KR20170031145A - 미스폴딩된 TNFR2:Fc의 정량 - Google Patents

미스폴딩된 TNFR2:Fc의 정량 Download PDF

Info

Publication number
KR20170031145A
KR20170031145A KR1020177001065A KR20177001065A KR20170031145A KR 20170031145 A KR20170031145 A KR 20170031145A KR 1020177001065 A KR1020177001065 A KR 1020177001065A KR 20177001065 A KR20177001065 A KR 20177001065A KR 20170031145 A KR20170031145 A KR 20170031145A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cys
tnfr2
disulfide
ser
tnfr
Prior art date
Application number
KR1020177001065A
Other languages
English (en)
Inventor
알프레드 루프레히터
미카엘 푹스
빌리엄 라마나
요한 홀츠만
크리스토프 포쉬
한스외르크 톨
로베르트 마이어
Original Assignee
산도즈 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=51210344&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20170031145(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 산도즈 아게 filed Critical 산도즈 아게
Publication of KR20170031145A publication Critical patent/KR20170031145A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
    • G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
    • G01N21/33—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using ultraviolet light
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30 CD40 or CD95
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/20—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material formation of disulphide bridges

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 다양한 치료적 적용에 사용되는 융합 단백질인 TNFR2:Fc의 샘플 내의 잘못 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 상대적인 양을 결정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 잘못 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 백분율을 결정하기 위한 상기 방법을 사용하여 TNFR2:Fc를 정제하는 방법 및 이에 의해 얻은 TNFR2:Fc 조성물에 관한 것이다.

Description

미스폴딩된 TNFR2:Fc의 정량{QUANTIFICATION OF MISFOLDED TNFR2:FC}
본 발명은 다양한 치료적 적용에 사용되는 융합 단백질인 TNFR2:Fc의 샘플 내의 특정 잘못 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 상대적인 양을 결정하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 특정 잘못 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 상대적인 양을 결정하기 위한 상기 방법을 사용하여 TNFR2:Fc를 정제하는 방법 및 이에 의해 얻은 TNFR2:Fc 조성물에 관한 것이다.
종양 괴사 인자 알파 (TNF-알파)는 급성기 반응을 자극하는 일군의 시토카인의 구성원이고, 따라서 전신 염증에 관여하는 시토카인이다. TNF-알파는 염증을 유도하고, 아폽토시스 세포 사멸을 유도하며, 종양 형성 및 바이러스 복제를 억제할 수 있다. TNF-알파 생산의 조절 장애는 자가 면역 질환, 강직성 척추염, 연소성 류마티스 관절염, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 베게너 (Wegener) 병 (육아종증), 크론 (Crohn) 병 또는 염증성 장 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), C형 간염, 자궁내막증, 천식, 악액질, 아토피성 피부염, 알츠하이머 (Alzheimer) 병 및 암과 같은 다양한 인간 질환에 관련되어 왔다.
그의 수용체 분자는 TNFR1 및 TNFR2를 포함한다. TNF-R1은 대부분의 조직에서 발현되지만, TNF-R2는 면역계의 세포에서만 발견된다. TNF-알파 동종삼량체와 접촉시, TNF 수용체는 삼량체를 형성하여 세포 내 세포 신호전달을 개시한다.
따라서, TNF-알파에 결합할 수 있는 가용성 TNFR 분자 또는 이의 단편은 TNF-알파에 대한 경쟁적 억제제로서 사용될 수 있다. 본 개시내용은 인간 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 융합된 상기 가용성 TNFR2 분자 (TNFR2:Fc), 및 보다 특히 상기 TNFR2:Fc 분자를 결정, 수득 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
TNFR2:Fc는 재조합 CHO 세포를 사용하는, 예를 들어 디히드로폴레이트 리덕타제 결핍 (dhfr-) CHO 세포를 사용하는 바이오프로세스에 의해 제조될 수 있다. TNFR2:Fc의 한 특정 형태는 겉보기 분자량이 125 kDa인 934개의 아미노산으로 이루어진 에타네르셉트 (etanercept)이다. 이것은 인간 IgG1의 Fc 부분에 연결된 인간 종양 괴사 인자 수용체 (p75)의 세포외 리간드-결합 부분의 동종이량체를 포함한다. 동종이량체의 두 분자에서 Fc 성분은 IgG1의 완전한 힌지, CH2 및 CH3 영역을 함유하지만, CH1 영역은 함유하지 않는다 (도 1 참조). 바람직하게는, 이것은 분비된 가용성 이량체 단백질로서 합성되는 반면, 3개의 디술피드 결합을 통한 Fc 영역의 이량체화는 번역 후에 발생한다.
질량 분광 분석뿐만 아니라 X-선 결정학의 사용에 의해, 바람직한 형태의 TNFR2:Fc, 즉 에타네르셉트의 완전한 디술피드 가교 패턴이 밝혀질 수 있다 (표 1 참조). TNFR2의 결정된 구조의 관련 부분 및 그의 TNF-알파와의 계면은 도 2 및 도 3에 제시되어 있고, 주요 TNFR2:Fc 변이체에 대한 디술피드 변이체의 연결성은 표 1에 요약한다 (또한, 도 4 참조).
<표 1>
에타네르셉트의 디술피드 가교 패턴
Figure pct00001
그러나, 미스폴딩된 TNFR2:Fc는 분석된 모든 TNFR2:Fc 제제에서 발견되었다. 이러한 미스폴딩된 TNFR2:Fc는 TNFR2:Fc가 상기 언급된 임의의 요법에 사용될 때 바람직하지 않다. US 7,294,481은 TNFR2:Fc와 같은 미스폴딩된 TNFR:Fc가 세포 배양 과정의 초기에 형성되고, 수송되며, 발현 산물의 상당한 비율 (약 25-50%)을 나타낸다고 보고하였다. TNFR:Fc 생산 숙주 세포가 생산 단계 동안 25-34℃의 온도에서 배양된다면, 상기 미스폴딩된 TNFR:Fc는 감소될 수 있다고 추가로 보고되었다. 또한, 상기 미스폴딩된 TNFR:Fc는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 분리될 수 있다고 보고되어 있다. 그러나, 본원의 실시예 부분에서 제시되는 바와 같이, 현재 이용가능한 TNFR2:Fc 제제 (엔브렐(ENBREL)®로 판매됨)는 여전히 잘못 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 계속 함유한다 (하기 표 4 참조). 이것은 잘못 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 정확하게 폴딩된 TNFR2:Fc로부터 분리하는 것이 어렵기 때문일 수 있다.
따라서, 예를 들어 요구되는 보다 높은 정도의 순도를 갖는 분획의 선택을 가능하게 하는, 샘플 내의 TNFR2:Fc의 순도 (본원에서, 잘못 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 양)를 결정하는 방법에 대한 필요성이 관련 기술 분야에 존재한다.
본 발명자들은 TNF-알파에 대한 TNF-알파 수용체 부분의 결합 영역에 잘못 가교된 디술피드 (Cys78-Cys88)를 포함하는 TNFR2:Fc 변이체를 확인하였다 (도 5 및 6 참조). 다량의 잘못 가교된 변이체 Cys78-Cys88 ("T7 변이체"또는 "T7")이 효능에 대한 부정적인 영향을 갖는다는 것은 생체 활성과 상기 T7 변이체의 양 사이의 상관 관계에 의해 입증되었다 (도 7 참조).
이러한 발견으로부터 출발하여, 본 발명자들은 비-환원 펩티드 맵핑 (mapping)에 의한 T7 변이체의 정량 방법을 개발하였다. 비-환원 조건 하에서 TNFR2:Fc 샘플을 트립신으로 소화시킴으로써, 단백질은 디술피드 다리 구조는 무손상 상태로 유지하면서 더 작은 성분으로 절단될 수 있다. 그 후, 생성된 펩티드를 역상 크로마토그래피에 의해 크로마토그래피 방식으로 추가로 분리하고, UV/Vis 검출을 통해 검출한다. 이 방법은 부정확하게 가교된 T7 변이체로부터 얻은 펩티드인 소위 T7 펩티드의 양을 상대적으로 정량할 수 있다. 바람직하게는, 부정확하게 가교된 T7 펩티드의 양은 얻어진 크로마토그램에서 T7 펩티드의 신호로부터 결정될 수 있다. 예를 들어, 이것은 디술피드 가교에 의해 영향을 받지 않는 참조 펩티드 또는 잔기 Cys74, Cys78, Cys88 및 Cys96의 디술피드 가교에 의해 영향을 받지 않는 참조 펩티드의 피크 면적에 상대적인 T7 펩티드의 피크 면적으로 표현될 수 있다. 새로 개발된 방법을 사용함으로써, 정확하게 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 T7 변이체가 동시에 용리되고 따라서 순수한 TNFR2:Fc 샘플 및/또는 감소된 양의 T7을 갖는 샘플을 함께 모을 수 없는 샘플을 확인할 수 있고, 이에 의해 최종 TNFR2:Fc 조성물의 개선된 순도/효능을 달성할 수 있다.
보다 구체적으로, Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 샘플에서 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc (즉, T7 변이체)를 결정하는 방법이 제공되고, 이 방법은
(a) Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 혼합물을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 단계 (a)의 샘플을 변성시키고 알킬화하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 생성된 샘플을 트립신 소화에 적용하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 생성된 샘플을 HPLC에 적용하여, Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 나타내는 단편을 분리하는 단계; 및
(e) 단계 (d)로부터 얻은 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 나타내는 피크에 대해 및 Cys74, Cys78, Cys88 및 Cys96의 디술피드 가교에 의해 영향을 받지 않는 피크에 대해 피크 적분을 수행하는 단계
를 포함하고; 여기서 TNFR2:Fc의 TNFR2 부분의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열의 아미노산 23-257에 대해 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일성; 가장 바람직하게는 100% 동일성을 갖는다.
또한, Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 정제하는 방법이 제공되고, 여기서 방법은 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 샘플을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 포함하는 적어도 하나의 크로마토그래피 단계에 적용하고; 상기 적어도 하나의 크로마토그래피 단계에 적용된 샘플에 비해 감소된 양의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 갖는, Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 하나 이상의 분획을 분리하는 것을 포함하고; 본원에 개시된 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 샘플에서 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 결정하는 방법을 사용하고 T7 (서열식별번호: 4) 및 T27 (서열식별번호: 5) 펩티드 신호의 피크 적분을 사용하고 아래에서 설명되는 식 (1)에 의해 상대적인 양을 계산하여 결정될 때, 상기 하나 이상의 분획은 총 TNFR2:Fc에 기초하여 2.2% 미만의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc, 바람직하게는 2.1% 미만, 바람직하게는 2.0% 미만, 바람직하게는 1.9% 미만, 바람직하게는 1.8% 미만, 보다 바람직하게는 1.7% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 1.6% 미만, 가장 바람직하게는 1.5% 또는 그 미만의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함한다.
또한, Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 정제하는 방법이 제공되고, 여기서 방법은 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 샘플을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 포함하는 적어도 하나의 크로마토그래피 단계에 적용하고; 상기 적어도 하나의 크로마토그래피 단계에 적용된 샘플에 비해 감소된 양의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 갖는, Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 하나 이상의 분획을 분리하는 것을 포함하고; Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 양은 본원에 개시된 방법을 사용하여 결정된다.
또한, 본 개시내용은
(a) 적합한 숙주 세포에서 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 조성물을 생산하고;
(b) 얻어진 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 조합물을 본원에 개시된 정제 방법에 의해 정제하는 것
을 포함하는 방법을 제공한다.
마지막으로, 본원에 개시된 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 샘플에서 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 결정하는 방법을 사용하고 T7 (서열식별번호: 4) 및 T27 (서열식별번호: 5) 펩티드 신호의 피크 적분을 사용하고 아래에서 설명되는 식 (1)에 의해 상대적인 양을 계산하여 결정될 때, 2.2% 미만의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc, 바람직하게는 2.1% 미만, 바람직하게는 2.0% 미만, 바람직하게는 1.9% 미만, 바람직하게는 1.8% 미만, 보다 바람직하게는 1.7% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 1.6% 미만, 가장 바람직하게는 1.5% 또는 그 미만의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 TNFR2:Fc의 조성물이 제공되고, 여기서 TNFR2:Fc의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열에 대해 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일성; 가장 바람직하게는 100% 동일성을 갖는다.
상기 조성물은 의학에 사용하기 위해, 예를 들어 자가 면역 질환, 강직성 척추염, 연소성 류마티스 관절염, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 육아종증, 염증성 장 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), C형 간염, 자궁내막증, 천식, 악액질, 아토피성 피부염, 알츠하이머병 및 암으로부터 선택되는 질환의 예방 및/또는 치료; 바람직하게는 강직성 척추염, 연소성 류마티스성 관절염, 건선, 건선성 관절염 및 류마티스성 관절염으로부터 선택되는 질환의 치료에 사용하기 위해 특히 적합하다.
본 개시내용은 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 샘플에서 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 결정하는 방법을 제공하고, 이 방법은
(a) Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 혼합물을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 단계 (a)의 샘플을 변성시키고 알킬화하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 생성된 샘플을 트립신 소화에 적용하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 생성된 샘플을 HPLC에 적용하여, Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 나타내는 단편을 분리하는 단계; 및
(e) 단계 (d)로부터 얻은 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 나타내는 피크에 대해 및 Cys74, Cys78, Cys88 및 Cys96의 디술피드 가교에 의해 영향을 받지 않는 피크에 대해 피크 적분을 수행하는 단계
를 포함하고; TNFR2:Fc의 TNFR2 부분의 아미노산 서열은 서열식별번호: 1의 아미노산 서열의 아미노산 23-257에 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일성; 가장 바람직하게는 100% 동일성을 갖는다. 서열식별번호: 1의 아미노산 1-22는 성숙 분비 단백질에서 절단된 신호 펩티드에 대응한다.
본 개시내용의 측면에서, TNFR2:Fc의 TNFR2 부분은 TNFR2의 세포외 부분의 적어도 150-235, 바람직하게는 200-235, 가장 바람직하게는 233-235 아미노산을 포함하는 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99%, 및 가장 바람직하게는 100% 동일성을 갖고 ELISA 또는 임의의 다른 편리한 검정에 의해 결정될 때 TNF-알파에 계속 결합하는 임의의 TNFR 폴리펩티드를 의미한다. 보다 바람직하게는, 상기 TNFR은 ELISA 또는 임의의 다른 편리한 검정에 의해 결정될 때 TNF-알파 및 릴프독소 알파 (LT-알파)에 결합할 수 있다. 상기 검정은 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
TNFR2의 CDS 및 단백질 서열 (TNF 수용체 유형 2; CD120b; p75/80; 인간의 경우: RefSeq (mRNA): NM_001066, RefSeq (단백질): NP_001057 (서열식별번호: 1)은 관련 기술분야에 알려져 있다.
일반적으로, 폴리펩티드는 문제의 서열이 아미노산 서열의 최상의 매칭 서열과 정렬되고 정렬된 서열에 대한 서열 사이의 서열 동일성이 적어도 x %인 경우, 규정된 길이의 아미노산의 전장에 걸쳐 또 다른 폴리 펩티드와 "적어도 x %의 동일성"을 갖는다. 이러한 정렬은 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 상동성 프로그램, 예컨대 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi의 NCBI 홈페이지에 제공된 "blastp"와 같은 "BLAST" 프로그램을, 상기 홈페이지에 제공된 디폴트 설정을 사용하여 수행될 수 있다. 폴리펩티드 세트의 서열 동일성 백분율을 계산하는 추가의 방법은 관련 기술분야에 알려져 있다.
Fc 영역 (단편 결정화 가능 영역)은 항체의 2개의 중쇄의 제2 및 제3 불변 도메인으로 이루어진 IgG의 경우, 항체의 꼬리 영역을 나타낸다. 특정 실시양태에서, Fc 폴리펩티드는 IgG 클래스 중쇄 또는 그의 단편 및/또는 변이체의 불변 영역을 포함하고, 다른 실시양태에서 다른 이뮤노글로불린 이소형의 불변 영역이 상기 TNFR2:Fc 융합체를 생성시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, IgM 클래스 중쇄의 불변 영역 또는 그의 단편 및/또는 변이체를 포함하는 TNFR2:Fc 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 바람직하게는, Fc 단편은 IgG, 보다 바람직하게는 IgG1, 훨씬 더 바람직하게는 인간 IgG1로부터 유래된다. 서열식별번호: 2에 의해 제공되는 인간 IgG1 클래스 중쇄 불변 도메인의 특정 예를 갖는 이뮤노글로불린 중쇄의 불변 영역은 CH1 도메인 (서열식별번호: 2의 아미노산 1 내지 98), 힌지 영역 (서열식별번호: 2의 아미노산 99 내지 110), CH2 도메인 (서열식별번호: 2의 아미노산 111 내지 223) 및 CH3 도메인 (서열식별번호: 2의 아미노산 224 내지 330)을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, Fc 도메인은 상기 중쇄 CH1 도메인, 힌지 영역, CH2 및 CH3 도메인 중 하나 또는 전부, 또는 이의 단편 또는 변이체를 함유할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태는 서열식별번호: 2의 전부 또는 일부에 융합된 TNFR2 (서열식별번호: 1)의 세포외 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 TNFR2:Fc를, 임의로 TNFR2:Fc의 TNFR2 부분과 Fc 부분 사이에 링커 폴리펩티드와 함께 포함한다. 예를 들어, CH1, CH2 및 전체 힌지 영역은 분자 내에 존재할 수 있다. 추가의 실시양태에서, CH1의 적어도 일부를 포함하는 중쇄 불변 영역은 TNFR2:Fc의 Fc 부분이다. 특정 실시양태는 또한 예를 들어 중쇄 사이에 디술피드 다리를 제공하기 위해 모든 힌지 영역 또는 힌지 영역의 C-말단 절반을 포함할 수 있다. 다량체, 예를 들어, 이량체 TNFR2:Fc가 요구되는 경우, 중쇄 사이의 디술피드 결합 형성에 관여하는 힌지 영역의 부분을 포함하는 것이 중요하다 (예를 들어, 서열식별번호: 2의 아미노산 109를 포함하는 서열식별번호: 2의 아미노산 99 내지 110의 일부). 바람직한 실시 양태에서, Fc 부분은 전체 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 도메인으로 이루어진다. 그러나, TNFR2:Fc는 C-말단 리신 잔기 (서열식별번호: 2의 아미노산 330)를 포함하지 않는 CH3 도메인의 부분을 포함할 수 있고, 이것은 이 잔기가 IgG 중쇄 폴리펩티드의 번역 후 처리시에 제거되는 것으로 관찰되었기 때문이다. Fc 융합체 및 Fc 단편은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 바람직하게는, TNFR2:Fc는 에타네르셉트와 본질적으로 동일/유사하고, 보다 바람직하게는 TNFR2:Fc는 에타네르셉트이다. 에타네르셉트는 p75 TNF-알파 수용체의 세포외 부분의 두 분자의 이량체이고, 각각의 분자는 인간 IgG1의 232개 아미노산 Fc 부분에 융합된 235개 아미노산 TNFR-유래 폴리펩티드로 이루어진다. 에타네르셉트의 단량체 성분의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3에 제시된다. 이 분자의 이량체 형태에서, 이들 융합 폴리펩티드 (또는 "단량체")의 2개는 2개의 단량체의 이뮤노글로불린 부분 사이에 형성되는 3개의 디술피드 결합에 의해 함께 유지된다. 따라서, 에타네르셉트 이량체는 934개의 아미노산으로 이루어지며, 대략 125 킬로달톤의 겉보기 분자량을 갖는다. 북미에서, 에타네르셉트는 상품명 엔브렐(Enbrel)® 하에 암젠 (Amgen)에 의해 판매된다. 와이어쓰 (Wyeth)/화이자 (Pfizer)는 다께다 파마슈티칼스 (Takeda Pharmaceuticals)가 판매하고 있는 일본을 제외한, 북미 이외의 지역의 유일한 엔브렐® 판매사이다.
본원에서 사용되는 용어 "본질적으로 에타네르셉트와 동일한/유사한"은 단계 (a)에 적용된 TNFR2:Fc의 아미노산 서열이 서열식별번호: 3에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 97% 동일성, 바람직하게는 서열식별번호: 3에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 98% 동일성, 보다 바람직하게는 99% 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 대안적으로 또는 추가로, TNFR2:Fc는 서열식별번호: 3의 아미노산 서열과 100% 서열 동일성을 가질 수 있고, (단지) 번역 후 변형에 의해, 예를 들어 글리코실화에 의해 에타네르셉트와 상이하거나 상이하지 않을 수 있다. 글리코실화 패턴을 변경하기 위한 적절한 절차 및 글리코실화 패턴을 결정하기 위한 시험은 통상의 기술자에게 잘 알려져있다.
TNFR2:Fc는 바람직하게는 포유동물 세포 기반 발현 시스템을 사용하여 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 바람직하게는, 상기 포유동물 세포-기반 발현 시스템은 베이비 햄스터 신장 세포주 (예를 들어, BHK21); 차이니즈 햄스터 난소 세포주 (예를 들어, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DXB, 또는 CHO-dhfr-); 뮤린 골수종 세포주 (예를 들어, SP2/0); 마우스 골수종 세포주 (예를 들어, NS0); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, HEK-293); 인간-망막-유래 세포주 (예를 들어, PER-C6), 및/또는 양수세포주 (예를 들어, CAP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나이다. 바람직하게는, 햄스터 세포 기반 발현 시스템이 사용된다. BHK21 ("Baby Hamster Kidney") 세포는 신생아 햄스터 신장 조직의 비정상적으로 급성장하는 일차 배양으로부터 기원하는 클론으로부터 유래된 시리아 햄스터 세포의 유사-배수체 확립 라인에 속한다. 상업적으로 이용가능하고 본 발명의 측면에서 사용될 수 있는 BHK-21 세포주의 비제한적인 예는 BHK-21 (C-13); BHK21-pcDNA3.1-HC; BHK570; Flp-In-BHK 세포주; 및/또는 BHK 21 (클론 13) 햄스터 세포주이다.
차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포는 차이니즈 햄스터의 난소에서 유래된 세포주이다. 이들은 종종 생물학 및 의학 연구에 사용되며, 치료 단백질 생산에서 상업적으로 이용된다. 이들은 1960년대에 도입되었고, 원래는 단층 배양으로서 성장하였다. 현재, CHO 세포는 재조합 단백질 치료제의 산업적 생산에 가장 일반적으로 사용되는 포유동물 숙주이고, 일반적으로 현탁 배양에서 성장된다.
상업적으로 이용가능하고 본 발명의 측면에서 사용될 수 있는 CHO 세포주의 비제한적인 예는 다음과 같다: 프리스타일 (FreeStyle) CHO-S 세포; ER-CHO 세포주; CHO 1-15 500 차이니즈 햄스터; CHO-DXB, CHO-dhfr-, CHO DP-12 클론#1934; CHO-CD36; CHO-ICAM-1; CHO-K1; 난소; HuZP3-CHOLec3.2.8.1; xrs5; CHO-K1/BB2 세포; CHO-K1/BB3 세포; CHO-K1/EDG8/G알파15 세포; CHO-K1/M5 세포; CHO-K1/NK1 세포; CHO-K1/NK3 세포; CHO-K1/NMUR1 세포; CHO-K1/NTSR1 세포; CHO-K1/OX1 세포; CHO-K1/PAC1/Gα15 세포; CHO-K1/PTAFR 세포; CHO-K1/TRH1 세포; CHO-K1/V1B 세포; 5HT1A G알파-15-NFAT-BLA CHO-K1 세포주; AVPR2 CRE-BLA CHO-K1 세포주; CHO-S 세포 SFM 어댑티드 (Adapted); DG44 세포; Flp-In-CHO 세포주; GeneSwitch-CHO 세포주; NFAT-bla CHO-K1 세포주; T-REx-CHO 세포주; GenoStat CHO K-1 안정한 세포주; GenoStat CHO K-1 안정한 세포주 Kit; CHO-K1 세포주 햄스터, CHO-PEPT1 세포주, CHO SSF3 및/또는 CHO-HPT1 세포주. 특히 바람직한 실시양태에서, 햄스터 세포-기반 발현 시스템은 CHO-dhfr- 세포주이다.
단계 (a)에서 적용될 TNFR2:Fc를 포함하는 샘플은 세포 배양 상청액 또는 세포 용 해물과 같은 세포 배양 물질일 수 있다. 바람직하게는, 용액은 무세포 및 무혈청 세포 배양 상청액이다. 훨씬 더 바람직한 양태에서, 용액은 예를 들어 친화도 크로마토그래피 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 추가로 정제된다. 일반적으로, 본원에서 개시되는 방법의 단계 (a)에서 인가되는 TNFR2:Fc는 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 혼합물을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 변성 및 알킬화 단계 (b)는 pH 7 내지 9, 바람직하게는 7.5 내지 8.5, 가장 바람직하게는 약 pH 8을 갖는 완충제 내에서 수행된다. 예를 들어, 완충제는 TRIS 완충제, 예컨대 10-100 mM TRIS, 보다 바람직하게는 20-80 mM TRIS를 포함하는 완충제일 수 있다. 완충제는 알킬화제, 예를 들어 0.5-1.5 M 아이오도아세트 아미드, 바람직하게는 0.9-1.2 M 아이오도아세트아미드를 추가로 포함한다. 또한, 단계 (b)의 완충제는 0.02%-0.5%의 절단가능한 계면활성제, 바람직하게는 0.1%-0.2%의 절단가능한 계면활성제를 포함하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 트립신 소화를 방해하지 않는 임의의 절단가능한 계면활성제가 사용될 수 있다. 특히 바람직한 절단가능한 계면활성제는 나트륨 3-[(2-메틸-2-운데실-1,3-디옥솔란-4-일)-메톡시]-1-프로판술포네이트, 나트륨 3-((1-(푸란-2-일)운데실옥시)카르보닐아미노)-프로판-1-술포네이트, 및 나트륨 3-(4-(1,1-비스(헥실옥시)에틸)피리디늄-1-일)프로판-1-술포네이트로부터 선택된다. 보다 바람직한 실시양태에서, 계면활성제는 나트륨 3-[(2-메틸-2-운데실-1,3-디옥솔란-4-일)메톡시]-1-프로판술포네이트이다. 일반적으로, 단계 (b)는 단계 (a)에서 적용된 TNFR2:Fc 혼합물을 변성시키고 알킬화하기에 충분한 온도에서 및 시간 동안 수행된다. 예를 들어, 단계 (b)는 40 내지 70℃에서 30 내지 60 분 동안 수행될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 단계 (b)는 50 내지 60℃에서 30 내지 45 분 동안 수행될 수 있다.
단계 (c)에서의 트립신 소화는 유효량의 트립신을 사용하여 소화를 촉진시키는 조건 하에서 충분한 시간 및 적절한 온도를 적용하여 수행된다. 예를 들어, 트립신 소화는 적절한 완충제에서 1-24h, 바람직하게는 6-18h 동안; 및 32-38℃, 예컨대 36-37℃에서 수행될 수 있다. 많은 경우에, 단계 (b)의 완충제 조건은 단계 (c)에 적합하지 않을 것이다. 이 경우에, 단계 (c)는 단계 (b)로부터 수득된 샘플의 완충제를 소화 전에 적합한 소화 완충제로 교환하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 소화 완충제는 5 내지 7, 보다 바람직하게는 5.5 내지 6.5의 pH를 갖는다. 적합한 소화 완충제는 완충제로서 MES를, 예를 들어 10-100 mM MES, 보다 바람직하게는 30-60 mM MES의 농도로 포함하는 소화 완충제를 포함한다. 완충제 이외에, 소화 완충제는 또한 절단가능한 계면활성제를 포함할 수 있다. 절단가능한 계면활성제는 단계 (b)에서 사용된 것과 동일할 수 있거나 또는 상이한 분해 가능한 계면활성제일 수 있다. 따라서, 절단가능한 계면활성제는 나트륨 3-[(2-메틸-2-운데실-1,3-디옥솔란-4-일)메톡시]-1-프로판술포네이트, 나트륨 3-((1-(푸란-2-일)운데실옥시)카르보닐아미노)프로판-1-술포네이트, 및 나트륨 3-(4-(1,1-비스(헥실옥시)에틸)피리디늄-1-일)프로판-1-술포네이트로부터 선택될 수 있다. 보다 바람직한 실시양태에서, 계면활성제는 나트륨 3-[(2-메틸-2-운데실-1,3-디옥솔란-4-일)메톡시]-1-프로판술포네이트이다. 존재할 경우, 소화 완충제는 0.02%-0.5%의 절단가능한 계면활성제, 바람직하게는 0.1%-0.2%의 절단가능한 계면활성제를 포함한다. 마지막으로, 단계 (c)는 10% 아세토니트릴 중의 1% 포름산의 첨가에 의해 종결될 수 있다. 통상의 기술자는 이러한 소화가 비-환원 조건 하에서 수행됨을인지할 것이다.
표 2에서, 환원 (!) 조건 하에서, 바람직한 TNFR2:Fc, 즉 에타네르셉트의 트립신 소화에서 수득된 모든 단편이 제시되어 있다.
<표 2>
Figure pct00002
Figure pct00003
표 1에 제시된 에타네르셉트의 디술피드 가교를 고려하여, 통상의 기술자는 본 발명의 결정 방법에서 제공되는 비-환원 조건 하에서, 예를 들어 무손상 Cys18-Cys31 디술피드 다리를 갖는 TNFR2:Fc 분자는 여전히 디술피드 다리에 의해 여전히 공유 결합되어 있기 때문에, 개별 단편 T1 (aa 1-19) 및 T3 (aa 22-34)이 이들 분자에서 얻어지지 않을 것임을 즉각적으로 인식할 것이다. 유사하게, 단편 T7 (aa 78-90)은 무손상 Cys74-Cys88 및/또는 Cys78-Cys96 디술피드 다리를 갖는 TNFR2:Fc 분자로부터 수득되지 않을 것이다. 그러나, Cys78이 Cys88과 디술피드 가교를 형성할 경우, TNFR2:Fc의 아미노산 78-90에 대응하는 단편이 수득된다.
이어서, 단계 (c)로부터 생성된 샘플을 HPLC에 적용함으로써 트립신 소화물에서 수득된 개별 단편을 분리한다. 특히, 본원에서 제시되는 방법에 따르면, Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 나타내는 단편을 다른 단편으로부터, 특히 Cys74-Cys88 및/또는 Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc로부터 분리한다. 특히 바람직한 실시양태에서, Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 나타내는 단편은 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열 ("T7"을, 또한 상기 표 2 참조)을 포함하고, 바람직하게는 이 서열로 이루어진다.
HPLC에서 적용되는 조건은 사용되는 장비 및 조건에 따라 다를 수 있지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 통상적인 조치에 의해 및 하기 실시예 섹션에서 제시되는 추가 지침에 비추어 용이하게 결정할 수 있다. HPLC에 적합한 특정 컬럼은 펩티드 단편의 분리를 허용하고 비-환원 조건을 유지하는 임의의 적합한 이동상을 사용하는 컬럼이다. 한 실시양태에서, 단계 (d)는 물 내의 0.05%-0.5% TFA, 바람직하게는 물 내의 0.1%-0.2%의 TFA를 포함하는 이동상에서 수행된다.
단계 (d)에서 얻은 크로마토그램을 사용하여, 통상의 기술자는 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 나타내는 피크에 대해 피크 적분을 수행할 수 있다. Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 상대적인 양을 평가하기 위해, 상기 TNFR2:Fc 이소형을 나타내는 피크 면적을 잔기 Cys74, Cys78, Cys88, 및 Cys96의 임의의 디술피드 가교에 의해 영향받지 않는 피크의 면적과 비교하는 것이 가장 적합하다. 바람직하게는, 잔기 Cys74, Cys78, Cys88, 및 Cys96의 디술피드 가교에 의해 영향받지 않는 피크는 디술피드 가교에 의해 전혀 영향받지 않고 따라서 디술피드 가교와 무관하게 샘플 내의 총 TNFR:Fc를 나타내는 단편의 피크이다. 훨씬 더 바람직하게는, 상기 참조 피크는 글리코실화 또는 임의의 다른 번역후 변형에 의해 추가의 영향을 받지 않는 펩티드에 대응한다. 또한, 상기 참조 피크는 메티오닌 잔기를 포함하지 않는 펩티드에 대응하는 것이 바람직한데, 그 이유는 메티오닌이 산화되어 2개의 분리된 신호를 생성할 수 있기 때문이다. 또한, 상기 참조 피크가 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 나타내는 단편과, 예컨대 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열 ("T7", 상기 표 2 참조)을 포함하는, 바람직하게는 이 서열로 이루어지는 펩티드와 거의 크기가 같은 펩티드에 대응하는 것이 바람직하다. 총 TNFR2:Fc를 나타내는 단편에 대한 바람직한 예는 서열식별번호: 5 ("T27"), 서열식별번호: 24 ("T22"), 서열식별번호: 29 ("T31") 및 서열식별번호: 36 ("T36") (또한 상기 표 2 참조)의 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 이로 이루어진다. 특히 바람직한 실시양태에서, 총 TNFR2:Fc를 나타내는 단편은 서열식별번호: 5 ("T27")에 제시된 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 이로 이루어진다. 그러나, Cys74, Cys78, Cys88, 및 Cys96의 디술피드 가교에 의해 영향받지 않는 다른 단편이, 특히 상기 표 1에 제시된 공지의 디술피드 가교 패턴에 비추어 또한 사용될 수 있음이 인정될 것이다.
가장 바람직한 실시양태에서, Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 나타내는 단편은 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열 ("T7")을 포함하고, 바람직하게는 이로 이루어지고, 총 TNFR2:Fc를 나타내는 단편은 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열 ("T27")을 포함하고, 바람직하게는 이로 이루어진다. 이 경우, Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 상대적인 양은
(i) Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 나타내는 HPLC 크로마토그램의 피크 면적 ("T7 면적") 및 총 TNFR2:Fc를 나타내는 HPLC 크로마토그램의 피크 면적 ("T27 면적")을 적분하고;
(ii) 하기 식 (1)에 따라 상대적인 양을 계산하는 것에 의해 결정된다:
Figure pct00004
(1)
면적 (T7): 단편 T7 (서열식별번호: 4)의 피크 면적,
면적 (T27): 단편 T27 (서열식별번호: 5)의 피크 면적.
Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 샘플에서 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 결정하기 위한 상기 개시된 방법은 TNFR2:Fc의 품질 관리뿐만 아니라 정제 공정에서 사용될 수 있다.
따라서, 또한 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 정제하는 방법이 제공되고, 여기서 방법은
Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 샘플을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 포함하는 적어도 하나의 크로마토그래피 단계에 적용하고;
상기 적어도 하나의 크로마토그래피 단계에 적용된 샘플에 비해 감소된 양의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 갖는, Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 하나 이상의 분획을 분리하는 것을 포함하고;
T7 및 T27의 피크 적분을 사용하고 상기 설명된 식 (1)에 의해 상대적인 양을 계산하는 방법을 사용하여 결정될 때, 상기 하나 이상의 분획은 총 TNFR2:Fc에 기초하여 2.2% 미만의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc, 바람직하게는 2.1% 미만, 바람직하게는 2.0% 미만, 바람직하게는 1.9% 미만, 바람직하게는 1.8% 미만, 보다 바람직하게는 1.7% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 1.6% 미만, 가장 바람직하게는 1.5% 또는 그 미만의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함한다.
유사하게, 본 개시내용은 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 정제하는 방법을 제공하고, 여기서 방법은
Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 샘플을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 포함하는 적어도 하나의 크로마토그래피 단계에 적용하고;
상기 적어도 하나의 크로마토그래피 단계에 적용된 샘플에 비해 감소된 양의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 갖는, Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 하나 이상의 분획을 분리하는 것을 포함하고;
Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 양은 본원에 개시된 방법을 사용하여 결정된다.
상기 방법의 바람직한 실시양태에서, TNFR2:Fc의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열에 대해 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일성; 가장 바람직하게는 100% 동일성을 갖는다.
조질 TNFR2:Fc를 포함하는 용액은 대체로 1단계로서 친화도 크로마토그래피에 적용된다. 본원에서 사용되는 용어 "상기 TNFR2:Fc를 포함하는 용액을 친화도 크로마토그래피에 적용하는 것"은 친화도 크로마토그래피가 TNFR2:Fc에 특이적임을 나타내고자 의도되고, 즉 본질적으로 TNFR2:Fc만이 TNFR2:Fc에 특이적인 상호작용을 통해 수지에 먼저 결합된 후, 수지는 일반적으로 세척되고, 이후 TNFR2:Fc는 적절한 조건을 적용하여 수지로부터 용리된다. 친화도 수지는 하나 이상의 단계 또는 TNFR2:Fc를 분리하기 위한 구배를 통해 염 농도, pH, pI, 전하 및 이온 강도를 변화시킴으로써 용리될 수 있다. 수지는 전형적으로 종종 TNFR:Fc와의 특이적인 상호작용을 제공하기 위해 변형된 아가로스의 겔 매트릭스이다.
예를 들어, 친화도 크로마토그래피는 단백질 A, 단백질 G, 상기 TNFR2:Fc의 Fc-부분에 결합할 수 있는 항체 또는 상기 TNFR2:Fc의 TNFR2-부분에 대해 작용하는 항체로 변형된 수지 상에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 상기 수지는 단백질 A 또는 단백질 G로 변형되고, 보다 바람직하게는 상기 수지는 단백질 A로 변형된다. 단백질 A는 인간 IgG1 및 IgG2 및 마우스 IgG2a 및 IgG2b에 높은 친화도로 결합하는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 세포벽에서 본래 발견된 단백질이다. 또한, 단백질 A는 인간 IgA, IgE 및 IgM뿐만 아니라 마우스 IgG3 및 IgG1에도 중등도의 친화도로 결합한다. 이것은 인간 IgD 또는 IgG3, 또는 마우스 IgA, IgE 및 IgM과 반응하지 않는다. 대안적으로, 단백질 G 또는 단백질 A/G와 같은 다른 Fc-결합 박테리아 단백질이 사용될 수 있다. 단백질 G는 인간 IgG1, IgG2 및 IgG4에 대한, 및 단백질 A와 대등한 마우스 IgG2a 및 IgG2b에 대한 결합 친화도를 갖는다. 그러나, 단백질 G는 또한 인간 IgG3 및 래트 이뮤노글로불린에 결합하고, 뮤린 IgG1 및 IgG3에 대한 그의 결합 친화도는 단백질 A에 비해 증가한다. 단백질 G는 IgA, IgD, IgE 또는 IgM에 대해 명백한 친화도를 나타내지 않는다. 단백질A/G는 단백질 A와 단백질 G 둘 모두의 재조합 융합 단백질이다. 단백질 A/G의 결합은 단백질 A보다 pH 의존성이 낮으며, 인간 및 마우스 IgG의 모든 하위클래스에 결합하고, 인간 IgA, IgE, IgM 및 (보다 낮은 정도로) IgD에 결합하지만, 마우스 IgA 또는 IgM에는 결합하지 않는다. 특히 적합한 단백질 A 수지는 MabSelect SuRe 수지 (지이 헬쓰케어 (GE Healthcare))이다. 상기 수지는 85 ㎛의 평균 입자 크기 및 15-22 g/L 수지의 로딩 용량을 갖는다. TNFR2:Fc의 Fc-부분이 단백질 A, 단백질 G 또는 단백질 A/G와 반응하지 않는다면, 상기 Fc-부분 또는 TNFR2-부분에 특이적인 항체를 사용할 수 있다. 적합한 항체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명하고, 상업적으로 이용가능하다.
친화도 매트릭스 또는 수지에 대한 TNFR2:Fc의 결합은 대체로 pH 6-8, 바람직하게는 pH 6.5-7.5, 보다 바람직하게는 약 pH 7.0에서 일어난다. 따라서, 친화도 수지에 결합하기 전에 용액의 pH를 조절할 필요가 있을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 상기 TNFR2:Fc가 결합된 수지는 이어서 하나 이상의 적합한 완충제로 세척된다. 상기 완충제는 예를 들어 5-50 mM 인산나트륨, 20-200 mM 염화나트륨 pH 6-8; 또는 포스페이트 완충제 또는 시트레이트 완충제 또는 아세테이트 완충제 또는 총 몰 농도가 1-100 mM, 바람직하게는 5-50 mM인 이들 완충제과 0-750 mM 염화나트륨, pH 5-6.5의 혼합물; 또는 관련 기술분야에서 설명되는 친화도 크로마토그래피 세척 완충제를 포함할 수 있다.
친화도 매트릭스로부터 TNFR2:Fc의 용리는 바람직하게는 산성 조건, 예컨대 2.5 내지 4.5의 pH, 보다 바람직하게는 3.0 내지 3.5의 pH를 적용함으로써 수행된다. 특정 경우에는, 보다 높은 pH에서 시작하여 보다 낮은 pH 값으로 이동하는 구배를 적용하는 것이 바람직하다. 용리는 예를 들어 아세트산, 시트르산 및/또는 인산에 기초한 완충제를 1 내지 100 mM, 바람직하게는 5 내지 50 mM의 농도로 포함하는 완충제를 사용하여 수행할 수 있다.
유량, 컬럼의 층 높이 등과 같은 추가 파라미터는 통상적인 방법을 사용하여 사례별로 결정되어야 한다. 그러나, 이를 위해, 친화도 크로마토그래피 절차는 관련 기술분야에 잘 공지되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 적어도 하나의 크로마토그래피 단계는 바람직하게는 HIC 단계 전에 수행되는 하나 이상의 이온 교환 크로마토그래피 단계를 추가로 포함한다.
예를 들어, 양이온 교환 단계가 적용될 수 있다. 특히, 방법이 2개의 이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는 경우, 적어도 하나의 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 적용하는 것이 일반적이다.
보다 바람직한 양태에서, TNFR2:Fc는 친화도 크로마토그래피 후에 음이온 교환 크로마토그래피의 하나 이상의 단계를 거치며, 이는 그의 전하에 기초한 분자의 분리 및 정제를 허용한다. 음이온 교환 크로마토그래피는 또한 상표명 캅토 어드히어 (Capto adhere)로 지이 헬쓰케어로부터 상업적으로 입수할 수 있는 멀티모드 크로마토그래피 (MMC) 매트릭스를 사용할 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피는 결합/용리 모드 또는 관통 모드 또는 둘 모두의 모드로 수행될 수 있다. 특정 예에서, 음이온 교환 크로마토그래피가 먼저 결합/용리 모드로 수행된 후, 관통 모드로 수행되는 제2 음이온 교환 단계가 수행되는 것이 바람직할 수 있다.
단지 예로서, 아래에서 결합/용리 모드에서의 전통적인 음이온 교환 크로마토그래피 단계가 설명된다.
TNFR2:Fc는 pH 7-8, 바람직하게는 pH 7.3-7.7에서 음이온 교환 수지에 결합된다. TNFR2:Fc가 음이온 교환 수지에 결합된 후, 상기 수지는 pH 7-8의 완충제로 세척되고, 적절한 세척 완충제는 포스페이트 완충제, 예를 들어 1 내지 50 mM 인산나트륨을 포함하는 완충제일 수 있다. 용리는 TNFR:Fc 음이온 교환 수지 사이의 이온 상호작용을 방해하는 염 농도를 갖는 포스페이트, 시트레이트, 또는 아세테이트 완충제, 또는 예를 들어 1-50 mM 인산나트륨을 포함하는 완충제, 예를 들어, 100-200 mM 염화나트륨을 포함하는 이들의 혼합물과 같은 완충제를 사용하여 수행될 수 있다.
단지 예로서, 아래에서 관통 모드에서의 멀티모드 음이온 교환 크로마토그래피 단계가 설명된다.
최상의 결과를 위해, TNFR2:Fc 함유 용액의 전도도는 20-60 mS/cm, 바람직하게는 25-46 mS/cm로; pH 5.5-6.5, 바람직하게는 pH 5.5-6.2로 조정된다. 완충제는 포스페이트, 시트레이트 또는 아세테이트 완충제 또는 이들의 혼합물, 예를 들어 1 내지 50 mM 인산나트륨, 시트르산나트륨 또는 아세트산나트륨; 및 200-700 mM 염화나트륨, 바람직하게는 250-600 mM 염화나트륨을 포함하는 완충제일 수 있다.
이어서, TNFR:Fc를 포함하는 음이온 교환 크로마토그래피 단계(들) 후에 수득된 분획을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)에 적용할 수 있다.
상기한 바와 같이, 정제 방법은 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)의 적어도 하나의 단계를 포함한다. 높은 염 농도에서, 단백질 표면의 비극성 기는 HIC 수지의 소수성 기 (예를 들어 옥틸 또는 페닐기)와 상호작용한다. 특히 유용한 HIC 수지는 시판 중인 페닐 세파로스 (Phenyl Sepharose) HP (지이 헬쓰케어) 및 토요펄 페닐 (Toyopearl Phenyl) 650, 예를 들어 토요펄 페닐 650 (M)이다. 소수성 효과는 증가된 이온 강도에 의해 증가되기 때문에, 용리액은 전형적으로 염 농도를 감소시키고, 세제 (소수성 상호작용을 방해함) 및/또는 pH 변화를 증가시키는 수성 완충제이다. 바람직한 실시양태에서, HIC는 pH 5.5-6.5, 바람직하게는 pH 5.8-6.5, 예컨대 pH 6.0의 완충제 중에서 수행된다.
또한, TNFR2:Fc가 HIC 수지에 결합하기 전에, TNFR2:Fc를 포함하는 분획(들)을 조정하여, 용액의 전도도가 50-100 mS/cm, 바람직하게는 70 내지 85 mS/cm의 범위에 있도록 할 필요가 있을 수 있다. 이것은 예를 들어 1M 또는 그 초과의 황산나트륨 농도에서 황산나트륨을 추가로 포함하는 시트르산나트륨, 인산나트륨 또는 아세트산나트륨 완충제로 TNFR2:Fc를 포함하는 분획(들)을 희석함으로써 달성될 수 있다.
TNFR2:Fc를 로딩한 후, HIC 수지를 적합한 완충제로 세척한다. 예를 들어, 수지는 50-150 mM 시트르산나트륨, 인산나트륨 또는 아세트산나트륨, 바람직하게는 50-100 mM 시트르산나트륨 또는 인산나트륨; 및 적당한 농도의 황산나트륨을 포함하는 세척 완충제로 세척될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 수지는 100 mM 인산나트륨 및 0.6 M 황산나트륨; 50 mM 인산나트륨 및 0.8 M 황산나트륨; 50 mM 인산나트륨 및 0.95 M 황산나트륨; 또는 50 mM 시트르산나트륨 및 0.8 M 황산나트륨을 포함하는 세척 완충제로 세척된다. 완충제 및/또는 황산나트륨의 농도는 구배로서 선택될 수 있거나, 또는 각각 상기 농도 범위 내의 단일 농도일 수 있다.
용리가 염 농도를 감소시켜 달성되어야 하는 경우, 상기 세척 완충제로부터 0-100% 구배를 보다 낮은 농도의 이온을 갖는 용리 완충제에 적용하여 TNFR2:Fc를 용리시킬 수 있다. 예를 들어, 용리 완충제는 시트레이트, 포스페이트 또는 아세테이트 완충제, 바람직하게는 상기 세척 완충제에서 사용된 것과 동일한 완충제 시스템일 수 있다. 보다 바람직하게는, 용리 완충제는 1 내지 100 mM 시트르산나트륨, 인산나트륨 또는 아세트산나트륨, 바람직하게는 10 내지 50 mM 시트르산나트륨 또는 인산나트륨; 및 0-100 mM 황산나트륨, 보다 바람직하게는 0-10 mM 황산나트륨을 포함한다. 수득된 용리된 분획에 대한 수율 및 생물활성에 관한 실제 데이터에 기초하여, 통상의 기술자는 수율, 순도 및 생물활성의 최상의 타협을 나타내는 최적 용리 창 (elution window)을 선택할 수 있다.
HIC 단계의 사용으로, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 결정된 샘플의 순도는 90% 초과, 바람직하게는 92% 초과, 훨씬 더 바람직하게는 95% 초과의 값으로 증가될 수 있다. 특히, 상기 HIC 단계는 TNFR2:Fc의 분해 생성물 (DP), TNFR2:Fc의 응집 생성물 (AP), 잘못 처리된 TNFR:Fc 단백질 또는 이량체, 잘못 폴딩된 TNFR:Fc 단백질 또는 잘못된 쇄내 및/또는 쇄간 디술피드 가교를 갖는 TNFR:Fc 단백질 또는 이량체와 같은 생성물 관련 불순물의 감소를 허용한다. 통상의 기술자는 잘못된 디술피드 가교 및 잘못된 폴딩이 상호 의존적 및/또는 상승적일 수 있음을 이해한다. 구체적으로, HIC 단계는 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 양을 줄일 수 있다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 상기 방법은 정제된 용액으로부터 임의의 불활성화된 바이러스 또는 다른 오염물을 분리하기 위해 및/또는 TNFR2:Fc를 추가 처리를 위해 준비하기 위해 정제된 TNFR2:Fc를 보다 적합한 완충제 내로 전달하기 위해 HIC 단계의 용리물이 나노여과, 한외여과 및/또는 정용여과에 적용되는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 정제된 TNFR2:Fc는 제약 조성물로 제제화될 수 있다. 그러한 제약 조성물은 전형적으로 분취액당 5-100 mg TNFR2:Fc, 바람직하게는 분취액당 10-75 mg TNFR2:Fc, 훨씬 더 바람직하게는 분취액당 20-60 mg TNFR2:Fc, 가장 바람직하게는 분취액당 25-50 mg TNFR2:Fc를 포함한다.
그러나, Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 백분율은 TNFR2:Fc의 생산 (즉, 발효) 동안의 조건에 따라 달라진다. 따라서, 또한
(a) 적합한 숙주 세포에서 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 조성물을 생산하고;
(b) 얻어진 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 조합물을 상기 설명된 정제 방법에 의해 정제하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
바람직한 실시양태에서, TNFR2:Fc는 CHO 숙주 세포를 사용하여 생산된다. TNFR2:Fc 생산 CHO 세포 배양 생산 과정은 4가지 단계를 기반으로 한다:
1. 접종 단계: 세포 은행 바이알을 해동시킨 후, 배양액을 점차 크기가 커지는 일련의 진탕 플라스크에서 팽창시켜 제1 생물 반응기를 시작하기에 충분한 세포 현탁액을 생성한다.
2. 팽창 단계: 접종물 훈련 후에, 최종 생물 반응기에서 생산을 시작하기 전에 하나 이상의 생물 반응기 전단계 배양을 실시하여 배양물을 추가로 팽창시킨다. 핵심 파라미터인 'pH'는 이 팽창 단계 동안 제어되는 설정점이다. 접종 및 팽창 단계 둘 모두 동안, 배양은 이동 및 접종 세포 밀도를 적절하게 제어함으로써 기하급수적인 성장 단계로 유지된다.
3. 생산 단계: 배치, 유가식 (fed-batch) 또는 관류 (perfusion) 세포 배양 생산 공정이 적용된다. 최초 세포 배양 온도가 높으면, 예를 들어 37℃이면, 온도는 생산 단계 동안, 예를 들어 30.5-36.5℃, 바람직하게는 30.5-35℃, 보다 바람직하게는 31-34℃, 훨씬 더 바람직하게는 31.5-33℃, 가장 바람직하게는 31.5-32.5℃의 온도로 낮출 수 있다. 그러나, 온도를 이미 생산 단계의 시작부터 상기 범위로 일정하게 유지하는 것도 역시 가능하다.
4. 설명: 생산 단계 종료 후에, 수확이 개시된다. 세포는 원심분리, 이어서 여과에 의해 분리되어 파편을 제거한다.
TNFR2:Fc 생산 CHO 과정은 접종, 팽창 및 생산 단계에서 동일하거나 다른 배지를 사용하여 수행할 수 있다. CHO 세포에서 당단백질 생산에 적합한 배지는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 US 6,048,728, WO 2011/134920 및 WO 2011/134921에 개시되어 있다. 바람직하게는, 모든 배지, 및 사용될 경우 임의의 영양분 공급원은 화학적으로 규정되고 동물성 성분이 없다.
상술한 바와 같이, pH 및 온도는 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 형성을 방지하는데 중요한 파라미터이다.
따라서, 바람직한 실시양태에서, 단계 (a)의 숙주 세포는 생산 단계 동안 30.5-36.5℃의 온도; 바람직하게는 30.5-35℃의 온도, 보다 바람직하게는 31-34℃의 온도, 훨씬 더 바람직하게는 31.5-33℃의 온도, 가장 바람직하게는 31.5-32.5℃의 온도에서 배양된다. 또한, 상기 숙주 세포는 바람직하게는 생산 단계 동안 6.75-7.00의 pH; 바람직하게는 6.80-6.95의 pH, 가장 바람직하게는 6.85-6.90의 pH에서 배양된다. 예를 들어, pH는 pCO2 및/또는 2% NaOH 용액을 통해 제어될 수 있다. 이와 관련하여, 실시예 섹션의 데이터를 또한 참조한다.
본원에 개시된 상기 방법을 사용하여 얻을 수 있는 TNFR2:Fc의 조성물은 총 TNFR2:Fc에 기초할 때 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 양이 특히 낮다. 따라서, 본 개시내용은 또한 상기 설명된 T7 및 T27의 피크 적분을 사용하는 방법에 따라 결정될 때, 2.2% 미만의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc, 바람직하게는 2.1% 미만, 바람직하게는 2.0% 미만, 바람직하게는 1.9% 미만, 바람직하게는 1.8% 미만, 보다 바람직하게는 1.7% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 1.6% 미만, 가장 바람직하게는 1.5% 또는 그 미만의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 TNFR2:Fc의 조성물을 제공하고, 여기서 TNFR2:Fc의 아미노산 서열은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열에 대해 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일성; 가장 바람직하게는 100% 동일성을 갖는다.
상기 조성물은 의학에서, 예컨대 대상체의 치료 방법에서 사용될 수 있고, 여기서 조성물은 대상체에게 투여된다. 보다 구체적으로, 본원에 개시된 조성물은 자가 면역 질환, 강직성 척추염, 연소성 류마티스 관절염, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 육아종증, 염증성 장 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), C형 간염, 자궁내막증, 천식, 악액질, 아토피성 피부염, 알츠하이머병 및 암으로부터 선택되는 질환의 예방 및/또는 치료; 바람직하게는 강직성 척추염, 연소성 류마티스성 관절염, 건선, 건선성 관절염 및 류마티스성 관절염으로부터 선택되는 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 다음과 같은 실시양태에 의해 추가로 설명된다.
1. (a) Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 혼합물을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
(b) 단계 (a)의 샘플을 변성시키고 알킬화하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 생성된 샘플을 트립신 소화에 적용하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 생성된 샘플을 HPLC에 적용하여, Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 나타내는 단편을 분리하는 단계; 및
(e) 단계 (d)로부터 얻은 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 나타내는 피크에 대해 및 Cys74, Cys78, Cys88 및 Cys96의 디술피드 가교에 의해 영향을 받지 않는 피크에 대해 피크 적분을 수행하는 단계
를 포함하고; 여기서 TNFR2:Fc의 TNFR2 부분의 아미노산 서열이 서열식별번호: 1의 아미노산 서열의 아미노산 23-257에 대해 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일성; 가장 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 것인, Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 샘플에서 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 결정하는 방법.
2. 실시양태 1에 있어서, 단계 (a)에 적용된 TNFR2:Fc의 아미노산 서열이 서열식별번호: 3의 아미노산 서열 (에타네르셉트)에 대해 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일성; 가장 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 것인 방법.
3. 실시양태 1 또는 2에 있어서, Cys74, Cys78, Cys88, 및 Cys96의 디술피드 가교에 의해 영향받지 않는 피크가 디술피드 가교에 의해 전혀 영향받지 않고 샘플 내의 총 TNFR:Fc를 나타내는 것인 방법.
4. 실시양태 3에 있어서, Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 나타내는 단편이 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열 ("T7")을 포함하고, 바람직하게는 이 서열로 이루어지는 것인 방법.
5. 실시양태 4에 있어서, 총 TNFR2:Fc를 나타내는 단편이 서열식별번호: 5에 제시된 아미노산 서열 ("T27")을 포함하고, 바람직하게는 이 서열로 이루어지는 것인 방법.
6. 실시양태 5에 있어서, Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 상대적인 양이
(i) Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 나타내는 HPLC 크로마토그램의 피크 면적 ("T7 면적") 및 총 TNFR2:Fc를 나타내는 HPLC 크로마토그램의 피크 면적 ("T27 면적")을 적분하고;
(ii) 하기 식 (1)에 따라 상대적인 양을 계산하는 것
Figure pct00005
(1)
에 의해 결정되는 것인 방법.
7. 상기 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단계 (b)가 0.5-1.5 M 아이오도아세트아미드, 바람직하게는 0.9-1.2 M 아이오도아세트아미드를 포함하는 완충제 내에서 수행되는 것인 방법.
8. 상기 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단계 (b)가 0.02%-0.5%, 바람직하게는 0.1%-0.2%의 절단가능한 계면활성제를 포함하는 완충제 내에서 수행되고; 특히 계면활성제가 나트륨 3-[(2-메틸-2-운데실-1,3-디옥솔란-4-일)메톡시]-1-프로판술포네이트, 나트륨 3-((1-(푸란-2-일)운데실옥시)카르보닐아미노)프로판-1-술포네이트, 및 나트륨 3-(4-(1,1-비스(헥실옥시)에틸)피리디늄-1-일)프로판-1-술포네이트로부터 선택되고; 보다 바람직하게는 계면활성제가 나트륨 3-[(2-메틸-2-운데실-1,3-디옥솔란-4-일)메톡시]-1-프로판술포네이트인 방법.
9. 상기 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단계 (b)가 pH가 7 내지 9, 바람직하게는 7.5 내지 8.5, 가장 바람직하게는 약 pH 8인 완충제 내에서 수행되는 것인 방법.
10. 상기 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단계 (b)가 TRIS 완충제, 바람직하게는 10-100 mM TRIS, 보다 바람직하게는 20-80 mM TRIS를 포함하는 완충제 내에서 수행되는 것인 방법.
11. 상기 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단계 (b)가 40 내지 70℃에서 30 내지 60 분 동안, 바람직하게는 50 내지 60℃에서 30 내지 45 분 동안 수행되는 것인 방법.
12. 상기 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단계 (c)가 단계 (b)로부터 수득된 샘플의 완충제를 적합한 소화 완충제로 교환하는 것을 포함하는 것인 방법.
13. 상기 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단계 (c)가 pH가 5 내지 7, 바람직하게는 5.5 내지 6.5인 소화 완충제 내에서 수행되는 것인 방법.
14. 상기 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단계 (c)가 완충제로서 MES를 포함하는 소화 완충제 내에서, 바람직하게는 10-100 mM MES, 보다 바람직하게는 30-60 mM MES를 포함하는 소화 완충제 내에서 수행되는 것인 방법.
15. 상기 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단계 (c)가 0.02%-0.5%, 바람직하게는 0.1%-0.2%의 절단가능한 계면활성제를 포함하는 소화 완충제 내에서 수행되고; 특히 계면활성제가 나트륨 3-[(2-메틸-2-운데실-1,3-디옥솔란-4-일)메톡시]-1-프로판술포네이트, 나트륨 3-((1-(푸란-2-일)운데실옥시)카르보닐아미노)프로판-1-술포네이트, 및 나트륨 3-(4-(1,1-비스(헥실옥시)에틸)피리디늄-1-일)프로판-1-술포네이트로부터 선택되고; 보다 바람직하게는 계면활성제가 나트륨 3-[(2-메틸-2-운데실-1,3-디옥솔란-4-일)메톡시]-1-프로판술포네이트인 방법.
16. 상기 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단계 (c)가 유효량의 트립신을 사용하여 1-24h, 바람직하게는 6-18h 동안; 32-38℃, 바람직하게는 36-37℃에서 수행되는 것인 방법.
17. 상기 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단계 (c)가 10% 아세토니트릴 중의 1% 포름산의 첨가에 의해 종결되는 것인 방법.
18. 상기 실시양태 중 어느 한 실시양태에 있어서, 단계 (d)가 물 내의 0.05%-0.5% TFA, 바람직하게는 물 내의 0.1%-0.2% TFA를 포함하는 이동상에서 수행되는 것인 방법.
19. Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 샘플을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 포함하는 적어도 하나의 크로마토그래피 단계에 적용하고;
상기 적어도 하나의 크로마토그래피 단계에 적용된 샘플에 비해 감소된 양의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 갖는, Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 하나 이상의 분획을 분리하는 것
을 포함하고; 실시양태 6에 따른 방법을 사용하여 결정될 때, 상기 하나 이상의 분획은 총 TNFR2:Fc에 기초하여 2.2% 미만의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc, 바람직하게는 2.1% 미만, 바람직하게는 2.0% 미만, 바람직하게는 1.9% 미만, 바람직하게는 1.8% 미만, 보다 바람직하게는 1.7% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 1.6% 미만, 가장 바람직하게는 1.5% 또는 그 미만의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 것인, Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 정제하는 방법.
20. Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 샘플을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 포함하는 적어도 하나의 크로마토그래피 단계에 적용하고;
상기 적어도 하나의 크로마토그래피 단계에 적용된 샘플에 비해 감소된 양의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 갖는, Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 하나 이상의 분획을 분리하는 것
을 포함하고; Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 양은 실시양태 1-18 중 어느 한 실시양태에 따른 방법을 사용하여 결정되는 것인, Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 정제하는 방법.
21. 실시양태 19 또는 20에 있어서, 적어도 하나의 크로마토그래피 단계가 바람직하게는 HIC 전에 수행되는 하나 이상의 이온 교환 크로마토그래피 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
22. 실시양태 21에 있어서, 하나 이상의 이온 교환 크로마토그래피 단계가 하나 이상의 음이온 교환 크로마토그래피 단계 또는 단계들인 방법.
23. 실시양태 22에 있어서, 하나 이상의 음이온 교환 크로마토그래피 단계의 적어도 하나가 멀티모드 음이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법.
24. 실시양태 19-23 중 어느 한 실시양태에 있어서, 방법이 바람직하게는 단백질 A 또는 단백질 G를 사용하는 친화도 크로마토그래피 단계를 추가로 포함하고; 상기 친화도 크로마토그래피 단계는 임의의 다른 크로마토그래피 단계 전에 수행되는 것인 방법.
25. 실시양태 19-24 중 어느 한 실시양태에 있어서, TNFR2:Fc의 아미노산 서열이 서열식별번호: 3의 아미노산 서열에 대해 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일성; 가장 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 것인 방법.
26. (a) 적합한 숙주 세포에서 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 조성물을 생산하고;
(b) 얻어진 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 조합물을 실시양태 19-25 중 어느 한 실시양태의 정제 방법에 의해 정제하는 것
을 포함하는 방법.
27. 실시양태 26에 있어서, 상기 숙주 세포가 생산 단계 동안 30.5-36.5℃의 온도; 바람직하게는 30.5-35℃의 온도, 보다 바람직하게는 31-34℃의 온도, 훨씬 더 바람직하게는 31.5-33℃의 온도, 가장 바람직하게는 31.5-32.5℃의 온도에서 배양되는 것인 방법.
28. 실시양태 26 또는 27에 있어서, 상기 숙주 세포가 생산 단계 동안 6.75-7.00의 pH; 바람직하게는 6.80-6.95의 pH, 가장 바람직하게는 6.85-6.90의 pH에서 배양되는 것인 방법.
29. 실시양태 26-28 중 어느 한 실시양태에 있어서, 상기 숙주 세포가 CHO 세포인 방법.
30. 실시양태 6에 규정된 방법에 따라 결정될 때, 총 TNFR2:Fc에 기초하여 2.2% 미만의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc, 바람직하게는 2.1% 미만, 바람직하게는 2.0% 미만, 바람직하게는 1.9% 미만, 바람직하게는 1.8% 미만, 보다 바람직하게는 1.7% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 1.6% 미만, 가장 바람직하게는 1.5% 또는 그 미만의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하고, 여기서 TNFR2:Fc의 아미노산 서열이 서열식별번호: 3의 아미노산 서열에 대해 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일성; 가장 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 것인 TNFR2:Fc의 조성물.
31. 실시양태 30에 있어서, 의학에 사용하기 위한 조성물.
32. 실시양태 31에 있어서, 자가 면역 질환, 강직성 척추염, 연소성 류마티스 관절염, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 육아종증, 염증성 장 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), C형 간염, 자궁내막증, 천식, 악액질, 아토피성 피부염, 알츠하이머병 및 암으로부터 선택되는 질환의 예방 및/또는 치료; 바람직하게는 강직성 척추염, 연소성 류마티스성 관절염, 건선, 건선성 관절염 및 류마티스성 관절염으로부터 선택되는 질환의 치료에 사용하기 위한 조성물.
33. 실시양태 19-25 중 어느 한 실시양태에 있어서, 정제가 대규모 (100 g 이상의 TNFR2:Fc)로 수행되는 것인 방법.
이하에서, 본 발명은 첨부 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시되고, 이들은 본 발명의 범위를 제한하고자 의도되지 않는다. 본원에서 언급되는 모든 참고문헌은 명백하게 참고로 포함된다.
<도면의 설명>
도 1: TNFR2:Fc의 모식도.
도 2: TNFR2:Fc (좌), TNF-알파 (우).
도 3: TNFR2:Fc 및 TNF-알파의 복합체.
도 4: TNFR2:Fc N-말단 TNF 알파 수용체 도메인 (서열식별번호: 1 참조)의 구조도. 아미노산은 단일 문자 코드로 표시된다. 아스파라긴 연결 N-글리칸 및 세린 또는 트레오닌 연결 O-글리칸은 그래픽으로 표시된다. 정확한 디술피드 가교는 특정 시스테인 잔기 사이의 연회색 막대로 표시된다.
도 5: 부정확하게 디술피드 가교된 펩티드 T7 (또한 서열식별번호: 4 참조) 및 내부 참조 펩티드 T27 (또한 서열식별번호: 5 참조)의 구조도. 아미노산은 단일 문자 코드로 표시된다. T7 펩티드는 시스테인 78과 88 사이의 비정상적인 디술피드 가교를 나타내고, 그의 풍부도는 생물활성과 부정적 상관관계가 있다. 참조 펩티드 T27은 디술피드 가교에 관여하지 않는다.
도 6: 수용체의 디술피드 다리 (문헌 ["Solution of the Structure of TNF-TNFR2 Complex." Mukai et al., Sci Signal 3(148), ra83, Nov 2010]에서 얻은 X-선 구조; 다리 및 설명 부분 표시).
도 7: 다양한 수준의 생물활성을 갖는 상이한 샘플에서 상기한 바와 같이 T7 및 T27의 피크 적분을 사용하는 방법에 따라 결정된 T7의 상대적인 양을 나타내는 보여주는 대표적인 데이터. y-축 상의 효능은 리포터 유전자 검정을 이용하여 결정하였고, 그 값은 임의의 값이다. 상이한 품질의 샘플을 분석하고, 표시된 모든 데이터 점에 기초하여 상관관계를 결정하였다.
<서열의 설명>
서열식별번호: 1
(인간 TNF 수용체 유형 2; CD120b; p75/80; RefSeq (단백질): NP_001057)
Figure pct00006
서열식별번호: 2 (인간 IgG1 클래스 중쇄 불변 도메인)
Figure pct00007
서열식별번호: 3 (에타네르셉트)
Figure pct00008
실시예
실시예 1: T7의 상대적인 양의 결정
TNFR2:Fc는 C-말단 Fc 항체 도메인 및 N-말단 TNF 알파 수용체 2 도메인으로 이루어진 융합 단백질이다. TNF 알파 수용체 도메인 2의 구조는 상기 생물 약제의 생물활성에 중요하고, 여러 개의 O-글리칸, 2개의 N-글리칸 및 11개의 디술피드 다리를 포함하는 매우 복잡한 물질이다 (도 4 및 6 참조). 서로 다른 디술피드 가교의 결과로서, 최종 TNFR2:Fc 약물 물질에 적어도 하나의 변이체 형태의 분자가 존재함을 알 수 있다.
비-환원 조건 하에서 트립신으로 TNFR2:Fc 샘플을 소화함으로써, 단백질은 더 작은 성분으로 절단될 수 있는 반면, 디술피드 다리 구조는 손상되지 않은 채로 유지될 수 있다. RP-HPLC-MS 분석을 이용한 펩티드의 해독은 시스테인 78과 88 사이에 비정상적인 디술피드 다리를 함유하는 것으로 밝혀진, T7으로 명명된 펩티드뿐만 아니라 예상되는 정확하게 연결된 펩티드의 존재를 입증하였다 (도 5 및 6 및 상기 표 2). 일부 정확하게 가교된 구조의 풍부성이 증가된 생물활성과 관련이 있는 것으로 밝혀졌지만, 이들의 다양성 및 복잡한 용리 프로파일은 LC-UV/Vis 접근법을 사용하여 생물활성의 안정적인 지표로 사용할 수 없게 한다. 그러나, 부정확하게 가교된 펩티드 T7은 감소된 생물활성과 안정한 상관관계를 나타냈다. 대표적인 데이터가 도 7에 제시되고, 이것은 상기한 바와 같이 생물활성과, T7 및 T27의 피크 적분을 사용하는 방법에 따라 결정된 T7의 상대적 양 사이의 강한 상관관계를 입증한다.
상대적인 T7 양은 다음과 같이 결정될 수 있다.
모든 샘플은 실온에서 해동한다. 모든 원심분리 단계는 냉장 원심분리기 (예를 들어, 에펜도르프 (Eppendorf) 원심분리기 5804R, 에펜도르프, 독일 함부르크)에서 수행한다. 약 80-300 ㎍, 바람직하게는 100-200 ㎍의 단백질이 전형적으로 샘플당 사용된다. 완충제를 적응시키기 위해, 예를 들어 비바스핀 (Vivaspin) 500, 10 kDa, 사르토리우스 아트. (Sartorius Art.) Nr.: VS0102와 같은 농축 장치를 사용하여 샘플을 적절한 단백질 농도로 농축하는 것이 필요할 수 있다. 샘플 또는 이들의 농축물에 세척 완충제 (50 mM TRIS pH 8)를 약 200 ㎕의 최종 부피의 세척 완충제에 첨가하고, 변성 용액 100 ㎕를 첨가한다. 변성 용액은 50 mM TRIS pH 8 내의 0.1% 라피게스트 (RapiGest) (워터스, no. 186001861) 950 ㎕를 50 mM TRIS pH 8 내의 1 M 아이오도아세트아미드 (시그마 (Sigma), no. I1149) 50 ㎕와 혼합하여 준비한다. 시약은 사용 직전에 준비되며, 빛으로부터 보호하기 위해, 예를 들어 알루미늄 호일로 덮어둔다. 가볍게 두드리면서 거품을 제거하고, 샘플을 50℃에서 40분 동안 인큐베이션한다 (예를 들어, 써모믹서 컴포트 (Thermomixer Comfort) (에펜도르프, 독일 함부르크) 사용).
샘플을 실온으로 냉각한 다음, 완충제를 최종 부피 20 - 40 ㎕의 소화 완충제 (HPLC 물 내의 50 mM MES (시그마, M5287) pH 6)로 교환한다. 이어서, 샘플을 각각 안전한 잠금 반응 튜브에 옮기고, 25 ㎕의 50 mM 소화 완충제 (HPLC 물 내의 50 mM MES pH) + 25 ㎕의 계면활성제가 함유된 소화 완충제 (50 mM MES pH 6 완충제 내의 0.1% 라피게스트 (워터스, 번호 186001861))을 첨가한다. 12 ㎕의 신선하게 재구성된 1 ㎍/㎕ 트립신을 첨가한다 (프로메가 (Promega), 트립신 골드 (Trypsin Gold), 질량 분광 등급, 사용 전에 50 mM MES pH 6.0 완충제로 재구성). 샘플을 부드럽게 쳐서 조심스럽게 교반한 후, 바로 원심분리하고, 가열 블록 (예를 들어, 써모믹서 컴포트, 에펜도르프, 독일 함부르크)에서 37℃에서 17h 동안 인큐베이션한다.
인큐베이션 후, 샘플을 써모믹서에서 꺼내고, 10% 아세토 니트릴 (HPLC 등급의 아세토 니트릴 ≥ 99.9 %, 예를 들어 머크 (Merck) no. (1.00030.2500)) 내의 49 ㎕의 종결 용액 (1% 포름산 (HPLC 등급, 예를 들어 써모사이언티픽 (ThermoScientific), 번호 40967)을 첨가한다. 이것을 가볍게 쳐서 부드럽게 혼합한다. 샘플을 16,000g 및 6℃에서 약 10 분 동안 원심분리한다. 약간 불투명한 펠렛은 원심분리 후 거의 보이지 않을 수 있다. 상기 1차 원심분리 후 샘플이 여전히 불투명하면, 원심분리를 반복한다. 이후에, 상청액을 300 ㎕ 자동 샘플 주입기 유리 바이알에 넣고, 물을 약 236 ㎕의 전체 부피에 첨가하고, 샘플을 냉각된 자동 샘플 주입기에 넣는다.
HPLC는 UV 검출기 (예를 들어, 온라인 탈기 장치 (G1322A), 바이너리 펌프 모듈 (G1312), 자동 온도 조절 자동 샘플 주입기 (G1329A/G1330A), 자동 온도 조절 컬럼 부분 (G1316A), VWD 검출기 G1314A)가 있는 1200SL 시리즈 LC 시스템, 모두 애질런트 테크놀로지스 (Agilent Technologies), 독일 발트브론) 및 적합한 컬럼 (예를 들어, 아센티스 익스프레스 펩티드 (Ascentis Express Peptide) ES-C18, 2.1mm ID x 15cm L Cat. No. 53307-U, 수펠 코 (Supelco))가 구비된 액체 크로마토그래피에 의해 수행한다. 다음 매개 변수가 사용된다.
실행 시간: 45 분
유속: 0.8 mL/분
압축성 좌측 펌프 46
압축성 우측 펌프 115
컬럼 온도: 60℃ (= 설정값)
주사 부피: 50 ㎕
자동 샘플 주입기 온도: 2 - 10℃
UV 검출기: 파장: 215 nm
피크폭: 0.025 분
MWD/DAD 검출기: 파장: 215 nm
피크폭: 0.03 분
대역폭: 4 nm
참조물 없음
슬릿폭: 4 nm
이동상 A HPLC 물 내의 0.1% TFA (HPLC 등급, 플루카 (Fluka)
no. 40967)
이동상 B 90% 아세토니트릴 및 10% HPLC 물 내의 0.1% TFA
구배
<표 3>
Figure pct00009
교차오염을 확인하기 위해 블랭크 샘플 (이동상 A)를 예를 들어 10회 주입할 때마다 주입할 수 있다.
크로마토그램의 적분은 적절한 크로마토그래피 데이터 시스템, 예를 들어 크로멜레온 (Chromeleon) (디오넥스 (Dionex), 미국 캘리포니아주 서니베일)을 사용하여 수행됩니다. T7 펩티드의 상대적인 양은 하기 식 (식 (1))에 따라 계산된다:
Figure pct00010
(1)
면적 (T7): T7의 피크 면적,
면적 (T27): T27의 피크 면적.
적절한 양의 샘플이 컬럼에 적용되도록 보장하기 위해, 제시된 샘플의 피크 면적 T27을 참조물 주입시의 평균 피크 면적과 비교한다. 계산은 다음 식에 따라 수행된다.
Figure pct00011
a샘플: TNFR:Fc 샘플의 T27 피크 면적,
a참조물: TNFR:Fc 참조물 주입시의 평균 T27 피크 면적.
사용된 모든 물질은 유럽 약전 등급 또는 대등한 품질의 것이었다. 완충제는 정제된 탈이온수로 제조하였다. 지시된 기기, 물질 및 시약에 대한 공급자 및 주문 번호는 예로서 제시된다. 이 제품들은 동일하거나 더 우수한 품질의 대등한 제품과 교환가능한 것으로 간주될 수 있다.
특히, 엔브렐®의 모든 US와 EU 배치에서 발견되는 T7의 상대적인 양은 참조 피크로서 T27 펩티드의 신호를 이용하여, 본 발명의 결정 방법에 따라 분석 및 계산될 때 2.3% 이상의 값을 나타내었다 (표 5 참조).
<표 4>
참조 제품 엔브렐® 내의 T7의 상대적인 양
Figure pct00012
이것은 본원에 제시된 생산 및 정제 방법이, T7 양이 전례없이 감소된 수준에서 TNFR2:Fc 및 특히 에타네르셉트를 생산할 수 있음을 입증하였다.
실시예 2: 다양한 양의 T7을 갖는 TNFR2:Fc 생산
잘못 가교된 변이체가 TNFR2:Fc의 제조를 위한 상류 공정 (USP)에서 이미 형성 될 수 있다는 것이 알려져 있다. DoE (Design of Experiment) 프로세스 특성화 연구의 샘플을 분석함으로써, 잘못 가교된 변이체의 양이 USP 수준에 영향을 미칠 수 있음을 알 수 있다 (표 4 참조). 제시된 값은 통계 모델로부터 얻은 것이다. 이 모델을 만들기 위해 채취한 TNFR2:Fc 샘플은 단백질 A 친화도 크로마토그래피에만 적용되었고, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 통해 정제되지 않았다. T7의 상대적인 양은 아래에서 설명되는 바와 같이 T7 및 T27의 피크 적분을 사용하는 방법에 따라 결정되었다.
<표 5>
Figure pct00013
실시예 3: TNFR2:Fc의 정제
하류 처리 (DSP) 동안, 잘못 가교된 변이체는 주로 HIC 정제 단계에서 고갈되지만, 소량은 관통 모드에서의 MMC 정제 단계와 같은 이전의 음이온 교환 정제 단계에 의해 이미 고갈될 수 있다.
친화도 크로마토그래피 (단백질 A)
정제 과정은 무세포 배양 상청액으로부터 시작한다. 물질을 0.2 ㎛ 여과하였다. 융합 단백질의 Fc 부분을 이용하여, TNFR:Fc는 단백질 A 수지에 대한 친화도 크로마토그래피에 의해 포획되었다. Fc 부분과의 단백질 A 상호작용은 매우 특이적이다. 따라서, 포획 크로마토그래피는 숙주 세포 단백질 (HCP), DNA 및 바이러스를 생성물로부터 매우 효율적으로 분리한다.
공정 온도는 21℃이었다. 세포 배양 상청액을, 150 mM 염화나트륨을 추가로 포함하는 pH 7.0의 인산나트륨 완충제로 평형화된 MabSelect SuRe 수지 (지이 헬쓰케어) 상에 로딩하였다. 이어서, 컬럼을 UV280이 기준선 (약 2 내지 6개의 컬럼 부피)에 근접한 신호에 복귀할 때까지 동일한 완충제로 세척하였다.
포획 단계의 HCP 제거 능력을 증가시키기 위해, 추가의 세척 단계가 도입되었다. 이 세척 완충제는 아세트산나트륨 및 0-500 mM 염화나트륨을 함유하였다. 이어서, ~3.2의 pH를 갖는 산성 완충제로 생성물을 용리하였다. 용리액을 합하고, 다음 정제 단계로 처리하였다.
음이온 교환 크로마토그래피 (AEX)
친화도 크로마토그래피 단계로부터 생성된 중간체를 pH 7.5로 조정하고, 프락토겔 (Fractogel) TMAE HiCap (M) 수지 (머크) 상에 로딩하였다. 이어서, 컬럼을 인산나트륨 완충제로 세정하고, 최종적으로 생성물을 150 mM 염화나트륨을 함유하는 인산나트륨 완충제로 용리하였다. 용리액을 합하고, 다음 정제 단계로 처리하였다.
MM 크로마토그래피 (MMC)
음이온 교환 크로마토그래피 단계로부터 합한 용리액을 4 M 염화나트륨을 사용하여 전도도를 조정하고, pH ≤ 2인 인산 용액을 사용하여 pH를 pH 6.0으로 조정하였다. 이어서, 중간체를 캅토 어드히어 수지 (지이 헬쓰케어) 상에 로딩하고, 20 mM 인산나트륨, 450 mM 염화나트륨 pH 6.0으로 평형화한 다음, 컬럼을 20 mM 인산나트륨, 450 mM 염화나트륨 (pH 6.0)으로 세척하였다. 생성물을 포함하는 관통 및 조기 세척 액을 수거하고, 한데 모았다.
소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)
MM 크로마토그래피로부터 한데 모든 분획을 1.4 M 황산나트륨을 포함하는 시트르산나트륨 완충제 (pH 6.0)로 희석하였다. 용액의 전도도는 약 80 mS/cm이었다. 이어서, 용액을 토요펄 페닐 650 (M)에 로딩하고, 황산나트륨을 포함하는 시트르산나트륨 완충제 (pH 6.0)로 평형화하였다. 이어서, 동일한 완충제로 컬럼을 세정하였다. 마지막으로, 평형 완충제로부터 용리 완충제 (25 mM 시트르산나트륨 pH 6.0)까지 0-100% 구배를 사용하여 컬럼을 용리한다.
생성물의 순도는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하고 DNA, 숙주 세포 단백질 (HCP), 단백질 A 및 내독소의 양을 측정하여 결정하였다. 또한, 단계 수율 및 총 수율은 각각의 정제 단계에 대해 계산되었다. 하기 표 8은 적어도 3회 실시된 상기 설명된 방법으로 얻은 데이터를 제시한다.
<표 6>
하류 처리 동안 펩티드 T7의 고갈
Figure pct00014
실시예 4: 스트레스 조건 하에서의 안정성
본원에 개시된 방법을 적용하면, 관련 기술 분야의 기술 수준에서 TNFR:Fc 제제와 비교하여 감소된 상대적인 T7 양을 갖는 TNFR:Fc 제제를 수득할 수 있다. T7의 낮은 양은 스트레스 처리시에도 유지된다.
<표 7>
Figure pct00015
참고문헌 목록
US 7,294,481
US 6,048,728
WO 2011/134920
WO 2011/134921
Mukai et al. (2010) "Solution of the Structure of TNF-TNFR2 Complex.", Sci Signal 3 (148), ra83
SEQUENCE LISTING <110> Sandoz AG <120> Quantification of misfolded TNFR2:Fc <130> 30A-128839 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 461 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu 1 5 10 15 Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr 20 25 30 Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln 35 40 45 Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys 50 55 60 Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys 85 90 95 Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg 100 105 110 Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu 115 120 125 Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 130 135 140 Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val 145 150 155 160 Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr 165 170 175 Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly 180 185 190 Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser 195 200 205 Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser 210 215 220 Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser 225 230 235 240 Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly 245 250 255 Asp Phe Ala Leu Pro Val Gly Leu Ile Val Gly Val Thr Ala Leu Gly 260 265 270 Leu Leu Ile Ile Gly Val Val Asn Cys Val Ile Met Thr Gln Val Lys 275 280 285 Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gln Arg Glu Ala Lys Val Pro His Leu Pro 290 295 300 Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gln Gly Pro Glu Gln Gln His Leu Leu 305 310 315 320 Ile Thr Ala Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser 325 330 335 Ala Leu Asp Arg Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gln Pro Gln Ala Pro Gly 340 345 350 Val Glu Ala Ser Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser Ser 355 360 365 Asp Ser Ser Pro Gly Gly His Gly Thr Gln Val Asn Val Thr Cys Ile 370 375 380 Val Asn Val Cys Ser Ser Ser Asp His Ser Ser Gln Cys Ser Ser Gln 385 390 395 400 Ala Ser Ser Thr Met Gly Asp Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro 405 410 415 Lys Asp Glu Gln Val Pro Phe Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser 420 425 430 Gln Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys Pro 435 440 445 Leu Pro Leu Gly Val Pro Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser 450 455 460 <210> 2 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 3 <211> 467 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Etanercept <400> 3 Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser 1 5 10 15 Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys 20 25 30 Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr 35 40 45 Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu 50 55 60 Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser 65 70 75 80 Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys 85 90 95 Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys 100 105 110 Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala 115 120 125 Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro 130 135 140 Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His 145 150 155 160 Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala 165 170 175 Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val 180 185 190 His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr 195 200 205 Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly 210 215 220 Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp Glu Pro Lys Ser Cys 225 230 235 240 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 245 250 255 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 275 280 285 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 305 310 315 320 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 340 345 350 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 355 360 365 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 370 375 380 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 385 390 395 400 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 Pro Gly Lys 465 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 1 5 <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser 1 5 10 15 Thr Cys Arg <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys 1 5 10 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys 1 5 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Val Phe Cys Thr Lys 1 5 <210> 10 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln 1 5 10 15 Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg 20 25 30 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Glu Gln Asn Arg 1 <210> 12 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys 1 5 10 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gln Glu Gly Cys Arg 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Leu Cys Ala Pro Leu Arg 1 5 <210> 15 <211> 65 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp 1 5 10 15 Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser 20 25 30 Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile 35 40 45 Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr 50 55 60 Arg 65 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ser Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg 1 5 10 15 <210> 17 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ser Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr 1 5 10 15 Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr 20 25 30 Gly Asp Glu Pro Lys 35 <210> 18 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ser Cys Asp Lys 1 <210> 19 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 10 15 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 1 5 <210> 21 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 1 5 10 15 Glu Val Lys <210> 22 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 1 5 10 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Thr Lys Pro Arg 1 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 1 5 <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 1 5 10 15 <210> 26 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Val Ser Asn Lys 1 <210> 27 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Thr Ile Ser Lys 1 <210> 28 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Gly Gln Pro Arg 1 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 1 5 10 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Glu Glu Met Thr Lys 1 5 <210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 1 5 10 <210> 32 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 1 5 10 15 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 20 <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 1 5 10 15 Lys <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Leu Thr Val Asp Lys 1 5 <210> 35 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 1 5 10 15 His Asn His Tyr Thr Gln Lys 20 <210> 36 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 1 5

Claims (15)

  1. (a) Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 혼합물을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    (b) 단계 (a)의 샘플을 변성시키고 알킬화하는 단계;
    (c) 단계 (b)에서 생성된 샘플을 트립신 소화에 적용하는 단계;
    (d) 단계 (c)에서 생성된 샘플을 HPLC에 적용하여, Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 나타내는 단편을 분리하고, 여기서 상기 단편은 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열 ("T7")로 이루어지는 것인 단계; 및
    (e) 단계 (d)로부터 얻은 서열식별번호: 4에 제시된 아미노산 서열 ("T7")로 이루어지는 단편을 나타내는 피크에 대해 및 Cys74, Cys78, Cys88 및 Cys96의 디술피드 가교에 의해 영향을 받지 않는 피크에 대해 피크 적분을 수행하는 단계
    를 포함하고; 여기서 TNFR2:Fc의 TNFR2 부분의 아미노산 서열이 서열식별번호: 1의 아미노산 서열의 아미노산 1-235에 대해 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일성; 가장 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 것인, Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 샘플에서 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 결정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (a)에 적용된 TNFR2:Fc의 아미노산 서열이 서열식별번호: 3의 아미노산 서열 (에타네르셉트)에 대해 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일성; 가장 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Cys74, Cys78, Cys88 및 Cys96의 디술피드 가교에 의해 영향을 받지 않는 피크가 디술피드 가교에 의해 전혀 영향받지 않고 샘플 내의 총 TNFR:Fc를 나타내는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 총 TNFR2:Fc를 나타내는 단편이 서열식별번호: 5 ("T27"), 서열식별번호: 24 ("T22"), 서열식별번호: 29 ("T31") 및 서열식별번호: 36 ("T39")으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 이로 이루어지고, 보다 바람직하게는 총 TNFR2:Fc를 나타내는 단편이 서열식별번호: 5 ("T27")를 포함하고, 바람직하게는 이로 이루어지는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 상대적인 양이
    (i) Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 나타내는 HPLC 크로마토그램의 피크 면적 ("T7 면적") 및 총 TNFR2:Fc를 나타내는 HPLC 크로마토그램의 피크 면적 ("T27 면적")을 적분하고;
    (ii) 하기 식 (1)에 따라 상대적인 양을 계산하는 것
    Figure pct00016
    (1)
    에 의해 결정되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 10-100 mM TRIS, 보다 바람직하게는 20-80 mM TRIS; 및/또는 0.5-1.5 M 아이오도아세트아미드, 바람직하게는 0.9-1.2 M 아이오도아세트아미드; 및/또는 0.02%-0.5%, 바람직하게는 0.1%-0.2%의 절단가능한 계면활성제를 포함하는, pH가 7 내지 9, 바람직하게는 7.5 내지 8.5, 가장 바람직하게는 약 pH 8인 완충제 내에서 수행되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 40 내지 70℃에서 30 내지 60 분 동안, 바람직하게는 50 내지 60℃에서 30 내지 45 분 동안 수행되는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)가 pH가 5 내지 7, 바람직하게는 5.5 내지 6.5이고 완충제로서 MES를 포함하는 소화 완충제 내에서, 바람직하게는 10-100 mM MES, 보다 바람직하게는 30-60 mM MES; 및/또는 0.02%-0.5%, 바람직하게는 0.1%-0.2%의 절단가능한 계면활성제를 포함하는 완충제 내에서 수행되는 것인 방법.
  9. 제6항 또는 제8항에 있어서, 계면활성제가 나트륨 3-[(2-메틸-2-운데실-1,3-디옥솔란-4-일)메톡시]-1-프로판술포네이트, 나트륨 3-((1-(푸란-2-일)운데실옥시)카르보닐아미노)프로판-1-술포네이트, 및 나트륨 3-(4-(1,1-비스(헥실옥시)에틸)피리디늄-1-일)프로판-1-술포네이트로부터 독립적으로 선택되고; 보다 바람직하게는 계면활성제가 나트륨 3-[(2-메틸-2-운데실-1,3-디옥솔란-4-일)메톡시]-1-프로판술포네이트인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)가 1-24h, 바람직하게는 6-18h 동안; 및 32-38℃, 바람직하게는 36-37℃에서 유효량의 트립신을 사용하여 수행되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (d)가 물 내의 0.05%-0.5% TFA, 바람직하게는 물 내의 0.1%-0.2% TFA를 포함하는 이동상에서 수행되는 것인 방법.
  12. Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 샘플을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 포함하는 적어도 하나의 크로마토그래피 단계에 적용하고;
    상기 적어도 하나의 크로마토그래피 단계에 적용된 샘플에 비해 감소된 양의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 갖는, Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 하나 이상의 분획을 분리하는 것
    을 포함하고; 여기서 제5항에 따른 방법을 사용하여 결정될 때, 상기 하나 이상의 분획은 총 TNFR2:Fc에 기초하여 2.2% 미만의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc, 바람직하게는 2.1% 미만, 바람직하게는 2.0% 미만, 바람직하게는 1.9% 미만, 바람직하게는 1.8% 미만, 보다 바람직하게는 1.7% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 1.6% 미만, 가장 바람직하게는 1.5% 또는 그 미만의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 것인, Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 정제하는 방법.
  13. Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 샘플을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 포함하는 적어도 하나의 크로마토그래피 단계에 적용하고;
    상기 적어도 하나의 크로마토그래피 단계에 적용된 샘플에 비해 감소된 양의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 갖는, Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 하나 이상의 분획을 분리하는 것
    을 포함하고; 여기서 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 양이 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 결정되는 것인, Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 정제하는 방법.
  14. (a) 적합한 숙주 세포에서 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하는 조성물을 생산하고;
    (b) 얻어진 Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 디술피드 가교된 TNFR2:Fc 및 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc의 조합물을 제12항 또는 제13항의 정제 방법에 의해 정제하는 것
    을 포함하는 방법.
  15. 제5항에 규정된 방법에 따라 결정될 때, 총 TNFR2:Fc에 기초하여 2.2% 미만의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc, 바람직하게는 2.1% 미만, 바람직하게는 2.0% 미만, 바람직하게는 1.9% 미만, 바람직하게는 1.8% 미만, 보다 바람직하게는 1.7% 미만, 훨씬 더 바람직하게는 1.6% 미만, 가장 바람직하게는 1.5% 또는 그 미만의 Cys78-Cys88 디술피드 가교된 TNFR2:Fc를 포함하고, 여기서 TNFR2:Fc의 아미노산 서열이 서열식별번호: 3의 아미노산 서열에 대해 적어도 97%, 바람직하게는 적어도 98%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 동일성; 가장 바람직하게는 100% 동일성을 갖는 것인, TNFR2:Fc의 조성물.
KR1020177001065A 2014-07-18 2015-07-17 미스폴딩된 TNFR2:Fc의 정량 KR20170031145A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14177696.3 2014-07-18
EP14177696.3A EP2975050B1 (en) 2014-07-18 2014-07-18 Quantification of misfolded TNFR2:Fc
PCT/EP2015/066385 WO2016009036A1 (en) 2014-07-18 2015-07-17 Quantification of misfolded tnfr2:fc

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20170031145A true KR20170031145A (ko) 2017-03-20

Family

ID=51210344

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177001065A KR20170031145A (ko) 2014-07-18 2015-07-17 미스폴딩된 TNFR2:Fc의 정량

Country Status (10)

Country Link
US (2) US9598718B2 (ko)
EP (1) EP2975050B1 (ko)
KR (1) KR20170031145A (ko)
AU (1) AU2015289100B2 (ko)
BR (1) BR112017000955A2 (ko)
CA (1) CA2952342A1 (ko)
ES (1) ES2733298T3 (ko)
MX (1) MX2017000831A (ko)
RU (1) RU2698671C2 (ko)
WO (1) WO2016009036A1 (ko)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0611901A2 (pt) 2005-06-14 2012-08-28 Amgen, Inc composição, liofilizado, kit, e, processo para preparar uma composição
AU2017345490B2 (en) 2016-10-21 2022-07-07 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations and methods of making the same
CA3233422A1 (en) * 2021-09-28 2023-04-06 Kashiv Biosciences, Llc An improved process for purification of fusion protein

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6048728A (en) 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
US7294481B1 (en) 1999-01-05 2007-11-13 Immunex Corporation Method for producing recombinant proteins
WO2003102225A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-11 Waters Investments Limited Destructible surfactants and uses thereof
AU2004262014B2 (en) 2003-08-01 2010-06-17 Amgen Inc. Crystalline tumor necrosis factor receptor 2 polypeptides
US7408030B2 (en) * 2005-01-13 2008-08-05 North Carolina State University Purification of immunoglobulins using affinity chromatography and peptide ligands
JP2010501623A (ja) * 2006-08-28 2010-01-21 アレス トレーディング ソシエテ アノニム Ｆｃ含有タンパク質の精製法
WO2010002911A2 (en) * 2008-06-30 2010-01-07 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Methods and materials for monitoring myeloma using quantitative mass spetrometry
RU2644651C2 (ru) 2010-04-26 2018-02-13 Новартис Аг Среда для культивирования клеток
SG185037A1 (en) 2010-04-26 2012-11-29 Novartis Ag Improved cell culture medium
CN102382190B (zh) 2010-09-01 2014-04-09 山东新时代药业有限公司 分离和去除TNFR-Fc融合蛋白中寡聚体的方法
AU2012220890A1 (en) * 2011-02-25 2013-08-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Yeast strain for the production of proteins with modified O-glycosylation
EP2723759A4 (en) 2011-06-24 2015-01-28 Reddys Lab Ltd Dr PURIFICATION OF CHIMERIC PROTEIN
KR101454316B1 (ko) 2011-08-17 2014-10-27 한화케미칼 주식회사 활성형 ＴＮＦＲ-Ｆｃ 융합 단백질을 제조하는 방법
CN104902914B (zh) * 2012-09-11 2019-01-01 科荣生生物科学公司 高纯度和优异产量的正确折叠的依那西普
WO2014102814A1 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Intas Biopharmaceuticals Limited Process for the purification of fc fusion proteins
ES2759061T3 (es) * 2013-03-15 2020-05-07 Biomolecular Holdings Llc Inmunoglobulina híbrida que contiene unión no peptidílica

Also Published As

Publication number Publication date
US20160017403A1 (en) 2016-01-21
EP2975050B1 (en) 2019-05-29
US9182410B1 (en) 2015-11-10
EP2975050A1 (en) 2016-01-20
AU2015289100A1 (en) 2017-01-12
US9598718B2 (en) 2017-03-21
AU2015289100B2 (en) 2019-08-15
MX2017000831A (es) 2017-05-01
BR112017000955A2 (pt) 2018-01-16
ES2733298T3 (es) 2019-11-28
WO2016009036A1 (en) 2016-01-21
RU2017102487A3 (ko) 2018-10-03
RU2017102487A (ru) 2018-08-20
RU2698671C2 (ru) 2019-08-28
CA2952342A1 (en) 2016-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2729482T3 (en) PROCEDURE FOR CLEANING FC-FUSION PROTEIN
US9279014B2 (en) Methods for preparing an active TNFR-Fc fusion protein
EP3048899B1 (en) On-column viral inactivation methods
JP2022081654A (ja) 低粘度の抗原結合タンパク質およびそれらの作製方法
EP2125866B1 (en) Method for the purification of recombinant blood coagulation factor ix enriched in sulfated and/or phosphorylated molecules
KR20120046274A (ko) 항체 생성의 최적화 방법
KR20090064377A (ko) 친화성 크로마토그래피를 사용하는 단백질 정제에 있어서 아르기닌 세척
EP2773439A1 (en) Chromatography process for resolving heterogeneous antibody aggregates
EP2734537B1 (en) Polypeptide separation methods
KR20170031145A (ko) 미스폴딩된 TNFR2:Fc의 정량
JP7097433B2 (ja) 宿主細胞ガレクチンおよび他の夾雑物からグリコシル化タンパク質を精製する方法
CA3127228A1 (en) Aflibercept attributes and methods of characterizing and modifying thereof
JP2016504337A (ja) イオン交換クロマトグラフィーを使用して高マンノースグリコフォームのレベルを制御する方法
US10988527B2 (en) Method for preparing TNFR-Fc fusion protein containing target content of impurities
JP2022500086A (ja) 改善された安定性およびリガンド結合親和性を有するｒａｇｅ融合タンパク質ならびにその使用
EP3512884A1 (en) Methods of purifying and qualifying antibodies
NZ733388B (en) Method for preparing tnfr-fc fusion protein containing target content of impurities

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application