ES2759061T3 - Inmunoglobulina híbrida que contiene unión no peptidílica - Google Patents

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Abstract

Un compuesto que tiene la estructura:**Fórmula** en donde A es un primer componente polipeptídico del compuesto; en donde C es un segundo componente polipeptídico del compuesto, componente polipeptídico que tiene en su extremo N una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una cisteína, selenocisteína, CP, CPXCP (donde X = P, R, o S), CDKTHTCPPCP, CVECPPCP, CCVECPPCP y CDTPPPCPRCP, y comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presentes en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; y (ii) se unen a un receptor de Fc, en donde B es una estructura química que une A y C; en donde la línea discontinua entre B y C representa un enlace peptidílico entre B y el extremo N de C; en donde la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:**Fórmula** en donde R1 es H o es parte de una estructura adicional que es una estructura cíclica, en donde la estructura cíclica adicional comprende R1 o una parte de R1, y también puede comprender R2 o una parte de R2, y el carbono entre R2 y el doble enlace alqueno.

Description

DESCRIPCIÓN
Inmunoglobulina híbrida que contiene unión no peptidílica
Antecedentes de la invención
Las proteínas prefieren formar estructuras globulares compactas o fibrosas, que minimizan su exposición al solvente. Esta tendencia es inherente tanto en el esqueleto polipeptídico con su propensión para estructura secundarias unida por hidrógeno, como en las interacciones de las cadenas laterales que fomentan el plegamiento terciario. Por tanto, los esfuerzos previos para introducir “flexibilidad” en los anticuerpos usando péptidos han sido en gran medida inadecuados. Por ejemplo, es común emplear combinaciones de un aminoácido que favorece las interacciones con el solvente (por ejemplo, serina) con uno que rompe la estructura helicoidal (por ejemplo, glicina). Mientras que este enfoque es útil en hacer proteínas de fusión tal como fragmentos de anticuerpo monocatenarios (scFv), las estructuras resultantes son realmente bastante compactas sin evidencia de extensibilidad (por ejemplo, véase, Robert et al, (2009) Engineered antibody intervention strategies for Alzheimer's disease and related dementias by targeting amyloid and toxic oligomers. Protein Eng. Des. Sel. 22, 199-208). Además, es probable que tales secuencias creen problemas adicionales debido s su inmunogenicidad intrínseca y susceptibilidad proteolítica.
Capon et al, Proc. Jpn. Acad., Ser. B, 87(2011) describe anticuerpos flexibles con bisagra no proteica. Sin embargo, Capon et al no divulga los compuestos de la presente invención.
Hay una necesidad para nuevos compuestos proteicos, que incorporen nuevas cadenas no proteicas, que sean tanto flexibles como extensibles, así como procesos para la producción de tales compuestos.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona un compuesto que tiene la estructura:
Figure imgf000002_0001
en donde A es un primer componente polipeptídico del compuesto;
en donde C es un segundo componente polipeptídico del compuesto, componente polipeptídico que tiene en su extremo N una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una cisteína, selenocisteína, CP, CPXCP (donde X = P, R, o S), CDKTHTCPPCP, CVECPPCP, CCVECPPCP y CDTPPPCPRCP, y comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presentes en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; y (ii) se unen a un receptor de Fc,
en donde B es una estructura química que une A y C;
en donde la línea discontinua entre B y C representa un enlace peptidílico entre B y el extremo N de C;
en donde la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000002_0002
en donde Ri es H o es parte de una estructura adicional que es una estructura cíclica, en donde la estructura cíclica adicional comprende R1 o una parte de R1, y también puede comprender R2 o una parte de R2, y el carbono entre R2 y el doble enlace alqueno.
La presente especificación describe un proceso para producir un compuesto que tiene la estructura:
A
\
Figure imgf000003_0001
en donde A es un primer componente polipeptídico del compuesto;
en donde C es un segundo componente polipeptídico del compuesto, componente polipeptídico que comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presentes en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; (ii) se unen a un receptor de Fc; y (iii) tiene en su extremo N una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una cisteína, selenocisteína, CP, CPXCP (donde X = P, R, o S), CDKTHTCPPCP, CVECPPCP, CCVECPPCP y CDTPPPCPRCP,
en donde B es una estructura química que une A y C;
en donde la línea discontinua entre B y C representa un enlace peptidílico;
en donde la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000003_0002
en donde R1 es H o es parte de una estructura adicional que es una estructura cíclica, en donde la estructura cíclica adicional comprende R1 o una parte de R1, y también puede comprender R2 o una parte de R2, y el carbono entre R2 y el doble enlace alqueno
que comprende las siguientes etapas:
a) obtener un A' que comprende A o un derivado de A, y un primer grupo reactivo terminal;
b) obtener un B' que comprende B o un derivado de B, un segundo grupo reactivo terminal y un tercer grupo reactivo terminal, en donde el segundo grupo reactivo terminal es capaz de reaccionar con el primer grupo reactivo terminal para formar un enlace no peptidílico;
c) obtener un C' que comprende C o un derivado de C, y un cuarto grupo reactivo terminal, en donde el cuarto grupo reactivo terminal es capaz de reaccionar con el tercer grupo reactivo terminal para formar un enlace peptidílico; y d) hacer reaccionar A', B' y C' en cualquier orden para producir el compuesto.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la preparación de TNR1B modificado con alquino por corte de una proteína de fusión TNR1B-inteína con cistil-propargilamida. El subproducto inteína se elimina por cromatografía en quitina. TNR1B modificado con azida y TNR1B modificado con cicloalquino se preparan de forma similar usando cistil-3-azidopropilamida, y varios derivados de ciclooctino (por ejemplo, DIBAC) de cisteína, respectivamente.
La figura 2 muestra el corte de TNR1B por (1) cisteína, (2) cisteína sulfonato de mercaptaetano (MESNA), (3) cistilpropargilamida, (4) cistil-propargilamida MESNA, y (5) MESNA. Todos los compuestos se usaron a una concentración 50 mM.
La figura 3 muestra la preparación de Fc6 modificado con azida por ligación (peptidilo) del dímero Fc6 y azida-DKTHT-tioéster (tabla 1 ).
La figura 4 muestra la preparación de Fc6 modificado con azida por ligación (peptidilo) del dímero Fc6 y azida-PEGn-DKTHT-tioéster (tabla 1). Fc modificado con cicloalquino se prepara de forma similar usando DIBAC-PEG12-tioéster.
La figura 5 muestra el análisis por SDS-PAGE (condiciones reductoras) de (1) Fc6 sin modificar, (2) el producto de reacción Az-DKTHT-Fc6 de la figura 3, y (3) el producto de reacción Az-PEG4-DKTHT-Fc6 de la figura 4.
La figura 6 muestra la síntesis de TNR1B-alquino-azida-Fc6 por ligación (no peptidílica) de TNR1B modificado con alquino y Az-DKTHT-Fc6.
La figura 7 muestra la síntesis de TNR1B-alquino-azida-PEGn-Fc6 por ligación (no peptidílica) de TNR1B modificado con alquino y azida-PEGn-DKTHT- Fc6. En este ejemplo, n = 4.
La figura 8 muestra el análisis por SDS-PAGE (condiciones reductoras) de (1) TNR1B modificado con alquino solo, (2) TNR1B modificado con alquino Az-DKTHT-Fc6 en ausencia de catalizador, (3) TNR1B modificado con alquino Az-DKTHT-Fc6 catalizador que lleva al producto de la figura 6, y (4) TNR1B modificado con alquino dializado Az-DKTHT-Fc6 catalizador que produce la formación aumentada del producto de la figura 6, (5) TNR1B modificado con alquino Az-PEG4-DKTHT-Fc6 en ausencia de catalizador, (6) TNR1B modificado con alquino Az-PEG4-DKTHT-Fc6 catalizador que lleva al producto de la figura 7, y (7) TNR1B modificado con alquino dializado Az-PEG4-DKTHT-Fc6 catalizador que produce la formación aumentada del producto de la figura 7. Las flechas corresponden a (a) Mr ~75.000, (b) Mr ~65.000, (c) Mr ~43.000, y (d) Mr ~28.000.
La figura 9 muestra el análisis por SDS-PAGE (condiciones reductoras) de (1) proteína de fusión TNR1B-Fc (etanercept) sola, (2) TNR1B modificado con alquino Az-DKTHT-Fc6 catalizador que lleva al producto de la figura 6, (3) proteína de fusión TNR1B-Fc (etanercept), y (4) TNR1B modificado con alquino Az-PEG4-DKTHT-Fc6 que lleva al producto de la figura 7. Las flechas corresponden a (a) Mr ~75.000, (b) Mr ~65.000, (c) Mr ~43.000, y (d) Mr ~28.000.
La figura 10 muestra el análisis por SDS-PAGE (condiciones reductoras) de (1) Fc6 sin modificar catalizador, (2) TNR1B modificado con alquino Fc6 sin modificar catalizador, (3) Az-DKTHT-Fc6 catalizador, (4) TNR1B modificado con alquino Az-DKTHT-Fc6 catalizador que lleva al producto de la figura 6, y (5) TNR1B modificado con alquino solo. Las flechas corresponden a (a) Mr ~75.000, (b) Mr ~65.000, (c) Mr ~43.000, (d) Mr ~28.000 y (e) Mr ~27.000.
La figura 11 muestra los péptidos trípticos identificados por LC/MS en el producto TNR1B-alquino-azida-DKTHT-Fc6 (Mr ~75.000) de la figura 10. Las secuencias peptídicas subrayadas son las identificadas por LC/MS que derivan de las secuencias parentales de TNR1B (superior) y Fc6 (inferior).
La figura 12 muestra el análisis por SPR de la unión de TNF-a por los productos de reacción TNR1B-alquino-azida-DKTHT-Fc6 (panel izquierdo) y TNR1 B-alquino-azida-PEG4-DKTHT-Fc6 (panel derecho) de la figura 9. Los datos de unión cinéticos se resumen en la tabla 2.
La figura 13 muestra la preparación de Fab' adalimumab en un proceso en tres etapas: 1) corte con IdeS a los fragmentos Fab'2 y Fc', 2) cromatografía en proteína A para eliminar el fragmento Fc', y 3) reducción suave del fragmento Fab'2 al fragmento Fab' con 2-mercaptoetilamina (MEA).
La figura 14 muestra el análisis por SDS-PAGE de (1) adalimumab, (2) adalimumab después de la escisión con IdeS, (3) Fab'2 de adalimumab después de la purificación con proteína A, (4) Fab' de adalimumab después del tratamiento con MEA del Fab'2 purificado con proteína A, (5) Fab'2 de adalimumab después de la purificación con proteína A, y (6) Fab' de adalimumab después del tratamiento con MEA del Fab'2 purificado con proteína A. Las muestras en los carriles 1,2, 5 y 6 eran análisis en condiciones reductoras; mientras que las muestras en los carriles 3 y 4 se analizaron en condiciones no reductoras. Las flechas corresponden a (a) la cadena pesada, (b) el fragmento Fc' de la cadena pesada, (c) el fragmento Fd' de la cadena pesada (que contiene la región variable), y (d) la cadena ligera.
La figura 15 muestra la preparación de Fab' modificado con cicloalquino por la reacción de Fab' de adalimumab con DIBAC-PEGy-Lys(Mal). En este ejemplo, PEGy = PEG12.
La figura 16 muestra el análisis por SDS-PAGE (condiciones no reductoras) de la síntesis y purificación de Fab' de adalimumab modificado con cicloalquino. El panel superior muestra la reacción a (1-6) pH 7,4 y (7-12) pH 7,0. La proporción de DIBAC-PEGy-Lys(Mal) respecto a Fab' fue (1) 0, (2) 10:1, (3) 5:1, (4) 2,5:1, (5) 1,2:1, (6) 0,6:1, (7) 0, (8) 10 , (9) 5, (10) 2,5, (11 ) 1,2, y (12 ) 0,6:1. El panel inferior muestra (1 ) Fab' sin reaccionar, (2 ) a (12) fracciones no unidas a proteína L que contienen solo el Fab' modificado con cicloalquino.
La figura 17 muestra el análisis por SDS-PAGE (condiciones reductoras) de (1) Fc6, (2) Az-DKTHT-Fc6, (3) Az-PEG12-DKTHT-Fc6, (4) Az-PEG24-DKTHT-Fc6, y (5) Az-PEG36-DKTHT-Fc6.
La figura 18 muestra la cromatografía de exclusión molecular de (a) Az-PEG36-DKTHT-Fc6, (b) Az-PEG24-DKTHT-Fc6, (c) Az-PEG-i2-DKTHT-Fc6, (d) Az-DKTHT-Fc6, y (e) Fc6.
La figura 19 muestra la síntesis de Fab'-PEGy-alquino-azida-PEGx-Fc6 por ligación (no peptidílica) de Fab' de adalimumab modificado con cicloalquino y Fc6 modificada con azida.
La figura 20 muestra la serie del producto Fab'-PEGy-alquino-azida-PEGx-Fc6.
La figura 21 muestra el análisis por SDS-PAGE de (1) anticuerpo entero adalimumab, (2) Fab' de adalimumab, (3) Fab'-PEG-i2-alquino, (4) Fab'-PEG12-alquino Az-DKTHT-Fc6, (5) Az-DKTHT-Fc6, (6) Fab'-PEG12-alquino Az-PEG-i2-DKTHT-Fc6, (7) Az-PEG-i2 -DKTHT-Fc6, (8) Fab'-PEG12-alquino Az-PEG24-DKTHT-Fc6, (9) Az-PEG24-DKTHT-Fc6 solo, (10) Fab'-PEG12-alquino Az-PEG36-DKTHT-Fc6, (11) Az-PEG36-DKTHT-Fc6, y (12) Fc6. Las muestras se corrieron en condiciones reductoras (panel superior) y condiciones no reductoras (panel inferior). En el panel superior la flecha muestra (a) cadena pesada de Fab'-PEGy-alquino-azida-PEGx-Fc6. En los paneles inferiores las flechas muestran (a) moléculas de Fab'-PEGy-alquino-azida-PEGx-Fc6 de dos manos, y (b) moléculas de Fab'-PEGy-alquino-azida-PEGx-Fc6 de una mano.
La figura 22 muestra la cromatografía de exclusión molecular (SEC) de los productos de reacción de dos manos: (a) Fab'-PEG-i2-alquino-azida-PEG36-DKTHT-Fc6, (b) Fab'-PEG-i2-alquino-azida-PEG24-DKTHT-Fc6, (c) Fab'-PEG12-alquino-azida-pEG-i2-DKTHT-Fc6, (d) Fab'-PEG-i2-alquino-azida-DKTHT-Fc6, y (e) adalimumab entero.
La figura 23 muestra la inhibición de la citotoxicidad de TNF-a en células WEHI por los productos de reacción. El panel superior muestra (a) el control de Fc6, (b) Fab' modificado con cicloalquino, (c) Fab'-PEG-i2-alquino-azida-DKTHT-Fc6, y (d) Fab'-PEG12-alquino-azida-PEG12-DKTHT-Fc6. El panel inferior muestra (a) el control de Fc6, (b) Fab' modificado con cicloalquino, (c) Fab'-PEG-i2-alquino-azida-PEG24-DKTHT-Fc6, y (d) Fab'-PEG-i2-alquino-azida-PEG36-DKTHT-Fc6.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un compuesto que tiene la estructura:
A
Figure imgf000005_0001
en donde A es un primer componente polipeptídico del compuesto;
en donde C es un segundo componente polipeptídico del compuesto, componente polipeptídico que tiene en su extremo N una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una cisteína, selenocisteína, CP, CPXCP (donde X = P, R, o S), CDKTHTCPPCP, CVECPPCP, CCVECPPCP y CDTPPPCPRCP, y comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presentes en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; y (ii) se unen a un receptor de Fc ,
en donde B es una estructura química que une A y C;
en donde la línea discontinua entre B y C representa un enlace peptidílico entre B y el extremo N de C;
en donde la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000006_0001
en donde Ri es H o es parte de una estructura adicional que es una estructura cíclica, en donde la estructura cíclica adicional comprende Ri o una parte de Ri, y también puede comprender R2 o una parte de R2, y el carbono entre R2 y el doble enlace alqueno.
La presente especificación describe un compuesto en donde la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000006_0002
en el que R5 es un grupo alquilo o arilo,
en donde R1 es H o es parte de una estructura adicional que es una estructura cíclica, en donde la estructura cíclica adicional comprende R1 o una parte de R1, y también puede comprender R2 o una parte de R2, y el carbono entre R2 y el doble enlace alqueno;
con la condición de que
Figure imgf000006_0003
Figure imgf000007_0003
en donde R2 representa una estructura orgánica que se une a uno de A o B y R4 representa una estructura orgánica que se une al otro de A o B.
En algunas formas de realización, la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000007_0001
en donde R1 es H o es parte de una estructura adicional que es una estructura cíclica, en donde la estructura cíclica adicional comprende R1 o una parte de R1, y también puede comprender R2 o una parte de R2, y el carbono entre R2 y el doble enlace alqueno.
En algunas formas de realización, la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000007_0002
en donde R1 es parte de una estructura adicional que es una estructura cíclica, en donde la estructura cíclica adicional comprende R1 o una parte de R1, y también puede comprender R2 o una parte de R2, y el carbono entre R2 y el doble enlace alqueno.
En algunas formas de realización, la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000008_0001
en donde R1 es parte de una estructura adicional que es una estructura cíclica, en donde la estructura cíclica adicional comprende R1 o una parte de R1, y también puede comprender R2 o una parte de R2, y el carbono entre R2 y el doble enlace alqueno.
En algunas formas de realización, R1 y R2 están unidos a través de al menos un enlace directo de modo que forman una estructura cíclica que comprende
) una parte de R1,
ii) una parte de R2,
ii) el carbono entre R2 y el doble enlace alqueno y
v) el doble enlace alqueno.
En algunas formas de realización Ri se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000008_0002
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
En algunas formas de realización,
Figure imgf000008_0003
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
En algunas formas de realización,
Figure imgf000008_0004
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
En algunas formas de realización,
Figure imgf000008_0005
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
En algunas formas de realización, el carbono entre R2 y el doble enlace alqueno está:
(i) directamente unido a R2 con un enlace sencillo y sustituido con dos sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, bencilo opcionalmente sustituido, alquilo opcionalmente sustituido o alcoxi opcionalmente sustituido; o
(ii) directamente unido a R2 a través de un doble enlace y un enlace sencillo.
En algunas formas de realización, el carbono entre R2 y el doble enlace alqueno está sustituido con dos hidrógenos y directamente unido a R2 con un enlace sencillo.
En algunas formas de realización, el carbono entre R2 y el doble enlace alqueno está directamente unido a R2 a través de un doble enlace y un enlace sencillo.
En algunas formas de realización, el carbono entre R2 y el doble enlace alqueno está directamente unido a R2 a través de un doble enlace y un enlace sencillo de modo que forma un anillo de fenilo que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
En algunas formas de realización,
Figure imgf000009_0001
donde R2 está unido a A a través de J, y
en donde J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o consiste en una cadena de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fracciones seleccionadas del grupo que consiste en un [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, alcohol polivinílico, polivinil alquil éter, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo de C1-C4, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo de C1-C4 , succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoilo y un aminoácido,
en donde [PEG(y)]z es:
Figure imgf000009_0002
En algunas formas de realización,
Figure imgf000009_0003
donde R2 está unido a A a través de J, y
en donde R2 está unido a R1 a través del átomo de nitrógeno de R2 ; y
en donde J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o consiste en una cadena de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fracciones seleccionadas del grupo que consiste en un [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, alcohol polivinílico, polivinil alquil éter, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo de C1-C4, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo de C1-C4 , succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoilo y un aminoácido,
en donde [PEG(y)]z es:
Figure imgf000009_0004
En algunas formas de realización, R2 es
Figure imgf000010_0001
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición,
en donde R2 está unido a R1 a través del átomo de nitrógeno de R2 ; y
en donde J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o consiste en una cadena de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fracciones seleccionadas del grupo que consiste en un [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, alcohol polivinílico, polivinil alquil éter, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo de C1-C4, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo de C1-C4 , succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoilo y un aminoácido,
en donde [PEG(y)]z es:
Figure imgf000010_0002
En algunas formas de realización,
Figure imgf000010_0003
posición.
Figure imgf000010_0004
cualquier posición.
En algunas formas de realización, R2 es
Figure imgf000010_0005
En algunas formas de realización, R2 es
Figure imgf000011_0001
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
En algunas formas de realización, R2 es
Figure imgf000011_0002
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
En algunas formas de realización, R2 es
Figure imgf000011_0003
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
En algunas formas de realización, R1 y R2 tomados juntos son:
Figure imgf000011_0004
Figure imgf000012_0001
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición,
en donde J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o consiste en una cadena de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fracciones seleccionadas del grupo que consiste en un [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, alcohol polivinílico, polivinil alquil éter, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo de C1-C4, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo de C1-C4 , succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoilo y un aminoácido,
en donde [PEG(y)]z es:
Figure imgf000012_0002
en donde y = 1-100 y z = 1 -10.
En algunas formas de realización, R1 y R2 tomados juntos son:
Figure imgf000012_0003
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
En algunas formas de realización, R1 y R2 tomados juntos son:
Figure imgf000013_0001
que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
En algunas formas de realización, la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición,
en donde J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o consiste en una cadena de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fracciones seleccionadas del grupo que consiste en un [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, alcohol polivinílico, polivinil alquil éter, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo de C1-C4, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo de C1-C4 , succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoilo y un aminoácido,
en donde [PEG(y)]z es:
Figure imgf000014_0001
En algunas formas de realización, la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000014_0002
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición.
En algunas formas de realización, la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000014_0003
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición.
En algunas formas de realización, la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000015_0001
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición,
en donde J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o consiste en una cadena de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fracciones seleccionadas del grupo que consiste en un [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, alcohol polivinílico, polivinil alquil éter, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo de C1-C4, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo de C1-C4 , succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoilo y un aminoácido,
en donde [PEG(y)]z es:
Figure imgf000016_0001
en donde y = 1-100 y z = 1 -10.
En algunas formas de realización, la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000016_0002
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición.
En algunas formas de realización, la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000016_0003
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición.
En algunas formas de realización, la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000017_0001
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición,
en donde J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o consiste en una cadena de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fracciones seleccionadas del grupo que consiste en un [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, alcohol polivinílico, polivinil alquil éter, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo de C1-C4, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo de C1-C4 , succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoilo y un aminoácido,
en donde [PEG(y)]z es:
en donde y = 1-100 y z = 1 -10.
En algunas formas de realización, la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000018_0001
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición.
En algunas formas de realización, la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000018_0002
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición.
En algunas formas de realización, la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000018_0003
Figure imgf000019_0001
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición,
en donde J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o consiste en una cadena de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fracciones seleccionadas del grupo que consiste en un [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, alcohol polivinílico, polivinil alquil éter, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo de C1-C4, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo de C1-C4 , succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoilo y un aminoácido,
en donde [PEG(y)]z es:
Figure imgf000019_0002
En algunas formas de realización, la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000020_0001
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición.
En algunas formas de realización, la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000020_0002
que está opcionalmente sustituida en cualquier posición.
En algunas formas de realización, la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000020_0003
En algunas formas de realización, R1 es H.
En algunas formas de realización, J es una estructura orgánica que comprende un grupo [PEG(y)]z.
En algunas formas de realización, J es una estructura orgánica que comprende un grupo polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, alcohol polivinílico, polivinil alquil éter, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), o polisacárido. En algunas formas de realización, J es una estructura orgánica que comprende un grupo alquilo de C1-C4.
En algunas formas de realización, J es una estructura orgánica que comprende una succinimida.
En algunas formas de realización, J es una estructura orgánica que comprende una amina.
En algunas formas de realización, J es una estructura orgánica que comprende un succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo o adipoilo.
En algunas formas de realización, J es una estructura orgánica que comprende un malonilo.
En algunas formas de realización, J es una estructura orgánica que comprende un aminoácido.
En algunas formas de realización, J es una estructura orgánica que comprende una cisteína.
En algunas formas de realización, J es una estructura orgánica que comprende una lisina.
En algunas formas de realización, J es una estructura orgánica que consiste en una cadena de 3 fracciones seleccionadas del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, alcohol polivinílico, polivinil alquil éter, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, alquilo de C1-C4, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo de C1-C4, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoilo o un aminoácido.
En algunas formas de realización, J es una estructura orgánica que consiste en una cadena de cuatro fracciones seleccionadas del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, alcohol polivinílico, polivinil alquil éter, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, alquilo de C1-C4, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo de C1-C4, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoilo y un aminoácido.
En algunas formas de realización, J es una estructura orgánica que consiste en una cadena de cinco fracciones seleccionadas del grupo que consiste en [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, alcohol polivinílico, polivinil alquil éter, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, alquilo de C1-C4, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo de C1-C4, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoilo y un aminoácido.
En algunas formas de realización, J comprende
Figure imgf000021_0001
grupo [PEG(y)]z unido a una lisina.
En algunas formas de realización, J comprende
Figure imgf000021_0002
grupo acilo de C1-C4 unido a un grupo succinimida. En algunas formas de realización, J comprende una lisina unida a un grupo acilo de C1-C4.
En algunas formas de realización, J comprende
Figure imgf000021_0003
grupo [PEG(y)]z, que está unido a un glutarilo.
En algunas formas de realización, J es una estructura orgánica que consiste en una cadena de cinco fracciones seleccionadas del grupo que consiste en [PEG(y)]z, succinimida, acilo de C1-C4, glutarilo o lisina.
En algunas formas de realización, J es un enlace.
En algunas formas de realización, J es una cisteína.
En algunas formas de realización, J tiene la estructura:
Figure imgf000021_0004
en donde n 1-3, m es 1-4, y es 1-100 y z es 1-10.
En algunas formas de realización, J tiene una estructura lineal.
En algunas formas de realización, J tiene una estructura ramificada.
En algunas formas de realización, R2 es
Figure imgf000022_0001
En algunas formas de realización, R2 es
Figure imgf000022_0002
En algunas formas de realización, R2 es
Figure imgf000023_0001
En algunas formas de realización, Ri y R2 tomados juntos son:
Figure imgf000023_0002
en donde n 1-3, m es 1-4, y es 1-100 y z es 1-10.
En algunas formas de realización, R1 y R2 tomados juntos son:
Figure imgf000024_0001
En algunas formas de realización, Ri y R2 tomados juntos son:
Figure imgf000024_0002
En algunas formas de realización la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000025_0001
En algunas formas de realización, la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000026_0001
En algunas formas de realización, la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000026_0002
En algunas formas de realización, la linea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000027_0002
en donde y = 1-100 y z = 1 -10 ;
en donde [PEG(x)]w es:
Figure imgf000027_0001
en donde x = 1-100 y w = 1 - 10.
En algunas formas de realización, y es 1-20.
En algunas formas de realización, y es 21-40.
En algunas formas de realización y es 41-60.
En algunas formas de realización y es 61-80.
En algunas formas de realización y es 30-50
En algunas formas de realización y es 12, 24, 36 o 48.
En algunas formas de realización z es 1.
En algunas formas de realización z es 0.
En algunas formas de realización el carbonilo terminal del grupo [PEG(y)]z es parte de un enlace amida.
En algunas formas de realización el amino terminal del grupo [PEG(y)]z es parte de un enlace amida.
En algunas formas de realización
Figure imgf000028_0001
en donde x es 1-100 y w es 0-5.
En algunas formas de realización x es 1 -20.
En algunas formas de realización x es 21-40.
En algunas formas de realización x es 41-60.
En algunas formas de realización x es 61-80.
En algunas formas de realización x es 30-50
En algunas formas de realización x es 12, 24, 36 o 48.
En algunas formas de realización w es 1.
En algunas formas de realización w es 0.
En algunas formas de realización R4 tiene la estructura:
Figure imgf000028_0002
En algunas formas de realización R4 está unido a B a través del carbono carbonilo terminal.
En algunas formas de realización la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000029_0001
En algunas formas de realización, R2 está unido a A a través de un enlace carbono-nitrógeno o un enlace carbonoazufre.
En algunas formas de realización, R2 está unido a A a través de un enlace carbono-nitrógeno.
En algunas formas de realización, el enlace carbono-nitrógeno es un enlace amida.
En algunas formas de realización, R2 está unido a A a través de un enlace amida entre el aminoácido C-terminal de A y un grupo amino en B.
En algunas formas de realización, el aminoácido terminal es cisteína.
En algunas formas de realización, R2 está unido a A a través de un enlace carbono-azufre.
En algunas formas de realización, R2 está unido a A a través de un enlace carbono-azufre formado entre R2 y un tiol libre.
En algunas formas de realización, R2 está unido a A a través de un enlace succinimida-azufre.
En algunas formas de realización, J comprende un residuo ramificado.
En algunas formas de realización, J está unido a más de un A a través del residuo ramificado.
En algunas formas de realización, B comprende un residuo ramificado.
En algunas formas de realización, B está unido a más de un A, cada uno a través de un enlace no peptidílico con el residuo ramificado.
En algunas formas de realización, B es un residuo ácido orgánico.
En algunas formas de realización, B es un tramo de 1-50 residuos de aminoácidos, y, opcionalmente, un residuo ácido orgánico.
En algunas formas de realización, B es un tramo de 1-10 aminoácidos consecutivos.
En algunas formas de realización, B comprende un tramo de aminoácidos consecutivos en la secuencia, o una parte de la misma, EPKSCDKTHTCPPCP, ERKCCVECPPCP, ELKTPLGDTTHTCPRCP(EPKSCDTPPPCPRCP)3, ESKYGPPCPSCP.
En algunas formas de realización, B tiene una treonina en su extremo C.
En algunas formas de realización, B está unido a C a través de un enlace peptidílico entre la cisteína o selenocisteína N-terminal de C y un residuo de aminoácido o un residuo de ácido orgánico de B.
En algunas formas de realización, C es un segundo componente polipeptídico del compuesto, componente polipeptídico que comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presentes en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; (ii) se unen a un receptor de Fc; y (iii) tienen en su extremo N una secuencia que comprende una cisteína natural seleccionada del grupo que consiste en CP, CPXCP (donde X = P, R, o S), CDKTHTCPPCP, CVECPPCP, CCVECPPCP y CDTPPPCPRCP.
En algunas formas de realización, C es un segundo componente polipeptídico del compuesto, componente polipeptídico que comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presentes en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; (ii) se unen a un receptor de Fc; y (iii) tienen en su extremo N una secuencia que comprende una cisteína o selenocisteína no natural.
En algunas formas de realización, C comprende aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presentes en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.
En algunas formas de realización, C comprende aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presentes en la cadena de un dominio Fc6 de un anticuerpo.
En algunas formas de realización, A comprende una proteína secretada.
En algunas formas de realización, A comprende un dominio extracelular de una proteína.
En algunas formas de realización, A tiene actividad biológica.
En algunas formas de realización, la actividad biológica es actividad de unión a diana.
En algunas formas de realización, A es una proteína que se pliega independientemente o una parte de la misma. En algunas formas de realización, A es una proteína glucosilada.
En algunas formas de realización, A comprende enlaces disulfuro intracadena.
En algunas formas de realización, A se une a una citoquina.
En algunas formas de realización, la citoquina es TNFa.
En algunas formas de realización, A comprende al menos un tramo de aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presentes en la cadena pesada de un Fab o Fab' de un anticuerpo.
En algunas formas de realización, A comprende al menos un tramo de aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presentes en la cadena ligera de un Fab o Fab' de un anticuerpo.
En algunas formas de realización, A comprende al menos un Fab o Fab' de un anticuerpo, o una parte de al menos un Fab o Fab'.
En algunas formas de realización, A comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 copias del Fab o Fab' o parte del mismo.
En algunas formas de realización, A comprende Fab-1 o Fab'1, o una parte del mismo del anticuerpo.
En algunas formas de realización, A comprende Fab-2 o Fab'2, o una parte del mismo del anticuerpo.
En algunas formas de realización, A comprende dos manos de Fab o Fab' del anticuerpo.
En algunas formas de realización, el Fab o Fab' está presente en adalimumab.
En algunas formas de realización, A comprende al menos un tramo de aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presentes en un anticuerpo monocatenario.
En algunas formas de realización, A comprende al menos un tramo de aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presentes en un receptor de TNFa.
En algunas formas de realización, el receptor de TNFa es TNR1B.
En algunas formas de realización, el compuesto forma parte de un homodímero.
En algunas formas de realización, el compuesto forma parte de un heterodímero.
La presente invención proporciona un homodímero que comprende un compuesto de la invención.
La presente invención proporciona un heterodímero que comprende un compuesto de la invención.
En algunas formas de realización, cada compuesto del dímero es capaz de unirse al otro por al menos un enlace disulfuro.
En algunas formas de realización, cada compuesto del dímero es capaz de unirse al otro por al menos un enlace disulfuro entre el C de cada compuesto.
En algunas formas de realización, cada compuesto del dímero está unido al otro por al menos un enlace disulfuro. En algunas formas de realización, cada compuesto del dímero está unido al otro por al menos un enlace disulfuro entre el C de cada compuesto.
En algunas formas de realización, cada compuesto del dímero está unido no covalentemente al otro.
La presente especificación describe un proceso para producir un compuesto que tiene la estructura:
Figure imgf000031_0001
en donde A es un primer componente polipeptídico del compuesto;
en donde C es un segundo componente polipeptídico del compuesto, componente polipeptídico que comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presentes en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; (ii) se unen a un receptor de Fc; y (iii) tiene en su extremo N una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una cisteína, selenocisteína, CP, CPXCP (donde X = P, R, o S), CDKTHTCPPCP, CVECPPCP, CCVECPPCP y CDTPPPCPRCP,
en donde B es una estructura química que une A y C;
en donde la línea discontinua entre B y C representa un enlace peptidílico;
en donde la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
Figure imgf000031_0002
en el que R5 es un grupo alquilo o arilo
en donde R1 es H o es parte de una estructura adicional que es una estructura cíclica, en donde la estructura cíclica adicional comprende R1 o una parte de R1, y también puede comprender R2 o una parte de R2, y el carbono entre R2 y el doble enlace alqueno;
Figure imgf000032_0001
en donde R2 representa una estructura orgánica que se une a uno de A o B y R4 representa una estructura orgánica que se une al otro de A o B;
que comprende las siguientes etapas:
a) obtener un A' que comprende A o un derivado de A, y un primer grupo reactivo terminal;
b) obtener un B' que comprende B o un derivado de B, un segundo grupo reactivo terminal y un tercer grupo reactivo termina, en donde el segundo reactivo terminal es capaz de reaccionar con el primer grupo reactivo terminal para formar un enlace no peptidílico;
c) obtener un C' que comprende C o un derivado de C, y un cuarto grupo reactivo terminal, en donde el cuarto grupo reactivo terminal es capaz de reaccionar con el tercer grupo reactivo terminal para formar un enlace peptidílico; y d) hacer reaccionar A', B' y C' en cualquier orden para producir el compuesto.
En algunos aspectos, la etapa d) se realiza al hacer reaccionar primero A’ y B’ para producir
Figure imgf000032_0002
; en donde B” comprende B y el tercer grupo reactivo terminal, y la línea continua entre B” y A representa un enlace no peptidílico;
y después hacer reaccionar
Figure imgf000032_0003
con C’ para producir el compuesto.
En algunos aspectos, la etapa d) se realiza al hacer reaccionar primero C’ y B’ para producir
Figure imgf000032_0004
; en donde B” comprende B y el segundo grupo reactivo terminal, y la línea discontinua entre B” y C representa un enlace peptidílico;
y después hacer reaccionar
Figure imgf000032_0005
con A’ para producir el compuesto.
En a lg u n o s asp ec tos , el p r im e r g ru po rea c tivo te rm in a l es una az ida , un tio l, una n itrona o un a lqu ino .
En a lg u n o s asp ec tos , el p r im e r g ru po rea c tivo te rm in a l es un a lqu ino .
En algunos aspectos, el alquino es un cicloalquino.
En algunos aspectos el alquino es un anillo de ocho miembros.
En algunos aspectos el alquino es un azaciclooctino.
En algunos aspectos, e l cicloalquino es un biarilazaciclooctino.
En algunos aspectos, e l cicloalquino es un ciclooctino.
En algunos aspectos, e l alquino es un alquino terminal.
En algunos aspectos, e l primer grupo reactivo terminal es una azida, tiol, o nitrona.
En algunos aspectos, el l primer grupo reactivo terminal es una azida.
En algunos aspectos, el l primer grupo reactivo terminal es un tiol.
En algunos aspectos, el l primer grupo reactivo terminal es una nitrona.
En algunos aspectos, el l primer grupo reactivo terminal es una N-alquilnitrona.
En algunos aspectos, e primer grupo reactivo terminal es una N-arilnitrona.
En algunos aspectos, e l segundo grupo reactivo terminal es una azida, un tiol, una nitrona o un alquino.
En algunos aspectos, e l segundo grupo reactivo terminal es un alquino.
En algunos aspectos, e l alquino es un cicloalquino.
En algunos aspectos el alquino es un anillo de ocho miembros.
En algunos aspectos el alquino es un azaciclooctino.
En algunos aspectos, e cicloalquino es un biarilazaciclooctino.
En algunos aspectos, e cicloalquino es un ciclooctino.
En algunos aspectos, e alquino es un alquino terminal.
En algunos aspectos, e segundo grupo reactivo terminal es una azida, tiol, o nitrona.
En algunos aspectos, e segundo grupo reactivo terminal es una azida.
En algunos aspectos, e segundo grupo reactivo terminal es un tiol.
En algunos aspectos, e segundo grupo reactivo terminal es una nitrona.
En algunos aspectos, e segundo grupo reactivo terminal es una N-alquilnitrona.
En algunos aspectos, e segundo grupo reactivo terminal es una N-arilnitrona.
En algunos aspectos, e primer grupo reactivo terminal es un alquino terminal y el segundo grupo reactivo terminal es una azida, un tiol o una nitrona.
En algunos aspectos, e segundo grupo reactivo terminal es una azida.
En algunos aspectos, e segundo grupo reactivo terminal es un tiol.
En algunos aspectos, e segundo grupo reactivo terminal es una nitrona.
En algunos aspectos, la nitrona es una N-alquil o N-aril nitrona.
En a lg u n o s a sp e c to s el p r im e r g ru po reac tivo te rm in a l es una az ida , tio l o n itrona y el seg un do g ru po rea c tivo te rm in a l es un a lqu ino te rm ina l.
En algunos aspectos, el primer grupo reactivo terminal es una azida.
En algunos aspectos, el primer grupo reactivo terminal es un tiol.
En algunos aspectos, el primer grupo reactivo terminal es una nitrona.
En algunos aspectos, la nitrona es una N-alquil o N-aril nitrona.
En algunos aspectos, el primer grupo reactivo terminal es un cicloalquino y el segundo grupo reactivo terminal es una azida, un tiol o una nitrona.
En algunos aspectos, el primer grupo reactivo terminal es una azida.
En algunos aspectos, el primer grupo reactivo terminal es un tiol.
En algunos aspectos, el primer grupo reactivo terminal es una nitrona.
En algunos aspectos, la nitrona es una N-alquil o N-aril nitrona.
En algunos aspectos el primer grupo reactivo terminal es una azida, tiol o nitrona y el segundo grupo reactivo terminal es un cicloalquino.
En algunos aspectos, el primer grupo reactivo terminal es una azida.
En algunos aspectos, el primer grupo reactivo terminal es un tiol.
En algunos aspectos, el primer grupo reactivo terminal es una nitrona.
En algunos aspectos, la nitrona es una N-alquil o N-aril nitrona.
En algunos aspectos el cicloalquino es un anillo de ocho miembros.
En algunos aspectos el alquino es un azaciclooctino.
En algunos aspectos, el cicloalquino es un biarilazaciclooctino.
En algunos aspectos, el cicloalquino es un ciclooctino.
En algunos aspectos, el primer grupo reactivo terminal es una azida y el segundo grupo reactivo terminal es un alquino terminal; o el primer grupo reactivo terminal es una azida y el segundo grupo reactivo terminal es un cicloalquino; o el primer grupo reactivo terminal es un tiol y el segundo grupo reactivo terminal es un cicloalquino; o el primer grupo reactivo terminal es una N-alquilnitrona o una N-arilnitrona y el segundo grupo reactivo terminal es un ciclooctino. En algunos aspectos, el segundo grupo reactivo terminal es una azida y el primer grupo reactivo terminal es un alquino terminal; o el segundo reactivo terminal es una azida y el primer grupo reactivo terminal es un cicloalquino; o el segundo grupo reactivo terminal es un tiol y el primer grupo reactivo terminal es un cicloalquino; o el segundo grupo reactivo terminal es una N-alquilnitrona o N-arilnitrona y el primer grupo reactivo terminal es un ciclooctino.
En algunos aspectos, el primer grupo reactivo terminal y el segundo grupo reactivo terminal reaccionan para producir un triazol, tioleno, N-alquilisoxazolina o N-arilisoxazolina.
En algunos aspectos, el primer grupo reactivo terminal y el segundo grupo reactivo terminal reaccionan para producir un triazol.
En algunos aspectos, el primer grupo reactivo terminal y el segundo grupo reactivo terminal reaccionan para producir un tioleno.
En algunos aspectos, el primer grupo reactivo terminal y el segundo grupo reactivo terminal reaccionan para producir una N-alquilisoxazolina o N-arilisoxazolina.
En algunos aspectos, el tercer grupo reactivo y el cuarto grupo reactivo terminal son independientemente cada uno un aminoácido o un derivado de aminoácido.
En a lg u n o s aspec tos , el te rc e r g ru po rea c tivo es una tre o n in a o un de riva d o de treon in a .
En algunos aspectos, el tercer grupo reactivo es un derivado tioéster de un aminoácido.
En algunos aspectos, el cuarto grupo reactivo es cisteína, selenocisteína, homocisteína, u homoselenocisteína, o un derivado de cisteína, selenocisteína, homocisteína, u homoselenocisteína.
En algunos aspectos, el cuarto grupo reactivo es cisteína o un derivado de cisteína.
En algunos aspectos, el cuarto grupo reactivo es cisteína.
En algunos aspectos, A' se prepara mediante las siguientes etapas:
i) obtener un A'' que comprende A o un derivado de A, y un tramo de aminoácidos consecutivos que comprenden una inteína;
ii) obtener un residuo de cisteína, selenocisteína, homocisteína u homoselenocisteína sustituido, o un derivado sustituido de un residuo de cisteína, selenocisteína, homocisteína u homoselenocisteína, en donde el residuo de cisteína está sustituido en el extremo C con una estructura orgánica que contiene un alquino, una azida, un tiol, o una nitrona; y
iii) hacer reaccionar A'' con el residuo de cisteína sustituido para producir A'.
En algunos aspectos, la estructura orgánica que contiene un alquino es N-propargilamina.
En algunos aspectos, A' se prepara mediante las siguientes etapas:
) obtener un A'' que comprende A o un derivado de A, y que comprende al menos un grupo tiol libre;
i) obtener un compuesto que comprende un primer grupo reactivo terminal y una maleimida terminal; y ii) hacer reaccionar A'' con el compuesto de la etapa ii) para producir A'.
En algunos aspectos, A'' se prepara mediante las siguientes etapas:
a) obtener un A''', en donde A''' es un polipéptido que comprende A o un derivado de A, y que comprende al menos un enlace disulfuro; y
b) tratar A''' con mercaptoetilamina (MEA) para producir A''.
En algunos aspectos A''' se prepara mediante las siguientes etapas:
a) obtener un anticuerpo monoclonal que comprende A o un derivado de A, y que comprende al menos un enlace disulfuro; y
b) tratar el polipéptido de la etapa a) con IdeS para producir A'''.
En algunos aspectos, el anticuerpo monoclonal se une a TNFa.
En algunos aspectos, el anticuerpo monoclonal es adalimumab.
En algunos aspectos, se produce el compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-15.
En algunos aspectos, si Ri es hidrógeno y el primer grupo reactivo terminal es alquino, entonces en la etapa d) B' se hacer reaccionar en presencia de un catalizador metálico.
En algunos aspectos, si Ri es hidrógeno y el segundo grupo reactivo terminal es alquino, entonces en la etapa d) B' se hacer reaccionar en presencia de un catalizador metálico.
En algunos aspectos, el catalizador metálico es Ag(I) o Cu(I).
En algunos aspectos, A' comprende uno o más residuos ramificados, en donde cada residuo ramificado comprende un primer grupo reactivo terminal adicional.
En algunos aspectos, B' comprende uno o más residuos ramificados, en donde cada residuo ramificado comprende un segundo grupo reactivo terminal adicional.
En algunos aspectos, B' comprende uno o más residuos ramificados, en donde cada residuo ramificado comprende un tercer grupo reactivo terminal adicional.
En algunos aspectos, el residuo ramificado es un residuo de aminoácido.
En algunos aspectos, el residuo de aminoácido es una lisina o un derivado de lisina, arginina o un derivado de arginina, ácido aspártico o un derivado de ácido aspártico, ácido glutámico o un derivado de ácido glutámico, asparragina o un derivado de asparragina, glutamina o un derivado de glutamina, tirosina o un derivado de tirosina, cisteína o un derivado de cisteína u ornitina o un derivado de ornitina.
En algunos aspectos, el residuo de aminoácido está sustituido en la posición N con un residuo que contiene un grupo reactivo amino o carbonilo terminal.
En algunos aspectos, el residuo ramificado es un residuo orgánico que contiene dos o más grupos amino terminales o dos o más grupos carbonilo terminales.
En algunos aspectos, el residuo orgánico es ácido iminodipropiónico, ácido iminodiacético, ácido 4-amino-pimélico, ácido 4-amino-heptanodioico, ácido, 3-aminohexanodioico, ácido 3-aminoadípico, ácido 2-aminooctanodioico, o ácido 2-amino-6-carbonil-heptanodioico.
En algunos aspectos, el residuo ramificado es una lisina o un derivado de lisina, arginina o un derivado de arginina, ácido aspártico o un derivado de ácido aspártico, ácido glutámico o un derivado de ácido glutámico, asparragina o un derivado de asparragina, glutamina o un derivado de glutamina, tirosina o un derivado de tirosina, cisteína o un derivado de cisteína u ornitina o un derivado de ornitina.
En algunos aspectos, el residuo ramificado es un aminoácido sustituido en la posición N con un residuo que contiene un grupo reactivo amino o carbonilo terminal.
En algunos aspectos, el residuo ramificado es un residuo orgánico que contiene dos o más grupos amino terminales o dos o más grupos carbonilo terminales.
En algunos aspectos, el residuo ramificado es un residuo orgánico que contiene dos o más grupos amino terminales. En algunos aspectos, el residuo ramificado es un residuo orgánico que contiene dos o más residuos carbonilo terminales. En algunos aspectos, el residuo ramificado es un ácido diaminopropiónico. En algunos aspectos, el residuo ramificado es un compuesto diaminopropiónico carbonilo.
En algunos aspectos, el residuo ramificado es 4-(carbonilmetoxi)fenilalanina, ácido 2-amino-6-(carbonilmetilamino)hexanoico, S-(carbonilpropil)cisteína, S-(carboniletil)cisteína, S-(carbonilmetil)cisteína, N-(carboniletil)glicina, N-(carbonilmetil)glicina, ácido iminodipropiónico, ácido iminodiacético, ácido 4-amino-pimélico, ácido 4-amino-heptanodioico, ácido, 3-aminohexanodioico, ácido 3-aminoadípico, ácido 2-aminooctanodioico, o ácido 2-amino-6-carbonil-heptanodioico.
En algunos aspectos, el residuo ramificado se prepara a partir de Fmoc-L-Asp-AMC, Fmoc-L-Asp-pNA, Fmoc-L-Glu-AMC, Fmoc-L-Glu-pNA, Fmoc-L-Glu(Edans)-OH, Fmoc-L-Glu(PEG-biotinil)-OH, éster 6-tert-butílico del ácido (S)-Fmoc-2-amino-hexanodioico, éster 6-tert-butílico del ácido (S)-Fmoc-2-amino-adipico, (S)-Fmoc-Aad(OtBu)-OH, éster 6-tert-butílico del ácido (S)-Fmoc-2-amino-5-tert-butoxicarbonil-hexanodioico, éster 7-tert-butílico del ácido (S)-Fmoc-2-amino-heptanodioico, éster 7-tert-butílico del ácido (S)-Fmoc-2-amino-pimelico, éster 7-tert-butílico del ácido (S)-Fmoc-2-amino-6-tert-butoxicarbonil-heptanodioico, éster 8-tert-butílico del ácido (S)-Fmoc-2-amino-octanodioico, éster 8-tert-butílico del ácido (S)-Fmoc-2-amino-suberico, (S)-Fmoc-Asu(OtBu)-OH, éster 1-tert-butílico del ácido (R)-Fmoc-3-amino-hexanodioico, éster 1-tert-butílico del ácido (R)-Fmoc-3-amino-adipico, éster 1-tert-butílico del ácido (R)-Fmoc-4-amino-heptanodioico, éster 1-tert-butílico del ácido (R)-Fmoc-4-amino-pimelico, ácido Boc-iminodiacetico, ácido Fmoc-iminodiacetico, ácido Boc-iminodipropionico, ácido Fmoc-iminodipropionico, Fmoc-N-(tertbutoxicarbonilmetil)-glicina, Fmoc-N-(tert-butoxicarboniletil)-glicina, Fmoc-L-Cys(tert-butoxicarbonilmetil)-OH ácido (R)-Fmoc-2-amino-3-(tert-butoxicarbonilmetilsulfanil)-propionico, Fmoc-L-Cys(tert-butoxicarbonilpropil)-OH ácido (R)-Fmoc-2-amino-3-(3-tert-butoxicarbonilpropilsulfanil)-propionico, Fmoc-L-Cys(tert-butoxicarboniletil)-OH ácido (R)-Fmoc-2-amino-3-(2-tert-butoxicarboniletilsulfanil)-propionico, Fmoc-4-(tert-butoxicarbonilmetoxi)-L-fenilalanina, o ácido (S)-Fmoc-2-amino-6-(Boc-tert-butoxicarbonilmetilamino)-hexanoico.
En algunos aspectos, el residuo ramificado se prepara a partir de ácido N-a-Boc-DL-diaminopropionico, ácido N-a-Boc-D-diaminopropionico, ácido N-a-Boc-L-diaminopropionico, ácido N-a-Fmoc-L-diaminopropionico, ácido N-a-Boc-N-p-Alloc-D-diaminopropionico, ácido N-a-Boc-N-p-Alloc-L-diaminopropionico, ácido N-a-Fmoc-N-p-alloc-L-diaminopropionico, ácido N-a-N-p-Bis-Boc-L-diaminopropionico, ácido N-a-Fmoc-N-p-Boc-D-diaminopropionic, ácido N-a-Fmoc-N-p-Boc-L-diaminopropionico, ácido N-a-Z-N-p-Boc-L-diaminopropionico, ácido N-a-Boc-N-p-Fmoc-D-diaminopropionico, ácido N-a-Boc-N-p-Fmoc-L-diaminopropionico, ácido N-a-N-p-Bis-Fmoc-L-diaminopropionico, ácido N-a-Z-N-p-Fmoc-L-diaminopropionico, ácido N-a-Boc-N-p-Z-L-diaminopropionico, ácido N-a-Fmoc-N-p-Z-L-diaminopropionico, ácido N-a-Fmoc-N-p-(Boc-aminooxiacetil)-L-diaminopropionico, ácido N-a-Boc-N-gamma-Fmoc-D-diaminobutírico, ácido N-a-Boc-N-gamma-Fmoc-L-diaminobutírico, ácido N-a-Boc-N-gamma-Fmoc-L-diaminobutírico, ácido N-a-Fmoc-N-gamma-Boc-D-diaminobutírico, ácido N-a-Fmoc-N-gamma-Boc-L-diaminobutírico, ácido N-a-Fmoc-N-gamma-Alloc-L-diaminobutírico, ácido (S)-N-b-Fmoc-N-gamma-Boc-3,4-diaminobutírico, H-L-ornitina, N-a-Boc-N-delta-Alloc-L-ornitina, N-a-Fmoc-N-delta-Alloc-L-ornitina, N-a-Fmoc-N-delta-Boc-L-ornitina, ácido (S)-Boc-2-amino-5-azido-pentanoico.DCHA, ácido (S)-Fmoc-2-amino-5-azido-pentanoico, N-a-N-delta-bis-Boc-N-a-N-delta-bis(3-Boc-aminopropil)-L-omitina, N-a-Boc-N-p-N-delta-N-delta-tris(3-Boc-aminopropil)-L-omitina, Fmoc-L-Lys(Biotina)-OH, Fmoc-L-Lys(Dabcyl)-OH, Fmoc-L-Lys(Boc) (Me)-OH, Fmoc-L-Lys(Boc) (iPr)-OH, ácido (2S,5R)-Fmoc-2-amino-4-(3-Boc-2,2-dimetil-oxazolidin-5-il)-butírico, ácido (S)-Fmoc-2-amino-6-(Boc-tert-butoxicarbonilmetilamino)-hexanoico, ácido (S)-Fmoc-2-amino-7-(Boc-amino)-heptanoico, Fmoc-L-Arg(Me) (Pbf)-OH, Fmoc-L-Arg(Me)2(Pbf)-OH, Fmoc-L-Arg(Me)2-OH, ácido (S)-Fmoc-3-amino-5-[(N'-Pbf-pirrolidina-1-carboximidoil)-amino]-pentanoico, Fmoc-L-Homoarg(Et)2-OH, ácido Boc-3-amino-5-(Fmoc-amino)-benzoico, ácido 3,5-bis[2-(Bocamino)etoxi]-benzoico, Fmoc-4-[2-(Boc-amino)etoxi]-L-fenilalanina, N,N-bis(N'-Fmoc-3-aminopropil)-glicina hemisulfato potásico, N,N-bis(N'-Fmoc-3-aminopropil)-glicina hemisulfato potásico, Fmoc-N-(2-Boc-aminoetil)-glicina, Fmoc-N-(3-Boc-aminopropil)-glicina, Fmoc-N-(4-Boc-aminobutil)-glicina, ácido (R,S)-N-a-Fmoc-N-a'-Bocdiaminoacetico, ácido N,N'-bis-Fmoc-diaminoacetico, ácido (S)-N-4-Fmoc-N-8-Boc-diaminooctanoico, ácido (R,S)-N-Fmoc-N'-Boc-imidazolidina-2-carboxílico, Fmoc-p(NH-Boc)-L-Phe-OH, Boc-p(NH-Fmoc)-L-Phe-OH, o Boc-p(NH-Z)-L-Phe-OH.
Se entiende que donde se proporciona un intervalo de parámetro, todos los números enteros dentro de ese intervalo, y décimos del mismo, también están proporcionados por la invención. Por ejemplo, “0,2-5 mg/kg/día” es una divulgación de 0,2 mg/kg/día, 0,3 mg/kg/día, 0,5 mg/kg/día, 0,6 mg/kg/día, etc. hasta 5,0 mg/kg/día.
Términos
Como se usan en el presente documento, y a menos que se indique de otra manera, cada uno de los siguientes térmicos tendrán la definición explicada a continuación.
E n la ce p e p tid ilo : la estructura
Figure imgf000037_0001
enlace peptidilo puede ser un enlace peptídico.
Tram o de a m in o á c id o s con secu tivos : una pluralidad de aminoácidos organizados en una cadena, cada uno de los cuales está unido a un aminoácido precedente por un enlace peptídico, excepto que el primer aminoácido en la cadena puede opcionalmente no estar unido a un aminoácido precedente. Los aminoácidos de la cadena pueden ser naturales o no naturales, o pueden comprender una mezcla de los mismos. Los aminoácidos, a menos que se indique de otra manera, pueden estar genéticamente codificados, ser naturales, pero no genéticamente codificados, o ser no naturales, y cualquier selección de los mismos.
R e s id u o de a m in o á c id o N -te rm ina l: el residuo terminal de un tramo de dos o más aminoácidos consecutivos que tiene un grupo funcional a-amino libre (-NH2), o un derivado de un grupo funcional a-amino libre (-NH2).
E x tre m o N: el grupo a-amino libre (-NH2) (o un derivado del mismo) de un residuo de aminoácido N-terminal.
R e s id u o de a m in o á c id o C -te rm ina l: El residuo terminal de un tramo de dos o más aminoácidos consecutivos que tiene un grupo funcional a-carboxilo libre (COOH) o un derivado de un grupo funcional a-carboxilo libre (COOH).
E x tre m o C: el grupo a-carboxilo libre (COOH) (o derivado del mismo) de un residuo aminoácido C-terminal.
Un “enlace”, a menos que se especifique otra cosa, o contrario al contexto, se entiende que incluye un enlace covalente, una interacción dipolo-dipolo tal como un enlace de hidrógeno, e interacciones intermoleculares tal como fuerzas de van der Waals,
Una “secuencia señal” es una cadena peptídica corta (3-60 aminoácidos de longitud) que dirige el transporte postraduccional de un polipéptido.
“Aminoácido” como se usa en el presente documento, en una forma de realización, significa un isómero L o D de los aminoácidos genéticamente codificados, es decir, isoleucina, alanina, leucina, asparragina, lisina, aspartato, metionina, cisteína, fenilalanina, glutamato, treonina, glutamina, triptófano, glicina, valina, prolina, arginina, serina, histidina, tirosina, selenocisteína, pirrolisina y también incluye homocisteína y homoselenocisteína.
Otros ejemplos de aminoácidos incluyen un isómero L o D de taurina, gaba, dopamina, lantionina, ácido 2-aminoisobutírico, deshidroalanina, ornitina y citrulina, así como homólogos no naturales y formas sintéticamente modificadas de los mismos que incluyen aminoácidos que tienen cadenas alquileno acortadas o alargadas en hasta dos átomos de carbono, aminoácidos que comprenden grupos arilo opcionalmente sustituidos, y aminoácidos que comprenden grupos halogenados, incluyendo grupos alquilo y arilo halogenados, así como beta o gamma aminoácidos, y análogos cíclicos.
Debido a la presencia de grupos amino y carboxilo ionizables, los aminoácidos en estas formas de realización pueden estar en forma de sales ácidas o básicas, o pueden estar en formas neutras. Los residuos de aminoácidos individuales también se pueden modificar por oxidación o reducción. Otras modificaciones contempladas incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, y metilación de los grupos alfa-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina.
Se pueden preparar derivados covalentes por unión de grupos funcionales particulares a las cadenas laterales de aminoácidos o en los extremos N y C.
Los compuestos que comprenden aminoácidos con sustituciones en el grupo R están dentro del ámbito de la invención. Se entiende que el experto en la materia puede seleccionar los sustituyentes y los patrones de sustitución en los compuestos de la presente invención para proporcionar compuestos que son químicamente estables a partir de materiales de partida fácilmente disponibles.
“Aminoácido natural” como se usa en el presente documento significa un isómero L o D de los aminoácidos genéticamente codificados, es decir, isoleucina, alanina, leucina, asparragina, lisina, aspartato, metionina, cisteína, fenilalanina, glutamato, treonina, glutamina, triptófano, glicina, valina, prolina, arginina, serina, histidina, tirosina, selenocisteína, pirrolisina y homocisteína y homoselenocisteína.
“Aminoácido no natural” como se usa en el presente documento significa un isómero L o D químicamente modificado de isoleucina, alanina, leucina, asparragina, lisina, aspartato, metionina, cisteína, fenilalanina, glutamato, treonina, glutamina, triptófano, glicina, valina, prolina, arginina, serina, histidina, tirosina, selenocisteína, pirrolisina, homocisteína, homoselenocisteína, taurina, gaba, dopamina, lantionina, ácido 2-aminoisobutírico, deshidroalanina, ornitina y citrulina, incluyendo derivados de cisteína y selenocisteína que tienen cadenas laterales alifáticas de C3-C10 entre el carbono alfa y el S o Se. En una forma de realización, la cadena lateral alifática es un alquileno. En otra forma de realización, la cadena lateral alifática es un alquenileno o alquinileno.
Además de los tramos de secuencias de aminoácidos consecutivos descritos en el presente documento, se contempla que se pueden preparar variantes de los mismos introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el a Dn codificante, y/o por síntesis de las secuencias de aminoácidos consecutivos deseadas. Los expertos en la materia apreciarán que los cambios de aminoácidos pueden alterar los procesos postraduccionales de los tramos de aminoácidos consecutivos descritos en el presente documento cuando la expresión es el método elegido de síntesis (más que síntesis química, por ejemplo), tal como cambiar el número o posición de sitios de glucosilación o alterar las características de anclaje a la membrana.
Se pueden hacer variaciones en las secuencias descritas en el presente documento, por ejemplo, usando cualquiera de las técnicas y directrices para mutaciones conservadoras y no conservadoras explicadas, por ejemplo, en la patente en EE UU No. 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución, deleción o inserción de uno o más codones que codifican la secuencia de aminoácidos consecutivos de interés que produce un cambio en la secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia nativa. Opcionalmente, la variación es por sustitución de al menos un aminoácido con cualquier otro aminoácido en uno o más de los dominios. Se puede encontrar orientación en determinar que residuo de aminoácido se puede insertar, sustituir o delecionar sin afectar adversamente la actividad deseada comparando la secuencia con la de moléculas de proteínas conocidas homólogas y minimizando el número de cambios en la secuencia de aminoácidos hechos en regiones de alta homología. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de sustituir un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como la sustitución de una leucina con una serina, es decir, sustituciones de aminoácidos conservadoras. Las inserciones o deleciones pueden estar opcionalmente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida se puede determinar haciendo sistemáticamente inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en la secuencia y ensayando las variantes resultantes para actividad mostrada por la secuencia de longitud completa o nativa madura. Se entiende que cualquier variación terminal se hace dentro del contexto de la invención divulgada en el presente documento.
Se preparan variantes de secuencia de aminoácidos del compañero de unión con varios objetivos en mente, incluyendo aumentar la afinidad del compañero de unión por su ligando, facilitar la estabilidad, purificación y preparación del compañero de unión, modificar su semivida en plasma, mejorar la eficacia terapéutica, y disminuir la gravedad o aparición de efectos secundarios durante el uso terapéutico del compañero de unión.
También se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de estas secuencias en el presente documento incluyendo variantes de inserción, sustitución o deleción. Tales variantes habitualmente se pueden preparar por mutagénesis dirigida de nucleótidos en el ADN que codifica el monómero de unión a diana, mediante lo cual se obtiene el ADN que codifica la variante, y después de ello, expresar el ADN en cultivo de células recombinantes. También se pueden preparar fragmentos que tienen hasta 100-150 residuos de aminoácidos de forma conveniente mediante síntesis in vitro. Tales variantes de secuencia de aminoácidos son variantes predeterminadas y no se encuentran en la naturaleza. Las variantes muestran la actividad biológica cualitativa (incluyendo unión a diana) de la forma no variante, aunque no necesariamente del mismo valor cuantitativo. Mientras que el sitio para introducir una variación en la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la mutación por sí no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, con el fin de optimizar el rendimiento de una mutación en un sitio determinado, se realiza mutación aleatoria o de saturación (donde se insertan todos los 20 residuos posibles) en el codón diana y la variante expresada se criba para la combinación óptima de actividades deseadas. Tal cribado está dentro de la capacidad normal en la técnica.
Las inserciones de aminoácidos habitualmente estarán en el orden de desde aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácidos; las sustituciones típicamente se introducen para residuos únicos; y las deleciones variarán aproximadamente desde 1 a 30 residuos. Las deleciones o inserciones preferiblemente se hacen en pares adyacentes, es decir, una delación de 2 residuos o inserción de 2 residuos. Será ampliamente aparente de la siguiente discusión que las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas se introducen o combinan para llegar a una construcción final.
En un aspecto, la especificación describe un compuesto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos que tiene al menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos aproximadamente el 81% de identidad de secuencia, más referiblemente al menos aproximadamente el 82% de identidad de secuencia, aún más referiblemente al menos aproximadamente el 83% de identidad de secuencia, aún más referiblemente al menos aproximadamente el 84% de identidad de secuencia, aún más referiblemente al menos aproximadamente el 85% de identidad de secuencia, aún más referiblemente al menos aproximadamente el 86% de identidad de secuencia, aún más referiblemente al menos aproximadamente el 87% de identidad de secuencia, aún más referiblemente al menos aproximadamente el 88% de identidad de secuencia, aún más referiblemente al menos aproximadamente el 89% de identidad de secuencia, aún más referiblemente al menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia, aún más referiblemente al menos aproximadamente el 91% de identidad de secuencia, aún más referiblemente al menos aproximadamente el 92% de identidad de secuencia, aún más referiblemente al menos aproximadamente el 93% de identidad de secuencia, aún más referiblemente al menos aproximadamente el 94% de identidad de secuencia, aún más referiblemente al menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia, aún más referiblemente al menos aproximadamente el 96% de identidad de secuencia, aún más referiblemente al menos aproximadamente el 97% de identidad de secuencia, aún más referiblemente al menos aproximadamente el 98% de identidad de secuencia, aún más referiblemente al menos aproximadamente el 99% de identidad de secuencia a una secuencia de aminoácidos divulgada en la especificación, una figura, una SEQ ID NO: o una lista de secuencias de la presente solicitud.
El % de los valores de identidad de secuencia de aminoácidos se pueden obtener fácilmente usando, por ejemplo, el programa de ordenador WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)).
Se proporcionan fragmentos de secuencias nativas en el presente documento. Tales fragmentos pueden estar truncados en el extremo N, extremo C, o pueden carecer de residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con una proteína nativa de longitud completa. De nuevo, se entiende que cualquier variación terminal se hace dentro del contexto de la invención divulgada en el presente documento. Ciertos fragmentos carecen de residuos de aminoácidos que no son esenciales para una actividad biológica deseada de la secuencia de interés.
Se puede usar cualquiera de un número de técnicas convencionales. Los fragmentos peptídicos deseados o fragmentos de tramos de aminoácidos consecutivos se pueden sintetizar químicamente. Un enfoque alternativo implica generar fragmentos por digestión enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con una enzima que se sabe corta proteínas en sitios definidos por residuos de aminoácidos particulares, o digiriendo el ADN con enzimas de restricción adecuadas y aislar el fragmento deseado. Aún otra técnica adecuada implica aislar y amplificar un fragmento de ADN que codifica un fragmento de polipéptido/secuencia deseado, por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se emplean oligonucleótidos que definen los extremos deseados del fragmento de ADN en los cebadores 5' y 3' en la PCR.
En formas de realización particulares, sustituciones conservadoras de interés se muestran en la tabla 1 bajo el encabezamiento de sustituciones preferidas. Si tales sustituciones producen un cambio en la actividad biológica, entonces cambios más sustanciales, denominados sustituciones ejemplares en la tabla 1, o como se describe adicionalmente posteriormente en referencia a clases de aminoácidos, se introducen y los productos se criban.
Tabla 1
Original Ejemplar Preferida
Ala (A) val; leu; ile val
Arg (R) lys; gln; asn lys
Asn(N) gln; his; lys; arg gln
Asp(D) glu glu
Cys (C) ser ser
Gln (Q) asn asn
Glu (E) asp asp
Gly (G) pro; ala ala
His (H) asn; gln; lys; arg arg
Ile (I) leu; val; met; ala; phe; norleucina leu
Leu (L) norleucina; ile; val; met; ala; phe ile
Lys (K) arg; gln; asn arg
Met (M) leu; phe; ile leu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu
Pro (P) ala ala
Ser (S) thr thr
Thr (T) ser ser
Trp (W) tyr; phe tyr
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe
Val (V) ile; leu, met; phe; ala; norleucina leu
Se logran modificaciones sustanciales en la función o identidad inmunológica de la secuencia seleccionando sustituciones que se diferencian significativamente en su efecto en mantener (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo, como una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos naturales se dividen en grupos basado en propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;
(3) ácidos: asp, glu;
(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;
(5) residuos que influyen la orientación de la cadena: gly, pro;
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservadoras implicarán intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Tales residuos sustituidos también se pueden introducir en los sitios de sustitución conservadora o, más preferiblemente, en los sitios restantes (no conservados).
Las variaciones se pueden hacer usando métodos conocidos en la técnica tal como, mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida), barrido de alanina, y mutagénesis por PCR. Se pueden realizar mutagénesis dirigida (Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), mutagénesis con casete (Wells et al., Gene, 34:315 (1985)), mutagénesis con selección por restricción (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)) u otras técnicas conocidas en el ADN clonado para producir el ADN variante.
También se puede emplear análisis de aminoácidos por barrido para identificar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de barrido preferidos están aminoácidos neutros, relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de barrido preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante (Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)). La alanina también es típicamente preferida porque es el aminoácido más común. Además, con frecuencia se encuentra tanto en posiciones enterradas como expuestas (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Si la sustitución con alanina no da cantidades adecuadas de variante, se puede usar un aminoácido isotérico.
Modificaciones covalentes: El tramo de aminoácidos consecutivos se puede modificar covalentemente. Un tipo de modificación covalente incluye hacer reaccionar residuos de aminoácidos dirigidos con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminales que no están implicados en un enlace -x-x-. La derivación con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para entrecruzar a una matriz o superficie soporte insoluble en agua para uso en el método para purificar anticuerpos anti-secuencia de interés, y viceversa. Los agentes de entrecruzamiento comúnmente usados incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicíclico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres disuccinimidílicos tal como 3,3'-ditiobis(succinimidil propionato), maleimidas bifuncionales tal como bis-maleimido-1,8-octano, y agentes tales como metil-3-((pazidofenil)ditio)propioimidato.
Otras modificaciones incluyen desamidación de residuos de glutaminilo y asparraginilo a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo, respectivamente, hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo y treonilo, metilación de los grupos alfa-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilación del amino N-terminal, y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente comprende alterar el patrón de glucosilación nativo del tramo de aminoácidos consecutivos. “Alterar el patrón de glucosilación nativo” se pretende para fines en el presente documento que signifique delecionar una o más fracciones glucídicas encontradas en secuencias de aminoácidos (ya sea eliminando el sitio de glucosilación subyacente o delecionando la glucosilación por medios químicos y/o enzimáticos), y/o añadir uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en la secuencia nativa. Además, la frase incluye cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas nativas, que implica un cambio en la naturaleza y proporción de las varias fracciones glucídicas presentes.
La adición de sitios de glucosilación a la secuencia de aminoácidos se puede lograr alterando la secuencia de aminoácidos. La alteración se puede hacer, por ejemplo, mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia nativa (para sitios de O-glucosilación). La secuencia de aminoácidos opcionalmente se puede alterar mediante cambios a nivel de ADN, en particular al mutar el ADN que codifica la secuencia de aminoácidos en bases preseleccionadas de modo que se generan codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otro medio de aumentar el número de fracciones de carbohidratos en la secuencia de aminoácidos es por acoplamiento químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. Tales métodos se describen en la técnica, por ejemplo, en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre, 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981).
La eliminación de fracciones glucídicas presentes en la secuencia de aminoácidos se puede lograr química o enzimáticamente o por sustitución mutacional de codones que codifican residuos de aminoácidos que sirven como dianas para glucosilación. En la técnica se conocen métodos de desglucosilación química y se describen, por ejemplo, por Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) y por Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981). La escisión enzimática de fracciones glucídicas en polipéptidos se puede lograr mediante el uso de una variedad de endo­ y exo-glucosilasas como se describe por Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987).
Otro tipo de modificación covalente comprende unir la secuencia de aminoácidos a uno de una variedad de polímeros no proteinaceos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, o polioxialquilenos de la manera que se explica en las patentes en EE UU No. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.
El término “sustitución”, “sustituido” y “sustituyente” se refiere a un grupo funcional como se ha descrito anteriormente en el que uno o más enlaces a un átomo de hidrógeno contenidos en el mismo se sustituyen por un enlace a átomos de no hidrógeno o no carbono, siempre que las valencias normales se mantengan y que la sustitución produzca un compuesto estable. Los grupos sustituidos también incluyen grupos en los que uno o más enlaces a un átomo de carbono(s) o hidrógeno(s) se sustituyen con uno o más enlaces, incluyendo dobles y triples enlaces, a un heteroátomo. Los ejemplos de grupos sustituyentes incluyen los grupos funcionales descritos anteriormente y halógenos (es decir, F, Cl, Br e I); grupos alquilo, tal como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, tert-butilo, y trifluorometilo; hidroxilo; grupos alcoxi, tal como metoxi, etoxi, n-propoxi, e isopropoxi; grupos ariloxi, tal como fenoxi; arilalquiloxi, tal como benciloxi (fenilmetoxi) y p-trifluorometilbenciloxi (4-trifluorometilfenilmetoxi); grupos heteroariloxi; grupos sulfonilo, tal como trifluorometanosulfonilo, metanosulfonilo, y p-toluenosulfonilo; nitro, nitrosilo; mercapto; grupos sulfanilo, tal como metilsulfanilo, etilsulfanilo y propilsulfanilo; ciano; grupos amino, tal como amino, metilamino, dimetilamino, etilamino, y dietilamino; y carboxilo. Donde se divulgan o reivindican múltiples fracciones sustituyentes, el compuesto sustituido puede estar independientemente sustituido por una o más de las fracciones sustituyentes divulgadas o reivindicadas, singular o pluralmente. Mediante independientemente sustituida, se quiere decir que los (dos o más) sustituyentes pueden ser iguales o diferentes.
En los compuestos usados en el método de la presente invención, los grupos alquilo, heteroalquilo, monociclo, biciclo, arilo, heteroarilo y heterociclo pueden estar adicionalmente sustituidos al sustituir uno o más átomos de hidrógeno con grupos no hidrógeno alternativos. estos incluyen, pero no están limitados a, halo, hidroxi, mercapto, amino, carboxi, ciano y carbamoilo.
Se entiende que los sustituyentes y patrones de sustitución en los compuestos usados en el método de la presente invención los puede seleccionar un experto en la materia para proporcionar compuestos que son químicamente estables y que se pueden sintetizar fácilmente por métodos conocidos en la técnica a partir de materiales de partida fácilmente disponibles. Si un sustituyente está él mismo sustituido con más de un grupo, se entiende que esos múltiples grupos pueden estar en el mismo carbono o en diferentes carbonos, siempre que se produzca una estructura estable.
Al elegir los compuestos usados en el método de la presente invención, un experto en la materia reconocerá que los varios sustituyentes, es decir, R1, R2, etc., se van a elegir según principios bien conocidos de conectividad de estructura química.
Como se usa en el presente documento, “alquilo” incluye grupos hidrocarbonados alifáticos saturados tanto ramificados como de cadena lineal que tienen el número especificado de átomos de carbono y que pueden estar sustituidos o sin sustituir. Por tanto, C-i-Cn, como en “alquilo de C-i-Cn” se define para que incluya grupos que tienen 1, 2, ..., n-1 o n carbonos en una organización lineal o ramificada. Por ejemplo, C1-C6, como en “alquilo de C-i-Ce’ se define para que incluya grupos que tienen 1, 2, 3, 4, 5, o 6 carbonos en una organización lineal o ramificada, y específicamente incluye metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, pentilo, y hexilo. A menos que se especifique otra cosa contiene de uno a diez carbonos. Los grupos alquilo pueden estar sin sustituir o sustituidos con uno o más sustituyentes, incluyendo, pero no limitados a, halógeno, alcoxi, alquiltio, trifluorometilo, difluorometilo, metoxi e hidroxilo.
Como se usa en el presente documento, “alquilo de C1-C4” incluye alquilo de C1-C4 tanto ramificado como de cadena lineal.
Como se usa en el presente documento, “arilo” se pretende que signifique cualquier anillo de carbono monocíclico, bicíclico o policíclico estable de hasta 10 átomos en cada anillo, en donde al menos un anillo es aromático, y puede estar sin sustituir o sustituido. Los ejemplos de tales elementos arilo incluyen, pero no están limitados a: fenilo, ptoluenilo (4-metilfenilo), naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, fenantrilo, antrilo o acenaftilo. En casos donde el sustituyente arilo es bicíclico y un anillo es no aromático, se entiende que la unión es a través del anillo aromático.
El término “fenilo” se pretende que signifique un anillo de seis miembros aromático que contiene seis carbonos, y cualquier derivado sustituido del mismo.
El término “bencilo” se pretende que signifique un metileno unido directamente a un anillo de benceno. Un grupo bencilo es un grupo metilo en donde un hidrógeno está sustituido con un grupo fenilo, y cualquier derivado sustituido del mismo.
Los compuestos usados en el método de la presente invención se pueden preparar por técnicas bien conocidas en la síntesis orgánica y familiares a un experto en la materia. Sin embargo, estas pueden no ser el único medio por el que sintetizar u obtener los compuestos deseados.
Los compuestos de la presente invención se pueden preparar por técnicas descritas en Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry, A.I. Vogel, A.R. Tatchell, B.S. Furnis, A.J. Hannaford, P.W.G. Smith, (Prentice Hall) 5a Edición (1996), March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Michael B. Smith, Jerry March, (Wiley-Interscience) 5a Edición (2007), y referencias en los mismos. Sin embargo, estos pueden no ser los únicos medios por los que sintetizar u obtener los compuestos deseados.
En algunas formas de realización de la presente invención, un compuesto comprende un polímero no proteinaceo. En algunas formas de realización, el polímero no proteinaceo puede ser un polímero sintético hidrofílico, es decir, un polímero no encontrado de otra manera en la naturaleza, Sin embargo, polímeros que existen en la naturaleza y se producen por métodos recombinantes o in vitro son útiles, como lo son polímeros que se aíslan de la naturaleza. Los polímeros de polivinilo hidrofílicos están en el ámbito de esta invención, por ejemplo, alcohol polivinílico y polivinilpirrolidona. Particularmente útiles son los éteres de polialquileno tal como polietilenglicol, polipropilenglicol, ésteres de polioxietileno o metoxipolietilenglicol; polioxialquilenos tal como polioxioetileno y polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbómeros; polisacáridos ramificados o sin ramificar que comprenden los monómeros sacáridos D-manosa, D- y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico (por ejemplo, ácido polimanurónico o ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y ácido neuramínico incluyendo homopolisacáridos y heteropolisacáridos tal como lactosa, amilopeptina, almidón, hidroxietilalmidón, amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glucógeno, o la subunidad de polisacárido de mucopolisacáridos ácidos, por ejemplo, ácido hialurónico; polímeros de polioles, tal como polisorbitol y polimanitol; y heparina o heparon.
S ales
Las sales de los compuestos divulgados en el presente documento están dentro del ámbito de la invención. Como se usa en el presente documento, una “sal” es sal de los compuestos presentes que se ha modificado haciendo sales ácidas o básicas de los compuestos.
Dominios Fc
El término “dominio Fc”, como se usa en el presente documento, en general se refiere a un complejo monómero o dímero, que comprende las secuencias polipeptídicas C-terminales de una cadena pesada de inmunoglobulina. El dominio Fc puede comprender secuencias Fc nativas o variantes. Aunque los límites del dominio Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, el dominio Fc de la cadena pesada de IgG humana habitualmente se define para extenderse desde un residuo de aminoácido en la región bisagra hasta el extremo carboxilo de la secuencia Fc. La secuencia Fc de una inmunoglobulina en general comprende dos regiones constantes, una región CH2 y una región CH3, y opcionalmente comprende una región CH4. Un dominio Fc humano se puede obtener de cualquier inmunoglobulina adecuada, tal como los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA, IgE, IgD o IgM.
Los dominios Fc adecuados se preparan por expresión de ADN recombinante de polipéptidos quiméricos pre-Fc que comprenden 1) un péptido señal, obtenido de una proteína secretada o transmembrana, que se corta en frente de un polipéptido maduro que tiene un residuo de cisteína N-terminal, contiguo con 2) un polipéptido de dominio Fc que tiene un residuo de cisteína N-terminal
Los ejemplos adecuados de péptidos señal son sonic hedgehog (SHH) (No. de registro de GenBank NM000193), IFNalfa-2 (IFN) (No. de registro de GenBank NP000596), y colesterol éster transferasa (CETP) (No. de registro de GenBank NM000078). Otros ejemplos adecuados incluyen Indian hedgehog (No. de registro de Genbank NM002181), desert hedgehog (No. de registro de Genbank NM021044), IFNalfa-1 (No. de registro de Genbank NP076918), IFNalfa-4 (No. de registro de Genbank NM021068), IFNalfa-5 (No. de registro de Genbank NM002169), IFNalfa-6 (No. de registro de Genbank NM021002), IFNalfa-7 (No. de registro de Genbank NM021057), IFNalfa-8 (No. de registro de Genbank NM002170), IFNalfa-10 (No. de registro de Genbank NM002171), IFNalfa-13 (No. de registro de Genbank NM006900), IFNalfa-14 (No. de registro de Genbank NM002172), IFNalfa-16 (No. de registro de Genbank NM002173), IFNalfa-17 (No. de registro de Genbank NM021268) e IFNalfa-21 (No. de registro de Genbank NM002175).
Los ejemplos adecuados de dominios Fc y sus polipéptidos quiméricos pre-Fc se muestran en SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 96. Los dominios Fc se obtienen al expresar los polipéptidos quiméricos pre-Fc en células en condiciones que llevan a su secreción y corte del péptido señal. Los polipéptidos pre-Fc se pueden expresar en células huéspedes procariotas o eucariotas. Preferiblemente, células huésped de mamífero se transfectan con vectores de expresión que codifican los polipéptidos pre-Fc.
Los dominios Fc de IgG1 humana que tienen la secuencia N-terminal CDKTHTCPPCPAPE, CPPCPAPE, y CPAPE se muestran en SEQ ID NO: 1, SeQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 17, respectivamente, y las secuencias de ADN que los codifican se muestran en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 10, y SEQ ID No: 18, respectivamente. El dominio de IgG1 de SEQ ID NO: 1 se obtiene al expresar los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 3 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 5 (péptido señal de IfN), y SEQ ID NO: 7 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de ADN mostradas en SEQ ID: 4, SEQ ID NO: 6 y SeQ ID NO: 8, respectivamente. El dominio de IgG1 de SEQ ID NO: 9 se obtiene al expresar los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 11 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 13 (péptido señal de IFN), y SeQ ID NO: 15 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de AdN mostradas en SEQ Id: 12, SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 16 , respectivamente. El dominio de IgG1 de SEQ ID NO: 17 se obtiene al expresar los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 19 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 21 (péptido señal de IFN), y SEQ ID NO: 23 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de ADN mostradas en SEQ ID: 20, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24, respectivamente.
Los dominios Fc de IgG2 humana que tienen la secuencia N-terminal CCVECPPCPAPE, CVECPPCPAPE, CPPCPAPE, y CPAPE se muestran en SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 49, respectivamente, y las secuencias de ADN que los codifican se muestran en SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 42, y SEQ ID NO: 50, respectivamente. El dominio de IgG2 de SEQ ID NO: 25 se obtiene al expresar los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 27 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 29 (péptido señal de IFN), y SEQ ID NO: 31 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de ADN mostradas en SeQ iD: 28, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 32, respectivamente. El dominio de IgG2 de SEQ ID NO: 33 se obtiene al expresar los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 35 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 37 (péptido señal de IFN), y SEQ ID NO: 39 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de ADN mostradas en SeQ iD: 36, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40, respectivamente. El dominio de IgG2 de SEQ ID NO: 41 se obtiene de los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 43 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 45 (péptido señal de iFn), y SeQ ID NO: 47 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de ADN mostradas en SeQ ID: 44, SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 48, respectivamente. El dominio de IgG2 de SEQ ID NO: 49 se obtiene de los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 51 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 53 (péptido señal de IfN), y sEq ID NO: 55 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de ADN mostradas en SEQ ID: 52, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 56, respectivamente.
Los dominios Fc de IgG3 humana que tienen la secuencia N-terminal (CPRCPEPKSDTPPP)3-CPRCPAPE, CPRCPAPE, y CPAPE se muestran en SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, y SEQ ID NO: 73, respectivamente, y las secuencias de ADN que los codifican se muestran en SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66, SEQ ID nO: 42, y SEQ ID NO: 74, respectivamente. El dominio de IgG3 de SEQ ID NO: 57 se obtiene al expresar los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 59 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 61 (péptido señal de IFN), y SEQ ID No: 63 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de aDn mostradas en sEq ID: 60, SEQ ID nO: 62 y SEQ ID NO: 64, respectivamente. El dominio de IgG3 de SEQ ID NO: 65 se obtiene al expresar los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 67 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 69 (péptido señal de IFN), y SEQ ID NO: 71 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de aDn mostradas en sEq ID: 68, SEQ ID nO: 70 y SEQ ID NO: 72, respectivamente. El dominio de IgG3 de SEQ ID NO: 73 se obtiene al expresar los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 75 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 77 (péptido señal de IFN), y SEQ ID NO: 79 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de aDn mostradas en sEq ID: 76, SEQ ID nO: 78 y SEQ ID NO: 80, respectivamente.
Los dominios Fc de IgG4 humana que tienen la secuencia N-terminal CPSCPAPE, y CPAPE se muestran en SEQ ID NO: 81, y SEQ ID NO: 89, respectivamente, y las secuencias de ADN que los codifican se muestran en SEQ ID NO: 82, y SEQ ID NO: 90, respectivamente. El dominio de IgG4 de SEQ ID NO: 81 se obtiene al expresar los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 83 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 85 (péptido señal de iFn), y SeQ ID NO: 87 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de ADN mostradas en SeQ ID: 84, SEQ ID NO: 86 y SEQ ID NO: 88, respectivamente. El dominio de IgG4 de SEQ ID NO: 89 se obtiene al expresar los polipéptidos quiméricos pre-Fc mostrados en SEQ ID NO: 91 (péptido señal de SHH), SEQ ID NO: 93 (péptido señal de IFN), y SeQ ID NO: 95 (péptido señal de CETP), usando las secuencias de ADN mostradas en SeQ ID: 92, SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 96, respectivamente.
Las células huésped adecuadas incluyen células embrionarias humanas 293 (ATCC CRL-1573) y células de ovario de hámster CHO-K1 (ATCC CCL-61) obtenidas de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, Md.). Las células se cultivan a 37 grados C en una atmósfera de aire, al 95%; dióxido de carbono, al 5%. Las células 293 se mantienen en medio mínimo esencial (Eagle) con L-glutamina 2 mM y BSS de Earle ajustado para que contenga bicarbonato de sodio 1,5 g/l, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, y piruvato de sodio 1,0 mM, al 90%; suero bovino fetal, al 10%. Las células CHO-K1 se mantienen en medio F12K de Ham con L-glutamina 2 mM, ajustado para que contenga bicarbonato de sodio 1,5 g/l, al 90%; suero bovino fetal, al 10%. Otras células huésped adecuadas incluyen células de riñón de mono CV1 (ATCC CCL-70), células de riñón de mono COS-7 (ATCC CrL-1651), células de riñón de mono VERO-76 (ATCC CRL-1587), células cervicales humanas HELA (ATCC CCL-2), células pulmonares humanas W138 (ATCC CCL-75), células de riñón canino MDCK (ATCC CCL-34), células de hígado de rata BRL3A (ATCC CRL-1442), células de riñón de hámster BHK (ATCC CCL-10), células mamarias de ratón MMT060562 (ATCC CCL-51), y linfocitos T CD8+ humanos (descritos en el documento en EE UU No. de serie 08/258.152).
Los ejemplos de un vector de expresión adecuado son pCDNA3.1(+) mostrado en SEQ ID NO: 97 y pSA mostrado en SEQ ID NO: 98. El plásmido pSA contiene los siguientes elementos de secuencia de ADN: 1) pBluescriptIIKS(+) (nucleótidos 912-2941/1-619, No. de registro de GenBank X52327), 2) un promotor, potenciador y primer aceptor de ayuste de exón de citomegalovirus humano (nucleótidos 63-912, No. de registro de GenBank K03104), 3) un segundo aceptor de ayuste de exón de alfa1-globina humana (nucleótidos 6808-6919, No. de registro de GenBank J00153), 4) un sitio de poliadenilación del antígeno T de SV40 (nucleótidos 2770-2533, Reddy et al. (1978) Science 200, 494-502), y 5) un origen de replicación de SV40 (nucleótidos 5725-5578, Reddy et al., ibid.) Otros vectores de expresión adecuados incluyen los plásmidos pSVeCD4DHFR y pRKCD4 (Patente en EE UU No. 5.336.603), plásmido pIK.1.1 (Patente en EE UU No. 5.359.046), plásmido pVL-2 (Patente en EE UU No. 5.838.464), plásmido pRT43.2F3 (descrito en el documento en EE UU No. de serie 08/258.152).
Los vectores de expresión adecuados para los polipéptidos pre-Fc de IgG humanos se pueden construir mediante la ligación de un fragmento de vector HindIII-PspOM1 preparado de SEQ ID NO: 98, con un fragmento de inserto HindIII-EagI preparado de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 28, 30, 32, 36, 38, 40, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 60, 62, 64, 68, 70, 72, 76, 78, 80, 84, 86, 88, 92, 94, y 96.
Los marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen de la neomicina fosfotransferasa (NEO) del transposón Tn5 (Southern y Berg (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1, 327-341), y el ADNc de la dihidrofolato reductasa (Lucas et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24, 1774-1779). Un ejemplo de un vector de expresión adecuado que incorpora un gen NEO es el plásmido pSA-NEO, que se construye ligando un primer fragmento de ADN, preparado por digestión de SEQ ID NO: 99 con EcoRI y BglII, con un segundo fragmento de ADN, preparado por digestión de sEq ID NO: 98 con EcoRI y BglII. SEQ ID nO: 99 incorpora un gen NEO (nucleótidos 1551 a 2345, No. de registro de GenBank No. U00004) precedido por una secuencia para el inicio de la traducción (Kozak (1991) J. Biol. Chem, 266, 19867-19870). Otro ejemplo de un vector de expresión adecuado que incorpora un gen NEO y un ADNc de DHFR es el plásmido pSVe-NEO-DHFR, que se construye ligando un primer fragmento de ADN, preparado por digestión de SEQ ID NO: 99 con EcoRI y BglII, con un segundo fragmento de ADN, preparado por digestión de pSVeCD4DHFR con EcoRI y BglII. El plásmido pSVe-NEO-DHFR usa promotor/potenciadores tempranos de SV40 para dirigir la expresión del gen NEO y el ADNc de DHFR. Otros marcadores seleccionables adecuados incluyen el gen XPGT (Mulligan y Berg (1980) Science 209, 1422-1427) y el gen de resistencia a higromicina (Sugden et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 410-413).
En una forma de realización, las células se transfectan mediante el método del fosfato de calcio de Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36, 59-74. Una mezcla de ADN (10 ug) se disuelve en 0,5 ml de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, y CaCl2227 mM. La mezcla de ADN contiene (en una proporción de 10:1:1) el ADN del vector de expresión, el ADN del marcador seleccionable, y un ADN que codifica el gen VA RNA (Thimmappaya et al. (1982) Cell 31, 543-551). A esta mezcla se añade, gota a gota, 0,5 ml de Hepes 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO41,5 mM. Se deja formar el precipitado de ADN durante 10 minutos a 25°C, después se suspende y se añade a las células que han crecido a confluencia en placas de cultivo celular de plástico de 100 mm. Después de 4 horas a 37°C, el medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 0,5 minutos. Las células se lavan después con medio sin suero, se añade medio de cultivo fresco, y las células se incuban durante 5 días.
En otra forma de realización, las células se transfectan de forma transitoria mediante el método de sulfato de dextrano de Somparyrac et al. (1981) Proc. Nat. Acad. Sci. 12, 7575-7579. Las células se hacen crecer hasta la máxima densidad en frascos de agitación, se concentran por centrifugación, y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba en el precipitado celular. Después de 4 horas a 37°C, el DEAE-dextrano se aspira y se añade glicerol al 20% en PBS durante 1,5 minutos. Las células se lavan después con medio sin suero, se reintroducen en los frascos de agitación que contiene medio de cultivo fresco con 5 microgramos/ml de insulina bovina y 0,1 microgramo/ml de transferrina bovina, y se incuba durante 4 días.
Después de la transfección por cualquier método, el medio condicionado se centrifuga y se filtra para eliminar las células huésped y restos. La muestra que contiene el dominio Fc luego se concentra y purifica por cualquier método seleccionado, tal como diálisis y/o cromatografía en columna (véase posteriormente). Para identificar el dominio Fc en el sobrenadante del cultivo celular, el medio de cultivo se retira de 24 a 96 horas después de la transfección, se concentra, y se analiza por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) en presencia o ausencia de un agente reductor tal como ditiotreitol.
Para expresión no amplificada, los plásmidos se transfectan en células 293 humanas (Graham et al., J. Gen. Virol.
36:59 74 (1977)), usando un procedimiento de alta eficacia (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2:3 10 (1990)). El medio se cambia a medio sin suero y se recoge a diario durante hasta cinco días. Para expresión no amplificada, los plásmidos se transfectan en células 293 humanas (Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 74 (1977)), usando un procedimiento de alta eficacia (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2:3 10 (1990)). El medio se cambia a medio sin suero y se recoge a diario durante hasta cinco días. Los dominios Fc se purifican a partir del sobrenadante de cultivo celular usando hiTrap Proteína A HP (Pharmacia). Los dominios Fc eluídos se someten a intercambio de tampón en PBS usando un Centricon-30 (Amicon), se concentran a 0,5 ml, se esterilizan por filtración usando un Millex-GV (Millipore) a 4°C.
Tramos de aminoácidos consecutivos
Los ejemplos de tramos de aminoácidos consecutivos como se denominan en el presente documento incluyen, pero no están limitados a, aminoácidos consecutivos que incluyen dominios de unión tal como proteínas secretadas o transmembrana, dominios de unión intracelulares y anticuerpos (enteros o partes de los mismos) y versiones modificadas de los mismos. Los siguientes son algunos ejemplos no limitantes:
1) Inmunoglobulinas
El término “anticuerpo” se usa en el sentido más amplio y específicamente cubre anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos), anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes, y fragmentos de anticuerpos siempre que muestren la actividad biológica deseada (por ejemplo, Fab y/o anticuerpos de un solo brazo).
La “clase” de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseída por su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM y varias de estas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se llaman a, 8, £, y, y M, respectivamente.
Un “fragmento de anticuerpo” se refiere a una molécula diferente de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
Los términos “anticuerpo de longitud completa”, “anticuerpo intacto”, y “anticuerpo entero” se usan en el presente documento de forma intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a la estructura de un anticuerpo nativo o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fc como se define en el presente documento.
Un anticuerpo “bloqueante” o un anticuerpo “antagonista” es uno que inhibe significativamente (ya sea parcialmente o por completo) una actividad biológica del antígeno al que se une.
Un “anticuerpo que se une al mismo epítopo” que un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición en el 50% o más, y a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en su ensayo de competición en el 50% o más. Se proporciona un ensayo de competición ejemplar en el presente documento.
El término “región variable” o “dominio variable” se refiere al dominio de una cadena pesada o ligera de un anticuerpo que está implicado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (VH y VL, respetivamente) de un anticuerpo nativo en general tienen estructuras similares, cada dominio comprende cuatro regiones marco conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). (Véase, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007)). Un único dominio VH o Vl puede ser suficiente para conferir especificidad de unión a antígeno. Además, los anticuerpos que se unen a un antígeno particular se pueden aislar usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para cribar una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Véase, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol.
150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
El término “región hipervariable” o “HVR”, como se usa en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos (“bucles hipervariables”). En general, los anticuerpos de cuatro cadenas nativos, comprenden seis HVR; tres en el VH (H1, H2, H3), y tres en el VL (L1, L2, L3). Las HVR en general comprenden residuos de aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las “regiones determinantes de complementariedad” (CDR), siendo las últimas de la mayor variabilidad de secuencia y/o estando implicadas en el reconocimiento de antígeno. Los bucles hipervariables ejemplares se producen en los residuos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), y 96-101 (H3). (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) Las CDR ejemplares (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CdR-H2, y CDR-H3) se producen en los residuos de aminoácidos at amino 24-34 de L1, 50-56 de L2, 89­ 97 de L3, 31-35B de H1, 50-65 de H2, y 95-102 de H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991).) Con la excepción de CDR1 en VH, las CDR en general comprenden los residuos de aminoácidos que forman los bucles hipervariables. Las CDR también comprenden “residuos determinantes de especificidad”, o “SDR”, que son residuos que entran en contacto con el antígeno. Los SDR están contenidos en regiones de las CDR llamadas CDR abreviadas, o a-CDR. Las a-CDR ejemplares (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2, y a-CDR-H3) se producen en los residuos de aminoácidos 31-34 de L1, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1, 50-58 de H2, y 95-102 de H3. (Véase, Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)). A menos que se indique de otra manera, los residuos HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplos, residuos FR) se numeran en el presente documento según Kabat et al., anteriormente.
“Marco” o “FR” se refiere a residuos de dominios variables diferentes de los residuos de la región hipervariable (HVR). La FR de un dominio variable en general consiste en cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. Según esto, las secuencias HVR y FR en general aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1 (L1)-FR2-H2 (L2)-FR3-H3 (L3)-FR4.
La frase “cadena pesada truncada N-terminalmente”, como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende partes, pero no todo de una cadena pesada de inmunoglobulina de longitud completa, en donde las partes que faltan son las normalmente localizadas en la región N-terminal de la cadena pesada. Las partes que faltan pueden incluir, pero no están limitadas a, el dominio variable, CH1, y parte o todo de una secuencia bisagra. En general, si la secuencia bisagra de tipo salvaje no está presente, el/los dominio(s) constante(s) restante(s) en la cadena pesada truncada N-terminalmente comprendería(n) un componente que es capaz de unirse a otra secuencia Fc (es decir, el “primer” polipéptido Fc como se describe en el presente documento). Por ejemplo, dicho componente puede ser un residuo modificado o un residuo de cisteína añadido capaz de formar un enlace disulfuro.
“Receptor de Fc” o “FcR” describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. En algunas formas de realización, un FcR es un FcR humano nativo. En algunas formas de realización, un FcR es uno que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y formas de ayuste alternativo de esos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un “receptor activador”) y FcyRIIB (un “receptor inhibidor”), que tienen secuencias de aminoácidos similares que se diferencian principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo de activación de inmunorreceptor basado de tirosina (ITAM) en su dominio citoplásmico. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibición de inmunorreceptor basado de tirosina (ITIM) en su dominio citoplásmico. (Véase, por ejemplo, Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan, por ejemplo, en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo los identificados en el futuro, están abarcados por el término “FcR” en el presente documento.
El término “receptor de Fc” o “FcR” también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) y regulación de la homeostasis de inmunoglobulinas. Los métodos de medir unión a FcRn son conocidos (véase, por ejemplo, Ghetie y Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); documento WO 2004/92219 (Hinton et al.).
Se pueden ensayar la unión de FcRn humano in vivo y la semivida en suero de polipéptidos de unión a FcRn humano de alta afinidad, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano, o en primates a los que se administran los polipéptidos con una región Fc variante. El documento WO 2000/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpo con unión mejorada o disminuida a FcR. Véase también, por ejemplo, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).
La “región bisagra”, “secuencia bisagra”, y variaciones de las mismas, como se usa en el presente documento, incluye el significado conocido en la técnica, que se ilustra en, por ejemplo, Janeway et al., Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4a ed., 1999); Bloom et al., Protein Science (1997), 6:407-415; Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202.
A menos que se indique otra cosa, la expresión “anticuerpo multivalente” se usa a lo largo de esta especificación para indicar un anticuerpo que comprende tres o más sitios de unión a antígeno. El anticuerpo multivalente preferiblemente está manipulado para tener tres o más sitios de unión a antígeno y en general no es un anticuerpo IgM o IgA de secuencia nativa.
Un fragmento “Fv” es un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y unión a antígeno completo. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable de cadena pesada y uno de ligera en asociación estrecha, que puede ser de naturaleza covalente, por ejemplo, en scFv. Es en esta configuración que las tres HVR de cada dominio variable interaccionan para definir un sitio de unión a antígeno en la superficie del dímero Vh-Vl. Colectivamente, las seis HVR o un subconjunto de las mismas confieren especificidad de unión a antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres HVR específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y unirse a antígeno, aunque habitualmente a una menor afinidad que el sitio de unión entero.
El fragmento “Fab” contiene un dominio variable y constante de la cadena ligera y un dominio variable y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 comprenden un par de fragmentos Fab que en general están covalentemente unidos cerca de sus extremos carboxi por cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen en la técnica otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo.
La frase “brazo de unión a antígeno”, como se usa en el presente documento, se refiere a una parte componente de un fragmento de anticuerpo que tiene una capacidad para unirse específicamente a una molécula diana de interés. En general y preferiblemente, el brazo de unión a antígeno es un complejo de secuencias polipeptídicas de inmunoglobulinas, por ejemplo, HVR y/o secuencias del dominio variable de una cadena ligera y pesada de inmunoglobulina.
Los fragmentos de anticuerpo “Fv monocatenarios” o “scFv” comprenden los dominios Vh y Vl de anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En general el polipéptido Fv comprende además un enlazador peptídico entre los dominios Vh y Vl, que permite al scFv formar la estructura deseada para unión a antígeno. Para una revisión de scFv, véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315 (1994).
El término “diacuerpos” se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de unión a antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de cadena pesada (Vh) unido a un dominio variable de cadena ligera (Vl) en la misma cadena polipeptídica (Vh y Vl). Al usar un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios están forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, documento EP 404,097; documento WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
La expresión “anticuerpos lineales” se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995). Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en tándem (Vh-Chi-Vh-Chi) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementarios, forman un par de regiones de unión a antígeno. los anticuerpos lineales pueden ser biespecíficos o monoespecíficos.
El término “anticuerpo monoclonal” como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo, que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpo monoclonal, tales variantes en general están presentes en cantidades minoritarias. En contraste a las preparaciones de anticuerpos policlonales, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por tanto, el modificador “monoclonal” indica el carácter de un anticuerpo como que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no se debe interpretar como que requiere producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a usar se pueden hacer por una variedad de técnicas, incluyendo, pero no limitadas a, el método del hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de presentación en fagos, y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen todo o parte de los loci de inmunoglobulinas humanas, tales métodos y otros métodos ejemplares para hacer anticuerpos monoclonales se describen en el presente documento.
El término anticuerpo “quimérico” se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera deriva de una fuente o especie diferente.
Un anticuerpo “humanizado” se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácidos de HVR no humanas y residuos de aminoácidos de FR humanas. En ciertas formas de realización, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las HVR (por ejemplo, CDR) corresponden a las de un anticuerpo no humano, y todo o sustancialmente todo de las f R corresponde a las de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una “forma humanizada” de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha experimentado humanización.
Un “anticuerpo humano” es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano específicamente excluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión a antígeno no humanos.
Un “anticuerpo desnudo” se refiere a un anticuerpo que no está conjugado a una fracción heteróloga (por ejemplo, una fracción citotóxica) o radiomarcador. El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación farmacéutica.
“Anticuerpos nativos” se refiere a moléculas de inmunoglobulinas naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos IgG nativos son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 dalton, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas por puentes disulfuro. Del extremo N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada un dominio pesado variable o un dominio variable de cadena pesada, seguido por tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3). De forma similar, del extremo N al C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada un dominio ligero variable o un dominio variable de cadena ligera, seguido por un dominio ligero constante (CL). La cadena ligera de un anticuerpo se puede asignar a uno de dos tipos, llamados kappa (k) y lambda (A), basado en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.
“Afinidad” se refiere a la potencia de la suma total de interacciones no covalentes entre un único sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su compañero de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otra manera, como se usa en el presente documento, “afinidad de unión” se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su compañero Y en general se puede representar por la constante de disociación (Kd). La afinidad se puede medir por métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos en el presente documento. Se describen formas de realización específicas ilustrativas y ejemplares para medir la afinidad de unión posteriormente.
Un anticuerpo “madurado por afinidad” se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más HVR, comparado con un anticuerpo parental que no posee tales alteraciones, tales alteraciones producen una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno.
Un anticuerpo que tiene una “característica biológica” de un anticuerpo designado es uno que posee una o más de las características biológicas de ese anticuerpo que lo distingue de otros anticuerpos que se unen al mismo antígeno.
Un “sitio de unión a antígeno funcional” de un anticuerpo es uno que es capaz de unirse a un antígeno diana. La afinidad de unión al antígeno del sitio de unión a antígeno no es necesariamente tan fuerte como el anticuerpo parental del que deriva el sitio de unión a antígeno, pero la capacidad de unirse al antígeno debe ser medible usando cualquiera de una variedad de métodos conocidos para evaluar la unión de anticuerpo a un antígeno. Además, la afinidad de unión al antígeno de cada uno de los sitios de unión al antígeno de un anticuerpo multivalente en el presente documento no necesita ser cuantitativamente la misma. Para los anticuerpos multiméricos en el presente documento, el número de sitios de unión a antígeno funcionales se puede evaluar usando análisis de ultracentrifugación como se describe en el ejemplo 2 de la publicación de solicitud de patente en EE UU No. 20050186208. Según este método de análisis, se combinan diferentes proporciones de antígeno diana respecto a anticuerpo multimérico y se calcula el peso molecular medio de los complejos asumiendo números diferentes de sitios de unión funcionales. Estos valores teóricos se compran con los valores experimentales reales obtenidos con el fin de evaluar el número de sitios de unión funcionales.
Un “anticuerpo dependiente de especie” es uno que tiene una afinidad de unión más fuerte para un antígeno de una primera especie de mamífero de la que tiene para un homólogo de ese antígeno de una segunda especie de mamífero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de especie “se une específicamente” a un antígeno humano (es decir tiene un valor de afinidad de unión (Kd) de no más de aproximadamente 1 x 10-7 M, preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 10-8 M y lo más preferiblemente no más de aproximadamente 1 x 10-9 M), pero tiene una afinidad de unión para un homólogo del antígeno de una segunda especie de mamífero no humano que es al menos aproximadamente 50 veces, o al menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces, más débil que su afinidad de unión para el antígeno humano. El anticuerpo dependiente de especie puede ser cualquiera de los varios tipos de anticuerpos que se han definido anteriormente. En algunas formas de realización, el anticuerpo específico de especie es un anticuerpo humanizado o humano.
Un anticuerpo “aislado” es uno que se ha separado de un componente de su medio natural. En algunas formas de realización, un anticuerpo se purifica a más del 95% o 99% de pureza determinado por, por ejemplo, electroforesis (por ejemplo, SDS-PAGE, isoelectroenfoque (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico o HPLC de fase inversa). Para una revisión de métodos para evaluar la pureza de anticuerpo, véase, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
2) Proteínas extracelulares
Las proteínas extracelulares desempeñan papeles importantes en, entre otras cosas, la formación, diferenciación y mantenimiento de organismos multicelulares. Se muestra una discusión de varias proteínas intracelulares de interés en la patente en EE UU No. 6.723.535, Ashkenazi et al., concedida el 20 de abril, 2004.
El destino de muchas células individuales, por ejemplo, proliferación, migración, diferenciación, o interacción con otras células, típicamente está regido por la información recibida de otras células y/o el medio inmediato. Esta información con frecuencia se transmite por polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos, y hormonas) que son, a su vez, recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o proteínas unidas a la membrana. Estos polipéptidos secretados o moléculas de señalización normalmente pasan a través de la ruta secretora celular para alcanzar su sitio de acción en el medio extracelular.
Las proteínas secretadas tienen varias aplicaciones industriales, incluyendo como fármacos, diagnósticos, biosensores y biorreactores. La mayoría de los fármacos proteicos disponibles actualmente, tal como agentes trombolíticos, interferones, interleuquinas, eritropoyetinas, factores estimulantes de colonias, y varias otras citoquinas, son proteínas secretoras. Sus receptores, que son proteínas de membrana, también tienen potencial como agentes terapéuticos o diagnósticos. Se están realizando esfuerzos tanto por la industria como por la academia para identificar nuevas proteínas secretadas nativas. Muchos esfuerzos se han enfocado en el cribado de genotecas de ADN recombinante de mamífero para identificar las secuencias codificantes de proteínas secretadas novedosas. Los ejemplos de métodos y técnicas de cribado se describen en la bibliografía (véase, por ejemplo, Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:7108-7113 (1996); Patente en EE UU No. 5.536.637)).
Las proteínas unidas a membrana y receptores pueden desempeñar papeles importantes en, entre otras cosas, la formación, diferenciación y mantenimiento de organismos multicelulares. El destino de muchas células individuales, por ejemplo, proliferación, migración, diferenciación, o interacción con otras células, típicamente está regido por la información recibida de otras células y/o el medio inmediato. Esta información con frecuencia se transmite por polipéptidos secretados (por ejemplo, factores mitogénicos, factores de supervivencia, factores citotóxicos, factores de diferenciación, neuropéptidos, y hormonas) que son, a su vez, recibidos e interpretados por diversos receptores celulares o proteínas unidas a la membrana. Tales proteínas unidas a membrana y receptores celulares incluyen, pero no están limitados a, receptores de citoquinas, receptores quinasas, receptores fosfatasas, receptores implicados en interacciones célula-célula, y moléculas de adhesión celular como selectinas e integrinas. Por ejemplo, la transducción de señales que regula el crecimiento y diferenciación celular está regulada en parte por fosforilación de varias proteínas celulares. Las proteínas tirosina quinasas, enzimas que catalizan ese proceso, también pueden actuar como receptores de factores de crecimiento. Los ejemplos incluyen receptor de factor de crecimiento de fibroblastos y receptor de factor de crecimiento nervioso.
Las proteínas unidas a membrana y moléculas de receptores tienen varias aplicaciones industriales, incluyendo como agentes farmacéuticos y diagnósticos. Las inmunoadhesinas receptores, por ejemplo, se pueden emplear como agentes terapéuticos para bloquear las interacciones ligando-receptor. Las proteínas unidas a membrana también se pueden emplear para el cribado de potenciales inhibidores peptídicos o de molécula pequeña de la interacción receptor/ligando relevante.
3) Síntesis C-terminal basada en inteína
Como se ha descrito, por ejemplo, en la patente en EE UU No. 6.849.428, concedida el 1 de febrero, 2005, las inteínas son el equivalente en proteína de los intrones de ARN con auto ayuste (véase Perler et al., Nucleic Acids Res. 22:1125-1127 (1994)), que catalizan su propia escisión de una proteína precursora con la fusión concomitante de las secuencias proteicas flanqueantes, conocidas como exteínas (revisado en Perler et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1:292299 (1997); Perler, F. B. Cell 92(1):1-4 (1998); Xu et al., EMBO J. 15(19):5146-5153 (1996)).
Estudios en el mecanismo del ayuste de inteínas llevaron al desarrollo de un sistema de purificación de proteínas que utilizaba corte inducido por tiol del enlace peptídico en el extremo N de la inteína Sce VMA (Chong et al., Gene 192(2):271-281 (1997)). La purificación con este sistema mediado por inteína genera una proteína expresada en bacterias con un tioéster C-terminal (Chong et al., (1997)). En una aplicación, donde se describe para aislar una proteína citotóxica, la proteína expresada en bacterias con el tioéster C-terminal se fusiona después a un péptido químicamente sintetizado con una cisteína N-terminal usando la química descrita para “ligación química nativa” (Evans et al., Protein Sci. 7:2256-2264 (1998); Muir et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6705-6710 (1998)).
Esta técnica, denominada “ligación de proteínas mediada por inteína” (IPL), representa un avance importante en técnicas semisintéticas de proteínas. Sin embargo, debido a que los péptidos químicamente sintetizados mayores de aproximadamente 100 residuos son difíciles de obtener, la aplicación general de IPL estaba limitada por el requisito de un péptido químicamente sintetizado como un compañero de ligación.
La tecnología IPL se expandió significativamente cuando se generó una proteína expresada con un extremo N predeterminado, tal como cisteína, como se describe, por ejemplo, en la patente en EE UU No. 6.849.428. Esto permite la fusión de una o más proteínas expresadas de una célula huésped, tal como células bacterianas, de levadura o de mamífero. En un ejemplo no limitante la inteína una RIR1 modificada de Methanobacterium thermoautotrophicum es esa que corta en el extremo C o el extremo N se usa lo que permite la liberación de una proteína expresada en bacterias durante una purificación en una columna, eliminando de esta manera la necesidad de proteasas por completo.
La tecnología de inteínas es un ejemplo de una ruta para obtener componentes. En una forma de realización, las subunidades de los compuestos de la invención se obtienen transfectando células adecuadas, capaces de expresar y secretar polipéptidos quiméricos maduros, en donde tales polipéptidos comprenden, por ejemplo, un dominio de adhesina contiguo a un dominio de inteína C-terminal aislable (véase, la patente en EE UU No. 6.849.428, Evans et al., concedida el 1 de febrero, 2005). Las células, tal como células de mamífero o células bacterianas, se transfectan usando técnicas de ADN recombinante conocidas. El polipéptido quimérico secretado se puede aislar después, por ejemplo, usando una resina de quitina derivatizada en el caso de una inteína-dominio de unión a quitina (véase la patente en EE UU No. 6.897.285, Xu et al., concedida el 24 de mayo, 2005), y después se trata en condiciones que permiten el corte mediado por tiol y la liberación de la ahora subunidad C-terminal terminada en tioéster. La subunidad de adhesión terminada en tioéster se convierte fácilmente a una subunidad terminada en cisteína C-terminal.
Por ejemplo, después de una reacción de autocorte de inteína, se genera un intermedio tioéster que permite la adición fácil de cisteína, selenocisteína, homocisteína u homoselenocisteína, o un derivado de cisteína, selenocisteína, homocisteína, homoselenocisteína, al extremo C por ligación química nativa. Los métodos de añadir una cisteína, selenocisteína, homocisteína u homoselenocisteína, o un derivado de cisteína, selenocisteína, homocisteína, homoselenocisteína, al extremo C por ligación química nativa que son útiles en aspectos de la presente invención se describen en la solicitud de patente en EE UU No. 2008/0254512, Capon, publicada el 16 de octubre, 2008.
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Otro aspecto de la presente especificación describe kits que comprenden los compuestos divulgados en el presente documento y las composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos. Un kit puede incluir, además del compuesto o composición farmacéutica, agentes diagnósticos o terapéuticos. Un kit también puede incluir instrucciones para uso en un método diagnóstico o terapéutico. En una forma de realización diagnóstica, el kit incluye el compuesto o una composición farmacéutica del mismo y un agente diagnóstico. En una forma de realización terapéutica, el kit incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo y uno o más agentes terapéuticos, tal como un agente antineoplásico adicional, agente antitumoral o agente quimioterapéutico.
Técnicas generales
La descripción posterior se refiere principalmente a la producción de tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés cultivando células transformadas o transfectadas con un vector que contiene un ácido nucleico codificante. Se contempla, por supuesto, que se puedan emplear métodos alternativos, que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos, o porciones de la misma, se puede producir por síntesis directa de péptidos usando técnicas de fase sólida (véase, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)). Se puede realizar síntesis de proteínas in vitro usando técnicas manuales o por automatización. La síntesis automatizada se puede lograr, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos de Applied Biosystems (Foster City, Calif.) usando las instrucciones del fabricante. Varias porciones de los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés se pueden sintetizar químicamente por separado y combinar usando métodos químicos o enzimáticos para producir los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés de longitud completa.
1. Selección y transformación de células huésped
Las células huésped se transforman o transfectan con vectores de expresión o clonación descritos en el presente documento para la producción y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones de cultivo, tal como medios, temperatura, pH y similares, las puede seleccionar el experto en la materia sin experimentación excesiva. En general, se pueden encontrar principios, protocolos, y técnicas prácticas para maximizar la productividad de cultivos celulares en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook et al., anteriormente.
El experto en la materia conoce métodos de transfección de células eucariotas y transformación de células procariotas, por ejemplo, CaCl2, CaPO4, mediada por liposoma y electroporación. Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se realiza usando técnicas estándar apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio, como se describe en Sambrook et al., anteriormente, o la electroporación, en general se usa para procariotas. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células vegetales, como se describe por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) y el documento WO 89/05859 publicado el 29 de junio, 1989. Para células de mamífero sin tales paredes celulares, se puede emplear el método de precipitación con fosfato de calcio de Graham y van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978). Se han descrito los aspectos generales de transfecciones del sistema huésped de células de mamífero en la patente en EE UU No. 4.399.216. Las transformaciones en levadura típicamente se llevan a cabo según el método de Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) y Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979). Sin embargo, también se pueden usar otros métodos para introducir ADN en células, tal como por microinyección nuclear, electroporación, fusión de protoplastos bacterianos con células intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para varias técnicas para transformar células de mamífero, véase, Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) y Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).
Las células huésped adecuadas para clonar o expresar ADN en los vectores en el presente documento incluyen células procariotas, de levadura, o eucariotas superiores. Los procariotas adecuados incluyen, pero no están limitados a, eubacterias, tal como organismos gram negativos o gram positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tal como E. coli. Varias cepas de E. coli están públicamente disponibles, tal como E. coli K12 cepa MM294 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); E. coli cepa W3110 (ATCC 27.325) y K5772 (ATCC 53.635). Otras células huésped procariotas adecuadas incluyen Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como Bacilli tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P divulgado en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril, 1989), Pseudomonas tal como P. aeruginosa, y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. La cepa W3110 es un huésped o huésped parental particularmente preferido porque es una cepa huésped común para fermentaciones de producto de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 puede estar modificada para efectuar una mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas para el huésped, con ejemplos de tales huéspedes incluyendo E. coli W3110 cepa 1A2, que tiene el genotipo completo tonA; E. coli W3110 cepa 9E4, que tiene el genotipo completo tonA ptr3; E. coli W3110 cepa 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo tonAptr3phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kanr; E. coli W3110 cepa 37D6, que tiene el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; E. coli W3110 cepa 40B4, que es al cepa 37D6 con una mutación de deleción degP no resistente a kanamicina; y una cepa de E. coli que tiene proteasa periplásmica mutante divulgada en la patente en E UU No. 4.946.783, concedida el 7 de agosto, 1990. Alternativamente, son adecuados métodos in vitro de clonación, etc., PCR u otras reacciones de polimerasas de ácidos nucleicos.
Además de procariotas, microbios eucariotas tal como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores codificantes. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariota inferior comúnmente usado. Otros incluyen Schizosaccharomyces pombe (Beach y Nurse, Nature, 290:140 (1981); documento EP 139.383 publicado el 2 de mayo, 1985); huéspedes de Kluyveromyces (Pat. en EE UU No.
4.943.529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) tal como, por ejemplo, K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)), K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (documento EP 402.226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)); Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis (documento EP 394.538 publicado el 31 de octubre, 1990); y hongos filamentosos tal como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (documento WO 91/00357 publicado el 10 de enero, 1991), y huéspedes de Aspergillus tal como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983); Tilburn et al., Gene, 26:205-221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)) y A. niger (Kelly y Hynes, EMBO J., 4:475479 (1985)). Las levaduras metilotrópicas son adecuadas en el presente documento e incluyen, pero no están limitadas a, levaduras capaces de crecimiento en metanol seleccionadas de los géneros que consisten en Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis, y Rhodotorula. Se puede encontrar una lista de especies específicas que son ejemplares de esta clase de levaduras en C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
Las células huésped adecuadas para la expresión de tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés glucosilados derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insecto tal como S2 de Drosophila y Sf9 de Spodoptera, así como células vegetales. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) y COS. Ejemplos más específicos incluyen la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2 , HB 8065); y tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51). La selección de la célula huésped apropiada se juzga que está dentro de las capacidades en la técnica.
2. Selección y uso de un vector replicable
El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifica el tramo de aminoácidos consecutivos o polipéptido de interés se puede insertar en un vector replicable para clonación (amplificación del ADN) o para expresión. Varios vectores están públicamente disponibles. El vector puede, por ejemplo, estar en forma de un plásmido, cósmido, partícula vírica, o fago. La secuencia de ácido nucleico apropiada se puede insertar en el vector por una variedad de procedimientos. En general, el ADN se inserta en un sitio(s) de endonucleasa de restricción apropiado(s) usando métodos conocidos en la técnica. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no están limitados a, una o más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligación estándar que conoce el experto en la materia.
Los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés se pueden producir de forma recombinante no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de corte específico en el extremo N de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte del ADN codificante que se inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa, 1pp, o enterotoxina estable al calor II. Para la secreción en levaduras la secuencia señal puede ser, por ejemplo, el líder de invertasa de levadura, líder de factor alfa (incluyendo líderes de factor alfa de Saccharomyces y Kluyveromyces, el último descrito en la patente en EE UU No. 5.010.182), o líder de fosfatasa ácida, el líder de glucoamilasa de C. albicans (documento EP 362.179 publicado el 4 de abril, 1990), o la señal descrita en el documento WO 90/13646 publicado el 15 de noviembre, 1990. En expresión en células de mamíferos, se pueden usar secuencias señal de mamíferos para dirigir la secreción de la proteína, tal como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o relacionada, así como líderes secretores víricos.
Los vectores tanto de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Tales secuencias se conocen para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias gram negativas, el origen del plásmido 2mu es adecuado para levadura, y varios orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos.
Los vectores de expresión y clonación típicamente contendrán un gen de selección, también llamado marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan deficiencia auxotróficas, o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli.
Un ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero son los que permiten la identificación de células competentes para absorber el ácido nucleico codificante, tal como DHFR o timidina quinasa. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR de tipo salvaje es la línea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y propagada como se describe por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980). Un gen de selección adecuado para su uso en levadura es el gen trp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)). El gen trp1 proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)).
Los vectores de expresión y clonación habitualmente contienen un promotor operativamente unido a la secuencia de ácido nucleico codificante para dirigir la síntesis de ARNm. Los promotores reconocidos por una variedad de potenciales células huésped se conocen bien. Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas promotores de beta-lactamasa y lactosa (Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)) fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); documento EP 36.776), y promotores híbridos tal como el promotortac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)). Los promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgrano (S.D.) operativamente unida al ADN codificante.
Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para uso con huéspedes levaduras incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al. J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)) u otras enzimas glucolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Re.g., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), tal como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con metabolismo de nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores apropiados para uso en expresión en levadura se describen adicionalmente en el documento EP 73.657.
La transcripción de vectores en células huésped de mamífero está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos del genoma de virus tal como virus del polioma, virus de la viruela aviar (documento UK 2.211.504 publicado el 5 de julio, 1989), adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus simio 40 (SV40), de promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, y de promotores de choque térmico, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de la célula huésped.
La transcripción de un ADN que codifica los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés por eucariotas superiores se puede aumentar al insertar una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos que actúan en cis del ADN, habitualmente aproximadamente desde 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Se conocen ahora muchas secuencias potenciadoras de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, alfa-fetoproteína, e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus de células eucariotas. Los ejemplos incluyen el potenciador del SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus. El potenciador puede estar separado en el vector en una posición 5' o 3' respecto a la secuencia codificante, pero está localizado preferiblemente en un sitio 5' del promotor.
Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (levadura, hongos, insecto, planta, animal, humano o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrá secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y la estabilizar el ARNm. Tales secuencias están comúnmente disponibles desde las regiones no traducidas en 5' y, ocasionalmente 3', de ADN o ADNc eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés.
Aún otros métodos, vectores, y células huésped adecuadas para la adaptación a la síntesis de tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos en cultivo de células de vertebrados recombinantes se describen en Gething et al., Nature 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:4046 (1979); documento EP 117.060; y documento EP 117.058.
3. Detección de amplificación/expresión génica
Se puede medir la amplificación y/o expresión génica em una muestra directamente, por ejemplo, por transferencia tipo Southern convencional, transferencia tipo Northern para cuantificar la transcripción del ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), transferencia en mancha (análisis de ADN), o hibridación in situ, usando una sonda apropiadamente marcada, basada en las secuencias proporcionadas en el presente documento. Alternativamente, se pueden emplear anticuerpos que pueden reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN, y dúplex híbridos ADN-ARN o dúplex ADN-proteína. Los anticuerpos a su vez pueden estar marcados y el ensayo se puede llevar a cabo donde el dúplex está unido a una superficie, de modo que, tras la formación del dúplex en la superficie, se puede detectar la presencia del anticuerpo unido al dúplex.
Alternativamente, la expresión génica se puede medir por métodos inmunológicos, tal como tinción inmunohistoquímica de células o secciones de tejido y ensayo de cultivo celular o líquidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto génico. Los anticuerpos útiles para la tinción inmunohistoquímica y/o el ensayo de fluidos muestra pueden ser monoclonales o policlonales, y se pueden preparar en cualquier mamífero. Convenientemente, los anticuerpos se pueden preparar contra tramos se aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés de secuencia nativa o contra un péptido sintético basado en las secuencias de ADN proporcionadas en el presente documento, o contra una secuencia exógena fusionada a ADN que codifica un tramo de aminoácidos consecutivos o polipéptido de interés y que codifica un epítopo de anticuerpo específico.
4. Purificación de polipéptido
Se pueden recuperar formas de los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés del medio de cultivo o de lisados de células huésped. Si está unido a la membrana, se puede liberar de la membrana usando una solución detergente adecuada (por ejemplo, Triton X-100) o por corte enzimático. Las células empleadas en la expresión de los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés se pueden romper por varios medios físicos o químicos, tal como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, rotura mecánica, o agentes de lisado celular.
Se puede desear purificar los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés a partir de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes. Los siguientes procedimientos son ejemplares de procedimientos de purificación adecuados: por fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; columnas de proteína A Sepharosa para eliminar contaminantes tal como IgG; y columnas de quelantes metálicos para unir formas etiquetadas con epítetos. Se pueden emplear varios métodos de purificación de proteínas y tales métodos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982). La(s) etapa(s) de purificación seleccionada(s) dependerá(n), por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción usado y los tramos de aminoácidos consecutivos o polipéptidos de interés particulares producidos.
E je m p lo de e xp re s ió n de tra m o de a m in o á c id o s c o n se cu tivo s o c o m p o n e n te p o lip e p tíd ic o de in te ré s en E. co li
La secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de interés o polipéptido deseados se amplifica inicialmente usando cebadores de PCR seleccionados. Los cebadores deben contener sitios de enzimas de restricción que correspondan a los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado. Se pueden emplear una variedad de vectores de expresión. Un ejemplo de un vector adecuado es pBR322 (derivado de E. coli; véase Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)) que contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina. El vector se digiere con enzimas de restricción y se desfosforila. Las secuencias amplificadas por PCR se ligan entonces en el vector. El vector preferiblemente incluirá secuencias que codifican un gen de resistencia a antibiótico, un promotor trp, un líder polihis (incluyendo los primeros seis codones de STII, secuencia polihis, y sitio de corte de enteroquinasa), la región que codifica la secuencia de aminoácidos de interés/polipéptido específico, terminador de transcripción lambda, y un gen argU.
La mezcla de ligación se usa después para transformar una cepa de E. coli seleccionada usando los métodos descritos en Sambrook et al., anteriormente. Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas de LB y se seleccionan después colonias resistentes al antibiótico. Se puede aislar el a Dn de plásmido y confirmar por análisis de restricción y secuenciación de ADN.
Los clones seleccionados se pueden hacer crecer durante la noche en medio de cultivo líquido tal como caldo LB suplementado con antibióticos. Los cultivos nocturnos se pueden usar posteriormente para inocular un cultivo a mayor escala. Las células se hacen crecer después hasta una densidad óptica deseada, durante lo cual se activa la expresión del promotor.
Después de cultivar las células durante varias horas más, las células se pueden recoger por centrifugación. El precipitado celular obtenido por la centrifugación se puede solubilizar usando varios agentes conocidos en la técnica, y la secuencia de aminoácidos de interés o polipéptido solubilizado se puede purificar después usando una columna de quelante metálico en condiciones que permitan unión estrecha de la proteína.
Los cebadores pueden contener sitios de enzimas de restricción que corresponden a los sitios de enzimas de restricción en el vector de expresión seleccionado, y otras secuencias útiles que proporcionan inicio de la traducción eficaz y fiable, purificación rápida en una columna de quelación metálica, y eliminación proteolítica con enteroquinasa. Las secuencias amplificadas por PCR, etiquetadas con poli-His se pueden ligar en un vector de expresión usado para transformar un huésped de E. coli basado en, por ejemplo, la cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq). Los transformantes se pueden hacer crecer primero en LB que contiene carbenicilina 50 mg/ml a 30°C con agitación hasta que se alcanza una D.O. de 3-5. Los cultivos se diluyen después 50-100 veces en medio C RAP (preparado mezclando 3,57 g de (N H ^S O 4, 0,71 g de citrato de sodio-2H2O, 1,07 g de KCl, 5,36 g de extracto de levadura de Difco, 5,36 g de hycase SF de Sheffield en 500 ml de agua, así como MPOS 110 mM, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y MgSO47 mM) y se hacen crecer durante aproximadamente 20-30 horas a 30°C con agitación. Se retiraron muestras para verificar la expresión mediante análisis por SD-PAGE, y el cultivo en masa se centrifuga para precipitar las células. Los precipitados celulares se congelaron hasta la purificación y renaturalización.
La pasta de E. coli de fermentaciones de 0,5 a 1 l (6-10 g de precipitado) se resuspendió en 10 volúmenes (p/v) en guanidina 7 M, tampón Tris 20 mM, pH 8. Se añaden sulfito de sodio sólido y tetrahionato de sodio para hacer concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y la solución se agitó durante la noche a 4°C. Esta etapa produce una proteína desnaturalizada con todos los residuos de cisteína bloqueados por sulfitolización. La solución se centrifugó a 40.000 rpm en una ultracentrífuga Beckman durante 30 min. El sobrenadante se diluyó con 3-5 volúmenes de tampón de columna de quelato metálico (guanidina 6 M, Tris 20 mM, pH 7,4) y se filtró a través de filtros de 0,22 micras para clarificar. Dependiendo del extracto clarificado se cargó en una columna de quelato metálico Ni-NTA Qiagen 5 mil equilibrada en el tampón de columna de quelato metálico. La columna se lavó con tampón adicional que contenía imidazol 50 mM (Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La proteína se eluyó con tampón que contenía imidazol 250 mM. Las fracciones que contenían la proteína deseada se juntaron y almacenaron a 4 grados C. Se estimó la concentración de proteína por su absorbancia a 280 nm usando el coeficiente de extinción calculado basado en su secuencia de aminoácidos.
E xp re s ió n de tra m o de a m in o á c id o s c o n s e c u tiv o s o p o lip é p tid o s en cé lu la s de m a m ífe ro
Este ejemplo general ilustra una preparación de una forma glucosilada de una secuencia de aminoácidos de interés o componente polipeptídico deseado por expresión recombinante en células de mamífero.
El vector pRK5 (véase, el documento EP 307.247, publicado el 15 de marzo, 1989) se puede emplear como el vector de expresión. Opcionalmente, el ADN codificante se liga en pRK5 con enzimas de restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN usando métodos de ligación tal como los descritos en Sambrook et al., anteriormente.
En una forma de realización, las células huésped seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC CCL 1573) se hacen crecer a confluencia en placas de cultivo celular en medio tal como DMEM suplementado con suero de ternera fetal y opcionalmente, componentes nutrientes y/o antibióticos. Se mezclan aproximadamente 10 |jg del ADN de vector ligado con aproximadamente 1 |jg de ADN que codifica el gen VA ARN [Thimmappaya et al., Cell 31:543 (1982)] y se disuelve en 500 j l de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1 mM, CaCl20,227 M. A esta mezcla se añaden, gota a gota, 500 j l de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO41,5 mM, y se deja que se forme un precipitado durante 10 minutos a 25°C. El precipitado se suspende y se añade a las células 293 y se deja asentar durante aproximadamente cuatro horas a 37°C. El medio de cultivo se aspira y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30 segundos. Las células 293 se lavan después con medio sin suero, se añade medio fresco y las células se incuban durante aproximadamente 5 días.
Aproximadamente 24 horas después de las transfecciones, el medio de cultivo se elimina y sustituye con medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contiene 35S-cisteína 200 jC i/m l y 35S-metionina 200 jCi/ml. Después de 12 horas de incubación, el medio condicionado se recoge, se concentra en un filtro de centrifugación, y se carga en un gel de SDS al 15%. El gel procesado se puede secar y exponer a película durante un periodo de tiempo seleccionado para revelar la presencia de la secuencia de aminoácidos de interés o componente polipeptídico. Los cultivos que contienen células transfectadas puede someterse a incubación adicional (en medio sin suero) y el medio se ensaya en bioensayos seleccionados.
En una técnica alternativa, el ácido nucleico de la secuencia de aminoácidos de interés o componente polipeptídico se puede introducir en células 293 de forma transitoria usando el método del sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981). Las células 293 se hacen crecer a la máxima densidad en un frasco de agitación y se añaden 700 jg de vector ligado. Las células se concentran primero del frasco de agitación por centrifugación y se lavan con PBS. El precipitado de ADN-dextrano se incuba en el precipitado celular durante cuatro horas. Las células se tratan con glicerol al 20% durante 90 segundos, se lavan con medio de cultivo celular y se reintroducen en el frasco de agitación que contiene medio de cultivo, insulina bovina 5 jg/m l y transferrina bovina 0,1 jg/ml. Después de aproximadamente cuatro días, el medio condicionado se centrifuga y se filtra para eliminar células y restos. La muestra que contiene la secuencia de aminoácidos de interés o componente polipeptídico expresado se puede después concentrar y purificar por cualquier método seleccionado, tal como diálisis y/o cromatografía en columna.
En otra forma de realización, la secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico se puede expresar en células CHO. La secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico se puede transfectar en células CHO usando reactivos conocidos tal como CaPO4 o DEAE-dextrano. Como se ha descrito anteriormente, los cultivos celulares se pueden incubar, y el medio sustituir con medio de cultivo (solo) o medio que contiene un raadiomarcador tal como 35S-metionina. Después de determinar la presencia de la secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico, el medio de cultivo se puede sustituir por medio sin suero. Preferiblemente, los cultivos se incuban durante aproximadamente 6 días, y después el medio condicionado se recoge. El medio que contiene la secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico expresado se puede después concentrar y purificar por cualquier método seleccionado.
También se puede expresar la secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico etiquetado con epítopo en células CHO huéspedes. La secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico se pueden subclonar fuera de un vector pRK5. El inserto del subclón puede someterse a PCR para fusionarlo en el mismo marco de lectura con una etiqueta epítopo seleccionada tal como etiqueta poli-his en un vector de expresión de baculovirus. El inserto de la secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico etiquetado con poli-his se puede subclonar después en un vector dirigido por SV40 que contiene un marcador de selección tal como DHFR para la selección de clones estables. Por último, se pueden transfectar células CHO (como se ha descrito anteriormente) con el vector dirigido por SV40. Se puede realizar marcaje, como se ha descrito anteriormente, para verificar la expresión. El medio de cultivo que contiene la secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico etiquetado con poli-His se puede después concentrar y purificar por cualquier método seleccionado, tal como cromatografía de afinidad de quelato de Ni2+.
En una forma de realización la secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico se expresan como una construcción de IgG (inmunoadhesina), en la que las secuencias codificantes para las formas solubles (por ejemplo, dominios extracelulares) de las respectivas proteínas se fusionan a una secuencia de la región constante de IgG1 que contiene los dominios bisagra, CH2 y CH2 y/o es una forma etiquetada con poli-his.
Después de la amplificación por PCR, los respectivos ADN se subclonan en un vector de expresión de CHO usando técnicas estándar como se describe en Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unidad 3.16, John Wiley and Sons (1997). Los vectores de expresión de CHO se construyen para tener sitios de restricción compatibles 5' y 3' del ADN de interés para permitir el transporte conveniente de los ADNc. El vector usado en la expresión en células CHO es como se describe en Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996), y usa el promotor/potenciador temprano de SV40 para dirigir la expresión del ADNc de interés y dihidrofolato reductasa (DHFR). La expresión de DHFR permite la selección para el mantenimiento estable del plásmido después de la transfección.
E xp re s ió n de tra m o de a m in o á c id o s c o n s e c u tiv o s o p o lip é p tid o s en le va d u ra
El siguiente método describe la expresión recombinante de una secuencia de aminoácidos de interés o componente polipeptídico deseados en levadura.
Primero, se construyen vectores de expresión en levadura para la producción intracelular o secreción de un tramo de aminoácidos consecutivos a partir de promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica una secuencia de aminoácidos de interés o componente polipeptídico deseados, un péptido señal seleccionado y el promotor se inserta en sitios de enzimas de restricción adecuados en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión intracelular de la secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico. Para secreción, el ADN que codifica el tramo de aminoácidos consecutivos se puede clonar en el plásmido seleccionado, junto con el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, la secuencia señal/líder secretora del factor alfa (si es necesario) para la expresión del tramo de aminoácidos consecutivos.
Se pueden transformar después células de levadura, tal como la cepa de levadura AB110, con los plásmidos de expresión descritos anteriormente y cultivar en el medio de fermentación seleccionado. Los sobrenadantes de levadura transformada se pueden analizar por precipitación con ácido tricloroacético al 10% y separación por SDS-PAGE, seguido por tinción de los geles con colorante azul de Coomassie.
La secuencia de aminoácidos de interés o componente polipeptídico recombinantes se puede posteriormente aislar y purificar eliminando las células de levadura del medio de fermentación por centrifugación y después concentrando el medio usando filtros de cartucho seleccionados. El concentrado que contiene la secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico se pueden purificar adicionalmente usando resinas de cromatografía en columna seleccionadas.
E xp re s ió n de tra m o s de tra m o de am in o á c id o s c o n se cu tivo s o p o lip é p tid o s en cé lu las de in s e c to in fe c ta d a s con b a cu lo v iru s
El siguiente ejemplo describe la expresión recombinante de tramos de aminoácidos consecutivos en células de insecto infectadas con baculovirus.
El ácido nucleico deseado que codifica el tramo de aminoácidos consecutivos se fusiona antes de una etiqueta epítopo contenida en un vector de expresión de baculovirus. Tales etiquetas epítopo incluyen etiquetas de poli-his y etiquetas de inmunoglobulinas (como regiones Fc de IgG). Se puede emplear una variedad de plásmidos, incluyendo plásmidos derivados de plásmidos comercialmente disponibles tal como pVL1393 (Novagen). Brevemente, la secuencia de aminoácidos de interés o componente polipeptídico o la porción deseada de la secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico (tal como la secuencia que codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana) se amplifica por PCR con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede incorporar sitios de enzimas de restricción flanqueantes (seleccionados). El producto se dirigiere después con esas enzimas de restricción seleccionadas y se subclona en el vector de expresión.
Se genera un baculovirus recombinante por cotransfección del plásmido anterior y ADN de virus BaculoGold™ (Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda (“Sf9”) (ATCC CRL 1711) usando lipofectina (comercialmente disponible de GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de incubación a 28°C, los virus liberados se recogen y usan para amplificaciones adicionales. La infección vírica y expresión de proteína se realiza como se describe por O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
La secuencia de aminoácidos de interés o el componente polipeptídico etiquetado con poli-his expresado se puede después purificar, por ejemplo, por cromatografía de afinidad de quelato de Ni2+ como sigue. Se preparan extractos de células Sf9 infectadas con virus recombinante como se describe por Rupert et al., Nature, 362:175-179 (1993). Brevemente, las células Sf9 se lavan, se resuspenden en tampón de sonicación (Hepes 25 ml, pH 7,9; MgCh 12,5 mM; EDTA 0,1 mM; glicerol al 10%; NP40 al 0,1%; KCl 0,4 M), y se sónica dos veces durante 20 segundos en hielo. Los sonicados se aclaran por centrifugación, y el sobrenadante se diluye 50 veces en tampón de carga (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a través de un filtro de 0,45 pm. Se prepara una columna de Ni2+-NTA agarosa (comercialmente disponible de Qiagen) con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se equilibra con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular filtrado se carga en la columna a 0,5 ml por minuto. La columna se lava a A280 basal con tampón de carga, punto en el se empieza la recogida de fracciones. A continuación, la columna se lava con tampón de lavado secundario (fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye la proteína unida de forma no específica. Después de alcanzar A280 basal otra vez, la columna se desarrolla con un gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampón de lavado secundario. Se recogen fracciones de un ml y se analizan por SDS-PAGE y tinción con plata o inmunotransferencia con Ni2+-NTA conjugado a fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen la secuencia etiquetada con His-i0 eluídas se juntan y dializan frente a tampón de carga.
Alternativamente, la purificación de la secuencia de aminoácidos etiquetada con IgG (o etiquetada con Fc) se puede realizar usando técnicas de cromatografía conocidas, incluyendo, por ejemplo, cromatografía en columna de proteína A o proteína G.
Las construcciones de proteínas que contienen Fc se pueden purificar del medio condicionado como sigue. El medio condicionado se bombea en una columna de proteína A de 5 ml (Pharmacia) que está equilibrada en tampón fosfato de Na 20 mM, pH 6,8. Después de cargar, la columna se lava extensamente con tampón de equilibrado antes de la elución con ácido cítrico 100 mM, pH 3,5. La proteína eluída se neutraliza inmediatamente recogiendo fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 ml de tampón Tris 1 M, pH 9. La proteína muy purificada posteriormente se desala en tampón de almacenamiento como se ha descrito anteriormente para las proteínas etiquetadas con poli-His. La homogeneidad de las proteínas se verifica por electroforesis en gel de poliacrilamida (PEG) con SDS y secuenciación de aminoácidos N-terminales por degradación de Edman.
Ejemplos de composiciones farmacéuticas
Se exponen ejemplos no limitantes de tales composiciones y dosis como sigue:
Las composiciones que comprenden un compuesto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos que comprende aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia de etanercept (por ejemplo, Enebrel) pueden comprender manitol, sacarosa y trometamina. En una forma de realización, la composición está en forma de un liofilizado. En una forma de realización, la composición se reconstituye con, por ejemplo, agua bacteriostática estéril para inyección (BWFI), USP (que contiene alcohol bencílico al 0,9%). En una forma de realización, el compuesto se administra a un sujeto para reducir signos y síntomas, inducir una respuesta clínica principal, inhibir la evolución de daño estructural, y mejorar la función física en sujetos con artritis reumatoide de moderada a gravemente activa. El compuesto se puede iniciar en combinación con metotrexato (MTX) o usar solo. En una forma de realización, el compuesto se administra a un sujeto para reducir signos y síntomas de artritis reumatoide juvenil de curso poliarticular de moderada a gravemente activa en sujetos que han tenido una respuesta inadecuada a uno o más DMARD. En una forma de realización, el compuesto se administra a un sujeto para reducir signos y síntomas, inhibir la evolución de daño estructural de artritis activa, y mejorar la función física en sujetos con artritis psoriásica. En una forma de realización el compuesto se administra a un sujeto para reducir signos y síntomas en sujetos con espondilitis anquilosante activa. En una forma de realización, el compuesto se administra a un sujeto para el tratamiento de psoriasis en placas de moderada a grave crónica. En una forma de realización, en donde el sujeto tiene artritis reumatoide, artritis psoriásica, o espondilitis anquilosante, el compuesto se administra a 25-75 mg a la semana dado como una o más inyecciones subcutáneas (SC). En una forma de realización adicional, el compuesto se administra a 50 mg a la semana en una única inyección SC. En una forma de realización, en donde el sujeto tiene psoriasis en placas el compuesto se administra a 25-75 mg dos veces a la semana o separado 4 días durante 3 meses seguido por una reducción a una dosis de mantenimiento de 50 mg a la semana. En una forma de realización, la dosis es entre 2x y 100x menor que las dosis expuestas en el presente documento. En una forma de realización en donde el sujeto tiene JRA de curso poliarticular activa, el compuesto se puede administrar a una dosis de 0,2-1,2 mg/kg a la semana (hasta un máximo de 75 mg a la semana). En una forma de realización adicional, el compuesto se administra a una dosis de 0,8 mg/kg a la semana (hasta un máximo de 50 mg a la semana). En algunas formas de realización la dosis es entre 2x y 100x menor que las dosis expuestas en el presente documento.
Las composiciones que comprenden un compuesto que comprende un tramo de aminoácidos consecutivos que comprende aminoácidos consecutivos que tienen la secuencia de infliximab (por ejemplo, Remicade) pueden comprender sacarosa, polisorbato 80, fosfato de sodio monobásico, monohidrato, y fosfato de sodio dibásico, dihidrato. En una forma de realización, no hay conservantes presentes. En una forma de realización, la composición está forma de un liofilizado. En una forma de realización, la composición se reconstituye con, por ejemplo, agua para inyección (BWFI), USP. En una forma de realización, el pH de la composición es 7,2 o es aproximadamente 7,2. En una forma de realización, el compuesto se administra a un sujeto con artritis reumatoide en una dosis de 2-4 mg/kg dado como una infusión intravenosa seguido con dosis similares adicionales a las 2 y 6 semanas después de la primera infusión luego cada 8 semanas después de ello. En una forma de realización adicional, el compuesto se administra en una dosis de 3 mg/kg dado como una infusión intravenosa seguido con dosis similares adicionales a las 2 y 6 semanas después de la primera infusión luego cada 8 semanas después de ello. En una forma de realización, la dosis se ajusta hasta 10 mg/kg o tratando tan frecuentemente como cada 4 semanas. En una forma de realización el compuesto se administra en combinación con metotrexato. En una forma de realización el compuesto se administra a un sujeto con enfermedad de Crohn o enfermedad de Crohn fistulizante a una dosis de 2-7 mg/kg dada como una pauta de inducción a las 0, 2 y 6 semanas seguido por una pauta de mantenimiento de 4-6 mg/kg cada 8 semanas después de ello para el tratamiento de enfermedad de Crohn o enfermedad fistulizante de moderada a gravemente activa. En una forma de realización adicional, el compuesto se administra a una dosis de 5 mg/kg dada como una pauta de inducción a las 0, 2 y 6 semanas seguido por una pauta de mantenimiento de 5 mg/kg cada 8 semanas después de ello para el tratamiento de enfermedad de Crohn o enfermedad fistulizante de moderada a gravemente activa. En una forma de realización, la dosis se ajusta hasta 10 mg/kg. En una forma de realización el compuesto se administra a un sujeto con espondilitis anquilosante a una dosis de 2-7 mg/kg dada como una infusión intravenosa seguido con dosis similares adicionales a las 2 y 6 semanas después de la primera infusión, luego cada 6 semanas después de ello. En una forma de realización adicional el compuesto se administra a una dosis de 5 mg/kg dada como una infusión intravenosa seguido con dosis similares adicionales a las 2 y 6 semanas después de la primera infusión, luego cada 6 semanas después de ello. En una forma de realización el compuesto se administra a un sujeto con artritis psoriásica a una dosis de 2-7 mg/kg dada como una infusión intravenosa seguido con dosis similares adicionales a las 2 y 6 semanas después de la primera infusión, luego cada 8 semanas después de ello. En una forma de realización adicional el compuesto se administra a una dosis de 5 mg/kg dada como una infusión intravenosa seguido con dosis similares adicionales a las 2 y 6 semanas después de la primera infusión, luego cada 8 semanas después de ello. En una forma de realización el compuesto se administra con metotrexato. En una forma de realización el compuesto se administra a un sujeto con colitis ulcerosa a una dosis de 2-7 mg/kg dada como una pauta de inducción a las 0, 2 y 6 semanas seguido por una pauta de mantenimiento de 2-7 mg/kg cada 8 semanas después de ello para el tratamiento de colitis ulcerosa de moderada a gravemente activa. En una forma de realización adicional, el compuesto se administra a un sujeto con colitis ulcerosa a una dosis de 5 mg/kg dada como una pauta de inducción a las 0, 2 y 6 semanas seguido por una pauta de mantenimiento de 5 mg/kg cada 8 semanas después de ello. En algunas formas de realización, la dosis es entre 2x y 100x menor que las dosis expuestas anteriormente en el presente documento para tratar las enfermedades individuales.
En cada una de las formas de realización de las composiciones descritas en el presente documento, las composiciones, cuando están en forma de un liofilizado, se pueden reconstituir con, por ejemplo, soluciones acuosas estériles, agua estéril, agua estéril para inyecciones (USP), agua bacteriostática estéril para inyecciones (USP) y equivalentes de las mismas que conocen los expertos en la materia.
Se entiende que en la administración de cualquiera de los compuestos presentes, el compuesto se puede administrar en aislamiento, en un soporte, como parte de una composición farmacéutica, o en cualquier vehículo apropiado.
D osis
Se entiende que donde se indica un intervalo de dosis en el presente documento, por ejemplo, 1-10 mg/kg a la semana, la invención divulgada en el presente documento también contempla cada dosis entera y cada décima de la misma, entre los límites superior e inferior. En el caso del ejemplo dado, por tanto, la invención contempla 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1,2,2, 2,3, 2,4, etc., mg/kg hasta 10 mg/kg.
En aspectos, los compuestos de la presente invención se pueden administrar como una única dosis o se pueden administrar como dosis múltiples.
En general, la dosis diaria para tratar un trastorno o afección según los métodos descritos anteriormente en general variará desde aproximadamente 0,01 hasta aproximadamente 10,0 mg/kg de peso corporal del sujeto que se va a tratar.
Un médico experto puede hacer variaciones basadas en los intervalos de dosis anteriormente mencionados teniendo en cuenta consideraciones conocidas tales como el peso, edad, y estado de la persona que se trata, la gravedad de la afección, y la vía particular de administración elegida.
También se espera que los compuestos divulgados llevarán a cabo unión cooperativa con consecuencias concomitantes sobre las dosis eficaces requeridas.
F á rm a co s
El término “soporte farmacéuticamente aceptable” se entiende que incluye excipientes, soportes o diluyentes. El soporte, diluyente o excipiente particular usado dependerá de los medios y fines para los que se aplican el principio activo.
Para la administración parenteral, se pueden emplear soluciones que contienen un compuesto de esta invención o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en solución acuosa estéril. Tales soluciones acuosas estériles deben estar adecuadamente tamponadas si es necesario y hacer primero el diluyente líquido isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. Los medios acuosos estériles empleados están todos fácilmente disponibles por técnicas estándar que conocen los expertos en la materia.
Las composiciones descritas en el presente documento pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones. La forma preferida depende de modo pretendido de administración y aplicación terapéutica. Algunas composiciones están en forma de soluciones inyectables o infusibles. Un modo de administración es parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular). En una forma de realización, el compuesto se administra por infusión o inyección intravenosa. En otra forma de realización, el compuesto se administra por inyección intramuscular o subcutánea.
Para uso terapéutico, las composiciones divulgadas aquí se pueden administrar de varias formas, incluyendo forma soluble por inyección en embolada, infusión continua, liberación sostenida de implantes, ingestión oral, inyección local (por ejemplo, intracardiaca, intramuscular), inyección sistémica u otras técnicas adecuadas bien conocidas en las artes farmacéuticas. Otros métodos de administración farmacéutica incluyen, pero no están limitados a, métodos de administración oral, subcutánea, transdérmica, intravenosa, intramuscular y parenteral. Típicamente, una composición soluble comprenderá un compuesto purificado junto con soportes, excipientes o diluyentes fisiológicamente aceptables. Tales soportes serán no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas. La preparación de tales composiciones puede implicar combinar un compuesto con tampones, antioxidantes, hidratos de carbono incluyendo glucosa, sacarosa o dextrinas, agentes quelantes tal como EDTA, glutatión y otros estabilizantes y excipientes. La solución salina tamponada o solución salina mezclada con seroalbúmina conespecífica son diluyentes apropiados ejemplares. El producto se puede formular como un liofilizado usando soluciones excipientes apropiadas (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes.
Otros derivados comprenden los compuestos/composiciones de esta invención unidos covalentemente a un polímero no proteinaceo. La unión al polímero en general se realiza de modo que no interfiera con la actividad biológica preferida del compuesto, por ejemplo, la actividad de unión del compuesto a una diana. El polímero no proteinaceo normalmente es un polímero sintético hidrofílico, es decir, un polímero no encontrado de otra manera en la naturaleza. Sin embargo, polímeros que existen en la naturaleza y se producen por métodos recombinantes o in vitro son útiles, como lo son polímeros que se aíslan de la naturaleza. Los polímeros polivinílicos hidrofílicos están dentro del ámbito de esta invención, por ejemplo, alcohol polivinílico y polivinilpirrolidona. Particularmente útiles son los éteres de polialquileno tal como polietilenglicol, polipropilenglicol, ésteres de polioxietileno o metoxipilietilenglicol; polioxialquilenos tal como polioxietileno, polioxipropileno, y copolímeros en bloque de polioxietileno y polioxipropileno (Pluronics); polimetacrilatos; carbómeros; polisacáridos ramificados o no ramificados que comprenden los monómeros sacáridos D-manosa, D- y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico (por ejemplo, ácido polimanurónico o ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D-glucosa y ácido neuramínico incluyendo homopolisacáridos y heteropolisacáridos tal como lactosa, amilopeptina, almidón, hidroxietilalmidón, amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glucógeno, o la subunidad de polisacárido de mucopolisacáridos ácidos, por ejemplo, ácido hialurónico; polímeros de polioles, tal como polisorbitol y polimanitol; y heparina o heparon.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden incluir una “cantidad terapéuticamente eficaz” o una “cantidad profilácticamente eficaz” de un compuesto de la invención. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto puede variar según factores tal como el estado de enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en que cualquier efecto tóxico o perjudicial del compuesto está superado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosis y durante periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado profiláctico deseado. Típicamente, puesto que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una fase anterior de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Esta invención se entenderá mejor mediante referencia a los detalles experimentales que siguen, pero los expertos en la materia apreciarán fácilmente que los experimentos específicos detallados son solo ilustrativos de la invención como se describe más completamente en las reivindicaciones que siguen después de ello.
Detalles experimentales
Ejemplo 1: TNR1B-alquino-azida-Fc6
Se preparó TNR1 B-alquino-azida-Fc6 a través de la reacción de TNR1B (receptor de TNF 1B) modificado con alquino con Fc6 modificada con azida como sigue. Se preparó TNR1B-azida-alquino-Fc6 usando los mismos principios a través de la reacción de TNR1B modificado con azida con Fc6 modificada con alquino.
Se preparó TNR1B modificado con alquino (TNR1B-Alk) por corte de TNR1B-inteína (proteína de fusión TNR1B-Mth) con cistil-propargilamida, HSCH2CH[NH2]CONHCH2CECH (Figura 1) y se preparó TNR1B modificado con azida (TNR1B-Az) con cistil-3-azidopropilamida, HSCH2CH[NH2]CONH(CH2)3NH2.
Se describen TNRIB-inteína y Fc6 en el documento en EE UU con número de serie 11/982085, publicado el 16 de octubre, 2008.
La proteína de fusión TNR1B-inteína se produjo usando el vector pCDNA3-TNR1B-Mth, cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 100. El polipéptido quimérico pre-TNR1B-inteína que se expresa inicialmente, que contiene el dominio extracelular de TNR1B unido en su extremo C por un enlace peptídico al extremo N de una inteína con auto ayuste Mth R1R1 en el sitio de autocorte, se muestra en SEQ ID NO: 101. El corte de las secuencias señal del TNR homólogas por la peptidasa de señal celular proporciona la proteína de fusión TNR1B-inteína madura que se secreta en el líquido de cultivo celular, cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 102.
La proteína Fc6 se expresó usando el vector pCDNA3-SHH-IgG1-Fc11, cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 103. El polipéptido pre-Fc6 que se expresa inicialmente se muestra en SEQ ID NO: 104. El corte de las secuencias señal de Sonic hedgehog (SHH) heterólogas por la peptidasa de señal celular proporciona la proteína Fc6 madura que secreta en el líquido de cultivo celular, cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 105.
La producción de proteínas se ejecutó por expresión transitoria en células CHO-DG44, adaptadas a cultivo en suspensión sin suero. Las transfecciones transitorias se hicieron con polietilenimina como el agente de transfección, en complejo con ADN, en condiciones de alta densidad como se describe por Rajendra et al., J. Biotechnol. 153, 22­ 26 (2011). Los cultivos de semillas en serie se mantuvieron en biorreactor TubeSpin® de 50 tubos obtenido de TPP (Trasadingen, CH) y se aumentaron a escala en volumen para generar suficiente biomasa para la transfección. Las transfecciones se llevaron a cabo en cultivos de 0,5-1,0 l. Los cultivos en esta escala se mantuvieron en botellas Schott de 2 l o 5 l con una tapa ventilada. Las botellas se agitaron a 180 rpm en un incubador agitador Hühner con humidificación y control de CO2 al 5%. El líquido de los cultivos celulares se recogió después de 10 días, se centrifugó y se esterilizó por filtración, antes de la purificación.
Se prepararon cistil-propargilamida y cistil-3-azidopropilamida como sigue. Boc-Cys(Trt)-OH, (C6H5)3CSCH2CH[NHCO2C(CHa)3]CO2H; propargilamina, HCECCH2NH; 3-azidopropilamina, NH2CH2CH2CH2N3; EDC, clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida; y HOBt, 1-hidroxibenzotriazol, y se obtuvieron de AnaSpec (Freemont, CA) o CPC Stientific (San Jose, Ca). Todos los otros productos químicos se obtuvieron de Sigma-Aldrich (San Luis, MO). Para la síntesis de cistil-propargilamida, una solución de Boc-Cys(Trt)-OH (100 mM) y propargilamina (100 mM) en CH2Cl2 se hizo 100 mM cada una en EDC, HOBt, y trietilamina. Para la síntesis de cistil-3-azidopropilamida, 3-azidopropilamina (100 mM) se sustituyó por propargilamina. Ambas reacciones se prepararon por el siguiente procedimiento. Después de agitar durante la noche a temperatura ambiente, la reacción se paró con un exceso de NaHCO3 saturado en agua, se extrajo con CH2Cl2, se secó sobre MgSO4, se filtró, se evaporó y se purificó por cromatografía en columna. Para eliminar los grupos protectores Boc/Trt, el producto intermedio se disolvió a una concentración de 0,05 M en TFA/triisopropilsilano/H2O (90:5:5) y se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. La reacción se secó después por evaporación y se extrajo con CH2Cl2. La fase orgánica se extrajo después con agua, dando el producto final cistil-propargilamida como un aceite amarillento, y el producto final cistil-3-azidopropilamida como un sólido amarillento.
Para preparar el TNR1B modificado con alquino (figura 1) o el TNR1B modificado con azida, la proteína TNR1B-inteína en el líquido del cultivo celular se aplicó a una columna empaquetada con bolas de quitina obtenida de New England BioLabs (Beverley, MA) que se preequilibró con tampón A (Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5). La proteína no unida se lavó de la columna con el tampón A. El corte se inició equilibrando rápidamente la resina de quitina en tampón B (Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM, pH 8,0) que contenía o bien cistil-propargilamida 50 mM (para t Nr 1B modificado con alquino) o bien cistil-3-azidopropilamida 50 mM (para TNR1B modificado con azida) y se llevó a cabo la incubación durante 24 a 96 horas a temperatura ambiente. Las proteínas TNR1B modificada con alquino (SEQ ID NO: 106) o TNR1B modificada con azida (SEQ ID NO: 107) cortadas se eluyeron de la columna con tampón A, se concentraron usando una unidad de filtro centrífugo Amicon Ultracel-3 de Millipore (Billerica, MA), se dializaron frente a solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin sales de Ca o Mg (PBS) obtenido de la Instalación de Cultivo Celular de la UCSF (San Francisco, CA), y se almacenaron a 4°C antes del uso.
La figura 2 muestra el análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) del TNR1B modificado con alquino, comparado con TNR1B modificado con cisteína (SEQ ID NO: 108) preparado usando cisteína 50 mM en lugar de cistil-propargilamida. SDS-PAGE se llevó a cabo usando geles NuPAGE® Novex Bis-Tris Midi (10%) obtenidos de Invitrogen (Carlsbad, CA). Las proteínas se visualizaron usando Silver Stain Plus o Bio-Safe Coomassie Stain obtenidos de Bio-Rad (Hercules, CA). El TNR1B modificado con alquino (carril 3) y el TNR1B modificado con cisteína (carril 1) tenían la misma Mr ~43.000. Además, el TNR1B modificado con alquino tenía actividad biológica comparable al TNR1B modificado con cisteína medida usando un ELISA sTNFRII/TNFRSF1B Quantikine humano obtenido de R&D Systems (Minneapolis, MN). Las preparaciones de TNR1B modificado con cisteína (carril 2), TNR1B modificado con alquino (carril 4) o TNR1B modificado con tioéster (SEQ ID NO: 109) (carril 5) hechas en presencia de MESNA 50 mM tenían una Mr similar, pero tenían menos del 5% de la actividad biológica observada para las preparaciones hechas en ausencia de MESNA. Por tanto, el TNR1B modificado con alquino preparado en ausencia de MESNA se empleó en estudios adicionales.
Se preparó Fc6 modificada con azida (Az-Fc6) por la reacción de la proteína Fc6 con varios tioésteres de péptidos que contienen azida (Figura 3) y tioésteres de PEG que contienen azida (figura 4). Se preparó Fc6 modificada con alquino (Alk-Fc6) por la reacción de tioésteres que contienen alquino con la proteína Fc6.
La proteína Fc6 recombinante se expresó en células de ovario de hámster chino (CHO) como se ha descrito para TNR1B-inteína (véase anteriormente) y se purificó por cromatografía de afinidad en proteína A. El sobrenadante del cultivo se aplicó a una columna empaquetada con rProteína A Fast Flow de Pharmacia (Upsala, Suecia) pre­ equilibrada con PBS. La columna se lavó extensamente con PBS y la proteína Fc6 se eluyó después con tampón glicina 0,1 M pH 2,7. Se recogieron fracciones en tubos que contenían 0,05 vol/vol de Tris HCl 1,0 M pH 9,0 (que da un pH final de 7,5), se juntaron, se dializaron frente a PBS, y se almacenaron a 4°C antes de su uso.
La tabla 1 muestra tioésteres que contienen azida y péptido/PEG que contienen alquino representativos. Los tioésteres se sintetizaron por una estrategia Fmoc-t-butilo en fase sólida en una resina de cloruro de 2-clorotritilo precargada con Fmoc-Thr(tBu)-OH. Se obtuvieron derivados de aminoácidos de CPC Scientific (Sunnyvale, CA), se obtuvieron derivados de Fmoc-PEGn-OH de Quanta BioDesign (Powell, OH), y se obtuvieron hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3.tetrametilaminio (HBTU), diclorometano (Dc M), ácido tricloroacético (TFA), N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt), N,N'-diisopropiletilcardiimida (DIEA) y triisopropilsilano (TIS) de Sigma (San Luis, MO). Se empleó la activación de HBTU estándar para la elongación de péptidos. Los péptidos que contenían PEG requirieron la inserción de un Fmoc-PEGn-OH. Como etapa final en la elongación de péptidos, el grupo protector a-Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) terminal se convirtió a Boc (tert-butoxicarbonilo). La resina peptídica se lavó con DCM y se cortó con TFA al 1%/DCM para dar el péptido protegido por completo con un ácido carboxílico libre en el extremo C. El tioéster de los péptidos se formó tratando el péptido protegido crudo con DIC/HOBt/DIEA y bencilmercaptano o tiofenol en DCM durante la noche. Después de la concentración, el tioéster de péptido protegido crudo se precipitó por múltiples trituraciones con éter frío seguido por centrifugación. La desprotección se llevó a cabo por tratamiento del producto protegido crudo con TFA/TIS/H2O 95:2,5:2,5 durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de la precipitación con éter enfriado en hielo, el tioéster del péptido desprotegido se purificó por RP-HPLC preparativa em un sistema de H2O-acetonitrilo (TFA al 0,1%) para dar el producto final con una pureza del 91-95% y el MS deseado.
Se prepararon Fc6 modificada con azida y Fc6 modificada con alquino por ligación química nativa como sigue. El ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES) se obtuvo de Acros (Morris Plains, NJ), tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) se obtuvo de Pierce (Rockford, IL), y el ácido 4-mercaptofenilacético (MPAA) se obtuvo de Sigma-Aldrich (San Luis, MO). Las reacciones se llevaron a cabo ligando los varios tioésteres mostrados en la tabla 1 con la proteína Fc6 como sigue. Las reacciones (100 ul) contenían tampón MES 50 mM, pH 6,5, TCEP 0,8 mM, MPAA 10 mM, 4 mg/ml del tioéster del péptido, y 0,5 mg/ml de la proteína Fc6. Después de incubación durante la noche a temperatura ambiente, las reacciones se ajustaron a pH 7,0 con 0,05 vol/vol de Tris-HCl 1,0 M, pH 9,0, se purificó usando bolas magnéticas de proteína A de New England BioLabs, se dializó en fosfato 1,0 M pH 8,0 y se concentró.
La figura 5 muestra el análisis por SDS-PAGE que demuestra que la proteína Fc6 (carril 1) reaccionó cuantitativamente con azida-DKTHT-tioéster para dar la proteína Az-DKTHT-Fc6 y azida-PEG4-DKTHT-tioéster para dar la proteína Az-PEG4-DKTHT-Fc6 (carril 3). La secuencia de la proteína Az-DKTHT-Fc6 se muestra en SEQ ID NO: 110 y la secuencia de la proteína Az-PEG4-DKTHT-Fc6 se muestra en SEQ ID NO: 111. El oligómero PEG4 dio un aumento de tamaño incremental comparable a la secuencia de 5 aminoácidos DKTHT. Esto muestra que una única unidad de monómero de oxietileno hace una contribución a la longitud del contorno similar a un único residuo de aminoácido, consistente con que tienen conformaciones completamente extendidas comparables de ~3,5 a 4 A (Flory (1969) Statistical Mechanics of Chain Molecules (Interscience Publishers, Nueva York).
Se preparó TNR1B-alquino-azida-Fc6 a través de la reacción del TNR1B modificado con alquino con la proteína Az-DKTHT-Fc6 (figura 6) y la proteína Az-PEG4-DKTHT-Fc6 (figura 7). Se obtuvieron fosfato de sodio, dibásico (anhidro) y fosfato de sodio, monobásico (monohidrato) de Acros, TCEP era de Pierce, CuSO4 (pentahidrato) era de Sigma-Aldrich, y Tris[1-bencil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metilamina (TBTA) de AnaSpec (Freemont, CA). Las reacciones (60 ul) contenían fosfato de sodio 0,1 M, pH 8,0, CuSO41,0 mM, TbTa 2,0 mM, el TNR1B modificado con alquino (30 ug), y bien la proteína Fc6 sin modificar, la proteína Az-DKTHT-Fc6 o la proteína Az-PEG4-DKTHT-Fc6 (10 ug). Las reacciones se iniciaron por la adición de TCEP 2,0 mM, y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente. Los productos de reacción se purificaron usando bolas magnéticas de proteína A para eliminar cualquier TNR1B modificado con alquino sin reaccionar.
La figura 8 muestra el análisis por SDS-PAGE de los productos TNR1B-alquino-azida-Fc6 en condiciones reductoras. En ausencia de CuSO4, TBTA y TCEP, tanto Az-DKt Ht -Fc6 (carril 2) como Az-PEG4-DKTHT-Fc6 (carril 5) dieron una única banda de Mr ~28-30.000 dalton (flecha d) correspondiente a las proteínas Fc6 modificadas con azida aportadas, sin signos de formación de ningún producto. Además, no había evidencia de ninguna contaminación de TNR1B modificado con alquino aportado (mostrado en el carril 1) después de la purificación con proteína A. Sin embargo, en presencia de CuSO4, TbTa y TCEP, la reacción entre TNR1B modificado con alquino y Az-DKTHT-Fc6 (carril 3) y la reacción entre TNR1B modificado con alquino y Az-PEG4-DKTHT-Fc6 (carril 6) ambas dieron dos nuevos productos de Mr ~75.000 dalton (flecha a) y ~65.000 dalton (flecha b). Las reacciones se llevaron a cabo usando una preparación de TNR1B modificado con alquino después de intercambio de tampón en fosfato 0,1 M pH 8,0 para eliminar sal dio esencialmente productos de reacción similares tanto con Az-DKTHT-Fc6 (carril 4) como Az-PEG4-DKTHT-Fc6 (carril 6), aunque hubo un aumento significativo en el rendimiento del producto de Mr ~75.000 dalton sobre el producto de Mr ~65.000 dalton.
La figura 9 muestra el análisis por SDS-PAGE que compara los productos de reacción TNR1B-alquino-azida-Fc6 (panel izquierdo) y los productos de reacción TNR1B-alquino-azida-PEG4-Fc6 (panel derecho) con la proteína de fusión TNR1B-Fc (etanercept). El producto TNR1B-alquino-azida-Fc6 de Mr ~75.000 dalton (carril 2), que tiene la secuencia predicha mostrada en SEQ ID NO: 112, y el producto TNR1B-alquino-azida-PEG4-Fc6 de Mr ~75.000 dalton (carril 4), que tiene la secuencia predicha mostrada en SEQ ID NO: 113, son esencialmente indistinguibles en tamaño de etanercept (carril 1, 3), cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO: 114.
La figura 10 muestra el análisis por SDS-PAGE que proporciona evidencia adicional que confirma el requisito de los grupos alquino y azida para reactividad. Las mezclas de reacción que contenían TNR1B modificado con alquino con proteína Fc6 sin modificar no dieron producto de reacción (carril 2) comparado con Fc6 sola (carril 1), mientras que TNR1B modificado con alquino con Az-DKTHT-Fc6 dio los productos esperados (carril 4) comparado con Az-DKTHT-Fc6 sola (carril 3). De nuevo, no era aparente contaminación del TNR1B modificado con alquino aportado (mostrado en el carril 5) después de la purificación con proteína A.
Los productos TNR1B-alquino-azida-Fc6 de la figura 10 se caracterizaron adicionalmente por secuenciación de su péptido tríptico por LC-MS. Después de SDS-PAGE, el gel se tiñó con azul de Coomassie y se cortaron cuatro regiones del gel, correspondientes al producto de Mr ~75.000 (flecha a), el producto de Mr ~65.000 (flecha b), la región no teñida donde migraría el TNR1B modificado con alquino (flecha c), y la proteína Az-DKTHT-Fc6 sin reaccionar de Mr ~28.000 (flecha d). Las cuatro porciones de gel se cortaron en trozos pequeños (~0,5-1,0 mm3) y se procesaron como sigue. Se obtuvieron bicarbonato de amonio, acetonitrilo, ditiotreitol, y yodoacetamida de Sigma-Aldrich, el ácido fórmico se obtuvo de Pierce, y la tripsina porcina (calidad de secuenciación) se obtuvo de Promega (Madison, WI). Para eliminar el colorante Coomassie, cada porción de gel se extrajo con 200 ul de NH4HCO325 mM en acetonitrilo al 50% agitando con el vórtex, se centrifugó para eliminar el sobrenadante y se rehidrató añadiendo acetonitrilo durante unos pocos minutos hasta que los trozos de gel encogieron y se volvieron blancos. El acetonitrilo se desechó, y las porciones de gel se secaron en una SpeedVac (Savant Instruments, Farmingdale, NY). Se llevó a cabo después reducción y alquilación rehidratando las porciones de gel en 40 ul de ditiotreitol 10 mM en NH4HCO325 mM, agitando con el vórtex, y se incubó a 56°C durante 45 minutos. El sobrenadante se desechó después, se añadieron 40 ul de yodoacetamida 55 mM en NH4HCO325 mM, las porciones de gel se agitaron con el vórtex y se incubaron en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se desechó, las porciones de gel se rehidrataron otra vez en acetonitrilo y se secaron en una Speed Vac. Se llevó a cabo después la digestión con tripsina rehidratando las porciones de gel en 25 ul de tripsina (12,5 ug/ml) en NH4HCO325 mM en hielo durante 60 minutos. El exceso de solución de tripsina se eliminó después, las porciones de gel se cubrieron con NH4HCO325 mM y se incubaron a 37°C durante la noche. El sobrenadante se eliminó, y el gel se extrajo después dos veces con 30 ul de acetonitrilo al 50%/ácido fórmico al 0,1% en agua. Los extractos orgánicos se combinaron con el sobrenadante acuoso, se redujeron a un volumen de 10 ul en una Speed Vac, después se analizaron por LC-MS usando un espectrómetro de masas Q-Star Elite (AB SCIEX, Foster City, CA).
La figura 11 resume la caracterización de la estructura del producto de reacción TNR1B-alquino-azida-Fc6 por espectrometría de masas. El producto de Mr ~75.000, como se esperaba para el producto TNR1 B-alquino-azida-Fc6 de longitud completa, contenía péptidos de las proteínas parentales tanto TNR1B modificado con alquino como Fc6 modificada con azida. Además, la cobertura de péptidos de la secuencia de TNR1B modificado con alquino (panel superior) se extendía desde la región N-terminal (EYYDQTAQMCCSK) a la región C-terminal (SMAPGAVHLPQPVST). De forma similar, la cobertura de péptidos de la secuencia de la proteína Fc6 modificada con azida (panel inferior) se extendía desde la región N-terminal (DTLMISR) a la región C-terminal (TTPPPVLDSDGSFFLYSK). En contraste, el Mr ~65.000 carecía del péptido EYYDQTAQMCCSK, lo que sugiere que era una versión N-terminalmente delecionada del producto TNR1B-alquino-azida-Fc6 de longitud completa. No se detectaron secuencias derivadas de la proteína TNR1B en la región sin teñir de Mr ~43.000 donde normalmente migraría el TNR1B modificado con alquino (flecha c), mientras que solo se detectaron secuencias derivadas de la proteína Fc6 en la proteína Az-DKTHT-Fc6 sin reaccionar de Mr ~28.000 (flecha d).
Los productos TNR1B-alquino-azida-Fc6 y TNR1 B-alquino-azida-PEG4-Fc6 de la figura 10 se caracterizaron adicionalmente para su actividad biológica midiendo su capacidad de unir TNF-a usando resonancia de plasmón de superficie (SPR). Se obtuvo proteína TNF-a humana recombinante (sin portador) de R&D Systems y se reconstituyó en PBS. Los estudios de SPR se llevaron a cabo usando un instrumento Biacore T100 de Biacore AB (Upsala, Suecia). Los ligandos unidos a superficie, TNR1B-alquino-azida-Fc6 y TNR1 B-alquino-azida-PEG4-Fc6, se inmovilizaron en un chip sensor CM5, serie S, usando un kit de acoplamiento de amina (BR-1000-50) obtenido de GE Healthcare (Piscataway, NJ) según las instrucciones del fabricante. La unión de TNF-a se llevó a cabo a 25°C en tampón Hepes 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, y Tween-20 al 0,005%. La unión se evaluó en duplicado a concentraciones de TNF-a de 0,156 nM, 0,312 nM, 0,625 nM, 1,25 nM, 2,5 nM, 5,0 nM, 10,0 nM, 20,0 nM, y 40 nM. Los datos se evaluaron usando Software de evaluación de Biacore T100, versión 2.0.3.
La figura 12 muestra las curvas de unión cinética para TNR1B-alquino-azida-Fc6 (panel izquierdo) y TNR1B-alquinoazida-PEG4-Fc6 (panel derecho). Ambos productos mostraron unión a TNF-a saturable, y se obtuvo un excelente ajuste empleando modelo exponencial doble (Chi2 ~0,05). La tabla 2 resume los datos de unión cinéticos. Aproximadamente el 40% de los sitios de unión para cada producto eran de mayor afinidad, con una constante de disociación 1,6 veces mayor para TNR1 B-alquino-azida-PEG4-Fc6 (Kd = 1,86x10'1° M) que para TNR1B-alquino-azida-Fc6 (Kd = 2,99x10'10 M). El 60% restante de los sitios de unión eran de menor afinidad, con constantes de disociación aproximadamente iguales para TNR1 B-alquino-azida-PEG4-Fc6 (Kd = 5,12x10'9 M) y TNR1B-alquino-azida-Fc6 (Kd = 5,17x10'9 M). La asociación del enlazador PEG4 con unión de alta afinidad aumentada, pero igual unión de baja afinidad, proporciona evidencia convincente para un mayor grado de unión cooperativa (de dos manos) de TNF-a por TNR1 B-alquino-azida-PEG4-Fc6 comparado con TNR1B-alquino-azida-Fc6.
Tabla 1. Tioésteres que contienen azida y que contienen alquino
Figure imgf000063_0001
Mr, Masa molecular relativa; MH+, valor de masa monoisotípico.
Figure imgf000064_0001
Ejemplo 2: Fab'-alquino-azida-Fc6
Se preparó Fab'-alquino-azida-Fc6 a través de la reacción de Fab' modificado con cicloalquino con Fc6 modificada con azida como sigue.
Se obtuvo adalimumab (Humira) como una formulación líquida (50 mg/ml) de Abbott (Abbott Park, IL). El fragmento Fab' se preparó usando proteasa IdesS para primero generar fragmento Fab'2 seguido por reducción selectiva de los disulfuros intercadena con 2-mercaptoetilamina (figura 13). Se intercambió el anticuerpo (10 mg) en tampón de corte (fosfato de sodio 50 mM, NaCl 150 mM, pH 6,6) usando una unidad de diálisis Slide-A-Lyzer Mini, MWCO de 10K de Pierce (Rockford, IL), después se incubó con IdeS recombinante etiquetada con his inmovilizada en bolas de agarosa (columna FragIT MidiSpin) de Genovis (Lund, Suecia) durante 1 hora a temperatura ambiente con mezclado constante. Las bolas se eliminaron de la solución de digestión por centrifugación, se lavaron dos veces con tampón de corte, y el digerido y las soluciones de lavado se combinaron después y se aplicaron a una columna HiTrap Proteína A HP de GE Life Sciences (Piscataway, NJ) para eliminar el fragmento Fc' y el anticuerpo sin digerir. Las fracciones no unidas que contienen el fragmento Fab'2 se redujeron al fragmento Fab' añadiendo alícuotas de 1 ml a un vial que contenía 6 mg de 2-mercaptoetailamina (MEA) de Pierce. Las reducciones se llevaron a cabo con EDTA 10 mM para minimizar la reoxidación de los disulfuros intercadena. Después de incubación a 37°C durante 110 min, el exceso de MEA se eliminó por intercambio de tampón en PBS que contenía EDTA 10 mM usando una columna de desalado PD-10 de GE Life Sciences (Piscataway, NJ). El eluato que contenía el fragmento Fab' se concentró usando una unidad de filtro centrífugo Amicon Ultracel-3 de Millipore (Billerica, MA).
La figura 14 muestra el análisis por SDS-PAGE de adalimumab después del corte con IdeS (panel A), seguido por cromatografía en proteína A y reducción suave con MEA (panel B). En presencia de un agente reductor fuerte (ditiotreitol) en el gel de poliacrilamida, el anticuerpo entero (carril 1) migró como una cadena pesada de Mr ~55.000 (flecha a) y una cadena ligera de Mr ~25.000 (flecha d). IdeS cortó la cadena pesada (carril 2) en un fragmento C-terminal de Mr ~29.000 (flecha b) y un fragmento N-terminal de Mr ~26.000 (flecha c). La cadena ligera y el fragmento N-terminal de la cadena pesada comprenden el dominio Fab'2, mientras que el fragmento C-terminal d ela cadena pesada comprende el dominio Fc'. La columna de proteína A eliminó eficazmente el dominio Fc' del dominio Fab' (compárese el carril 2 con los carriles 5 y 6). En condiciones no reductoras, el dominio Fab'2 migró como una especie única de Mr ~110.000 (carril 3), mientras que el dominio Fab' producido por reducción suave con MEA migró como una especie única de Mr ~55.000 (carril 4). En condiciones reductoras, el dominio Fab'2 (carril 5) y el dominio Fab' (carril 6) dieron ambos la misma cadena ligera (flecha d) y fragmento N-terminal de la cadena pesada (flecha c), como se esperaba. Por tanto, el dominio Fab' obtenido por este procedimiento estaba esencialmente libre de los dominios Fab'2 y Fc'.
Se preparó Fab' modificado con cicloalquino a partir del dominio Fab' de adalimumab usando un enlazador bifuncional, DIBAC-PEG-i2-Lys(Mal), que contiene un grupo maleimida capaz de reaccionar con los grupos tiol libres en el fragmento Fab' (figura 15). Se preparó DIBAC-PEG-i2-Lys(Mal) usando una estrategia de síntesis en fase sólida con Fmoc. Se obtuvieron Lys(Mtt)-resina de Wang y 3-maleimidopropanoato de succinimido (Mpa-OSu) de CPC Scientific (Sunnyvale, CA), Fmoc-N-amido-dPEG12-ácido se obtuvo de Quanta BioDesign (Powell, OH), y ácido 5-(11,12-dideshidrobenceno[b,f]azocin-5(6H)-il)-5-oxopentanoico, un aza-dibenzociclooctino funcionalizado con ácido (DIBAC-ácido) se sintetizó como se describe por Debets, M. F. et al., C hem . C om m un. 46, 97-99 (2010). Fmoc-N-amidodPEG-12-ácido y DIBAC-ácido se hicieron reaccionar secuencialmente con Lys(Mtt)-resina de Wang para obtener DIBAC-PEG-i2-Lys(Mtt)-resina de Wang, después se trató con TFA/DCM/TIS (1:96:3) para eliminar el grupo Mtt. La resina desprotegida se hizo reaccionar con Mpa-OSu en el grupo amino libre en la cadena lateral de la lisina para obtener DIBAC-PEG-i2-Lys(Mal)-resina de Wang. Después de cortar con TFA/agua (95:5), el producto crudo se purificó por RP-HPLC preparativa para dar el producto DIBAC-PEG-i2-Lys(Mal) (DPKM) con el 93% de pureza y el espectro MS deseado.
La figura 16 muestra la modificación química del fragmento Fab' de adalimumab con el enlazador DIBAC-PEG12-Lys(Mal) y la purificación del Fab' modificado con cicloalquino resultante. Para la purificación, se llevaron a cabo reacciones (0,535 ml) en fosfato de sodio 0,1 M a pH 7,0 y pH 7,4, cada una contenía 5 mg de fragmento Fab' y 10 mg de DIBAC-PEG-i2-Lys(Mal). Después de 30 horas de incubación a temperatura ambiente, las dos reacciones se combinaron y se intercambió tampón a acetato de sodio 20 mM, NaCl 20 mM, pH 5,5 usando una columna PD-10. El eluato (3,5 ml) se aplicó a una columna de intercambio catiónico HiTrap SP HP de GE Life Sciences que retuvo todo el Fab' sin modificar y Fab'2 residual. Las fracciones no unidas (0,55 ml) que contenían el Fab' modificado con cicloalquino purificado (figura 16b) se juntaron, se ajustaron a pH 7,0 con PBS 10x (0,55 ml), y se concentraron por cromatografía de afinidad en una columna de proteína L (Capto L) de GE Life Sciences. El Fab' modificado con cicloalquino se eluyó de la columna de proteína L con glicina HCl 0,1 M pH 2,7 (2,4 ml), se neutralizó con 1/20 volúmenes de Tris HCl 1,0 M pH 9,0, se intercambió el tampón a PBS usando una columna PD-10 (3,5 ml) y se concentró usando una unidad de filtro centrífugo Amicon Ultracel-3 a un volumen final de 70 ul a una concentración de 9,5 mg/ml.
Se usaron varias proteínas Fc6 modificadas con azida con enlazadores PEG de diferentes longitudes en la preparación de Fab' de adalimumab-cicloalquino-azida-Fc6. Se prepararon Az-DKTHT-Fc6 (figura 3) y derivados de Az-DKTHT-PEGx-Fc6 con X = 12, 24 y 36 (figura 4) en reacciones (2 ml) que contenían MES 50 mM pH 6,5, TCEP 0,8 mM, MPAA 10 mM, 5 mg/ml de cada uno de los cuatro Az-DKTHT-PEGx-tioésteres y 2,36 mg/ml de proteína Fc6. Después de 20 horas a temperatura ambiente, las reacciones se neutralizaron con 100 ul de Tris HCl pH 9,0, se clarificaron por centrifugación a 12.000xg, y se aplicaron a 1 ml de columna HiTrap proteína A HP. Las columnas se lavaron con 12 vol de PBS, las proteínas Fc6 modificadas con azida se eluyeron después con glicina HCl 0,1 M pH 2,7 (2,0 ml), se neutralizaron con 1/20 volúmenes de Tris HCl 1M pH 9,0. se dializaron frente a tres cambios de PBS durante 12 horas cada uno usando una unidad de diálisis Slide-A-Lyzer Mini, MWCO de 10K, y se concentraron usando unidades de filtro centrífugos Amicon Ultracel-3.
La figura 17 el análisis por SDS-PAGE en condiciones reductoras de las proteínas Fc6 (carril 1), Az-DKTHT-Fc6 (carril 2), Az-DKTHT-PEG-i2-Fc6 (carril 3), Az-DKTHT-PEG24-Fc6 (carril 4), y Az-DKTHT-PEGs6-Fc6 (carril 5) por SDS-PAGE. La proteína Fc6 reaccionó cuantitativamente (> 90%) con los cuatro tioésteres, dando una escalera de productos de tamaño creciente.
La figura 18 muestra el análisis por cromatografía de exclusión molecular (SEC) para confirmar que los cuatro productos de proteína Fc6 modificada con azida tenían la misma estructura dimérica que la molécula Fc6 parental. Se llevó a cabo SEC usando un sistema de HPLC Prominence (Shimadzu Corp, Kioto, Japón). Las columnas TSKgel Super SW3000 (columna de 4,6 mm x 30 cm, precolumna de 4,6 mm x 5 cm) se obtuvieron de TOSOH Bioscience (Tokio, Japón). La fase móvil, velocidad de flujo, temperatura de columna y longitud de onda de detección usadas fueron fosfato de sodio 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7,4, 0,35 ml/min, 30°C, y 280 nm, respectivamente. Los cuatro productos de proteína Fc6 modificada con azida mostraron un tiempo de retención que disminuyó según aumentaba el tamaño del enlazador PEG, confirmando su estructura dimérica. Los cuatro productos también dieron esencialmente un pico único, lo que demuestra una estructura de dos manos en que ambos extremos N del dímero Fc6 parental estaban modificados por el enlazador de PEG lo que se confirmó por análisis por SDS-PAGE en condiciones no reductoras (véase posteriormente).
El Fab' modificado con ciclooctino se hizo reaccionar con las cuatro moléculas de Fc6 modificada con azida (figura 19) , dando una familia de estructuras Fab'-PEGy-cicloalquino-azida-PEGx-Fc6 con brazos de longitud creciente (figura 20) . Las longitudes globales de los brazos resultantes fueron Fab'-PEG-i2-Fc6 (para x = 0, y = 12), Fab'-PEG24-Fc6 (para x = 12, y = 12), Fab'-PEG36-Fc6 (para x = 24, y = 12), y Fab'-PEG48-Fc6 (para x = 36, y = 12). Las reacciones (8 ul) se llevaron a cabo en fosfato de sodio 0,1 M pH 7,0 durante la noche a temperatura ambiente con cada una de las proteínas Fc6 modificada con azida (2,5 mg/ml) en presencia o ausencia de Fab' modificado con cicloalquino (5 mg/ml).
La figura 21 muestra el análisis por SDS-PAGE de la reacción Fab'-cicloalquino-azida-Fc6 en condiciones reductoras y no reductoras. En ausencia del Fab' modificado con cicloalquino (carriles 5, 7, 9, y 11), todas las cuatro proteínas Fc6 modificadas con azida dieron una única banda en geles tanto reductores como no reductores, confirmando su estructura dimérica de dos manos. En presencia del Fab' modificado con cicloalquino (carriles 4, 6, 8, y 10), todas las cuatro proteínas Fc6 modificadas con azida se consumían en gran medida en la reacción resultante. En condiciones reductoras, las cuatro reacciones dieron un producto con Mr ~57.000 a 62.000 (flecha a). El tamaño del producto Fab'-PEG-i2-Fc6 (carril 4) era aproximadamente 1-2 kD mayor que la cadena pesada de adalimumab de tipo salvaje (carril 1), mientras que los productos Fab'-PEG24-Fc6 (carril 6), Fab'-PEG36-Fc6 (carril 8), y Fab'-PEG48-Fc6 (carril 10) aumentaron más con la longitud global del enlazador de PEG. En condiciones no reductoras, se observaron dos productos, un primer producto de Mr ~155.000 a 160.000 (flecha a) y un segundo de Mr ~110.000 a 115.000 (flecha b). El producto Fab'-PEG-i2-Fc6 mayor (carril 4) era aproximadamente 5 kD mayor que el anticuerpo adalimumab entero (carril 1), consistente con el producto de dos manos esperado, mientras que los productos más grandes Fab'-PEG24-Fc6 (carril 6), Fab'-PEG36-Fc6 (carril 8), y Fab'-PEG48-Fc6 (carril 10) aun aumentaron más de tamaño según aumentaba la longitud global del enlazador de PEG.
La figura 22 muestra el análisis por SEC para confirmar la estructura de dos manos (es decir, dos manos Fab' unidas a un dominio Fc6) del producto de reacción más grande con Mr ~155.000 a 160.000 de las reacciones Fab'-PEG12-Fc6, Fab'-PEG24-Fc6, Fab'-PEG36-Fc6 y Fab'-PEG48-Fc6. Todos los cuatro productos de reacción mostraron un tiempo de retención más corto que el anticuerpo completo adalimumab que disminuyó más según aumentaba el tamaño del enlazador de PEG, confirmando la estructura de dos manos observada por el análisis por SDS-PAGE.
La actividad biológica de los productos Fab'-cicloalquino-azida-Fc6 se evaluó por su capacidad para neutralizar citotoxicidad mediada por TNF-a en células murinas WEHI tratadas con actinomicina D. La línea celular WEHI-13VAR de ratón (ATCC CRL-2148) se obtuvo de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, MD) y se cultivó en medio RPMI 1640 de Gibco (RPMI-1640) suplementado con suero bovino fetal (SBF) al 10% y penicilina y estreptomicina (10 U/ml), obtenidas de Life Tecnologies (Grand Island, NY). Los ensayos de citotoxicidad de TNF-a se llevaron a cabo como sigue. Se sembraron células WEHI-13VAR se sembraron en placas de cultivo celular blancas de Nunc de 96 pocillos obtenidas de Thermo Fisher (Whaltham, MA) a 2*104 células por pocillo durante la noche y después se trataron con actinomicina D (0,5 pg/ml) obtenido de Sigma (San Luis, MO) y TNF-a (0,2 ng/ml) en ausencia o presencia de TNFR-IgG u otros inhibidores. Después de 24 horas de incubación a 37°C/CO2 al 5%, la viabilidad celular se determinó con sistemas de ensayo de viabilidad celular luminiscentes CellTiter-Glo (Promega, Madison, WI) que mide la cantidad de ATP presente en células metabólicamente activas y luminiscencia medida usando un luminómetro POLARstar (BMG LABTECH Inc., Cary, NC). Cada inhibidor se diluyó en diez diluciones en serie de 3 veces empezando a 10 pg/ml y se midió en duplicado o triplicado. Los datos de citotoxicidad se calcularon usando las siguientes ecuaciones: (1-lectura de luciferasa de la muestra/lectura de luciferasa de células tratadas con actinomicina D solo) x 100%, y se presentan como la media ± desviación estándar. Se usó Enebrel como un control positivo de citotoxicidad y Fc6 como un control negativo.
La figura 23 muestra la neutralización de la citotoxicidad mediada por TNF-a por mezclas de reacción de Fab'-PEGi2-Fc6, Fab'-PEG24-Fc6, Fab'-PEG36-Fc6 y Fab'-PEG48-Fc6 comparadas con el Fab' modificado con cicloalquino (basado en cantidades iguales de Fab' modificado con cicloalquino aportado). Las mezclas de reacción de Fab'-PEGi2-Fc6 y Fab'-PEG24-Fc6 ambas mostraron actividad de neutralización de TNF-a comparable comparada con la del Fab' modificado con cicloalquino aportado (panel superior), mientras que las mezclas de reacción de Fab'-PEG36-Fc6 y Fab'-PEG48-Fc6 mostraron un aumento de 1,5 veces y 2,0 veces, respectivamente, en su actividad de neutralización de TNF-a comparada con la del Fab' modificado con cicloalquino aportado (panel inferior). Puesto que la cantidad del producto de dos manos representaba solo el 10-20% del Fab' modificado con cicloalquino total en cada reacción estimado por SDS-PAGE (figura 22), se estima que los productos de dos manos de las reacciones de Fab'-PEG36-Fc6 y Fab'-PEG48-Fc6 son al menos 7,5 veces y l0 veces mayores que el Fab' modificado con cicloalquino aportado, respectivamente.
Ejemplo 3: Fab-alquino-azida-Fc6
Se prepara Fab-alquino-azida-Fc6 haciendo reaccionar Fc6 modificada con azida con una proteína Fab modificada con alquino o modificada con cicloalquino que se produce por corte de una proteína de fusión Fab-inteína como sigue. De forma similar, se prepara Fab-azida-alquino-Fc6 haciendo reaccionar Fc6 modificada con alquino o modificada con cicloalquino con una proteína Fab modificada con azida que se produce por corte de una proteína de fusión Fabinteína.
La proteína de fusión Fab de adalimumab-inteína se produce cotransfectando el vector de expresión pFUSE2ss-DE27-VK-CLIg-hk (SEQ ID NO: 115) con pFUSE2ss-DE27-VYl-CHIg-hG1-Mth-1 (SEQ ID NO: 116) o pFUSE2ss-DE27-VY1-CHIg-hG1-Mth-2 (SEQ ID NO: 117).
El vector pFUSE2ss-DE27-VK-CLIg-hk dirige la expresión de la cadena ligera pre-kappa de adalimumab mostrada en SEQ ID NO: 118. El corte de la secuencia señal de IL-2 heteróloga por la peptidasa de señal celular proporciona la cadena ligera kappa madura de adalimumab mostrada en SEQ ID NO: 119.
El vector pFUSE2ss-DE27-VY1-CHIg-hG1-Mth-1 dirige la expresión de un primer tipo de polipéptido quimérico pre­ cadena pesada-inteína mostrado en SEQ ID NO: 120, en el que la cadena pesada de adalimumab VH y los dominios CH1 están unidos en su extremo C al extremo N de una inteína de auto ayuste R1R1 en el sitio de autocorte. El corte de la secuencia señal heteróloga de IL-2 por la peptidasa de señal celular proporciona la proteína de fusión cadena pesada madura-inteína mostrada en SEQ ID nO: 121. Juntas, las proteínas de SEQ ID NO: 119 y SEQ ID NO: 121 comprenden la proteína de fusión Fab-1 de adalimumab-inteína que se secreta al líquido del cultivo celular.
El vector pFUSE2ss-DE27-VY1-CHIg-hG1-Mth-2 dirige la expresión de un segundo tipo de polipéptido quimérico pre­ cadena pesada-inteína mostrado en SEQ ID NO: 122, en el que la cadena pesada de adalimumab VH y los dominios CH1 están unidos en su extremo C al extremo N de una inteína de auto ayuste R1R1 en el sitio de autocorte. El corte de la secuencia señal heteróloga de IL-2 por la peptidasa de señal celular proporciona la proteína de fusión cadena pesada madura-inteína mostrada en SEQ ID nO: 123. Juntas, las proteínas de SEQ ID NO: 119 y SEQ ID NO: 123 comprenden la proteína de fusión Fab-2 de adalimumab-inteína que se secreta al líquido del cultivo celular.
La producción de proteína se realiza por expresión transitoria en células CHO-DG44 esencialmente como se describe en el ejemplo 1, mediante la cotransfección de SEQ ID NO: 115 con SEQ ID NO: 116 para producir la proteína de fusión Fab-1 de adalimumab-inteína, y mediante la cotransfección de SEQ ID NO: 115 con SEQ ID NO: 117 para producir Fab-2 de adalimumab-inteína.
Las proteínas Fab de adalimumab modificadas con alquino se producen por corte de las proteínas de fusión Fab de adalimumab-inteína con cistil-propargilamida 50 mM esencialmente como se describe en el ejemplo 1. La proteína de fusión Fab-1 de adalimumab-inteína se corta con cistil-propargilamida para producir proteína Fab-1 de adalimumab modificada con alquino que es una proteína heterodimérica de SEQ ID NO: 119 y sEq ID NO: 124. La proteína de fusión Fab-2 de adalimumab-inteína se corta con cistil-propargilamida para producir proteína Fab-2 de adalimumab modificada con alquino que es una proteína heterodimérica de SEQ ID NO: 119 y SEQ ID NO: 125.
Las proteínas Fab de adalimumab modificadas con azida se producen por corte de las proteínas de fusión Fab de adalimumab-inteína con cistil-3-azidopropilamida 50 mM esencialmente como se describe en el ejemplo 1. La proteína de fusión Fab-1 de adalimumab-inteína se corta con cistil-3-azidopropilamida para producir proteína Fab-1 de adalimumab que es una proteína heterodimérica de SEQ ID NO: 119 y sEq ID NO: 126. La proteína de fusión Fab-2 de adalimumab-inteína se corta con cistil-3-azidopropilamida para producir proteína Fab-2 de adalimumab que es una proteína heterodimérica de SEQ ID NO: 119 y sEq Id NO: 127.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un compuesto que tiene la estructura:
    A
    Figure imgf000208_0001
    en donde A es un primer componente polipeptídico del compuesto;
    en donde C es un segundo componente polipeptídico del compuesto, componente polipeptídico que tiene en su extremo N una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una cisteína, selenocisteína, CP, CPXCP (donde X = P, R, o S), CDKTHTCPPCP, CVECPPCP, CCVECPPCP y CDTPPPCPRCP, y comprende aminoácidos consecutivos que (i) son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presentes en una cadena de un dominio Fc de un anticuerpo; y (ii) se unen a un receptor de Fc, en donde B es una estructura química que une A y C;
    en donde la línea discontinua entre B y C representa un enlace peptidílico entre B y el extremo N de C; en donde la línea continua entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
    Figure imgf000208_0002
    en donde R1 es H o es parte de una estructura adicional que es una estructura cíclica, en donde la estructura cíclica adicional comprende R1 o una parte de R1, y también puede comprender R2 o una parte de R2, y el carbono entre R2 y el doble enlace alqueno.
    El compuesto según la reivindicación 1, en donde R1 y R2 están unidos a través de al menos un enlace directo de modo que forman una estructura cíclica que comprende
    i) una parte de R1,
    ii) una parte de R2,
    iii) el carbono entre R2 y el doble enlace alqueno, y
    iv) el doble enlace alqueno.
    El compuesto según la reivindicación 2, en donde R1 se selecciona del grupo que consiste en:
    Figure imgf000209_0001
    que está opcionalmente sustituido en cualquier posición.
    El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el carbono entre R2 y el doble enlace alqueno está directamente unido a R2 a través de un doble enlace y un enlace sencillo.
    El compuesto según la reivindicación 4, en donde R2 es:
    Figure imgf000209_0002
    que está opcionalmente sustituido en cualquier posición,
    en donde R2 está unido a R1 a través del átomo de nitrógeno de R2; y
    en donde J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o consiste en una cadena de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fracciones seleccionadas del grupo que consiste en un [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, alcohol polivinílico, polivinil alquil éter, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo de C1-C4, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo de C1-C4, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoilo y un aminoácido,
    en donde [PEG(y)]z es:
    Figure imgf000209_0003
    El compuesto según la reivindicación 4, en donde R1 y R2 tomados juntos son:
    Figure imgf000210_0001
    que está opcionalmente sustituido en cualquier posición,
    en donde J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o consiste en una cadena de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fracciones seleccionadas del grupo que consiste en un [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, alcohol polivinílico, polivinil alquil éter, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo de C1-C4, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo de C1-C4, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoilo y un aminoácido,
    en donde [PEG(y)]z es:
    Figure imgf000210_0002
    en donde y = 1-100 y z = 1-10.
    7. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o 6, en donde la línea sólida entre A y B representa un enlace no peptidílico que comprende la estructura:
    Figure imgf000211_0001
    que está opcionalmente sustituida en cualquier posición,
    en donde J es un enlace o una estructura orgánica que comprende o consiste en una cadena de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fracciones seleccionadas del grupo que consiste en un [PEG(y)]z, polialquilenglicol, poliol polioxialquilado, alcohol polivinílico, polivinil alquil éter, poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-glicólico), polisacárido, un residuo ramificado, alquilo de C1-C4, amina, azufre, oxígeno, succinimida, maleimida, glicerol, triazol, isoxazolidina, acilo de C1-C4, succinilo, malonilo, glutarilo, ftalilo, adipoilo y un aminoácido,
    en donde [PEG(y)]z es:
    Figure imgf000212_0001
    8. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde A comprende una proteína secretada.
    9. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde A comprende un dominio extracelular de una proteína.
    10. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde A comprende al menos un Fab o Fab' de un anticuerpo, o una parte del al menos un Fab o Fab'.
    11. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde A comprende al menos un tramo de aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presentes en un anticuerpo monocatenario.
    12. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde A comprende al menos un tramo de aminoácidos consecutivos que son idénticos a un tramo de aminoácidos consecutivos presentes en un receptor de TNFa.
    13. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que forma parte de un homodímero.
    14. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que forma parte de un heterodímero.
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