RU2698671C2 - КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА НЕПРАВИЛЬНО СВЕРНУТОГО TNFR2:Fc - Google Patents
КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА НЕПРАВИЛЬНО СВЕРНУТОГО TNFR2:Fc Download PDFInfo
- Publication number
- RU2698671C2 RU2698671C2 RU2017102487A RU2017102487A RU2698671C2 RU 2698671 C2 RU2698671 C2 RU 2698671C2 RU 2017102487 A RU2017102487 A RU 2017102487A RU 2017102487 A RU2017102487 A RU 2017102487A RU 2698671 C2 RU2698671 C2 RU 2698671C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cys
- tnfr2
- disulfide bonds
- disulfide bond
- disulfide
- Prior art date
Links
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 title claims abstract description 295
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 title claims abstract description 293
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 122
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 31
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 12
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 206010059176 Juvenile idiopathic arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 208000019069 chronic childhood arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 201000002215 juvenile rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 55
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 52
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 36
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 32
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 claims description 24
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims description 24
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 claims description 24
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 23
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 22
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 21
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 21
- 108010008165 Etanercept Proteins 0.000 claims description 20
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 18
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 16
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 16
- 229960000403 etanercept Drugs 0.000 claims description 15
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 11
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- TVPPOWAYYCDJAS-UHFFFAOYSA-M sodium;3-[(2-methyl-2-undecyl-1,3-dioxolan-4-yl)methoxy]propane-1-sulfonate Chemical group [Na+].CCCCCCCCCCCC1(C)OCC(COCCCS([O-])(=O)=O)O1 TVPPOWAYYCDJAS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 8
- -1 2-methyl-2-undecyl-1,3-dioxolan-4-yl Chemical group 0.000 claims description 7
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 claims description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- NPAWNPCNZAPTKA-UHFFFAOYSA-M sodium;propane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].CCCS([O-])(=O)=O NPAWNPCNZAPTKA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 9
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 60
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 49
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 36
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 28
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 23
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 23
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 15
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 15
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 15
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 14
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 14
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 14
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 14
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 13
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 11
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 11
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 10
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 10
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 108010072106 tumstatin (74-98) Proteins 0.000 description 9
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 6
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 229940073621 enbrel Drugs 0.000 description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 4
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 4
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 4
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 4
- 201000009273 Endometriosis Diseases 0.000 description 4
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 4
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 4
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 235000011083 sodium citrates Nutrition 0.000 description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101000801232 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 2
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 2
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 2
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 2
- 239000012515 MabSelect SuRe Substances 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- IHCXPSYCHXFXKT-DCAQKATOSA-N Pro-Arg-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IHCXPSYCHXFXKT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 2
- 101710187743 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 108010052670 arginyl-glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 125000006297 carbonyl amino group Chemical group [H]N([*:2])C([*:1])=O 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 2
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000000414 obstructive effect Effects 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- DIBLBAURNYJYBF-XLXZRNDBSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]hexanoyl]amino]acetyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 DIBLBAURNYJYBF-XLXZRNDBSA-N 0.000 description 1
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQNRVGJCPCNMKT-JLPGSUDCSA-N 2-(4-benzylpiperazin-1-yl)-n-[(2-hydroxy-3-prop-2-enyl-phenyl)methylideneamino]acetamide Chemical compound OC1=C(CC=C)C=CC=C1\C=N/NC(=O)CN1CCN(CC=2C=CC=CC=2)CC1 YQNRVGJCPCNMKT-JLPGSUDCSA-N 0.000 description 1
- 206010048998 Acute phase reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N Ala-Leu-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- IORKCNUBHNIMKY-CIUDSAMLSA-N Ala-Pro-Glu Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O IORKCNUBHNIMKY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WQKAQKZRDIZYNV-VZFHVOOUSA-N Ala-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WQKAQKZRDIZYNV-VZFHVOOUSA-N 0.000 description 1
- ZJBUILVYSXQNSW-YTWAJWBKSA-N Arg-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O ZJBUILVYSXQNSW-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 1
- ZUVMUOOHJYNJPP-XIRDDKMYSA-N Arg-Trp-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ZUVMUOOHJYNJPP-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- BVLIJXXSXBUGEC-SRVKXCTJSA-N Asn-Asn-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O BVLIJXXSXBUGEC-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WQLJRNRLHWJIRW-KKUMJFAQSA-N Asn-His-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O WQLJRNRLHWJIRW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- RCFGLXMZDYNRSC-CIUDSAMLSA-N Asn-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RCFGLXMZDYNRSC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- HNXWVVHIGTZTBO-LKXGYXEUSA-N Asn-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O HNXWVVHIGTZTBO-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- LGCVSPFCFXWUEY-IHPCNDPISA-N Asn-Trp-Tyr Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CC=C(C=C3)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N LGCVSPFCFXWUEY-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- MJIJBEYEHBKTIM-BYULHYEWSA-N Asn-Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N MJIJBEYEHBKTIM-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- QXHVOUSPVAWEMX-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O QXHVOUSPVAWEMX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- DPNWSMBUYCLEDG-CIUDSAMLSA-N Asp-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DPNWSMBUYCLEDG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N Asp-Pro-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JSNWZMFSLIWAHS-HJGDQZAQSA-N Asp-Thr-Leu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O JSNWZMFSLIWAHS-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- SQIARYGNVQWOSB-BZSNNMDCSA-N Asp-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O SQIARYGNVQWOSB-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102100035418 Ceramide synthase 4 Human genes 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- NDNZRWUDUMTITL-FXQIFTODSA-N Cys-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NDNZRWUDUMTITL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- ALTQTAKGRFLRLR-GUBZILKMSA-N Cys-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N ALTQTAKGRFLRLR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 102400001059 Dentin sialoprotein Human genes 0.000 description 1
- HJEINPVZRDJRBY-UHFFFAOYSA-N Disul Chemical compound OS(=O)(=O)OCCOC1=CC=C(Cl)C=C1Cl HJEINPVZRDJRBY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XKBASPWPBXNVLQ-WDSKDSINSA-N Gln-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XKBASPWPBXNVLQ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- HMIXCETWRYDVMO-GUBZILKMSA-N Gln-Pro-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HMIXCETWRYDVMO-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- FITIQFSXXBKFFM-NRPADANISA-N Gln-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FITIQFSXXBKFFM-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- HUFCEIHAFNVSNR-IHRRRGAJSA-N Glu-Gln-Tyr Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 HUFCEIHAFNVSNR-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- KASDBWKLWJKTLJ-GUBZILKMSA-N Glu-Glu-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O KASDBWKLWJKTLJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BFEZQZKEPRKKHV-SRVKXCTJSA-N Glu-Pro-Lys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O BFEZQZKEPRKKHV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- BPCLDCNZBUYGOD-BPUTZDHNSA-N Glu-Trp-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 BPCLDCNZBUYGOD-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N Glu-Val-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O WGYHAAXZWPEBDQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 1
- GMTXWRIDLGTVFC-IUCAKERBSA-N Gly-Lys-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GMTXWRIDLGTVFC-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- HAOUOFNNJJLVNS-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Ser Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HAOUOFNNJJLVNS-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- FULZDMOZUZKGQU-ONGXEEELSA-N Gly-Val-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)CN FULZDMOZUZKGQU-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- MAABHGXCIBEYQR-XVYDVKMFSA-N His-Asn-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N MAABHGXCIBEYQR-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- FYVHHKMHFPMBBG-GUBZILKMSA-N His-Gln-Asp Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N FYVHHKMHFPMBBG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- TTYKEFZRLKQTHH-MELADBBJSA-N His-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)N)C(=O)O TTYKEFZRLKQTHH-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000737544 Homo sapiens Ceramide synthase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001139126 Homo sapiens Krueppel-like factor 6 Proteins 0.000 description 1
- 101001024391 Homo sapiens Neuromedin-U receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000591385 Homo sapiens Neurotensin receptor type 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001133600 Homo sapiens Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor Proteins 0.000 description 1
- 101001080401 Homo sapiens Proteasome assembly chaperone 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000653759 Homo sapiens Sphingosine 1-phosphate receptor 5 Proteins 0.000 description 1
- 101100425757 Homo sapiens TNFRSF1B gene Proteins 0.000 description 1
- 101000807859 Homo sapiens Vasopressin V2 receptor Proteins 0.000 description 1
- MKWSZEHGHSLNPF-NAKRPEOUSA-N Ile-Ala-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N MKWSZEHGHSLNPF-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- 102100020679 Krueppel-like factor 6 Human genes 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- QJUWBDPGGYVRHY-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N QJUWBDPGGYVRHY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N Leu-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O YOKVEHGYYQEQOP-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- WMIOEVKKYIMVKI-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O WMIOEVKKYIMVKI-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N Leu-Ser-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N SBANPBVRHYIMRR-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N Leu-Ser-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BRTVHXHCUSXYRI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ILDSIMPXNFWKLH-KATARQTJSA-N Leu-Thr-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ILDSIMPXNFWKLH-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O AIQWYVFNBNNOLU-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- VUBIPAHVHMZHCM-KKUMJFAQSA-N Leu-Tyr-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 VUBIPAHVHMZHCM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- YQFZRHYZLARWDY-IHRRRGAJSA-N Leu-Val-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN YQFZRHYZLARWDY-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- XNKDCYABMBBEKN-IUCAKERBSA-N Lys-Gly-Gln Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O XNKDCYABMBBEKN-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- RFQATBGBLDAKGI-VHSXEESVSA-N Lys-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O RFQATBGBLDAKGI-VHSXEESVSA-N 0.000 description 1
- QQPSCXKFDSORFT-IHRRRGAJSA-N Lys-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QQPSCXKFDSORFT-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- LUTDBHBIHHREDC-IHRRRGAJSA-N Lys-Pro-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O LUTDBHBIHHREDC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- MIFFFXHMAHFACR-KATARQTJSA-N Lys-Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN MIFFFXHMAHFACR-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- IEVXCWPVBYCJRZ-IXOXFDKPSA-N Lys-Thr-His Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 IEVXCWPVBYCJRZ-IXOXFDKPSA-N 0.000 description 1
- DLCAXBGXGOVUCD-PPCPHDFISA-N Lys-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O DLCAXBGXGOVUCD-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- CAVRAQIDHUPECU-UVOCVTCTSA-N Lys-Thr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CAVRAQIDHUPECU-UVOCVTCTSA-N 0.000 description 1
- QLFAPXUXEBAWEK-NHCYSSNCSA-N Lys-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QLFAPXUXEBAWEK-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- GILLQRYAWOMHED-DCAQKATOSA-N Lys-Val-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN GILLQRYAWOMHED-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- RKIIYGUHIQJCBW-SRVKXCTJSA-N Met-His-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O RKIIYGUHIQJCBW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FWAHLGXNBLWIKB-NAKRPEOUSA-N Met-Ile-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCSC FWAHLGXNBLWIKB-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000017921 NTSR1 Human genes 0.000 description 1
- 102100035314 Neuromedin-U receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 229960005552 PAC-1 Drugs 0.000 description 1
- 101150084398 PTAFR gene Proteins 0.000 description 1
- JDMKQHSHKJHAHR-UHFFFAOYSA-N Phe-Phe-Leu-Tyr Natural products C=1C=C(O)C=CC=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)CC1=CC=CC=C1 JDMKQHSHKJHAHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZJPGOXWRFNKIQL-JYJNAYRXSA-N Phe-Pro-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 ZJPGOXWRFNKIQL-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 108700023400 Platelet-activating factor receptors Proteins 0.000 description 1
- TUYWCHPXKQTISF-LPEHRKFASA-N Pro-Cys-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O TUYWCHPXKQTISF-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- UAYHMOIGIQZLFR-NHCYSSNCSA-N Pro-Gln-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UAYHMOIGIQZLFR-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- LGSANCBHSMDFDY-GARJFASQSA-N Pro-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O LGSANCBHSMDFDY-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- KWMUAKQOVYCQJQ-ZPFDUUQYSA-N Pro-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 KWMUAKQOVYCQJQ-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FMLRRBDLBJLJIK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- JLMZKEQFMVORMA-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 JLMZKEQFMVORMA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- KBUAPZAZPWNYSW-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 KBUAPZAZPWNYSW-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- GMJDSFYVTAMIBF-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GMJDSFYVTAMIBF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- MKGIILKDUGDRRO-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 MKGIILKDUGDRRO-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- VAUMZJHYZQXZBQ-WHFBIAKZSA-N Ser-Asn-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O VAUMZJHYZQXZBQ-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- UGJRQLURDVGULT-LKXGYXEUSA-N Ser-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O UGJRQLURDVGULT-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- KNCJWSPMTFFJII-ZLUOBGJFSA-N Ser-Cys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O KNCJWSPMTFFJII-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO UQFYNFTYDHUIMI-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N Ser-Gly-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O YMTLKLXDFCSCNX-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- HMRAQFJFTOLDKW-GUBZILKMSA-N Ser-His-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HMRAQFJFTOLDKW-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XNCUYZKGQOCOQH-YUMQZZPRSA-N Ser-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O XNCUYZKGQOCOQH-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- GZSZPKSBVAOGIE-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GZSZPKSBVAOGIE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N Ser-Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SRSPTFBENMJHMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- AXKJPUBALUNJEO-UBHSHLNASA-N Ser-Trp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AXKJPUBALUNJEO-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- HNDMFDBQXYZSRM-IHRRRGAJSA-N Ser-Val-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HNDMFDBQXYZSRM-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 102100029802 Sphingosine 1-phosphate receptor 5 Human genes 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N Thr-Ala-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- ASJDFGOPDCVXTG-KATARQTJSA-N Thr-Cys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ASJDFGOPDCVXTG-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- KWQBJOUOSNJDRR-XAVMHZPKSA-N Thr-Cys-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O KWQBJOUOSNJDRR-XAVMHZPKSA-N 0.000 description 1
- LAFLAXHTDVNVEL-WDCWCFNPSA-N Thr-Gln-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O LAFLAXHTDVNVEL-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- KGKWKSSSQGGYAU-SUSMZKCASA-N Thr-Gln-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N)O KGKWKSSSQGGYAU-SUSMZKCASA-N 0.000 description 1
- BDGBHYCAZJPLHX-HJGDQZAQSA-N Thr-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BDGBHYCAZJPLHX-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- JMBRNXUOLJFURW-BEAPCOKYSA-N Thr-Phe-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N)O JMBRNXUOLJFURW-BEAPCOKYSA-N 0.000 description 1
- BKVICMPZWRNWOC-RHYQMDGZSA-N Thr-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O BKVICMPZWRNWOC-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- XGFGVFMXDXALEV-XIRDDKMYSA-N Trp-Leu-Asn Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)N XGFGVFMXDXALEV-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- QYSBJAUCUKHSLU-JYJNAYRXSA-N Tyr-Arg-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QYSBJAUCUKHSLU-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- JJNXZIPLIXIGBX-HJPIBITLSA-N Tyr-Ile-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N JJNXZIPLIXIGBX-HJPIBITLSA-N 0.000 description 1
- GZUIDWDVMWZSMI-KKUMJFAQSA-N Tyr-Lys-Cys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 GZUIDWDVMWZSMI-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- NHOVZGFNTGMYMI-KKUMJFAQSA-N Tyr-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 NHOVZGFNTGMYMI-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- PWKMJDQXKCENMF-MEYUZBJRSA-N Tyr-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PWKMJDQXKCENMF-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- QHDXUYOYTPWCSK-RCOVLWMOSA-N Val-Asp-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)N QHDXUYOYTPWCSK-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- UEHRGZCNLSWGHK-DLOVCJGASA-N Val-Glu-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O UEHRGZCNLSWGHK-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- HGJRMXOWUWVUOA-GVXVVHGQSA-N Val-Leu-Gln Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N HGJRMXOWUWVUOA-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- HPANGHISDXDUQY-ULQDDVLXSA-N Val-Lys-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N HPANGHISDXDUQY-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- HJSLDXZAZGFPDK-ULQDDVLXSA-N Val-Phe-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](C(C)C)N HJSLDXZAZGFPDK-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- KISFXYYRKKNLOP-IHRRRGAJSA-N Val-Phe-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N KISFXYYRKKNLOP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- SSYBNWFXCFNRFN-GUBZILKMSA-N Val-Pro-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SSYBNWFXCFNRFN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N Val-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N VHIZXDZMTDVFGX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N Val-Thr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O HTONZBWRYUKUKC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- JVGDAEKKZKKZFO-RCWTZXSCSA-N Val-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O JVGDAEKKZKKZFO-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 102100037108 Vasopressin V2 receptor Human genes 0.000 description 1
- AHIZUOHBPONPMB-UHFFFAOYSA-N [Na].O1C=CC=C1 Chemical compound [Na].O1C=CC=C1 AHIZUOHBPONPMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001776 amniocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 239000013019 capto adhere Substances 0.000 description 1
- 239000013018 capto adhere resin Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012504 chromatography matrix Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 230000008482 dysregulation Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 108010013768 glutamyl-aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010000434 glycyl-alanyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010050475 glycyl-leucyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010044311 leucyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010073472 leucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010091871 leucylmethionine Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 238000012433 multimodal chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 108010024654 phenylalanyl-prolyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 102000030769 platelet activating factor receptor Human genes 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-M propane-1-sulfonate Chemical compound CCCS([O-])(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013214 routine measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 108010048397 seryl-lysyl-leucine Proteins 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000013179 statistical model Methods 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 108010071097 threonyl-lysyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- 230000006433 tumor necrosis factor production Effects 0.000 description 1
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 108010052774 valyl-lysyl-glycyl-phenylalanyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000007794 visualization technique Methods 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
- C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/25—Colour; Spectral properties, i.e. comparison of effect of material on the light at two or more different wavelengths or wavelength bands
- G01N21/31—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry
- G01N21/33—Investigating relative effect of material at wavelengths characteristic of specific elements or molecules, e.g. atomic absorption spectrometry using ultraviolet light
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8831—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving peptides or proteins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- G01N2333/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30 CD40 or CD95
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
- G01N2440/20—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material formation of disulphide bridges
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая способ определения TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 в образце, содержащем TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, способ очистки TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, способ получения и очистки TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 и композиция TNFR2:Fc для лечения заболевания, выбранного из анкилозирующего спондилита, ювенильного ревматоидного артрита, псориаза, псориатического артрита и ревматоидного артрита. В одном из вариантов реализации способ получения и очистки TNFR2:Fc включает в себя стадию получения композиции, содержащей TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88. Изобретение расширяет арсенал способов определения и очистки TNFR2:Fc в образце. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 7 ил., 7 табл., 4 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к способам определения относительного количества специфического TNFR2:Fc с некорректными дисульфидными связями в образце TNFR2:Fc, который представляет собой слитый белок, который используют в различных терапевтических применениях. Кроме того, изобретение относится к способу очистки TNFR2:Fc с использованием указанного способа для определения относительного количества указанного TNFR2:Fc с некорректными дисульфидными связями, и к композициям TNFR2:Fc, полученным таким образом.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Фактор некроза опухоли альфа (TNF-альфа) является членом группы цитокинов, которые стимулируют реакцию острой фазы, и, таким образом, он представляет собой цитокин, участвующий в системном воспалении. TNF-альфа может вызывать воспаление, индуцировать апоптоз клеток и ингибировать онкогенез и репликацию вируса. Дисрегуляция продуцирования TNF-альфа вовлечена в различные заболевания человека, такие как аутоиммунное заболевание, анкилозирующий спондилит, ювенильный ревматоидный артрит, псориаз, псориатический артрит, ревматоидный артрит, болезнь Вегенера (гранулематоз), болезнь Крона или воспалительное заболевание кишечника, хроническое обструктивное заболевание легких (COPD), гепатит С, эндометриоз, астма, кахексия, атопический дерматит, болезнь Альцгеймера, а также рак.
Молекулы его рецептора включают TNFR1 и TNFR2. TNF-R1 экспрессируется в клетках большинства тканей, в то время как TNF-R2 обнаруживается только в клетках иммунной системы. При контакте с гомотримерами TNF-альфа TNF-рецепторы образуют тримеры и тем самым инициируют внутриклеточную сигнальную систему клеток.
Соответственно, растворимые молекулы TNFR или их фрагменты, которые способны связываться с TNF-альфа, могут использоваться в качестве конкурентного ингибитора TNF-альфа. Настоящее изобретение относится к таким растворимым молекулам TNFR2, слитым с Fc-частью человеческого иммуноглобулина (TNFR2:Fc), и, более конкретно, к способам определения, получения и очистки таких молекул TNFR2:Fc.
TNFR2:Fc может быть получен с помощью биопроцесса с использованием рекомбинантных клеток СНО, например, с помощью клеток (dhfr-) СНО, дефицитных по дигидрофолатредуктазе. Одна конкретная форма TNFR2:Fc представляет собой этанерцепт, который состоит из 934 аминокислот со средней молекулярной массой 125 кДа. Он включает в себя гомодимер внеклеточной лиганд-связывающей части рецептора человеческого фактора некроза опухоли (p75), связанный с Fc-частью человеческого IgG1. Компонент Fc в обеих молекулах гомодимера содержит полные шарнирные, СН2- и СН3-области, но не содержит СН1-область IgG1 (см. Фигуру 1). Он предпочтительно синтезируется в виде димерного, секретируемого растворимого белка, в то время как димеризация Fc-области посредством трех дисульфидных связей происходит пост-трансляционно.
При использовании рентгеноструктурной кристаллографии, а также масс-спектрометрии может быть выявлен полный профиль дисульфидных связей предпочтительной формы человеческого TNFR2:Fc, этанерцепта (см. Таблицу 1). Соответствующие части выясненных структур TNFR2 и области его контакта с TNF-альфа представлены на Фигуре 2 и на Фигуре 3, в то время как способности связывания вариантов дисульфидов для основного варианта TNFR2:Fc суммированы в Таблице 1 (см. также Фигуру 4).
Таблица 1 Профиль дисульфидных связей этанерсепта
Внутрицепочечные (Рецептор/Fc-часть) | Межцепочечные | |
Cys(18)-Cys(31) | Cys(98)-Cys(115) | Cys(240)-Cys(240ʹ) |
Cys(32)-Cys(45) | Cys(121)-Cys(139) | Cys(246)-Cys(246ʹ) |
Cys(35)-Cys(53) | Cys(142)-Cys(157) | Cys(249)-Cys(249ʹ) |
Cys(56)-Cys(71) | Cys(163)-Cys(178) | |
Cys(74)-Cys(88) | Cys(281)-Cys(341) | |
Cys(78)-Cys(96) | Cys(387)-Cys(445) | |
Cys(104)-Cys(112) |
Однако неправильно свернутый TNFR2:Fc был обнаружен во всех анализируемых препаратах TNFR2:Fc. Такой неправильно свернутый TNFR2:Fc не является предпочтительным, когда TNFR2:Fc используется в любой из вышеуказанных терапий. В US 7294481 сообщается, что такой неправильно свернутый TNFR:Fc, такой как TNFR2:Fc, образуется на ранней стадии процесса культивирования клеток, транспортируется и представляет собой значительную часть (примерно 25-50%) продукта экспрессии. Кроме того, сообщается, что количество такого неправильно свернутого TNFR:Fc может быть уменьшено, если TNFR:Fc-продуцирующую клетку-хозяин культивировать при температуре 25-34°С в течение фазы продуцирования. Кроме того, сообщается, что такие неправильно свернутые TNFR:Fc могут быть отделены с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия.
Однако, как представлено в разделе примеров в настоящем документе, доступные в настоящее время препараты TNFR2:Fc (продаются как ENBREL®) все еще содержат TNFR2:Fc с некорректными дисульфидными связями (см. Таблицу 4 ниже). Это может быть связано с трудностями его отделения от корректно свернутого TNFR2:Fc.
Соответственно, существует потребность данной области техники в способах определения чистоты TNFR2:Fc в образце - в данном случае количества TNFR2:Fc с некорректными дисульфидными связями - которое дает возможность выбора, например, фракций, имеющих целевую более высокую степень чистоты.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы изобретения идентифицировали вариант TNFR2:Fc, содержащий некорректную дисульфидную связь в области связывания части рецептора TNF-альфа с TNF-альфа (Cys78-Cys88) (см Фигуры 5 и 6). В данном документе продемонстрировано с помощью корреляции между биоактивностью и количеством варианта с некорректной дисульфидной связью Cys78-Cys88 («вариант Т7» или «Т7»), что большие количества этого варианта Т7 оказывают негативное влияние на эффективность (см. Фигуру 7).
Исходя из этого факта, авторы настоящего изобретения разработали способ количественной оценки варианта Т7 с помощью пептидного картирования в невосстанавливающих условиях. Путем расщепления образцов TNFR2:Fc с помощью трипсина при невосстанавливающих условиях белок может быть расщеплен на более мелкие компоненты, в то время как структуры дисульфидных связей остаются интактными. После этого полученные пептиды дополнительно хроматографически разделяли с помощью хроматографии с обращенной фазой и детектировали с помощью УФ/визуального обнаружения. Этот способ дает возможность относительной количественной оценки количества так называемого пептида Т7, который представляет собой пептид, полученный из вариантов T7 с некорректными дисульфидными связями. Предпочтительно, количество пептида Т7 с некорректными дисульфидными связями может быть определено на основе сигнала для пептида Т7 в полученной хроматограмме. Например, оно может быть выражено в виде площади пика для пептида Т7 относительно площади пика для эталонного пептида, который не подвержен влиянию дисульфидных связей, или эталонного пептида, который не подвержен влиянию дисульфидной связи остатков Cys74, Cys78, Cys88 и Cys96. Путем использования нового разработанного способа можно идентифицировать образцы, в которых совместно элюируется TNFR2:Fc с корректными дисульфидными связями и вариант Т7, и которые, таким образом, не могут быть объединены с образцами чистого TNFR2:Fc и/или с образцами с уменьшенным количеством варианта Т7, достигая таким образом повышенной чистоты/эффективности конечной композиции TNFR2:Fc.
Более конкретно, предлагается способ определения TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 (т.е. вариант Т7) в образце, содержащем TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, где способ включает стадии:
(a) предоставления образца, содержащего смесь TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 и TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96;
(b) денатурации и алкилирования образца стадии (а);
(c) подвергания образца, полученного на стадии (b), расщеплению трипсином;
(d) подвергания образца, полученного на стадии (с), ВЭЖХ, тем самым отделяя фрагменты, характерные для TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88; и
(e) проведения интегрирования для пика, характерного для TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 и для пика, не подверженного влиянию дисульфидных связей Cys74, Cys78, Cys88 и Cys96, полученного на стадии (d);
где аминокислотная последовательность TNFR2-части TNFR2:Fc имеет по меньшей мере 97% идентичности, предпочтительно, по меньшей мере 98%, более предпочтительно, по меньшей мере 99% идентичности; наиболее предпочтительно, 100% идентичности с аминокислотами 23-257 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
Также предлагается способ очистки TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, где способ включает подвергание образца, содержащего TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 по меньшей мере, одной хроматографической стадии, где по меньшей мере, одна хроматографическая стадия включает хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC); и разделение одной или нескольких фракций, содержащих TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, которые содержат уменьшенное количество TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 по сравнению с образцом, подвергнутым указанной, по меньшей мере, одной хроматографической стадии; где указанные одна или несколько фракций содержат менее чем 2,2% TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 на основе суммарного TNFR2:Fc, предпочтительно менее чем 2,1%, предпочтительно менее чем 2%, предпочтительно менее чем 1,9%, предпочтительно менее чем 1,8%, более предпочтительно менее чем 1,7%, еще более предпочтительно менее чем 1,6%, и наиболее предпочтительно 1,5% или менее TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, как было определено с использованием способа определения TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 в образце, содержащем TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, раскрытого в данном документе, и с использованием интегрирования пика пептидных сигналов Т7 (SEQ ID NO: 4) и Т27 (SEQ ID NO: 5) и вычисления относительного количества по формуле (1), как описано ниже.
Кроме того, предлагается способ очистки TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, причем способ включает подвергание образца, содержащего TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, по меньшей мере, одной хроматографической стадии, где, по меньшей мере, одна хроматографическая стадия включает гидрофобную хроматографию (HIC); и отделение одной или нескольких фракций, содержащих TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, которые содержат уменьшенное количество TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 по сравнению с образцом, подвергнутым указанной, по меньшей мере, одной хроматографической стадии; где количество TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 определяется с использованием способа, описанного в настоящем документе.
Кроме того, в настоящем изобретении предлагается способ, включающий
(a) получение композиции, содержащей TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 в подходящей клетке-хозяине; и
(b) очистку полученной комбинации TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 с помощью способа очистки, описанного в настоящем документе.
Наконец, также раскрыта композиция TNFR2:Fc, где аминокислотная последовательность TNFR2:Fc имеет, по меньшей мере, 97% идентичности, предпочтительно, по меньшей мере, 98%, более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности; наиболее предпочтительно 100% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, содержащая менее чем 2,2% TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, предпочтительно менее 2,1%, предпочтительно менее чем 2%, предпочтительно менее чем 1,9%, предпочтительно менее чем 1,8%, более предпочтительно менее чем 1,7%, еще более предпочтительно менее чем 1,6%, и наиболее предпочтительно 1,5% или менее TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, как было определено с использованием способа определения TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 в образце, содержащем TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, раскрытого в настоящем документе и с использованием интегрирования пиков пептидных сигналов Т7 (SEQ ID NO: 4) и Т27 (SEQ ID NO: 5) и путем вычисления относительного количества по формуле (1), как описано ниже.
Такая композиция особенно подходит для применения в медицине, например, для применения в предотвращении и/или лечении заболевания, выбранного из аутоиммунного заболевания, анкилозирующего спондилита, ювенильного ревматоидного артрита, псориаза, псориатического артрита, ревматоидного артрита, гранулематоза, воспалительного заболевания кишечника, хронической обструктивной болезни легких (COPD), гепатита С, эндометриоза, астмы, кахексии, атопического дерматита, болезни Альцгеймера и рака; предпочтительно подходит при лечении заболевания, выбранного из анкилозирующего спондилита, ювенильного ревматоидного артрита, псориаза, псориатического артрита и ревматоидного артрита.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ
В настоящем изобретении предлагается способ определения TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 в образце, содержащем TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, где способ включает стадии:
(a) предоставление образца, содержащего смесь TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 и TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96;
(b) денатурация и алкилирование образца, полученного на стадии (а);
(c) подвергание образца, полученного на стадии (b), трипсиновому расщеплению;
(d) подвергание образца, полученного на стадии (с), ВЭЖХ, тем самым отделяя фрагменты, характерные для TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88; и
(e) проведение интегрирования для пика, характерного для TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 и для пика, не подверженного влиянию дисульфидных связей Cys74, Cys78, Cys88 и Cys96, как получено на стадии (d);
где аминокислотная последовательность TNFR2-части TNFR2:Fc имеет по меньшей мере 97% идентичности, предпочтительно, по меньшей мере 98%, более предпочтительно, по меньшей мере 99% идентичности; наиболее предпочтительно 100% идентичности с аминокислотами 23-257 из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Аминокислоты 1-22 из SEQ ID NO: 1 соответствуют сигнальному пептиду, который вырезается в зрелом секретируемом белке.
В контексте настоящего описания, TNFR2-часть TNFR2:Fc относится к любому TNFR-полипептиду, имеющему по меньшей мере 97% идентичности, предпочтительно, по меньшей мере 98%, более предпочтительно, по меньшей мере 99% и наиболее предпочтительно 100% идентичности по всей длине аминокислотной последовательности, содержащей, по меньшей мере, 150-235, предпочтительно 200-235, наиболее предпочтительно 233-235 аминокислот внеклеточной части TNFR2, и сохраняющему связывание с TNF-альфа, как определено с помощью тИФА или любого другого удобного анализа. Более предпочтительно, TNFR способен связываться с TNF-альфа и лимфотоксином альфа (LT-альфа), как определено методом тИФА или любым другим удобным анализом. Такие анализы хорошо известны специалисту в данной области.
CDS и белковые последовательности TNFR2 (TNF-рецептора типа 2; CD120b; р75/80; для человека: RefSeq (мРНК): NM_001066, RefSeq (белок): NP_001057 (SEQ ID NO: 1)), известны в данной области техники.
Как правило, полипептид имеет «по меньшей мере х% идентичности» по всей длине последовательности аминокислот определенной длины с другим полипептидом, если рассматриваемая последовательность выровнена наилучшим образом с согласующейся аминокислотной последовательностью, и идентичность последовательности между ней и выровненной последовательностью составляет, по меньшей мере х%. Такое выравнивание может осуществляться с использованием, например, общедоступных компьютерных программ поиска гомологии, таких как «BLAST», таких как «blastp», предоставляемых на домашней странице NCBI по адресу www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi, используя предусмотренные там параметры по умолчанию. Другие методы расчета процента идентичности последовательности групп полипептидов известны в данной области техники.
Fc-область (фрагмент кристаллизующейся области) относится к хвостовой области антитела, в случае IgG, состоящий из второго и третьего константного домена двух тяжелых цепей антитела. В некоторых воплощениях, Fc-полипептид содержит константную область тяжелой цепи IgG-класса или ее фрагмента и/или варианта, и в других воплощениях константная область других изотипов иммуноглобулинов может быть использована для создания таких химер TNFR2:Fc. Например, может быть использован полипептид TNFR2:Fc, содержащий константную область тяжелой цепи класса IgM, или его фрагмент и/или вариант. Предпочтительно, Fc-фрагмент получают из IgG, более предпочтительно из IgG1, еще более предпочтительно из IgG1 человека. Константная область тяжелых цепей иммуноглобулина с конкретным примером константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина класса IgG1 человека, представленная в SEQ ID NO: 2, содержит домен CH1 (аминокислоты 1-98 из SEQ ID NO: 2), шарнирную область (аминокислоты 99-110 SEQ ID NO: 2), домен СН2 (аминокислоты 111-223 из SEQ ID NO: 2), и домен СН3 (аминокислоты 224-330 SEQ ID NO: 2). Используемый в настоящем документе Fc-домен может содержать один из следующих компонентов или их все: домен СН1 тяжелой цепи, шарнирную область, домены CH2 и CH3, описанные выше, или их фрагменты или варианты. Некоторые воплощения изобретения включают TNFR2:Fc, содержащий весь или часть внеклеточного домена TNFR2 (SEQ ID NO: 1), слитого со всей последовательностью SEQ ID NO: 2 или с ее частью, необязательно с линкерным полипептидом между участком TNFR2 и участком Fc из TNFR2:Fc. Например, в молекуле могут присутствовать СН1, СН2 и вся шарнирная область. В других воплощениях, константная область тяжелой цепи, содержащая, по меньшей мере, часть CH1, представляет собой Fc-часть TNFR2:Fc. Некоторые воплощения могут также включать, например, всю шарнирную область или С-концевую половину шарнирной области, чтобы обеспечить дисульфидную связь между тяжелыми цепями. Если требуется мультимерный, например, димерный TNFR2:Fc, то важно включать часть шарнирной области, вовлеченной в образование дисульфидных связей между тяжелыми цепями (например, часть аминокислот 99-110 SEQ ID NO: 2, которая включает аминокислоту 109 SEQ ID NO: 2). В предпочтительном воплощении Fc-часть состоит из полноразмерной шарнирной области и доменов СН2 и СН3. Однако, TNFR2:Fc может содержать части домена СН3, которые не включают С-концевой остаток лизина (аминокислота 330 SEQ ID NO: 2), поскольку было замечено, что этот остаток должен быть удален в пост-трансляционном процессинге полипептидов тяжелой цепи IgG. Fc-химеры и Fc-фрагменты хорошо известны в данной области техники.
Предпочтительно, TNFR2:Fc, по существу, идентичен/аналогичен этанерцепту, более предпочтительно, TNFR2:Fc представляет собой этанерцепт. Этанерцепт представляет собой димер двух молекул внеклеточной части р75 рецептора TNF-альфа, причем каждая молекула состоит из 235 аминокислот полипептида, полученного из TNFR, который слит с 232-аминокислотной Fc-частью человеческого IgG1. Аминокислотная последовательность мономерного компонента этанерцепта представлена в виде SEQ ID NO: 3. В димерной форме этой молекулы два из этих слитых полипептидов (или «мономеров») удерживаются вместе с помощью трех дисульфидных связей, которые образуются между иммуноглобулиновыми частями двух мономеров. Поэтому димер этанерцепта состоит из 934 аминокислот и имеет кажущуюся молекулярную массу, составляющую приблизительно 125 кДа. В Северной Америке, этанерцепт продается компанией Amgen под торговым названием ENBREL®. Wyeth/Pfizer является единственным продавцом ENBREL® за пределами Северной Америки, за исключением Японии, где Takeda Pharmaceuticals продает лекарственные средства.
Термин «по существу идентичен/подобен этанерсепту», используемый в настоящем документе, означает, что аминокислотная последовательность TNFR2:Fc, применяемая на стадии (а), имеет, по меньшей мере, 97% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3, предпочтительно, по меньшей мере, 98% идентичности, более предпочтительно 99% идентичности с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 3. В качестве альтернативы или дополнительно, TNFR2:Fc может иметь 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3 и может или нет отличаться от этанерцепта по пост-трансляционным модификациям (только), например, путем гликозилирования. Приемлемые процедуры изменения профиля гликозилирования и тесты для определения профиля гликозилирования хорошо известны специалисту в данной области.
TNFR2:Fc может быть получен рекомбинантным способом, предпочтительно путем использования системы экспрессии на основе клеток млекопитающих. Предпочтительно, указанная система экспрессии на основе клеток млекопитающих представляет собой, по меньшей мере, одну, выбранную из группы, состоящей из клеточных линий почек детеныша хомяка (например, ВНК21); клеточной линии яичников китайского хомяка (например, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DXB или CHO-dhfr-); мышиных клеточных линий миеломы (например, SP2/0); мышиных клеточных линий миеломы (например, NS0); Человеческих эмбриональных почечных клеточных линий (например, НЕК-293); Человеческих клеточных линий, полученных из сетчатки (например, PER-С6), и/или клеточных линий амниоцитов (например, CAP). Предпочтительно, используются системы экспрессии на основе клеток хомяка. Клетки ВНК21 («почки детеныша хомяка») принадлежат к квази-диплоидной клеточной линии, созданной из клеток сирийских хомяков с происхождением из клона необычно быстро растущей первичной культуры ткани почек новорожденного хомяка. Неограничивающие примеры клеточных линий ВНК-21, которые являются коммерчески доступными и могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, представляют собой ВНК-21 (С-13); ВНК21-pcDNA3.1-HC; BHK570; клеточную линию FLP-In-ВНК; и/или клеточную линию хомяка ВНК 21 (клон 13).
Клетки яичника китайского хомяка (СНО) представляют собой клеточную линию, полученную из яичника китайского хомяка. Они часто используются в биологических и медицинских исследованиях и коммерчески используются в производстве терапевтических белков. Они были получены в 1960-х годах и первоначально выращивались в виде монослойной культуры. На сегодняшний день клетки СНО являются наиболее часто используемыми клетками-хозяевами из млекопитающих для промышленного получения рекомбинантных белковых терапевтических средств и обычно выращиваются в суспензионной культуре.
Неограничивающие примеры клеточных линий СНО, которые являются коммерчески доступными и могут использоваться в контексте настоящего изобретения, представляют собой клетки FreeStyle СНО-S; клеточную линию ER-СНО; CHO 1-15 500 CHINESE HAM; CHO-DXB, CHO-dhfr-, CHO DP-12 клон#1934; CHO-CD36; CHO-ICAM-1; CHO-K1; яичники; HuZP3-CHOLec3.2.8.1; xrs5; CHO-K1/BB2 клетки; CHO-K1/BB3 клетки; CHO-K1/EDG8/Galpha15 клетки; CHO-K1/M5 клетки; CHO-K1/NK1 клетки; CHO-K1/NK3 клетки; CHO-K1/NMUR1 клетки; CHO-K1/NTSR1 клетки; CHO-K1/OX1 клетки; CHO-K1/PAC1/Gα15 клетки; CHO-K1/PTAFR клетки; CHO-K1/TRH1 клетки; CHO-K1/V1B клетки; 5HT1A Galpha-15-NFAT-BLA CHO-K1 клеточную линию; AVPR2 CRE-BLA CHO-K1 клеточную линию; CHO-S клетки SFM адаптированные; DG44 клетки; Flp-In-CHO клеточную линию; GeneSwitch-CHO клеточную линию; NFAT-bla CHO-K1 клеточную линию; T-REx-CHO клеточную линию; GenoStat CHO K-1 стабильную клеточную линию; набор GenoStat CHO K-1 стабильной клеточной линии; CHO-K1 клеточную линию хомяка, CHO-PEPT1 клеточную линию, CHO SSF3 и/или CHO-HPT1 клеточную линию. В особенно предпочтительном воплощении, система экспрессии на основе клеток хомяка представляет собой клеточную линию СНО-dhfr-.
Образец, содержащий TNFR2:Fc, для применения на стадии (а), может представлять собой материал, такой как надосадочная жидкость клеточной культуры или клеточный лизат. Предпочтительно, раствор представляет собой бесклеточную и бессывороточную надосадочную жидкость клеточной культуры. В еще более предпочтительном воплощении, раствор дополнительно очищают, например, с помощью аффинной хроматографии и/или хроматографии гидрофобного взаимодействия. Как правило, TNFR2:Fc, применяемый на стадии (а) способа, раскрытого в настоящем документе, содержит смесь TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 и TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96.
В предпочтительном воплощении, стадию (b) денатурации и алкилирования осуществляют в буфере, имеющем рН в диапазоне от 7 до 9, предпочтительно от 7,5 до 8,5, наиболее предпочтительно примерно рН 8. Например, буфер может представлять собой TRIS-буфер, такой как буфер, содержащий 10-100 мМ TRIS, более предпочтительно, 20-80 мМ TRIS. Буфер дополнительно содержит алкилирующий агент, например, 0,5-1,5 М иодацетамид, предпочтительно 0,9-1,2 М иодацетамид. Кроме того, предпочтительно, что буфер стадии (b) включает 0,02% -0,5% расщепляемого поверхностно-активного вещества, предпочтительно 0,1%-0,2% расщепляемого поверхностно-активного вещества. Вообще, может быть использовано любое поверхностно-активное вещество, которое не препятствует трипсиновому расщеплению. Особенно предпочтительные расщепляемые поверхностно-активные вещества выбирают из 3-[(2-метил-2-ундецил-1,3-диоксолан-4-ил)метокси]-1-пропансульфоната натрия, 3-((1-(фуран-2-ил)ундецилокси)карбониламино)-пропан-1-сульфоната натрия и 3-(4-(1,1-бис(гексилокси)этил)пиридиний-1-ил)пропан-1-сульфоната натрия. В более предпочтительном воплощении поверхностно-активное вещество представляет собой 3-[(2-метил-2-ундецил-1,3-диоксолан-4-ил)метокси]-1-пропансульфонат натрия. В общем, стадию (b) проводят при температуре и в течение времени, достаточных для денатурации и алкилирования смеси TNFR2:Fc, применяемой на стадии (a). Например, стадия (b) может быть проведена при температуре 40-70°C в течение 30-60 мин. В предпочтительном воплощении, стадия (b) может быть проведена при температуре 50-60°C в течение 30-45 мин.
Расщепление трипсином на стадии (с) проводят с использованием эффективного количества трипсина и применения достаточного времени и соответствующей температуры в условиях, которые облегчают расщепление. Например, трипсиновое расщепление может быть проведен в подходящем буфере в течение 1-24ч, предпочтительно в течение 6-18ч; и при 32-38°С, например, при 36-37°С. Во многих случаях буферные условия на стадии (b) не будут пригодны для стадии (с). В таких случаях, стадия (с) может включать замену буфера образца, полученного из стадии (b) в подходящем буфере для расщепления перед расщеплением. Предпочтительно, указанный буфер для расщепления имеет рН в диапазоне 5-7, более предпочтительно в диапазоне от 5,5 до 6,5. Подходящие буферы для расщепления включают буферы для расщепления, содержащие MES в качестве буферного агента, например, в концентрации 10-100 мМ MES, более предпочтительно 30-60 мМ MES. В дополнение к буферному агенту буфер для расщепления может также содержать расщепляемое поверхностно-активное вещество. Расщепляемое поверхностно-активное вещество может быть таким же, как на стадии (b) или может быть другим расщепляемым поверхностно-активным веществом. Соответственно, расщепляемое поверхностно-активное вещество может быть выбрано из 3-[(2-метил-2-ундецил-1,3-диоксолан-4-ил)метокси]-1-пропансульфоната натрия, 3-((1-(фуран-2-ил)ундецилокси)карбониламино)пропан-1-сульфоната натрия и 3-(4-(1,1-бис(гексилокси)этил)пиридиний-1-ил)пропан-1-сульфоната натрия. В более предпочтительном воплощении поверхностно-активное вещество представляет собой 3-[(2-метил-2-ундецил-1,3-диоксолан-4-ил)метокси]-1-пропансульфонат натрия. Если они присутствуют, буферы для расщепления содержат 0,02%-0,5% расщепляемого поверхностно-активного вещества, предпочтительно 0,1%-0,2% расщепляемого поверхностно-активного вещества. Наконец, стадия (с) может быть терминирована путем добавления 1% муравьиной кислоты в 10% ацетонитриле. Специалист в данной области заметит, что это расщепление осуществляется в невосстанавливающих условиях.
В Таблице 2 перечислены все фрагменты, которые получаются при трипсиновом расщеплении предпочтительного TNFR2:Fc, а именно этанерцепта, в восстанавливающих (!) условиях.
Таблица 2
Пептид No. | No. Аминокислот | SEQ ID NO: | Последовательность |
T1 | 1- 19 | 6 | LPAQVAFTPYAPEPGSTCR |
T2 | 20- 21 | LR | |
T3 | 22- 34 | 7 | EYYDQTAQMCCSK |
T4 | 35- 42 | 8 | CSPGQHAK |
T5 | 43- 47 | 9 | VFCTK |
T6 | 48- 77 | 10 | TSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSR |
T7 | 78- 90 | 4 | CSSDQVETQACTR |
T8 | 91- 94 | 11 | EQNR |
T9 | 95-108 | 12 | ICTCRPGWYCALSK |
T10 | 109-113 | 13 | QEGCR |
T11 | 114-119 | 14 | LCAPLR |
T12 | 120-120 | K | |
T13 | 121-185 | 15 | CRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTR |
T14 | 186-201 | 16 | SMAPGAVHLPQPVSTR |
T15 | 202-238 | 17 | SQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPK |
T16 | 239-242 | 18 | SCDK |
T17 | 243-268 | 19 | THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK |
T18 | 269-275 | 20 | DTLMISR |
T19 | 276-294 | 21 | TPEVTCVVVDVSHEDPEVK |
T20 | 295-308 | 22 | FNWYVDGVEVHNAK |
T21 | 309-312 | 23 | TKPR |
T22 | 313-321 | 24 | EEQYNSTYR |
T23 | 322-337 | 25 | VVSVLTVLHQDWLNGK |
T24 | 338-340 | EYK | |
T25 | 341-342 | CK | |
T26 | 343-346 | 26 | VSNK |
T27 | 347-354 | 5 | ALPAPIEK |
T28 | 355-358 | 27 | TISK |
T29 | 359-360 | AK | |
T30 | 361-364 | 28 | GQPR |
T31 | 365-375 | 29 | EPQVYTLPPSR |
T32 | 376-380 | 30 | EEMTK |
T33 | 381-390 | 31 | NQVSLTCLVK |
T34 | 391-412 | 32 | GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK |
T35 | 413-429 | 33 | TTPPVLDSDGSFFLYSK |
T36 | 430-434 | 34 | LTVDK |
T37 | 435-436 | SR | |
T38 | 437-459 | 35 | WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK |
T39 | 460-467 | 36 | SLSLSPGK |
Принимая во внимание дисульфидные связи этанерцепта, представленные в Таблице 1, специалист в данной области сразу поймет, что при невосстанавливающих условиях, как это предусмотрено в способе определения согласно настоящему изобретению, например, индивидуальные фрагменты Т1 (аа 1-19) и Т3 (аа 22-34) не будут получены в молекулах TNFR2:Fc с интактной дисульфидной связью Cys18-Cys31, поскольку они все еще ковалентно связаны этой дисульфидной связью. Аналогичным образом, фрагмент T7 (аа 78-90) не будет получен из молекулы TNFR2:Fc с интактными дисульфидными связями Cys74-Cys88 и/или Cys78-Cys96. Однако если Cys78 образует дисульфидную связь с Cys88, то будет получен фрагмент, соответствующий аминокислотам 78-90 TNFR2:Fc.
Затем образец, полученный на стадии (с), подвергают ВЭЖХ, тем самым отделяя индивидуальные фрагменты, полученные при трипсиновом расщеплении. В частности, в соответствии со способом, представленным в настоящем описании, фрагменты, характерные для TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 от других фрагментов, в частности, от фрагментов, характерных для TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys74-Cys88 и/или Cys78-Cys96. В особенно предпочтительном воплощении, фрагменты, характерные для TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, включают, предпочтительно, состоят из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4 («Т7», см также Таблицу 2 выше).
Условия, применяемые в ВЭЖХ, могут отличаться в зависимости от оборудования и используемых условий, но специалист в данной области техники легко сможет определить тоже самое рутинными измерениями и в свете дополнительных указаний, представленных в разделе примеров ниже. Конкретные подходящие колонки для ВЭЖХ представляют собой такие колонки, которые допускают разделение пептидных фрагментов и использование любой подходящей подвижной фазы для поддержания невосстанавливающих условий. В одном воплощении, стадию (d) проводят в подвижной фазе, содержащей 0,05%-0,5% ТФУ в воде, предпочтительно 0,1% -0,2% ТФУ в воде.
Используя хроматограмму, полученную на стадии (d), специалист может провести интегрирование для пика, характерного для TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88. Для того чтобы оценить относительное количество TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, наиболее удобно сравнить площадь пика, характерного для случая, когда эта изоформа TNFR2:Fc с площадью пика не подвержена влиянию любой дисульфидной связи из остатков Cys74, Cys78, Cys88 и Cys96. Предпочтительно, пик, не подверженный влиянию дисульфидных связей остатков Cys74, Cys78, Cys88 и Cys96, представляет собой пик фрагмента, который совсем не зависит от дисульфидной связи и, следовательно, является характерным для суммарного TNFR:Fc в образце, независимо от дисульфидных связей. Еще более предпочтительно, этот эталонный пик соответствует пептиду, который, кроме всего прочего, не подвержен влиянию гликозилирования или любой другой пост-трансляционной модификации. Кроме того, предпочтительно, что этот эталонный пик соответствует пептиду, который не содержит остаток метионина, так как метионин может быть подвержен окислению и давать два расщепленных сигнала. Кроме того, предпочтительно, что эталонный пик соответствует пептиду, размер которого примерно такой же, как у фрагментов, характерных для TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, например примерно такого же размера как пептид, включающий, предпочтительно состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4 («Т7», см также Таблицу 2 выше). Предпочтительные примеры фрагментов, характерных для суммарного TNFR2:Fc, включают, предпочтительно состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из группы SEQ ID NO: 5 («T27»), SEQ ID NO. 24 («Т22»), SEQ ID NO: 29 («Т31»), и SEQ ID NO: 36 («Т36»); Смотри также Таблицу 2 выше. В особенно предпочтительном воплощении, фрагменты, характерные для суммарного TNFR2:Fc, включают, предпочтительно состоят из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5 («Т27»). Однако будет понятно, что другие фрагменты, которые не подвержены влиянию дисульфидных связей Cys74, Cys78, Cys88 и Cys96, могут быть также использованы, в частности, с учетом известного профиля дисульфидных связей, представленных в Таблице 1 выше.
В наиболее предпочтительном воплощении, фрагменты, характерные для TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, включают в себя, предпочтительно состоят из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4 («Т7»); и фрагменты, характерные для суммарного TNFR2:Fc, включают, предпочтительно состоят из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5 («Т27»). В этом случае определяют относительное количество TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 с помощью интегрирования площади пиков в хроматограмме ВЭЖХ, характерной для TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 («область Т7») и характерной для суммарного TNFR2:Fc («T27 область»); и
вычисления относительного количества согласно формуле (1).
Отн.%(T7)=([площадь (T7)]/([площадь (T7)]+[площадь (T27)]))x100 (1)
Площадь (Т7): площадь пика фрагмента Т7 (SEQ ID NO: 4)
Площадь (Т27): площадь пика фрагмента Т27 (SEQ ID NO: 5)
Описанный выше способ определения TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 в образце, содержащем TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, может быть предпочтительно использован в управлении качеством, а также в процесс очистки TNFR2:Fc.
Соответственно, также предлагается способ очистки TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, где способ включает
подвергание образца, содержащего TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, по меньшей мере, одной хроматографической стадии, где по меньшей мере, одна хроматографическая стадия включает хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC); и
разделение одной или нескольких фракций, содержащих TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, которые содержат уменьшенное количество TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 по сравнению с образцом, подвергнутым указанной, по меньшей мере, одной хроматографической стадии;
где указанная одна или более фракций содержат менее чем 2,2% TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 на основе суммарного TNFR2:Fc, предпочтительно менее чем 2,1%, предпочтительно менее чем 2%, предпочтительно менее чем 1,9%, предпочтительно менее чем 1,8%, более предпочтительно менее чем 1,7%, еще более предпочтительно менее чем 1,6%, и наиболее предпочтительно 1,5% или менее TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, как было определено с помощью способа с использованием интегрирования пиков Т7 и Т27 и вычисления относительного количества по формула (1), как описано выше.
Аналогичным образом, в настоящем изобретении предлагается способ очистки TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, причем способ включает
подвергание образца, содержащего TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, по меньшей мере, одной хроматографической стадии, где по меньшей мере, одна хроматографическая стадия включает хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC); и
разделение одной или нескольких фракций, содержащих TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, которые содержат уменьшенное количество TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 по сравнению с образцом, подвергнутым указанной, по меньшей мере, одной хроматографической стадии;
где количество TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 определяют с использованием способа, описанного в настоящем документе.
В предпочтительном воплощении этих способов, аминокислотная последовательность TNFR2:Fc имеет по меньшей мере 97% идентичности, предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99% идентичности; наиболее предпочтительно 100% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3.
Раствор, содержащий неочищенный TNFR2:Fc, обычно подвергают аффинной хроматографии в качестве первого стадии. Используемый в настоящем документе термин «подвергание раствора, содержащего указанный TNFR2:Fc, аффинной хроматографии», предназначен для указания того, что аффинная хроматография является специфичной для TNFR2:Fc, т.е., по существу только TNFR2:Fc прежде всего связывается со смолой посредством взаимодействия, которое является специфическим для TNFR2:Fc, затем смолу, обычно промывают, после чего TNFR2:Fc элюируют из смолы путем применения подходящих условий. С аффинных смол может происходить элюирование путем изменения концентрации соли, рН, pI, заряда и ионной силы в одну или несколько стадий или через градиент для разделения TNFR2:Fc. Смола обычно представляет собой гелевую матрицу, часто из агарозы, которая модифицируется для того, чтобы обеспечить специфическое взаимодействие с TNFR:Fc.
Например, аффинная хроматография может проводиться на смоле, модифицированной Протеином А, Протеином G, антителом, способным связываться с Fc-частью указанного TNFR2:Fc, или антителом, направленным против TNFR2-части указанного TNFR2:Fc. Предпочтительно указанная смола модифицируется Протеином А или Протеином G и, более предпочтительно, указанная смола модифицируется Протеином А. Протеин А представляет собой белок, первоначально найденный в клеточной стенке золотистого стафилококка, который связывается с высокой аффинностью с человеческими IgG1 и IgG2, а также с мышиными IgG2a и IgG2b. Кроме того, Протеин А связывается с умеренной аффинностью с человеческими IgA, IgE и IgM, а также с мышиными IgG3 и IgG1. Он не вступает в реакцию с человеческими IgD или IgG3 или с мышиными IgA, IgE и IgM. В качестве альтернативы, могут использоваться другие Fc-связывающие бактериальные белки, такие как Протеин G или Протеин A/G. Протеин G обладает аффинностью связывания с человеческими IgG1, IgG2 и IgG4, и с мышиными IgG2a и IgG2b, что сравнимо с Протеином А. Однако, Протеин G также связывается с человеческим IgG3 и с крысиными иммуноглобулинами, и его аффинность связывания с мышиными IgG1 и IgG3 увеличивается по сравнению с Протеином А. Протеин G не демонстрирует кажущуюся аффинность к IgA, IgD, IgE или IgM. Протеин A/G представляет собой рекомбинантный слитый белок обоих, Протеина А и Протеина G. Связывание Протеина A/G меньше зависит от рН, чем у Протеина А, он связывается со всеми подклассами человеческого и мышиного IgG, связывается с человеческими IgA, IgE, IgM, и (в меньшей степени) IgD, но не связывается с мышиными IgA или IgM. Конкретная подходящая смола с Протеином А представляет собой смолу MabSelect Sure (GE Healthcare).Указанная смола имеет средний размер частиц 85 мкм, а также загрузочную способность 15-22 г/л смолы. Если Fc-часть TNFR2:Fc, не реагирует с Протеином А, Протеином G или Протеином A/G, то можно использовать антитела, которые специфичны для указанной Fc-части или TNFR2-части. Подходящие антитела будут очевидны специалистам в этой области техники и коммерчески доступны.
Связывание TNFR2:Fc с аффинной матрицей или со смолой, как правило, происходит при рН 6-8, предпочтительно при рН 6,5-7,5, и более предпочтительно, примерно при рН 7. Следовательно, может быть необходимо доведение рН раствора перед связыванием с аффинной смолой. В предпочтительном воплощении, смолу после связывания с указанным TNFR2:Fc промывают одним или несколькими подходящими буферами. Такие буферы могут содержать, например, 5-50 мМ фосфат натрия, 20-200 мМ хлорид натрия, рН 6-8; или фосфатный буфер или цитратный буфер или ацетатный буфер или смесь буферов с суммарной молярностью 1-100 мМ, предпочтительно 5-50 мМ с 0-750 мМ хлорид натрия, рН 5-6,5; или промывочные буферы аффинной хроматографии, описанные в данной области.
Элюирование TNFR2:Fc из аффинной матрицы предпочтительно проводят с применением кислых условий, таких как рН от 2,5 до 4,5, более предпочтительно, путем применения рН в диапазоне от 3 до 3,5. В некоторых случаях целесообразно применение градиента, начиная с более высоких значений рН в сторону более низких значений рН. Например, элюирование может быть проведено с использованием буфера, включающего буфер на основе уксусной кислоты, лимонной кислоты и/или фосфорной кислоты в концентрации 1-100 мМ, предпочтительно 5-50 мМ.
Дополнительные параметры, такие как скорость потока, высота слоя колонки и т.д. должны определяться на индивидуальной основе с использованием стандартных методов. Однако для достижения этой цели следует принимать во внимание, что процедуры аффинной хроматографии хорошо известны в данной области техники.
В предпочтительном воплощении, по меньшей мере, одна хроматографическая стадия дополнительно содержит одну или несколько стадий хроматографии ионного обмена, которые предпочтительно проводят перед стадией HIC.
Например, может применяться стадия катионного обмена. В частности, если способ содержит две ионообменные хроматографические стадии, то эта общая практика состоит в применении по меньшей мере, одной катионообменной хроматографической стадии.
В более предпочтительном воплощении, TNFR2:Fc подвергают одной или более стадий анионообменной хроматографии после аффинной хроматографии, что позволяет разделение и очистку молекул на основе их заряда. Анионообменная хроматография может также использовать матрицу мультимодальной хроматографии (MMC), такую как коммерчески доступная от компании GE Healthcare под торговым названием Capto adhere. Анионообменная хроматография может быть осуществлена в режиме связывания/элюирования или в проточном режиме или в обоих. В некоторых случаях может быть предпочтительным, чтобы анионообменная хроматография сначала осуществлялась в режиме связывания/элюирования с последующей второй анионообменной стадией, которую проводят в проточном режиме.
Всего лишь в качестве примера описана следующая классическая стадия анионообменной хроматографии в режиме связывания/элюирования.
TNFR2:Fc связывается с анионообменной смолой при рН 7-8, предпочтительно при рН 7,3-7,7. После того, как TNFR2:Fc связывается с анионообменной смолой, указанную смолу промывают буфером при рН 7-8, соответствующий промывочный буфер может представлять собой фосфатный буфер, например, буфер, содержащий 1-50 мМ фосфат натрия. Элюирование может быть осуществлено путем использования буфера, такого как фосфатный, цитратный или ацетатный буфер или их смесь, например, содержащая 1-50 мМ фосфат натрия, имеющая концентрацию соли, которая нарушает ионное взаимодействие между TNFR:Fc и анионообменной смолой, например, 100-200 мМ хлорида натрия.
Всего лишь в качестве примера далее описана стадия мультимодальной анионообменной хроматографии.
Для достижения наилучших результатов проводимость TNFR2:Fc-содержащего раствора доводят до 20-60 мСм/см, предпочтительно до 25-46 мСм/см; и рН до 5,5-6,5, предпочтительно до рН 5,5-6,2. Буфер может представлять собой фосфатный, цитратный или ацетатный буфер, или их смесь, например, буфер, содержащий 1-50 мМ фосфат натрия, цитрат натрия или ацетат натрия; и 200-700 мМ хлорид натрия, предпочтительно 250-600 мМ хлорид натрия.
TNFR:Fc-содержащая фракция(и), полученная после стадии(й) анионообменной хроматографии, может затем быть подвергнута хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC).
Как установлено выше, способ очистки содержит, по меньшей, мере одну стадию хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC). При высоких концентрациях соли неполярные группы на поверхности белка взаимодействуют с гидрофобными группами, например, с октильными или фенильными группами смолы HIC. Особенно удобные смолы HIC представляют собой коммерчески доступные Фенилсефарозу HP (GE Healthcare) и Toyopearl Phenyl 650, например, Toyopearl Phenyl 650 (М). Поскольку гидрофобные эффекты дополняются повышенной ионной силой, элюат обычно представляет собой водный буфер с уменьшением концентрации соли, увеличением концентрации детергента (который разрушает гидрофобные взаимодействия) и/или с изменениями рН. В предпочтительном воплощении HIC осуществляют в буфере, имеющем рН в интервале от 5,5-6,5, предпочтительно при рН 5,8-6,5, таком как рН 6.
Кроме того, перед связыванием TNFR2:Fc со смолой HIC может быть необходимо регулировать фракцию(и), содержащую TNFR2:Fc, таким образом, чтобы проводимость раствора находилась в диапазоне 50-100 мСм/см, предпочтительно 70-85 мСм/см. Это может быть достигнуто, например, путем разбавления фракции(й), содержащей TNFR2:Fc, с помощью буфера цитрата натрия, фосфата натрия или ацетата натрия, дополнительно содержащего сульфат натрия в концентрации 1 М или выше.
После загрузки TNFR2:Fc смолу HIC промывают подходящим буфером. Например, смола может быть промыта промывочным буфером, содержащим 50-150 мМ цитрат натрия, фосфат натрия или ацетат натрия, предпочтительно 50-100 мМ цитрат натрия или фосфат натрия; и сульфат натрия в подходящей концентрации. В предпочтительном воплощении смолу промывают промывочным буфером, содержащим 100 мМ фосфата натрия и 0,6 М сульфат натрия; 50 мМ фосфат натрия и сульфат натрия 0,8 М; 50 мМ фосфат натрия и сульфат натрия 0,95 М; или 50 мМ цитрат натрия и 0,8 М сульфат натрия. Концентрация буфера и/или сульфата натрия может быть выбрана в виде градиента, или может каждый может иметь одну концентрацию, попадающую в указанные выше диапазоны.
В случае, когда элюирования должно быть достигнуто за счет уменьшения концентрации соли, TNFR2:Fc можно элюировать с применением 0-100% градиента от указанного промывочного буфера до элюцирующего буфера, имеющего более низкую концентрацию ионов. Например, элюирующий буфер может представлять собой цитратный, фосфатный или ацетатный буфер, предпочтительно такой же буферной системы, какая используется в указанном промывочном буфере. Более предпочтительно, элюирующий буфер содержит 1-100 мМ цитрат натрия, фосфат натрия или ацетат натрия, предпочтительно 10-50 мМ цитрат натрия или фосфат натрия; и 0-100 мМ сульфат натрия, и более предпочтительно 0-10 мМ сульфат натрия. На основе фактических данных, касающихся выхода и биоактивности для полученных элюированных фракций, специалист в данной области может выбрать оптимальное окно элюирования, что представляет собой наилучший компромисс между выходом, чистотой и биологической активностью.
При использовании стадии HIC степень чистоты образца, как определено с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC), может быть увеличена до значений выше 90%, предпочтительно выше 92%, еще более предпочтительно выше 95%. В частности, эта стадия HIC позволяет уменьшить количество примесей, связанных с продуктом, таких как продукты деградации (DP) из TNFR2:Fc, продукты агрегации (AP) из TNFR2:Fc, неправильно процессируемые белки или димеры TNFR:Fc, неправильно свернутые белки TNFR:Fc или белки или димеры TNFR:Fc с некорректными внутрицепочечными и/или межцепочечными дисульфидными связями. Квалифицированным специалистам понятно, что некорректные дисульфидные связи и некорректное свертывание могут быть взаимозависимыми и/или синергетическими. В частности, стадия HIC может быть использована для уменьшения количества TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88.
В других предпочтительных воплощениях способ может дополнительно включать стадию, в которой элюат на стадии HIC подвергают нанофильтрации, ультрафильтрации и/или диафильтрации, для того, чтобы отделить любые инактивированные вирусы или другие загрязняющие вещества из очищенного раствора и/или перенести очищенный TNFR2:Fc в более подходящий буфер для того, чтобы сделать TNFR2:Fc готовым для дальнейшей обработки. Например, очищенный TNFR2:Fc может быть приготовлен в виде фармацевтической композиции. Такие фармацевтические композиции содержат обычно 5-100 мг TNFR2:Fc на аликвоту, предпочтительно 10-75 мг TNFR2:Fc на аликвоту, еще более предпочтительно 20-60 мг TNFR2:Fc на аликвоту, и наиболее предпочтительно 25-50 мг TNFR2:Fc на аликвоту.
Однако, процент TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 также зависит от условий в процессе производства (т.е. ферментации) TNFR2:Fc. Таким образом, также предлагается способ, включающий
(a) получение композиции, содержащей TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 в подходящей клетке-хозяине; и
(b) очистку полученной комбинации TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 с помощью способа очистки, как описано выше.
В предпочтительном воплощении, TNFR2:Fc получают с использованием клетки-хозяина CHO. В основе способа получения TNFR2:Fc-продуцирующей клеточной культуры лежит четыре этапа:
1. Фаза инокуляции: После размораживания флакона с банком клеток культуру наращивают в серии встряхиваемых колб увеличивающегося размера для получения достаточного количества суспензии клеток, чтобы запустить первый биореактор.
2. Фаза наращивания: После ряда инокуляций запускают один или несколько биореакторов до стадий культивирования для дополнительного наращивания культуры до начала продуцирования в конечном биореакторе. Ключевой параметр «рН» контролируется в заданных точках во время этой фазы наращивания. Во время обеих фаз, фазы инокуляции и наращивания, культуру поддерживают в экспоненциальной фазе роста путем надлежащего контроля переноса и плотности посева клеток.
3. Фаза продуцирования: Применяют периодический, подпитываемый или перфузионный процесс получения клеточной культуры. Если исходная температура клеточной культуры выше, например, 37°С, то температура может быть снижена в процессе стадии продуцирования, например, до 30,5-36,5°С, предпочтительно до 30,5-35°C, более предпочтительно до температуры 31-34°С, еще более предпочтительно до температуры 31,5-33°C, и наиболее предпочтительно до температуры 31,5-32,5°С. Однако в равной степени целесообразно поддерживать температуру постоянно в вышеуказанных диапазонах, начиная с диапазона продуцирования.
4. Осветление: После окончания фазы продуцирования начинают сбор. Клетки отделяют центрифугированием с последующей фильтрацией для удаления дебриса.
Способ получения TNFR2:Fc-продуцироующих CHO может работать с в средах для фаз инокуляции или в других средах наращивания и продуцирования. Подходящие среды для продуцирования гликопротеина в клетках СНО известны в данной области техники и описаны, например, в US 6048728, WO 2011/134920 и WO 2011/134921. Предпочтительно, все среды и, если используются, любые подпитки химически определены и свободны от компонентов животного происхождения.
Как было объяснено выше, рН и температура являются критическими параметрами во избежание образования TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys78-Cys88.
Следовательно, в предпочтительном воплощении, клетку-хозяин на стадии (а) культивируют при температуре 30,5-36,5°С в течение фазы продуцирования; предпочтительно при температуре 30,5-35°C, более предпочтительно при температуре 31-34°С, еще более предпочтительно при температуре 31,5-33°C, и наиболее предпочтительно при температуре 31,5-32,5°С. Кроме того, указанную клетку-хозяин предпочтительно культивируют при рН 6,75-7 на стадии продуцирования; предпочтительно при рН 6,8-6,95, и наиболее предпочтительно при рН 6,85-6,9. Например, рН можно регулировать с помощью рСО2 и/или 2% раствора NaOH. В этом контексте см. также данные в разделе Примеров.
Композиция TNFR2:Fc, которая может быть получена с использованием указанных выше способов, раскрытых в настоящем документе, представляет собой композицию с особенно низким содержанием TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 на основе суммарного содержания TNFR2:Fc. Таким образом, в настоящем изобретении также предлагается композиция TNFR2:Fc, где аминокислотная последовательность TNFR2:Fc имеет, по меньшей мере, 97% идентичности, предпочтительно, по меньшей мере, 98%, более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности; наиболее предпочтительно 100% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, содержащей менее чем 2,2% TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, предпочтительно менее чем 2,1%, предпочтительно менее чем 2%, предпочтительно менее чем 1,9%, предпочтительно менее чем 1,8%, более предпочтительно менее чем 1,7%, еще более предпочтительно менее чем 1,6%, и наиболее предпочтительно 1,5% или менее TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, как определено согласно способу с использованием интегрирования пиков Т7 и Т27, как описано выше.
Такая композиция может быть использована в медицине, например, в способе лечения объекта, где композицию вводят объекту. Более конкретно, композиция, как описано в настоящем документе, может быть использована для предотвращения и/или лечения заболевания, выбранного из аутоиммунного заболевания, анкилозирующего спондилита, ювенильного ревматоидного артрита, псориаза, псориатического артрита, ревматоидного артрита, гранулематоза, воспалительного заболевания кишечника, хронического обструктивного заболевания легких (COPD), гепатита С, эндометриоза, астмы, кахексии, атопического дерматита, болезни Альцгеймера и рака; предпочтительно для лечения заболевания, выбранного из анкилозирующего спондилита, ювенильного ревматоидного артрита, псориаза, псориатического артрита и ревматоидного артрита.
Настоящее изобретение дополнительно описывается следующими воплощениями.
1. Способ определения TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 в образце, содержащем TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, где способ включает стадии:
(a) получение образца, содержащего смесь TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 и TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96;
(b) денатурация и алкилирование образца, полученного на стадии (а);
(c) подвергание образца, полученного на стадии (b), трипсиновому расщеплению;
(d) подвергание образца, полученного на стадии (с), ВЭЖХ, тем самым отделяя фрагменты, характерные для TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88; и
(e) проведение интегрирования для пика, характерного для TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 и для пика, не подверженного влиянию дисульфидных связей Cys74, Cys78, Cys88 и Cys96, как получено на стадии (d);
где аминокислотная последовательность TNFR2-части TNFR2:Fc имеет, по меньшей мере, 97% идентичности, предпочтительно, по меньшей мере, 98%, более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности; наиболее предпочтительно 100% идентичности с аминокислотами 23-257 из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
2. Способ воплощения 1, где аминокислотная последовательность TNFR2:Fc, применяемого на стадии (а), имеет, по меньшей мере, 97% идентичности, предпочтительно, по меньшей мере, 98%, более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности; наиболее предпочтительно 100% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3 (этанерцепт).
3. Способ воплощения 1 или 2, где пик, не подверженный влиянию дисульфидных связей Cys74, Cys78, Cys88, и Cys96, не подвержен влиянию дисульфидных связей совсем, и это характерно для суммарного TNFR:Fc в образце.
4. Способ воплощения 3, где фрагменты характерные для TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, включают, предпочтительно состоят из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4 («Т7»).
5. Способ воплощения 4, где фрагменты, характерные для суммарного TNFR2:Fc, включают, предпочтительно состоят из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5 («Т27»).
6. Способ воплощения 5, где определяют относительное количество TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 с помощью
(I) интегрирования площади пиков в хроматограмме ВЭЖХ, характерной для TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 («площадь Т7») и характерной для суммарного TNFR2:Fc («площадь T27»); и
(II) вычисления относительного количества в соответствии с формулой (1).
Отн.%(T7)=([площадь (T7)]/([площадь (T7)]+[площадь (T27)]))x100 (1)
7. Способ любого из предыдущих воплощений, где стадию (b) осуществляют в буфере, содержащем 0,5-1,5 М иодацетамид, предпочтительно 0,9-1,2 М иодацетамид.
8. Способ любого из предыдущих воплощений, где стадию (b) проводят в буфере, содержащем 0,02%-0,5% расщепляемого поверхностно-активного вещества, предпочтительно 0,1%-0,2%; в частности, где поверхностно-активное вещество выбирают из 3-[(2-метил-2-ундецил-1,3-диоксолан-4-ил)метокси]-1-пропансульфоната натрия, 3-((1-(фуран-2-ил)ундецилокси)карбониламино)пропан-1-сульфоната натрия, и 3-(4-(1,1-бис(гексилокси)этил)пиридиний-1-ил)пропан-1-сульфоната натрия; более предпочтительно, где поверхностно-активное вещество представляет собой 3-[(2-метил-2-ундецил-1,3-диоксолан-4-ил)метокси]-1-пропансульфонат натрия.
9. Способ любого из предыдущих воплощений, где стадию (b) осуществляют в буфере, имеющем рН в диапазоне 7-9, предпочтительно 7,5-8,5, наиболее предпочтительно примерно рН 8.
10. Способ любого из предыдущих воплощений, где стадию (b) проводят в буфере TRIS, предпочтительно в буфере, содержащем 10-100 мМ TRIS, более предпочтительно 20-80 мМ TRIS.
11. Способ любого из предыдущих воплощений, где стадию (b) проводят при 40-70°С в течение 30-60 мин, предпочтительно при 50-60°С в течение 30-45 мин.
12. Способ любого из предыдущих воплощений, где стадия (с) включает замену буфера образца, полученного на стадии (b), на подходящий буфер для расщепления.
13. Способ любого из предыдущих воплощений, где стадию (с) проводят в буфере для расщепления, имеющем рН в диапазоне 5-7, предпочтительно 5,5-6,5.
14. Способ любого из предыдущих воплощений, где стадию (с) проводят в буфере для расщепления, содержащем MES в качестве буферного агента, предпочтительно в буфере, содержащем 10-100 мМ MES, более предпочтительно 30-60 мМ MES.
15. Способ любого из предыдущих воплощений, где стадию (с) проводят в буфере для расщепления, содержащем 0,02%-0,5% расщепляемого поверхностно-активного вещества, предпочтительно 0,1% -0,2%; в частности, где поверхностно-активное вещество выбирают из 3-[(2-метил-2-ундецил-1,3-диоксолан-4-ил)метокси]-1-пропансульфоната натрия, 3-((1-(фуран-2-ил)ундецилокси)карбониламино)пропан-1-сульфоната натрия, и 3-(4-(1,1-бис(гексилокси)этил)пиридиний-1-ил)пропан-1-сульфоната натрия; более предпочтительно, где поверхностно-активное вещество представляет собой 3-[(2-метил-2-ундецил-1,3-диоксолан-4-ил)метокси]-1-пропансульфонат натрия.
16. Способ любого из предыдущих воплощений, где стадию (с) проводят с использованием эффективного количества трипсина в течение 1-24ч, предпочтительно в течение 6-18ч; и при 32-38°С, предпочтительно при 36-37°С.
17. Способ любого из предыдущих воплощений, где стадию (с), прекращают путем добавления 1% муравьиной кислоты в 10% ацетонитриле.
18. Способ любого из предыдущих воплощений, где стадию (d) проводят в подвижной фазе, содержащей 0,05%-0,5% ТФУ в воде, предпочтительно 0,1% -0,2% ТФУ в воде.
19. Способ очистки TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, причем способ включает
подвергание образца, содержащего TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, по меньшей мере одной хроматографической стадии, где, по меньшей мере одна хроматографическая стадия включает хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC); и
отделение одной или нескольких фракций, содержащих TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, и которые содержат уменьшенное количество TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 по сравнению с образцом, подвергнутым указанной, по меньшей мере, одной хроматографической стадии;
где указанная одна или несколько фракций содержат менее чем 2,2% TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 на основе суммарного содержания TNFR2:Fc, предпочтительно менее чем 2,1%, предпочтительно менее чем 2%, предпочтительно менее чем 1,9%, предпочтительно менее чем 1,8%, более предпочтительно менее чем 1,7%, еще более предпочтительно менее чем 1,6%, и наиболее предпочтительно 1,5% или менее TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, как было определено с использованием способа согласно воплощению 6.
20. Способ очистки TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, причем способ включает
подвергание образца, содержащего TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, по меньшей мере одной хроматографической стадии, где по меньшей мере одна хроматографическая стадия включает хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC); и
отделение одной или нескольких фракций, содержащих TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, которые имеют уменьшенное количество TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 по сравнению с образцом, подвергнутого указанной, по меньшей мере, одной хроматографической стадии;
где количество TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 определяется с использованием способа по любому из воплощений 1-18.
21. Способ воплощения 19 или 20, где, по меньшей мере, одна хроматографическая стадия дополнительно содержит одну или несколько стадий ионообменной хроматографии, которые предпочтительно проводят до HIC.
22. Способ воплощения 21, где одна или несколько стадий ионообменной хроматографии представляют собой одну или более стадий анионообменной хроматографии.
23. Способ воплощения 22, где, по меньшей мере, одна из одной или нескольких стадий анионообменной хроматографии включает мультимодальную анионообменную хроматографию.
24. Способ любого из воплощений 19-23, где способ дополнительно содержит стадию аффинной хроматографии, предпочтительно с использованием Протеина A или Протеина G; причем указанную стадию аффинной хроматографии проводят перед любой другой хроматографической стадией.
25. Способ любого из воплощений 19-24, где аминокислотная последовательность TNFR2:Fc имеет, по меньшей мере, 97% идентичности, предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99% идентичности; наиболее предпочтительно 100% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3.
26. Способ, включающий:
(a) получение композиции, содержащей TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 в подходящей клетке-хозяине; и
(b) очистку полученной комбинации TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 с помощью способа очистки любого из воплощений 19-25.
27. Способ воплощения 26, где указанную клетку-хозяин культивируют при температуре 30,5-36,5°С в течение фазы продуцирования; предпочтительно при температуре 30,5-35°С, более предпочтительно при температуре 31-34°С, еще более предпочтительно при температуре 31,5-33°C, и наиболее предпочтительно при температуре 31,5-32,5°С.
28. Способ воплощения 26 или 27, где указанную клетку-хозяин культивируют при рН 6,75-7 в фазе продуцирования; предпочтительно при рН 6,80-6,95, а наиболее предпочтительно при рН 6,85-6,9.
29. Способ любого из воплощений 26-28, где указанная клетка-хозяин представляет собой клетку CHO.
30. Композиция TNFR2:Fc, где аминокислотная последовательность TNFR2:Fc имеет, по меньшей мере, 97% идентичности, предпочтительно, по меньшей мере, 98%, более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности; наиболее предпочтительно 100% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, содержащей менее чем 2,2% TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 на основе суммарного содержания TNFR2:Fc, предпочтительно менее чем 2,1%, предпочтительно менее чем 2%, предпочтительно менее чем 1,9%, предпочтительно менее чем 1,8%, более предпочтительно менее чем 1,7%, еще более предпочтительно менее чем 1,6%, и наиболее предпочтительно 1,5% или менее TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, как определено согласно способу воплощения 6.
31. Композиция, как определено в воплощении 30, для применения в медицине.
32. Композиция, как определено в воплощении 31, для применения в предотвращении и/или лечении заболевания, выбранного из аутоиммунного заболевания, анкилозирующего спондилита, ювенильного ревматоидного артрита, псориаза, псориатического артрита, ревматоидного артрита, гранулематоза, воспалительного заболевания кишечника, хронического обструктивного заболевания легких ( COPD), гепатита С, эндометриоза, астмы, кахексии, атопического дерматита, болезни Альцгеймера и рака; предпочтительно в лечении заболевания, выбранного из анкилозирующего спондилита, ювенильного ревматоидного артрита, псориаза, псориатического артрита и ревматоидного артрита.
33. Способ любого из воплощений 19-25, где очистку осуществляют в крупном масштабе (100 г TNFR2:Fc или более).
В дальнейшем настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими фигурами и примерами, которые не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Все ссылки, приведенные в настоящем документе, включены в качестве ссылки в явном виде.
ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1: Схематическое изображение TNFR2:Fc.
Фигура 2: TNFR2:Fc (слева), TNF-альфа (справа).
Фигура 3: Комплекс TNFR2:Fc и TNF-альфа.
Фигура 4: структурное представление TNFR2:Fc с N-концевым доменом рецептора TNF-альфа (см. также SEQ ID NO: 1). Аминокислоты обозначены однобуквенным кодом. Аспарагин-связанные N-гликаны и серин- или треонин-связанные O-гликаны обозначены графически. Корректные дисульфидные связи показаны светло-серыми полосками между конкретными остатками цистеина.
Фигура 5: структурное представление пептида Т7 с некорректными дисульфидными связями (см. также SEQ ID NO: 4) и пептид Т27 внутреннего эталона (см. также SEQ ID NO: 5). Аминокислоты обозначены однобуквенным кодом. Пептид T7 демонстрирует аберрантную дисульфидную связь между цистеинами 78 и 88, и ее представленность отрицательно коррелирует с биологической активностью. Эталонный пептид T27 не вовлечен в дисульфидные связи.
Фигура 6: Дисульфидные связи рецептора (рентгеновская структура, взятая из «Solution of the Structure of the TNF-TNFR2 Complex.» Mukai et al., Sci Signal 3(148), ra83, Nov 2010; добавлены отметки связей и текст).
Фигура 7: Репрезентативные данные, демонстрирующие относительное количество Т7, определенного согласно способу с использованием интегрирования пиков Т7 и Т27, как описано выше, в различных образцах с различной степенью биологической активности. Эффективность на оси у определяли с использованием анализа гена-репортера, значения являются произвольными. Были проанализированы образцы различного качества и корреляцию определяли на основании всех представленных точек на графике.
ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
(SEQ ID NO: 1)
(Человеческий TNF рецептор типа 2; CD120осн; р75/80; RefSeq (белок): NP_001057)
MAPVAVWAAL AVGLELWAAA HALPAQVAFT PYAPEPGSTC RLREYYDQTA QMCCSKCSPG 60
QHAKVFCTKT SDTVCDSCED STYTQLWNWV PECLSCGSRC SSDQVETQAC TREQNRICTC 120
RPGWYCALSK QEGCRLCAPL RKCRPGFGVA RPGTETSDVV CKPCAPGTFS NTTSSTDICR 180
PHQICNVVAI PGNASMDAVC TSTSPTRSMA PGAVHLPQPV STRSQHTQPT PEPSTAPSTS 240
FLLPMGPSPP AEGSTGDFAL PVGLIVGVTA LGLLIIGVVN CVIMTQVKKK PLCLQREAKV 300
PHLPADKARG TQGPEQQHLL ITAPSSSSSS LESSASALDR RAPTRNQPQA PGVEASGAGE 360
ARASTGSSDS SPGGHGTQVN VTCIVNVCSS SDHSSQCSSQ ASSTMGDTDS SPSESPKDEQ 420
VPFSKEECAF RSQLETPETL LGSTEEKPLP LGVPDAGMKP S 461
SEQ ID NO: 2 (константный домен тяжелой цепи человеческого IgG класса IgG1)
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
SEQ ID NO: 3 (этанерцепт)
LPAQVAFTPY APEPGSTCRL REYYDQTAQM CCSKCSPGQH AKVFCTKTSD TVCDSCEDST 60
YTQLWNWVPE CLSCGSRCSS DQVETQACTR EQNRICTCRP GWYCALSKQE GCRLCAPLRK 120
CRPGFGVARP GTETSDVVCK PCAPGTFSNT TSSTDICRPH QICNVVAIPG NASMDAVCTS 180
TSPTRSMAPG AVHLPQPVST RSQHTQPTPE PSTAPSTSFL LPMGPSPPAE GSTGDEPKSC 240
DKTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVKFNWYVD 300
GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK 360
GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS 420
DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK 467
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Определение относительного количества T7
TNFR2:Fc представляет собой слитый белок, состоящий из С-концевого Fc-домена антитела и N-концевого домена 2 рецептора TNF-альфа. Структура домена 2 рецептора TNF-альфа имеет решающее значение для биологической активности этого биофармацевтического средства и является весьма сложной, содержащей множество O-гликанов, два N-гликана и одиннадцать дисульфидных связей (см. Фигуры 4 и 6). Можно показать, что форма, по меньшей мере, одного варианта молекулы представлена в конечном лекарственном веществе TNFR2:Fc в результате различных дисульфидных связей.
Путем расщепления образцов TNFR2:Fc с помощью трипсина при невосстанавливающих условиях белок может быть расщеплен на более мелкие компоненты, в то время как структуры дисульфидных связей остаются интактными. Прояснение структуры пептидов с использованием анализа ОФ-ВЭЖХ-МС показало наличие ожидаемых пептидов с корректными дисульфидными связями, а также пептида, обозначенного Т7, который, как было показано, содержит аберрантную дисульфидную связь между цистеинами 78 и 88 (см. Фигуры 5 и 6 и Таблицу 2 выше). В то время как было обнаружено, что относительное содержание некоторых корректных мостиковых структур коррелирует с повышенной биологической активностью, их разнообразие и сложные профили элюирования исключают их использование в качестве стабильных показателей биоактивности с помощью способа ЖХ-УФ/Визуализация. Однако пептид Т7 с некорректными дисульфидными связями демонстрировал устойчивую корреляцию с пониженной биологической активностью. Репрезентативные данные представлены на Фигуре 7, демонстрируя сильную корреляцию между биоактивностью и относительным количеством Т7, определенным в соответствии со способ с использованием интегрирования пиков Т7 и Т27, как описано выше.
Относительное количество Т7 может быть определено следующим образом.
Все образцы размораживали при комнатной температуре. Все стадии центрифугирования проводили на охлаждаемой центрифуге (например, Центрифуга Eppendorf 5804R; Eppendorf, Гамбург, Германия). Использовали, как правило, примерно 80-300 мкг, предпочтительно 100-200 мкг белка на образец. Для того чтобы адаптировать буфер, может быть необходимо сконцентрировать образцы до соответствующей концентрации белка, например, с помощью устройства концентрирования, такого как Vivaspin 500, 10 кДа, Sartorius Art.Nr.: VS0102. К образцам или их концентратам добавляли промывочный буфер (50 мМ TRIS, рН 8) до конечного объема примерно 200 мкл промывочного буфера для промывки. Добавляли 100 мкл денатурирующего раствора. Денатурирующий раствор получали путем смешивания 950мкл 0,1% RapiGest (Waters, no. 186001861) в 50 мМ TRIS рН 8 вместе с 50 мкл 1 М йодацетамида (Sigma, no. I1149) в 50 мМ TRIS, рН 8. Реактив готовили непосредственно перед использованием и закрывали, например, алюминиевой фольгой для защиты от света. Пузыри удаляли путем легкого постукивания, и образец инкубировали в течение 40 мин при 50°C (например, с помощью Thermomixer Comfort; Eppendorf Гамбург, Германия).
Образцам давали возможность остыть до комнатной температуры, а затем заменяли буфер до конечного объема 20-40 мкл буфера для расщепления (50 мМ MES (Sigma, M5287) в воде ВЭЖХ, рН 6). Затем каждый из образцов переносили в реакционную пробирку с безопасной блокировкой и добавляли 25 мкл 50 мМ буфера для расщепления (50 мМ MES в воде ВЭЖХ, рН)+25 мкл буфера для расщепления с поверхностно-активным веществом (0,1% RapiGest (Waters, № 186001861) в буфере 50 мМ MES, рН 6). Добавляли 12мкл свежевосстановленного трипсина, 1нг/мкл (Promega, Трипсин Gold, класс чистоты Масс-Спектр., восстанавливали буфером 50мм MES, рН 6, непосредственно перед использованием). Образец осторожно перемешивали путем осторожного встряхивания, затем недолго осаждали центрифугированием и инкубировали в течение 17 ч при 37°С в нагревательном блоке (например, Thermomixer Comfort; Eppendorf Hamburg, Германия).
После инкубирования образцы удаляли из термомиксера и добавляли 49 мкл терминирующего раствора (1% муравьиной кислоты (класса чистоты ВЭЖХ, например, ThermoScientific, № 40967) в 10% ацетонитрила (ацетонитрил класса чистоты ВЭЖХ ≥ 99,9%, например, Merck № (1.00030.2500)). Его осторожно перемешивали, слегка встряхивая. Образцы центрифугировали в течение прибл. 10мин при 16000g и 6°C. После центрифугирования может быть едва заметен немного непрозрачный осадок. Если образец оставался непрозрачным после первого центрифугирования, то его повторяли. Затем надосадочную жидкость переносили автосэмплером в стеклянную пробирку емкостью 300 мкл, добавляли воду до общего объема приблизительно 236 мкл, и образцы помещали в охлаждаемый автосэмплер.
ВЭЖХ проводили с использованием жидкостного хроматографа с УФ-детектором (например, система 1200SL серии LC с онлайн-дегазатором (G1322A), бинарным модулем насоса (G1312), термостатируемым автосамплером (G1329A/G1330A), термостатируемым отделом колонки (G1316A), детектором VWD (G1314A);. все от Agilent Technologies, Вальдброн, Германия) и соответствующей колонки (например, Ascentis Express Peptide ES-C18, 2,1 мм ID х 15 см L № по кат. 53307-U; Supelco). Использовали следующие параметры:
Время прогона: | 45 мин |
Скорость потока: | 0,8 мл/мин |
Сжимаемость Левый насос | 46 |
Сжимаемость Правый насос | 115 |
Температура колонки: 60°C (= заданное значение) | 60°C (= заданное значение) |
Объем вкола: | 50 мкл |
Температура автосэмплера: | 2-10°C |
УФ-детектор: | Длина волны: 215 нм Ширина Пика: 0,025мин |
MWD/DAD Детектор: | Длина волны: 215 нм Ширина пика:0,03мин Ширина полосы: 4нм Нет Ссылки Ширина щели: 4нм |
Подвижная фаза А | 0,1% ТФК (класс ВЭЖХ, Fluka № 40967) в воде ВЭЖХ |
Мобильная фаза В | 0,1% ТФК в 90% ацетонитриле и 10% воды ВЭЖХ |
Градиент |
Таблица 3
Время [мин] | %B | Скорость потока [мл/мин] |
0 | 0 | 0,8 |
2,5 | 0 | 0,8 |
25 | 16 | 0,8 |
28 | 18 | 0,8 |
33 | 100 | 0,8 |
37 | 100 | 0,8 |
40 | 0 | 0,8 |
45 | 0 | 0,8 |
Для контроля примесей пустые образцы (подвижная фаза А) могут быть введены каждую, например, 10-ую инъекцию.
Интегрирование хроматограмм осуществляли с использованием подходящей системы данных хроматографии, например Chromeleon (Dionex, Саннивейл, Калифорния, США). Относительное количество пептида Т7 рассчитывали в соответствии со следующим уравнением (формула (1)):
Отн.%(T7)=([площадь (T7)]/([площадь (T7)]+[площадь (T27)]))x100 (1)
Площадь (Т7): площадь пика T7
Площадь (T27): площадь пика T27
Для того чтобы гарантировать, что на колонку нанесли надлежащее количество образца, площадь пика Т27 в заданном образце сравнивали со средней площадью пика инъекции эталонного вещества. Расчеты осуществляли в соответствии с уравнением:
Количество наносимого образца [%]=(аобразца/аэталона)*100
аобразца площадь пика T27 образца TNFR:Fc
аэталона средняя площадь пика T27 инъекции эталонного вещества TNFR:Fc
Все используемые вещества относились к классу Ph. Eur. или имели сопоставимое качество. Буферы готовили с использованием очищенной и деионизированной воды. Поставщики и номера заказов для указанных инструментов, материалов и реагентов приведены в качестве примеров. Эти продукты можно считать взаимозаменяемыми с аналогичными продуктами такого же или лучшего качества.
Следует особо отметить, что относительные количества T7, обнаруженные во всех исследованных партиях США и ЕС ENBREL®, показали значения 2,3% или выше при анализе и расчете в соответствии со способом определения по настоящему изобретению с использованием сигнала пептида T27 в качестве эталонного пика, см. Таблицу 5.
Таблица 4. Относительное количество Т7 в эталонном продукте ENBREL®
Партия | T7 [%] |
#1026663 (US) | 2,4 |
#F36988 (EU) | 2,4 |
#F76195 (EU) | 2,8 |
#1028435 (US) | 2,3 |
#1026662 (US) | 2,3 |
#F69006 (EU) | 2,8 |
Это свидетельствует о том, что способы получения и очистки, представленные в настоящем документе, способны производить TNFR2:Fc и, в частности, этанерцепт с беспрецедентным уровнем уменьшенного количества Т7.
Пример 2: Получение TNFR2:Fc с различными количествами T7
Известно, что варианты с некорректными дисульфидными связями уже могут быть сформированы в процессе выше (USP) для производства TNFR2:Fc. Анализируя образцы DoE (планирование эксперимента) процесса описательных исследований можно было бы показать, что количество вариантов с некорректными дисульфидными связями может влиять на уровень USP (см. Таблицу 4). Приведенные значения получены из статистической модели. Образцы TNFR2:Fc, взятые для создания этой модели, подвергали только аффинной хроматографии с Протеином А и не очищали с помощью гидрофобной хроматографии. Относительное количество T7 определяли в соответствии со способом с использованием интегрирования пиков Т7 и Т27, как описано ниже.
Таблица 5
95% доверительный интервал | 95% доверительный интервал | |||||||
pH | T7 [%] | Нижний предел | Верхний предел | Температура [°C] | T7 [%] | Нижний предел | Верхний предел | |
6,65 | 3,86 | 3,59 | 4,14 | 30,5 | 2,21 | 1,92 | 2,5 | |
6,70 | 3,59 | 3,42 | 3,76 | 31,5 | 2,4 | 2,24 | 2,55 | |
6,80 | 3,25 | 3,12 | 3,38 | 33,0 | 3,19 | 3,05 | 3,32 | |
6,90 | 3,2 | 3,04 | 3,35 | 34,5 | 4,59 | 4,3 | 4,88 | |
6,95 | 3,27 | 3,07 | 3,48 | 35,5 | 5,87 | 5,31 | 6,42 |
Пример 3: Очистка TNFR2:Fc
Во время нижеследующих процессов (DSP) варианты с некорректными дисульфидными связями в основном исчерпанные на стадии очистки HIC, при этом в небольших количествах могут быть уже исчерпанными на предыдущей стадии анионообменной очистки, такой как стадия очистки ММС в проточном режиме.
Аффинная хроматография (Протеин А)
Процесс очистки начинали с бесклеточных надосадочных жидкостей. Материал фильтровали на фильтре 0,2 мкм. Используя Fc-часть слитого белка, TNFR:Fc захватывали с помощью аффинной хроматографии на смоле с Протеином А. Взаимодействие Протеина А с Fc-частью очень специфично. Таким образом, захватывающая хроматография очень эффективно отделяет белки клетки-хозяина (НСР), ДНК и вирус от продукта.
Температура процесса составила 21°C. Надосадочную жидкость клеточной культуры загружали на смолу MabSelect SuRe (GE Healthcare), уравновешенную натрий-фосфатным буфером, pH 7, дополнительно содержащим 150 мМ хлорида натрия. Затем колонку промывали тем же самым буфером до тех пор, пока значение при УФ280 не возвращалось к сигналу, близкому к базовому (примерно 2-6 объемов колонки).
Для увеличения удаляющей способности HCP стадии захвата вводили дополнительную стадию промывки. Этот промывочный буфер содержал ацетат натрия и 0-500 мМ хлорида натрия. За этим следовало элюирование продукта кислотным буфером, имеющим рН ~ 3,2. Элюаты объединяли и обрабатывали для следующей стадии очистки.
Анионообменная хроматография (AEX)
Промежуточный продукт, полученный на стадии аффинной хроматографии, доводили до рН 7,5 и загружали на смолу Фрактогель ТМАЕ HiCap (M) (Merck). После этого колонку промывали натрий-фосфатным буфером и, наконец, продукт элюировали натрий-фосфатным буфером, содержащим 150 мМ хлорида натрия. Элюаты объединяли и обрабатывали для следующей стадии очистки.
ММ хроматография (ММС)
Объединенные элюаты из стадии анионообменной хроматографии доводили по проводимости с использованием 4 М хлорида натрия, и рН доводили до рН 6 с использованием раствора фосфорной кислоты рН ≤ 2. Затем промежуточный продукт загружали на смолу Capto adhere (GE Healthcare), уравновешенную 20 мМ фосфатом натрия, 450 мМ хлоридом натрия, рН 6, и колонку затем промывали 20 мМ фосфатом натрия, 450 мМ хлоридом натрия, рН 6. Элюат и раннюю промывку, содержащую продукт, собирали и объединяли.
Хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC)
Объединенные фракции из хроматографии ММ разводили буфером цитрата натрия с рН 6, содержащим 1,4 М сульфат натрия. Проводимость раствора составляла примерно 80 мСм/см. Затем раствор загружали на Toyopearl Phenyl 650 (М) и уравновешивали буфером цитрата натрия с рН 6, содержащим сульфат натрия. Затем колонку промывали тем же самым буфером. Наконец, проводили элюирование с колонк с использованием 0-100% градиента от уравновешивающего буфера до элюирующего буфера (25 мМ цитрат натрия, рН 6).
Чистоту продукта определяли с использованием эксклюзионной хроматографии (SEC), а также путем определения количества ДНК, белков клетки-хозяина (НСР), Протеина А и эндотоксина. Кроме того, рассчитывали для каждой стадии очистки выход постадийно и суммарный выход. Таблица 8 ниже демонстрирует данные, полученные с помощью описанного выше способа, по меньшей мере, для трех прогонов.
Таблица 6 Исчерпание пептида T7 во время нижеследующей обработки
Партия | Стадии очистки | T7 [%] | Эффективность [относительные единицы] |
1 | Прот A | 3,63 | 71 |
1 | + AEX+MMC | 3,05 | 74 |
1 | + HIC | 1,54 | 91 |
2 | Прот A | 3,44 | 72 |
2 | + AEX+MMC | 3,16 | 75 |
2 | + HIC | 1,23 | 93 |
Пример 4: Стабильность в условиях стресса
Применение способов, описанных в настоящем документе, позволяет получить препараты TNFR:Fc с пониженным относительным количеством Т7 по сравнению с препаратами TNFR:Fc, известными из уровня техники. Низкое количество T7 также поддерживали при стрессовой обработке.
Таблица 7
Образец No. | T7 относительно T27 (% T7) | |
3 | Конечный состав | 1,2 |
3 | 1 месяц при 40°C | 1,8 |
4 | 1 месяц при 40°C | 1,9 |
Список использованной литературы
US 7294481
US 6048728
WO 2011/134920
WO 2011/134921
Mukai et al. (2010) «Solution of the Structure of the TNF-TNFR2 Complex.», Sci Signal 3 (148), ra83
Claims (41)
1. Способ определения TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 в образце, содержащем TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, где способ включает стадии:
(a) предоставления образца, содержащего смесь TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 и TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96;
(b) денатурации и алкилирования образца стадии (а);
(c) подвергание образца, полученного на стадии (b), трипсиновому расщеплению в невосстанавливающих условиях;
(d) подвергания образца, полученного на стадии (с), ВЭЖХ, тем самым отделяя фрагменты, характерные для TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, где указанные фрагменты состоят из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4 («Т7»); и
(e) проведения интегрирования для пика, характерного для фрагментов, состоящих из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4 («Т7»), и для пика, не подверженного влиянию дисульфидных связей Cys74, Cys78, Cys88 и Cys96, как получено на стадии (d);
где аминокислотная последовательность TNFR2-части TNFR2:Fc имеет по меньшей мере 97% идентичности, предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99% идентичности; наиболее предпочтительно 100% идентичности с аминокислотами 1-235 из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность TNFR2:Fc, применяемого на стадии (а), имеет по меньшей мере 97% идентичности, предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99% идентичности; наиболее предпочтительно 100% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3 (этанерцепт).
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что пик, не подверженный влиянию дисульфидных связей Cys74, Cys78, Cys88 и Cys96, не подвержен влиянию дисульфидных связей совсем и является характерным для суммарного TNFR:Fc в образце.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что фрагменты, характерные для суммарного TNFR2:Fc, содержат, предпочтительно состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5 («Т27»), SEQ ID NO: 24 («Т22»), SEQ ID NO: 29 («Т31»), и SEQ ID NO: 36 («Т39»), более предпочтительно, где фрагменты, характерные для суммарного TNFR2:Fc, содержат, предпочтительно состоят из SEQ ID NO: 5 («T27»).
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что относительное количество TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 определяют с помощью
(i) интегрирования площадей пиков в хроматограмме ВЭЖХ, характерных для TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 («площадь Т7») и характерных для суммарного TNFR2:Fc («площадь T27»); и
(ii) расчета относительного количества согласно формуле (1)
X (в %)=([площадь T7]/([площадь T7]+[площадь T27]))x100 .
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что стадию (b) проводят в буфере, имеющем рН в диапазоне 7-9, предпочтительно 7,5-8,5, наиболее предпочтительно примерно рН 8, содержащем
10-100 мМ Tris, более предпочтительно 20-80 мМ Tris; и/или
0,5-1,5 М йодацетамид, предпочтительно 0,9-1,2 M йодацетамид; и/или
расщепляемое поверхностно-активное вещество.
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что стадию (b) проводят при 40-70°C в течение 30-60 мин, предпочтительно при 50-60°С в течение 30-45 мин.
8. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что стадию (с) проводят в буфере для расщепления, имеющем рН в диапазоне 5-7, предпочтительно 5,5-6,5; и где буфер для расщепления содержит MES в качестве буферного агента, предпочтительно в буфере, содержащем 10-100 мМ MES, более предпочтительно 30-60 мМ MES; и/или
0,02%-0,5% расщепляемого поверхностно-активного вещества, предпочтительно 0,1% -0,2%.
9. Способ по п.6 или 8, отличающийся тем, что поверхностно-активное вещество независимо выбирают из
3-[(2-метил-2-ундецил-1,3-диоксолан-4-ил)метокси]-1-пропансульфоната натрия,
3-((1-(фуран-2-ил)ундецилокси)карбониламино)пропан-1-сульфоната натрия, и
3-(4-(1,1-бис(гексилокси)этил)пиридиний-1-ил)пропан-1-сульфоната натрия;
более предпочтительно, где поверхностно-активное вещество представляет собой 3-[(2-метил-2-ундецил-1,3-диоксолан-4-ил)метокси]-1-пропансульфонат натрия.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что стадию (с) проводят с использованием эффективного количества трипсина в течение 1-24 ч, предпочтительно в течение 6-18 ч; и
при 32-38°С, предпочтительно при 36-37°С.
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что стадию (d) проводят в подвижной фазе, содержащей 0,05%-0,5% ТФУ в воде, предпочтительно 0,1% -0,2% ТФУ в воде.
12. Способ очистки TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, причем способ включает:
(а) подвергание образца, содержащего TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys78-Cys88, по меньшей мере одной хроматографической стадии, где по меньшей мере одна хроматографическая стадия включает хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC); и
(b) отделение одной или нескольких фракций, содержащих TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, который содержит уменьшенное количество TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 по сравнению с образцом согласно (а);
где указанные одна или несколько фракций содержат менее чем 2,2% TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 на основе суммарного TNFR2:Fc, предпочтительно менее чем 2,1%, предпочтительно менее чем 2,%, предпочтительно менее чем 1,9%, предпочтительно менее чем 1,8%, более предпочтительно менее чем 1,7%, еще более предпочтительно менее чем 1,6% и наиболее предпочтительно 1,5% или менее TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, при определении с использованием способа по п.5.
13. Способ очистки TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, где способ включает:
(а) подвергание образца, содержащего TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, по меньшей мере одной хроматографической стадии, где по меньшей мере одна хроматографическая стадия включает хроматографию гидрофобного взаимодействия (HIC); и
(b) отделение одной или нескольких фракций, содержащих TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96, которые содержат уменьшенное количество TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 по сравнению с образцом согласно (а);
где количество TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 определяют с использованием способа по любому из пп.1-11.
14. Способ получения и очистки TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, включающий:
(a) получение композиции, содержащей TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 в подходящей клетке-хозяине; и
(b) очистку полученной комбинации TNFR2:Fc с дисульфидными связями Cys74-Cys88/Cys78-Cys96 и TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 с помощью способа очистки по любому из пп.12 или 13.
15. Композиция TNFR2:Fc для лечения заболевания, выбранного из анкилозирующего спондилита, ювенильного ревматоидного артрита, псориаза, псориатического артрита и ревматоидного артрита, где аминокислотная последовательность TNFR2:Fc имеет по меньшей мере 97% идентичности, предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99% идентичности; наиболее предпочтительно 100% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, содержащей менее чем 2,2% TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88 на основе суммарного TNFR2:Fc, предпочтительно менее чем 2,1%, предпочтительно менее чем 2%, предпочтительно менее чем 1,9%, предпочтительно менее чем 1,8%, более предпочтительно менее чем 1,7%, еще более предпочтительно менее чем 1,6% и наиболее предпочтительно 1,5% или менее TNFR2:Fc с дисульфидной связью Cys78-Cys88, как определено согласно способу по п.5.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP14177696.3 | 2014-07-18 | ||
EP14177696.3A EP2975050B1 (en) | 2014-07-18 | 2014-07-18 | Quantification of misfolded TNFR2:Fc |
PCT/EP2015/066385 WO2016009036A1 (en) | 2014-07-18 | 2015-07-17 | Quantification of misfolded tnfr2:fc |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2017102487A RU2017102487A (ru) | 2018-08-20 |
RU2017102487A3 RU2017102487A3 (ru) | 2018-10-03 |
RU2698671C2 true RU2698671C2 (ru) | 2019-08-28 |
Family
ID=51210344
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2017102487A RU2698671C2 (ru) | 2014-07-18 | 2015-07-17 | КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА НЕПРАВИЛЬНО СВЕРНУТОГО TNFR2:Fc |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9598718B2 (ru) |
EP (1) | EP2975050B1 (ru) |
KR (1) | KR20170031145A (ru) |
AU (1) | AU2015289100B2 (ru) |
BR (1) | BR112017000955A2 (ru) |
CA (1) | CA2952342A1 (ru) |
ES (1) | ES2733298T3 (ru) |
MX (1) | MX2017000831A (ru) |
RU (1) | RU2698671C2 (ru) |
WO (1) | WO2016009036A1 (ru) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
BRPI0611901A2 (pt) | 2005-06-14 | 2012-08-28 | Amgen, Inc | composição, liofilizado, kit, e, processo para preparar uma composição |
AU2017345490B2 (en) | 2016-10-21 | 2022-07-07 | Amgen Inc. | Pharmaceutical formulations and methods of making the same |
CA3233422A1 (en) * | 2021-09-28 | 2023-04-06 | Kashiv Biosciences, Llc | An improved process for purification of fusion protein |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA017152B1 (ru) * | 2006-08-28 | 2012-10-30 | Арес Трейдинг С.А. | СПОСОБ ОЧИСТКИ Fc-СОДЕРЖАЩИХ БЕЛКОВ |
US20130295608A1 (en) * | 2011-02-25 | 2013-11-07 | Piotr Bobrowicz | Yeast strain for the production of proteins with modified o-glycosylation |
US20140072560A1 (en) * | 2012-09-11 | 2014-03-13 | Coherus Biosciences, Inc. | Correctly folded etanercept in high purity and excellent yield |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6048728A (en) | 1988-09-23 | 2000-04-11 | Chiron Corporation | Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression |
US7294481B1 (en) | 1999-01-05 | 2007-11-13 | Immunex Corporation | Method for producing recombinant proteins |
WO2003102225A1 (en) * | 2002-05-31 | 2003-12-11 | Waters Investments Limited | Destructible surfactants and uses thereof |
AU2004262014B2 (en) | 2003-08-01 | 2010-06-17 | Amgen Inc. | Crystalline tumor necrosis factor receptor 2 polypeptides |
US7408030B2 (en) * | 2005-01-13 | 2008-08-05 | North Carolina State University | Purification of immunoglobulins using affinity chromatography and peptide ligands |
WO2010002911A2 (en) * | 2008-06-30 | 2010-01-07 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Methods and materials for monitoring myeloma using quantitative mass spetrometry |
RU2644651C2 (ru) | 2010-04-26 | 2018-02-13 | Новартис Аг | Среда для культивирования клеток |
SG185037A1 (en) | 2010-04-26 | 2012-11-29 | Novartis Ag | Improved cell culture medium |
CN102382190B (zh) | 2010-09-01 | 2014-04-09 | 山东新时代药业有限公司 | 分离和去除TNFR-Fc融合蛋白中寡聚体的方法 |
EP2723759A4 (en) | 2011-06-24 | 2015-01-28 | Reddys Lab Ltd Dr | PURIFICATION OF CHIMERIC PROTEIN |
KR101454316B1 (ko) | 2011-08-17 | 2014-10-27 | 한화케미칼 주식회사 | 활성형 TNFR-Fc 융합 단백질을 제조하는 방법 |
WO2014102814A1 (en) | 2012-12-31 | 2014-07-03 | Intas Biopharmaceuticals Limited | Process for the purification of fc fusion proteins |
ES2759061T3 (es) * | 2013-03-15 | 2020-05-07 | Biomolecular Holdings Llc | Inmunoglobulina híbrida que contiene unión no peptidílica |
-
2014
- 2014-07-18 EP EP14177696.3A patent/EP2975050B1/en not_active Revoked
- 2014-07-18 ES ES14177696T patent/ES2733298T3/es active Active
- 2014-08-08 US US14/455,183 patent/US9598718B2/en active Active
- 2014-10-17 US US14/516,992 patent/US9182410B1/en active Active
-
2015
- 2015-07-17 WO PCT/EP2015/066385 patent/WO2016009036A1/en active Application Filing
- 2015-07-17 BR BR112017000955A patent/BR112017000955A2/pt active Search and Examination
- 2015-07-17 RU RU2017102487A patent/RU2698671C2/ru active
- 2015-07-17 MX MX2017000831A patent/MX2017000831A/es unknown
- 2015-07-17 AU AU2015289100A patent/AU2015289100B2/en not_active Ceased
- 2015-07-17 KR KR1020177001065A patent/KR20170031145A/ko not_active Application Discontinuation
- 2015-07-17 CA CA2952342A patent/CA2952342A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EA017152B1 (ru) * | 2006-08-28 | 2012-10-30 | Арес Трейдинг С.А. | СПОСОБ ОЧИСТКИ Fc-СОДЕРЖАЩИХ БЕЛКОВ |
US20130295608A1 (en) * | 2011-02-25 | 2013-11-07 | Piotr Bobrowicz | Yeast strain for the production of proteins with modified o-glycosylation |
US20140072560A1 (en) * | 2012-09-11 | 2014-03-13 | Coherus Biosciences, Inc. | Correctly folded etanercept in high purity and excellent yield |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
"Высокоэффективная жидкостная хромотография в биохимии", А.Хеншен, Москва, МИР, 1988, стр. 233-249. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20160017403A1 (en) | 2016-01-21 |
EP2975050B1 (en) | 2019-05-29 |
US9182410B1 (en) | 2015-11-10 |
EP2975050A1 (en) | 2016-01-20 |
AU2015289100A1 (en) | 2017-01-12 |
US9598718B2 (en) | 2017-03-21 |
AU2015289100B2 (en) | 2019-08-15 |
MX2017000831A (es) | 2017-05-01 |
BR112017000955A2 (pt) | 2018-01-16 |
ES2733298T3 (es) | 2019-11-28 |
KR20170031145A (ko) | 2017-03-20 |
WO2016009036A1 (en) | 2016-01-21 |
RU2017102487A3 (ru) | 2018-10-03 |
RU2017102487A (ru) | 2018-08-20 |
CA2952342A1 (en) | 2016-01-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2729482B1 (en) | Method for purifying fc-fusion protein | |
JP5931255B2 (ja) | 免疫グロブリン溶液を精製するための方法 | |
EP3048899B1 (en) | On-column viral inactivation methods | |
US9279014B2 (en) | Methods for preparing an active TNFR-Fc fusion protein | |
US20190194248A1 (en) | Polypeptide Separation Methods | |
RU2698671C2 (ru) | КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА НЕПРАВИЛЬНО СВЕРНУТОГО TNFR2:Fc | |
JP7097433B2 (ja) | 宿主細胞ガレクチンおよび他の夾雑物からグリコシル化タンパク質を精製する方法 | |
EP3102589A1 (en) | Use of cation-exchange chromatography in the flow-through mode to enrich post-translational modifications | |
RU2670889C9 (ru) | Способ контроля гликозилирования рекомбинантного гликопротеина | |
WO2004092218A1 (ja) | 組換えアンチトロンビンの製造方法 |