVRSME-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- HGJRMXOWUWVUOA-GVXVVHGQSA-N Val-Leu-Gln Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N HGJRMXOWUWVUOA-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- KISFXYYRKKNLOP-IHRRRGAJSA-N Val-Phe-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N KISFXYYRKKNLOP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- KRAHMIJVUPUOTQ-DCAQKATOSA-N Val-Ser-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N KRAHMIJVUPUOTQ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- NZYNRRGJJVSSTJ-GUBZILKMSA-N Val-Ser-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NZYNRRGJJVSSTJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- ZLNYBMWGPOKSLW-LSJOCFKGSA-N Val-Val-Asp Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O ZLNYBMWGPOKSLW-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- JVGDAEKKZKKZFO-RCWTZXSCSA-N Val-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O JVGDAEKKZKKZFO-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 102100037108 Vasopressin V2 receptor Human genes 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 108010050025 alpha-glutamyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001776 amniocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 239000013019 capto adhere Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108010013768 glutamyl-aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010050475 glycyl-leucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 108010024654 phenylalanyl-prolyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 102000030769 platelet activating factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013214 routine measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 108010048397 seryl-lysyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- NPAWNPCNZAPTKA-UHFFFAOYSA-M sodium;propane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].CCCS([O-])(=O)=O NPAWNPCNZAPTKA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000013179 statistical model Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 108010071097 threonyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000006433 tumor necrosis factor production Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 108010052774 valyl-lysyl-glycyl-phenylalanyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
- G01N21/33—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using ultraviolet light
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30 CD40 or CD95
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
- G01N2440/20—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material formation of disulphide bridges
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Método para determinar la cantidad relativa de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en una muestra que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88, en el que el método comprende las etapas de: (a) proporcionar una muestra que comprende una mezcla de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 y TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96; (b) desnaturalizar y alquilar la muestra de la etapa (a); (c) someter la muestra resultante de la etapa (b) a digestión tríptica en condiciones no reductoras; (d) someter la muestra resultante de la etapa (c) a HPLC, separando de ese modo fragmentos indicativos de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88, en el que dichos fragmentos consisten en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 ("T7"); (e) realizar una integración de pico para el pico indicativo de fragmentos que consisten en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 ("T7"), y para un pico no afectado por la formación de puentes disulfuro de Cys74, Cys78, Cys88 y Cys96 que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5 ("T27"), tal como se obtiene a partir de la etapa (d); en el que el pico no afectado por la formación de puentes disulfuro de Cys74, Cys78, Cys88 y Cys96 no se ve afectado por la formación de puentes disulfuro en absoluto y es indicativo de la TNFR:Fc total en la muestra; y (f) calcular la cantidad relativa según la fórmula (1)**Fórmula** en el que la secuencia de aminoácidos de la parte de TNFR2 de TNFR2:Fc tiene al menos el 97% de identidad con los aminoácidos 1-235 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
Description
DESCRIPCIÓN
Cuantificación de TNFR2:Fc plegado erróneamente
Descripción
La presente invención se refiere a métodos para determinar la cantidad relativa de una TNFR2:Fc con puente disulfuro erróneo específica en una muestra de TNFR2:Fc, una proteína de fusión que se usa en una variedad de aplicaciones terapéuticas. Además, la invención se refiere a un método para purificar TNFR2:Fc usando dicho método para determinar la cantidad relativa de dicha TNFR2:Fc con puente disulfuro erróneo específica, y a composiciones de TNFR2:Fc obtenidas de ese modo.
Antecedentes de la invención
El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) es un miembro de un grupo de citocinas que estimulan la reacción de fase aguda, y por tanto es una citocina implicada en inflamación sistémica. TNF-alfa es capaz de inducir inflamación, inducir muerte celular apoptótica e inhibir la tumorigénesis y replicación viral. La desregulación de la producción de TNF-alfa se ha implicado en una variedad de enfermedades humanas como enfermedad autoinmunitaria, espondilitis anquilosante, artritis reumatoide juvenil, psoriasis, artritis soriásica, artritis reumatoide, enfermedad de Wegener (granulomatosis), enfermedad de Crohn o enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), hepatitis C, endometriosis, asma, caquexia, dermatitis atópica, Alzheimer así como cáncer.
Sus moléculas receptoras incluyen TNFR1 y TNFR2. TNF-R1 se expresa en la mayoría de los tejidos, mientras que TNF-R2 se encuentra solo en las células del sistema inmunitario. Tras el contacto con homotrímeros de TNF-alfa, los receptores de TNF forman trímeros y, por tanto, inician la señalización celular intracelular.
Por consiguiente, las moléculas de TNFR solubles o fragmentos de las mismas, que son capaces de unirse a TNF-alfa, pueden usarse como inhibidor competitivo para TNF-alfa. La presente divulgación se refiere a tales moléculas de TNFR2 solubles fusionadas a una porción Fc de una inmunoglobulina humana (TNFR2:Fc), y más particularmente a métodos para determinar, obtener y purificar tales moléculas de TNFR2: Fc.
Puede fabricarse TNFR2:Fc mediante un proceso biológico usando células CHO recombinantes, por ejemplo usando células CHO deficientes en dihidrofolato reductasa (dhfr-). Una forma particular de TNFR2:Fc es etanercept, que consiste en 934 aminoácidos con un peso molecular aparente de 125 kDa. Comprende un homodímero de la porción de unión a ligando extracelular del receptor del factor de necrosis tumoral humano (p75) unido a la porción Fc de una IgG1 humana. El componente de Fc en ambas moléculas del homodímero contiene las regiones bisagra, CH2 y CH3 completas, pero no la región CH1 de IgG1 (véase la figura 1). Preferiblemente se sintetiza como una proteína soluble, secretada y dimérica, mientras que la dimerización de la región Fc por medio de tres enlaces disulfuro se produce de manera postraduccional.
Mediante el uso de cristalografía de rayos X así como de espectrometría de masas, pudo dilucidarse el patrón completo de puentes disulfuro de una forma preferida de TNFR2 humana:Fc, etanercept (véase la tabla 1). Las partes relevantes de las estructuras resueltas de TNFR2 y su superficie de contacto con TNF-alfa se muestran en la figura 2 y la figura 3, mientras que la conectividad de las variantes de disulfuro para la variante principal de TNFR2:Fc se resume en la tabla 1 (véase también la figura 4).
Tabla 1 Patrón de puentes disulfuro de etanercept
Intracatenarios (receptor/parte de Fc) 
Intercatenarios
Cys(18)-Cys(31) Cys(98)-Cys(115) Cys(240)-Cys(240')
Cys(32)-Cys(45) Cys(121)-Cys(139) Cys(246)-Cys(246')
Cys(35)-Cys(53) Cys(142)-Cys(157) Cys(249)-Cys(249')
Sin embargo, se ha encontrado TNFR2:Fc plegada erróneamente en todas las preparaciones de TNFR2:Fc analizadas.
Tal TNFR2:Fc plegada erróneamente no se prefiere cuando se utiliza TNFR2:Fc en cualquiera de las terapias mencionadas anteriormente. El documento US 7.294.481 notifica que dicha TNFR:Fc plegada erróneamente, tal como TNFR2:Fc, se forma tempranamente en el proceso de cultivo celular, se transporta y representa una proporción significativa (aproximadamente el 25-50%) del producto de expresión. Se notifica además que tal TNFR:Fc plegada erróneamente puede reducirse si la célula huésped que produce TNFR:Fc se cultiva a una temperatura de 25-342C durante la fase de producción. Además, se notifica que tal TNFR:Fc plegada erróneamente puede separarse mediante cromatografía de interacción hidrófoba.
El documento US 2014/072560 da a conocer métodos para separar etanercept plegado correctamente (TNFR2:Fc) de etanercept y agregados plegados incorrectamente, mientras que la divulgación se refiere TNFR:Fc con puentes disulfuro correctos y puentes disulfuro incorrectos.
Martínez et al. Journal of Analytical Sciences 18 (2): 248 (2014) se titula “Comparability of a Three-Dimensional Structure in Biopharmaceuticals Using Spectroscopic Methods”, y en general describe los antecedentes técnicos de métodos espectroscópicos.
El documento WO 2014/144911 A2, presentado el 14 de marzo de 2014 y publicado el 18 de septiembre de 2014, se refiere a inmunoglobulinas híbridas que contienen un enlace no peptidilo.
Tal como se muestra en la sección de ejemplos en el presente documento, las preparaciones de TNFR2:Fc actualmente disponibles (comercializadas como ENBREL®) contienen todavía TNFR2:Fc con puentes disulfuro erróneos (véase la tabla 4 más adelante). Esto puede deberse a la dificultad de separar el mismo de TNFR2:Fc plegada correctamente. Por consiguiente, existe la necesidad en la técnica de métodos para determinar la pureza de TNFR2:Fc en una muestra, en este caso la cantidad de TNFR2:Fc con puentes disulfuro erróneos, que permitan la selección de, por ejemplo, fracciones que tienen el grado más alto deseado pureza.
Sumario de la invención
Los inventores identificaron una variante de TNFR2:Fc que comprende un disulfuro con puente incorrecto en la región de unión de la parte de receptor de TNF-alfa a TNF-alfa (Cys78-Cys88) (véanse las figuras 5 y 6). Se demuestra en el presente documento mediante correlaciones entre la bioactividad y la cantidad de la variante con puente incorrecto Cys78-Cys88 (“variante T7” o “T7”), que altas cantidades de esta variante T7 tienen un impacto negativo sobre la potencia (véase la figura 7).
Partiendo de este hallazgo, los inventores desarrollaron un método para la cuantificación de la variante T7 mediante mapeo de péptidos no reductor. Al digerir muestras de TNFR2:Fc con tripsina en condiciones no reductoras, la proteína puede escindirse en componentes más pequeños, mientras que las estructuras de puentes disulfuro permanecen intactas. Después de eso, los péptidos producidos se separan de manera cromatográfica adicionalmente mediante cromatografía de fase inversa y se detectan por medio de detección UV/Vis. Este método permite una cuantificación relativa de la cantidad del denominado péptido T7 que es un péptido obtenido a partir de variantes T7 con puente incorrecto.
Preferiblemente, la cantidad de péptido T7 con puente incorrecto puede determinarse a partir de la señal del péptido T7 en el cromatograma obtenido. Por ejemplo puede expresarse como el área de pico para el péptido T7 en relación con el área de pico para un péptido de referencia, que no se ve afectado por la formación de puentes disulfuro o un péptido de referencia que no se ve afectado por la formación de puentes disulfuro de los residuos Cys74, Cys78, Cys88 y Cys96. Mediante el uso del método recién desarrollado es posible identificar muestras en las que eluyen conjuntamente TNFR2:Fc y variante T7 con puentes disulfuro correctos, y que por tanto no pueden agruparse con muestras de TNFR2:Fc puras y/o muestras con una cantidad reducida de variante T7, logrando de ese modo una pureza/potencia mejorada de la composición de TNFR2:Fc final.
Más específicamente, se proporciona un método para determinar la cantidad relativa de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 (es decir, variante T7) en una muestra que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88, en el que el método comprende las etapas de:
(a) proporcionar una muestra que comprende una mezcla de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 y TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96;
(b) desnaturalizar y alquilar la muestra de la etapa (a);
(c) someter la muestra resultante de la etapa (b) a digestión tríptica en condiciones no reductoras;
(d) someter la muestra resultante de la etapa (c) a HPLC, separando de ese modo fragmentos indicativos de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88, en el que dichos fragmentos consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 (“T7”);
(e) realizar una integración de pico para el pico indicativo de fragmentos que consisten en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 (“T7”), y para un pico no afectado por la formación de puentes disulfuro de
Cys74, Cys78, Cys88 y Cys96 que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5 (“T27”), tal como se obtiene a partir de la etapa (d); en el que el pico no afectado por la formación de puentes disulfuro de Cys74, Cys78, Cys88 y Cys96 no se ve afectado por la formación de puentes disulfuro en absoluto y es indicativo de la TNFR2:Fc total en la muestra; y
(f) calcular la cantidad relativa según fórmula (1)
en el que la secuencia de aminoácidos de la parte de TNFR2 de TNFR2:Fc tiene al menos el 97% de identidad con los aminoácidos 23-257 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
También se proporciona un método de preparación de una composición de TNFR2:Fc que comprende menos del 2,2% de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 basándose en TNFR2:Fc total, en el que el método comprende someter una muestra que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 a al menos una etapa cromatográfica, en el que la al menos una etapa cromatográfica comprende una cromatografía de interacción hidrófoba (HIC); y separar una o más fracciones que comprenden TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 que tienen una cantidad reducida de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en comparación con la muestra sometida a dicha al menos una etapa cromatográfica; en el que dicha una o más fracciones comprenden menos del 2,2% de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 basándose en TNFR2:Fc total, tal como se determina usando el método para determinar TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en una muestra que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 dado a conocer en el presente documento y usando integración de pico de señales de péptido T7 (SEQ ID NO: 4) y T27 (SEQ ID NO: 5) y calculando la cantidad relativa mediante la fórmula (1) tal como se describe más adelante.
Se proporciona además un método de purificación de TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, en el que el método comprende someter una muestra que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 a al menos una etapa cromatográfica, en el que la al menos una etapa cromatográfica comprende una cromatografía de interacción hidrófoba (HIC); y separar una o más fracciones que comprenden TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 que tienen una cantidad reducida de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en comparación con la muestra sometida a dicha al menos una etapa cromatográfica; en el que la cantidad de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 se determina usando un método tal como se da a conocer en el presente documento.
Además, la presente divulgación proporciona un método que comprende
(a) producir una composición que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en una célula huésped adecuada; y
(b) purificar la combinación obtenida de TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 mediante el método de purificación dado a conocer en el presente documento.
Finalmente, también se da a conocer una composición de TNFR2:Fc, en la que la secuencia de aminoácidos de la TNFR2:Fc tiene una identidad de al menos el 97% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, que comprende menos del 2,2% de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88, determinada usando el método para determinar TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en una muestra que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 dado a conocer en el presente documento y usando integración de pico de señales de péptido T7 (SEQ ID NO: 4) y T27 (SEQ ID NO: 5) y calculando la cantidad relativa mediante la fórmula (1) tal como se describe más adelante.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
La presente divulgación proporciona un método para determinar la cantidad relativa de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en una muestra que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88, en el que el método comprende las etapas de:
(a) proporcionar una muestra que comprende una mezcla de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 y TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96;
(b) desnaturalizar y alquilar la muestra de la etapa (a);
(c) someter la muestra resultante de la etapa (b) a digestión tríptica en condiciones no reductoras;
(d) someter la muestra resultante de la etapa (c) a HPLC, separando de ese modo fragmentos indicativos de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en el que dichos fragmentos consisten en la secuencia de aminoácidos mostrada en s Eq ID NO: 4 (“T7”);
(e) realizar una integración de pico para el pico indicativo de fragmentos que consisten en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 (“T7”), y para un pico no afectado por la formación de puentes disulfuro de Cys74, Cys78, Cys88 y Cys96 que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5 (“T27”), tal como se obtiene a partir de la etapa (d); en el que el pico no afectado por la formación de puentes disulfuro de Cys74, Cys78, Cys88 y Cys96 no se ve afectado por la formación de puentes disulfuro en absoluto y es indicativo de la TNFR2:Fc total en la muestra; y
(f) calcular la cantidad relativa según la fórmula (1)
en el que la secuencia de aminoácidos de la parte de TNFR2 de TNFR2:Fc tiene al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, más preferiblemente al menos el 99% de identidad; lo más preferiblemente el 100% de identidad con los aminoácidos 23-257 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Los aminoácidos 1-22 de SEQ ID NO: 1 corresponden al péptido señal recortado en la proteína secretada madura.
En el contexto de la presente divulgación, la parte de TNFR2 de TNFR2:Fc se refiere a cualquier polipéptido de TNFR que tenga al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, más preferiblemente al menos el 99% y lo más preferiblemente el 100% de identidad a lo largo de la longitud completa de una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 150-235, preferiblemente 200-235 y lo más preferiblemente 233-235 aminoácidos de la parte extracelular de TNFR2, y que todavía se une a TNF-alfa, tal como se determina mediante ELISA o cualquier otro ensayo conveniente. Más preferiblemente, dicho TNFR es capaz de unirse a TNF-alfa y linfotoxina alfa (LT-alfa), tal como se determina mediante ELISA o cualquier otro ensayo conveniente. Tales ensayos se los conoce bien el experto en la técnica.
Las secuencias de proteína y CDS de TNFR2 (receptor de TNF tipo 2; CD120b; p75/80; para ser humano: sec. de ref. (ARNm): NM_001066, sec. de ref. (proteína): NP_001057 (SeQ ID NO:1)) se conocen en la técnica.
Generalmente, un polipéptido tiene “al menos el x% de identidad” a lo largo de la longitud completa de una longitud definida de aminoácidos con otro polipéptido si la secuencia en cuestión se alinea con la mejor secuencia coincidente de la secuencia de aminoácidos y la identidad de secuencia entre las secuencias alineadas es de al menos el x%. Una alineación de este tipo puede realizarse usando por ejemplo programas informáticos de homología disponibles públicamente tales como el programa “BLAST”, tal como “blastp” proporcionado en la página web del NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi, usando los parámetros por defecto proporcionados en la misma. Se conocen en la técnica métodos adicionales de cálculo de los porcentajes de identidad de secuencia de conjuntos de polipéptidos.
La región Fc (fragmento de región cristalizable) se refiere a la región de la cola de un anticuerpo, en el caso de IgG compuesta por el segundo y tercer dominio constante de las dos cadenas pesadas del anticuerpo. En ciertas realizaciones, el polipéptido Fc comprende la región constante de una cadena pesada de clase IgG o un fragmento y/o variante de la misma y en otras realizaciones la región constante de otros isotipos de inmunoglobulina puede usarse para generar tales fusiones de TNFR2:Fc. Por ejemplo, podría usarse un polipéptido TNFR2:Fc que comprende la región constante de una cadena pesada de clase IgM o un fragmento y/o variante de la misma. Preferiblemente, el fragmento Fc se deriva de IgG, más preferiblemente de IgG1, incluso más preferiblemente de IgG1 humana. La región constante de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, con un ejemplo específico de un dominio constante de la cadena pesada de la clase IgG1 proporcionado por SEQ ID NO: 2, comprende un dominio CH1 (aminoácidos 1 a 98 de sEq ID NO: 2), una región bisagra (aminoácidos 99 a 110 de SEQ ID NO: 2), un dominio CH2 (aminoácidos 111 a 223 de SEQ ID NO: 2) y un dominio CH3 (aminoácidos 224 a 330 de SEQ ID NO: 2). Tal como se usa en el presente documento, un dominio Fc puede contener uno o todos los dominios CH1 de cadena pesada, región de bisagra, CH2 y CH3 descritos anteriormente, o fragmentos o variantes de los mismos. Ciertas realizaciones de la invención incluyen TNFR2:Fc que comprende todo o una parte del dominio extracelular de TNFR2 (SEQ ID NO: 1) fusionado a toda o una parte de SEQ ID NO: 2, opcionalmente con un polipéptido ligador
entre la parte de TNFR2 y la parte de Fc del TNFR2:Fc. Por ejemplo, CH1, CH2 y toda la región bisagra pueden estar presentes en la molécula. En realizaciones adicionales, una región constante de cadena pesada que comprende al menos una parte de CH1 es la parte Fc de una TNFR2:Fc. Ciertas realizaciones también pueden incluir, por ejemplo, toda la región bisagra o la mitad C-terminal de la región de bisagra para proporcionar un puente disulfuro entre cadenas pesadas. Si se desea una TNFR2:Fc multimérica, por ejemplo dimérica, es importante incluir la parte de la región bisagra implicada en la formación de puentes disulfuro entre las cadenas pesadas (por ejemplo, una porción de los aminoácidos 99 a 110 de SEQ ID NO: 2 que incluye el aminoácido 109 de SEQ ID NO: 2). En una realización preferida, la parte de Fc consiste en la región bisagra completa y los dominios CH2 y CH3. Sin embargo, la TNFR2:Fc puede comprender partes del dominio CH3 que no incluyen el residuo de lisina C-terminal (aminoácido 330 de SEQ ID NO: 2), ya que se ha observado que este residuo se elimina en el procesamiento postraduccional de polipéptidos de cadena pesada de IgG. Las fusiones de Fc y los fragmentos de Fc se conocen bien en la técnica.
Preferiblemente, la TNFR2:Fc es esencialmente idéntica/similar a etanercept, más preferiblemente, la TNFR2:Fc es etanercept. Etanercept es un dímero de dos moléculas de la porción extracelular del receptor de TNF-alfa p75, consistiendo cada molécula en un polipéptido derivado de TNFR de 235 aminoácidos que se fusiona a una parte de Fc de 232 aminoácidos de IgG1 humana.
La secuencia de aminoácidos del componente monomérico de etanercept se muestra como SEQ ID NO: 3. En la forma dimérica de esta molécula, dos de estos polipéptidos de fusión (o “monómeros”) se mantienen unidos por tres enlaces disulfuro que se forman entre las partes de inmunoglobulina de los dos monómeros. El dímero de etanercept, por tanto, consiste en 934 aminoácidos y tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 125 kilodaltons.
En América del Norte, etanercept se comercializa por Amgen con el nombre comercial Enbrel®. Wyeth/Pfizer es el único comercializador de Enbrel® fuera de América del Norte, excepto Japón, donde Takeda Pharmaceuticals comercializa el fármaco.
El término “esencialmente idéntico/similar a etanercept” tal como se usa en el presente documento significa que la secuencia de aminoácidos de la TNFR2:Fc aplicada a la etapa (a) tiene al menos el 97% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3, preferiblemente al menos el 98% de identidad, más preferiblemente el 99% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 3. Alternativa o adicionalmente, la TNFR2:Fc puede tener el 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, y puede diferir o no de etanercept por modificaciones postraduccionales (solo), por ejemplo, por glicosilación. El experto en la técnica conoce bien procedimientos adecuados para cambiar un patrón de glicosilación y las pruebas para determinar un patrón de glicosilación.
La TNFR2:Fc puede producirse de manera recombinante, preferiblemente usando un sistema de expresión basado en células de mamíferos. Preferiblemente, dicho sistema de expresión basado en células de mamíferos es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en líneas celulares de riñón de cría de hámster (por ejemplo, BHK21); líneas celulares de ovario de hámster chino (por ejemplo, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DXB o CHO-dhfr-); líneas celulares de mieloma murino (por ejemplo, SP2/0); líneas celulares de mieloma de ratón (por ejemplo, NS0); líneas celulares de riñón embrionario humano (por ejemplo, HEK-293); líneas celulares derivadas de la retina humana (por ejemplo, PER-C6) y/o líneas celulares de amniocitos (por ejemplo, CAP). Preferiblemente, están usándose sistemas de expresión basados en células de hámster. Las células BHK21 (“riñón de cría de hámster”) pertenecen a una línea establecida casi diploide de células de hámster sirio, descendientes de un clon de un cultivo primario de crecimiento inusualmente rápido de tejido renal de hámster recién nacido. Ejemplos no limitativos de líneas celulares BHK-21 que están disponibles comercialmente y que pueden usarse en el contexto de la presente invención son BHK-21 (C-13); BHK21 -pcDNA3.1-HC; BHK570; línea celular Flp-In-BHK; y/o línea celular de hámster BHK 21 (clon 13).
Las células de ovario de hámster chino (CHO) son una línea celular derivada del ovario del hámster chino. A menudo se usan en investigación biológica y médica y se utilizan comercialmente en la producción de proteínas terapéuticas. Se introdujeron en la década de 1960 y se hicieron crecer originalmente como un cultivo en monocapa. Hoy en día, las células CHO son los huéspedes de mamífero más comúnmente usados para la producción industrial de productos terapéuticos de proteínas recombinantes y habitualmente se hacen crecer en cultivo en suspensión.
Ejemplos no limitativos de líneas celulares CHO que están disponibles comercialmente y pueden usarse en el contexto de la presente invención con células FreeStile CHO-S; línea celular ER-CHO; cHO 1-15 500 CHINESE HAM; CHO-DXB, CHOdhfr-, CHO DP-12 clon n.2 1934; CHO-CD36; CHO-ICAM-1; CHO-K1; ovario; HuZP3-CHOLec3.2.8.1; xrs5; células CHO-K1/BB2; células CHO-K1/BB3; células CHO-K1/EDG8/Galpha15; células CHO-K1/M5; células CHO-K1/NK1; células CHO-K1/NK3; células CHO-K1/NMUR1; células CHO-K1/NTSR1; células CHO-K1/OX1; células CHO-K1/PAC1/Ga15; células CHO-K1/PTAFR; células CHO-K1/TRH1; células CHO-K1/V1B; línea celular 5HT1A Galfa-15-NFAT-BLA CHO-K1; línea celular AVPR2 CRE-BLA CHOK1; células CHO-S SFM adaptadas; células DG44; línea celular FIp-In-CHO; línea celular GeneSwitch-CHO; línea celular NFAT-bla CHO-K1; línea celular T-REx-CHO; línea celular estable GenoStat CHO K-1; kit de línea celular estable GenoStat CHO K-1; línea celular CHO-K1 de hámster, línea celular CHO-PEPT1, línea celular CHO SSF3 y/o CHO-HPT1. En una realización particularmente preferida, el sistema de expresión basado en células de hámster es una línea celular CHO-dhfr-.
La muestra que comprende la TNFR2:Fc que va a aplicarse en la etapa (a) puede ser un material de cultivo, tal como un sobrenadante de cultivo celular o un lisado celular. Preferiblemente la disolución es un sobrenadante de cultivo celular libre de células y libre de suero. En una realización incluso más preferida, la disolución se purifica adicionalmente, por ejemplo mediante cromatografía de afinidad y/o cromatografía de interacción hidrófoba. Generalmente la TNFR2:Fc aplicada en la etapa (a) del método dado a conocer en el presente documento comprende una mezcla de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 y TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96.
En una realización preferida, la etapa de desnaturalizar y alquilar (b) se lleva a cabo en un tampón que tiene un pH en el intervalo de 7 a 9, preferiblemente de 7,5 a 8,5, lo más preferiblemente pH 8 aproximadamente. Por ejemplo, el tampón puede ser un tampón TRIS, tal como un tampón que comprende TRIS 10-100 mM, más preferiblemente TRIS 20-80 mM. El tampón comprende además un agente alquilante, por ejemplo yodoacetamida 0,5-1,5 M, preferiblemente yodoacetamida 0,9-1,2 M. Se prefiere adicionalmente que el tampón de la etapa (b) comprenda el 0,02%-0,5% de un tensioactivo escindible, preferiblemente el 0,1%-0,2% de un tensioactivo escindible. En general, puede usarse cualquier tensioactivo escindible que no interfiera con la digestión tríptica. Se seleccionan tensioactivos escindibles particularmente preferidos de 3-[(2-metil-2-undecil-1,3-dioxolan-4-il)-metoxi]-1-propanosulfonato de sodio, 3-((1-(furan-2-il)undeciloxi)carbonilamino)-propano-1-sulfonato de sodio y 3-(4-(1,1-bis(hexiloxi)etil)piridinio-1 -il)propano-1 -sulfonato de sodio. En una realización más preferida, el tensioactivo es 3-[(2-metil-2-undecil-1,3-dioxolan-4-il)metoxi]-1-propanosulfonato de sodio. En general, la etapa (b) se lleva a cabo a una temperatura y durante un tiempo suficientes para desnaturalizar y alquilar la mezcla de TNFR2:Fc aplicada en la etapa (a). Por ejemplo, la etapa (b) puede llevarse a cabo a de 40 a 70°C durante de 30 a 60 min. En una realización preferida, la etapa (b) puede llevarse a cabo a de 50 a 60°C durante de 30 a 45 min.
La digestión en la etapa (c) se lleva a cabo usando una cantidad eficaz de tripsina y aplicando un tiempo suficiente y una temperatura apropiada en condiciones que facilitan la digestión. Por ejemplo, la digestión tríptica puede llevarse a cabo en un tampón adecuado durante 1-24 h, preferiblemente durante 6-18 h; y a 32-38°, tal como a 36-37°C. En muchos casos las condiciones de tampón en la etapa (b) no serán adecuadas para la etapa (c). En estos casos, la etapa (c) puede comprender intercambiar el tampón de la muestra obtenida de la etapa (b) a un tampón de digestión adecuado antes de la digestión. Preferiblemente, dicho tampón de digestión tiene un pH en el intervalo de 5 a 7, más preferiblemente en el intervalo de 5,5 a 6,5. Los tampones de digestión adecuados incluyen tampones de digestión que comprenden MES como agente tamponante, por ejemplo en una concentración de MES 10-100 mM, más preferiblemente MES 30-60 mM. Además del agente tamponante, el tampón de digestión puede comprender también un tensioactivo escindible. El tensioactivo escindible puede ser el mismo que se usó en la etapa (b) o puede ser un tensioactivo escindible diferente. Por consiguiente, el tensioactivo escindible puede seleccionarse de 3-[(2-metil-2-undecil-1,3-dioxolan-4-il)metoxi]-1-propanosulfonato de sodio, 3-((1-(furan-2-il)undeciloxi)carbonilamino)propano-1-sulfonato de sodio y 3-(4-(1,1 -bis(hexiloxi)etil)piridinio-1 -il)propano-1 -sulfonato de sodio. En una realización más preferida el tensioactivo es 3-[(2-metil-2-undecil-1,3-dioxolan-4-il)metoxi]-1-propanosulfonato de sodio. Si está presente, los tampones de digestión comprenden el 0,02%-0,5% de un tensioactivo escindible, preferiblemente el 0,1%-0,2% de tensioactivo escindible. Finalmente, la etapa (c) puede terminarse mediante la adición de ácido fórmico al 1% en acetonitrilo al 10%. El experto en la técnica observará que esta digestión se realiza en condiciones no reductoras.
En la tabla 2, se enumeran todos los fragmentos que se obtienen en una digestión tríptica de una TNFR2:Fc preferida, concretamente etanercept, en condiciones reductoras (!).
Tabla 2
Teniendo en consideración la formación de puentes disulfuro de etanercept mostrada en la tabla 1, el experto en la técnica se dará cuenta inmediatamente de que en condiciones no reductoras tal como se proporcionan en el método de determinación de la presente invención, por ejemplo los fragmentos individuales T1 (aa 1-19) y T3 (aa 22-34) no se obtendrán en moléculas de TNFR2:Fc con un puente disulfuro Cys18-Cys31 intacto ya que están todavía unidos covalentemente por este puente disulfuro. De manera similar, el fragmento T7 (aa 78-90) no se obtendrá a partir de moléculas de TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88 y/o Cys78-Cys96 intactos. Sin embargo, si Cys78 está formando un puente disulfuro con Cys88, se obtendrá un fragmento correspondiente a los aminoácidos 78-90 de TNFR2:Fc.
Entonces, la muestra resultante de la etapa (c) se somete a HPLC, separando de ese modo los fragmentos individuales obtenidos en la digestión tríptica. En particular, según el método presentado en el presente documento, fragmentos indicativos de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 de los otros fragmentos, en particular de fragmentos indicativos de TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88 y/o Cys78-Cys96. Los fragmentos indicativos de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 consisten en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 (“T7”, véase también anteriormente la tabla 2).
Las condiciones aplicadas en la HPLC pueden diferir dependiendo del equipo y las condiciones usadas, pero un experto en la técnica estará capacitado fácilmente para determinar las mismas mediante medidas de rutina y en vista de la orientación adicional proporcionada en la sección de ejemplos más adelante. Columnas adecuadas particulares para HPLC son las que permiten la separación de fragmentos peptídicos, y usando cualquier fase móvil adecuada que mantenga las condiciones no reductoras. En una realización, la etapa (d) se lleva a cabo en una fase móvil que comprende TFA al 0,05%-0,5% en agua, preferiblemente TFA al 0,1%-0,2% en agua.
Usando el cromatograma obtenido en la etapa (d), el experto en la técnica puede realizar una integración de pico para el pico indicativo de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88. Con el fin de evaluar la cantidad relativa de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88, lo más adecuado es comparar el área de pico indicativo de esta isoforma de TNFR2:Fc con el área de un pico no afectado por ninguna formación de puentes disulfuro de los residuos Cys74, Cys78, Cys88 y Cys96. Preferiblemente, el pico no afectado por la formación de puentes disulfuro de los residuos Cys74, Cys78, Cys88 y Cys96 es un pico de un fragmento que no se ve afectado por la formación de puentes disulfuro en absoluto y, por tanto, indicativo de la TNFR:Fc total en la muestra, independientemente de la formación de puentes disulfuro. Este pico de referencia es un péptido además no afectado por la glicosilación o cualquier otra modificación postraduccional. Los fragmentos indicativos de TNFR2:Fc total consisten en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5 (“T27”, véase también anteriormente la tabla 2). Sin embargo, se reconocerá que pueden usarse también otros fragmentos que no se ven afectados por la formación de puentes disulfuro de Cys74, Cys78, Cys88 y Cys96, en particular en vista del patrón de formación de puentes disulfuro conocido proporcionado en la tabla 1 anteriormente.
Por consiguiente, los fragmentos indicativos de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 consisten en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 (“T7”); y los fragmentos indicativos de TNFR2:Fc total consisten en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5 (“T27”). En este caso, la cantidad relativa de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 se determina
(i) integrando las áreas de pico en el cromatograma de HPLC indicativo de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 (“área de T7”) e indicativo de TNFR2:Fc total (“área de T27”); y
(ii) calculando la cantidad relativa según fórmula (1).
área (T7): área de pico del fragmento T7 (SEC ID NO: 4)
área (T27): área de pico del fragmento T27 (SEC ID NO: 5)
El método dado a conocer anteriormente para determinar TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en una muestra que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 puede usarse ventajosamente en gestión de calidad así como en el procedimiento de purificación de TNFR2:Fc.
Por consiguiente, también se proporciona un método de purificación de TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, en el que el método comprende
someter una muestra que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 a al menos una etapa cromatográfica, en el que la al menos una etapa cromatográfica comprende una cromatografía de interacción hidrófoba (HIC); y
separar una o más fracciones que comprenden TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 que tienen una cantidad reducida de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en comparación con la muestra sometida a dicha al menos una etapa cromatográfica;
en el que dicha una o más fracciones comprenden menos del 2,2% de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 basándose en TNFR2:Fc total, preferiblemente menos del 2,1%, preferiblemente menos del 2,0%, preferiblemente menos del 1,9%, preferiblemente menos del 1,8%, más preferiblemente menos del 1,7%, incluso más preferiblemente menos del 1,6% y lo más preferiblemente el 1,5% o menos de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 cuando se determina usando el método que usa integración de picos de T7 y T27 y calculando la cantidad relativa mediante la fórmula (1) tal como se describió anteriormente.
Asimismo, la presente divulgación proporciona un método de purificación de TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, en el que el método comprende
someter una muestra que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 a al menos una etapa cromatográfica, en el que la al menos una etapa cromatográfica comprende una cromatografía de interacción hidrófoba (HIC); y
separar una o más fracciones que comprenden TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 que tienen una cantidad reducida de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en comparación con la muestra sometida a dicha al menos una etapa cromatográfica;
en el que la cantidad de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 se determina usando un método tal como se da a conocer en el presente documento.
En una realización preferida de estos métodos, la secuencia de aminoácidos de la TNFR2:Fc tiene al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, más preferiblemente al menos el 99% de identidad; lo más preferiblemente el 100% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
La disolución que comprende la TNFR2:Fc en bruto se somete habitualmente a cromatografía de afinidad como primera etapa. El término “someter una disolución que comprende dicha TNFR2:Fc a cromatografía de afinidad” tal como se usa en el presente documento pretende indicar que la cromatografía de afinidad es específica para la TNFR2:Fc, es decir esencialmente sólo la TNFR2:Fc se une en primer lugar a una resina por medio de una interacción que es específica para la TNFR2:Fc, luego la resina se lava habitualmente, tras lo cual la TNFR2:Fc se eluye de la resina aplicando condiciones adecuadas. Las resinas de afinidad pueden eluirse cambiando las concentraciones de sal, pH, pI, carga y fuerza iónica en una o más etapas o a través de un gradiente para resolver la TNFR2:Fc.
La resina es normalmente una matriz de gel, a menudo de agarosa, que se ha modificado con el fin de proporcionar una interacción específica con TNFR:Fc.
Por ejemplo, la cromatografía de afinidad puede llevarse a cabo en una resina modificada con proteína A, proteína G, un anticuerpo capaz de unirse a la parte de Fc de dicha TNFR2:Fc o un anticuerpo dirigido con la parte de TNFR2 de dicha TNFR2:Fc. Preferiblemente dicha resina está modificada con proteína A o proteína G, y más preferiblemente, dicha resina está modificada con proteína A. La proteína A es una proteína originalmente encontrada en la pared celular de Staphylococcus aureus que se une con alta afinidad a IgG1 e IgG2 humanas así como IgG2a e IgG2b de ratón. Además, la proteína A se une con afinidad moderada a IgA, IgE e IgM humanas así como a IgG3 e IgG1 de ratón. No reacciona con IgD o IgG3 humanas, o IgA, IgE y IgM murinas. Alternativamente, pueden usarse otras proteínas bacterianas de unión a Fc tales como proteína G o proteína A/G. La proteína G tiene una afinidad de unión a IgG1, IgG2 e IgG4 humanas, y a IgG2a e IgG2b murinas que es comparable a la proteína A. Sin embargo, la proteína G también se une a IgG3 humana e inmunoglobulinas de rata, y su afinidad de unión a IgG 1 e IgG3 murina aumenta en comparación con la proteína A. La proteína G presenta una afinidad aparente con IgA, IgD, IgE o IgM. La proteína A/G es una proteína de fusión recombinante de tanto proteína A como proteína G.
La unión de la proteína A/G es menos dependiente del pH que la proteína A, se une a todas las subclases de IgG humana y de ratón, se une a IgA, IgE, IgM humanas y (en un menor grado) a IgD, pero no se une a IgA o IgM de ratón. Una resina de proteína A adecuada particular es la resina MabSelect SuRe (GE Healthcare). Dicha resina tiene un tamaño de partícula medio de 85 pm y una capacidad de carga de 15-22 g/l de resina. Si la parte de Fc de TNFR2:Fc no reacciona con la proteína A, proteína G o proteína A/G, pueden usarse anticuerpos que son específicos para dicha parte de Fc o la parte de TNFR2. A los expertos en la técnica se les ocurrirán anticuerpos adecuados y están disponibles comercialmente.
La unión de la TNFR2:Fc a la resina o matriz de afinidad se produce habitualmente a pH 6-8, preferiblemente a pH 6,5-7,5, y más preferiblemente a aproximadamente pH 7,0. Por tanto, puede ser necesario ajustar el pH de la disolución antes de la unión a la resina de afinidad. En una realización preferida, la resina que tiene unida dicha TNFR2:Fc se lava entonces con uno o más tampones adecuados.
Tales tampones pueden comprender por ejemplo fosfato de sodio 5-50 mM, cloruro de sodio 20-200 mM pH 6-8; o un tampón fosfato o un tampón citrato o un tampón acetato o una mezcla de estos tampones con una molaridad total de 1-100 mM, preferiblemente 5-50 mM con cloruro de sodio 0-750 mM, pH 5-6,5; o tampones de lavado de cromatografía de afinidad descritos en la técnica.
La elución de TNFR2:Fc la matriz de afinidad se lleva a cabo preferiblemente aplicando condiciones ácidas tales como un pH que oscila entre 2,5 y 4,5, más preferiblemente aplicando un pH que oscila entre 3,0 y 3,5. En determinados casos, es deseable aplicar un gradiente que comienza a partir del pH superior hacia valor de pH inferior. La elución puede llevarse a cabo, por ejemplo, usando un tampón que comprende un tampón basado en ácido acético, ácido cítrico y/o ácido fosfórico a concentraciones de 1-100 mM, preferiblemente 5-50 mM.
Parámetros adicionales, tales como velocidad de flujo, altura de lecho de la columna, etc. tendrán que determinarse caso a cabo usando métodos de rutina. Sin embargo, para ese fin, se apreciará que se conocen bien en la técnica procedimientos cromatográficos de afinidad.
En una realización preferida, la al menos una etapa cromatográfica comprende además una o más etapas de cromatografía de intercambio iónico, que se realizan preferiblemente antes de la etapa de HIC.
Por ejemplo, puede aplicarse una etapa de intercambio catiónico. En particular si un método contiene dos etapas cromatográficas de intercambio iónico, es una práctica general aplicar al menos una etapa cromatográfica de intercambio iónico.
En una realización más preferida, la TNFR2:Fc se somete a una o más etapas de cromatografía de intercambio aniónico tras la cromatografía de afinidad, que permite la separación y purificación de moléculas basándose en su carga. La cromatografía de intercambio aniónico también puede usar una matriz de cromatografía multimodal (MMC), tal como una disponible comercialmente de GE Healthcare con el nombre comercial Capto adhere. La cromatografía de intercambio aniónico puede llevarse a cabo en el modo de unión/elución o modo de flujo pasante o ambos. En determinados casos, puede preferirse que la cromatografía de intercambio aniónico se lleve a cabo en primer lugar en el modo de unión/elución seguido por una segunda etapa de intercambio aniónico en el modo de flujo pasante.
Meramente como ejemplo, a continuación se describe una etapa de cromatografía de intercambio aniónico clásica en el modo de unión/elución.
La TNFR2:Fc se une a la resina de intercambio aniónico a pH 7-8, preferiblemente a pH 7,3-7,7. Una vez que TNFR2:Fc está unida a la resina de intercambio aniónico, dicha resina se lava con un tampón a pH 7-8, un tampón de lavado apropiado puede ser un tampón fosfato, por ejemplo, un tampón que comprende fosfato de sodio 1-50 mM. La elución puede lograrse usando un tampón, tal como un tampón fosfato, citrato o acetato, o una mezcla de los mismos, por ejemplo que comprende fosfato de sodio 1-50 mM, que tiene una concentración de sal que altera la interacción iónica entre la TNFR:Fc y la resina de intercambio aniónico, por ejemplo, cloruro de sodio 100-200 mM.
Meramente como ejemplo, a continuación se describe una etapa de cromatografía de intercambio aniónico multimodal en el modo de flujo pasante.
Para lograr los mejores resultados, la conductividad de la disolución que contiene TNFR2:Fc se ajusta a 20-60 mS/cm, preferiblemente a 25-46 mS/cm; y a pH 5,5-6,5, preferiblemente a pH 5,5-6,2. El tampón puede ser un tampón fosfato, citrato o acetato, o una mezcla de los mismos, por ejemplo un tampón que comprende fosfato de sodio, citrato de sodio o acetato de sodio 1-50 mM; y cloruro de sodio 200-700 mM, preferiblemente cloruro de sodio 250-600 mM.
La(s) fracción/fracciones obtenida(s) tras la(s) etapa(s) de cromatografía de intercambio aniónico que comprende(n) la TNFR:Fc podría(n) someterse entonces a una cromatografía de interacción hidrófoba (HIC).
Tal como se estableció anteriormente, el método de purificación comprende al menos una etapa de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC). A altas concentraciones de sal, grupos no polares en la superficie de la proteína interaccionan con los grupos hidrófobos, por ejemplo grupos octilo o fenilo, de la resina de HIC. Resinas de HIC útiles particulares están disponibles comercialmente, Pheny Sepharose HP (GE Healthcare) y Toyopearl Phenyl 650, por ejemplo Toyopearl Fenilo 650 (M). Puesto que los efectos hidrófobos aumentan por el aumento de la fuerza iónica, el eluyente es normalmente un tampón acuoso con concentraciones de sal decrecientes, concentraciones crecientes de detergente (que altera las interacciones hidrófobas) y/o cambios en el pH. En una realización preferida, la HIC se lleva a cabo en un tampón que tiene un pH que oscila entre 5,5-6,5, preferiblemente pH 5,8-6,5, tal como un pH de 6,0.
Además, antes de la unión de la TNFR2:Fc a la resina de HIC, puede ser necesario ajustar la(s) fracción/fracciones que comprende(n) la TNFR2:Fc, de modo que la conductividad de la disolución esté en el intervalo de 50-100 mS/cm, preferiblemente 70-85 mS/cm. Esto puede lograrse, por ejemplo, diluyendo la(s) fracción/fracciones que comprende(n) la TNFR2:Fc con un tampón citrato de sodio, fosfato de sodio o acetato de sodio que comprende además sulfato de sodio a concentraciones de o por encima de sulfato de sodio 1 M.
Tras la carga de la TNFR2:Fc, la resina de HIC se lava con un tampón adecuado. Por ejemplo, la resina puede lavarse con un tampón de lavado que comprende citrato de sodio, fosfato de sodio o acetato de sodio 50-150 mM, preferiblemente citrato de sodio o fosfato de sodio 50-100 mM; y una concentración apropiada de sulfato de sodio. En una realización preferida, la resina se lava con un tampón de lavado que comprende fosfato de sodio 100 mM y sulfato de sodio 0,6 M; fosfato de sodio 50 mM y sulfato de sodio 0,8 M; fosfato de sodio 50 mM y sulfato de sodio 0,95 M; o citrato de sodio 50 mM y sulfato de sodio 0,8 M. La concentración del tampón y/o del sulfato de sodio puede elegirse como un gradiente, o puede ser cada una única concentración que se encuentra dentro de los intervalos anteriores.
En el caso de que la elución vaya a lograrse disminuyendo la concentración de sal, la TNFR2:Fc puede eluirse aplicando un gradiente del 0-100% de dicho tampón de lavado a un tampón de elución que tiene una concentración inferior de iones. Por ejemplo, el tampón de elución puede ser un tampón citrato, fosfato o acetato, preferiblemente el mismo sistema de tampón usado en dicho tampón de lavado. Más preferiblemente, el tampón de elución comprende citrato de sodio, fosfato de sodio o acetato de sodio 1-100 mM, preferiblemente citrato de sodio o fosfato de sodio 10-50 mM; y sulfato de sodio 0-100 mM, y más preferiblemente sulfato de sodio 0-10 mM. Basándose en los datos reales con respecto al rendimiento y la bioactividad para las fracciones eluidas obtenidas, el experto en la técnica puede seleccionar una ventana de elución óptima, que representa el mejor compromiso de rendimiento, pureza y bioactividad.
Con el uso de una etapa de HIC, el grado de pureza de la muestra, tal como se determina mediante cromatografía de exclusión molecular (SEC) puede aumentarse hasta valores por encima del 90%, preferiblemente por encima del 92%, incluso más preferiblemente por encima del 95%. En particular, esta etapa de HIC permite la reducción de impurezas relacionadas con el producto, tales como productos de degradación (DP) de TNFR2:Fc, productos de agregación (AP) de TNFR2:Fc, dímeros o proteínas TNFR:Fc procesados erróneamente, proteínas TNFR:Fc plegadas erróneamente o dímeros o proteínas TNFR:Fc con formación de puentes disulfuro intercatenarios y/o intracatenarios erróneos. El experto en la técnica entiende que la formación de puentes disulfuro erróneos y el plegamiento erróneo pueden ser mutuamente dependientes y/o sinérgicos. Específicamente, la etapa de HIC puede usarse para reducir la cantidad de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88.
En realizaciones adicionales preferidas, el método puede comprender además una etapa, en la que el eluato de la etapa de HIC se somete a nanofiltración, ultrafiltración y/o diafiltración, con el fin de separar cualquier virus inactivado u otros contaminantes de la disolución purificada y/o transferir la TNFR2:Fc purificada a un tampón más adecuado con el fin de hacer que la TNFR2:Fc esté lista para su procesamiento adicional. Por ejemplo, la TNFR2:Fc purificada puede formularse para dar una composición farmacéutica.
Sin embargo, el porcentaje de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 es también dependiente de las condiciones durante la producción (es decir, fermentación) de la TNFR2:Fc. Por tanto, también se proporciona un método que comprende
(a) producir una composición que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cysg6 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en una célula huésped adecuada; y
(b) purificar la combinación obtenida de TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cysg6 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 mediante el método de purificación tal como se describió anteriormente.
En una realización preferida, la TNFR2:Fc se produce usando una célula huésped CHO. El proceso de producción de cultivo de células CHO que producen TNFR2:Fc se basa en cuatro fases:
1. Fase de inoculación: Tras descongelar un vial de banco de células, el cultivo se expande en una serie de frascos de agitación de tamaño creciente para generar suficiente suspensión celular para iniciar el primer biorreactor.
2. Fase de expansión: Tras el tren de inóculos, se ejecutan uno más cultivos de fase previa de biorreactor para expandir adicionalmente el cultivo antes de iniciar la producción en el biorreactor final. El parámetro clave ‘pH’ es un punto de ajuste controlado durante esta fase de expansión. Durante ambas fases, de inóculo y de expansión, el cultivo se mantiene en la fase de crecimiento exponencial controlando adecuadamente las densidades celulares de transferencia y de siembra.
3. Fase de producción: Se aplica un procedimiento de producción de cultivo celular discontinuo, de alimentación discontinua o de perfusión. Si la temperatura de cultivo celular original es superior, por ejemplo 37°C, la temperatura puede reducirse durante la fase de producción, por ejemplo hasta 30,5-36,5°C, preferiblemente hasta 30,5-35°C, más preferiblemente hasta una temperatura de 31-34°C, incluso más preferiblemente hasta una temperatura de 31,5-33°C, y lo más preferiblemente a una temperatura de 31,5-32,5°C. Sin embargo, es igualmente viable mantener la temperatura de manera constante en los intervalos anteriores ya desde el comienzo de la fase de producción.
4. Clarificación: Tras el final de la fase de producción, se inicia la cosecha. Las células se separan mediante centrifugación seguido por filtración para eliminar residuos.
El procedimiento de CHO que producen TNFR2:Fc puede ejecutarse con el mismo o diferente medio para las fases de inoculación, expansión y producción. En la técnica se conocen medios adecuados para la producción de glicoproteínas en células CHO y se dan a conocer por ejemplo en los documentos US 6.048.728, WO 2011/134920 y WO 2011/134921. Preferiblemente, todos los medios y, si emplea, cualquier alimentación están químicamente definidos y libres de componentes animales.
Tal como se explicó anteriormente, el pH y la temperatura son parámetros críticos para evitar la formación de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88.
Por tanto, en una realización preferida, la célula huésped en la etapa (a) se cultiva a una temperatura de 30,5-36,52C durante la fase de producción; preferiblemente a una temperatura de 30,5-35°C, más preferiblemente a una temperatura de 31-34°C, incluso más preferiblemente a una temperatura de 31,5-33°C y lo más preferiblemente a una temperatura de 31,5-32,5°C. Además, dicha célula huésped se cultiva preferiblemente a un pH de 6,75-7,00 durante la fase de producción; preferiblemente a un pH de 6,80-6,95 y lo más preferiblemente a un pH de 6,85-6,90. Por ejemplo, el pH puede controlarse por medio de pCO2 y/o una disolución de NaOH al 2%. En este contexto, véanse también los datos en la sección de ejemplos.
La composición de TNFR2:Fc, que puede obtenerse usando los métodos anteriores dados a conocer en el presente documento, es particularmente baja en TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 basándose en TNFR2:Fc total. Por tanto, la presente divulgación también proporciona una composición de TNFR2:Fc, en la que la secuencia de aminoácidos de la TNFR2:Fc tiene al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, más preferiblemente al menos el 99% de identidad; lo más preferiblemente el 100% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, que comprende menos del 2,2% de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88, preferiblemente menos del 2,1%, preferiblemente menos del 2,0%, preferiblemente menos del 1,9%, preferiblemente menos del 1,8%, más preferiblemente menos del 1,7%, incluso más preferiblemente menos del 1,6% y lo más preferiblemente el 1,5% o menos de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88, determinado según el método usando integración de pico de T7 y T27 tal como se describió anteriormente.
Una composición de este tipo puede usarse en medicina tal como en un método de tratamiento de un sujeto, en el que la composición se administra al sujeto. Más específicamente, la composición tal como se da a conocer en el presente documento puede usarse en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad seleccionada de enfermedad autoinmunitaria, espondilitis anquilosante, artritis reumatoide juvenil, psoriasis, artritis soriásica, artritis reumatoide, granulomatosis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), hepatitis C, endometriosis, asma, caquexia, dermatitis atópica, alzheimer y cáncer; preferiblemente en el tratamiento de una enfermedad seleccionada de espondilitis anquilosante, artritis reumatoide juvenil, psoriasis, artritis soriásica y artritis reumatoide.
La invención se describe además mediante las siguientes realizaciones.
1. Un método para determinar la cantidad relativa de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en una muestra que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cysg6 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88, en el que el método comprende las etapas de:
(a) proporcionar una muestra que comprende una mezcla de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 y TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96;
(b) desnaturalizar y alquilar la muestra de la etapa (a);
(c) someter la muestra resultante de la etapa (b) a digestión tríptica en condiciones no reductoras;
(d) someter la muestra resultante de la etapa (c) a HPLC, separando de ese modo fragmentos indicativos de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88, en el que dichos fragmentos consisten en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 (“T7”);
(e) realizar una integración de pico para el pico indicativo de fragmentos que consisten en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 (“T7”), y para un pico no afectado por la formación de puentes disulfuro de Cys74, Cys78, Cys88 y Cys96 que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5 (“T27”), tal como se obtiene a partir de la etapa (d); en el que el pico no afectado por la formación de puentes disulfuro de Cys74, Cys78, Cys88 y Cys96 no se ve afectado por la formación de puentes disulfuro en absoluto y es indicativo de la TNFR2:Fc total en la muestra; y
(f) calcular la cantidad relativa según la fórmula (1)
en el que la secuencia de aminoácidos de la parte de TNFR2 de TNFR2:Fc tiene al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, más preferiblemente al menos el 99% de identidad; lo más preferiblemente el 100% de identidad con los aminoácidos 23-257 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
2. El método de la realización 1, en el que la secuencia de aminoácidos de la TNFR2:Fc aplicada a la etapa (a) tiene al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, más preferiblemente al menos el 99% de identidad; lo más preferiblemente el 100% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (etanercept).
3. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que la etapa (b) se lleva a cabo en un tampón que comprende yodoacetamida 0,5-1,5 M, preferiblemente yodoacetamida 0,9-1,2 M.
4. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que la etapa (b) se lleva a cabo en un tampón que comprende el 0,02%-0,5% de un tensioactivo escindible, preferiblemente el 0,1%-0,2%; en particular en el que el tensioactivo se selecciona de 3-[(2-metil-2-undecil-1,3-dioxolan-4-il)metoxi]-1-propanosulfonato de sodio, 3-((1-(furan-2-il)undeciloxi)carbonilamino)propano-1-sulfonato de sodio y 3-(4-(1,1-bis(hexiloxi)etil)piridinio-1-il)propano-1-sulfonato de sodio; más preferiblemente en el que el tensioactivo es 3-[(2-metil-2-undecil-1,3-dioxolan-4-il)metoxi]-1-propanosulfonato de sodio.
5. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que la etapa (b) se lleva a cabo en un tampón que tiene un pH en el intervalo de 7 a 9, preferiblemente de 7,5 a 8,5, lo más preferiblemente de aproximadamente pH 8.
6. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que la etapa (b) se lleva a cabo en un tampón TRIS, preferiblemente en un tampón que comprende TRIS 10-100 mM, más preferiblemente TRIS 20-80 mM.
7. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que la etapa (b) se lleva a cabo a de 40 a 70°C durante de 30 a 60 min, preferiblemente a de 50 a 60°C durante de 30 a 45 min.
8. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que la etapa (c) comprende intercambiar el tampón de la muestra obtenida de la etapa (b) a un tampón de digestión adecuado.
9. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que la etapa (c) se lleva a cabo en un tampón de digestión que tiene un pH en el intervalo de 5 a 7, preferiblemente de 5,5 a 6,5.
10. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que la etapa (c) se lleva a cabo en un tampón de digestión que comprende MES como agente tamponante, preferiblemente en un tampón que comprende MES 10-100 mM, más preferiblemente MES 30-60 mM.
11. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que la etapa (c) se lleva a cabo en un tampón de digestión que comprende el 0,02%-0,5% de un tensioactivo escindible, preferiblemente el 0,1%-0,2%; en particular en el que el tensioactivo se selecciona de 3-[(2-metil-2-undecil-1,3-dioxolan-4-il)metoxi]-1-propanosulfonato de sodio, 3-((1-(furan-2-il)undeciloxi)carbonilamino)propano-1-sulfonato de sodio y 3-(4-(1,1-bis(hexiloxi)etil)piridinio-1 -il)propano-1 -sulfonato de sodio; más preferiblemente en el que el tensioactivo es 3-[(2-metil-2-undecil-1,3-dioxolan-4-il)metoxi]-1 -propanosulfonato de sodio.
12. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que la etapa (c) se lleva a cabo usando una cantidad eficaz de tripsina durante 1-24 h, preferiblemente durante 6-18 h; y a 32-38°, preferiblemente a 36-37°C.
13. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que la etapa (c) se termina mediante la adición de ácido fórmico al 1% en acetonitrilo al 10%.
14. El método de una cualquiera de las realizaciones anteriores, en el que la etapa (d) se lleva a cabo en una fase móvil que comprende TFA al 0,05%-0,5% en agua, preferiblemente TFA al 0,1%-0,2% en agua.
15. Un método de preparación de una composición de TNFR2:Fc que comprende menos del 2,2% de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 basándose en TNFR2:Fc total, en el que el método comprende
someter una muestra que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cysg6 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 a al menos una etapa cromatográfica, en el que la al menos una etapa cromatográfica comprende una cromatografía de interacción hidrófoba (HIC); y
separar una o más fracciones que comprenden TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 que tienen una cantidad reducida de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en comparación con la muestra sometida a dicha al menos una etapa cromatográfica;
en el que dicha una o más fracciones comprenden menos del 2,2% de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 basándose en TNFR2:Fc total, preferiblemente menos del 2,1%, preferiblemente menos del 2,0%, preferiblemente menos del 1,9%, preferiblemente menos del 1,8%, más preferiblemente menos del 1,7%, incluso más preferiblemente menos del 1,6% y lo más preferiblemente el 1,5% o menos de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88, tal como se determina usando un método según la realización 1.
16. Un método de purificación de TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, en el que el método comprende someter una muestra que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y
TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 a al menos una etapa cromatográfica, en el que la al menos una etapa cromatográfica comprende una cromatografía de interacción hidrófoba (HIC); y
separar una o más fracciones que comprenden TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 que tienen una cantidad reducida de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en comparación con la muestra sometida a dicha al menos una etapa cromatográfica;
en el que la cantidad de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 se determina usando un método según una cualquiera de las realizaciones 1-14.
17. El método de la realización 15 o 16, en el que la al menos una etapa cromatográfica comprende además una o más etapas de cromatografía de intercambio iónico, que se realizan preferiblemente antes de la HIC.
18. El método de la realización 17, en el que la una o más etapas de cromatografía de intercambio iónico son una o más etapas de cromatografía de intercambio aniónico.
19. El método de la realización 18, en el que al menos una de la una o más etapas de cromatografía de intercambio aniónico comprenden una cromatografía de intercambio aniónico multimodal.
20. El método de una cualquiera de las realizaciones 15-19, en el que el método comprende además una etapa cromatográfica de afinidad, preferiblemente usando proteína A o proteína G; realizándose dicha etapa cromatográfica de afinidad antes de cualquier otra etapa cromatográfica.
21. El método de una cualquiera de las realizaciones 15-20, en el que la secuencia de aminoácidos de la TNFR2:Fc tiene al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, más preferiblemente al menos el 99% de identidad; lo más preferiblemente el 100% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
22. Un método que comprende
(a) producir una composición que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cysg6 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en una célula huésped adecuada; y
(b) purificar la combinación obtenida de TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 mediante el método de purificación de una cualquiera de las realizaciones 15-21.
23. El método de la realización 22, en el que dicha célula huésped se cultiva a una temperatura de 30,5-36,5°C durante la fase de producción; preferiblemente a una temperatura de 30,5-35°C, más preferiblemente a una temperatura de 31-34°C, incluso más preferiblemente a una temperatura de 31,5-33°C y lo más preferiblemente a una temperatura de 31,5-32,5°C.
24. El método de la realización 22 o 23, en el que dicha célula huésped se cultiva a un pH de 6,75-7,00 durante la fase de producción; preferiblemente a un pH de 6,80-6,95 y lo más preferiblemente a un pH de 6,85-6,90.
25. El método de una cualquiera de las realizaciones 22-24, en el que dicha célula huésped es una célula CHO.
26. Una composición de TNFR2:Fc, en la que la secuencia de aminoácidos de la TNFR2:Fc tiene al menos el 97%, preferiblemente al menos el 98%, más preferiblemente al menos el 99% de identidad; lo más preferiblemente el 100% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, que comprende menos del 2,2% de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 basándose en TNFR2:Fc total, preferiblemente menos del 2,1%, preferiblemente menos del 2,0%, preferiblemente menos del 1,9%, preferiblemente menos del 1,8%, más preferiblemente menos del 1,7%, incluso más preferiblemente menos del 1,6% y lo más preferiblemente el 1,5% o menos de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88, determinado según el método tal como se define en la realización 5.
27. Composición tal como se define en la realización 26, para su uso en medicina.
28. Composición tal como se define en la realización 27, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad seleccionada de enfermedad autoinmunitaria, espondilitis anquilosante, artritis reumatoide juvenil, psoriasis, artritis soriásica, artritis reumatoide, granulomatosis, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), hepatitis C, endometriosis, asma, caquexia, dermatitis atópica, alzheimer y cáncer; preferiblemente en el tratamiento de una enfermedad seleccionada de espondilitis anquilosante, artritis reumatoide juvenil, psoriasis, artritis soriásica y artritis reumatoide.
29. El método de una cualquiera de las realizaciones 15-21, en el que la purificación se realiza a gran escala (100 g de TNFR2:Fc o más).
A continuación, la presente invención se ilustra adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos, que no pretenden limitar el alcance de la presente invención.
Descripción de las figuras
Figura 1: ilustración esquemática de TNFR2:Fc.
Figura 2: TNFR2:Fc (izquierda), TNF-alfa (derecha).
Figura 3: Complejo de TNFR2:Fc y TNF-alfa.
Figura 4: Representación estructural del dominio de receptor de TNF alfa N-terminal de TNFR2:Fc (véase también SEQ ID NO: 1). Los aminoácidos se indican mediante un código de una única letra. Los N-glicanos unidos a asparagina y los O-glicanos unidos a serina o treonina se indican gráficamente. Se muestra la formación de puentes disulfuro correctos mediante barras de color gris claro entre residuos de cisteína específicos.
Figura 5: Representación estructural de péptido T7 con puente disulfuro incorrecto (véase también SEQ ID NO: 4) y el péptido de referencia interno T27 (véase también SEQ ID NO: 5). Los aminoácidos se indican mediante un código de una única letra. El péptido T7 presenta un puente disulfuro aberrante entre las cisteínas 78 y 88 y su abundancia se correlaciona negativamente con la bioactividad. El péptido de referencia T27 no está implicado en la formación de puentes disulfuro.
Figura 6: Puentes disulfuro del receptor (estructura de rayos X tomada de “Solution of the Structure of the TNF-TNFR2 Complex.” Mukai et a/., Sci Signal 3(148), ra83, noviembre de 2010; marcaje de puentes y texto añadido). Figura 7: Datos representativos que muestran la cantidad relativa de T7 determinada según el método usando integración de pico de T7 y T27 tal como se describió anteriormente en diferente muestras con niveles variables de bioactividad. La potencia en el eje y se determinó usando un ensayo de gen indicador, los valores son valores arbitrarios. Se analizaron muestras de diferente calidad y se determinó la correlación basándose en todos los puntos de datos mostrados.
Descripción de las secuencias
SEQ ID NO: 1
(receptor de TNF humano tipo 2; CD120b; p75/80; sec. de ref. (proteína): NP_001057)
MAPVAVWAAL AVGLELWAAAI1ALPAQVAFT PYAPEPGSTCRLREYYDQTA QMCCSKCSPG 60 QHAKVFCTKT SDTVCDSCEDSTYTQLWNWV PECLSCGSRCSSDQVETQAC TREQNRICTC 120 RPGWYCALSK QEGCRLCAPLRKCRPGFGVA RPGTETSDVVCKPCAPGTFñ MTTSSTDICR 180 PHQICNVVAI PGNASMDAVCTSTSPTRSMA PGAVHLPQPVSTRSQHTQPT PEPSTAPSTS 240 FLLPMGPSPP AEGSTGDFALPVGLIVGVTA LGLLIIGVVN CVTMTQVKKK PLCLQREAKV 300 PHLPADKARG TQGPEQQI1LLITAPSSSSSS LESSASALDR RAPTRNQPQA PGVEASGAGE 360 ARASTGSSDS SPGGHGTQVNVTCIVNVCSS SDHSSQCSSQASSTMGDTDS SPSESPKDEQ 420 VPFSKEECAF RSQLETPETL LGSTEEKPI.P LGVPDAGMKP S 461 SEQ ID NO: 2 (dominio constante de cadena pesada de clase IgG1 humana)
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
SEQ ID NO: 3 (Etanercept)
LPAQVAFTPY APEPGSTCRL REYYDQTAQM CC3KCSPGQH AKVFCTKTSD TVCDSCED5T 80
YTQLWNWVPE LLbLbbKLob DQVETQACTR EQNRICTCRP GWYCALSKQE GCRLCAPLRK 120
CRPGFGVARP GTETSDVVCK PCAPGTFSNT TSSTDICRPH QICNVVA1PG NASMDAVCTS 180
TSPTRSMA.PG AVHLPQPVST RSQHTQPTPE PSTAPSTSFL LPMGPSPPAE GSTGDEPKSC 240
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMI5RTPEVT CVVVDV5HED PEVKFMWYVD 300
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK 380
GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPYLDS 420
DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK 467 Ejemplos
Ejemplo 1: Determinación de la cantidad relativa de T7
TNFR2:Fc es una proteína de fusión compuesta por un dominio de anticuerpo Fc C-terminal y un dominio 2 de receptor de TNF alfa N-terminal. La estructura del dominio 2 de receptor de TNF alfa es crítica para la bioactividad de este compuesto biofarmacéutico y es altamente compleja conteniendo múltiples O-glicanos, dos N-glicanos y once puentes disulfuro (véanse también las figuras 4 y 6). Pudo mostrarse que existe al menos una forma variante de la molécula en la sustancia farmacológica de TNFR2:Fc final como resultado de una formación de puentes disulfuro diferente.
Al digerir muestras de TNFR2:Fc con tripsina en condiciones no reductoras, la proteína puede escindirse para dar componentes más pequeños, mientras que las estructuras de puentes disulfuro permanecen intactas. La dilucidación de los péptidos usando análisis de RP-HPLC-EM verificó la presencia de los péptidos con puentes correctos esperados así como un péptido denominado T7, que se mostró que contiene un puente disulfuro aberrante entre las cisteínas 78 y 88 (véanse las figuras 5 y 6, y la tabla 2 anteriormente). Aunque se encontró que la abundancia de algunas estructuras con puentes correctos se correlacionada con una bioactividad aumentada, su diversidad y perfiles de elución complejos impidieron su uso como indicadores estables de bioactividad usando un enfoque de CL-UV/Vis. Sin embargo, el péptido T7 con puentes incorrectos presentó una correlación estable con bioactividad reducida. Se muestran datos representativos en la figura 7, demostrando la fuerte correlación entre la bioactividad y la cantidad relativa de T7 determinada según el método usando integración de pico de T7 y T27 tal como se describió anteriormente.
La cantidad relativa de T7 puede determinarse tal como sigue.
Todas las muestras se descongelan a temperatura ambiente. Todas las etapas de centrifugación se llevan a cabo en una centrífuga refrigerada (por ejemplo, centrífuga Eppendorf 5804R; Eppendorf, Hamburgo, Alemania). Normalmente se usan aproximadamente 80-300 mg, preferiblemente 100-200 mg de proteína por muestra. Con el fin de adaptar el tampón, puede ser necesario concentrar las muestras hasta una concentración de proteína apropiada, por ejemplo usando un dispositivo de concentración tal como Vivaspin 500, 10 kDa, n.° de art. de Sartorius: VS0102. A las muestras o sus concentrados, se les añade tampón de lavado (TRIS 50 mM pH 8) hasta un volumen final de aproximadamente 200 ml de tampón de lavado. Se añaden 100 ml de disolución de desnaturalización. La disolución de desnaturalización se prepara mezclando 950 ml de RapiGest al 0,1% (Waters, n.° 186001861) en TRIS 50 mM pH 8 con 50 ml de yodoacetamida 1 M (Sigma, n.° I1149) en TRIS 50 mM pH 8. El reactivo se prepara directamente antes de su uso, y se cubre por ejemplo con papel de aluminio para protegerlo frente a la luz. Se eliminan las burbujas dando pequeños golpecitos y la muestra se incuba durante 40 min a 50°C (por ejemplo usando Thermomixer Comfort; Eppendorf Hamburgo, Alemania).
Se permite que las muestras se enfríen hasta temperatura ambiente y luego se intercambia el tampón hasta un volumen final de 20 - 40 ml de tampón de digestión (MES 50 mM (Sigma, M5287) en agua para HPLC pH 6). Entonces se transfiere cada muestra a un tubo de reacción con cierre de seguridad, y se añaden 25 ml de tampón de digestión 50 mM (MES 50 mM en agua para HPLC pH) 25 ml de tampón de digestión con tensioactivo (RapiGest al 0,1% (Waters, n.° 186001861) en tampón MES 50 mM pH 6). Se añaden 12 ml de la tripsina 1 mg/ml recién reconstituida (Promega, tripsina Gold, calidad de espec. de masas, reconstituida con tampón MES 50 mM pH 6,0 directamente antes de su uso). La muestra se agita cuidadosamente moviendo suavemente, luego se centrifuga brevemente y se incuba durante 17 h a 37°C en un bloque de calentamiento (por ejemplo Thermomixer Comfort; Eppendorf Hamburgo, Alemania).
Tras la incubación, las muestras se retiran del Thermomixer, y se añaden 49 ml de disolución de terminación (ácido fórmico al 1% (calidad de HPLC, por ejemplo, ThermoScientific, n.° 40967) en acetonitrilo al 10% (acetonitrilo de calidad de HPLC > 99,9%, por ejemplo Merck n.° (1.00030.2500)). Se mezcla suavemente mediante moviendo ligeramente. Las muestras se centrifugan durante aproximadamente 10 min a 16.000g y 6°C. Un sedimento ligeramente opaco puede ser apenas visible tras la centrifugación. Si la muestra es todavía opaca tras esta primera centrifugación, se repite la centrifugación. Entonces se transfiere el sobrenadante a un vial de vidrio de inyector automático de 300 ml, se añade agua hasta un volumen global de aproximadamente 236 ml y se colocan las muestras en un inyector automático enfriado.
Se lleva a cabo HPLC usando un cromatógrafo de líquidos con un detector UV (por ejemplo sistema 1200SL serie LC con desgasificador en línea (G1322A), módulo de bomba binaria (G1312), inyector automático termostatizado (G1329A/G1330A), departamento de columna termostatizado (G1316A), detector de VWD (G1314A); todos de Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) y una columna adecuada (por ejemplo, Ascentis Express Peptide ES-C18, 2,1 mm de DI x 15 cm de L n.° de cat. 53307-U; Supelco). Se usan los siguientes parámetros:
Tiempo de ejecución: 45 min
Velocidad de flujo: 0,8 ml/min
Compresibilidad bomba izquierda 46
Compresibilidad bomba derecha 115
Temperatura de la columna: 60°C (= punto de ajuste)
Volumen de inyección: 50 ml
Temperatura del inyector automático: 2 - 102C
Detector UV: Longitud de onda: 215 nm
Anchura de pico: 0,025 min
Detector MWD/DAD: Longitud de onda: 215 nm
Anchura de pico: 0,03 min
Anchura de banda: 4 nm
Sin referencia
Anchura de rendija: 4 nm
Fase móvil A TFA al 0,1% (grado de HPLC, Fluka n.° 40967) en agua de HPLC Fase móvil B TFA al 0,1% en el 90% de acetonitrilo y el 10% de agua de HPLC
Gradiente
Tabla 3
Para comprobar la transferencia, pueden inyectarse muestras de blanco (fase móvil A) cada por ejemplo 10 inyecciones.
La integración de los cromatogramas se realiza usando un sistema de datos de cromatografía adecuado, por ejemplo Chromeleon (Dionex, Sunnyvale, CA, EE.UU.). La cantidad relativa de péptido T7 se calcula según la siguiente ecuación (fórmula (1)):
Área (T7): área de pico de T7
Área (T27): área de pico de T27
Para garantizar que se aplicó la cantidad apropiada de muestra sobre la columna, se compara el área de pico T27 en unas muestras dadas con el área de pico promedio de una inyección de sustancia de referencia. Los cálculos se realizan según la siguiente ecuación:
amuestra área de pico de T27 de la muestra de TNFR:Fc
areferencia área de pico de T27 promedio de las inyecciones de sustancia de referencia de TNFR:Fc Todas las sustancias eran de grado de Ph. Eur. o de calidad comparable. Los tampones se prepararon con agua purificada y desionizada. Los proveedores y números de orden de instrumentos, materiales y reactivos indicados se facilitan como ejemplos. Estos productos pueden considerarse intercambiables con productos comparables de la misma o mejor calidad.
Lo más notablemente, las cantidades relativas de T7 encontradas en todos los lotes de EE.UU. y UE de Enbrel® examinados mostraron valores del 2,3% o superiores cuando se analizaron y calcularon según el método de determinación de la presente invención usando la señal del péptido T27 como pico de referencia, véase la tabla 5. Tabla 4. Cantidades relativas de T7 en el producto de referencia Enbrel®
Lote T7 [%]
N.21026663 (EE.UU.) 2,4
N.2 F36988 (UE) 2,4
N.2 F76195 (UE) 2,8
N.21028435 (EE.UU.) 2,3
N.21026662 (EE.UU.) 2,3
N.2 F69006 (UE) 2,8
Esto demostró que los métodos de producción y purificación presentados en el presente documento son capaces de producir TNFR2:Fc y en particular etanercept a un nivel sin precedentes de cantidad de T7 reducida.
Ejemplo 2: Producción de TNFR2:Fc con cantidades variables de T7
Se sabe que las variantes con puentes incorrectos pueden formarse ya en el procedimiento anterior (USP) para la fabricación de TNFR2:Fc. Al analizar muestras de estudios de caracterización de procedimientos de DoE (diseño de experimentos), pudo mostrarse que la cantidad de variantes con puentes incorrectos puede verse influida al nivel de USP (véase la tabla 4). Los valores proporcionados se obtienen de un modelo estadístico. Las muestras de TNFR2:Fc tomadas para establecer este modelo se sometieron sólo a cromatografía de afinidad de proteína A y no se purificaron por medio de cromatografía de interacción hidrófoba. La cantidad relativa de T7 se determinó según el método usando integración de pico de T7 y T27 tal como se describe a continuación.
Tabla 5
Ejemplo 3: Purificación de TNFR2:Fc
Durante el procesamiento posterior (DSP), las variantes con puentes incorrectos se agotan principalmente en la etapa de purificación de HIC, mientras que pequeñas cantidades pueden agotarse ya mediante una etapa de purificación de intercambio aniónico previa, tal como una etapa de purificación de MMC en modo de flujo pasante.
Cromatografía de afinidad (proteína A)
El procedimiento de purificación comienza a partir de sobrenadantes de cultivo libres de células. El material se filtró a través de 0,2 pm. Utilizando la parte de Fc de la proteína de fusión, se capturó TNFR:Fc mediante cromatografía de afinidad sobre resina de proteína A. La interacción de la proteína A con la parte de Fc es muy específica. Por tanto, la cromatografía de captura separa muy eficazmente proteínas de la célula huésped (HCP), ADN y virus del producto.
La temperatura del procedimiento era de 21°C. Se cargó el sobrenadante de cultivo celular sobre la resina MabSelect SuRe (GE Healthcare), se equilibró con tampón fosfato de sodio de pH 7,0 que comprende además cloruro de sodio 150 mM. Entonces, se lavó la columna con el mismo tampón hasta que UV280 retorna a la señal cercana al nivel inicial (de aproximadamente 2 a 6 volúmenes de columna).
Para aumentar la capacidad de eliminación de HCP de la etapa de captura, se introdujo una etapa de lavado adicional. Este tampón de lavado contenía acetato de sodio y cloruro de sodio 0-500 mM. Le siguió la elución del producto con un tampón ácido que tenía un pH de ~3,2. Se combinaron los eluatos y se procesaron para la siguiente etapa de purificación.
Cromatografía de intercambio aniónico (AEX)
Claims (14)
1. Método para determinar la cantidad relativa de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en una muestra que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88, en el que el método comprende las etapas de:
(a) proporcionar una muestra que comprende una mezcla de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 y TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96;
(b) desnaturalizar y alquilar la muestra de la etapa (a);
(c) someter la muestra resultante de la etapa (b) a digestión tríptica en condiciones no reductoras;
(d) someter la muestra resultante de la etapa (c) a HPLC, separando de ese modo fragmentos indicativos de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88, en el que dichos fragmentos consisten en la secuencia de aminoácidos mostrada en s Eq ID NO: 4 (“T7”);
(e) realizar una integración de pico para el pico indicativo de fragmentos que consisten en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 (“T7”), y para un pico no afectado por la formación de puentes disulfuro de Cys74, Cys78, Cys88 y Cys96 que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 5 (“T27”), tal como se obtiene a partir de la etapa (d); en el que el pico no afectado por la formación de puentes disulfuro de Cys74, Cys78, Cys88 y Cys96 no se ve afectado por la formación de puentes disulfuro en absoluto y es indicativo de la TNFR:Fc total en la muestra; y
(f) calcular la cantidad relativa según la fórmula (1)
en el que la secuencia de aminoácidos de la parte de TNFR2 de TNFR2:Fc tiene al menos el 97% de identidad con los aminoácidos 1 -235 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
2. Método según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de la TNFR2:Fc aplicada a la etapa (a) tiene al menos el 97% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (b) se lleva a cabo en un tampón que tiene un pH en el intervalo de 7 a 9, que comprende TRIS 10-100 mM, y/o yodoacetamida 0,5-1,5 M, y/o el 0,02%-0,5% de un tensioactivo escindible.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (b) se lleva a cabo a de 40 a 70°C durante de 30 a 60 min.
5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (c) se lleva a cabo en un tampón de digestión que tiene un pH en el intervalo de 5 a 7; y en el que el tampón de digestión comprende MES como agente tamponante; y/o el 0,02%-0,5% de un tensioactivo escindible.
6. Método según la reivindicación 3 o 5, en el que el tensioactivo se selecciona independientemente de 3-[(2-metil-2-undecil-1,3-dioxolan-4-il)metoxi]-1 -propanosulfonato de sodio, 3-((1 -(furan-2-il)undeciloxi)carbonilamino)propano-1 -sulfonato de sodio y 3-(4-(1,1 -bis(hexiloxi)etil)piridinio-1 -il)propano-1 -sulfonato de sodio.
7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (c) se lleva a cabo usando una cantidad eficaz de tripsina durante 1-24 h y a 32-38°C.
8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (d) se lleva a cabo en una fase móvil que comprende TFA al 0,05%-0,5% en agua.
9. Método de purificación de TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, en el que el método comprende someter una muestra que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 a al menos una etapa cromatográfica, en el que la al menos una etapa cromatográfica comprende una cromatografía de interacción hidrófoba (HIC); y separar una o más fracciones que comprenden TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 que tienen una cantidad reducida de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en comparación con la muestra sometida a dicha al menos una etapa cromatográfica; en el que la cantidad de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 se determina usando un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
10. Método que comprende
(a) producir una composición que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en una célula huésped adecuada; y
(b) purificar la combinación obtenida de TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 mediante el método de purificación según la reivindicación 9.
11. Composición de TNFR2:Fc, en la que la secuencia de aminoácidos de la TNFR2:Fc tiene al menos el 97% de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, que comprende menos del 2,2% de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 basándose en TNFR2:Fc total, determinado según el método tal como se define en la reivindicación 1.
12. Composición según la reivindicación 11, que comprende menos del 1,6% de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88, determinado según el método tal como se define en la reivindicación 1.
13. Método de preparación de una composición de TNFR2:Fc según la reivindicación 11, en el que el método comprende someter una muestra que comprende TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 y TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 a al menos una etapa cromatográfica, en el que la al menos una etapa cromatográfica comprende una cromatografía de interacción hidrófoba (HIC); y separar una o más fracciones que comprenden TNFR2:Fc con puentes disulfuro Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 que tienen una cantidad reducida de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 en comparación con la muestra sometida a dicha al menos una etapa cromatográfica; en el que dicha una o más fracciones comprenden menos del 2,2% de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88 basándose en TNFR2:Fc total, tal como se determina usando un método según la reivindicación 1.
14. Método según la reivindicación 13, en el que dicha una o más fracciones comprenden menos del 1,6% de TNFR2:Fc con puente disulfuro Cys78-Cys88, tal como se determina usando un método según la reivindicación 1.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP14177696.3A EP2975050B1 (en) | 2014-07-18 | 2014-07-18 | Quantification of misfolded TNFR2:Fc |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2733298T3 true ES2733298T3 (es) | 2019-11-28 |
Family
ID=51210344
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES14177696T Active ES2733298T3 (es) | 2014-07-18 | 2014-07-18 | Cuantificación de TNFR2:Fc plegado erróneamente |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9598718B2 (es) |
| EP (1) | EP2975050B1 (es) |
| KR (1) | KR20170031145A (es) |
| AU (1) | AU2015289100B2 (es) |
| BR (1) | BR112017000955A2 (es) |
| CA (1) | CA2952342A1 (es) |
| ES (1) | ES2733298T3 (es) |
| MX (1) | MX2017000831A (es) |
| RU (1) | RU2698671C2 (es) |
| WO (1) | WO2016009036A1 (es) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1909831A4 (en) | 2005-06-14 | 2013-02-20 | Amgen Inc | PREPARATIONS OF SPONTANEOUS TAMPING PROTEINS |
| US20180110856A1 (en) | 2016-10-21 | 2018-04-26 | Amgen Inc. | Pharmaceutical Formulations and Methods of Making the Same |
| WO2023053032A1 (en) * | 2021-09-28 | 2023-04-06 | Kashiv Biosciences, Llc | An improved process for purification of fusion protein |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6048728A (en) | 1988-09-23 | 2000-04-11 | Chiron Corporation | Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression |
| US7294481B1 (en) | 1999-01-05 | 2007-11-13 | Immunex Corporation | Method for producing recombinant proteins |
| WO2003102225A1 (en) * | 2002-05-31 | 2003-12-11 | Waters Investments Limited | Destructible surfactants and uses thereof |
| EP1654281A1 (en) | 2003-08-01 | 2006-05-10 | Amgen, Inc. | Crystalline tumor necrosis factor receptor 2 polypeptides |
| US7408030B2 (en) * | 2005-01-13 | 2008-08-05 | North Carolina State University | Purification of immunoglobulins using affinity chromatography and peptide ligands |
| ES2755386T5 (es) * | 2006-08-28 | 2023-04-05 | Ares Trading Sa | Proceso para la purificación de proteínas que contienen fragmentos Fc |
| WO2010002911A2 (en) * | 2008-06-30 | 2010-01-07 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Methods and materials for monitoring myeloma using quantitative mass spetrometry |
| WO2011134921A1 (en) | 2010-04-26 | 2011-11-03 | Novartis Ag | Improved cell culture medium |
| KR101828623B1 (ko) | 2010-04-26 | 2018-02-12 | 노파르티스 아게 | 개선된 세포 배양 배지 |
| CN102382190B (zh) | 2010-09-01 | 2014-04-09 | 山东新时代药业有限公司 | 分离和去除TNFR-Fc融合蛋白中寡聚体的方法 |
| KR20140114278A (ko) * | 2011-02-25 | 2014-09-26 | 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 | 변형된 ｏ-글리코실화를 갖는 단백질의 생산을 위한 효모 균주 |
| EP2723759A4 (en) | 2011-06-24 | 2015-01-28 | Reddys Lab Ltd Dr | PURIFICATION OF CHIMERIC PROTEIN |
| KR101454316B1 (ko) | 2011-08-17 | 2014-10-27 | 한화케미칼 주식회사 | 활성형 ＴＮＦＲ-Ｆｃ 융합 단백질을 제조하는 방법 |
| JP2015533797A (ja) * | 2012-09-11 | 2015-11-26 | コヒラス・バイオサイエンシズ・インコーポレイテッド | 高純度および優れた収率の正確に折り畳まれたエタネルセプト |
| WO2014102814A1 (en) | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Intas Biopharmaceuticals Limited | Process for the purification of fc fusion proteins |
| DK2968495T3 (da) * | 2013-03-15 | 2019-10-14 | Daniel J Capon | Hybrid immunoglobulin indeholdende en ikke-peptid-bro |
-
2014
- 2014-07-18 EP EP14177696.3A patent/EP2975050B1/en not_active Revoked
- 2014-07-18 ES ES14177696T patent/ES2733298T3/es active Active
- 2014-08-08 US US14/455,183 patent/US9598718B2/en active Active
- 2014-10-17 US US14/516,992 patent/US9182410B1/en active Active
-
2015
- 2015-07-17 KR KR1020177001065A patent/KR20170031145A/ko not_active Application Discontinuation
- 2015-07-17 WO PCT/EP2015/066385 patent/WO2016009036A1/en active Application Filing
- 2015-07-17 AU AU2015289100A patent/AU2015289100B2/en not_active Ceased
- 2015-07-17 BR BR112017000955A patent/BR112017000955A2/pt active Search and Examination
- 2015-07-17 CA CA2952342A patent/CA2952342A1/en not_active Abandoned
- 2015-07-17 RU RU2017102487A patent/RU2698671C2/ru active
- 2015-07-17 MX MX2017000831A patent/MX2017000831A/es unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2017102487A3 (es) | 2018-10-03 |
| EP2975050B1 (en) | 2019-05-29 |
| EP2975050A1 (en) | 2016-01-20 |
| KR20170031145A (ko) | 2017-03-20 |
| US9182410B1 (en) | 2015-11-10 |
| CA2952342A1 (en) | 2016-01-21 |
| BR112017000955A2 (pt) | 2018-01-16 |
| RU2017102487A (ru) | 2018-08-20 |
| US9598718B2 (en) | 2017-03-21 |
| AU2015289100A1 (en) | 2017-01-12 |
| MX2017000831A (es) | 2017-05-01 |
| WO2016009036A1 (en) | 2016-01-21 |
| RU2698671C2 (ru) | 2019-08-28 |
| AU2015289100B2 (en) | 2019-08-15 |
| US20160017403A1 (en) | 2016-01-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2676031T3 (es) | Cromatografía de afinidad basada en el receptor Fc | |
| ES2755386T3 (es) | Proceso para la purificación de proteínas que contienen fragmentos Fc | |
| CN112203642A (zh) | 用于皮下注射的包含人透明质酸酶ph20变体和药物的药物组合物 | |
| US9279014B2 (en) | Methods for preparing an active TNFR-Fc fusion protein | |
| EP3048899B1 (en) | On-column viral inactivation methods | |
| ES2670827T3 (es) | Proceso para la purificación del factor estimulador de colonias de granulocitos, G-CSF | |
| CN102171237A (zh) | 使用蛋白a亲和色谱法纯化抗体的方法 | |
| CN106589132A (zh) | 组合物和用于生产组合物的方法 | |
| CA2890575C (en) | Antibody and antibody composition production method | |
| JP6273326B2 (ja) | 移動相の調整によって、ポリペプチド単量体、凝集物およびフラグメントを分離するための選択性を向上させた、イオン交換クロマトグラフィー | |
| ES2733298T3 (es) | Cuantificación de TNFR2:Fc plegado erróneamente | |
| JP7097433B2 (ja) | 宿主細胞ガレクチンおよび他の夾雑物からグリコシル化タンパク質を精製する方法 | |
| JP6396313B2 (ja) | 操作された単量体抗体断片 | |
| JP2016504337A (ja) | イオン交換クロマトグラフィーを使用して高マンノースグリコフォームのレベルを制御する方法 | |
| Stange | Characterization of excipients for their application during purification of monoclonal antibodies and other therapeutic proteins | |
| TW202409060A (zh) | 用於降低脂酶活性之方法 | |
| CN115398236A (zh) | 用于糖基化的蛋白质的电泳的去糖基化方法 |